https://wiki.fkkt.uni-lj.si/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=Mateja+Cigoj 2026-04-10T07:56:55Z User contributions MediaWiki 1.39.3 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BiotINK_-_nov_pristop_k_biotiskanju_tkiva&diff=11962 2016-12-04T15:31:30Z

<p>Mateja Cigoj: /* Ligandi za membranske proteine  */</p> <hr /> <div>LMU-TUM München: BiotINK - rethINK tissue printing, http://2016.igem.org/Team:LMU-TUM_Munich <br /> <br /> == Tehnologija biotiskanja ==<br /> <br /> Biotiskanje je postopek priprave večplastnih celičnih struktur in uporabo tehnologije 3D tiskanja. Biotiskanje predstavlja velik doprinos na področju regnerativne medicine, ker omogoča izdelavo tkivnih presadkov iz bolnikovih lastnih celic. Poleg tega so tkivni modeli uporabni tudi za potrebe farmakoloških in toksikoloških študij ter za študije razvoja bolezni. Današnja tehnologija biotiskanja omogoča pripravo nekaterih enostavnejših tkiv, na primer večplastnih modelov kože, hrustanca, kosti, žil in sapnika. Tiskanje popolnih funkcionalnih organov trenutno še ni mogoče, zaradi kompleksnosti različnih celičnih struktur.  <br /> <br /> Večina tehnik biotiskanja temelji na nanašanju celic na podporni matriks, ki predstavlja oporo za celice in oblikuje strukturo tkiva. Po določenem času začnejo celice oblikovati intercelularne kontakte in začnejo rasti v dvodimenzionalnih celičnih plasteh. Za rekonstrukcijo tkiva se morajo celične plasti medsebojno povezati in podporno ogrodje pa se razgradi ter nadomesti s komponentami zunajceličnega matriksa, ki jih sintetizirajo celice. Biotiskanje je tehnično gledano kompleksen, dolgotrajen in drag proces, ki je še v fazi razvoja. En od glavnih izzivov ostaja izbira primernega podpornega materiala za izdelavo celičnega ogrodja, ki bo kompatibilno z biološkim okoljem v katerega ga vgradimo.  <br /> <br /> Skupina študentov iz Münchna je za tekmovanje iGEM si je postavila cilj izboljšati tehniko biotiskanja, da bo postopek hitrejši, cenejši in bolj učinkovit. Zamislili so si sistem v katerem celice na površini izražajo receptorje z vezanim avidinom oz. molekulami biotina in medij, ki vsebuje streptavidin oz. biotinilirane proteine. Interakcija med molekulami biotina in streptavidina, s kostanto disociacije 10&lt;sup&gt;-15&lt;/sup&gt; M, je ena izmed najmočnejših bioloških interakcij (za primerjavo je konstanta disociacije protiteles v območju 10&lt;sup&gt;-7&lt;/sup&gt; – 10&lt;sup&gt;-11&lt;/sup&gt; M). Prednost takšnega sistema je, da celice ne potrebujejo podpornega ogrodja, na katere bi jih nanašali, temveč interakcije med omenjenimi celičnimi receptorji in ligandi v mediju omogočijo takojšnje premreženje celic tekom samega tiskanja in nastanek stabilnih tridimenzionalnih celičnih struktur.  <br /> <br /> == Membranski proteini == <br />  <br /> Na celicah so izrazili dva tipa membranskih proteinov (receptorjev), ki bi omogočali polimerizacijo celic: <br /> * Receptor z biotin akceptorskim peptidom (BAP), ki omogoča reakcije z streptavidinom in drugimi variantami avidina. BAP je 15 aminokislin dolg peptid, ki izvira iz E.coli. Biotiniliranje peptida je potekalo endogeno s soizraženo bakterijsko biotin ligazo BirA. <br /> * Receptor z avidinsko podenoto, ki omogoča povezovanje z biotiniliranimi proteini. Testiral so dve različici avidina in sicer monomerni avidin, ki predstavlja eno samo podenoto tetramernega avidina in t.i. enoverižni avidin (scAvidin), ki je podoben naravnemu avidinu, z razliko da je sestavljen zgolj iz ene polipeptidne verige. <br /> <br /> ===Priprava konstruktov===<br /> <br /> Za receptorske proteine so pripravili konstrukte, ki so vsebovali CMV promotor, signalni peptid BM40, funkcionalni membranski protein in poliadenilacijski signal.  <br /> Za sidranje proteina v celično membrano so uporabili transmembransko regijo EGF receptorja (BBa_K157002), kateri so na C-konec dodali t.i. stop-transfer sekvenco, iz naravnega EGF receptorja in fleksibilne povezovalce (GGGGC)2 na obeh koncih. Za preverjanje pravilne ekspresije in lokalizacije receptorja, so v receptorski konstrukt vnesli 3 elemente za detekcijo: rdeči fluorescenčni protein mRuby 3 za detekcijo receptorja s fluorescenčnim mikroskopom, epitop za A3C5 protitelesa za imunokemično detekcijo in Strep-tag II oznako za detekcijo in čiščenje z imunokemijskimi metodami. <br /> <br /> Konstrukte so testirali v MEXiTM celični liniji, ki omogoča semi-stabilno transfekcijo. Gre za suspenzijo humane celične linije HEK293E, ki ima v genomu vgrajen virusni protein EBNA1 iz Eppstein-Barr virusa, ki uravnava iniciacijo replikacije virusa in skrbi za ohranjanje virusne DNA v gostiteljski celici. MEXiTM celična linija vsebuje vektorski plazmid pDSG-IBA, katerega začetno mesto replikacije (ORI) prepozna protein EBNA1, ki pritegne faktorje replikacije in sproži podvajanje plazmida. Receptorske konstrukte so klonirali v pDSG-iGEM plazmid in transficirali MEXi celice. Transfekcijo so izvedli s kationskim polimerom polietilen iminom, ki tvori kompleks z negativno nabito DNA, ki lahko ustopa v celico prek endocitoze.  <br /> <br /> Kasneje so konstrukte vključili tudi v genom celic. Za ta namen so uporabili sistem FlpIn™. Gre za tri-komponentni sistem, v katerem nastopajo HEK-TRex™-293 celice z kromosomskim Flp rekobinacijskim mestom, plazmid z zapisom za Flp rekombinazo in plazmid z želenim vključkom, ki tudi vsebuje Flp rekombinacijsko mesto, ki omogoča vgraditev v tarčni kromosom. Celice, ki uspešno integrirajo plazmid v svoj genom izgubijo rezistenco na Zeocin™, obenem pa pridobijo odpornost na higromicin B, ker plazmid nosi zapis za higromicin-fosfotransferazo, ki s svojo kinazno aktivnostjo inaktivira higromicin B.  <br /> <br /> == Ligandi za membranske proteine ==<br /> V bakterijah E.coli so izrazili štirih različne variente avidina.  <br />   <br /> * Streptavidin divjega tipa, ki vsebuje 4 vezavna mesta za biotin.  <br /> * Traptavidin, ki se od streptavidina razlikuje v dveh točkovnih mutacijah, ki povzročita povečano afiniteto  do biotina. Poleg tega ima traptavidin izboljšano termostabilnost in funkcionalnost pri višjih temperaturah (TM~10 °C višja). <br /> * Streptacin, ki vsebuje 8 aminokislin dolgo strep-tag oznako, ki omogoča enostavno in učinkovito čiščenje z afinitetno kromatografijo. <br /> * Monomeni avidin (eMA), ki lahko veže le eno biotinsko molekulo, kar prepreči nastanek neželenih prečnih povezav z biotinskimi konjugati. <br />   <br /> Vezavne lastnosti posameznih variant avidina so ovrednotili s fluorescenčno titracijo. To je metoda pri kateri titriramo protein z ligandom in ob spremljanju spremembe intrinzične fluorescence proteina. Iz eksperimentalnih podatkov so izračunali konstante disociacije KD, s katerimi so ovrednotili afinitete vezave. Najvišjo afiniteto je kazal monomerni avidin. <br /> <br /> Pripravili so tudi različne biotinilirane proteine. <br /> <br /> * PAS-lizin, ki je polipeptid sestavljen iz ponovitev prolin-alanin-serin z lizinom na vsakem 20 mestu, katerega lahko biotiniliramo. <br /> * Zeleni fluorescirajoči protein (GFP), ki omogoča opazovanje poteka polimerizacije pod fluorescenčnim mikroskopom. <br /> * Goveji serumski albumin (BSA), ki je pogosto uporabljan v laboratoriju kot proteinski standard, ker vsebuje 60 lizinskih ostankov in je dobro topen je tudi potencialno primeren kot biotiniliran povezovalec za celice. <br /> <br /> Za biotinilacijo proteinov so uporabili biotin, ki je zaestren z N-hidroksisucinimidno skupino (biotin-NHS). NHS estri lahko zreagirajo z primarnimi ali sekundarnimi amini prek SN2 reakcijskega mehanizma, pri čemer pride do tvorbe amidne vezi. (NSH estri se veliko uporabljajo za konjugiranje proteinov z fluorescenčnimi barvili ali biotinom.) Da bi zaščitili biotinilirane proteine pred delovanjem serumske biotinidaze (encim, ki odceplja biotin) so uporabili različne derivate biotina odporne na cepitev. <br /> <br /> == Polimerizacijski poizkusi ==<br /> Pri polimerizacijskih poizkusih so uporabili celice, ki so na površini izražale scAvidin, kot liganda pa sta služila biotiniliran BSA in streptavidin. Prve eksperimente niso izvajali s printerjem ampak pod fluorescenčnim mikroskopom. Suspenzijo celic so uvedli v medij, ki je vseboval biotiniliran BSA, ta je služil kot ligand za celične receptorje. Nastalo mešanico so po kapljicah injicirali v rezervoar z raztopino streptavidina, kjer je potekla polimerizacija nanešenih celic.    <br /> <br /> Za potrebe vizualizacije so v medij s celicami dodali manjšo količino biotiniliranega GFP.  Ugotovili so, da je polimerizacija odvisna od treh dejavnikov: celične gostote, koncentracije ligandov (biotiniliranega BSA) v mediju in koncentracije streptavidina v rezervoarju. Testirali so tudi druge ligande, kot najboljša povezovalna proteina sta se izkazala biotiniliran PAS-lizin in biotiniliran BSA.  <br />  <br /> Ko so iz množice poizkusov določili optimalna razmerja celic in ostalih komponent so prešli na uporabo 3D biotiskanja. Uporabili so konvencionalni 3D printer Ultimaker 2 plus, katerega so predhodno modificirali v biotiskalnik, tako da so sami natisnili mankajoče komponente printerja oz. dokupili določene dele. Njihov končni izdelek je omogočal injiciranje celic na milimeter natančno.  <br /> <br /> Da bi zagotovili fiksno pritrjevanje prve plasti celic na podlago, so podlago prekrili z poli-D- lizinom, katerega so biotinilirali z dodatkom biotin-NSH estra. Tako so pridobili začetno z biotinom prekrito plast, na katero so se celice lahko pritrdile prek avidinskega receptorja. Za ovrednotenje stabilnost nanosa celic, so v posamezne plasti nanašali različno obarvane celice. Z opazovanjem pod fluorescenčnim mikroskopom so ovrednotili, da sta celični plasti fiksno pritrjeni ena na drugo, in da enako obarvane celice ležijo v isti ravnini, celice so tudi po stresanju ohranile svojo lego v zamreženi strukturi.  <br /> <br /> == Hibridna naprava za kontrolo ravni glukoze v krvi ==<br /> Tehnologijo biotiskanja bi lahko izkoristili tudi za pripravo biološko-mehatronskih naprav, za uravnavanje porušene homeostaze pri nekaterih patoloških stanjih. Lahko bi na primer razvili hibridne organe, v katerih bi elektromehanske komponente zaznavale biološke signale iz okolice in komunicirale s celicami v tkivu ter jih usmerjale v pravilno delovanje. Tehnologija biotiskanja bi omogočila povezovanje bioloških komponent z nebiološkimi v obliko primerno za inplantacijo v bolnika. <br /> <br /> Kot praktični primer takšne aplikacije so si zamislili hibridno napravo, ki bi uravnavala izločanje inzulina pri bolnikih s sladkorno boleznijo tip I.  Mehanski del naprave bi meril koncentracijo glukoze in inzulina v krvi in na podlagi tega posredoval signale do tarčnih celic, ki bi sprožile oz. zavrle izločanje inzulina glede na trenutne potrebe organizma. <br /> Prenos signala iz električnega vezja na tarčne celice bi potekal preko svetlobe določene valovne dolžine, ki bi jo celice zaznale s pomočjo specifičnih receptorjev na membrani. V notranjosti celice bi se v prisotnosti svetlobe sprožili signalni mehanizmi, ki bi vodili v porast Ca2+ v citosolu, in posledično sprožili izražanje genov, ki so pod kontrolo od Ca2+ odzivnih elementov. Celice bi predhodno dizajnirali tako, da bi vsebovale gen za preproinzulin ki bi se izražal pod kontrolo od Ca2+ odzivnega promotorja. <br /> <br /> Da bi testirali svojo zamisel so v celicah izrazili sistem, ki združuje signalno pot med receptorjem za modro svetlobo, fototropinom, in kalcijevim kanalčkom Orai na endoplazemskem retikulumu. Sistem deluje tako, da se v prisotnosti svetlobe iz fuzijskega receptorja fototropina odcepi protein Stim1, ki aktivira Ca2+ kanalček Orai, kar privede do izločanja Ca2+ iz endoplazemskega retikuluma v citosol. V genom celice so ustavili tudi konstrukt, ki je vseboval promotor s tremi Ca2+ odzivnimi elementi (SRE, CRE in NFAT odzivni elementi), ki so uravnavali izražanje nanoluciferinaze. Preko fluorescence nanoluciferinaze so tako izmerili odziv promotorja na obsevanje celic z modro svetlobo. Poizkus je bil uspešen, celice so po obsevanju z modro svetlobo 4-5x več nanoluciferinaze kot kontrolne celice.  <br /> <br /> <br /> ==Viri==<br /> # iGEM projekt BiotINK - rethINK tissue printing, dostopen na povezavi: http://2016.igem.org/Team:LMU-TUM_Munich <br /> # Ozbolat IT, Yin Y: Bioprinting toward organ fabrication: challenges and future trends. IEEE Transactions on Biomedical Engineering 60.3 (2013): 691-699. <br /> <br /> [[Seminarji SB 12016/17]]</div>

Mateja Cigoj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BiotINK_-_nov_pristop_k_biotiskanju_tkiva&diff=11961 2016-12-04T13:13:15Z

<p>Mateja Cigoj: /* Polimerizacijski poizkusi */</p> <hr /> <div>LMU-TUM München: BiotINK - rethINK tissue printing, http://2016.igem.org/Team:LMU-TUM_Munich <br /> <br /> == Tehnologija biotiskanja ==<br /> <br /> Biotiskanje je postopek priprave večplastnih celičnih struktur in uporabo tehnologije 3D tiskanja. Biotiskanje predstavlja velik doprinos na področju regnerativne medicine, ker omogoča izdelavo tkivnih presadkov iz bolnikovih lastnih celic. Poleg tega so tkivni modeli uporabni tudi za potrebe farmakoloških in toksikoloških študij ter za študije razvoja bolezni. Današnja tehnologija biotiskanja omogoča pripravo nekaterih enostavnejših tkiv, na primer večplastnih modelov kože, hrustanca, kosti, žil in sapnika. Tiskanje popolnih funkcionalnih organov trenutno še ni mogoče, zaradi kompleksnosti različnih celičnih struktur.  <br /> <br /> Večina tehnik biotiskanja temelji na nanašanju celic na podporni matriks, ki predstavlja oporo za celice in oblikuje strukturo tkiva. Po določenem času začnejo celice oblikovati intercelularne kontakte in začnejo rasti v dvodimenzionalnih celičnih plasteh. Za rekonstrukcijo tkiva se morajo celične plasti medsebojno povezati in podporno ogrodje pa se razgradi ter nadomesti s komponentami zunajceličnega matriksa, ki jih sintetizirajo celice. Biotiskanje je tehnično gledano kompleksen, dolgotrajen in drag proces, ki je še v fazi razvoja. En od glavnih izzivov ostaja izbira primernega podpornega materiala za izdelavo celičnega ogrodja, ki bo kompatibilno z biološkim okoljem v katerega ga vgradimo.  <br /> <br /> Skupina študentov iz Münchna je za tekmovanje iGEM si je postavila cilj izboljšati tehniko biotiskanja, da bo postopek hitrejši, cenejši in bolj učinkovit. Zamislili so si sistem v katerem celice na površini izražajo receptorje z vezanim avidinom oz. molekulami biotina in medij, ki vsebuje streptavidin oz. biotinilirane proteine. Interakcija med molekulami biotina in streptavidina, s kostanto disociacije 10&lt;sup&gt;-15&lt;/sup&gt; M, je ena izmed najmočnejših bioloških interakcij (za primerjavo je konstanta disociacije protiteles v območju 10&lt;sup&gt;-7&lt;/sup&gt; – 10&lt;sup&gt;-11&lt;/sup&gt; M). Prednost takšnega sistema je, da celice ne potrebujejo podpornega ogrodja, na katere bi jih nanašali, temveč interakcije med omenjenimi celičnimi receptorji in ligandi v mediju omogočijo takojšnje premreženje celic tekom samega tiskanja in nastanek stabilnih tridimenzionalnih celičnih struktur.  <br /> <br /> == Membranski proteini == <br />  <br /> Na celicah so izrazili dva tipa membranskih proteinov (receptorjev), ki bi omogočali polimerizacijo celic: <br /> * Receptor z biotin akceptorskim peptidom (BAP), ki omogoča reakcije z streptavidinom in drugimi variantami avidina. BAP je 15 aminokislin dolg peptid, ki izvira iz E.coli. Biotiniliranje peptida je potekalo endogeno s soizraženo bakterijsko biotin ligazo BirA. <br /> * Receptor z avidinsko podenoto, ki omogoča povezovanje z biotiniliranimi proteini. Testiral so dve različici avidina in sicer monomerni avidin, ki predstavlja eno samo podenoto tetramernega avidina in t.i. enoverižni avidin (scAvidin), ki je podoben naravnemu avidinu, z razliko da je sestavljen zgolj iz ene polipeptidne verige. <br /> <br /> ===Priprava konstruktov===<br /> <br /> Za receptorske proteine so pripravili konstrukte, ki so vsebovali CMV promotor, signalni peptid BM40, funkcionalni membranski protein in poliadenilacijski signal.  <br /> Za sidranje proteina v celično membrano so uporabili transmembransko regijo EGF receptorja (BBa_K157002), kateri so na C-konec dodali t.i. stop-transfer sekvenco, iz naravnega EGF receptorja in fleksibilne povezovalce (GGGGC)2 na obeh koncih. Za preverjanje pravilne ekspresije in lokalizacije receptorja, so v receptorski konstrukt vnesli 3 elemente za detekcijo: rdeči fluorescenčni protein mRuby 3 za detekcijo receptorja s fluorescenčnim mikroskopom, epitop za A3C5 protitelesa za imunokemično detekcijo in Strep-tag II oznako za detekcijo in čiščenje z imunokemijskimi metodami. <br /> <br /> Konstrukte so testirali v MEXiTM celični liniji, ki omogoča semi-stabilno transfekcijo. Gre za suspenzijo humane celične linije HEK293E, ki ima v genomu vgrajen virusni protein EBNA1 iz Eppstein-Barr virusa, ki uravnava iniciacijo replikacije virusa in skrbi za ohranjanje virusne DNA v gostiteljski celici. MEXiTM celična linija vsebuje vektorski plazmid pDSG-IBA, katerega začetno mesto replikacije (ORI) prepozna protein EBNA1, ki pritegne faktorje replikacije in sproži podvajanje plazmida. Receptorske konstrukte so klonirali v pDSG-iGEM plazmid in transficirali MEXi celice. Transfekcijo so izvedli s kationskim polimerom polietilen iminom, ki tvori kompleks z negativno nabito DNA, ki lahko ustopa v celico prek endocitoze.  <br /> <br /> Kasneje so konstrukte vključili tudi v genom celic. Za ta namen so uporabili sistem FlpIn™. Gre za tri-komponentni sistem, v katerem nastopajo HEK-TRex™-293 celice z kromosomskim Flp rekobinacijskim mestom, plazmid z zapisom za Flp rekombinazo in plazmid z želenim vključkom, ki tudi vsebuje Flp rekombinacijsko mesto, ki omogoča vgraditev v tarčni kromosom. Celice, ki uspešno integrirajo plazmid v svoj genom izgubijo rezistenco na Zeocin™, obenem pa pridobijo odpornost na higromicin B, ker plazmid nosi zapis za higromicin-fosfotransferazo, ki s svojo kinazno aktivnostjo inaktivira higromicin B.  <br /> <br /> == Ligandi za membranske proteine ==<br /> V bakterijah E.coli so izrazili štirih različne variente avidina.  <br />   <br /> * Streptavidin divjega tipa, ki vsebuje 4 vezavna mesta za biotin.  <br /> * Traptavidin, ki se od streptavidina razlikuje v dveh točkovnih mutacijah, ki povzročita povečano afiniteto  do biotina. Poleg tega ima traptavidin izboljšano termostabilnost in funkcionalnost pri višjih temperaturah (TM~10 °C višja). <br /> * Streptacin, ki vsebuje 8 aminokislin dolgo strep-tag oznako, ki omogoča enostavno in učinkovito čiščenje z afinitetno kromatografijo. <br /> * Monomeni avidin (eMA), ki lahko veže le eno biotinsko molekulo, kar prepreči nastanek neželenih prečnih povezav z biotinskimi konjugati. <br />   <br /> Vezavne lastnosti posameznih variant avidina so ovrednotili s fluorescenčno titracijo. To je metoda pri kateri titriramo protein z ligandom in ob spremljanju spremembe intrinzične fluorescence proteina. Iz eksperimentalnih podatkov so izračunali konstante disociacije KD, s katerimi so ovrednotili afinitete vezave. Najvišjo afiniteto je kazal monomerni avidin. <br /> <br /> Pripravili so tudi različne biotinilirane proteine. <br /> <br /> * PAS-lizin, ki je polipeptid sestavljen iz ponovitev prolin-alanin-serin z lizinom na vsakem 20 mestu, katerega lahko biotiniliramo. <br /> * Zeleni fluorescirajoči protein (eGFP), ki omogoča opazovanje poteka polimerizacije pod fluorescenčnim mikroskopom. <br /> * Goveji serumski albumin, ki je pogosto uporabljan v laboratoriju kot proteinski standard, ker vsebuje 60 lizinskih ostankov in je dobro topen je tudi potencialno primeren kot biotiniliran povezovalec za celice. <br /> <br /> Za biotinilacijo proteinov so uporabili biotin, ki je zaestren z N-hidroksisucinimidno skupino (biotin-NHS). NHS estri lahko zreagirajo z primarnimi ali sekundarnimi amini prek SN2 reakcijskega mehanizma, pri čemer pride do tvorbe amidne vezi. (NSH estri se veliko uporabljajo za konjugiranje proteinov z fluorescenčnimi barvili ali biotinom.) Da bi zaščitili biotinilirane proteine pred delovanjem serumske biotinidaze (encim, ki odceplja biotin) so uporabili različne derivate biotina odporne na cepitev. <br /> <br /> == Polimerizacijski poizkusi ==<br /> Pri polimerizacijskih poizkusih so uporabili celice, ki so na površini izražale scAvidin, kot liganda pa sta služila biotiniliran BSA in streptavidin. Prve eksperimente niso izvajali s printerjem ampak pod fluorescenčnim mikroskopom. Suspenzijo celic so uvedli v medij, ki je vseboval biotiniliran BSA, ta je služil kot ligand za celične receptorje. Nastalo mešanico so po kapljicah injicirali v rezervoar z raztopino streptavidina, kjer je potekla polimerizacija nanešenih celic.    <br /> <br /> Za potrebe vizualizacije so v medij s celicami dodali manjšo količino biotiniliranega GFP.  Ugotovili so, da je polimerizacija odvisna od treh dejavnikov: celične gostote, koncentracije ligandov (biotiniliranega BSA) v mediju in koncentracije streptavidina v rezervoarju. Testirali so tudi druge ligande, kot najboljša povezovalna proteina sta se izkazala biotiniliran PAS-lizin in biotiniliran BSA.  <br />  <br /> Ko so iz množice poizkusov določili optimalna razmerja celic in ostalih komponent so prešli na uporabo 3D biotiskanja. Uporabili so konvencionalni 3D printer Ultimaker 2 plus, katerega so predhodno modificirali v biotiskalnik, tako da so sami natisnili mankajoče komponente printerja oz. dokupili določene dele. Njihov končni izdelek je omogočal injiciranje celic na milimeter natančno.  <br /> <br /> Da bi zagotovili fiksno pritrjevanje prve plasti celic na podlago, so podlago prekrili z poli-D- lizinom, katerega so biotinilirali z dodatkom biotin-NSH estra. Tako so pridobili začetno z biotinom prekrito plast, na katero so se celice lahko pritrdile prek avidinskega receptorja. Za ovrednotenje stabilnost nanosa celic, so v posamezne plasti nanašali različno obarvane celice. Z opazovanjem pod fluorescenčnim mikroskopom so ovrednotili, da sta celični plasti fiksno pritrjeni ena na drugo, in da enako obarvane celice ležijo v isti ravnini, celice so tudi po stresanju ohranile svojo lego v zamreženi strukturi.  <br /> <br /> == Hibridna naprava za kontrolo ravni glukoze v krvi ==<br /> Tehnologijo biotiskanja bi lahko izkoristili tudi za pripravo biološko-mehatronskih naprav, za uravnavanje porušene homeostaze pri nekaterih patoloških stanjih. Lahko bi na primer razvili hibridne organe, v katerih bi elektromehanske komponente zaznavale biološke signale iz okolice in komunicirale s celicami v tkivu ter jih usmerjale v pravilno delovanje. Tehnologija biotiskanja bi omogočila povezovanje bioloških komponent z nebiološkimi v obliko primerno za inplantacijo v bolnika. <br /> <br /> Kot praktični primer takšne aplikacije so si zamislili hibridno napravo, ki bi uravnavala izločanje inzulina pri bolnikih s sladkorno boleznijo tip I.  Mehanski del naprave bi meril koncentracijo glukoze in inzulina v krvi in na podlagi tega posredoval signale do tarčnih celic, ki bi sprožile oz. zavrle izločanje inzulina glede na trenutne potrebe organizma. <br /> Prenos signala iz električnega vezja na tarčne celice bi potekal preko svetlobe določene valovne dolžine, ki bi jo celice zaznale s pomočjo specifičnih receptorjev na membrani. V notranjosti celice bi se v prisotnosti svetlobe sprožili signalni mehanizmi, ki bi vodili v porast Ca2+ v citosolu, in posledično sprožili izražanje genov, ki so pod kontrolo od Ca2+ odzivnih elementov. Celice bi predhodno dizajnirali tako, da bi vsebovale gen za preproinzulin ki bi se izražal pod kontrolo od Ca2+ odzivnega promotorja. <br /> <br /> Da bi testirali svojo zamisel so v celicah izrazili sistem, ki združuje signalno pot med receptorjem za modro svetlobo, fototropinom, in kalcijevim kanalčkom Orai na endoplazemskem retikulumu. Sistem deluje tako, da se v prisotnosti svetlobe iz fuzijskega receptorja fototropina odcepi protein Stim1, ki aktivira Ca2+ kanalček Orai, kar privede do izločanja Ca2+ iz endoplazemskega retikuluma v citosol. V genom celice so ustavili tudi konstrukt, ki je vseboval promotor s tremi Ca2+ odzivnimi elementi (SRE, CRE in NFAT odzivni elementi), ki so uravnavali izražanje nanoluciferinaze. Preko fluorescence nanoluciferinaze so tako izmerili odziv promotorja na obsevanje celic z modro svetlobo. Poizkus je bil uspešen, celice so po obsevanju z modro svetlobo 4-5x več nanoluciferinaze kot kontrolne celice.  <br /> <br /> <br /> ==Viri==<br /> # iGEM projekt BiotINK - rethINK tissue printing, dostopen na povezavi: http://2016.igem.org/Team:LMU-TUM_Munich <br /> # Ozbolat IT, Yin Y: Bioprinting toward organ fabrication: challenges and future trends. IEEE Transactions on Biomedical Engineering 60.3 (2013): 691-699. <br /> <br /> [[Seminarji SB 12016/17]]</div>

Mateja Cigoj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BiotINK_-_nov_pristop_k_biotiskanju_tkiva&diff=11959 2016-12-04T10:55:51Z

<p>Mateja Cigoj: /* Tehnologija biotiskanja */</p> <hr /> <div>LMU-TUM München: BiotINK - rethINK tissue printing, http://2016.igem.org/Team:LMU-TUM_Munich <br /> <br /> == Tehnologija biotiskanja ==<br /> <br /> Biotiskanje je postopek priprave večplastnih celičnih struktur in uporabo tehnologije 3D tiskanja. Biotiskanje predstavlja velik doprinos na področju regnerativne medicine, ker omogoča izdelavo tkivnih presadkov iz bolnikovih lastnih celic. Poleg tega so tkivni modeli uporabni tudi za potrebe farmakoloških in toksikoloških študij ter za študije razvoja bolezni. Današnja tehnologija biotiskanja omogoča pripravo nekaterih enostavnejših tkiv, na primer večplastnih modelov kože, hrustanca, kosti, žil in sapnika. Tiskanje popolnih funkcionalnih organov trenutno še ni mogoče, zaradi kompleksnosti različnih celičnih struktur.  <br /> <br /> Večina tehnik biotiskanja temelji na nanašanju celic na podporni matriks, ki predstavlja oporo za celice in oblikuje strukturo tkiva. Po določenem času začnejo celice oblikovati intercelularne kontakte in začnejo rasti v dvodimenzionalnih celičnih plasteh. Za rekonstrukcijo tkiva se morajo celične plasti medsebojno povezati in podporno ogrodje pa se razgradi ter nadomesti s komponentami zunajceličnega matriksa, ki jih sintetizirajo celice. Biotiskanje je tehnično gledano kompleksen, dolgotrajen in drag proces, ki je še v fazi razvoja. En od glavnih izzivov ostaja izbira primernega podpornega materiala za izdelavo celičnega ogrodja, ki bo kompatibilno z biološkim okoljem v katerega ga vgradimo.  <br /> <br /> Skupina študentov iz Münchna je za tekmovanje iGEM si je postavila cilj izboljšati tehniko biotiskanja, da bo postopek hitrejši, cenejši in bolj učinkovit. Zamislili so si sistem v katerem celice na površini izražajo receptorje z vezanim avidinom oz. molekulami biotina in medij, ki vsebuje streptavidin oz. biotinilirane proteine. Interakcija med molekulami biotina in streptavidina, s kostanto disociacije 10&lt;sup&gt;-15&lt;/sup&gt; M, je ena izmed najmočnejših bioloških interakcij (za primerjavo je konstanta disociacije protiteles v območju 10&lt;sup&gt;-7&lt;/sup&gt; – 10&lt;sup&gt;-11&lt;/sup&gt; M). Prednost takšnega sistema je, da celice ne potrebujejo podpornega ogrodja, na katere bi jih nanašali, temveč interakcije med omenjenimi celičnimi receptorji in ligandi v mediju omogočijo takojšnje premreženje celic tekom samega tiskanja in nastanek stabilnih tridimenzionalnih celičnih struktur.  <br /> <br /> == Membranski proteini == <br />  <br /> Na celicah so izrazili dva tipa membranskih proteinov (receptorjev), ki bi omogočali polimerizacijo celic: <br /> * Receptor z biotin akceptorskim peptidom (BAP), ki omogoča reakcije z streptavidinom in drugimi variantami avidina. BAP je 15 aminokislin dolg peptid, ki izvira iz E.coli. Biotiniliranje peptida je potekalo endogeno s soizraženo bakterijsko biotin ligazo BirA. <br /> * Receptor z avidinsko podenoto, ki omogoča povezovanje z biotiniliranimi proteini. Testiral so dve različici avidina in sicer monomerni avidin, ki predstavlja eno samo podenoto tetramernega avidina in t.i. enoverižni avidin (scAvidin), ki je podoben naravnemu avidinu, z razliko da je sestavljen zgolj iz ene polipeptidne verige. <br /> <br /> ===Priprava konstruktov===<br /> <br /> Za receptorske proteine so pripravili konstrukte, ki so vsebovali CMV promotor, signalni peptid BM40, funkcionalni membranski protein in poliadenilacijski signal.  <br /> Za sidranje proteina v celično membrano so uporabili transmembransko regijo EGF receptorja (BBa_K157002), kateri so na C-konec dodali t.i. stop-transfer sekvenco, iz naravnega EGF receptorja in fleksibilne povezovalce (GGGGC)2 na obeh koncih. Za preverjanje pravilne ekspresije in lokalizacije receptorja, so v receptorski konstrukt vnesli 3 elemente za detekcijo: rdeči fluorescenčni protein mRuby 3 za detekcijo receptorja s fluorescenčnim mikroskopom, epitop za A3C5 protitelesa za imunokemično detekcijo in Strep-tag II oznako za detekcijo in čiščenje z imunokemijskimi metodami. <br /> <br /> Konstrukte so testirali v MEXiTM celični liniji, ki omogoča semi-stabilno transfekcijo. Gre za suspenzijo humane celične linije HEK293E, ki ima v genomu vgrajen virusni protein EBNA1 iz Eppstein-Barr virusa, ki uravnava iniciacijo replikacije virusa in skrbi za ohranjanje virusne DNA v gostiteljski celici. MEXiTM celična linija vsebuje vektorski plazmid pDSG-IBA, katerega začetno mesto replikacije (ORI) prepozna protein EBNA1, ki pritegne faktorje replikacije in sproži podvajanje plazmida. Receptorske konstrukte so klonirali v pDSG-iGEM plazmid in transficirali MEXi celice. Transfekcijo so izvedli s kationskim polimerom polietilen iminom, ki tvori kompleks z negativno nabito DNA, ki lahko ustopa v celico prek endocitoze.  <br /> <br /> Kasneje so konstrukte vključili tudi v genom celic. Za ta namen so uporabili sistem FlpIn™. Gre za tri-komponentni sistem, v katerem nastopajo HEK-TRex™-293 celice z kromosomskim Flp rekobinacijskim mestom, plazmid z zapisom za Flp rekombinazo in plazmid z želenim vključkom, ki tudi vsebuje Flp rekombinacijsko mesto, ki omogoča vgraditev v tarčni kromosom. Celice, ki uspešno integrirajo plazmid v svoj genom izgubijo rezistenco na Zeocin™, obenem pa pridobijo odpornost na higromicin B, ker plazmid nosi zapis za higromicin-fosfotransferazo, ki s svojo kinazno aktivnostjo inaktivira higromicin B.  <br /> <br /> == Ligandi za membranske proteine ==<br /> V bakterijah E.coli so izrazili štirih različne variente avidina.  <br />   <br /> * Streptavidin divjega tipa, ki vsebuje 4 vezavna mesta za biotin.  <br /> * Traptavidin, ki se od streptavidina razlikuje v dveh točkovnih mutacijah, ki povzročita povečano afiniteto  do biotina. Poleg tega ima traptavidin izboljšano termostabilnost in funkcionalnost pri višjih temperaturah (TM~10 °C višja). <br /> * Streptacin, ki vsebuje 8 aminokislin dolgo strep-tag oznako, ki omogoča enostavno in učinkovito čiščenje z afinitetno kromatografijo. <br /> * Monomeni avidin (eMA), ki lahko veže le eno biotinsko molekulo, kar prepreči nastanek neželenih prečnih povezav z biotinskimi konjugati. <br />   <br /> Vezavne lastnosti posameznih variant avidina so ovrednotili s fluorescenčno titracijo. To je metoda pri kateri titriramo protein z ligandom in ob spremljanju spremembe intrinzične fluorescence proteina. Iz eksperimentalnih podatkov so izračunali konstante disociacije KD, s katerimi so ovrednotili afinitete vezave. Najvišjo afiniteto je kazal monomerni avidin. <br /> <br /> Pripravili so tudi različne biotinilirane proteine. <br /> <br /> * PAS-lizin, ki je polipeptid sestavljen iz ponovitev prolin-alanin-serin z lizinom na vsakem 20 mestu, katerega lahko biotiniliramo. <br /> * Zeleni fluorescirajoči protein (eGFP), ki omogoča opazovanje poteka polimerizacije pod fluorescenčnim mikroskopom. <br /> * Goveji serumski albumin, ki je pogosto uporabljan v laboratoriju kot proteinski standard, ker vsebuje 60 lizinskih ostankov in je dobro topen je tudi potencialno primeren kot biotiniliran povezovalec za celice. <br /> <br /> Za biotinilacijo proteinov so uporabili biotin, ki je zaestren z N-hidroksisucinimidno skupino (biotin-NHS). NHS estri lahko zreagirajo z primarnimi ali sekundarnimi amini prek SN2 reakcijskega mehanizma, pri čemer pride do tvorbe amidne vezi. (NSH estri se veliko uporabljajo za konjugiranje proteinov z fluorescenčnimi barvili ali biotinom.) Da bi zaščitili biotinilirane proteine pred delovanjem serumske biotinidaze (encim, ki odceplja biotin) so uporabili različne derivate biotina odporne na cepitev. <br /> <br /> == Polimerizacijski poizkusi ==<br /> Pri polimerizacijskih poizkusih so uporabili celice, ki so na površini izražale scAvidin, biotiniliran BSA in streptavidin. Prve eksperimente niso izvajali s printerjem ampak pod fluorescenčnim mikroskopom. Suspenzijo celic so uvedli v medij, ki je vseboval biotiniliran BSA, ta je služil kot ligand za celične receptorje. Nastalo mešanico so po kapljicah injicirali v rezervoar z raztopino streptavidina, kjer je potekla polimerizacija nanešenih celic.    <br /> <br /> Za potrebe vizualizacije so v medij s celicami dodali manjšo količino biotiniliranega GFP.  Ugotovili so, da je polimerizacija odvisna od treh dejavnikov: celične gostote, koncentracije ligandov (biotiniliranega BSA) v mediju in koncentracije streptavidina v rezervoarju. Testirali so tudi druge ligande, kot najboljša povezovalna proteina sta se izkazala biotiniliran PAS-lizin in biotiniliran BSA.  <br />  <br /> Ko so iz množice poizkusov določili optimalna razmerja celic in ostalih komponent so prešli na uporabo 3D biotiskanja. Uporabili so konvencionalni 3D printer Ultimaker 2 plus, katerega so predhodno modificirali v biotiskalnik, tako da so sami natisnili mankajoče komponente printerja oz. dokupili določene dele. Njihov končni izdelek je omogočal injiciranje celic na milimeter natančno.  <br /> <br /> Da bi zagotovili fiksno pritrjevanje prve plasti celic na podlago, so podlago prekrili z poli-D- lizinom, katerega so biotinilirali z dodatkom biotin-NSH estra. Tako so pridobili začetno z biotinom prekrito plast, na katero so se celice lahko pritrdile prek avidinskega receptorja. Za ovrednotenje stabilnost nanosa celic, so v posamezne plasti nanašali različno obarvane celice. Z opazovanjem pod fluorescenčnim mikroskopom so ovrednotili, da sta celični plasti fiksno pritrjeni ena na drugo, in da enako obarvane celice ležijo v isti ravnini, celice so tudi po stresanju ohranile svojo lego v zamreženi strukturi.  <br /> <br /> == Hibridna naprava za kontrolo ravni glukoze v krvi ==<br /> Tehnologijo biotiskanja bi lahko izkoristili tudi za pripravo biološko-mehatronskih naprav, za uravnavanje porušene homeostaze pri nekaterih patoloških stanjih. Lahko bi na primer razvili hibridne organe, v katerih bi elektromehanske komponente zaznavale biološke signale iz okolice in komunicirale s celicami v tkivu ter jih usmerjale v pravilno delovanje. Tehnologija biotiskanja bi omogočila povezovanje bioloških komponent z nebiološkimi v obliko primerno za inplantacijo v bolnika. <br /> <br /> Kot praktični primer takšne aplikacije so si zamislili hibridno napravo, ki bi uravnavala izločanje inzulina pri bolnikih s sladkorno boleznijo tip I.  Mehanski del naprave bi meril koncentracijo glukoze in inzulina v krvi in na podlagi tega posredoval signale do tarčnih celic, ki bi sprožile oz. zavrle izločanje inzulina glede na trenutne potrebe organizma. <br /> Prenos signala iz električnega vezja na tarčne celice bi potekal preko svetlobe določene valovne dolžine, ki bi jo celice zaznale s pomočjo specifičnih receptorjev na membrani. V notranjosti celice bi se v prisotnosti svetlobe sprožili signalni mehanizmi, ki bi vodili v porast Ca2+ v citosolu, in posledično sprožili izražanje genov, ki so pod kontrolo od Ca2+ odzivnih elementov. Celice bi predhodno dizajnirali tako, da bi vsebovale gen za preproinzulin ki bi se izražal pod kontrolo od Ca2+ odzivnega promotorja. <br /> <br /> Da bi testirali svojo zamisel so v celicah izrazili sistem, ki združuje signalno pot med receptorjem za modro svetlobo, fototropinom, in kalcijevim kanalčkom Orai na endoplazemskem retikulumu. Sistem deluje tako, da se v prisotnosti svetlobe iz fuzijskega receptorja fototropina odcepi protein Stim1, ki aktivira Ca2+ kanalček Orai, kar privede do izločanja Ca2+ iz endoplazemskega retikuluma v citosol. V genom celice so ustavili tudi konstrukt, ki je vseboval promotor s tremi Ca2+ odzivnimi elementi (SRE, CRE in NFAT odzivni elementi), ki so uravnavali izražanje nanoluciferinaze. Preko fluorescence nanoluciferinaze so tako izmerili odziv promotorja na obsevanje celic z modro svetlobo. Poizkus je bil uspešen, celice so po obsevanju z modro svetlobo 4-5x več nanoluciferinaze kot kontrolne celice.  <br /> <br /> <br /> ==Viri==<br /> # iGEM projekt BiotINK - rethINK tissue printing, dostopen na povezavi: http://2016.igem.org/Team:LMU-TUM_Munich <br /> # Ozbolat IT, Yin Y: Bioprinting toward organ fabrication: challenges and future trends. IEEE Transactions on Biomedical Engineering 60.3 (2013): 691-699. <br /> <br /> [[Seminarji SB 12016/17]]</div>

Mateja Cigoj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BiotINK_-_nov_pristop_k_biotiskanju_tkiva&diff=11958 2016-12-04T10:53:46Z

<p>Mateja Cigoj: /* Tehnologija biotiskanja */</p> <hr /> <div>LMU-TUM München: BiotINK - rethINK tissue printing, http://2016.igem.org/Team:LMU-TUM_Munich <br /> <br /> == Tehnologija biotiskanja ==<br /> <br /> Biotiskanje je postopek priprave večplastnih celičnih struktur in uporabo tehnologije 3D tiskanja. Biotiskanje predstavlja velik doprinos na področju regnerativne medicine, ker omogoča izdelavo tkivnih presadkov iz bolnikovih lastnih celic. Poleg tega so tkivni modeli uporabni tudi za potrebe farmakoloških in toksikoloških študij ter za študije razvoja bolezni. Današnja tehnologija biotiskanja omogoča pripravo nekaterih enostavnejših tkiv, na primer večplastnih modelov kože, hrustanca, kosti, žil in sapnika. Tiskanje popolnih funkcionalnih organov trenutno še ni mogoče, zaradi kompleksnosti različnih celičnih struktur.  <br /> <br /> Večina tehnik biotiskanja temelji na nanašanju celic na podporni matriks, ki predstavlja oporo za celice in oblikuje strukturo tkiva. Po določenem času začnejo celice oblikovati intercelularne kontakte in začnejo rasti v dvodimenzionalnih celičnih plasteh. Za rekonstrukcijo tkiva se morajo celične plasti medsebojno povezati in podporno ogrodje pa se razgradi ter nadomesti s komponentami zunajceličnega matriksa, ki jih sintetizirajo celice. Biotiskanje je tehnično gledano kompleksen, dolgotrajen in drag proces, ki je še v fazi razvoja. En od glavnih izzivov ostaja izbira primernega podpornega materiala za izdelavo celičnega ogrodja, ki bo kompatibilno z biološkim okoljem v katerega ga vgradimo.  <br /> <br /> Skupina študentov iz Münchna je za tekmovanje iGEM si je postavila cilj izboljšati tehniko biotiskanja, da bo postopek hitrejši, cenejši in bolj učinkovit. Zamislili so si sistem v katerem celice na površini izražajo receptorje z vezanim avidinom oz. molekulami biotina in medij, ki vsebuje streptavidin oz. biotinilirane proteine. Interakcija med molekulami biotina in streptavidina, s kostanto disociacije &lt;math&gt;10^{-15} M&lt;/math&gt;, je ena izmed najmočnejših bioloških interakcij (za primerjavo je konstanta disociacije protiteles v območju 10^-7 – 10^-11 M). Prednost takšnega sistema je, da celice ne potrebujejo podpornega ogrodja, na katere bi jih nanašali, temveč interakcije med omenjenimi celičnimi receptorji in ligandi v mediju omogočijo takojšnje premreženje celic tekom samega tiskanja in nastanek stabilnih tridimenzionalnih celičnih struktur.  <br /> <br /> == Membranski proteini == <br />  <br /> Na celicah so izrazili dva tipa membranskih proteinov (receptorjev), ki bi omogočali polimerizacijo celic: <br /> * Receptor z biotin akceptorskim peptidom (BAP), ki omogoča reakcije z streptavidinom in drugimi variantami avidina. BAP je 15 aminokislin dolg peptid, ki izvira iz E.coli. Biotiniliranje peptida je potekalo endogeno s soizraženo bakterijsko biotin ligazo BirA. <br /> * Receptor z avidinsko podenoto, ki omogoča povezovanje z biotiniliranimi proteini. Testiral so dve različici avidina in sicer monomerni avidin, ki predstavlja eno samo podenoto tetramernega avidina in t.i. enoverižni avidin (scAvidin), ki je podoben naravnemu avidinu, z razliko da je sestavljen zgolj iz ene polipeptidne verige. <br /> <br /> ===Priprava konstruktov===<br /> <br /> Za receptorske proteine so pripravili konstrukte, ki so vsebovali CMV promotor, signalni peptid BM40, funkcionalni membranski protein in poliadenilacijski signal.  <br /> Za sidranje proteina v celično membrano so uporabili transmembransko regijo EGF receptorja (BBa_K157002), kateri so na C-konec dodali t.i. stop-transfer sekvenco, iz naravnega EGF receptorja in fleksibilne povezovalce (GGGGC)2 na obeh koncih. Za preverjanje pravilne ekspresije in lokalizacije receptorja, so v receptorski konstrukt vnesli 3 elemente za detekcijo: rdeči fluorescenčni protein mRuby 3 za detekcijo receptorja s fluorescenčnim mikroskopom, epitop za A3C5 protitelesa za imunokemično detekcijo in Strep-tag II oznako za detekcijo in čiščenje z imunokemijskimi metodami. <br /> <br /> Konstrukte so testirali v MEXiTM celični liniji, ki omogoča semi-stabilno transfekcijo. Gre za suspenzijo humane celične linije HEK293E, ki ima v genomu vgrajen virusni protein EBNA1 iz Eppstein-Barr virusa, ki uravnava iniciacijo replikacije virusa in skrbi za ohranjanje virusne DNA v gostiteljski celici. MEXiTM celična linija vsebuje vektorski plazmid pDSG-IBA, katerega začetno mesto replikacije (ORI) prepozna protein EBNA1, ki pritegne faktorje replikacije in sproži podvajanje plazmida. Receptorske konstrukte so klonirali v pDSG-iGEM plazmid in transficirali MEXi celice. Transfekcijo so izvedli s kationskim polimerom polietilen iminom, ki tvori kompleks z negativno nabito DNA, ki lahko ustopa v celico prek endocitoze.  <br /> <br /> Kasneje so konstrukte vključili tudi v genom celic. Za ta namen so uporabili sistem FlpIn™. Gre za tri-komponentni sistem, v katerem nastopajo HEK-TRex™-293 celice z kromosomskim Flp rekobinacijskim mestom, plazmid z zapisom za Flp rekombinazo in plazmid z želenim vključkom, ki tudi vsebuje Flp rekombinacijsko mesto, ki omogoča vgraditev v tarčni kromosom. Celice, ki uspešno integrirajo plazmid v svoj genom izgubijo rezistenco na Zeocin™, obenem pa pridobijo odpornost na higromicin B, ker plazmid nosi zapis za higromicin-fosfotransferazo, ki s svojo kinazno aktivnostjo inaktivira higromicin B.  <br /> <br /> == Ligandi za membranske proteine ==<br /> V bakterijah E.coli so izrazili štirih različne variente avidina.  <br />   <br /> * Streptavidin divjega tipa, ki vsebuje 4 vezavna mesta za biotin.  <br /> * Traptavidin, ki se od streptavidina razlikuje v dveh točkovnih mutacijah, ki povzročita povečano afiniteto  do biotina. Poleg tega ima traptavidin izboljšano termostabilnost in funkcionalnost pri višjih temperaturah (TM~10 °C višja). <br /> * Streptacin, ki vsebuje 8 aminokislin dolgo strep-tag oznako, ki omogoča enostavno in učinkovito čiščenje z afinitetno kromatografijo. <br /> * Monomeni avidin (eMA), ki lahko veže le eno biotinsko molekulo, kar prepreči nastanek neželenih prečnih povezav z biotinskimi konjugati. <br />   <br /> Vezavne lastnosti posameznih variant avidina so ovrednotili s fluorescenčno titracijo. To je metoda pri kateri titriramo protein z ligandom in ob spremljanju spremembe intrinzične fluorescence proteina. Iz eksperimentalnih podatkov so izračunali konstante disociacije KD, s katerimi so ovrednotili afinitete vezave. Najvišjo afiniteto je kazal monomerni avidin. <br /> <br /> Pripravili so tudi različne biotinilirane proteine. <br /> <br /> * PAS-lizin, ki je polipeptid sestavljen iz ponovitev prolin-alanin-serin z lizinom na vsakem 20 mestu, katerega lahko biotiniliramo. <br /> * Zeleni fluorescirajoči protein (eGFP), ki omogoča opazovanje poteka polimerizacije pod fluorescenčnim mikroskopom. <br /> * Goveji serumski albumin, ki je pogosto uporabljan v laboratoriju kot proteinski standard, ker vsebuje 60 lizinskih ostankov in je dobro topen je tudi potencialno primeren kot biotiniliran povezovalec za celice. <br /> <br /> Za biotinilacijo proteinov so uporabili biotin, ki je zaestren z N-hidroksisucinimidno skupino (biotin-NHS). NHS estri lahko zreagirajo z primarnimi ali sekundarnimi amini prek SN2 reakcijskega mehanizma, pri čemer pride do tvorbe amidne vezi. (NSH estri se veliko uporabljajo za konjugiranje proteinov z fluorescenčnimi barvili ali biotinom.) Da bi zaščitili biotinilirane proteine pred delovanjem serumske biotinidaze (encim, ki odceplja biotin) so uporabili različne derivate biotina odporne na cepitev. <br /> <br /> == Polimerizacijski poizkusi ==<br /> Pri polimerizacijskih poizkusih so uporabili celice, ki so na površini izražale scAvidin, biotiniliran BSA in streptavidin. Prve eksperimente niso izvajali s printerjem ampak pod fluorescenčnim mikroskopom. Suspenzijo celic so uvedli v medij, ki je vseboval biotiniliran BSA, ta je služil kot ligand za celične receptorje. Nastalo mešanico so po kapljicah injicirali v rezervoar z raztopino streptavidina, kjer je potekla polimerizacija nanešenih celic.    <br /> <br /> Za potrebe vizualizacije so v medij s celicami dodali manjšo količino biotiniliranega GFP.  Ugotovili so, da je polimerizacija odvisna od treh dejavnikov: celične gostote, koncentracije ligandov (biotiniliranega BSA) v mediju in koncentracije streptavidina v rezervoarju. Testirali so tudi druge ligande, kot najboljša povezovalna proteina sta se izkazala biotiniliran PAS-lizin in biotiniliran BSA.  <br />  <br /> Ko so iz množice poizkusov določili optimalna razmerja celic in ostalih komponent so prešli na uporabo 3D biotiskanja. Uporabili so konvencionalni 3D printer Ultimaker 2 plus, katerega so predhodno modificirali v biotiskalnik, tako da so sami natisnili mankajoče komponente printerja oz. dokupili določene dele. Njihov končni izdelek je omogočal injiciranje celic na milimeter natančno.  <br /> <br /> Da bi zagotovili fiksno pritrjevanje prve plasti celic na podlago, so podlago prekrili z poli-D- lizinom, katerega so biotinilirali z dodatkom biotin-NSH estra. Tako so pridobili začetno z biotinom prekrito plast, na katero so se celice lahko pritrdile prek avidinskega receptorja. Za ovrednotenje stabilnost nanosa celic, so v posamezne plasti nanašali različno obarvane celice. Z opazovanjem pod fluorescenčnim mikroskopom so ovrednotili, da sta celični plasti fiksno pritrjeni ena na drugo, in da enako obarvane celice ležijo v isti ravnini, celice so tudi po stresanju ohranile svojo lego v zamreženi strukturi.  <br /> <br /> == Hibridna naprava za kontrolo ravni glukoze v krvi ==<br /> Tehnologijo biotiskanja bi lahko izkoristili tudi za pripravo biološko-mehatronskih naprav, za uravnavanje porušene homeostaze pri nekaterih patoloških stanjih. Lahko bi na primer razvili hibridne organe, v katerih bi elektromehanske komponente zaznavale biološke signale iz okolice in komunicirale s celicami v tkivu ter jih usmerjale v pravilno delovanje. Tehnologija biotiskanja bi omogočila povezovanje bioloških komponent z nebiološkimi v obliko primerno za inplantacijo v bolnika. <br /> <br /> Kot praktični primer takšne aplikacije so si zamislili hibridno napravo, ki bi uravnavala izločanje inzulina pri bolnikih s sladkorno boleznijo tip I.  Mehanski del naprave bi meril koncentracijo glukoze in inzulina v krvi in na podlagi tega posredoval signale do tarčnih celic, ki bi sprožile oz. zavrle izločanje inzulina glede na trenutne potrebe organizma. <br /> Prenos signala iz električnega vezja na tarčne celice bi potekal preko svetlobe določene valovne dolžine, ki bi jo celice zaznale s pomočjo specifičnih receptorjev na membrani. V notranjosti celice bi se v prisotnosti svetlobe sprožili signalni mehanizmi, ki bi vodili v porast Ca2+ v citosolu, in posledično sprožili izražanje genov, ki so pod kontrolo od Ca2+ odzivnih elementov. Celice bi predhodno dizajnirali tako, da bi vsebovale gen za preproinzulin ki bi se izražal pod kontrolo od Ca2+ odzivnega promotorja. <br /> <br /> Da bi testirali svojo zamisel so v celicah izrazili sistem, ki združuje signalno pot med receptorjem za modro svetlobo, fototropinom, in kalcijevim kanalčkom Orai na endoplazemskem retikulumu. Sistem deluje tako, da se v prisotnosti svetlobe iz fuzijskega receptorja fototropina odcepi protein Stim1, ki aktivira Ca2+ kanalček Orai, kar privede do izločanja Ca2+ iz endoplazemskega retikuluma v citosol. V genom celice so ustavili tudi konstrukt, ki je vseboval promotor s tremi Ca2+ odzivnimi elementi (SRE, CRE in NFAT odzivni elementi), ki so uravnavali izražanje nanoluciferinaze. Preko fluorescence nanoluciferinaze so tako izmerili odziv promotorja na obsevanje celic z modro svetlobo. Poizkus je bil uspešen, celice so po obsevanju z modro svetlobo 4-5x več nanoluciferinaze kot kontrolne celice.  <br /> <br /> <br /> ==Viri==<br /> # iGEM projekt BiotINK - rethINK tissue printing, dostopen na povezavi: http://2016.igem.org/Team:LMU-TUM_Munich <br /> # Ozbolat IT, Yin Y: Bioprinting toward organ fabrication: challenges and future trends. IEEE Transactions on Biomedical Engineering 60.3 (2013): 691-699. <br /> <br /> [[Seminarji SB 12016/17]]</div>

Mateja Cigoj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BiotINK_-_nov_pristop_k_biotiskanju_tkiva&diff=11957 2016-12-04T10:45:34Z

<p>Mateja Cigoj: /* Tehnologija biotiskanja */</p> <hr /> <div>LMU-TUM München: BiotINK - rethINK tissue printing, http://2016.igem.org/Team:LMU-TUM_Munich <br /> <br /> == Tehnologija biotiskanja ==<br /> <br /> Biotiskanje je postopek priprave večplastnih celičnih struktur in uporabo tehnologije 3D tiskanja. Biotiskanje predstavlja velik doprinos na področju regnerativne medicine, ker omogoča izdelavo tkivnih presadkov iz bolnikovih lastnih celic. Poleg tega so tkivni modeli uporabni tudi za potrebe farmakoloških in toksikoloških študij ter za študije razvoja bolezni. Današnja tehnologija biotiskanja omogoča pripravo nekaterih enostavnejših tkiv, na primer večplastnih modelov kože, hrustanca, kosti, žil in sapnika. Tiskanje popolnih funkcionalnih organov trenutno še ni mogoče, zaradi kompleksnosti različnih celičnih struktur.  <br /> <br /> Večina tehnik biotiskanja temelji na nanašanju celic na podporni matriks, ki predstavlja oporo za celice in oblikuje strukturo tkiva. Po določenem času začnejo celice oblikovati intercelularne kontakte in začnejo rasti v dvodimenzionalnih celičnih plasteh. Za rekonstrukcijo tkiva se morajo celične plasti medsebojno povezati in podporno ogrodje pa se razgradi ter nadomesti s komponentami zunajceličnega matriksa, ki jih sintetizirajo celice. Biotiskanje je tehnično gledano kompleksen, dolgotrajen in drag proces, ki je še v fazi razvoja. En od glavnih izzivov ostaja izbira primernega podpornega materiala za izdelavo celičnega ogrodja, ki bo kompatibilno z biološkim okoljem v katerega ga vgradimo.  <br /> <br /> Skupina študentov iz Münchna je za tekmovanje iGEM si je postavila cilj izboljšati tehniko biotiskanja, da bo postopek hitrejši, cenejši in bolj učinkovit. Zamislili so si sistem v katerem celice na površini izražajo receptorje z vezanim avidinom oz. molekulami biotina in medij, ki vsebuje streptavidin oz. biotinilirane proteine. Interakcija med molekulami biotina in streptavidina, s kostanto disociacije 10-15 M, je ena izmed najmočnejših bioloških interakcij (za primerjavo je konstanta disociacije protiteles v območju 10-7 – 10-11 M). Prednost takšnega sistema je, da celice ne potrebujejo podpornega ogrodja, na katere bi jih nanašali, temveč interakcije med omenjenimi celičnimi receptorji in ligandi v mediju omogočijo takojšnje premreženje celic tekom samega tiskanja in nastanek stabilnih tridimenzionalnih celičnih struktur.  <br /> <br /> == Membranski proteini == <br />  <br /> Na celicah so izrazili dva tipa membranskih proteinov (receptorjev), ki bi omogočali polimerizacijo celic: <br /> * Receptor z biotin akceptorskim peptidom (BAP), ki omogoča reakcije z streptavidinom in drugimi variantami avidina. BAP je 15 aminokislin dolg peptid, ki izvira iz E.coli. Biotiniliranje peptida je potekalo endogeno s soizraženo bakterijsko biotin ligazo BirA. <br /> * Receptor z avidinsko podenoto, ki omogoča povezovanje z biotiniliranimi proteini. Testiral so dve različici avidina in sicer monomerni avidin, ki predstavlja eno samo podenoto tetramernega avidina in t.i. enoverižni avidin (scAvidin), ki je podoben naravnemu avidinu, z razliko da je sestavljen zgolj iz ene polipeptidne verige. <br /> <br /> ===Priprava konstruktov===<br /> <br /> Za receptorske proteine so pripravili konstrukte, ki so vsebovali CMV promotor, signalni peptid BM40, funkcionalni membranski protein in poliadenilacijski signal.  <br /> Za sidranje proteina v celično membrano so uporabili transmembransko regijo EGF receptorja (BBa_K157002), kateri so na C-konec dodali t.i. stop-transfer sekvenco, iz naravnega EGF receptorja in fleksibilne povezovalce (GGGGC)2 na obeh koncih. Za preverjanje pravilne ekspresije in lokalizacije receptorja, so v receptorski konstrukt vnesli 3 elemente za detekcijo: rdeči fluorescenčni protein mRuby 3 za detekcijo receptorja s fluorescenčnim mikroskopom, epitop za A3C5 protitelesa za imunokemično detekcijo in Strep-tag II oznako za detekcijo in čiščenje z imunokemijskimi metodami. <br /> <br /> Konstrukte so testirali v MEXiTM celični liniji, ki omogoča semi-stabilno transfekcijo. Gre za suspenzijo humane celične linije HEK293E, ki ima v genomu vgrajen virusni protein EBNA1 iz Eppstein-Barr virusa, ki uravnava iniciacijo replikacije virusa in skrbi za ohranjanje virusne DNA v gostiteljski celici. MEXiTM celična linija vsebuje vektorski plazmid pDSG-IBA, katerega začetno mesto replikacije (ORI) prepozna protein EBNA1, ki pritegne faktorje replikacije in sproži podvajanje plazmida. Receptorske konstrukte so klonirali v pDSG-iGEM plazmid in transficirali MEXi celice. Transfekcijo so izvedli s kationskim polimerom polietilen iminom, ki tvori kompleks z negativno nabito DNA, ki lahko ustopa v celico prek endocitoze.  <br /> <br /> Kasneje so konstrukte vključili tudi v genom celic. Za ta namen so uporabili sistem FlpIn™. Gre za tri-komponentni sistem, v katerem nastopajo HEK-TRex™-293 celice z kromosomskim Flp rekobinacijskim mestom, plazmid z zapisom za Flp rekombinazo in plazmid z želenim vključkom, ki tudi vsebuje Flp rekombinacijsko mesto, ki omogoča vgraditev v tarčni kromosom. Celice, ki uspešno integrirajo plazmid v svoj genom izgubijo rezistenco na Zeocin™, obenem pa pridobijo odpornost na higromicin B, ker plazmid nosi zapis za higromicin-fosfotransferazo, ki s svojo kinazno aktivnostjo inaktivira higromicin B.  <br /> <br /> == Ligandi za membranske proteine ==<br /> V bakterijah E.coli so izrazili štirih različne variente avidina.  <br />   <br /> * Streptavidin divjega tipa, ki vsebuje 4 vezavna mesta za biotin.  <br /> * Traptavidin, ki se od streptavidina razlikuje v dveh točkovnih mutacijah, ki povzročita povečano afiniteto  do biotina. Poleg tega ima traptavidin izboljšano termostabilnost in funkcionalnost pri višjih temperaturah (TM~10 °C višja). <br /> * Streptacin, ki vsebuje 8 aminokislin dolgo strep-tag oznako, ki omogoča enostavno in učinkovito čiščenje z afinitetno kromatografijo. <br /> * Monomeni avidin (eMA), ki lahko veže le eno biotinsko molekulo, kar prepreči nastanek neželenih prečnih povezav z biotinskimi konjugati. <br />   <br /> Vezavne lastnosti posameznih variant avidina so ovrednotili s fluorescenčno titracijo. To je metoda pri kateri titriramo protein z ligandom in ob spremljanju spremembe intrinzične fluorescence proteina. Iz eksperimentalnih podatkov so izračunali konstante disociacije KD, s katerimi so ovrednotili afinitete vezave. Najvišjo afiniteto je kazal monomerni avidin. <br /> <br /> Pripravili so tudi različne biotinilirane proteine. <br /> <br /> * PAS-lizin, ki je polipeptid sestavljen iz ponovitev prolin-alanin-serin z lizinom na vsakem 20 mestu, katerega lahko biotiniliramo. <br /> * Zeleni fluorescirajoči protein (eGFP), ki omogoča opazovanje poteka polimerizacije pod fluorescenčnim mikroskopom. <br /> * Goveji serumski albumin, ki je pogosto uporabljan v laboratoriju kot proteinski standard, ker vsebuje 60 lizinskih ostankov in je dobro topen je tudi potencialno primeren kot biotiniliran povezovalec za celice. <br /> <br /> Za biotinilacijo proteinov so uporabili biotin, ki je zaestren z N-hidroksisucinimidno skupino (biotin-NHS). NHS estri lahko zreagirajo z primarnimi ali sekundarnimi amini prek SN2 reakcijskega mehanizma, pri čemer pride do tvorbe amidne vezi. (NSH estri se veliko uporabljajo za konjugiranje proteinov z fluorescenčnimi barvili ali biotinom.) Da bi zaščitili biotinilirane proteine pred delovanjem serumske biotinidaze (encim, ki odceplja biotin) so uporabili različne derivate biotina odporne na cepitev. <br /> <br /> == Polimerizacijski poizkusi ==<br /> Pri polimerizacijskih poizkusih so uporabili celice, ki so na površini izražale scAvidin, biotiniliran BSA in streptavidin. Prve eksperimente niso izvajali s printerjem ampak pod fluorescenčnim mikroskopom. Suspenzijo celic so uvedli v medij, ki je vseboval biotiniliran BSA, ta je služil kot ligand za celične receptorje. Nastalo mešanico so po kapljicah injicirali v rezervoar z raztopino streptavidina, kjer je potekla polimerizacija nanešenih celic.    <br /> <br /> Za potrebe vizualizacije so v medij s celicami dodali manjšo količino biotiniliranega GFP.  Ugotovili so, da je polimerizacija odvisna od treh dejavnikov: celične gostote, koncentracije ligandov (biotiniliranega BSA) v mediju in koncentracije streptavidina v rezervoarju. Testirali so tudi druge ligande, kot najboljša povezovalna proteina sta se izkazala biotiniliran PAS-lizin in biotiniliran BSA.  <br />  <br /> Ko so iz množice poizkusov določili optimalna razmerja celic in ostalih komponent so prešli na uporabo 3D biotiskanja. Uporabili so konvencionalni 3D printer Ultimaker 2 plus, katerega so predhodno modificirali v biotiskalnik, tako da so sami natisnili mankajoče komponente printerja oz. dokupili določene dele. Njihov končni izdelek je omogočal injiciranje celic na milimeter natančno.  <br /> <br /> Da bi zagotovili fiksno pritrjevanje prve plasti celic na podlago, so podlago prekrili z poli-D- lizinom, katerega so biotinilirali z dodatkom biotin-NSH estra. Tako so pridobili začetno z biotinom prekrito plast, na katero so se celice lahko pritrdile prek avidinskega receptorja. Za ovrednotenje stabilnost nanosa celic, so v posamezne plasti nanašali različno obarvane celice. Z opazovanjem pod fluorescenčnim mikroskopom so ovrednotili, da sta celični plasti fiksno pritrjeni ena na drugo, in da enako obarvane celice ležijo v isti ravnini, celice so tudi po stresanju ohranile svojo lego v zamreženi strukturi.  <br /> <br /> == Hibridna naprava za kontrolo ravni glukoze v krvi ==<br /> Tehnologijo biotiskanja bi lahko izkoristili tudi za pripravo biološko-mehatronskih naprav, za uravnavanje porušene homeostaze pri nekaterih patoloških stanjih. Lahko bi na primer razvili hibridne organe, v katerih bi elektromehanske komponente zaznavale biološke signale iz okolice in komunicirale s celicami v tkivu ter jih usmerjale v pravilno delovanje. Tehnologija biotiskanja bi omogočila povezovanje bioloških komponent z nebiološkimi v obliko primerno za inplantacijo v bolnika. <br /> <br /> Kot praktični primer takšne aplikacije so si zamislili hibridno napravo, ki bi uravnavala izločanje inzulina pri bolnikih s sladkorno boleznijo tip I.  Mehanski del naprave bi meril koncentracijo glukoze in inzulina v krvi in na podlagi tega posredoval signale do tarčnih celic, ki bi sprožile oz. zavrle izločanje inzulina glede na trenutne potrebe organizma. <br /> Prenos signala iz električnega vezja na tarčne celice bi potekal preko svetlobe določene valovne dolžine, ki bi jo celice zaznale s pomočjo specifičnih receptorjev na membrani. V notranjosti celice bi se v prisotnosti svetlobe sprožili signalni mehanizmi, ki bi vodili v porast Ca2+ v citosolu, in posledično sprožili izražanje genov, ki so pod kontrolo od Ca2+ odzivnih elementov. Celice bi predhodno dizajnirali tako, da bi vsebovale gen za preproinzulin ki bi se izražal pod kontrolo od Ca2+ odzivnega promotorja. <br /> <br /> Da bi testirali svojo zamisel so v celicah izrazili sistem, ki združuje signalno pot med receptorjem za modro svetlobo, fototropinom, in kalcijevim kanalčkom Orai na endoplazemskem retikulumu. Sistem deluje tako, da se v prisotnosti svetlobe iz fuzijskega receptorja fototropina odcepi protein Stim1, ki aktivira Ca2+ kanalček Orai, kar privede do izločanja Ca2+ iz endoplazemskega retikuluma v citosol. V genom celice so ustavili tudi konstrukt, ki je vseboval promotor s tremi Ca2+ odzivnimi elementi (SRE, CRE in NFAT odzivni elementi), ki so uravnavali izražanje nanoluciferinaze. Preko fluorescence nanoluciferinaze so tako izmerili odziv promotorja na obsevanje celic z modro svetlobo. Poizkus je bil uspešen, celice so po obsevanju z modro svetlobo 4-5x več nanoluciferinaze kot kontrolne celice.  <br /> <br /> <br /> ==Viri==<br /> # iGEM projekt BiotINK - rethINK tissue printing, dostopen na povezavi: http://2016.igem.org/Team:LMU-TUM_Munich <br /> # Ozbolat IT, Yin Y: Bioprinting toward organ fabrication: challenges and future trends. IEEE Transactions on Biomedical Engineering 60.3 (2013): 691-699. <br /> <br /> [[Seminarji SB 12016/17]]</div>

Mateja Cigoj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BiotINK_-_nov_pristop_k_biotiskanju_tkiva&diff=11956 2016-12-04T10:17:05Z

<p>Mateja Cigoj: /* Tehnologija biotiskanja */</p> <hr /> <div>LMU-TUM München: BiotINK - rethINK tissue printing, http://2016.igem.org/Team:LMU-TUM_Munich <br /> <br /> == Tehnologija biotiskanja ==<br /> <br /> Biotiskanje je postopek priprave večplastnih celičnih struktur in uporabo tehnologije 3D tiskanja. Biotiskanje predstavlja velik doprinos na področju regnerativne medicine, ker omogoča izdelavo tkivnih presadkov iz bolnikovih lastnih celic. Poleg tega so tkivni modeli uporabni tudi za potrebe farmakoloških in toksikoloških študij ter za študije razvoja bolezni. Današnja tehnologija biotiskanja omogoča pripravo nekaterih enostavnejših tkiv, na primer večplastnih modelov kože, hrustanca, kosti, žil in sapnika. Tiskanje popolnih funkcionalnih organov trenutno še ni mogoče, zaradi kompleksnosti različnih celičnih struktur.  <br /> <br /> Večina tehnik biotiskanja temelji na nanašanju celic na podporni matriks, ki predstavlja oporo za celice in oblikuje strukturo tkiva. Po določenem času začnejo celice oblikovati intercelularne kontakte in začnejo rasti v dvodimenzionalnih celičnih plasteh. Za rekonstrukcijo tkiva se morajo celične plasti medsebojno povezati in podporno ogrodje pa se razgradi ter nadomesti s komponentami zunajceličnega matriksa, ki jih sintetizirajo celice. Biotiskanje je tehnično gledano kompleksen, dolgotrajen in drag proces, ki je še v fazi razvoja. En od glavnih izzivov ostaja izbira primernega podpornega materiala za izdelavo celičnega ogrodja, ki bo kompatibilno z biološkim okoljem v katerega ga vgradimo.  <br /> <br /> Skupina študentov iz Münchna je za tekmovanje iGEM si je postavila cilj izboljšati tehniko biotiskanja, da bo postopek hitrejši, cenejši in bolj učinkovit. Zamislili so si sistem v katerem celice na površini izražajo receptorje z vezanim avidinom oz. molekulami biotina in medij, ki vsebuje streptavidin oz. biotinilirane proteine. Interakcija med molekulami biotina in streptavidina, s kostanto disociacije 10-15 M-1, je ena izmed najmočnejših bioloških interakcij (za primerjavo je konstanta disociacije protiteles v območju 10-7 – 10-11 M-1). Prednost takšnega sistema je, da celice ne potrebujejo podpornega ogrodja, na katere bi jih nanašali, temveč interakcije med omenjenimi celičnimi receptorji in ligandi v mediju omogočijo takojšnje premreženje celic tekom samega tiskanja in nastanek stabilnih tridimenzionalnih celičnih struktur.  <br /> <br /> == Membranski proteini == <br />  <br /> Na celicah so izrazili dva tipa membranskih proteinov (receptorjev), ki bi omogočali polimerizacijo celic: <br /> * Receptor z biotin akceptorskim peptidom (BAP), ki omogoča reakcije z streptavidinom in drugimi variantami avidina. BAP je 15 aminokislin dolg peptid, ki izvira iz E.coli. Biotiniliranje peptida je potekalo endogeno s soizraženo bakterijsko biotin ligazo BirA. <br /> * Receptor z avidinsko podenoto, ki omogoča povezovanje z biotiniliranimi proteini. Testiral so dve različici avidina in sicer monomerni avidin, ki predstavlja eno samo podenoto tetramernega avidina in t.i. enoverižni avidin (scAvidin), ki je podoben naravnemu avidinu, z razliko da je sestavljen zgolj iz ene polipeptidne verige. <br /> <br /> ===Priprava konstruktov===<br /> <br /> Za receptorske proteine so pripravili konstrukte, ki so vsebovali CMV promotor, signalni peptid BM40, funkcionalni membranski protein in poliadenilacijski signal.  <br /> Za sidranje proteina v celično membrano so uporabili transmembransko regijo EGF receptorja (BBa_K157002), kateri so na C-konec dodali t.i. stop-transfer sekvenco, iz naravnega EGF receptorja in fleksibilne povezovalce (GGGGC)2 na obeh koncih. Za preverjanje pravilne ekspresije in lokalizacije receptorja, so v receptorski konstrukt vnesli 3 elemente za detekcijo: rdeči fluorescenčni protein mRuby 3 za detekcijo receptorja s fluorescenčnim mikroskopom, epitop za A3C5 protitelesa za imunokemično detekcijo in Strep-tag II oznako za detekcijo in čiščenje z imunokemijskimi metodami. <br /> <br /> Konstrukte so testirali v MEXiTM celični liniji, ki omogoča semi-stabilno transfekcijo. Gre za suspenzijo humane celične linije HEK293E, ki ima v genomu vgrajen virusni protein EBNA1 iz Eppstein-Barr virusa, ki uravnava iniciacijo replikacije virusa in skrbi za ohranjanje virusne DNA v gostiteljski celici. MEXiTM celična linija vsebuje vektorski plazmid pDSG-IBA, katerega začetno mesto replikacije (ORI) prepozna protein EBNA1, ki pritegne faktorje replikacije in sproži podvajanje plazmida. Receptorske konstrukte so klonirali v pDSG-iGEM plazmid in transficirali MEXi celice. Transfekcijo so izvedli s kationskim polimerom polietilen iminom, ki tvori kompleks z negativno nabito DNA, ki lahko ustopa v celico prek endocitoze.  <br /> <br /> Kasneje so konstrukte vključili tudi v genom celic. Za ta namen so uporabili sistem FlpIn™. Gre za tri-komponentni sistem, v katerem nastopajo HEK-TRex™-293 celice z kromosomskim Flp rekobinacijskim mestom, plazmid z zapisom za Flp rekombinazo in plazmid z želenim vključkom, ki tudi vsebuje Flp rekombinacijsko mesto, ki omogoča vgraditev v tarčni kromosom. Celice, ki uspešno integrirajo plazmid v svoj genom izgubijo rezistenco na Zeocin™, obenem pa pridobijo odpornost na higromicin B, ker plazmid nosi zapis za higromicin-fosfotransferazo, ki s svojo kinazno aktivnostjo inaktivira higromicin B.  <br /> <br /> == Ligandi za membranske proteine ==<br /> V bakterijah E.coli so izrazili štirih različne variente avidina.  <br />   <br /> * Streptavidin divjega tipa, ki vsebuje 4 vezavna mesta za biotin.  <br /> * Traptavidin, ki se od streptavidina razlikuje v dveh točkovnih mutacijah, ki povzročita povečano afiniteto  do biotina. Poleg tega ima traptavidin izboljšano termostabilnost in funkcionalnost pri višjih temperaturah (TM~10 °C višja). <br /> * Streptacin, ki vsebuje 8 aminokislin dolgo strep-tag oznako, ki omogoča enostavno in učinkovito čiščenje z afinitetno kromatografijo. <br /> * Monomeni avidin (eMA), ki lahko veže le eno biotinsko molekulo, kar prepreči nastanek neželenih prečnih povezav z biotinskimi konjugati. <br />   <br /> Vezavne lastnosti posameznih variant avidina so ovrednotili s fluorescenčno titracijo. To je metoda pri kateri titriramo protein z ligandom in ob spremljanju spremembe intrinzične fluorescence proteina. Iz eksperimentalnih podatkov so izračunali konstante disociacije KD, s katerimi so ovrednotili afinitete vezave. Najvišjo afiniteto je kazal monomerni avidin. <br /> <br /> Pripravili so tudi različne biotinilirane proteine. <br /> <br /> * PAS-lizin, ki je polipeptid sestavljen iz ponovitev prolin-alanin-serin z lizinom na vsakem 20 mestu, katerega lahko biotiniliramo. <br /> * Zeleni fluorescirajoči protein (eGFP), ki omogoča opazovanje poteka polimerizacije pod fluorescenčnim mikroskopom. <br /> * Goveji serumski albumin, ki je pogosto uporabljan v laboratoriju kot proteinski standard, ker vsebuje 60 lizinskih ostankov in je dobro topen je tudi potencialno primeren kot biotiniliran povezovalec za celice. <br /> <br /> Za biotinilacijo proteinov so uporabili biotin, ki je zaestren z N-hidroksisucinimidno skupino (biotin-NHS). NHS estri lahko zreagirajo z primarnimi ali sekundarnimi amini prek SN2 reakcijskega mehanizma, pri čemer pride do tvorbe amidne vezi. (NSH estri se veliko uporabljajo za konjugiranje proteinov z fluorescenčnimi barvili ali biotinom.) Da bi zaščitili biotinilirane proteine pred delovanjem serumske biotinidaze (encim, ki odceplja biotin) so uporabili različne derivate biotina odporne na cepitev. <br /> <br /> == Polimerizacijski poizkusi ==<br /> Pri polimerizacijskih poizkusih so uporabili celice, ki so na površini izražale scAvidin, biotiniliran BSA in streptavidin. Prve eksperimente niso izvajali s printerjem ampak pod fluorescenčnim mikroskopom. Suspenzijo celic so uvedli v medij, ki je vseboval biotiniliran BSA, ta je služil kot ligand za celične receptorje. Nastalo mešanico so po kapljicah injicirali v rezervoar z raztopino streptavidina, kjer je potekla polimerizacija nanešenih celic.    <br /> <br /> Za potrebe vizualizacije so v medij s celicami dodali manjšo količino biotiniliranega GFP.  Ugotovili so, da je polimerizacija odvisna od treh dejavnikov: celične gostote, koncentracije ligandov (biotiniliranega BSA) v mediju in koncentracije streptavidina v rezervoarju. Testirali so tudi druge ligande, kot najboljša povezovalna proteina sta se izkazala biotiniliran PAS-lizin in biotiniliran BSA.  <br />  <br /> Ko so iz množice poizkusov določili optimalna razmerja celic in ostalih komponent so prešli na uporabo 3D biotiskanja. Uporabili so konvencionalni 3D printer Ultimaker 2 plus, katerega so predhodno modificirali v biotiskalnik, tako da so sami natisnili mankajoče komponente printerja oz. dokupili določene dele. Njihov končni izdelek je omogočal injiciranje celic na milimeter natančno.  <br /> <br /> Da bi zagotovili fiksno pritrjevanje prve plasti celic na podlago, so podlago prekrili z poli-D- lizinom, katerega so biotinilirali z dodatkom biotin-NSH estra. Tako so pridobili začetno z biotinom prekrito plast, na katero so se celice lahko pritrdile prek avidinskega receptorja. Za ovrednotenje stabilnost nanosa celic, so v posamezne plasti nanašali različno obarvane celice. Z opazovanjem pod fluorescenčnim mikroskopom so ovrednotili, da sta celični plasti fiksno pritrjeni ena na drugo, in da enako obarvane celice ležijo v isti ravnini, celice so tudi po stresanju ohranile svojo lego v zamreženi strukturi.  <br /> <br /> == Hibridna naprava za kontrolo ravni glukoze v krvi ==<br /> Tehnologijo biotiskanja bi lahko izkoristili tudi za pripravo biološko-mehatronskih naprav, za uravnavanje porušene homeostaze pri nekaterih patoloških stanjih. Lahko bi na primer razvili hibridne organe, v katerih bi elektromehanske komponente zaznavale biološke signale iz okolice in komunicirale s celicami v tkivu ter jih usmerjale v pravilno delovanje. Tehnologija biotiskanja bi omogočila povezovanje bioloških komponent z nebiološkimi v obliko primerno za inplantacijo v bolnika. <br /> <br /> Kot praktični primer takšne aplikacije so si zamislili hibridno napravo, ki bi uravnavala izločanje inzulina pri bolnikih s sladkorno boleznijo tip I.  Mehanski del naprave bi meril koncentracijo glukoze in inzulina v krvi in na podlagi tega posredoval signale do tarčnih celic, ki bi sprožile oz. zavrle izločanje inzulina glede na trenutne potrebe organizma. <br /> Prenos signala iz električnega vezja na tarčne celice bi potekal preko svetlobe določene valovne dolžine, ki bi jo celice zaznale s pomočjo specifičnih receptorjev na membrani. V notranjosti celice bi se v prisotnosti svetlobe sprožili signalni mehanizmi, ki bi vodili v porast Ca2+ v citosolu, in posledično sprožili izražanje genov, ki so pod kontrolo od Ca2+ odzivnih elementov. Celice bi predhodno dizajnirali tako, da bi vsebovale gen za preproinzulin ki bi se izražal pod kontrolo od Ca2+ odzivnega promotorja. <br /> <br /> Da bi testirali svojo zamisel so v celicah izrazili sistem, ki združuje signalno pot med receptorjem za modro svetlobo, fototropinom, in kalcijevim kanalčkom Orai na endoplazemskem retikulumu. Sistem deluje tako, da se v prisotnosti svetlobe iz fuzijskega receptorja fototropina odcepi protein Stim1, ki aktivira Ca2+ kanalček Orai, kar privede do izločanja Ca2+ iz endoplazemskega retikuluma v citosol. V genom celice so ustavili tudi konstrukt, ki je vseboval promotor s tremi Ca2+ odzivnimi elementi (SRE, CRE in NFAT odzivni elementi), ki so uravnavali izražanje nanoluciferinaze. Preko fluorescence nanoluciferinaze so tako izmerili odziv promotorja na obsevanje celic z modro svetlobo. Poizkus je bil uspešen, celice so po obsevanju z modro svetlobo 4-5x več nanoluciferinaze kot kontrolne celice.  <br /> <br /> <br /> ==Viri==<br /> # iGEM projekt BiotINK - rethINK tissue printing, dostopen na povezavi: http://2016.igem.org/Team:LMU-TUM_Munich <br /> # Ozbolat IT, Yin Y: Bioprinting toward organ fabrication: challenges and future trends. IEEE Transactions on Biomedical Engineering 60.3 (2013): 691-699. <br /> <br /> [[Seminarji SB 12016/17]]</div>

Mateja Cigoj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BiotINK_-_nov_pristop_k_biotiskanju_tkiva&diff=11954 2016-12-03T21:03:01Z

<p>Mateja Cigoj: </p> <hr /> <div>LMU-TUM München: BiotINK - rethINK tissue printing, http://2016.igem.org/Team:LMU-TUM_Munich <br /> <br /> == Tehnologija biotiskanja ==<br /> <br /> Biotiskanje je postopek, priprave večplastnih celičnih struktur in uporabo tehnologije 3D tiskanja. Biotiskanje predstavlja velik doprinos na področju regnerativne medicine, ker omogoča izdelavo tkivnih presadkov iz bolnikovih lastnih celic. Poleg tega so tkivni modeli uporabni tudi za potrebe farmakoloških in toksikoloških študij ter za študije razvoja bolezni. Današnja tehnologija biotiskanja omogoča pripravo nekaterih enostavnejših tkiv, na primer večplastnih modelov kože, hrustanca, kosti, žil in sapnika. Tiskanje popolnih funkcionalnih organov trenutno še ni mogoče, zaradi kompleksnosti različnih celičnih struktur.  <br /> <br /> Večina tehnik biotiskanja temelji na nanašanju celic na podporni matriks, ki predstavlja oporo za celice in oblikuje strukturo tkiva. Po določenem času začnejo celice oblikovati intercelularne kontakte in začnejo rasti v dvodimenzionalnih celičnih plasteh. Za rekonstrukcijo tkiva se morajo celične plasti medsebojno povezati in podporno ogrodje pa se razgradi ter nadomesti s komponentami zunajceličnega matriksa, ki jih sintetizirajo celice. Biotiskanje je tehnično gledano kompleksen, dolgotrajen in drag proces, ki je še v fazi razvoja. En od glavnih izzivov ostaja izbira primernega podpornega materiala za izdelavo celičnega ogrodja, ki bo kompatibilno z biološkim okoljem v katerega ga vgradimo.  <br /> <br /> Skupina študentov iz Münchna je za tekmovanje iGEM si je postavila cilj izboljšati tehniko biotiskanja, da bo postopek hitrejši, cenejši in bolj učinkovit. Zamislili so si sistem v katerem celice na površini izražajo receptorje z vezanim avidinom oz. molekulami biotina in medij, ki vsebuje streptavidin oz. biotinilirane proteine. Interakcija med molekulami biotina in streptavidina, s kostanto disociacije 10-15 M-1, je ena izmed najmočnejših bioloških interakcij (za primerjavo je konstanta disociacije protiteles v območju 10-7 – 10-11 M-1). Prednost takšnega sistema je, da celice ne potrebujejo podpornega ogrodja, na katere bi jih nanašali, temveč interakcije med omenjenimi celičnimi receptorji in ligandi v mediju omogočijo takojšnje premreženje celic tekom samega tiskanja in nastanek stabilnih tridimenzionalnih celičnih struktur.  <br /> <br /> == Membranski proteini == <br />  <br /> Na celicah so izrazili dva tipa membranskih proteinov (receptorjev), ki bi omogočali polimerizacijo celic: <br /> * Receptor z biotin akceptorskim peptidom (BAP), ki omogoča reakcije z streptavidinom in drugimi variantami avidina. BAP je 15 aminokislin dolg peptid, ki izvira iz E.coli. Biotiniliranje peptida je potekalo endogeno s soizraženo bakterijsko biotin ligazo BirA. <br /> * Receptor z avidinsko podenoto, ki omogoča povezovanje z biotiniliranimi proteini. Testiral so dve različici avidina in sicer monomerni avidin, ki predstavlja eno samo podenoto tetramernega avidina in t.i. enoverižni avidin (scAvidin), ki je podoben naravnemu avidinu, z razliko da je sestavljen zgolj iz ene polipeptidne verige. <br /> <br /> ===Priprava konstruktov===<br /> <br /> Za receptorske proteine so pripravili konstrukte, ki so vsebovali CMV promotor, signalni peptid BM40, funkcionalni membranski protein in poliadenilacijski signal.  <br /> Za sidranje proteina v celično membrano so uporabili transmembransko regijo EGF receptorja (BBa_K157002), kateri so na C-konec dodali t.i. stop-transfer sekvenco, iz naravnega EGF receptorja in fleksibilne povezovalce (GGGGC)2 na obeh koncih. Za preverjanje pravilne ekspresije in lokalizacije receptorja, so v receptorski konstrukt vnesli 3 elemente za detekcijo: rdeči fluorescenčni protein mRuby 3 za detekcijo receptorja s fluorescenčnim mikroskopom, epitop za A3C5 protitelesa za imunokemično detekcijo in Strep-tag II oznako za detekcijo in čiščenje z imunokemijskimi metodami. <br /> <br /> Konstrukte so testirali v MEXiTM celični liniji, ki omogoča semi-stabilno transfekcijo. Gre za suspenzijo humane celične linije HEK293E, ki ima v genomu vgrajen virusni protein EBNA1 iz Eppstein-Barr virusa, ki uravnava iniciacijo replikacije virusa in skrbi za ohranjanje virusne DNA v gostiteljski celici. MEXiTM celična linija vsebuje vektorski plazmid pDSG-IBA, katerega začetno mesto replikacije (ORI) prepozna protein EBNA1, ki pritegne faktorje replikacije in sproži podvajanje plazmida. Receptorske konstrukte so klonirali v pDSG-iGEM plazmid in transficirali MEXi celice. Transfekcijo so izvedli s kationskim polimerom polietilen iminom, ki tvori kompleks z negativno nabito DNA, ki lahko ustopa v celico prek endocitoze.  <br /> <br /> Kasneje so konstrukte vključili tudi v genom celic. Za ta namen so uporabili sistem FlpIn™. Gre za tri-komponentni sistem, v katerem nastopajo HEK-TRex™-293 celice z kromosomskim Flp rekobinacijskim mestom, plazmid z zapisom za Flp rekombinazo in plazmid z želenim vključkom, ki tudi vsebuje Flp rekombinacijsko mesto, ki omogoča vgraditev v tarčni kromosom. Celice, ki uspešno integrirajo plazmid v svoj genom izgubijo rezistenco na Zeocin™, obenem pa pridobijo odpornost na higromicin B, ker plazmid nosi zapis za higromicin-fosfotransferazo, ki s svojo kinazno aktivnostjo inaktivira higromicin B.  <br /> <br /> == Ligandi za membranske proteine ==<br /> V bakterijah E.coli so izrazili štirih različne variente avidina.  <br />   <br /> * Streptavidin divjega tipa, ki vsebuje 4 vezavna mesta za biotin.  <br /> * Traptavidin, ki se od streptavidina razlikuje v dveh točkovnih mutacijah, ki povzročita povečano afiniteto  do biotina. Poleg tega ima traptavidin izboljšano termostabilnost in funkcionalnost pri višjih temperaturah (TM~10 °C višja). <br /> * Streptacin, ki vsebuje 8 aminokislin dolgo strep-tag oznako, ki omogoča enostavno in učinkovito čiščenje z afinitetno kromatografijo. <br /> * Monomeni avidin (eMA), ki lahko veže le eno biotinsko molekulo, kar prepreči nastanek neželenih prečnih povezav z biotinskimi konjugati. <br />   <br /> Vezavne lastnosti posameznih variant avidina so ovrednotili s fluorescenčno titracijo. To je metoda pri kateri titriramo protein z ligandom in ob spremljanju spremembe intrinzične fluorescence proteina. Iz eksperimentalnih podatkov so izračunali konstante disociacije KD, s katerimi so ovrednotili afinitete vezave. Najvišjo afiniteto je kazal monomerni avidin. <br /> <br /> Pripravili so tudi različne biotinilirane proteine. <br /> <br /> * PAS-lizin, ki je polipeptid sestavljen iz ponovitev prolin-alanin-serin z lizinom na vsakem 20 mestu, katerega lahko biotiniliramo. <br /> * Zeleni fluorescirajoči protein (eGFP), ki omogoča opazovanje poteka polimerizacije pod fluorescenčnim mikroskopom. <br /> * Goveji serumski albumin, ki je pogosto uporabljan v laboratoriju kot proteinski standard, ker vsebuje 60 lizinskih ostankov in je dobro topen je tudi potencialno primeren kot biotiniliran povezovalec za celice. <br /> <br /> Za biotinilacijo proteinov so uporabili biotin, ki je zaestren z N-hidroksisucinimidno skupino (biotin-NHS). NHS estri lahko zreagirajo z primarnimi ali sekundarnimi amini prek SN2 reakcijskega mehanizma, pri čemer pride do tvorbe amidne vezi. (NSH estri se veliko uporabljajo za konjugiranje proteinov z fluorescenčnimi barvili ali biotinom.) Da bi zaščitili biotinilirane proteine pred delovanjem serumske biotinidaze (encim, ki odceplja biotin) so uporabili različne derivate biotina odporne na cepitev. <br /> <br /> == Polimerizacijski poizkusi ==<br /> Pri polimerizacijskih poizkusih so uporabili celice, ki so na površini izražale scAvidin, biotiniliran BSA in streptavidin. Prve eksperimente niso izvajali s printerjem ampak pod fluorescenčnim mikroskopom. Suspenzijo celic so uvedli v medij, ki je vseboval biotiniliran BSA, ta je služil kot ligand za celične receptorje. Nastalo mešanico so po kapljicah injicirali v rezervoar z raztopino streptavidina, kjer je potekla polimerizacija nanešenih celic.    <br /> <br /> Za potrebe vizualizacije so v medij s celicami dodali manjšo količino biotiniliranega GFP.  Ugotovili so, da je polimerizacija odvisna od treh dejavnikov: celične gostote, koncentracije ligandov (biotiniliranega BSA) v mediju in koncentracije streptavidina v rezervoarju. Testirali so tudi druge ligande, kot najboljša povezovalna proteina sta se izkazala biotiniliran PAS-lizin in biotiniliran BSA.  <br />  <br /> Ko so iz množice poizkusov določili optimalna razmerja celic in ostalih komponent so prešli na uporabo 3D biotiskanja. Uporabili so konvencionalni 3D printer Ultimaker 2 plus, katerega so predhodno modificirali v biotiskalnik, tako da so sami natisnili mankajoče komponente printerja oz. dokupili določene dele. Njihov končni izdelek je omogočal injiciranje celic na milimeter natančno.  <br /> <br /> Da bi zagotovili fiksno pritrjevanje prve plasti celic na podlago, so podlago prekrili z poli-D- lizinom, katerega so biotinilirali z dodatkom biotin-NSH estra. Tako so pridobili začetno z biotinom prekrito plast, na katero so se celice lahko pritrdile prek avidinskega receptorja. Za ovrednotenje stabilnost nanosa celic, so v posamezne plasti nanašali različno obarvane celice. Z opazovanjem pod fluorescenčnim mikroskopom so ovrednotili, da sta celični plasti fiksno pritrjeni ena na drugo, in da enako obarvane celice ležijo v isti ravnini, celice so tudi po stresanju ohranile svojo lego v zamreženi strukturi.  <br /> <br /> == Hibridna naprava za kontrolo ravni glukoze v krvi ==<br /> Tehnologijo biotiskanja bi lahko izkoristili tudi za pripravo biološko-mehatronskih naprav, za uravnavanje porušene homeostaze pri nekaterih patoloških stanjih. Lahko bi na primer razvili hibridne organe, v katerih bi elektromehanske komponente zaznavale biološke signale iz okolice in komunicirale s celicami v tkivu ter jih usmerjale v pravilno delovanje. Tehnologija biotiskanja bi omogočila povezovanje bioloških komponent z nebiološkimi v obliko primerno za inplantacijo v bolnika. <br /> <br /> Kot praktični primer takšne aplikacije so si zamislili hibridno napravo, ki bi uravnavala izločanje inzulina pri bolnikih s sladkorno boleznijo tip I.  Mehanski del naprave bi meril koncentracijo glukoze in inzulina v krvi in na podlagi tega posredoval signale do tarčnih celic, ki bi sprožile oz. zavrle izločanje inzulina glede na trenutne potrebe organizma. <br /> Prenos signala iz električnega vezja na tarčne celice bi potekal preko svetlobe določene valovne dolžine, ki bi jo celice zaznale s pomočjo specifičnih receptorjev na membrani. V notranjosti celice bi se v prisotnosti svetlobe sprožili signalni mehanizmi, ki bi vodili v porast Ca2+ v citosolu, in posledično sprožili izražanje genov, ki so pod kontrolo od Ca2+ odzivnih elementov. Celice bi predhodno dizajnirali tako, da bi vsebovale gen za preproinzulin ki bi se izražal pod kontrolo od Ca2+ odzivnega promotorja. <br /> <br /> Da bi testirali svojo zamisel so v celicah izrazili sistem, ki združuje signalno pot med receptorjem za modro svetlobo, fototropinom, in kalcijevim kanalčkom Orai na endoplazemskem retikulumu. Sistem deluje tako, da se v prisotnosti svetlobe iz fuzijskega receptorja fototropina odcepi protein Stim1, ki aktivira Ca2+ kanalček Orai, kar privede do izločanja Ca2+ iz endoplazemskega retikuluma v citosol. V genom celice so ustavili tudi konstrukt, ki je vseboval promotor s tremi Ca2+ odzivnimi elementi (SRE, CRE in NFAT odzivni elementi), ki so uravnavali izražanje nanoluciferinaze. Preko fluorescence nanoluciferinaze so tako izmerili odziv promotorja na obsevanje celic z modro svetlobo. Poizkus je bil uspešen, celice so po obsevanju z modro svetlobo 4-5x več nanoluciferinaze kot kontrolne celice.  <br /> <br /> <br /> ==Viri==<br /> # iGEM projekt BiotINK - rethINK tissue printing, dostopen na povezavi: http://2016.igem.org/Team:LMU-TUM_Munich <br /> # Ozbolat IT, Yin Y: Bioprinting toward organ fabrication: challenges and future trends. IEEE Transactions on Biomedical Engineering 60.3 (2013): 691-699. <br /> <br /> [[Seminarji SB 12016/17]]</div>

Mateja Cigoj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BiotINK_-_nov_pristop_k_biotiskanju_tkiva&diff=11953 2016-12-03T21:02:12Z

<p>Mateja Cigoj: /* Tehnologija biotiskanja */</p> <hr /> <div>LMU-TUM München: BiotINK - rethINK tissue printing http://2016.igem.org/Team:LMU-TUM_Munich <br /> <br /> == Tehnologija biotiskanja ==<br /> <br /> Biotiskanje je postopek, priprave večplastnih celičnih struktur in uporabo tehnologije 3D tiskanja. Biotiskanje predstavlja velik doprinos na področju regnerativne medicine, ker omogoča izdelavo tkivnih presadkov iz bolnikovih lastnih celic. Poleg tega so tkivni modeli uporabni tudi za potrebe farmakoloških in toksikoloških študij ter za študije razvoja bolezni. Današnja tehnologija biotiskanja omogoča pripravo nekaterih enostavnejših tkiv, na primer večplastnih modelov kože, hrustanca, kosti, žil in sapnika. Tiskanje popolnih funkcionalnih organov trenutno še ni mogoče, zaradi kompleksnosti različnih celičnih struktur.  <br /> <br /> Večina tehnik biotiskanja temelji na nanašanju celic na podporni matriks, ki predstavlja oporo za celice in oblikuje strukturo tkiva. Po določenem času začnejo celice oblikovati intercelularne kontakte in začnejo rasti v dvodimenzionalnih celičnih plasteh. Za rekonstrukcijo tkiva se morajo celične plasti medsebojno povezati in podporno ogrodje pa se razgradi ter nadomesti s komponentami zunajceličnega matriksa, ki jih sintetizirajo celice. Biotiskanje je tehnično gledano kompleksen, dolgotrajen in drag proces, ki je še v fazi razvoja. En od glavnih izzivov ostaja izbira primernega podpornega materiala za izdelavo celičnega ogrodja, ki bo kompatibilno z biološkim okoljem v katerega ga vgradimo.  <br /> <br /> Skupina študentov iz Münchna je za tekmovanje iGEM si je postavila cilj izboljšati tehniko biotiskanja, da bo postopek hitrejši, cenejši in bolj učinkovit. Zamislili so si sistem v katerem celice na površini izražajo receptorje z vezanim avidinom oz. molekulami biotina in medij, ki vsebuje streptavidin oz. biotinilirane proteine. Interakcija med molekulami biotina in streptavidina, s kostanto disociacije 10-15 M-1, je ena izmed najmočnejših bioloških interakcij (za primerjavo je konstanta disociacije protiteles v območju 10-7 – 10-11 M-1). Prednost takšnega sistema je, da celice ne potrebujejo podpornega ogrodja, na katere bi jih nanašali, temveč interakcije med omenjenimi celičnimi receptorji in ligandi v mediju omogočijo takojšnje premreženje celic tekom samega tiskanja in nastanek stabilnih tridimenzionalnih celičnih struktur.  <br /> <br /> == Membranski proteini == <br />  <br /> Na celicah so izrazili dva tipa membranskih proteinov (receptorjev), ki bi omogočali polimerizacijo celic: <br /> * Receptor z biotin akceptorskim peptidom (BAP), ki omogoča reakcije z streptavidinom in drugimi variantami avidina. BAP je 15 aminokislin dolg peptid, ki izvira iz E.coli. Biotiniliranje peptida je potekalo endogeno s soizraženo bakterijsko biotin ligazo BirA. <br /> * Receptor z avidinsko podenoto, ki omogoča povezovanje z biotiniliranimi proteini. Testiral so dve različici avidina in sicer monomerni avidin, ki predstavlja eno samo podenoto tetramernega avidina in t.i. enoverižni avidin (scAvidin), ki je podoben naravnemu avidinu, z razliko da je sestavljen zgolj iz ene polipeptidne verige. <br /> <br /> ===Priprava konstruktov===<br /> <br /> Za receptorske proteine so pripravili konstrukte, ki so vsebovali CMV promotor, signalni peptid BM40, funkcionalni membranski protein in poliadenilacijski signal.  <br /> Za sidranje proteina v celično membrano so uporabili transmembransko regijo EGF receptorja (BBa_K157002), kateri so na C-konec dodali t.i. stop-transfer sekvenco, iz naravnega EGF receptorja in fleksibilne povezovalce (GGGGC)2 na obeh koncih. Za preverjanje pravilne ekspresije in lokalizacije receptorja, so v receptorski konstrukt vnesli 3 elemente za detekcijo: rdeči fluorescenčni protein mRuby 3 za detekcijo receptorja s fluorescenčnim mikroskopom, epitop za A3C5 protitelesa za imunokemično detekcijo in Strep-tag II oznako za detekcijo in čiščenje z imunokemijskimi metodami. <br /> <br /> Konstrukte so testirali v MEXiTM celični liniji, ki omogoča semi-stabilno transfekcijo. Gre za suspenzijo humane celične linije HEK293E, ki ima v genomu vgrajen virusni protein EBNA1 iz Eppstein-Barr virusa, ki uravnava iniciacijo replikacije virusa in skrbi za ohranjanje virusne DNA v gostiteljski celici. MEXiTM celična linija vsebuje vektorski plazmid pDSG-IBA, katerega začetno mesto replikacije (ORI) prepozna protein EBNA1, ki pritegne faktorje replikacije in sproži podvajanje plazmida. Receptorske konstrukte so klonirali v pDSG-iGEM plazmid in transficirali MEXi celice. Transfekcijo so izvedli s kationskim polimerom polietilen iminom, ki tvori kompleks z negativno nabito DNA, ki lahko ustopa v celico prek endocitoze.  <br /> <br /> Kasneje so konstrukte vključili tudi v genom celic. Za ta namen so uporabili sistem FlpIn™. Gre za tri-komponentni sistem, v katerem nastopajo HEK-TRex™-293 celice z kromosomskim Flp rekobinacijskim mestom, plazmid z zapisom za Flp rekombinazo in plazmid z želenim vključkom, ki tudi vsebuje Flp rekombinacijsko mesto, ki omogoča vgraditev v tarčni kromosom. Celice, ki uspešno integrirajo plazmid v svoj genom izgubijo rezistenco na Zeocin™, obenem pa pridobijo odpornost na higromicin B, ker plazmid nosi zapis za higromicin-fosfotransferazo, ki s svojo kinazno aktivnostjo inaktivira higromicin B.  <br /> <br /> == Ligandi za membranske proteine ==<br /> V bakterijah E.coli so izrazili štirih različne variente avidina.  <br />   <br /> * Streptavidin divjega tipa, ki vsebuje 4 vezavna mesta za biotin.  <br /> * Traptavidin, ki se od streptavidina razlikuje v dveh točkovnih mutacijah, ki povzročita povečano afiniteto  do biotina. Poleg tega ima traptavidin izboljšano termostabilnost in funkcionalnost pri višjih temperaturah (TM~10 °C višja). <br /> * Streptacin, ki vsebuje 8 aminokislin dolgo strep-tag oznako, ki omogoča enostavno in učinkovito čiščenje z afinitetno kromatografijo. <br /> * Monomeni avidin (eMA), ki lahko veže le eno biotinsko molekulo, kar prepreči nastanek neželenih prečnih povezav z biotinskimi konjugati. <br />   <br /> Vezavne lastnosti posameznih variant avidina so ovrednotili s fluorescenčno titracijo. To je metoda pri kateri titriramo protein z ligandom in ob spremljanju spremembe intrinzične fluorescence proteina. Iz eksperimentalnih podatkov so izračunali konstante disociacije KD, s katerimi so ovrednotili afinitete vezave. Najvišjo afiniteto je kazal monomerni avidin. <br /> <br /> Pripravili so tudi različne biotinilirane proteine. <br /> <br /> * PAS-lizin, ki je polipeptid sestavljen iz ponovitev prolin-alanin-serin z lizinom na vsakem 20 mestu, katerega lahko biotiniliramo. <br /> * Zeleni fluorescirajoči protein (eGFP), ki omogoča opazovanje poteka polimerizacije pod fluorescenčnim mikroskopom. <br /> * Goveji serumski albumin, ki je pogosto uporabljan v laboratoriju kot proteinski standard, ker vsebuje 60 lizinskih ostankov in je dobro topen je tudi potencialno primeren kot biotiniliran povezovalec za celice. <br /> <br /> Za biotinilacijo proteinov so uporabili biotin, ki je zaestren z N-hidroksisucinimidno skupino (biotin-NHS). NHS estri lahko zreagirajo z primarnimi ali sekundarnimi amini prek SN2 reakcijskega mehanizma, pri čemer pride do tvorbe amidne vezi. (NSH estri se veliko uporabljajo za konjugiranje proteinov z fluorescenčnimi barvili ali biotinom.) Da bi zaščitili biotinilirane proteine pred delovanjem serumske biotinidaze (encim, ki odceplja biotin) so uporabili različne derivate biotina odporne na cepitev. <br /> <br /> == Polimerizacijski poizkusi ==<br /> Pri polimerizacijskih poizkusih so uporabili celice, ki so na površini izražale scAvidin, biotiniliran BSA in streptavidin. Prve eksperimente niso izvajali s printerjem ampak pod fluorescenčnim mikroskopom. Suspenzijo celic so uvedli v medij, ki je vseboval biotiniliran BSA, ta je služil kot ligand za celične receptorje. Nastalo mešanico so po kapljicah injicirali v rezervoar z raztopino streptavidina, kjer je potekla polimerizacija nanešenih celic.    <br /> <br /> Za potrebe vizualizacije so v medij s celicami dodali manjšo količino biotiniliranega GFP.  Ugotovili so, da je polimerizacija odvisna od treh dejavnikov: celične gostote, koncentracije ligandov (biotiniliranega BSA) v mediju in koncentracije streptavidina v rezervoarju. Testirali so tudi druge ligande, kot najboljša povezovalna proteina sta se izkazala biotiniliran PAS-lizin in biotiniliran BSA.  <br />  <br /> Ko so iz množice poizkusov določili optimalna razmerja celic in ostalih komponent so prešli na uporabo 3D biotiskanja. Uporabili so konvencionalni 3D printer Ultimaker 2 plus, katerega so predhodno modificirali v biotiskalnik, tako da so sami natisnili mankajoče komponente printerja oz. dokupili določene dele. Njihov končni izdelek je omogočal injiciranje celic na milimeter natančno.  <br /> <br /> Da bi zagotovili fiksno pritrjevanje prve plasti celic na podlago, so podlago prekrili z poli-D- lizinom, katerega so biotinilirali z dodatkom biotin-NSH estra. Tako so pridobili začetno z biotinom prekrito plast, na katero so se celice lahko pritrdile prek avidinskega receptorja. Za ovrednotenje stabilnost nanosa celic, so v posamezne plasti nanašali različno obarvane celice. Z opazovanjem pod fluorescenčnim mikroskopom so ovrednotili, da sta celični plasti fiksno pritrjeni ena na drugo, in da enako obarvane celice ležijo v isti ravnini, celice so tudi po stresanju ohranile svojo lego v zamreženi strukturi.  <br /> <br /> == Hibridna naprava za kontrolo ravni glukoze v krvi ==<br /> Tehnologijo biotiskanja bi lahko izkoristili tudi za pripravo biološko-mehatronskih naprav, za uravnavanje porušene homeostaze pri nekaterih patoloških stanjih. Lahko bi na primer razvili hibridne organe, v katerih bi elektromehanske komponente zaznavale biološke signale iz okolice in komunicirale s celicami v tkivu ter jih usmerjale v pravilno delovanje. Tehnologija biotiskanja bi omogočila povezovanje bioloških komponent z nebiološkimi v obliko primerno za inplantacijo v bolnika. <br /> <br /> Kot praktični primer takšne aplikacije so si zamislili hibridno napravo, ki bi uravnavala izločanje inzulina pri bolnikih s sladkorno boleznijo tip I.  Mehanski del naprave bi meril koncentracijo glukoze in inzulina v krvi in na podlagi tega posredoval signale do tarčnih celic, ki bi sprožile oz. zavrle izločanje inzulina glede na trenutne potrebe organizma. <br /> Prenos signala iz električnega vezja na tarčne celice bi potekal preko svetlobe določene valovne dolžine, ki bi jo celice zaznale s pomočjo specifičnih receptorjev na membrani. V notranjosti celice bi se v prisotnosti svetlobe sprožili signalni mehanizmi, ki bi vodili v porast Ca2+ v citosolu, in posledično sprožili izražanje genov, ki so pod kontrolo od Ca2+ odzivnih elementov. Celice bi predhodno dizajnirali tako, da bi vsebovale gen za preproinzulin ki bi se izražal pod kontrolo od Ca2+ odzivnega promotorja. <br /> <br /> Da bi testirali svojo zamisel so v celicah izrazili sistem, ki združuje signalno pot med receptorjem za modro svetlobo, fototropinom, in kalcijevim kanalčkom Orai na endoplazemskem retikulumu. Sistem deluje tako, da se v prisotnosti svetlobe iz fuzijskega receptorja fototropina odcepi protein Stim1, ki aktivira Ca2+ kanalček Orai, kar privede do izločanja Ca2+ iz endoplazemskega retikuluma v citosol. V genom celice so ustavili tudi konstrukt, ki je vseboval promotor s tremi Ca2+ odzivnimi elementi (SRE, CRE in NFAT odzivni elementi), ki so uravnavali izražanje nanoluciferinaze. Preko fluorescence nanoluciferinaze so tako izmerili odziv promotorja na obsevanje celic z modro svetlobo. Poizkus je bil uspešen, celice so po obsevanju z modro svetlobo 4-5x več nanoluciferinaze kot kontrolne celice.  <br /> <br /> <br /> ==Viri==<br /> # iGEM projekt BiotINK - rethINK tissue printing, dostopen na povezavi: http://2016.igem.org/Team:LMU-TUM_Munich <br /> # Ozbolat IT, Yin Y: Bioprinting toward organ fabrication: challenges and future trends. IEEE Transactions on Biomedical Engineering 60.3 (2013): 691-699. <br /> <br /> [[Seminarji SB 12016/17]]</div>

Mateja Cigoj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BiotINK_-_nov_pristop_k_biotiskanju_tkiva&diff=11951 2016-12-03T20:58:56Z

<p>Mateja Cigoj: /* Viri */</p> <hr /> <div>== Tehnologija biotiskanja ==<br /> <br /> Biotiskanje je postopek, priprave večplastnih celičnih struktur in uporabo tehnologije 3D tiskanja. Biotiskanje predstavlja velik doprinos na področju regnerativne medicine, ker omogoča izdelavo tkivnih presadkov iz bolnikovih lastnih celic. Poleg tega so tkivni modeli uporabni tudi za potrebe farmakoloških in toksikoloških študij ter za študije razvoja bolezni. Današnja tehnologija biotiskanja omogoča pripravo nekaterih enostavnejših tkiv, na primer večplastnih modelov kože, hrustanca, kosti, žil in sapnika. Tiskanje popolnih funkcionalnih organov trenutno še ni mogoče, zaradi kompleksnosti različnih celičnih struktur.  <br /> <br /> Večina tehnik biotiskanja temelji na nanašanju celic na podporni matriks, ki predstavlja oporo za celice in oblikuje strukturo tkiva. Po določenem času začnejo celice oblikovati intercelularne kontakte in začnejo rasti v dvodimenzionalnih celičnih plasteh. Za rekonstrukcijo tkiva se morajo celične plasti medsebojno povezati in podporno ogrodje pa se razgradi ter nadomesti s komponentami zunajceličnega matriksa, ki jih sintetizirajo celice. Biotiskanje je tehnično gledano kompleksen, dolgotrajen in drag proces, ki je še v fazi razvoja. En od glavnih izzivov ostaja izbira primernega podpornega materiala za izdelavo celičnega ogrodja, ki bo kompatibilno z biološkim okoljem v katerega ga vgradimo.  <br /> <br /> Skupina študentov iz Münchna je za tekmovanje iGEM si je postavila cilj izboljšati tehniko biotiskanja, da bo postopek hitrejši, cenejši in bolj učinkovit. Zamislili so si sistem v katerem celice na površini izražajo receptorje z vezanim avidinom oz. molekulami biotina in medij, ki vsebuje streptavidin oz. biotinilirane proteine. Interakcija med molekulami biotina in streptavidina, s kostanto disociacije 10-15 M-1, je ena izmed najmočnejših bioloških interakcij (za primerjavo je konstanta disociacije protiteles v območju 10-7 – 10-11 M-1). Prednost takšnega sistema je, da celice ne potrebujejo podpornega ogrodja, na katere bi jih nanašali, temveč interakcije med omenjenimi celičnimi receptorji in ligandi v mediju omogočijo takojšnje premreženje celic tekom samega tiskanja in nastanek stabilnih tridimenzionalnih celičnih struktur.  <br /> <br /> == Membranski proteini == <br />  <br /> Na celicah so izrazili dva tipa membranskih proteinov (receptorjev), ki bi omogočali polimerizacijo celic: <br /> * Receptor z biotin akceptorskim peptidom (BAP), ki omogoča reakcije z streptavidinom in drugimi variantami avidina. BAP je 15 aminokislin dolg peptid, ki izvira iz E.coli. Biotiniliranje peptida je potekalo endogeno s soizraženo bakterijsko biotin ligazo BirA. <br /> * Receptor z avidinsko podenoto, ki omogoča povezovanje z biotiniliranimi proteini. Testiral so dve različici avidina in sicer monomerni avidin, ki predstavlja eno samo podenoto tetramernega avidina in t.i. enoverižni avidin (scAvidin), ki je podoben naravnemu avidinu, z razliko da je sestavljen zgolj iz ene polipeptidne verige. <br /> <br /> ===Priprava konstruktov===<br /> <br /> Za receptorske proteine so pripravili konstrukte, ki so vsebovali CMV promotor, signalni peptid BM40, funkcionalni membranski protein in poliadenilacijski signal.  <br /> Za sidranje proteina v celično membrano so uporabili transmembransko regijo EGF receptorja (BBa_K157002), kateri so na C-konec dodali t.i. stop-transfer sekvenco, iz naravnega EGF receptorja in fleksibilne povezovalce (GGGGC)2 na obeh koncih. Za preverjanje pravilne ekspresije in lokalizacije receptorja, so v receptorski konstrukt vnesli 3 elemente za detekcijo: rdeči fluorescenčni protein mRuby 3 za detekcijo receptorja s fluorescenčnim mikroskopom, epitop za A3C5 protitelesa za imunokemično detekcijo in Strep-tag II oznako za detekcijo in čiščenje z imunokemijskimi metodami. <br /> <br /> Konstrukte so testirali v MEXiTM celični liniji, ki omogoča semi-stabilno transfekcijo. Gre za suspenzijo humane celične linije HEK293E, ki ima v genomu vgrajen virusni protein EBNA1 iz Eppstein-Barr virusa, ki uravnava iniciacijo replikacije virusa in skrbi za ohranjanje virusne DNA v gostiteljski celici. MEXiTM celična linija vsebuje vektorski plazmid pDSG-IBA, katerega začetno mesto replikacije (ORI) prepozna protein EBNA1, ki pritegne faktorje replikacije in sproži podvajanje plazmida. Receptorske konstrukte so klonirali v pDSG-iGEM plazmid in transficirali MEXi celice. Transfekcijo so izvedli s kationskim polimerom polietilen iminom, ki tvori kompleks z negativno nabito DNA, ki lahko ustopa v celico prek endocitoze.  <br /> <br /> Kasneje so konstrukte vključili tudi v genom celic. Za ta namen so uporabili sistem FlpIn™. Gre za tri-komponentni sistem, v katerem nastopajo HEK-TRex™-293 celice z kromosomskim Flp rekobinacijskim mestom, plazmid z zapisom za Flp rekombinazo in plazmid z želenim vključkom, ki tudi vsebuje Flp rekombinacijsko mesto, ki omogoča vgraditev v tarčni kromosom. Celice, ki uspešno integrirajo plazmid v svoj genom izgubijo rezistenco na Zeocin™, obenem pa pridobijo odpornost na higromicin B, ker plazmid nosi zapis za higromicin-fosfotransferazo, ki s svojo kinazno aktivnostjo inaktivira higromicin B.  <br /> <br /> == Ligandi za membranske proteine ==<br /> V bakterijah E.coli so izrazili štirih različne variente avidina.  <br />   <br /> * Streptavidin divjega tipa, ki vsebuje 4 vezavna mesta za biotin.  <br /> * Traptavidin, ki se od streptavidina razlikuje v dveh točkovnih mutacijah, ki povzročita povečano afiniteto  do biotina. Poleg tega ima traptavidin izboljšano termostabilnost in funkcionalnost pri višjih temperaturah (TM~10 °C višja). <br /> * Streptacin, ki vsebuje 8 aminokislin dolgo strep-tag oznako, ki omogoča enostavno in učinkovito čiščenje z afinitetno kromatografijo. <br /> * Monomeni avidin (eMA), ki lahko veže le eno biotinsko molekulo, kar prepreči nastanek neželenih prečnih povezav z biotinskimi konjugati. <br />   <br /> Vezavne lastnosti posameznih variant avidina so ovrednotili s fluorescenčno titracijo. To je metoda pri kateri titriramo protein z ligandom in ob spremljanju spremembe intrinzične fluorescence proteina. Iz eksperimentalnih podatkov so izračunali konstante disociacije KD, s katerimi so ovrednotili afinitete vezave. Najvišjo afiniteto je kazal monomerni avidin. <br /> <br /> Pripravili so tudi različne biotinilirane proteine. <br /> <br /> * PAS-lizin, ki je polipeptid sestavljen iz ponovitev prolin-alanin-serin z lizinom na vsakem 20 mestu, katerega lahko biotiniliramo. <br /> * Zeleni fluorescirajoči protein (eGFP), ki omogoča opazovanje poteka polimerizacije pod fluorescenčnim mikroskopom. <br /> * Goveji serumski albumin, ki je pogosto uporabljan v laboratoriju kot proteinski standard, ker vsebuje 60 lizinskih ostankov in je dobro topen je tudi potencialno primeren kot biotiniliran povezovalec za celice. <br /> <br /> Za biotinilacijo proteinov so uporabili biotin, ki je zaestren z N-hidroksisucinimidno skupino (biotin-NHS). NHS estri lahko zreagirajo z primarnimi ali sekundarnimi amini prek SN2 reakcijskega mehanizma, pri čemer pride do tvorbe amidne vezi. (NSH estri se veliko uporabljajo za konjugiranje proteinov z fluorescenčnimi barvili ali biotinom.) Da bi zaščitili biotinilirane proteine pred delovanjem serumske biotinidaze (encim, ki odceplja biotin) so uporabili različne derivate biotina odporne na cepitev. <br /> <br /> == Polimerizacijski poizkusi ==<br /> Pri polimerizacijskih poizkusih so uporabili celice, ki so na površini izražale scAvidin, biotiniliran BSA in streptavidin. Prve eksperimente niso izvajali s printerjem ampak pod fluorescenčnim mikroskopom. Suspenzijo celic so uvedli v medij, ki je vseboval biotiniliran BSA, ta je služil kot ligand za celične receptorje. Nastalo mešanico so po kapljicah injicirali v rezervoar z raztopino streptavidina, kjer je potekla polimerizacija nanešenih celic.    <br /> <br /> Za potrebe vizualizacije so v medij s celicami dodali manjšo količino biotiniliranega GFP.  Ugotovili so, da je polimerizacija odvisna od treh dejavnikov: celične gostote, koncentracije ligandov (biotiniliranega BSA) v mediju in koncentracije streptavidina v rezervoarju. Testirali so tudi druge ligande, kot najboljša povezovalna proteina sta se izkazala biotiniliran PAS-lizin in biotiniliran BSA.  <br />  <br /> Ko so iz množice poizkusov določili optimalna razmerja celic in ostalih komponent so prešli na uporabo 3D biotiskanja. Uporabili so konvencionalni 3D printer Ultimaker 2 plus, katerega so predhodno modificirali v biotiskalnik, tako da so sami natisnili mankajoče komponente printerja oz. dokupili določene dele. Njihov končni izdelek je omogočal injiciranje celic na milimeter natančno.  <br /> <br /> Da bi zagotovili fiksno pritrjevanje prve plasti celic na podlago, so podlago prekrili z poli-D- lizinom, katerega so biotinilirali z dodatkom biotin-NSH estra. Tako so pridobili začetno z biotinom prekrito plast, na katero so se celice lahko pritrdile prek avidinskega receptorja. Za ovrednotenje stabilnost nanosa celic, so v posamezne plasti nanašali različno obarvane celice. Z opazovanjem pod fluorescenčnim mikroskopom so ovrednotili, da sta celični plasti fiksno pritrjeni ena na drugo, in da enako obarvane celice ležijo v isti ravnini, celice so tudi po stresanju ohranile svojo lego v zamreženi strukturi.  <br /> <br /> == Hibridna naprava za kontrolo ravni glukoze v krvi ==<br /> Tehnologijo biotiskanja bi lahko izkoristili tudi za pripravo biološko-mehatronskih naprav, za uravnavanje porušene homeostaze pri nekaterih patoloških stanjih. Lahko bi na primer razvili hibridne organe, v katerih bi elektromehanske komponente zaznavale biološke signale iz okolice in komunicirale s celicami v tkivu ter jih usmerjale v pravilno delovanje. Tehnologija biotiskanja bi omogočila povezovanje bioloških komponent z nebiološkimi v obliko primerno za inplantacijo v bolnika. <br /> <br /> Kot praktični primer takšne aplikacije so si zamislili hibridno napravo, ki bi uravnavala izločanje inzulina pri bolnikih s sladkorno boleznijo tip I.  Mehanski del naprave bi meril koncentracijo glukoze in inzulina v krvi in na podlagi tega posredoval signale do tarčnih celic, ki bi sprožile oz. zavrle izločanje inzulina glede na trenutne potrebe organizma. <br /> Prenos signala iz električnega vezja na tarčne celice bi potekal preko svetlobe določene valovne dolžine, ki bi jo celice zaznale s pomočjo specifičnih receptorjev na membrani. V notranjosti celice bi se v prisotnosti svetlobe sprožili signalni mehanizmi, ki bi vodili v porast Ca2+ v citosolu, in posledično sprožili izražanje genov, ki so pod kontrolo od Ca2+ odzivnih elementov. Celice bi predhodno dizajnirali tako, da bi vsebovale gen za preproinzulin ki bi se izražal pod kontrolo od Ca2+ odzivnega promotorja. <br /> <br /> Da bi testirali svojo zamisel so v celicah izrazili sistem, ki združuje signalno pot med receptorjem za modro svetlobo, fototropinom, in kalcijevim kanalčkom Orai na endoplazemskem retikulumu. Sistem deluje tako, da se v prisotnosti svetlobe iz fuzijskega receptorja fototropina odcepi protein Stim1, ki aktivira Ca2+ kanalček Orai, kar privede do izločanja Ca2+ iz endoplazemskega retikuluma v citosol. V genom celice so ustavili tudi konstrukt, ki je vseboval promotor s tremi Ca2+ odzivnimi elementi (SRE, CRE in NFAT odzivni elementi), ki so uravnavali izražanje nanoluciferinaze. Preko fluorescence nanoluciferinaze so tako izmerili odziv promotorja na obsevanje celic z modro svetlobo. Poizkus je bil uspešen, celice so po obsevanju z modro svetlobo 4-5x več nanoluciferinaze kot kontrolne celice.  <br /> <br /> <br /> ==Viri==<br /> # iGEM projekt BiotINK - rethINK tissue printing, dostopen na povezavi: http://2016.igem.org/Team:LMU-TUM_Munich <br /> # Ozbolat IT, Yin Y: Bioprinting toward organ fabrication: challenges and future trends. IEEE Transactions on Biomedical Engineering 60.3 (2013): 691-699. <br /> <br /> [[Seminarji SB 12016/17]]</div>

Mateja Cigoj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BiotINK_-_nov_pristop_k_biotiskanju_tkiva&diff=11950 2016-12-03T20:56:52Z

<p>Mateja Cigoj: New page: == Tehnologija biotiskanja == Biotiskanje je postopek, priprave večplastnih celičnih struktur in uporabo tehnologije 3D tiskanja. Biotiskanje predstavlja velik doprinos na področju reg...</p> <hr /> <div>== Tehnologija biotiskanja ==<br /> <br /> Biotiskanje je postopek, priprave večplastnih celičnih struktur in uporabo tehnologije 3D tiskanja. Biotiskanje predstavlja velik doprinos na področju regnerativne medicine, ker omogoča izdelavo tkivnih presadkov iz bolnikovih lastnih celic. Poleg tega so tkivni modeli uporabni tudi za potrebe farmakoloških in toksikoloških študij ter za študije razvoja bolezni. Današnja tehnologija biotiskanja omogoča pripravo nekaterih enostavnejših tkiv, na primer večplastnih modelov kože, hrustanca, kosti, žil in sapnika. Tiskanje popolnih funkcionalnih organov trenutno še ni mogoče, zaradi kompleksnosti različnih celičnih struktur.  <br /> <br /> Večina tehnik biotiskanja temelji na nanašanju celic na podporni matriks, ki predstavlja oporo za celice in oblikuje strukturo tkiva. Po določenem času začnejo celice oblikovati intercelularne kontakte in začnejo rasti v dvodimenzionalnih celičnih plasteh. Za rekonstrukcijo tkiva se morajo celične plasti medsebojno povezati in podporno ogrodje pa se razgradi ter nadomesti s komponentami zunajceličnega matriksa, ki jih sintetizirajo celice. Biotiskanje je tehnično gledano kompleksen, dolgotrajen in drag proces, ki je še v fazi razvoja. En od glavnih izzivov ostaja izbira primernega podpornega materiala za izdelavo celičnega ogrodja, ki bo kompatibilno z biološkim okoljem v katerega ga vgradimo.  <br /> <br /> Skupina študentov iz Münchna je za tekmovanje iGEM si je postavila cilj izboljšati tehniko biotiskanja, da bo postopek hitrejši, cenejši in bolj učinkovit. Zamislili so si sistem v katerem celice na površini izražajo receptorje z vezanim avidinom oz. molekulami biotina in medij, ki vsebuje streptavidin oz. biotinilirane proteine. Interakcija med molekulami biotina in streptavidina, s kostanto disociacije 10-15 M-1, je ena izmed najmočnejših bioloških interakcij (za primerjavo je konstanta disociacije protiteles v območju 10-7 – 10-11 M-1). Prednost takšnega sistema je, da celice ne potrebujejo podpornega ogrodja, na katere bi jih nanašali, temveč interakcije med omenjenimi celičnimi receptorji in ligandi v mediju omogočijo takojšnje premreženje celic tekom samega tiskanja in nastanek stabilnih tridimenzionalnih celičnih struktur.  <br /> <br /> == Membranski proteini == <br />  <br /> Na celicah so izrazili dva tipa membranskih proteinov (receptorjev), ki bi omogočali polimerizacijo celic: <br /> * Receptor z biotin akceptorskim peptidom (BAP), ki omogoča reakcije z streptavidinom in drugimi variantami avidina. BAP je 15 aminokislin dolg peptid, ki izvira iz E.coli. Biotiniliranje peptida je potekalo endogeno s soizraženo bakterijsko biotin ligazo BirA. <br /> * Receptor z avidinsko podenoto, ki omogoča povezovanje z biotiniliranimi proteini. Testiral so dve različici avidina in sicer monomerni avidin, ki predstavlja eno samo podenoto tetramernega avidina in t.i. enoverižni avidin (scAvidin), ki je podoben naravnemu avidinu, z razliko da je sestavljen zgolj iz ene polipeptidne verige. <br /> <br /> ===Priprava konstruktov===<br /> <br /> Za receptorske proteine so pripravili konstrukte, ki so vsebovali CMV promotor, signalni peptid BM40, funkcionalni membranski protein in poliadenilacijski signal.  <br /> Za sidranje proteina v celično membrano so uporabili transmembransko regijo EGF receptorja (BBa_K157002), kateri so na C-konec dodali t.i. stop-transfer sekvenco, iz naravnega EGF receptorja in fleksibilne povezovalce (GGGGC)2 na obeh koncih. Za preverjanje pravilne ekspresije in lokalizacije receptorja, so v receptorski konstrukt vnesli 3 elemente za detekcijo: rdeči fluorescenčni protein mRuby 3 za detekcijo receptorja s fluorescenčnim mikroskopom, epitop za A3C5 protitelesa za imunokemično detekcijo in Strep-tag II oznako za detekcijo in čiščenje z imunokemijskimi metodami. <br /> <br /> Konstrukte so testirali v MEXiTM celični liniji, ki omogoča semi-stabilno transfekcijo. Gre za suspenzijo humane celične linije HEK293E, ki ima v genomu vgrajen virusni protein EBNA1 iz Eppstein-Barr virusa, ki uravnava iniciacijo replikacije virusa in skrbi za ohranjanje virusne DNA v gostiteljski celici. MEXiTM celična linija vsebuje vektorski plazmid pDSG-IBA, katerega začetno mesto replikacije (ORI) prepozna protein EBNA1, ki pritegne faktorje replikacije in sproži podvajanje plazmida. Receptorske konstrukte so klonirali v pDSG-iGEM plazmid in transficirali MEXi celice. Transfekcijo so izvedli s kationskim polimerom polietilen iminom, ki tvori kompleks z negativno nabito DNA, ki lahko ustopa v celico prek endocitoze.  <br /> <br /> Kasneje so konstrukte vključili tudi v genom celic. Za ta namen so uporabili sistem FlpIn™. Gre za tri-komponentni sistem, v katerem nastopajo HEK-TRex™-293 celice z kromosomskim Flp rekobinacijskim mestom, plazmid z zapisom za Flp rekombinazo in plazmid z želenim vključkom, ki tudi vsebuje Flp rekombinacijsko mesto, ki omogoča vgraditev v tarčni kromosom. Celice, ki uspešno integrirajo plazmid v svoj genom izgubijo rezistenco na Zeocin™, obenem pa pridobijo odpornost na higromicin B, ker plazmid nosi zapis za higromicin-fosfotransferazo, ki s svojo kinazno aktivnostjo inaktivira higromicin B.  <br /> <br /> == Ligandi za membranske proteine ==<br /> V bakterijah E.coli so izrazili štirih različne variente avidina.  <br />   <br /> * Streptavidin divjega tipa, ki vsebuje 4 vezavna mesta za biotin.  <br /> * Traptavidin, ki se od streptavidina razlikuje v dveh točkovnih mutacijah, ki povzročita povečano afiniteto  do biotina. Poleg tega ima traptavidin izboljšano termostabilnost in funkcionalnost pri višjih temperaturah (TM~10 °C višja). <br /> * Streptacin, ki vsebuje 8 aminokislin dolgo strep-tag oznako, ki omogoča enostavno in učinkovito čiščenje z afinitetno kromatografijo. <br /> * Monomeni avidin (eMA), ki lahko veže le eno biotinsko molekulo, kar prepreči nastanek neželenih prečnih povezav z biotinskimi konjugati. <br />   <br /> Vezavne lastnosti posameznih variant avidina so ovrednotili s fluorescenčno titracijo. To je metoda pri kateri titriramo protein z ligandom in ob spremljanju spremembe intrinzične fluorescence proteina. Iz eksperimentalnih podatkov so izračunali konstante disociacije KD, s katerimi so ovrednotili afinitete vezave. Najvišjo afiniteto je kazal monomerni avidin. <br /> <br /> Pripravili so tudi različne biotinilirane proteine. <br /> <br /> * PAS-lizin, ki je polipeptid sestavljen iz ponovitev prolin-alanin-serin z lizinom na vsakem 20 mestu, katerega lahko biotiniliramo. <br /> * Zeleni fluorescirajoči protein (eGFP), ki omogoča opazovanje poteka polimerizacije pod fluorescenčnim mikroskopom. <br /> * Goveji serumski albumin, ki je pogosto uporabljan v laboratoriju kot proteinski standard, ker vsebuje 60 lizinskih ostankov in je dobro topen je tudi potencialno primeren kot biotiniliran povezovalec za celice. <br /> <br /> Za biotinilacijo proteinov so uporabili biotin, ki je zaestren z N-hidroksisucinimidno skupino (biotin-NHS). NHS estri lahko zreagirajo z primarnimi ali sekundarnimi amini prek SN2 reakcijskega mehanizma, pri čemer pride do tvorbe amidne vezi. (NSH estri se veliko uporabljajo za konjugiranje proteinov z fluorescenčnimi barvili ali biotinom.) Da bi zaščitili biotinilirane proteine pred delovanjem serumske biotinidaze (encim, ki odceplja biotin) so uporabili različne derivate biotina odporne na cepitev. <br /> <br /> == Polimerizacijski poizkusi ==<br /> Pri polimerizacijskih poizkusih so uporabili celice, ki so na površini izražale scAvidin, biotiniliran BSA in streptavidin. Prve eksperimente niso izvajali s printerjem ampak pod fluorescenčnim mikroskopom. Suspenzijo celic so uvedli v medij, ki je vseboval biotiniliran BSA, ta je služil kot ligand za celične receptorje. Nastalo mešanico so po kapljicah injicirali v rezervoar z raztopino streptavidina, kjer je potekla polimerizacija nanešenih celic.    <br /> <br /> Za potrebe vizualizacije so v medij s celicami dodali manjšo količino biotiniliranega GFP.  Ugotovili so, da je polimerizacija odvisna od treh dejavnikov: celične gostote, koncentracije ligandov (biotiniliranega BSA) v mediju in koncentracije streptavidina v rezervoarju. Testirali so tudi druge ligande, kot najboljša povezovalna proteina sta se izkazala biotiniliran PAS-lizin in biotiniliran BSA.  <br />  <br /> Ko so iz množice poizkusov določili optimalna razmerja celic in ostalih komponent so prešli na uporabo 3D biotiskanja. Uporabili so konvencionalni 3D printer Ultimaker 2 plus, katerega so predhodno modificirali v biotiskalnik, tako da so sami natisnili mankajoče komponente printerja oz. dokupili določene dele. Njihov končni izdelek je omogočal injiciranje celic na milimeter natančno.  <br /> <br /> Da bi zagotovili fiksno pritrjevanje prve plasti celic na podlago, so podlago prekrili z poli-D- lizinom, katerega so biotinilirali z dodatkom biotin-NSH estra. Tako so pridobili začetno z biotinom prekrito plast, na katero so se celice lahko pritrdile prek avidinskega receptorja. Za ovrednotenje stabilnost nanosa celic, so v posamezne plasti nanašali različno obarvane celice. Z opazovanjem pod fluorescenčnim mikroskopom so ovrednotili, da sta celični plasti fiksno pritrjeni ena na drugo, in da enako obarvane celice ležijo v isti ravnini, celice so tudi po stresanju ohranile svojo lego v zamreženi strukturi.  <br /> <br /> == Hibridna naprava za kontrolo ravni glukoze v krvi ==<br /> Tehnologijo biotiskanja bi lahko izkoristili tudi za pripravo biološko-mehatronskih naprav, za uravnavanje porušene homeostaze pri nekaterih patoloških stanjih. Lahko bi na primer razvili hibridne organe, v katerih bi elektromehanske komponente zaznavale biološke signale iz okolice in komunicirale s celicami v tkivu ter jih usmerjale v pravilno delovanje. Tehnologija biotiskanja bi omogočila povezovanje bioloških komponent z nebiološkimi v obliko primerno za inplantacijo v bolnika. <br /> <br /> Kot praktični primer takšne aplikacije so si zamislili hibridno napravo, ki bi uravnavala izločanje inzulina pri bolnikih s sladkorno boleznijo tip I.  Mehanski del naprave bi meril koncentracijo glukoze in inzulina v krvi in na podlagi tega posredoval signale do tarčnih celic, ki bi sprožile oz. zavrle izločanje inzulina glede na trenutne potrebe organizma. <br /> Prenos signala iz električnega vezja na tarčne celice bi potekal preko svetlobe določene valovne dolžine, ki bi jo celice zaznale s pomočjo specifičnih receptorjev na membrani. V notranjosti celice bi se v prisotnosti svetlobe sprožili signalni mehanizmi, ki bi vodili v porast Ca2+ v citosolu, in posledično sprožili izražanje genov, ki so pod kontrolo od Ca2+ odzivnih elementov. Celice bi predhodno dizajnirali tako, da bi vsebovale gen za preproinzulin ki bi se izražal pod kontrolo od Ca2+ odzivnega promotorja. <br /> <br /> Da bi testirali svojo zamisel so v celicah izrazili sistem, ki združuje signalno pot med receptorjem za modro svetlobo, fototropinom, in kalcijevim kanalčkom Orai na endoplazemskem retikulumu. Sistem deluje tako, da se v prisotnosti svetlobe iz fuzijskega receptorja fototropina odcepi protein Stim1, ki aktivira Ca2+ kanalček Orai, kar privede do izločanja Ca2+ iz endoplazemskega retikuluma v citosol. V genom celice so ustavili tudi konstrukt, ki je vseboval promotor s tremi Ca2+ odzivnimi elementi (SRE, CRE in NFAT odzivni elementi), ki so uravnavali izražanje nanoluciferinaze. Preko fluorescence nanoluciferinaze so tako izmerili odziv promotorja na obsevanje celic z modro svetlobo. Poizkus je bil uspešen, celice so po obsevanju z modro svetlobo 4-5x več nanoluciferinaze kot kontrolne celice.  <br /> <br /> <br /> ==Viri==<br /> 1. iGEM projekt BiotINK - rethINK tissue printing, dostopen na povezavi: http://2016.igem.org/Team:LMU-TUM_Munich <br /> <br /> 2. Ozbolat IT, Yin Y: Bioprinting toward organ fabrication: challenges and future trends. IEEE Transactions on Biomedical Engineering 60.3 (2013): 691-699. </div>

Mateja Cigoj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2016/17&diff=11948 2016-12-03T20:36:40Z

<p>Mateja Cigoj: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2016/17 študentje predstavljajo naslednje teme:<br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI&lt;br&gt;<br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.)<br /> # [[Učinkovito ciljanje izraženih in utišanih genov v človeških zarodnih in induciranih pluripotentnih celicah z nukleazami z motivi cinkovih prstov]]. Angelika Vižintin (22. 11. 2016)<br /> # [[Izdelava sintetičnega genoma s pristopom sestavljanja celotnega genoma: Bakteriofag φX174 iz sintetičnih oligonukleotidov]]. Darja Božič (22.11.2016)<br /> # [[Modeliranje sintetične večcelične ure: Represilatorji, sklopljeni z zaznavanjem celične gostote]]. Vita Vidmar (22. 11. 2016)<br /> <br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI&lt;br&gt;<br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> #[[Mezenhimske matične celice nove generacije]]. Danijela Jošić (22.11.2016)<br /> #[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bakterije%2C_ki_kelirajo_bakrove_ione%2C_v_boju_proti_Wilsonovi_bolezni Bakterije, ki kelirajo bakrove ione, v boju proti Wilsonovi bolezni. Simon Bolta (22. 11. 2016)]<br /> #[[&quot;Training protein&quot; - PETaze]]. Urša Kapš (29.11.2016)<br /> #[[Plasticure: rešitev za učinkovitejšo razgradnjo plastike]]. Marjeta Horvat (29. 11. 2016)<br /> #[[Quantifly]]. Ema Guštin (29. 11. 2016)<br /> #[[Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur]]. Mojca Juteršek (29. 11. 2016)<br /> #[[BeeT Beehave]]. Maja Svetličič (29.11.2016)<br /> #[[BiotINK - nov pristop k biotiskanju tkiva]]. Mateja Cigoj (6. 12. 2016)<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 12 minut (10-14). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.</div>

Mateja Cigoj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Protonske_%C4%8Drpalke&diff=6717 2012-01-03T20:23:36Z

<p>Mateja Cigoj: </p> <hr /> <div>Protonske črpalke so membranski [[protein]]i, ki omogočajo prenos proteinov skozi [[celična membrana|celično membrano]]. Pri tem gre za [[Transport_majhnih_molekul_skozi_membrano|aktivni transport]], kar pomeni, da se protoni prenašajo s področja z nižjo koncentracijo preko membrane na področje z višjo koncentracijo. Za to pa je potreben vložek energije v obliki molekul adenozin trifosfata ([[ATP]]).<br /> Bistvo delovanja protonskih črpalk je v tem, da energijo molekule ATP pretvori v elektrokemijski potencial, ki se lahko porabi za druge celične procese. <br /> <br /> Primer takšne črpalke je natrij-kalijeva črpalka, imenovana Na+/K+ ATP-aza, ki je v plazemski membrani skoraj vsake evkariontske celice. <br /> <br /> ====Na+/K+ ATP-aza====<br /> Celice za svoje normalno delovanje potrebujejo določeno koncentracijo natrija in kalija, ki ni enaka koncentraciji teh ionov v zunajcelični tekočini. Zato mora celica z aktivnim antiportom[http://en.wikipedia.org/wiki/Antiport] ves čas črpati natrijeve ione iz celice in kalijeve ione v celico. Natrij kalijeva črpalka, ki sodeluje pri tem procesu je sestavljena iz dveh podenot nameščenih v plazemsko membrano. <br /> Proces transporta poteka tako, da se najprej trije natrijevi ioni vežejo na citoplazemski strani črpalke. Sledi vezava fosfatne skupine iz molekule ATP (Poteče encimsko katalizna fosforilacija. Molekula ATP odda fosfatno skupino in se pretvori v [[ADP]]). Vezava fosfatne skupine sproži konformacijsko spremembo črpalke, da ta potisne natrijeve ione v zunajcelično tekočino. Prazna protonska črpalka sedaj lahko sprejme dva kalijeva iona iz zunajcelične okolice. Ob njuni vezavi pa se fosfatna skupina odcepi, kar povzroči, da se protein vrne v prvotno konformacijsko obliko in prečrpa kalijeva iona v celico. <br /> <br /> Pri takšnem transportu protonov (3 Na+ iz celice in 2K+ v celico), pride do neto razlike v elektrokemijskem potencialu[http://en.wikipedia.org/wiki/Electrochemical_potential] na obeh straneh membrane (znotraj celice je manjši kot zunaj celice). Takšna potencialna razlika je na primer ključna v živčnih celicah, zaradi nastanka živčnega impulza[http://en.wikipedia.org/wiki/Nerve_impulse]. <br /> <br /> Tudi v procesu [[celično dihanje|celičnega dihanja]] deluje protonska črpalka, ki s črpanjem protonom iz notranjosti mitohondrija[http://en.wikipedia.org/wiki/Mitochondrion] v prostor med zunanjo in notranjo membrano ustvari koncentracijski gradient in s tem elektrokemijski potencial, ki deluje kot „baterija“ za shranjevanje energije v celici.<br /> <br /> ==Viri in literatura:==<br /> <br /> [[Category:LEX]]<br /> <br /> Boyer R. Temelji biokemije. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Knjižna zbirka Scripta. ISBN 961-242-041-6<br /> <br /> Wikipedija. Članek: Proton Pump. (Zadnja objava 5. november 2011 ob 23:05) http://en.wikipedia.org/wiki/Proton_pump <br /> <br /> Wikipedija. Članek: ATPase. (Zadnja objava: 15. april 2011 ob 21:02) http://en.wikipedia.org/wiki/Transmembrane_ATPase <br /> <br /> Wikipedija. Članek: Na+/K+-ATPase (zadnja objava: 19 november 2011 ob 14:49) http://en.wikipedia.org/wiki/NaKATPase<br /> <br /> ==Povezave==<br /> http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120068/bio05.swf::Proton%20Pump <br /> <br /> http://vedez.dzs.si/datoteke/bio-procesi/1_zgradba-in-delovanje-celice/1_prepustnost_membrane/1_aktivni-transport/1_natrij-kalijeva-crpalka/1_uvod/index.html <br /> <br /> http://www.svarog.si/biologija/MSS/index.php?page_id=10959</div>

Mateja Cigoj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Protonske_%C4%8Drpalke&diff=6691 2012-01-03T17:11:11Z

<p>Mateja Cigoj: </p> <hr /> <div>Protonske črpalke so membranski [[protein]]i, ki omogočajo prenos proteinov skozi [[celična membrana|celično membrano]]. Pri tem gre za [[Transport_majhnih_molekul_skozi_membrano|aktivni transport]], kar pomeni, da se protoni prenašajo s področja z nižjo koncentracijo preko membrane na področje z višjo koncentracijo. Za to pa je potreben vložek energije v obliki molekul adenozin trifosfata ([[ATP]]).<br /> Bistvo delovanja protonskih črpalk je v tem, da energijo molekule ATP pretvori v elektrokemijski potencial, ki se lahko porabi za druge celične procese. <br /> <br /> Primer takšne črpalke je natrij-kalijeva črpalka, imenovana Na+/K+ ATP-aza, ki je v plazemski membrani skoraj vsake evkariontske celice. <br /> <br /> ====Na+/K+ ATP-aza====<br /> Celice za svoje normalno delovanje potrebujejo določeno koncentracijo natrija in kalija, ki ni enaka koncentraciji teh ionov v zunajcelični tekočini. Zato mora celica z aktivnim antiportom[http://en.wikipedia.org/wiki/Antiport] ves čas črpati natrijeve ione iz celice in kalijeve ione v celico. Natrij kalijeva črpalka, ki sodeluje pri tem procesu je sestavljena iz dveh podenot nameščenih v plazemsko membrano. <br /> Proces transporta poteka tako, da se najprej trije natrijevi ioni vežejo na citoplazemski strani črpalke. Sledi vezava fosfatne skupine iz molekule ATP (Poteče encimsko katalizna fosforilacija. Molekula ATP odda fosfatno skupino in se pretvori v [[ADP]]). Vezava fosfatne skupine sproži konformacijsko spremembo črpalke, da ta potisne natrijeve ione v zunajcelično tekočino. Prazna protonska črpalka sedaj lahko sprejme dva kalijeva iona iz zunajcelične okolice. Ob njuni vezavi pa se fosfatna skupina odcepi, kar povzroči, da se protein vrne v prvotno konformacijsko obliko in prečrpa kalijeva iona v celico. <br /> <br /> Pri takšnem transportu protonov (3 Na+ iz celice in 2K+ v celico), pride do neto razlike v elektrokemijskem potencialu[http://en.wikipedia.org/wiki/Electrochemical_potential] na obeh straneh membrane (znotraj celice je manjši kot zunaj celice). Takšna potencialna razlika je na primer ključna v živčnih celicah, zaradi nastanka živčnega impulza[http://en.wikipedia.org/wiki/Nerve_impulse]. <br /> <br /> Tudi v procesu [[celično dihanje|celičnega dihanja]] deluje protonska črpalka, ki s črpanjem protonom iz notranjosti mitohondrija[http://en.wikipedia.org/wiki/Mitochondrion] v prostor med zunanjo in notranjo membrano ustvari koncentracijski gradient in s tem elektrokemijski potencial, ki deluje kot „baterija“ za shranjevanje energije v celici.<br /> <br /> ==Viri in literatura:==<br /> <br /> Boyer R. Temelji biokemije. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Knjižna zbirka Scripta. ISBN 961-242-041-6<br /> <br /> Wikipedija. Članek: Proton Pump. (Zadnja objava 5. november 2011 ob 23:05) http://en.wikipedia.org/wiki/Proton_pump <br /> <br /> Wikipedija. Članek: ATPase. (Zadnja objava: 15. april 2011 ob 21:02) http://en.wikipedia.org/wiki/Transmembrane_ATPase <br /> <br /> Wikipedija. Članek: Na+/K+-ATPase (zadnja objava: 19 november 2011 ob 14:49) http://en.wikipedia.org/wiki/NaKATPase<br /> <br /> ==Povezave==<br /> http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120068/bio05.swf::Proton%20Pump <br /> <br /> http://vedez.dzs.si/datoteke/bio-procesi/1_zgradba-in-delovanje-celice/1_prepustnost_membrane/1_aktivni-transport/1_natrij-kalijeva-crpalka/1_uvod/index.html <br /> <br /> http://www.svarog.si/biologija/MSS/index.php?page_id=10959</div>

Mateja Cigoj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Protonske_%C4%8Drpalke&diff=6690 2012-01-03T17:08:58Z

<p>Mateja Cigoj: </p> <hr /> <div>Protonske črpalke so membranski [[protein]]i, ki omogočajo prenos proteinov skozi [[celična membrana|celično membrano]]. Pri tem gre za [[Transport_majhnih_molekul_skozi_membrano|aktivni transport]], kar pomeni, da se protoni prenašajo s področja z nižjo koncentracijo preko membrane na področje z višjo koncentracijo. Za to pa je potreben vložek energije v obliki molekul adenozin trifosfata ([[ATP]]).<br /> Bistvo delovanja protonskih črpalk je v tem, da energijo molekule ATP pretvori v elektrokemijski potencial, ki se lahko porabi za druge celične procese. <br /> <br /> Primer takšne črpalke je natrij-kalijeva črpalka, imenovana Na+/K+ ATP-aza, ki je v plazemski membrani skoraj vsake evkariontske celice. <br /> <br /> Na+/K+ ATP-aza<br /> Celice za svoje normalno delovanje potrebujejo določeno koncentracijo natrija in kalija, ki ni enaka koncentraciji teh ionov v zunajcelični tekočini. Zato mora celica z aktivnim antiportom[http://en.wikipedia.org/wiki/Antiport] ves čas črpati natrijeve ione iz celice in kalijeve ione v celico. Natrij kalijeva črpalka, ki sodeluje pri tem procesu je sestavljena iz dveh podenot nameščenih v plazemsko membrano. <br /> Proces transporta poteka tako, da se najprej trije natrijevi ioni vežejo na citoplazemski strani črpalke. Sledi vezava fosfatne skupine iz molekule ATP (Poteče encimsko katalizna fosforilacija. Molekula ATP odda fosfatno skupino in se pretvori v [[ADP]]). Vezava fosfatne skupine sproži konformacijsko spremembo črpalke, da ta potisne natrijeve ione v zunajcelično tekočino. Prazna protonska črpalka sedaj lahko sprejme dva kalijeva iona iz zunajcelične okolice. Ob njuni vezavi pa se fosfatna skupina odcepi, kar povzroči, da se protein vrne v prvotno konformacijsko obliko in prečrpa kalijeva iona v celico. <br /> <br /> Pri takšnem transportu protonov (3 Na+ iz celice in 2K+ v celico), pride do neto razlike v elektrokemijskem potencialu[http://en.wikipedia.org/wiki/Electrochemical_potential] na obeh straneh membrane (znotraj celice je manjši kot zunaj celice). Takšna potencialna razlika je na primer ključna v živčnih celicah, zaradi nastanka živčnega impulza[http://en.wikipedia.org/wiki/Nerve_impulse]. <br /> <br /> Tudi v procesu [[celično dihanje|celičnega dihanja]] deluje protonska črpalka, ki s črpanjem protonom iz notranjosti mitohondrija[http://en.wikipedia.org/wiki/Mitochondrion] v prostor med zunanjo in notranjo membrano ustvari koncentracijski gradient in s tem elektrokemijski potencial, ki deluje kot „baterija“ za shranjevanje energije v celici.<br /> <br /> ==Viri in literatura:==<br /> <br /> Boyer R. Temelji biokemije. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Knjižna zbirka Scripta. ISBN 961-242-041-6<br /> <br /> Wikipedija. Članek: Proton Pump. (Zadnja objava 5. november 2011 ob 23:05) http://en.wikipedia.org/wiki/Proton_pump <br /> <br /> Wikipedija. Članek: ATPase. (Zadnja objava: 15. april 2011 ob 21:02) http://en.wikipedia.org/wiki/Transmembrane_ATPase <br /> <br /> Wikipedija. Članek: Na+/K+-ATPase (zadnja objava: 19 november 2011 ob 14:49) http://en.wikipedia.org/wiki/NaKATPase<br /> <br /> ==Povezave==<br /> http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120068/bio05.swf::Proton%20Pump <br /> <br /> http://vedez.dzs.si/datoteke/bio-procesi/1_zgradba-in-delovanje-celice/1_prepustnost_membrane/1_aktivni-transport/1_natrij-kalijeva-crpalka/1_uvod/index.html <br /> <br /> http://www.svarog.si/biologija/MSS/index.php?page_id=10959</div>

Mateja Cigoj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Protonske_%C4%8Drpalke&diff=6689 2012-01-03T17:04:44Z

<p>Mateja Cigoj: </p> <hr /> <div>Protonske črpalke so membranski [[protein]]i, ki omogočajo prenos proteinov skozi [[celična membrana|celično membrano]]. Pri tem gre za [[Transport_majhnih_molekul_skozi_membrano|aktivni transport]], kar pomeni, da se protoni prenašajo s področja z nižjo koncentracijo preko membrane na področje z višjo koncentracijo. Za to pa je potreben vložek energije v obliki molekul adenozin trifosfata ([[ATP]]).<br /> Bistvo delovanja protonskih črpalk je v tem, da energijo molekule ATP pretvori v elektrokemijski potencial, ki se lahko porabi za druge celične procese. <br /> <br /> Primer takšne črpalke je natrij-kalijeva črpalka, imenovana Na+/K+ ATP-aza, ki je v plazemski membrani skoraj vsake evkariontske celice. <br /> <br /> Na+/K+ ATP-aza<br /> Celice za svoje normalno delovanje potrebujejo določeno koncentracijo natrija in kalija, ki ni enaka koncentraciji teh ionov v zunajcelični tekočini. Zato mora celica z aktivnim antiportom[http://en.wikipedia.org/wiki/Antiport] ves čas črpati natrijeve ione iz celice in kalijeve ione v celico. Natrij kalijeva črpalka, ki sodeluje pri tem procesu je sestavljena iz dveh podenot nameščenih v plazemsko membrano. <br /> Proces transporta poteka tako, da se najprej trije natrijevi ioni vežejo na citoplazemski strani črpalke. Sledi vezava fosfatne skupine iz molekule ATP (Poteče encimsko katalizna fosforilacija. Molekula ATP odda fosfatno skupino in se pretvori v [[ADP]]). Vezava fosfatne skupine sproži konformacijsko spremembo črpalke, da ta potisne natrijeve ione v zunajcelično tekočino. Prazna protonska črpalka sedaj lahko sprejme dva kalijeva iona iz zunajcelične okolice. Ob njuni vezavi pa se fosfatna skupina odcepi, kar povzroči, da se protein vrne v prvotno konformacijsko obliko in prečrpa kalijeva iona v celico. <br /> <br /> Pri takšnem transportu protonov (3 Na+ iz celice in 2K+ v celico), pride do neto razlike v elektrokemijskem potencialu[http://en.wikipedia.org/wiki/Electrochemical_potential] na obeh straneh membrane (znotraj celice je manjši kot zunaj celice). Takšna potencialna razlika je na primer ključna v živčnih celicah, zaradi nastanka živčnega impulza[http://en.wikipedia.org/wiki/Nerve_impulse]. <br /> <br /> Tudi v procesu [[celično dihanje|celičnega dihanja]] deluje protonska črpalka, ki s črpanjem protonom iz notranjosti mitohondrija v prostor med zunanjo in notranjo membrano ustvari koncentracijski gradient in s tem elektrokemijski potencial, ki deluje kot „baterija“ za shranjevanje energije v celici.<br /> <br /> ==Viri in literatura:==<br /> <br /> Boyer R. Temelji biokemije. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Knjižna zbirka Scripta. ISBN 961-242-041-6<br /> <br /> Wikipedija. Članek: Proton Pump. (Zadnja objava 5. november 2011 ob 23:05) http://en.wikipedia.org/wiki/Proton_pump <br /> <br /> Wikipedija. Članek: ATPase. (Zadnja objava: 15. april 2011 ob 21:02) http://en.wikipedia.org/wiki/Transmembrane_ATPase <br /> <br /> Wikipedija. Članek: Na+/K+-ATPase (zadnja objava: 19 november 2011 ob 14:49) http://en.wikipedia.org/wiki/NaKATPase<br /> <br /> ==Povezave==<br /> http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120068/bio05.swf::Proton%20Pump <br /> <br /> http://vedez.dzs.si/datoteke/bio-procesi/1_zgradba-in-delovanje-celice/1_prepustnost_membrane/1_aktivni-transport/1_natrij-kalijeva-crpalka/1_uvod/index.html <br /> <br /> http://www.svarog.si/biologija/MSS/index.php?page_id=10959</div>

Mateja Cigoj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Protonske_%C4%8Drpalke&diff=6688 2012-01-03T17:04:32Z

<p>Mateja Cigoj: </p> <hr /> <div>Protonske črpalke so membranski [[protein]]i, ki omogočajo prenos proteinov skozi [[celična membrana|celično membrano]]. Pri tem gre za [[Transport_majhnih_molekul_skozi_membrano|aktivni transport]], kar pomeni, da se protoni prenašajo s področja z nižjo koncentracijo preko membrane na področje z višjo koncentracijo. Za to pa je potreben vložek energije v obliki molekul adenozin trifosfata ([[ATP]]).<br /> Bistvo delovanja protonskih črpalk je v tem, da energijo molekule ATP pretvori v elektrokemijski potencial, ki se lahko porabi za druge celične procese. <br /> <br /> Primer takšne črpalke je natrij-kalijeva črpalka, imenovana Na+/K+ ATP-aza, ki je v plazemski membrani skoraj vsake evkariontske celice. <br /> <br /> Na+/K+ ATP-aza<br /> Celice za svoje normalno delovanje potrebujejo določeno koncentracijo natrija in kalija, ki ni enaka koncentraciji teh ionov v zunajcelični tekočini. Zato mora celica z aktivnim antiportom[http://en.wikipedia.org/wiki/Antiport] ves čas črpati natrijeve ione iz celice in kalijeve ione v celico. Natrij kalijeva črpalka, ki sodeluje pri tem procesu je sestavljena iz dveh podenot nameščenih v plazemsko membrano. <br /> Proces transporta poteka tako, da se najprej trije natrijevi ioni vežejo na citoplazemski strani črpalke. Sledi vezava fosfatne skupine iz molekule ATP (Poteče encimsko katalizna fosforilacija. Molekula ATP odda fosfatno skupino in se pretvori v [[ADP]]). Vezava fosfatne skupine sproži konformacijsko spremembo črpalke, da ta potisne natrijeve ione v zunajcelično tekočino. Prazna protonska črpalka sedaj lahko sprejme dva kalijeva iona iz zunajcelične okolice. Ob njuni vezavi pa se fosfatna skupina odcepi, kar povzroči, da se protein vrne v prvotno konformacijsko obliko in prečrpa kalijeva iona v celico. <br /> <br /> Pri takšnem transportu protonov (3 Na+ iz celice in 2K+ v celico), pride do neto razlike v elektrokemijskem potencialu[http://en.wikipedia.org/wiki/Electrochemical_potential] na obeh straneh membrane (znotraj celice je manjši kot zunaj celice). Takšna potencialna razlika je na primer ključna v živčnih celicah, zaradi nastanka živčnega impulza[http://en.wikipedia.org/wiki/Nerve_impulse]. <br /> <br /> Tudi v procesu [[celično dihanje|celičnega dihanja]] deluje protonska črpalka, ki s črpanjem protonom iz notranjosti mitohondrija v prostor med zunanjo in notranjo membrano ustvari koncentracijski gradient in s tem elektrokemijski potencial, ki deluje kot „baterija“ za shranjevanje energije v celici.<br /> <br /> ----<br /> <br /> ==Viri in literatura:==<br /> <br /> Boyer R. Temelji biokemije. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Knjižna zbirka Scripta. ISBN 961-242-041-6<br /> <br /> Wikipedija. Članek: Proton Pump. (Zadnja objava 5. november 2011 ob 23:05) http://en.wikipedia.org/wiki/Proton_pump <br /> <br /> Wikipedija. Članek: ATPase. (Zadnja objava: 15. april 2011 ob 21:02) http://en.wikipedia.org/wiki/Transmembrane_ATPase <br /> <br /> Wikipedija. Članek: Na+/K+-ATPase (zadnja objava: 19 november 2011 ob 14:49) http://en.wikipedia.org/wiki/NaKATPase<br /> <br /> ==Povezave==<br /> http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120068/bio05.swf::Proton%20Pump <br /> <br /> http://vedez.dzs.si/datoteke/bio-procesi/1_zgradba-in-delovanje-celice/1_prepustnost_membrane/1_aktivni-transport/1_natrij-kalijeva-crpalka/1_uvod/index.html <br /> <br /> http://www.svarog.si/biologija/MSS/index.php?page_id=10959</div>

Mateja Cigoj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Protonske_%C4%8Drpalke&diff=6687 2012-01-03T17:00:22Z

<p>Mateja Cigoj: /* Viri in literatura: */</p> <hr /> <div>Protonske črpalke so membranski [[protein]]i, ki omogočajo prenos proteinov skozi [[celična membrana|celično membrano]]. Pri tem gre za [[Transport_majhnih_molekul_skozi_membrano|aktivni transport]], kar pomeni, da se protoni prenašajo s področja z nižjo koncentracijo preko membrane na področje z višjo koncentracijo. Za to pa je potreben vložek energije v obliki molekul adenozin trifosfata ([[ATP]]).<br /> Bistvo delovanja protonskih črpalk je v tem, da energijo molekule ATP pretvori v elektrokemijski potencial, ki se lahko porabi za druge celične procese. <br /> <br /> Primer takšne črpalke je natrij-kalijeva črpalka, imenovana Na+/K+ ATP-aza, ki je v plazemski membrani skoraj vsake evkariontske celice. <br /> <br /> Na+/K+ ATP-aza<br /> Celice za svoje normalno delovanje potrebujejo določeno koncentracijo natrija in kalija, ki ni enaka koncentraciji teh ionov v zunajcelični tekočini. Zato mora celica z aktivnim antiportom[http://en.wikipedia.org/wiki/Antiport] ves čas črpati natrijeve ione iz celice in kalijeve ione v celico. Natrij kalijeva črpalka, ki sodeluje pri tem procesu je sestavljena iz dveh podenot nameščenih v plazemsko membrano. <br /> Proces transporta poteka tako, da se najprej trije natrijevi ioni vežejo na citoplazemski strani črpalke. Sledi vezava fosfatne skupine iz molekule ATP (Poteče encimsko katalizna fosforilacija. Molekula ATP odda fosfatno skupino in se pretvori v [[ADP]]). Vezava fosfatne skupine sproži konformacijsko spremembo črpalke, da ta potisne natrijeve ione v zunajcelično tekočino. Prazna protonska črpalka sedaj lahko sprejme dva kalijeva iona iz zunajcelične okolice. Ob njuni vezavi pa se fosfatna skupina odcepi, kar povzroči, da se protein vrne v prvotno konformacijsko obliko in prečrpa kalijeva iona v celico. <br /> <br /> Pri takšnem transportu protonov (3 Na+ iz celice in 2K+ v celico), pride do neto razlike v elektrokemijskem potencialu[http://en.wikipedia.org/wiki/Electrochemical_potential] na obeh straneh membrane (znotraj celice je manjši kot zunaj celice). Takšna potencialna razlika je na primer ključna v živčnih celicah, zaradi nastanka živčnega impulza[http://en.wikipedia.org/wiki/Nerve_impulse]. <br /> <br /> Tudi v procesu [[celično dihanje|celičnega dihanja]] deluje protonska črpalka, ki s črpanjem protonom iz notranjosti mitohondrija v prostor med zunanjo in notranjo membrano ustvari koncentracijski gradient in s tem elektrokemijski potencial, ki deluje kot „baterija“ za shranjevanje energije v celici.<br /> <br /> ==Viri in literatura:==<br /> <br /> Boyer R. Temelji biokemije. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Knjižna zbirka Scripta. ISBN 961-242-041-6<br /> <br /> Wikipedija. Članek: Proton Pump. (Zadnja objava 5. november 2011 ob 23:05) http://en.wikipedia.org/wiki/Proton_pump <br /> <br /> Wikipedija. Članek: ATPase. (Zadnja objava: 15. april 2011 ob 21:02) http://en.wikipedia.org/wiki/Transmembrane_ATPase <br /> <br /> Wikipedija. Članek: Na+/K+-ATPase (zadnja objava: 19 november 2011 ob 14:49) http://en.wikipedia.org/wiki/NaKATPase<br /> <br /> ==Povezave==<br /> http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120068/bio05.swf::Proton%20Pump <br /> <br /> http://vedez.dzs.si/datoteke/bio-procesi/1_zgradba-in-delovanje-celice/1_prepustnost_membrane/1_aktivni-transport/1_natrij-kalijeva-crpalka/1_uvod/index.html <br /> <br /> http://www.svarog.si/biologija/MSS/index.php?page_id=10959</div>

Mateja Cigoj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Protonske_%C4%8Drpalke&diff=6686 2012-01-03T17:00:12Z

<p>Mateja Cigoj: </p> <hr /> <div>Protonske črpalke so membranski [[protein]]i, ki omogočajo prenos proteinov skozi [[celična membrana|celično membrano]]. Pri tem gre za [[Transport_majhnih_molekul_skozi_membrano|aktivni transport]], kar pomeni, da se protoni prenašajo s področja z nižjo koncentracijo preko membrane na področje z višjo koncentracijo. Za to pa je potreben vložek energije v obliki molekul adenozin trifosfata ([[ATP]]).<br /> Bistvo delovanja protonskih črpalk je v tem, da energijo molekule ATP pretvori v elektrokemijski potencial, ki se lahko porabi za druge celične procese. <br /> <br /> Primer takšne črpalke je natrij-kalijeva črpalka, imenovana Na+/K+ ATP-aza, ki je v plazemski membrani skoraj vsake evkariontske celice. <br /> <br /> Na+/K+ ATP-aza<br /> Celice za svoje normalno delovanje potrebujejo določeno koncentracijo natrija in kalija, ki ni enaka koncentraciji teh ionov v zunajcelični tekočini. Zato mora celica z aktivnim antiportom[http://en.wikipedia.org/wiki/Antiport] ves čas črpati natrijeve ione iz celice in kalijeve ione v celico. Natrij kalijeva črpalka, ki sodeluje pri tem procesu je sestavljena iz dveh podenot nameščenih v plazemsko membrano. <br /> Proces transporta poteka tako, da se najprej trije natrijevi ioni vežejo na citoplazemski strani črpalke. Sledi vezava fosfatne skupine iz molekule ATP (Poteče encimsko katalizna fosforilacija. Molekula ATP odda fosfatno skupino in se pretvori v [[ADP]]). Vezava fosfatne skupine sproži konformacijsko spremembo črpalke, da ta potisne natrijeve ione v zunajcelično tekočino. Prazna protonska črpalka sedaj lahko sprejme dva kalijeva iona iz zunajcelične okolice. Ob njuni vezavi pa se fosfatna skupina odcepi, kar povzroči, da se protein vrne v prvotno konformacijsko obliko in prečrpa kalijeva iona v celico. <br /> <br /> Pri takšnem transportu protonov (3 Na+ iz celice in 2K+ v celico), pride do neto razlike v elektrokemijskem potencialu[http://en.wikipedia.org/wiki/Electrochemical_potential] na obeh straneh membrane (znotraj celice je manjši kot zunaj celice). Takšna potencialna razlika je na primer ključna v živčnih celicah, zaradi nastanka živčnega impulza[http://en.wikipedia.org/wiki/Nerve_impulse]. <br /> <br /> Tudi v procesu [[celično dihanje|celičnega dihanja]] deluje protonska črpalka, ki s črpanjem protonom iz notranjosti mitohondrija v prostor med zunanjo in notranjo membrano ustvari koncentracijski gradient in s tem elektrokemijski potencial, ki deluje kot „baterija“ za shranjevanje energije v celici.<br /> <br /> ==Viri in literatura:==<br /> <br /> Boyer R. Temelji biokemije. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Knjižna zbirka Scripta. ISBN 961-242-041-6<br /> Wikipedija. Članek: Proton Pump. (Zadnja objava 5. november 2011 ob 23:05) http://en.wikipedia.org/wiki/Proton_pump <br /> Wikipedija. Članek: ATPase. (Zadnja objava: 15. april 2011 ob 21:02) http://en.wikipedia.org/wiki/Transmembrane_ATPase <br /> Wikipedija. Članek: Na+/K+-ATPase (zadnja objava: 19 november 2011 ob 14:49) http://en.wikipedia.org/wiki/NaKATPase <br /> <br /> <br /> ==Povezave==<br /> http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120068/bio05.swf::Proton%20Pump <br /> <br /> http://vedez.dzs.si/datoteke/bio-procesi/1_zgradba-in-delovanje-celice/1_prepustnost_membrane/1_aktivni-transport/1_natrij-kalijeva-crpalka/1_uvod/index.html <br /> <br /> http://www.svarog.si/biologija/MSS/index.php?page_id=10959</div>

Mateja Cigoj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Protonske_%C4%8Drpalke&diff=6684 2012-01-03T16:54:45Z

<p>Mateja Cigoj: </p> <hr /> <div>Protonske črpalke so membranski [[protein]]i, ki omogočajo prenos proteinov skozi [[celična membrana|celično membrano]]. Pri tem gre za [[Transport_majhnih_molekul_skozi_membrano|aktivni transport]], kar pomeni, da se protoni prenašajo s področja z nižjo koncentracijo preko membrane na področje z višjo koncentracijo. Za to pa je potreben vložek energije v obliki molekul adenozin trifosfata ([[ATP]]).<br /> Bistvo delovanja protonskih črpalk je v tem, da energijo molekule ATP pretvori v elektrokemijski potencial, ki se lahko porabi za druge celične procese. <br /> <br /> Primer takšne črpalke je natrij-kalijeva črpalka, imenovana Na+/K+ ATP-aza, ki je v plazemski membrani skoraj vsake evkariontske celice. <br /> <br /> Na+/K+ ATP-aza<br /> Celice za svoje normalno delovanje potrebujejo določeno koncentracijo natrija in kalija, ki ni enaka koncentraciji teh ionov v zunajcelični tekočini. Zato mora celica z aktivnim antiportom[http://en.wikipedia.org/wiki/Antiport] ves čas črpati natrijeve ione iz celice in kalijeve ione v celico. Natrij kalijeva črpalka, ki sodeluje pri tem procesu je sestavljena iz dveh podenot nameščenih v plazemsko membrano. <br /> Proces transporta poteka tako, da se najprej trije natrijevi ioni vežejo na citoplazemski strani črpalke. Sledi vezava fosfatne skupine iz molekule ATP (Poteče encimsko katalizna fosforilacija. Molekula ATP odda fosfatno skupino in se pretvori v ADP). Vezava fosfatne skupine sproži konformacijsko spremembo črpalke, da ta potisne natrijeve ione v zunajcelično tekočino. Prazna protonska črpalka sedaj lahko sprejme dva kalijeva iona iz zunajcelične okolice. Ob njuni vezavi pa se fosfatna skupina odcepi, kar povzroči, da se protein vrne v prvotno konformacijsko obliko in prečrpa kalijeva iona v celico. <br /> <br /> Pri takšnem transportu protonov (3 Na+ iz celice in 2K+ v celico), pride do neto razlike v elektrokemijskem potencialu na obeh straneh membrane (znotraj celice je manjši kot zunaj celice). Takšna potencialna razlika je na primer ključna v živčnih celicah, zaradi nastanka živčnega impulza. <br /> <br /> Tudi v procesu celičnega dihanja deluje protonska črpalka, ki s črpanjem protonom iz notranjosti mitohondrija v prostor med zunanjo in notranjo membrano ustvari koncentracijski gradient in s tem elektrokemijski potencial, ki deluje kot „baterija“ za shranjevanje energije v celici.<br /> <br /> ==Viri in literatura:==<br /> <br /> Boyer R. Temelji biokemije. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Knjižna zbirka Scripta. ISBN 961-242-041-6<br /> Wikipedija. Članek: Proton Pump. (Zadnja objava 5. november 2011 ob 23:05) http://en.wikipedia.org/wiki/Proton_pump <br /> Wikipedija. Članek: ATPase. (Zadnja objava: 15. april 2011 ob 21:02) http://en.wikipedia.org/wiki/Transmembrane_ATPase <br /> Wikipedija. Članek: Na+/K+-ATPase (zadnja objava: 19 november 2011 ob 14:49) http://en.wikipedia.org/wiki/NaKATPase <br /> <br /> <br /> ==Povezave==<br /> http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120068/bio05.swf::Proton%20Pump <br /> <br /> http://vedez.dzs.si/datoteke/bio-procesi/1_zgradba-in-delovanje-celice/1_prepustnost_membrane/1_aktivni-transport/1_natrij-kalijeva-crpalka/1_uvod/index.html <br /> <br /> http://www.svarog.si/biologija/MSS/index.php?page_id=10959</div>

Mateja Cigoj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Protonske_%C4%8Drpalke&diff=6683 2012-01-03T16:45:04Z

<p>Mateja Cigoj: </p> <hr /> <div>Protonske črpalke so membranski proteini, ki omogočajo prenos proteinov skozi celično membrano. Pri tem gre za aktivni transport, kar pomeni, da se protoni prenašajo s področja z nižjo koncentracijo preko membrane na področje z višjo koncentracijo. Za to pa je potreben vložek energije v obliki molekul adenozin trifosfata (ATP).<br /> Bistvo delovanja protonskih črpalk je v tem, da energijo molekule ATP pretvori v elektrokemijski potencial, ki se lahko porabi za druge celične procese. <br /> <br /> Primer takšne črpalke je natrij-kalijeva črpalka, imenovana Na+/K+ ATP-aza, ki je v plazemski membrani skoraj vsake evkariontske celice. <br /> <br /> Na+/K+ ATP-aza<br /> Celice za svoje normalno delovanje potrebujejo določeno koncentracijo natrija in kalija, ki ni enaka koncentraciji teh ionov v zunajcelični tekočini. Zato mora celica z aktivnim antiportom ves čas črpati natrijeve ione iz celice in kalijeve ione v celico. Natrij kalijeva črpalka, ki sodeluje pri tem procesu je sestavljena iz dveh podenot nameščenih v plazemsko membrano. <br /> Proces transporta poteka tako, da se najprej trije natrijevi ioni vežejo na citoplazemski strani črpalke. Sledi vezava fosfatne skupine iz molekule ATP (Poteče encimsko katalizna fosforilacija. Molekula ATP odda fosfatno skupino in se pretvori v ADP). Vezava fosfatne skupine sproži konformacijsko spremembo črpalke, da ta potisne natrijeve ione v zunajcelično tekočino. Prazna protonska črpalka sedaj lahko sprejme dva kalijeva iona iz zunajcelične okolice. Ob njuni vezavi pa se fosfatna skupina odcepi, kar povzroči, da se protein vrne v prvotno konformacijsko obliko in prečrpa kalijeva iona v celico. <br /> <br /> Pri takšnem transportu protonov (3 Na+ iz celice in 2K+ v celico), pride do neto razlike v elektrokemijskem potencialu na obeh straneh membrane (znotraj celice je manjši kot zunaj celice). Takšna potencialna razlika je na primer ključna v živčnih celicah, zaradi nastanka živčnega impulza. <br /> <br /> Tudi v procesu celičnega dihanja deluje protonska črpalka, ki s črpanjem protonom iz notranjosti mitohondrija v prostor med zunanjo in notranjo membrano ustvari koncentracijski gradient in s tem elektrokemijski potencial, ki deluje kot „baterija“ za shranjevanje energije v celici.<br /> <br /> ==Viri in literatura:==<br /> <br /> Boyer R. Temelji biokemije. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Knjižna zbirka Scripta. ISBN 961-242-041-6<br /> Wikipedija. Članek: Proton Pump. (Zadnja objava 5. november 2011 ob 23:05) http://en.wikipedia.org/wiki/Proton_pump <br /> Wikipedija. Članek: ATPase. (Zadnja objava: 15. april 2011 ob 21:02) http://en.wikipedia.org/wiki/Transmembrane_ATPase <br /> Wikipedija. Članek: Na+/K+-ATPase (zadnja objava: 19 november 2011 ob 14:49) http://en.wikipedia.org/wiki/NaKATPase <br /> <br /> <br /> ==Povezave==<br /> http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120068/bio05.swf::Proton%20Pump <br /> <br /> http://vedez.dzs.si/datoteke/bio-procesi/1_zgradba-in-delovanje-celice/1_prepustnost_membrane/1_aktivni-transport/1_natrij-kalijeva-crpalka/1_uvod/index.html <br /> <br /> http://www.svarog.si/biologija/MSS/index.php?page_id=10959</div>

Mateja Cigoj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Hirudin&diff=6681 2012-01-03T16:44:20Z

<p>Mateja Cigoj: Undo revision 6680 by Mateja Cigoj (Talk)</p> <hr /> <div>=Hirudin=<br /> '''Hirudin''' je najmočnejši znan naravni inhibitor [[trombin]]a in spada v eno od dveh večjih skupin direktnih inhibitorjev trombina (bivalentni inhibitorji trombina), kamor spadajo tudi derivati hirudina (najbolj znani: lepirudin, desirudin in bivalirudin). Uporablja se ga kot [[antikoagulant]], saj se ireverzibilno z visoko afiniteto veže na aktivno mesto in na zunanje vezavno mesto (angl.:exosite 1) trombina, to sta mesti, kamor se drugače veže [[fibrinogen]]. Pri tem nastane stabilen nekovalenten hirudin-trombin kompleks [http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Thrombin_block_by_hirudin.PNG slika kompleksa] ([[disociacijska konstanta]] ~10&lt;sup&gt;-14&lt;/sup&gt; M ) in tako preprečuje tvorbo [[fibrin]]a iz fibrinogena in zavira nastanek koagulacijskih faktorjev V,VIII in XIII, kar onemogoči strjevanje krvi. Hirudin se veže tako na trombin vezan v strdkih, kot tudi na prosto plavajočega v krvi (preprečuje nastanek in topi že nastale strdke) .<br /> <br /> Zgodovinsko je snov leta 1884 odkril britanski fiziolog John Berry Haycraft v obustnih žlezah medicinske pijavke (''hirudo medicinalis'') in jo poimenoval po njenem latinskem imenu. Snov so prvič izolirali v petdesetih letih 20. stoletja, njeno strukturo pa so uspeli razvozlati šele leta 1976. Hirudin in njegove derivate najdemo tudi v drugih vrstah pijavk (npr. ''Hirudinaria manillensis'').<br /> <br /> Hirudin se lahko pridobiva direktno iz obustnih žlez pijavke, zaradi zamudnega in dragega postopka pa ga pridobivajo, enako kot tudi druge derivate hirudina, z [[rekombinantna tehnologija|rekombinantno tehnologijo]].<br /> <br /> V medicini se uporablja za preprečevanje [[tromboza|tromboze]], terapevtsko pomemben je tudi pri drugih motnjah strjevanja krvi, pri zdravljenju [[hematom]]ov in površinskih krčnih žil, v obliki injekcije ali kreme, uporabljajo ga tudi za nižanje visokega krvnega pritiska. Prednost hirudina pred drugimi antikoagulanti (npr. [[heparin]]) je, da ne vpliva na biološko aktivnost drugih serumskih proteinov. Način zdravljenja pri katerem se uporabljajo pijavke se imenuje hirudoterapija [http://www.leeches.biz/hirudotherapy.htm].<br /> <br /> je polipeptid iz 65 aminokislinskih ostankov (struktura je utrjena s tremi disulfidnimi mostički), molekulska masa je približno 7kDa.<br /> <br /> ==viri==<br /> *B. Sket, M. Gogala: Živalstvo Slovenije, stran 150-154<br /> *S. Offermanns, W. Rosenthal: Encyclopedic reference of molecular pharmacology, stran 56-61<br /> * [http://en.wikipedia.org/wiki/Hirudin Hirudin, Wikipedia]<br /> * [http://www.abcam.com/Hirudin-protein-ab59096.html Abcam]<br /> <br /> [[Category:LEX]]</div>

Mateja Cigoj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Hirudin&diff=6680 2012-01-03T16:44:00Z

<p>Mateja Cigoj: /* Hirudin */</p> <hr /> <div>'''Hirudin''' je najmočnejši znan naravni inhibitor [[trombin]]a in spada v eno od dveh večjih skupin direktnih inhibitorjev trombina (bivalentni inhibitorji trombina), kamor spadajo tudi derivati hirudina (najbolj znani: lepirudin, desirudin in bivalirudin). Uporablja se ga kot [[antikoagulant]], saj se ireverzibilno z visoko afiniteto veže na aktivno mesto in na zunanje vezavno mesto (angl.:exosite 1) trombina, to sta mesti, kamor se drugače veže [[fibrinogen]]. Pri tem nastane stabilen nekovalenten hirudin-trombin kompleks [http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Thrombin_block_by_hirudin.PNG slika kompleksa] ([[disociacijska konstanta]] ~10&lt;sup&gt;-14&lt;/sup&gt; M ) in tako preprečuje tvorbo [[fibrin]]a iz fibrinogena in zavira nastanek koagulacijskih faktorjev V,VIII in XIII, kar onemogoči strjevanje krvi. Hirudin se veže tako na trombin vezan v strdkih, kot tudi na prosto plavajočega v krvi (preprečuje nastanek in topi že nastale strdke) .<br /> <br /> Zgodovinsko je snov leta 1884 odkril britanski fiziolog John Berry Haycraft v obustnih žlezah medicinske pijavke (''hirudo medicinalis'') in jo poimenoval po njenem latinskem imenu. Snov so prvič izolirali v petdesetih letih 20. stoletja, njeno strukturo pa so uspeli razvozlati šele leta 1976. Hirudin in njegove derivate najdemo tudi v drugih vrstah pijavk (npr. ''Hirudinaria manillensis'').<br /> <br /> Hirudin se lahko pridobiva direktno iz obustnih žlez pijavke, zaradi zamudnega in dragega postopka pa ga pridobivajo, enako kot tudi druge derivate hirudina, z [[rekombinantna tehnologija|rekombinantno tehnologijo]].<br /> <br /> V medicini se uporablja za preprečevanje [[tromboza|tromboze]], terapevtsko pomemben je tudi pri drugih motnjah strjevanja krvi, pri zdravljenju [[hematom]]ov in površinskih krčnih žil, v obliki injekcije ali kreme, uporabljajo ga tudi za nižanje visokega krvnega pritiska. Prednost hirudina pred drugimi antikoagulanti (npr. [[heparin]]) je, da ne vpliva na biološko aktivnost drugih serumskih proteinov. Način zdravljenja pri katerem se uporabljajo pijavke se imenuje hirudoterapija [http://www.leeches.biz/hirudotherapy.htm].<br /> <br /> je polipeptid iz 65 aminokislinskih ostankov (struktura je utrjena s tremi disulfidnimi mostički), molekulska masa je približno 7kDa.<br /> <br /> ==viri==<br /> *B. Sket, M. Gogala: Živalstvo Slovenije, stran 150-154<br /> *S. Offermanns, W. Rosenthal: Encyclopedic reference of molecular pharmacology, stran 56-61<br /> * [http://en.wikipedia.org/wiki/Hirudin Hirudin, Wikipedia]<br /> * [http://www.abcam.com/Hirudin-protein-ab59096.html Abcam]<br /> <br /> [[Category:LEX]]</div>

Mateja Cigoj https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Protonske_%C4%8Drpalke&diff=6678 2012-01-03T16:43:04Z

<p>Mateja Cigoj: New page: PROTONSKE ČRPALKE Protonske črpalke so membranski proteini, ki omogočajo prenos proteinov skozi celično membrano. Pri tem gre za aktivni transport, kar pomeni, da se protoni prenaša...</p> <hr /> <div>PROTONSKE ČRPALKE<br /> <br /> Protonske črpalke so membranski proteini, ki omogočajo prenos proteinov skozi celično membrano. Pri tem gre za aktivni transport, kar pomeni, da se protoni prenašajo s področja z nižjo koncentracijo preko membrane na področje z višjo koncentracijo. Za to pa je potreben vložek energije v obliki molekul adenozin trifosfata (ATP).<br /> Bistvo delovanja protonskih črpalk je v tem, da energijo molekule ATP pretvori v elektrokemijski potencial, ki se lahko porabi za druge celične procese. <br /> <br /> Primer takšne črpalke je natrij-kalijeva črpalka, imenovana Na+/K+ ATP-aza, ki je v plazemski membrani skoraj vsake evkariontske celice. <br /> <br /> Na+/K+ ATP-aza<br /> Celice za svoje normalno delovanje potrebujejo določeno koncentracijo natrija in kalija, ki ni enaka koncentraciji teh ionov v zunajcelični tekočini. Zato mora celica z aktivnim antiportom ves čas črpati natrijeve ione iz celice in kalijeve ione v celico. Natrij kalijeva črpalka, ki sodeluje pri tem procesu je sestavljena iz dveh podenot nameščenih v plazemsko membrano. <br /> Proces transporta poteka tako, da se najprej trije natrijevi ioni vežejo na citoplazemski strani črpalke. Sledi vezava fosfatne skupine iz molekule ATP (Poteče encimsko katalizna fosforilacija. Molekula ATP odda fosfatno skupino in se pretvori v ADP). Vezava fosfatne skupine sproži konformacijsko spremembo črpalke, da ta potisne natrijeve ione v zunajcelično tekočino. Prazna protonska črpalka sedaj lahko sprejme dva kalijeva iona iz zunajcelične okolice. Ob njuni vezavi pa se fosfatna skupina odcepi, kar povzroči, da se protein vrne v prvotno konformacijsko obliko in prečrpa kalijeva iona v celico. <br /> <br /> Pri takšnem transportu protonov (3 Na+ iz celice in 2K+ v celico), pride do neto razlike v elektrokemijskem potencialu na obeh straneh membrane (znotraj celice je manjši kot zunaj celice). Takšna potencialna razlika je na primer ključna v živčnih celicah, zaradi nastanka živčnega impulza. <br /> <br /> Tudi v procesu celičnega dihanja deluje protonska črpalka, ki s črpanjem protonom iz notranjosti mitohondrija v prostor med zunanjo in notranjo membrano ustvari koncentracijski gradient in s tem elektrokemijski potencial, ki deluje kot „baterija“ za shranjevanje energije v celici.<br /> <br /> Viri in literatura:<br /> <br /> Boyer R. Temelji biokemije. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Knjižna zbirka Scripta. ISBN 961-242-041-6<br /> Wikipedija. Članek: Proton Pump. (Zadnja objava 5. november 2011 ob 23:05) http://en.wikipedia.org/wiki/Proton_pump <br /> Wikipedija. Članek: ATPase. (Zadnja objava: 15. april 2011 ob 21:02) http://en.wikipedia.org/wiki/Transmembrane_ATPase <br /> Wikipedija. Članek: Na+/K+-ATPase (zadnja objava: 19 november 2011 ob 14:49) http://en.wikipedia.org/wiki/NaKATPase <br /> <br /> <br /> Povezave:<br /> http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120068/bio05.swf::Proton%20Pump <br /> <br /> http://vedez.dzs.si/datoteke/bio-procesi/1_zgradba-in-delovanje-celice/1_prepustnost_membrane/1_aktivni-transport/1_natrij-kalijeva-crpalka/1_uvod/index.html <br /> <br /> http://www.svarog.si/biologija/MSS/index.php?page_id=10959</div>

Mateja Cigoj