Wiki FKKT - User contributions [en]

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-06T08:16:38Z

Marusasernc: /* Nestrukturni proteini */

== Uvod ==

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

==== Pomen poznavanja genoma ====

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.

==== Mutacije virusov ====

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

==== Primerjava genomov med koronavirusi ====

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.

== Genom Koronavirusov ==

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali zraven zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le teh. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice.
Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne proteine se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

==== Bralni okvirji ====

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1ab (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

==== Nestrukturni proteini ====

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov.
Poznamo dva načina cepitve poliproteinov.
V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.

Nestrukturni proteini 2 - 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini.
Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze.
Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse (glej uvod). Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu.
Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

==== Strukturni N protein ====

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

==Življenjski cikel virusa v celici==

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljskimi faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celično membrano in nato takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih veziklov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

==Replikacija==

Koronavirusi se od ostalih virusov razlikujejo po unikatni strategiji replikacije. Replikacija virusnih RNA sledi za translacijo in oblikovanjem RTC kompleksa. Ko replikacijsko transkripcijski kompleks interagira z koronavirusno RNA(+) se začne replikacija RNA molekul. Nastane RNA(-), s katero se lahko zgodita 2 stvari; kot prvo lahko poteče replikacija in se zopet sintetizira RNA(+) molekula, ki je identična molekuli, ki je prišla v celico iz virusa. Ta se lahko porabi za translacijo in nastanek nestrukturnih proteinov ali pa se zapakira v nove virione in zapusti celico, kot drugo pa lahko poteče diskontinuirna transkripcija. Nastajajo različne subgenomske RNA (sgRNA), s pomočjo od RNA odvisne RNA polimeraze. sgRNA služi tvorbi strukturnih in akcesornih proteinov.
Veliko replikonskih zaporedij je zelo pomembnih pri replikaciji RNA. V 5' UTR koncu genoma je 7 lasničnih zank, ki se razširijo v gen 1a. V 3' UTR koncu pa je izbočena lasnična zanka, psevdovozel in hipervariabilno območje. Lasnična zanka in psevdovozel na 3' koncu se prekrivata in zato ne moreta nastajati enakočasno. Iz tu izhaja ideja, da določene strukture regulirajo različne stopnje RNA sinteze, čeprav podrobnejši mehanizmi delovanja še niso jasni. Bolj raziskan pa je mehanizem nadaljnje replikacije dednega materiala in sicer diskontinuirana transkripcija.
Sama replikacija v veziklih poteka v citosolu gostiteljske celice, sam virus pa kontrolira celoten potek tudi s pomočjo nekaterih virusnih proteinov, ki se prenesejo v jedro gostiteljske celice. Kot vemo, se geni v jedrcu celice izražajo bolj intenzivno, zato tudi položaj genov oz. delov kromosoma vpliva na njihovo prepisovanje. Virusni proteini interagirajo z jedrnimi antigeni in jih prerazporedijo, tako da se intenzivneje sintetizirajo proteini, ki so za virusni življenjski cikel najpomembnejši. Vplivanje na proliferacijo gostiteljske celice je skupna značilnost vseh nidovirusov.

====Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa====

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko-transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Nekaj posameznih struktur je bolj natančno definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

====Zaščitno okolje za replikacijo genskega materiala====

Podrobnejši mehanizem replikacije RNA je žal neznanka, je pa znano kje poteka replikacija (in tudi transkripcija) RNA. Nekatere študije zatrjujejo, da vezikli z dvojno membrano izvirajo iz endoplazemskega retikuluma, spet druge trdijo, da ti vezikli nastanejo kot produkti makrofagov, katerim manjka ATG5 (ključna komponenta avtofagosomov). Vsekakor pa njihova formacija vključuje ukrivljanje membran, kar je lahko ključno za insercijo virusnih proteinov v membrano veziklov. Vloga veziklov ni le tvorba primernega okolja za replikacijo RNA in njene zaščite, temveč sodelujejo tudi pri translaciji in tvorbi kapside okrog viriona.
Proteini nsp3, 5 in 8 (vsi sodelujejo pri replikciji) so locirani zunaj membrane teh veziklov, ostali nestrukturni proteini, ki tvorijo RTC kompleks pa so razporejeni na notranji membrani. V notranjosti so opazili tudi dvoverižno RNA, ki verjetno predstavlja intermediat replikacije.

==Viri==
1. Chen, Y., Liu, Q. & Guo, D. Emerging coronaviruses: Genome structure, replication, and pathogenesis. Journal of Medical Virology vol. 92 418–423 (2020).

2. Yuhang, W., Grunewald, M. & Perlman, S. Coronaviruses: An Updated Overview of Their Replication and Pathogenesis. An Autom. Irrig. Syst. Using Arduino Microcontroller 1908, 2–6 (2020).

3. V’kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H. & Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology vol. 19 155–170 (2021).

4. Enjuanes, L., Almazán, F., Sola, I., Zuñiga, S. & Zuñiga, Z. Biochemical Aspects of Coronavirus Replication and Virus-Host Interaction. (2006).

5. Graham, R. L., Sparks, J. S., Eckerle, L. D., Sims, A. C. & Denison, M. R. SARS coronavirus replicase proteins in pathogenesis. (2007).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-06T07:18:49Z

Marusasernc: /* Bralni okvirji */

== Uvod ==

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

==== Pomen poznavanja genoma ====

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.

==== Mutacije virusov ====

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

==== Primerjava genomov med koronavirusi ====

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.

== Genom Koronavirusov ==

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali zraven zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le teh. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice.
Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne proteine se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

==== Bralni okvirji ====

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1ab (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

==== Nestrukturni proteini ====

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov.
Poznamo dva načina cepitve poliproteinov.
V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.
Nestrukturni proteini 2 - 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini.
Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze.
Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse (glej uvod). Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu.
Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

==== Strukturni N protein ====

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

==Življenjski cikel virusa v celici==

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljskimi faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celično membrano in nato takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih veziklov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

==Replikacija==

Koronavirusi se od ostalih virusov razlikujejo po unikatni strategiji replikacije. Replikacija virusnih RNA sledi za translacijo in oblikovanjem RTC kompleksa. Ko replikacijsko transkripcijski kompleks interagira z koronavirusno RNA(+) se začne replikacija RNA molekul. Nastane RNA(-), s katero se lahko zgodita 2 stvari; kot prvo lahko poteče replikacija in se zopet sintetizira RNA(+) molekula, ki je identična molekuli, ki je prišla v celico iz virusa. Ta se lahko porabi za translacijo in nastanek nestrukturnih proteinov ali pa se zapakira v nove virione in zapusti celico, kot drugo pa lahko poteče diskontinuirna transkripcija. Nastajajo različne subgenomske RNA (sgRNA), s pomočjo od RNA odvisne RNA polimeraze. sgRNA služi tvorbi strukturnih in akcesornih proteinov.
Veliko replikonskih zaporedij je zelo pomembnih pri replikaciji RNA. V 5' UTR koncu genoma je 7 lasničnih zank, ki se razširijo v gen 1a. V 3' UTR koncu pa je izbočena lasnična zanka, psevdovozel in hipervariabilno območje. Lasnična zanka in psevdovozel na 3' koncu se prekrivata in zato ne moreta nastajati enakočasno. Iz tu izhaja ideja, da določene strukture regulirajo različne stopnje RNA sinteze, čeprav podrobnejši mehanizmi delovanja še niso jasni. Bolj raziskan pa je mehanizem nadaljnje replikacije dednega materiala in sicer diskontinuirana transkripcija.
Sama replikacija v veziklih poteka v citosolu gostiteljske celice, sam virus pa kontrolira celoten potek tudi s pomočjo nekaterih virusnih proteinov, ki se prenesejo v jedro gostiteljske celice. Kot vemo, se geni v jedrcu celice izražajo bolj intenzivno, zato tudi položaj genov oz. delov kromosoma vpliva na njihovo prepisovanje. Virusni proteini interagirajo z jedrnimi antigeni in jih prerazporedijo, tako da se intenzivneje sintetizirajo proteini, ki so za virusni življenjski cikel najpomembnejši. Vplivanje na proliferacijo gostiteljske celice je skupna značilnost vseh nidovirusov.

====Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa====

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko-transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Nekaj posameznih struktur je bolj natančno definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

====Zaščitno okolje za replikacijo genskega materiala====

Podrobnejši mehanizem replikacije RNA je žal neznanka, je pa znano kje poteka replikacija (in tudi transkripcija) RNA. Nekatere študije zatrjujejo, da vezikli z dvojno membrano izvirajo iz endoplazemskega retikuluma, spet druge trdijo, da ti vezikli nastanejo kot produkti makrofagov, katerim manjka ATG5 (ključna komponenta avtofagosomov). Vsekakor pa njihova formacija vključuje ukrivljanje membran, kar je lahko ključno za insercijo virusnih proteinov v membrano veziklov. Vloga veziklov ni le tvorba primernega okolja za replikacijo RNA in njene zaščite, temveč sodelujejo tudi pri translaciji in tvorbi kapside okrog viriona.
Proteini nsp3, 5 in 8 (vsi sodelujejo pri replikciji) so locirani zunaj membrane teh veziklov, ostali nestrukturni proteini, ki tvorijo RTC kompleks pa so razporejeni na notranji membrani. V notranjosti so opazili tudi dvoverižno RNA, ki verjetno predstavlja intermediat replikacije.

==Viri==
1. Chen, Y., Liu, Q. & Guo, D. Emerging coronaviruses: Genome structure, replication, and pathogenesis. Journal of Medical Virology vol. 92 418–423 (2020).

2. Yuhang, W., Grunewald, M. & Perlman, S. Coronaviruses: An Updated Overview of Their Replication and Pathogenesis. An Autom. Irrig. Syst. Using Arduino Microcontroller 1908, 2–6 (2020).

3. V’kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H. & Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology vol. 19 155–170 (2021).

4. Enjuanes, L., Almazán, F., Sola, I., Zuñiga, S. & Zuñiga, Z. Biochemical Aspects of Coronavirus Replication and Virus-Host Interaction. (2006).

5. Graham, R. L., Sparks, J. S., Eckerle, L. D., Sims, A. C. & Denison, M. R. SARS coronavirus replicase proteins in pathogenesis. (2007).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Talk:Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T15:25:45Z

Marusasernc:

Luka Stanković (Uvod, Genom koronavirusov)

Maruša Sernc (Genom koronavirusov, Replikacija)

Luka Šegota (Življenjski cikel virusa v celici, Replikacija)

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T12:12:56Z

Marusasernc: /* Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa */

== Uvod ==

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

==== Pomen poznavanja genoma ====

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.

==== Mutacije virusov ====

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

==== Primerjava genomov med koronavirusi ====

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.

== Genom Koronavirusov ==

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali zraven zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le teh. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice.
Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne proteine se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

==== Bralni okvirji ====

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1b (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

==== Nestrukturni proteini ====

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov.
Poznamo dva načina cepitve poliproteinov.
V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.
Nestrukturni proteini 2 - 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini.
Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze.
Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse (glej uvod). Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu.
Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

==== Strukturni N protein ====

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

==Življenjski cikel virusa v celici==

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljskimi faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celično membrano in nato takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih veziklov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

==Replikacija==

Koronavirusi se od ostalih virusov razlikujejo po unikatni strategiji replikacije. Replikacija virusnih RNA sledi za translacijo in oblikovanjem RTC kompleksa. Ko replikacijsko transkripcijski kompleks interagira z koronavirusno RNA(+) se začne replikacija RNA molekul. Nastane RNA(-), s katero se lahko zgodita 2 stvari; kot prvo lahko poteče replikacija in se zopet sintetizira RNA(+) molekula, ki je identična molekuli, ki je prišla v celico iz virusa. Ta se lahko porabi za translacijo in nastanek nestrukturnih proteinov ali pa se zapakira v nove virione in zapusti celico, kot drugo pa lahko poteče diskontinuirna transkripcija. Nastajajo različne subgenomske RNA (sgRNA), s pomočjo od RNA odvisne RNA polimeraze. sgRNA služi tvorbi strukturnih in akcesornih proteinov.
Veliko replikonskih zaporedij je zelo pomembnih pri replikaciji RNA. V 5' UTR koncu genoma je 7 lasničnih zank, ki se razširijo v gen 1a. V 3' UTR koncu pa je izbočena lasnična zanka, psevdovozel in hipervariabilno območje. Lasnična zanka in psevdovozel na 3' koncu se prekrivata in zato ne moreta nastajati enakočasno. Iz tu izhaja ideja, da določene strukture regulirajo različne stopnje RNA sinteze, čeprav podrobnejši mehanizmi delovanja še niso jasni. Bolj raziskan pa je mehanizem nadaljnje replikacije dednega materiala in sicer diskontinuirana transkripcija.
Sama replikacija v veziklih poteka v citosolu gostiteljske celice, sam virus pa kontrolira celoten potek tudi s pomočjo nekaterih virusnih proteinov, ki se prenesejo v jedro gostiteljske celice. Kot vemo, se geni v jedrcu celice izražajo bolj intenzivno, zato tudi položaj genov oz. delov kromosoma vpliva na njihovo prepisovanje. Virusni proteini interagirajo z jedrnimi antigeni in jih prerazporedijo, tako da se intenzivneje sintetizirajo proteini, ki so za virusni življenjski cikel najpomembnejši. Vplivanje na proliferacijo gostiteljske celice je skupna značilnost vseh nidovirusov.

====Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa====

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko-transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Nekaj posameznih struktur je bolj natančno definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

====Zaščitno okolje za replikacijo genskega materiala====

Podrobnejši mehanizem replikacije RNA je žal neznanka, je pa znano kje poteka replikacija (in tudi transkripcija) RNA. Nekatere študije zatrjujejo, da vezikli z dvojno membrano izvirajo iz endoplazemskega retikuluma, spet druge trdijo, da ti vezikli nastanejo kot produkti makrofagov, katerim manjka ATG5 (ključna komponenta avtofagosomov). Vsekakor pa njihova formacija vključuje ukrivljanje membran, kar je lahko ključno za insercijo virusnih proteinov v membrano veziklov. Vloga veziklov ni le tvorba primernega okolja za replikacijo RNA in njene zaščite, temveč sodelujejo tudi pri translaciji in tvorbi kapside okrog viriona.
Proteini nsp3, 5 in 8 (vsi sodelujejo pri replikciji) so locirani zunaj membrane teh veziklov, ostali nestrukturni proteini, ki tvorijo RTC kompleks pa so razporejeni na notranji membrani. V notranjosti so opazili tudi dvoverižno RNA, ki verjetno predstavlja intermediat replikacije.

==Viri==
1. Chen, Y., Liu, Q. & Guo, D. Emerging coronaviruses: Genome structure, replication, and pathogenesis. Journal of Medical Virology vol. 92 418–423 (2020).

2. Yuhang, W., Grunewald, M. & Perlman, S. Coronaviruses: An Updated Overview of Their Replication and Pathogenesis. An Autom. Irrig. Syst. Using Arduino Microcontroller 1908, 2–6 (2020).

3. V’kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H. & Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology vol. 19 155–170 (2021).

4. Enjuanes, L., Almazán, F., Sola, I., Zuñiga, S. & Zuñiga, Z. Biochemical Aspects of Coronavirus Replication and Virus-Host Interaction. (2006).

5. Graham, R. L., Sparks, J. S., Eckerle, L. D., Sims, A. C. & Denison, M. R. SARS coronavirus replicase proteins in pathogenesis. (2007).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T12:12:00Z

Marusasernc: /* Replikacija */

== Uvod ==

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

==== Pomen poznavanja genoma ====

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.

==== Mutacije virusov ====

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

==== Primerjava genomov med koronavirusi ====

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.

== Genom Koronavirusov ==

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali zraven zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le teh. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice.
Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne proteine se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

==== Bralni okvirji ====

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1b (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

==== Nestrukturni proteini ====

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov.
Poznamo dva načina cepitve poliproteinov.
V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.
Nestrukturni proteini 2 - 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini.
Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze.
Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse (glej uvod). Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu.
Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

==== Strukturni N protein ====

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

==Življenjski cikel virusa v celici==

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljskimi faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celično membrano in nato takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih veziklov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

==Replikacija==

Koronavirusi se od ostalih virusov razlikujejo po unikatni strategiji replikacije. Replikacija virusnih RNA sledi za translacijo in oblikovanjem RTC kompleksa. Ko replikacijsko transkripcijski kompleks interagira z koronavirusno RNA(+) se začne replikacija RNA molekul. Nastane RNA(-), s katero se lahko zgodita 2 stvari; kot prvo lahko poteče replikacija in se zopet sintetizira RNA(+) molekula, ki je identična molekuli, ki je prišla v celico iz virusa. Ta se lahko porabi za translacijo in nastanek nestrukturnih proteinov ali pa se zapakira v nove virione in zapusti celico, kot drugo pa lahko poteče diskontinuirna transkripcija. Nastajajo različne subgenomske RNA (sgRNA), s pomočjo od RNA odvisne RNA polimeraze. sgRNA služi tvorbi strukturnih in akcesornih proteinov.
Veliko replikonskih zaporedij je zelo pomembnih pri replikaciji RNA. V 5' UTR koncu genoma je 7 lasničnih zank, ki se razširijo v gen 1a. V 3' UTR koncu pa je izbočena lasnična zanka, psevdovozel in hipervariabilno območje. Lasnična zanka in psevdovozel na 3' koncu se prekrivata in zato ne moreta nastajati enakočasno. Iz tu izhaja ideja, da določene strukture regulirajo različne stopnje RNA sinteze, čeprav podrobnejši mehanizmi delovanja še niso jasni. Bolj raziskan pa je mehanizem nadaljnje replikacije dednega materiala in sicer diskontinuirana transkripcija.
Sama replikacija v veziklih poteka v citosolu gostiteljske celice, sam virus pa kontrolira celoten potek tudi s pomočjo nekaterih virusnih proteinov, ki se prenesejo v jedro gostiteljske celice. Kot vemo, se geni v jedrcu celice izražajo bolj intenzivno, zato tudi položaj genov oz. delov kromosoma vpliva na njihovo prepisovanje. Virusni proteini interagirajo z jedrnimi antigeni in jih prerazporedijo, tako da se intenzivneje sintetizirajo proteini, ki so za virusni življenjski cikel najpomembnejši. Vplivanje na proliferacijo gostiteljske celice je skupna značilnost vseh nidovirusov.

====Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa====

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Nekaj posameznih struktur je bolj natančno definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

====Zaščitno okolje za replikacijo genskega materiala====

Podrobnejši mehanizem replikacije RNA je žal neznanka, je pa znano kje poteka replikacija (in tudi transkripcija) RNA. Nekatere študije zatrjujejo, da vezikli z dvojno membrano izvirajo iz endoplazemskega retikuluma, spet druge trdijo, da ti vezikli nastanejo kot produkti makrofagov, katerim manjka ATG5 (ključna komponenta avtofagosomov). Vsekakor pa njihova formacija vključuje ukrivljanje membran, kar je lahko ključno za insercijo virusnih proteinov v membrano veziklov. Vloga veziklov ni le tvorba primernega okolja za replikacijo RNA in njene zaščite, temveč sodelujejo tudi pri translaciji in tvorbi kapside okrog viriona.
Proteini nsp3, 5 in 8 (vsi sodelujejo pri replikciji) so locirani zunaj membrane teh veziklov, ostali nestrukturni proteini, ki tvorijo RTC kompleks pa so razporejeni na notranji membrani. V notranjosti so opazili tudi dvoverižno RNA, ki verjetno predstavlja intermediat replikacije.

==Viri==
1. Chen, Y., Liu, Q. & Guo, D. Emerging coronaviruses: Genome structure, replication, and pathogenesis. Journal of Medical Virology vol. 92 418–423 (2020).

2. Yuhang, W., Grunewald, M. & Perlman, S. Coronaviruses: An Updated Overview of Their Replication and Pathogenesis. An Autom. Irrig. Syst. Using Arduino Microcontroller 1908, 2–6 (2020).

3. V’kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H. & Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology vol. 19 155–170 (2021).

4. Enjuanes, L., Almazán, F., Sola, I., Zuñiga, S. & Zuñiga, Z. Biochemical Aspects of Coronavirus Replication and Virus-Host Interaction. (2006).

5. Graham, R. L., Sparks, J. S., Eckerle, L. D., Sims, A. C. & Denison, M. R. SARS coronavirus replicase proteins in pathogenesis. (2007).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T12:07:12Z

Marusasernc: /* Replikacija */

== Uvod ==

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

==== Pomen poznavanja genoma ====

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.

==== Mutacije virusov ====

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

==== Primerjava genomov med koronavirusi ====

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.

== Genom Koronavirusov ==

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali zraven zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le teh. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice.
Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne proteine se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

==== Bralni okvirji ====

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1b (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

==== Nestrukturni proteini ====

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov.
Poznamo dva načina cepitve poliproteinov.
V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.
Nestrukturni proteini 2 - 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini.
Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze.
Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse (glej uvod). Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu.
Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

==== Strukturni N protein ====

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

==Življenjski cikel virusa v celici==

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljskimi faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celično membrano in nato takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih veziklov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

==Replikacija==

Koronavirusi se od ostalih virusov razlikujejo po unikatni strategiji replikacije. Replikacija virusnih RNA sledi za translacijo in oblikovanjem RTC kompleksa. Ko replikacijsko transkripcijski kompleks interagira z koronavirusno RNA(+) se začne replikacija RNA molekul. Nastane RNA(-), s katero se lahko zgodita 2 stvari; kot prvo lahko poteče replikacija in se zopet sintetizira RNA(+) molekula, ki je identična molekuli, ki je prišla v celico iz virusa. Ta se lahko porabi za translacijo in nastanek nestrukturnih proteinov ali pa se zapakira v nove virione in zapusti celico, kot drugo pa lahko poteče diskontinuirna transkripcija. Nastajajo različne subgenomske RNA (sgRNA), s pomočjo od RNA odvisne RNA polimeraze. sgRNA služi tvorbi strukturnih in akcesornih proteinov.
Veliko replikonskih zaporedij je zelo pomembnih pri replikaciji RNA. V 5' UTR koncu genoma je 7 lasničnih zank, ki se razširijo v gen 1a. V 3' UTR koncu pa je izbočena lasnična zanka, psevdoknot in hipervariabilno območje. Lasnična zanka in psevdovozelj na 3' koncu se prekrivata in zato ne moreta nastajati enakočasno. Iz tu izhaja ideja, da določene strukture regulirajo različne stopnje RNA sinteze, čeprav podrobnejši mehanizmi delovanja še niso jasni. Bolj raziskan pa je mehanizem nadaljnje replikacije dednega materiala in sicer diskontinuirana transkripcija.
Sama replikacija v veziklih poteka v citosolu gostiteljske celice, sam virus pa kontrolira celoten potek tudi s pomočjo nekaterih virusnih proteinov, ki se prenesejo v jedro gostiteljske celice. Kot vemo, se geni v jedrcu celice izražajo bolj intenzivno, zato tudi položaj genov oz. delov kromosoma vpliva na njihovo prepisovanje. Virusni proteini interagirajo z jedrnimi antigeni in jih prerazporedijo, tako da se intenzivneje sintetizirajo proteini, ki so za virusni življenjski cikel najpomembnejši. Vplivanje na proliferacijo gostiteljske celice je skupna značilnost vseh nidovirusov.

====Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa====

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Nekaj posameznih struktur je bolj natančno definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

====Zaščitno okolje za replikacijo genskega materiala====

Podrobnejši mehanizem replikacije RNA je žal neznanka, je pa znano kje poteka replikacija (in tudi transkripcija) RNA. Nekatere študije zatrjujejo, da vezikli z dvojno membrano izvirajo iz endoplazemskega retikuluma, spet druge trdijo, da ti vezikli nastanejo kot produkti makrofagov, katerim manjka ATG5 (ključna komponenta avtofagosomov). Vsekakor pa njihova formacija vključuje ukrivljanje membran, kar je lahko ključno za insercijo virusnih proteinov v membrano veziklov. Vloga veziklov ni le tvorba primernega okolja za replikacijo RNA in njene zaščite, temveč sodelujejo tudi pri translaciji in tvorbi kapside okrog viriona.
Proteini nsp3, 5 in 8 (vsi sodelujejo pri replikciji) so locirani zunaj membrane teh veziklov, ostali nestrukturni proteini, ki tvorijo RTC kompleks pa so razporejeni na notranji membrani. V notranjosti so opazili tudi dvoverižno RNA, ki verjetno predstavlja intermediat replikacije.

==Viri==
1. Chen, Y., Liu, Q. & Guo, D. Emerging coronaviruses: Genome structure, replication, and pathogenesis. Journal of Medical Virology vol. 92 418–423 (2020).

2. Yuhang, W., Grunewald, M. & Perlman, S. Coronaviruses: An Updated Overview of Their Replication and Pathogenesis. An Autom. Irrig. Syst. Using Arduino Microcontroller 1908, 2–6 (2020).

3. V’kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H. & Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology vol. 19 155–170 (2021).

4. Enjuanes, L., Almazán, F., Sola, I., Zuñiga, S. & Zuñiga, Z. Biochemical Aspects of Coronavirus Replication and Virus-Host Interaction. (2006).

5. Graham, R. L., Sparks, J. S., Eckerle, L. D., Sims, A. C. & Denison, M. R. SARS coronavirus replicase proteins in pathogenesis. (2007).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T12:04:28Z

Marusasernc: /* Življenjski cikel virusa v celici */

== Uvod ==

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

==== Pomen poznavanja genoma ====

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.

==== Mutacije virusov ====

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

==== Primerjava genomov med koronavirusi ====

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.

== Genom Koronavirusov ==

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali zraven zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le teh. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice.
Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne proteine se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

==== Bralni okvirji ====

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1b (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

==== Nestrukturni proteini ====

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov.
Poznamo dva načina cepitve poliproteinov.
V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.
Nestrukturni proteini 2 - 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini.
Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze.
Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse (glej uvod). Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu.
Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

==== Strukturni N protein ====

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

==Življenjski cikel virusa v celici==

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljskimi faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celično membrano in nato takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih veziklov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

==Replikacija==

Koronavirusi se od ostalih virusov razlikujejo po unikatni strategiji replikacije. Replikacija virusnih RNA sledi za translacijo in oblikovanjem RTC kompleksa. Ko replikacijsko transkripcijski kompleks interagira z koronavirusno RNA(+) se začne replikacija RNA molekul. Nastane RNA(-), s katero se lahko zgodita 2 stvari; 1. lahko poteče replikacija in se zopet sintetizira RNA(+) molekula, ki je identična molekuli, ki je prišla v celico iz virusa. Ta se lahko porabi za translacijo in nastanek nestrukturnih proteinov ali pa se zapakira v nove virione in zapusti celico ali pa 2. diskontinuirna transkripcija. Nastajajo različne subgenomske RNA (sgRNA), s pomočjo od RNA odvisne RNA polimeraze. sgRNA služi tvorbi strukturnih in akcesornih proteinov.
Veliko replikonskih zaporedij je zelo pomembnih pri replikaciji RNA. V 5' UTR koncu genoma je 7 lasničnih zank, ki se razširijo v gen 1a. V 3' UTR koncu pa je izbočena lasnična zanka, psevdoknot in hipervariabilno območje. Lasnična zanka in psevdovozelj na 3' koncu se prekrivata in zato ne moreta nastajati enakočasno. Iz tu izhaja ideja, da določene strukture regulirajo različne stopnje RNA sinteze, čeprav podrobnejši mehanizmi delovanja še niso jasni. Bolj raziskan pa je mehanizem nadaljnje replikacije dednega materiala in sicer diskontinuirana transkripcija.
Sama replikacija v veziklih poteka v citosolu gostiteljske celice, sam virus pa kontrolira celoten potek tudi s pomočjo nekaterih virusnih proteinov, ki se prenesejo v jedro gostiteljske celice. Kot vemo, se geni v jedrcu celice izražajo bolj intenzivno, zato tudi položaj genov oz. delov kromosoma vpliva na njihovo prepisovanje. Virusni proteini interagirajo z jedrnimi antigeni in jih prerazporedijo, tako da se intenzivneje sintetizirajo proteini, ki so za virusni življenjski cikel najpomembnejši. Vplivanje na proliferacijo gostiteljske celice je skupna značilnost vseh nidovirusov.

====Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa====

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Nekaj posameznih struktur je bolj natančno definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

====Zaščitno okolje za replikacijo genskega materiala====

Podrobnejši mehanizem replikacije RNA je žal neznanka, je pa znano kje poteka replikacija (in tudi transkripcija) RNA. Nekatere študije zatrjujejo, da vezikli z dvojno membrano izvirajo iz endoplazemskega retikuluma, spet druge trdijo, da ti vezikli nastanejo kot produkti makrofagov, katerim manjka ATG5 (ključna komponenta avtofagosomov). Vsekakor pa njihova formacija vključuje ukrivljanje membran, kar je lahko ključno za insercijo virusnih proteinov v membrano veziklov. Vloga veziklov ni le tvorba primernega okolja za replikacijo RNA in njene zaščite, temveč sodelujejo tudi pri translaciji in tvorbi kapside okrog viriona.
Proteini nsp3, 5 in 8 (vsi sodelujejo pri replikciji) so locirani zunaj membrane teh veziklov, ostali nestrukturni proteini, ki tvorijo RTC kompleks pa so razporejeni na notranji membrani. V notranjosti so opazili tudi dvoverižno RNA, ki verjetno predstavlja intermediat replikacije.

==Viri==
1. Chen, Y., Liu, Q. & Guo, D. Emerging coronaviruses: Genome structure, replication, and pathogenesis. Journal of Medical Virology vol. 92 418–423 (2020).

2. Yuhang, W., Grunewald, M. & Perlman, S. Coronaviruses: An Updated Overview of Their Replication and Pathogenesis. An Autom. Irrig. Syst. Using Arduino Microcontroller 1908, 2–6 (2020).

3. V’kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H. & Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology vol. 19 155–170 (2021).

4. Enjuanes, L., Almazán, F., Sola, I., Zuñiga, S. & Zuñiga, Z. Biochemical Aspects of Coronavirus Replication and Virus-Host Interaction. (2006).

5. Graham, R. L., Sparks, J. S., Eckerle, L. D., Sims, A. C. & Denison, M. R. SARS coronavirus replicase proteins in pathogenesis. (2007).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T12:02:23Z

Marusasernc: /* Življenjski cikel virusa v celici */

== Uvod ==

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

==== Pomen poznavanja genoma ====

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.

==== Mutacije virusov ====

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

==== Primerjava genomov med koronavirusi ====

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.

== Genom Koronavirusov ==

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali zraven zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le teh. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice.
Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne proteine se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

==== Bralni okvirji ====

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1b (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

==== Nestrukturni proteini ====

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov.
Poznamo dva načina cepitve poliproteinov.
V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.
Nestrukturni proteini 2 - 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini.
Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze.
Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse (glej uvod). Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu.
Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

==== Strukturni N protein ====

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

==Življenjski cikel virusa v celici==

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljskimi faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celiično membrano. Sledi takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih mehurčkov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

==Replikacija==

Koronavirusi se od ostalih virusov razlikujejo po unikatni strategiji replikacije. Replikacija virusnih RNA sledi za translacijo in oblikovanjem RTC kompleksa. Ko replikacijsko transkripcijski kompleks interagira z koronavirusno RNA(+) se začne replikacija RNA molekul. Nastane RNA(-), s katero se lahko zgodita 2 stvari; 1. lahko poteče replikacija in se zopet sintetizira RNA(+) molekula, ki je identična molekuli, ki je prišla v celico iz virusa. Ta se lahko porabi za translacijo in nastanek nestrukturnih proteinov ali pa se zapakira v nove virione in zapusti celico ali pa 2. diskontinuirna transkripcija. Nastajajo različne subgenomske RNA (sgRNA), s pomočjo od RNA odvisne RNA polimeraze. sgRNA služi tvorbi strukturnih in akcesornih proteinov.
Veliko replikonskih zaporedij je zelo pomembnih pri replikaciji RNA. V 5' UTR koncu genoma je 7 lasničnih zank, ki se razširijo v gen 1a. V 3' UTR koncu pa je izbočena lasnična zanka, psevdoknot in hipervariabilno območje. Lasnična zanka in psevdovozelj na 3' koncu se prekrivata in zato ne moreta nastajati enakočasno. Iz tu izhaja ideja, da določene strukture regulirajo različne stopnje RNA sinteze, čeprav podrobnejši mehanizmi delovanja še niso jasni. Bolj raziskan pa je mehanizem nadaljnje replikacije dednega materiala in sicer diskontinuirana transkripcija.
Sama replikacija v veziklih poteka v citosolu gostiteljske celice, sam virus pa kontrolira celoten potek tudi s pomočjo nekaterih virusnih proteinov, ki se prenesejo v jedro gostiteljske celice. Kot vemo, se geni v jedrcu celice izražajo bolj intenzivno, zato tudi položaj genov oz. delov kromosoma vpliva na njihovo prepisovanje. Virusni proteini interagirajo z jedrnimi antigeni in jih prerazporedijo, tako da se intenzivneje sintetizirajo proteini, ki so za virusni življenjski cikel najpomembnejši. Vplivanje na proliferacijo gostiteljske celice je skupna značilnost vseh nidovirusov.

====Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa====

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Nekaj posameznih struktur je bolj natančno definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

====Zaščitno okolje za replikacijo genskega materiala====

Podrobnejši mehanizem replikacije RNA je žal neznanka, je pa znano kje poteka replikacija (in tudi transkripcija) RNA. Nekatere študije zatrjujejo, da vezikli z dvojno membrano izvirajo iz endoplazemskega retikuluma, spet druge trdijo, da ti vezikli nastanejo kot produkti makrofagov, katerim manjka ATG5 (ključna komponenta avtofagosomov). Vsekakor pa njihova formacija vključuje ukrivljanje membran, kar je lahko ključno za insercijo virusnih proteinov v membrano veziklov. Vloga veziklov ni le tvorba primernega okolja za replikacijo RNA in njene zaščite, temveč sodelujejo tudi pri translaciji in tvorbi kapside okrog viriona.
Proteini nsp3, 5 in 8 (vsi sodelujejo pri replikciji) so locirani zunaj membrane teh veziklov, ostali nestrukturni proteini, ki tvorijo RTC kompleks pa so razporejeni na notranji membrani. V notranjosti so opazili tudi dvoverižno RNA, ki verjetno predstavlja intermediat replikacije.

==Viri==
1. Chen, Y., Liu, Q. & Guo, D. Emerging coronaviruses: Genome structure, replication, and pathogenesis. Journal of Medical Virology vol. 92 418–423 (2020).

2. Yuhang, W., Grunewald, M. & Perlman, S. Coronaviruses: An Updated Overview of Their Replication and Pathogenesis. An Autom. Irrig. Syst. Using Arduino Microcontroller 1908, 2–6 (2020).

3. V’kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H. & Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology vol. 19 155–170 (2021).

4. Enjuanes, L., Almazán, F., Sola, I., Zuñiga, S. & Zuñiga, Z. Biochemical Aspects of Coronavirus Replication and Virus-Host Interaction. (2006).

5. Graham, R. L., Sparks, J. S., Eckerle, L. D., Sims, A. C. & Denison, M. R. SARS coronavirus replicase proteins in pathogenesis. (2007).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T12:01:28Z

Marusasernc: /* Življenjsji cikel virusa v celici */

== Uvod ==

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

==== Pomen poznavanja genoma ====

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.

==== Mutacije virusov ====

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

==== Primerjava genomov med koronavirusi ====

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.

== Genom Koronavirusov ==

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali zraven zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le teh. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice.
Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne proteine se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

==== Bralni okvirji ====

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1b (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

==== Nestrukturni proteini ====

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov.
Poznamo dva načina cepitve poliproteinov.
V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.
Nestrukturni proteini 2 - 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini.
Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze.
Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse (glej uvod). Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu.
Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

==== Strukturni N protein ====

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

==Življenjski cikel virusa v celici==

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljski faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celiično membrano. Sledi takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih mehurčkov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

==Replikacija==

Koronavirusi se od ostalih virusov razlikujejo po unikatni strategiji replikacije. Replikacija virusnih RNA sledi za translacijo in oblikovanjem RTC kompleksa. Ko replikacijsko transkripcijski kompleks interagira z koronavirusno RNA(+) se začne replikacija RNA molekul. Nastane RNA(-), s katero se lahko zgodita 2 stvari; 1. lahko poteče replikacija in se zopet sintetizira RNA(+) molekula, ki je identična molekuli, ki je prišla v celico iz virusa. Ta se lahko porabi za translacijo in nastanek nestrukturnih proteinov ali pa se zapakira v nove virione in zapusti celico ali pa 2. diskontinuirna transkripcija. Nastajajo različne subgenomske RNA (sgRNA), s pomočjo od RNA odvisne RNA polimeraze. sgRNA služi tvorbi strukturnih in akcesornih proteinov.
Veliko replikonskih zaporedij je zelo pomembnih pri replikaciji RNA. V 5' UTR koncu genoma je 7 lasničnih zank, ki se razširijo v gen 1a. V 3' UTR koncu pa je izbočena lasnična zanka, psevdoknot in hipervariabilno območje. Lasnična zanka in psevdovozelj na 3' koncu se prekrivata in zato ne moreta nastajati enakočasno. Iz tu izhaja ideja, da določene strukture regulirajo različne stopnje RNA sinteze, čeprav podrobnejši mehanizmi delovanja še niso jasni. Bolj raziskan pa je mehanizem nadaljnje replikacije dednega materiala in sicer diskontinuirana transkripcija.
Sama replikacija v veziklih poteka v citosolu gostiteljske celice, sam virus pa kontrolira celoten potek tudi s pomočjo nekaterih virusnih proteinov, ki se prenesejo v jedro gostiteljske celice. Kot vemo, se geni v jedrcu celice izražajo bolj intenzivno, zato tudi položaj genov oz. delov kromosoma vpliva na njihovo prepisovanje. Virusni proteini interagirajo z jedrnimi antigeni in jih prerazporedijo, tako da se intenzivneje sintetizirajo proteini, ki so za virusni življenjski cikel najpomembnejši. Vplivanje na proliferacijo gostiteljske celice je skupna značilnost vseh nidovirusov.

====Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa====

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Nekaj posameznih struktur je bolj natančno definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

====Zaščitno okolje za replikacijo genskega materiala====

Podrobnejši mehanizem replikacije RNA je žal neznanka, je pa znano kje poteka replikacija (in tudi transkripcija) RNA. Nekatere študije zatrjujejo, da vezikli z dvojno membrano izvirajo iz endoplazemskega retikuluma, spet druge trdijo, da ti vezikli nastanejo kot produkti makrofagov, katerim manjka ATG5 (ključna komponenta avtofagosomov). Vsekakor pa njihova formacija vključuje ukrivljanje membran, kar je lahko ključno za insercijo virusnih proteinov v membrano veziklov. Vloga veziklov ni le tvorba primernega okolja za replikacijo RNA in njene zaščite, temveč sodelujejo tudi pri translaciji in tvorbi kapside okrog viriona.
Proteini nsp3, 5 in 8 (vsi sodelujejo pri replikciji) so locirani zunaj membrane teh veziklov, ostali nestrukturni proteini, ki tvorijo RTC kompleks pa so razporejeni na notranji membrani. V notranjosti so opazili tudi dvoverižno RNA, ki verjetno predstavlja intermediat replikacije.

==Viri==
1. Chen, Y., Liu, Q. & Guo, D. Emerging coronaviruses: Genome structure, replication, and pathogenesis. Journal of Medical Virology vol. 92 418–423 (2020).

2. Yuhang, W., Grunewald, M. & Perlman, S. Coronaviruses: An Updated Overview of Their Replication and Pathogenesis. An Autom. Irrig. Syst. Using Arduino Microcontroller 1908, 2–6 (2020).

3. V’kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H. & Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology vol. 19 155–170 (2021).

4. Enjuanes, L., Almazán, F., Sola, I., Zuñiga, S. & Zuñiga, Z. Biochemical Aspects of Coronavirus Replication and Virus-Host Interaction. (2006).

5. Graham, R. L., Sparks, J. S., Eckerle, L. D., Sims, A. C. & Denison, M. R. SARS coronavirus replicase proteins in pathogenesis. (2007).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T11:59:53Z

Marusasernc: /* Nestrukturni proteini */

== Uvod ==

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

==== Pomen poznavanja genoma ====

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.

==== Mutacije virusov ====

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

==== Primerjava genomov med koronavirusi ====

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.

== Genom Koronavirusov ==

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali zraven zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le teh. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice.
Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne proteine se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

==== Bralni okvirji ====

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1b (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

==== Nestrukturni proteini ====

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov.
Poznamo dva načina cepitve poliproteinov.
V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.
Nestrukturni proteini 2 - 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini.
Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze.
Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse (glej uvod). Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu.
Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

==== Strukturni N protein ====

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

==Življenjsji cikel virusa v celici==

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljski faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celiično membrano. Sledi takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih mehurčkov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

==Replikacija==

Koronavirusi se od ostalih virusov razlikujejo po unikatni strategiji replikacije. Replikacija virusnih RNA sledi za translacijo in oblikovanjem RTC kompleksa. Ko replikacijsko transkripcijski kompleks interagira z koronavirusno RNA(+) se začne replikacija RNA molekul. Nastane RNA(-), s katero se lahko zgodita 2 stvari; 1. lahko poteče replikacija in se zopet sintetizira RNA(+) molekula, ki je identična molekuli, ki je prišla v celico iz virusa. Ta se lahko porabi za translacijo in nastanek nestrukturnih proteinov ali pa se zapakira v nove virione in zapusti celico ali pa 2. diskontinuirna transkripcija. Nastajajo različne subgenomske RNA (sgRNA), s pomočjo od RNA odvisne RNA polimeraze. sgRNA služi tvorbi strukturnih in akcesornih proteinov.
Veliko replikonskih zaporedij je zelo pomembnih pri replikaciji RNA. V 5' UTR koncu genoma je 7 lasničnih zank, ki se razširijo v gen 1a. V 3' UTR koncu pa je izbočena lasnična zanka, psevdoknot in hipervariabilno območje. Lasnična zanka in psevdovozelj na 3' koncu se prekrivata in zato ne moreta nastajati enakočasno. Iz tu izhaja ideja, da določene strukture regulirajo različne stopnje RNA sinteze, čeprav podrobnejši mehanizmi delovanja še niso jasni. Bolj raziskan pa je mehanizem nadaljnje replikacije dednega materiala in sicer diskontinuirana transkripcija.
Sama replikacija v veziklih poteka v citosolu gostiteljske celice, sam virus pa kontrolira celoten potek tudi s pomočjo nekaterih virusnih proteinov, ki se prenesejo v jedro gostiteljske celice. Kot vemo, se geni v jedrcu celice izražajo bolj intenzivno, zato tudi položaj genov oz. delov kromosoma vpliva na njihovo prepisovanje. Virusni proteini interagirajo z jedrnimi antigeni in jih prerazporedijo, tako da se intenzivneje sintetizirajo proteini, ki so za virusni življenjski cikel najpomembnejši. Vplivanje na proliferacijo gostiteljske celice je skupna značilnost vseh nidovirusov.

====Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa====

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Nekaj posameznih struktur je bolj natančno definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

====Zaščitno okolje za replikacijo genskega materiala====

Podrobnejši mehanizem replikacije RNA je žal neznanka, je pa znano kje poteka replikacija (in tudi transkripcija) RNA. Nekatere študije zatrjujejo, da vezikli z dvojno membrano izvirajo iz endoplazemskega retikuluma, spet druge trdijo, da ti vezikli nastanejo kot produkti makrofagov, katerim manjka ATG5 (ključna komponenta avtofagosomov). Vsekakor pa njihova formacija vključuje ukrivljanje membran, kar je lahko ključno za insercijo virusnih proteinov v membrano veziklov. Vloga veziklov ni le tvorba primernega okolja za replikacijo RNA in njene zaščite, temveč sodelujejo tudi pri translaciji in tvorbi kapside okrog viriona.
Proteini nsp3, 5 in 8 (vsi sodelujejo pri replikciji) so locirani zunaj membrane teh veziklov, ostali nestrukturni proteini, ki tvorijo RTC kompleks pa so razporejeni na notranji membrani. V notranjosti so opazili tudi dvoverižno RNA, ki verjetno predstavlja intermediat replikacije.

==Viri==
1. Chen, Y., Liu, Q. & Guo, D. Emerging coronaviruses: Genome structure, replication, and pathogenesis. Journal of Medical Virology vol. 92 418–423 (2020).

2. Yuhang, W., Grunewald, M. & Perlman, S. Coronaviruses: An Updated Overview of Their Replication and Pathogenesis. An Autom. Irrig. Syst. Using Arduino Microcontroller 1908, 2–6 (2020).

3. V’kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H. & Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology vol. 19 155–170 (2021).

4. Enjuanes, L., Almazán, F., Sola, I., Zuñiga, S. & Zuñiga, Z. Biochemical Aspects of Coronavirus Replication and Virus-Host Interaction. (2006).

5. Graham, R. L., Sparks, J. S., Eckerle, L. D., Sims, A. C. & Denison, M. R. SARS coronavirus replicase proteins in pathogenesis. (2007).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T11:57:18Z

Marusasernc: /* Nestrukturni proteini */

== Uvod ==

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

==== Pomen poznavanja genoma ====

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.

==== Mutacije virusov ====

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

==== Primerjava genomov med koronavirusi ====

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.

== Genom Koronavirusov ==

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali zraven zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le teh. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice.
Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne proteine se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

==== Bralni okvirji ====

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1b (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

==== Nestrukturni proteini ====

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov.
Poznamo dva načina cepitve poliproteinov.
V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.
Nestrukturni proteini 2 - 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini.
Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze.
Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse. Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu.
Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

==== Strukturni N protein ====

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

==Življenjsji cikel virusa v celici==

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljski faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celiično membrano. Sledi takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih mehurčkov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

==Replikacija==

Koronavirusi se od ostalih virusov razlikujejo po unikatni strategiji replikacije. Replikacija virusnih RNA sledi za translacijo in oblikovanjem RTC kompleksa. Ko replikacijsko transkripcijski kompleks interagira z koronavirusno RNA(+) se začne replikacija RNA molekul. Nastane RNA(-), s katero se lahko zgodita 2 stvari; 1. lahko poteče replikacija in se zopet sintetizira RNA(+) molekula, ki je identična molekuli, ki je prišla v celico iz virusa. Ta se lahko porabi za translacijo in nastanek nestrukturnih proteinov ali pa se zapakira v nove virione in zapusti celico ali pa 2. diskontinuirna transkripcija. Nastajajo različne subgenomske RNA (sgRNA), s pomočjo od RNA odvisne RNA polimeraze. sgRNA služi tvorbi strukturnih in akcesornih proteinov.
Veliko replikonskih zaporedij je zelo pomembnih pri replikaciji RNA. V 5' UTR koncu genoma je 7 lasničnih zank, ki se razširijo v gen 1a. V 3' UTR koncu pa je izbočena lasnična zanka, psevdoknot in hipervariabilno območje. Lasnična zanka in psevdovozelj na 3' koncu se prekrivata in zato ne moreta nastajati enakočasno. Iz tu izhaja ideja, da določene strukture regulirajo različne stopnje RNA sinteze, čeprav podrobnejši mehanizmi delovanja še niso jasni. Bolj raziskan pa je mehanizem nadaljnje replikacije dednega materiala in sicer diskontinuirana transkripcija.
Sama replikacija v veziklih poteka v citosolu gostiteljske celice, sam virus pa kontrolira celoten potek tudi s pomočjo nekaterih virusnih proteinov, ki se prenesejo v jedro gostiteljske celice. Kot vemo, se geni v jedrcu celice izražajo bolj intenzivno, zato tudi položaj genov oz. delov kromosoma vpliva na njihovo prepisovanje. Virusni proteini interagirajo z jedrnimi antigeni in jih prerazporedijo, tako da se intenzivneje sintetizirajo proteini, ki so za virusni življenjski cikel najpomembnejši. Vplivanje na proliferacijo gostiteljske celice je skupna značilnost vseh nidovirusov.

====Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa====

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Nekaj posameznih struktur je bolj natančno definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

====Zaščitno okolje za replikacijo genskega materiala====

Podrobnejši mehanizem replikacije RNA je žal neznanka, je pa znano kje poteka replikacija (in tudi transkripcija) RNA. Nekatere študije zatrjujejo, da vezikli z dvojno membrano izvirajo iz endoplazemskega retikuluma, spet druge trdijo, da ti vezikli nastanejo kot produkti makrofagov, katerim manjka ATG5 (ključna komponenta avtofagosomov). Vsekakor pa njihova formacija vključuje ukrivljanje membran, kar je lahko ključno za insercijo virusnih proteinov v membrano veziklov. Vloga veziklov ni le tvorba primernega okolja za replikacijo RNA in njene zaščite, temveč sodelujejo tudi pri translaciji in tvorbi kapside okrog viriona.
Proteini nsp3, 5 in 8 (vsi sodelujejo pri replikciji) so locirani zunaj membrane teh veziklov, ostali nestrukturni proteini, ki tvorijo RTC kompleks pa so razporejeni na notranji membrani. V notranjosti so opazili tudi dvoverižno RNA, ki verjetno predstavlja intermediat replikacije.

==Viri==
1. Chen, Y., Liu, Q. & Guo, D. Emerging coronaviruses: Genome structure, replication, and pathogenesis. Journal of Medical Virology vol. 92 418–423 (2020).

2. Yuhang, W., Grunewald, M. & Perlman, S. Coronaviruses: An Updated Overview of Their Replication and Pathogenesis. An Autom. Irrig. Syst. Using Arduino Microcontroller 1908, 2–6 (2020).

3. V’kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H. & Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology vol. 19 155–170 (2021).

4. Enjuanes, L., Almazán, F., Sola, I., Zuñiga, S. & Zuñiga, Z. Biochemical Aspects of Coronavirus Replication and Virus-Host Interaction. (2006).

5. Graham, R. L., Sparks, J. S., Eckerle, L. D., Sims, A. C. & Denison, M. R. SARS coronavirus replicase proteins in pathogenesis. (2007).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T11:50:47Z

Marusasernc: /* Nestrukturni proteini */

== Uvod ==

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

==== Pomen poznavanja genoma ====

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.

==== Mutacije virusov ====

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

==== Primerjava genomov med koronavirusi ====

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.

== Genom Koronavirusov ==

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali zraven zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le teh. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice.
Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne proteine se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

==== Bralni okvirji ====

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1b (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

==== Nestrukturni proteini ====

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov.
Poznamo dva načina cepitve poliproteinov.
V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.
Nestrukturni proteini 2 do 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini.
Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze.
Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse. Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu.
Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

==== Strukturni N protein ====

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

==Življenjsji cikel virusa v celici==

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljski faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celiično membrano. Sledi takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih mehurčkov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

==Replikacija==

Koronavirusi se od ostalih virusov razlikujejo po unikatni strategiji replikacije. Replikacija virusnih RNA sledi za translacijo in oblikovanjem RTC kompleksa. Ko replikacijsko transkripcijski kompleks interagira z koronavirusno RNA(+) se začne replikacija RNA molekul. Nastane RNA(-), s katero se lahko zgodita 2 stvari; 1. lahko poteče replikacija in se zopet sintetizira RNA(+) molekula, ki je identična molekuli, ki je prišla v celico iz virusa. Ta se lahko porabi za translacijo in nastanek nestrukturnih proteinov ali pa se zapakira v nove virione in zapusti celico ali pa 2. diskontinuirna transkripcija. Nastajajo različne subgenomske RNA (sgRNA), s pomočjo od RNA odvisne RNA polimeraze. sgRNA služi tvorbi strukturnih in akcesornih proteinov.
Veliko replikonskih zaporedij je zelo pomembnih pri replikaciji RNA. V 5' UTR koncu genoma je 7 lasničnih zank, ki se razširijo v gen 1a. V 3' UTR koncu pa je izbočena lasnična zanka, psevdoknot in hipervariabilno območje. Lasnična zanka in psevdovozelj na 3' koncu se prekrivata in zato ne moreta nastajati enakočasno. Iz tu izhaja ideja, da določene strukture regulirajo različne stopnje RNA sinteze, čeprav podrobnejši mehanizmi delovanja še niso jasni. Bolj raziskan pa je mehanizem nadaljnje replikacije dednega materiala in sicer diskontinuirana transkripcija.
Sama replikacija v veziklih poteka v citosolu gostiteljske celice, sam virus pa kontrolira celoten potek tudi s pomočjo nekaterih virusnih proteinov, ki se prenesejo v jedro gostiteljske celice. Kot vemo, se geni v jedrcu celice izražajo bolj intenzivno, zato tudi položaj genov oz. delov kromosoma vpliva na njihovo prepisovanje. Virusni proteini interagirajo z jedrnimi antigeni in jih prerazporedijo, tako da se intenzivneje sintetizirajo proteini, ki so za virusni življenjski cikel najpomembnejši. Vplivanje na proliferacijo gostiteljske celice je skupna značilnost vseh nidovirusov.

====Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa====

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Nekaj posameznih struktur je bolj natančno definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

====Zaščitno okolje za replikacijo genskega materiala====

Podrobnejši mehanizem replikacije RNA je žal neznanka, je pa znano kje poteka replikacija (in tudi transkripcija) RNA. Nekatere študije zatrjujejo, da vezikli z dvojno membrano izvirajo iz endoplazemskega retikuluma, spet druge trdijo, da ti vezikli nastanejo kot produkti makrofagov, katerim manjka ATG5 (ključna komponenta avtofagosomov). Vsekakor pa njihova formacija vključuje ukrivljanje membran, kar je lahko ključno za insercijo virusnih proteinov v membrano veziklov. Vloga veziklov ni le tvorba primernega okolja za replikacijo RNA in njene zaščite, temveč sodelujejo tudi pri translaciji in tvorbi kapside okrog viriona.
Proteini nsp3, 5 in 8 (vsi sodelujejo pri replikciji) so locirani zunaj membrane teh veziklov, ostali nestrukturni proteini, ki tvorijo RTC kompleks pa so razporejeni na notranji membrani. V notranjosti so opazili tudi dvoverižno RNA, ki verjetno predstavlja intermediat replikacije.

==Viri==
1. Chen, Y., Liu, Q. & Guo, D. Emerging coronaviruses: Genome structure, replication, and pathogenesis. Journal of Medical Virology vol. 92 418–423 (2020).

2. Yuhang, W., Grunewald, M. & Perlman, S. Coronaviruses: An Updated Overview of Their Replication and Pathogenesis. An Autom. Irrig. Syst. Using Arduino Microcontroller 1908, 2–6 (2020).

3. V’kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H. & Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology vol. 19 155–170 (2021).

4. Enjuanes, L., Almazán, F., Sola, I., Zuñiga, S. & Zuñiga, Z. Biochemical Aspects of Coronavirus Replication and Virus-Host Interaction. (2006).

5. Graham, R. L., Sparks, J. S., Eckerle, L. D., Sims, A. C. & Denison, M. R. SARS coronavirus replicase proteins in pathogenesis. (2007).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T11:45:36Z

Marusasernc: /* Genom Koronavirusov */

== Uvod ==

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

==== Pomen poznavanja genoma ====

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.

==== Mutacije virusov ====

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

==== Primerjava genomov med koronavirusi ====

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.

== Genom Koronavirusov ==

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali zraven zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le teh. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice.
Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne proteine se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

==== Bralni okvirji ====

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1b (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

==== Nestrukturni proteini ====

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov.
Poznamo dva načina cepitve poliproteinov:
V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.
Nestrukturni proteini 2 do 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini.
Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze.
Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse. Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu.
Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

==== Strukturni N protein ====

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

==Življenjsji cikel virusa v celici==

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljski faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celiično membrano. Sledi takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih mehurčkov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

==Replikacija==

Koronavirusi se od ostalih virusov razlikujejo po unikatni strategiji replikacije. Replikacija virusnih RNA sledi za translacijo in oblikovanjem RTC kompleksa. Ko replikacijsko transkripcijski kompleks interagira z koronavirusno RNA(+) se začne replikacija RNA molekul. Nastane RNA(-), s katero se lahko zgodita 2 stvari; 1. lahko poteče replikacija in se zopet sintetizira RNA(+) molekula, ki je identična molekuli, ki je prišla v celico iz virusa. Ta se lahko porabi za translacijo in nastanek nestrukturnih proteinov ali pa se zapakira v nove virione in zapusti celico ali pa 2. diskontinuirna transkripcija. Nastajajo različne subgenomske RNA (sgRNA), s pomočjo od RNA odvisne RNA polimeraze. sgRNA služi tvorbi strukturnih in akcesornih proteinov.
Veliko replikonskih zaporedij je zelo pomembnih pri replikaciji RNA. V 5' UTR koncu genoma je 7 lasničnih zank, ki se razširijo v gen 1a. V 3' UTR koncu pa je izbočena lasnična zanka, psevdoknot in hipervariabilno območje. Lasnična zanka in psevdovozelj na 3' koncu se prekrivata in zato ne moreta nastajati enakočasno. Iz tu izhaja ideja, da določene strukture regulirajo različne stopnje RNA sinteze, čeprav podrobnejši mehanizmi delovanja še niso jasni. Bolj raziskan pa je mehanizem nadaljnje replikacije dednega materiala in sicer diskontinuirana transkripcija.
Sama replikacija v veziklih poteka v citosolu gostiteljske celice, sam virus pa kontrolira celoten potek tudi s pomočjo nekaterih virusnih proteinov, ki se prenesejo v jedro gostiteljske celice. Kot vemo, se geni v jedrcu celice izražajo bolj intenzivno, zato tudi položaj genov oz. delov kromosoma vpliva na njihovo prepisovanje. Virusni proteini interagirajo z jedrnimi antigeni in jih prerazporedijo, tako da se intenzivneje sintetizirajo proteini, ki so za virusni življenjski cikel najpomembnejši. Vplivanje na proliferacijo gostiteljske celice je skupna značilnost vseh nidovirusov.

====Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa====

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Nekaj posameznih struktur je bolj natančno definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

====Zaščitno okolje za replikacijo genskega materiala====

Podrobnejši mehanizem replikacije RNA je žal neznanka, je pa znano kje poteka replikacija (in tudi transkripcija) RNA. Nekatere študije zatrjujejo, da vezikli z dvojno membrano izvirajo iz endoplazemskega retikuluma, spet druge trdijo, da ti vezikli nastanejo kot produkti makrofagov, katerim manjka ATG5 (ključna komponenta avtofagosomov). Vsekakor pa njihova formacija vključuje ukrivljanje membran, kar je lahko ključno za insercijo virusnih proteinov v membrano veziklov. Vloga veziklov ni le tvorba primernega okolja za replikacijo RNA in njene zaščite, temveč sodelujejo tudi pri translaciji in tvorbi kapside okrog viriona.
Proteini nsp3, 5 in 8 (vsi sodelujejo pri replikciji) so locirani zunaj membrane teh veziklov, ostali nestrukturni proteini, ki tvorijo RTC kompleks pa so razporejeni na notranji membrani. V notranjosti so opazili tudi dvoverižno RNA, ki verjetno predstavlja intermediat replikacije.

==Viri==
1. Chen, Y., Liu, Q. & Guo, D. Emerging coronaviruses: Genome structure, replication, and pathogenesis. Journal of Medical Virology vol. 92 418–423 (2020).

2. Yuhang, W., Grunewald, M. & Perlman, S. Coronaviruses: An Updated Overview of Their Replication and Pathogenesis. An Autom. Irrig. Syst. Using Arduino Microcontroller 1908, 2–6 (2020).

3. V’kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H. & Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology vol. 19 155–170 (2021).

4. Enjuanes, L., Almazán, F., Sola, I., Zuñiga, S. & Zuñiga, Z. Biochemical Aspects of Coronavirus Replication and Virus-Host Interaction. (2006).

5. Graham, R. L., Sparks, J. S., Eckerle, L. D., Sims, A. C. & Denison, M. R. SARS coronavirus replicase proteins in pathogenesis. (2007).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T11:45:00Z

Marusasernc: /* Genom Koronavirusov */

== Uvod ==

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

==== Pomen poznavanja genoma ====

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.

==== Mutacije virusov ====

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

==== Primerjava genomov med koronavirusi ====

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.

== Genom Koronavirusov ==

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali zraven zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le teh. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice.
Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne protein se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

==== Bralni okvirji ====

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1b (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

==== Nestrukturni proteini ====

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov.
Poznamo dva načina cepitve poliproteinov:
V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.
Nestrukturni proteini 2 do 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini.
Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze.
Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse. Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu.
Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

==== Strukturni N protein ====

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

==Življenjsji cikel virusa v celici==

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljski faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celiično membrano. Sledi takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih mehurčkov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

==Replikacija==

Koronavirusi se od ostalih virusov razlikujejo po unikatni strategiji replikacije. Replikacija virusnih RNA sledi za translacijo in oblikovanjem RTC kompleksa. Ko replikacijsko transkripcijski kompleks interagira z koronavirusno RNA(+) se začne replikacija RNA molekul. Nastane RNA(-), s katero se lahko zgodita 2 stvari; 1. lahko poteče replikacija in se zopet sintetizira RNA(+) molekula, ki je identična molekuli, ki je prišla v celico iz virusa. Ta se lahko porabi za translacijo in nastanek nestrukturnih proteinov ali pa se zapakira v nove virione in zapusti celico ali pa 2. diskontinuirna transkripcija. Nastajajo različne subgenomske RNA (sgRNA), s pomočjo od RNA odvisne RNA polimeraze. sgRNA služi tvorbi strukturnih in akcesornih proteinov.
Veliko replikonskih zaporedij je zelo pomembnih pri replikaciji RNA. V 5' UTR koncu genoma je 7 lasničnih zank, ki se razširijo v gen 1a. V 3' UTR koncu pa je izbočena lasnična zanka, psevdoknot in hipervariabilno območje. Lasnična zanka in psevdovozelj na 3' koncu se prekrivata in zato ne moreta nastajati enakočasno. Iz tu izhaja ideja, da določene strukture regulirajo različne stopnje RNA sinteze, čeprav podrobnejši mehanizmi delovanja še niso jasni. Bolj raziskan pa je mehanizem nadaljnje replikacije dednega materiala in sicer diskontinuirana transkripcija.
Sama replikacija v veziklih poteka v citosolu gostiteljske celice, sam virus pa kontrolira celoten potek tudi s pomočjo nekaterih virusnih proteinov, ki se prenesejo v jedro gostiteljske celice. Kot vemo, se geni v jedrcu celice izražajo bolj intenzivno, zato tudi položaj genov oz. delov kromosoma vpliva na njihovo prepisovanje. Virusni proteini interagirajo z jedrnimi antigeni in jih prerazporedijo, tako da se intenzivneje sintetizirajo proteini, ki so za virusni življenjski cikel najpomembnejši. Vplivanje na proliferacijo gostiteljske celice je skupna značilnost vseh nidovirusov.

====Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa====

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Nekaj posameznih struktur je bolj natančno definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

====Zaščitno okolje za replikacijo genskega materiala====

Podrobnejši mehanizem replikacije RNA je žal neznanka, je pa znano kje poteka replikacija (in tudi transkripcija) RNA. Nekatere študije zatrjujejo, da vezikli z dvojno membrano izvirajo iz endoplazemskega retikuluma, spet druge trdijo, da ti vezikli nastanejo kot produkti makrofagov, katerim manjka ATG5 (ključna komponenta avtofagosomov). Vsekakor pa njihova formacija vključuje ukrivljanje membran, kar je lahko ključno za insercijo virusnih proteinov v membrano veziklov. Vloga veziklov ni le tvorba primernega okolja za replikacijo RNA in njene zaščite, temveč sodelujejo tudi pri translaciji in tvorbi kapside okrog viriona.
Proteini nsp3, 5 in 8 (vsi sodelujejo pri replikciji) so locirani zunaj membrane teh veziklov, ostali nestrukturni proteini, ki tvorijo RTC kompleks pa so razporejeni na notranji membrani. V notranjosti so opazili tudi dvoverižno RNA, ki verjetno predstavlja intermediat replikacije.

==Viri==
1. Chen, Y., Liu, Q. & Guo, D. Emerging coronaviruses: Genome structure, replication, and pathogenesis. Journal of Medical Virology vol. 92 418–423 (2020).

2. Yuhang, W., Grunewald, M. & Perlman, S. Coronaviruses: An Updated Overview of Their Replication and Pathogenesis. An Autom. Irrig. Syst. Using Arduino Microcontroller 1908, 2–6 (2020).

3. V’kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H. & Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology vol. 19 155–170 (2021).

4. Enjuanes, L., Almazán, F., Sola, I., Zuñiga, S. & Zuñiga, Z. Biochemical Aspects of Coronavirus Replication and Virus-Host Interaction. (2006).

5. Graham, R. L., Sparks, J. S., Eckerle, L. D., Sims, A. C. & Denison, M. R. SARS coronavirus replicase proteins in pathogenesis. (2007).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T11:43:52Z

Marusasernc: /* Genom Koronavirusov */

== Uvod ==

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

==== Pomen poznavanja genoma ====

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.

==== Mutacije virusov ====

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

==== Primerjava genomov med koronavirusi ====

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.

== Genom Koronavirusov ==

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali zraven zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le-the. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice.
Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne protein se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

==== Bralni okvirji ====

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1b (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

==== Nestrukturni proteini ====

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov.
Poznamo dva načina cepitve poliproteinov:
V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.
Nestrukturni proteini 2 do 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini.
Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze.
Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse. Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu.
Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

==== Strukturni N protein ====

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

==Življenjsji cikel virusa v celici==

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljski faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celiično membrano. Sledi takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih mehurčkov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

==Replikacija==

Koronavirusi se od ostalih virusov razlikujejo po unikatni strategiji replikacije. Replikacija virusnih RNA sledi za translacijo in oblikovanjem RTC kompleksa. Ko replikacijsko transkripcijski kompleks interagira z koronavirusno RNA(+) se začne replikacija RNA molekul. Nastane RNA(-), s katero se lahko zgodita 2 stvari; 1. lahko poteče replikacija in se zopet sintetizira RNA(+) molekula, ki je identična molekuli, ki je prišla v celico iz virusa. Ta se lahko porabi za translacijo in nastanek nestrukturnih proteinov ali pa se zapakira v nove virione in zapusti celico ali pa 2. diskontinuirna transkripcija. Nastajajo različne subgenomske RNA (sgRNA), s pomočjo od RNA odvisne RNA polimeraze. sgRNA služi tvorbi strukturnih in akcesornih proteinov.
Veliko replikonskih zaporedij je zelo pomembnih pri replikaciji RNA. V 5' UTR koncu genoma je 7 lasničnih zank, ki se razširijo v gen 1a. V 3' UTR koncu pa je izbočena lasnična zanka, psevdoknot in hipervariabilno območje. Lasnična zanka in psevdovozelj na 3' koncu se prekrivata in zato ne moreta nastajati enakočasno. Iz tu izhaja ideja, da določene strukture regulirajo različne stopnje RNA sinteze, čeprav podrobnejši mehanizmi delovanja še niso jasni. Bolj raziskan pa je mehanizem nadaljnje replikacije dednega materiala in sicer diskontinuirana transkripcija.
Sama replikacija v veziklih poteka v citosolu gostiteljske celice, sam virus pa kontrolira celoten potek tudi s pomočjo nekaterih virusnih proteinov, ki se prenesejo v jedro gostiteljske celice. Kot vemo, se geni v jedrcu celice izražajo bolj intenzivno, zato tudi položaj genov oz. delov kromosoma vpliva na njihovo prepisovanje. Virusni proteini interagirajo z jedrnimi antigeni in jih prerazporedijo, tako da se intenzivneje sintetizirajo proteini, ki so za virusni življenjski cikel najpomembnejši. Vplivanje na proliferacijo gostiteljske celice je skupna značilnost vseh nidovirusov.

====Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa====

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Nekaj posameznih struktur je bolj natančno definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

====Zaščitno okolje za replikacijo genskega materiala====

Podrobnejši mehanizem replikacije RNA je žal neznanka, je pa znano kje poteka replikacija (in tudi transkripcija) RNA. Nekatere študije zatrjujejo, da vezikli z dvojno membrano izvirajo iz endoplazemskega retikuluma, spet druge trdijo, da ti vezikli nastanejo kot produkti makrofagov, katerim manjka ATG5 (ključna komponenta avtofagosomov). Vsekakor pa njihova formacija vključuje ukrivljanje membran, kar je lahko ključno za insercijo virusnih proteinov v membrano veziklov. Vloga veziklov ni le tvorba primernega okolja za replikacijo RNA in njene zaščite, temveč sodelujejo tudi pri translaciji in tvorbi kapside okrog viriona.
Proteini nsp3, 5 in 8 (vsi sodelujejo pri replikciji) so locirani zunaj membrane teh veziklov, ostali nestrukturni proteini, ki tvorijo RTC kompleks pa so razporejeni na notranji membrani. V notranjosti so opazili tudi dvoverižno RNA, ki verjetno predstavlja intermediat replikacije.

==Viri==
1. Chen, Y., Liu, Q. & Guo, D. Emerging coronaviruses: Genome structure, replication, and pathogenesis. Journal of Medical Virology vol. 92 418–423 (2020).

2. Yuhang, W., Grunewald, M. & Perlman, S. Coronaviruses: An Updated Overview of Their Replication and Pathogenesis. An Autom. Irrig. Syst. Using Arduino Microcontroller 1908, 2–6 (2020).

3. V’kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H. & Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology vol. 19 155–170 (2021).

4. Enjuanes, L., Almazán, F., Sola, I., Zuñiga, S. & Zuñiga, Z. Biochemical Aspects of Coronavirus Replication and Virus-Host Interaction. (2006).

5. Graham, R. L., Sparks, J. S., Eckerle, L. D., Sims, A. C. & Denison, M. R. SARS coronavirus replicase proteins in pathogenesis. (2007).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T11:37:57Z

Marusasernc: /* Primerjava genomov med koronavirusi */

== Uvod ==

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

==== Pomen poznavanja genoma ====

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.

==== Mutacije virusov ====

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

==== Primerjava genomov med koronavirusi ====

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.

== Genom Koronavirusov ==

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali pored zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le-the. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice.
Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne protein se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

==== Bralni okvirji ====

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1b (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

==== Nestrukturni proteini ====

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov.
Poznamo dva načina cepitve poliproteinov:
V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.
Nestrukturni proteini 2 do 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini.
Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze.
Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse. Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu.
Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

==== Strukturni N protein ====

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

==Življenjsji cikel virusa v celici==

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljski faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celiično membrano. Sledi takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih mehurčkov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

==Replikacija==

Koronavirusi se od ostalih virusov razlikujejo po unikatni strategiji replikacije. Replikacija virusnih RNA sledi za translacijo in oblikovanjem RTC kompleksa. Ko replikacijsko transkripcijski kompleks interagira z koronavirusno RNA(+) se začne replikacija RNA molekul. Nastane RNA(-), s katero se lahko zgodita 2 stvari; 1. lahko poteče replikacija in se zopet sintetizira RNA(+) molekula, ki je identična molekuli, ki je prišla v celico iz virusa. Ta se lahko porabi za translacijo in nastanek nestrukturnih proteinov ali pa se zapakira v nove virione in zapusti celico ali pa 2. diskontinuirna transkripcija. Nastajajo različne subgenomske RNA (sgRNA), s pomočjo od RNA odvisne RNA polimeraze. sgRNA služi tvorbi strukturnih in akcesornih proteinov.
Veliko replikonskih zaporedij je zelo pomembnih pri replikaciji RNA. V 5' UTR koncu genoma je 7 lasničnih zank, ki se razširijo v gen 1a. V 3' UTR koncu pa je izbočena lasnična zanka, psevdoknot in hipervariabilno območje. Lasnična zanka in psevdovozelj na 3' koncu se prekrivata in zato ne moreta nastajati enakočasno. Iz tu izhaja ideja, da določene strukture regulirajo različne stopnje RNA sinteze, čeprav podrobnejši mehanizmi delovanja še niso jasni. Bolj raziskan pa je mehanizem nadaljnje replikacije dednega materiala in sicer diskontinuirana transkripcija.
Sama replikacija v veziklih poteka v citosolu gostiteljske celice, sam virus pa kontrolira celoten potek tudi s pomočjo nekaterih virusnih proteinov, ki se prenesejo v jedro gostiteljske celice. Kot vemo, se geni v jedrcu celice izražajo bolj intenzivno, zato tudi položaj genov oz. delov kromosoma vpliva na njihovo prepisovanje. Virusni proteini interagirajo z jedrnimi antigeni in jih prerazporedijo, tako da se intenzivneje sintetizirajo proteini, ki so za virusni življenjski cikel najpomembnejši. Vplivanje na proliferacijo gostiteljske celice je skupna značilnost vseh nidovirusov.

====Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa====

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Nekaj posameznih struktur je bolj natančno definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

====Zaščitno okolje za replikacijo genskega materiala====

Podrobnejši mehanizem replikacije RNA je žal neznanka, je pa znano kje poteka replikacija (in tudi transkripcija) RNA. Nekatere študije zatrjujejo, da vezikli z dvojno membrano izvirajo iz endoplazemskega retikuluma, spet druge trdijo, da ti vezikli nastanejo kot produkti makrofagov, katerim manjka ATG5 (ključna komponenta avtofagosomov). Vsekakor pa njihova formacija vključuje ukrivljanje membran, kar je lahko ključno za insercijo virusnih proteinov v membrano veziklov. Vloga veziklov ni le tvorba primernega okolja za replikacijo RNA in njene zaščite, temveč sodelujejo tudi pri translaciji in tvorbi kapside okrog viriona.
Proteini nsp3, 5 in 8 (vsi sodelujejo pri replikciji) so locirani zunaj membrane teh veziklov, ostali nestrukturni proteini, ki tvorijo RTC kompleks pa so razporejeni na notranji membrani. V notranjosti so opazili tudi dvoverižno RNA, ki verjetno predstavlja intermediat replikacije.

==Viri==
1. Chen, Y., Liu, Q. & Guo, D. Emerging coronaviruses: Genome structure, replication, and pathogenesis. Journal of Medical Virology vol. 92 418–423 (2020).

2. Yuhang, W., Grunewald, M. & Perlman, S. Coronaviruses: An Updated Overview of Their Replication and Pathogenesis. An Autom. Irrig. Syst. Using Arduino Microcontroller 1908, 2–6 (2020).

3. V’kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H. & Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology vol. 19 155–170 (2021).

4. Enjuanes, L., Almazán, F., Sola, I., Zuñiga, S. & Zuñiga, Z. Biochemical Aspects of Coronavirus Replication and Virus-Host Interaction. (2006).

5. Graham, R. L., Sparks, J. S., Eckerle, L. D., Sims, A. C. & Denison, M. R. SARS coronavirus replicase proteins in pathogenesis. (2007).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T11:37:37Z

Marusasernc: /* Mutacije virusov */

== Uvod ==

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

==== Pomen poznavanja genoma ====

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.

==== Mutacije virusov ====

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

== Primerjava genomov med koronavirusi ==

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.

== Genom Koronavirusov ==

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali pored zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le-the. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice.
Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne protein se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

==== Bralni okvirji ====

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1b (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

==== Nestrukturni proteini ====

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov.
Poznamo dva načina cepitve poliproteinov:
V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.
Nestrukturni proteini 2 do 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini.
Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze.
Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse. Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu.
Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

==== Strukturni N protein ====

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

==Življenjsji cikel virusa v celici==

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljski faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celiično membrano. Sledi takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih mehurčkov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

==Replikacija==

Koronavirusi se od ostalih virusov razlikujejo po unikatni strategiji replikacije. Replikacija virusnih RNA sledi za translacijo in oblikovanjem RTC kompleksa. Ko replikacijsko transkripcijski kompleks interagira z koronavirusno RNA(+) se začne replikacija RNA molekul. Nastane RNA(-), s katero se lahko zgodita 2 stvari; 1. lahko poteče replikacija in se zopet sintetizira RNA(+) molekula, ki je identična molekuli, ki je prišla v celico iz virusa. Ta se lahko porabi za translacijo in nastanek nestrukturnih proteinov ali pa se zapakira v nove virione in zapusti celico ali pa 2. diskontinuirna transkripcija. Nastajajo različne subgenomske RNA (sgRNA), s pomočjo od RNA odvisne RNA polimeraze. sgRNA služi tvorbi strukturnih in akcesornih proteinov.
Veliko replikonskih zaporedij je zelo pomembnih pri replikaciji RNA. V 5' UTR koncu genoma je 7 lasničnih zank, ki se razširijo v gen 1a. V 3' UTR koncu pa je izbočena lasnična zanka, psevdoknot in hipervariabilno območje. Lasnična zanka in psevdovozelj na 3' koncu se prekrivata in zato ne moreta nastajati enakočasno. Iz tu izhaja ideja, da določene strukture regulirajo različne stopnje RNA sinteze, čeprav podrobnejši mehanizmi delovanja še niso jasni. Bolj raziskan pa je mehanizem nadaljnje replikacije dednega materiala in sicer diskontinuirana transkripcija.
Sama replikacija v veziklih poteka v citosolu gostiteljske celice, sam virus pa kontrolira celoten potek tudi s pomočjo nekaterih virusnih proteinov, ki se prenesejo v jedro gostiteljske celice. Kot vemo, se geni v jedrcu celice izražajo bolj intenzivno, zato tudi položaj genov oz. delov kromosoma vpliva na njihovo prepisovanje. Virusni proteini interagirajo z jedrnimi antigeni in jih prerazporedijo, tako da se intenzivneje sintetizirajo proteini, ki so za virusni življenjski cikel najpomembnejši. Vplivanje na proliferacijo gostiteljske celice je skupna značilnost vseh nidovirusov.

====Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa====

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Nekaj posameznih struktur je bolj natančno definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

====Zaščitno okolje za replikacijo genskega materiala====

Podrobnejši mehanizem replikacije RNA je žal neznanka, je pa znano kje poteka replikacija (in tudi transkripcija) RNA. Nekatere študije zatrjujejo, da vezikli z dvojno membrano izvirajo iz endoplazemskega retikuluma, spet druge trdijo, da ti vezikli nastanejo kot produkti makrofagov, katerim manjka ATG5 (ključna komponenta avtofagosomov). Vsekakor pa njihova formacija vključuje ukrivljanje membran, kar je lahko ključno za insercijo virusnih proteinov v membrano veziklov. Vloga veziklov ni le tvorba primernega okolja za replikacijo RNA in njene zaščite, temveč sodelujejo tudi pri translaciji in tvorbi kapside okrog viriona.
Proteini nsp3, 5 in 8 (vsi sodelujejo pri replikciji) so locirani zunaj membrane teh veziklov, ostali nestrukturni proteini, ki tvorijo RTC kompleks pa so razporejeni na notranji membrani. V notranjosti so opazili tudi dvoverižno RNA, ki verjetno predstavlja intermediat replikacije.

==Viri==
1. Chen, Y., Liu, Q. & Guo, D. Emerging coronaviruses: Genome structure, replication, and pathogenesis. Journal of Medical Virology vol. 92 418–423 (2020).

2. Yuhang, W., Grunewald, M. & Perlman, S. Coronaviruses: An Updated Overview of Their Replication and Pathogenesis. An Autom. Irrig. Syst. Using Arduino Microcontroller 1908, 2–6 (2020).

3. V’kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H. & Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology vol. 19 155–170 (2021).

4. Enjuanes, L., Almazán, F., Sola, I., Zuñiga, S. & Zuñiga, Z. Biochemical Aspects of Coronavirus Replication and Virus-Host Interaction. (2006).

5. Graham, R. L., Sparks, J. S., Eckerle, L. D., Sims, A. C. & Denison, M. R. SARS coronavirus replicase proteins in pathogenesis. (2007).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T11:36:49Z

Marusasernc: /* Mutacije virusov */

== Uvod ==

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

==== Pomen poznavanja genoma ====

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.

== Mutacije virusov ==

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

== Primerjava genomov med koronavirusi ==

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.

== Genom Koronavirusov ==

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali pored zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le-the. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice.
Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne protein se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

==== Bralni okvirji ====

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1b (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

==== Nestrukturni proteini ====

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov.
Poznamo dva načina cepitve poliproteinov:
V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.
Nestrukturni proteini 2 do 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini.
Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze.
Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse. Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu.
Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

==== Strukturni N protein ====

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

==Življenjsji cikel virusa v celici==

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljski faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celiično membrano. Sledi takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih mehurčkov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

==Replikacija==

Koronavirusi se od ostalih virusov razlikujejo po unikatni strategiji replikacije. Replikacija virusnih RNA sledi za translacijo in oblikovanjem RTC kompleksa. Ko replikacijsko transkripcijski kompleks interagira z koronavirusno RNA(+) se začne replikacija RNA molekul. Nastane RNA(-), s katero se lahko zgodita 2 stvari; 1. lahko poteče replikacija in se zopet sintetizira RNA(+) molekula, ki je identična molekuli, ki je prišla v celico iz virusa. Ta se lahko porabi za translacijo in nastanek nestrukturnih proteinov ali pa se zapakira v nove virione in zapusti celico ali pa 2. diskontinuirna transkripcija. Nastajajo različne subgenomske RNA (sgRNA), s pomočjo od RNA odvisne RNA polimeraze. sgRNA služi tvorbi strukturnih in akcesornih proteinov.
Veliko replikonskih zaporedij je zelo pomembnih pri replikaciji RNA. V 5' UTR koncu genoma je 7 lasničnih zank, ki se razširijo v gen 1a. V 3' UTR koncu pa je izbočena lasnična zanka, psevdoknot in hipervariabilno območje. Lasnična zanka in psevdovozelj na 3' koncu se prekrivata in zato ne moreta nastajati enakočasno. Iz tu izhaja ideja, da določene strukture regulirajo različne stopnje RNA sinteze, čeprav podrobnejši mehanizmi delovanja še niso jasni. Bolj raziskan pa je mehanizem nadaljnje replikacije dednega materiala in sicer diskontinuirana transkripcija.
Sama replikacija v veziklih poteka v citosolu gostiteljske celice, sam virus pa kontrolira celoten potek tudi s pomočjo nekaterih virusnih proteinov, ki se prenesejo v jedro gostiteljske celice. Kot vemo, se geni v jedrcu celice izražajo bolj intenzivno, zato tudi položaj genov oz. delov kromosoma vpliva na njihovo prepisovanje. Virusni proteini interagirajo z jedrnimi antigeni in jih prerazporedijo, tako da se intenzivneje sintetizirajo proteini, ki so za virusni življenjski cikel najpomembnejši. Vplivanje na proliferacijo gostiteljske celice je skupna značilnost vseh nidovirusov.

====Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa====

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Nekaj posameznih struktur je bolj natančno definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

====Zaščitno okolje za replikacijo genskega materiala====

Podrobnejši mehanizem replikacije RNA je žal neznanka, je pa znano kje poteka replikacija (in tudi transkripcija) RNA. Nekatere študije zatrjujejo, da vezikli z dvojno membrano izvirajo iz endoplazemskega retikuluma, spet druge trdijo, da ti vezikli nastanejo kot produkti makrofagov, katerim manjka ATG5 (ključna komponenta avtofagosomov). Vsekakor pa njihova formacija vključuje ukrivljanje membran, kar je lahko ključno za insercijo virusnih proteinov v membrano veziklov. Vloga veziklov ni le tvorba primernega okolja za replikacijo RNA in njene zaščite, temveč sodelujejo tudi pri translaciji in tvorbi kapside okrog viriona.
Proteini nsp3, 5 in 8 (vsi sodelujejo pri replikciji) so locirani zunaj membrane teh veziklov, ostali nestrukturni proteini, ki tvorijo RTC kompleks pa so razporejeni na notranji membrani. V notranjosti so opazili tudi dvoverižno RNA, ki verjetno predstavlja intermediat replikacije.

==Viri==
1. Chen, Y., Liu, Q. & Guo, D. Emerging coronaviruses: Genome structure, replication, and pathogenesis. Journal of Medical Virology vol. 92 418–423 (2020).

2. Yuhang, W., Grunewald, M. & Perlman, S. Coronaviruses: An Updated Overview of Their Replication and Pathogenesis. An Autom. Irrig. Syst. Using Arduino Microcontroller 1908, 2–6 (2020).

3. V’kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H. & Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology vol. 19 155–170 (2021).

4. Enjuanes, L., Almazán, F., Sola, I., Zuñiga, S. & Zuñiga, Z. Biochemical Aspects of Coronavirus Replication and Virus-Host Interaction. (2006).

5. Graham, R. L., Sparks, J. S., Eckerle, L. D., Sims, A. C. & Denison, M. R. SARS coronavirus replicase proteins in pathogenesis. (2007).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T11:36:27Z

Marusasernc: /* Pomen poznavanja genoma */

== Uvod ==

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

==== Pomen poznavanja genoma ====

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.

== Mutacije virusov ==

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

==== Primerjava genomov med koronavirusi ====

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.

== Genom Koronavirusov ==

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali pored zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le-the. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice.
Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne protein se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

==== Bralni okvirji ====

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1b (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

==== Nestrukturni proteini ====

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov.
Poznamo dva načina cepitve poliproteinov:
V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.
Nestrukturni proteini 2 do 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini.
Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze.
Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse. Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu.
Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

==== Strukturni N protein ====

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

==Življenjsji cikel virusa v celici==

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljski faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celiično membrano. Sledi takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih mehurčkov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

==Replikacija==

Koronavirusi se od ostalih virusov razlikujejo po unikatni strategiji replikacije. Replikacija virusnih RNA sledi za translacijo in oblikovanjem RTC kompleksa. Ko replikacijsko transkripcijski kompleks interagira z koronavirusno RNA(+) se začne replikacija RNA molekul. Nastane RNA(-), s katero se lahko zgodita 2 stvari; 1. lahko poteče replikacija in se zopet sintetizira RNA(+) molekula, ki je identična molekuli, ki je prišla v celico iz virusa. Ta se lahko porabi za translacijo in nastanek nestrukturnih proteinov ali pa se zapakira v nove virione in zapusti celico ali pa 2. diskontinuirna transkripcija. Nastajajo različne subgenomske RNA (sgRNA), s pomočjo od RNA odvisne RNA polimeraze. sgRNA služi tvorbi strukturnih in akcesornih proteinov.
Veliko replikonskih zaporedij je zelo pomembnih pri replikaciji RNA. V 5' UTR koncu genoma je 7 lasničnih zank, ki se razširijo v gen 1a. V 3' UTR koncu pa je izbočena lasnična zanka, psevdoknot in hipervariabilno območje. Lasnična zanka in psevdovozelj na 3' koncu se prekrivata in zato ne moreta nastajati enakočasno. Iz tu izhaja ideja, da določene strukture regulirajo različne stopnje RNA sinteze, čeprav podrobnejši mehanizmi delovanja še niso jasni. Bolj raziskan pa je mehanizem nadaljnje replikacije dednega materiala in sicer diskontinuirana transkripcija.
Sama replikacija v veziklih poteka v citosolu gostiteljske celice, sam virus pa kontrolira celoten potek tudi s pomočjo nekaterih virusnih proteinov, ki se prenesejo v jedro gostiteljske celice. Kot vemo, se geni v jedrcu celice izražajo bolj intenzivno, zato tudi položaj genov oz. delov kromosoma vpliva na njihovo prepisovanje. Virusni proteini interagirajo z jedrnimi antigeni in jih prerazporedijo, tako da se intenzivneje sintetizirajo proteini, ki so za virusni življenjski cikel najpomembnejši. Vplivanje na proliferacijo gostiteljske celice je skupna značilnost vseh nidovirusov.

====Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa====

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Nekaj posameznih struktur je bolj natančno definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

====Zaščitno okolje za replikacijo genskega materiala====

Podrobnejši mehanizem replikacije RNA je žal neznanka, je pa znano kje poteka replikacija (in tudi transkripcija) RNA. Nekatere študije zatrjujejo, da vezikli z dvojno membrano izvirajo iz endoplazemskega retikuluma, spet druge trdijo, da ti vezikli nastanejo kot produkti makrofagov, katerim manjka ATG5 (ključna komponenta avtofagosomov). Vsekakor pa njihova formacija vključuje ukrivljanje membran, kar je lahko ključno za insercijo virusnih proteinov v membrano veziklov. Vloga veziklov ni le tvorba primernega okolja za replikacijo RNA in njene zaščite, temveč sodelujejo tudi pri translaciji in tvorbi kapside okrog viriona.
Proteini nsp3, 5 in 8 (vsi sodelujejo pri replikciji) so locirani zunaj membrane teh veziklov, ostali nestrukturni proteini, ki tvorijo RTC kompleks pa so razporejeni na notranji membrani. V notranjosti so opazili tudi dvoverižno RNA, ki verjetno predstavlja intermediat replikacije.

==Viri==
1. Chen, Y., Liu, Q. & Guo, D. Emerging coronaviruses: Genome structure, replication, and pathogenesis. Journal of Medical Virology vol. 92 418–423 (2020).

2. Yuhang, W., Grunewald, M. & Perlman, S. Coronaviruses: An Updated Overview of Their Replication and Pathogenesis. An Autom. Irrig. Syst. Using Arduino Microcontroller 1908, 2–6 (2020).

3. V’kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H. & Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology vol. 19 155–170 (2021).

4. Enjuanes, L., Almazán, F., Sola, I., Zuñiga, S. & Zuñiga, Z. Biochemical Aspects of Coronavirus Replication and Virus-Host Interaction. (2006).

5. Graham, R. L., Sparks, J. S., Eckerle, L. D., Sims, A. C. & Denison, M. R. SARS coronavirus replicase proteins in pathogenesis. (2007).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Talk:Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T10:58:09Z

Marusasernc:

Luka Stanković (Uvod - celoten, Genom koronavirusov)

Maruša Sernc (Genom koronavirusov, Replikacija)

Luka Šegota (Življenjski cikel virusa v celici, Replikacija)

Talk:Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T10:57:49Z

Marusasernc: New page: Luka Stanković (Uvod - celoten, Genom koronavirusov) Maruša Sernc (Genom koronavirusov, Replikacija) Luka Šegota (Življenjski cikel virusa v celici, Replikacija)

Luka Stanković (Uvod - celoten, Genom koronavirusov)
Maruša Sernc (Genom koronavirusov, Replikacija)
Luka Šegota (Življenjski cikel virusa v celici, Replikacija)

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T10:46:47Z

Marusasernc: /* Viri */

== Uvod ==

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

==== Pomen poznavanja genoma ====

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.
Mutacije virusov

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

==== Primerjava genomov med koronavirusi ====

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.

== Genom Koronavirusov ==

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali pored zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le-the. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice.
Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne protein se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

==== Bralni okvirji ====

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1b (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

==== Nestrukturni proteini ====

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov.
Poznamo dva načina cepitve poliproteinov:
V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.
Nestrukturni proteini 2 do 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini.
Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze.
Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse. Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu.
Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

==== Strukturni N protein ====

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

==Življenjsji cikel virusa v celici==

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljski faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celiično membrano. Sledi takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih mehurčkov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

==Replikacija==

Koronavirusi se od ostalih virusov razlikujejo po unikatni strategiji replikacije. Replikacija virusnih RNA sledi za translacijo in oblikovanjem RTC kompleksa. Ko replikacijsko transkripcijski kompleks interagira z koronavirusno RNA(+) se začne replikacija RNA molekul. Nastane RNA(-), s katero se lahko zgodita 2 stvari; 1. lahko poteče replikacija in se zopet sintetizira RNA(+) molekula, ki je identična molekuli, ki je prišla v celico iz virusa. Ta se lahko porabi za translacijo in nastanek nestrukturnih proteinov ali pa se zapakira v nove virione in zapusti celico ali pa 2. diskontinuirna transkripcija. Nastajajo različne subgenomske RNA (sgRNA), s pomočjo od RNA odvisne RNA polimeraze. sgRNA služi tvorbi strukturnih in akcesornih proteinov.
Veliko replikonskih zaporedij je zelo pomembnih pri replikaciji RNA. V 5' UTR koncu genoma je 7 lasničnih zank, ki se razširijo v gen 1a. V 3' UTR koncu pa je izbočena lasnična zanka, psevdoknot in hipervariabilno območje. Lasnična zanka in psevdovozelj na 3' koncu se prekrivata in zato ne moreta nastajati enakočasno. Iz tu izhaja ideja, da določene strukture regulirajo različne stopnje RNA sinteze, čeprav podrobnejši mehanizmi delovanja še niso jasni. Bolj raziskan pa je mehanizem nadaljnje replikacije dednega materiala in sicer diskontinuirana transkripcija.
Sama replikacija v veziklih poteka v citosolu gostiteljske celice, sam virus pa kontrolira celoten potek tudi s pomočjo nekaterih virusnih proteinov, ki se prenesejo v jedro gostiteljske celice. Kot vemo, se geni v jedrcu celice izražajo bolj intenzivno, zato tudi položaj genov oz. delov kromosoma vpliva na njihovo prepisovanje. Virusni proteini interagirajo z jedrnimi antigeni in jih prerazporedijo, tako da se intenzivneje sintetizirajo proteini, ki so za virusni življenjski cikel najpomembnejši. Vplivanje na proliferacijo gostiteljske celice je skupna značilnost vseh nidovirusov.

====Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa====

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Nekaj posameznih struktur je bolj natančno definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

====Zaščitno okolje za replikacijo genskega materiala====

Podrobnejši mehanizem replikacije RNA je žal neznanka, je pa znano kje poteka replikacija (in tudi transkripcija) RNA. Nekatere študije zatrjujejo, da vezikli z dvojno membrano izvirajo iz endoplazemskega retikuluma, spet druge trdijo, da ti vezikli nastanejo kot produkti makrofagov, katerim manjka ATG5 (ključna komponenta avtofagosomov). Vsekakor pa njihova formacija vključuje ukrivljanje membran, kar je lahko ključno za insercijo virusnih proteinov v membrano veziklov. Vloga veziklov ni le tvorba primernega okolja za replikacijo RNA in njene zaščite, temveč sodelujejo tudi pri translaciji in tvorbi kapside okrog viriona.
Proteini nsp3, 5 in 8 (vsi sodelujejo pri replikciji) so locirani zunaj membrane teh veziklov, ostali nestrukturni proteini, ki tvorijo RTC kompleks pa so razporejeni na notranji membrani. V notranjosti so opazili tudi dvoverižno RNA, ki verjetno predstavlja intermediat replikacije.

==Viri==
1. Chen, Y., Liu, Q. & Guo, D. Emerging coronaviruses: Genome structure, replication, and pathogenesis. Journal of Medical Virology vol. 92 418–423 (2020).

2. Yuhang, W., Grunewald, M. & Perlman, S. Coronaviruses: An Updated Overview of Their Replication and Pathogenesis. An Autom. Irrig. Syst. Using Arduino Microcontroller 1908, 2–6 (2020).

3. V’kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H. & Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology vol. 19 155–170 (2021).

4. Enjuanes, L., Almazán, F., Sola, I., Zuñiga, S. & Zuñiga, Z. Biochemical Aspects of Coronavirus Replication and Virus-Host Interaction. (2006).

5. Graham, R. L., Sparks, J. S., Eckerle, L. D., Sims, A. C. & Denison, M. R. SARS coronavirus replicase proteins in pathogenesis. (2007).

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T10:22:43Z

Marusasernc: /* Viri */

== Uvod ==

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

==== Pomen poznavanja genoma ====

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.
Mutacije virusov

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

==== Primerjava genomov med koronavirusi ====

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.

== Genom Koronavirusov ==

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali pored zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le-the. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice.
Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne protein se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

==== Bralni okvirji ====

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1b (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

==== Nestrukturni proteini ====

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov.
Poznamo dva načina cepitve poliproteinov:
V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.
Nestrukturni proteini 2 do 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini.
Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze.
Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse. Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu.
Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

==== Strukturni N protein ====

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

==Življenjsji cikel virusa v celici==

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljski faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celiično membrano. Sledi takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih mehurčkov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

==Replikacija==

Koronavirusi se od ostalih virusov razlikujejo po unikatni strategiji replikacije. Replikacija virusnih RNA sledi za translacijo in oblikovanjem RTC kompleksa. Ko replikacijsko transkripcijski kompleks interagira z koronavirusno RNA(+) se začne replikacija RNA molekul. Nastane RNA(-), s katero se lahko zgodita 2 stvari; 1. lahko poteče replikacija in se zopet sintetizira RNA(+) molekula, ki je identična molekuli, ki je prišla v celico iz virusa. Ta se lahko porabi za translacijo in nastanek nestrukturnih proteinov ali pa se zapakira v nove virione in zapusti celico ali pa 2. diskontinuirna transkripcija. Nastajajo različne subgenomske RNA (sgRNA), s pomočjo od RNA odvisne RNA polimeraze. sgRNA služi tvorbi strukturnih in akcesornih proteinov.
Veliko replikonskih zaporedij je zelo pomembnih pri replikaciji RNA. V 5' UTR koncu genoma je 7 lasničnih zank, ki se razširijo v gen 1a. V 3' UTR koncu pa je izbočena lasnična zanka, psevdoknot in hipervariabilno območje. Lasnična zanka in psevdovozelj na 3' koncu se prekrivata in zato ne moreta nastajati enakočasno. Iz tu izhaja ideja, da določene strukture regulirajo različne stopnje RNA sinteze, čeprav podrobnejši mehanizmi delovanja še niso jasni. Bolj raziskan pa je mehanizem nadaljnje replikacije dednega materiala in sicer diskontinuirana transkripcija.
Sama replikacija v veziklih poteka v citosolu gostiteljske celice, sam virus pa kontrolira celoten potek tudi s pomočjo nekaterih virusnih proteinov, ki se prenesejo v jedro gostiteljske celice. Kot vemo, se geni v jedrcu celice izražajo bolj intenzivno, zato tudi položaj genov oz. delov kromosoma vpliva na njihovo prepisovanje. Virusni proteini interagirajo z jedrnimi antigeni in jih prerazporedijo, tako da se intenzivneje sintetizirajo proteini, ki so za virusni življenjski cikel najpomembnejši. Vplivanje na proliferacijo gostiteljske celice je skupna značilnost vseh nidovirusov.

====Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa====

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Nekaj posameznih struktur je bolj natančno definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

====Zaščitno okolje za replikacijo genskega materiala====

Podrobnejši mehanizem replikacije RNA je žal neznanka, je pa znano kje poteka replikacija (in tudi transkripcija) RNA. Nekatere študije zatrjujejo, da vezikli z dvojno membrano izvirajo iz endoplazemskega retikuluma, spet druge trdijo, da ti vezikli nastanejo kot produkti makrofagov, katerim manjka ATG5 (ključna komponenta avtofagosomov). Vsekakor pa njihova formacija vključuje ukrivljanje membran, kar je lahko ključno za insercijo virusnih proteinov v membrano veziklov. Vloga veziklov ni le tvorba primernega okolja za replikacijo RNA in njene zaščite, temveč sodelujejo tudi pri translaciji in tvorbi kapside okrog viriona.
Proteini nsp3, 5 in 8 (vsi sodelujejo pri replikciji) so locirani zunaj membrane teh veziklov, ostali nestrukturni proteini, ki tvorijo RTC kompleks pa so razporejeni na notranji membrani. V notranjosti so opazili tudi dvoverižno RNA, ki verjetno predstavlja intermediat replikacije.

==Viri==
1. Chen, Y., Liu, Q. & Guo, D. Emerging coronaviruses: Genome structure, replication, and pathogenesis. Journal of Medical Virology vol. 92 418–423 (2020).

2. Yuhang, W., Grunewald, M. & Perlman, S. Coronaviruses: An Updated Overview of Their Replication and Pathogenesis. An Autom. Irrig. Syst. Using Arduino Microcontroller 1908, 2–6 (2020).

3. V’kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H. & Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology vol. 19 155–170 (2021).

4. Enjuanes, L., Almazán, F., Sola, I., Zuñiga, S. & Zuñiga, Z. Biochemical Aspects of Coronavirus Replication and Virus-Host Interaction. (2006).

5. Graham, R. L., Sparks, J. S., Eckerle, L. D., Sims, A. C. & Denison, M. R. SARS coronavirus replicase proteins in pathogenesis. (2007).

Struktura genoma in replikacija RNA pri koronavirusih

2021-05-05T10:21:32Z

Marusasernc: /* Viri */

== Uvod ==

Koronavirusi (Coronaviridae) so največja družina virusov iz roda Nidovirales. Vsi virusi družin rodu Nidovirales (Coronaviridae, Arteriviridae, Roniviridae in Mesoniviridae) so nesegmentirani RNA virusi obdani s fosfolipidnim ovojem in dobro ohranjeno organizacijo gnoma. Slednji je pri Nidovirales v primerjavi z RNA virusi drugih rodov mnogo daljši in specifičen v številnih pogledih.

==== Pomen poznavanja genoma ====

Poznavanje genoma virusa je ključnega pomena. S sekvenciranjem genoma virusa lahko izvemo več o njegovi strukturi, delovanju, življenjskem ciklu, hitrosti širjenja in njegovi smrtonostnosti, obenem pa nam razkriva njegove slabosti in možnosti za boj proti virusu.
Mutacije virusov

Virusi se ves čas spreminjajo in kljub relativno uspešnim popravljalnim mehanizmom pri velikemu številu replikacij prihaja do mutacij. Le-te se sicer v večini primerov ne ohranijo, če ne pripomorejo k povečanju možnosti preživetja virusa ali pa k povečanju njegove infektivnosti. SARS-CoV-2 je najbolj razširjen koronavirus in je do maja 2021 okužil več kot 150 milijonov ljudi, kar je virusu omogočilo zelo veliko število replikacij in posledično mutacij, ki vodijo do nastanka novih sevov virusa. Do maja 2021 je bilo sekvencioniranih že več kot 1,3 milijone genomov SARS-CoV-2. Pogost odvzem vzorcev in sekvenciranje genomov virusa širše populacije je ključen za sledenje razvoja virusa in identifikacijo novih sevov.

==== Primerjava genomov med koronavirusi ====

Primerjava genomov posameznih virusov nam pomaga razumeti njihovo evolucijo in potencialno sorodnost med njimi, kar nam omogoča hitrejšo identifikacijo sredstva za boj proti novim virusom na podlagi preteklih raziskav sorodnih primerov. Poravnava genomov koronavirusov je pokazala 58 % ujemanje na področju regije nestrukturnih proteinov in 43 % ujemanje na delu genoma, ki nosi zapis za strukturne proteine. Slednje nakazuje na dejstvu, da so zapisi za nestrukturni proteini veliko bolj ohranjeni, medtem ko je pri sami strukturi virusa skozi evolucijo prihajalo do večjega števila prilagoditev odvisnih od gostitelja. (Analiza genoma SARS-CoV-2 je pokazala večje ujemanje z SARS-CoV najdenega v netopirjih kakor tistega, ki je bil prisoten pri okužbi pri ljudeh.

== Genom Koronavirusov ==

Genom koronavirusa je pozitivna enoverižna RNA zgrajena iz približno 30 tisoč baznih parov, kar ga uvršča med RNA viruse z najdaljšim genomom. Na 5’ koncu je zaščiten s 5’ kapo. Začne se z vodilno verigo ter nekodirajočo regijo. Tu se nahajajo številne zankaste structure, ki imajo pomembno vlogo pri translaciji in transkripciji. V smeri proti 3’ koncu sledi področje z zapisi za nestrukturne proteine. To področje se razteza čez približno 2/3 genoma (okoli 20 tisoč baz). Primarna naloga nestrukturnih proteinov je tvorba replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki omogoča podvojevanje RNA. Nestrukturni proteini, ki ne sodelujejo pri replikaciji oziroma transkripciji, omogočajo virusu nadzor nad gostiteljem.

Zadnjih 10 tisoč baz nosi zapis za strukturne proteine, ki so del kasneje nastalega viriona. Štirje osrednji strukturni proteini, ki imajo kodirajoče regije v genomu nanizane v enakem zaporedju, kot so navedeni v besedilu, so S protein, ki sestavlja bodice (S-spike), protein M, sestavni del membrane (M-membrane), E protein ovojnice (E-envelope) in protein N (N-nucleocapsid). Genom poleg naštetih vsebuje tudi zapise za več drugih strukturnih proteinov, ki se nahajajo med ali pored zapisov za S, M, E, N proteine. V zadnji tretjini genoma na 3’ se nahajajo tudi zapisi za pomožne proteine. Slednji nimajo pomembne vloge pri transkripciji in translaciji, saj sta procesa potekala tudi po izbrisu le-the. Izkazalo pa se je, da imajo ponekod ključno vlogo pri oslabitvi obrambnega mehanizma gostiteljske celice.
Pred vsakim zaporedjem, ki kodira zapis za strukturne ali pomožne protein se nahajajo regulatorna zaporedja, ki regulirajo transkripcijo in s tem vplivajo na ekspresijo določenega proteina. Pri 3’ koncu se zopet pojavi nekodirajoča regija, ki ji na sledi poli-A rep.

==== Bralni okvirji ====

Večina koronavirusnih genomov in subgenomov vsebuje vsaj 6 odprtih bralnih okvirjev. Bralna okvirja ORF1a in b (imenovana tudi rep1a in rep1b) pokrivata območje zapisa za nestrukturne proteine, katerih je 16 pri vseh koronavirusih (z izjemo gamma-koronavirusov, ki so brez prvega). Translacija ORF1a podaja poliprotein velikosti 500 kDa, imenovan poliprotein 1a (pp1a). Pri translaciji ORF1a/b, kjer pride do zamika bralnega okvirja za -1, pa dobimo poliprotein velikosti 800 kDa, ki se imenuje poliprotein 1b (pp1ab). Da lahko pride do zamika bralnega okvirja in s tem do sinteze obeh poliproteinov, virus uporablja spolzko zaporedje in RNA psevdovozel, ki povzročata ribosomalni premik bralnega okvirja iz rep1a na odprti bralni okvir rep1b. V večini primerov ribosom odvija psevodvozel in nadaljuje s translacijo dokler ne naleti na rep 1a stop kodon. Občasno pa psevdovozel prepreči ribosomu nadaljevanje elongacije, kar povzroči zaustavitev translacije na spolzkem zaporedju. Temu sledi premik bralnega okvirja za eno mesto nazaj in kot rezultat dobimo poliprotein 1ab. Virusi verjetno uporabljajo premik bralnega okvirja za regulacijo razmerja med poliproteinoma 1a in 1ab. Slednja nista bila zaznana v času infekcije, kar nakazuje na dejstvo, da sta pocesirana v zrele proteine šele v kotranslacijskem oziroma posttranslacijskem procesu.

==== Nestrukturni proteini ====

Iz pp1a nastanejo nestrukturni proteini 1 – 11, medtem ko je pp1ab procesiran v vseh 16 nestrukturnih proteinov.
Poznamo dva načina cepitve poliproteinov:
V prvem primeru ena ali dve papain-like proteazi, ki se nahajata v nsp3 cepita za nestrukturne proteine 1, 2 in 3. Nekatere od teh proteaz imajo tudi deubikvitinazno aktivnost, ki nasprotuje celični antivirusni obrambi. Imajo tudi pomembno vlogo pri združevanju virusnih replikacijskih struktur. Glavna proteaza – nsp5 opravi ostalih 11 cepitev. Kot vidimo, imajo glavna in papain-like proteaze pomembno vlogo že na začetku replikacije, zato predstavljajo pomembno tarčo za napad zdravil, predvsem nsp5, saj ima zelo specifično zaporedje in je bistveno lažje izdelati molekule, ki se bodo vezale le nanjo in ne bodo poškodovale ostalih proteaz v celici.
Nestrukturni proteini 2 do 16 se povežejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks, ki je ključen pri sintezi RNA. Nsp3, 4 in 6 imajo v svoji strukturi transmembranske vijačnice, ki zasidrajo replikacijsko-transkripcijski kompleks v membrano organelov, v katerih poteka sinteza virusne RNA. Ti organeli se imenujejo vezikli z dvojno membrano, za njihov nastanek pa so ključni prav ti trije nestrukturni proteini.
Nsp 7, 8, 9 in 10 sodelujejo pri subgenomski in genomski replikaciji (subgenomska oz. diskontinuirna replikacija je natančneje razložena v naslednjem seminarju). Nsp7 in 8 tvorita heksadekamerni strukturi in sta ključni za vezavo RNA. Nsp10 je neencimski protein, ki vpliva na pravilnost replikacije tako, da regulira aktivnost nsp14 in 16. Mutacije v nsp10 inhibirajo sintezo -RNA, vendar je ta efekt neposreden, saj so raziskave pokazale, da je nsp10 ključen za funkcioniranje glavne proteaze.
Nsp14 je eksonukleaza, ki cepi od 3' proti 5' koncu in skrbi za pravilno transkripcijo RNA, saj služi za kontrolno branje. Nsp15 vsebuje endoribonukleazno domeno, ki pa je značilna le za koronaviruse oz. za nidoviruse. Enako velja tudi za eksonukleazo, zato predstavljata ta dva proteina genetska markerja za to vrsto virusov. Nsp 16 je od S-adenozil-metionina odvisna RNA transferaza, ki pa sodeluje pri tvorbi kape na 5’ koncu.
Nsp12 je od RNA odvisna RNA-polimeraza, nsp13 pa RNA helikaza. Nsp8 najverjetneje deluje kot primaza in je skupaj z nsp7 kofaktor glavne polimeraze.

==== Strukturni N protein ====

S samo replikacijo je neposredno povezan tudi strukturni protein N, ki tvori z genomsko RNA ribonukleoprotein, torej sodeluje tudi pri replikaciji. V začetnih fazah infekcije N protein kolokalizira z replikacijsko-transkripcijskim kompleksom v veziklih z dvojno membrano. Sicer raziskave o sodelovanju N proteina še potekajo, nekateri znanstveniki trdijo, da je njegova prisotnost nujna za sintezo RNA, medtem ko mu drugi pri replikaciji ne pripisujejo pretirano velikega pomena. Nekatere analize so sicer pokazale 100 krat večjo aktivnost replikona ob prisotnosti cis oblike N proteina in kar 1000 krat povečano aktivnost, če je bila navzoča trans oblika. Ali je prisotnost samega proteina bolj ključna pri replikaciji ali transkripciji ali pri obema je potrebno še raziskati.

==Življenjsji cikel virusa v celici==

V času življenjskega cikla v celici koronavirus replicira svojo genomsko RNA, v namen tvorbe kopij celotne dolžine RNA, ki so nato vključene v novonastale virusne delce. Replikacija se začne takoj po okužbi. Koronavirus se veže na celico s pomočjo interakcij med S-proteinom virusa in receptorji na celicah (ACE-2 v primeru SARS-CoV-2) ter gostiteljski faktorji (TMPRSS2). Sledi fuzija virusa s celiično membrano. Sledi takojšnja translacija dveh velikih odprtih bralnih okvirjev, ORF1a in ORF1b. Sintetizirata se 2 velika poliproteina pp1a in pp1ab, ki se preko posttranslacijskih modifikacij preoblikujeta v več manjših nestrukturnih proteinov (nsps), ki se oblikujejo v replikacijsko-transkripcijski kompleks. Ustvari se zaščitno okolje za replikacijo virusnega dednega materiala, ki sestoji iz perinulklearnih dvomembranskih mehurčkov (DMV), zvitih membran (CM) in majhnih odprtih dvojno membranskih kroglic (DMS). Strukturni proteini se preselijo na membrane endoplazemskega retikuluma in prehajajo čez ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC), kjer se združijo strukturni proteini z novo nastalo (+)RNA, ki kasneje služi kot podlaga za nastajanje novih mRNA molekul. Za tem se virioni iz celice izločijo z eksocitozo.

==Replikacija==

Koronavirusi se od ostalih virusov razlikujejo po unikatni strategiji replikacije. Replikacija virusnih RNA sledi za translacijo in oblikovanjem RTC kompleksa. Ko replikacijsko transkripcijski kompleks interagira z koronavirusno RNA(+) se začne replikacija RNA molekul. Nastane RNA(-), s katero se lahko zgodita 2 stvari; 1. lahko poteče replikacija in se zopet sintetizira RNA(+) molekula, ki je identična molekuli, ki je prišla v celico iz virusa. Ta se lahko porabi za translacijo in nastanek nestrukturnih proteinov ali pa se zapakira v nove virione in zapusti celico ali pa 2. diskontinuirna transkripcija. Nastajajo različne subgenomske RNA (sgRNA), s pomočjo od RNA odvisne RNA polimeraze. sgRNA služi tvorbi strukturnih in akcesornih proteinov.
Veliko replikonskih zaporedij je zelo pomembnih pri replikaciji RNA. V 5' UTR koncu genoma je 7 lasničnih zank, ki se razširijo v gen 1a. V 3' UTR koncu pa je izbočena lasnična zanka, psevdoknot in hipervariabilno območje. Lasnična zanka in psevdovozelj na 3' koncu se prekrivata in zato ne moreta nastajati enakočasno. Iz tu izhaja ideja, da določene strukture regulirajo različne stopnje RNA sinteze, čeprav podrobnejši mehanizmi delovanja še niso jasni. Bolj raziskan pa je mehanizem nadaljnje replikacije dednega materiala in sicer diskontinuirana transkripcija.
Sama replikacija v veziklih poteka v citosolu gostiteljske celice, sam virus pa kontrolira celoten potek tudi s pomočjo nekaterih virusnih proteinov, ki se prenesejo v jedro gostiteljske celice. Kot vemo, se geni v jedrcu celice izražajo bolj intenzivno, zato tudi položaj genov oz. delov kromosoma vpliva na njihovo prepisovanje. Virusni proteini interagirajo z jedrnimi antigeni in jih prerazporedijo, tako da se intenzivneje sintetizirajo proteini, ki so za virusni življenjski cikel najpomembnejši. Vplivanje na proliferacijo gostiteljske celice je skupna značilnost vseh nidovirusov.

====Tvorba replikacijsko-transkripcijskega kompleksa====

Replikacija virusa je direktno povezana z tvorbo replikacijsko transkripcijskega kompleksa (RTC), ki je tudi potencialna tarča za zdravila. Na RTC poteka sinteza tako genomske kot tudi subgenomske RNA, katera je potrebna tako za replikacijo virusnega genoma kot tudi za transkripcijo virusnih proteinsko kodiranih genov. Nekaj posameznih struktur je bolj natančno definiranih (glej strukture posameznih nestrukturnih proteinov). Replikacija in transkripcija potekata po modelu leader-to-body fusion.

====Zaščitno okolje za replikacijo genskega materiala====

Podrobnejši mehanizem replikacije RNA je žal neznanka, je pa znano kje poteka replikacija (in tudi transkripcija) RNA. Nekatere študije zatrjujejo, da vezikli z dvojno membrano izvirajo iz endoplazemskega retikuluma, spet druge trdijo, da ti vezikli nastanejo kot produkti makrofagov, katerim manjka ATG5 (ključna komponenta avtofagosomov). Vsekakor pa njihova formacija vključuje ukrivljanje membran, kar je lahko ključno za insercijo virusnih proteinov v membrano veziklov. Vloga veziklov ni le tvorba primernega okolja za replikacijo RNA in njene zaščite, temveč sodelujejo tudi pri translaciji in tvorbi kapside okrog viriona.
Proteini nsp3, 5 in 8 (vsi sodelujejo pri replikciji) so locirani zunaj membrane teh veziklov, ostali nestrukturni proteini, ki tvorijo RTC kompleks pa so razporejeni na notranji membrani. V notranjosti so opazili tudi dvoverižno RNA, ki verjetno predstavlja intermediat replikacije.

==Viri==
1. Chen, Y., Liu, Q. & Guo, D. Emerging coronaviruses: Genome structure, replication, and pathogenesis. Journal of Medical Virology vol. 92 418–423 (2020).
2. Yuhang, W., Grunewald, M. & Perlman, S. Coronaviruses: An Updated Overview of Their Replication and Pathogenesis. An Autom. Irrig. Syst. Using Arduino Microcontroller 1908, 2–6 (2020).
3. V’kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H. & Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology vol. 19 155–170 (2021).
4. Enjuanes, L., Almazán, F., Sola, I., Zuñiga, S. & Zuñiga, Z. Biochemical Aspects of Coronavirus Replication and Virus-Host Interaction. (2006).
5. Graham, R. L., Sparks, J. S., Eckerle, L. D., Sims, A. C. & Denison, M. R. SARS coronavirus replicase proteins in pathogenesis. (2007).

BIO2 Povzetki seminarjev 2020

2021-01-08T20:44:53Z

Marusasernc: /* POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2020/21 */

= POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2020/21 =

==Jan Bregar - Protein retinoblastoma==

Protein retinoblastoma (pRb) je eden ključnih proteinov, ki regulirajo celični cikel in njegova inaktivacija lahko povzroči različna bolezenska stanja. Ta protein regulira ključni prehod iz G1 v S fazo celičnega cikla s pomočjo interakcij z družino E2F, ki je vrsta transkripcijskih faktorjev celičnega cikla. Retinoblastoma protein (pRb) nadzoruje tudi izstop celice iz celičnega cikla. Njeno aktivnost regulira več mehanizmov, ki zaznavajo znotraj- in zunajcelične signale, ki blokirajo ali dovoljujejo fosforilacijo. pRb fosforilirajo od ciklina odvisne kinaze (Cdk-ji) in s tem protein Rb bodisi inaktivirajo ali pa rahlo spremenijo njegove lastnosti, protein pa vseeno ohrani svojo funkcijo. Odkrili so tudi, da pRb regulira apoptozo s pomočjo enakih interakcij s transkripcijskimi faktorji E2F. To, da je pRb vpleten pri apoptozi, popolno dopolnjuje pRb kot pomemben določevalec usode celice. Med trajanjem celičenga cikla je pRb inaktiviran, kar povzroči, da je celica bolj občutljiva na apoptotske stimuluse. Regulacijo apoptoze lahko onesposobijo nekateri virusi, ki s svojimi onkoproteini povzročijo napake v delovanju proteina Rb, kar lahko predstavlja tveganje za organizem. pRb – E2F kompleksi imajo pomembno vlogo pri regulaciji transkripcije genov, ki so vključeni v diferenciaciji in razvoju.

==Ajda Beltram - Struktura in dinamika signalnih komplekov GPCR==

Receptorji sklopljeni z G-proteinom (GPCR) so transmembranski proteini, ki kot odgovor na ligande regulirajo veliko signalnih poti preko heterotrimernih G-proteinov ali pa preko fosforilacije receptorja s kinazo GRK in arestinov. Vendar ti proteini ne obstajajo le v aktivirani ali neaktivirani obliki, pač pa imajo veliko konformacijskih stanj, ki vsaka sproži svojo signalno pot. Mene je zanimala podrobna razlaga konformacijskih sprememb, ki se zgodijo med prenosom signala. Za aktivacijo G-proteinov je potrebna zamenjava GDP z GTP, kjer igra ključno vlogo razcep domen podenote α G-proteina in destabilizacija vezavnega mesta za nukleotid na Ras-domeni podenote α, kar so posledice konformacijskih sprememb, ki jih povzroči vezava na receptor. Različni ligandi, ki se vežejo na receptorje, pa lahko vplivajo tudi na afiniteto G-proteina do GDP. Kompleksi receptor-G-protein, ki nastanejo z vezavo popolnih agonistov, imajo manjšo afiniteto do GDP, kot tisti, ki so nastali z vezavo delnih agonistov. Pri arestinih pa so prav tako prišli do novega spoznanja. Aktivacija arestinov je večinoma prikazana kot proces iz dveh delov in sicer vezave na fosforiliran C-rep receptorja in nato vezave na jedro receptorja, vendar pa so odkrili, da lahko obe vezavi posebej aktivirata arestin. To nakazuje na to, da verjetno obstaja veliko različnih kompleksov arestina in receptorja, ki regulirajo vsak svojo signalno pot.

==Anja Moškrič - Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmitorjev==

Signalizacija živčnih celic med drugim poteka s prenosom nevrotransmitorjev preko sinaps. Pri kemični sinapsi gre za pretvarjanje električnih impulzov v eksocitotsko sprostitev nevrotransmitorja (npr. glutamat, GABA, epinefrin, norepinefrin). Pri pretvarjanju signala imajo ključno vlogo napetostno uravnavani kalcijevi ionski kanalčki (Cav), v presinaptičnem predelu. Ti, kot odgovor na depolarizacijo nevrona, usmerjajo kalcijeve ione v notranjost celice in posledično sprožijo fuzijo mešička (z nevrotransmitorjem) s presinaptično membrano. Zgrajeni so iz več podenot, od teh je glavna α1, ki tvori poro za pretok ionov. Podenoti α2δ in β pa regulirata lastnosti. Kanalčke glede na obliko glavne podenote klasificiramo v 3 večje skupine: Cav1, Cav2 in Cav3. V večini sinaps so prisotni kanalčki iz družine Cav2. Da eksocitoza lahko poteče hitro in učinkovito, morajo biti Cav locirani znotraj aktivne regije presinaptične membrane, v bližini mesta eksocitoze. Slednjo kalcijevi kanalčki regulirajo preko različnih proteinov. Pomembnejši predstavnik je družina proteinov RIM (z rab3 vezavne molekule). Ti se na kanalček vežejo z RIM vezavnimi proteini (RBP). Z njimi asociira tudi protein munc13, ki je v membrani vezikla in nevrona vezani s proteini SNARE. Ti so mediatorji pri fuziji membran. Delovanje kanalčka inaktivirajo procesi, kot sta od napetosti odvisni mehanizem in od kalcija odvisen mehanizem, ki je povezan s kalmodulinom.

==Gregor Strniša - Načini aktivacije GPCR==

GPCR, oziroma z G proteinom sklopljeni receptorji, so transmembranski proteini, ki s svojim delovanjem vplivajo na dogajanje v celici. Zaradi vezave liganda na njihovo zunajcelično stran se jim spremeni konformacija in omogoči prenos signala preko različnih signalnih molekul. Signal se preko različnih G proteinov in β-arrestinov prenaša do drugih proteinov v celici. Kmalu po odkritju GPCR se je izkazalo, da vsi ne delujejo po istem principu. Nove raziskovalne metode so omogočile napredek na področju vizualizacije molekul in njihovega sledenja v celici. Tako so znanstveniki prišli do odkritja petih novih metod aktivacije GPCR, ki lažje razložijo delovanje receptorjev. Med seboj so si različne, a se lahko pogosto prekrivajo in dopolnjujejo. GPCR omogočijo več možnosti odgovora na določen ligand in njegovo koncentracijo. Načini aktivacije, predstavljeni v moji seminarski nalogi, so pristranska aktivacija, znotrajcelična aktivacija, dimerizacijska aktivacija, transaktivacija in dvofazna aktivacija. Posamezen receptor navadno deluje na več načinov. Ob posameznem načinu so podani primeri receptorjev in njihovega delovanja. Z razumevanjem načinov njihove aktivacije se odprejo nove možnosti razvoja zdravil, ki bi delovale preko GPCR, ali vplivale na njihove signalne poti.

==Nikola Janakievski - Selective Androgen Receptor Modulators==

Selective Androgen Receptors Modulators or better known as SARMs, were discovered 30 years ago, as a potential replacement to steroid therapy. SARMs are a type of Selective Receptor Modulators (SRM), compounds which can act both as agonists and antagonists in androgen receptors (ARs) (as a non-steroid replacement), according to the tissue they are in. The main idea behind SARMs, is improving the hormone therapies we have currently, which use synthetic steroids. An ideal SARM could have all the benefits of steroid hormones, without the side effects. The potential benefits and safety of SARMs is yet to be determined, there are numerous ongoing studies for various applications. It is important to have a summary of all these potential application and past examples of studies. In this seminar, we aim to do just that, by comparing all past studies and future potential applications related to SARMs. We conclude that, SARMs are a viable alternative, possibly an improvement to synthetic steroids, although much more research and clinical trials are required for SARMs to become truly applicable.

==Vid Dobrovoljc - Medsebojni vpliv signalnih poti na primeru RTK in GPCR signalnih poti==

Preučevanje součinkovanja med signalnimi potmi v celici je zelo zanimivo področje, vendar dokaj težko za raziskovanje. S seminarjem sem poizkusil predstaviti sovplivanje inzulinske(RTK) in β-adrenergične (GCPR) poti v srcu. . Inzulin na β-adrenergične (βAR) poti vpliva s fosforilacijo receptorja z različnimi kinazami, na primer protein kinazo A (PKA) G-protein kinazo (GRK2) in celo sam inzulinskim receptorjem (INSR), kar vodi do desenzitacije in včasih tudi internalizacije receptorja z vezavo β-arestina. Drug način vplivanja je z delovanjem na nižje člene v signalni poti, na primer na koncentracijo cAMP s fosfodiesterazami (PDE). Inzulin lahko tudi s pomočjo fosforilacije uporabi β-adrenergično pot za krepitev svojega signala. Zelo pomembna točka obeh signalnih poti je GRK2, ki po naravi deluje inhibirajoče na obe signalni poti, po zadnjih rezultatih pa jo poleg tega inzulin uporablja za še dodatno inhibicijo GPCR poti. Vplivanje βAR poti na inzulinsko pot je manj jasno, vendar kaže, da lahko βAR na sprejem glukoze v odvisnosti od situacije vpliva tako pozitivno kot negativno, dokaj pomembno vlogo pri tem pa ima PKB. Domnevam, da bo v prihodnosti vedno več raziskav na temo povezav med signalnimi potmi, saj bodo razvite nove opazovalne tehnike, poleg tega pa je razumevanje povezav koristno tako pri razvoju novih tehnik zdravljenja, kot pri samem študiju razvoja celične signalizacije

==Rebeka Jerina - Kofein kot antagonist adenozinskih receptorjev==

Veliko ljudi po svetu pije kavo, čaj ali kokakolo. Vsem naštetim pijačam je skupen kofein, najpogosteje zaužit psihostimulant na svetu. Kofein povzroča veliko učinkov, med katerimi je najbolj znan vpliv na budnost. Zanima me ali vemo kako in zakaj jo povzroči. Kofein je antagonist adenozinskih receptorjev (ARs). Ima podobno strukturo kot adenozin, zato lahko zaseda njegova vezavna mesta. Adenozinski receptorji so izraženi v mnogih tkivih, veliko pa jih najdemo v centralnem živčnem sistemu (CNS). Raziskala sem, da kofein večinoma vpliva na adenozinska receptorja podtipa A1 in A2A. Te dva podtipa adenozinskih receptorjev (ARs) vplivata na regulacijo mnogih fizioloških funkcij kot so spanje, kognicija, motivacija in čustva. Kofein tako z antagonizmom adenozinskih receptorjev (ARs) prepreči signalno kaskado, ki bi spodbudila zaspanost in posledično ohranja budnost. Adenozinski receptorji (ARs) spadajo pod receptorje povezane z G-proteini. Zgradba A1AR in A2AAR se nekoliko razlikuje, zato je tudi mehanizem delovanja teh dveh podtipov nekoliko drugačen. Signalizacija adenozinskih receptorjev (ARs) lahko poteka po več različnih signalnih poteh. Kofein bi zaradi pozitivnih okrepitvenih učinkov, pojava različnih duševnih motenj in pojava negativnih simptomov po prenehanju uživanja lahko prištevali med droge. Raziskave so pokazale, da se z antagonizmom adenozinskih receptorjev da uspešno zdraviti tudi številne bolezni. Glede na učinke in uporabo kofeina bi lahko rekli, da velja za hranilo, zdravilo ali drogo.

==Zala Perko - Mehanizmi vezave ligandov in regeneracija fotoreceptorjev očesne mrežnice==

Fotoreceptorji v membrani celic očesne mrežnice so značilni predstavniki z G-proteinom sklopljenih receptorjev. Njihova naloga je absorpcija svetlobe določene valovne dolžine in prenos signala preko G-proteina na citoplazemsko stran, kjer poteče veriga encimsko kataliziranih reakcij. Aktiviran fotoreceptor mora v procesu regeneracije ponovno zavzeti neaktivno konformacijo in vezati naravni ligand 11-cis-retinal. Barvni fotoreceptorji jodopsini zahtevajo učinkovit regeneracijski mehanizem, ker morajo stalno procesirati veliko količino svetlobnih signalov. Aktivna konformacija jodopsina razpade veliko hitreje v primerjavi z rodopsinom in tudi sam potek regeneracije je pri jodopsinih hitrejši. Vzrok za to bi lahko bila različna usoda desenzibiliziranih receptorjev. Nedavno so odkrili možnost, da pri regeneraciji jodopsinov pride do preusmeritve signalne poti. Namesto, da se receptor deaktivira preko internalizacije z arestinom, ostane v membrani in veže ligand glede na prehodno konformacijsko stanje v katerem se nahaja. Na različen potek regeneracije jodopsinov bi lahko vplivala tudi vezava druge molekule retinala v alosterično mesto, ki je posledica konformacijskih sprememb. Povezava med interakcijo retinala in njegovih analogov z določenim konformacijskim intermediatom ima pomembno vlogo tudi s terapevtskega vidika, saj GPCR-ji v splošnem predstavljajo terapevtske tarče za zdravljenje mnogih obolenj. Uporaba analogov 11-cis-retinala, kot sta 9CR in 6mr, ki se vežeta v aktivno ali eno od alosteričnih mest, bi lahko predstavljala učinkovit pristop pri zdravljenju prirojenih mutacij v fotoreceptorjih.

==Eva Vene - Povezava bolečine z vezavo kapsaicina na TRPV1==

Družina TRP kanalčkov pri živalih združuje devet manjših skupin kationskih prenašalcev, ki odločilno vplivajo na pravilno delovanje organizma. Eden od tovrstnih kanalčkov je tudi TRPV1 z angleškim imenom »transient receptor potential vanilloid 1«. Tega najdemo v mnogih organih in organskih sistemih, natančneje pa se v tem seminarju osredotočamo na njegovo vlogo v perifernem živčevju. TRPV1 vsebuje okoli polovica vseh somatskih in visceralnih senzoričnih nevronov, zato je pomemben mediator pri nocicepciji oziroma zaznavanju možno nevarnih stimulov ter njihovim prevodom v akcijskih potencial. Njegovo delovanje, poleg nekaterih drugih dražljajev, lahko vzbudi organska molekula, imenovana kapsaicin. Slednjega najdemo v sadežih rastlin rodu Capsicum in ga pojmujemo kot eno odločilnih molekul za pekoč okus teh plodov. Ob vezavi kapsaicina na TRPV1 v celico vdrejo kationi, ki spodbudijo različne celične procese, ključne za oblikovanje in prenos živčnega signala do možganov ter pojav vnetja. Posebej zanimive so dvolične posledice vezave kapsaicina, ki sicer vodijo do bolečine, draženja in vnetja, a omogočijo tudi refrakcijsko dobo kanalčka, ki predstavlja čas, ko slednjega ne moremo aktivirati ter desenzitacijo in degradacijo živčnih vlaken, kar povezujemo z analgetičnim učinkom te molekule. Ob redni daljši izpostavitvi kapsaicinu, ki ga lahko administriramo transdermalno ali injiciramo, se tako uspešno uporablja pri lajšanju kroničnih bolečin.

==Erik Putar - AMPK: senzor glukoze ter celičnega energijskega stanja ==

Celica uporablja z AMP aktivirano protein kinazo (AMPK) kot senzor celičnega energijskega stanja in glukoze. Njen glavni aktivator je AMP, ki promovira fosforilacijo Thr172 na AMPK, inhibira defosforilacijo fosforiliranega Thr172 ter alosterično aktivira AMPK. Aktivacija AMPK poteče že ob majhem energijskem deficitu in sproži regulatorni odgovor, ki preusmeri celični metabolizem iz anabolizma v katabolizem. Fosforilacija Thr172 poteče preko kinaze LKB1, medtem ko sta glikogen sintaza in acetil koencim A karboksilaza (ACC) dve tarči izmed mnogih kinazne aktivnosti AMPK. AMPK je heterotrimer sestavljen iz podenot α, β in γ. V α podenoti je prisotno kinazno aktivno mesto ter Thr172, medtem ko so na γ podenoti prisotna vezavna mesta za adenin nukleotide. β podenota je miristilirana na svojem N koncu, kar je ključnega pomena za delovanje glukoznega senzorja. Ta mehanizem poteka na lizosomih in sicer s tvorbo velikega kompleksa, ki vsebuje aldolazo, v-ATPazo, Ragulator, AXIN, LKB1 ter AMPK. Aldolaza je sicer tista, ki čuti prisotnost glukoze in to preko fruktoze 1,6-bisfosfata (FBP): odsotnost FBP v njenem aktivnem mestu aktivira AMPK neodvisno od razmerja koncentracijah adenin nukleotidov in tako preusmeri celico iz glikolitične v alternativne oksidativne poti.

==Timotej Sotošek - Regulacija mišičnega glikogena: granule in njeni proteini ==

Glikogen je primarna oblika shranjevanja glukoze, ki je hitra in dostopna oblika energije. Kljub njegovi pomembnosti pa procesi regulacije glikogena še vedno niso popolnoma jasni. Metabolizem glikogena je zelo reguliran, hkrati pa dinamičen. Kako se bo metabolizem glikogena usmeril, je odvisno od mnogih dejavnikov. Zaloge glikogena v skeletnih mišicah so razdeljena na tri območja: podsarkomerno, intermiofibrilarno in intramiofibrilarno. Vsako od teh območij ima drugačno funkcijo v celici in temu primerno vsaka zase regulira sintezo in razgradnjo glikogenskih granul. Vsaka granula glikogena pa je sposobna tudi samostojnega izvajanja regulacije, pri kateri sodelujejo različni proteini. Eden pomembnejših je protein fosfataza 1 (PP1), ki nadzoruje aktivnost ključnih encimov, kot so glikogen sintaza (GS) in glikogen fosforilaza (GP), pri tem pa mu pomaga glikogen tarčni protein (PTG), ki deluje kot ogrodni protein med PP1 in drugimi proteini. Ta proces je reguliran preko kompleksa laforin-malin, ki prekine povezavo med PP1 in PTG. V seminarju so predstavljene naloge in lastnosti glikogena v treh oddelkih znotraj skeletnih mišic. Predstavljen bo vpliv, ki ga imajo našteti proteini na sintezo glikogena, podrobnejši opis naloge, zgradbe proteinov laforina in malina, kako kompleks laforin-malin inhibira glikogen sintezo ter kakšne so posledice nedelovanja tega proteinskega kompleksa.

==Nika Tomsič - Acetil-CoA: glavni metabolit in sekundarni obveščevalec ==

Acetil-CoA je eden glavnih metabolitov. Deluje kot mejna točka med glikolizo in Krebsovim ciklom. Poleg tega so pomembne tudi njegove naloge kot sekundarni obveščevalec. Nadzoruje ključne celične procese, vključno z energetsko presnovo, mitozo in avtofagijo, tako neposredno kot preko regulacije ekspresije genov. Acetil-CoA običajno nastane v mitohondrijskem matriksu iz piruvata ali kot posledica β-oksidacije dolge verige maščobnih kislin. Lahko pa nastane tudi v citosolu z oksidacijo aminokislin, etanola ali z delovanjem acetil-CoA sintetaze, ki združuje dve glavni komponenti: acetil in koencim A. Razmerje med koncentracijama v mitohondrijskem matriksu in v citosolu je vedno enako. Govorimo torej o nekem dinamičnem ravnotežju, ki ga omogočajo številni prenašalci. Mitohondrijska memebrana je sicer neprepustna za acetil-CoA, zato mora najprej zreagirati v drugo obliko, da lahko vstopa ali iztopa iz mitohondrija. V mitohondrij vstopa piruvat s pomočjo citrat – piruvatnih prenašalcev. Tu piruvat dehidrogenazni kompleks katalizira reakcijo v acetil-CoA. Ko pa je v mitohondriju preveč acetil-CoA, se lahko ta prenese v citosol ali jedro v obliki acetilkarnitina preko karnitinskega prenašalca. V citosolu se spet povrne v acetil-CoA in je lahko vir anabolizma maščobnih kislin ali aminokislin, v jedru pa je njegova funkcija acetiliranje histonov. To omogoči prepisovanje genskega materiala. Lahko pa tudi nadaljuje svojo pot v mitohondriju in vstopi v citratni cikel, kjer je prvi korak pretvorba v citrat preko citratnega sinteznega kompleksa.

==Aleksandra Rauter - Vloga intermediatov Krebsovega cikla v makrofagih==

Makrofagi so nepogrešljive komponente imunskega sistema, ki izhajajo iz matičnih celic kostnega mozga in nastajajo v procesu hematopoeze. Glavne funkcije, ki jih opravljajo so fagocitoza, izločanje citokinov in sodelovanje pri humoralnem imunskem odzivu skupaj z limfociti. Njihovo aktivacijo povzroči prisotnost različnih citokinov, ki se vežejo na specifične TLR receptorje. Najpogostejši ligand klasične aktivacije je lipopolisaharid (LPS), strukturna komponenta celičnih sten bakterij. Zaznava vezanega liganda preko adapterskih proteinov, signalne kaskade, transkripcijskih faktorjev vodi do razvoja enega od dveh fenotipov makrofagov. M1 fenotip ima baktericidno in fagocitno delovanje, M2 pa sodeluje predvsem pri reparaciji tkiv. Točni mehanizmi, ki to povzročijo, še niso poznani. M1 makrofag ima reprogramiran Krebsov cikel, kar povzroči akumulacijo različnih intermediatov v mitohondriju. Ti se lahko prenesejo v citosol preko specifičnih transporterjev in sodelujejo pri različnih regulatornih mehanizmih. Sukcinat povzroči povečano izločanje vnetnih citokinov preko stabilizacije transkripcijskega faktorja HIF-1α, povečanja količine mROS, posttranslacijskih modifikacij proteinov in signalizacije preko z GPCR. Spremenjen Krebsov cikel povzroči akumulacijo citrata, ki je perkurzor itakonata. Ta preko transkripcijske regulacije in inhibicije določenih encimov regulira protivnetni in protimikrobni odziv. Fumarat in α-ketoglutarat sodelujeta pri epigenetski regulaciji celičnih procesov.

==Jakob Tomšič - Funkcije ketonskih telesc v centralnem živčevju ==

Acetoacetat, β-hidroksibutirat in aceton, drugače imenovani tudi ketonska telesca, so produkti našega metabolizma, ki ob pomankanju hranil možgansko tkivo, srce in skeletne mišice oskrbujejo z energijo. Ketogeneze pa danes ne povezujemo le s stanjem pomankanja hranil, ampak jo lahko spodbudimo tudi s tako imenovano ketogeno dieto, ki ji pripisujejo mnoge pozitivne učinke. Vloga ketogene diete pri epilepsiji in drugih nevroloških boleznih je poznana že skoraj stoletje, vendar so bili mehanizmi za antiepileptično delovanje vedno uganka. Trenutno poznamo več funkcij ketonskih telesc, ki presegajo njihovo osnovno metabolno vlogo. Ketonska telesca imajo epigenetski vpliv in lahko spodbujajo izražanje antioksidativnih genov. Prav tako je viden vpliv na vezikularni transport glutamatata z VGLUT v nevronih in zaviranje prenosa signala z GABA nevrotransmiterji. Ketonska telesca izražajo nevrozaščitno in protivnetno vlogo z vplivom na imunski sistem, z vezavo na HCA2 receptor, ki spodbuja nastanek prostagladina D2, in inhibicijo NLRP3 inflamasoma. Nevrološke motnje, kot je epilepsija, imajo več vzrokov, med katerimi sta neizpodbitno prevelika vzburjenost nevronov ter vnetno stanje tkiva. Vedno več dokazov kaže na vlogo ketonskih telesc pri nadziranju in manjšanju števila epileptičnih napadov pri bolnikih. Kljub vsem dokazom in povezavam pa še vedno obstajajo dvomi, da so ravno ketonska telesca tista, ki imajo antiepileptične funkcijo.

==Laura Unuk - Motnje oksidacije dolgoverižnih maščobnih kislin in karnitinskega transporta ==

Motnje oksidacije dolgoverižnih maščobnih kislin (lcFAOD) so dedne avtosomske recesivne bolezni, ki onemogočajo metabolizem maščobnih kislin. Gre za mutacije genov, ki kodirajo encime oksidacije in karnitinskega transporta. Pri oksidaciji dolgoverižnih maščobnih kislin (12-18 C-atomov) sodeluje več kot 15 encimov, vendar le motnja enega lahko pripelje do kliničnih simptomov, kot so šibkost mišic, odpoved jeter, odpoved srca, itd. Glavni encimi, ki katalizirajo karnitinski transport so OCTN2 (organski-kationski-transporter-novel-2), CPT1 (karnitin-palmitoil-transferaza-tipa-1A), CPT2 (karnitin-palmitoil-transferaza-tipa-2) in CACT (karnitin-acilkarnitin-translokaza); encimi, ki pa katalizirajo oksidacijo so VLCAD (zelo-dolgoverižna-acil-CoA-dehidrogenaza), MTP (mitohondrijski-trifunkcijski-protein), LCHAD (dolgoverižna-3-hidroksiacil-CoA-dehidrogenaza) in LCKAT (dolgoverižna-3-ketoacil-CoA-tiolaza). Karnitin je pomembna molekula za prenos dolgoverižnih maščobnih kislin skozi membrano mitohondrija, saj dolgoverižna maščobna kislina lahko vstopi v mitohondrij le v obliki acil-karnitin estra. Najpogostejša motnja pri oksidaciji dolgoverižnih maščobnih kislin pa je motnja VLCAD encima, ki katalizira reakcije odcepa dveh ogljikovih atomov iz maščobne kisline na CoA. Nastali acil-CoA lahko nato vstopi v cikel citronske kisline, kjer nastane ATP. Ob nedelovanju VLCAD pride do pomanjkanja ATP v celici in posledično kliničnih simptomov. Zaznavanje napake enega od encimov je izvedena preko profila acilkarnitina v krvi, plazmi ali DBS. Z metodo NBS ('newborn screening') lahko kmalu po rojstvu že zaznajo motnjo in tako s hitrim zdravljenjem preprečijo neprijetno napredovanje bolezni. Poleg trenutnega zdravljenja so v razvoju različne terapije za zdravljenje motenj, ki pa imajo velik potencial.

==Stefanija Ivanova - Vpliv telovadbe na metabolizem ketonskih telesc ==

Ketonska telesca predstavljajo alternativno energijo za možgane, srce in skeletne mišice pod določenimi pogoji, kot so stradanje, intenzivna vadba, nenadzorovan diabetes ali po zaužitju ketonskih dodatkov. Zanimanje za delovanje ketonskih telesc se je povečalo predvsem pri športnikih. Ker ima uživanje eksogenih ketonov dramatične učinke na metabolizem skeletnih mišic med vadbo, imajo lahko športniki od tega koristi. Pomembna premisleka sta, kako športniki tolerirajo vnos ketonskih estrov med vadbo in ali dodatek ogroža ali vpliva na vnos ogljikovih hidratov. Zaužitje ketonskih dodatkov lahko hitro poveča koncentracijo ketonskih telesc, v primerjavi s ketogeno prehrano ali stradanjem, ki potrebujeta vsaj nekaj dni. Dodatek eksogenih ketonov predstavlja vir energije in ima lahko učinke pri varčevanju zalog ogljikovih hidratov med treningom v času nizke razpoložljivosti ogljikovih hidratov. Varčevanje zalog endogenih ogljikovih hidratov bi teoretično povzročilo večjo zmogljivost med ključnimi deli, med katerim so ogljikovi hidrati prevladujoči substrat. Dokler niso metabolne interakcije dodatkov ketonskih estrov s skeletnimi mišicami med vadbo popolnoma razjasnjene, vse predlagane ergogene lastnosti ostanejo teoretične. Glavni razlog za utemeljevanje eksogenih dodatkov ketonov morajo biti ugotovitve, da se ketoliza med vadbo poveča in pomembno prispeva k oskrbi z energijo. Čeprav obstajajo predlogi, da so dodatki ketonskih telesc koristni za športnike, je trenutno premalo informacij o učinkih dodatkov na metabolizem ketonskih telesc med vadbo. Na številna vprašanja je še treba odgovoriti.

==Nika Perko - Encim karbamoil fosfat sintetaza 1 ==

Karbamoil fosfat sintetaza 1 (CPS1) je limitni encim cikla uree, ker katalizira njeno prvo tristopenjsko reakcijo. Nahaja se v matriksu mitohondrija v celicah jeter, ledvic in tankega črevesa. Sestavljen je iz šestih domen: interakcijske, glutaminazne, integracijske, alosterične in dveh katalitskih. Encim je lahko v neaktivni ali aktivni obliki. Alosterično ga aktivira N-acetil-L-glutamat. Encim se lahko pozitivno regulira s proteinom Sirtuin 5 in glukagonom, negativno pa z mikro RNA miR-19b in od ATP odvisno kinazo (AMPK). Napačno delovanje kateregakoli od petih encimov ali transporterjev cikla uree vodi v zelo redko bolezen – motnje cikla sečnine. Prav motnja v delovanju encima CPS1 povzročajo najhujšo obliko te bolezni. Izrazi se lahko tako v neonatalni dobi kot tudi kasneje, določi pa se jo preko encimske ali genske analize. Simptomi so lahko letargija, bruhanje, encefalopatija in koma. Mutacije tega in tudi preostalih encimov ciklusa povzročijo hiperamoniemijo, ki se jo zdravi s hemodializo in raznimi zdravili, kot so L-arginin hidroklorid, natrijev benzoat in natrijev fenilbutirat. Bolniki se morajo držati stroge diete, bogate z ogljikovimi hidrati in maščobami. Poleg omenjenih zdravil lahko uživajo tudi N-karbamil-L-glutamat, ki deluje kot šaperon, stabilizator in aktivator. Trenutno je edina trajna in učinkovita rešitev transplantacija jeter, v prihodnosti pa bo morda učinkovita tudi genska terapija.

==Neža Leskovar - Urea transporterji in regulacija skoncentriranosti urina ==

Urea je vodotopna polarna molekula, ki lahko počasi prehaja čez celične membrane z difuzijo, hiter in učinkovit transport pa ji omogočajo urea transporterji UT-A in UT-B. Ti sodelujejo pri izločanju odvečnega dušika iz telesa, koncentriranju urina in s tem pri regulaciji tekočinskega ravnovesja ter ponovni uporabi dušika vezanega v urei s pomočjo črevesnih bakterij. Transporterji so v osnovi sestavljeni iz dveh hidrofobnih transmembranskih domen in velike ekstracelularne povezovalne zanke, razen UT-A1, ki je rezultat podvojene osnovne strukture. So N-glikozilirani in imajo znotrajcelični aminski in karboksilni konec. UT-A transporterji se večinoma nahajajo v ledvicah. UT-A1 najdemo v spodnjem predelu ledvičnega zbiralca, v apikalnih delih celic, kjer omogoča prehod uree iz zbiralca v epitelne celice. UT-A3 se prav tako nahaja v spodnjem predelu ledvičnega zbiralca, le da v bazalnih delih celic in omogoča prehod uree nazaj v telesni obtok. UT-A2 se nahaja v Henlejevi zanki in skrbi za prehod uree iz ledvične sredice nazaj v Henlejevo zanko. UT-A4 je bil najden v ledvicah podgan, UT-A5 so našli v testisih miši in UT-A6 v človeškem črevesju. UT-B transporterji se nahajajo v ledvičnih kapilarah, najdemo jih tudi v različnih tkivih. Transport uree je dobro reguliran z vazopresinom, hiperosmolarnostjo, ubikvinacijo in drugimi načini.

==Luka Šegota - Hiperamoniemija ==

Amonijak je pomemben vir dušika v telesu. Ima vlogo skrbnika ravnovesja aminokislin, sodeluje pri sintezi proteinov in zagotavlja pH vrednost okolja. Stanje ko je amonijaka v krvi preveč, imenujemo hiperamoniemija. Telo odstranjuje amonijak v jetrih in v manjšem obsegu tudi v ledvicah preko cikla uree. V možganih pa se amonijak odstrani s pomočjo glutamin sintetaze, ki iz glutamata in amonijaka tvori glutamin, ki je pomemben transporter dušika in s tem amonijaka. Glavni vzrok za hiperamoniemijo so motnje v ciklu uree. Poznamo primarno hiperamoniemijo, ki se razvije zaradi pomankanja encimov ali transporterjev v ciklu uree in pa sekundarno, ki izvira iz inhibicije cikla uree. Amonijak povzroča največje težave v možganih, saj lahko prosto prehaja krvno-možgansko bariero. Tam povzroča pojave kot so otekanje astrocitov, eksitotoksičnost in neravnovesja med aminokislinami, žal pa je večino teh procesov slabo raziskanih, zato je večina mehanizmov opisanih le s hipotezami. Zdravljenje hiperamoniemije poteka preko dveh možnih poti; 1) terapije, ki znižujejo nastanek in absorpcijo amonijaka, tako da zmanjšajo število bakterij, ki proizvajajo ureaze, ali zmanjšajo degradacijo glutamina, 2) terapije, ki izboljšujejo mehanizme izločanja amonijaka, preko aktivacije cikla uree ali sinteze glutamina.

==Ela Bizjak - Mutacije mitohondrijske DNA, heterogenost in mitohondrijske bolezni==

Mutacije mitohondrijske DNA so del mitohondriju lastnega dednega zapisa. Mitohondrijska DNA je krožna molekula, ki je stabilizirana z zvitjem v nukleoide. Najpogosteje mutacije nastanejo med replikacijo, saj je po predvidenih mehanizmih takrat DNA dolgo izpostavljena in enoverižna, prav tako pa je podvajanje pogosto. Poleg tega, da ima mitohondrijska polimeraza šibko eksonukleazno aktivnost, se v bližini dednega materiala nahaja tudi respiratorna veriga, ki proizvaja reaktivne kisikove radikale. Mutacije se širijo glede na njihovo vrsto. Delecije imajo pri podvajanju prednost, ker so manjše kot nemutirane molekule, zato v organelu hitro prevladujejo, dedni prenos delecij pa je zelo redek. Točkovne mutacije se širijo s sproščeno replikacijo, delitvami in fisijami mitohondrijev. Če so prisotne v spolnih celicah matere, jih podedujejo vsi njeni potomci. Heteroplazmija se lahko med tkivi osebka razlikuje. Te razlike so opazne v nepravilnostih na proteinskih superkompleksih, oblikah krist, sestavi mitohondrijske membrane, napetostnem potencialu in okvarah respiratorne verige. S sledenjem mutacijam ali različnim haploskupinam lahko sledimo tudi migracijam populacij. Nekatere dedne mutacije so odgovorne tudi za bolezenska stanja, če je nosilka mutacij mati. Najpogosteje prizadenejo živčevje, pojavijo pa se lahko ob rojstvu ali kasneje med 20. in 40. letom.

==Bor Krajnik - Reaktivne kisikove zvrsti in njihova vloga pri regulaciji celične proliferacije ==

Kisikove reaktivne zvrsti ali krajše ROS so zelo reaktivne zvrsti, ki nastajajo pri redukciji molekularnega kisika, med seboj pa se pretvarjajo spontano ali s pomočjo encimov. V celici sta najpomembnejša predstavnika vodikov peroksid in superoksidni anion. Glaven vir ROS v celici so mitohondriji, kjer nastajajo kot produkt preobremenjenih elektronskih prenašalnih verig. Sprva se je njihova pristnost v organizmih smatrala za izključno škodljivo, ampak danes vemo, da imajo v človeškem organizmu več funkcij. V celici igrajo pomembno vlogo v določenih signalnih poteh, kar dosežejo z oksidacijo predvsem cisteinskih ostankov. Ob hipoksiji so ROS pomembne pri stabilizaciji ene od podenot hipoksija inducibilnih faktorjev (HIF), to so transkripcijski fakorji, ki regulirajo ekspresijo genov in so pomembni za angiogenezo in celično proliferacijo. Prav tako so pomemben člen signalne poti preko katere hormon angiotenzin II spodbuja delitev celic gladkih mišic v žilah. Regulirajo aktivacijo T-celic, kar privede do njihove proliferacije. ROS so vpletene tudi v proliferacijo rakastih celic, v katerih visoki nivoji ROS pomagajo pri angiogenezi, ki je potrebna zaradi hitre rasti tumorja kar vodi v hipoksijo. Zaradi tega so bile preizkušene kot potencialna tarča pri zdravljenju raka vendar so rezultati mešani.

==Maja Kobal - Od UCP1 odvisna in neodvisna termogeneza==

Termogeneza je proces nastajanja toplote in je eden od mehanizmov termoregulacije. Glavni regulator adaptivne nedrgetajoče termogeneze je protein UCP1, imenovan tudi termogenin. To je razklopitveni (ang. uncoupling) protein, ki se nahaja v notranji mitohondrijski membrani rjavih in bež adipocitov (maščobne celice), kjer razklaplja protonski gradient, ki se ustvari med procesom dihalne verige. Gradient protonov preusmeri nazaj v matriks mitohondrija, namesto da bi ta šel preko ATP-sintaze. Tako torej ne nastane ATP, ampak sprosti se toplota, ki segreje celico in pomaga ohranjati stalno telesno temperaturo. Glavni regulatorji delovanja UCP1 so maščobne kisline in purinski nukleotidi; prvi delujejo kot aktivatorji, slednji pa kot inhibitorji. Novejše raziskave pa so pokazale mehanizme in termogene regulatorje v adipocitih, ki so neodvisni od UCP1. Ti mehanizmi so kroženje kalcijevih ionov preko mehanizma SERCA, kreatin-substratni cikel, kroženje lipidov, transport glicerol-3-fosfata in razklop preko N-acil aminokislin. Natančno poznavanje mehanizmov termogeneze bi ponudilo številne nove možnosti za zdravljenje debelosti in sladkorne bolezni tipa 2. Znanje o UCP1 neodvisnih mehanizmih termogeneze bi bilo zelo uporabno za zdravljenje predebelih in starejših ljudi, ki nimajo UCP1-pozitivnih adipocitov. Čeprav že več desetletij potekajo raziskave o termogenezi, je znanje na tem področju pomanjkljivo, tako da bodo potrebne še številne raziskave.

==Martin Stanonik - Ekofiziologija obstoječih fototrofov in vplivi na evolucijo oksigene fotosinteze==

Oksigena fotosinteza je pomemben mikrobiološki proces, ki je omogočil dvig atmosferske koncentracije kisika in posledični razvoj večceličnih organizmov. Pred tem procesom so že obstajali mehanizmi, ki so proizvajali energijo. Za to so potrebovali molekule bogate z elektroni, kot H2S. Vendar ti procesi niso proizvajali kisika, kot stranskega produkta. Zato je sprememba kompozicije atmosfere, ali GOE (Great Oxidation Event) povzročila smrt mnogih organizmov kake 2.5 milijarde let nazaj. Tisti, ki pa so preživeli, so pa razvili obrambne mehanizme proti radikalnimi molekulami (ROS), ki so nastale iz kisika, ali pa so se umaknili v globje predele takratnih oceanov, kjer so še zmeraj prevladovali pogoji pred GOE. Kljub temu znanju natančen pojav in razvoj teh procesov še ni poznan. Danes še obstajajo organizmi, ki izvajajo te procese, nekateri lahko celo oba, vendar je to odvisno od okolja. To, vključno z fosili in filogenetskimi raziskavami, bi nam lahko pomagalo razumeti kako se je razvilo življenje na Zemlji. Organizmi z oskigeno fotosintezo so pomemben vir kisika v okoljih. Oksigena fotosinteza vključuje mnoge dele, kot reaktivne centre (RCI in RCII) in fotosisteme PSI in PSII ter OEC, ki je sistem ,ki tvori stranski produkt kisik. Pojav teh mehanizmov tudi še ni natančno poznan zato bodo potrebne še številne raziskave.

==Tinkara Božič - Pomen saharoze in njenega metabolizma za rastline==
Saharoza je pomemben disaharid, ki vpliva na rast rastlin, njihov razvoj, reprodukcijo in obrambne odgovore. Višek trioza fosfata, ki nastane iz ogljika med aktivno fotosintezo, se v citoplazmi pretvori v saharozo. Z delovanjem saharoze je tesno povezana še trehaloza, oligosaharid iz dveh molekul glukoze, ki ima v celicah regulatorno vlogo. Saharoza je pomembna predvsem zaradi cepitve na heksozi glukozo in fruktozo, kar poteka na dva načina – lahko jo cepi saharozna sintaza ali jo hidrolizirajo invertaze. Slednje encime inhibirajo posebni proteini, imenovani invertazni inhibitorji. Saharozna pot se v rastlinah začne v fotosintetskih tkivih, nadaljuje z nalaganjem v floem, zaključi pa se z odlaganjem iz floema v ponore oz. nefotosintetska tkiva. Invertaze so treh vrst in jih klasificiramo glede na njihov pH ter mesto v celici – poznamo invertaze celične stene, vakuolne invertaze in citoplazemske invertaze. Nastopijo v celicah ponora, ko je potrebna cepitev saharoze na njeni sestavni molekuli. Invertaze celične stene pa sodelujejo še pri obrambnih odgovorih celice na napad patogenih organizmov, ko jo ti izkoriščajo za sladkorje. Če pa patogeni v navezo s celicami prinašajo hranila, ki jih gostitelji potrebujejo, to povezavo imenujemo mikoriza. Ta hranila so v glavnem fosfati, sladkor, ki ga od rastlin prejemajo patogeni organizmi, pa je glukoza.

==Mateja Milošević - CAM tip fotosinteze: Crassulacean Acid Metabolism==
CAM tip fotosinteze je evolucijska prilagoditev določenih vrst rastlin na ekstremne okoljske razmere, kot je pomanjkanje vode in zelo visoke temperature – tipičen primer takih rastlin so kaktusi v puščavi, ali kot prilagoditev ko rastlina ne more privoščiti si dovolj CO₂ čez dan. Takšen tip fotosinteze se od običajnega C3 tipa razlikuje po tem, da vsebuje dodaten encim t. j. fosfoenolpiruvat karboksilaza (PEPC). Ta skupaj z encimom RuBisCO pomaga asimilirati zunanji CO₂. Delovanje teh dveh encimov je časovno ločeno, in prav po tem se CAM fotosinteza razlikuje od še enega tipa fotosinteze – tipa C4. Asimilacija zunanjega CO₂ je ločena po fazah. Da se rastlina izogne prekomerni izgubi vode, čez dan svoje posebne listne pore - stome - zapre, uporablja pa v sebi shranjene energijsko bogate molekule. Ko pride do spremembe v okolici, npr. nastopi noč, rastlina svoje stome odpre in tako sprejme zunanji CO₂. Pomemben intermediat je malat2-, ki nastaja z obdelavo zunanjega CO₂ in se shranjuje v vakuoli v obliki malatne kisline. Ko se malat dekarboksilira, iz njega nastaneta piruvat in CO₂. Ta dva v nadaljnih metabolnih procesih doprineseta energijo in pomembne intermediate..

==Nika Banovšek - Regulacija mlečnih lipidov preko hrane in transkripcijskih faktorjev ter vpliv mleka na novorojenčka==
Mleko je edina, in zato glavna prehrana novorojenčka, ki je v začetnih fazah svojega obstoja zelo ranljiv. V materinih mlečnih žlezah nastajajo primerne sestavine, ki so pomembne tako za periferni kot za centralni razvoj mladiča. Mlečni lipidi so glavna komponenta mleka. Nastajajo preko različnih substratov; med glavne štejemo maščobe kisline, glukozo in glicerol. V citosolu mlečnih epitelnih celic se iz slednjih tvorijo predvsem srednje dolge verige mašobnih kislin, ki igrajo pomembno vlogo v telesu novorojenčka, saj mu prinašajo tako hranilne vrednosti in energijo kakor tudi nekatere signalne molekule. Triacilgliceroli nastajajo v endoplazmatskem retikulumu, kjer se nato zapakirajo kot mehurčki in se iz mlečne epitelne celice izločajo v obliki mleka. Na sestavo mleka in regulacijo njegovih sestavin vplivajo številni dejavniki. Med ključne štejemo transkripcijske faktorje, kot sta, npr. SREBP-1 in PPARγ, in samo prehrano. Če imajo matere novorojenčkov genetske okvare ali slabe prehranske navade, se v celici zgodijo napačne regulacije v sintezi mlečnih lipidov ter pride do tvorbe in izločanja »toksičnega« mleka v alveolih mlečnih žlez. Takšno mleko lahko povzroči velike nepravilnosti v telesu novorojenčka, saj ta zaužije sebi škodljive snovi, ki vodijo do raznih notranjih vnetij. Zaužitje takšne vrste mleka se lahko odraža tudi v dolgoročnem razvoju otroka v obliki različnih bolezni.

==Luka Stanković - LIPIDNE KAPLJE: nastanek, struktura in zorenje lipidnih kapelj==
Lipidne kaplje so bile prvič odkrite pred več kot 100 leti. Kljub temu, se jim do nedavnega ni posvečalo večje pozornosti in pripisovalo znatnejše vloge v delovanju organizma. Danes odkrivamo, da ne gre le za celično strukturo, ki shranjuje lipide, temveč gre za nadvse pomemben organel, ki ga najdemo v vseh evkariontskih celicah. Ne le, da so kaplje nadvse pomembne za metabolne procese, temveč imajo tudi pomembno vlogo pri zaščiti pred lipotoksičnostjo, poškodbi mitohondrijev, obnavljanju homeostaze, zadnje čase pa se odkriva tudi njihov pomen v signalnih poteh. Kljub številnim funkcijam, med katerimi je še veliko neraziskanega, se v seminarju posvečamo predvsem nastanku kapelj, njihovi strukturi in njihovem zorenju. Nastanek lipidne kaplje začnemo z nastankom maščobnih kislin iz acetil CoA. Le-te se v ER skupaj z glicerolom s pomočjo kompleksa encimov pretežno pretvorijo v di- in triacilgliceride. Naraščanje njihove koncentracije znotraj membrane ER povzroči nastanek in odcep kaplje iz membrane. V večini primerov gre za reguliran odcep v citosol. Celoten proces in kasnejšo zorenje uravnava cela kopica proteinov, katerih natančni mehanizmi ali pa celo vloge v nekaterih primerih še niso popolnoma jasni. Napake v delovanju slednjih pa lahko povzročajo hujše zdravstvene zaplete kot so debelost, inzulinska odpornost in posledično diabetis.

== Ana Pervanja - Vpliv cirkadianega cikla na biosintezo lipidov==
Cirkadiani ritem oz. cikel je mehanizem, ki na podlagi zunanjih dražljajev vpliva na delovanje organizma. Proces poteka na osnovi zaznave svetlobe v fotosenzitivnih ganglijskih celicah, ki pošljejo signal v hipotalamus, kjer se nahaja glavna »ura«. Ta nato uskladi ostale organe po telesu. Posledica tega je nihanje regulatornih molekul (oscilatorjev) v perifernih celicah, ki preko glavnih regulatornih encimov vplivajo na metabolizem. Na biosintezo lipidov vplivata dve od cirkadianega cikla odvisni molekuli: transkripcijski faktor SREPB, ki sodeluje pri sintezi maščobnih kislin in sterolov, in jedrni receptor PPARγ, ki vpliva na sintezo maščobnih kislin z zelo dolgimi verigami. V primeru motenj cirkadianega cikla, ki so lahko posledica nepravilnega delovanja regulatornih molekul ali neusklajenosti glavne in perifernih »ur«, pride do disregulacije metabolizma. To lahko vodi do razvoja debelosti, sladkorne bolezni tipa II, ateroskleroze, možganske in srčne kapi idr.

== Aljaž Simonič - Inhibitorji sinteze nukleotidov kot protivirusna zdravila širokega spektra ==
Virusi so parazitski biološki delci, ki v svojih gostiteljih povzročajo bolezni. Večina do sedaj uporabljanih protivirusnih zdravil deluje na virusne proteine, vendar ta pristop ne omogoča zdravljenja več virusov z enim zdravilom in je občutljiv na mutacije virusa. Različne na gostitelja delujoče učinkovine bi lahko kljub hujšim stranskim učinkom delovale kot širokospektralna protivirusna zdravila. Med takšnimi spojinami so obetavni tudi inhibitorji biosinteze nukleotidov, sistema kompleksnih metabolnih poti, ki tvorijo nove purinske in pirimidinske nukleotide ali reciklirajo delno razgrajene. Inhibicija teh poti virusom odvzame molekule, ki jih za replikacijo neizogibno potrebujejo v količinah, ki močno presegajo potrebe ter zaloge zdravih celic in v okuženih celicah zato tudi spodbujajo njihove sintezne poti ali alternativno zavirajo njihovo razgradnjo, ter jih tako prizadanejo bolj kot zdrave celice. V klinični rabi kot protivirusno zdravilo je ribavirin, inhibitor sinteze gvanozina, ki deluje tudi kot mutagen. Za različne druge bolezni se uporabljajo tudi inhibitorji de novo sinteze pirimidinov, vendar zaradi učinkovite reciklaže in visoke koncentracije uridina v krvni plazmi sami po sebi niso uspešni proti virusnim okužbam. To bi lahko popravilo dodajanje inhibitorja reciklažne poti.

== Luka Hafner - GABA in njeni receptorji v človeških možganih ==
GABA ali 4-aminobutanojska kislina je neproteinogena aminokislina, ki je prisotna v večini organizmov . Sprva je bilo mišljeno, da je le sekundarni metabolit v rastlinah in mikroorganizmih. Komaj leta 1950 je bila odkrita tudi v centralnem živčnem sistemu sesalcev in 1967 je bila prepoznana kot nevrotransmiter. Pri sesalcih je prisotna skoraj v vseh tkivih in deluje kot signalna molekula z vrsto vlog. Nastaja v kratki metabolni poti "GABA shunt", in sicer preko glutamat dekarboksilaze, v manjši meri pa pri razgradnji putrescina. V centralnem živčnem sistemu deluje kot inhibitorni nevrotransmiter. Veže se na GABAA in GABAB receptorje. GABAA receptorji so kloridni kanalčki, ki imajo poleg GABA vezavnega mesta številna alosterična vezavna mesta. GABAB receptorji so GPCR receptorji, ki posredno odpirajo kalijeve kanalčke in inhibirajo kalcijeve kanalčke in adenilil ciklazo. Z aktivacijo receptorjev se nevron hiperpolarizira in tako se prepreči prenos signala. GABA ima zelo pomembno vlogo pri prenatalnem razvoju živčnega sistema, kjer vpliva na proliferacijo, migracijo in diferenciacijo živčnih celic. Ker ima GABA tako pomembno vlogo pri uravnavanju delovanja centralnega živčnega sistema, lahko nepravilnosti pri GABA signalizaciji privedejo do številnih nevroloških in psiholoških obolenj.

== Nika Bedrač - Vpliv estrogena in njegovih receptorjev na skeletne mišice ==
Estrogeni so steroidni hormoni, glavni predstavniki pa so 17β -estradiol, estron in estriol. Pri ženskah uravnavajo funkcijo reproduktivnega sistema, rast in razvoj spolnih organov, ohranitev sekundarnih spolnih znakov, imajo pa tudi vpliv na kostno gostoto, delovanje skeletnih mišic, delovanje možganov itd. So male lipofilne molekule, ki lahko direktno prehajajo membrano in se na citosolni strani vežejo na estrogenske receptorje. Od tam se lahko translocirajo v jedro in interagirajo z jedrno DNA, ob enem pa lahko tudi regulirajo transkripcijo in replikacijo mitohondrijske DNA. Glavna estrogenska receptorja sta ER-α in ER-β , razlika med njima je v tem, kateri gen ju kodira in v katerih organih sta prisotna.
Koncentracije estrogena pomembno vplivajo na telesno vzdržljivost in na izbiro substrata, ki ga celica med samo aktivnostjo oksidira. Raziskave so pokazale, da so pri glodavcih samice bile bolj telesno vzdržljive in so kot primarni substrat porabljale maščobne kisline – do podobnih ugotovitev so prišli tudi pri ljudeh. Koncentracija estrogena v telesu pri ženskah bistveno fluktuira in je odvisne od obdobja menstrualnega cikla.
S starostjo se koncentracija estrogena (predvsem pri ženskah) zmanjša, kar pa se lahko odraža v upadu mišične mase in kostne gostote. Za zdravljenje se uporabljajo hormonske nadomestne terapije.

== Srna Anastasovska - Grelin in njegove funkcije v organizmu ==
Grelin je hormon ki je bil odkrit kot endogeni ligand ki se veže na GHS receptor in s tem stimulira sekrecijo GH hormona. Sestavljen je iz 28 aminokislin, kjer je Ser 3 oktaniliran, kar je bistveno za biološko aktivnost hormona. Ta reakcija oktaniliranja katalizira ghrelin O-acil transferaza (GOAT) in je med prvimi peptidni hormoni ki ima takšno modifikacijo. V telesu so prisotni več oblik grelina: acilirane, deacilirane itd. Hormon je identificiran pri mnogih sesalcih in ima podobno funkcijo pri vseh. Grelin ima več funkcij v organizmu: stimulira sproščanje rastnega hormona (GH), signalizira možganom kadar potrebuje vnos hrane tako da aktivira celice v hipotalamusu in hipofizi, vključno z NPY nevroni ki stimulirajo apetit, regulira metabolizem glukoze, poboljša učenje in spomin, regulira metabolizem energije. Ko je želodec prazen, v zgornji regiji sintetizira grelin ki potem po kri ali vagusnem sistemu signalizira in aktivira regije v hipotalamusu (arkuatno jedro) ki nato stimulirajo apetit. Številne funkcije grelina in njegova sposobnost širjenja v številna tkiva omogočajo široko uporabo v medicini pri zdravljenju različnih bolezni ali stanj kot so anemija, bulimija, deficit rastnega hormona, odpoved srca, postoperativnega ileusa, in ima tudi pozitiven učinek na kardiovaskularnem sistemu. Odkritje grelina je omogočilo znanstvenikom vpogled v nove mehanizme regulacije in razumevanje hranjenja.

== Manca Pirc - Galanin, spexin in kisspeptin ==
Hormoni in nevrotransmitorji so ene ključnih molekul za vzdrževanje homeostaze v telesu. Med njih uvrščamo tudi tri sorodne biološke aktivne peptide, in sicer galanin, kisspeptin in spexin. Galanin so odkrili leta 1978 v prašičjem prebavnem traktu, kisspeptin so odkrili leta 1996 v rakavih celicah, ki niso bile zmožne metastaze. Obstoj spexina so leta 2007 potrdili s pomočjo bioinformacijskih študij in tako potrdili njegov obstoj še pred samo izolacijo peptida. Galanin in spexin povzročita odziv v celici preko vezave na receptorje tipa 1 – 3 za galanin (GALR1-3), medtem ko se kisspeptin veže na receptor za kisspeptin (KISS1R ali GPR-54). Spexin specifičnega receptorja pa še niso prepoznali. Njihova biološka vloga še ni popolnoma raziskana, vseeno vemo, da so pomembni pri homeostazi glukoze, vzdrževanju telesne teže, izražanju spolnih hormonov. V nadaljevanju seminarja si bomo pogledali, kakšno vlogo imajo pri homeostazi glukoze, izražanju spolnih hormonov in kako vplivajo na razvoj rakavih obolenj. Spexin, galanin in kisspeptin imajo vsi pozitivne učinke na uravnavanje koncentracije glukoze v krvi, kisspeptin je izredno pomemben sporočevalec za izražanje gnRH (gonadotropin sproščujoči hormon), ki spodbudi izločanje ostalih spolnih hormonov; kisspeptin pa je bil sprva prepoznam kot supresor metastaze.

== Nika Malečkar - Reaktivne kisikove spojine, koencim Q in njuna vloga v glavkomu ==
Glavkom je nevrodegenerativna bolezen očesnega živca, kjer je poškodovan vidni živec na mestu izhoda iz očesa. V Evropi prizadene približno 2 na 100 ljudi, starejših od 40 let. Zaradi velikega odstotka ljudi, ki zaradi neuspešnega zdravljenja oslepi, so se strokovnjaki obrnili k iskanju vzrokov in preprečevanju razvoja bolezni. Kot rezultat velike porabe kisika mrežnih celic, so le-te ranljive na vpliv oksidativnega stresa, ki nastane kot posledica previsokih koncentracij reaktivnih kisikovih spojin. To so prosti radikali, ki vplivajo na nepravilno delovanje mitohondrijev, oksidacijo encimov, motnje prenosa signalov in posledično povzročajo apoptozo celic. Njihov škodljivi učinek preprečujejo antioksidanti, med njimi tudi koencim Q10, ki ima vitaminu podobne funkcije. Nahaja se v večjih ali manjših koncentracijah povsod po telesu, je ključen dejavnik prenosa elektronov v ATP sintezi ter pomemben zaradi svoje antioksidantske in obnovitvene sposobnosti. Uporabljamo ga lahko kot prehransko dopolnilo, kremo ali zdravilo pri nevrodegenerativnih boleznih, med drugim tudi v glavkomu. Koencim Q inhibira apoptozo, ohranja morfologijo mitohondrija in pravilno izražanje mitohondrijske DNA ter deluje kot pufer pri porušeni homeostazi kalcija. V tej seminarski nalogi bom bolj natančno predstavila delovanje in vpliv reaktivnih kisikovih spojin ter koencima Q in opisala njuno vlogo v glavkomu.

== Evgen Kozole - Sirtuini in njihova vloga v organizmu ==
Vsak posameznik bi si v današnjem času želel, da bi dočakal dolgo življenjsko dobo in bil pri tem tudi zdrav. V organizmu obstajajo molekule, ki s svojim delovanjem neposredno vplivajo na proces staranja in druge biološke procese, kot na primer transkripcijo genov, apoptozo, metabolizem in popravljanje DNA. Gre za tako imenovane sirtuine. Sirtuini so družina proteinov, ki imajo encimsko aktivnost, ki je v večini primerov odvisna od NAD+ deacetilaze, preko katere vplivajo na transkripcijo genov, nekateri pa imajo tudi ADP-ribozilazno aktivnost. V človeškem organizmu lahko najdemo sedem različnih sirtuinov (SirT1-7), ki se predvsem razlikujejo po tem, kje v celici se nahajajo in kakšne so njihove vloge. Lastnost, ki je skupna večini sirtuinov je uravnavanje metabolizma in transkripcija genov. Njihovo delovanje v organizmu je skrajno pomembno, saj regulirajo procese, ki so življenjskega pomena, kot na primer izločanje inzulina, glikolizo, uravnavanje reaktivnih kisikovih zvrti in še mnoge druge. Nekateri sirtuini vplivajo tudi na potek kroničnih bolezni in so zadolženi za odziv imunskega sistema. V določenih primerih lahko izboljšajo potek kroničnih bolezni in odziv imunskega sistema, lahko pa tudi poslabšajo situacijo v primeru, da pride do mutacije gena in organizem izloča preveliko količino določenega sirtuina.

== Petra Sintič - Triptofan in njegova vloga v telesu ==
Triptofan (simbol Trp) je ena od osmih esencialnih aminokislin, ki jih v človeškem telesu ni mogoče sintetizirati in jih je treba dovajati s hrano, predvsem iz živalskih ali rastlinskih virov. Čeprav ima nižjo koncentracijo v človeškem telesu glede na ostale primarne aminokisline, je triptofan ključna sestavina številnih presnovnih funkcij. Pomemben je za presnovo proteinov in je predhodnik nekaterih zelo pomembnih snovi v telesu, kot so nevrotransmitor serotonin, hormon melatonin in eden najbolj pomembnih B-kompleksov, niacin. Serotonin, ki ga imenujemo tudi hormon sreče nam daje občutek zadovoljstva in dobrega počutja. Melatonin ima pa glavno vlogo pri uravnavanju dnevno-nočnega cikla. Sposobnost spreminjanja hitrosti sinteze serotonina v možganih z manipulacijo koncentracije triptofana je temelj številnih raziskav, zlasti na temo pomanjkanja ali izčrpavanja L-triptofana in posledic le tega. Poleg tega so klinični testi zagotovili nekaj začetnih dokazov o učinkovitosti triptofana za zdravljenje psihiatričnih motenj, preprečevanje agresije, motenj spanca, sezonsko efektivnih motenj, zlasti kadar se uporablja v kombinaciji z drugimi terapevtskimi sredstvi. Vendar so rezultati teh raziskav za enkrat še vedno preveč neodločni in ne konsistentni in so na to temo potrebne še nadaljne raziskave in preskušnje.

== Eva Kanalec - Oksitocin in njegova vloga v telesu ==
Oksitocin je peptidni hormon, sestavljen iz devetih aminokislin. Prvih šest aminokislin ima ciklično strukturo, ki je posledica disulfidne vezi med cisteinoma, zadnje tri aminokisline pa imajo linearno strukturo. Njegova sinteza poteka v hipotalamusu, skladišči se v zadnjem režnju hipofize oziroma v nevrohipofizi, od koder se tudi sprošča v krvni obtok. V telesu se veže na oksitocinske receptorje, ki jih najdemo v maternici, hipofizi, ledvicah in v ventromedialnem nukleusu hipotalamusa. Receptor je sestavljen iz sedmih transmembranskih domen, ki so na notranji strani membrane sklopljeni z G-proteinom, ta poskrbi za prenos signala naprej po celici. Receptor je specifičen za vezavo oksitocina, saj bi se nanj lahko vezali oksitocinu podobni hormoni kot je na primer vazopresin. Oksitocin ima v telesu pomembno vlogo pri porodu, kjer skrbi za krčenje gladkih mišic maternice. Pomembno vlogo pa naj bi imel tudi pri vplivu na apetit in izbor hrane. Vlogo ima tudi pri navezovanju socialnih stikov, kot je stik med materjo in dojenčkom, ter stik med partnerjema. Dokazano je bilo, da imajo socialni stiki vpliv na povečano raven oksitocina v telesu. V zdravstvu se antagoniste oksitocinskih receptorjev uporablja za zaviranje prezgodnjih porodov, oksitocin pa se uporablja za sprožitev poroda. Potencial za razvoj novih terapij, ki bi temeljile na tarčenju oksitocinskega receptorja ali uporabljale oksitocin, je zelo velik.

== Špela Kladnik - Leptin in njegova potencialna vloga biomarkerja za debelost ==
Debelost je bolezen modernega časa. Statistični podatki nakazujejo, da je debelih vedno več ljudi, debelost pa se v veliko primerih začne pojavljati že v zgodnjih letih. Prekomerna telesna teža ni vedno posledica napačnega prehranjevanja in nezdravega načina življenja. Pojavi se lahko tudi zaradi morebitnih genskih napak in, kakor je bilo raziskano, tudi zaradi motenj v delovanju hormona leptina, ki je eden od hormonov za regulacijo hranjenja. Leptin nastaja v maščobnih celicah in z delovanjem na hipotalamus uravnava vnos hrane in apetit. Je polipeptid, sestavljen iz štirih antiparalelnih α-vijačnic, ki se veže na receptor preko signalne poti JAK-STAT. V telesu imamo več oblik leptinskih receptorjev, ki se razlikujejo v dolžini znotrajcelične domene. Najbolj sta raziskani obliki Ob-Rb, ki je glavna za prenos signala, in (s)Ob-Re, ki je topni leptinski receptor. Določanje koncentracije prostega, vezanega in celotnega leptina ter koncentracije topnih leptinskih receptorjev ima pomembno vlogo pri razumevanju pojava debelosti. Pri vitkih osebah se leptin večinoma nahaja vezan na receptor, medtem ko se pri debelih ljudeh večinoma nahaja v prosti obliki. Zmanjšanje koncentracije topnega leptinskega receptorja lahko nakazuje na manjše število delujočih receptorjev, zato se lahko leptin že v zgodnjih letih uporablja kot biomarker za napovedovanje in zdravljenje debelosti.

==David Verdel - Biosinteza in raznolikost presnove terpena v rastlinah ==
Terpeni al z drugo besedo terpenoidi so večkrat teme raziskav na področju kemije in biokemije kot tudi biologije. Uporabljamo jih v različnih panogah in imajo pomembno ekološko vlogo za rastline in ekosistem. Vse rastline sintetizirajo raznovrstne in edinstvene terpenoide. Nekatere najdemo v večini rastlinah in so skupni vsem, vendar se mnogi sintetizirajo le v določenih taksonih in se vključujejo v določene ekološke razmere. Osnovne biosintetske poti terpenoidov s pomočjo terpen sintaze (TPS), so pogoste pri vseh rastlinah. Nekatere sintetizirajo terpene po mevalonski poti (MVA) nekatere pa po nemevalonski poti (MEP) kjer s pomočjo izopentenil difosfata (IPP) in njegovega alilnega izomera dimetilalil difosfata (DMAPP) ter terpen sintaze (TPS) sintetizirajo od monoterpenov do tetraterpenov in nekateri celo tudi hemiterpene. Nedavne raziskave dokazujejo, da se pri sintezi terpenov uporablaja mnogo več substratov, ki jih lahko uporabljajo encimi terpen sintaze (TPS). Nekateri encimi lahko katalizirajo tvorbo terpenov, čeprav niso iz družine encimov terpen sintaze (TPS). Novo odkriti substrati v nekaterih rastlinah s pomočjo terpen sintaze (TPS) lahko sintetizirajo terpene po različnih poteh kot tudi nekatere povezane z mikrobno TPS. V nekaterih rastlinah pa se celo pojavlja novo odkrit medorganski način prenosa terpenov v rastlinah in nove mehanizmi sinteze terpenov.

== Maruša Sernc - Kreatin, neprecenljiv vir energije in dober prijatelj fitneserjev ==
Pri omembi kreatina se nam najprej pojavi asociacija na prehranski dodatek, ki ga uživajo športniki. Kar pa je v ozadju, kemijska narava, metabolna vloga, razgradnja in podobno, pa večini ostaja neznano. Kaj omogoča kreatinu biti številka 1 na lestvici učinkovitih prehranskih dodatkov pri anaerobnih športih? Zakaj ga veliko zdravnikov predpisuje bolnikom z nevrološkimi težavami? Kreatin (Cr) spada v skupino fosfagenov, njegova glavna metabolna funkcija pa je vzdrževanje koncentracije ATP med anaerobnim mišičnim delom. Deluje torej kot ATP pufer, ki omogoča prenos energije iz mitohondrijev v ostale predele celice brez prisotnosti kisika. To lastnost kreatinu omogoča reverzibilna reakcija encima kreatin kinaze, ki osnovno obliko kreatina spremeni v kreatin fosfatno obliko (PCr). Ob pomanjkanju ATP-ja v celici pa reakcija poteka v obratni smeri, in iz kreatin fosfata nastajata kreatin in anorganski fosfat (Pi). Slednji se združi z ADP in dobimo novo molekulo ATP. To je torej razlog, zakaj se kreatin uvaja v dieto številnih profesionalnih kakor tudi rekreativnih športnikov. Nadaljnje raziskave in študije pa so pokazale pozitiven vpliv kreatina na kognitivne in nevrološke funkcije našega telesa. Dokazano je bilo, da kreatin učinkovito deluje pri lajšanju simptomov številnih nevrodegenerativnih bolezni, kot so Huntingtonova bolezen, Parkinsonova bolezen in cerebralna ishemija. Pomembno je dodati, da za zdaj v povezavi s kreatinskimi dodatki ni bilo odkritih še nobenih resnejših negativnih posledic.

BIO2 Povzetki seminarjev 2020

2021-01-08T20:42:52Z

Marusasernc: /* POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2020/21 */

= POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2020/21 =

==Jan Bregar - Protein retinoblastoma==

Protein retinoblastoma (pRb) je eden ključnih proteinov, ki regulirajo celični cikel in njegova inaktivacija lahko povzroči različna bolezenska stanja. Ta protein regulira ključni prehod iz G1 v S fazo celičnega cikla s pomočjo interakcij z družino E2F, ki je vrsta transkripcijskih faktorjev celičnega cikla. Retinoblastoma protein (pRb) nadzoruje tudi izstop celice iz celičnega cikla. Njeno aktivnost regulira več mehanizmov, ki zaznavajo znotraj- in zunajcelične signale, ki blokirajo ali dovoljujejo fosforilacijo. pRb fosforilirajo od ciklina odvisne kinaze (Cdk-ji) in s tem protein Rb bodisi inaktivirajo ali pa rahlo spremenijo njegove lastnosti, protein pa vseeno ohrani svojo funkcijo. Odkrili so tudi, da pRb regulira apoptozo s pomočjo enakih interakcij s transkripcijskimi faktorji E2F. To, da je pRb vpleten pri apoptozi, popolno dopolnjuje pRb kot pomemben določevalec usode celice. Med trajanjem celičenga cikla je pRb inaktiviran, kar povzroči, da je celica bolj občutljiva na apoptotske stimuluse. Regulacijo apoptoze lahko onesposobijo nekateri virusi, ki s svojimi onkoproteini povzročijo napake v delovanju proteina Rb, kar lahko predstavlja tveganje za organizem. pRb – E2F kompleksi imajo pomembno vlogo pri regulaciji transkripcije genov, ki so vključeni v diferenciaciji in razvoju.

==Ajda Beltram - Struktura in dinamika signalnih komplekov GPCR==

Receptorji sklopljeni z G-proteinom (GPCR) so transmembranski proteini, ki kot odgovor na ligande regulirajo veliko signalnih poti preko heterotrimernih G-proteinov ali pa preko fosforilacije receptorja s kinazo GRK in arestinov. Vendar ti proteini ne obstajajo le v aktivirani ali neaktivirani obliki, pač pa imajo veliko konformacijskih stanj, ki vsaka sproži svojo signalno pot. Mene je zanimala podrobna razlaga konformacijskih sprememb, ki se zgodijo med prenosom signala. Za aktivacijo G-proteinov je potrebna zamenjava GDP z GTP, kjer igra ključno vlogo razcep domen podenote α G-proteina in destabilizacija vezavnega mesta za nukleotid na Ras-domeni podenote α, kar so posledice konformacijskih sprememb, ki jih povzroči vezava na receptor. Različni ligandi, ki se vežejo na receptorje, pa lahko vplivajo tudi na afiniteto G-proteina do GDP. Kompleksi receptor-G-protein, ki nastanejo z vezavo popolnih agonistov, imajo manjšo afiniteto do GDP, kot tisti, ki so nastali z vezavo delnih agonistov. Pri arestinih pa so prav tako prišli do novega spoznanja. Aktivacija arestinov je večinoma prikazana kot proces iz dveh delov in sicer vezave na fosforiliran C-rep receptorja in nato vezave na jedro receptorja, vendar pa so odkrili, da lahko obe vezavi posebej aktivirata arestin. To nakazuje na to, da verjetno obstaja veliko različnih kompleksov arestina in receptorja, ki regulirajo vsak svojo signalno pot.

==Anja Moškrič - Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmitorjev==

Signalizacija živčnih celic med drugim poteka s prenosom nevrotransmitorjev preko sinaps. Pri kemični sinapsi gre za pretvarjanje električnih impulzov v eksocitotsko sprostitev nevrotransmitorja (npr. glutamat, GABA, epinefrin, norepinefrin). Pri pretvarjanju signala imajo ključno vlogo napetostno uravnavani kalcijevi ionski kanalčki (Cav), v presinaptičnem predelu. Ti, kot odgovor na depolarizacijo nevrona, usmerjajo kalcijeve ione v notranjost celice in posledično sprožijo fuzijo mešička (z nevrotransmitorjem) s presinaptično membrano. Zgrajeni so iz več podenot, od teh je glavna α1, ki tvori poro za pretok ionov. Podenoti α2δ in β pa regulirata lastnosti. Kanalčke glede na obliko glavne podenote klasificiramo v 3 večje skupine: Cav1, Cav2 in Cav3. V večini sinaps so prisotni kanalčki iz družine Cav2. Da eksocitoza lahko poteče hitro in učinkovito, morajo biti Cav locirani znotraj aktivne regije presinaptične membrane, v bližini mesta eksocitoze. Slednjo kalcijevi kanalčki regulirajo preko različnih proteinov. Pomembnejši predstavnik je družina proteinov RIM (z rab3 vezavne molekule). Ti se na kanalček vežejo z RIM vezavnimi proteini (RBP). Z njimi asociira tudi protein munc13, ki je v membrani vezikla in nevrona vezani s proteini SNARE. Ti so mediatorji pri fuziji membran. Delovanje kanalčka inaktivirajo procesi, kot sta od napetosti odvisni mehanizem in od kalcija odvisen mehanizem, ki je povezan s kalmodulinom.

==Gregor Strniša - Načini aktivacije GPCR==

GPCR, oziroma z G proteinom sklopljeni receptorji, so transmembranski proteini, ki s svojim delovanjem vplivajo na dogajanje v celici. Zaradi vezave liganda na njihovo zunajcelično stran se jim spremeni konformacija in omogoči prenos signala preko različnih signalnih molekul. Signal se preko različnih G proteinov in β-arrestinov prenaša do drugih proteinov v celici. Kmalu po odkritju GPCR se je izkazalo, da vsi ne delujejo po istem principu. Nove raziskovalne metode so omogočile napredek na področju vizualizacije molekul in njihovega sledenja v celici. Tako so znanstveniki prišli do odkritja petih novih metod aktivacije GPCR, ki lažje razložijo delovanje receptorjev. Med seboj so si različne, a se lahko pogosto prekrivajo in dopolnjujejo. GPCR omogočijo več možnosti odgovora na določen ligand in njegovo koncentracijo. Načini aktivacije, predstavljeni v moji seminarski nalogi, so pristranska aktivacija, znotrajcelična aktivacija, dimerizacijska aktivacija, transaktivacija in dvofazna aktivacija. Posamezen receptor navadno deluje na več načinov. Ob posameznem načinu so podani primeri receptorjev in njihovega delovanja. Z razumevanjem načinov njihove aktivacije se odprejo nove možnosti razvoja zdravil, ki bi delovale preko GPCR, ali vplivale na njihove signalne poti.

==Nikola Janakievski - Selective Androgen Receptor Modulators==

Selective Androgen Receptors Modulators or better known as SARMs, were discovered 30 years ago, as a potential replacement to steroid therapy. SARMs are a type of Selective Receptor Modulators (SRM), compounds which can act both as agonists and antagonists in androgen receptors (ARs) (as a non-steroid replacement), according to the tissue they are in. The main idea behind SARMs, is improving the hormone therapies we have currently, which use synthetic steroids. An ideal SARM could have all the benefits of steroid hormones, without the side effects. The potential benefits and safety of SARMs is yet to be determined, there are numerous ongoing studies for various applications. It is important to have a summary of all these potential application and past examples of studies. In this seminar, we aim to do just that, by comparing all past studies and future potential applications related to SARMs. We conclude that, SARMs are a viable alternative, possibly an improvement to synthetic steroids, although much more research and clinical trials are required for SARMs to become truly applicable.

==Vid Dobrovoljc - Medsebojni vpliv signalnih poti na primeru RTK in GPCR signalnih poti==

Preučevanje součinkovanja med signalnimi potmi v celici je zelo zanimivo področje, vendar dokaj težko za raziskovanje. S seminarjem sem poizkusil predstaviti sovplivanje inzulinske(RTK) in β-adrenergične (GCPR) poti v srcu. . Inzulin na β-adrenergične (βAR) poti vpliva s fosforilacijo receptorja z različnimi kinazami, na primer protein kinazo A (PKA) G-protein kinazo (GRK2) in celo sam inzulinskim receptorjem (INSR), kar vodi do desenzitacije in včasih tudi internalizacije receptorja z vezavo β-arestina. Drug način vplivanja je z delovanjem na nižje člene v signalni poti, na primer na koncentracijo cAMP s fosfodiesterazami (PDE). Inzulin lahko tudi s pomočjo fosforilacije uporabi β-adrenergično pot za krepitev svojega signala. Zelo pomembna točka obeh signalnih poti je GRK2, ki po naravi deluje inhibirajoče na obe signalni poti, po zadnjih rezultatih pa jo poleg tega inzulin uporablja za še dodatno inhibicijo GPCR poti. Vplivanje βAR poti na inzulinsko pot je manj jasno, vendar kaže, da lahko βAR na sprejem glukoze v odvisnosti od situacije vpliva tako pozitivno kot negativno, dokaj pomembno vlogo pri tem pa ima PKB. Domnevam, da bo v prihodnosti vedno več raziskav na temo povezav med signalnimi potmi, saj bodo razvite nove opazovalne tehnike, poleg tega pa je razumevanje povezav koristno tako pri razvoju novih tehnik zdravljenja, kot pri samem študiju razvoja celične signalizacije

==Rebeka Jerina - Kofein kot antagonist adenozinskih receptorjev==

Veliko ljudi po svetu pije kavo, čaj ali kokakolo. Vsem naštetim pijačam je skupen kofein, najpogosteje zaužit psihostimulant na svetu. Kofein povzroča veliko učinkov, med katerimi je najbolj znan vpliv na budnost. Zanima me ali vemo kako in zakaj jo povzroči. Kofein je antagonist adenozinskih receptorjev (ARs). Ima podobno strukturo kot adenozin, zato lahko zaseda njegova vezavna mesta. Adenozinski receptorji so izraženi v mnogih tkivih, veliko pa jih najdemo v centralnem živčnem sistemu (CNS). Raziskala sem, da kofein večinoma vpliva na adenozinska receptorja podtipa A1 in A2A. Te dva podtipa adenozinskih receptorjev (ARs) vplivata na regulacijo mnogih fizioloških funkcij kot so spanje, kognicija, motivacija in čustva. Kofein tako z antagonizmom adenozinskih receptorjev (ARs) prepreči signalno kaskado, ki bi spodbudila zaspanost in posledično ohranja budnost. Adenozinski receptorji (ARs) spadajo pod receptorje povezane z G-proteini. Zgradba A1AR in A2AAR se nekoliko razlikuje, zato je tudi mehanizem delovanja teh dveh podtipov nekoliko drugačen. Signalizacija adenozinskih receptorjev (ARs) lahko poteka po več različnih signalnih poteh. Kofein bi zaradi pozitivnih okrepitvenih učinkov, pojava različnih duševnih motenj in pojava negativnih simptomov po prenehanju uživanja lahko prištevali med droge. Raziskave so pokazale, da se z antagonizmom adenozinskih receptorjev da uspešno zdraviti tudi številne bolezni. Glede na učinke in uporabo kofeina bi lahko rekli, da velja za hranilo, zdravilo ali drogo.

==Zala Perko - Mehanizmi vezave ligandov in regeneracija fotoreceptorjev očesne mrežnice==

Fotoreceptorji v membrani celic očesne mrežnice so značilni predstavniki z G-proteinom sklopljenih receptorjev. Njihova naloga je absorpcija svetlobe določene valovne dolžine in prenos signala preko G-proteina na citoplazemsko stran, kjer poteče veriga encimsko kataliziranih reakcij. Aktiviran fotoreceptor mora v procesu regeneracije ponovno zavzeti neaktivno konformacijo in vezati naravni ligand 11-cis-retinal. Barvni fotoreceptorji jodopsini zahtevajo učinkovit regeneracijski mehanizem, ker morajo stalno procesirati veliko količino svetlobnih signalov. Aktivna konformacija jodopsina razpade veliko hitreje v primerjavi z rodopsinom in tudi sam potek regeneracije je pri jodopsinih hitrejši. Vzrok za to bi lahko bila različna usoda desenzibiliziranih receptorjev. Nedavno so odkrili možnost, da pri regeneraciji jodopsinov pride do preusmeritve signalne poti. Namesto, da se receptor deaktivira preko internalizacije z arestinom, ostane v membrani in veže ligand glede na prehodno konformacijsko stanje v katerem se nahaja. Na različen potek regeneracije jodopsinov bi lahko vplivala tudi vezava druge molekule retinala v alosterično mesto, ki je posledica konformacijskih sprememb. Povezava med interakcijo retinala in njegovih analogov z določenim konformacijskim intermediatom ima pomembno vlogo tudi s terapevtskega vidika, saj GPCR-ji v splošnem predstavljajo terapevtske tarče za zdravljenje mnogih obolenj. Uporaba analogov 11-cis-retinala, kot sta 9CR in 6mr, ki se vežeta v aktivno ali eno od alosteričnih mest, bi lahko predstavljala učinkovit pristop pri zdravljenju prirojenih mutacij v fotoreceptorjih.

==Eva Vene - Povezava bolečine z vezavo kapsaicina na TRPV1==

Družina TRP kanalčkov pri živalih združuje devet manjših skupin kationskih prenašalcev, ki odločilno vplivajo na pravilno delovanje organizma. Eden od tovrstnih kanalčkov je tudi TRPV1 z angleškim imenom »transient receptor potential vanilloid 1«. Tega najdemo v mnogih organih in organskih sistemih, natančneje pa se v tem seminarju osredotočamo na njegovo vlogo v perifernem živčevju. TRPV1 vsebuje okoli polovica vseh somatskih in visceralnih senzoričnih nevronov, zato je pomemben mediator pri nocicepciji oziroma zaznavanju možno nevarnih stimulov ter njihovim prevodom v akcijskih potencial. Njegovo delovanje, poleg nekaterih drugih dražljajev, lahko vzbudi organska molekula, imenovana kapsaicin. Slednjega najdemo v sadežih rastlin rodu Capsicum in ga pojmujemo kot eno odločilnih molekul za pekoč okus teh plodov. Ob vezavi kapsaicina na TRPV1 v celico vdrejo kationi, ki spodbudijo različne celične procese, ključne za oblikovanje in prenos živčnega signala do možganov ter pojav vnetja. Posebej zanimive so dvolične posledice vezave kapsaicina, ki sicer vodijo do bolečine, draženja in vnetja, a omogočijo tudi refrakcijsko dobo kanalčka, ki predstavlja čas, ko slednjega ne moremo aktivirati ter desenzitacijo in degradacijo živčnih vlaken, kar povezujemo z analgetičnim učinkom te molekule. Ob redni daljši izpostavitvi kapsaicinu, ki ga lahko administriramo transdermalno ali injiciramo, se tako uspešno uporablja pri lajšanju kroničnih bolečin.

==Erik Putar - AMPK: senzor glukoze ter celičnega energijskega stanja ==

Celica uporablja z AMP aktivirano protein kinazo (AMPK) kot senzor celičnega energijskega stanja in glukoze. Njen glavni aktivator je AMP, ki promovira fosforilacijo Thr172 na AMPK, inhibira defosforilacijo fosforiliranega Thr172 ter alosterično aktivira AMPK. Aktivacija AMPK poteče že ob majhem energijskem deficitu in sproži regulatorni odgovor, ki preusmeri celični metabolizem iz anabolizma v katabolizem. Fosforilacija Thr172 poteče preko kinaze LKB1, medtem ko sta glikogen sintaza in acetil koencim A karboksilaza (ACC) dve tarči izmed mnogih kinazne aktivnosti AMPK. AMPK je heterotrimer sestavljen iz podenot α, β in γ. V α podenoti je prisotno kinazno aktivno mesto ter Thr172, medtem ko so na γ podenoti prisotna vezavna mesta za adenin nukleotide. β podenota je miristilirana na svojem N koncu, kar je ključnega pomena za delovanje glukoznega senzorja. Ta mehanizem poteka na lizosomih in sicer s tvorbo velikega kompleksa, ki vsebuje aldolazo, v-ATPazo, Ragulator, AXIN, LKB1 ter AMPK. Aldolaza je sicer tista, ki čuti prisotnost glukoze in to preko fruktoze 1,6-bisfosfata (FBP): odsotnost FBP v njenem aktivnem mestu aktivira AMPK neodvisno od razmerja koncentracijah adenin nukleotidov in tako preusmeri celico iz glikolitične v alternativne oksidativne poti.

==Timotej Sotošek - Regulacija mišičnega glikogena: granule in njeni proteini ==

Glikogen je primarna oblika shranjevanja glukoze, ki je hitra in dostopna oblika energije. Kljub njegovi pomembnosti pa procesi regulacije glikogena še vedno niso popolnoma jasni. Metabolizem glikogena je zelo reguliran, hkrati pa dinamičen. Kako se bo metabolizem glikogena usmeril, je odvisno od mnogih dejavnikov. Zaloge glikogena v skeletnih mišicah so razdeljena na tri območja: podsarkomerno, intermiofibrilarno in intramiofibrilarno. Vsako od teh območij ima drugačno funkcijo v celici in temu primerno vsaka zase regulira sintezo in razgradnjo glikogenskih granul. Vsaka granula glikogena pa je sposobna tudi samostojnega izvajanja regulacije, pri kateri sodelujejo različni proteini. Eden pomembnejših je protein fosfataza 1 (PP1), ki nadzoruje aktivnost ključnih encimov, kot so glikogen sintaza (GS) in glikogen fosforilaza (GP), pri tem pa mu pomaga glikogen tarčni protein (PTG), ki deluje kot ogrodni protein med PP1 in drugimi proteini. Ta proces je reguliran preko kompleksa laforin-malin, ki prekine povezavo med PP1 in PTG. V seminarju so predstavljene naloge in lastnosti glikogena v treh oddelkih znotraj skeletnih mišic. Predstavljen bo vpliv, ki ga imajo našteti proteini na sintezo glikogena, podrobnejši opis naloge, zgradbe proteinov laforina in malina, kako kompleks laforin-malin inhibira glikogen sintezo ter kakšne so posledice nedelovanja tega proteinskega kompleksa.

==Nika Tomsič - Acetil-CoA: glavni metabolit in sekundarni obveščevalec ==

Acetil-CoA je eden glavnih metabolitov. Deluje kot mejna točka med glikolizo in Krebsovim ciklom. Poleg tega so pomembne tudi njegove naloge kot sekundarni obveščevalec. Nadzoruje ključne celične procese, vključno z energetsko presnovo, mitozo in avtofagijo, tako neposredno kot preko regulacije ekspresije genov. Acetil-CoA običajno nastane v mitohondrijskem matriksu iz piruvata ali kot posledica β-oksidacije dolge verige maščobnih kislin. Lahko pa nastane tudi v citosolu z oksidacijo aminokislin, etanola ali z delovanjem acetil-CoA sintetaze, ki združuje dve glavni komponenti: acetil in koencim A. Razmerje med koncentracijama v mitohondrijskem matriksu in v citosolu je vedno enako. Govorimo torej o nekem dinamičnem ravnotežju, ki ga omogočajo številni prenašalci. Mitohondrijska memebrana je sicer neprepustna za acetil-CoA, zato mora najprej zreagirati v drugo obliko, da lahko vstopa ali iztopa iz mitohondrija. V mitohondrij vstopa piruvat s pomočjo citrat – piruvatnih prenašalcev. Tu piruvat dehidrogenazni kompleks katalizira reakcijo v acetil-CoA. Ko pa je v mitohondriju preveč acetil-CoA, se lahko ta prenese v citosol ali jedro v obliki acetilkarnitina preko karnitinskega prenašalca. V citosolu se spet povrne v acetil-CoA in je lahko vir anabolizma maščobnih kislin ali aminokislin, v jedru pa je njegova funkcija acetiliranje histonov. To omogoči prepisovanje genskega materiala. Lahko pa tudi nadaljuje svojo pot v mitohondriju in vstopi v citratni cikel, kjer je prvi korak pretvorba v citrat preko citratnega sinteznega kompleksa.

==Aleksandra Rauter - Vloga intermediatov Krebsovega cikla v makrofagih==

Makrofagi so nepogrešljive komponente imunskega sistema, ki izhajajo iz matičnih celic kostnega mozga in nastajajo v procesu hematopoeze. Glavne funkcije, ki jih opravljajo so fagocitoza, izločanje citokinov in sodelovanje pri humoralnem imunskem odzivu skupaj z limfociti. Njihovo aktivacijo povzroči prisotnost različnih citokinov, ki se vežejo na specifične TLR receptorje. Najpogostejši ligand klasične aktivacije je lipopolisaharid (LPS), strukturna komponenta celičnih sten bakterij. Zaznava vezanega liganda preko adapterskih proteinov, signalne kaskade, transkripcijskih faktorjev vodi do razvoja enega od dveh fenotipov makrofagov. M1 fenotip ima baktericidno in fagocitno delovanje, M2 pa sodeluje predvsem pri reparaciji tkiv. Točni mehanizmi, ki to povzročijo, še niso poznani. M1 makrofag ima reprogramiran Krebsov cikel, kar povzroči akumulacijo različnih intermediatov v mitohondriju. Ti se lahko prenesejo v citosol preko specifičnih transporterjev in sodelujejo pri različnih regulatornih mehanizmih. Sukcinat povzroči povečano izločanje vnetnih citokinov preko stabilizacije transkripcijskega faktorja HIF-1α, povečanja količine mROS, posttranslacijskih modifikacij proteinov in signalizacije preko z GPCR. Spremenjen Krebsov cikel povzroči akumulacijo citrata, ki je perkurzor itakonata. Ta preko transkripcijske regulacije in inhibicije določenih encimov regulira protivnetni in protimikrobni odziv. Fumarat in α-ketoglutarat sodelujeta pri epigenetski regulaciji celičnih procesov.

==Jakob Tomšič - Funkcije ketonskih telesc v centralnem živčevju ==

Acetoacetat, β-hidroksibutirat in aceton, drugače imenovani tudi ketonska telesca, so produkti našega metabolizma, ki ob pomankanju hranil možgansko tkivo, srce in skeletne mišice oskrbujejo z energijo. Ketogeneze pa danes ne povezujemo le s stanjem pomankanja hranil, ampak jo lahko spodbudimo tudi s tako imenovano ketogeno dieto, ki ji pripisujejo mnoge pozitivne učinke. Vloga ketogene diete pri epilepsiji in drugih nevroloških boleznih je poznana že skoraj stoletje, vendar so bili mehanizmi za antiepileptično delovanje vedno uganka. Trenutno poznamo več funkcij ketonskih telesc, ki presegajo njihovo osnovno metabolno vlogo. Ketonska telesca imajo epigenetski vpliv in lahko spodbujajo izražanje antioksidativnih genov. Prav tako je viden vpliv na vezikularni transport glutamatata z VGLUT v nevronih in zaviranje prenosa signala z GABA nevrotransmiterji. Ketonska telesca izražajo nevrozaščitno in protivnetno vlogo z vplivom na imunski sistem, z vezavo na HCA2 receptor, ki spodbuja nastanek prostagladina D2, in inhibicijo NLRP3 inflamasoma. Nevrološke motnje, kot je epilepsija, imajo več vzrokov, med katerimi sta neizpodbitno prevelika vzburjenost nevronov ter vnetno stanje tkiva. Vedno več dokazov kaže na vlogo ketonskih telesc pri nadziranju in manjšanju števila epileptičnih napadov pri bolnikih. Kljub vsem dokazom in povezavam pa še vedno obstajajo dvomi, da so ravno ketonska telesca tista, ki imajo antiepileptične funkcijo.

==Laura Unuk - Motnje oksidacije dolgoverižnih maščobnih kislin in karnitinskega transporta ==

Motnje oksidacije dolgoverižnih maščobnih kislin (lcFAOD) so dedne avtosomske recesivne bolezni, ki onemogočajo metabolizem maščobnih kislin. Gre za mutacije genov, ki kodirajo encime oksidacije in karnitinskega transporta. Pri oksidaciji dolgoverižnih maščobnih kislin (12-18 C-atomov) sodeluje več kot 15 encimov, vendar le motnja enega lahko pripelje do kliničnih simptomov, kot so šibkost mišic, odpoved jeter, odpoved srca, itd. Glavni encimi, ki katalizirajo karnitinski transport so OCTN2 (organski-kationski-transporter-novel-2), CPT1 (karnitin-palmitoil-transferaza-tipa-1A), CPT2 (karnitin-palmitoil-transferaza-tipa-2) in CACT (karnitin-acilkarnitin-translokaza); encimi, ki pa katalizirajo oksidacijo so VLCAD (zelo-dolgoverižna-acil-CoA-dehidrogenaza), MTP (mitohondrijski-trifunkcijski-protein), LCHAD (dolgoverižna-3-hidroksiacil-CoA-dehidrogenaza) in LCKAT (dolgoverižna-3-ketoacil-CoA-tiolaza). Karnitin je pomembna molekula za prenos dolgoverižnih maščobnih kislin skozi membrano mitohondrija, saj dolgoverižna maščobna kislina lahko vstopi v mitohondrij le v obliki acil-karnitin estra. Najpogostejša motnja pri oksidaciji dolgoverižnih maščobnih kislin pa je motnja VLCAD encima, ki katalizira reakcije odcepa dveh ogljikovih atomov iz maščobne kisline na CoA. Nastali acil-CoA lahko nato vstopi v cikel citronske kisline, kjer nastane ATP. Ob nedelovanju VLCAD pride do pomanjkanja ATP v celici in posledično kliničnih simptomov. Zaznavanje napake enega od encimov je izvedena preko profila acilkarnitina v krvi, plazmi ali DBS. Z metodo NBS ('newborn screening') lahko kmalu po rojstvu že zaznajo motnjo in tako s hitrim zdravljenjem preprečijo neprijetno napredovanje bolezni. Poleg trenutnega zdravljenja so v razvoju različne terapije za zdravljenje motenj, ki pa imajo velik potencial.

==Stefanija Ivanova - Vpliv telovadbe na metabolizem ketonskih telesc ==

Ketonska telesca predstavljajo alternativno energijo za možgane, srce in skeletne mišice pod določenimi pogoji, kot so stradanje, intenzivna vadba, nenadzorovan diabetes ali po zaužitju ketonskih dodatkov. Zanimanje za delovanje ketonskih telesc se je povečalo predvsem pri športnikih. Ker ima uživanje eksogenih ketonov dramatične učinke na metabolizem skeletnih mišic med vadbo, imajo lahko športniki od tega koristi. Pomembna premisleka sta, kako športniki tolerirajo vnos ketonskih estrov med vadbo in ali dodatek ogroža ali vpliva na vnos ogljikovih hidratov. Zaužitje ketonskih dodatkov lahko hitro poveča koncentracijo ketonskih telesc, v primerjavi s ketogeno prehrano ali stradanjem, ki potrebujeta vsaj nekaj dni. Dodatek eksogenih ketonov predstavlja vir energije in ima lahko učinke pri varčevanju zalog ogljikovih hidratov med treningom v času nizke razpoložljivosti ogljikovih hidratov. Varčevanje zalog endogenih ogljikovih hidratov bi teoretično povzročilo večjo zmogljivost med ključnimi deli, med katerim so ogljikovi hidrati prevladujoči substrat. Dokler niso metabolne interakcije dodatkov ketonskih estrov s skeletnimi mišicami med vadbo popolnoma razjasnjene, vse predlagane ergogene lastnosti ostanejo teoretične. Glavni razlog za utemeljevanje eksogenih dodatkov ketonov morajo biti ugotovitve, da se ketoliza med vadbo poveča in pomembno prispeva k oskrbi z energijo. Čeprav obstajajo predlogi, da so dodatki ketonskih telesc koristni za športnike, je trenutno premalo informacij o učinkih dodatkov na metabolizem ketonskih telesc med vadbo. Na številna vprašanja je še treba odgovoriti.

==Nika Perko - Encim karbamoil fosfat sintetaza 1 ==

Karbamoil fosfat sintetaza 1 (CPS1) je limitni encim cikla uree, ker katalizira njeno prvo tristopenjsko reakcijo. Nahaja se v matriksu mitohondrija v celicah jeter, ledvic in tankega črevesa. Sestavljen je iz šestih domen: interakcijske, glutaminazne, integracijske, alosterične in dveh katalitskih. Encim je lahko v neaktivni ali aktivni obliki. Alosterično ga aktivira N-acetil-L-glutamat. Encim se lahko pozitivno regulira s proteinom Sirtuin 5 in glukagonom, negativno pa z mikro RNA miR-19b in od ATP odvisno kinazo (AMPK). Napačno delovanje kateregakoli od petih encimov ali transporterjev cikla uree vodi v zelo redko bolezen – motnje cikla sečnine. Prav motnja v delovanju encima CPS1 povzročajo najhujšo obliko te bolezni. Izrazi se lahko tako v neonatalni dobi kot tudi kasneje, določi pa se jo preko encimske ali genske analize. Simptomi so lahko letargija, bruhanje, encefalopatija in koma. Mutacije tega in tudi preostalih encimov ciklusa povzročijo hiperamoniemijo, ki se jo zdravi s hemodializo in raznimi zdravili, kot so L-arginin hidroklorid, natrijev benzoat in natrijev fenilbutirat. Bolniki se morajo držati stroge diete, bogate z ogljikovimi hidrati in maščobami. Poleg omenjenih zdravil lahko uživajo tudi N-karbamil-L-glutamat, ki deluje kot šaperon, stabilizator in aktivator. Trenutno je edina trajna in učinkovita rešitev transplantacija jeter, v prihodnosti pa bo morda učinkovita tudi genska terapija.

==Neža Leskovar - Urea transporterji in regulacija skoncentriranosti urina ==

Urea je vodotopna polarna molekula, ki lahko počasi prehaja čez celične membrane z difuzijo, hiter in učinkovit transport pa ji omogočajo urea transporterji UT-A in UT-B. Ti sodelujejo pri izločanju odvečnega dušika iz telesa, koncentriranju urina in s tem pri regulaciji tekočinskega ravnovesja ter ponovni uporabi dušika vezanega v urei s pomočjo črevesnih bakterij. Transporterji so v osnovi sestavljeni iz dveh hidrofobnih transmembranskih domen in velike ekstracelularne povezovalne zanke, razen UT-A1, ki je rezultat podvojene osnovne strukture. So N-glikozilirani in imajo znotrajcelični aminski in karboksilni konec. UT-A transporterji se večinoma nahajajo v ledvicah. UT-A1 najdemo v spodnjem predelu ledvičnega zbiralca, v apikalnih delih celic, kjer omogoča prehod uree iz zbiralca v epitelne celice. UT-A3 se prav tako nahaja v spodnjem predelu ledvičnega zbiralca, le da v bazalnih delih celic in omogoča prehod uree nazaj v telesni obtok. UT-A2 se nahaja v Henlejevi zanki in skrbi za prehod uree iz ledvične sredice nazaj v Henlejevo zanko. UT-A4 je bil najden v ledvicah podgan, UT-A5 so našli v testisih miši in UT-A6 v človeškem črevesju. UT-B transporterji se nahajajo v ledvičnih kapilarah, najdemo jih tudi v različnih tkivih. Transport uree je dobro reguliran z vazopresinom, hiperosmolarnostjo, ubikvinacijo in drugimi načini.

==Luka Šegota - Hiperamoniemija ==

Amonijak je pomemben vir dušika v telesu. Ima vlogo skrbnika ravnovesja aminokislin, sodeluje pri sintezi proteinov in zagotavlja pH vrednost okolja. Stanje ko je amonijaka v krvi preveč, imenujemo hiperamoniemija. Telo odstranjuje amonijak v jetrih in v manjšem obsegu tudi v ledvicah preko cikla uree. V možganih pa se amonijak odstrani s pomočjo glutamin sintetaze, ki iz glutamata in amonijaka tvori glutamin, ki je pomemben transporter dušika in s tem amonijaka. Glavni vzrok za hiperamoniemijo so motnje v ciklu uree. Poznamo primarno hiperamoniemijo, ki se razvije zaradi pomankanja encimov ali transporterjev v ciklu uree in pa sekundarno, ki izvira iz inhibicije cikla uree. Amonijak povzroča največje težave v možganih, saj lahko prosto prehaja krvno-možgansko bariero. Tam povzroča pojave kot so otekanje astrocitov, eksitotoksičnost in neravnovesja med aminokislinami, žal pa je večino teh procesov slabo raziskanih, zato je večina mehanizmov opisanih le s hipotezami. Zdravljenje hiperamoniemije poteka preko dveh možnih poti; 1) terapije, ki znižujejo nastanek in absorpcijo amonijaka, tako da zmanjšajo število bakterij, ki proizvajajo ureaze, ali zmanjšajo degradacijo glutamina, 2) terapije, ki izboljšujejo mehanizme izločanja amonijaka, preko aktivacije cikla uree ali sinteze glutamina.

==Ela Bizjak - Mutacije mitohondrijske DNA, heterogenost in mitohondrijske bolezni==

Mutacije mitohondrijske DNA so del mitohondriju lastnega dednega zapisa. Mitohondrijska DNA je krožna molekula, ki je stabilizirana z zvitjem v nukleoide. Najpogosteje mutacije nastanejo med replikacijo, saj je po predvidenih mehanizmih takrat DNA dolgo izpostavljena in enoverižna, prav tako pa je podvajanje pogosto. Poleg tega, da ima mitohondrijska polimeraza šibko eksonukleazno aktivnost, se v bližini dednega materiala nahaja tudi respiratorna veriga, ki proizvaja reaktivne kisikove radikale. Mutacije se širijo glede na njihovo vrsto. Delecije imajo pri podvajanju prednost, ker so manjše kot nemutirane molekule, zato v organelu hitro prevladujejo, dedni prenos delecij pa je zelo redek. Točkovne mutacije se širijo s sproščeno replikacijo, delitvami in fisijami mitohondrijev. Če so prisotne v spolnih celicah matere, jih podedujejo vsi njeni potomci. Heteroplazmija se lahko med tkivi osebka razlikuje. Te razlike so opazne v nepravilnostih na proteinskih superkompleksih, oblikah krist, sestavi mitohondrijske membrane, napetostnem potencialu in okvarah respiratorne verige. S sledenjem mutacijam ali različnim haploskupinam lahko sledimo tudi migracijam populacij. Nekatere dedne mutacije so odgovorne tudi za bolezenska stanja, če je nosilka mutacij mati. Najpogosteje prizadenejo živčevje, pojavijo pa se lahko ob rojstvu ali kasneje med 20. in 40. letom.

==Bor Krajnik - Reaktivne kisikove zvrsti in njihova vloga pri regulaciji celične proliferacije ==

Kisikove reaktivne zvrsti ali krajše ROS so zelo reaktivne zvrsti, ki nastajajo pri redukciji molekularnega kisika, med seboj pa se pretvarjajo spontano ali s pomočjo encimov. V celici sta najpomembnejša predstavnika vodikov peroksid in superoksidni anion. Glaven vir ROS v celici so mitohondriji, kjer nastajajo kot produkt preobremenjenih elektronskih prenašalnih verig. Sprva se je njihova pristnost v organizmih smatrala za izključno škodljivo, ampak danes vemo, da imajo v človeškem organizmu več funkcij. V celici igrajo pomembno vlogo v določenih signalnih poteh, kar dosežejo z oksidacijo predvsem cisteinskih ostankov. Ob hipoksiji so ROS pomembne pri stabilizaciji ene od podenot hipoksija inducibilnih faktorjev (HIF), to so transkripcijski fakorji, ki regulirajo ekspresijo genov in so pomembni za angiogenezo in celično proliferacijo. Prav tako so pomemben člen signalne poti preko katere hormon angiotenzin II spodbuja delitev celic gladkih mišic v žilah. Regulirajo aktivacijo T-celic, kar privede do njihove proliferacije. ROS so vpletene tudi v proliferacijo rakastih celic, v katerih visoki nivoji ROS pomagajo pri angiogenezi, ki je potrebna zaradi hitre rasti tumorja kar vodi v hipoksijo. Zaradi tega so bile preizkušene kot potencialna tarča pri zdravljenju raka vendar so rezultati mešani.

==Maja Kobal - Od UCP1 odvisna in neodvisna termogeneza==

Termogeneza je proces nastajanja toplote in je eden od mehanizmov termoregulacije. Glavni regulator adaptivne nedrgetajoče termogeneze je protein UCP1, imenovan tudi termogenin. To je razklopitveni (ang. uncoupling) protein, ki se nahaja v notranji mitohondrijski membrani rjavih in bež adipocitov (maščobne celice), kjer razklaplja protonski gradient, ki se ustvari med procesom dihalne verige. Gradient protonov preusmeri nazaj v matriks mitohondrija, namesto da bi ta šel preko ATP-sintaze. Tako torej ne nastane ATP, ampak sprosti se toplota, ki segreje celico in pomaga ohranjati stalno telesno temperaturo. Glavni regulatorji delovanja UCP1 so maščobne kisline in purinski nukleotidi; prvi delujejo kot aktivatorji, slednji pa kot inhibitorji. Novejše raziskave pa so pokazale mehanizme in termogene regulatorje v adipocitih, ki so neodvisni od UCP1. Ti mehanizmi so kroženje kalcijevih ionov preko mehanizma SERCA, kreatin-substratni cikel, kroženje lipidov, transport glicerol-3-fosfata in razklop preko N-acil aminokislin. Natančno poznavanje mehanizmov termogeneze bi ponudilo številne nove možnosti za zdravljenje debelosti in sladkorne bolezni tipa 2. Znanje o UCP1 neodvisnih mehanizmih termogeneze bi bilo zelo uporabno za zdravljenje predebelih in starejših ljudi, ki nimajo UCP1-pozitivnih adipocitov. Čeprav že več desetletij potekajo raziskave o termogenezi, je znanje na tem področju pomanjkljivo, tako da bodo potrebne še številne raziskave.

==Martin Stanonik - Ekofiziologija obstoječih fototrofov in vplivi na evolucijo oksigene fotosinteze==

Oksigena fotosinteza je pomemben mikrobiološki proces, ki je omogočil dvig atmosferske koncentracije kisika in posledični razvoj večceličnih organizmov. Pred tem procesom so že obstajali mehanizmi, ki so proizvajali energijo. Za to so potrebovali molekule bogate z elektroni, kot H2S. Vendar ti procesi niso proizvajali kisika, kot stranskega produkta. Zato je sprememba kompozicije atmosfere, ali GOE (Great Oxidation Event) povzročila smrt mnogih organizmov kake 2.5 milijarde let nazaj. Tisti, ki pa so preživeli, so pa razvili obrambne mehanizme proti radikalnimi molekulami (ROS), ki so nastale iz kisika, ali pa so se umaknili v globje predele takratnih oceanov, kjer so še zmeraj prevladovali pogoji pred GOE. Kljub temu znanju natančen pojav in razvoj teh procesov še ni poznan. Danes še obstajajo organizmi, ki izvajajo te procese, nekateri lahko celo oba, vendar je to odvisno od okolja. To, vključno z fosili in filogenetskimi raziskavami, bi nam lahko pomagalo razumeti kako se je razvilo življenje na Zemlji. Organizmi z oskigeno fotosintezo so pomemben vir kisika v okoljih. Oksigena fotosinteza vključuje mnoge dele, kot reaktivne centre (RCI in RCII) in fotosisteme PSI in PSII ter OEC, ki je sistem ,ki tvori stranski produkt kisik. Pojav teh mehanizmov tudi še ni natančno poznan zato bodo potrebne še številne raziskave.

==Tinkara Božič - Pomen saharoze in njenega metabolizma za rastline==
Saharoza je pomemben disaharid, ki vpliva na rast rastlin, njihov razvoj, reprodukcijo in obrambne odgovore. Višek trioza fosfata, ki nastane iz ogljika med aktivno fotosintezo, se v citoplazmi pretvori v saharozo. Z delovanjem saharoze je tesno povezana še trehaloza, oligosaharid iz dveh molekul glukoze, ki ima v celicah regulatorno vlogo. Saharoza je pomembna predvsem zaradi cepitve na heksozi glukozo in fruktozo, kar poteka na dva načina – lahko jo cepi saharozna sintaza ali jo hidrolizirajo invertaze. Slednje encime inhibirajo posebni proteini, imenovani invertazni inhibitorji. Saharozna pot se v rastlinah začne v fotosintetskih tkivih, nadaljuje z nalaganjem v floem, zaključi pa se z odlaganjem iz floema v ponore oz. nefotosintetska tkiva. Invertaze so treh vrst in jih klasificiramo glede na njihov pH ter mesto v celici – poznamo invertaze celične stene, vakuolne invertaze in citoplazemske invertaze. Nastopijo v celicah ponora, ko je potrebna cepitev saharoze na njeni sestavni molekuli. Invertaze celične stene pa sodelujejo še pri obrambnih odgovorih celice na napad patogenih organizmov, ko jo ti izkoriščajo za sladkorje. Če pa patogeni v navezo s celicami prinašajo hranila, ki jih gostitelji potrebujejo, to povezavo imenujemo mikoriza. Ta hranila so v glavnem fosfati, sladkor, ki ga od rastlin prejemajo patogeni organizmi, pa je glukoza.

==Mateja Milošević - CAM tip fotosinteze: Crassulacean Acid Metabolism==
CAM tip fotosinteze je evolucijska prilagoditev določenih vrst rastlin na ekstremne okoljske razmere, kot je pomanjkanje vode in zelo visoke temperature – tipičen primer takih rastlin so kaktusi v puščavi, ali kot prilagoditev ko rastlina ne more privoščiti si dovolj CO₂ čez dan. Takšen tip fotosinteze se od običajnega C3 tipa razlikuje po tem, da vsebuje dodaten encim t. j. fosfoenolpiruvat karboksilaza (PEPC). Ta skupaj z encimom RuBisCO pomaga asimilirati zunanji CO₂. Delovanje teh dveh encimov je časovno ločeno, in prav po tem se CAM fotosinteza razlikuje od še enega tipa fotosinteze – tipa C4. Asimilacija zunanjega CO₂ je ločena po fazah. Da se rastlina izogne prekomerni izgubi vode, čez dan svoje posebne listne pore - stome - zapre, uporablja pa v sebi shranjene energijsko bogate molekule. Ko pride do spremembe v okolici, npr. nastopi noč, rastlina svoje stome odpre in tako sprejme zunanji CO₂. Pomemben intermediat je malat2-, ki nastaja z obdelavo zunanjega CO₂ in se shranjuje v vakuoli v obliki malatne kisline. Ko se malat dekarboksilira, iz njega nastaneta piruvat in CO₂. Ta dva v nadaljnih metabolnih procesih doprineseta energijo in pomembne intermediate..

==Nika Banovšek - Regulacija mlečnih lipidov preko hrane in transkripcijskih faktorjev ter vpliv mleka na novorojenčka==
Mleko je edina, in zato glavna prehrana novorojenčka, ki je v začetnih fazah svojega obstoja zelo ranljiv. V materinih mlečnih žlezah nastajajo primerne sestavine, ki so pomembne tako za periferni kot za centralni razvoj mladiča. Mlečni lipidi so glavna komponenta mleka. Nastajajo preko različnih substratov; med glavne štejemo maščobe kisline, glukozo in glicerol. V citosolu mlečnih epitelnih celic se iz slednjih tvorijo predvsem srednje dolge verige mašobnih kislin, ki igrajo pomembno vlogo v telesu novorojenčka, saj mu prinašajo tako hranilne vrednosti in energijo kakor tudi nekatere signalne molekule. Triacilgliceroli nastajajo v endoplazmatskem retikulumu, kjer se nato zapakirajo kot mehurčki in se iz mlečne epitelne celice izločajo v obliki mleka. Na sestavo mleka in regulacijo njegovih sestavin vplivajo številni dejavniki. Med ključne štejemo transkripcijske faktorje, kot sta, npr. SREBP-1 in PPARγ, in samo prehrano. Če imajo matere novorojenčkov genetske okvare ali slabe prehranske navade, se v celici zgodijo napačne regulacije v sintezi mlečnih lipidov ter pride do tvorbe in izločanja »toksičnega« mleka v alveolih mlečnih žlez. Takšno mleko lahko povzroči velike nepravilnosti v telesu novorojenčka, saj ta zaužije sebi škodljive snovi, ki vodijo do raznih notranjih vnetij. Zaužitje takšne vrste mleka se lahko odraža tudi v dolgoročnem razvoju otroka v obliki različnih bolezni.

==Luka Stanković - LIPIDNE KAPLJE: nastanek, struktura in zorenje lipidnih kapelj==
Lipidne kaplje so bile prvič odkrite pred več kot 100 leti. Kljub temu, se jim do nedavnega ni posvečalo večje pozornosti in pripisovalo znatnejše vloge v delovanju organizma. Danes odkrivamo, da ne gre le za celično strukturo, ki shranjuje lipide, temveč gre za nadvse pomemben organel, ki ga najdemo v vseh evkariontskih celicah. Ne le, da so kaplje nadvse pomembne za metabolne procese, temveč imajo tudi pomembno vlogo pri zaščiti pred lipotoksičnostjo, poškodbi mitohondrijev, obnavljanju homeostaze, zadnje čase pa se odkriva tudi njihov pomen v signalnih poteh. Kljub številnim funkcijam, med katerimi je še veliko neraziskanega, se v seminarju posvečamo predvsem nastanku kapelj, njihovi strukturi in njihovem zorenju. Nastanek lipidne kaplje začnemo z nastankom maščobnih kislin iz acetil CoA. Le-te se v ER skupaj z glicerolom s pomočjo kompleksa encimov pretežno pretvorijo v di- in triacilgliceride. Naraščanje njihove koncentracije znotraj membrane ER povzroči nastanek in odcep kaplje iz membrane. V večini primerov gre za reguliran odcep v citosol. Celoten proces in kasnejšo zorenje uravnava cela kopica proteinov, katerih natančni mehanizmi ali pa celo vloge v nekaterih primerih še niso popolnoma jasni. Napake v delovanju slednjih pa lahko povzročajo hujše zdravstvene zaplete kot so debelost, inzulinska odpornost in posledično diabetis.

== Ana Pervanja - Vpliv cirkadianega cikla na biosintezo lipidov==
Cirkadiani ritem oz. cikel je mehanizem, ki na podlagi zunanjih dražljajev vpliva na delovanje organizma. Proces poteka na osnovi zaznave svetlobe v fotosenzitivnih ganglijskih celicah, ki pošljejo signal v hipotalamus, kjer se nahaja glavna »ura«. Ta nato uskladi ostale organe po telesu. Posledica tega je nihanje regulatornih molekul (oscilatorjev) v perifernih celicah, ki preko glavnih regulatornih encimov vplivajo na metabolizem. Na biosintezo lipidov vplivata dve od cirkadianega cikla odvisni molekuli: transkripcijski faktor SREPB, ki sodeluje pri sintezi maščobnih kislin in sterolov, in jedrni receptor PPARγ, ki vpliva na sintezo maščobnih kislin z zelo dolgimi verigami. V primeru motenj cirkadianega cikla, ki so lahko posledica nepravilnega delovanja regulatornih molekul ali neusklajenosti glavne in perifernih »ur«, pride do disregulacije metabolizma. To lahko vodi do razvoja debelosti, sladkorne bolezni tipa II, ateroskleroze, možganske in srčne kapi idr.

== Aljaž Simonič - Inhibitorji sinteze nukleotidov kot protivirusna zdravila širokega spektra ==
Virusi so parazitski biološki delci, ki v svojih gostiteljih povzročajo bolezni. Večina do sedaj uporabljanih protivirusnih zdravil deluje na virusne proteine, vendar ta pristop ne omogoča zdravljenja več virusov z enim zdravilom in je občutljiv na mutacije virusa. Različne na gostitelja delujoče učinkovine bi lahko kljub hujšim stranskim učinkom delovale kot širokospektralna protivirusna zdravila. Med takšnimi spojinami so obetavni tudi inhibitorji biosinteze nukleotidov, sistema kompleksnih metabolnih poti, ki tvorijo nove purinske in pirimidinske nukleotide ali reciklirajo delno razgrajene. Inhibicija teh poti virusom odvzame molekule, ki jih za replikacijo neizogibno potrebujejo v količinah, ki močno presegajo potrebe ter zaloge zdravih celic in v okuženih celicah zato tudi spodbujajo njihove sintezne poti ali alternativno zavirajo njihovo razgradnjo, ter jih tako prizadanejo bolj kot zdrave celice. V klinični rabi kot protivirusno zdravilo je ribavirin, inhibitor sinteze gvanozina, ki deluje tudi kot mutagen. Za različne druge bolezni se uporabljajo tudi inhibitorji de novo sinteze pirimidinov, vendar zaradi učinkovite reciklaže in visoke koncentracije uridina v krvni plazmi sami po sebi niso uspešni proti virusnim okužbam. To bi lahko popravilo dodajanje inhibitorja reciklažne poti.

== Luka Hafner - GABA in njeni receptorji v človeških možganih ==
GABA ali 4-aminobutanojska kislina je neproteinogena aminokislina, ki je prisotna v večini organizmov . Sprva je bilo mišljeno, da je le sekundarni metabolit v rastlinah in mikroorganizmih. Komaj leta 1950 je bila odkrita tudi v centralnem živčnem sistemu sesalcev in 1967 je bila prepoznana kot nevrotransmiter. Pri sesalcih je prisotna skoraj v vseh tkivih in deluje kot signalna molekula z vrsto vlog. Nastaja v kratki metabolni poti "GABA shunt", in sicer preko glutamat dekarboksilaze, v manjši meri pa pri razgradnji putrescina. V centralnem živčnem sistemu deluje kot inhibitorni nevrotransmiter. Veže se na GABAA in GABAB receptorje. GABAA receptorji so kloridni kanalčki, ki imajo poleg GABA vezavnega mesta številna alosterična vezavna mesta. GABAB receptorji so GPCR receptorji, ki posredno odpirajo kalijeve kanalčke in inhibirajo kalcijeve kanalčke in adenilil ciklazo. Z aktivacijo receptorjev se nevron hiperpolarizira in tako se prepreči prenos signala. GABA ima zelo pomembno vlogo pri prenatalnem razvoju živčnega sistema, kjer vpliva na proliferacijo, migracijo in diferenciacijo živčnih celic. Ker ima GABA tako pomembno vlogo pri uravnavanju delovanja centralnega živčnega sistema, lahko nepravilnosti pri GABA signalizaciji privedejo do številnih nevroloških in psiholoških obolenj.

== Nika Bedrač - Vpliv estrogena in njegovih receptorjev na skeletne mišice ==
Estrogeni so steroidni hormoni, glavni predstavniki pa so 17β -estradiol, estron in estriol. Pri ženskah uravnavajo funkcijo reproduktivnega sistema, rast in razvoj spolnih organov, ohranitev sekundarnih spolnih znakov, imajo pa tudi vpliv na kostno gostoto, delovanje skeletnih mišic, delovanje možganov itd. So male lipofilne molekule, ki lahko direktno prehajajo membrano in se na citosolni strani vežejo na estrogenske receptorje. Od tam se lahko translocirajo v jedro in interagirajo z jedrno DNA, ob enem pa lahko tudi regulirajo transkripcijo in replikacijo mitohondrijske DNA. Glavna estrogenska receptorja sta ER-α in ER-β , razlika med njima je v tem, kateri gen ju kodira in v katerih organih sta prisotna.
Koncentracije estrogena pomembno vplivajo na telesno vzdržljivost in na izbiro substrata, ki ga celica med samo aktivnostjo oksidira. Raziskave so pokazale, da so pri glodavcih samice bile bolj telesno vzdržljive in so kot primarni substrat porabljale maščobne kisline – do podobnih ugotovitev so prišli tudi pri ljudeh. Koncentracija estrogena v telesu pri ženskah bistveno fluktuira in je odvisne od obdobja menstrualnega cikla.
S starostjo se koncentracija estrogena (predvsem pri ženskah) zmanjša, kar pa se lahko odraža v upadu mišične mase in kostne gostote. Za zdravljenje se uporabljajo hormonske nadomestne terapije.

== Srna Anastasovska - Grelin in njegove funkcije v organizmu ==
Grelin je hormon ki je bil odkrit kot endogeni ligand ki se veže na GHS receptor in s tem stimulira sekrecijo GH hormona. Sestavljen je iz 28 aminokislin, kjer je Ser 3 oktaniliran, kar je bistveno za biološko aktivnost hormona. Ta reakcija oktaniliranja katalizira ghrelin O-acil transferaza (GOAT) in je med prvimi peptidni hormoni ki ima takšno modifikacijo. V telesu so prisotni več oblik grelina: acilirane, deacilirane itd. Hormon je identificiran pri mnogih sesalcih in ima podobno funkcijo pri vseh. Grelin ima več funkcij v organizmu: stimulira sproščanje rastnega hormona (GH), signalizira možganom kadar potrebuje vnos hrane tako da aktivira celice v hipotalamusu in hipofizi, vključno z NPY nevroni ki stimulirajo apetit, regulira metabolizem glukoze, poboljša učenje in spomin, regulira metabolizem energije. Ko je želodec prazen, v zgornji regiji sintetizira grelin ki potem po kri ali vagusnem sistemu signalizira in aktivira regije v hipotalamusu (arkuatno jedro) ki nato stimulirajo apetit. Številne funkcije grelina in njegova sposobnost širjenja v številna tkiva omogočajo široko uporabo v medicini pri zdravljenju različnih bolezni ali stanj kot so anemija, bulimija, deficit rastnega hormona, odpoved srca, postoperativnega ileusa, in ima tudi pozitiven učinek na kardiovaskularnem sistemu. Odkritje grelina je omogočilo znanstvenikom vpogled v nove mehanizme regulacije in razumevanje hranjenja.

== Manca Pirc - Galanin, spexin in kisspeptin ==
Hormoni in nevrotransmitorji so ene ključnih molekul za vzdrževanje homeostaze v telesu. Med njih uvrščamo tudi tri sorodne biološke aktivne peptide, in sicer galanin, kisspeptin in spexin. Galanin so odkrili leta 1978 v prašičjem prebavnem traktu, kisspeptin so odkrili leta 1996 v rakavih celicah, ki niso bile zmožne metastaze. Obstoj spexina so leta 2007 potrdili s pomočjo bioinformacijskih študij in tako potrdili njegov obstoj še pred samo izolacijo peptida. Galanin in spexin povzročita odziv v celici preko vezave na receptorje tipa 1 – 3 za galanin (GALR1-3), medtem ko se kisspeptin veže na receptor za kisspeptin (KISS1R ali GPR-54). Spexin specifičnega receptorja pa še niso prepoznali. Njihova biološka vloga še ni popolnoma raziskana, vseeno vemo, da so pomembni pri homeostazi glukoze, vzdrževanju telesne teže, izražanju spolnih hormonov. V nadaljevanju seminarja si bomo pogledali, kakšno vlogo imajo pri homeostazi glukoze, izražanju spolnih hormonov in kako vplivajo na razvoj rakavih obolenj. Spexin, galanin in kisspeptin imajo vsi pozitivne učinke na uravnavanje koncentracije glukoze v krvi, kisspeptin je izredno pomemben sporočevalec za izražanje gnRH (gonadotropin sproščujoči hormon), ki spodbudi izločanje ostalih spolnih hormonov; kisspeptin pa je bil sprva prepoznam kot supresor metastaze.

== Nika Malečkar - Reaktivne kisikove spojine, koencim Q in njuna vloga v glavkomu ==
Glavkom je nevrodegenerativna bolezen očesnega živca, kjer je poškodovan vidni živec na mestu izhoda iz očesa. V Evropi prizadene približno 2 na 100 ljudi, starejših od 40 let. Zaradi velikega odstotka ljudi, ki zaradi neuspešnega zdravljenja oslepi, so se strokovnjaki obrnili k iskanju vzrokov in preprečevanju razvoja bolezni. Kot rezultat velike porabe kisika mrežnih celic, so le-te ranljive na vpliv oksidativnega stresa, ki nastane kot posledica previsokih koncentracij reaktivnih kisikovih spojin. To so prosti radikali, ki vplivajo na nepravilno delovanje mitohondrijev, oksidacijo encimov, motnje prenosa signalov in posledično povzročajo apoptozo celic. Njihov škodljivi učinek preprečujejo antioksidanti, med njimi tudi koencim Q10, ki ima vitaminu podobne funkcije. Nahaja se v večjih ali manjših koncentracijah povsod po telesu, je ključen dejavnik prenosa elektronov v ATP sintezi ter pomemben zaradi svoje antioksidantske in obnovitvene sposobnosti. Uporabljamo ga lahko kot prehransko dopolnilo, kremo ali zdravilo pri nevrodegenerativnih boleznih, med drugim tudi v glavkomu. Koencim Q inhibira apoptozo, ohranja morfologijo mitohondrija in pravilno izražanje mitohondrijske DNA ter deluje kot pufer pri porušeni homeostazi kalcija. V tej seminarski nalogi bom bolj natančno predstavila delovanje in vpliv reaktivnih kisikovih spojin ter koencima Q in opisala njuno vlogo v glavkomu.

== Evgen Kozole - Sirtuini in njihova vloga v organizmu ==
Vsak posameznik bi si v današnjem času želel, da bi dočakal dolgo življenjsko dobo in bil pri tem tudi zdrav. V organizmu obstajajo molekule, ki s svojim delovanjem neposredno vplivajo na proces staranja in druge biološke procese, kot na primer transkripcijo genov, apoptozo, metabolizem in popravljanje DNA. Gre za tako imenovane sirtuine. Sirtuini so družina proteinov, ki imajo encimsko aktivnost, ki je v večini primerov odvisna od NAD+ deacetilaze, preko katere vplivajo na transkripcijo genov, nekateri pa imajo tudi ADP-ribozilazno aktivnost. V človeškem organizmu lahko najdemo sedem različnih sirtuinov (SirT1-7), ki se predvsem razlikujejo po tem, kje v celici se nahajajo in kakšne so njihove vloge. Lastnost, ki je skupna večini sirtuinov je uravnavanje metabolizma in transkripcija genov. Njihovo delovanje v organizmu je skrajno pomembno, saj regulirajo procese, ki so življenjskega pomena, kot na primer izločanje inzulina, glikolizo, uravnavanje reaktivnih kisikovih zvrti in še mnoge druge. Nekateri sirtuini vplivajo tudi na potek kroničnih bolezni in so zadolženi za odziv imunskega sistema. V določenih primerih lahko izboljšajo potek kroničnih bolezni in odziv imunskega sistema, lahko pa tudi poslabšajo situacijo v primeru, da pride do mutacije gena in organizem izloča preveliko količino določenega sirtuina.

== Petra Sintič - Triptofan in njegova vloga v telesu ==
Triptofan (simbol Trp) je ena od osmih esencialnih aminokislin, ki jih v človeškem telesu ni mogoče sintetizirati in jih je treba dovajati s hrano, predvsem iz živalskih ali rastlinskih virov. Čeprav ima nižjo koncentracijo v človeškem telesu glede na ostale primarne aminokisline, je triptofan ključna sestavina številnih presnovnih funkcij. Pomemben je za presnovo proteinov in je predhodnik nekaterih zelo pomembnih snovi v telesu, kot so nevrotransmitor serotonin, hormon melatonin in eden najbolj pomembnih B-kompleksov, niacin. Serotonin, ki ga imenujemo tudi hormon sreče nam daje občutek zadovoljstva in dobrega počutja. Melatonin ima pa glavno vlogo pri uravnavanju dnevno-nočnega cikla. Sposobnost spreminjanja hitrosti sinteze serotonina v možganih z manipulacijo koncentracije triptofana je temelj številnih raziskav, zlasti na temo pomanjkanja ali izčrpavanja L-triptofana in posledic le tega. Poleg tega so klinični testi zagotovili nekaj začetnih dokazov o učinkovitosti triptofana za zdravljenje psihiatričnih motenj, preprečevanje agresije, motenj spanca, sezonsko efektivnih motenj, zlasti kadar se uporablja v kombinaciji z drugimi terapevtskimi sredstvi. Vendar so rezultati teh raziskav za enkrat še vedno preveč neodločni in ne konsistentni in so na to temo potrebne še nadaljne raziskave in preskušnje.

== Eva Kanalec - Oksitocin in njegova vloga v telesu ==
Oksitocin je peptidni hormon, sestavljen iz devetih aminokislin. Prvih šest aminokislin ima ciklično strukturo, ki je posledica disulfidne vezi med cisteinoma, zadnje tri aminokisline pa imajo linearno strukturo. Njegova sinteza poteka v hipotalamusu, skladišči se v zadnjem režnju hipofize oziroma v nevrohipofizi, od koder se tudi sprošča v krvni obtok. V telesu se veže na oksitocinske receptorje, ki jih najdemo v maternici, hipofizi, ledvicah in v ventromedialnem nukleusu hipotalamusa. Receptor je sestavljen iz sedmih transmembranskih domen, ki so na notranji strani membrane sklopljeni z G-proteinom, ta poskrbi za prenos signala naprej po celici. Receptor je specifičen za vezavo oksitocina, saj bi se nanj lahko vezali oksitocinu podobni hormoni kot je na primer vazopresin. Oksitocin ima v telesu pomembno vlogo pri porodu, kjer skrbi za krčenje gladkih mišic maternice. Pomembno vlogo pa naj bi imel tudi pri vplivu na apetit in izbor hrane. Vlogo ima tudi pri navezovanju socialnih stikov, kot je stik med materjo in dojenčkom, ter stik med partnerjema. Dokazano je bilo, da imajo socialni stiki vpliv na povečano raven oksitocina v telesu. V zdravstvu se antagoniste oksitocinskih receptorjev uporablja za zaviranje prezgodnjih porodov, oksitocin pa se uporablja za sprožitev poroda. Potencial za razvoj novih terapij, ki bi temeljile na tarčenju oksitocinskega receptorja ali uporabljale oksitocin, je zelo velik.

== Špela Kladnik - Leptin in njegova potencialna vloga biomarkerja za debelost ==
Debelost je bolezen modernega časa. Statistični podatki nakazujejo, da je debelih vedno več ljudi, debelost pa se v veliko primerih začne pojavljati že v zgodnjih letih. Prekomerna telesna teža ni vedno posledica napačnega prehranjevanja in nezdravega načina življenja. Pojavi se lahko tudi zaradi morebitnih genskih napak in, kakor je bilo raziskano, tudi zaradi motenj v delovanju hormona leptina, ki je eden od hormonov za regulacijo hranjenja. Leptin nastaja v maščobnih celicah in z delovanjem na hipotalamus uravnava vnos hrane in apetit. Je polipeptid, sestavljen iz štirih antiparalelnih α-vijačnic, ki se veže na receptor preko signalne poti JAK-STAT. V telesu imamo več oblik leptinskih receptorjev, ki se razlikujejo v dolžini znotrajcelične domene. Najbolj sta raziskani obliki Ob-Rb, ki je glavna za prenos signala, in (s)Ob-Re, ki je topni leptinski receptor. Določanje koncentracije prostega, vezanega in celotnega leptina ter koncentracije topnih leptinskih receptorjev ima pomembno vlogo pri razumevanju pojava debelosti. Pri vitkih osebah se leptin večinoma nahaja vezan na receptor, medtem ko se pri debelih ljudeh večinoma nahaja v prosti obliki. Zmanjšanje koncentracije topnega leptinskega receptorja lahko nakazuje na manjše število delujočih receptorjev, zato se lahko leptin že v zgodnjih letih uporablja kot biomarker za napovedovanje in zdravljenje debelosti.

==David Verdel - Biosinteza in raznolikost presnove terpena v rastlinah ==
Terpeni al z drugo besedo terpenoidi so večkrat teme raziskav na področju kemije in biokemije kot tudi biologije. Uporabljamo jih v različnih panogah in imajo pomembno ekološko vlogo za rastline in ekosistem. Vse rastline sintetizirajo raznovrstne in edinstvene terpenoide. Nekatere najdemo v večini rastlinah in so skupni vsem, vendar se mnogi sintetizirajo le v določenih taksonih in se vključujejo v določene ekološke razmere. Osnovne biosintetske poti terpenoidov s pomočjo terpen sintaze (TPS), so pogoste pri vseh rastlinah. Nekatere sintetizirajo terpene po mevalonski poti (MVA) nekatere pa po nemevalonski poti (MEP) kjer s pomočjo izopentenil difosfata (IPP) in njegovega alilnega izomera dimetilalil difosfata (DMAPP) ter terpen sintaze (TPS) sintetizirajo od monoterpenov do tetraterpenov in nekateri celo tudi hemiterpene. Nedavne raziskave dokazujejo, da se pri sintezi terpenov uporablaja mnogo več substratov, ki jih lahko uporabljajo encimi terpen sintaze (TPS). Nekateri encimi lahko katalizirajo tvorbo terpenov, čeprav niso iz družine encimov terpen sintaze (TPS). Novo odkriti substrati v nekaterih rastlinah s pomočjo terpen sintaze (TPS) lahko sintetizirajo terpene po različnih poteh kot tudi nekatere povezane z mikrobno TPS. V nekaterih rastlinah pa se celo pojavlja novo odkrit medorganski način prenosa terpenov v rastlinah in nove mehanizmi sinteze terpenov.

== Maruša Sernc - Kreatin, neprecenčjiv vir energije in dober prijatelj fitneserjev ==
Pri omembi kreatina se nam najprej pojavi asociacija na prehranski dodatek, ki ga uživajo športniki. Kar pa je v ozadju, kemijska narava, metabolna vloga, razgradnja in podobno, pa večini ostaja neznano. Kaj omogoča kreatinu biti številka 1 na lestvici učinkovitih prehranskih dodatkov pri anaerobnih športih? Zakaj ga veliko zdravnikov predpisuje bolnikom z nevrološkimi težavami? Kreatin (Cr) spada v skupino fosfagenov, njegova glavna metabolna funkcija pa je vzdrževanje koncentracije ATP med anaerobnim mišičnim delom. Deluje torej kot ATP pufer, ki omogoča prenos energije iz mitohondrijev v ostale predele celice brez prisotnosti kisika. To lastnost kreatinu omogoča reverzibilna reakcija encima kreatin kinaze, ki osnovno obliko kreatina spremeni v kreatin fosfatno obliko (PCr). Ob pomanjkanju ATP-ja v celici pa reakcija poteka v obratni smeri, in iz kreatin fosfata nastajata kreatin in anorganski fosfat (Pi). Slednji se združi z ADP in dobimo novo molekulo ATP. To je torej razlog, zakaj se kreatin uvaja v dieto številnih profesionalnih kakor tudi rekreativnih športnikov. Nadaljnje raziskave in študije pa so pokazale pozitiven vpliv kreatina na kognitivne in nevrološke funkcije našega telesa. Dokazano je bilo, da kreatin učinkovito deluje pri lajšanju simptomov številnih nevrodegenerativnih bolezni, kot so Huntingtonova bolezen, Parkinsonova bolezen in cerebralna ishemija. Pomembno je dodati, da za zdaj v povezavi s kreatinskimi dodatki ni bilo odkritih še nobenih resnejših negativnih posledic.

BIO2 Seminar 2020

2021-01-08T20:36:52Z

Marusasernc:

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Ajda Beltram||12||Zgradba in dinamika signalnih kompleksov GPCR||Luka Hafner||Tinkara Božič||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Jan Bregar||12||Protein retinoblastoma||Nika Bedrač||Martin Stanonik||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Anja Moškrič||12|| Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmiterjev||Srna Anastasovska||Luka Stanković||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Gregor Strniša||12||Načini aktivacije GPCR||Manca Pirc||Ana Pervanja||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Vid Dobrovoljc||12||Medsebojni vpliv signalnih poti na primeru RTK in GPCR signalnih poti||Maruša Sernc||Nika Banovšek||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Nikola Janakievski||12||Selective androgen receptor modulators||Ajda Beltram||Aljaž Simonič||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Rebeka Jerina||12||Kofein kot antagonist adenozinskih receptorjev||Jan Bregar||Luka Hafner||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Eva Vene||12||Povezava bolečine z vezavo kapsaicina na TRPV1||Anja Moškrič||Nika Bedrač||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Zala Perko||12||Mehanizmi vezave ligandov in regeneracija fotoreceptorjev očesne mrežnice||Gregor Strniša||Srna Anastasovska||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Erik Putar||14-15||AMPK: senzor glukoze in celičnega energijskega stanja||Nikola Janakievski||Manca Pirc||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Iva Matić||14-15||||Rebeka Jerina||Maruša Sernc||06/11/20||09/11/20||13/01/21
|-
| Timotej Sotošek||14-15||Regulacija mišičnega glikogena: granula in njeni proteini||Eva Vene||Ajda Beltram||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Nika Tomsič||16||Acetil-CoA: glavni metabolit in sekundarni obveščevalec||Zala Perko||Jan Bregar||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Andrej Špenko||16||||Erik Putar||Anja Moškrič||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Aleksandra Rauter||16||Vloga intermediatov Krebsovega cikla v makrofagih||Iva Matić||Gregor Strniša||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Laura Unuk||17||Motnje oksidacije dolgoverižnih maščobnih kislin in karnitinskega transporta||Timotej Sotošek||Nikola Janakievski||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Stefanija Ivanova||17||Vpliv telovadbe na metabolizem ketonskih telesc||Nika Tomsič||Rebeka Jerina||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Jakob Tomšič||17||Funkcije ketonskih telesc v centralnem živčevju||Andrej Špenko||Eva Vene||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Neža Leskovar||18||Urea transporterji in regulacija skoncentriranosti urina||Aleksandra Rauter||Zala Perko||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Luka Šegota||18||Hiperamoniemija||Laura Unuk||Erik Putar||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Nika Perko||18||Encim karbamoil fosfat sintetaza 1||Stefanija Ivanova||Iva Matić||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Ela Bizjak||19||Mutacije mitohondrijske DNA, heterogenost in mitohondrijske bolezni||Jakob Tomšič||Timotej Sotošek||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Bor Krajnik||19||Reaktivne kisikove zvrsti in njihova vloga pri regulaciji celične proliferacije||Neža Leskovar||Nika Tomsič||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Maja Kobal||19||Od UCP1 odvisna in neodvisna termogeneza||Luka Šegota||Vid Dobrovoljc||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Mateja Milošević||20||CAM tip fotosinteze: Crassualacean Acid Metabolism||Nika Perko||Andrej Špenko||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Tinkara Božič||20||Pomen saharoze in njenega metabolizma za rastline||Ela Bizjak||Aleksandra Rauter||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Martin Stanonik||20||Ekofiziologija obstoječih fototrofov in vplivi na evolucijo oksigene fotosinteze||Bor Krajnik||Laura Unuk||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Luka Stanković||21||Nastanek, struktura in zorenje lipidnih kapelj v organizmu||Maja Kobal||Stefanija Ivanova||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Ana Pervanja||21||Vpliv cirkadianega ritma na biosintezo lipidov||Mateja Milošević||Jakob Tomšič||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Nika Banovšek||21||Regulacija mlečnih lipidov preko hrane in transkripcijskih faktorjev ter vpliv mleka na novorojenčka||Tinkara Božič||Neža Leskovar||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Aljaž Simonič||22||Inhibitorji sinteze nukleotidov kot protivirusna zdravila širokega spektra||Martin Stanonik||Luka Šegota||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Luka Hafner||22||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2020#Luka_Hafner_-_GABA_in_njeni_receptorji_v_.C4.8Dlove.C5.A1kih_mo.C5.BEganih GABA in njeni receptorji v človeških možganih]|||Luka Stanković||Ana Žagar||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Ana Žagar||22||||Vid Dobrovoljc||Nika Perko||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Nika Bedrač||23|||Vpliv estrogena in estrogenskih receptorjev na skeletne mišice ||Ana Pervanja||Ela Bizjak||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Srna Anastasovska||23||Grelin in njegove funkcije v organizmu||Nika Banovšek||Bor Krajnik||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Manca Pirc||23||Galanin, spexin in kisspeptin||Aljaž Simonič||Maja Kobal||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Maruša Sernc||23||Kreatin, neprecenljiv vir energije in dober prijatelj fitneserjev||Ana Žagar||Mateja Milošević||08/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Lea Nicouleau||any chapter||||||||06/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Marjorie Leaud||any chapter||||||||06/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Evgen Kozole||||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2020#Evgen_Kozole_-_Sirtuini_in_njihova_vloga_v_organizmu Sirtuini in njihova vloga v organizmu]||||||||||
|-
| Eva Kanalec||||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2020#Eva_Kanalec_-_Oksitocin_in_njegova_vloga_v_telesu Oksitocin in njegova vloga v telesu]||||||||||
|-
| Špela Kladnik||||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2020#.C5.A0pela_Kladnik_-_Leptin_in_njegova_potencialna_vloga_biomarkerja_za_debelost Leptin in njegova potencialna vloga biomarkerja]||||||||||
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Razporeditev je začasna in se lahko še spremeni, načeloma pa se termini do vključno 18. poglavja ne bodo spreminjali.
Prosim,da mi sporočite morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2020|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike, bolje več. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20-25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v okviru celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Seminar 2020

2021-01-08T19:58:08Z

Marusasernc:

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Ajda Beltram||12||Zgradba in dinamika signalnih kompleksov GPCR||Luka Hafner||Tinkara Božič||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Jan Bregar||12||Protein retinoblastoma||Nika Bedrač||Martin Stanonik||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Anja Moškrič||12|| Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmiterjev||Srna Anastasovska||Luka Stanković||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Gregor Strniša||12||Načini aktivacije GPCR||Manca Pirc||Ana Pervanja||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Vid Dobrovoljc||12||Medsebojni vpliv signalnih poti na primeru RTK in GPCR signalnih poti||Maruša Sernc||Nika Banovšek||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Nikola Janakievski||12||Selective androgen receptor modulators||Ajda Beltram||Aljaž Simonič||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Rebeka Jerina||12||Kofein kot antagonist adenozinskih receptorjev||Jan Bregar||Luka Hafner||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Eva Vene||12||Povezava bolečine z vezavo kapsaicina na TRPV1||Anja Moškrič||Nika Bedrač||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Zala Perko||12||Mehanizmi vezave ligandov in regeneracija fotoreceptorjev očesne mrežnice||Gregor Strniša||Srna Anastasovska||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Erik Putar||14-15||AMPK: senzor glukoze in celičnega energijskega stanja||Nikola Janakievski||Manca Pirc||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Iva Matić||14-15||||Rebeka Jerina||Maruša Sernc||06/11/20||09/11/20||13/01/21
|-
| Timotej Sotošek||14-15||Regulacija mišičnega glikogena: granula in njeni proteini||Eva Vene||Ajda Beltram||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Nika Tomsič||16||Acetil-CoA: glavni metabolit in sekundarni obveščevalec||Zala Perko||Jan Bregar||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Andrej Špenko||16||||Erik Putar||Anja Moškrič||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Aleksandra Rauter||16||Vloga intermediatov Krebsovega cikla v makrofagih||Iva Matić||Gregor Strniša||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Laura Unuk||17||Motnje oksidacije dolgoverižnih maščobnih kislin in karnitinskega transporta||Timotej Sotošek||Nikola Janakievski||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Stefanija Ivanova||17||Vpliv telovadbe na metabolizem ketonskih telesc||Nika Tomsič||Rebeka Jerina||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Jakob Tomšič||17||Funkcije ketonskih telesc v centralnem živčevju||Andrej Špenko||Eva Vene||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Neža Leskovar||18||Urea transporterji in regulacija skoncentriranosti urina||Aleksandra Rauter||Zala Perko||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Luka Šegota||18||Hiperamoniemija||Laura Unuk||Erik Putar||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Nika Perko||18||Encim karbamoil fosfat sintetaza 1||Stefanija Ivanova||Iva Matić||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Ela Bizjak||19||Mutacije mitohondrijske DNA, heterogenost in mitohondrijske bolezni||Jakob Tomšič||Timotej Sotošek||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Bor Krajnik||19||Reaktivne kisikove zvrsti in njihova vloga pri regulaciji celične proliferacije||Neža Leskovar||Nika Tomsič||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Maja Kobal||19||Od UCP1 odvisna in neodvisna termogeneza||Luka Šegota||Vid Dobrovoljc||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Mateja Milošević||20||CAM tip fotosinteze: Crassualacean Acid Metabolism||Nika Perko||Andrej Špenko||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Tinkara Božič||20||Pomen saharoze in njenega metabolizma za rastline||Ela Bizjak||Aleksandra Rauter||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Martin Stanonik||20||Ekofiziologija obstoječih fototrofov in vplivi na evolucijo oksigene fotosinteze||Bor Krajnik||Laura Unuk||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Luka Stanković||21||Nastanek, struktura in zorenje lipidnih kapelj v organizmu||Maja Kobal||Stefanija Ivanova||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Ana Pervanja||21||Vpliv cirkadianega ritma na biosintezo lipidov||Mateja Milošević||Jakob Tomšič||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Nika Banovšek||21||Regulacija mlečnih lipidov preko hrane in transkripcijskih faktorjev ter vpliv mleka na novorojenčka||Tinkara Božič||Neža Leskovar||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Aljaž Simonič||22||Inhibitorji sinteze nukleotidov kot protivirusna zdravila širokega spektra||Martin Stanonik||Luka Šegota||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Luka Hafner||22||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2020#Luka_Hafner_-_GABA_in_njeni_receptorji_v_.C4.8Dlove.C5.A1kih_mo.C5.BEganih GABA in njeni receptorji v človeških možganih]|||Luka Stanković||Ana Žagar||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Ana Žagar||22||||Vid Dobrovoljc||Nika Perko||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Nika Bedrač||23|||Vpliv estrogena in estrogenskih receptorjev na skeletne mišice ||Ana Pervanja||Ela Bizjak||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Srna Anastasovska||23||Grelin in njegove funkcije v organizmu||Nika Banovšek||Bor Krajnik||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Manca Pirc||23||Galanin, spexin in kisspeptin||Aljaž Simonič||Maja Kobal||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Maruša Sernc||23||Kreatin, neprecenljiv založnik energije in dober prijatelj fitneserjev||Ana Žagar||Mateja Milošević||08/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Lea Nicouleau||any chapter||||||||06/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Marjorie Leaud||any chapter||||||||06/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Evgen Kozole||||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2020#Evgen_Kozole_-_Sirtuini_in_njihova_vloga_v_organizmu Sirtuini in njihova vloga v organizmu]||||||||||
|-
| Eva Kanalec||||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2020#Eva_Kanalec_-_Oksitocin_in_njegova_vloga_v_telesu Oksitocin in njegova vloga v telesu]||||||||||
|-
| Špela Kladnik||||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2020#.C5.A0pela_Kladnik_-_Leptin_in_njegova_potencialna_vloga_biomarkerja_za_debelost Leptin in njegova potencialna vloga biomarkerja]||||||||||
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Razporeditev je začasna in se lahko še spremeni, načeloma pa se termini do vključno 18. poglavja ne bodo spreminjali.
Prosim,da mi sporočite morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2020|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike, bolje več. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20-25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v okviru celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Seminar 2020

2020-12-09T19:43:25Z

Marusasernc:

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Ajda Beltram||12||Zgradba in dinamika signalnih kompleksov GPCR||Luka Hafner||Tinkara Božič||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Jan Bregar||12||Protein retinoblastoma||Nika Bedrač||Martin Stanonik||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Anja Moškrič||12|| Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmiterjev||Srna Anastasovska||Luka Stanković||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Gregor Strniša||12||Načini aktivacije GPCR||Manca Pirc||Ana Pervanja||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Vid Dobrovoljc||12||Medsebojni vpliv signalnih poti na primeru RTK in GPCR signalnih poti||Maruša Sernc||Nika Banovšek||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Nikola Janakievski||12||Selective androgen receptor modulators||Ajda Beltram||Aljaž Simonič||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Rebeka Jerina||12||Kofein kot antagonist adenozinskih receptorjev||Jan Bregar||Luka Hafner||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Eva Vene||12||Povezava bolečine z vezavo kapsaicina na TRPV1||Anja Moškrič||Nika Bedrač||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Zala Perko||12||Mehanizmi vezave ligandov in regeneracija fotoreceptorjev očesne mrežnice||Gregor Strniša||Srna Anastasovska||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Erik Putar||14-15||AMPK: senzor glukoze in celičnega energijskega stanja||Nikola Janakievski||Manca Pirc||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Iva Matić||14-15||||Rebeka Jerina||Maruša Sernc||06/11/20||09/11/20||13/01/21
|-
| Timotej Sotošek||14-15||Regulacija mišičnega glikogena: granula in njeni proteini||Eva Vene||Ajda Beltram||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Nika Tomsič||16||Acetil-CoA: glavni metabolit in sekundarni obveščevalec||Zala Perko||Jan Bregar||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Andrej Špenko||16||||Erik Putar||Anja Moškrič||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Aleksandra Rauter||16||Vloga intermediatov Krebsovega cikla v makrofagih||Iva Matić||Gregor Strniša||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Laura Unuk||17||Motnje oksidacije dolgoverižnih maščobnih kislin in karnitinskega transporta||Timotej Sotošek||Nikola Janakievski||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Stefanija Ivanova||17||Vpliv telovadbe na metabolizem ketonskih telesc||Nika Tomsič||Rebeka Jerina||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Jakob Tomšič||17||Funkcije ketonskih telesc v centralnem živčevju||Andrej Špenko||Eva Vene||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Neža Leskovar||18||Urea transporterji in regulacija skoncentriranosti urina||Aleksandra Rauter||Zala Perko||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Luka Šegota||18||||Laura Unuk||Erik Putar||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Nika Perko||18||Encim karbamoil fosfat sintetaza 1||Stefanija Ivanova||Iva Matić||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Ela Bizjak||19||Mutacije mitohondrijske DNA, heterogenost in mitohondrijske bolezni||Jakob Tomšič||Timotej Sotošek||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Bor Krajnik||19||Reaktivne kisikove zvrsti in njihova vloga pri regulaciji celične proliferacije||Neža Leskovar||Nika Tomsič||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Maja Kobal||19||Od UCP1 odvisna in neodvisna termogeneza||Luka Šegota||Vid Dobrovoljc||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Mateja Milošević||20||CAM tip fotosinteze: Crassualacean Acid Metabolism||Nika Perko||Andrej Špenko||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Tinkara Božič||20||Pomen saharoze in njenega metabolizma za rastline||Ela Bizjak||Aleksandra Rauter||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Martin Stanonik||20||Ekofiziologija obstoječih fototrofov in vplivi na evolucijo oksigene fotosinteze||Bor Krajnik||Laura Unuk||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Luka Stanković||21||Nastanek, struktura in zorenje lipidnih kapelj v organizmu||Maja Kobal||Stefanija Ivanova||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Ana Pervanja||21||Vpliv cirkadianega ritma na metabolizem lipidov||Mateja Milošević||Jakob Tomšič||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Nika Banovšek||21||Regulacija mlečnih lipidov preko hrane in transkripcijskih faktorjev ter vpliv mleka na novorojenčka||Tinkara Božič||Neža Leskovar||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Aljaž Simonič||22||Inhibitorji sinteze pirimidinov kot protivirusna zdravila širokega spektra||Martin Stanonik||Luka Šegota||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Luka Hafner||22||||Luka Stanković||Ana Žagar||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Ana Žagar||22||||Vid Dobrovoljc||Nika Perko||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Nika Bedrač||23||||Ana Pervanja||Ela Bizjak||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Srna Anastasovska||23||||Nika Banovšek||Bor Krajnik||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Manca Pirc||23||||Aljaž Simonič||Maja Kobal||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Maruša Sernc||23||Učinki uporabe kreatina v športu in medicini||Ana Žagar||Mateja Milošević||08/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Lea Nicouleau||any chapter||||||||06/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Marjorie Leaud||any chapter||||||||06/01/21||11/01/21||13/01/21
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Razporeditev je začasna in se lahko še spremeni, načeloma pa se termini do vključno 18. poglavja ne bodo spreminjali.
Prosim,da mi sporočite morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2020|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike, bolje več. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20-25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v okviru celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.