Wiki FKKT - User contributions [en]

Seminarji SB 2020/21

2021-05-12T11:26:23Z

Marusamismas:

V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline]
(Liza Ulčakar) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 
6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) 
7 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) 
8 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reverzibilna_toplotna_regulacija_za_bifunkcionalno_dinamično_uravnavanje_izražanja_genov_v_E._coli Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli] (Urška Fajdiga) 
9 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dna_optogenetska_naprava_na_osnovi_BRET_za_pulzirajo%C4%8Do_ekspresijo_transgena%2C_ki_omogo%C4%8Da_glukozno_homeostazo_pri_mi%C5%A1ih Sintetična optogenetska naprava na osnovi BRET za pulzirajočo ekspresijo transgena, ki omogoča glukozno homeostazo pri miših] (Paula Horvat) 
10 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hkratna_karakterizacija_več_različnih_racionalno_načrtovanih_promotorskih_arhitektur Vpogled v kombinatorno logiko z IPTG induciranih sistemov] (Urška Zagorc) 
11 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ponovno_določanje_specifičnosti_izven_citoplazme_aktivnih_sigma_faktorjev Ponovno določanje specifičnosti izven citoplazme aktivnih sigma faktorjev] (Eva Keber) 
12 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hierarhi%C4%8Dno_sestavljanje_asimetri%C4%8Dnih_ikozaedri%C4%8Dnih_virusnih_kapsid Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid] (Urška Pečarič Strnad) 
13 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Avtomatizirano_oblikovanje_sintezne_mikrobne_zdru%C5%BEbe Avtomatizirano oblikovanje sintezne mikrobne združbe] (Urša Lovše)

14 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Regulacija_stopnje_izra%C5%BEanja_z_L-arabinozo_v_ekspresijskem_sistemu_T7_z_razklopljeno_rastjo Regulacija stopnje izražanja z L-arabinozo v ekspresijskem sistemu T7 z razklopljeno rastjo] (Maruša Mišmaš)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv]
(Špela Supej) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 
4 [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) 
6 [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) 
7 [[Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe]] (Mirsad Mešić) 
8 [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) 
9 [[Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata]] (Jernej Imperl) 
10 [[NANOFLEX: Standardiziran, prilagodljiv in priročen celični biosenzor]] (Martin Špendl) 
11 [[FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib]] (Mateja Žvipelj) 
12 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/samoreplicirajoč_COVID-19_test Samoreplicirajoč COVID-19-test] (Irma Zeljković) 

----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Seminarji SB 2020/21

2021-05-12T11:26:09Z

Marusamismas:

V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline]
(Liza Ulčakar) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 
6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) 
7 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) 
8 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reverzibilna_toplotna_regulacija_za_bifunkcionalno_dinamično_uravnavanje_izražanja_genov_v_E._coli Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli] (Urška Fajdiga) 
9 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dna_optogenetska_naprava_na_osnovi_BRET_za_pulzirajo%C4%8Do_ekspresijo_transgena%2C_ki_omogo%C4%8Da_glukozno_homeostazo_pri_mi%C5%A1ih Sintetična optogenetska naprava na osnovi BRET za pulzirajočo ekspresijo transgena, ki omogoča glukozno homeostazo pri miših] (Paula Horvat) 
10 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hkratna_karakterizacija_več_različnih_racionalno_načrtovanih_promotorskih_arhitektur Vpogled v kombinatorno logiko z IPTG induciranih sistemov] (Urška Zagorc) 
11 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ponovno_določanje_specifičnosti_izven_citoplazme_aktivnih_sigma_faktorjev Ponovno določanje specifičnosti izven citoplazme aktivnih sigma faktorjev] (Eva Keber) 
12 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hierarhi%C4%8Dno_sestavljanje_asimetri%C4%8Dnih_ikozaedri%C4%8Dnih_virusnih_kapsid Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid] (Urška Pečarič Strnad) 
13 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Avtomatizirano_oblikovanje_sintezne_mikrobne_zdru%C5%BEbe Avtomatizirano oblikovanje sintezne mikrobne združbe] (Urša Lovše)
14 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Regulacija_stopnje_izra%C5%BEanja_z_L-arabinozo_v_ekspresijskem_sistemu_T7_z_razklopljeno_rastjo Regulacija stopnje izražanja z L-arabinozo v ekspresijskem sistemu T7 z razklopljeno rastjo] (Maruša Mišmaš)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv]
(Špela Supej) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 
4 [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) 
6 [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) 
7 [[Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe]] (Mirsad Mešić) 
8 [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) 
9 [[Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata]] (Jernej Imperl) 
10 [[NANOFLEX: Standardiziran, prilagodljiv in priročen celični biosenzor]] (Martin Špendl) 
11 [[FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib]] (Mateja Žvipelj) 
12 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/samoreplicirajoč_COVID-19_test Samoreplicirajoč COVID-19-test] (Irma Zeljković) 

----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Seminarji SB 2020/21

2021-05-12T11:25:39Z

Marusamismas:

Seminarji SB 2020/21

2021-05-12T11:25:19Z

Marusamismas:

V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline]
(Liza Ulčakar) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 
6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) 
7 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) 
8 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reverzibilna_toplotna_regulacija_za_bifunkcionalno_dinamično_uravnavanje_izražanja_genov_v_E._coli Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli] (Urška Fajdiga) 
9 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dna_optogenetska_naprava_na_osnovi_BRET_za_pulzirajo%C4%8Do_ekspresijo_transgena%2C_ki_omogo%C4%8Da_glukozno_homeostazo_pri_mi%C5%A1ih Sintetična optogenetska naprava na osnovi BRET za pulzirajočo ekspresijo transgena, ki omogoča glukozno homeostazo pri miših] (Paula Horvat) 
10 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hkratna_karakterizacija_več_različnih_racionalno_načrtovanih_promotorskih_arhitektur Vpogled v kombinatorno logiko z IPTG induciranih sistemov] (Urška Zagorc) 
11 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ponovno_določanje_specifičnosti_izven_citoplazme_aktivnih_sigma_faktorjev Ponovno določanje specifičnosti izven citoplazme aktivnih sigma faktorjev] (Eva Keber) 
12 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hierarhi%C4%8Dno_sestavljanje_asimetri%C4%8Dnih_ikozaedri%C4%8Dnih_virusnih_kapsid Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid] (Urška Pečarič Strnad) 
13 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Avtomatizirano_oblikovanje_sintezne_mikrobne_zdru%C5%BEbe Avtomatizirano oblikovanje sintezne mikrobne združbe] (Urša Lovše)
14 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Regulacija_stopnje_izra%C5%BEanja_z_L-arabinozo_v_ekspresijskem_sistemu_T7_z_razklopljeno_rastjo Regulacija stopnje izražanja z L-arabinozo v ekspresijskem sistemu T7 z razklopljeno rastjo] (Maruša Mišmaš)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv]
(Špela Supej) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 
4 [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) 
6 [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) 
7 [[Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe]] (Mirsad Mešić) 
8 [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) 
9 [[Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata]] (Jernej Imperl) 
10 [[NANOFLEX: Standardiziran, prilagodljiv in priročen celični biosenzor]] (Martin Špendl) 
11 [[FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib]] (Mateja Žvipelj) 
12 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/samoreplicirajoč_COVID-19_test Samoreplicirajoč COVID-19-test] (Irma Zeljković) 

----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Regulacija stopnje izražanja z L-arabinozo v ekspresijskem sistemu T7 z razklopljeno rastjo

2021-05-12T11:23:59Z

Marusamismas:

''Povzeto po članku:'' [https://www.pnas.org/content/pnas/101/17/6355.full.pdf Stargardt, P., Striedner, G. & Mairhofer, J. Tunable expression rate control of a growth-decoupled T7 expression system by L-arabinose only. Microb Cell Fact 20, 27 (2021).]

== '''Uvod''' ==
Pri izražanju rekombinantnih proteinov želimo pridobiti čim več topnega in funkcionalnega produkta, vendar v gostiteljskih celicah zaradi visoke stopnje izražanja rekombinantnega proteina lahko hitro pride do porabe aminokislin, do stresnega odziva celice ali pa se rekombinantni protein začne kopičiti v obliki netopnih agregatov oziroma inkluzijskih telesc.
Še posebej težavni so membranski proteini, pri katerih hitro pride do nasičenosti kapacitete transporta v periplazmo ali zunanjo membrano, encimi, pri katerih lahko pride do motenj v metabolizmu in pa proteini, ki so toksični za gostiteljsko celico.

Obstaja optimalna stopnja izražanja, ki da maksimalno količino produkta in to želimo doseči z uravnavanjem nivoja izražanja rekombinantnega proteina.

== '''Ekspresijski sistemi, ki omogočajo regulirano izražanje gena''' ==
Obstaja že nekaj sistemov, ki omogočajo bolj natančno regulacijo stopnje izražanja.
Pripravili so sev z mutiranim laktoznim promotorjem, ki omogoča počasnejše prepisovanje gena, T7 polimerazo lahko inhibiramo z njenim naravnim inhibitorjem T7 lizocimom, ki ga vstavimo pod ramnozni promotor in ga induciramo z L-ramnozo, z ortogonalnimi ribostikali pa lahko uravnavamo nivo translacije.

V tem članku so pripravili nov gostiteljski sev, ki je zmožen razklopiti lastno rast od sinteze rekombinantnega proteina. Celica zaustavi produkcijo lastnih genov in vse metabolne vire in ves sintezni sistem usmeri v produkcijo tarčnega proteina. To tehnologijo so poimenovali enGenes-X-press in jo je ta raziskovalna skupino predstavila v [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00028 drugem članku pred tem]. V tem članku pa so to tehnologijo nadgradili in testirali možnost natančnega uravnavanja stopnje izražanja z uporabo različnih koncentracij L-arabinoze.

== '''Tehnologija enGenes-X-press''' ==
Ustvarili so sev, ki omeji svojo rast in metabolne vire preusmeri v proizvodnjo tarčnega proteina. To so dosegli z izražanjem peptida Gp2. Ta izhaja iz bakteriofaga in deluje kot inhibitor gostiteljske RNA polimeraze. Tako je transkripcija gostiteljskih genov onemogočena in rast celic se ustavi. Tarčni gen na plazmidu pa se prepisuje z ortogonalno T7 polimerazo.

Za pripravo tega seva so vzeli sev E.coli BL21(DE3). Ta že vsebuje zapis za ortogonalno T7 RNA polimerazo na kromosomu pod kontrolo laktoznega promotorja, ki ga induciramo z IPTG.
S homologno rekombinacijo so na kromosom na mestu attTn7 vstavili gen za Gp2 pod arabinozni promotor, ki ga pa induciramo z L-arabinozo.
Izbrisali so še gene arabinoznega operona araBADC, da se arabinoza ne more presnavljati in lahko deluje kot induktor v tem sevu. Ob dodatku arabinoze se bo torej sproži sinteza Gp2, gostiteljska RNA polimeraza je inhibirana in celična rast se ustavi. Z dodatkom IPTG pa se sproži sinteza T7 polimeraze in tarčnega proteina na plazmidu.

== '''Uporaba samo L-arabinoze za natančno uravnavanje izražanja''' ==
V tem članku so ta sistem nadgradili. Namesto uporabe dveh induktorjev (IPTG in L-arabinoze) so uporabili samo L-arabinozo. Pogoj je, da lahko L-arabinoza inducira izražanje laktoznega T7 promotorja, kar so v nekaterih sevih E.coli dokazali že raziskovalci pred njimi.

Za sašijo so vzeli sev E.coli BL21-AI. Ta že vsebuje gen za T7 polimerazo pod arabinoznim promotorjem vključen na mesto araB. S tem je gen araB izbrisan, zato se arabinoza v celici ne more presnavljati in lahko deluje kot induktor.
Dodatno so s homologno rekombinacijo na mesto attTn7 na kromosomu vključili zapis za peptid Gp2 pod arabinozni promotor.
Tako so z L-arabinozo lahko hkrati inducirali izražanje Gp2 in T7 RNA polimeraze.

== '''Karakterizacija''' ==
S spremljanjem kinetike rasti so dokazali, da njihov novi sev, po indukciji upočasni svojo rast.
Z merjenjem fluorescence reporterskega proteina GFP so dokazali, da njihov novi sev, proizvede večjo količino produkta v primerjavi z originalnim sevom.
S pretočno citometrijo so dokazali, da indukcija samo z L-arabinozo ohrani bolj homogeno populacijo celic v primerjavi z indukcijo z IPTG.
Z SDS-PAGE so dokazali, da pri indukciji z nižjo koncentracijo L-arabinoze nastane manj ikluzijskih telesc kot pri indukciji z višjo koncentracijo.
Z izražanjem membranskih proteinov fuziranih z GFP so dokazali, da je ta sev primeren za izražanje membranskih proteinov.

=='''Zaključek'''==
- Z zaustavitvijo rasti celice se sprostijo metabolni viri, sintezni sistem in šaperoni za produkcijo večje količine tarčnega proteina.

- Z različnimi koncentracijami L-arabinoze lahko uravnavamo nivo izražanja tarčnega proteina pod laktoznim T7 promotorjem.

- Sistem je uporaben za produkcijo membranskih proteinov in drugih težavnih proteinov

== '''Viri'''==
[1.] Stargardt, P., Striedner, G. & Mairhofer, J. Tunable expression rate control of a growth-decoupled T7 expression system by L-arabinose only. Microb Cell Fact 20, 27 (2021). https://doi.org/10.1186/s12934-021-01512-7

[2.] Patrick Stargardt, Lukas Feuchtenhofer, Monika Cserjan-Puschmann, Gerald Striedner, and Juergen Mairhofer: Bacteriophage Inspired Growth-Decoupled Recombinant Protein Production in Escherichia coli. ACS Synthetic Biology 2020 9 (6), 1336-1348

[3.] Sørensen, H.P., Mortensen, K.K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb Cell Fact 4, 1 (2005). https://doi.org/10.1186/1475-2859-4-1

[4.] Narayanan N, Hsieh M, Xu Y, Chou CP. Arabinose-induction of lac-derived promoter systems for penicillin acylase production in Escherichia coli. Biotechnol Prog. 2006;22:617–25.
Morra, R., Shankar, J., Robinson, C. J., Halliwell, S., Butler, L., Upton, M., … Dixon, N. (2015). Dual transcriptional-translational cascade permits cellular level tuneable expression control. Nucleic Acids Research, 44(3), e21–e21. doi:10.1093/nar/gkv912

[5.] Lin, W.-J.; Huang, S.-W.; Chou, C. P. DegP coexpression minimizes inclusion body formation upon overproduction of recombinant penicillin acylase in Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 2001, 73, 484-492.

Regulacija stopnje izražanja z L-arabinozo v ekspresijskem sistemu T7 z razklopljeno rastjo

2021-05-12T11:23:01Z

Marusamismas:

''Povzeto po članku:'' [https://www.pnas.org/content/pnas/101/17/6355.full.pdf Stargardt, P., Striedner, G. & Mairhofer, J. Tunable expression rate control of a growth-decoupled T7 expression system by L-arabinose only. Microb Cell Fact 20, 27 (2021).]

== '''Uvod''' ==
Pri izražanju rekombinantnih proteinov želimo pridobiti čim več topnega in funkcionalnega produkta, vendar v gostiteljskih celicah zaradi visoke stopnje izražanja rekombinantnega proteina lahko hitro pride do porabe aminokislin, do stresnega odziva celice ali pa se rekombinantni protein začne kopičiti v obliki netopnih agregatov oziroma inkluzijskih telesc. P
Še posebej težavni so membranski proteini, pri katerih hitro pride do nasičenosti kapacitete transporta v periplazmo ali zunanjo membrano, encimi, pri katerih lahko pride do motenj v metabolizmu in pa proteini, ki so toksični za gostiteljsko celico.
Obstaja optimalna stopnja izražanja, ki da maksimalno količino produkta in to želimo doseči z uravnavanjem nivoja izražanja rekombinantnega proteina.

== '''Ekspresijski sistemi, ki omogočajo regulirano izražanje gena''' ==
Obstaja že nekaj sistemov, ki omogočajo bolj natančno regulacijo stopnje izražanja.
Pripravili so sev z mutiranim laktoznim promotorjem, ki omogoča počasnejše prepisovanje gena, T7 polimerazo lahko inhibiramo z njenim naravnim inhibitorjem T7 lizocimom, ki ga vstavimo pod ramnozni promotor in ga induciramo z L-ramnozo, z ortogonalnimi ribostikali pa lahko uravnavamo nivo translacije.
V tem članku so pripravili nov gostiteljski sev, ki je zmožen razklopiti lastno rast od sinteze rekombinantnega proteina. Celica zaustavi produkcijo lastnih genov in vse metabolne vire in ves sintezni sistem usmeri v produkcijo tarčnega proteina. To tehnologijo so poimenovali enGenes-X-press in jo je ta raziskovalna skupino predstavila v [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00028 drugem članku pred tem]. V tem članku pa so to tehnologijo nadgradili in testirali možnost natančnega uravnavanja stopnje izražanja z uporabo različnih koncentracij L-arabinoze.

== '''Tehnologija enGenes-X-press''' ==
Ustvarili so sev, ki omeji svojo rast in metabolne vire preusmeri v proizvodnjo tarčnega proteina. To so dosegli z izražanjem peptida Gp2. Ta izhaja iz bakteriofaga in deluje kot inhibitor gostiteljske RNA polimeraze. Tako je transkripcija gostiteljskih genov onemogočena in rast celic se ustavi. Tarčni gen na plazmidu pa se prepisuje z ortogonalno T7 polimerazo.
Za pripravo tega seva so vzeli sev E.coli BL21(DE3). Ta že vsebuje zapis za ortogonalno T7 RNA polimerazo na kromosomu pod kontrolo laktoznega promotorja, ki ga induciramo z IPTG.
S homologno rekombinacijo so na kromosom na mestu attTn7 vstavili gen za Gp2 pod arabinozni promotor, ki ga pa induciramo z L-arabinozo.
Izbrisali so še gene arabinoznega operona araBADC, da se arabinoza ne more presnavljati in lahko deluje kot induktor v tem sevu. Ob dodatku arabinoze se bo torej sproži sinteza Gp2, gostiteljska RNA polimeraza je inhibirana in celična rast se ustavi. Z dodatkom IPTG pa se sproži sinteza T7 polimeraze in tarčnega proteina na plazmidu.

== '''Uporaba samo L-arabinoze za natančno uravnavanje izražanja''' ==
V tem članku so ta sistem nadgradili. Namesto uporabe dveh induktorjev (IPTG in L-arabinoze) so uporabili samo L-arabinozo. Pogoj je, da lahko L-arabinoza inducira izražanje laktoznega T7 promotorja, kar so v nekaterih sevih E.coli dokazali že raziskovalci pred njimi.
Za sašijo so vzeli sev E.coli BL21-AI. Ta že vsebuje gen za T7 polimerazo pod arabinoznim promotorjem vključen na mesto araB. S tem je gen araB izbrisan, zato se arabinoza v celici ne more presnavljati in lahko deluje kot induktor.
Dodatno so s homologno rekombinacijo na mesto attTn7 na kromosomu vključili zapis za peptid Gp2 pod arabinozni promotor.
Tako so z L-arabinozo lahko hkrati inducirali izražanje Gp2 in T7 RNA polimeraze.

== '''Karakterizacija''' ==
S spremljanjem kinetike rasti so dokazali, da njihov novi sev, po indukciji upočasni svojo rast.
Z merjenjem fluorescence reporterskega proteina GFP so dokazali, da njihov novi sev, proizvede večjo količino produkta v primerjavi z originalnim sevom.
S pretočno citometrijo so dokazali, da indukcija samo z L-arabinozo ohrani bolj homogeno populacijo celic v primerjavi z indukcijo z IPTG.
Z SDS-PAGE so dokazali, da pri indukciji z nižjo koncentracijo L-arabinoze nastane manj ikluzijskih telesc kot pri indukciji z višjo koncentracijo.
Z izražanjem membranskih proteinov fuziranih z GFP so dokazali, da je ta sev primeren za izražanje membranskih proteinov.

=='''Zaključek'''==
- Z zaustavitvijo rasti celice se sprostijo metabolni viri, sintezni sistem in šaperoni za produkcijo večje količine tarčnega proteina.

- Z različnimi koncentracijami L-arabinoze lahko uravnavamo nivo izražanja tarčnega proteina pod laktoznim T7 promotorjem.

- Sistem je uporaben za produkcijo membranskih proteinov in drugih težavnih proteinov

== '''Viri'''==
[1.] Stargardt, P., Striedner, G. & Mairhofer, J. Tunable expression rate control of a growth-decoupled T7 expression system by L-arabinose only. Microb Cell Fact 20, 27 (2021). https://doi.org/10.1186/s12934-021-01512-7

[2.] Patrick Stargardt, Lukas Feuchtenhofer, Monika Cserjan-Puschmann, Gerald Striedner, and Juergen Mairhofer: Bacteriophage Inspired Growth-Decoupled Recombinant Protein Production in Escherichia coli. ACS Synthetic Biology 2020 9 (6), 1336-1348

[3.] Sørensen, H.P., Mortensen, K.K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb Cell Fact 4, 1 (2005). https://doi.org/10.1186/1475-2859-4-1

[4.] Narayanan N, Hsieh M, Xu Y, Chou CP. Arabinose-induction of lac-derived promoter systems for penicillin acylase production in Escherichia coli. Biotechnol Prog. 2006;22:617–25.
Morra, R., Shankar, J., Robinson, C. J., Halliwell, S., Butler, L., Upton, M., … Dixon, N. (2015). Dual transcriptional-translational cascade permits cellular level tuneable expression control. Nucleic Acids Research, 44(3), e21–e21. doi:10.1093/nar/gkv912

[5.] Lin, W.-J.; Huang, S.-W.; Chou, C. P. DegP coexpression minimizes inclusion body formation upon overproduction of recombinant penicillin acylase in Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 2001, 73, 484-492.

Regulacija stopnje izražanja z L-arabinozo v ekspresijskem sistemu T7 z razklopljeno rastjo

2021-05-12T11:22:46Z

Marusamismas:

''Povzeto po članku:'' [https://www.pnas.org/content/pnas/101/17/6355.full.pdf Stargardt, P., Striedner, G. & Mairhofer, J. Tunable expression rate control of a growth-decoupled T7 expression system by L-arabinose only. Microb Cell Fact 20, 27 (2021).]

== '''Uvod''' ==
Pri izražanju rekombinantnih proteinov želimo pridobiti čim več topnega in funkcionalnega produkta, vendar v gostiteljskih celicah zaradi visoke stopnje izražanja rekombinantnega proteina lahko hitro pride do porabe aminokislin, do stresnega odziva celice ali pa se rekombinantni protein začne kopičiti v obliki netopnih agregatov oziroma inkluzijskih telesc. P
Še posebej težavni so membranski proteini, pri katerih hitro pride do nasičenosti kapacitete transporta v periplazmo ali zunanjo membrano, encimi, pri katerih lahko pride do motenj v metabolizmu in pa proteini, ki so toksični za gostiteljsko celico.
Obstaja optimalna stopnja izražanja, ki da maksimalno količino produkta in to želimo doseči z uravnavanjem nivoja izražanja rekombinantnega proteina.

== '''Ekspresijski sistemi, ki omogočajo regulirano izražanje gena''' ==
Obstaja že nekaj sistemov, ki omogočajo bolj natančno regulacijo stopnje izražanja.
Pripravili so sev z mutiranim laktoznim promotorjem, ki omogoča počasnejše prepisovanje gena, T7 polimerazo lahko inhibiramo z njenim naravnim inhibitorjem T7 lizocimom, ki ga vstavimo pod ramnozni promotor in ga induciramo z L-ramnozo, z ortogonalnimi ribostikali pa lahko uravnavamo nivo translacije.
V tem članku so pripravili nov gostiteljski sev, ki je zmožen razklopiti lastno rast od sinteze rekombinantnega proteina. Celica zaustavi produkcijo lastnih genov in vse metabolne vire in ves sintezni sistem usmeri v produkcijo tarčnega proteina. To tehnologijo so poimenovali enGenes-X-press in jo je ta raziskovalna skupino predstavila v [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00028 drugem članku pred tem]. V tem članku pa so to tehnologijo nadgradili in testirali možnost natančnega uravnavanja stopnje izražanja z uporabo različnih koncentracij L-arabinoze.

== '''Tehnologija enGenes-X-press''' ==
Ustvarili so sev, ki omeji svojo rast in metabolne vire preusmeri v proizvodnjo tarčnega proteina. To so dosegli z izražanjem peptida Gp2. Ta izhaja iz bakteriofaga in deluje kot inhibitor gostiteljske RNA polimeraze. Tako je transkripcija gostiteljskih genov onemogočena in rast celic se ustavi. Tarčni gen na plazmidu pa se prepisuje z ortogonalno T7 polimerazo.
Za pripravo tega seva so vzeli sev E.coli BL21(DE3). Ta že vsebuje zapis za ortogonalno T7 RNA polimerazo na kromosomu pod kontrolo laktoznega promotorja, ki ga induciramo z IPTG.
S homologno rekombinacijo so na kromosom na mestu attTn7 vstavili gen za Gp2 pod arabinozni promotor, ki ga pa induciramo z L-arabinozo.
Izbrisali so še gene arabinoznega operona araBADC, da se arabinoza ne more presnavljati in lahko deluje kot induktor v tem sevu. Ob dodatku arabinoze se bo torej sproži sinteza Gp2, gostiteljska RNA polimeraza je inhibirana in celična rast se ustavi. Z dodatkom IPTG pa se sproži sinteza T7 polimeraze in tarčnega proteina na plazmidu.

== '''Uporaba samo L-arabinoze za natančno uravnavanje izražanja''' ==
V tem članku so ta sistem nadgradili. Namesto uporabe dveh induktorjev (IPTG in L-arabinoze) so uporabili samo L-arabinozo. Pogoj je, da lahko L-arabinoza inducira izražanje laktoznega T7 promotorja, kar so v nekaterih sevih E.coli dokazali že raziskovalci pred njimi.
Za sašijo so vzeli sev E.coli BL21-AI. Ta že vsebuje gen za T7 polimerazo pod arabinoznim promotorjem vključen na mesto araB. S tem je gen araB izbrisan, zato se arabinoza v celici ne more presnavljati in lahko deluje kot induktor.
Dodatno so s homologno rekombinacijo na mesto attTn7 na kromosomu vključili zapis za peptid Gp2 pod arabinozni promotor.
Tako so z L-arabinozo lahko hkrati inducirali izražanje Gp2 in T7 RNA polimeraze.

== '''Karakterizacija''' ==
S spremljanjem kinetike rasti so dokazali, da njihov novi sev, po indukciji upočasni svojo rast.
Z merjenjem fluorescence reporterskega proteina GFP so dokazali, da njihov novi sev, proizvede večjo količino produkta v primerjavi z originalnim sevom.
S pretočno citometrijo so dokazali, da indukcija samo z L-arabinozo ohrani bolj homogeno populacijo celic v primerjavi z indukcijo z IPTG.
Z SDS-PAGE so dokazali, da pri indukciji z nižjo koncentracijo L-arabinoze nastane manj ikluzijskih telesc kot pri indukciji z višjo koncentracijo.
Z izražanjem membranskih proteinov fuziranih z GFP so dokazali, da je ta sev primeren za izražanje membranskih proteinov.

=='''Zaključek'''==
- Z zaustavitvijo rasti celice se sprostijo metabolni viri, sintezni sistem in šaperoni za produkcijo večje količine tarčnega proteina.
- Z različnimi koncentracijami L-arabinoze lahko uravnavamo nivo izražanja tarčnega proteina pod laktoznim T7 promotorjem.
- Sistem je uporaben za produkcijo membranskih proteinov in drugih težavnih proteinov

== '''Viri'''==
[1.] Stargardt, P., Striedner, G. & Mairhofer, J. Tunable expression rate control of a growth-decoupled T7 expression system by L-arabinose only. Microb Cell Fact 20, 27 (2021). https://doi.org/10.1186/s12934-021-01512-7

[2.] Patrick Stargardt, Lukas Feuchtenhofer, Monika Cserjan-Puschmann, Gerald Striedner, and Juergen Mairhofer: Bacteriophage Inspired Growth-Decoupled Recombinant Protein Production in Escherichia coli. ACS Synthetic Biology 2020 9 (6), 1336-1348

[3.] Sørensen, H.P., Mortensen, K.K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb Cell Fact 4, 1 (2005). https://doi.org/10.1186/1475-2859-4-1

[4.] Narayanan N, Hsieh M, Xu Y, Chou CP. Arabinose-induction of lac-derived promoter systems for penicillin acylase production in Escherichia coli. Biotechnol Prog. 2006;22:617–25.
Morra, R., Shankar, J., Robinson, C. J., Halliwell, S., Butler, L., Upton, M., … Dixon, N. (2015). Dual transcriptional-translational cascade permits cellular level tuneable expression control. Nucleic Acids Research, 44(3), e21–e21. doi:10.1093/nar/gkv912

[5.] Lin, W.-J.; Huang, S.-W.; Chou, C. P. DegP coexpression minimizes inclusion body formation upon overproduction of recombinant penicillin acylase in Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 2001, 73, 484-492.

Regulacija stopnje izražanja z L-arabinozo v ekspresijskem sistemu T7 z razklopljeno rastjo

2021-05-12T11:21:49Z

Marusamismas:

''Povzeto po članku:'' [https://www.pnas.org/content/pnas/101/17/6355.full.pdf Stargardt, P., Striedner, G. & Mairhofer, J. Tunable expression rate control of a growth-decoupled T7 expression system by L-arabinose only. Microb Cell Fact 20, 27 (2021).]

== '''Uvod''' ==
Pri izražanju rekombinantnih proteinov želimo pridobiti čim več topnega in funkcionalnega produkta, vendar v gostiteljskih celicah zaradi visoke stopnje izražanja rekombinantnega proteina lahko hitro pride do porabe aminokislin, do stresnega odziva celice ali pa se rekombinantni protein začne kopičiti v obliki netopnih agregatov oziroma inkluzijskih telesc. P
Še posebej težavni so membranski proteini, pri katerih hitro pride do nasičenosti kapacitete transporta v periplazmo ali zunanjo membrano, encimi, pri katerih lahko pride do motenj v metabolizmu in pa proteini, ki so toksični za gostiteljsko celico.
Obstaja optimalna stopnja izražanja, ki da maksimalno količino produkta in to želimo doseči z uravnavanjem nivoja izražanja rekombinantnega proteina.

== '''Ekspresijski sistemi, ki omogočajo regulirano izražanje gena''' ==
Obstaja že nekaj sistemov, ki omogočajo bolj natančno regulacijo stopnje izražanja.
Pripravili so sev z mutiranim laktoznim promotorjem, ki omogoča počasnejše prepisovanje gena, T7 polimerazo lahko inhibiramo z njenim naravnim inhibitorjem T7 lizocimom, ki ga vstavimo pod ramnozni promotor in ga induciramo z L-ramnozo, z ortogonalnimi ribostikali pa lahko uravnavamo nivo translacije.
V tem članku so pripravili nov gostiteljski sev, ki je zmožen razklopiti lastno rast od sinteze rekombinantnega proteina. Celica zaustavi produkcijo lastnih genov in vse metabolne vire in ves sintezni sistem usmeri v produkcijo tarčnega proteina. To tehnologijo so poimenovali enGenes-X-press in jo je ta raziskovalna skupino predstavila v [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00028 drugem članku pred tem]. V tem članku pa so to tehnologijo nadgradili in testirali možnost natančnega uravnavanja stopnje izražanja z uporabo različnih koncentracij L-arabinoze.

== '''Tehnologija enGenes-X-press''' ==
Ustvarili so sev, ki omeji svojo rast in metabolne vire preusmeri v proizvodnjo tarčnega proteina. To so dosegli z izražanjem peptida Gp2. Ta izhaja iz bakteriofaga in deluje kot inhibitor gostiteljske RNA polimeraze. Tako je transkripcija gostiteljskih genov onemogočena in rast celic se ustavi. Tarčni gen na plazmidu pa se prepisuje z ortogonalno T7 polimerazo.
Za pripravo tega seva so vzeli sev E.coli BL21(DE3). Ta že vsebuje zapis za ortogonalno T7 RNA polimerazo na kromosomu pod kontrolo laktoznega promotorja, ki ga induciramo z IPTG.
S homologno rekombinacijo so na kromosom na mestu attTn7 vstavili gen za Gp2 pod arabinozni promotor, ki ga pa induciramo z L-arabinozo.
Izbrisali so še gene arabinoznega operona araBADC, da se arabinoza ne more presnavljati in lahko deluje kot induktor v tem sevu. Ob dodatku arabinoze se bo torej sproži sinteza Gp2, gostiteljska RNA polimeraza je inhibirana in celična rast se ustavi. Z dodatkom IPTG pa se sproži sinteza T7 polimeraze in tarčnega proteina na plazmidu.

== '''Uporaba samo L-arabinoze za natančno uravnavanje izražanja''' ==
V tem članku so ta sistem nadgradili. Namesto uporabe dveh induktorjev (IPTG in L-arabinoze) so uporabili samo L-arabinozo. Pogoj je, da lahko L-arabinoza inducira izražanje laktoznega T7 promotorja, kar so v nekaterih sevih E.coli dokazali že raziskovalci pred njimi.
Za sašijo so vzeli sev E.coli BL21-AI. Ta že vsebuje gen za T7 polimerazo pod arabinoznim promotorjem vključen na mesto araB. S tem je gen araB izbrisan, zato se arabinoza v celici ne more presnavljati in lahko deluje kot induktor.
Dodatno so s homologno rekombinacijo na mesto attTn7 na kromosomu vključili zapis za peptid Gp2 pod arabinozni promotor.
Tako so z L-arabinozo lahko hkrati inducirali izražanje Gp2 in T7 RNA polimeraze.

== '''Karakterizacija''' ==
S spremljanjem kinetike rasti so dokazali, da njihov novi sev, po indukciji upočasni svojo rast.
Z merjenjem fluorescence reporterskega proteina GFP so dokazali, da njihov novi sev, proizvede večjo količino produkta v primerjavi z originalnim sevom.
S pretočno citometrijo so dokazali, da indukcija samo z L-arabinozo ohrani bolj homogeno populacijo celic v primerjavi z indukcijo z IPTG.
Z SDS-PAGE so dokazali, da pri indukciji z nižjo koncentracijo L-arabinoze nastane manj ikluzijskih telesc kot pri indukciji z višjo koncentracijo.
Z izražanjem membranskih proteinov fuziranih z GFP so dokazali, da je ta sev primeren za izražanje membranskih proteinov.

=='''Zaključek'''==
- Z zaustavitvijo rasti celice se sprostijo metabolni viri, sintezni sistem in šaperoni za produkcijo večje količine tarčnega proteina.
- Z različnimi koncentracijami L-arabinoze lahko uravnavamo nivo izražanja tarčnega proteina pod laktoznim T7 promotorjem.
- Sistem je uporaben za produkcijo membranskih proteinov in drugih težavnih proteinov

== '''Viri'''==
1. Stargardt, P., Striedner, G. & Mairhofer, J. Tunable expression rate control of a growth-decoupled T7 expression system by L-arabinose only. Microb Cell Fact 20, 27 (2021). https://doi.org/10.1186/s12934-021-01512-7

2. Patrick Stargardt, Lukas Feuchtenhofer, Monika Cserjan-Puschmann, Gerald Striedner, and Juergen Mairhofer: Bacteriophage Inspired Growth-Decoupled Recombinant Protein Production in Escherichia coli. ACS Synthetic Biology 2020 9 (6), 1336-1348

3. Sørensen, H.P., Mortensen, K.K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb Cell Fact 4, 1 (2005). https://doi.org/10.1186/1475-2859-4-1

4. Narayanan N, Hsieh M, Xu Y, Chou CP. Arabinose-induction of lac-derived promoter systems for penicillin acylase production in Escherichia coli. Biotechnol Prog. 2006;22:617–25.
Morra, R., Shankar, J., Robinson, C. J., Halliwell, S., Butler, L., Upton, M., … Dixon, N. (2015). Dual transcriptional-translational cascade permits cellular level tuneable expression control. Nucleic Acids Research, 44(3), e21–e21. doi:10.1093/nar/gkv912

5. Lin, W.-J.; Huang, S.-W.; Chou, C. P. DegP coexpression minimizes inclusion body formation upon overproduction of recombinant penicillin acylase in Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 2001, 73, 484-492.

Regulacija stopnje izražanja z L-arabinozo v ekspresijskem sistemu T7 z razklopljeno rastjo

2021-05-12T11:21:35Z

Marusamismas:

''Povzeto po članku:'' [https://www.pnas.org/content/pnas/101/17/6355.full.pdf Stargardt, P., Striedner, G. & Mairhofer, J. Tunable expression rate control of a growth-decoupled T7 expression system by L-arabinose only. Microb Cell Fact 20, 27 (2021).]

== '''Uvod''' ==
Pri izražanju rekombinantnih proteinov želimo pridobiti čim več topnega in funkcionalnega produkta, vendar v gostiteljskih celicah zaradi visoke stopnje izražanja rekombinantnega proteina lahko hitro pride do porabe aminokislin, do stresnega odziva celice ali pa se rekombinantni protein začne kopičiti v obliki netopnih agregatov oziroma inkluzijskih telesc. P
Še posebej težavni so membranski proteini, pri katerih hitro pride do nasičenosti kapacitete transporta v periplazmo ali zunanjo membrano, encimi, pri katerih lahko pride do motenj v metabolizmu in pa proteini, ki so toksični za gostiteljsko celico.
Obstaja optimalna stopnja izražanja, ki da maksimalno količino produkta in to želimo doseči z uravnavanjem nivoja izražanja rekombinantnega proteina.

== '''Ekspresijski sistemi, ki omogočajo regulirano izražanje gena''' ==
Obstaja že nekaj sistemov, ki omogočajo bolj natančno regulacijo stopnje izražanja.
Pripravili so sev z mutiranim laktoznim promotorjem, ki omogoča počasnejše prepisovanje gena, T7 polimerazo lahko inhibiramo z njenim naravnim inhibitorjem T7 lizocimom, ki ga vstavimo pod ramnozni promotor in ga induciramo z L-ramnozo, z ortogonalnimi ribostikali pa lahko uravnavamo nivo translacije.
V tem članku so pripravili nov gostiteljski sev, ki je zmožen razklopiti lastno rast od sinteze rekombinantnega proteina. Celica zaustavi produkcijo lastnih genov in vse metabolne vire in ves sintezni sistem usmeri v produkcijo tarčnega proteina. To tehnologijo so poimenovali enGenes-X-press in jo je ta raziskovalna skupino predstavila v [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00028 drugem članku pred tem]. V tem članku pa so to tehnologijo nadgradili in testirali možnost natančnega uravnavanja stopnje izražanja z uporabo različnih koncentracij L-arabinoze.

== '''Tehnologija enGenes-X-press''' ==
Ustvarili so sev, ki omeji svojo rast in metabolne vire preusmeri v proizvodnjo tarčnega proteina. To so dosegli z izražanjem peptida Gp2. Ta izhaja iz bakteriofaga in deluje kot inhibitor gostiteljske RNA polimeraze. Tako je transkripcija gostiteljskih genov onemogočena in rast celic se ustavi. Tarčni gen na plazmidu pa se prepisuje z ortogonalno T7 polimerazo.
Za pripravo tega seva so vzeli sev E.coli BL21(DE3). Ta že vsebuje zapis za ortogonalno T7 RNA polimerazo na kromosomu pod kontrolo laktoznega promotorja, ki ga induciramo z IPTG.
S homologno rekombinacijo so na kromosom na mestu attTn7 vstavili gen za Gp2 pod arabinozni promotor, ki ga pa induciramo z L-arabinozo.
Izbrisali so še gene arabinoznega operona araBADC, da se arabinoza ne more presnavljati in lahko deluje kot induktor v tem sevu. Ob dodatku arabinoze se bo torej sproži sinteza Gp2, gostiteljska RNA polimeraza je inhibirana in celična rast se ustavi. Z dodatkom IPTG pa se sproži sinteza T7 polimeraze in tarčnega proteina na plazmidu.

== '''Uporaba samo L-arabinoze za natančno uravnavanje izražanja''' ==
V tem članku so ta sistem nadgradili. Namesto uporabe dveh induktorjev (IPTG in L-arabinoze) so uporabili samo L-arabinozo. Pogoj je, da lahko L-arabinoza inducira izražanje laktoznega T7 promotorja, kar so v nekaterih sevih E.coli dokazali že raziskovalci pred njimi.
Za sašijo so vzeli sev E.coli BL21-AI. Ta že vsebuje gen za T7 polimerazo pod arabinoznim promotorjem vključen na mesto araB. S tem je gen araB izbrisan, zato se arabinoza v celici ne more presnavljati in lahko deluje kot induktor.
Dodatno so s homologno rekombinacijo na mesto attTn7 na kromosomu vključili zapis za peptid Gp2 pod arabinozni promotor.
Tako so z L-arabinozo lahko hkrati inducirali izražanje Gp2 in T7 RNA polimeraze.

== '''Karakterizacija''' ==
S spremljanjem kinetike rasti so dokazali, da njihov novi sev, po indukciji upočasni svojo rast.
Z merjenjem fluorescence reporterskega proteina GFP so dokazali, da njihov novi sev, proizvede večjo količino produkta v primerjavi z originalnim sevom.
S pretočno citometrijo so dokazali, da indukcija samo z L-arabinozo ohrani bolj homogeno populacijo celic v primerjavi z indukcijo z IPTG.
Z SDS-PAGE so dokazali, da pri indukciji z nižjo koncentracijo L-arabinoze nastane manj ikluzijskih telesc kot pri indukciji z višjo koncentracijo.
Z izražanjem membranskih proteinov fuziranih z GFP so dokazali, da je ta sev primeren za izražanje membranskih proteinov.

=='''Zaključek'''==
- Z zaustavitvijo rasti celice se sprostijo metabolni viri, sintezni sistem in šaperoni za produkcijo večje količine tarčnega proteina.
- Z različnimi koncentracijami L-arabinoze lahko uravnavamo nivo izražanja tarčnega proteina pod laktoznim T7 promotorjem.
- Sistem je uporaben za produkcijo membranskih proteinov in drugih težavnih proteinov

== '''Viri'''==
1. Stargardt, P., Striedner, G. & Mairhofer, J. Tunable expression rate control of a growth-decoupled T7 expression system by L-arabinose only. Microb Cell Fact 20, 27 (2021). https://doi.org/10.1186/s12934-021-01512-7

2. Patrick Stargardt, Lukas Feuchtenhofer, Monika Cserjan-Puschmann, Gerald Striedner, and Juergen Mairhofer: Bacteriophage Inspired Growth-Decoupled Recombinant Protein Production in Escherichia coli. ACS Synthetic Biology 2020 9 (6), 1336-1348

3. Sørensen, H.P., Mortensen, K.K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb Cell Fact 4, 1 (2005). https://doi.org/10.1186/1475-2859-4-1

4. Narayanan N, Hsieh M, Xu Y, Chou CP. Arabinose-induction of lac-derived promoter systems for penicillin acylase production in Escherichia coli. Biotechnol Prog. 2006;22:617–25.
Morra, R., Shankar, J., Robinson, C. J., Halliwell, S., Butler, L., Upton, M., … Dixon, N. (2015). Dual transcriptional-translational cascade permits cellular level tuneable expression control. Nucleic Acids Research, 44(3), e21–e21. doi:10.1093/nar/gkv912

5. Lin, W.-J.; Huang, S.-W.; Chou, C. P. DegP coexpression minimizes inclusion body formation upon overproduction of recombinant penicillin acylase in Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 2001, 73, 484-492.

Regulacija stopnje izražanja z L-arabinozo v ekspresijskem sistemu T7 z razklopljeno rastjo

2021-05-12T11:21:16Z

Marusamismas:

''Povzeto po članku:'' [https://www.pnas.org/content/pnas/101/17/6355.full.pdf Stargardt, P., Striedner, G. & Mairhofer, J. Tunable expression rate control of a growth-decoupled T7 expression system by L-arabinose only. Microb Cell Fact 20, 27 (2021).]

== '''Uvod''' ==
Pri izražanju rekombinantnih proteinov želimo pridobiti čim več topnega in funkcionalnega produkta, vendar v gostiteljskih celicah zaradi visoke stopnje izražanja rekombinantnega proteina lahko hitro pride do porabe aminokislin, do stresnega odziva celice ali pa se rekombinantni protein začne kopičiti v obliki netopnih agregatov oziroma inkluzijskih telesc. P
Še posebej težavni so membranski proteini, pri katerih hitro pride do nasičenosti kapacitete transporta v periplazmo ali zunanjo membrano, encimi, pri katerih lahko pride do motenj v metabolizmu in pa proteini, ki so toksični za gostiteljsko celico.
Obstaja optimalna stopnja izražanja, ki da maksimalno količino produkta in to želimo doseči z uravnavanjem nivoja izražanja rekombinantnega proteina.

== '''Ekspresijski sistemi, ki omogočajo regulirano izražanje gena''' ==
Obstaja že nekaj sistemov, ki omogočajo bolj natančno regulacijo stopnje izražanja.
Pripravili so sev z mutiranim laktoznim promotorjem, ki omogoča počasnejše prepisovanje gena, T7 polimerazo lahko inhibiramo z njenim naravnim inhibitorjem T7 lizocimom, ki ga vstavimo pod ramnozni promotor in ga induciramo z L-ramnozo, z ortogonalnimi ribostikali pa lahko uravnavamo nivo translacije.
V tem članku so pripravili nov gostiteljski sev, ki je zmožen razklopiti lastno rast od sinteze rekombinantnega proteina. Celica zaustavi produkcijo lastnih genov in vse metabolne vire in ves sintezni sistem usmeri v produkcijo tarčnega proteina. To tehnologijo so poimenovali enGenes-X-press in jo je ta raziskovalna skupino predstavila v [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00028 drugem članku pred tem]. V tem članku pa so to tehnologijo nadgradili in testirali možnost natančnega uravnavanja stopnje izražanja z uporabo različnih koncentracij L-arabinoze.

== '''Tehnologija enGenes-X-press''' ==
Ustvarili so sev, ki omeji svojo rast in metabolne vire preusmeri v proizvodnjo tarčnega proteina. To so dosegli z izražanjem peptida Gp2. Ta izhaja iz bakteriofaga in deluje kot inhibitor gostiteljske RNA polimeraze. Tako je transkripcija gostiteljskih genov onemogočena in rast celic se ustavi. Tarčni gen na plazmidu pa se prepisuje z ortogonalno T7 polimerazo.
Za pripravo tega seva so vzeli sev E.coli BL21(DE3). Ta že vsebuje zapis za ortogonalno T7 RNA polimerazo na kromosomu pod kontrolo laktoznega promotorja, ki ga induciramo z IPTG.
S homologno rekombinacijo so na kromosom na mestu attTn7 vstavili gen za Gp2 pod arabinozni promotor, ki ga pa induciramo z L-arabinozo.
Izbrisali so še gene arabinoznega operona araBADC, da se arabinoza ne more presnavljati in lahko deluje kot induktor v tem sevu. Ob dodatku arabinoze se bo torej sproži sinteza Gp2, gostiteljska RNA polimeraza je inhibirana in celična rast se ustavi. Z dodatkom IPTG pa se sproži sinteza T7 polimeraze in tarčnega proteina na plazmidu.

== '''Uporaba samo L-arabinoze za natančno uravnavanje izražanja''' ==
V tem članku so ta sistem nadgradili. Namesto uporabe dveh induktorjev (IPTG in L-arabinoze) so uporabili samo L-arabinozo. Pogoj je, da lahko L-arabinoza inducira izražanje laktoznega T7 promotorja, kar so v nekaterih sevih E.coli dokazali že raziskovalci pred njimi.
Za sašijo so vzeli sev E.coli BL21-AI. Ta že vsebuje gen za T7 polimerazo pod arabinoznim promotorjem vključen na mesto araB. S tem je gen araB izbrisan, zato se arabinoza v celici ne more presnavljati in lahko deluje kot induktor.
Dodatno so s homologno rekombinacijo na mesto attTn7 na kromosomu vključili zapis za peptid Gp2 pod arabinozni promotor.
Tako so z L-arabinozo lahko hkrati inducirali izražanje Gp2 in T7 RNA polimeraze.

== '''Karakterizacija''' ==
S spremljanjem kinetike rasti so dokazali, da njihov novi sev, po indukciji upočasni svojo rast.
Z merjenjem fluorescence reporterskega proteina GFP so dokazali, da njihov novi sev, proizvede večjo količino produkta v primerjavi z originalnim sevom.
S pretočno citometrijo so dokazali, da indukcija samo z L-arabinozo ohrani bolj homogeno populacijo celic v primerjavi z indukcijo z IPTG.
Z SDS-PAGE so dokazali, da pri indukciji z nižjo koncentracijo L-arabinoze nastane manj ikluzijskih telesc kot pri indukciji z višjo koncentracijo.
Z izražanjem membranskih proteinov fuziranih z GFP so dokazali, da je ta sev primeren za izražanje membranskih proteinov.

=='''Zaključek'''==
- Z zaustavitvijo rasti celice se sprostijo metabolni viri, sintezni sistem in šaperoni za produkcijo večje količine tarčnega proteina.
- Z različnimi koncentracijami L-arabinoze lahko uravnavamo nivo izražanja tarčnega proteina pod laktoznim T7 promotorjem.
- Sistem je uporaben za produkcijo membranskih proteinov in drugih težavnih proteinov

== '''Viri'''==
1. Stargardt, P., Striedner, G. & Mairhofer, J. Tunable expression rate control of a growth-decoupled T7 expression system by L-arabinose only. Microb Cell Fact 20, 27 (2021). https://doi.org/10.1186/s12934-021-01512-7

2. Patrick Stargardt, Lukas Feuchtenhofer, Monika Cserjan-Puschmann, Gerald Striedner, and Juergen Mairhofer: Bacteriophage Inspired Growth-Decoupled Recombinant Protein Production in Escherichia coli. ACS Synthetic Biology 2020 9 (6), 1336-1348

3. Sørensen, H.P., Mortensen, K.K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb Cell Fact 4, 1 (2005). https://doi.org/10.1186/1475-2859-4-1

4. Narayanan N, Hsieh M, Xu Y, Chou CP. Arabinose-induction of lac-derived promoter systems for penicillin acylase production in Escherichia coli. Biotechnol Prog. 2006;22:617–25.
Morra, R., Shankar, J., Robinson, C. J., Halliwell, S., Butler, L., Upton, M., … Dixon, N. (2015). Dual transcriptional-translational cascade permits cellular level tuneable expression control. Nucleic Acids Research, 44(3), e21–e21. doi:10.1093/nar/gkv912

5. Lin, W.-J.; Huang, S.-W.; Chou, C. P. DegP coexpression minimizes inclusion body formation upon overproduction of recombinant penicillin acylase in Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 2001, 73, 484-492.

Regulacija stopnje izražanja z L-arabinozo v ekspresijskem sistemu T7 z razklopljeno rastjo

2021-05-12T11:20:31Z

Marusamismas:

''Povzeto po članku:'' [https://www.pnas.org/content/pnas/101/17/6355.full.pdf Stargardt, P., Striedner, G. & Mairhofer, J. Tunable expression rate control of a growth-decoupled T7 expression system by L-arabinose only. Microb Cell Fact 20, 27 (2021).]

== '''Uvod''' ==
Pri izražanju rekombinantnih proteinov želimo pridobiti čim več topnega in funkcionalnega produkta, vendar v gostiteljskih celicah zaradi visoke stopnje izražanja rekombinantnega proteina lahko hitro pride do porabe aminokislin, do stresnega odziva celice ali pa se rekombinantni protein začne kopičiti v obliki netopnih agregatov oziroma inkluzijskih telesc. P
Še posebej težavni so membranski proteini, pri katerih hitro pride do nasičenosti kapacitete transporta v periplazmo ali zunanjo membrano, encimi, pri katerih lahko pride do motenj v metabolizmu in pa proteini, ki so toksični za gostiteljsko celico.
Obstaja optimalna stopnja izražanja, ki da maksimalno količino produkta in to želimo doseči z uravnavanjem nivoja izražanja rekombinantnega proteina.

== '''Ekspresijski sistemi, ki omogočajo regulirano izražanje gena''' ==
Obstaja že nekaj sistemov, ki omogočajo bolj natančno regulacijo stopnje izražanja.
Pripravili so sev z mutiranim laktoznim promotorjem, ki omogoča počasnejše prepisovanje gena, T7 polimerazo lahko inhibiramo z njenim naravnim inhibitorjem T7 lizocimom, ki ga vstavimo pod ramnozni promotor in ga induciramo z L-ramnozo, z ortogonalnimi ribostikali pa lahko uravnavamo nivo translacije.
V tem članku so pripravili nov gostiteljski sev, ki je zmožen razklopiti lastno rast od sinteze rekombinantnega proteina. Celica zaustavi produkcijo lastnih genov in vse metabolne vire in ves sintezni sistem usmeri v produkcijo tarčnega proteina. To tehnologijo so poimenovali enGenes-X-press in jo je ta raziskovalna skupino predstavila v [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00028 drugem članku pred tem]. V tem članku pa so to tehnologijo nadgradili in testirali možnost natančnega uravnavanja stopnje izražanja z uporabo različnih koncentracij L-arabinoze.

== '''Tehnologija enGenes-X-press''' ==
Ustvarili so sev, ki omeji svojo rast in metabolne vire preusmeri v proizvodnjo tarčnega proteina. To so dosegli z izražanjem peptida Gp2. Ta izhaja iz bakteriofaga in deluje kot inhibitor gostiteljske RNA polimeraze. Tako je transkripcija gostiteljskih genov onemogočena in rast celic se ustavi. Tarčni gen na plazmidu pa se prepisuje z ortogonalno T7 polimerazo.
Za pripravo tega seva so vzeli sev E.coli BL21(DE3). Ta že vsebuje zapis za ortogonalno T7 RNA polimerazo na kromosomu pod kontrolo laktoznega promotorja, ki ga induciramo z IPTG.
S homologno rekombinacijo so na kromosom na mestu attTn7 vstavili gen za Gp2 pod arabinozni promotor, ki ga pa induciramo z L-arabinozo.
Izbrisali so še gene arabinoznega operona araBADC, da se arabinoza ne more presnavljati in lahko deluje kot induktor v tem sevu. Ob dodatku arabinoze se bo torej sproži sinteza Gp2, gostiteljska RNA polimeraza je inhibirana in celična rast se ustavi. Z dodatkom IPTG pa se sproži sinteza T7 polimeraze in tarčnega proteina na plazmidu.

== '''Uporaba samo L-arabinoze za natančno uravnavanje izražanja''' ==
V tem članku so ta sistem nadgradili. Namesto uporabe dveh induktorjev (IPTG in L-arabinoze) so uporabili samo L-arabinozo. Pogoj je, da lahko L-arabinoza inducira izražanje laktoznega T7 promotorja, kar so v nekaterih sevih E.coli dokazali že raziskovalci pred njimi.
Za sašijo so vzeli sev E.coli BL21-AI. Ta že vsebuje gen za T7 polimerazo pod arabinoznim promotorjem vključen na mesto araB. S tem je gen araB izbrisan, zato se arabinoza v celici ne more presnavljati in lahko deluje kot induktor.
Dodatno so s homologno rekombinacijo na mesto attTn7 na kromosomu vključili zapis za peptid Gp2 pod arabinozni promotor.
Tako so z L-arabinozo lahko hkrati inducirali izražanje Gp2 in T7 RNA polimeraze.

== '''Karakterizacija''' ==
S spremljanjem kinetike rasti so dokazali, da njihov novi sev, po indukciji upočasni svojo rast.
Z merjenjem fluorescence reporterskega proteina GFP so dokazali, da njihov novi sev, proizvede večjo količino produkta v primerjavi z originalnim sevom.
S pretočno citometrijo so dokazali, da indukcija samo z L-arabinozo ohrani bolj homogeno populacijo celic v primerjavi z indukcijo z IPTG.
Z SDS-PAGE so dokazali, da pri indukciji z nižjo koncentracijo L-arabinoze nastane manj ikluzijskih telesc kot pri indukciji z višjo koncentracijo.
Z izražanjem membranskih proteinov fuziranih z GFP so dokazali, da je ta sev primeren za izražanje membranskih proteinov.

=='''Zaključek'''==
- Z zaustavitvijo rasti celice se sprostijo metabolni viri, sintezni sistem in šaperoni za produkcijo večje količine tarčnega proteina.
- Z različnimi koncentracijami L-arabinoze lahko uravnavamo nivo izražanja tarčnega proteina pod laktoznim T7 promotorjem.
- Sistem je uporaben za produkcijo membranskih proteinov in drugih težavnih proteinov

== '''Viri'''==
1. Stargardt, P., Striedner, G. & Mairhofer, J. Tunable expression rate control of a growth-decoupled T7 expression system by L-arabinose only. Microb Cell Fact 20, 27 (2021). https://doi.org/10.1186/s12934-021-01512-7
2. Patrick Stargardt, Lukas Feuchtenhofer, Monika Cserjan-Puschmann, Gerald Striedner, and Juergen Mairhofer: Bacteriophage Inspired Growth-Decoupled Recombinant Protein Production in Escherichia coli. ACS Synthetic Biology 2020 9 (6), 1336-1348
3. Sørensen, H.P., Mortensen, K.K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb Cell Fact 4, 1 (2005). https://doi.org/10.1186/1475-2859-4-1
4. Narayanan N, Hsieh M, Xu Y, Chou CP. Arabinose-induction of lac-derived promoter systems for penicillin acylase production in Escherichia coli. Biotechnol Prog. 2006;22:617–25.
Morra, R., Shankar, J., Robinson, C. J., Halliwell, S., Butler, L., Upton, M., … Dixon, N. (2015). Dual transcriptional-translational cascade permits cellular level tuneable expression control. Nucleic Acids Research, 44(3), e21–e21. doi:10.1093/nar/gkv912
5. Lin, W.-J.; Huang, S.-W.; Chou, C. P. DegP coexpression minimizes inclusion body formation upon overproduction of recombinant penicillin acylase in Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 2001, 73, 484-492.

Regulacija stopnje izražanja z L-arabinozo v ekspresijskem sistemu T7 z razklopljeno rastjo

2021-05-12T11:20:18Z

Marusamismas:

''Povzeto po članku:''[https://www.pnas.org/content/pnas/101/17/6355.full.pdf Stargardt, P., Striedner, G. & Mairhofer, J. Tunable expression rate control of a growth-decoupled T7 expression system by L-arabinose only. Microb Cell Fact 20, 27 (2021).]

== '''Uvod''' ==
Pri izražanju rekombinantnih proteinov želimo pridobiti čim več topnega in funkcionalnega produkta, vendar v gostiteljskih celicah zaradi visoke stopnje izražanja rekombinantnega proteina lahko hitro pride do porabe aminokislin, do stresnega odziva celice ali pa se rekombinantni protein začne kopičiti v obliki netopnih agregatov oziroma inkluzijskih telesc. P
Še posebej težavni so membranski proteini, pri katerih hitro pride do nasičenosti kapacitete transporta v periplazmo ali zunanjo membrano, encimi, pri katerih lahko pride do motenj v metabolizmu in pa proteini, ki so toksični za gostiteljsko celico.
Obstaja optimalna stopnja izražanja, ki da maksimalno količino produkta in to želimo doseči z uravnavanjem nivoja izražanja rekombinantnega proteina.

== '''Ekspresijski sistemi, ki omogočajo regulirano izražanje gena''' ==
Obstaja že nekaj sistemov, ki omogočajo bolj natančno regulacijo stopnje izražanja.
Pripravili so sev z mutiranim laktoznim promotorjem, ki omogoča počasnejše prepisovanje gena, T7 polimerazo lahko inhibiramo z njenim naravnim inhibitorjem T7 lizocimom, ki ga vstavimo pod ramnozni promotor in ga induciramo z L-ramnozo, z ortogonalnimi ribostikali pa lahko uravnavamo nivo translacije.
V tem članku so pripravili nov gostiteljski sev, ki je zmožen razklopiti lastno rast od sinteze rekombinantnega proteina. Celica zaustavi produkcijo lastnih genov in vse metabolne vire in ves sintezni sistem usmeri v produkcijo tarčnega proteina. To tehnologijo so poimenovali enGenes-X-press in jo je ta raziskovalna skupino predstavila v [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00028 drugem članku pred tem]. V tem članku pa so to tehnologijo nadgradili in testirali možnost natančnega uravnavanja stopnje izražanja z uporabo različnih koncentracij L-arabinoze.

== '''Tehnologija enGenes-X-press''' ==
Ustvarili so sev, ki omeji svojo rast in metabolne vire preusmeri v proizvodnjo tarčnega proteina. To so dosegli z izražanjem peptida Gp2. Ta izhaja iz bakteriofaga in deluje kot inhibitor gostiteljske RNA polimeraze. Tako je transkripcija gostiteljskih genov onemogočena in rast celic se ustavi. Tarčni gen na plazmidu pa se prepisuje z ortogonalno T7 polimerazo.
Za pripravo tega seva so vzeli sev E.coli BL21(DE3). Ta že vsebuje zapis za ortogonalno T7 RNA polimerazo na kromosomu pod kontrolo laktoznega promotorja, ki ga induciramo z IPTG.
S homologno rekombinacijo so na kromosom na mestu attTn7 vstavili gen za Gp2 pod arabinozni promotor, ki ga pa induciramo z L-arabinozo.
Izbrisali so še gene arabinoznega operona araBADC, da se arabinoza ne more presnavljati in lahko deluje kot induktor v tem sevu. Ob dodatku arabinoze se bo torej sproži sinteza Gp2, gostiteljska RNA polimeraza je inhibirana in celična rast se ustavi. Z dodatkom IPTG pa se sproži sinteza T7 polimeraze in tarčnega proteina na plazmidu.

== '''Uporaba samo L-arabinoze za natančno uravnavanje izražanja''' ==
V tem članku so ta sistem nadgradili. Namesto uporabe dveh induktorjev (IPTG in L-arabinoze) so uporabili samo L-arabinozo. Pogoj je, da lahko L-arabinoza inducira izražanje laktoznega T7 promotorja, kar so v nekaterih sevih E.coli dokazali že raziskovalci pred njimi.
Za sašijo so vzeli sev E.coli BL21-AI. Ta že vsebuje gen za T7 polimerazo pod arabinoznim promotorjem vključen na mesto araB. S tem je gen araB izbrisan, zato se arabinoza v celici ne more presnavljati in lahko deluje kot induktor.
Dodatno so s homologno rekombinacijo na mesto attTn7 na kromosomu vključili zapis za peptid Gp2 pod arabinozni promotor.
Tako so z L-arabinozo lahko hkrati inducirali izražanje Gp2 in T7 RNA polimeraze.

== '''Karakterizacija''' ==
S spremljanjem kinetike rasti so dokazali, da njihov novi sev, po indukciji upočasni svojo rast.
Z merjenjem fluorescence reporterskega proteina GFP so dokazali, da njihov novi sev, proizvede večjo količino produkta v primerjavi z originalnim sevom.
S pretočno citometrijo so dokazali, da indukcija samo z L-arabinozo ohrani bolj homogeno populacijo celic v primerjavi z indukcijo z IPTG.
Z SDS-PAGE so dokazali, da pri indukciji z nižjo koncentracijo L-arabinoze nastane manj ikluzijskih telesc kot pri indukciji z višjo koncentracijo.
Z izražanjem membranskih proteinov fuziranih z GFP so dokazali, da je ta sev primeren za izražanje membranskih proteinov.

=='''Zaključek'''==
- Z zaustavitvijo rasti celice se sprostijo metabolni viri, sintezni sistem in šaperoni za produkcijo večje količine tarčnega proteina.
- Z različnimi koncentracijami L-arabinoze lahko uravnavamo nivo izražanja tarčnega proteina pod laktoznim T7 promotorjem.
- Sistem je uporaben za produkcijo membranskih proteinov in drugih težavnih proteinov

== '''Viri'''==
1. Stargardt, P., Striedner, G. & Mairhofer, J. Tunable expression rate control of a growth-decoupled T7 expression system by L-arabinose only. Microb Cell Fact 20, 27 (2021). https://doi.org/10.1186/s12934-021-01512-7
2. Patrick Stargardt, Lukas Feuchtenhofer, Monika Cserjan-Puschmann, Gerald Striedner, and Juergen Mairhofer: Bacteriophage Inspired Growth-Decoupled Recombinant Protein Production in Escherichia coli. ACS Synthetic Biology 2020 9 (6), 1336-1348
3. Sørensen, H.P., Mortensen, K.K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb Cell Fact 4, 1 (2005). https://doi.org/10.1186/1475-2859-4-1
4. Narayanan N, Hsieh M, Xu Y, Chou CP. Arabinose-induction of lac-derived promoter systems for penicillin acylase production in Escherichia coli. Biotechnol Prog. 2006;22:617–25.
Morra, R., Shankar, J., Robinson, C. J., Halliwell, S., Butler, L., Upton, M., … Dixon, N. (2015). Dual transcriptional-translational cascade permits cellular level tuneable expression control. Nucleic Acids Research, 44(3), e21–e21. doi:10.1093/nar/gkv912
5. Lin, W.-J.; Huang, S.-W.; Chou, C. P. DegP coexpression minimizes inclusion body formation upon overproduction of recombinant penicillin acylase in Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 2001, 73, 484-492.

Regulacija stopnje izražanja z L-arabinozo v ekspresijskem sistemu T7 z razklopljeno rastjo

2021-05-12T11:18:58Z

Marusamismas: New page: ''Povzeto po članku:''[https://www.pnas.org/content/pnas/101/17/6355.full.pdf] == '''Uvod''' == Pri izražanju rekombinantnih proteinov želimo pridobiti čim več topnega in funkcionaln...

''Povzeto po članku:''[https://www.pnas.org/content/pnas/101/17/6355.full.pdf]

== '''Uvod''' ==
Pri izražanju rekombinantnih proteinov želimo pridobiti čim več topnega in funkcionalnega produkta, vendar v gostiteljskih celicah zaradi visoke stopnje izražanja rekombinantnega proteina lahko hitro pride do porabe aminokislin, do stresnega odziva celice ali pa se rekombinantni protein začne kopičiti v obliki netopnih agregatov oziroma inkluzijskih telesc. P
Še posebej težavni so membranski proteini, pri katerih hitro pride do nasičenosti kapacitete transporta v periplazmo ali zunanjo membrano, encimi, pri katerih lahko pride do motenj v metabolizmu in pa proteini, ki so toksični za gostiteljsko celico.
Obstaja optimalna stopnja izražanja, ki da maksimalno količino produkta in to želimo doseči z uravnavanjem nivoja izražanja rekombinantnega proteina.

== '''Ekspresijski sistemi, ki omogočajo regulirano izražanje gena''' ==
Obstaja že nekaj sistemov, ki omogočajo bolj natančno regulacijo stopnje izražanja.
Pripravili so sev z mutiranim laktoznim promotorjem, ki omogoča počasnejše prepisovanje gena, T7 polimerazo lahko inhibiramo z njenim naravnim inhibitorjem T7 lizocimom, ki ga vstavimo pod ramnozni promotor in ga induciramo z L-ramnozo, z ortogonalnimi ribostikali pa lahko uravnavamo nivo translacije.
V tem članku so pripravili nov gostiteljski sev, ki je zmožen razklopiti lastno rast od sinteze rekombinantnega proteina. Celica zaustavi produkcijo lastnih genov in vse metabolne vire in ves sintezni sistem usmeri v produkcijo tarčnega proteina. To tehnologijo so poimenovali enGenes-X-press in jo je ta raziskovalna skupino predstavila v [https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00028 drugem članku pred tem]. V tem članku pa so to tehnologijo nadgradili in testirali možnost natančnega uravnavanja stopnje izražanja z uporabo različnih koncentracij L-arabinoze.

== '''Tehnologija enGenes-X-press''' ==
Ustvarili so sev, ki omeji svojo rast in metabolne vire preusmeri v proizvodnjo tarčnega proteina. To so dosegli z izražanjem peptida Gp2. Ta izhaja iz bakteriofaga in deluje kot inhibitor gostiteljske RNA polimeraze. Tako je transkripcija gostiteljskih genov onemogočena in rast celic se ustavi. Tarčni gen na plazmidu pa se prepisuje z ortogonalno T7 polimerazo.
Za pripravo tega seva so vzeli sev E.coli BL21(DE3). Ta že vsebuje zapis za ortogonalno T7 RNA polimerazo na kromosomu pod kontrolo laktoznega promotorja, ki ga induciramo z IPTG.
S homologno rekombinacijo so na kromosom na mestu attTn7 vstavili gen za Gp2 pod arabinozni promotor, ki ga pa induciramo z L-arabinozo.
Izbrisali so še gene arabinoznega operona araBADC, da se arabinoza ne more presnavljati in lahko deluje kot induktor v tem sevu. Ob dodatku arabinoze se bo torej sproži sinteza Gp2, gostiteljska RNA polimeraza je inhibirana in celična rast se ustavi. Z dodatkom IPTG pa se sproži sinteza T7 polimeraze in tarčnega proteina na plazmidu.

== '''Uporaba samo L-arabinoze za natančno uravnavanje izražanja''' ==
V tem članku so ta sistem nadgradili. Namesto uporabe dveh induktorjev (IPTG in L-arabinoze) so uporabili samo L-arabinozo. Pogoj je, da lahko L-arabinoza inducira izražanje laktoznega T7 promotorja, kar so v nekaterih sevih E.coli dokazali že raziskovalci pred njimi.
Za sašijo so vzeli sev E.coli BL21-AI. Ta že vsebuje gen za T7 polimerazo pod arabinoznim promotorjem vključen na mesto araB. S tem je gen araB izbrisan, zato se arabinoza v celici ne more presnavljati in lahko deluje kot induktor.
Dodatno so s homologno rekombinacijo na mesto attTn7 na kromosomu vključili zapis za peptid Gp2 pod arabinozni promotor.
Tako so z L-arabinozo lahko hkrati inducirali izražanje Gp2 in T7 RNA polimeraze.

== '''Karakterizacija''' ==
S spremljanjem kinetike rasti so dokazali, da njihov novi sev, po indukciji upočasni svojo rast.
Z merjenjem fluorescence reporterskega proteina GFP so dokazali, da njihov novi sev, proizvede večjo količino produkta v primerjavi z originalnim sevom.
S pretočno citometrijo so dokazali, da indukcija samo z L-arabinozo ohrani bolj homogeno populacijo celic v primerjavi z indukcijo z IPTG.
Z SDS-PAGE so dokazali, da pri indukciji z nižjo koncentracijo L-arabinoze nastane manj ikluzijskih telesc kot pri indukciji z višjo koncentracijo.
Z izražanjem membranskih proteinov fuziranih z GFP so dokazali, da je ta sev primeren za izražanje membranskih proteinov.

=='''Zaključek'''==
- Z zaustavitvijo rasti celice se sprostijo metabolni viri, sintezni sistem in šaperoni za produkcijo večje količine tarčnega proteina.
- Z različnimi koncentracijami L-arabinoze lahko uravnavamo nivo izražanja tarčnega proteina pod laktoznim T7 promotorjem.
- Sistem je uporaben za produkcijo membranskih proteinov in drugih težavnih proteinov

== '''Viri'''==
1. Stargardt, P., Striedner, G. & Mairhofer, J. Tunable expression rate control of a growth-decoupled T7 expression system by L-arabinose only. Microb Cell Fact 20, 27 (2021). https://doi.org/10.1186/s12934-021-01512-7
2. Patrick Stargardt, Lukas Feuchtenhofer, Monika Cserjan-Puschmann, Gerald Striedner, and Juergen Mairhofer: Bacteriophage Inspired Growth-Decoupled Recombinant Protein Production in Escherichia coli. ACS Synthetic Biology 2020 9 (6), 1336-1348
3. Sørensen, H.P., Mortensen, K.K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb Cell Fact 4, 1 (2005). https://doi.org/10.1186/1475-2859-4-1
4. Narayanan N, Hsieh M, Xu Y, Chou CP. Arabinose-induction of lac-derived promoter systems for penicillin acylase production in Escherichia coli. Biotechnol Prog. 2006;22:617–25.
Morra, R., Shankar, J., Robinson, C. J., Halliwell, S., Butler, L., Upton, M., … Dixon, N. (2015). Dual transcriptional-translational cascade permits cellular level tuneable expression control. Nucleic Acids Research, 44(3), e21–e21. doi:10.1093/nar/gkv912
5. Lin, W.-J.; Huang, S.-W.; Chou, C. P. DegP coexpression minimizes inclusion body formation upon overproduction of recombinant penicillin acylase in Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 2001, 73, 484-492.