Wiki FKKT - User contributions [en]

Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v Yarrowia lipolytica

2023-05-08T19:21:58Z

Masa andoljsek: /* Hibridni pEYK450 */

Povzeto po članku: [https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-023-02020-6 ''L. Vidal, et al. : Bidirectional hybrid erythritol-inducible promoter for synthetic biology in Yarrowia lipolytica. Microb. Cell Fact. '''2023''', 22(1), str. 1–17.'']

=Uvod=
''Yarrowia lipolytica'' je askomicetna gliva, ki se zelo pogosto uporablja v biotehnologiji [1]. Ima sposobnost presnavljanja nestandarnih substratov, kot so polialkoholi, organske kisline, dolgoverižni ogljikovodiki, organski odpadki, glicerol, etanol ipd. [1, 2]. Proizvaja veliko lipolitičnih encimov, ki so uporabni v različnih industrijah [1]. V industriji se uporablja tudi za proizvodnjo polinenasičenih maščobnih kislin, biogoriv, sekundarnih metabolitov, ipd. [2]. Zaradi teh lastnosti se z različnimi metodami editira genom ''Y. lipolytica''. Primeri so: Golden Gate sestavljanje (GGA), tehnologija CRISPR-Cas9 in kapljična mikrofluidika. Obstaja tudi knjižnica promotorjev, ki se uporabljajo v omenjeni glivi. Raziskovalci iz članka so si želeli izboljšati gensko ekspresijo za industrijsko uporabo, zato so poskušali sintetizirati nov, boljši promotor [3].
==Katabolizem eritritola==
Eritritol je poliol, ki se v prehrani pogosto uporablja kot nizko kalorični nadomestek sladkorja. V naravi je široko prisoten in se nahaja v mnogih živilih [4].
Katabolizem eritritola v ''Y. lipolytica'' se začne z eritritolno dehidrogenazo, ki jo kodira gen ''EYD1''. Ta encim pretvarja eritritol v eritrulozo. Nato eritrulozo fosforilira eritruloza kinaza, ki jo kodira gen ''EYK1''. Produkt je L-eritruloza-1P, ki jo L-eritruloza-1P izomeraza (ki je kodirana z genom ''EYL2''), pretvori v eritroza-4P. V zadnjem koraku sodeluje encim D-eritruloza-4P, ki jo kodira gen ''EXL1'', in pretvori produkt v eritroza-4P. Predvidevajo, da gen ''EUF1'' kodira za transkripcijski faktor, ki sodeluje pri presnovi eritritola. Vsi našteti geni so zapisani na kromosomu F v regiji, ki se imenuje skupek za presnovo eritritola. Izražanje teh genov inducirata eritritol in eritruloza.
Pred kratkim so okarakterizirali zgornje aktivacijsko zaporedje (UAS), ki je povezano z genoma ''EYK1'' in ''EYD1''. To so odkrili tako, da so s filogenetskimi analizami in mutagenezo identificirali ohranjene regulatorne motive. Nato so uporabili rumeni fluorescenčni protein (YFP) in rdeči fluorescenčni protein (RedStarII), ki sta pokazala vzorce izražanja za nativne in z eritritolom inducirane promotorje. Določili so strukturo promotorja EXK1 in tudi njegovo inducibilnost z eritritolom in eritrulozo, ki poteka preko UAS-eyk1 (imenovano tudi škatla A). Nadaljnje analize katabolizma eritritola so pokazale, da je pEYK promotor za ''EYK1'' in tudi za ''EYL1''. To pomeni, da je pEYK dvosmerni promotor (BDP). To je DNA zaporedje, ki omogoča prepis DNA v obe smeri. Temu procesu se reče divergentna transkripcija. Te BDPje regulira baker, zato ga ne morejo uporabiti v industrijski rabi [3].

=Rezultati=
V študiji so naredili nov z eritritolom induciran hibridni BDP za uporabo v ''Y. lipolytica''. Ustvarili so naravne in hibridne BDP biokocke z uporabo pEYK. Naredili so jih kompatibilne s kloniranjem na način Golden Gate. Izražanje je bilo zaznano v obeh transkripcijskih smereh (Uporabili so fluorescenčna reporterska proteina (YFP and RedStarII)). Najmočnejše izražanje promotorja je bilo pri hibridnem pEYK v smeri EYL1. [3].

==Skupek za presnovo eritritola vsebuje dvosmerni promotor==
V skupku za presnovo eritritola so identificirali 3 pare divergentnih genov: YALI0F01540g in ''EUF1, EYK1'' in ''EYL1'', ter ''EYD1'' in YALI0F01672g. Nato so primerjali skupke treh različnih sevov ''Y. lipolytica''. S prileganjem zaporedij so ugotovili, da sta bila gena YALI0F01540g in YALI0F01672g narobe napovedana in anotirana (nimata enakega start kodona pri različnih sevih, dolžina pa je bila med 3 000 in 4 000 baznih parov). Analiza je pokazala, da je regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' dolga 438 baznih parov. V evkariontih je UAS lociran med – 1000 in + 50 mesta od začetnega mesta za transkripcijo.
Intergenska regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' je bila preučevana že v preteklosti, a so se osredotočili le na enosmerni promotor pEYK. Že takrat so pokazali, da je pEYK z eritritolom induciran promotor. Škatla TATA je bila identificirana blizu ''EYK1'' start kodona. V raziskavi iz članka so primerjali intergensko zaporedje regije med 5 različnimi sevi rodu ''Yarrowia''. Našli so še drugo škatlo TATA blizu ''EYK1'' start kodona [3].

==Regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' je eritritol-inducibilen BDP==
Ustvarili so reporterski sistem, ki je temeljil na dveh reporterskih genih, ki sta kodirala za rumeni in rdeči fluorescenčni protein. Reporterski sistemi so testirali različne BDPje ali hibridne BDPje (HBDP) v obeh smereh transkripcije. Reporterski sistem so ustvarili s pomočjo GoldenGate sestavljanja (GGA). Uporabili so 6 biokock in vektor [3].
Prvo so ustvarili donorske vektorje, ki so vsebovali ''YFP-TLIP2'', ''RedStarII-TLIP2'', in intergensko regijo ''EYK1-EYL1'' (pEYK450) v smerni in protismerni transkripcijski orientaciji. To so naredili s pomnoževanjem PCR. Intergenska regija pEYK450 ima smerno orientacijo proti ''EYK1'' in protismerno orientacijo proti'' EYL1''. Vsaka pEYK450 z reporterskimi geni je bila vključena v vektor GGE114. Nastali so plazmidi ''GGAURA3ex-RedStarII-pEYK450-Fw-YFP'' (JME4766) in ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-Rv-YFP'' (JME4768) ter tudi hibridni plazmidi iz pEYK, pri čemer so nastali hibridni plazmidi ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-5AB-Fw-YFP'' (JME4891) in ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-5ABRv-YFP'' (JME4892).
Plazmide, so vstavili v ''Y. lipolytica''. Za vsak konstrukt so izolirali 48 transformantov. Fluorescenco YFP in RedStarII so merili med celično rastjo na minimalnem gojišču, ki je vsebovalo eritritol. Odstranili so nefluorescenčne transformante in transformante s previsoko fluorescenco (več integracij v genom). Za vsak konstrukt so izbrali 8 transformant in jih shranili v glivni Golden Gate zbirki. Fluorescenco so merili na bralcu mikrotitrskih plošč. Preverjali so moč in nivoje indukcije pEYK450 v obeh smereh.
Glive, ki so vsebovale fluorescenčno reportersko kaseto, so proizvajale rdečo in rumeno fluorescenco pri smerni in protismerni orientaciji glede na promotor. Transkripcija v smeri ''EYL1'' je bila 3,5 in 2,7-krat večja kot v smeri proti ''EYK1''. Pri kontrolnem sevu so zaznali zanemarljive nivoje fluorescence [3].

==Indukcija pEYK450 je odvisna od koncentracije eritritola in eritruloze==
Glive so rastle v minimalnem gojišču z eritritolom ali eritrulozo v koncentraciji 0 g/L, 2,5 g/L in 5 g/L. Kot vir ogljika so uporabili glukozo v koncentraciji 5 g/L, da ne bi kot vira ogljika glive uporabljale eritritol ali eritrulozo. ''Y. lipolytica'' so naredili delecijo ''EYK1'', da ne bi že sam sev presnavljal eritritol in eritrulozo. Ko v gojišču ni bilo dodanega eritritola, pri ''Y. lipolytica'' niso zaznali niti rumene niti rdeče fluorescence. Ob dodatku eritritola so zaznali obe fluorescenci. Pri višji koncentraciji eritritola so zaznali močnejšo fluorescenco. Enake rezultate so dobili pri dodatku eritruloze. S tem so pokazali, da je indukcija odvisna od koncentracije eritritola ali eritruloze v gojišču [3].
==Hibridni pEYK450==
Prejšnje raziskave so pokazale, da se moč promotorja poveča, če hibridni promotor vsebuje več kopij zgornjega aktivacijskega zaporedja (Škatla A). V tej raziskavi so naredili hibridni promotor s petimi škatlami A. Promotor so poimenovali pEYK450-5AB, saj vsebuje 5 škatel A in 1 škatlo B. Promotor so vstavili v obeh smereh glede na fluorescenčne reporterske gene (''pEYK450-5AB-Fw'' in ''pEYK450-5AB-Rv''). Eksperiment so izvedli enako kot pri nehibridnem pEYK450. Promotor je bil tako močen, da je fluorescenca YFP presegla mejo detekcije. Merjenje fluorescence je pokazalo, da pEYK450-5AB proizvaja fluorescenco v obojesmerni transkripcijski orientaciji. Ekspresija v smeri ''EYL1'' je bila 2-krat večja kot v smeri ''EYK1'', kar je enako razmerje kot pri nehibridnem promotorju. V primerjavi z nehibridnim promtorjem je imel hibridni promotor 19,2 – krat večjo moč v smeri ''EYK1'' in 10,8 – krat večjo moč v smeri ''EYL1''. To je potrdilo, da tendemne ponovitve UAS1-eyk1 močno povečajo moč promotorja v obe smeri transkripcije [3].
Naredili so tudi poskus, kjer so primerjali moč izražanja enosmernega promotorja pEYK300 s hibridnim promotorjem pEYK300-5AB. Ugotovili so, da se tudi v tem primeru moč izražanja poveča pri hibridnem, in sicer za približno 12 – krat [3].

==Moč promotorja pEYK450‑5AB je v mikrobioreaktorjih odvisna od sestave gojišča==
Raziskovali so, če bi lahko uporabili pEYK450-5AB v mikrobioreaktorjih pri pogojih visoke gostote kulture, kar je pogosto v industriji. Najvišjo gostoto celic so dosegli z uporabo gojišča, ki je vsebovalo glukozo v koncentraciji 50 g/L. Fluorescenca se je poviševala s poviševanjem koncentracije glukoze v gojišču, dokler ni dosegla plato (50 g/l). Podobne rezultate so dobili pri gojišču z glicerolom, kjer so plato dosegli pri 80 g/ L. Raziskave so pokazale, da je največja moč dvosmernega promotorja pri pogojih visoke gostote kulture [3].

=Literatura=

1. E. A. Johnson, C. Echavarri-Erasun: Yeast Biotechnology. The Yeasts '''2011''', 1, str. 21–44.

2. N. Gohil, G. Bhattacharjee, V. Singh: An introduction to microbial cell factories for production of biomolecules. Microb. Cell Factories Eng. Prod. Biomol. '''2021''', str. 1–19.

3. L. Vidal, et al. : Bidirectional hybrid erythritol-inducible promoter for synthetic biology in Yarrowia lipolytica. Microb. Cell Fact. '''2023''', 22(1), str. 1–17.

4. W. O. Bernt, J. F. Borzelleca, G. Flamm, I. C. Munro: Erythritol: A review of biological and toxicological studies. Regul. Toxicol. Pharmacol. '''1996''', 24(2 II), str. 191–197.

Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v Yarrowia lipolytica

2023-05-08T06:25:00Z

Masa andoljsek: /* Rezultati */

Povzeto po članku: [https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-023-02020-6 ''L. Vidal, et al. : Bidirectional hybrid erythritol-inducible promoter for synthetic biology in Yarrowia lipolytica. Microb. Cell Fact. '''2023''', 22(1), str. 1–17.'']

=Uvod=
''Yarrowia lipolytica'' je askomicetna gliva, ki se zelo pogosto uporablja v biotehnologiji [1]. Ima sposobnost presnavljanja nestandarnih substratov, kot so polialkoholi, organske kisline, dolgoverižni ogljikovodiki, organski odpadki, glicerol, etanol ipd. [1, 2]. Proizvaja veliko lipolitičnih encimov, ki so uporabni v različnih industrijah [1]. V industriji se uporablja tudi za proizvodnjo polinenasičenih maščobnih kislin, biogoriv, sekundarnih metabolitov, ipd. [2]. Zaradi teh lastnosti se z različnimi metodami editira genom ''Y. lipolytica''. Primeri so: Golden Gate sestavljanje (GGA), tehnologija CRISPR-Cas9 in kapljična mikrofluidika. Obstaja tudi knjižnica promotorjev, ki se uporabljajo v omenjeni glivi. Raziskovalci iz članka so si želeli izboljšati gensko ekspresijo za industrijsko uporabo, zato so poskušali sintetizirati nov, boljši promotor [3].
==Katabolizem eritritola==
Eritritol je poliol, ki se v prehrani pogosto uporablja kot nizko kalorični nadomestek sladkorja. V naravi je široko prisoten in se nahaja v mnogih živilih [4].
Katabolizem eritritola v ''Y. lipolytica'' se začne z eritritolno dehidrogenazo, ki jo kodira gen ''EYD1''. Ta encim pretvarja eritritol v eritrulozo. Nato eritrulozo fosforilira eritruloza kinaza, ki jo kodira gen ''EYK1''. Produkt je L-eritruloza-1P, ki jo L-eritruloza-1P izomeraza (ki je kodirana z genom ''EYL2''), pretvori v eritroza-4P. V zadnjem koraku sodeluje encim D-eritruloza-4P, ki jo kodira gen ''EXL1'', in pretvori produkt v eritroza-4P. Predvidevajo, da gen ''EUF1'' kodira za transkripcijski faktor, ki sodeluje pri presnovi eritritola. Vsi našteti geni so zapisani na kromosomu F v regiji, ki se imenuje skupek za presnovo eritritola. Izražanje teh genov inducirata eritritol in eritruloza.
Pred kratkim so okarakterizirali zgornje aktivacijsko zaporedje (UAS), ki je povezano z genoma ''EYK1'' in ''EYD1''. To so odkrili tako, da so s filogenetskimi analizami in mutagenezo identificirali ohranjene regulatorne motive. Nato so uporabili rumeni fluorescenčni protein (YFP) in rdeči fluorescenčni protein (RedStarII), ki sta pokazala vzorce izražanja za nativne in z eritritolom inducirane promotorje. Določili so strukturo promotorja EXK1 in tudi njegovo inducibilnost z eritritolom in eritrulozo, ki poteka preko UAS-eyk1 (imenovano tudi škatla A). Nadaljnje analize katabolizma eritritola so pokazale, da je pEYK promotor za ''EYK1'' in tudi za ''EYL1''. To pomeni, da je pEYK dvosmerni promotor (BDP). To je DNA zaporedje, ki omogoča prepis DNA v obe smeri. Temu procesu se reče divergentna transkripcija. Te BDPje regulira baker, zato ga ne morejo uporabiti v industrijski rabi [3].

=Rezultati=
V študiji so naredili nov z eritritolom induciran hibridni BDP za uporabo v ''Y. lipolytica''. Ustvarili so naravne in hibridne BDP biokocke z uporabo pEYK. Naredili so jih kompatibilne s kloniranjem na način Golden Gate. Izražanje je bilo zaznano v obeh transkripcijskih smereh (Uporabili so fluorescenčna reporterska proteina (YFP and RedStarII)). Najmočnejše izražanje promotorja je bilo pri hibridnem pEYK v smeri EYL1. [3].

==Skupek za presnovo eritritola vsebuje dvosmerni promotor==
V skupku za presnovo eritritola so identificirali 3 pare divergentnih genov: YALI0F01540g in ''EUF1, EYK1'' in ''EYL1'', ter ''EYD1'' in YALI0F01672g. Nato so primerjali skupke treh različnih sevov ''Y. lipolytica''. S prileganjem zaporedij so ugotovili, da sta bila gena YALI0F01540g in YALI0F01672g narobe napovedana in anotirana (nimata enakega start kodona pri različnih sevih, dolžina pa je bila med 3 000 in 4 000 baznih parov). Analiza je pokazala, da je regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' dolga 438 baznih parov. V evkariontih je UAS lociran med – 1000 in + 50 mesta od začetnega mesta za transkripcijo.
Intergenska regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' je bila preučevana že v preteklosti, a so se osredotočili le na enosmerni promotor pEYK. Že takrat so pokazali, da je pEYK z eritritolom induciran promotor. Škatla TATA je bila identificirana blizu ''EYK1'' start kodona. V raziskavi iz članka so primerjali intergensko zaporedje regije med 5 različnimi sevi rodu ''Yarrowia''. Našli so še drugo škatlo TATA blizu ''EYK1'' start kodona [3].

==Regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' je eritritol-inducibilen BDP==
Ustvarili so reporterski sistem, ki je temeljil na dveh reporterskih genih, ki sta kodirala za rumeni in rdeči fluorescenčni protein. Reporterski sistemi so testirali različne BDPje ali hibridne BDPje (HBDP) v obeh smereh transkripcije. Reporterski sistem so ustvarili s pomočjo GoldenGate sestavljanja (GGA). Uporabili so 6 biokock in vektor [3].
Prvo so ustvarili donorske vektorje, ki so vsebovali ''YFP-TLIP2'', ''RedStarII-TLIP2'', in intergensko regijo ''EYK1-EYL1'' (pEYK450) v smerni in protismerni transkripcijski orientaciji. To so naredili s pomnoževanjem PCR. Intergenska regija pEYK450 ima smerno orientacijo proti ''EYK1'' in protismerno orientacijo proti'' EYL1''. Vsaka pEYK450 z reporterskimi geni je bila vključena v vektor GGE114. Nastali so plazmidi ''GGAURA3ex-RedStarII-pEYK450-Fw-YFP'' (JME4766) in ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-Rv-YFP'' (JME4768) ter tudi hibridni plazmidi iz pEYK, pri čemer so nastali hibridni plazmidi ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-5AB-Fw-YFP'' (JME4891) in ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-5ABRv-YFP'' (JME4892).
Plazmide, so vstavili v ''Y. lipolytica''. Za vsak konstrukt so izolirali 48 transformantov. Fluorescenco YFP in RedStarII so merili med celično rastjo na minimalnem gojišču, ki je vsebovalo eritritol. Odstranili so nefluorescenčne transformante in transformante s previsoko fluorescenco (več integracij v genom). Za vsak konstrukt so izbrali 8 transformant in jih shranili v glivni Golden Gate zbirki. Fluorescenco so merili na bralcu mikrotitrskih plošč. Preverjali so moč in nivoje indukcije pEYK450 v obeh smereh.
Glive, ki so vsebovale fluorescenčno reportersko kaseto, so proizvajale rdečo in rumeno fluorescenco pri smerni in protismerni orientaciji glede na promotor. Transkripcija v smeri ''EYL1'' je bila 3,5 in 2,7-krat večja kot v smeri proti ''EYK1''. Pri kontrolnem sevu so zaznali zanemarljive nivoje fluorescence [3].

==Indukcija pEYK450 je odvisna od koncentracije eritritola in eritruloze==
Glive so rastle v minimalnem gojišču z eritritolom ali eritrulozo v koncentraciji 0 g/L, 2,5 g/L in 5 g/L. Kot vir ogljika so uporabili glukozo v koncentraciji 5 g/L, da ne bi kot vira ogljika glive uporabljale eritritol ali eritrulozo. ''Y. lipolytica'' so naredili delecijo ''EYK1'', da ne bi že sam sev presnavljal eritritol in eritrulozo. Ko v gojišču ni bilo dodanega eritritola, pri ''Y. lipolytica'' niso zaznali niti rumene niti rdeče fluorescence. Ob dodatku eritritola so zaznali obe fluorescenci. Pri višji koncentraciji eritritola so zaznali močnejšo fluorescenco. Enake rezultate so dobili pri dodatku eritruloze. S tem so pokazali, da je indukcija odvisna od koncentracije eritritola ali eritruloze v gojišču [3].
==Hibridni pEYK450==
Prejšnje raziskave so pokazale, da se moč promotorja poveča, če hibridni promotor vsebuje več kopij zgornjega aktivacijskega zaporedja (Škatla A). V tej raziskavi so naredili hibridni promotor s petimi škatlami A. Promotor so poimenovali pEYK450-5AB, saj vsebuje 5 škatel A in 1 škatlo B. Promotor so vstavili v obeh smereh glede na fluorescenčne reporterske gene (''pEYK450-5AB-Fw'' in ''pEYK450-5AB-Rv''). Eksperiment so izvedli enako kot pri nehibridnem pEYK450. Promotor je bil tako močen, da je fluorescenca YFP presegla mejo detekcije. Merjenje fluorescence je pokazalo, da pEYK450-5AB proizvaja fluorescenco v obojesmerni transkripcijski orientaciji. Ekspresija v smeri ''EYK1'' je bila 2-krat večja kot v smeri ''EYL1'', kar je enako razmerje kot pri nehibridnem promotorju. V primerjavi z nehibridnim promtorjem je imel hibridni promotor 19,2 – krat večjo moč v smeri ''EYK1'' in 10,8 – krat večjo moč v smeri ''EYL1''. To je potrdilo, da tendemne ponovitve UAS1-eyk1 močno povečajo moč promotorja v obe smeri transkripcije [3].
Naredili so tudi poskus, kjer so primerjali moč izražanja enosmernega promotorja pEYK300 s hibridnim promotorjem pEYK300-5AB. Ugotovili so, da se tudi v tem primeru moč izražanja poveča pri hibridnem, in sicer za približno 12 – krat [3].
==Moč promotorja pEYK450‑5AB je v mikrobioreaktorjih odvisna od sestave gojišča==
Raziskovali so, če bi lahko uporabili pEYK450-5AB v mikrobioreaktorjih pri pogojih visoke gostote kulture, kar je pogosto v industriji. Najvišjo gostoto celic so dosegli z uporabo gojišča, ki je vsebovalo glukozo v koncentraciji 50 g/L. Fluorescenca se je poviševala s poviševanjem koncentracije glukoze v gojišču, dokler ni dosegla plato (50 g/l). Podobne rezultate so dobili pri gojišču z glicerolom, kjer so plato dosegli pri 80 g/ L. Raziskave so pokazale, da je največja moč dvosmernega promotorja pri pogojih visoke gostote kulture [3].

=Literatura=

1. E. A. Johnson, C. Echavarri-Erasun: Yeast Biotechnology. The Yeasts '''2011''', 1, str. 21–44.

2. N. Gohil, G. Bhattacharjee, V. Singh: An introduction to microbial cell factories for production of biomolecules. Microb. Cell Factories Eng. Prod. Biomol. '''2021''', str. 1–19.

3. L. Vidal, et al. : Bidirectional hybrid erythritol-inducible promoter for synthetic biology in Yarrowia lipolytica. Microb. Cell Fact. '''2023''', 22(1), str. 1–17.

4. W. O. Bernt, J. F. Borzelleca, G. Flamm, I. C. Munro: Erythritol: A review of biological and toxicological studies. Regul. Toxicol. Pharmacol. '''1996''', 24(2 II), str. 191–197.

Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v Yarrowia lipolytica

2023-05-08T06:22:13Z

Masa andoljsek: /* Rezultati */

Povzeto po članku: [https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-023-02020-6 ''L. Vidal, et al. : Bidirectional hybrid erythritol-inducible promoter for synthetic biology in Yarrowia lipolytica. Microb. Cell Fact. '''2023''', 22(1), str. 1–17.'']

=Uvod=
''Yarrowia lipolytica'' je askomicetna gliva, ki se zelo pogosto uporablja v biotehnologiji [1]. Ima sposobnost presnavljanja nestandarnih substratov, kot so polialkoholi, organske kisline, dolgoverižni ogljikovodiki, organski odpadki, glicerol, etanol ipd. [1, 2]. Proizvaja veliko lipolitičnih encimov, ki so uporabni v različnih industrijah [1]. V industriji se uporablja tudi za proizvodnjo polinenasičenih maščobnih kislin, biogoriv, sekundarnih metabolitov, ipd. [2]. Zaradi teh lastnosti se z različnimi metodami editira genom ''Y. lipolytica''. Primeri so: Golden Gate sestavljanje (GGA), tehnologija CRISPR-Cas9 in kapljična mikrofluidika. Obstaja tudi knjižnica promotorjev, ki se uporabljajo v omenjeni glivi. Raziskovalci iz članka so si želeli izboljšati gensko ekspresijo za industrijsko uporabo, zato so poskušali sintetizirati nov, boljši promotor [3].
==Katabolizem eritritola==
Eritritol je poliol, ki se v prehrani pogosto uporablja kot nizko kalorični nadomestek sladkorja. V naravi je široko prisoten in se nahaja v mnogih živilih [4].
Katabolizem eritritola v ''Y. lipolytica'' se začne z eritritolno dehidrogenazo, ki jo kodira gen ''EYD1''. Ta encim pretvarja eritritol v eritrulozo. Nato eritrulozo fosforilira eritruloza kinaza, ki jo kodira gen ''EYK1''. Produkt je L-eritruloza-1P, ki jo L-eritruloza-1P izomeraza (ki je kodirana z genom ''EYL2''), pretvori v eritroza-4P. V zadnjem koraku sodeluje encim D-eritruloza-4P, ki jo kodira gen ''EXL1'', in pretvori produkt v eritroza-4P. Predvidevajo, da gen ''EUF1'' kodira za transkripcijski faktor, ki sodeluje pri presnovi eritritola. Vsi našteti geni so zapisani na kromosomu F v regiji, ki se imenuje skupek za presnovo eritritola. Izražanje teh genov inducirata eritritol in eritruloza.
Pred kratkim so okarakterizirali zgornje aktivacijsko zaporedje (UAS), ki je povezano z genoma ''EYK1'' in ''EYD1''. To so odkrili tako, da so s filogenetskimi analizami in mutagenezo identificirali ohranjene regulatorne motive. Nato so uporabili rumeni fluorescenčni protein (YFP) in rdeči fluorescenčni protein (RedStarII), ki sta pokazala vzorce izražanja za nativne in z eritritolom inducirane promotorje. Določili so strukturo promotorja EXK1 in tudi njegovo inducibilnost z eritritolom in eritrulozo, ki poteka preko UAS-eyk1 (imenovano tudi škatla A). Nadaljnje analize katabolizma eritritola so pokazale, da je pEYK promotor za ''EYK1'' in tudi za ''EYL1''. To pomeni, da je pEYK dvosmerni promotor (BDP). To je DNA zaporedje, ki omogoča prepis DNA v obe smeri. Temu procesu se reče divergentna transkripcija. Te BDPje regulira baker, zato ga ne morejo uporabiti v industrijski rabi [3].

=Rezultati=
V študiji so naredili nov z eritritolom induciran hibridni BDP za uporabo v ''Y. lipolytica''. Ustvarili so naravne in hibridne BDP biokocke z uporabo pEYK. Naredili so jih kompatibilne s kloniranjem na način Golden Gate. Izražanje je bilo zaznano v obeh transkripcijskih smereh (Uporabili so fluorescenčna reporterska proteina (YFP and RedStarII)). Najmočnejše izražanje promotorja je bilo pri hibridnem pEYK v smeri EYL1. [3].

==Skupek za presnovo eritritola vsebuje dvosmerni promotor==
V skupku za presnovo eritritola so identificirali 3 pare divergentnih genov: YALI0F01540g in ''EUF1, EYK1'' in ''EYL1'', ter ''EYD1'' in YALI0F01672g. Nato so primerjali skupke treh različnih sevov ''Y. lipolytica''. S prileganjem zaporedij so ugotovili, da sta bila gena YALI0F01540g in YALI0F01672g narobe napovedana in anotirana (nimata enakega start kodona pri različnih sevih, dolžina pa je bila med 3 000 in 4 000 baznih parov). Analiza je pokazala, da je regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' dolga 438 baznih parov. V evkariontih je UAS lociran med – 1000 in + 50 mesta od začetnega mesta za transkripcijo.
Intergenska regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' je bila preučevana že v preteklosti, a so se osredotočili le na enosmerni promotor pEYK. Že takrat so pokazali, da je pEYK z eritritolom induciran promotor. Škatla TATA je bila identificirana blizu ''EYK1'' start kodona. V raziskavi iz članka so primerjali intergensko zaporedje regije med 5 različnimi sevi rodu ''Yarrowia''. Našli so še drugo škatlo TATA blizu ''EYK1'' start kodona.

==Regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' je eritritol-inducibilen BDP==
Ustvarili so reporterski sistem, ki je temeljil na dveh reporterskih genih, ki sta kodirala za rumeni in rdeči fluorescenčni protein. Reporterski sistemi so testirali različne BDPje ali hibridne BDPje (HBDP) v obeh smereh transkripcije. Reporterski sistem so ustvarili s pomočjo GoldenGate sestavljanja (GGA). Uporabili so 6 biokock in vektor.
Prvo so ustvarili donorske vektorje, ki so vsebovali ''YFP-TLIP2'', ''RedStarII-TLIP2'', in intergensko regijo ''EYK1-EYL1'' (pEYK450) v smerni in protismerni transkripcijski orientaciji. To so naredili s pomnoževanjem PCR. Intergenska regija pEYK450 ima smerno orientacijo proti ''EYK1'' in protismerno orientacijo proti'' EYL1''. Vsaka pEYK450 z reporterskimi geni je bila vključena v vektor GGE114. Nastali so plazmidi ''GGAURA3ex-RedStarII-pEYK450-Fw-YFP'' (JME4766) in ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-Rv-YFP'' (JME4768) ter tudi hibridni plazmidi iz pEYK, pri čemer so nastali hibridni plazmidi ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-5AB-Fw-YFP'' (JME4891) in ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-5ABRv-YFP'' (JME4892).
Plazmide, so vstavili v ''Y. lipolytica''. Za vsak konstrukt so izolirali 48 transformantov. Fluorescenco YFP in RedStarII so merili med celično rastjo na minimalnem gojišču, ki je vsebovalo eritritol. Odstranili so nefluorescenčne transformante in transformante s previsoko fluorescenco (več integracij v genom). Za vsak konstrukt so izbrali 8 transformant in jih shranili v glivni Golden Gate zbirki. Fluorescenco so merili na bralcu mikrotitrskih plošč. Preverjali so moč in nivoje indukcije pEYK450 v obeh smereh.
Glive, ki so vsebovale fluorescenčno reportersko kaseto, so proizvajale rdečo in rumeno fluorescenco pri smerni in protismerni orientaciji glede na promotor. Transkripcija v smeri ''EYL1'' je bila 3,5 in 2,7-krat večja kot v smeri proti ''EYK1''. Pri kontrolnem sevu so zaznali zanemarljive nivoje fluorescence.

==Indukcija pEYK450 je odvisna od koncentracije eritritola in eritruloze==
Glive so rastle v minimalnem gojišču z eritritolom ali eritrulozo v koncentraciji 0 g/L, 2,5 g/L in 5 g/L. Kot vir ogljika so uporabili glukozo v koncentraciji 5 g/L, da ne bi kot vira ogljika glive uporabljale eritritol ali eritrulozo. ''Y. lipolytica'' so naredili delecijo ''EYK1'', da ne bi že sam sev presnavljal eritritol in eritrulozo. Ko v gojišču ni bilo dodanega eritritola, pri ''Y. lipolytica'' niso zaznali niti rumene niti rdeče fluorescence. Ob dodatku eritritola so zaznali obe fluorescenci. Pri višji koncentraciji eritritola so zaznali močnejšo fluorescenco. Enake rezultate so dobili pri dodatku eritruloze. S tem so pokazali, da je indukcija odvisna od koncentracije eritritola ali eritruloze v gojišču.
==Hibridni pEYK450==
Prejšnje raziskave so pokazale, da se moč promotorja poveča, če hibridni promotor vsebuje več kopij zgornjega aktivacijskega zaporedja (Škatla A). V tej raziskavi so naredili hibridni promotor s petimi škatlami A. Promotor so poimenovali pEYK450-5AB, saj vsebuje 5 škatel A in 1 škatlo B. Promotor so vstavili v obeh smereh glede na fluorescenčne reporterske gene (''pEYK450-5AB-Fw'' in ''pEYK450-5AB-Rv''). Eksperiment so izvedli enako kot pri nehibridnem pEYK450. Promotor je bil tako močen, da je fluorescenca YFP presegla mejo detekcije. Merjenje fluorescence je pokazalo, da pEYK450-5AB proizvaja fluorescenco v obojesmerni transkripcijski orientaciji. Ekspresija v smeri ''EYK1'' je bila 2-krat večja kot v smeri ''EYL1'', kar je enako razmerje kot pri nehibridnem promotorju. V primerjavi z nehibridnim promtorjem je imel hibridni promotor 19,2 – krat večjo moč v smeri ''EYK1'' in 10,8 – krat večjo moč v smeri ''EYL1''. To je potrdilo, da tendemne ponovitve UAS1-eyk1 močno povečajo moč promotorja v obe smeri transkripcije.
Naredili so tudi poskus, kjer so primerjali moč izražanja enosmernega promotorja pEYK300 s hibridnim promotorjem pEYK300-5AB. Ugotovili so, da se tudi v tem primeru moč izražanja poveča pri hibridnem, in sicer za približno 12 – krat.
==Moč promotorja pEYK450‑5AB je v mikrobioreaktorjih odvisna od sestave gojišča==
Raziskovali so, če bi lahko uporabili pEYK450-5AB v mikrobioreaktorjih pri pogojih visoke gostote kulture, kar je pogosto v industriji. Najvišjo gostoto celic so dosegli z uporabo gojišča, ki je vsebovalo glukozo v koncentraciji 50 g/L. Fluorescenca se je poviševala s poviševanjem koncentracije glukoze v gojišču, dokler ni dosegla plato (50 g/l). Podobne rezultate so dobili pri gojišču z glicerolom, kjer so plato dosegli pri 80 g/ L. Raziskave so pokazale, da je največja moč dvosmernega promotorja pri pogojih visoke gostote kulture.

=Literatura=

1. E. A. Johnson, C. Echavarri-Erasun: Yeast Biotechnology. The Yeasts '''2011''', 1, str. 21–44.

2. N. Gohil, G. Bhattacharjee, V. Singh: An introduction to microbial cell factories for production of biomolecules. Microb. Cell Factories Eng. Prod. Biomol. '''2021''', str. 1–19.

3. L. Vidal, et al. : Bidirectional hybrid erythritol-inducible promoter for synthetic biology in Yarrowia lipolytica. Microb. Cell Fact. '''2023''', 22(1), str. 1–17.

4. W. O. Bernt, J. F. Borzelleca, G. Flamm, I. C. Munro: Erythritol: A review of biological and toxicological studies. Regul. Toxicol. Pharmacol. '''1996''', 24(2 II), str. 191–197.

Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v Yarrowia lipolytica

2023-05-08T06:22:00Z

Masa andoljsek: /* Regija med EYK1 in EYL1 je eritritol-inducibilen BDP */

Povzeto po članku: [https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-023-02020-6 ''L. Vidal, et al. : Bidirectional hybrid erythritol-inducible promoter for synthetic biology in Yarrowia lipolytica. Microb. Cell Fact. '''2023''', 22(1), str. 1–17.'']

=Uvod=
''Yarrowia lipolytica'' je askomicetna gliva, ki se zelo pogosto uporablja v biotehnologiji [1]. Ima sposobnost presnavljanja nestandarnih substratov, kot so polialkoholi, organske kisline, dolgoverižni ogljikovodiki, organski odpadki, glicerol, etanol ipd. [1, 2]. Proizvaja veliko lipolitičnih encimov, ki so uporabni v različnih industrijah [1]. V industriji se uporablja tudi za proizvodnjo polinenasičenih maščobnih kislin, biogoriv, sekundarnih metabolitov, ipd. [2]. Zaradi teh lastnosti se z različnimi metodami editira genom ''Y. lipolytica''. Primeri so: Golden Gate sestavljanje (GGA), tehnologija CRISPR-Cas9 in kapljična mikrofluidika. Obstaja tudi knjižnica promotorjev, ki se uporabljajo v omenjeni glivi. Raziskovalci iz članka so si želeli izboljšati gensko ekspresijo za industrijsko uporabo, zato so poskušali sintetizirati nov, boljši promotor [3].
==Katabolizem eritritola==
Eritritol je poliol, ki se v prehrani pogosto uporablja kot nizko kalorični nadomestek sladkorja. V naravi je široko prisoten in se nahaja v mnogih živilih [4].
Katabolizem eritritola v ''Y. lipolytica'' se začne z eritritolno dehidrogenazo, ki jo kodira gen ''EYD1''. Ta encim pretvarja eritritol v eritrulozo. Nato eritrulozo fosforilira eritruloza kinaza, ki jo kodira gen ''EYK1''. Produkt je L-eritruloza-1P, ki jo L-eritruloza-1P izomeraza (ki je kodirana z genom ''EYL2''), pretvori v eritroza-4P. V zadnjem koraku sodeluje encim D-eritruloza-4P, ki jo kodira gen ''EXL1'', in pretvori produkt v eritroza-4P. Predvidevajo, da gen ''EUF1'' kodira za transkripcijski faktor, ki sodeluje pri presnovi eritritola. Vsi našteti geni so zapisani na kromosomu F v regiji, ki se imenuje skupek za presnovo eritritola. Izražanje teh genov inducirata eritritol in eritruloza.
Pred kratkim so okarakterizirali zgornje aktivacijsko zaporedje (UAS), ki je povezano z genoma ''EYK1'' in ''EYD1''. To so odkrili tako, da so s filogenetskimi analizami in mutagenezo identificirali ohranjene regulatorne motive. Nato so uporabili rumeni fluorescenčni protein (YFP) in rdeči fluorescenčni protein (RedStarII), ki sta pokazala vzorce izražanja za nativne in z eritritolom inducirane promotorje. Določili so strukturo promotorja EXK1 in tudi njegovo inducibilnost z eritritolom in eritrulozo, ki poteka preko UAS-eyk1 (imenovano tudi škatla A). Nadaljnje analize katabolizma eritritola so pokazale, da je pEYK promotor za ''EYK1'' in tudi za ''EYL1''. To pomeni, da je pEYK dvosmerni promotor (BDP). To je DNA zaporedje, ki omogoča prepis DNA v obe smeri. Temu procesu se reče divergentna transkripcija. Te BDPje regulira baker, zato ga ne morejo uporabiti v industrijski rabi [3].

=Rezultati=
V študiji so naredili nov z eritritolom induciran hibridni BDP za uporabo v ''Y. lipolytica''. Ustvarili so naravne in hibridne BDP biokocke z uporabo pEYK. Naredili so jih kompatibilne s kloniranjem na način Golden Gate. Izražanje je bilo zaznano v obeh transkripcijskih smereh (Uporabili so fluorescenčna reporterska proteina (YFP and RedStarII)). Najmočnejše izražanje promotorja je bilo pri hibridnem pEYK v smeri EYK1. [3].

==Skupek za presnovo eritritola vsebuje dvosmerni promotor==
V skupku za presnovo eritritola so identificirali 3 pare divergentnih genov: YALI0F01540g in ''EUF1, EYK1'' in ''EYL1'', ter ''EYD1'' in YALI0F01672g. Nato so primerjali skupke treh različnih sevov ''Y. lipolytica''. S prileganjem zaporedij so ugotovili, da sta bila gena YALI0F01540g in YALI0F01672g narobe napovedana in anotirana (nimata enakega start kodona pri različnih sevih, dolžina pa je bila med 3 000 in 4 000 baznih parov). Analiza je pokazala, da je regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' dolga 438 baznih parov. V evkariontih je UAS lociran med – 1000 in + 50 mesta od začetnega mesta za transkripcijo.
Intergenska regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' je bila preučevana že v preteklosti, a so se osredotočili le na enosmerni promotor pEYK. Že takrat so pokazali, da je pEYK z eritritolom induciran promotor. Škatla TATA je bila identificirana blizu ''EYK1'' start kodona. V raziskavi iz članka so primerjali intergensko zaporedje regije med 5 različnimi sevi rodu ''Yarrowia''. Našli so še drugo škatlo TATA blizu ''EYK1'' start kodona.

==Regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' je eritritol-inducibilen BDP==
Ustvarili so reporterski sistem, ki je temeljil na dveh reporterskih genih, ki sta kodirala za rumeni in rdeči fluorescenčni protein. Reporterski sistemi so testirali različne BDPje ali hibridne BDPje (HBDP) v obeh smereh transkripcije. Reporterski sistem so ustvarili s pomočjo GoldenGate sestavljanja (GGA). Uporabili so 6 biokock in vektor.
Prvo so ustvarili donorske vektorje, ki so vsebovali ''YFP-TLIP2'', ''RedStarII-TLIP2'', in intergensko regijo ''EYK1-EYL1'' (pEYK450) v smerni in protismerni transkripcijski orientaciji. To so naredili s pomnoževanjem PCR. Intergenska regija pEYK450 ima smerno orientacijo proti ''EYK1'' in protismerno orientacijo proti'' EYL1''. Vsaka pEYK450 z reporterskimi geni je bila vključena v vektor GGE114. Nastali so plazmidi ''GGAURA3ex-RedStarII-pEYK450-Fw-YFP'' (JME4766) in ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-Rv-YFP'' (JME4768) ter tudi hibridni plazmidi iz pEYK, pri čemer so nastali hibridni plazmidi ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-5AB-Fw-YFP'' (JME4891) in ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-5ABRv-YFP'' (JME4892).
Plazmide, so vstavili v ''Y. lipolytica''. Za vsak konstrukt so izolirali 48 transformantov. Fluorescenco YFP in RedStarII so merili med celično rastjo na minimalnem gojišču, ki je vsebovalo eritritol. Odstranili so nefluorescenčne transformante in transformante s previsoko fluorescenco (več integracij v genom). Za vsak konstrukt so izbrali 8 transformant in jih shranili v glivni Golden Gate zbirki. Fluorescenco so merili na bralcu mikrotitrskih plošč. Preverjali so moč in nivoje indukcije pEYK450 v obeh smereh.
Glive, ki so vsebovale fluorescenčno reportersko kaseto, so proizvajale rdečo in rumeno fluorescenco pri smerni in protismerni orientaciji glede na promotor. Transkripcija v smeri ''EYL1'' je bila 3,5 in 2,7-krat večja kot v smeri proti ''EYK1''. Pri kontrolnem sevu so zaznali zanemarljive nivoje fluorescence.

==Indukcija pEYK450 je odvisna od koncentracije eritritola in eritruloze==
Glive so rastle v minimalnem gojišču z eritritolom ali eritrulozo v koncentraciji 0 g/L, 2,5 g/L in 5 g/L. Kot vir ogljika so uporabili glukozo v koncentraciji 5 g/L, da ne bi kot vira ogljika glive uporabljale eritritol ali eritrulozo. ''Y. lipolytica'' so naredili delecijo ''EYK1'', da ne bi že sam sev presnavljal eritritol in eritrulozo. Ko v gojišču ni bilo dodanega eritritola, pri ''Y. lipolytica'' niso zaznali niti rumene niti rdeče fluorescence. Ob dodatku eritritola so zaznali obe fluorescenci. Pri višji koncentraciji eritritola so zaznali močnejšo fluorescenco. Enake rezultate so dobili pri dodatku eritruloze. S tem so pokazali, da je indukcija odvisna od koncentracije eritritola ali eritruloze v gojišču.
==Hibridni pEYK450==
Prejšnje raziskave so pokazale, da se moč promotorja poveča, če hibridni promotor vsebuje več kopij zgornjega aktivacijskega zaporedja (Škatla A). V tej raziskavi so naredili hibridni promotor s petimi škatlami A. Promotor so poimenovali pEYK450-5AB, saj vsebuje 5 škatel A in 1 škatlo B. Promotor so vstavili v obeh smereh glede na fluorescenčne reporterske gene (''pEYK450-5AB-Fw'' in ''pEYK450-5AB-Rv''). Eksperiment so izvedli enako kot pri nehibridnem pEYK450. Promotor je bil tako močen, da je fluorescenca YFP presegla mejo detekcije. Merjenje fluorescence je pokazalo, da pEYK450-5AB proizvaja fluorescenco v obojesmerni transkripcijski orientaciji. Ekspresija v smeri ''EYK1'' je bila 2-krat večja kot v smeri ''EYL1'', kar je enako razmerje kot pri nehibridnem promotorju. V primerjavi z nehibridnim promtorjem je imel hibridni promotor 19,2 – krat večjo moč v smeri ''EYK1'' in 10,8 – krat večjo moč v smeri ''EYL1''. To je potrdilo, da tendemne ponovitve UAS1-eyk1 močno povečajo moč promotorja v obe smeri transkripcije.
Naredili so tudi poskus, kjer so primerjali moč izražanja enosmernega promotorja pEYK300 s hibridnim promotorjem pEYK300-5AB. Ugotovili so, da se tudi v tem primeru moč izražanja poveča pri hibridnem, in sicer za približno 12 – krat.
==Moč promotorja pEYK450‑5AB je v mikrobioreaktorjih odvisna od sestave gojišča==
Raziskovali so, če bi lahko uporabili pEYK450-5AB v mikrobioreaktorjih pri pogojih visoke gostote kulture, kar je pogosto v industriji. Najvišjo gostoto celic so dosegli z uporabo gojišča, ki je vsebovalo glukozo v koncentraciji 50 g/L. Fluorescenca se je poviševala s poviševanjem koncentracije glukoze v gojišču, dokler ni dosegla plato (50 g/l). Podobne rezultate so dobili pri gojišču z glicerolom, kjer so plato dosegli pri 80 g/ L. Raziskave so pokazale, da je največja moč dvosmernega promotorja pri pogojih visoke gostote kulture.

=Literatura=

1. E. A. Johnson, C. Echavarri-Erasun: Yeast Biotechnology. The Yeasts '''2011''', 1, str. 21–44.

2. N. Gohil, G. Bhattacharjee, V. Singh: An introduction to microbial cell factories for production of biomolecules. Microb. Cell Factories Eng. Prod. Biomol. '''2021''', str. 1–19.

3. L. Vidal, et al. : Bidirectional hybrid erythritol-inducible promoter for synthetic biology in Yarrowia lipolytica. Microb. Cell Fact. '''2023''', 22(1), str. 1–17.

4. W. O. Bernt, J. F. Borzelleca, G. Flamm, I. C. Munro: Erythritol: A review of biological and toxicological studies. Regul. Toxicol. Pharmacol. '''1996''', 24(2 II), str. 191–197.

Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v Yarrowia lipolytica

2023-05-08T06:19:11Z

Masa andoljsek: /* Skupek za presnovo eritritola vsebuje dvosmerni promotor */

Povzeto po članku: [https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-023-02020-6 ''L. Vidal, et al. : Bidirectional hybrid erythritol-inducible promoter for synthetic biology in Yarrowia lipolytica. Microb. Cell Fact. '''2023''', 22(1), str. 1–17.'']

=Uvod=
''Yarrowia lipolytica'' je askomicetna gliva, ki se zelo pogosto uporablja v biotehnologiji [1]. Ima sposobnost presnavljanja nestandarnih substratov, kot so polialkoholi, organske kisline, dolgoverižni ogljikovodiki, organski odpadki, glicerol, etanol ipd. [1, 2]. Proizvaja veliko lipolitičnih encimov, ki so uporabni v različnih industrijah [1]. V industriji se uporablja tudi za proizvodnjo polinenasičenih maščobnih kislin, biogoriv, sekundarnih metabolitov, ipd. [2]. Zaradi teh lastnosti se z različnimi metodami editira genom ''Y. lipolytica''. Primeri so: Golden Gate sestavljanje (GGA), tehnologija CRISPR-Cas9 in kapljična mikrofluidika. Obstaja tudi knjižnica promotorjev, ki se uporabljajo v omenjeni glivi. Raziskovalci iz članka so si želeli izboljšati gensko ekspresijo za industrijsko uporabo, zato so poskušali sintetizirati nov, boljši promotor [3].
==Katabolizem eritritola==
Eritritol je poliol, ki se v prehrani pogosto uporablja kot nizko kalorični nadomestek sladkorja. V naravi je široko prisoten in se nahaja v mnogih živilih [4].
Katabolizem eritritola v ''Y. lipolytica'' se začne z eritritolno dehidrogenazo, ki jo kodira gen ''EYD1''. Ta encim pretvarja eritritol v eritrulozo. Nato eritrulozo fosforilira eritruloza kinaza, ki jo kodira gen ''EYK1''. Produkt je L-eritruloza-1P, ki jo L-eritruloza-1P izomeraza (ki je kodirana z genom ''EYL2''), pretvori v eritroza-4P. V zadnjem koraku sodeluje encim D-eritruloza-4P, ki jo kodira gen ''EXL1'', in pretvori produkt v eritroza-4P. Predvidevajo, da gen ''EUF1'' kodira za transkripcijski faktor, ki sodeluje pri presnovi eritritola. Vsi našteti geni so zapisani na kromosomu F v regiji, ki se imenuje skupek za presnovo eritritola. Izražanje teh genov inducirata eritritol in eritruloza.
Pred kratkim so okarakterizirali zgornje aktivacijsko zaporedje (UAS), ki je povezano z genoma ''EYK1'' in ''EYD1''. To so odkrili tako, da so s filogenetskimi analizami in mutagenezo identificirali ohranjene regulatorne motive. Nato so uporabili rumeni fluorescenčni protein (YFP) in rdeči fluorescenčni protein (RedStarII), ki sta pokazala vzorce izražanja za nativne in z eritritolom inducirane promotorje. Določili so strukturo promotorja EXK1 in tudi njegovo inducibilnost z eritritolom in eritrulozo, ki poteka preko UAS-eyk1 (imenovano tudi škatla A). Nadaljnje analize katabolizma eritritola so pokazale, da je pEYK promotor za ''EYK1'' in tudi za ''EYL1''. To pomeni, da je pEYK dvosmerni promotor (BDP). To je DNA zaporedje, ki omogoča prepis DNA v obe smeri. Temu procesu se reče divergentna transkripcija. Te BDPje regulira baker, zato ga ne morejo uporabiti v industrijski rabi [3].

=Rezultati=
V študiji so naredili nov z eritritolom induciran hibridni BDP za uporabo v ''Y. lipolytica''. Ustvarili so naravne in hibridne BDP biokocke z uporabo pEYK. Naredili so jih kompatibilne s kloniranjem na način Golden Gate. Izražanje je bilo zaznano v obeh transkripcijskih smereh (Uporabili so fluorescenčna reporterska proteina (YFP and RedStarII)). Najmočnejše izražanje promotorja je bilo pri hibridnem pEYK v smeri EYK1. [3].

==Skupek za presnovo eritritola vsebuje dvosmerni promotor==
V skupku za presnovo eritritola so identificirali 3 pare divergentnih genov: YALI0F01540g in ''EUF1, EYK1'' in ''EYL1'', ter ''EYD1'' in YALI0F01672g. Nato so primerjali skupke treh različnih sevov ''Y. lipolytica''. S prileganjem zaporedij so ugotovili, da sta bila gena YALI0F01540g in YALI0F01672g narobe napovedana in anotirana (nimata enakega start kodona pri različnih sevih, dolžina pa je bila med 3 000 in 4 000 baznih parov). Analiza je pokazala, da je regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' dolga 438 baznih parov. V evkariontih je UAS lociran med – 1000 in + 50 mesta od začetnega mesta za transkripcijo.
Intergenska regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' je bila preučevana že v preteklosti, a so se osredotočili le na enosmerni promotor pEYK. Že takrat so pokazali, da je pEYK z eritritolom induciran promotor. Škatla TATA je bila identificirana blizu ''EYK1'' start kodona. V raziskavi iz članka so primerjali intergensko zaporedje regije med 5 različnimi sevi rodu ''Yarrowia''. Našli so še drugo škatlo TATA blizu ''EYK1'' start kodona.

==Regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' je eritritol-inducibilen BDP==
Ustvarili so reporterski sistem, ki je temeljil na dveh reporterskih genih, ki sta kodirala za rumeni in rdeči fluorescenčni protein. Reporterski sistemi so testirali različne BDPje ali hibridne BDPje (HBDP) v obeh smereh transkripcije. Reporterski sistem so ustvarili s pomočjo GoldenGate sestavljanja. Uporabili so 6 biokock in vektor.
Prvo so ustvarili donorske vektorje, ki so vsebovali ''YFP-TLIP2'', ''RedStarII-TLIP2'', in intergensko regijo ''EYK1-EYL1'' (pEYK450) v smerni in protismerni transkripcijski orientaciji. To so naredili s pomnoževanjem PCR. Intergenska regija pEYK450 ima smerno orientacijo proti ''EYK1'' in protismerno orientacijo proti'' EYL1''. Vsaka pEYK450 z reporterskimi geni je bila vključena v vektor GGE114. Nastali so plazmidi ''GGAURA3ex-RedStarII-pEYK450-Fw-YFP'' (JME4766) in ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-Rv-YFP'' (JME4768) ter tudi hibridni plazmidi iz pEYK, pri čemer so nastali hibridni plazmidi ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-5AB-Fw-YFP'' (JME4891) in ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-5ABRv-YFP'' (JME4892).
Plazmide, so vstavili v ''Y. lipolytica''. Za vsak konstrukt so izolirali 48 transformantov. Fluorescenco YFP in RedStarII so merili med celično rastjo na minimalnem gojišču, ki je vsebovalo eritritol. Odstranili so nefluorescenčne transformante in transformante s previsoko fluorescenco (več integracij v genom). Za vsak konstrukt so izbrali 8 transformant in jih shranili v glivni Golden Gate zbirki. Fluorescenco so merili na bralcu mikrotitrskih plošč. Preverjali so moč in nivoje indukcije pEYK450 v obeh smereh.
Glive, ki so vsebovale fluorescenčno reportersko kaseto, so proizvajale rdečo in rumeno fluorescenco v obeh transkripcijskih orientacijah. Transkripcija v smeri ''EYL1'' je bila 3,5 in 2,7-krat večja kot v smeri proti ''EYK1''. Pri kontrolnem sevu so zaznali zanemarljive nivoje fluorescence.

==Indukcija pEYK450 je odvisna od koncentracije eritritola in eritruloze==
Glive so rastle v minimalnem gojišču z eritritolom ali eritrulozo v koncentraciji 0 g/L, 2,5 g/L in 5 g/L. Kot vir ogljika so uporabili glukozo v koncentraciji 5 g/L, da ne bi kot vira ogljika glive uporabljale eritritol ali eritrulozo. ''Y. lipolytica'' so naredili delecijo ''EYK1'', da ne bi že sam sev presnavljal eritritol in eritrulozo. Ko v gojišču ni bilo dodanega eritritola, pri ''Y. lipolytica'' niso zaznali niti rumene niti rdeče fluorescence. Ob dodatku eritritola so zaznali obe fluorescenci. Pri višji koncentraciji eritritola so zaznali močnejšo fluorescenco. Enake rezultate so dobili pri dodatku eritruloze. S tem so pokazali, da je indukcija odvisna od koncentracije eritritola ali eritruloze v gojišču.
==Hibridni pEYK450==
Prejšnje raziskave so pokazale, da se moč promotorja poveča, če hibridni promotor vsebuje več kopij zgornjega aktivacijskega zaporedja (Škatla A). V tej raziskavi so naredili hibridni promotor s petimi škatlami A. Promotor so poimenovali pEYK450-5AB, saj vsebuje 5 škatel A in 1 škatlo B. Promotor so vstavili v obeh smereh glede na fluorescenčne reporterske gene (''pEYK450-5AB-Fw'' in ''pEYK450-5AB-Rv''). Eksperiment so izvedli enako kot pri nehibridnem pEYK450. Promotor je bil tako močen, da je fluorescenca YFP presegla mejo detekcije. Merjenje fluorescence je pokazalo, da pEYK450-5AB proizvaja fluorescenco v obojesmerni transkripcijski orientaciji. Ekspresija v smeri ''EYK1'' je bila 2-krat večja kot v smeri ''EYL1'', kar je enako razmerje kot pri nehibridnem promotorju. V primerjavi z nehibridnim promtorjem je imel hibridni promotor 19,2 – krat večjo moč v smeri ''EYK1'' in 10,8 – krat večjo moč v smeri ''EYL1''. To je potrdilo, da tendemne ponovitve UAS1-eyk1 močno povečajo moč promotorja v obe smeri transkripcije.
Naredili so tudi poskus, kjer so primerjali moč izražanja enosmernega promotorja pEYK300 s hibridnim promotorjem pEYK300-5AB. Ugotovili so, da se tudi v tem primeru moč izražanja poveča pri hibridnem, in sicer za približno 12 – krat.
==Moč promotorja pEYK450‑5AB je v mikrobioreaktorjih odvisna od sestave gojišča==
Raziskovali so, če bi lahko uporabili pEYK450-5AB v mikrobioreaktorjih pri pogojih visoke gostote kulture, kar je pogosto v industriji. Najvišjo gostoto celic so dosegli z uporabo gojišča, ki je vsebovalo glukozo v koncentraciji 50 g/L. Fluorescenca se je poviševala s poviševanjem koncentracije glukoze v gojišču, dokler ni dosegla plato (50 g/l). Podobne rezultate so dobili pri gojišču z glicerolom, kjer so plato dosegli pri 80 g/ L. Raziskave so pokazale, da je največja moč dvosmernega promotorja pri pogojih visoke gostote kulture.

=Literatura=

1. E. A. Johnson, C. Echavarri-Erasun: Yeast Biotechnology. The Yeasts '''2011''', 1, str. 21–44.

2. N. Gohil, G. Bhattacharjee, V. Singh: An introduction to microbial cell factories for production of biomolecules. Microb. Cell Factories Eng. Prod. Biomol. '''2021''', str. 1–19.

3. L. Vidal, et al. : Bidirectional hybrid erythritol-inducible promoter for synthetic biology in Yarrowia lipolytica. Microb. Cell Fact. '''2023''', 22(1), str. 1–17.

4. W. O. Bernt, J. F. Borzelleca, G. Flamm, I. C. Munro: Erythritol: A review of biological and toxicological studies. Regul. Toxicol. Pharmacol. '''1996''', 24(2 II), str. 191–197.

Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v Yarrowia lipolytica

2023-05-08T06:17:51Z

Masa andoljsek: /* Rezultati */

Povzeto po članku: [https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-023-02020-6 ''L. Vidal, et al. : Bidirectional hybrid erythritol-inducible promoter for synthetic biology in Yarrowia lipolytica. Microb. Cell Fact. '''2023''', 22(1), str. 1–17.'']

=Uvod=
''Yarrowia lipolytica'' je askomicetna gliva, ki se zelo pogosto uporablja v biotehnologiji [1]. Ima sposobnost presnavljanja nestandarnih substratov, kot so polialkoholi, organske kisline, dolgoverižni ogljikovodiki, organski odpadki, glicerol, etanol ipd. [1, 2]. Proizvaja veliko lipolitičnih encimov, ki so uporabni v različnih industrijah [1]. V industriji se uporablja tudi za proizvodnjo polinenasičenih maščobnih kislin, biogoriv, sekundarnih metabolitov, ipd. [2]. Zaradi teh lastnosti se z različnimi metodami editira genom ''Y. lipolytica''. Primeri so: Golden Gate sestavljanje (GGA), tehnologija CRISPR-Cas9 in kapljična mikrofluidika. Obstaja tudi knjižnica promotorjev, ki se uporabljajo v omenjeni glivi. Raziskovalci iz članka so si želeli izboljšati gensko ekspresijo za industrijsko uporabo, zato so poskušali sintetizirati nov, boljši promotor [3].
==Katabolizem eritritola==
Eritritol je poliol, ki se v prehrani pogosto uporablja kot nizko kalorični nadomestek sladkorja. V naravi je široko prisoten in se nahaja v mnogih živilih [4].
Katabolizem eritritola v ''Y. lipolytica'' se začne z eritritolno dehidrogenazo, ki jo kodira gen ''EYD1''. Ta encim pretvarja eritritol v eritrulozo. Nato eritrulozo fosforilira eritruloza kinaza, ki jo kodira gen ''EYK1''. Produkt je L-eritruloza-1P, ki jo L-eritruloza-1P izomeraza (ki je kodirana z genom ''EYL2''), pretvori v eritroza-4P. V zadnjem koraku sodeluje encim D-eritruloza-4P, ki jo kodira gen ''EXL1'', in pretvori produkt v eritroza-4P. Predvidevajo, da gen ''EUF1'' kodira za transkripcijski faktor, ki sodeluje pri presnovi eritritola. Vsi našteti geni so zapisani na kromosomu F v regiji, ki se imenuje skupek za presnovo eritritola. Izražanje teh genov inducirata eritritol in eritruloza.
Pred kratkim so okarakterizirali zgornje aktivacijsko zaporedje (UAS), ki je povezano z genoma ''EYK1'' in ''EYD1''. To so odkrili tako, da so s filogenetskimi analizami in mutagenezo identificirali ohranjene regulatorne motive. Nato so uporabili rumeni fluorescenčni protein (YFP) in rdeči fluorescenčni protein (RedStarII), ki sta pokazala vzorce izražanja za nativne in z eritritolom inducirane promotorje. Določili so strukturo promotorja EXK1 in tudi njegovo inducibilnost z eritritolom in eritrulozo, ki poteka preko UAS-eyk1 (imenovano tudi škatla A). Nadaljnje analize katabolizma eritritola so pokazale, da je pEYK promotor za ''EYK1'' in tudi za ''EYL1''. To pomeni, da je pEYK dvosmerni promotor (BDP). To je DNA zaporedje, ki omogoča prepis DNA v obe smeri. Temu procesu se reče divergentna transkripcija. Te BDPje regulira baker, zato ga ne morejo uporabiti v industrijski rabi [3].

=Rezultati=
V študiji so naredili nov z eritritolom induciran hibridni BDP za uporabo v ''Y. lipolytica''. Ustvarili so naravne in hibridne BDP biokocke z uporabo pEYK. Naredili so jih kompatibilne s kloniranjem na način Golden Gate. Izražanje je bilo zaznano v obeh transkripcijskih smereh (Uporabili so fluorescenčna reporterska proteina (YFP and RedStarII)). Najmočnejše izražanje promotorja je bilo pri hibridnem pEYK v smeri EYK1. [3].

==Skupek za presnovo eritritola vsebuje dvosmerni promotor==
V skupku za presnovo eritritola so identificirali 3 pare divergentnih genov: YALI0F01540g in ''EUF1, EYK1'' in ''EYL1'', ter ''EYD1'' in YALI0F01672g. Nato so primerjali skupke treh različnih sevov ''Y. lipolytica''. S prileganjem zaporedij so ugotovili, da sta bila gena YALI0F01540g in YALI0F01672g narobe napovedana in anotirana (nimata enakega start kodona pri različnih sevih, dolžina pa je bila med 3 000 in 4 000 baznih parov). Analiza je pokazala, da je regija med ''EYK1'' in ''EYKL1'' dolga 438 baznih parov. V evkariontih je UAS lociran med – 1000 in + 50 mesta od začetnega mesta za transkripcijo.
Intergenska regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' je bila preučevana že v preteklosti, a so se osredotočili le na enosmerni promotor pEYK. Že takrat so pokazali, da je pEYK z eritritolom induciran promotor. Škatla TATA je bila identificirana blizu ''EYK1'' start kodona. Primerjali so intergensko zaporedje regije med 5 različnimi sevi rodu ''Yarrowia''. Našli so še drugo škatlo TATA blizu ''EYK1'' start kodona.
==Regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' je eritritol-inducibilen BDP==
Ustvarili so reporterski sistem, ki je temeljil na dveh reporterskih genih, ki sta kodirala za rumeni in rdeči fluorescenčni protein. Reporterski sistemi so testirali različne BDPje ali hibridne BDPje (HBDP) v obeh smereh transkripcije. Reporterski sistem so ustvarili s pomočjo GoldenGate sestavljanja. Uporabili so 6 biokock in vektor.
Prvo so ustvarili donorske vektorje, ki so vsebovali ''YFP-TLIP2'', ''RedStarII-TLIP2'', in intergensko regijo ''EYK1-EYL1'' (pEYK450) v smerni in protismerni transkripcijski orientaciji. To so naredili s pomnoževanjem PCR. Intergenska regija pEYK450 ima smerno orientacijo proti ''EYK1'' in protismerno orientacijo proti'' EYL1''. Vsaka pEYK450 z reporterskimi geni je bila vključena v vektor GGE114. Nastali so plazmidi ''GGAURA3ex-RedStarII-pEYK450-Fw-YFP'' (JME4766) in ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-Rv-YFP'' (JME4768) ter tudi hibridni plazmidi iz pEYK, pri čemer so nastali hibridni plazmidi ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-5AB-Fw-YFP'' (JME4891) in ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-5ABRv-YFP'' (JME4892).
Plazmide, so vstavili v ''Y. lipolytica''. Za vsak konstrukt so izolirali 48 transformantov. Fluorescenco YFP in RedStarII so merili med celično rastjo na minimalnem gojišču, ki je vsebovalo eritritol. Odstranili so nefluorescenčne transformante in transformante s previsoko fluorescenco (več integracij v genom). Za vsak konstrukt so izbrali 8 transformant in jih shranili v glivni Golden Gate zbirki. Fluorescenco so merili na bralcu mikrotitrskih plošč. Preverjali so moč in nivoje indukcije pEYK450 v obeh smereh.
Glive, ki so vsebovale fluorescenčno reportersko kaseto, so proizvajale rdečo in rumeno fluorescenco v obeh transkripcijskih orientacijah. Transkripcija v smeri ''EYL1'' je bila 3,5 in 2,7-krat večja kot v smeri proti ''EYK1''. Pri kontrolnem sevu so zaznali zanemarljive nivoje fluorescence.

==Indukcija pEYK450 je odvisna od koncentracije eritritola in eritruloze==
Glive so rastle v minimalnem gojišču z eritritolom ali eritrulozo v koncentraciji 0 g/L, 2,5 g/L in 5 g/L. Kot vir ogljika so uporabili glukozo v koncentraciji 5 g/L, da ne bi kot vira ogljika glive uporabljale eritritol ali eritrulozo. ''Y. lipolytica'' so naredili delecijo ''EYK1'', da ne bi že sam sev presnavljal eritritol in eritrulozo. Ko v gojišču ni bilo dodanega eritritola, pri ''Y. lipolytica'' niso zaznali niti rumene niti rdeče fluorescence. Ob dodatku eritritola so zaznali obe fluorescenci. Pri višji koncentraciji eritritola so zaznali močnejšo fluorescenco. Enake rezultate so dobili pri dodatku eritruloze. S tem so pokazali, da je indukcija odvisna od koncentracije eritritola ali eritruloze v gojišču.
==Hibridni pEYK450==
Prejšnje raziskave so pokazale, da se moč promotorja poveča, če hibridni promotor vsebuje več kopij zgornjega aktivacijskega zaporedja (Škatla A). V tej raziskavi so naredili hibridni promotor s petimi škatlami A. Promotor so poimenovali pEYK450-5AB, saj vsebuje 5 škatel A in 1 škatlo B. Promotor so vstavili v obeh smereh glede na fluorescenčne reporterske gene (''pEYK450-5AB-Fw'' in ''pEYK450-5AB-Rv''). Eksperiment so izvedli enako kot pri nehibridnem pEYK450. Promotor je bil tako močen, da je fluorescenca YFP presegla mejo detekcije. Merjenje fluorescence je pokazalo, da pEYK450-5AB proizvaja fluorescenco v obojesmerni transkripcijski orientaciji. Ekspresija v smeri ''EYK1'' je bila 2-krat večja kot v smeri ''EYL1'', kar je enako razmerje kot pri nehibridnem promotorju. V primerjavi z nehibridnim promtorjem je imel hibridni promotor 19,2 – krat večjo moč v smeri ''EYK1'' in 10,8 – krat večjo moč v smeri ''EYL1''. To je potrdilo, da tendemne ponovitve UAS1-eyk1 močno povečajo moč promotorja v obe smeri transkripcije.
Naredili so tudi poskus, kjer so primerjali moč izražanja enosmernega promotorja pEYK300 s hibridnim promotorjem pEYK300-5AB. Ugotovili so, da se tudi v tem primeru moč izražanja poveča pri hibridnem, in sicer za približno 12 – krat.
==Moč promotorja pEYK450‑5AB je v mikrobioreaktorjih odvisna od sestave gojišča==
Raziskovali so, če bi lahko uporabili pEYK450-5AB v mikrobioreaktorjih pri pogojih visoke gostote kulture, kar je pogosto v industriji. Najvišjo gostoto celic so dosegli z uporabo gojišča, ki je vsebovalo glukozo v koncentraciji 50 g/L. Fluorescenca se je poviševala s poviševanjem koncentracije glukoze v gojišču, dokler ni dosegla plato (50 g/l). Podobne rezultate so dobili pri gojišču z glicerolom, kjer so plato dosegli pri 80 g/ L. Raziskave so pokazale, da je največja moč dvosmernega promotorja pri pogojih visoke gostote kulture.

=Literatura=

1. E. A. Johnson, C. Echavarri-Erasun: Yeast Biotechnology. The Yeasts '''2011''', 1, str. 21–44.

2. N. Gohil, G. Bhattacharjee, V. Singh: An introduction to microbial cell factories for production of biomolecules. Microb. Cell Factories Eng. Prod. Biomol. '''2021''', str. 1–19.

3. L. Vidal, et al. : Bidirectional hybrid erythritol-inducible promoter for synthetic biology in Yarrowia lipolytica. Microb. Cell Fact. '''2023''', 22(1), str. 1–17.

4. W. O. Bernt, J. F. Borzelleca, G. Flamm, I. C. Munro: Erythritol: A review of biological and toxicological studies. Regul. Toxicol. Pharmacol. '''1996''', 24(2 II), str. 191–197.

Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v Yarrowia lipolytica

2023-05-08T06:15:49Z

Masa andoljsek: /* Katabolizem eritritola */

Povzeto po članku: [https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-023-02020-6 ''L. Vidal, et al. : Bidirectional hybrid erythritol-inducible promoter for synthetic biology in Yarrowia lipolytica. Microb. Cell Fact. '''2023''', 22(1), str. 1–17.'']

=Uvod=
''Yarrowia lipolytica'' je askomicetna gliva, ki se zelo pogosto uporablja v biotehnologiji [1]. Ima sposobnost presnavljanja nestandarnih substratov, kot so polialkoholi, organske kisline, dolgoverižni ogljikovodiki, organski odpadki, glicerol, etanol ipd. [1, 2]. Proizvaja veliko lipolitičnih encimov, ki so uporabni v različnih industrijah [1]. V industriji se uporablja tudi za proizvodnjo polinenasičenih maščobnih kislin, biogoriv, sekundarnih metabolitov, ipd. [2]. Zaradi teh lastnosti se z različnimi metodami editira genom ''Y. lipolytica''. Primeri so: Golden Gate sestavljanje (GGA), tehnologija CRISPR-Cas9 in kapljična mikrofluidika. Obstaja tudi knjižnica promotorjev, ki se uporabljajo v omenjeni glivi. Raziskovalci iz članka so si želeli izboljšati gensko ekspresijo za industrijsko uporabo, zato so poskušali sintetizirati nov, boljši promotor [3].
==Katabolizem eritritola==
Eritritol je poliol, ki se v prehrani pogosto uporablja kot nizko kalorični nadomestek sladkorja. V naravi je široko prisoten in se nahaja v mnogih živilih [4].
Katabolizem eritritola v ''Y. lipolytica'' se začne z eritritolno dehidrogenazo, ki jo kodira gen ''EYD1''. Ta encim pretvarja eritritol v eritrulozo. Nato eritrulozo fosforilira eritruloza kinaza, ki jo kodira gen ''EYK1''. Produkt je L-eritruloza-1P, ki jo L-eritruloza-1P izomeraza (ki je kodirana z genom ''EYL2''), pretvori v eritroza-4P. V zadnjem koraku sodeluje encim D-eritruloza-4P, ki jo kodira gen ''EXL1'', in pretvori produkt v eritroza-4P. Predvidevajo, da gen ''EUF1'' kodira za transkripcijski faktor, ki sodeluje pri presnovi eritritola. Vsi našteti geni so zapisani na kromosomu F v regiji, ki se imenuje skupek za presnovo eritritola. Izražanje teh genov inducirata eritritol in eritruloza.
Pred kratkim so okarakterizirali zgornje aktivacijsko zaporedje (UAS), ki je povezano z genoma ''EYK1'' in ''EYD1''. To so odkrili tako, da so s filogenetskimi analizami in mutagenezo identificirali ohranjene regulatorne motive. Nato so uporabili rumeni fluorescenčni protein (YFP) in rdeči fluorescenčni protein (RedStarII), ki sta pokazala vzorce izražanja za nativne in z eritritolom inducirane promotorje. Določili so strukturo promotorja EXK1 in tudi njegovo inducibilnost z eritritolom in eritrulozo, ki poteka preko UAS-eyk1 (imenovano tudi škatla A). Nadaljnje analize katabolizma eritritola so pokazale, da je pEYK promotor za ''EYK1'' in tudi za ''EYL1''. To pomeni, da je pEYK dvosmerni promotor (BDP). To je DNA zaporedje, ki omogoča prepis DNA v obe smeri. Temu procesu se reče divergentna transkripcija. Te BDPje regulira baker, zato ga ne morejo uporabiti v industrijski rabi [3].

=Rezultati=

==Skupek za presnovo eritritola vsebuje dvosmerni promotor==
V skupku za presnovo eritritola so identificirali 3 pare divergentnih genov: YALI0F01540g in ''EUF1, EYK1'' in ''EYL1'', ter ''EYD1'' in YALI0F01672g. Nato so primerjali skupke treh različnih sevov ''Y. lipolytica''. S prileganjem zaporedij so ugotovili, da sta bila gena YALI0F01540g in YALI0F01672g narobe napovedana in anotirana (nimata enakega start kodona pri različnih sevih, dolžina pa je bila med 3 000 in 4 000 baznih parov). Analiza je pokazala, da je regija med ''EYK1'' in ''EYKL1'' dolga 438 baznih parov. V evkariontih je UAS lociran med – 1000 in + 50 mesta od začetnega mesta za transkripcijo.
Intergenska regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' je bila preučevana že v preteklosti, a so se osredotočili le na enosmerni promotor pEYK. Že takrat so pokazali, da je pEYK z eritritolom induciran promotor. Škatla TATA je bila identificirana blizu ''EYK1'' start kodona. Primerjali so intergensko zaporedje regije med 5 različnimi sevi rodu ''Yarrowia''. Našli so še drugo škatlo TATA blizu ''EYK1'' start kodona.
==Regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' je eritritol-inducibilen BDP==
Ustvarili so reporterski sistem, ki je temeljil na dveh reporterskih genih, ki sta kodirala za rumeni in rdeči fluorescenčni protein. Reporterski sistemi so testirali različne BDPje ali hibridne BDPje (HBDP) v obeh smereh transkripcije. Reporterski sistem so ustvarili s pomočjo GoldenGate sestavljanja. Uporabili so 6 biokock in vektor.
Prvo so ustvarili donorske vektorje, ki so vsebovali ''YFP-TLIP2'', ''RedStarII-TLIP2'', in intergensko regijo ''EYK1-EYL1'' (pEYK450) v smerni in protismerni transkripcijski orientaciji. To so naredili s pomnoževanjem PCR. Intergenska regija pEYK450 ima smerno orientacijo proti ''EYK1'' in protismerno orientacijo proti'' EYL1''. Vsaka pEYK450 z reporterskimi geni je bila vključena v vektor GGE114. Nastali so plazmidi ''GGAURA3ex-RedStarII-pEYK450-Fw-YFP'' (JME4766) in ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-Rv-YFP'' (JME4768) ter tudi hibridni plazmidi iz pEYK, pri čemer so nastali hibridni plazmidi ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-5AB-Fw-YFP'' (JME4891) in ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-5ABRv-YFP'' (JME4892).
Plazmide, so vstavili v ''Y. lipolytica''. Za vsak konstrukt so izolirali 48 transformantov. Fluorescenco YFP in RedStarII so merili med celično rastjo na minimalnem gojišču, ki je vsebovalo eritritol. Odstranili so nefluorescenčne transformante in transformante s previsoko fluorescenco (več integracij v genom). Za vsak konstrukt so izbrali 8 transformant in jih shranili v glivni Golden Gate zbirki. Fluorescenco so merili na bralcu mikrotitrskih plošč. Preverjali so moč in nivoje indukcije pEYK450 v obeh smereh.
Glive, ki so vsebovale fluorescenčno reportersko kaseto, so proizvajale rdečo in rumeno fluorescenco v obeh transkripcijskih orientacijah. Transkripcija v smeri ''EYL1'' je bila 3,5 in 2,7-krat večja kot v smeri proti ''EYK1''. Pri kontrolnem sevu so zaznali zanemarljive nivoje fluorescence.

==Indukcija pEYK450 je odvisna od koncentracije eritritola in eritruloze==
Glive so rastle v minimalnem gojišču z eritritolom ali eritrulozo v koncentraciji 0 g/L, 2,5 g/L in 5 g/L. Kot vir ogljika so uporabili glukozo v koncentraciji 5 g/L, da ne bi kot vira ogljika glive uporabljale eritritol ali eritrulozo. ''Y. lipolytica'' so naredili delecijo ''EYK1'', da ne bi že sam sev presnavljal eritritol in eritrulozo. Ko v gojišču ni bilo dodanega eritritola, pri ''Y. lipolytica'' niso zaznali niti rumene niti rdeče fluorescence. Ob dodatku eritritola so zaznali obe fluorescenci. Pri višji koncentraciji eritritola so zaznali močnejšo fluorescenco. Enake rezultate so dobili pri dodatku eritruloze. S tem so pokazali, da je indukcija odvisna od koncentracije eritritola ali eritruloze v gojišču.
==Hibridni pEYK450==
Prejšnje raziskave so pokazale, da se moč promotorja poveča, če hibridni promotor vsebuje več kopij zgornjega aktivacijskega zaporedja (Škatla A). V tej raziskavi so naredili hibridni promotor s petimi škatlami A. Promotor so poimenovali pEYK450-5AB, saj vsebuje 5 škatel A in 1 škatlo B. Promotor so vstavili v obeh smereh glede na fluorescenčne reporterske gene (''pEYK450-5AB-Fw'' in ''pEYK450-5AB-Rv''). Eksperiment so izvedli enako kot pri nehibridnem pEYK450. Promotor je bil tako močen, da je fluorescenca YFP presegla mejo detekcije. Merjenje fluorescence je pokazalo, da pEYK450-5AB proizvaja fluorescenco v obojesmerni transkripcijski orientaciji. Ekspresija v smeri ''EYL1'' je bila 2-krat večja kot v smeri ''EYK1'', kar je enako razmerje kot pri nehibridnem promotorju. V primerjavi z nehibridnim promtorjem je imel hibridni promotor 19,2 – krat večjo moč v smeri ''EYK1'' in 10,8 – krat večjo moč v smeri ''EYL1''. To je potrdilo, da tendemne ponovitve UAS1-eyk1 močno povečajo moč promotorja v obe smeri transkripcije.
Naredili so tudi poskus, kjer so primerjali moč izražanja enosmernega promotorja pEYK300 s hibridnim promotorjem pEYK300-5AB. Ugotovili so, da se tudi v tem primeru moč izražanja poveča pri hibridnem, in sicer za približno 12 – krat.
==Moč promotorja pEYK450‑5AB je v mikrobioreaktorjih odvisna od sestave gojišča==
Raziskovali so, če bi lahko uporabili pEYK450-5AB v mikrobioreaktorjih pri pogojih visoke gostote kulture, kar je pogosto v industriji. Najvišjo gostoto celic so dosegli z uporabo gojišča, ki je vsebovalo glukozo v koncentraciji 50 g/L. Fluorescenca se je poviševala s poviševanjem koncentracije glukoze v gojišču, dokler ni dosegla plato (50 g/l). Podobne rezultate so dobili pri gojišču z glicerolom, kjer so plato dosegli pri 80 g/ L. Raziskave so pokazale, da je največja moč dvosmernega promotorja pri pogojih visoke gostote kulture.

=Literatura=

1. E. A. Johnson, C. Echavarri-Erasun: Yeast Biotechnology. The Yeasts '''2011''', 1, str. 21–44.

2. N. Gohil, G. Bhattacharjee, V. Singh: An introduction to microbial cell factories for production of biomolecules. Microb. Cell Factories Eng. Prod. Biomol. '''2021''', str. 1–19.

3. L. Vidal, et al. : Bidirectional hybrid erythritol-inducible promoter for synthetic biology in Yarrowia lipolytica. Microb. Cell Fact. '''2023''', 22(1), str. 1–17.

4. W. O. Bernt, J. F. Borzelleca, G. Flamm, I. C. Munro: Erythritol: A review of biological and toxicological studies. Regul. Toxicol. Pharmacol. '''1996''', 24(2 II), str. 191–197.

Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v Yarrowia lipolytica

2023-05-08T06:13:05Z

Masa andoljsek: /* Katabolizem eritritola */

Povzeto po članku: [https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-023-02020-6 ''L. Vidal, et al. : Bidirectional hybrid erythritol-inducible promoter for synthetic biology in Yarrowia lipolytica. Microb. Cell Fact. '''2023''', 22(1), str. 1–17.'']

=Uvod=
''Yarrowia lipolytica'' je askomicetna gliva, ki se zelo pogosto uporablja v biotehnologiji [1]. Ima sposobnost presnavljanja nestandarnih substratov, kot so polialkoholi, organske kisline, dolgoverižni ogljikovodiki, organski odpadki, glicerol, etanol ipd. [1, 2]. Proizvaja veliko lipolitičnih encimov, ki so uporabni v različnih industrijah [1]. V industriji se uporablja tudi za proizvodnjo polinenasičenih maščobnih kislin, biogoriv, sekundarnih metabolitov, ipd. [2]. Zaradi teh lastnosti se z različnimi metodami editira genom ''Y. lipolytica''. Primeri so: Golden Gate sestavljanje (GGA), tehnologija CRISPR-Cas9 in kapljična mikrofluidika. Obstaja tudi knjižnica promotorjev, ki se uporabljajo v omenjeni glivi. Raziskovalci iz članka so si želeli izboljšati gensko ekspresijo za industrijsko uporabo, zato so poskušali sintetizirati nov, boljši promotor [3].
==Katabolizem eritritola==
Eritritol je poliol, ki se v prehrani pogosto uporablja kot nizko kalorični nadomestek sladkorja. V naravi je široko prisoten in se nahaja v mnogih živilih [4].
Katabolizem eritritola v ''Y. lipolytica'' se začne z eritritolno dehidrogenazo, ki jo kodira gen ''EYD1''. Ta encim pretvarja eritritol v eritrulozo. Nato eritrulozo fosforilira eritruloza kinaza, ki jo kodira gen ''EYK1''. Produkt je L-eritruloza-1P, ki jo L-eritruloza-1P izomeraza (ki je kodirana z genom ''EYL2''), pretvori v eritroza-4P. V zadnjem koraku sodeluje encim D-eritruloza-4P, ki jo kodira gen ''EXL1'', in pretvori produkt v eritroza-4P. Predvidevajo, da gen ''EUF1'' kodira za transkripcijski faktor, ki sodeluje pri presnovi eritritola. Vsi našteti geni so zapisani na kromosomu F v regiji, ki se imenuje skupek za presnovo eritritola. Izražanje teh genov inducirata eritritol in eritruloza.
Pred kratkim so okarakterizirali zgornje aktivacijsko zaporedje (UAS), ki je povezano z genoma ''EYK1'' in ''EYD1''. To so odkrili tako, da so s filogenetskimi analizami in mutagenezo identificirali ohranjene regulatorne motive. Nato so uporabili rumeni fluorescenčni protein (YFP) in rdeči fluorescenčni protein (RedStarII), ki sta pokazala vzorce izražanja za nativne in z eritritolom inducirane promotorje. Določili so strukturo promotorja EXK1 in tudi njegovo inducibilnost z eritritolom in eritrulozo, ki poteka preko UAS-eyk1 (imenovano tudi škatla A). Nadaljnje analize katabolizma eritritola so pokazale, da je pEYK promotor za ''EYK1'' in tudi za ''EYL1''. To pomeni, da je pEYK dvosmerni promotor (BDP). To je DNA zaporedje, ki omogoča prepis DNA v obe smeri. Temu procesu se reče divergentna transkripcija. Te BDPje regulira baker, zato ga ne morejo uporabiti v industrijski rabi.
V študiji so naredili nov z eritritolom induciran hibridni BDP za uporabo v ''Y. lipolytica''. Ustvarili so naravne in hibridne BDP biokocke z uporabo pEYK. Naredili so jih kompatibilne s kloniranjem na način Golden Gate. Izražanje je bilo zaznano v obeh transkripcijskih smereh (Uporabili so fluorescenčna reporterska proteina (YFP and RedStarII)) [3].

=Rezultati=

==Skupek za presnovo eritritola vsebuje dvosmerni promotor==
V skupku za presnovo eritritola so identificirali 3 pare divergentnih genov: YALI0F01540g in ''EUF1, EYK1'' in ''EYL1'', ter ''EYD1'' in YALI0F01672g. Nato so primerjali skupke treh različnih sevov ''Y. lipolytica''. S prileganjem zaporedij so ugotovili, da sta bila gena YALI0F01540g in YALI0F01672g narobe napovedana in anotirana (nimata enakega start kodona pri različnih sevih, dolžina pa je bila med 3 000 in 4 000 baznih parov). Analiza je pokazala, da je regija med ''EYK1'' in ''EYKL1'' dolga 438 baznih parov. V evkariontih je UAS lociran med – 1000 in + 50 mesta od začetnega mesta za transkripcijo.
Intergenska regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' je bila preučevana že v preteklosti, a so se osredotočili le na enosmerni promotor pEYK. Že takrat so pokazali, da je pEYK z eritritolom induciran promotor. Škatla TATA je bila identificirana blizu ''EYK1'' start kodona. Primerjali so intergensko zaporedje regije med 5 različnimi sevi rodu ''Yarrowia''. Našli so še drugo škatlo TATA blizu ''EYK1'' start kodona.
==Regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' je eritritol-inducibilen BDP==
Ustvarili so reporterski sistem, ki je temeljil na dveh reporterskih genih, ki sta kodirala za rumeni in rdeči fluorescenčni protein. Reporterski sistemi so testirali različne BDPje ali hibridne BDPje (HBDP) v obeh smereh transkripcije. Reporterski sistem so ustvarili s pomočjo GoldenGate sestavljanja. Uporabili so 6 biokock in vektor.
Prvo so ustvarili donorske vektorje, ki so vsebovali ''YFP-TLIP2'', ''RedStarII-TLIP2'', in intergensko regijo ''EYK1-EYL1'' (pEYK450) v smerni in protismerni transkripcijski orientaciji. To so naredili s pomnoževanjem PCR. Intergenska regija pEYK450 ima smerno orientacijo proti ''EYK1'' in protismerno orientacijo proti'' EYL1''. Vsaka pEYK450 z reporterskimi geni je bila vključena v vektor GGE114. Nastali so plazmidi ''GGAURA3ex-RedStarII-pEYK450-Fw-YFP'' (JME4766) in ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-Rv-YFP'' (JME4768) ter tudi hibridni plazmidi iz pEYK, pri čemer so nastali hibridni plazmidi ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-5AB-Fw-YFP'' (JME4891) in ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-5ABRv-YFP'' (JME4892).
Plazmide, so vstavili v ''Y. lipolytica''. Za vsak konstrukt so izolirali 48 transformantov. Fluorescenco YFP in RedStarII so merili med celično rastjo na minimalnem gojišču, ki je vsebovalo eritritol. Odstranili so nefluorescenčne transformante in transformante s previsoko fluorescenco (več integracij v genom). Za vsak konstrukt so izbrali 8 transformant in jih shranili v glivni Golden Gate zbirki. Fluorescenco so merili na bralcu mikrotitrskih plošč. Preverjali so moč in nivoje indukcije pEYK450 v obeh smereh.
Glive, ki so vsebovale fluorescenčno reportersko kaseto, so proizvajale rdečo in rumeno fluorescenco v obeh transkripcijskih orientacijah. Transkripcija v smeri ''EYL1'' je bila 3,5 in 2,7-krat večja kot v smeri proti ''EYK1''. Pri kontrolnem sevu so zaznali zanemarljive nivoje fluorescence.

==Indukcija pEYK450 je odvisna od koncentracije eritritola in eritruloze==
Glive so rastle v minimalnem gojišču z eritritolom ali eritrulozo v koncentraciji 0 g/L, 2,5 g/L in 5 g/L. Kot vir ogljika so uporabili glukozo v koncentraciji 5 g/L, da ne bi kot vira ogljika glive uporabljale eritritol ali eritrulozo. ''Y. lipolytica'' so naredili delecijo ''EYK1'', da ne bi že sam sev presnavljal eritritol in eritrulozo. Ko v gojišču ni bilo dodanega eritritola, pri ''Y. lipolytica'' niso zaznali niti rumene niti rdeče fluorescence. Ob dodatku eritritola so zaznali obe fluorescenci. Pri višji koncentraciji eritritola so zaznali močnejšo fluorescenco. Enake rezultate so dobili pri dodatku eritruloze. S tem so pokazali, da je indukcija odvisna od koncentracije eritritola ali eritruloze v gojišču.
==Hibridni pEYK450==
Prejšnje raziskave so pokazale, da se moč promotorja poveča, če hibridni promotor vsebuje več kopij zgornjega aktivacijskega zaporedja (Škatla A). V tej raziskavi so naredili hibridni promotor s petimi škatlami A. Promotor so poimenovali pEYK450-5AB, saj vsebuje 5 škatel A in 1 škatlo B. Promotor so vstavili v obeh smereh glede na fluorescenčne reporterske gene (''pEYK450-5AB-Fw'' in ''pEYK450-5AB-Rv''). Eksperiment so izvedli enako kot pri nehibridnem pEYK450. Promotor je bil tako močen, da je fluorescenca YFP presegla mejo detekcije. Merjenje fluorescence je pokazalo, da pEYK450-5AB proizvaja fluorescenco v obojesmerni transkripcijski orientaciji. Ekspresija v smeri ''EYL1'' je bila 2-krat večja kot v smeri ''EYK1'', kar je enako razmerje kot pri nehibridnem promotorju. V primerjavi z nehibridnim promtorjem je imel hibridni promotor 19,2 – krat večjo moč v smeri ''EYK1'' in 10,8 – krat večjo moč v smeri ''EYL1''. To je potrdilo, da tendemne ponovitve UAS1-eyk1 močno povečajo moč promotorja v obe smeri transkripcije.
Naredili so tudi poskus, kjer so primerjali moč izražanja enosmernega promotorja pEYK300 s hibridnim promotorjem pEYK300-5AB. Ugotovili so, da se tudi v tem primeru moč izražanja poveča pri hibridnem, in sicer za približno 12 – krat.
==Moč promotorja pEYK450‑5AB je v mikrobioreaktorjih odvisna od sestave gojišča==
Raziskovali so, če bi lahko uporabili pEYK450-5AB v mikrobioreaktorjih pri pogojih visoke gostote kulture, kar je pogosto v industriji. Najvišjo gostoto celic so dosegli z uporabo gojišča, ki je vsebovalo glukozo v koncentraciji 50 g/L. Fluorescenca se je poviševala s poviševanjem koncentracije glukoze v gojišču, dokler ni dosegla plato (50 g/l). Podobne rezultate so dobili pri gojišču z glicerolom, kjer so plato dosegli pri 80 g/ L. Raziskave so pokazale, da je največja moč dvosmernega promotorja pri pogojih visoke gostote kulture.

=Literatura=

1. E. A. Johnson, C. Echavarri-Erasun: Yeast Biotechnology. The Yeasts '''2011''', 1, str. 21–44.

2. N. Gohil, G. Bhattacharjee, V. Singh: An introduction to microbial cell factories for production of biomolecules. Microb. Cell Factories Eng. Prod. Biomol. '''2021''', str. 1–19.

3. L. Vidal, et al. : Bidirectional hybrid erythritol-inducible promoter for synthetic biology in Yarrowia lipolytica. Microb. Cell Fact. '''2023''', 22(1), str. 1–17.

4. W. O. Bernt, J. F. Borzelleca, G. Flamm, I. C. Munro: Erythritol: A review of biological and toxicological studies. Regul. Toxicol. Pharmacol. '''1996''', 24(2 II), str. 191–197.

Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v Yarrowia lipolytica

2023-05-08T06:12:49Z

Masa andoljsek: /* Uvod */

Povzeto po članku: [https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-023-02020-6 ''L. Vidal, et al. : Bidirectional hybrid erythritol-inducible promoter for synthetic biology in Yarrowia lipolytica. Microb. Cell Fact. '''2023''', 22(1), str. 1–17.'']

=Uvod=
''Yarrowia lipolytica'' je askomicetna gliva, ki se zelo pogosto uporablja v biotehnologiji [1]. Ima sposobnost presnavljanja nestandarnih substratov, kot so polialkoholi, organske kisline, dolgoverižni ogljikovodiki, organski odpadki, glicerol, etanol ipd. [1, 2]. Proizvaja veliko lipolitičnih encimov, ki so uporabni v različnih industrijah [1]. V industriji se uporablja tudi za proizvodnjo polinenasičenih maščobnih kislin, biogoriv, sekundarnih metabolitov, ipd. [2]. Zaradi teh lastnosti se z različnimi metodami editira genom ''Y. lipolytica''. Primeri so: Golden Gate sestavljanje (GGA), tehnologija CRISPR-Cas9 in kapljična mikrofluidika. Obstaja tudi knjižnica promotorjev, ki se uporabljajo v omenjeni glivi. Raziskovalci iz članka so si želeli izboljšati gensko ekspresijo za industrijsko uporabo, zato so poskušali sintetizirati nov, boljši promotor [3].
==Katabolizem eritritola==
Eritritol je poliol, ki se v prehrani pogosto uporablja kot nizko kalorični nadomestek sladkorja. V naravi je široko prisoten in se nahaja v mnogih živilih [4].
Katabolizem eritritola v ''Y. lipolytica'' se začne z eritritolno dehidrogenazo, ki jo kodira gen ''EYD1''. Ta encim pretvarja eritritol v eritrulozo. Nato eritrulozo fosforilira eritruloza kinaza, ki jo kodira gen ''EYK1''. Produkt je L-eritruloza-1P, ki jo L-eritruloza-1P izomeraza (ki je kodirana z genom ''EYL2''), pretvori v eritroza-4P. V zadnjem koraku sodeluje encim D-eritruloza-4P, ki jo kodira gen ''EXL1'', in pretvori produkt v eritroza-4P. Predvidevajo, da gen ''EUF1'' kodira za transkripcijski faktor, ki sodeluje pri presnovi eritritola. Vsi našteti geni so zapisani na kromosomu F v regiji, ki se imenuje skupek za presnovo eritritola. Izražanje teh genov inducirata eritritol in eritruloza.
Pred kratkim so okarakterizirali zgornje aktivacijsko zaporedje (UAS), ki je povezano z genoma ''EYK1'' in ''EYD1''. To so odkrili tako, da so s filogenetskimi analizami in mutagenezo identificirali ohranjene regulatorne motive. Nato so uporabili rumeni fluorescenčni protein (YFP) in rdeči fluorescenčni protein (RedStarII), ki sta pokazala vzorce izražanja za nativne in z eritritolom inducirane promotorje. Določili so strukturo promotorja EXK1 in tudi njegovo inducibilnost z eritritolom in eritrulozo, ki poteka preko UAS-eyk1 (imenovano tudi škatla A). Nadaljnje analize katabolizma eritritola so pokazale, da je pEYK promotor za ''EYK1'' in tudi za ''EYL1''. To pomeni, da je pEYK dvosmerni promotor (BDP). To je DNA zaporedje, ki omogoča prepis DNA v obe smeri. Temu procesu se reče divergentna transkripcija. Te BDPje regulira baker, zato ga ne morejo uporabiti v industrijski rabi.
V študiji so naredili nov z eritritolom induciran hibridni BDP za uporabo v ''Y. lipolytica''. Ustvarili so naravne in hibridne BDP biokocke z uporabo pEYK. Naredili so jih kompatibilne s kloniranjem na način Golden Gate. Izražanje je bilo zaznano v obeh transkripcijskih smereh (Uporabili so fluorescenčna reporterska proteina (YFP and RedStarII)).

=Rezultati=

==Skupek za presnovo eritritola vsebuje dvosmerni promotor==
V skupku za presnovo eritritola so identificirali 3 pare divergentnih genov: YALI0F01540g in ''EUF1, EYK1'' in ''EYL1'', ter ''EYD1'' in YALI0F01672g. Nato so primerjali skupke treh različnih sevov ''Y. lipolytica''. S prileganjem zaporedij so ugotovili, da sta bila gena YALI0F01540g in YALI0F01672g narobe napovedana in anotirana (nimata enakega start kodona pri različnih sevih, dolžina pa je bila med 3 000 in 4 000 baznih parov). Analiza je pokazala, da je regija med ''EYK1'' in ''EYKL1'' dolga 438 baznih parov. V evkariontih je UAS lociran med – 1000 in + 50 mesta od začetnega mesta za transkripcijo.
Intergenska regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' je bila preučevana že v preteklosti, a so se osredotočili le na enosmerni promotor pEYK. Že takrat so pokazali, da je pEYK z eritritolom induciran promotor. Škatla TATA je bila identificirana blizu ''EYK1'' start kodona. Primerjali so intergensko zaporedje regije med 5 različnimi sevi rodu ''Yarrowia''. Našli so še drugo škatlo TATA blizu ''EYK1'' start kodona.
==Regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' je eritritol-inducibilen BDP==
Ustvarili so reporterski sistem, ki je temeljil na dveh reporterskih genih, ki sta kodirala za rumeni in rdeči fluorescenčni protein. Reporterski sistemi so testirali različne BDPje ali hibridne BDPje (HBDP) v obeh smereh transkripcije. Reporterski sistem so ustvarili s pomočjo GoldenGate sestavljanja. Uporabili so 6 biokock in vektor.
Prvo so ustvarili donorske vektorje, ki so vsebovali ''YFP-TLIP2'', ''RedStarII-TLIP2'', in intergensko regijo ''EYK1-EYL1'' (pEYK450) v smerni in protismerni transkripcijski orientaciji. To so naredili s pomnoževanjem PCR. Intergenska regija pEYK450 ima smerno orientacijo proti ''EYK1'' in protismerno orientacijo proti'' EYL1''. Vsaka pEYK450 z reporterskimi geni je bila vključena v vektor GGE114. Nastali so plazmidi ''GGAURA3ex-RedStarII-pEYK450-Fw-YFP'' (JME4766) in ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-Rv-YFP'' (JME4768) ter tudi hibridni plazmidi iz pEYK, pri čemer so nastali hibridni plazmidi ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-5AB-Fw-YFP'' (JME4891) in ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-5ABRv-YFP'' (JME4892).
Plazmide, so vstavili v ''Y. lipolytica''. Za vsak konstrukt so izolirali 48 transformantov. Fluorescenco YFP in RedStarII so merili med celično rastjo na minimalnem gojišču, ki je vsebovalo eritritol. Odstranili so nefluorescenčne transformante in transformante s previsoko fluorescenco (več integracij v genom). Za vsak konstrukt so izbrali 8 transformant in jih shranili v glivni Golden Gate zbirki. Fluorescenco so merili na bralcu mikrotitrskih plošč. Preverjali so moč in nivoje indukcije pEYK450 v obeh smereh.
Glive, ki so vsebovale fluorescenčno reportersko kaseto, so proizvajale rdečo in rumeno fluorescenco v obeh transkripcijskih orientacijah. Transkripcija v smeri ''EYL1'' je bila 3,5 in 2,7-krat večja kot v smeri proti ''EYK1''. Pri kontrolnem sevu so zaznali zanemarljive nivoje fluorescence.

==Indukcija pEYK450 je odvisna od koncentracije eritritola in eritruloze==
Glive so rastle v minimalnem gojišču z eritritolom ali eritrulozo v koncentraciji 0 g/L, 2,5 g/L in 5 g/L. Kot vir ogljika so uporabili glukozo v koncentraciji 5 g/L, da ne bi kot vira ogljika glive uporabljale eritritol ali eritrulozo. ''Y. lipolytica'' so naredili delecijo ''EYK1'', da ne bi že sam sev presnavljal eritritol in eritrulozo. Ko v gojišču ni bilo dodanega eritritola, pri ''Y. lipolytica'' niso zaznali niti rumene niti rdeče fluorescence. Ob dodatku eritritola so zaznali obe fluorescenci. Pri višji koncentraciji eritritola so zaznali močnejšo fluorescenco. Enake rezultate so dobili pri dodatku eritruloze. S tem so pokazali, da je indukcija odvisna od koncentracije eritritola ali eritruloze v gojišču.
==Hibridni pEYK450==
Prejšnje raziskave so pokazale, da se moč promotorja poveča, če hibridni promotor vsebuje več kopij zgornjega aktivacijskega zaporedja (Škatla A). V tej raziskavi so naredili hibridni promotor s petimi škatlami A. Promotor so poimenovali pEYK450-5AB, saj vsebuje 5 škatel A in 1 škatlo B. Promotor so vstavili v obeh smereh glede na fluorescenčne reporterske gene (''pEYK450-5AB-Fw'' in ''pEYK450-5AB-Rv''). Eksperiment so izvedli enako kot pri nehibridnem pEYK450. Promotor je bil tako močen, da je fluorescenca YFP presegla mejo detekcije. Merjenje fluorescence je pokazalo, da pEYK450-5AB proizvaja fluorescenco v obojesmerni transkripcijski orientaciji. Ekspresija v smeri ''EYL1'' je bila 2-krat večja kot v smeri ''EYK1'', kar je enako razmerje kot pri nehibridnem promotorju. V primerjavi z nehibridnim promtorjem je imel hibridni promotor 19,2 – krat večjo moč v smeri ''EYK1'' in 10,8 – krat večjo moč v smeri ''EYL1''. To je potrdilo, da tendemne ponovitve UAS1-eyk1 močno povečajo moč promotorja v obe smeri transkripcije.
Naredili so tudi poskus, kjer so primerjali moč izražanja enosmernega promotorja pEYK300 s hibridnim promotorjem pEYK300-5AB. Ugotovili so, da se tudi v tem primeru moč izražanja poveča pri hibridnem, in sicer za približno 12 – krat.
==Moč promotorja pEYK450‑5AB je v mikrobioreaktorjih odvisna od sestave gojišča==
Raziskovali so, če bi lahko uporabili pEYK450-5AB v mikrobioreaktorjih pri pogojih visoke gostote kulture, kar je pogosto v industriji. Najvišjo gostoto celic so dosegli z uporabo gojišča, ki je vsebovalo glukozo v koncentraciji 50 g/L. Fluorescenca se je poviševala s poviševanjem koncentracije glukoze v gojišču, dokler ni dosegla plato (50 g/l). Podobne rezultate so dobili pri gojišču z glicerolom, kjer so plato dosegli pri 80 g/ L. Raziskave so pokazale, da je največja moč dvosmernega promotorja pri pogojih visoke gostote kulture.

=Literatura=

1. E. A. Johnson, C. Echavarri-Erasun: Yeast Biotechnology. The Yeasts '''2011''', 1, str. 21–44.

2. N. Gohil, G. Bhattacharjee, V. Singh: An introduction to microbial cell factories for production of biomolecules. Microb. Cell Factories Eng. Prod. Biomol. '''2021''', str. 1–19.

3. L. Vidal, et al. : Bidirectional hybrid erythritol-inducible promoter for synthetic biology in Yarrowia lipolytica. Microb. Cell Fact. '''2023''', 22(1), str. 1–17.

4. W. O. Bernt, J. F. Borzelleca, G. Flamm, I. C. Munro: Erythritol: A review of biological and toxicological studies. Regul. Toxicol. Pharmacol. '''1996''', 24(2 II), str. 191–197.

Seminarji SB 2022/23

2023-05-07T22:09:33Z

Masa andoljsek:

V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_tumor_ciljajočih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_dušikov(II)_oksid Priprava tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljeni_ribocim%2C_ki_signale_nativnih_RNA_pove%C5%BEe_z_ortogonalnimi_proteinskimi_izhodnimi_signali Razcepljeni ribocim, ki signale nativnih RNA poveže z ortogonalnimi proteinskimi izhodnimi signali] (Ajda Beltram)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_nadzor_%C5%A1tevila_plazmidov_v_celici_%28Tulip%29 Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)] (Gregor Strniša)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Skupnostna_znanost_je_na%C4%8Drtovala_ribosome_s_koristnimi_fenotipi Skupnostna znanost je načrtovala ribosome s koristnimi fenotipi] (Tanja Gošnjak)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pristop_sintezne_biologije_za_načrtovanje_kandidata_za_cepivo_proti_delta_različici_SARSCoV2_je_razkril_motnjo_favoriziranega_para_kodonov_kot_boljšo_strategijo_pred_uporabo_redkih_kodonov Pristop sintezne biologije za načrtovanje kandidata za cepivo proti delta različici SARS-CoV-2 je razkril motnjo favoriziranega para kodonov kot boljšo strategijo pred uporabo redkih kodonov] (Stefanija Ivanova)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Dvosmerni_hibridni_eritritol_–_inducibilni_promotor_za_sintezno_biologijo_v_Yarrowia_lipolytica Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v ''Yarrowia lipolytica''] (Maša Andoljšek)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NETLANTIS NETLANTIS] (Maša Gabrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BINANOX BINANOX] (Vivian Nemanič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CoBiota CoBiota] (Petra Sintič)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].

Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v Yarrowia lipolytica

2023-05-07T22:09:13Z

Masa andoljsek: New page: Povzeto po članku: [https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-023-02020-6 ''L. Vidal, et al. : Bidirectional hybrid erythritol-inducible promoter for synth...

Povzeto po članku: [https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-023-02020-6 ''L. Vidal, et al. : Bidirectional hybrid erythritol-inducible promoter for synthetic biology in Yarrowia lipolytica. Microb. Cell Fact. '''2023''', 22(1), str. 1–17.'']

=Uvod=
''Yarrowia lipolytica'' je askomicetna gliva, ki se zelo pogosto uporablja v biotehnologiji1. Ima sposobnost presnavljanja nestandarnih substratov, kot so polialkoholi, organske kisline, dolgoverižni ogljikovodiki, organski odpadki, glicerol, etanol ipd. [1, 2]. Proizvaja veliko lipolitičnih encimov, ki so uporabni v različnih industrijah [1]. V industriji se uporablja tudi za proizvodnjo polinenasičenih maščobnih kislin, biogoriv, sekundarnih metabolitov, ipd. [2]. Zaradi teh lastnosti se z različnimi metodami editira genom Y. lipolytica. Primeri so: Golden Gate sestavljanje (GGA), tehnologija CRISPR-Cas9 in kapljična mikrofluidika. Obstaja tudi knjižnica promotorjev, ki se uporabljajo v omenjeni glivi. Raziskovalci iz članka so si želeli izboljšati gensko ekspresijo za industrijsko uporabo, zato so poskušali sintetizirati nov, boljši promotor [3].
==Katabolizem eritritola==
Eritritol je poliol, ki se v prehrani pogosto uporablja kot nizko kalorični nadomestek sladkorja. V naravi je široko prisoten in se nahaja v mnogih živilih [4].
Katabolizem eritritola v ''Y. lipolytica'' se začne z eritritolno dehidrogenazo, ki jo kodira gen ''EYD1''. Ta encim pretvarja eritritol v eritrulozo. Nato eritrulozo fosforilira eritruloza kinaza, ki jo kodira gen ''EYK1''. Produkt je L-eritruloza-1P, ki jo L-eritruloza-1P izomeraza (ki je kodirana z genom ''EYL2''), pretvori v eritroza-4P. V zadnjem koraku sodeluje encim D-eritruloza-4P, ki jo kodira gen ''EXL1'', in pretvori produkt v eritroza-4P. Predvidevajo, da gen ''EUF1'' kodira za transkripcijski faktor, pri sodeluje pri presnovi eritritola. Vsi našteti geni so zapisani na kromosomu F v regiji, ki se imenuje skupek za presnovo eritritola. Izražanje teh genov inducirata eritritol in eritruloza.
Pred kratkim so okarakterizirali zgornje aktivacijsko zaporedje (UAS), ki je povezano z ''EYK1'' in ''EYD1''. To so odkrili tako, da so s filogenetskimi analizami in mutagenezo identificirali ohranjene regulatorne motive. Nato so uporabili rumeni fluorescenčni protein (YFP) in rdeči fluorescenčni protein (RedStarII), ki sta pokazala vzorce izražanja za nativne in z eritritolom inducirane promotorje. Določili so strukturo promotorja EXK1 in tudi njegovo inducibilnost z eritritolom in eritrulozo, ki poteka preko UAS-eyk1 (imenovano tudi škatla A). Nadaljnje analize katabolizma eritritola so pokazale, da je pEYK promotor za ''EYK1'' in tudi za ''EYL1''. To pomeni, da je pEYK dvosmerni promotor (BDP). To je DNA zaporedje, ki omogoča prepis DNA v obe smeri. Temu procesu se reče divergentna transkripcija. Te BDPje regulira baker, zato se ne morejo uporabiti v industrijski rabi.
V študiji so naredili nov z eritritolom induciran hibridni BDP za uporabo v ''Y. lipolytica''. Ustvarili so naravne in hibridne BDP biokocke z uporabo pEYK. Naredili so jih kompatibilne s kloniranjem na način Golden Gate. Izražanje je bilo zaznano v obeh transkripcijskih smereh (Uporabili so fluorescenčna reporterska proteina (YFP and RedStarII)).
=Rezultati=

==Skupek za presnovo eritritola vsebuje dvosmerni promotor==
V skupku za presnovo eritritola so identificirali 3 pare divergentnih genov: YALI0F01540g in ''EUF1, EYK1'' in ''EYL1'', ter ''EYD1'' in YALI0F01672g. Nato so primerjali skupke treh različnih sevov ''Y. lipolytica''. S prileganjem zaporedij so ugotovili, da sta bila gena YALI0F01540g in YALI0F01672g narobe napovedana in anotirana (nimata enakega start kodona pri različnih sevih, dolžina pa je bila med 3 000 in 4 000 baznih parov). Analiza je pokazala, da je regija med ''EYK1'' in ''EYKL1'' dolga 438 baznih parov. V evkariontih je UAS lociran med – 1000 in + 50 mesta od začetnega mesta za transkripcijo.
Intergenska regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' je bila preučevana že v preteklosti, a so se osredotočili le na enosmerni promotor pEYK. Že takrat so pokazali, da je pEYK z eritritolom induciran promotor. Škatla TATA je bila identificirana blizu ''EYK1'' start kodona. Primerjali so intergensko zaporedje regije med 5 različnimi sevi rodu ''Yarrowia''. Našli so še drugo škatlo TATA blizu ''EYK1'' start kodona.
==Regija med ''EYK1'' in ''EYL1'' je eritritol-inducibilen BDP==
Ustvarili so reporterski sistem, ki je temeljil na dveh reporterskih genih, ki sta kodirala za rumeni in rdeči fluorescenčni protein. Reporterski sistemi so testirali različne BDPje ali hibridne BDPje (HBDP) v obeh smereh transkripcije. Reporterski sistem so ustvarili s pomočjo GoldenGate sestavljanja. Uporabili so 6 biokock in vektor.
Prvo so ustvarili donorske vektorje, ki so vsebovali ''YFP-TLIP2'', ''RedStarII-TLIP2'', in intergensko regijo ''EYK1-EYL1'' (pEYK450) v smerni in protismerni transkripcijski orientaciji. To so naredili s pomnoževanjem PCR. Intergenska regija pEYK450 ima smerno orientacijo proti ''EYK1'' in protismerno orientacijo proti'' EYL1''. Vsaka pEYK450 z reporterskimi geni je bila vključena v vektor GGE114. Nastali so plazmidi ''GGAURA3ex-RedStarII-pEYK450-Fw-YFP'' (JME4766) in ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-Rv-YFP'' (JME4768) ter tudi hibridni plazmidi iz pEYK, pri čemer so nastali hibridni plazmidi ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-5AB-Fw-YFP'' (JME4891) in ''GGA-URA3ex-RedStarII-pEYK450-5ABRv-YFP'' (JME4892).
Plazmide, so vstavili v ''Y. lipolytica''. Za vsak konstrukt so izolirali 48 transformantov. Fluorescenco YFP in RedStarII so merili med celično rastjo na minimalnem gojišču, ki je vsebovalo eritritol. Odstranili so nefluorescenčne transformante in transformante s previsoko fluorescenco (več integracij v genom). Za vsak konstrukt so izbrali 8 transformant in jih shranili v glivni Golden Gate zbirki. Fluorescenco so merili na bralcu mikrotitrskih plošč. Preverjali so moč in nivoje indukcije pEYK450 v obeh smereh.
Glive, ki so vsebovale fluorescenčno reportersko kaseto, so proizvajale rdečo in rumeno fluorescenco v obeh transkripcijskih orientacijah. Transkripcija v smeri ''EYL1'' je bila 3,5 in 2,7-krat večja kot v smeri proti ''EYK1''. Pri kontrolnem sevu so zaznali zanemarljive nivoje fluorescence.

==Indukcija pEYK450 je odvisna od koncentracije eritritola in eritruloze==
Glive so rastle v minimalnem gojišču z eritritolom ali eritrulozo v koncentraciji 0 g/L, 2,5 g/L in 5 g/L. Kot vir ogljika so uporabili glukozo v koncentraciji 5 g/L, da ne bi kot vira ogljika glive uporabljale eritritol ali eritrulozo. ''Y. lipolytica'' so naredili delecijo ''EYK1'', da ne bi že sam sev presnavljal eritritol in eritrulozo. Ko v gojišču ni bilo dodanega eritritola, pri ''Y. lipolytica'' niso zaznali niti rumene niti rdeče fluorescence. Ob dodatku eritritola so zaznali obe fluorescenci. Pri višji koncentraciji eritritola so zaznali močnejšo fluorescenco. Enake rezultate so dobili pri dodatku eritruloze. S tem so pokazali, da je indukcija odvisna od koncentracije eritritola ali eritruloze v gojišču.
==Hibridni pEYK450==
Prejšnje raziskave so pokazale, da se moč promotorja poveča, če hibridni promotor vsebuje več kopij zgornjega aktivacijskega zaporedja (Škatla A). V tej raziskavi so naredili hibridni promotor s petimi škatlami A. Promotor so poimenovali pEYK450-5AB, saj vsebuje 5 škatel A in 1 škatlo B. Promotor so vstavili v obeh smereh glede na fluorescenčne reporterske gene (''pEYK450-5AB-Fw'' in ''pEYK450-5AB-Rv''). Eksperiment so izvedli enako kot pri nehibridnem pEYK450. Promotor je bil tako močen, da je fluorescenca YFP presegla mejo detekcije. Merjenje fluorescence je pokazalo, da pEYK450-5AB proizvaja fluorescenco v obojesmerni transkripcijski orientaciji. Ekspresija v smeri ''EYL1'' je bila 2-krat večja kot v smeri ''EYK1'', kar je enako razmerje kot pri nehibridnem promotorju. V primerjavi z nehibridnim promtorjem je imel hibridni promotor 19,2 – krat večjo moč v smeri ''EYK1'' in 10,8 – krat večjo moč v smeri ''EYL1''. To je potrdilo, da tendemne ponovitve UAS1-eyk1 močno povečajo moč promotorja v obe smeri transkripcije.
Naredili so tudi poskus, kjer so primerjali moč izražanja enosmernega promotorja pEYK300 s hibridnim promotorjem pEYK300-5AB. Ugotovili so, da se tudi v tem primeru moč izražanja poveča pri hibridnem, in sicer za približno 12 – krat.
==Moč promotorja pEYK450‑5AB je v mikrobioreaktorjih odvisna od sestave gojišča==
Raziskovali so, če bi lahko uporabili pEYK450-5AB v mikrobioreaktorjih pri pogojih visoke gostote kulture, kar je pogosto v industriji. Najvišjo gostoto celic so dosegli z uporabo gojišča, ki je vsebovalo glukozo v koncentraciji 50 g/L. Fluorescenca se je poviševala s poviševanjem koncentracije glukoze v gojišču, dokler ni dosegla plato (50 g/l). Podobne rezultate so dobili pri gojišču z glicerolom, kjer so plato dosegli pri 80 g/ L. Raziskave so pokazale, da je največja moč dvosmernega promotorja pri pogojih visoke gostote kulture.

=Literatura=

1. E. A. Johnson, C. Echavarri-Erasun: Yeast Biotechnology. The Yeasts '''2011''', 1, str. 21–44.

2. N. Gohil, G. Bhattacharjee, V. Singh: An introduction to microbial cell factories for production of biomolecules. Microb. Cell Factories Eng. Prod. Biomol. '''2021''', str. 1–19.

3. L. Vidal, et al. : Bidirectional hybrid erythritol-inducible promoter for synthetic biology in Yarrowia lipolytica. Microb. Cell Fact. '''2023''', 22(1), str. 1–17.

4. W. O. Bernt, J. F. Borzelleca, G. Flamm, I. C. Munro: Erythritol: A review of biological and toxicological studies. Regul. Toxicol. Pharmacol. '''1996''', 24(2 II), str. 191–197.

Seminarji SB 2022/23

2023-05-07T22:08:50Z

Masa andoljsek:

V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_tumor_ciljajočih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_dušikov(II)_oksid Priprava tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljeni_ribocim%2C_ki_signale_nativnih_RNA_pove%C5%BEe_z_ortogonalnimi_proteinskimi_izhodnimi_signali Razcepljeni ribocim, ki signale nativnih RNA poveže z ortogonalnimi proteinskimi izhodnimi signali] (Ajda Beltram)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_nadzor_%C5%A1tevila_plazmidov_v_celici_%28Tulip%29 Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)] (Gregor Strniša)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Skupnostna_znanost_je_na%C4%8Drtovala_ribosome_s_koristnimi_fenotipi Skupnostna znanost je načrtovala ribosome s koristnimi fenotipi] (Tanja Gošnjak)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pristop_sintezne_biologije_za_načrtovanje_kandidata_za_cepivo_proti_delta_različici_SARSCoV2_je_razkril_motnjo_favoriziranega_para_kodonov_kot_boljšo_strategijo_pred_uporabo_redkih_kodonov Pristop sintezne biologije za načrtovanje kandidata za cepivo proti delta različici SARS-CoV-2 je razkril motnjo favoriziranega para kodonov kot boljšo strategijo pred uporabo redkih kodonov] (Stefanija Ivanova)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Dvosmerni_hibridni_eritritol_–_inducibilni_promotor_za_sintezno_biologijo_v_Yarrowia_lipolytica Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v ''Yarrowia lipolytica''] (Maša Andoljšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Dvosmerni Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v ''Yarrowia lipolytica''] (Maša Andoljšek)
NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NETLANTIS NETLANTIS] (Maša Gabrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BINANOX BINANOX] (Vivian Nemanič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CoBiota CoBiota] (Petra Sintič)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].

2023-01-07T11:36:05Z

Masa andoljsek:

Ferocen

2023-01-07T11:35:50Z

Masa andoljsek: