Wiki FKKT - User contributions [en]

PHOCUS: Insekticid proti kobilicam na osnovi bakteriofagov

2021-05-25T10:06:51Z

Matija Ruparčič: /* Karakterizacija RNAi */

PHOCUS je projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, s katerim je ekipa podiplomskih študentov iz Delfta na Nizozemskem osvojila prvo mesto na področju Hrana.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:TUDelft

Avtor povzetka: Matija Ruparčič

== Problem ==
Puščavske kobilice (''Schistocerca gregaria'') običajno živijo samotarsko, med sušnimi obdobji pa se ob iskanju hrane združijo skupaj. Ko gostota združbe preseže kritično mejo, preidejo kobilice iz neškodljivega samotarskega fenotipa (solitaria) v črednega (gregaria), pri čemer se jim spremenijo morfologija, vedenjski vzorci in prehranske navade [1]. V čredni obliki se puščavske kobilice zbirajo v rojih, ki lahko štejejo tudi do 8 milijonov osebkov; tak roj v dnevu poje enako količino hrane kot 3,5 milijona ljudi [2].

Zaradi neizmerne škode, ki jo roji kobilic povzročajo vsako leto na območju Severne Afrike, Arabskega polotoka in Južne Azije, je obvladovanje njihovega števila ključnega pomena. Za to sta na voljo dva pristopa, kemični ter biološki pesticidi, ki pa imata oba svoje pomanjkljivosti; kemični pesticidi so sicer učinkoviti, vendar nespecifični, medtem ko so biološki pesticidi sicer specifični, a delujejo prepočasi za uporabo ob nenadnih izbruhih [2, 3].

== Projekt PHOCUS ==

=== Ideja ===
Ideja projekta je bila zasnovati nov biološki pesticid, ki je še vedno specifičen, obenem pa deluje hitreje kot trenutni. Ekipa iz Delfta se je odločila uporabiti rekombinantne bakteriofage z zapisi za toksine, ki delujejo le na kobilicah. Ob zaužitju poškropljene hrane pridejo fagi v črevo kobilic, kjer okužijo bakterije črevesne flore. Tekom okužbe pričnejo le-te sintetizirati, nove bakteriofage, ki po lizi okužijo sosednje bakterije, in toksine, ki se ob lizi sprostijo v lumen črevesa in povzročijo smrt kobilice [4].

Končni izdelek naj bi vseboval koktejl litičnih fagov, ki okužijo več vrst bakterij iz rodu ''Enterobacter''; ta namreč predstavlja velik delež mikrobioma puščavskih kobilic [5].

=== Princip delovanja ===
Ekipa je zasnovala PHOCUS tako, da povzroči smrt kobilic na dva načina, in sicer preko (1) insekticidne aktivnosti toksina Cry7Ca1 ter (2) preko utišanja genov z RNA interferenco (RNAi).

Cry7Ca1 je endotoksin delta, ki ga ob sporulaciji proizvaja bakterija Bacillus thuringiensis (sev BTH-13). Mehanizem delovanja še ni popolnoma znan; predvideva se, da se aktivni toksin specifično veže na receptor na membrani črevesnih celic in povzroči tvorbo ionskega kanalčka, kar privede do celične lize ter s tem do poškodbe črevesa [4]. Tako kot ostali endotoksini delta iz B. thuringiensis ima tudi Cry7Ca1 omejen spekter delovanja; pri kobilicah Locusta migratoria manilensis izkazuje visoko insekticidno aktivnost, medtem ko je neškodljiv za metulje, hrošče in dvokrilce [6].

Rekombinantni fagi naj bi poleg zapisa za toksin vsebovali še zapis za kratko lasnično RNA (shRNA). Ta bi se na koncu litičnega cikla prav tako sprostila v lumen črevesa, nato pa bi prešla v hemolimfo in z tam v celice, kjer bi ob procesiranju z endonukleazo DICER dozorela v siRNA. Slednja nato lahko tvori kompleks RISC, ki utiša tarčne gene, kar privede bodisi do smrti bodisi do neplodnosti kobilice [4, 7]. Prehod shRNA iz lumna črevesa v hemolimfo je lahko dodatno olajšana z uporabo dostavljalnega proteina, ki vsebuje regijo s katero se specifično veže na shRNA; primer take regije je RNA-vezavna domena (RBD) iz proteina Fox-1 [8].

== Eksperimentalno delo ==
Zaradi pandemije COVID-19 ekipi ni uspelo sestaviti in ovrednotiti delovanje PHOCUS, vendar pa so uspešno pripravili 10 osnovnih ter 9 sestavljenih bioloških delov, s katerimi so okarakterizirali posamezne komponente insekticida. Pri eksperimentih so uporabljali bakterije ''Escherichia coli'' BL21(DE3) ter bakteriofage T7.

=== Priprava rekombinantnih fagov ===
Rekombinantne fage T7 so pripravili s pomočjo homologne rekombinacije, in sicer z metodo BRED (angl. Bacteriophage Recombineering of Electroporated DNA) [9].

Znotraj fagne DNA so izbrali tri neesencialne gene, ki so jih želeli zamenjati z reporterskim genom (eGFP), in sicer: 0,6A in 1,1 (zgodnja gena) ter 4,3 (srednji gen). Vključek so pripravili tako, da so s PCR pomnožili zapis za eGFP ter mu preko previsov na vsako stran dodali 100 bp zaporedje, ki je bilo homologno tarčnemu genu na fagu. Z vključkom so nato preko elektroporacije transformirali ''E. coli'' BL21(DE3) in jih nato okužili s fagi T7. Ob vstopu fagne DNA v celico je prišlo do homologne rekombinacije z vključkom, pri čemer je nastala rekombinantna fagna DNA [9].

Bakterije so pred tem transformirali še s plazmidi pKDsgRNA, ki so vsebovali vodilno RNA (sgRNA) za enega izmed treh neesencialni fagni gen, in pCas9-CR4, ki je vseboval zapis za endonukleazo Cas9. Kompleks sgRNA-Cas9 prepozna tarčno zaporedje na fagni DNA divjega tipa (wt) in ga cepi, s čimer se zmanjša število novonastalih wt fagov.

=== Karakterizacija RNAi ===
Tekom karakterizacije RNAi komponente so jih zanimale tri stvari:
* Ali lahko z RNA-polimerazo T7 pridobijo pravilno prepisano shRNA ''in vitro''?
* Ali se domena RBD iz proteina Fox-1 veže specifično na shRNA?
* Ali lahko endonukleaza DICER prepozna ter procesira shRNA do siRNA?

In vitro translacijo s polimerazo T7 so izvedli s pomočjo kompleta reagentov T7 RiboMAX RNAi express kit (Promega). Uporabili so shRNA, ki je sestavljena iz: i) prepoznavnega zaporedja za eGFP, ii) zavoja, ki ga prepozna Fox-1 in iii) previsa GG na 3'-koncu ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407006 BBa_K3407006]) ter jo vstavili pod promotor T7 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407022 BBa_K3407022]). Sintetizirane shRNA so analizirali na Urea-PAGE.

Vezavo domene RBD iz Fox-1 na shRNA so preverjali s testom zamika elektroforezne mobilnosti (EMSA). ''E. coli'' BL21(DE3) so transformirali s prej omenjeno shRNA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407022 BBa_K3407022]) ter Fox-1 RBD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407020 BBa_K3407020]) v molarnih razmerjih 1:1 ter 1:2. Eksperiment so ponovili še trikrat; prvič so uporabili mutirano obliko Fox-1 RBD, ki naj bi imela nižjo afiniteto do shRNA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407024 BBa_K3407024]), drugič shRNA, ki ima dve mutaciji na zavoju ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407023 BBa_K3407023]), tretjič pa in mutiran Fox-1 RBD in mutirano shRNA. Vzorce so analizirali na nativnem PAGE.

Ali bi DICER iz kobilic prepoznal ter procesiral shRNA do siRNA so preverili s tem, da so 400 ng shRNA inkubirali pri 25°C v pufru, ki je vseboval 0,2 µM DICER iz ''Drosophila melanogaster''. Po določenem času (1-5 h) so reakcijo prekinili s tekočim dušikom in vzorce analizirali na Urea-PAGE.

=== Matematični model ===
Delovanje PHOCUS so testirali s pomočjo matematičnega modela, ki so ga priredili po že obstoječem, ki sta ga zasnovala Beretta in Kuang [10]. Model vsebuje štiri spremenljivke: i) koncentracija zdravih bakterij, ii) koncentracija okuženih bakterij, iii) koncentracija fagov in iv) koncentracija toksinov ter spremlja spreminjanje le-teh skozi čas; pri tem upošteva iz eksperimentov/literature pridobljene parametre (npr. hitrost rasti in lize bakterij, maksimalna kapaciteta bakterij, hitrost propadanja fagov itd.). Model so kasneje dopolnili še z dodatnim korakom, kjer so upoštevali razvoj rezistence na fage. Model so evalvirali tako, da so bakterije ''E. coli'' okužili s fagi T7 in merili časovno odvisnost OD600 bakterij ter časovno odvisnost koncentracije fagov.

== Rezultati ==
Ekipi je tekom priprave rekombinantnih fagov T7 uspelo zamenjati vse tri neesencialne gene z metodo BRED, vendar so pri genih 0,6A in 1,1 opazili še neželene produkte, zato so v nadaljevanju uporabljali fage z zamenjanim genom 4,3. Kljub uporabi sistema CRISPR-Cas9 jim rekombinantnih fagov ni uspelo izolirati, saj so plaki še vedno vsebovali fage divjega tipa.

Tekom karakterizacije RNAi komponente so ugotovili, da lahko polimeraza T7 uspešno prepiše zapis za shRNA in vitro; prepisana shRNA pri tem tudi zavzame pravilno sekundarno strukturo (lasnična zanka). Eksperimenti z metodo EMSA so pokazali, da se RBD Fox-1 lahko veže tako tarčno kot tudi na mutirano shRNA, medtem ko se mutirana domena ne veže na nobeno. Domena se veže močneje pri molarnem razmerju 1:2. Ugotovili so tudi, da DICER iz ''D. melanogaster'' prepozna in procesira shRNA do siRNA, kar nakazuje, da je ima uporabljena shRNA potencial za utišanje genov kobilic v procesu RNAi.

Simulacije z matematičnim modelom so pokazale, da lahko insekticid proizvede zadostno količino toksinov, ki povzroči smrt osebkov v manj kot 7 dneh; hitrost razvoja rezistence na fage je prepočasna, da bi bistveno vplivala na produkcijo toksinov. Evalvacija modela je pokazala, da uporabljene enačbe in parametri odražajo realno stanje sistema.

== Zaključek ==
Na tekmovanju iGEM 2020 je na področju Hrana zmagala skupina študentov iz UT Delft. Pripravili so insekticid z imenom PHOCUS, ki temelji na uporabi rekombinantnih bakteriofagov, ki okužijo črevesno floro kobilic ter povzročijo sintezo toksina Cry7Ca1 ter shRNA. Uspelo jim je okarakterizirati posamezne komponente insekticida, z matematičnim modelom pa jim je uspelo dokazati, da lahko insekticid ubije kobilice v dovolj hitrem času.

Pred uporabo v praksi bi bilo treba opraviti še naslednje stvari:
* Preveriti toksičnost Cry7Ca1 za ''Schistocerca gregaria''
* Priprava dostavljalnega proteina za olajšan transport shRNA iz lumna črevesa v hemolimfo
* Preizkusiti prepisovanje več shRNA v tandemu (tshRNA) in procesiranje le-te do posameznih shRNA z encimom Mini-3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407018 BBa_K3407018])
* Preizkusiti koekspresijo shRNA z inhibitorji RNaz

== Viri ==
# D. A. Cullen, A. J. Cease, A. V. Latchininsky, A. Ayali, K. Berry, J. Buhl, R. De Keyser, B. Foquet, J. C. Hadrich, … S. M. Rogers: From Molecules to Management: Mechanisms and Consequences of Locust Phase Polyphenism. 1. izd., Elsevier Ltd. 2017, Let. 53.
# A. Roussi: Why gigantic locust swarms are challenging governments and researchers. Nature 2020, 579(7799), str. 330–330.
# L. Zhang, M. Lecoq, A. Latchininsky, D. Hunter: Locust and Grasshopper Management. Annu. Rev. Entomol. 2019, 64(1), str. 15–34.
# TU Delft iGEM Team https://2020.igem.org/Team:TUDelft (pridobljeno 19. 5. 2021).
# O. Lavy, U. Gophna, E. Gefen, A. Ayali: The effect of density-dependent phase on the locust gut bacterial composition. Front. Microbiol. 2019, 10(JAN), str. 1–8.
# Y. Wu, C.-F. Lei, D. Yi, P.-M. Liu, M.-Y. Gao: Novel Bacillus thuringiensis δ-Endotoxin Active against Locusta migratoria manilensis. Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77(10), str. 3227–3233.
# G. J. Hannon: RNA interference. Nature 2002, 418(6894), str. 244–251.
# S. D. Auweter, R. Fasan, L. Reymond, J. G. Underwood, D. L. Black, S. Pitsch, F. H.-T. Allain: Molecular basis of RNA recognition by the human alternative splicing factor Fox-1. EMBO J. 2006, 25(1), str. 163–173.
# L. J. Marinelli, M. Piuri, Z. Swigoňová, A. Balachandran, L. M. Oldfield, J. C. van Kessel, G. F. Hatfull: BRED: A Simple and Powerful Tool for Constructing Mutant and Recombinant Bacteriophage Genomes. PLoS One 2008, 3(12), str. e3957.
# E. Beretta, Y. Kuang: Modeling and analysis of a marine bacteriophage infection. Math. Biosci. 1998, 149(1), str. 57–76.

PHOCUS: Insekticid proti kobilicam na osnovi bakteriofagov

2021-05-24T16:46:56Z

Matija Ruparčič: /* Matematični model */

PHOCUS je projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, s katerim je ekipa podiplomskih študentov iz Delfta na Nizozemskem osvojila prvo mesto na področju Hrana.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:TUDelft

Avtor povzetka: Matija Ruparčič

== Problem ==
Puščavske kobilice (''Schistocerca gregaria'') običajno živijo samotarsko, med sušnimi obdobji pa se ob iskanju hrane združijo skupaj. Ko gostota združbe preseže kritično mejo, preidejo kobilice iz neškodljivega samotarskega fenotipa (solitaria) v črednega (gregaria), pri čemer se jim spremenijo morfologija, vedenjski vzorci in prehranske navade [1]. V čredni obliki se puščavske kobilice zbirajo v rojih, ki lahko štejejo tudi do 8 milijonov osebkov; tak roj v dnevu poje enako količino hrane kot 3,5 milijona ljudi [2].

Zaradi neizmerne škode, ki jo roji kobilic povzročajo vsako leto na območju Severne Afrike, Arabskega polotoka in Južne Azije, je obvladovanje njihovega števila ključnega pomena. Za to sta na voljo dva pristopa, kemični ter biološki pesticidi, ki pa imata oba svoje pomanjkljivosti; kemični pesticidi so sicer učinkoviti, vendar nespecifični, medtem ko so biološki pesticidi sicer specifični, a delujejo prepočasi za uporabo ob nenadnih izbruhih [2, 3].

== Projekt PHOCUS ==

=== Ideja ===
Ideja projekta je bila zasnovati nov biološki pesticid, ki je še vedno specifičen, obenem pa deluje hitreje kot trenutni. Ekipa iz Delfta se je odločila uporabiti rekombinantne bakteriofage z zapisi za toksine, ki delujejo le na kobilicah. Ob zaužitju poškropljene hrane pridejo fagi v črevo kobilic, kjer okužijo bakterije črevesne flore. Tekom okužbe pričnejo le-te sintetizirati, nove bakteriofage, ki po lizi okužijo sosednje bakterije, in toksine, ki se ob lizi sprostijo v lumen črevesa in povzročijo smrt kobilice [4].

Končni izdelek naj bi vseboval koktejl litičnih fagov, ki okužijo več vrst bakterij iz rodu ''Enterobacter''; ta namreč predstavlja velik delež mikrobioma puščavskih kobilic [5].

=== Princip delovanja ===
Ekipa je zasnovala PHOCUS tako, da povzroči smrt kobilic na dva načina, in sicer preko (1) insekticidne aktivnosti toksina Cry7Ca1 ter (2) preko utišanja genov z RNA interferenco (RNAi).

Cry7Ca1 je endotoksin delta, ki ga ob sporulaciji proizvaja bakterija Bacillus thuringiensis (sev BTH-13). Mehanizem delovanja še ni popolnoma znan; predvideva se, da se aktivni toksin specifično veže na receptor na membrani črevesnih celic in povzroči tvorbo ionskega kanalčka, kar privede do celične lize ter s tem do poškodbe črevesa [4]. Tako kot ostali endotoksini delta iz B. thuringiensis ima tudi Cry7Ca1 omejen spekter delovanja; pri kobilicah Locusta migratoria manilensis izkazuje visoko insekticidno aktivnost, medtem ko je neškodljiv za metulje, hrošče in dvokrilce [6].

Rekombinantni fagi naj bi poleg zapisa za toksin vsebovali še zapis za kratko lasnično RNA (shRNA). Ta bi se na koncu litičnega cikla prav tako sprostila v lumen črevesa, nato pa bi prešla v hemolimfo in z tam v celice, kjer bi ob procesiranju z endonukleazo DICER dozorela v siRNA. Slednja nato lahko tvori kompleks RISC, ki utiša tarčne gene, kar privede bodisi do smrti bodisi do neplodnosti kobilice [4, 7]. Prehod shRNA iz lumna črevesa v hemolimfo je lahko dodatno olajšana z uporabo dostavljalnega proteina, ki vsebuje regijo s katero se specifično veže na shRNA; primer take regije je RNA-vezavna domena (RBD) iz proteina Fox-1 [8].

== Eksperimentalno delo ==
Zaradi pandemije COVID-19 ekipi ni uspelo sestaviti in ovrednotiti delovanje PHOCUS, vendar pa so uspešno pripravili 10 osnovnih ter 9 sestavljenih bioloških delov, s katerimi so okarakterizirali posamezne komponente insekticida. Pri eksperimentih so uporabljali bakterije ''Escherichia coli'' BL21(DE3) ter bakteriofage T7.

=== Priprava rekombinantnih fagov ===
Rekombinantne fage T7 so pripravili s pomočjo homologne rekombinacije, in sicer z metodo BRED (angl. Bacteriophage Recombineering of Electroporated DNA) [9].

Znotraj fagne DNA so izbrali tri neesencialne gene, ki so jih želeli zamenjati z reporterskim genom (eGFP), in sicer: 0,6A in 1,1 (zgodnja gena) ter 4,3 (srednji gen). Vključek so pripravili tako, da so s PCR pomnožili zapis za eGFP ter mu preko previsov na vsako stran dodali 100 bp zaporedje, ki je bilo homologno tarčnemu genu na fagu. Z vključkom so nato preko elektroporacije transformirali ''E. coli'' BL21(DE3) in jih nato okužili s fagi T7. Ob vstopu fagne DNA v celico je prišlo do homologne rekombinacije z vključkom, pri čemer je nastala rekombinantna fagna DNA [9].

Bakterije so pred tem transformirali še s plazmidi pKDsgRNA, ki so vsebovali vodilno RNA (sgRNA) za enega izmed treh neesencialni fagni gen, in pCas9-CR4, ki je vseboval zapis za endonukleazo Cas9. Kompleks sgRNA-Cas9 prepozna tarčno zaporedje na fagni DNA divjega tipa (wt) in ga cepi, s čimer se zmanjša število novonastalih wt fagov.

=== Karakterizacija RNAi ===
Tekom karakterizacije RNAi komponente so jih zanimale tri stvari:
* Ali lahko z RNA-polimerazo T7 pridobijo shRNA s pravilno sekundarno strukturo in vitro?
* Ali se domena RBD iz proteina Fox-1 veže specifično na shRNA?
* Ali lahko endonukleaza DICER prepozna ter procesira shRNA do siRNA?

In vitro translacijo s polimerazo T7 so izvedli s pomočjo kompleta reagentov T7 RiboMAX RNAi express kit (Promega). Uporabili so shRNA, ki je sestavljena iz: i) prepoznavnega zaporedja za eGFP, ii) zavoja, ki ga prepozna Fox-1 in iii) previsa GG na 3'-koncu ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407006 BBa_K3407006]) ter jo vstavili pod promotor T7 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407022 BBa_K3407022]). Sintetizirane shRNA so analizirali na Urea-PAGE.

Vezavo domene RBD iz Fox-1 na shRNA so preverjali s testom zamika elektroforezne mobilnosti (EMSA). ''E. coli'' BL21(DE3) so transformirali s prej omenjeno shRNA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407022 BBa_K3407022]) ter Fox-1 RBD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407020 BBa_K3407020]) v molarnih razmerjih 1:1 ter 1:2. Eksperiment so ponovili še trikrat; prvič so uporabili mutirano obliko Fox-1 RBD, ki naj bi imela nižjo afiniteto do shRNA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407024 BBa_K3407024]), drugič shRNA, ki ima dve mutaciji na zavoju ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407023 BBa_K3407023]), tretjič pa in mutiran Fox-1 RBD in mutirano shRNA. Vzorce so analizirali na nativnem PAGE.

Ali bi DICER iz kobilic prepoznal ter procesiral shRNA do siRNA so preverili s tem, da so 400 ng shRNA inkubirali pri 25°C v pufru, ki je vseboval 0,2 µM DICER iz ''Drosophila melanogaster''. Po določenem času (1-5 h) so reakcijo prekinili s tekočim dušikom in vzorce analizirali na Urea-PAGE.

=== Matematični model ===
Delovanje PHOCUS so testirali s pomočjo matematičnega modela, ki so ga priredili po že obstoječem, ki sta ga zasnovala Beretta in Kuang [10]. Model vsebuje štiri spremenljivke: i) koncentracija zdravih bakterij, ii) koncentracija okuženih bakterij, iii) koncentracija fagov in iv) koncentracija toksinov ter spremlja spreminjanje le-teh skozi čas; pri tem upošteva iz eksperimentov/literature pridobljene parametre (npr. hitrost rasti in lize bakterij, maksimalna kapaciteta bakterij, hitrost propadanja fagov itd.). Model so kasneje dopolnili še z dodatnim korakom, kjer so upoštevali razvoj rezistence na fage. Model so evalvirali tako, da so bakterije ''E. coli'' okužili s fagi T7 in merili časovno odvisnost OD600 bakterij ter časovno odvisnost koncentracije fagov.

== Rezultati ==
Ekipi je tekom priprave rekombinantnih fagov T7 uspelo zamenjati vse tri neesencialne gene z metodo BRED, vendar so pri genih 0,6A in 1,1 opazili še neželene produkte, zato so v nadaljevanju uporabljali fage z zamenjanim genom 4,3. Kljub uporabi sistema CRISPR-Cas9 jim rekombinantnih fagov ni uspelo izolirati, saj so plaki še vedno vsebovali fage divjega tipa.

Tekom karakterizacije RNAi komponente so ugotovili, da lahko polimeraza T7 uspešno prepiše zapis za shRNA in vitro; prepisana shRNA pri tem tudi zavzame pravilno sekundarno strukturo (lasnična zanka). Eksperimenti z metodo EMSA so pokazali, da se RBD Fox-1 lahko veže tako tarčno kot tudi na mutirano shRNA, medtem ko se mutirana domena ne veže na nobeno. Domena se veže močneje pri molarnem razmerju 1:2. Ugotovili so tudi, da DICER iz ''D. melanogaster'' prepozna in procesira shRNA do siRNA, kar nakazuje, da je ima uporabljena shRNA potencial za utišanje genov kobilic v procesu RNAi.

Simulacije z matematičnim modelom so pokazale, da lahko insekticid proizvede zadostno količino toksinov, ki povzroči smrt osebkov v manj kot 7 dneh; hitrost razvoja rezistence na fage je prepočasna, da bi bistveno vplivala na produkcijo toksinov. Evalvacija modela je pokazala, da uporabljene enačbe in parametri odražajo realno stanje sistema.

== Zaključek ==
Na tekmovanju iGEM 2020 je na področju Hrana zmagala skupina študentov iz UT Delft. Pripravili so insekticid z imenom PHOCUS, ki temelji na uporabi rekombinantnih bakteriofagov, ki okužijo črevesno floro kobilic ter povzročijo sintezo toksina Cry7Ca1 ter shRNA. Uspelo jim je okarakterizirati posamezne komponente insekticida, z matematičnim modelom pa jim je uspelo dokazati, da lahko insekticid ubije kobilice v dovolj hitrem času.

Pred uporabo v praksi bi bilo treba opraviti še naslednje stvari:
* Preveriti toksičnost Cry7Ca1 za ''Schistocerca gregaria''
* Priprava dostavljalnega proteina za olajšan transport shRNA iz lumna črevesa v hemolimfo
* Preizkusiti prepisovanje več shRNA v tandemu (tshRNA) in procesiranje le-te do posameznih shRNA z encimom Mini-3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407018 BBa_K3407018])
* Preizkusiti koekspresijo shRNA z inhibitorji RNaz

== Viri ==
# D. A. Cullen, A. J. Cease, A. V. Latchininsky, A. Ayali, K. Berry, J. Buhl, R. De Keyser, B. Foquet, J. C. Hadrich, … S. M. Rogers: From Molecules to Management: Mechanisms and Consequences of Locust Phase Polyphenism. 1. izd., Elsevier Ltd. 2017, Let. 53.
# A. Roussi: Why gigantic locust swarms are challenging governments and researchers. Nature 2020, 579(7799), str. 330–330.
# L. Zhang, M. Lecoq, A. Latchininsky, D. Hunter: Locust and Grasshopper Management. Annu. Rev. Entomol. 2019, 64(1), str. 15–34.
# TU Delft iGEM Team https://2020.igem.org/Team:TUDelft (pridobljeno 19. 5. 2021).
# O. Lavy, U. Gophna, E. Gefen, A. Ayali: The effect of density-dependent phase on the locust gut bacterial composition. Front. Microbiol. 2019, 10(JAN), str. 1–8.
# Y. Wu, C.-F. Lei, D. Yi, P.-M. Liu, M.-Y. Gao: Novel Bacillus thuringiensis δ-Endotoxin Active against Locusta migratoria manilensis. Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77(10), str. 3227–3233.
# G. J. Hannon: RNA interference. Nature 2002, 418(6894), str. 244–251.
# S. D. Auweter, R. Fasan, L. Reymond, J. G. Underwood, D. L. Black, S. Pitsch, F. H.-T. Allain: Molecular basis of RNA recognition by the human alternative splicing factor Fox-1. EMBO J. 2006, 25(1), str. 163–173.
# L. J. Marinelli, M. Piuri, Z. Swigoňová, A. Balachandran, L. M. Oldfield, J. C. van Kessel, G. F. Hatfull: BRED: A Simple and Powerful Tool for Constructing Mutant and Recombinant Bacteriophage Genomes. PLoS One 2008, 3(12), str. e3957.
# E. Beretta, Y. Kuang: Modeling and analysis of a marine bacteriophage infection. Math. Biosci. 1998, 149(1), str. 57–76.

PHOCUS: Insekticid proti kobilicam na osnovi bakteriofagov

2021-05-24T15:55:14Z

Matija Ruparčič: /* Karakterizacija RNAi */

PHOCUS je projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, s katerim je ekipa podiplomskih študentov iz Delfta na Nizozemskem osvojila prvo mesto na področju Hrana.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:TUDelft

Avtor povzetka: Matija Ruparčič

== Problem ==
Puščavske kobilice (''Schistocerca gregaria'') običajno živijo samotarsko, med sušnimi obdobji pa se ob iskanju hrane združijo skupaj. Ko gostota združbe preseže kritično mejo, preidejo kobilice iz neškodljivega samotarskega fenotipa (solitaria) v črednega (gregaria), pri čemer se jim spremenijo morfologija, vedenjski vzorci in prehranske navade [1]. V čredni obliki se puščavske kobilice zbirajo v rojih, ki lahko štejejo tudi do 8 milijonov osebkov; tak roj v dnevu poje enako količino hrane kot 3,5 milijona ljudi [2].

Zaradi neizmerne škode, ki jo roji kobilic povzročajo vsako leto na območju Severne Afrike, Arabskega polotoka in Južne Azije, je obvladovanje njihovega števila ključnega pomena. Za to sta na voljo dva pristopa, kemični ter biološki pesticidi, ki pa imata oba svoje pomanjkljivosti; kemični pesticidi so sicer učinkoviti, vendar nespecifični, medtem ko so biološki pesticidi sicer specifični, a delujejo prepočasi za uporabo ob nenadnih izbruhih [2, 3].

== Projekt PHOCUS ==

=== Ideja ===
Ideja projekta je bila zasnovati nov biološki pesticid, ki je še vedno specifičen, obenem pa deluje hitreje kot trenutni. Ekipa iz Delfta se je odločila uporabiti rekombinantne bakteriofage z zapisi za toksine, ki delujejo le na kobilicah. Ob zaužitju poškropljene hrane pridejo fagi v črevo kobilic, kjer okužijo bakterije črevesne flore. Tekom okužbe pričnejo le-te sintetizirati, nove bakteriofage, ki po lizi okužijo sosednje bakterije, in toksine, ki se ob lizi sprostijo v lumen črevesa in povzročijo smrt kobilice [4].

Končni izdelek naj bi vseboval koktejl litičnih fagov, ki okužijo več vrst bakterij iz rodu ''Enterobacter''; ta namreč predstavlja velik delež mikrobioma puščavskih kobilic [5].

=== Princip delovanja ===
Ekipa je zasnovala PHOCUS tako, da povzroči smrt kobilic na dva načina, in sicer preko (1) insekticidne aktivnosti toksina Cry7Ca1 ter (2) preko utišanja genov z RNA interferenco (RNAi).

Cry7Ca1 je endotoksin delta, ki ga ob sporulaciji proizvaja bakterija Bacillus thuringiensis (sev BTH-13). Mehanizem delovanja še ni popolnoma znan; predvideva se, da se aktivni toksin specifično veže na receptor na membrani črevesnih celic in povzroči tvorbo ionskega kanalčka, kar privede do celične lize ter s tem do poškodbe črevesa [4]. Tako kot ostali endotoksini delta iz B. thuringiensis ima tudi Cry7Ca1 omejen spekter delovanja; pri kobilicah Locusta migratoria manilensis izkazuje visoko insekticidno aktivnost, medtem ko je neškodljiv za metulje, hrošče in dvokrilce [6].

Rekombinantni fagi naj bi poleg zapisa za toksin vsebovali še zapis za kratko lasnično RNA (shRNA). Ta bi se na koncu litičnega cikla prav tako sprostila v lumen črevesa, nato pa bi prešla v hemolimfo in z tam v celice, kjer bi ob procesiranju z endonukleazo DICER dozorela v siRNA. Slednja nato lahko tvori kompleks RISC, ki utiša tarčne gene, kar privede bodisi do smrti bodisi do neplodnosti kobilice [4, 7]. Prehod shRNA iz lumna črevesa v hemolimfo je lahko dodatno olajšana z uporabo dostavljalnega proteina, ki vsebuje regijo s katero se specifično veže na shRNA; primer take regije je RNA-vezavna domena (RBD) iz proteina Fox-1 [8].

== Eksperimentalno delo ==
Zaradi pandemije COVID-19 ekipi ni uspelo sestaviti in ovrednotiti delovanje PHOCUS, vendar pa so uspešno pripravili 10 osnovnih ter 9 sestavljenih bioloških delov, s katerimi so okarakterizirali posamezne komponente insekticida. Pri eksperimentih so uporabljali bakterije ''Escherichia coli'' BL21(DE3) ter bakteriofage T7.

=== Priprava rekombinantnih fagov ===
Rekombinantne fage T7 so pripravili s pomočjo homologne rekombinacije, in sicer z metodo BRED (angl. Bacteriophage Recombineering of Electroporated DNA) [9].

Znotraj fagne DNA so izbrali tri neesencialne gene, ki so jih želeli zamenjati z reporterskim genom (eGFP), in sicer: 0,6A in 1,1 (zgodnja gena) ter 4,3 (srednji gen). Vključek so pripravili tako, da so s PCR pomnožili zapis za eGFP ter mu preko previsov na vsako stran dodali 100 bp zaporedje, ki je bilo homologno tarčnemu genu na fagu. Z vključkom so nato preko elektroporacije transformirali ''E. coli'' BL21(DE3) in jih nato okužili s fagi T7. Ob vstopu fagne DNA v celico je prišlo do homologne rekombinacije z vključkom, pri čemer je nastala rekombinantna fagna DNA [9].

Bakterije so pred tem transformirali še s plazmidi pKDsgRNA, ki so vsebovali vodilno RNA (sgRNA) za enega izmed treh neesencialni fagni gen, in pCas9-CR4, ki je vseboval zapis za endonukleazo Cas9. Kompleks sgRNA-Cas9 prepozna tarčno zaporedje na fagni DNA divjega tipa (wt) in ga cepi, s čimer se zmanjša število novonastalih wt fagov.

=== Karakterizacija RNAi ===
Tekom karakterizacije RNAi komponente so jih zanimale tri stvari:
* Ali lahko z RNA-polimerazo T7 pridobijo shRNA s pravilno sekundarno strukturo in vitro?
* Ali se domena RBD iz proteina Fox-1 veže specifično na shRNA?
* Ali lahko endonukleaza DICER prepozna ter procesira shRNA do siRNA?

In vitro translacijo s polimerazo T7 so izvedli s pomočjo kompleta reagentov T7 RiboMAX RNAi express kit (Promega). Uporabili so shRNA, ki je sestavljena iz: i) prepoznavnega zaporedja za eGFP, ii) zavoja, ki ga prepozna Fox-1 in iii) previsa GG na 3'-koncu ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407006 BBa_K3407006]) ter jo vstavili pod promotor T7 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407022 BBa_K3407022]). Sintetizirane shRNA so analizirali na Urea-PAGE.

Vezavo domene RBD iz Fox-1 na shRNA so preverjali s testom zamika elektroforezne mobilnosti (EMSA). ''E. coli'' BL21(DE3) so transformirali s prej omenjeno shRNA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407022 BBa_K3407022]) ter Fox-1 RBD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407020 BBa_K3407020]) v molarnih razmerjih 1:1 ter 1:2. Eksperiment so ponovili še trikrat; prvič so uporabili mutirano obliko Fox-1 RBD, ki naj bi imela nižjo afiniteto do shRNA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407024 BBa_K3407024]), drugič shRNA, ki ima dve mutaciji na zavoju ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407023 BBa_K3407023]), tretjič pa in mutiran Fox-1 RBD in mutirano shRNA. Vzorce so analizirali na nativnem PAGE.

Ali bi DICER iz kobilic prepoznal ter procesiral shRNA do siRNA so preverili s tem, da so 400 ng shRNA inkubirali pri 25°C v pufru, ki je vseboval 0,2 µM DICER iz ''Drosophila melanogaster''. Po določenem času (1-5 h) so reakcijo prekinili s tekočim dušikom in vzorce analizirali na Urea-PAGE.

=== Matematični model ===
Delovanje PHOCUS so testirali s pomočjo matematičnega modela, ki so ga priredili po že obstoječem, ki sta ga zasnovala Beretta in Kuang [10]. Model vsebuje štiri spremenljivke: i) koncentracija zdravih bakterij, ii) koncentracija okuženih bakterij, iii) koncentracija fagov in iv) koncentracija toksinov ter spremlja spreminjanje le-teh skozi čas; pri tem upošteva iz eksperimentov/literature pridobljene parametre (npr. hitrost rasti in lize bakterij, maksimalna kapaciteta bakterij, hitrost propadanja fagov itd.). Model so kasneje dopolnili še z dodatnim korakom, kjer so upoštevali razvoj rezistence na fage. Model so evalvirali tako, da so bakterije E. coli okužili s fagi T7 in merili časovno odvisnost OD600 bakterij ter časovno odvisnost koncentracije fagov.

== Rezultati ==
Ekipi je tekom priprave rekombinantnih fagov T7 uspelo zamenjati vse tri neesencialne gene z metodo BRED, vendar so pri genih 0,6A in 1,1 opazili še neželene produkte, zato so v nadaljevanju uporabljali fage z zamenjanim genom 4,3. Kljub uporabi sistema CRISPR-Cas9 jim rekombinantnih fagov ni uspelo izolirati, saj so plaki še vedno vsebovali fage divjega tipa.

Tekom karakterizacije RNAi komponente so ugotovili, da lahko polimeraza T7 uspešno prepiše zapis za shRNA in vitro; prepisana shRNA pri tem tudi zavzame pravilno sekundarno strukturo (lasnična zanka). Eksperimenti z metodo EMSA so pokazali, da se RBD Fox-1 lahko veže tako tarčno kot tudi na mutirano shRNA, medtem ko se mutirana domena ne veže na nobeno. Domena se veže močneje pri molarnem razmerju 1:2. Ugotovili so tudi, da DICER iz ''D. melanogaster'' prepozna in procesira shRNA do siRNA, kar nakazuje, da je ima uporabljena shRNA potencial za utišanje genov kobilic v procesu RNAi.

Simulacije z matematičnim modelom so pokazale, da lahko insekticid proizvede zadostno količino toksinov, ki povzroči smrt osebkov v manj kot 7 dneh; hitrost razvoja rezistence na fage je prepočasna, da bi bistveno vplivala na produkcijo toksinov. Evalvacija modela je pokazala, da uporabljene enačbe in parametri odražajo realno stanje sistema.

== Zaključek ==
Na tekmovanju iGEM 2020 je na področju Hrana zmagala skupina študentov iz UT Delft. Pripravili so insekticid z imenom PHOCUS, ki temelji na uporabi rekombinantnih bakteriofagov, ki okužijo črevesno floro kobilic ter povzročijo sintezo toksina Cry7Ca1 ter shRNA. Uspelo jim je okarakterizirati posamezne komponente insekticida, z matematičnim modelom pa jim je uspelo dokazati, da lahko insekticid ubije kobilice v dovolj hitrem času.

Pred uporabo v praksi bi bilo treba opraviti še naslednje stvari:
* Preveriti toksičnost Cry7Ca1 za ''Schistocerca gregaria''
* Priprava dostavljalnega proteina za olajšan transport shRNA iz lumna črevesa v hemolimfo
* Preizkusiti prepisovanje več shRNA v tandemu (tshRNA) in procesiranje le-te do posameznih shRNA z encimom Mini-3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407018 BBa_K3407018])
* Preizkusiti koekspresijo shRNA z inhibitorji RNaz

== Viri ==
# D. A. Cullen, A. J. Cease, A. V. Latchininsky, A. Ayali, K. Berry, J. Buhl, R. De Keyser, B. Foquet, J. C. Hadrich, … S. M. Rogers: From Molecules to Management: Mechanisms and Consequences of Locust Phase Polyphenism. 1. izd., Elsevier Ltd. 2017, Let. 53.
# A. Roussi: Why gigantic locust swarms are challenging governments and researchers. Nature 2020, 579(7799), str. 330–330.
# L. Zhang, M. Lecoq, A. Latchininsky, D. Hunter: Locust and Grasshopper Management. Annu. Rev. Entomol. 2019, 64(1), str. 15–34.
# TU Delft iGEM Team https://2020.igem.org/Team:TUDelft (pridobljeno 19. 5. 2021).
# O. Lavy, U. Gophna, E. Gefen, A. Ayali: The effect of density-dependent phase on the locust gut bacterial composition. Front. Microbiol. 2019, 10(JAN), str. 1–8.
# Y. Wu, C.-F. Lei, D. Yi, P.-M. Liu, M.-Y. Gao: Novel Bacillus thuringiensis δ-Endotoxin Active against Locusta migratoria manilensis. Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77(10), str. 3227–3233.
# G. J. Hannon: RNA interference. Nature 2002, 418(6894), str. 244–251.
# S. D. Auweter, R. Fasan, L. Reymond, J. G. Underwood, D. L. Black, S. Pitsch, F. H.-T. Allain: Molecular basis of RNA recognition by the human alternative splicing factor Fox-1. EMBO J. 2006, 25(1), str. 163–173.
# L. J. Marinelli, M. Piuri, Z. Swigoňová, A. Balachandran, L. M. Oldfield, J. C. van Kessel, G. F. Hatfull: BRED: A Simple and Powerful Tool for Constructing Mutant and Recombinant Bacteriophage Genomes. PLoS One 2008, 3(12), str. e3957.
# E. Beretta, Y. Kuang: Modeling and analysis of a marine bacteriophage infection. Math. Biosci. 1998, 149(1), str. 57–76.

PHOCUS: Insekticid proti kobilicam na osnovi bakteriofagov

2021-05-24T15:47:36Z

Matija Ruparčič: /* Karakterizacija RNAi */

PHOCUS je projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, s katerim je ekipa podiplomskih študentov iz Delfta na Nizozemskem osvojila prvo mesto na področju Hrana.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:TUDelft

Avtor povzetka: Matija Ruparčič

== Problem ==
Puščavske kobilice (''Schistocerca gregaria'') običajno živijo samotarsko, med sušnimi obdobji pa se ob iskanju hrane združijo skupaj. Ko gostota združbe preseže kritično mejo, preidejo kobilice iz neškodljivega samotarskega fenotipa (solitaria) v črednega (gregaria), pri čemer se jim spremenijo morfologija, vedenjski vzorci in prehranske navade [1]. V čredni obliki se puščavske kobilice zbirajo v rojih, ki lahko štejejo tudi do 8 milijonov osebkov; tak roj v dnevu poje enako količino hrane kot 3,5 milijona ljudi [2].

Zaradi neizmerne škode, ki jo roji kobilic povzročajo vsako leto na območju Severne Afrike, Arabskega polotoka in Južne Azije, je obvladovanje njihovega števila ključnega pomena. Za to sta na voljo dva pristopa, kemični ter biološki pesticidi, ki pa imata oba svoje pomanjkljivosti; kemični pesticidi so sicer učinkoviti, vendar nespecifični, medtem ko so biološki pesticidi sicer specifični, a delujejo prepočasi za uporabo ob nenadnih izbruhih [2, 3].

== Projekt PHOCUS ==

=== Ideja ===
Ideja projekta je bila zasnovati nov biološki pesticid, ki je še vedno specifičen, obenem pa deluje hitreje kot trenutni. Ekipa iz Delfta se je odločila uporabiti rekombinantne bakteriofage z zapisi za toksine, ki delujejo le na kobilicah. Ob zaužitju poškropljene hrane pridejo fagi v črevo kobilic, kjer okužijo bakterije črevesne flore. Tekom okužbe pričnejo le-te sintetizirati, nove bakteriofage, ki po lizi okužijo sosednje bakterije, in toksine, ki se ob lizi sprostijo v lumen črevesa in povzročijo smrt kobilice [4].

Končni izdelek naj bi vseboval koktejl litičnih fagov, ki okužijo več vrst bakterij iz rodu ''Enterobacter''; ta namreč predstavlja velik delež mikrobioma puščavskih kobilic [5].

=== Princip delovanja ===
Ekipa je zasnovala PHOCUS tako, da povzroči smrt kobilic na dva načina, in sicer preko (1) insekticidne aktivnosti toksina Cry7Ca1 ter (2) preko utišanja genov z RNA interferenco (RNAi).

Cry7Ca1 je endotoksin delta, ki ga ob sporulaciji proizvaja bakterija Bacillus thuringiensis (sev BTH-13). Mehanizem delovanja še ni popolnoma znan; predvideva se, da se aktivni toksin specifično veže na receptor na membrani črevesnih celic in povzroči tvorbo ionskega kanalčka, kar privede do celične lize ter s tem do poškodbe črevesa [4]. Tako kot ostali endotoksini delta iz B. thuringiensis ima tudi Cry7Ca1 omejen spekter delovanja; pri kobilicah Locusta migratoria manilensis izkazuje visoko insekticidno aktivnost, medtem ko je neškodljiv za metulje, hrošče in dvokrilce [6].

Rekombinantni fagi naj bi poleg zapisa za toksin vsebovali še zapis za kratko lasnično RNA (shRNA). Ta bi se na koncu litičnega cikla prav tako sprostila v lumen črevesa, nato pa bi prešla v hemolimfo in z tam v celice, kjer bi ob procesiranju z endonukleazo DICER dozorela v siRNA. Slednja nato lahko tvori kompleks RISC, ki utiša tarčne gene, kar privede bodisi do smrti bodisi do neplodnosti kobilice [4, 7]. Prehod shRNA iz lumna črevesa v hemolimfo je lahko dodatno olajšana z uporabo dostavljalnega proteina, ki vsebuje regijo s katero se specifično veže na shRNA; primer take regije je RNA-vezavna domena (RBD) iz proteina Fox-1 [8].

== Eksperimentalno delo ==
Zaradi pandemije COVID-19 ekipi ni uspelo sestaviti in ovrednotiti delovanje PHOCUS, vendar pa so uspešno pripravili 10 osnovnih ter 9 sestavljenih bioloških delov, s katerimi so okarakterizirali posamezne komponente insekticida. Pri eksperimentih so uporabljali bakterije ''Escherichia coli'' BL21(DE3) ter bakteriofage T7.

=== Priprava rekombinantnih fagov ===
Rekombinantne fage T7 so pripravili s pomočjo homologne rekombinacije, in sicer z metodo BRED (angl. Bacteriophage Recombineering of Electroporated DNA) [9].

Znotraj fagne DNA so izbrali tri neesencialne gene, ki so jih želeli zamenjati z reporterskim genom (eGFP), in sicer: 0,6A in 1,1 (zgodnja gena) ter 4,3 (srednji gen). Vključek so pripravili tako, da so s PCR pomnožili zapis za eGFP ter mu preko previsov na vsako stran dodali 100 bp zaporedje, ki je bilo homologno tarčnemu genu na fagu. Z vključkom so nato preko elektroporacije transformirali ''E. coli'' BL21(DE3) in jih nato okužili s fagi T7. Ob vstopu fagne DNA v celico je prišlo do homologne rekombinacije z vključkom, pri čemer je nastala rekombinantna fagna DNA [9].

Bakterije so pred tem transformirali še s plazmidi pKDsgRNA, ki so vsebovali vodilno RNA (sgRNA) za enega izmed treh neesencialni fagni gen, in pCas9-CR4, ki je vseboval zapis za endonukleazo Cas9. Kompleks sgRNA-Cas9 prepozna tarčno zaporedje na fagni DNA divjega tipa (wt) in ga cepi, s čimer se zmanjša število novonastalih wt fagov.

=== Karakterizacija RNAi ===
Tekom karakterizacije RNAi komponente so jih zanimale tri stvari:
* Ali lahko z RNA-polimerazo T7 pridobijo shRNA s pravilno sekundarno strukturo in vitro?
* Ali se domena RBD iz proteina Fox-1 veže specifično na shRNA?
* Ali predstavlja shRNA dober substrat za endonukleazo DICER?

In vitro translacijo s polimerazo T7 so izvedli s pomočjo kompleta reagentov T7 RiboMAX RNAi express kit (Promega). Uporabili so shRNA, ki je sestavljena iz: i) prepoznavnega zaporedja za eGFP, ii) zavoja, ki ga prepozna Fox-1 in iii) previsa GG na 3'-koncu ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407006 BBa_K3407006]) ter jo vstavili pod promotor T7 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407022 BBa_K3407022]). Sintetizirane shRNA so analizirali na Urea-PAGE.

Vezavo domene RBD iz Fox-1 na shRNA so preverjali s testom zamika elektroforezne mobilnosti (EMSA). ''E. coli'' BL21(DE3) so transformirali s prej omenjeno shRNA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407022 BBa_K3407022]) ter Fox-1 RBD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407020 BBa_K3407020]) v molarnih razmerjih 1:1 ter 1:2. Eksperiment so ponovili še trikrat; prvič so uporabili mutirano obliko Fox-1 RBD, ki naj bi imela nižjo afiniteto do shRNA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407024 BBa_K3407024]), drugič shRNA, ki ima dve mutaciji na zavoju ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407023 BBa_K3407023]), tretjič pa in mutiran Fox-1 RBD in mutirano shRNA. Vzorce so analizirali na nativnem PAGE.

Ali bi DICER iz kobilic prepoznal ter procesiral shRNA do siRNA so preverili s tem, da so 400 ng shRNA inkubirali pri 25°C v pufru, ki je vseboval 0,2 µM DICER iz ''Drosophila melanogaster''. Po določenem času (1-5 h) so reakcijo prekinili s tekočim dušikom in vzorce analizirali na Urea-PAGE.

=== Matematični model ===
Delovanje PHOCUS so testirali s pomočjo matematičnega modela, ki so ga priredili po že obstoječem, ki sta ga zasnovala Beretta in Kuang [10]. Model vsebuje štiri spremenljivke: i) koncentracija zdravih bakterij, ii) koncentracija okuženih bakterij, iii) koncentracija fagov in iv) koncentracija toksinov ter spremlja spreminjanje le-teh skozi čas; pri tem upošteva iz eksperimentov/literature pridobljene parametre (npr. hitrost rasti in lize bakterij, maksimalna kapaciteta bakterij, hitrost propadanja fagov itd.). Model so kasneje dopolnili še z dodatnim korakom, kjer so upoštevali razvoj rezistence na fage. Model so evalvirali tako, da so bakterije E. coli okužili s fagi T7 in merili časovno odvisnost OD600 bakterij ter časovno odvisnost koncentracije fagov.

== Rezultati ==
Ekipi je tekom priprave rekombinantnih fagov T7 uspelo zamenjati vse tri neesencialne gene z metodo BRED, vendar so pri genih 0,6A in 1,1 opazili še neželene produkte, zato so v nadaljevanju uporabljali fage z zamenjanim genom 4,3. Kljub uporabi sistema CRISPR-Cas9 jim rekombinantnih fagov ni uspelo izolirati, saj so plaki še vedno vsebovali fage divjega tipa.

Tekom karakterizacije RNAi komponente so ugotovili, da lahko polimeraza T7 uspešno prepiše zapis za shRNA in vitro; prepisana shRNA pri tem tudi zavzame pravilno sekundarno strukturo (lasnična zanka). Eksperimenti z metodo EMSA so pokazali, da se RBD Fox-1 lahko veže tako tarčno kot tudi na mutirano shRNA, medtem ko se mutirana domena ne veže na nobeno. Domena se veže močneje pri molarnem razmerju 1:2. Ugotovili so tudi, da DICER iz ''D. melanogaster'' prepozna in procesira shRNA do siRNA, kar nakazuje, da je ima uporabljena shRNA potencial za utišanje genov kobilic v procesu RNAi.

Simulacije z matematičnim modelom so pokazale, da lahko insekticid proizvede zadostno količino toksinov, ki povzroči smrt osebkov v manj kot 7 dneh; hitrost razvoja rezistence na fage je prepočasna, da bi bistveno vplivala na produkcijo toksinov. Evalvacija modela je pokazala, da uporabljene enačbe in parametri odražajo realno stanje sistema.

== Zaključek ==
Na tekmovanju iGEM 2020 je na področju Hrana zmagala skupina študentov iz UT Delft. Pripravili so insekticid z imenom PHOCUS, ki temelji na uporabi rekombinantnih bakteriofagov, ki okužijo črevesno floro kobilic ter povzročijo sintezo toksina Cry7Ca1 ter shRNA. Uspelo jim je okarakterizirati posamezne komponente insekticida, z matematičnim modelom pa jim je uspelo dokazati, da lahko insekticid ubije kobilice v dovolj hitrem času.

Pred uporabo v praksi bi bilo treba opraviti še naslednje stvari:
* Preveriti toksičnost Cry7Ca1 za ''Schistocerca gregaria''
* Priprava dostavljalnega proteina za olajšan transport shRNA iz lumna črevesa v hemolimfo
* Preizkusiti prepisovanje več shRNA v tandemu (tshRNA) in procesiranje le-te do posameznih shRNA z encimom Mini-3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407018 BBa_K3407018])
* Preizkusiti koekspresijo shRNA z inhibitorji RNaz

== Viri ==
# D. A. Cullen, A. J. Cease, A. V. Latchininsky, A. Ayali, K. Berry, J. Buhl, R. De Keyser, B. Foquet, J. C. Hadrich, … S. M. Rogers: From Molecules to Management: Mechanisms and Consequences of Locust Phase Polyphenism. 1. izd., Elsevier Ltd. 2017, Let. 53.
# A. Roussi: Why gigantic locust swarms are challenging governments and researchers. Nature 2020, 579(7799), str. 330–330.
# L. Zhang, M. Lecoq, A. Latchininsky, D. Hunter: Locust and Grasshopper Management. Annu. Rev. Entomol. 2019, 64(1), str. 15–34.
# TU Delft iGEM Team https://2020.igem.org/Team:TUDelft (pridobljeno 19. 5. 2021).
# O. Lavy, U. Gophna, E. Gefen, A. Ayali: The effect of density-dependent phase on the locust gut bacterial composition. Front. Microbiol. 2019, 10(JAN), str. 1–8.
# Y. Wu, C.-F. Lei, D. Yi, P.-M. Liu, M.-Y. Gao: Novel Bacillus thuringiensis δ-Endotoxin Active against Locusta migratoria manilensis. Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77(10), str. 3227–3233.
# G. J. Hannon: RNA interference. Nature 2002, 418(6894), str. 244–251.
# S. D. Auweter, R. Fasan, L. Reymond, J. G. Underwood, D. L. Black, S. Pitsch, F. H.-T. Allain: Molecular basis of RNA recognition by the human alternative splicing factor Fox-1. EMBO J. 2006, 25(1), str. 163–173.
# L. J. Marinelli, M. Piuri, Z. Swigoňová, A. Balachandran, L. M. Oldfield, J. C. van Kessel, G. F. Hatfull: BRED: A Simple and Powerful Tool for Constructing Mutant and Recombinant Bacteriophage Genomes. PLoS One 2008, 3(12), str. e3957.
# E. Beretta, Y. Kuang: Modeling and analysis of a marine bacteriophage infection. Math. Biosci. 1998, 149(1), str. 57–76.

PHOCUS: Insekticid proti kobilicam na osnovi bakteriofagov

2021-05-24T15:34:47Z

Matija Ruparčič: /* Karakterizacija RNAi */

PHOCUS je projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, s katerim je ekipa podiplomskih študentov iz Delfta na Nizozemskem osvojila prvo mesto na področju Hrana.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:TUDelft

Avtor povzetka: Matija Ruparčič

== Problem ==
Puščavske kobilice (''Schistocerca gregaria'') običajno živijo samotarsko, med sušnimi obdobji pa se ob iskanju hrane združijo skupaj. Ko gostota združbe preseže kritično mejo, preidejo kobilice iz neškodljivega samotarskega fenotipa (solitaria) v črednega (gregaria), pri čemer se jim spremenijo morfologija, vedenjski vzorci in prehranske navade [1]. V čredni obliki se puščavske kobilice zbirajo v rojih, ki lahko štejejo tudi do 8 milijonov osebkov; tak roj v dnevu poje enako količino hrane kot 3,5 milijona ljudi [2].

Zaradi neizmerne škode, ki jo roji kobilic povzročajo vsako leto na območju Severne Afrike, Arabskega polotoka in Južne Azije, je obvladovanje njihovega števila ključnega pomena. Za to sta na voljo dva pristopa, kemični ter biološki pesticidi, ki pa imata oba svoje pomanjkljivosti; kemični pesticidi so sicer učinkoviti, vendar nespecifični, medtem ko so biološki pesticidi sicer specifični, a delujejo prepočasi za uporabo ob nenadnih izbruhih [2, 3].

== Projekt PHOCUS ==

=== Ideja ===
Ideja projekta je bila zasnovati nov biološki pesticid, ki je še vedno specifičen, obenem pa deluje hitreje kot trenutni. Ekipa iz Delfta se je odločila uporabiti rekombinantne bakteriofage z zapisi za toksine, ki delujejo le na kobilicah. Ob zaužitju poškropljene hrane pridejo fagi v črevo kobilic, kjer okužijo bakterije črevesne flore. Tekom okužbe pričnejo le-te sintetizirati, nove bakteriofage, ki po lizi okužijo sosednje bakterije, in toksine, ki se ob lizi sprostijo v lumen črevesa in povzročijo smrt kobilice [4].

Končni izdelek naj bi vseboval koktejl litičnih fagov, ki okužijo več vrst bakterij iz rodu ''Enterobacter''; ta namreč predstavlja velik delež mikrobioma puščavskih kobilic [5].

=== Princip delovanja ===
Ekipa je zasnovala PHOCUS tako, da povzroči smrt kobilic na dva načina, in sicer preko (1) insekticidne aktivnosti toksina Cry7Ca1 ter (2) preko utišanja genov z RNA interferenco (RNAi).

Cry7Ca1 je endotoksin delta, ki ga ob sporulaciji proizvaja bakterija Bacillus thuringiensis (sev BTH-13). Mehanizem delovanja še ni popolnoma znan; predvideva se, da se aktivni toksin specifično veže na receptor na membrani črevesnih celic in povzroči tvorbo ionskega kanalčka, kar privede do celične lize ter s tem do poškodbe črevesa [4]. Tako kot ostali endotoksini delta iz B. thuringiensis ima tudi Cry7Ca1 omejen spekter delovanja; pri kobilicah Locusta migratoria manilensis izkazuje visoko insekticidno aktivnost, medtem ko je neškodljiv za metulje, hrošče in dvokrilce [6].

Rekombinantni fagi naj bi poleg zapisa za toksin vsebovali še zapis za kratko lasnično RNA (shRNA). Ta bi se na koncu litičnega cikla prav tako sprostila v lumen črevesa, nato pa bi prešla v hemolimfo in z tam v celice, kjer bi ob procesiranju z endonukleazo DICER dozorela v siRNA. Slednja nato lahko tvori kompleks RISC, ki utiša tarčne gene, kar privede bodisi do smrti bodisi do neplodnosti kobilice [4, 7]. Prehod shRNA iz lumna črevesa v hemolimfo je lahko dodatno olajšana z uporabo dostavljalnega proteina, ki vsebuje regijo s katero se specifično veže na shRNA; primer take regije je RNA-vezavna domena (RBD) iz proteina Fox-1 [8].

== Eksperimentalno delo ==
Zaradi pandemije COVID-19 ekipi ni uspelo sestaviti in ovrednotiti delovanje PHOCUS, vendar pa so uspešno pripravili 10 osnovnih ter 9 sestavljenih bioloških delov, s katerimi so okarakterizirali posamezne komponente insekticida. Pri eksperimentih so uporabljali bakterije ''Escherichia coli'' BL21(DE3) ter bakteriofage T7.

=== Priprava rekombinantnih fagov ===
Rekombinantne fage T7 so pripravili s pomočjo homologne rekombinacije, in sicer z metodo BRED (angl. Bacteriophage Recombineering of Electroporated DNA) [9].

Znotraj fagne DNA so izbrali tri neesencialne gene, ki so jih želeli zamenjati z reporterskim genom (eGFP), in sicer: 0,6A in 1,1 (zgodnja gena) ter 4,3 (srednji gen). Vključek so pripravili tako, da so s PCR pomnožili zapis za eGFP ter mu preko previsov na vsako stran dodali 100 bp zaporedje, ki je bilo homologno tarčnemu genu na fagu. Z vključkom so nato preko elektroporacije transformirali ''E. coli'' BL21(DE3) in jih nato okužili s fagi T7. Ob vstopu fagne DNA v celico je prišlo do homologne rekombinacije z vključkom, pri čemer je nastala rekombinantna fagna DNA [9].

Bakterije so pred tem transformirali še s plazmidi pKDsgRNA, ki so vsebovali vodilno RNA (sgRNA) za enega izmed treh neesencialni fagni gen, in pCas9-CR4, ki je vseboval zapis za endonukleazo Cas9. Kompleks sgRNA-Cas9 prepozna tarčno zaporedje na fagni DNA divjega tipa (wt) in ga cepi, s čimer se zmanjša število novonastalih wt fagov.

=== Karakterizacija RNAi ===
Tekom karakterizacije RNAi komponente so jih zanimale tri stvari:
* Ali lahko z RNA-polimerazo T7 pridobijo shRNA s pravilno sekundarno strukturo in vitro?
* Ali se domena RBD iz proteina Fox-1 veže specifično na shRNA?
* Ali predstavlja shRNA dober substrat za endonukleazo DICER?

In vitro translacijo s polimerazo T7 so izvedli s pomočjo kompleta reagentov T7 RiboMAX RNAi express kit (Promega). Uporabili so shRNA, ki je sestavljena iz: i) prepoznavnega zaporedja za eGFP, ii) zavoja, ki ga prepozna Fox-1 in iii) previsa GG na 3'-koncu ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407006 BBa_K3407006]) ter jo vstavili pod promotor T7 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407022 BBa_K3407022]). Sintetizirane shRNA so analizirali na Urea-PAGE.

Vezavo domene RBD iz Fox-1 na shRNA so preverjali s testom zamika elektroforezne mobilnosti (EMSA). ''E. coli'' BL21(DE3) so transformirali s prej omenjeno shRNA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407022 BBa_K3407022]) ter Fox-1 RBD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407020 BBa_K3407020]) v molarnih razmerjih 1:1 ter 1:2. Eksperiment so ponovili še dvakrat; prvič so uporabili mutirano obliko Fox-1 RBD, ki naj bi imela nižjo afiniteto do shRNA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407024 BBa_K3407024]), drugič pa z shRNA, ki ima dve mutaciji na zavoju ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407023 BBa_K3407023]) vzorce so analizirali na nativnem PAGE.

Ali bi DICER iz kobilic prepoznal ter procesiral shRNA do siRNA so preverili s tem, da so 400 ng shRNA inkubirali pri 25°C v pufru, ki je vseboval 0,2 µM DICER iz ''Drosophila melanogaster''. Po določenem času (1-5 h) so reakcijo prekinili s tekočim dušikom in vzorce analizirali na Urea-PAGE.

=== Matematični model ===
Delovanje PHOCUS so testirali s pomočjo matematičnega modela, ki so ga priredili po že obstoječem, ki sta ga zasnovala Beretta in Kuang [10]. Model vsebuje štiri spremenljivke: i) koncentracija zdravih bakterij, ii) koncentracija okuženih bakterij, iii) koncentracija fagov in iv) koncentracija toksinov ter spremlja spreminjanje le-teh skozi čas; pri tem upošteva iz eksperimentov/literature pridobljene parametre (npr. hitrost rasti in lize bakterij, maksimalna kapaciteta bakterij, hitrost propadanja fagov itd.). Model so kasneje dopolnili še z dodatnim korakom, kjer so upoštevali razvoj rezistence na fage. Model so evalvirali tako, da so bakterije E. coli okužili s fagi T7 in merili časovno odvisnost OD600 bakterij ter časovno odvisnost koncentracije fagov.

== Rezultati ==
Ekipi je tekom priprave rekombinantnih fagov T7 uspelo zamenjati vse tri neesencialne gene z metodo BRED, vendar so pri genih 0,6A in 1,1 opazili še neželene produkte, zato so v nadaljevanju uporabljali fage z zamenjanim genom 4,3. Kljub uporabi sistema CRISPR-Cas9 jim rekombinantnih fagov ni uspelo izolirati, saj so plaki še vedno vsebovali fage divjega tipa.

Tekom karakterizacije RNAi komponente so ugotovili, da lahko polimeraza T7 uspešno prepiše zapis za shRNA in vitro; prepisana shRNA pri tem tudi zavzame pravilno sekundarno strukturo (lasnična zanka). Eksperimenti z metodo EMSA so pokazali, da se RBD Fox-1 lahko veže tako tarčno kot tudi na mutirano shRNA, medtem ko se mutirana domena ne veže na nobeno. Domena se veže močneje pri molarnem razmerju 1:2. Ugotovili so tudi, da DICER iz ''D. melanogaster'' prepozna in procesira shRNA do siRNA, kar nakazuje, da je ima uporabljena shRNA potencial za utišanje genov kobilic v procesu RNAi.

Simulacije z matematičnim modelom so pokazale, da lahko insekticid proizvede zadostno količino toksinov, ki povzroči smrt osebkov v manj kot 7 dneh; hitrost razvoja rezistence na fage je prepočasna, da bi bistveno vplivala na produkcijo toksinov. Evalvacija modela je pokazala, da uporabljene enačbe in parametri odražajo realno stanje sistema.

== Zaključek ==
Na tekmovanju iGEM 2020 je na področju Hrana zmagala skupina študentov iz UT Delft. Pripravili so insekticid z imenom PHOCUS, ki temelji na uporabi rekombinantnih bakteriofagov, ki okužijo črevesno floro kobilic ter povzročijo sintezo toksina Cry7Ca1 ter shRNA. Uspelo jim je okarakterizirati posamezne komponente insekticida, z matematičnim modelom pa jim je uspelo dokazati, da lahko insekticid ubije kobilice v dovolj hitrem času.

Pred uporabo v praksi bi bilo treba opraviti še naslednje stvari:
* Preveriti toksičnost Cry7Ca1 za ''Schistocerca gregaria''
* Priprava dostavljalnega proteina za olajšan transport shRNA iz lumna črevesa v hemolimfo
* Preizkusiti prepisovanje več shRNA v tandemu (tshRNA) in procesiranje le-te do posameznih shRNA z encimom Mini-3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407018 BBa_K3407018])
* Preizkusiti koekspresijo shRNA z inhibitorji RNaz

== Viri ==
# D. A. Cullen, A. J. Cease, A. V. Latchininsky, A. Ayali, K. Berry, J. Buhl, R. De Keyser, B. Foquet, J. C. Hadrich, … S. M. Rogers: From Molecules to Management: Mechanisms and Consequences of Locust Phase Polyphenism. 1. izd., Elsevier Ltd. 2017, Let. 53.
# A. Roussi: Why gigantic locust swarms are challenging governments and researchers. Nature 2020, 579(7799), str. 330–330.
# L. Zhang, M. Lecoq, A. Latchininsky, D. Hunter: Locust and Grasshopper Management. Annu. Rev. Entomol. 2019, 64(1), str. 15–34.
# TU Delft iGEM Team https://2020.igem.org/Team:TUDelft (pridobljeno 19. 5. 2021).
# O. Lavy, U. Gophna, E. Gefen, A. Ayali: The effect of density-dependent phase on the locust gut bacterial composition. Front. Microbiol. 2019, 10(JAN), str. 1–8.
# Y. Wu, C.-F. Lei, D. Yi, P.-M. Liu, M.-Y. Gao: Novel Bacillus thuringiensis δ-Endotoxin Active against Locusta migratoria manilensis. Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77(10), str. 3227–3233.
# G. J. Hannon: RNA interference. Nature 2002, 418(6894), str. 244–251.
# S. D. Auweter, R. Fasan, L. Reymond, J. G. Underwood, D. L. Black, S. Pitsch, F. H.-T. Allain: Molecular basis of RNA recognition by the human alternative splicing factor Fox-1. EMBO J. 2006, 25(1), str. 163–173.
# L. J. Marinelli, M. Piuri, Z. Swigoňová, A. Balachandran, L. M. Oldfield, J. C. van Kessel, G. F. Hatfull: BRED: A Simple and Powerful Tool for Constructing Mutant and Recombinant Bacteriophage Genomes. PLoS One 2008, 3(12), str. e3957.
# E. Beretta, Y. Kuang: Modeling and analysis of a marine bacteriophage infection. Math. Biosci. 1998, 149(1), str. 57–76.

PHOCUS: Insekticid proti kobilicam na osnovi bakteriofagov

2021-05-24T13:09:29Z

Matija Ruparčič: /* Princip delovanja */

PHOCUS je projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, s katerim je ekipa podiplomskih študentov iz Delfta na Nizozemskem osvojila prvo mesto na področju Hrana.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:TUDelft

Avtor povzetka: Matija Ruparčič

== Problem ==
Puščavske kobilice (''Schistocerca gregaria'') običajno živijo samotarsko, med sušnimi obdobji pa se ob iskanju hrane združijo skupaj. Ko gostota združbe preseže kritično mejo, preidejo kobilice iz neškodljivega samotarskega fenotipa (solitaria) v črednega (gregaria), pri čemer se jim spremenijo morfologija, vedenjski vzorci in prehranske navade [1]. V čredni obliki se puščavske kobilice zbirajo v rojih, ki lahko štejejo tudi do 8 milijonov osebkov; tak roj v dnevu poje enako količino hrane kot 3,5 milijona ljudi [2].

Zaradi neizmerne škode, ki jo roji kobilic povzročajo vsako leto na območju Severne Afrike, Arabskega polotoka in Južne Azije, je obvladovanje njihovega števila ključnega pomena. Za to sta na voljo dva pristopa, kemični ter biološki pesticidi, ki pa imata oba svoje pomanjkljivosti; kemični pesticidi so sicer učinkoviti, vendar nespecifični, medtem ko so biološki pesticidi sicer specifični, a delujejo prepočasi za uporabo ob nenadnih izbruhih [2, 3].

== Projekt PHOCUS ==

=== Ideja ===
Ideja projekta je bila zasnovati nov biološki pesticid, ki je še vedno specifičen, obenem pa deluje hitreje kot trenutni. Ekipa iz Delfta se je odločila uporabiti rekombinantne bakteriofage z zapisi za toksine, ki delujejo le na kobilicah. Ob zaužitju poškropljene hrane pridejo fagi v črevo kobilic, kjer okužijo bakterije črevesne flore. Tekom okužbe pričnejo le-te sintetizirati, nove bakteriofage, ki po lizi okužijo sosednje bakterije, in toksine, ki se ob lizi sprostijo v lumen črevesa in povzročijo smrt kobilice [4].

Končni izdelek naj bi vseboval koktejl litičnih fagov, ki okužijo več vrst bakterij iz rodu ''Enterobacter''; ta namreč predstavlja velik delež mikrobioma puščavskih kobilic [5].

=== Princip delovanja ===
Ekipa je zasnovala PHOCUS tako, da povzroči smrt kobilic na dva načina, in sicer preko (1) insekticidne aktivnosti toksina Cry7Ca1 ter (2) preko utišanja genov z RNA interferenco (RNAi).

Cry7Ca1 je endotoksin delta, ki ga ob sporulaciji proizvaja bakterija Bacillus thuringiensis (sev BTH-13). Mehanizem delovanja še ni popolnoma znan; predvideva se, da se aktivni toksin specifično veže na receptor na membrani črevesnih celic in povzroči tvorbo ionskega kanalčka, kar privede do celične lize ter s tem do poškodbe črevesa [4]. Tako kot ostali endotoksini delta iz B. thuringiensis ima tudi Cry7Ca1 omejen spekter delovanja; pri kobilicah Locusta migratoria manilensis izkazuje visoko insekticidno aktivnost, medtem ko je neškodljiv za metulje, hrošče in dvokrilce [6].

Rekombinantni fagi naj bi poleg zapisa za toksin vsebovali še zapis za kratko lasnično RNA (shRNA). Ta bi se na koncu litičnega cikla prav tako sprostila v lumen črevesa, nato pa bi prešla v hemolimfo in z tam v celice, kjer bi ob procesiranju z endonukleazo DICER dozorela v siRNA. Slednja nato lahko tvori kompleks RISC, ki utiša tarčne gene, kar privede bodisi do smrti bodisi do neplodnosti kobilice [4, 7]. Prehod shRNA iz lumna črevesa v hemolimfo je lahko dodatno olajšana z uporabo dostavljalnega proteina, ki vsebuje regijo s katero se specifično veže na shRNA; primer take regije je RNA-vezavna domena (RBD) iz proteina Fox-1 [8].

== Eksperimentalno delo ==
Zaradi pandemije COVID-19 ekipi ni uspelo sestaviti in ovrednotiti delovanje PHOCUS, vendar pa so uspešno pripravili 10 osnovnih ter 9 sestavljenih bioloških delov, s katerimi so okarakterizirali posamezne komponente insekticida. Pri eksperimentih so uporabljali bakterije ''Escherichia coli'' BL21(DE3) ter bakteriofage T7.

=== Priprava rekombinantnih fagov ===
Rekombinantne fage T7 so pripravili s pomočjo homologne rekombinacije, in sicer z metodo BRED (angl. Bacteriophage Recombineering of Electroporated DNA) [9].

Znotraj fagne DNA so izbrali tri neesencialne gene, ki so jih želeli zamenjati z reporterskim genom (eGFP), in sicer: 0,6A in 1,1 (zgodnja gena) ter 4,3 (srednji gen). Vključek so pripravili tako, da so s PCR pomnožili zapis za eGFP ter mu preko previsov na vsako stran dodali 100 bp zaporedje, ki je bilo homologno tarčnemu genu na fagu. Z vključkom so nato preko elektroporacije transformirali ''E. coli'' BL21(DE3) in jih nato okužili s fagi T7. Ob vstopu fagne DNA v celico je prišlo do homologne rekombinacije z vključkom, pri čemer je nastala rekombinantna fagna DNA [9].

Bakterije so pred tem transformirali še s plazmidi pKDsgRNA, ki so vsebovali vodilno RNA (sgRNA) za enega izmed treh neesencialni fagni gen, in pCas9-CR4, ki je vseboval zapis za endonukleazo Cas9. Kompleks sgRNA-Cas9 prepozna tarčno zaporedje na fagni DNA divjega tipa (wt) in ga cepi, s čimer se zmanjša število novonastalih wt fagov.

=== Karakterizacija RNAi ===
Tekom karakterizacije RNAi komponente so jih zanimale tri stvari:
* Ali lahko z RNA-polimerazo T7 pridobijo shRNA s pravilno sekundarno strukturo in vitro?
* Ali se domena RBD iz proteina Fox-1 veže specifično na lasnično zanko shRNA?
* Ali predstavlja shRNA dober substrat za endonukleazo DICER?

In vitro translacijo s polimerazo T7 so izvedli s pomočjo kompleta reagentov T7 RiboMAX RNAi express kit (Promega). Uporabili so shRNA, ki je sestavljena iz: i) prepoznavnega zaporedja za eGFP, ii) zavoja, ki ga prepozna Fox-1 in iii) previsa GG na 3'-koncu ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407006 BBa_K3407006]) ter jo vstavili pod promotor T7 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407022 BBa_K3407022]). Sintetizirane shRNA so analizirali na Urea-PAGE.

Vezavo domene RBD iz Fox-1 na shRNA so preverjali s testom zamika elektroforezne mobilnosti (EMSA). ''E. coli'' BL21(DE3) so transformirali s prej omenjeno shRNA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407022 BBa_K3407022]) ter Fox-1 RBD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407020 BBa_K3407020]) v molarnih razmerjih 1:1 ter 1:2. Eksperiment so ponovili še dvakrat; prvič so uporabili mutirano obliko Fox-1 RBD, ki naj bi imela nižjo afiniteto do shRNA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407024 BBa_K3407024]), drugič pa z shRNA, ki ima dve mutaciji na zavoju ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407023 BBa_K3407023]) vzorce so analizirali na nativnem PAGE.

Ali bi DICER iz kobilic prepoznal ter procesiral shRNA do siRNA so preverili s tem, da so 400 ng shRNA inkubirali pri 25°C v pufru, ki je vseboval 0,2 µM DICER iz ''Drosophila melanogaster''. Po določenem času (1-5 h) so reakcijo prekinili s tekočim dušikom in vzorce analizirali na Urea-PAGE.

=== Matematični model ===
Delovanje PHOCUS so testirali s pomočjo matematičnega modela, ki so ga priredili po že obstoječem, ki sta ga zasnovala Beretta in Kuang [10]. Model vsebuje štiri spremenljivke: i) koncentracija zdravih bakterij, ii) koncentracija okuženih bakterij, iii) koncentracija fagov in iv) koncentracija toksinov ter spremlja spreminjanje le-teh skozi čas; pri tem upošteva iz eksperimentov/literature pridobljene parametre (npr. hitrost rasti in lize bakterij, maksimalna kapaciteta bakterij, hitrost propadanja fagov itd.). Model so kasneje dopolnili še z dodatnim korakom, kjer so upoštevali razvoj rezistence na fage. Model so evalvirali tako, da so bakterije E. coli okužili s fagi T7 in merili časovno odvisnost OD600 bakterij ter časovno odvisnost koncentracije fagov.

== Rezultati ==
Ekipi je tekom priprave rekombinantnih fagov T7 uspelo zamenjati vse tri neesencialne gene z metodo BRED, vendar so pri genih 0,6A in 1,1 opazili še neželene produkte, zato so v nadaljevanju uporabljali fage z zamenjanim genom 4,3. Kljub uporabi sistema CRISPR-Cas9 jim rekombinantnih fagov ni uspelo izolirati, saj so plaki še vedno vsebovali fage divjega tipa.

Tekom karakterizacije RNAi komponente so ugotovili, da lahko polimeraza T7 uspešno prepiše zapis za shRNA in vitro; prepisana shRNA pri tem tudi zavzame pravilno sekundarno strukturo (lasnična zanka). Eksperimenti z metodo EMSA so pokazali, da se RBD Fox-1 lahko veže tako tarčno kot tudi na mutirano shRNA, medtem ko se mutirana domena ne veže na nobeno. Domena se veže močneje pri molarnem razmerju 1:2. Ugotovili so tudi, da DICER iz ''D. melanogaster'' prepozna in procesira shRNA do siRNA, kar nakazuje, da je ima uporabljena shRNA potencial za utišanje genov kobilic v procesu RNAi.

Simulacije z matematičnim modelom so pokazale, da lahko insekticid proizvede zadostno količino toksinov, ki povzroči smrt osebkov v manj kot 7 dneh; hitrost razvoja rezistence na fage je prepočasna, da bi bistveno vplivala na produkcijo toksinov. Evalvacija modela je pokazala, da uporabljene enačbe in parametri odražajo realno stanje sistema.

== Zaključek ==
Na tekmovanju iGEM 2020 je na področju Hrana zmagala skupina študentov iz UT Delft. Pripravili so insekticid z imenom PHOCUS, ki temelji na uporabi rekombinantnih bakteriofagov, ki okužijo črevesno floro kobilic ter povzročijo sintezo toksina Cry7Ca1 ter shRNA. Uspelo jim je okarakterizirati posamezne komponente insekticida, z matematičnim modelom pa jim je uspelo dokazati, da lahko insekticid ubije kobilice v dovolj hitrem času.

Pred uporabo v praksi bi bilo treba opraviti še naslednje stvari:
* Preveriti toksičnost Cry7Ca1 za ''Schistocerca gregaria''
* Priprava dostavljalnega proteina za olajšan transport shRNA iz lumna črevesa v hemolimfo
* Preizkusiti prepisovanje več shRNA v tandemu (tshRNA) in procesiranje le-te do posameznih shRNA z encimom Mini-3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407018 BBa_K3407018])
* Preizkusiti koekspresijo shRNA z inhibitorji RNaz

== Viri ==
# D. A. Cullen, A. J. Cease, A. V. Latchininsky, A. Ayali, K. Berry, J. Buhl, R. De Keyser, B. Foquet, J. C. Hadrich, … S. M. Rogers: From Molecules to Management: Mechanisms and Consequences of Locust Phase Polyphenism. 1. izd., Elsevier Ltd. 2017, Let. 53.
# A. Roussi: Why gigantic locust swarms are challenging governments and researchers. Nature 2020, 579(7799), str. 330–330.
# L. Zhang, M. Lecoq, A. Latchininsky, D. Hunter: Locust and Grasshopper Management. Annu. Rev. Entomol. 2019, 64(1), str. 15–34.
# TU Delft iGEM Team https://2020.igem.org/Team:TUDelft (pridobljeno 19. 5. 2021).
# O. Lavy, U. Gophna, E. Gefen, A. Ayali: The effect of density-dependent phase on the locust gut bacterial composition. Front. Microbiol. 2019, 10(JAN), str. 1–8.
# Y. Wu, C.-F. Lei, D. Yi, P.-M. Liu, M.-Y. Gao: Novel Bacillus thuringiensis δ-Endotoxin Active against Locusta migratoria manilensis. Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77(10), str. 3227–3233.
# G. J. Hannon: RNA interference. Nature 2002, 418(6894), str. 244–251.
# S. D. Auweter, R. Fasan, L. Reymond, J. G. Underwood, D. L. Black, S. Pitsch, F. H.-T. Allain: Molecular basis of RNA recognition by the human alternative splicing factor Fox-1. EMBO J. 2006, 25(1), str. 163–173.
# L. J. Marinelli, M. Piuri, Z. Swigoňová, A. Balachandran, L. M. Oldfield, J. C. van Kessel, G. F. Hatfull: BRED: A Simple and Powerful Tool for Constructing Mutant and Recombinant Bacteriophage Genomes. PLoS One 2008, 3(12), str. e3957.
# E. Beretta, Y. Kuang: Modeling and analysis of a marine bacteriophage infection. Math. Biosci. 1998, 149(1), str. 57–76.

PHOCUS: Insekticid proti kobilicam na osnovi bakteriofagov

2021-05-24T11:06:18Z

Matija Ruparčič: /* Zaključek */

PHOCUS je projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, s katerim je ekipa podiplomskih študentov iz Delfta na Nizozemskem osvojila prvo mesto na področju Hrana.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:TUDelft

Avtor povzetka: Matija Ruparčič

== Problem ==
Puščavske kobilice (''Schistocerca gregaria'') običajno živijo samotarsko, med sušnimi obdobji pa se ob iskanju hrane združijo skupaj. Ko gostota združbe preseže kritično mejo, preidejo kobilice iz neškodljivega samotarskega fenotipa (solitaria) v črednega (gregaria), pri čemer se jim spremenijo morfologija, vedenjski vzorci in prehranske navade [1]. V čredni obliki se puščavske kobilice zbirajo v rojih, ki lahko štejejo tudi do 8 milijonov osebkov; tak roj v dnevu poje enako količino hrane kot 3,5 milijona ljudi [2].

Zaradi neizmerne škode, ki jo roji kobilic povzročajo vsako leto na območju Severne Afrike, Arabskega polotoka in Južne Azije, je obvladovanje njihovega števila ključnega pomena. Za to sta na voljo dva pristopa, kemični ter biološki pesticidi, ki pa imata oba svoje pomanjkljivosti; kemični pesticidi so sicer učinkoviti, vendar nespecifični, medtem ko so biološki pesticidi sicer specifični, a delujejo prepočasi za uporabo ob nenadnih izbruhih [2, 3].

== Projekt PHOCUS ==

=== Ideja ===
Ideja projekta je bila zasnovati nov biološki pesticid, ki je še vedno specifičen, obenem pa deluje hitreje kot trenutni. Ekipa iz Delfta se je odločila uporabiti rekombinantne bakteriofage z zapisi za toksine, ki delujejo le na kobilicah. Ob zaužitju poškropljene hrane pridejo fagi v črevo kobilic, kjer okužijo bakterije črevesne flore. Tekom okužbe pričnejo le-te sintetizirati, nove bakteriofage, ki po lizi okužijo sosednje bakterije, in toksine, ki se ob lizi sprostijo v lumen črevesa in povzročijo smrt kobilice [4].

Končni izdelek naj bi vseboval koktejl litičnih fagov, ki okužijo več vrst bakterij iz rodu ''Enterobacter''; ta namreč predstavlja velik delež mikrobioma puščavskih kobilic [5].

=== Princip delovanja ===
Ekipa je zasnovala PHOCUS tako, da povzroči smrt kobilic na dva načina, in sicer preko (1) insekticidne aktivnosti toksina Cry7Ca1 ter (2) preko utišanja genov z RNA interferenco (RNAi).

Cry7Ca1 je endotoksin delta, ki ga ob sporulaciji proizvaja bakterija Bacillus thuringiensis (sev BTH-13). Mehanizem delovanja še ni popolnoma znan; predvideva se, da se aktivni toksin specifično veže na receptor na membrani črevesnih celic in povzroči tvorbo ionskega kanalčka, kar privede do celične lize ter s tem do poškodbe črevesa [4]. Tako kot ostali endotoksini delta iz B. thuringiensis ima tudi Cry7Ca1 omejen spekter delovanja; pri kobilicah Locusta migratoria manilensis izkazuje visoko insekticidno aktivnost, medtem ko je neškodljiv za metulje, hrošče in dvokrilce [6].

Rekombinantni fagi naj bi poleg zapisa za toksin vsebovali še zapis za kratko lasnično RNA (shRNA). Ta bi se na koncu litičnega cikla prav tako sprostila v lumen črevesa, nato pa bi prešla v hemolimfo in z tam v celice, kjer bi ob procesiranju z endonukleazo DICER dozorela v siRNA. Slednja nato lahko tvori kompleks RISC, ki utiša tarčne gene, kar privede bodisi do smrti bodisi do neplodnosti kobilice [4, 7]. Prehod shRNA iz lumna črevesa v hemolimfo je lahko dodatno olajšana z uporabo dostavljalnega proteina, ki vsebuje regijo, ki se specifično veže na shRNA; primer take regije je RNA-vezavna domena (RBD) iz proteina Fox-1 [8].

== Eksperimentalno delo ==
Zaradi pandemije COVID-19 ekipi ni uspelo sestaviti in ovrednotiti delovanje PHOCUS, vendar pa so uspešno pripravili 10 osnovnih ter 9 sestavljenih bioloških delov, s katerimi so okarakterizirali posamezne komponente insekticida. Pri eksperimentih so uporabljali bakterije ''Escherichia coli'' BL21(DE3) ter bakteriofage T7.

=== Priprava rekombinantnih fagov ===
Rekombinantne fage T7 so pripravili s pomočjo homologne rekombinacije, in sicer z metodo BRED (angl. Bacteriophage Recombineering of Electroporated DNA) [9].

Znotraj fagne DNA so izbrali tri neesencialne gene, ki so jih želeli zamenjati z reporterskim genom (eGFP), in sicer: 0,6A in 1,1 (zgodnja gena) ter 4,3 (srednji gen). Vključek so pripravili tako, da so s PCR pomnožili zapis za eGFP ter mu preko previsov na vsako stran dodali 100 bp zaporedje, ki je bilo homologno tarčnemu genu na fagu. Z vključkom so nato preko elektroporacije transformirali ''E. coli'' BL21(DE3) in jih nato okužili s fagi T7. Ob vstopu fagne DNA v celico je prišlo do homologne rekombinacije z vključkom, pri čemer je nastala rekombinantna fagna DNA [9].

Bakterije so pred tem transformirali še s plazmidi pKDsgRNA, ki so vsebovali vodilno RNA (sgRNA) za enega izmed treh neesencialni fagni gen, in pCas9-CR4, ki je vseboval zapis za endonukleazo Cas9. Kompleks sgRNA-Cas9 prepozna tarčno zaporedje na fagni DNA divjega tipa (wt) in ga cepi, s čimer se zmanjša število novonastalih wt fagov.

=== Karakterizacija RNAi ===
Tekom karakterizacije RNAi komponente so jih zanimale tri stvari:
* Ali lahko z RNA-polimerazo T7 pridobijo shRNA s pravilno sekundarno strukturo in vitro?
* Ali se domena RBD iz proteina Fox-1 veže specifično na lasnično zanko shRNA?
* Ali predstavlja shRNA dober substrat za endonukleazo DICER?

In vitro translacijo s polimerazo T7 so izvedli s pomočjo kompleta reagentov T7 RiboMAX RNAi express kit (Promega). Uporabili so shRNA, ki je sestavljena iz: i) prepoznavnega zaporedja za eGFP, ii) zavoja, ki ga prepozna Fox-1 in iii) previsa GG na 3'-koncu ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407006 BBa_K3407006]) ter jo vstavili pod promotor T7 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407022 BBa_K3407022]). Sintetizirane shRNA so analizirali na Urea-PAGE.

Vezavo domene RBD iz Fox-1 na shRNA so preverjali s testom zamika elektroforezne mobilnosti (EMSA). ''E. coli'' BL21(DE3) so transformirali s prej omenjeno shRNA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407022 BBa_K3407022]) ter Fox-1 RBD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407020 BBa_K3407020]) v molarnih razmerjih 1:1 ter 1:2. Eksperiment so ponovili še dvakrat; prvič so uporabili mutirano obliko Fox-1 RBD, ki naj bi imela nižjo afiniteto do shRNA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407024 BBa_K3407024]), drugič pa z shRNA, ki ima dve mutaciji na zavoju ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407023 BBa_K3407023]) vzorce so analizirali na nativnem PAGE.

Ali bi DICER iz kobilic prepoznal ter procesiral shRNA do siRNA so preverili s tem, da so 400 ng shRNA inkubirali pri 25°C v pufru, ki je vseboval 0,2 µM DICER iz ''Drosophila melanogaster''. Po določenem času (1-5 h) so reakcijo prekinili s tekočim dušikom in vzorce analizirali na Urea-PAGE.

=== Matematični model ===
Delovanje PHOCUS so testirali s pomočjo matematičnega modela, ki so ga priredili po že obstoječem, ki sta ga zasnovala Beretta in Kuang [10]. Model vsebuje štiri spremenljivke: i) koncentracija zdravih bakterij, ii) koncentracija okuženih bakterij, iii) koncentracija fagov in iv) koncentracija toksinov ter spremlja spreminjanje le-teh skozi čas; pri tem upošteva iz eksperimentov/literature pridobljene parametre (npr. hitrost rasti in lize bakterij, maksimalna kapaciteta bakterij, hitrost propadanja fagov itd.). Model so kasneje dopolnili še z dodatnim korakom, kjer so upoštevali razvoj rezistence na fage. Model so evalvirali tako, da so bakterije E. coli okužili s fagi T7 in merili časovno odvisnost OD600 bakterij ter časovno odvisnost koncentracije fagov.

== Rezultati ==
Ekipi je tekom priprave rekombinantnih fagov T7 uspelo zamenjati vse tri neesencialne gene z metodo BRED, vendar so pri genih 0,6A in 1,1 opazili še neželene produkte, zato so v nadaljevanju uporabljali fage z zamenjanim genom 4,3. Kljub uporabi sistema CRISPR-Cas9 jim rekombinantnih fagov ni uspelo izolirati, saj so plaki še vedno vsebovali fage divjega tipa.

Tekom karakterizacije RNAi komponente so ugotovili, da lahko polimeraza T7 uspešno prepiše zapis za shRNA in vitro; prepisana shRNA pri tem tudi zavzame pravilno sekundarno strukturo (lasnična zanka). Eksperimenti z metodo EMSA so pokazali, da se RBD Fox-1 lahko veže tako tarčno kot tudi na mutirano shRNA, medtem ko se mutirana domena ne veže na nobeno. Domena se veže močneje pri molarnem razmerju 1:2. Ugotovili so tudi, da DICER iz ''D. melanogaster'' prepozna in procesira shRNA do siRNA, kar nakazuje, da je ima uporabljena shRNA potencial za utišanje genov kobilic v procesu RNAi.

Simulacije z matematičnim modelom so pokazale, da lahko insekticid proizvede zadostno količino toksinov, ki povzroči smrt osebkov v manj kot 7 dneh; hitrost razvoja rezistence na fage je prepočasna, da bi bistveno vplivala na produkcijo toksinov. Evalvacija modela je pokazala, da uporabljene enačbe in parametri odražajo realno stanje sistema.

== Zaključek ==
Na tekmovanju iGEM 2020 je na področju Hrana zmagala skupina študentov iz UT Delft. Pripravili so insekticid z imenom PHOCUS, ki temelji na uporabi rekombinantnih bakteriofagov, ki okužijo črevesno floro kobilic ter povzročijo sintezo toksina Cry7Ca1 ter shRNA. Uspelo jim je okarakterizirati posamezne komponente insekticida, z matematičnim modelom pa jim je uspelo dokazati, da lahko insekticid ubije kobilice v dovolj hitrem času.

Pred uporabo v praksi bi bilo treba opraviti še naslednje stvari:
* Preveriti toksičnost Cry7Ca1 za ''Schistocerca gregaria''
* Priprava dostavljalnega proteina za olajšan transport shRNA iz lumna črevesa v hemolimfo
* Preizkusiti prepisovanje več shRNA v tandemu (tshRNA) in procesiranje le-te do posameznih shRNA z encimom Mini-3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407018 BBa_K3407018])
* Preizkusiti koekspresijo shRNA z inhibitorji RNaz

== Viri ==
# D. A. Cullen, A. J. Cease, A. V. Latchininsky, A. Ayali, K. Berry, J. Buhl, R. De Keyser, B. Foquet, J. C. Hadrich, … S. M. Rogers: From Molecules to Management: Mechanisms and Consequences of Locust Phase Polyphenism. 1. izd., Elsevier Ltd. 2017, Let. 53.
# A. Roussi: Why gigantic locust swarms are challenging governments and researchers. Nature 2020, 579(7799), str. 330–330.
# L. Zhang, M. Lecoq, A. Latchininsky, D. Hunter: Locust and Grasshopper Management. Annu. Rev. Entomol. 2019, 64(1), str. 15–34.
# TU Delft iGEM Team https://2020.igem.org/Team:TUDelft (pridobljeno 19. 5. 2021).
# O. Lavy, U. Gophna, E. Gefen, A. Ayali: The effect of density-dependent phase on the locust gut bacterial composition. Front. Microbiol. 2019, 10(JAN), str. 1–8.
# Y. Wu, C.-F. Lei, D. Yi, P.-M. Liu, M.-Y. Gao: Novel Bacillus thuringiensis δ-Endotoxin Active against Locusta migratoria manilensis. Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77(10), str. 3227–3233.
# G. J. Hannon: RNA interference. Nature 2002, 418(6894), str. 244–251.
# S. D. Auweter, R. Fasan, L. Reymond, J. G. Underwood, D. L. Black, S. Pitsch, F. H.-T. Allain: Molecular basis of RNA recognition by the human alternative splicing factor Fox-1. EMBO J. 2006, 25(1), str. 163–173.
# L. J. Marinelli, M. Piuri, Z. Swigoňová, A. Balachandran, L. M. Oldfield, J. C. van Kessel, G. F. Hatfull: BRED: A Simple and Powerful Tool for Constructing Mutant and Recombinant Bacteriophage Genomes. PLoS One 2008, 3(12), str. e3957.
# E. Beretta, Y. Kuang: Modeling and analysis of a marine bacteriophage infection. Math. Biosci. 1998, 149(1), str. 57–76.

PHOCUS: Insekticid proti kobilicam na osnovi bakteriofagov

2021-05-24T11:06:05Z

Matija Ruparčič: /* Matematični model */

PHOCUS je projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, s katerim je ekipa podiplomskih študentov iz Delfta na Nizozemskem osvojila prvo mesto na področju Hrana.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:TUDelft

Avtor povzetka: Matija Ruparčič

== Problem ==
Puščavske kobilice (''Schistocerca gregaria'') običajno živijo samotarsko, med sušnimi obdobji pa se ob iskanju hrane združijo skupaj. Ko gostota združbe preseže kritično mejo, preidejo kobilice iz neškodljivega samotarskega fenotipa (solitaria) v črednega (gregaria), pri čemer se jim spremenijo morfologija, vedenjski vzorci in prehranske navade [1]. V čredni obliki se puščavske kobilice zbirajo v rojih, ki lahko štejejo tudi do 8 milijonov osebkov; tak roj v dnevu poje enako količino hrane kot 3,5 milijona ljudi [2].

Zaradi neizmerne škode, ki jo roji kobilic povzročajo vsako leto na območju Severne Afrike, Arabskega polotoka in Južne Azije, je obvladovanje njihovega števila ključnega pomena. Za to sta na voljo dva pristopa, kemični ter biološki pesticidi, ki pa imata oba svoje pomanjkljivosti; kemični pesticidi so sicer učinkoviti, vendar nespecifični, medtem ko so biološki pesticidi sicer specifični, a delujejo prepočasi za uporabo ob nenadnih izbruhih [2, 3].

== Projekt PHOCUS ==

=== Ideja ===
Ideja projekta je bila zasnovati nov biološki pesticid, ki je še vedno specifičen, obenem pa deluje hitreje kot trenutni. Ekipa iz Delfta se je odločila uporabiti rekombinantne bakteriofage z zapisi za toksine, ki delujejo le na kobilicah. Ob zaužitju poškropljene hrane pridejo fagi v črevo kobilic, kjer okužijo bakterije črevesne flore. Tekom okužbe pričnejo le-te sintetizirati, nove bakteriofage, ki po lizi okužijo sosednje bakterije, in toksine, ki se ob lizi sprostijo v lumen črevesa in povzročijo smrt kobilice [4].

Končni izdelek naj bi vseboval koktejl litičnih fagov, ki okužijo več vrst bakterij iz rodu ''Enterobacter''; ta namreč predstavlja velik delež mikrobioma puščavskih kobilic [5].

=== Princip delovanja ===
Ekipa je zasnovala PHOCUS tako, da povzroči smrt kobilic na dva načina, in sicer preko (1) insekticidne aktivnosti toksina Cry7Ca1 ter (2) preko utišanja genov z RNA interferenco (RNAi).

Cry7Ca1 je endotoksin delta, ki ga ob sporulaciji proizvaja bakterija Bacillus thuringiensis (sev BTH-13). Mehanizem delovanja še ni popolnoma znan; predvideva se, da se aktivni toksin specifično veže na receptor na membrani črevesnih celic in povzroči tvorbo ionskega kanalčka, kar privede do celične lize ter s tem do poškodbe črevesa [4]. Tako kot ostali endotoksini delta iz B. thuringiensis ima tudi Cry7Ca1 omejen spekter delovanja; pri kobilicah Locusta migratoria manilensis izkazuje visoko insekticidno aktivnost, medtem ko je neškodljiv za metulje, hrošče in dvokrilce [6].

Rekombinantni fagi naj bi poleg zapisa za toksin vsebovali še zapis za kratko lasnično RNA (shRNA). Ta bi se na koncu litičnega cikla prav tako sprostila v lumen črevesa, nato pa bi prešla v hemolimfo in z tam v celice, kjer bi ob procesiranju z endonukleazo DICER dozorela v siRNA. Slednja nato lahko tvori kompleks RISC, ki utiša tarčne gene, kar privede bodisi do smrti bodisi do neplodnosti kobilice [4, 7]. Prehod shRNA iz lumna črevesa v hemolimfo je lahko dodatno olajšana z uporabo dostavljalnega proteina, ki vsebuje regijo, ki se specifično veže na shRNA; primer take regije je RNA-vezavna domena (RBD) iz proteina Fox-1 [8].

== Eksperimentalno delo ==
Zaradi pandemije COVID-19 ekipi ni uspelo sestaviti in ovrednotiti delovanje PHOCUS, vendar pa so uspešno pripravili 10 osnovnih ter 9 sestavljenih bioloških delov, s katerimi so okarakterizirali posamezne komponente insekticida. Pri eksperimentih so uporabljali bakterije ''Escherichia coli'' BL21(DE3) ter bakteriofage T7.

=== Priprava rekombinantnih fagov ===
Rekombinantne fage T7 so pripravili s pomočjo homologne rekombinacije, in sicer z metodo BRED (angl. Bacteriophage Recombineering of Electroporated DNA) [9].

Znotraj fagne DNA so izbrali tri neesencialne gene, ki so jih želeli zamenjati z reporterskim genom (eGFP), in sicer: 0,6A in 1,1 (zgodnja gena) ter 4,3 (srednji gen). Vključek so pripravili tako, da so s PCR pomnožili zapis za eGFP ter mu preko previsov na vsako stran dodali 100 bp zaporedje, ki je bilo homologno tarčnemu genu na fagu. Z vključkom so nato preko elektroporacije transformirali ''E. coli'' BL21(DE3) in jih nato okužili s fagi T7. Ob vstopu fagne DNA v celico je prišlo do homologne rekombinacije z vključkom, pri čemer je nastala rekombinantna fagna DNA [9].

Bakterije so pred tem transformirali še s plazmidi pKDsgRNA, ki so vsebovali vodilno RNA (sgRNA) za enega izmed treh neesencialni fagni gen, in pCas9-CR4, ki je vseboval zapis za endonukleazo Cas9. Kompleks sgRNA-Cas9 prepozna tarčno zaporedje na fagni DNA divjega tipa (wt) in ga cepi, s čimer se zmanjša število novonastalih wt fagov.

=== Karakterizacija RNAi ===
Tekom karakterizacije RNAi komponente so jih zanimale tri stvari:
* Ali lahko z RNA-polimerazo T7 pridobijo shRNA s pravilno sekundarno strukturo in vitro?
* Ali se domena RBD iz proteina Fox-1 veže specifično na lasnično zanko shRNA?
* Ali predstavlja shRNA dober substrat za endonukleazo DICER?

In vitro translacijo s polimerazo T7 so izvedli s pomočjo kompleta reagentov T7 RiboMAX RNAi express kit (Promega). Uporabili so shRNA, ki je sestavljena iz: i) prepoznavnega zaporedja za eGFP, ii) zavoja, ki ga prepozna Fox-1 in iii) previsa GG na 3'-koncu ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407006 BBa_K3407006]) ter jo vstavili pod promotor T7 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407022 BBa_K3407022]). Sintetizirane shRNA so analizirali na Urea-PAGE.

Vezavo domene RBD iz Fox-1 na shRNA so preverjali s testom zamika elektroforezne mobilnosti (EMSA). ''E. coli'' BL21(DE3) so transformirali s prej omenjeno shRNA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407022 BBa_K3407022]) ter Fox-1 RBD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407020 BBa_K3407020]) v molarnih razmerjih 1:1 ter 1:2. Eksperiment so ponovili še dvakrat; prvič so uporabili mutirano obliko Fox-1 RBD, ki naj bi imela nižjo afiniteto do shRNA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407024 BBa_K3407024]), drugič pa z shRNA, ki ima dve mutaciji na zavoju ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407023 BBa_K3407023]) vzorce so analizirali na nativnem PAGE.

Ali bi DICER iz kobilic prepoznal ter procesiral shRNA do siRNA so preverili s tem, da so 400 ng shRNA inkubirali pri 25°C v pufru, ki je vseboval 0,2 µM DICER iz ''Drosophila melanogaster''. Po določenem času (1-5 h) so reakcijo prekinili s tekočim dušikom in vzorce analizirali na Urea-PAGE.

=== Matematični model ===
Delovanje PHOCUS so testirali s pomočjo matematičnega modela, ki so ga priredili po že obstoječem, ki sta ga zasnovala Beretta in Kuang [10]. Model vsebuje štiri spremenljivke: i) koncentracija zdravih bakterij, ii) koncentracija okuženih bakterij, iii) koncentracija fagov in iv) koncentracija toksinov ter spremlja spreminjanje le-teh skozi čas; pri tem upošteva iz eksperimentov/literature pridobljene parametre (npr. hitrost rasti in lize bakterij, maksimalna kapaciteta bakterij, hitrost propadanja fagov itd.). Model so kasneje dopolnili še z dodatnim korakom, kjer so upoštevali razvoj rezistence na fage. Model so evalvirali tako, da so bakterije E. coli okužili s fagi T7 in merili časovno odvisnost OD600 bakterij ter časovno odvisnost koncentracije fagov.

== Rezultati ==
Ekipi je tekom priprave rekombinantnih fagov T7 uspelo zamenjati vse tri neesencialne gene z metodo BRED, vendar so pri genih 0,6A in 1,1 opazili še neželene produkte, zato so v nadaljevanju uporabljali fage z zamenjanim genom 4,3. Kljub uporabi sistema CRISPR-Cas9 jim rekombinantnih fagov ni uspelo izolirati, saj so plaki še vedno vsebovali fage divjega tipa.

Tekom karakterizacije RNAi komponente so ugotovili, da lahko polimeraza T7 uspešno prepiše zapis za shRNA in vitro; prepisana shRNA pri tem tudi zavzame pravilno sekundarno strukturo (lasnična zanka). Eksperimenti z metodo EMSA so pokazali, da se RBD Fox-1 lahko veže tako tarčno kot tudi na mutirano shRNA, medtem ko se mutirana domena ne veže na nobeno. Domena se veže močneje pri molarnem razmerju 1:2. Ugotovili so tudi, da DICER iz ''D. melanogaster'' prepozna in procesira shRNA do siRNA, kar nakazuje, da je ima uporabljena shRNA potencial za utišanje genov kobilic v procesu RNAi.

Simulacije z matematičnim modelom so pokazale, da lahko insekticid proizvede zadostno količino toksinov, ki povzroči smrt osebkov v manj kot 7 dneh; hitrost razvoja rezistence na fage je prepočasna, da bi bistveno vplivala na produkcijo toksinov. Evalvacija modela je pokazala, da uporabljene enačbe in parametri odražajo realno stanje sistema.

== Zaključek ==
Na tekmovanju iGEM 2020 je na področju Hrana zmagala skupina študentov iz UT Delft. Pripravili so insekticid z imenom PHOKUS, ki temelji na uporabi rekombinantnih bakteriofagov, ki okužijo črevesno floro kobilic ter povzročijo sintezo toksina Cry7Ca1 ter shRNA. Uspelo jim je okarakterizirati posamezne komponente insekticida, z matematičnim modelom pa jim je uspelo dokazati, da lahko insekticid ubije kobilice v dovolj hitrem času.

Pred uporabo v praksi bi bilo treba opraviti še naslednje stvari:
* Preveriti toksičnost Cry7Ca1 za ''Schistocerca gregaria''
* Priprava dostavljalnega proteina za olajšan transport shRNA iz lumna črevesa v hemolimfo
* Preizkusiti prepisovanje več shRNA v tandemu (tshRNA) in procesiranje le-te do posameznih shRNA z encimom Mini-3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407018 BBa_K3407018])
* Preizkusiti koekspresijo shRNA z inhibitorji RNaz

== Viri ==
# D. A. Cullen, A. J. Cease, A. V. Latchininsky, A. Ayali, K. Berry, J. Buhl, R. De Keyser, B. Foquet, J. C. Hadrich, … S. M. Rogers: From Molecules to Management: Mechanisms and Consequences of Locust Phase Polyphenism. 1. izd., Elsevier Ltd. 2017, Let. 53.
# A. Roussi: Why gigantic locust swarms are challenging governments and researchers. Nature 2020, 579(7799), str. 330–330.
# L. Zhang, M. Lecoq, A. Latchininsky, D. Hunter: Locust and Grasshopper Management. Annu. Rev. Entomol. 2019, 64(1), str. 15–34.
# TU Delft iGEM Team https://2020.igem.org/Team:TUDelft (pridobljeno 19. 5. 2021).
# O. Lavy, U. Gophna, E. Gefen, A. Ayali: The effect of density-dependent phase on the locust gut bacterial composition. Front. Microbiol. 2019, 10(JAN), str. 1–8.
# Y. Wu, C.-F. Lei, D. Yi, P.-M. Liu, M.-Y. Gao: Novel Bacillus thuringiensis δ-Endotoxin Active against Locusta migratoria manilensis. Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77(10), str. 3227–3233.
# G. J. Hannon: RNA interference. Nature 2002, 418(6894), str. 244–251.
# S. D. Auweter, R. Fasan, L. Reymond, J. G. Underwood, D. L. Black, S. Pitsch, F. H.-T. Allain: Molecular basis of RNA recognition by the human alternative splicing factor Fox-1. EMBO J. 2006, 25(1), str. 163–173.
# L. J. Marinelli, M. Piuri, Z. Swigoňová, A. Balachandran, L. M. Oldfield, J. C. van Kessel, G. F. Hatfull: BRED: A Simple and Powerful Tool for Constructing Mutant and Recombinant Bacteriophage Genomes. PLoS One 2008, 3(12), str. e3957.
# E. Beretta, Y. Kuang: Modeling and analysis of a marine bacteriophage infection. Math. Biosci. 1998, 149(1), str. 57–76.

PHOCUS: Insekticid proti kobilicam na osnovi bakteriofagov

2021-05-23T22:33:06Z

Matija Ruparčič: /* Zaključek */

PHOCUS je projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, s katerim je ekipa podiplomskih študentov iz Delfta na Nizozemskem osvojila prvo mesto na področju Hrana.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:TUDelft

Avtor povzetka: Matija Ruparčič

== Problem ==
Puščavske kobilice (''Schistocerca gregaria'') običajno živijo samotarsko, med sušnimi obdobji pa se ob iskanju hrane združijo skupaj. Ko gostota združbe preseže kritično mejo, preidejo kobilice iz neškodljivega samotarskega fenotipa (solitaria) v črednega (gregaria), pri čemer se jim spremenijo morfologija, vedenjski vzorci in prehranske navade [1]. V čredni obliki se puščavske kobilice zbirajo v rojih, ki lahko štejejo tudi do 8 milijonov osebkov; tak roj v dnevu poje enako količino hrane kot 3,5 milijona ljudi [2].

Zaradi neizmerne škode, ki jo roji kobilic povzročajo vsako leto na območju Severne Afrike, Arabskega polotoka in Južne Azije, je obvladovanje njihovega števila ključnega pomena. Za to sta na voljo dva pristopa, kemični ter biološki pesticidi, ki pa imata oba svoje pomanjkljivosti; kemični pesticidi so sicer učinkoviti, vendar nespecifični, medtem ko so biološki pesticidi sicer specifični, a delujejo prepočasi za uporabo ob nenadnih izbruhih [2, 3].

== Projekt PHOCUS ==

=== Ideja ===
Ideja projekta je bila zasnovati nov biološki pesticid, ki je še vedno specifičen, obenem pa deluje hitreje kot trenutni. Ekipa iz Delfta se je odločila uporabiti rekombinantne bakteriofage z zapisi za toksine, ki delujejo le na kobilicah. Ob zaužitju poškropljene hrane pridejo fagi v črevo kobilic, kjer okužijo bakterije črevesne flore. Tekom okužbe pričnejo le-te sintetizirati, nove bakteriofage, ki po lizi okužijo sosednje bakterije, in toksine, ki se ob lizi sprostijo v lumen črevesa in povzročijo smrt kobilice [4].

Končni izdelek naj bi vseboval koktejl litičnih fagov, ki okužijo več vrst bakterij iz rodu ''Enterobacter''; ta namreč predstavlja velik delež mikrobioma puščavskih kobilic [5].

=== Princip delovanja ===
Ekipa je zasnovala PHOCUS tako, da povzroči smrt kobilic na dva načina, in sicer preko (1) insekticidne aktivnosti toksina Cry7Ca1 ter (2) preko utišanja genov z RNA interferenco (RNAi).

Cry7Ca1 je endotoksin delta, ki ga ob sporulaciji proizvaja bakterija Bacillus thuringiensis (sev BTH-13). Mehanizem delovanja še ni popolnoma znan; predvideva se, da se aktivni toksin specifično veže na receptor na membrani črevesnih celic in povzroči tvorbo ionskega kanalčka, kar privede do celične lize ter s tem do poškodbe črevesa [4]. Tako kot ostali endotoksini delta iz B. thuringiensis ima tudi Cry7Ca1 omejen spekter delovanja; pri kobilicah Locusta migratoria manilensis izkazuje visoko insekticidno aktivnost, medtem ko je neškodljiv za metulje, hrošče in dvokrilce [6].

Rekombinantni fagi naj bi poleg zapisa za toksin vsebovali še zapis za kratko lasnično RNA (shRNA). Ta bi se na koncu litičnega cikla prav tako sprostila v lumen črevesa, nato pa bi prešla v hemolimfo in z tam v celice, kjer bi ob procesiranju z endonukleazo DICER dozorela v siRNA. Slednja nato lahko tvori kompleks RISC, ki utiša tarčne gene, kar privede bodisi do smrti bodisi do neplodnosti kobilice [4, 7]. Prehod shRNA iz lumna črevesa v hemolimfo je lahko dodatno olajšana z uporabo dostavljalnega proteina, ki vsebuje regijo, ki se specifično veže na shRNA; primer take regije je RNA-vezavna domena (RBD) iz proteina Fox-1 [8].

== Eksperimentalno delo ==
Zaradi pandemije COVID-19 ekipi ni uspelo sestaviti in ovrednotiti delovanje PHOCUS, vendar pa so uspešno pripravili 10 osnovnih ter 9 sestavljenih bioloških delov, s katerimi so okarakterizirali posamezne komponente insekticida. Pri eksperimentih so uporabljali bakterije ''Escherichia coli'' BL21(DE3) ter bakteriofage T7.

=== Priprava rekombinantnih fagov ===
Rekombinantne fage T7 so pripravili s pomočjo homologne rekombinacije, in sicer z metodo BRED (angl. Bacteriophage Recombineering of Electroporated DNA) [9].

Znotraj fagne DNA so izbrali tri neesencialne gene, ki so jih želeli zamenjati z reporterskim genom (eGFP), in sicer: 0,6A in 1,1 (zgodnja gena) ter 4,3 (srednji gen). Vključek so pripravili tako, da so s PCR pomnožili zapis za eGFP ter mu preko previsov na vsako stran dodali 100 bp zaporedje, ki je bilo homologno tarčnemu genu na fagu. Z vključkom so nato preko elektroporacije transformirali ''E. coli'' BL21(DE3) in jih nato okužili s fagi T7. Ob vstopu fagne DNA v celico je prišlo do homologne rekombinacije z vključkom, pri čemer je nastala rekombinantna fagna DNA [9].

Bakterije so pred tem transformirali še s plazmidi pKDsgRNA, ki so vsebovali vodilno RNA (sgRNA) za enega izmed treh neesencialni fagni gen, in pCas9-CR4, ki je vseboval zapis za endonukleazo Cas9. Kompleks sgRNA-Cas9 prepozna tarčno zaporedje na fagni DNA divjega tipa (wt) in ga cepi, s čimer se zmanjša število novonastalih wt fagov.

=== Karakterizacija RNAi ===
Tekom karakterizacije RNAi komponente so jih zanimale tri stvari:
* Ali lahko z RNA-polimerazo T7 pridobijo shRNA s pravilno sekundarno strukturo in vitro?
* Ali se domena RBD iz proteina Fox-1 veže specifično na lasnično zanko shRNA?
* Ali predstavlja shRNA dober substrat za endonukleazo DICER?

In vitro translacijo s polimerazo T7 so izvedli s pomočjo kompleta reagentov T7 RiboMAX RNAi express kit (Promega). Uporabili so shRNA, ki je sestavljena iz: i) prepoznavnega zaporedja za eGFP, ii) zavoja, ki ga prepozna Fox-1 in iii) previsa GG na 3'-koncu ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407006 BBa_K3407006]) ter jo vstavili pod promotor T7 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407022 BBa_K3407022]). Sintetizirane shRNA so analizirali na Urea-PAGE.

Vezavo domene RBD iz Fox-1 na shRNA so preverjali s testom zamika elektroforezne mobilnosti (EMSA). ''E. coli'' BL21(DE3) so transformirali s prej omenjeno shRNA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407022 BBa_K3407022]) ter Fox-1 RBD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407020 BBa_K3407020]) v molarnih razmerjih 1:1 ter 1:2. Eksperiment so ponovili še dvakrat; prvič so uporabili mutirano obliko Fox-1 RBD, ki naj bi imela nižjo afiniteto do shRNA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407024 BBa_K3407024]), drugič pa z shRNA, ki ima dve mutaciji na zavoju ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407023 BBa_K3407023]) vzorce so analizirali na nativnem PAGE.

Ali bi DICER iz kobilic prepoznal ter procesiral shRNA do siRNA so preverili s tem, da so 400 ng shRNA inkubirali pri 25°C v pufru, ki je vseboval 0,2 µM DICER iz ''Drosophila melanogaster''. Po določenem času (1-5 h) so reakcijo prekinili s tekočim dušikom in vzorce analizirali na Urea-PAGE.

=== Matematični model ===
Delovanje PHOKUS so testirali s pomočjo matematičnega modela, ki so ga priredili po že obstoječem, ki sta ga zasnovala Beretta in Kuang [10]. Model vsebuje štiri spremenljivke: i) koncentracija zdravih bakterij, ii) koncentracija okuženih bakterij, iii) koncentracija fagov in iv) koncentracija toksinov ter spremlja spreminjanje le-teh skozi čas; pri tem upošteva iz eksperimentov/literature pridobljene parametre (npr. hitrost rasti in lize bakterij, maksimalna kapaciteta bakterij, hitrost propadanja fagov itd.). Model so kasneje dopolnili še z dodatnim korakom, kjer so upoštevali razvoj rezistence na fage. Model so evalvirali tako, da so bakterije E. coli okužili s fagi T7 in merili časovno odvisnost OD600 bakterij ter časovno odvisnost koncentracije fagov.

== Rezultati ==
Ekipi je tekom priprave rekombinantnih fagov T7 uspelo zamenjati vse tri neesencialne gene z metodo BRED, vendar so pri genih 0,6A in 1,1 opazili še neželene produkte, zato so v nadaljevanju uporabljali fage z zamenjanim genom 4,3. Kljub uporabi sistema CRISPR-Cas9 jim rekombinantnih fagov ni uspelo izolirati, saj so plaki še vedno vsebovali fage divjega tipa.

Tekom karakterizacije RNAi komponente so ugotovili, da lahko polimeraza T7 uspešno prepiše zapis za shRNA in vitro; prepisana shRNA pri tem tudi zavzame pravilno sekundarno strukturo (lasnična zanka). Eksperimenti z metodo EMSA so pokazali, da se RBD Fox-1 lahko veže tako tarčno kot tudi na mutirano shRNA, medtem ko se mutirana domena ne veže na nobeno. Domena se veže močneje pri molarnem razmerju 1:2. Ugotovili so tudi, da DICER iz ''D. melanogaster'' prepozna in procesira shRNA do siRNA, kar nakazuje, da je ima uporabljena shRNA potencial za utišanje genov kobilic v procesu RNAi.

Simulacije z matematičnim modelom so pokazale, da lahko insekticid proizvede zadostno količino toksinov, ki povzroči smrt osebkov v manj kot 7 dneh; hitrost razvoja rezistence na fage je prepočasna, da bi bistveno vplivala na produkcijo toksinov. Evalvacija modela je pokazala, da uporabljene enačbe in parametri odražajo realno stanje sistema.

== Zaključek ==
Na tekmovanju iGEM 2020 je na področju Hrana zmagala skupina študentov iz UT Delft. Pripravili so insekticid z imenom PHOKUS, ki temelji na uporabi rekombinantnih bakteriofagov, ki okužijo črevesno floro kobilic ter povzročijo sintezo toksina Cry7Ca1 ter shRNA. Uspelo jim je okarakterizirati posamezne komponente insekticida, z matematičnim modelom pa jim je uspelo dokazati, da lahko insekticid ubije kobilice v dovolj hitrem času.

Pred uporabo v praksi bi bilo treba opraviti še naslednje stvari:
* Preveriti toksičnost Cry7Ca1 za ''Schistocerca gregaria''
* Priprava dostavljalnega proteina za olajšan transport shRNA iz lumna črevesa v hemolimfo
* Preizkusiti prepisovanje več shRNA v tandemu (tshRNA) in procesiranje le-te do posameznih shRNA z encimom Mini-3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407018 BBa_K3407018])
* Preizkusiti koekspresijo shRNA z inhibitorji RNaz

== Viri ==
# D. A. Cullen, A. J. Cease, A. V. Latchininsky, A. Ayali, K. Berry, J. Buhl, R. De Keyser, B. Foquet, J. C. Hadrich, … S. M. Rogers: From Molecules to Management: Mechanisms and Consequences of Locust Phase Polyphenism. 1. izd., Elsevier Ltd. 2017, Let. 53.
# A. Roussi: Why gigantic locust swarms are challenging governments and researchers. Nature 2020, 579(7799), str. 330–330.
# L. Zhang, M. Lecoq, A. Latchininsky, D. Hunter: Locust and Grasshopper Management. Annu. Rev. Entomol. 2019, 64(1), str. 15–34.
# TU Delft iGEM Team https://2020.igem.org/Team:TUDelft (pridobljeno 19. 5. 2021).
# O. Lavy, U. Gophna, E. Gefen, A. Ayali: The effect of density-dependent phase on the locust gut bacterial composition. Front. Microbiol. 2019, 10(JAN), str. 1–8.
# Y. Wu, C.-F. Lei, D. Yi, P.-M. Liu, M.-Y. Gao: Novel Bacillus thuringiensis δ-Endotoxin Active against Locusta migratoria manilensis. Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77(10), str. 3227–3233.
# G. J. Hannon: RNA interference. Nature 2002, 418(6894), str. 244–251.
# S. D. Auweter, R. Fasan, L. Reymond, J. G. Underwood, D. L. Black, S. Pitsch, F. H.-T. Allain: Molecular basis of RNA recognition by the human alternative splicing factor Fox-1. EMBO J. 2006, 25(1), str. 163–173.
# L. J. Marinelli, M. Piuri, Z. Swigoňová, A. Balachandran, L. M. Oldfield, J. C. van Kessel, G. F. Hatfull: BRED: A Simple and Powerful Tool for Constructing Mutant and Recombinant Bacteriophage Genomes. PLoS One 2008, 3(12), str. e3957.
# E. Beretta, Y. Kuang: Modeling and analysis of a marine bacteriophage infection. Math. Biosci. 1998, 149(1), str. 57–76.

Seminarji SB 2020/21

2021-05-23T22:32:16Z

Matija Ruparčič:

[http://www.example.com link title]V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline] (Liza Ulčakar) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reverzibilna_toplotna_regulacija_za_bifunkcionalno_dinamično_uravnavanje_izražanja_genov_v_E._coli Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli] (Urška Fajdiga) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dna_optogenetska_naprava_na_osnovi_BRET_za_pulzirajo%C4%8Do_ekspresijo_transgena%2C_ki_omogo%C4%8Da_glukozno_homeostazo_pri_mi%C5%A1ih Sintetična optogenetska naprava na osnovi BRET za pulzirajočo ekspresijo transgena, ki omogoča glukozno homeostazo pri miših] (Paula Horvat) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hkratna_karakterizacija_več_različnih_racionalno_načrtovanih_promotorskih_arhitektur Vpogled v kombinatorno logiko z IPTG induciranih sistemov] (Urška Zagorc) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ponovno_določanje_specifičnosti_izven_citoplazme_aktivnih_sigma_faktorjev Ponovno določanje specifičnosti izven citoplazme aktivnih sigma faktorjev] (Eva Keber) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hierarhi%C4%8Dno_sestavljanje_asimetri%C4%8Dnih_ikozaedri%C4%8Dnih_virusnih_kapsid Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid] (Urška Pečarič Strnad) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Avtomatizirano_oblikovanje_sintezne_mikrobne_zdru%C5%BEbe Avtomatizirano oblikovanje sintezne mikrobne združbe] (Urša Lovše) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Regulacija_stopnje_izra%C5%BEanja_z_L-arabinozo_v_ekspresijskem_sistemu_T7_z_razklopljeno_rastjo Regulacija stopnje izražanja z L-arabinozo v ekspresijskem sistemu T7 z razklopljeno rastjo] (Maruša Mišmaš) 
# [[Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom|Oblikovanje sintetičnega faga iz ''P. aeruginosa'' z reduciranim genomom]] (Martina Lokar) 
#[[Uravnavanje izražanja genov s pomočjo nanoteles in njihov vpliv na epigenetski spomin]] (Sara Laznik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_humanih_CAR_imunskih_celic_z_napredno_logiko_in_porazdeljenim_računalništvom Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom] (Tjaša Mlakar) 
# [[Utišanje genov na osnovi majhnih protismernih DNA omogoča manipulacijo in replikacijo genoma bakteriofagov v brezceličnem sistemu]] (Anže Karlek) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Translacijski_nadzor_izražanja_encima_odstranjevalca_preko_s_toksinom_induciranega_miRNA_stikala Translacijski nadzor izražanja encima odstranjevalca preko s toksinom induciranega miRNA stikala] (Ernestina Lavrih) 
# [[Sintetični promotorji za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju]] (Saša Slabe) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv] (Špela Supej) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 
# [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) 
# [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) 
# [[Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe]] (Mirsad Mešić) 
# [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) 
# [[Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata]] (Jernej Imperl) 
# [[NANOFLEX: Standardiziran, prilagodljiv in priročen celični biosenzor]] (Martin Špendl) 
# [[FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib]] (Mateja Žvipelj) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/samoreplicirajoč_COVID-19_test Samoreplicirajoč COVID-19-test] (Irma Zeljković) 
# [[Renervate: Polimer za zdravljenje poškodb hrbtenjače]] (Sabina Sladič Oblak) 
# [[PROSTATUS: Diagnostika raka prostate]] (Luka Gnidovec) 
# [[RootPatch: Boj proti škodljivim nematodam v prsti]] (Nina Lukančič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SINISENS:_kvantifikacija_makrolidnih_antibiotikov_v_okolju SINISENS-kvantifikacija makrolidnih antibiotikov v okolju] (Maja Globočnik) 
# [[PHOCUS: Insekticid proti kobilicam na osnovi bakteriofagov]] (Matija Ruparčič) 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

PHOCUS: Insekticid proti kobilicam na osnovi bakteriofagov

2021-05-23T22:30:52Z

Matija Ruparčič: New page: PHOCUS je projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, s katerim je ekipa podiplomskih študentov iz Delfta na Nizozemskem osvojila prvo mesto na področju Hrana. Spletna stran projekta: https:...

PHOCUS je projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, s katerim je ekipa podiplomskih študentov iz Delfta na Nizozemskem osvojila prvo mesto na področju Hrana.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:TUDelft

Avtor povzetka: Matija Ruparčič

== Problem ==
Puščavske kobilice (''Schistocerca gregaria'') običajno živijo samotarsko, med sušnimi obdobji pa se ob iskanju hrane združijo skupaj. Ko gostota združbe preseže kritično mejo, preidejo kobilice iz neškodljivega samotarskega fenotipa (solitaria) v črednega (gregaria), pri čemer se jim spremenijo morfologija, vedenjski vzorci in prehranske navade [1]. V čredni obliki se puščavske kobilice zbirajo v rojih, ki lahko štejejo tudi do 8 milijonov osebkov; tak roj v dnevu poje enako količino hrane kot 3,5 milijona ljudi [2].

Zaradi neizmerne škode, ki jo roji kobilic povzročajo vsako leto na območju Severne Afrike, Arabskega polotoka in Južne Azije, je obvladovanje njihovega števila ključnega pomena. Za to sta na voljo dva pristopa, kemični ter biološki pesticidi, ki pa imata oba svoje pomanjkljivosti; kemični pesticidi so sicer učinkoviti, vendar nespecifični, medtem ko so biološki pesticidi sicer specifični, a delujejo prepočasi za uporabo ob nenadnih izbruhih [2, 3].

== Projekt PHOCUS ==

=== Ideja ===
Ideja projekta je bila zasnovati nov biološki pesticid, ki je še vedno specifičen, obenem pa deluje hitreje kot trenutni. Ekipa iz Delfta se je odločila uporabiti rekombinantne bakteriofage z zapisi za toksine, ki delujejo le na kobilicah. Ob zaužitju poškropljene hrane pridejo fagi v črevo kobilic, kjer okužijo bakterije črevesne flore. Tekom okužbe pričnejo le-te sintetizirati, nove bakteriofage, ki po lizi okužijo sosednje bakterije, in toksine, ki se ob lizi sprostijo v lumen črevesa in povzročijo smrt kobilice [4].

Končni izdelek naj bi vseboval koktejl litičnih fagov, ki okužijo več vrst bakterij iz rodu ''Enterobacter''; ta namreč predstavlja velik delež mikrobioma puščavskih kobilic [5].

=== Princip delovanja ===
Ekipa je zasnovala PHOCUS tako, da povzroči smrt kobilic na dva načina, in sicer preko (1) insekticidne aktivnosti toksina Cry7Ca1 ter (2) preko utišanja genov z RNA interferenco (RNAi).

Cry7Ca1 je endotoksin delta, ki ga ob sporulaciji proizvaja bakterija Bacillus thuringiensis (sev BTH-13). Mehanizem delovanja še ni popolnoma znan; predvideva se, da se aktivni toksin specifično veže na receptor na membrani črevesnih celic in povzroči tvorbo ionskega kanalčka, kar privede do celične lize ter s tem do poškodbe črevesa [4]. Tako kot ostali endotoksini delta iz B. thuringiensis ima tudi Cry7Ca1 omejen spekter delovanja; pri kobilicah Locusta migratoria manilensis izkazuje visoko insekticidno aktivnost, medtem ko je neškodljiv za metulje, hrošče in dvokrilce [6].

Rekombinantni fagi naj bi poleg zapisa za toksin vsebovali še zapis za kratko lasnično RNA (shRNA). Ta bi se na koncu litičnega cikla prav tako sprostila v lumen črevesa, nato pa bi prešla v hemolimfo in z tam v celice, kjer bi ob procesiranju z endonukleazo DICER dozorela v siRNA. Slednja nato lahko tvori kompleks RISC, ki utiša tarčne gene, kar privede bodisi do smrti bodisi do neplodnosti kobilice [4, 7]. Prehod shRNA iz lumna črevesa v hemolimfo je lahko dodatno olajšana z uporabo dostavljalnega proteina, ki vsebuje regijo, ki se specifično veže na shRNA; primer take regije je RNA-vezavna domena (RBD) iz proteina Fox-1 [8].

== Eksperimentalno delo ==
Zaradi pandemije COVID-19 ekipi ni uspelo sestaviti in ovrednotiti delovanje PHOCUS, vendar pa so uspešno pripravili 10 osnovnih ter 9 sestavljenih bioloških delov, s katerimi so okarakterizirali posamezne komponente insekticida. Pri eksperimentih so uporabljali bakterije ''Escherichia coli'' BL21(DE3) ter bakteriofage T7.

=== Priprava rekombinantnih fagov ===
Rekombinantne fage T7 so pripravili s pomočjo homologne rekombinacije, in sicer z metodo BRED (angl. Bacteriophage Recombineering of Electroporated DNA) [9].

Znotraj fagne DNA so izbrali tri neesencialne gene, ki so jih želeli zamenjati z reporterskim genom (eGFP), in sicer: 0,6A in 1,1 (zgodnja gena) ter 4,3 (srednji gen). Vključek so pripravili tako, da so s PCR pomnožili zapis za eGFP ter mu preko previsov na vsako stran dodali 100 bp zaporedje, ki je bilo homologno tarčnemu genu na fagu. Z vključkom so nato preko elektroporacije transformirali ''E. coli'' BL21(DE3) in jih nato okužili s fagi T7. Ob vstopu fagne DNA v celico je prišlo do homologne rekombinacije z vključkom, pri čemer je nastala rekombinantna fagna DNA [9].

Bakterije so pred tem transformirali še s plazmidi pKDsgRNA, ki so vsebovali vodilno RNA (sgRNA) za enega izmed treh neesencialni fagni gen, in pCas9-CR4, ki je vseboval zapis za endonukleazo Cas9. Kompleks sgRNA-Cas9 prepozna tarčno zaporedje na fagni DNA divjega tipa (wt) in ga cepi, s čimer se zmanjša število novonastalih wt fagov.

=== Karakterizacija RNAi ===
Tekom karakterizacije RNAi komponente so jih zanimale tri stvari:
* Ali lahko z RNA-polimerazo T7 pridobijo shRNA s pravilno sekundarno strukturo in vitro?
* Ali se domena RBD iz proteina Fox-1 veže specifično na lasnično zanko shRNA?
* Ali predstavlja shRNA dober substrat za endonukleazo DICER?

In vitro translacijo s polimerazo T7 so izvedli s pomočjo kompleta reagentov T7 RiboMAX RNAi express kit (Promega). Uporabili so shRNA, ki je sestavljena iz: i) prepoznavnega zaporedja za eGFP, ii) zavoja, ki ga prepozna Fox-1 in iii) previsa GG na 3'-koncu ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407006 BBa_K3407006]) ter jo vstavili pod promotor T7 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407022 BBa_K3407022]). Sintetizirane shRNA so analizirali na Urea-PAGE.

Vezavo domene RBD iz Fox-1 na shRNA so preverjali s testom zamika elektroforezne mobilnosti (EMSA). ''E. coli'' BL21(DE3) so transformirali s prej omenjeno shRNA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407022 BBa_K3407022]) ter Fox-1 RBD ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407020 BBa_K3407020]) v molarnih razmerjih 1:1 ter 1:2. Eksperiment so ponovili še dvakrat; prvič so uporabili mutirano obliko Fox-1 RBD, ki naj bi imela nižjo afiniteto do shRNA ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407024 BBa_K3407024]), drugič pa z shRNA, ki ima dve mutaciji na zavoju ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407023 BBa_K3407023]) vzorce so analizirali na nativnem PAGE.

Ali bi DICER iz kobilic prepoznal ter procesiral shRNA do siRNA so preverili s tem, da so 400 ng shRNA inkubirali pri 25°C v pufru, ki je vseboval 0,2 µM DICER iz ''Drosophila melanogaster''. Po določenem času (1-5 h) so reakcijo prekinili s tekočim dušikom in vzorce analizirali na Urea-PAGE.

=== Matematični model ===
Delovanje PHOKUS so testirali s pomočjo matematičnega modela, ki so ga priredili po že obstoječem, ki sta ga zasnovala Beretta in Kuang [10]. Model vsebuje štiri spremenljivke: i) koncentracija zdravih bakterij, ii) koncentracija okuženih bakterij, iii) koncentracija fagov in iv) koncentracija toksinov ter spremlja spreminjanje le-teh skozi čas; pri tem upošteva iz eksperimentov/literature pridobljene parametre (npr. hitrost rasti in lize bakterij, maksimalna kapaciteta bakterij, hitrost propadanja fagov itd.). Model so kasneje dopolnili še z dodatnim korakom, kjer so upoštevali razvoj rezistence na fage. Model so evalvirali tako, da so bakterije E. coli okužili s fagi T7 in merili časovno odvisnost OD600 bakterij ter časovno odvisnost koncentracije fagov.

== Rezultati ==
Ekipi je tekom priprave rekombinantnih fagov T7 uspelo zamenjati vse tri neesencialne gene z metodo BRED, vendar so pri genih 0,6A in 1,1 opazili še neželene produkte, zato so v nadaljevanju uporabljali fage z zamenjanim genom 4,3. Kljub uporabi sistema CRISPR-Cas9 jim rekombinantnih fagov ni uspelo izolirati, saj so plaki še vedno vsebovali fage divjega tipa.

Tekom karakterizacije RNAi komponente so ugotovili, da lahko polimeraza T7 uspešno prepiše zapis za shRNA in vitro; prepisana shRNA pri tem tudi zavzame pravilno sekundarno strukturo (lasnična zanka). Eksperimenti z metodo EMSA so pokazali, da se RBD Fox-1 lahko veže tako tarčno kot tudi na mutirano shRNA, medtem ko se mutirana domena ne veže na nobeno. Domena se veže močneje pri molarnem razmerju 1:2. Ugotovili so tudi, da DICER iz ''D. melanogaster'' prepozna in procesira shRNA do siRNA, kar nakazuje, da je ima uporabljena shRNA potencial za utišanje genov kobilic v procesu RNAi.

Simulacije z matematičnim modelom so pokazale, da lahko insekticid proizvede zadostno količino toksinov, ki povzroči smrt osebkov v manj kot 7 dneh; hitrost razvoja rezistence na fage je prepočasna, da bi bistveno vplivala na produkcijo toksinov. Evalvacija modela je pokazala, da uporabljene enačbe in parametri odražajo realno stanje sistema.

== Zaključek ==
Na tekmovanju iGEM 2020 je na področju Hrana zmagala skupina študentov iz UT Delft. Pripravili so insekticid z imenom PHOKUS, ki temelji na uporabi rekombinantnih bakteriofagov, ki okužijo črevesno floro kobilic ter povzročijo sintezo toksina Cry7Ca1 ter shRNA. Uspelo jim je okarakterizirati posamezne komponente insekticida, z matematičnim modelom pa jim je uspelo dokazati, da lahko insekticid ubije kobilice v dovolj hitrem času.

Pred uporabo v praksi bi bilo treba opraviti še naslednje stvari:
* Preveriti toksičnost Cry7Ca1 za Schistocerca gregaria
* Priprava dostavljalnega proteina za olajšan transport shRNA iz lumna črevesa v hemolimfo
* Preizkusiti prepisovanje več shRNA v tandemu (tshRNA) in procesiranje le-te do posameznih shRNA z encimom Mini-3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3407018 BBa_K3407018])
* Preizkusiti koekspresijo shRNA z inhibitorji RNaz

== Viri ==
# D. A. Cullen, A. J. Cease, A. V. Latchininsky, A. Ayali, K. Berry, J. Buhl, R. De Keyser, B. Foquet, J. C. Hadrich, … S. M. Rogers: From Molecules to Management: Mechanisms and Consequences of Locust Phase Polyphenism. 1. izd., Elsevier Ltd. 2017, Let. 53.
# A. Roussi: Why gigantic locust swarms are challenging governments and researchers. Nature 2020, 579(7799), str. 330–330.
# L. Zhang, M. Lecoq, A. Latchininsky, D. Hunter: Locust and Grasshopper Management. Annu. Rev. Entomol. 2019, 64(1), str. 15–34.
# TU Delft iGEM Team https://2020.igem.org/Team:TUDelft (pridobljeno 19. 5. 2021).
# O. Lavy, U. Gophna, E. Gefen, A. Ayali: The effect of density-dependent phase on the locust gut bacterial composition. Front. Microbiol. 2019, 10(JAN), str. 1–8.
# Y. Wu, C.-F. Lei, D. Yi, P.-M. Liu, M.-Y. Gao: Novel Bacillus thuringiensis δ-Endotoxin Active against Locusta migratoria manilensis. Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77(10), str. 3227–3233.
# G. J. Hannon: RNA interference. Nature 2002, 418(6894), str. 244–251.
# S. D. Auweter, R. Fasan, L. Reymond, J. G. Underwood, D. L. Black, S. Pitsch, F. H.-T. Allain: Molecular basis of RNA recognition by the human alternative splicing factor Fox-1. EMBO J. 2006, 25(1), str. 163–173.
# L. J. Marinelli, M. Piuri, Z. Swigoňová, A. Balachandran, L. M. Oldfield, J. C. van Kessel, G. F. Hatfull: BRED: A Simple and Powerful Tool for Constructing Mutant and Recombinant Bacteriophage Genomes. PLoS One 2008, 3(12), str. e3957.
# E. Beretta, Y. Kuang: Modeling and analysis of a marine bacteriophage infection. Math. Biosci. 1998, 149(1), str. 57–76.

Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.

2021-04-07T20:23:50Z

Matija Ruparčič: /* POTEK EKSPERIMENTA */

== UVOD ==

Rekombinaza Dre izhaja iz bakteriofaga D6 in pripada družini tirozinskih rekombinaz. Deluje tako, da prepozna tarčna mesta rox, ki so sestavljena iz dveh 14 bp dolgih palindromskih ponovitev, med katerima se nahaja 4 bp dolg distančnik. Ob vezavi dveh rekombinaz na tarčni mesti, se le ti stakneta, pri čemer Dre cepi zaporedje znotraj distančnika, kar privede do izmenjave verig in s tem do rekombinacije [1,2].

Fotoinducibilno rekombinazo so pripravili na osnovi fuzije s cepljenimi proteini; rekombinazo Dre so cepili na dva nefunkcionalna fragmenta, ki se ne moreta več združiti skupaj, ter ju fuzirali s proteini iz fotodimerizacijskih sistemov. Ob prisotnosti svetlobe določene valovne dolžine fuzijska partnerja dimerizirata, pri čemer se fragmenta Dre združita v aktivno celoto [1, 3].

== POTEK EKSPERIMENTA ==

Ker kristalna struktura Dre še ni bila rešena, so raziskovalci potencialna mesta cepitve določili s pripravo modela kristalne strukture Dre na osnovi homologije z rekombinazo Cre. Pare fragmentov iz pridobljenih mest cepitev so dali čez dva presejalna testa. V prvem so kot fuzijska partnerja uporabili dimerizacijski Coh2 Docs, v drugem pa fotodimerizacijska sistema CRY2-CIB1 ter Magnets (nMag-pMag). Konstrukte s fuziranimi fragmenti so skupaj z reporterjem rox-stop-rox-Rluc preko transfekcije vnesli v celice HEK293T ter merili aktivnost luciferaze [1].

Sledila je optimizacija fotoinducibilne Dre (PA-Dre), pri čemer so uporabili najboljši par fragmentov iz presejalnih testov ter sistem Magnets. Tekom optimizacije so primerjali:
* različne kombinacije položajev fuzijskih partnerjev
* različne distančnike (L)
* vpliv jedrskega lokalizacijskega signala (NLS)

Delovanje PA-Dre so nato okarakterizirali v ''in vitro'' ter ''in vivo'' pogojih. Pri poskusih ''in vitro'' so v transficiranih celicah primerjali izražanje reporterskih proteinov v odvisnosti od časa izpostavljenosti ter intenzitete modre svetlobe. Dodatno so preverjali še prostorsko odvisnost delovanja PA-Dre z uporabo maske, ki je prepuščala svetlobo le na določenih delih. V sklopu ''in vivo'' eksperimentov so mišim v repno veno injicirali plazmida s PA-Dre in reporterskim proteinom, jih obsevali 8 h ter izmerili signal. Rezultate so primerjali z mišmi, katerim so injicirali PA-Cre [1].

Za konec so zasnovali sistem CALID (Cre-activated light-inducible Dre), ki je sestavljen iz:
* rekombinaze Cre (na svojem vektorju ali že prisotna kot transgen v organizmu)
* vektor z inverzno orientiranim zapisom za PA-Dre, ki je obdan z mesti lox v inverzni orientaciji
* tarčni gen, ki je obdan z mesti rox

Sistem so testirali tako, da so inverzno orientiran zapis za PA-Dre preko virusnega vektorja AAV9 vnesli v možgane rekombinantnih miši, ki so izražale rekombinazo Cre samo v celicah internevronov, ki proizvajajo parvalbumin (PV), poleg tega pa so vsebovale transgen z reporterskim proteinom, pred katerim je bil z mesti rox obdan stop kodon. Mišje možgane so en teden po injekciji obsevali z modro svetlobo preko optičnih vlaken in spremljali signal. Negativno kontrolo so predstavljale miši, ki so bile ves čas v temi [1].

== REZULTATI ==

Pri presejalnih testih so najmočnejše signale in najboljše razmerje signal/šum dobili s parom fragmentov DreN246/DreC247, fuzirana s proteini iz sistema Magnets [1].

Tekom optimizacije so ugotovili, da najboljše rezultate izkazujeta konstrukta: DreN246-L4-nMag in pMag-L4-DreN247-NLSNLP [1].

''In vitro'' eksperimenti so pokazali, da intenziteta signala reporterskega proteina narašča s časom obsevanja in se nasiči pri 32 urah. Poleg tega tudi narašča z intenziteto svetlobe; nasiči se pri intenziteti 1 mW/cm2. Pri eksperimentu z masko je prišlo do signala samo na mestih, kjer je svetloba lahko prehajala čez masko. ''In vivo'' eksperimenti so pokazali, da PA-Dre deluje tudi v živih organizmih, poleg tega pa je bilo prisotnega manj šuma kot pri PA-Cre [1].

Za konec so ugotovili, da je sistem CALID učinkovit za urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah; signal reporterskega proteina so namreč zaznali samo v celicah internevronov PV, poleg tega pa signal ni bilo prisoten pri negativnih kontrolah. Ugotovili so tudi, da intenziteta in čas obsevanja tudi v tem primeru vplivata na količino celic, ki izražajo reporterski protein [1].

== ZAKLJUČEK ==

Raziskovalna skupina je razvila rekombinazo Dre, ki se preko sistema Magnets aktivira v prisotnosti modre svetlobe. S presejalnimi testi in optimizacijo so dobili sistem, ki izkazuje visoko učinkovitost in odlično razmerje signal/šum. Z ''in vitro'' in ''in vivo'' poskusi so dokazali, da je PA-Dre učinkovita tudi v živih organizmih in je prostorsko ter časovno odvisna, s poskusi na sistemu CALID pa so dokazali, da le ta predstavlja uporabno orodje za urejanje genoma v specifičnih vrstah celic [1].

== VIRI ==

# H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.
# K. Anastassiadis, J. Fu, C. Patsch, S. Hu, S. Weidlich, K. Duerschke, F. Buchholz, F. Edenhofer, A. F. Stewart: Dre recombinase, like Cre, is a highly efficient site-specific recombinase in E. coli, mammalian cells and mice. DMM Dis. Model. Mech. 2009, 2(9–10), str. 508–515.
# L. Benedetti, J. S. Marvin, H. Falahati, A. Guillén-Samander, L. L. Looger, P. De Camilli: Optimized vivid-derived magnets photodimerizers for subcellular optogenetics in mammalian cells. Elife 2020, 9, str. 1–49.

Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.

2021-04-07T07:45:16Z

Matija Ruparčič: /* REZULTATI */

== UVOD ==

Rekombinaza Dre izhaja iz bakteriofaga D6 in pripada družini tirozinskih rekombinaz. Deluje tako, da prepozna tarčna mesta rox, ki so sestavljena iz dveh 14 bp dolgih palindromskih ponovitev, med katerima se nahaja 4 bp dolg distančnik. Ob vezavi dveh rekombinaz na tarčni mesti, se le ti stakneta, pri čemer Dre cepi zaporedje znotraj distančnika, kar privede do izmenjave verig in s tem do rekombinacije [1,2].

Fotoinducibilno rekombinazo so pripravili na osnovi fuzije s cepljenimi proteini; rekombinazo Dre so cepili na dva nefunkcionalna fragmenta, ki se ne moreta več združiti skupaj, ter ju fuzirali s proteini iz fotodimerizacijskih sistemov. Ob prisotnosti svetlobe določene valovne dolžine fuzijska partnerja dimerizirata, pri čemer se fragmenta Dre združita v aktivno celoto [1, 3].

== POTEK EKSPERIMENTA ==

Ker kristalna struktura Dre še ni bila rešena, so raziskovalci potencialna mesta cepitve določili s pripravo modela kristalne strukture Dre na osnovi homologije z rekombinazo Cre. Pare fragmentov iz pridobljenih mest cepitev so dali čez dva presejalna testa. V prvem so kot fuzijska partnerja uporabili dimerizacijski Coh2 Docs, v drugem pa fotodimerizacijska sistema CRY2-CIB1 ter Magnets (nMag-pMag). Konstrukte s fuziranimi fragmenti so skupaj z reporterjem rox-stop-rox-Rluc preko transfekcije vnesli v celice HEK293T ter merili aktivnost luciferaze [1].

Sledila je optimizacija fotoinducibilne Dre (PA-Dre), pri čemer so uporabili najboljši par fragmentov iz presejalnih testov ter sistem Magnets. Tekom optimizacije so primerjali:
* različne kombinacije položajev fuzijskih partnerjev
* različne distančnike (L)
* vpliv jedrskega lokalizacijskega signala (NLS)

Delovanje PA-Dre so nato preverili v ''in vitro'' ter ''in vivo'' pogojih. Pri poskusih ''in vitro'' so v transficiranih celicah primerjali izražanje reporterskih proteinov v odvisnosti od časa izpostavljenosti ter intenzitete modre svetlobe. Dodatno so preverjali še prostorsko odvisnost delovanja PA-Dre z uporabo maske, ki je prepuščala svetlobo le na določenih delih. V sklopu ''in vivo'' eksperimentov so mišim v repno veno injicirali plazmida s PA-Dre in reporterskim proteinom, jih obsevali 8 h ter izmerili signal. Rezultate so primerjali z mišmi, katerim so injicirali PA-Cre [1].

Za konec so zasnovali sistem CALID (Cre-activated light-inducible Dre), ki je sestavljen iz:
* rekombinaze Cre (na svojem vektorju ali že prisotna kot transgen v organizmu)
* vektor z inverzno orientiranim zapisom za PA-Dre, ki je obdan z mesti lox v inverzni orientaciji
* tarčni gen, ki je obdan z mesti rox

Sistem so testirali tako, da so inverzno orientiran zapis za PA-Dre preko virusnega vektorja AAV9 vnesli v možgane rekombinantnih miši, ki so izražale rekombinazo Cre samo v celicah internevronov, ki proizvajajo parvalbumin (PV), poleg tega pa so vsebovale transgen z reporterskim proteinom, pred katerim je bil z mesti rox obdan stop kodon. Mišje možgane so en teden po injekciji obsevali z modro svetlobo preko optičnih vlaken in spremljali signal. Negativno kontrolo so predstavljale miši, ki so bile ves čas v temi [1].

== REZULTATI ==

Pri presejalnih testih so najmočnejše signale in najboljše razmerje signal/šum dobili s parom fragmentov DreN246/DreC247, fuzirana s proteini iz sistema Magnets [1].

Tekom optimizacije so ugotovili, da najboljše rezultate izkazujeta konstrukta: DreN246-L4-nMag in pMag-L4-DreN247-NLSNLP [1].

''In vitro'' eksperimenti so pokazali, da intenziteta signala reporterskega proteina narašča s časom obsevanja in se nasiči pri 32 urah. Poleg tega tudi narašča z intenziteto svetlobe; nasiči se pri intenziteti 1 mW/cm2. Pri eksperimentu z masko je prišlo do signala samo na mestih, kjer je svetloba lahko prehajala čez masko. ''In vivo'' eksperimenti so pokazali, da PA-Dre deluje tudi v živih organizmih, poleg tega pa je bilo prisotnega manj šuma kot pri PA-Cre [1].

Za konec so ugotovili, da je sistem CALID učinkovit za urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah; signal reporterskega proteina so namreč zaznali samo v celicah internevronov PV, poleg tega pa signal ni bilo prisoten pri negativnih kontrolah. Ugotovili so tudi, da intenziteta in čas obsevanja tudi v tem primeru vplivata na količino celic, ki izražajo reporterski protein [1].

== ZAKLJUČEK ==

Raziskovalna skupina je razvila rekombinazo Dre, ki se preko sistema Magnets aktivira v prisotnosti modre svetlobe. S presejalnimi testi in optimizacijo so dobili sistem, ki izkazuje visoko učinkovitost in odlično razmerje signal/šum. Z ''in vitro'' in ''in vivo'' poskusi so dokazali, da je PA-Dre učinkovita tudi v živih organizmih in je prostorsko ter časovno odvisna, s poskusi na sistemu CALID pa so dokazali, da le ta predstavlja uporabno orodje za urejanje genoma v specifičnih vrstah celic [1].

== VIRI ==

# H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.
# K. Anastassiadis, J. Fu, C. Patsch, S. Hu, S. Weidlich, K. Duerschke, F. Buchholz, F. Edenhofer, A. F. Stewart: Dre recombinase, like Cre, is a highly efficient site-specific recombinase in E. coli, mammalian cells and mice. DMM Dis. Model. Mech. 2009, 2(9–10), str. 508–515.
# L. Benedetti, J. S. Marvin, H. Falahati, A. Guillén-Samander, L. L. Looger, P. De Camilli: Optimized vivid-derived magnets photodimerizers for subcellular optogenetics in mammalian cells. Elife 2020, 9, str. 1–49.

Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.

2021-04-07T07:44:41Z

Matija Ruparčič: /* REZULTATI */

== UVOD ==

Rekombinaza Dre izhaja iz bakteriofaga D6 in pripada družini tirozinskih rekombinaz. Deluje tako, da prepozna tarčna mesta rox, ki so sestavljena iz dveh 14 bp dolgih palindromskih ponovitev, med katerima se nahaja 4 bp dolg distančnik. Ob vezavi dveh rekombinaz na tarčni mesti, se le ti stakneta, pri čemer Dre cepi zaporedje znotraj distančnika, kar privede do izmenjave verig in s tem do rekombinacije [1,2].

Fotoinducibilno rekombinazo so pripravili na osnovi fuzije s cepljenimi proteini; rekombinazo Dre so cepili na dva nefunkcionalna fragmenta, ki se ne moreta več združiti skupaj, ter ju fuzirali s proteini iz fotodimerizacijskih sistemov. Ob prisotnosti svetlobe določene valovne dolžine fuzijska partnerja dimerizirata, pri čemer se fragmenta Dre združita v aktivno celoto [1, 3].

== POTEK EKSPERIMENTA ==

Ker kristalna struktura Dre še ni bila rešena, so raziskovalci potencialna mesta cepitve določili s pripravo modela kristalne strukture Dre na osnovi homologije z rekombinazo Cre. Pare fragmentov iz pridobljenih mest cepitev so dali čez dva presejalna testa. V prvem so kot fuzijska partnerja uporabili dimerizacijski Coh2 Docs, v drugem pa fotodimerizacijska sistema CRY2-CIB1 ter Magnets (nMag-pMag). Konstrukte s fuziranimi fragmenti so skupaj z reporterjem rox-stop-rox-Rluc preko transfekcije vnesli v celice HEK293T ter merili aktivnost luciferaze [1].

Sledila je optimizacija fotoinducibilne Dre (PA-Dre), pri čemer so uporabili najboljši par fragmentov iz presejalnih testov ter sistem Magnets. Tekom optimizacije so primerjali:
* različne kombinacije položajev fuzijskih partnerjev
* različne distančnike (L)
* vpliv jedrskega lokalizacijskega signala (NLS)

Delovanje PA-Dre so nato preverili v ''in vitro'' ter ''in vivo'' pogojih. Pri poskusih ''in vitro'' so v transficiranih celicah primerjali izražanje reporterskih proteinov v odvisnosti od časa izpostavljenosti ter intenzitete modre svetlobe. Dodatno so preverjali še prostorsko odvisnost delovanja PA-Dre z uporabo maske, ki je prepuščala svetlobo le na določenih delih. V sklopu ''in vivo'' eksperimentov so mišim v repno veno injicirali plazmida s PA-Dre in reporterskim proteinom, jih obsevali 8 h ter izmerili signal. Rezultate so primerjali z mišmi, katerim so injicirali PA-Cre [1].

Za konec so zasnovali sistem CALID (Cre-activated light-inducible Dre), ki je sestavljen iz:
* rekombinaze Cre (na svojem vektorju ali že prisotna kot transgen v organizmu)
* vektor z inverzno orientiranim zapisom za PA-Dre, ki je obdan z mesti lox v inverzni orientaciji
* tarčni gen, ki je obdan z mesti rox

Sistem so testirali tako, da so inverzno orientiran zapis za PA-Dre preko virusnega vektorja AAV9 vnesli v možgane rekombinantnih miši, ki so izražale rekombinazo Cre samo v celicah internevronov, ki proizvajajo parvalbumin (PV), poleg tega pa so vsebovale transgen z reporterskim proteinom, pred katerim je bil z mesti rox obdan stop kodon. Mišje možgane so en teden po injekciji obsevali z modro svetlobo preko optičnih vlaken in spremljali signal. Negativno kontrolo so predstavljale miši, ki so bile ves čas v temi [1].

== REZULTATI ==

Pri presejalnih testih so najmočnejše signale in najboljše razmerje signal/šum dobili s parom fragmentov DreN246/DreC247, fuzirana s proteini iz sistema Magnets [1].

Tekom optimizacije so ugotovili, da najboljše rezultate izkazujeta konstrukta: DreN246-L4-nMag in pMag-L4-DreN247-NLSNLP [1].

''In vitro'' eksperimenti so pokazali, da intenziteta signala reporterskega proteina narašča s časom obsevanja in se nasiči pri 32 urah. Poleg tega tudi narašča z intenziteto svetlobe; nasiči se pri intenziteti 1 mW/cm2. Pri eksperimentu z masko je prišlo do signala samo na mestih, kjer je svetloba lahko prehajala čez masko. ''In vivo'' eksperimenti so pokazali, da PA Dre deluje tudi v živih organizmih, poleg tega pa je bilo prisotnega manj šuma kot pri PA Cre [1].

Za konec so ugotovili, da je sistem CALID učinkovit za urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah; signal reporterskega proteina so namreč zaznali samo v celicah internevronov PV, poleg tega pa signal ni bilo prisoten pri negativnih kontrolah. Ugotovili so tudi, da intenziteta in čas obsevanja tudi v tem primeru vplivata na količino celic, ki izražajo reporterski protein [1].

== ZAKLJUČEK ==

Raziskovalna skupina je razvila rekombinazo Dre, ki se preko sistema Magnets aktivira v prisotnosti modre svetlobe. S presejalnimi testi in optimizacijo so dobili sistem, ki izkazuje visoko učinkovitost in odlično razmerje signal/šum. Z ''in vitro'' in ''in vivo'' poskusi so dokazali, da je PA-Dre učinkovita tudi v živih organizmih in je prostorsko ter časovno odvisna, s poskusi na sistemu CALID pa so dokazali, da le ta predstavlja uporabno orodje za urejanje genoma v specifičnih vrstah celic [1].

== VIRI ==

# H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.
# K. Anastassiadis, J. Fu, C. Patsch, S. Hu, S. Weidlich, K. Duerschke, F. Buchholz, F. Edenhofer, A. F. Stewart: Dre recombinase, like Cre, is a highly efficient site-specific recombinase in E. coli, mammalian cells and mice. DMM Dis. Model. Mech. 2009, 2(9–10), str. 508–515.
# L. Benedetti, J. S. Marvin, H. Falahati, A. Guillén-Samander, L. L. Looger, P. De Camilli: Optimized vivid-derived magnets photodimerizers for subcellular optogenetics in mammalian cells. Elife 2020, 9, str. 1–49.

Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.

2021-04-07T07:44:23Z

Matija Ruparčič: /* REZULTATI */

== UVOD ==

Rekombinaza Dre izhaja iz bakteriofaga D6 in pripada družini tirozinskih rekombinaz. Deluje tako, da prepozna tarčna mesta rox, ki so sestavljena iz dveh 14 bp dolgih palindromskih ponovitev, med katerima se nahaja 4 bp dolg distančnik. Ob vezavi dveh rekombinaz na tarčni mesti, se le ti stakneta, pri čemer Dre cepi zaporedje znotraj distančnika, kar privede do izmenjave verig in s tem do rekombinacije [1,2].

Fotoinducibilno rekombinazo so pripravili na osnovi fuzije s cepljenimi proteini; rekombinazo Dre so cepili na dva nefunkcionalna fragmenta, ki se ne moreta več združiti skupaj, ter ju fuzirali s proteini iz fotodimerizacijskih sistemov. Ob prisotnosti svetlobe določene valovne dolžine fuzijska partnerja dimerizirata, pri čemer se fragmenta Dre združita v aktivno celoto [1, 3].

== POTEK EKSPERIMENTA ==

Ker kristalna struktura Dre še ni bila rešena, so raziskovalci potencialna mesta cepitve določili s pripravo modela kristalne strukture Dre na osnovi homologije z rekombinazo Cre. Pare fragmentov iz pridobljenih mest cepitev so dali čez dva presejalna testa. V prvem so kot fuzijska partnerja uporabili dimerizacijski Coh2 Docs, v drugem pa fotodimerizacijska sistema CRY2-CIB1 ter Magnets (nMag-pMag). Konstrukte s fuziranimi fragmenti so skupaj z reporterjem rox-stop-rox-Rluc preko transfekcije vnesli v celice HEK293T ter merili aktivnost luciferaze [1].

Sledila je optimizacija fotoinducibilne Dre (PA-Dre), pri čemer so uporabili najboljši par fragmentov iz presejalnih testov ter sistem Magnets. Tekom optimizacije so primerjali:
* različne kombinacije položajev fuzijskih partnerjev
* različne distančnike (L)
* vpliv jedrskega lokalizacijskega signala (NLS)

Delovanje PA-Dre so nato preverili v ''in vitro'' ter ''in vivo'' pogojih. Pri poskusih ''in vitro'' so v transficiranih celicah primerjali izražanje reporterskih proteinov v odvisnosti od časa izpostavljenosti ter intenzitete modre svetlobe. Dodatno so preverjali še prostorsko odvisnost delovanja PA-Dre z uporabo maske, ki je prepuščala svetlobo le na določenih delih. V sklopu ''in vivo'' eksperimentov so mišim v repno veno injicirali plazmida s PA-Dre in reporterskim proteinom, jih obsevali 8 h ter izmerili signal. Rezultate so primerjali z mišmi, katerim so injicirali PA-Cre [1].

Za konec so zasnovali sistem CALID (Cre-activated light-inducible Dre), ki je sestavljen iz:
* rekombinaze Cre (na svojem vektorju ali že prisotna kot transgen v organizmu)
* vektor z inverzno orientiranim zapisom za PA-Dre, ki je obdan z mesti lox v inverzni orientaciji
* tarčni gen, ki je obdan z mesti rox

Sistem so testirali tako, da so inverzno orientiran zapis za PA-Dre preko virusnega vektorja AAV9 vnesli v možgane rekombinantnih miši, ki so izražale rekombinazo Cre samo v celicah internevronov, ki proizvajajo parvalbumin (PV), poleg tega pa so vsebovale transgen z reporterskim proteinom, pred katerim je bil z mesti rox obdan stop kodon. Mišje možgane so en teden po injekciji obsevali z modro svetlobo preko optičnih vlaken in spremljali signal. Negativno kontrolo so predstavljale miši, ki so bile ves čas v temi [1].

== REZULTATI ==

Pri presejalnih testih so najmočnejše signale in najboljše razmerje signal/šum dobili s parom fragmentov DreN246/DreC247, fuzirana s proteini iz sistema Magnets [1].

Tekom optimizacije so ugotovili, da najboljše rezultate izkazujeta konstrukta: DreN246-L4-nMag in pMag-L4-DreN247-NLSNLP [1].

''In vitro'' eksperimenti so pokazali, da intenziteta signala reporterskega proteina narašča s časom obsevanja in se nasiči pri 32 urah. Poleg tega tudi narašča z intenziteto svetlobe; nasiči se pri intenziteti 1 mW/cm2. Pri eksperimentu z masko je prišlo do signala samo na mestih, kjer je svetloba lahko prehajala čez masko. ''In vivo'' eksperimenti so pokazali, da PA Dre deluje tudi v živih organizmih, poleg tega pa je bilo prisotnega manj šuma kot pri PA Cre [1].
Za konec so ugotovili, da je sistem CALID učinkovit za urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah; signal reporterskega proteina so namreč zaznali samo v celicah internevronov PV, poleg tega pa signal ni bilo prisoten pri negativnih kontrolah. Ugotovili so tudi, da intenziteta in čas obsevanja tudi v tem primeru vplivata na količino celic, ki izražajo reporterski protein [1].

== ZAKLJUČEK ==

Raziskovalna skupina je razvila rekombinazo Dre, ki se preko sistema Magnets aktivira v prisotnosti modre svetlobe. S presejalnimi testi in optimizacijo so dobili sistem, ki izkazuje visoko učinkovitost in odlično razmerje signal/šum. Z ''in vitro'' in ''in vivo'' poskusi so dokazali, da je PA-Dre učinkovita tudi v živih organizmih in je prostorsko ter časovno odvisna, s poskusi na sistemu CALID pa so dokazali, da le ta predstavlja uporabno orodje za urejanje genoma v specifičnih vrstah celic [1].

== VIRI ==

# H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.
# K. Anastassiadis, J. Fu, C. Patsch, S. Hu, S. Weidlich, K. Duerschke, F. Buchholz, F. Edenhofer, A. F. Stewart: Dre recombinase, like Cre, is a highly efficient site-specific recombinase in E. coli, mammalian cells and mice. DMM Dis. Model. Mech. 2009, 2(9–10), str. 508–515.
# L. Benedetti, J. S. Marvin, H. Falahati, A. Guillén-Samander, L. L. Looger, P. De Camilli: Optimized vivid-derived magnets photodimerizers for subcellular optogenetics in mammalian cells. Elife 2020, 9, str. 1–49.

Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.

2021-04-07T07:43:31Z

Matija Ruparčič: /* REZULTATI */

== UVOD ==

Rekombinaza Dre izhaja iz bakteriofaga D6 in pripada družini tirozinskih rekombinaz. Deluje tako, da prepozna tarčna mesta rox, ki so sestavljena iz dveh 14 bp dolgih palindromskih ponovitev, med katerima se nahaja 4 bp dolg distančnik. Ob vezavi dveh rekombinaz na tarčni mesti, se le ti stakneta, pri čemer Dre cepi zaporedje znotraj distančnika, kar privede do izmenjave verig in s tem do rekombinacije [1,2].

Fotoinducibilno rekombinazo so pripravili na osnovi fuzije s cepljenimi proteini; rekombinazo Dre so cepili na dva nefunkcionalna fragmenta, ki se ne moreta več združiti skupaj, ter ju fuzirali s proteini iz fotodimerizacijskih sistemov. Ob prisotnosti svetlobe določene valovne dolžine fuzijska partnerja dimerizirata, pri čemer se fragmenta Dre združita v aktivno celoto [1, 3].

== POTEK EKSPERIMENTA ==

Ker kristalna struktura Dre še ni bila rešena, so raziskovalci potencialna mesta cepitve določili s pripravo modela kristalne strukture Dre na osnovi homologije z rekombinazo Cre. Pare fragmentov iz pridobljenih mest cepitev so dali čez dva presejalna testa. V prvem so kot fuzijska partnerja uporabili dimerizacijski Coh2 Docs, v drugem pa fotodimerizacijska sistema CRY2-CIB1 ter Magnets (nMag-pMag). Konstrukte s fuziranimi fragmenti so skupaj z reporterjem rox-stop-rox-Rluc preko transfekcije vnesli v celice HEK293T ter merili aktivnost luciferaze [1].

Sledila je optimizacija fotoinducibilne Dre (PA-Dre), pri čemer so uporabili najboljši par fragmentov iz presejalnih testov ter sistem Magnets. Tekom optimizacije so primerjali:
* različne kombinacije položajev fuzijskih partnerjev
* različne distančnike (L)
* vpliv jedrskega lokalizacijskega signala (NLS)

Delovanje PA-Dre so nato preverili v ''in vitro'' ter ''in vivo'' pogojih. Pri poskusih ''in vitro'' so v transficiranih celicah primerjali izražanje reporterskih proteinov v odvisnosti od časa izpostavljenosti ter intenzitete modre svetlobe. Dodatno so preverjali še prostorsko odvisnost delovanja PA-Dre z uporabo maske, ki je prepuščala svetlobo le na določenih delih. V sklopu ''in vivo'' eksperimentov so mišim v repno veno injicirali plazmida s PA-Dre in reporterskim proteinom, jih obsevali 8 h ter izmerili signal. Rezultate so primerjali z mišmi, katerim so injicirali PA-Cre [1].

Za konec so zasnovali sistem CALID (Cre-activated light-inducible Dre), ki je sestavljen iz:
* rekombinaze Cre (na svojem vektorju ali že prisotna kot transgen v organizmu)
* vektor z inverzno orientiranim zapisom za PA-Dre, ki je obdan z mesti lox v inverzni orientaciji
* tarčni gen, ki je obdan z mesti rox

Sistem so testirali tako, da so inverzno orientiran zapis za PA-Dre preko virusnega vektorja AAV9 vnesli v možgane rekombinantnih miši, ki so izražale rekombinazo Cre samo v celicah internevronov, ki proizvajajo parvalbumin (PV), poleg tega pa so vsebovale transgen z reporterskim proteinom, pred katerim je bil z mesti rox obdan stop kodon. Mišje možgane so en teden po injekciji obsevali z modro svetlobo preko optičnih vlaken in spremljali signal. Negativno kontrolo so predstavljale miši, ki so bile ves čas v temi [1].

== REZULTATI ==

Pri presejalnih testih so najmočnejše signale in najboljše razmerje signal/šum dobili s parom fragmentov DreN246/DreC247, fuzirana s proteini iz sistema Magnets [1].
Tekom optimizacije so ugotovili, da najboljše rezultate izkazujeta konstrukta: DreN246-L4-nMag in pMag-L4-DreN247-NLSDreNNLP [1].

''In vitro'' eksperimenti so pokazali, da intenziteta signala reporterskega proteina narašča s časom obsevanja in se nasiči pri 32 urah. Poleg tega tudi narašča z intenziteto svetlobe; nasiči se pri intenziteti 1 mW/cm2. Pri eksperimentu z masko je prišlo do signala samo na mestih, kjer je svetloba lahko prehajala čez masko. ''In vivo'' eksperimenti so pokazali, da PA Dre deluje tudi v živih organizmih, poleg tega pa je bilo prisotnega manj šuma kot pri PA Cre [1].
Za konec so ugotovili, da je sistem CALID učinkovit za urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah; signal reporterskega proteina so namreč zaznali samo v celicah internevronov PV, poleg tega pa signal ni bilo prisoten pri negativnih kontrolah. Ugotovili so tudi, da intenziteta in čas obsevanja tudi v tem primeru vplivata na količino celic, ki izražajo reporterski protein [1].

== ZAKLJUČEK ==

Raziskovalna skupina je razvila rekombinazo Dre, ki se preko sistema Magnets aktivira v prisotnosti modre svetlobe. S presejalnimi testi in optimizacijo so dobili sistem, ki izkazuje visoko učinkovitost in odlično razmerje signal/šum. Z ''in vitro'' in ''in vivo'' poskusi so dokazali, da je PA-Dre učinkovita tudi v živih organizmih in je prostorsko ter časovno odvisna, s poskusi na sistemu CALID pa so dokazali, da le ta predstavlja uporabno orodje za urejanje genoma v specifičnih vrstah celic [1].

== VIRI ==

# H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.
# K. Anastassiadis, J. Fu, C. Patsch, S. Hu, S. Weidlich, K. Duerschke, F. Buchholz, F. Edenhofer, A. F. Stewart: Dre recombinase, like Cre, is a highly efficient site-specific recombinase in E. coli, mammalian cells and mice. DMM Dis. Model. Mech. 2009, 2(9–10), str. 508–515.
# L. Benedetti, J. S. Marvin, H. Falahati, A. Guillén-Samander, L. L. Looger, P. De Camilli: Optimized vivid-derived magnets photodimerizers for subcellular optogenetics in mammalian cells. Elife 2020, 9, str. 1–49.

MBT seminarji 2021

2021-04-06T21:27:25Z

Matija Ruparčič:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah:

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.) 
# An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.) 

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)

'''Gensko spremenjene živali in celične linije''' 
# Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout "et. al"; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)
# Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse (H. Li ''et. al''; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117(52), 2021; https://doi.org/10.1073/pnas.2003991117). [[Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.]] Matija Ruparčič (8.4.)

'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti''' 
# Saša Slabe (14.4.)
# Luka Gnidovec (15.4.)
# Liza Ulčakar (15.4.)

'''Biotehnološki polimeri''' 
# Anže Karlek (21.4.)
# Ana Maklin (22.4.)
# Urban Hribar (22.4.)

'''Biotehnološko pridobljeni encimi''' 
# Urška Fajdiga (5.5.)
# Mirsad Mešić (6.5.)
# Martina Lokar (6.5.)

'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji''' 
# Jerneja Nimac (12.5.)
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)
# Klementina Polanec (13.5.)
# Ernestina Lavrih (13.5.)

'''Biomasa in biogoriva''' 
# Željka Erić (19.5.)
# Karin Dobravc Škof (20.5.)
# Katja Doberšek (20.5.)

'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija''' 
# Almina Tahirović (26.5.)
# Eva Keber (27.5.)
# Nina Lukančič (27.5.)

Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.

2021-04-06T21:21:31Z

Matija Ruparčič:

== UVOD ==

Rekombinaza Dre izhaja iz bakteriofaga D6 in pripada družini tirozinskih rekombinaz. Deluje tako, da prepozna tarčna mesta rox, ki so sestavljena iz dveh 14 bp dolgih palindromskih ponovitev, med katerima se nahaja 4 bp dolg distančnik. Ob vezavi dveh rekombinaz na tarčni mesti, se le ti stakneta, pri čemer Dre cepi zaporedje znotraj distančnika, kar privede do izmenjave verig in s tem do rekombinacije [1,2].

Fotoinducibilno rekombinazo so pripravili na osnovi fuzije s cepljenimi proteini; rekombinazo Dre so cepili na dva nefunkcionalna fragmenta, ki se ne moreta več združiti skupaj, ter ju fuzirali s proteini iz fotodimerizacijskih sistemov. Ob prisotnosti svetlobe določene valovne dolžine fuzijska partnerja dimerizirata, pri čemer se fragmenta Dre združita v aktivno celoto [1, 3].

== POTEK EKSPERIMENTA ==

Ker kristalna struktura Dre še ni bila rešena, so raziskovalci potencialna mesta cepitve določili s pripravo modela kristalne strukture Dre na osnovi homologije z rekombinazo Cre. Pare fragmentov iz pridobljenih mest cepitev so dali čez dva presejalna testa. V prvem so kot fuzijska partnerja uporabili dimerizacijski Coh2 Docs, v drugem pa fotodimerizacijska sistema CRY2-CIB1 ter Magnets (nMag-pMag). Konstrukte s fuziranimi fragmenti so skupaj z reporterjem rox-stop-rox-Rluc preko transfekcije vnesli v celice HEK293T ter merili aktivnost luciferaze [1].

Sledila je optimizacija fotoinducibilne Dre (PA-Dre), pri čemer so uporabili najboljši par fragmentov iz presejalnih testov ter sistem Magnets. Tekom optimizacije so primerjali:
* različne kombinacije položajev fuzijskih partnerjev
* različne distančnike (L)
* vpliv jedrskega lokalizacijskega signala (NLS)

Delovanje PA-Dre so nato preverili v ''in vitro'' ter ''in vivo'' pogojih. Pri poskusih ''in vitro'' so v transficiranih celicah primerjali izražanje reporterskih proteinov v odvisnosti od časa izpostavljenosti ter intenzitete modre svetlobe. Dodatno so preverjali še prostorsko odvisnost delovanja PA-Dre z uporabo maske, ki je prepuščala svetlobo le na določenih delih. V sklopu ''in vivo'' eksperimentov so mišim v repno veno injicirali plazmida s PA-Dre in reporterskim proteinom, jih obsevali 8 h ter izmerili signal. Rezultate so primerjali z mišmi, katerim so injicirali PA-Cre [1].

Za konec so zasnovali sistem CALID (Cre-activated light-inducible Dre), ki je sestavljen iz:
* rekombinaze Cre (na svojem vektorju ali že prisotna kot transgen v organizmu)
* vektor z inverzno orientiranim zapisom za PA-Dre, ki je obdan z mesti lox v inverzni orientaciji
* tarčni gen, ki je obdan z mesti rox

Sistem so testirali tako, da so inverzno orientiran zapis za PA-Dre preko virusnega vektorja AAV9 vnesli v možgane rekombinantnih miši, ki so izražale rekombinazo Cre samo v celicah internevronov, ki proizvajajo parvalbumin (PV), poleg tega pa so vsebovale transgen z reporterskim proteinom, pred katerim je bil z mesti rox obdan stop kodon. Mišje možgane so en teden po injekciji obsevali z modro svetlobo preko optičnih vlaken in spremljali signal. Negativno kontrolo so predstavljale miši, ki so bile ves čas v temi [1].

== REZULTATI ==

Pri presejalnih testih so najmočnejše signale in najboljše razmerje signal/šum rezultate dobili s parom fragmentov DreN246/DreC247, fuzirana s proteini iz sistema Magnets [1].
Tekom optimizacije so ugotovili, da najboljše rezultate izkazujeta konstrukta: DreN246-L4-nMag in pMag-L4-DreN247-NLSDreNNLP [1].

''In vitro'' eksperimenti so pokazali, da intenziteta signala reporterskega proteina narašča s časom obsevanja in se nasiči pri 32 urah. Poleg tega tudi narašča z intenziteto svetlobe; nasiči se pri intenziteti 1 mW/cm2. Pri eksperimentu z masko je prišlo do signala samo na mestih, kjer je svetloba lahko prehajala čez masko. ''In vivo'' eksperimenti so pokazali, da PA Dre deluje tudi v živih organizmih, poleg tega pa je bilo prisotnega manj šuma kot pri PA Cre [1].
Za konec so ugotovili, da je sistem CALID učinkovit za urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah; signal reporterskega proteina so namreč zaznali samo v celicah internevronov PV, poleg tega pa signal ni bilo prisoten pri negativnih kontrolah. Ugotovili so tudi, da intenziteta in čas obsevanja tudi v tem primeru vplivata na količino celic, ki izražajo reporterski protein [1].

== ZAKLJUČEK ==

Raziskovalna skupina je razvila rekombinazo Dre, ki se preko sistema Magnets aktivira v prisotnosti modre svetlobe. S presejalnimi testi in optimizacijo so dobili sistem, ki izkazuje visoko učinkovitost in odlično razmerje signal/šum. Z ''in vitro'' in ''in vivo'' poskusi so dokazali, da je PA-Dre učinkovita tudi v živih organizmih in je prostorsko ter časovno odvisna, s poskusi na sistemu CALID pa so dokazali, da le ta predstavlja uporabno orodje za urejanje genoma v specifičnih vrstah celic [1].

== VIRI ==

# H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.
# K. Anastassiadis, J. Fu, C. Patsch, S. Hu, S. Weidlich, K. Duerschke, F. Buchholz, F. Edenhofer, A. F. Stewart: Dre recombinase, like Cre, is a highly efficient site-specific recombinase in E. coli, mammalian cells and mice. DMM Dis. Model. Mech. 2009, 2(9–10), str. 508–515.
# L. Benedetti, J. S. Marvin, H. Falahati, A. Guillén-Samander, L. L. Looger, P. De Camilli: Optimized vivid-derived magnets photodimerizers for subcellular optogenetics in mammalian cells. Elife 2020, 9, str. 1–49.

Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.

2021-04-06T21:20:26Z

Matija Ruparčič:

== UVOD ==

Rekombinaza Dre izhaja iz bakteriofaga D6 in pripada družini tirozinskih rekombinaz. Deluje tako, da prepozna tarčna mesta rox, ki so sestavljena iz dveh 14 bp dolgih palindromskih ponovitev, med katerima se nahaja 4 bp dolg distančnik. Ob vezavi dveh rekombinaz na tarčni mesti, se le ti stakneta, pri čemer Dre cepi zaporedje znotraj distančnika, kar privede do izmenjave verig in s tem do rekombinacije [1,2].

Fotoinducibilno rekombinazo so pripravili na osnovi fuzije s cepljenimi proteini; rekombinazo Dre so cepili na dva nefunkcionalna fragmenta, ki se ne moreta več združiti skupaj, ter ju fuzirali s proteini iz fotodimerizacijskih sistemov. Ob prisotnosti svetlobe določene valovne dolžine fuzijska partnerja dimerizirata, pri čemer se fragmenta Dre združita v aktivno celoto [1, 3].

== POTEK EKSPERIMENTA ==

Ker kristalna struktura Dre še ni bila rešena, so raziskovalci potencialna mesta cepitve določili s pripravo modela kristalne strukture Dre na osnovi homologije z rekombinazo Cre. Pare fragmentov iz pridobljenih mest cepitev so dali čez dva presejalna testa. V prvem so kot fuzijska partnerja uporabili dimerizacijski Coh2 Docs, v drugem pa fotodimerizacijska sistema CRY2-CIB1 ter Magnets (nMag-pMag). Konstrukte s fuziranimi fragmenti so skupaj z reporterjem rox-stop-rox-Rluc preko transfekcije vnesli v celice HEK293T ter merili aktivnost luciferaze [1].

Sledila je optimizacija fotoinducibilne Dre (PA-Dre), pri čemer so uporabili najboljši par fragmentov iz presejalnih testov ter sistem Magnets. Tekom optimizacije so primerjali:
* različne kombinacije položajev fuzijskih partnerjev
* različne distančnike (L)
* vpliv jedrskega lokalizacijskega signala (NLS)

Delovanje PA-Dre so nato preverili v in vitro ter in vivo pogojih. Pri poskusih in vitro so v transficiranih celicah primerjali izražanje reporterskih proteinov v odvisnosti od časa izpostavljenosti ter intenzitete modre svetlobe. Dodatno so preverjali še prostorsko odvisnost delovanja PA-Dre z uporabo maske, ki je prepuščala svetlobo le na določenih delih. V sklopu in vivo eksperimentov so mišim v repno veno injicirali plazmida s PA-Dre in reporterskim proteinom, jih obsevali 8 h ter izmerili signal. Rezultate so primerjali z mišmi, katerim so injicirali PA-Cre [1].

Za konec so zasnovali sistem CALID (Cre-activated light-inducible Dre), ki je sestavljen iz:
* rekombinaze Cre (na svojem vektorju ali že prisotna kot transgen v organizmu)
* vektor z inverzno orientiranim zapisom za PA-Dre, ki je obdan z mesti lox v inverzni orientaciji
* tarčni gen, ki je obdan z mesti rox

Sistem so testirali tako, da so inverzno orientiran zapis za PA-Dre preko virusnega vektorja AAV9 vnesli v možgane rekombinantnih miši, ki so izražale rekombinazo Cre samo v celicah internevronov, ki proizvajajo parvalbumin (PV), poleg tega pa so vsebovale transgen z reporterskim proteinom, pred katerim je bil z mesti rox obdan stop kodon. Mišje možgane so en teden po injekciji obsevali z modro svetlobo preko optičnih vlaken in spremljali signal. Negativno kontrolo so predstavljale miši, ki so bile ves čas v temi [1].

== REZULTATI ==

Pri presejalnih testih so najmočnejše signale in najboljše razmerje signal/šum rezultate dobili s parom fragmentov DreN246/DreC247, fuzirana s proteini iz sistema Magnets [1].
Tekom optimizacije so ugotovili, da najboljše rezultate izkazujeta konstrukta: DreN246-L4-nMag in pMag-L4-DreN247-NLSDreNNLP [1].

In vitro eksperimenti so pokazali, da intenziteta signala reporterskega proteina narašča s časom obsevanja in se nasiči pri 32 urah. Poleg tega tudi narašča z intenziteto svetlobe; nasiči se pri intenziteti 1 mW/cm2. Pri eksperimentu z masko je prišlo do signala samo na mestih, kjer je svetloba lahko prehajala čez masko. In vivo eksperimenti so pokazali, da PA Dre deluje tudi v živih organizmih, poleg tega pa je bilo prisotnega manj šuma kot pri PA Cre [1].
Za konec so ugotovili, da je sistem CALID učinkovit za urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah; signal reporterskega proteina so namreč zaznali samo v celicah internevronov PV, poleg tega pa signal ni bilo prisoten pri negativnih kontrolah. Ugotovili so tudi, da intenziteta in čas obsevanja tudi v tem primeru vplivata na količino celic, ki izražajo reporterski protein [1].

== ZAKLJUČEK ==

Raziskovalna skupina je razvila rekombinazo Dre, ki se preko sistema Magnets aktivira v prisotnosti modre svetlobe. S presejalnimi testi in optimizacijo so dobili sistem, ki izkazuje visoko učinkovitost in odlično razmerje signal/šum. Z in vitro in in vivo poskusi so dokazali, da je PA-Dre učinkovita tudi v živih organizmih in je prostorsko ter časovno odvisna, s poskusi na sistemu CALID pa so dokazali, da le ta predstavlja uporabno orodje za urejanje genoma v specifičnih vrstah celic [1].

== VIRI ==

# H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.
# K. Anastassiadis, J. Fu, C. Patsch, S. Hu, S. Weidlich, K. Duerschke, F. Buchholz, F. Edenhofer, A. F. Stewart: Dre recombinase, like Cre, is a highly efficient site-specific recombinase in E. coli, mammalian cells and mice. DMM Dis. Model. Mech. 2009, 2(9–10), str. 508–515.
# L. Benedetti, J. S. Marvin, H. Falahati, A. Guillén-Samander, L. L. Looger, P. De Camilli: Optimized vivid-derived magnets photodimerizers for subcellular optogenetics in mammalian cells. Elife 2020, 9, str. 1–49.

Značilnosti cepiva proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)

2021-03-23T22:01:39Z

Matija Ruparčič:

Cepivo britansko-švedskega farmacevtskega podjetja AstraZeneca je namenjeno zaščiti pred okužbo z virusom SARS-CoV-2, ki povzroča bolezen COVID-19. Deluje po principu vektorskega sistema z adenovirusom; cepivo vsebuje gensko spremenjen šimpanzji adenovirus ChAdOx1, ki kodira glikoprotein Spike virusa SARS-CoV-2, poleg tega pa so mu bili izbrisani geni, ki so ključni za replikacijo in transkripcijo adenovirusne DNA. Gensko spremenjeni adenovirusi po cepljenju vstopijo v človeške celice, kjer v jedro sprostijo rekombinantno DNA. Tam nato preko transkripcije nastane mRNA, ki vsebuje informacijo za sintezo proteina Spike, nato pa se le-ta transportira v citoplazmo, kjer se prične sinteza proteina. Nastali glikoprotein Spike sam po sebi sicer ni nevaren, vendar pa ga celica prepozna kot tujega in zato sproži imunski odgovor, pri čemer nastanejo protitelesa, ki specifično prepoznajo ter nevtralizirajo protein. Cepljenje omogoča telesu vzpostaviti dovolj veliko zalogo protiteles ter imunskih celic, ki bodo ob morebitni okužbi prepoznali proteine Spike na virusu
SARS-CoV-2 in ga pravočasno uničili, preden bi prišlo do razvoja bolezni.

Priprava cepiva se začne s sintezo rekombinantne adenovirusne DNA. S pomočjo homologne rekombinacije se iz DNA divjega tipa adenovirusa ChAdOx1 izbriše gen E1, ki je ključen za aktivacijo vseh ostalih adenovirusnih genov, na njegovo mesto pa se umesti gen, ki vsebuje informacijo za sintezo glikoproteina Spike. Poleg tega se izbriše tudi gen E3, ki za pripravo gensko spremenjenjih adenovirusov ni potreben, del gena E4 pa se zamenja z ekvivalentom iz človeškega adenovirusa HuAd5. Sintetizirana DNA se nato preko transfekcije vnese v gensko spremenjene človeške embrionalne ledvične celice (HEK293), ki v genomu vsebujejo gen E1 iz adenovirusa HuAd5; s tem pride do trans-komplementacije in tako do tvorbe novih rekombinantnih adenovirusov, ki se jih izolira preko ultracentrifugacije z gradientom CsCl. Izoliranim virusom se za konec dodajo še pomožne snovi, ki služijo kot emulgatorji, uravnalci pH in prezervativi.

Cepivo se injicira v mišico (intramuskularno), in sicer v odmerku 0,5 mL. Če želimo doseči največjo možno zaščito, ki jo cepivo nudi, se je potrebno po 12 tednih cepiti še z drugim odmerkom; s tem dosežemo 82 % zaščito. Cepivo je primerno za osebe starejše od 18 let. Zaradi nukleokapside adenovirusa, ki ščiti rekombinantno DNA, vektorskih cepiv ni potrebno hraniti pri zelo nizkih temperaturah, zato jih hranimo v hladilniku (2-8 °C), kjer so obstojna nekaj mesecev.

----

Viri in literatura:

# Assessment report COVID-19 Vaccine AstraZeneca. Ema, 2021 https://www.ema.europa.eu/en/medicines/human/EPAR/covid-19-vaccine-astrazeneca?fbclid=IwAR081Lvs179VBlNzxf0OOvZoJZliM9818ORbuliEiytkH-gGVi0MouiDAZs#authorisation-details-section (pridobljeno 19. 3. 2021).
# M. D. J. Dicks, A. J. Spencer, N. J. Edwards, G. Wadell, K. Bojang, S. C. Gilbert, A. V. S. Hill, M. G. Cottingham: A novel chimpanzee adenovirus vector with low human seroprevalence: Improved systems for vector derivation and comparative immunogenicity. PLoS One 2012, 7(7).
# S. Singh, R. Kumar, B. Agrawal: Adenoviral Vector-Based Vaccines and Gene Therapies: Current Status and Future Prospects. Adenoviruses 2019.
# P. M. Folegatti, K. J. Ewer, P. K. Aley, B. Angus, S. Becker, S. Belij-Rammerstorfer, D. Bellamy, S. Bibi, M. Bittaye, … Y. Yau: Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. Lancet 2020, 396(10249), str. 467–478.
# N. van Doremalen, T. Lambe, A. Spencer, S. Belij-Rammerstorfer, J. N. Purushotham, J. R. Port, V. A. Avanzato, T. Bushmaker, A. Flaxman, … V. J. Munster: ChAdOx1 nCoV-19 vaccine prevents SARS-CoV-2 pneumonia in rhesus macaques. Nature 2020, 586(7830), str. 578–582.
# A. Almuqrin, A. Davidson, M. K. Williamson, P. Lewis, K. Heesom, S. Morris, S. Gilbert, D. Matthews: SARS-CoV-2 candidate vaccine ChAdOx1 nCoV-19 infection of human cell lines reveals a normal low range of viral backbone gene expression alongside very high levels of SARS-CoV-2 S glycoprotein expression. Genome Med. 2020, str. 1–17.

Značilnosti cepiva proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)

2021-03-23T21:59:33Z

Matija Ruparčič:

Cepivo britansko-švedskega farmacevtskega podjetja AstraZeneca je namenjeno zaščiti pred okužbo z virusom SARS-CoV-2, ki povzroča bolezen COVID-19. Deluje po principu vektorskega sistema z adenovirusom; cepivo vsebuje gensko spremenjen šimpanzji adenovirus ChAdOx1, ki kodira glikoprotein Spike virusa SARS-CoV-2, poleg tega pa so mu bili izbrisani geni, ki so ključni za replikacijo in transkripcijo adenovirusne DNA. Gensko spremenjeni adenovirusi po cepljenju vstopijo v človeške celice, kjer v jedro sprostijo rekombinantno DNA. Tam nato preko transkripcije nastane mRNA, ki vsebuje informacijo za sintezo proteina Spike, nato pa se le-ta transportira v citoplazmo, kjer se prične sinteza proteina. Nastali glikoprotein Spike sam po sebi sicer ni nevaren, vendar pa ga celica prepozna kot tujega in zato sproži imunski odgovor, pri čemer nastanejo protitelesa, ki specifično prepoznajo ter nevtralizirajo protein. Cepljenje omogoča telesu vzpostaviti dovolj veliko zalogo protiteles ter imunskih celic, ki bodo ob morebitni okužbi prepoznali proteine Spike na virusu
SARS-CoV-2 in ga pravočasno uničili preden bi prišlo do razvoja bolezni.

Priprava cepiva se začne s sintezo rekombinantne adenovirusne DNA. S pomočjo homologne rekombinacije se iz DNA divjega tipa adenovirusa ChAdOx1 izbriše gen E1, ki je ključen za aktivacijo vseh ostalih adenovirusnih genov, na njegovo mesto pa se umesti gen, ki vsebuje informacijo za sintezo glikoproteina Spike. Poleg tega se izbriše tudi gen E3, ki za pripravo gensko spremenjenjih adenovirusov ni potreben, del gena E4 pa se zamenja z ekvivalentom iz človeškega adenovirusa HuAd5. Sintetizirana DNA se nato preko transfekcije vnese v gensko spremenjene človeške embrionalne ledvične celice (HEK293), ki v genomu vsebujejo gen E1 iz adenovirusa HuAd5; s tem pride do trans-komplementacije in tako do tvorbe novih rekombinantnih adenovirusov, ki se jih izolira preko ultracentrifugacije z gradientom CsCl. Izoliranim virusom se za konec dodajo še pomožne snovi, ki služijo kot emulgator, uravnalci pH in prezervativi.

Cepivo se injicira v mišico (intramuskularno), in sicer v odmerku 0,5 mL. Če želimo doseči največjo možno zaščito, ki jo cepivo nudi, se je potrebno po 12 tednih cepiti še z drugim odmerkom; s tem dosežemo 82 % zaščito. Cepivo je primerno za osebe starejše od 18 let. Zaradi nukleokapside adenovirusa, ki ščiti rekombinantno DNA, vektorskih cepiv ni potrebno hraniti pri zelo nizkih temperaturah, zato jih hranimo v hladilniku (2-8 °C), kjer so obstojna nekaj mesecev.

----

Viri in literatura:

# Assessment report COVID-19 Vaccine AstraZeneca. Ema, 2021 https://www.ema.europa.eu/en/medicines/human/EPAR/covid-19-vaccine-astrazeneca?fbclid=IwAR081Lvs179VBlNzxf0OOvZoJZliM9818ORbuliEiytkH-gGVi0MouiDAZs#authorisation-details-section (pridobljeno 19. 3. 2021).
# M. D. J. Dicks, A. J. Spencer, N. J. Edwards, G. Wadell, K. Bojang, S. C. Gilbert, A. V. S. Hill, M. G. Cottingham: A novel chimpanzee adenovirus vector with low human seroprevalence: Improved systems for vector derivation and comparative immunogenicity. PLoS One 2012, 7(7).
# S. Singh, R. Kumar, B. Agrawal: Adenoviral Vector-Based Vaccines and Gene Therapies: Current Status and Future Prospects. Adenoviruses 2019.
# P. M. Folegatti, K. J. Ewer, P. K. Aley, B. Angus, S. Becker, S. Belij-Rammerstorfer, D. Bellamy, S. Bibi, M. Bittaye, … Y. Yau: Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. Lancet 2020, 396(10249), str. 467–478.
# N. van Doremalen, T. Lambe, A. Spencer, S. Belij-Rammerstorfer, J. N. Purushotham, J. R. Port, V. A. Avanzato, T. Bushmaker, A. Flaxman, … V. J. Munster: ChAdOx1 nCoV-19 vaccine prevents SARS-CoV-2 pneumonia in rhesus macaques. Nature 2020, 586(7830), str. 578–582.
# A. Almuqrin, A. Davidson, M. K. Williamson, P. Lewis, K. Heesom, S. Morris, S. Gilbert, D. Matthews: SARS-CoV-2 candidate vaccine ChAdOx1 nCoV-19 infection of human cell lines reveals a normal low range of viral backbone gene expression alongside very high levels of SARS-CoV-2 S glycoprotein expression. Genome Med. 2020, str. 1–17.

Značilnosti cepiva proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)

2021-03-23T21:58:21Z

Matija Ruparčič:

Cepivo britansko-švedskega farmacevtskega podjetja AstraZeneca je namenjeno zaščiti pred okužbo z virusom SARS-CoV-2, ki povzroča bolezen COVID-19. Deluje po principu vektorskega sistema z adenovirusom; cepivo vsebuje gensko spremenjen šimpanzji adenovirus ChAdOx1, ki kodira glikoprotein Spike virusa SARS-CoV-2, poleg tega pa so mu bili izbrisani geni, ki so ključni za replikacijo in transkripcijo adenovirusne DNA. Gensko spremenjeni adenovirusi po cepljenju vstopijo v človeške celice, kjer v jedro sprostijo rekombinantno DNA. Tam nato preko transkripcije nastane mRNA, ki vsebuje informacijo za sintezo proteina Spike, nato pa se le-ta transportira v citoplazmo, kjer se prične sinteza proteina. Nastali glikoprotein Spike sam po sebi sicer ni nevaren, vendar pa ima zaradi tujosti antigenske lastnosti in zato sproži imunski odgovor, pri čemer nastanejo protitelesa, ki specifično prepoznajo ter nevtralizirajo protein. Cepljenje omogoča telesu vzpostaviti dovolj veliko zalogo protiteles ter imunskih celic, ki bodo ob morebitni okužbi prepoznali proteine Spike na virusu
SARS-CoV-2 in ga pravočasno uničili preden bi prišlo do razvoja bolezni.

Priprava cepiva se začne s sintezo rekombinantne adenovirusne DNA. S pomočjo homologne rekombinacije se iz DNA divjega tipa adenovirusa ChAdOx1 izbriše gen E1, ki je ključen za aktivacijo vseh ostalih adenovirusnih genov, na njegovo mesto pa se umesti gen, ki vsebuje informacijo za sintezo glikoproteina Spike. Poleg tega se izbriše tudi gen E3, ki za pripravo gensko spremenjenjih adenovirusov ni potreben, del gena E4 pa se zamenja z ekvivalentom iz človeškega adenovirusa HuAd5. Sintetizirana DNA se nato preko transfekcije vnese v gensko spremenjene človeške embrionalne ledvične celice (HEK293), ki v genomu vsebujejo gen E1 iz adenovirusa HuAd5; s tem pride do trans-komplementacije in tako do tvorbe novih rekombinantnih adenovirusov, ki se jih izolira preko ultracentrifugacije z gradientom CsCl. Izoliranim virusom se za konec dodajo še pomožne snovi, ki služijo kot emulgator, uravnalci pH in prezervativi.

Cepivo se injicira v mišico (intramuskularno), in sicer v odmerku 0,5 mL. Če želimo doseči največjo možno zaščito, ki jo cepivo nudi, se je potrebno po 12 tednih cepiti še z drugim odmerkom; s tem dosežemo 82 % zaščito. Cepivo je primerno za osebe starejše od 18 let. Zaradi nukleokapside adenovirusa, ki ščiti rekombinantno DNA, vektorskih cepiv ni potrebno hraniti pri zelo nizkih temperaturah, zato jih hranimo v hladilniku (2-8 °C), kjer so obstojna nekaj mesecev.

----

Viri in literatura:

# Assessment report COVID-19 Vaccine AstraZeneca. Ema, 2021 https://www.ema.europa.eu/en/medicines/human/EPAR/covid-19-vaccine-astrazeneca?fbclid=IwAR081Lvs179VBlNzxf0OOvZoJZliM9818ORbuliEiytkH-gGVi0MouiDAZs#authorisation-details-section (pridobljeno 19. 3. 2021).
# M. D. J. Dicks, A. J. Spencer, N. J. Edwards, G. Wadell, K. Bojang, S. C. Gilbert, A. V. S. Hill, M. G. Cottingham: A novel chimpanzee adenovirus vector with low human seroprevalence: Improved systems for vector derivation and comparative immunogenicity. PLoS One 2012, 7(7).
# S. Singh, R. Kumar, B. Agrawal: Adenoviral Vector-Based Vaccines and Gene Therapies: Current Status and Future Prospects. Adenoviruses 2019.
# P. M. Folegatti, K. J. Ewer, P. K. Aley, B. Angus, S. Becker, S. Belij-Rammerstorfer, D. Bellamy, S. Bibi, M. Bittaye, … Y. Yau: Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. Lancet 2020, 396(10249), str. 467–478.
# N. van Doremalen, T. Lambe, A. Spencer, S. Belij-Rammerstorfer, J. N. Purushotham, J. R. Port, V. A. Avanzato, T. Bushmaker, A. Flaxman, … V. J. Munster: ChAdOx1 nCoV-19 vaccine prevents SARS-CoV-2 pneumonia in rhesus macaques. Nature 2020, 586(7830), str. 578–582.
# A. Almuqrin, A. Davidson, M. K. Williamson, P. Lewis, K. Heesom, S. Morris, S. Gilbert, D. Matthews: SARS-CoV-2 candidate vaccine ChAdOx1 nCoV-19 infection of human cell lines reveals a normal low range of viral backbone gene expression alongside very high levels of SARS-CoV-2 S glycoprotein expression. Genome Med. 2020, str. 1–17.

Protikovidna cepiva

2021-03-23T21:56:28Z

Matija Ruparčič:

študentski seminar pri predmetu Molekularna biotehnologija 2020/21 
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo 
Magistrski študij Biokemija 

Seminar pripravljajo študentje 1. in 2. letnika magistrskega študija. Kratki povzetki morajo biti napisani na taki ravni zahtevnosti, da so razumljivi širši javnosti. Predstavitve seminarjev (6 oz. 12 minut) imajo splošen uvod in strokovno nadaljevanje. Vsebina temelji na javno dostopnih podatkih v času priprave seminarja. Po zadnji seminarski predstavitvi bomo predvidoma izdali zbornih povzetkov, ki bo vključeval tudi slikovne razlage. Poleg tega seminarja morajo študentje pripraviti tudi daljšo predstavitev teme iz znanstvene literature.

Razpored predstavitev:

# [[Molekularnobiološke značilnosti SARS-CoV-2 in aktualni mutanti (južnoafriški, britanski, nigerijski,...)]] - 11.3. (12 min) 
# [[Interakcija SARS-CoV-2 s tarčno celico]] - 11.3. (6 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca Moderna (mRNA)]] - 18.3. (12 min) 
# [[Rezultati kliničnih testiranj cepiva proizvajalca Moderna (mRNA) ]] - 18.3.(6 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)]] - 25.3. (12 min) 
# Rezultati kliničnih testiranj proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1) - 25.3. (6 min) 
# Značilnosti cepiva proizvajalca Pfizer / BioNTech (mRNA) - 1.4. (12 min) 
# Rezultati kliničnih testiranj cepiva proizvajalca Pfizer / BioNTech (mRNA) - 1.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva proizvajalca Johnson&Johnson / Jennsen (Ad26) - 8.4. (6 min) 
# Opuščena cepiva: Merck (IAVI, Themix), Imperial College London, Univ. of Queensland - 8.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Sputnik V (Gamaleya) (Ad26, Ad5) - 15.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva CanSino (Ad5) - 15.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiv Sinopharm in Sinovac (inaktivirano) - 22.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Bharat Biotech (inaktivirano) - 22.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Novavax (proteinsko) - 6.5. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Vector Institute (proteinsko) - 6.5. (6 min) 
# Značilnosti cepiva EpiVacCorona (peptidno) - 13.5. (6 min) 
nerazporejeno:
# Značilnosti cepiva Zyadus Cadilla (DNA) - 13.5. 
# Značilnosti cepiva COVAXX / UBI (peptidno) - 20.5.

Značilnosti cepiva proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)

2021-03-23T21:54:43Z

Matija Ruparčič:

Cepivo britansko-švedskega farmacevtskega podjetja AstraZeneca je namenjeno zaščiti pred okužbo z virusom SARS-CoV-2, ki povzroča bolezen COVID-19. Deluje po principu vektorskega sistema z adenovirusom; cepivo vsebuje gensko spremenjen šimpanzji adenovirus ChAdOx1, ki kodira glikoprotein Spike virusa SARS-CoV-2, poleg tega pa so mu bili izbrisani geni, ki so ključni za replikacijo in transkripcijo adenovirusne DNA. Gensko spremenjeni adenovirusi po cepljenju vstopijo v človeške celice, kjer v jedro sprostijo rekombinantno DNA. Tam nato preko transkripcije nastane mRNA, ki vsebuje informacijo za sintezo proteina Spike, nato pa se le ta transportira v citoplazmo, kjer se prične sinteza proteina. Nastali glikoprotein Spike sam po sebi sicer ni nevaren, vendar pa ima zaradi tujosti antigenske lastnosti in zato sproži imunski odgovor, pri čemer nastanejo protitelesa, ki specifično prepoznajo ter nevtralizirajo protein. Cepljenje omogoča telesu vzpostaviti dovolj veliko zalogo protiteles ter imunskih celic, ki bodo ob morebitni okužbi prepoznali proteine Spike na virusu
SARS-CoV-2 in ga pravočasno uničili preden bi prišlo do razvoja bolezni.

Priprava cepiva se začne s sintezo rekombinantne adenovirusne DNA. S pomočjo homologne rekombinacije se iz DNA divjega tipa adenovirusa ChAdOx1 izbriše gen E1, ki je ključen za aktivacijo vseh ostalih adenovirusnih genov, na njegovo mesto pa se umesti gen, ki vsebuje informacijo za sintezo glikoproteina Spike. Poleg tega se izbriše tudi gen E3, ki za pripravo gensko spremenjenjih adenovirusov ni potreben, del gena E4 pa se zamenja z ekvivalentom iz človeškega adenovirusa HuAd5. Sintetizirana DNA se nato preko transfekcije vnese v gensko spremenjene človeške embrionalne ledvične celice (HEK293), ki v genomu vsebujejo gen E1 iz adenovirusa HuAd5; s tem pride do trans-komplementacije in tako do tvorbe novih rekombinantnih adenovirusov, ki se jih izolira preko ultracentrifugacije z gradientom CsCl. Izoliranim virusom se za konec dodajo še pomožne snovi, ki služijo kot emulgator, uravnalci pH in prezervativi.

Cepivo se injicira v mišico (intramuskularno), in sicer v odmerku 0,5 mL. Če želimo doseči največjo možno zaščito, ki jo cepivo nudi, se je potrebno po 12 tednih cepiti še z drugim odmerkom; s tem dosežemo 82 % zaščito. Cepivo je primerno za osebe starejše od 18 let. Zaradi nukleokapside adenovirusa, ki ščiti rekombinantno DNA, vektorskih cepiv ni potrebno hraniti pri zelo nizkih temperaturah, zato jih hranimo v hladilniku (2-8 °C), kjer so obstojna nekaj mesecev.

----

Viri in literatura:

# Assessment report COVID-19 Vaccine AstraZeneca. Ema, 2021 https://www.ema.europa.eu/en/medicines/human/EPAR/covid-19-vaccine-astrazeneca?fbclid=IwAR081Lvs179VBlNzxf0OOvZoJZliM9818ORbuliEiytkH-gGVi0MouiDAZs#authorisation-details-section (pridobljeno 19. 3. 2021).
# M. D. J. Dicks, A. J. Spencer, N. J. Edwards, G. Wadell, K. Bojang, S. C. Gilbert, A. V. S. Hill, M. G. Cottingham: A novel chimpanzee adenovirus vector with low human seroprevalence: Improved systems for vector derivation and comparative immunogenicity. PLoS One 2012, 7(7).
# S. Singh, R. Kumar, B. Agrawal: Adenoviral Vector-Based Vaccines and Gene Therapies: Current Status and Future Prospects. Adenoviruses 2019.
# P. M. Folegatti, K. J. Ewer, P. K. Aley, B. Angus, S. Becker, S. Belij-Rammerstorfer, D. Bellamy, S. Bibi, M. Bittaye, … Y. Yau: Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. Lancet 2020, 396(10249), str. 467–478.
# N. van Doremalen, T. Lambe, A. Spencer, S. Belij-Rammerstorfer, J. N. Purushotham, J. R. Port, V. A. Avanzato, T. Bushmaker, A. Flaxman, … V. J. Munster: ChAdOx1 nCoV-19 vaccine prevents SARS-CoV-2 pneumonia in rhesus macaques. Nature 2020, 586(7830), str. 578–582.
# A. Almuqrin, A. Davidson, M. K. Williamson, P. Lewis, K. Heesom, S. Morris, S. Gilbert, D. Matthews: SARS-CoV-2 candidate vaccine ChAdOx1 nCoV-19 infection of human cell lines reveals a normal low range of viral backbone gene expression alongside very high levels of SARS-CoV-2 S glycoprotein expression. Genome Med. 2020, str. 1–17.

Značilnosti cepiva proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)

2021-03-23T21:53:35Z

Matija Ruparčič: New page: Cepivo britansko-švedskega farmacevtskega podjetja AstraZeneca je namenjeno zaščiti pred okužbo z virusom SARS CoV 2, ki povzroča bolezen COVID-19. Deluje po principu vektorskega sist...

Cepivo britansko-švedskega farmacevtskega podjetja AstraZeneca je namenjeno zaščiti pred okužbo z virusom SARS CoV 2, ki povzroča bolezen COVID-19. Deluje po principu vektorskega sistema z adenovirusom; cepivo vsebuje gensko spremenjen šimpanzji adenovirus ChAdOx1, ki kodira glikoprotein Spike virusa SARS-CoV-2, poleg tega pa so mu bili izbrisani geni, ki so ključni za replikacijo in transkripcijo adenovirusne DNA. Gensko spremenjeni adenovirusi po cepljenju vstopijo v človeške celice, kjer v jedro sprostijo rekombinantno DNA. Tam nato preko transkripcije nastane mRNA, ki vsebuje informacijo za sintezo proteina Spike, nato pa se le ta transportira v citoplazmo, kjer se prične sinteza proteina. Nastali glikoprotein Spike sam po sebi sicer ni nevaren, vendar pa ima zaradi tujosti antigenske lastnosti in zato sproži imunski odgovor, pri čemer nastanejo protitelesa, ki specifično prepoznajo ter nevtralizirajo protein. Cepljenje omogoča telesu vzpostaviti dovolj veliko zalogo protiteles ter imunskih celic, ki bodo ob morebitni okužbi prepoznali proteine Spike na virusu SARS CoV 2 in ga pravočasno uničili preden bi prišlo do razvoja bolezni.

Priprava cepiva se začne s sintezo rekombinantne adenovirusne DNA. S pomočjo homologne rekombinacije se iz DNA divjega tipa adenovirusa ChAdOx1 izbriše gen E1, ki je ključen za aktivacijo vseh ostalih adenovirusnih genov, na njegovo mesto pa se umesti gen, ki vsebuje informacijo za sintezo glikoproteina Spike. Poleg tega se izbriše tudi gen E3, ki za pripravo gensko spremenjenjih adenovirusov ni potreben, del gena E4 pa se zamenja z ekvivalentom iz človeškega adenovirusa HuAd5. Sintetizirana DNA se nato preko transfekcije vnese v gensko spremenjene človeške embrionalne ledvične celice (HEK293), ki v genomu vsebujejo gen E1 iz adenovirusa HuAd5; s tem pride do trans-komplementacije in tako do tvorbe novih rekombinantnih adenovirusov, ki se jih izolira preko ultracentrifugacije z gradientom CsCl. Izoliranim virusom se za konec dodajo še pomožne snovi, ki služijo kot emulgator, uravnalci pH in prezervativi.

Cepivo se injicira v mišico (intramuskularno), in sicer v odmerku 0,5 mL. Če želimo doseči največjo možno zaščito, ki jo cepivo nudi, se je potrebno po 12 tednih cepiti še z drugim odmerkom; s tem dosežemo 82 % zaščito. Cepivo je primerno za osebe starejše od 18 let. Zaradi nukleokapside adenovirusa, ki ščiti rekombinantno DNA, vektorskih cepiv ni potrebno hraniti pri zelo nizkih temperaturah, zato jih hranimo v hladilniku (2-8 °C), kjer so obstojna nekaj mesecev.

----

Viri in literatura:

# Assessment report COVID-19 Vaccine AstraZeneca. Ema, 2021 https://www.ema.europa.eu/en/medicines/human/EPAR/covid-19-vaccine-astrazeneca?fbclid=IwAR081Lvs179VBlNzxf0OOvZoJZliM9818ORbuliEiytkH-gGVi0MouiDAZs#authorisation-details-section (pridobljeno 19. 3. 2021).
# M. D. J. Dicks, A. J. Spencer, N. J. Edwards, G. Wadell, K. Bojang, S. C. Gilbert, A. V. S. Hill, M. G. Cottingham: A novel chimpanzee adenovirus vector with low human seroprevalence: Improved systems for vector derivation and comparative immunogenicity. PLoS One 2012, 7(7).
# S. Singh, R. Kumar, B. Agrawal: Adenoviral Vector-Based Vaccines and Gene Therapies: Current Status and Future Prospects. Adenoviruses 2019.
# P. M. Folegatti, K. J. Ewer, P. K. Aley, B. Angus, S. Becker, S. Belij-Rammerstorfer, D. Bellamy, S. Bibi, M. Bittaye, … Y. Yau: Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. Lancet 2020, 396(10249), str. 467–478.
# N. van Doremalen, T. Lambe, A. Spencer, S. Belij-Rammerstorfer, J. N. Purushotham, J. R. Port, V. A. Avanzato, T. Bushmaker, A. Flaxman, … V. J. Munster: ChAdOx1 nCoV-19 vaccine prevents SARS-CoV-2 pneumonia in rhesus macaques. Nature 2020, 586(7830), str. 578–582.
# A. Almuqrin, A. Davidson, M. K. Williamson, P. Lewis, K. Heesom, S. Morris, S. Gilbert, D. Matthews: SARS-CoV-2 candidate vaccine ChAdOx1 nCoV-19 infection of human cell lines reveals a normal low range of viral backbone gene expression alongside very high levels of SARS-CoV-2 S glycoprotein expression. Genome Med. 2020, str. 1–17.

MBT seminarji 2021

2021-03-10T15:26:47Z

Matija Ruparčič:

MBT seminarji 2021

2021-03-10T15:26:36Z

Matija Ruparčič:

BNT-seminar

2021-03-09T18:28:27Z

Matija Ruparčič:

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019058 
30200303 
30019363 
30019057 
30170131 
30170078 
30170177 
30200324 
30019063 
30170103 
30170002 
30200319 
30200309 
30200320 
30019056 
30200311 
30200306 
30170243 
30019051 
30170141 
30170061 
30019035 
30200316 
30170222 
30200317 
30170193 

| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
16.3.2021 
23.3.2021 
23.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
13.4.2021 
13.4.2021 
20.4.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
23.3.2021 
20.4.2020 
6.4.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
11.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
30.3.2021 
13.4.2021 
11.5.2021 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Aljaž Bratina 
Urban Hribar 
Sabina Sladič Oblak 
Barbara Slapnik 
Tina Kolenc Milavec 
Klementina Polanec 
Martin Špendl 
Tjaša Mlakar 
Sara Laznik 
Martina Lokar 
Doroteja Armič 
Martin Špendl 
Saša Slabe 
Mateja Žvipelj 
Špela Supej 
Urška Fajdiga 
Ernestina Lavrih 
Nika Mikulič Vernik 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Tadej Medved 
Urška Zagorc 
Nina Lukančič 
Urška Pečarič Strnad 
Anže Karlek 
Luka Gnidovec 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Urška Zagorc 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Sara Laznik 
Luka Gnidovec 
Irma Zeljković 
Jernej Imperl 
Barbara Slapnik 
Urša Lovše 
Mateja Žvipelj 
Neža Pavko 
Almina Tahirović 
Nika Mikulič Vernik 
Urška Fajdiga 
Saša Slabe 
Klementina Polanec 
Tjaša Mlakar 
Ajda Godec 
Jernej Imperl 
Špela Supej 
Aljaž Bratina 
Nina Lukančič 
Matija Ruparčič 
Anže Karlek 
Sabina S. Oblak 
Urban Hribar 
|-

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Povzetki seminarjev 2018

2018-11-24T00:44:13Z

Matija Ruparčič: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2018/2019 */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2018/2019 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2018 stran]

===Karmen Mlinar: Signalizacija in odzivi na abiotski stres pri rastlinah===
Rastline živijo v stalno spreminjajočem se okolju, ki je pogosto neugodno in stresno za njihovo rast in razvoj. Primer abiotskega stresa so suša, ekstremne temperature, slanost tal, pomanjkanje hranil v prsti ipd. Rastline lahko stres preživijo tako, da se mu prilagodijo ali pa izognejo. V nasprotnem primeru so obsojene na smrt. Identificiranih je le malo senzorjev, ki zaznavajo stres. Pri signalizaciji odzivov na stresna okolja pogosto sodeluje družina kinaz SnRK, ki zaznajo spremembe v energijskem statusu rastline, ki jih povzroči stres. Znane so tri poddružine SnRKs: SnRK1s, SnRK2s, ki sodelujejo pri osmotskem stresu in ABA signalizaciji, in SnRK3s, ki so ključni regulatorji ionske homeostaze pri spopadanju s solnim stresom. Pri ionskem stresu pogosto problem predstavlja Na+. Pri njegovi signalizaciji je ključna SOS signalna pot. Signalizacija temperaturnega stresa se začne s spremembami v fluidnosti membrane, kar zaznajo integralni membranski proteini. Pri signalizaciji pogosto sodelujejo tudi MAPKs, CPKs in stresni hormon ABA, pomembno vlogo pa nosijo sekundarni sporočevalci kot sta kalcij in ROS. Vse to stremi k vzpostavitvi ionske in vodne homeostaze ter celične stabilnosti v stresnem okolju. Z razumevanjem signalizacije stresa in odzivov, ki sledijo, bomo lahko izboljšali odpornost pridelkov na stres in s tem zagotovili kmetijsko stabilnost in preskrbo s hrano za rastoče svetovno prebivalstvo.

===Aljaž Bratina: Pomen različnih signalnih poti pri staranju===
Staranje je postopna izguba fiziološke integritete in vodi v prizadeto funkcionalnost ter povečano možnost za smrt. Hitremu staranju nasprotna je dolgoživost, to je stanje, v katerem organizem ne izgublja funkcionalnosti ali jo izgublja počasneje. Staranje lahko opredelimo z devetimi splošnimi lastnostmi, ki jih opazimo v večini organizmov. Pri preučevanju staranja opazujemo organizem C. elegans, ki lahko med razvojem v primeru neugodnih razmer razvije stanje dauer, v katerem je razvoj ustavljen in je tako organizem sposoben preživeti dalj časa. Pri regulaciji staranja in dolgoživosti so pomembne mnoge celične signalne poti, kot del njih pa predvsem jedrni receptorji, ki uravnavajo prepisovanje genov, ki imajo vpliv na hitrost staranja oz. vzdrževanje dolgoživosti. V seminarski nalogi so opisane štiri pomembne signalne poti in njihov vpliv na staranje. Pri prvi je pomemben jedrni receptor DAF-12, ki za svoje delovanje potrebuje steroid DA. Neugodne razmere ga deaktivirajo, kar vodi v razvoj stanja dauer. Na dolgoživost pozitivno vpliva tudi aktiviran kompleks NSBP-1 in jedrnega receptorja DAF-16, ki sta del signalne poti IIS. To pot regulira tudi količina holesterola v celici. Dolgoživost povzročajo tudi prekinitveni post, pri katerem se aktivira jedrni receptor AP-1, pa tudi odstranitev zarodnih celic, ki poleg prej omenjene DAF-12 in DAF-16 aktivira tudi nekatere druge receptorje, npr. NHR-80 in NH3-49.

===Eva Gartner: Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi===
Wnt signalizacija zajema skupino signalnih poti, ki jih regulirajo wnt proteini. Ti se vežejo na posebne receptorje v membrani celice, preko katerih se signal prenese v notranjost. Wnt signalizacijo sestavljajo tri glavne signalizacijske poti: kanonična wnt pot, ki vključuje protein β-katenin, nekanonična (PCP) pot in nekanonična pot, ki sodeluje pri regulaciji kalcija. Vse poti se začnejo z vezavo wnt-liganda na transmembranske Fz receptorje in prenosom signala do znotrajceličnega proteina Dsh. Od tu naprej se poti razcepijo vsaka v svojo smer. Wnt signalizacija sodeluje v mnogih procesih, potrebnih za normalen razvoj organizma, kot so npr. razmnoževanje, specializacija in migracije celic. Prisotnost regulacije z wnt signalizacijo so odkrili tudi pri srčni fibrozi in z njo povezanih boleznih in poškodbah srca. V zdravih celicah wnt signalizacija navadno ni prisotna. Izraz fibroza se nanaša na povečanje količine zunajceličnega matriksa, zaradi česar postane srčna mišica otrdela in krčenje manj intenzivno. Pride do prekomerne namnožitve fibroblastov in diferenciacije v miofibroblaste, ki so fenotipsko med fibroblasti in mišičnimi celicami. Kljub številnim raziskavam, ki dokazujejo vpletenost wnt signalizacije v razvoju fibroze, natančni mehanizmi vseh signalnih poti še vedno niso znani. Potrebne so še nadaljnje raziskave za razumevanje zapletene celične komunikacije in odkritje novih terapevtskih možnosti.

===Neža Žerjav: Vloga kaspaz pri celični smrti===
Kaspaze so cisteinske peptidaze, ki sodelujejo v signalnih poteh celične smrti. Poznamo več vrst celične smrti, med njii tudi apoptozo, nekrozo, nekroptozo in piroptozo. Vloga kaspaz pri apoptozi je dobro znana, so adapterski proteini ali pa aktivno sodelujejo pri postopni razgradnji celice, saj sprožijo nastajanje apoptotskih veziklov in fagocitozo celice. Nekrozo označujemo kot neprogramirano celično smrt, vendar to za nekroptozo, ki ji pravimo tudi programirana nekroza, ne drži. Slednja je namreč v celici konkurenčna apoptozi, preko kaspaz sta recipročno regulirani. Nekroptozo kaspaze zavirajo, saj inhibirajo kompleks RIPK1/RIPK3, ki z aktivacijo proteina MLKL povzroči razlitje celične vsebine, značilno za nekrozo. Kaspaze sodelujejo tudi pri piroptozi, ki je posledica stresnih dejavnikov iz okolice – poškodb, patogenih organizmov ali njihovih toksinov. Kaspaze pri piroptozi povzročijo aktivacijo gasdermina D, ki sproži celično lizo, in vnetni odziv. Poznavanje delovanja kaspaz nam omogoča tako vpogled v razvoj in mehanizem vzdrževanja homeostaze organizmov, kakor tudi razumevanje patoloških procesov, na primer multiple in amiotrofične lateralne skleroze, ishemične bolezni srca ter vnetnih odzivov zaradi okužb.

===Meta Kodrič: Svetlobne signalne poti za uravnavanje fotomorfogeneze===
Svetloba je za rastline eden od najpomembnejših okoljskih signalov, ki vplivajo na rast in razvoj. V odvisnosti od intenzitete in valovne dolžine svetlobe se pri rastlinah pojavljata dva kontrastna razvojna procesa. Fotomorfogeneza je osnovna oblika rasti, saj rastlinam omogoča razvoj v avtotrofne organizme, sposobne opravljati fotosintezo, skotomorfogeneza pa je le zavrta oblika fotomorfogeneze, ki se odvija v temi. Potek teh dveh procesov rastline uravnavajo pod vplivom svetlobnega signala v svetlobni signalni poti. V njej sodelujejo fotoreceptorji ter pozitivni in negativni regulatorji fotomorfogeneze. V temi se fotoreceptor fitokrom nahaja v biološko neaktivni obliki v citosolu rastlinske celice. Negativni regulatorji se tako lahko v jedru prosto vežejo na druge molekule. Transkripcijski faktorji PIF se v obliki dimerov vežejo na promotorske regije na molekuli DNA in s tem preprečijo prepisovanje genov za fotomorfogenezo. Proteini COP/DET/FUS delujejo kot E3 ligaze pozitivnih regulatorjev HY5, HFR1, LAF1 in tako sodelujejo pri njihovi razgradnji. Z vzajemnim delovanjem tako negativni regulatorji zatirajo potek fotomorfogeneze. Na svetlobi se fitokrom konformacijsko spremeni in preide v jedro. Tam v sodelovanju z drugimi molekulami inhibira negativne regulatorje, bodisi s preprečitvijo njihovega encimskega delovanja, bodisi s sodelovanjem pri njihovi razgradnji. Posledično lahko postanejo aktivni pozitivni regulatorji, ki se vežejo poleg promotorskih regij na DNA in tako aktivirajo prepisovanje genov za fotomorfogenezo.

===Tina Zavodnik: Mehanična transdukcija in proteini Piezo===
Praktično vsi organizmi so občutljivi na mehanske dražljaje. Fizične sile regulirajo številne fiziološke procese, nezadostni oz. napačni odzivi nanje pa lahko vodijo do številnih okvar ali bolezni. Naše zaznavanje teh dražljajev in njihova pretvorba v biokemijske informacije, imenovana tudi mehanotransdukcija, sta torej ključna za dojemanje sveta okoli nas in odzivanje nanj. To nam omogočajo čutila, navadno sestavljena iz čutilne celice ali receptorja in senzoričnega nevrona. Zaradi obstoja mnogo različnih vrst in intenzitet dražljajev so se tudi čutnice in senzorični nevroni specializirali v zaznavanje vsakega od stimulusov. Merklovi živčni končiči so mehanski receptorji, sposobni zaznavati nežen pritisk na koži. To pa jim omogočajo posebni ionski kanalčki, imenovani proteini Piezo. Nežen dotik na površini kože sproži prenos mehaničnega dražljaja do Merklovih živčnih končičev, kjer se aktivira kanalček Piezo2 v Merklovi celici. Aktivacija kanalčka omogoči prehod kalcijevih in natrijevih ionov v notranjost celice. Merklova celica se depolarizira in sproži akcijski potencial v pripadajočem aferentnem nevronu. Mehanični dražljaj pa aktivira tudi kanalčke Piezo2 v membrani SA1 aferentnega nevrona in s tem sproži dodatno vzpostavitev akcijskega potenciala. Pred kratkim je bila odkrita struktura proteina Piezo, kar pa še vedno ne razkriva natančnega mehanizma aktivacije ionskega kanalčka zaradi mehanskega dražljaja. Najverjetneje se zaradi mehanskega dražljaja spremeni konformacija proteina Piezo. Kanalček se odpre in ioni lahko pod vplivom koncentracijskega gradienta prehajajo skozi membrano.

===Doroteja Armič: Bifunkcionalen encim PFK-2/FBPaza-2 in njegova vloga v metabolizmu glukoze===
PFK-2/FBPaza-2 (fosfofruktokinaza-2/fruktoza-2,6-bisfosfataza) je eden izmed encimov, ki sodelujejo pri regulaciji metabolizma glukoze v evkariontih. Je bifunkcionalen encim, ki uravnava, ali bo v celici potekala glikoliza ali glukoneogeneza. Za to je odgovoren posredno, saj regulira količino alosteričnega efektorja encimov PFK-1 in FBPaza-1 – fruktoze-2,6-bisfosfata. En encim ima dve katalitični domeni. Kinazna domena katalizira sintezo, bisfosfatazna domena pa razgradnjo fruktoze-2,6-bisfosfata. Delovanje encima je regulirano na nivoju posttranslacijske modifikacije, in sicer s fosforilacijo/defosforilacijo. Pri sesalcih obstajajo štirje različni izocimi, vsakega kodira drug gen. Ti izocimi so jetrni, srčni, možganski in izocim testisov. Vsak izocim pa ima več izooblik, ki nastanejo z alternativnim spajanjem eksonov. Izooblike se razlikujejo v regulatornih regijah. Fosforilirajo in defosforilirajo jih drugačne kinaze, nekatere izooblike pa fosforilacijskih mest sploh nimajo. Encim PFK-2/FBPaza-2 je nastal s fuzijo dveh genov. Encim se je razvil tako, da je funkcionalen samo, če sta prisotni obe domeni. Tudi pri tripanosomatidih in kvasovkah, kjer je encim monofunkcionalen, je zato še vedno zapis za obe domeni. V razvoju je prišlo do različnih izooblik v različnih tkivih oziroma organizmih zaradi drugačnih potreb za metabolizem glukoze. Ker PFK-2/FBPaza uravnava glikolizo in glukoneogenezo, bi lahko tarčno reguliranje encima postalo nov način zdravljenja diabetesa.

===Martina Lokar: Biotinilacija proteinov ===
Biotin je pomemben encimski kofaktor, saj olajša prenos karboksilne skupine med metaboliti pri karboksilaciji, dekarboksilaciji in transkarboksilaciji. Biotin protein ligaza (BPL) ga v procesu biotinilacije veže na tarčni biotin-odvisen encim. Biotinilacija je dvostopenjski proces, pri katerem pride v prvem koraku do ligacije biotina in ATP ter nastanka intermediata biotinil-AMP. V drugem koraku se biotin iz biotinil-AMP veže na tarčni encim in pride do sprostitve molekule AMP. Ker je biotin v naravi redek, organizmi natančno uravnavajo njegovo porabo. Evkarionti so nezmožni sami sintetizirati biotin, zato ga pridobivajo iz okolja. Zadostno količino ohranjajo v biotinskem ciklu z reciklacijo biotina iz biotin-odvisnih encimov. Pri metaboličnih procesih sesalcev sodeluje pet biotin-odvisnih karboksilaz, ki so v splošnem zgrajene iz treh domen: domene BC, domene CT in domene BCCD. Biotin je kovalentno vezan na lizinski ostanek v domeni BCCD in se preko modela zibajoče roke ali modela zibajoče domene med katalizo translocira iz domene BC v domeno CT. Karboksilaze katalizirajo reakcijo prenosa karboksilne skupine na substrat v dveh korakih. Najprej se v domeni BC karboksilna skupina veže na biotin. Slednji se nato premakne v domeno CT, kjer se karboksilna skupina iz biotina prenese na substrat. Če telo ni sposobno uravnavati in izkoriščati zaloge biotina, človek oboli za boleznijo MCD.

===Lara Drinovec: AMPK in avtofagija pri glukoznem/glikogenem metabolizmu===
Glukozni/glikogeni metabolizem je primarna metabolična pot, ki je uravnavana na najrazličnejših nivojih, glede na potrebe celice. Znano je, da raven glukoze v krvi uravnavata dva hormona: inzulin, ki omogoča prevzem glukoze v celico in glukagon z nasprotno učinkovitostjo. Metabolni regulator, ki deluje od inzulina neodvisno in se odziva na krčenje mišic, je AMPK (AMP-aktivirana protein kinaza). Aktivira jo lahko AMP, tako da se veže na vezavno mesto na eni izmed treh podenot AMPK. Spremembo koncentracije AMP lahko AMPK zazna hitreje kot spremembo koncentracije ATP. Aktivirana AMPK inhibira anabolne poti in aktivira katabolne procese, ter tako vzdržuje energijsko homoestazo v aktivnih celicah. Pomembno vlogo pri vzdrževanju nivoja glukoze v celici igra tudi avtofagija, ki povzroči razgradnjo hranilnih snovi, kot so glikogen in lipidne kapljice, s tem zagotovi celici zadostno količino glukoze, in tako deluje kot nadomesten proces za glukoneogenezo. Tudi ta proces je v celicah uravnavan, in sicer z različnimi signalnimi molekulami. Mnogo bolezni, kot sta na primer diabetes in rak, sta tesno povezani z nefunkcionalnostjo nekaterih metaboličnih senzorjev ali avtofagije, zato je razumevanje njihovih funkcionalnih interakcij osnova za nove terapevtske možnosti.

=== Tina Kolenc Milavec: Intermediati Krebsovega cikla kot signalne molekule pri vnetnem in protivnetnem odgovoru===
Intermediati Krebsovega cikla imajo v celici pomembno vlogo, saj ne služijo le kot vmesni produkti v procesu nastanka molekul ATP, temveč tudi kot prekurzorji za sintezo drugih biološko pomembnih molekul ter kot signalne molekule v številnih metaboličnih poteh. Ko se na tolične receptorje (TLR4) na površini makrofaga vežejo s patogeni povezani molekulski vzorci, pride v celici do preklopa metabolizma z oksidativne fosforilacije na glikolizo za namene pridobivanja energije v obliki ATP, kar neposredno vpliva na vnetno stanje v celici. Krebsov cikel, ki sedaj nima več vloge zagotavljanja energije celici, se prekine na dveh mestih: za sukcinatom ter pri izocitrat dehidrogenazi, kar omogoči, da intermediati citratnega cikla delujejo kot signalne molekule. Pri vnetnem odzivu organizma na patogene sta zelo pomembna sukcinat in citrat. Prvi povzroči povišanje koncentracije Hif1α v celici ter nastanek reaktivnih kisikovih spojin (ROS) zaradi vzvratnega elektronskega transporta, citrat pa deluje kot substrat za verigo reakcij, ki prav tako vodijo do nastanka ROS. Pri ponovni vzpostavitvi normalnih razmer v celici po uspešni odstranitvi patogenov pa ima pomembno vlogo itakonat - molekula, ki nastane iz cis-akonitata. Ta vpliva na tri pomembne molekule (sukcinat dehidrogenazo, Nrf2 ter ATF3), ki sprožijo vsaka svojo kaskado reakcij protivnetnega odgovora.

===Valeriya Musina: Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na celične procese===
Krebsov cikel je bil oblikovan osedemdeset let nazaj, vloge njegovih inermediatov, zlasti sukcinata in fumarata, pa so bile odkrite nedavno. V zadnjem času so bile narejene številne raziskave človeških bolezni, zlasti niza specifičnih vrst raka, ki so razkrile pomembne vloge intermediatov Krebsovega cikla pri metilaciji genov in s tem pri preoblikovanju celic. Intermediati Krebsovega cikla lahko delujejo kot primarni substrati, signalne molekule ali sodelujejo pri posttranslacijskih modifikacijah. Vedno več dokazov kaže, da ima epigenetika pomembno vlogo pri regulaciji dobe zdravja, in je vključena v proces staranja. 2-oksoglutarat (α-ketoglutarat) je ključni metabolit v Krebsovem ciklu, vendar je tudi obvezen substrat za 2-oksoglutarat odvisne dioksigenaze (2-OGDO). Družina encimov 2-OGDO vključuje glavne encime za demetilacijo DNA in histonov, encime Ten-Eleven translocation (TETs) in encime z domeno Jumonji C (JmjC). Poleg tega lahko člani družine 2-OGDO regulirajo sintezo kolagena in odzive na hipoksično okolje tudi na neepigenetski način. 2-oksoglutarat je substrat 2-oksoglutarat dehidrogenaz (2-OGDH), zato lahko motnje v funkciji 2-OGDH v Krebsovem ciklu povzročijo globalne degenerativne spremembe v strukturi kromatina. Sukcinat in fumarat močna inhibitorja 2-OGDO encimov, zato ravnotežje reakcij v Krebsovem ciklu lahko vpliva na raven metilacije DNA in histonov ter tako nadzira izražanje genov.

===Marko Pavleković: Vloga sukcinata kot ligand z G proteini vezanega receptorja GPR91===
Znano je, da je cikel citronske kisline osrednjega pomena za presnovo celic in energetsko homeostazo. Vendar marsikateri intermediat cikla igra vlogo tudi v drugih procesih v telesu. Na primer sukcinat deluje kot ekstracelularni ligand z vezavo na z G proteinom vezan receptor, znan kot GPR91, izražen v ledvicah, jetrih, srcu, retinalnih celicah in morda v številnih drugih tkivih, kar vodi do širokega nabora fizioloških in patoloških učinkov. V normalnih pogojih se sukcinata ne sintetizira dovolj, da bi lahko aktiviral GPR91, šele v pogojih kot so ishemija, diabetes in hipoksija, sukcinata nastane dovolj. Ker pa sukcinat nastaja v matriksu mitohondrija mora na poti do receptorja, ki se nahaja na zunanji strani celic, prečkati še tri membrane. Skozi GPR91 je sukcinat vključen v funkcije, kot so uravnavanje krvnega tlaka, zaviranje lipolize v belem maščobnem tkivu, razvoj vaskularizacije mrežnice, srčna hipertrofija in aktivacija zvezdastih jetrnih celic z ishemičnimi hepatociti. Zaradi tega je sukcinatni receptor obetajoč cilj za zdravila za preprečevanje teh neželenih patoloških učinkov. Nedavni razvoj antagonistov, specifičnih za SUCNR1, odpira nove možnosti za raziskave v modelih za te motnje in lahko sčasoma zagotovi nove možnosti za zdravljenje bolnikov.

===Klementina Polanec: Sirtuini kot regulatorji oksidacije maščobnih kislin===
Sirtuini so družina visoko ohranjenih proteinov (SIRT1-SIRT7 pri sesalcih), ki imajo regulatorno vlogo v metabolizmu in staranju. Delujejo kot regulatorji oksidacije maščobnih kislin v odgovor na številne strese za celico, kot so omejitev kalorij, postenje, mraz. Ker se zniža nivo ATP v celici in je glukoze premalo, se poveča razgradnja glikogena, hkrati pa se pospeši oksidacija maščobnih kislin v mišicah in jetrih. Do nedavnega je veljajo prepričanje, da je aktivnost sirtuinov odvisna le od koncentracije NAD+ v celici. Raziskovalci so pred kratkim dokazali, da se lahko SIRT1 aktivira tudi s fosforilacijo, ki jo izvede protein kinaza A (PKA). Ko so sirtuini aktivirani, delujejo v glavnem kot deacetilaze številnih encimov, s čimer jih aktivirajo. SIRT1 tako deacetilira PGC1α, ki pospeši izražanje tarčnih genov, ki so povezani z oksidacijo maščobnih kislin. SIRT3 pa odvisno od koncentracije NAD+ deacetilira in s tem aktivira LCAD (long-chain acyl-CoA dehydrogenase). To je pri miših ključen encim, ki sodeluje v oksidaciji dolgoverižnih maščobnih kislin. S pospešeno oksidacijo celica dvigne nivo ATP in ponovno vzpostavi homeostazo. Sirtuini so zato lahko potencialna tarča za zdravljenje motenj v oksidaciji maščobnih kislin ter tudi za preprečevanje prekomerne teže oziroma debelosti.

===Tadej Medved: Vpliv oksidacije maščobnih kislin na usodo celic===
Usodo celic, tj. končne lastnosti, ki jih bo celica izražala po razvoju in diferenciaciji, določajo številni procesi. Mednje spada tudi metabolična β-oksidacija maščobnih kislin. Izkaže se, da je količina acetil-CoA, pridobljena preko oksidacije maščobnih kislin, pogosto odločilni dejavnik za izražanje lastnosti določenih tipov celic; do sedaj je bil ta vpliv raziskan v endotelijskih celicah limfnih žil in srca ter v limfocitih T. Ključna regulacija oksidacije MK se prične pri izražanju encima CPT1, ki omogoča transport maščobnih kislin v mitohondrij. V srčnem endoteliju vpliva ta proces na pretvorbo endotelijskih celic v mezenhimske, in sicer zaradi TGF-β signalizacije, ki z inhibicijo metabolizma MK sproži spremembe celičnih lastnosti v mezenhimske. V endoteliju limfnih žil je oksidacija MK pomembna za vršenje limfangiogeneze, tj. tvorbe novih limfnih žil s proliferacijo in diferenciacijo obstoječih limfnih endotelijskih celic. Ta proces je odvisen od signalov VEGF-C in PROX1; slednji poveča izražanje CPT1 in pripravi celico do migracije in proliferacije. Količina acetil-CoA je relevanten dejavnik za diferenciacijo in dolgoživost spominskih T celic, povezana pa je preko aktivacije AMPK s signalno molekulo TRAF6. V T celicah na sploh pa močno učinkuje PD-1, ki pospeši tako hidrolizo MK kot tudi njihovo oksidacijo in omogoča preživetje teh celic v pogojih, kjer niso sposobne sprejemanja drugih hranilnih snovi, kot je glukoza.

===Rebeka Dajčman: Metabolizen, signalizacija in farmakološka funkcija ketonskih teles===
ketonska telesa nastanejo kot stranski produk pri presnovi maščobnih kislin. mednje sodijo acetoacetat, aceton in najobstojnejši beta hidroksibutirat. njihova sinteza se poveča, ko telesu primanjkuje ogljikovih hidratov. to je med stradanjem, po športni aktivnosti, med nosečnostjo ali med ketonsko dieto. v seminarski nalogi bom predstavila metabolično bot ketonskih teles. od sinteze v jetrih do njihovega transporta v ostala tkiva. to so predvsem skeletne mišice, srce in možgani ter njihovo oksidacijo nazaj v acetil-CoA. sinteza ketonskih teles je regulirana s transkripcijsko in post-translacijsko regulacijo. pri tem gre predvsem za regulacijo encimov, ki sodelujejo v sintezi in razgradnji teles. ketonska telesa pa imajo vlogo regulacije dveh membranskih receptorje ali histonske deacetilaze. ketonska telesa se že desetletja uporabljajo v zdravljenju nevrodegenerativnih bolezni in v tej smeri tudi tečejo prihodnje raziskave

===Sumeja Kudelić: Transsulfuracijska pot kot obrambni mehanizem celic pri oksidativnem stresu===
Transsulfuracijska pot, kot novo raziskovalno področje nam podarja veliko pozitivnih načinov v boju proti oksidativnemu stresu. Oksidativni stres, kot negativni dejavnik celic s svojimi reaktivnimi kisikovim zvrsti, poškoduje različne celične organele, kar vodi do celične smrti. Pri transsulfuraciji poti je ugotovljeno, da bistveni pomen ima cistein y-liaza, ki je biosintetični encim cisteina. Pri razgradnji cisteina lahko pridobimo vodikov sulfid (H2S), ki je v zelo majhnih koncentracijah pomemben signalizator celice. Več mehanizmov pozitivnega delovanja transsulfuracije poti (posredne ali neposredne) je raziskano, te so prišli do rezultatov, ki bi lahko pomagali pri izboljšanem terapevtskem zdravljenju nevrodegenerativnih bolezni, ki so povezane z metabolizmom aminokislin. Važno je iztakniti, da s pomočjo tega mehanizma ali z njeno inhibicijo bi tudi vplivali na bakterijsko smrt. Saj se pri bakterijah razvila obrambna stimulacija transsulfuracijske poti, pri čemer so bakterije postale 'imune' na antibiotike. Vodikov sulfid kot pomemben dejavnik transsulfuracijske poti vpliva na to, da veže proste ione, ki bi lahko v oksidativnih pogojih (H2O2) reagirali s to spojino. Kot posledica reakcije nastanejo prosti kisikovi radikali, ki poškodujejo celične organele. Nevrodegenerativne bolezni uporabljajo transsulfuracijsko pot kod pomemben vir aminokislin in tudi s tem preprečujejo, da so njihove celice izpostavljene oksidativnemu stresu.

===Matija Ruparčič: Ureaze in njihova vloga v živih bitjih===
Ureaze so metaloencimi, ki katalizirajo hidrolizo uree oziroma sečnine. Pri tem nastaneta dve molekuli amoniaka ter ena molekula ogljikovega dioksida. Najdemo jih v veliko organizmih kot so rastline, glive in bakterije. Le živali jih nimajo, saj se pri njih sečnina tvori kot odpadni produkt. Strukturno se razlikujejo glede na vrsto organizma, zapis za njihove sestavne dele pa se skriva v velikem številu genov. Za organizme, ki jih vsebujejo, predstavljajo ključen faktor za življenje. S pomočjo njih lahko bakterije ''Helicobacter pylori'' preživijo v ekstremno kislih razmerah želodca, bakterijam ''Proteus mirabilis'' omogočajo tvorbo zaščitnih biofilmov, rastlinam pa zagotavljajo bogat vir dušika in jim pomagajo pri katabolizmu arginina. Pred kratkim pa so odkrili, da imajo poleg tega ureaze še druge naloge, ki niso povezane z njihovo katalitično sposobnostjo. Med te štejemo vlogo medcelične komunikacije pri lišajih, obramba pred oksidativnim stresom kot odgovor imunskega sistema in še veliko več. Poznamo jih sicer že skoraj 150 let, vendar o njih vemo še vedno relativno malo. Motivacija za njihovo preučevanje pa je velika, saj nam lahko pomagajo k napredkom na raznih področjih kot sta medicina in agronomija.

BIO2 Seminar 2018

2018-11-23T18:26:33Z

Matija Ruparčič: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Eva Gartner || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Eva_Gartner:_Wnt_signalizacija_in_njena_vloga_pri_sr.C4.8Dni_fibrozi Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi] || Anamarija Agnič || Anastasija Nechevska || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Aljaž Bratina || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Alja.C5.BE_Bratina:_Pomen_razli.C4.8Dnih_signalnih_poti_pri_staranju Pomen različnih signalnih poti pri staranju]|| Lara Drinovec || Liza Ulčakar || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Karmen Mlinar || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Karmen_Mlinar:_Signalizacija_in_odzivi_na_abiotski_stres_pri_rastlinah Signalizacija in odzivi na abiotski stres v rastlinah] || Luka Gnidovec || Maja Škof || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Tina Zavodnik || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Zavodnik:_Mehani.C4.8Dna_transdukcija_in_proteini_Piezo Mehanična transdukcija in proteini Piezo] || Jernej Imperl || Ajda Godec || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Meta Kodrič || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Meta_Kodri.C4.8D:_Svetlobne_signalne_poti_za_uravnavanje_fotomorfogeneze Svetlobne signalne poti za uravnavanje fotomorfogeneze] || Laura Gašperšič || Neža Blaznik || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Neža Žerjav || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Ne.C5.BEa_.C5.BDerjav:_Vloga_kaspaz_pri_celi.C4.8Dni_smrti Vloga kaspaz pri celični smrti] || Nika Boštic || Urša Štrancar || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Doroteja Armič || 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Doroteja_Armi.C4.8D:_Bifunkcionalen_encim_PFK-2.2FFBPaza-2_in_njegova_vloga_v_metabolizmu_glukoze Bifunkcionalen encim PFK-2/FBPaza-2 in njegova vloga v metabolizmu glukoze] || Eva Gartner || Anamarija Agnič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Lara Drinovec || 14-15 || AMPK in avtofagija pri glukoznem/glikogenem metabolizmu || Aljaž Bratina || Barbara Jaklič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Martina Lokar || 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Martina_Lokar:_Biotinilacija_proteinov Biotinilacija proteinov]|| Karmen Mlinar || Luka Gnidovec || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Marko Pavleković || 16 || Vloga sukcinata kot ligand z G proteini vezanega receptorja GPR91 || Tina Zavodnik || Jernej Imperl || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Valeriya Musina || 16 || Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na celične procese || Meta Kodrič || Laura Gašperšič || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Tina Kolenc Milavec || 16 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Kolenc_Milavec:_Intermediati_Krebsovega_cikla_kot_signalne_molekule_pri_vnetnem_in_protivnetnem_odgovoru Intermediati Krebsovega cikla kot signalne molekule pri vnetnem in protivnetnem odgovoru]|| Neža Žerjav || Nika Boštic || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Andrej Špenko || 17 || Regulacija oksidacije maščobnih kislin v skeletnih mišicah || Doroteja Armič || Eva Gartner || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Tadej Medved || 17 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tadej_Medved:_Vpliv_oksidacije_ma.C5.A1.C4.8Dobnih_kislin_na_usodo_celic Vpliv oksidacije maščobnih kislin na usodo celic] || Sanja Stanković || Aljaž Bratina || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Klementina Polanec || 17 || Sirtuini kot regulatorji oksidacije maščobnih kislin || Martina Lokar || Karmen Mlinar || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Rebeka Dajčman || 17 || Ketonska telesa kot signalni metaboliti || Marko Pavleković || Tina Zavodnik || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Sumeja Kudelić || 18 || Transsulfuracijska pot kot obrambni mehanizem celic pri oksidativnem stresu || Valeriya Musina || Meta Kodrič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Matija Ruparčič || 18 || Ureaze in njihova vloga v živih bitjih || Tina Kolenc Milavec || Neža Žerjav || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Maks Kumek || 18 || Vloga metabolizma arginina v celični regulaciji in erekcija || Andrej Špenko || Doroteja Armič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Anže Šumah || 19 || Termogeneza in termogenin || Tadej Medved || Sanja Stanković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Barbara Jaklič || 19 || moj naslov || Klementina Polanec || Martina Lokar || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Gašper Anton Komatar || 19 || Kako športna vadba pospeši biosintezo mitohondrijev in vpliva na zdravje || Rebeka Dajčman || Marko Pavleković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Praznik Liza || 19 || moj naslov || Sumeja Kudelić || Valeriya Musina || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Lara Hrvatin || 20 || Mehanizmi koncentriranja ogljika || Matija Ruparčič || Tina Kolenc Milavec || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Sonja Gabrijelčič || 20 || moj naslov || Maks Kumek || Andrej Špenko || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Anastasija Nechevska || 20 || moj naslov || Anže Šumah || Tadej Medved || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Liza Ulčakar || 21 || Vloga interakcij med lipidnimi kapljicami in organeli pri homeostazi lipidov|| Barbara Jaklič || Klementina Polanec || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Maja Škof || 21 || Sinteza sfingolipidov in njihova vloga v celicah || Gašper Anton Komatar || Rebeka Dajčman || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Ajda Godec || 21 || Biosinteza leukotriena B4 || Praznik Liza || Sumeja Kudelić || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Neža Blaznik || 22 || moj naslov || Lara Hrvatin || Matija Ruparčič || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Urša Štrancar || 22 || moj naslov || Sonja Gabrijelčič || Maks Kumek || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Anamarija Agnič || 22 || moj naslov || Anastasija Nechevska || Anže Šumah || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Sanja Stanković || 23 || moj naslov || Liza Ulčakar || Lara Drinovec|| 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Luka Gnidovec || 23 || moj naslov || Maja Škof || Gašper Anton Komatar || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Jernej Imperl || 23 || moj naslov || Ajda Godec || Praznik Liza || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Laura Gašperšič || 23 || moj naslov || Neža Blaznik || Lara Hrvatin || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Nika Boštic || 23 || moj naslov || Urša Štrancar || Sonja Gabrijelčič || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2018|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Seminar 2018

2018-11-19T17:03:09Z

Matija Ruparčič: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="left" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Eva Gartner || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Eva_Gartner:_Wnt_signalizacija_in_njena_vloga_pri_sr.C4.8Dni_fibrozi Wnt signalizacija in njena vloga pri srčni fibrozi] || Anamarija Agnič || Anastasija Nechevska || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Aljaž Bratina || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Alja.C5.BE_Bratina:_Pomen_razli.C4.8Dnih_signalnih_poti_pri_staranju Pomen različnih signalnih poti pri staranju]|| Lara Drinovec || Liza Ulčakar || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Karmen Mlinar || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Karmen_Mlinar:_Signalizacija_in_odzivi_na_abiotski_stres_pri_rastlinah Signalizacija in odzivi na abiotski stres v rastlinah] || Luka Gnidovec || Maja Škof || 15/10/2018 || 16/10/2018 || 17/10/2018
|-
| Tina Zavodnik || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Zavodnik:_Mehani.C4.8Dna_transdukcija_in_proteini_Piezo Mehanična transdukcija in proteini Piezo] || Jernej Imperl || Ajda Godec || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Meta Kodrič || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Meta_Kodri.C4.8D:_Svetlobne_signalne_poti_za_uravnavanje_fotomorfogeneze Svetlobne signalne poti za uravnavanje fotomorfogeneze] || Laura Gašperšič || Neža Blaznik || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Neža Žerjav || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Ne.C5.BEa_.C5.BDerjav:_Vloga_kaspaz_pri_celi.C4.8Dni_smrti Vloga kaspaz pri celični smrti] || Nika Boštic || Urša Štrancar || 19/10/2018 || 22/10/2018 || 24/10/2018
|-
| Doroteja Armič || 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Doroteja_Armi.C4.8D:_Bifunkcionalen_encim_PFK-2.2FFBPaza-2_in_njegova_vloga_v_metabolizmu_glukoze Bifunkcionalen encim PFK-2/FBPaza-2 in njegova vloga v metabolizmu glukoze] || Eva Gartner || Anamarija Agnič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Lara Drinovec || 14-15 || AMPK in avtofagija pri glukoznem/glikogenem metabolizmu || Aljaž Bratina || Barbara Jaklič || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Martina Lokar || 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Martina_Lokar:_Biotinilacija_proteinov Biotinilacija proteinov]|| Karmen Mlinar || Luka Gnidovec || 02/11/2018 || 05/11/2018 || 07/11/2018
|-
| Marko Pavleković || 16 || Vloga sukcinata kot ligand z G proteini vezanega receptorja GPR91 || Tina Zavodnik || Jernej Imperl || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Valeriya Musina || 16 || Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na celične procese || Meta Kodrič || Laura Gašperšič || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Tina Kolenc Milavec || 16 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tina_Kolenc_Milavec:_Intermediati_Krebsovega_cikla_kot_signalne_molekule_pri_vnetnem_in_protivnetnem_odgovoru Intermediati Krebsovega cikla kot signalne molekule pri vnetnem in protivnetnem odgovoru]|| Neža Žerjav || Nika Boštic || 09/11/2018 || 12/11/2018 || 14/11/2018
|-
| Andrej Špenko || 17 || Regulacija oksidacije maščobnih kislin v skeletnih mišicah || Doroteja Armič || Eva Gartner || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Tadej Medved || 17 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2018#Tadej_Medved:_Vpliv_oksidacije_ma.C5.A1.C4.8Dobnih_kislin_na_usodo_celic Vpliv oksidacije maščobnih kislin na usodo celic] || Sanja Stanković || Aljaž Bratina || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Klementina Polanec || 17 || Sirtuini kot regulatorji oksidacije maščobnih kislin || Martina Lokar || Karmen Mlinar || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Rebeka Dajčman || 17 || Ketonska telesa kot signalni metaboliti || Marko Pavleković || Tina Zavodnik || 16/11/2018 || 19/11/2018 || 21/11/2018
|-
| Sumeja Kudelić || 18 || Transsulfuracijska pot kot obrambni mehanizem celic pri oksidativnem stresu || Valeriya Musina || Meta Kodrič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Matija Ruparčič || 18 || Encimi ureaze in njihova vloga v živih bitjih || Tina Kolenc Milavec || Neža Žerjav || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Maks Kumek || 18 || moj naslov || Andrej Špenko || Doroteja Armič || 23/11/2018 || 26/11/2018 || 28/11/2018
|-
| Anže Šumah || 19 || moj naslov || Tadej Medved || Sanja Stanković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Barbara Jaklič || 19 || moj naslov || Klementina Polanec || Martina Lokar || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Gašper Anton Komatar || 19 || Kako športna vadba pospeši biosintezo mitohondrijev in vpliva na zdravje || Rebeka Dajčman || Marko Pavleković || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Praznik Liza || 19 || moj naslov || Sumeja Kudelić || Valeriya Musina || 30/11/2018 || 03/12/2018 || 05/12/2018
|-
| Lara Hrvatin || 20 || Mehanizmi koncentriranja ogljika || Matija Ruparčič || Tina Kolenc Milavec || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Sonja Gabrijelčič || 20 || moj naslov || Maks Kumek || Andrej Špenko || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Anastasija Nechevska || 20 || moj naslov || Anže Šumah || Tadej Medved || 07/12/2018 || 10/12/2018 || 12/12/2018
|-
| Liza Ulčakar || 21 || Vloga interakcij med lipidnimi kapljicami in organeli pri homeostazi lipidov|| Barbara Jaklič || Klementina Polanec || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Maja Škof || 21 || Sfingozin kinaza: struktura in regulacija || Gašper Anton Komatar || Rebeka Dajčman || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Ajda Godec || 21 || Biosinteza leukotriena B4 || Praznik Liza || Sumeja Kudelić || 14/12/2018 || 17/12/2018 || 19/12/2018
|-
| Neža Blaznik || 22 || moj naslov || Lara Hrvatin || Matija Ruparčič || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Urša Štrancar || 22 || moj naslov || Sonja Gabrijelčič || Maks Kumek || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Anamarija Agnič || 22 || moj naslov || Anastasija Nechevska || Anže Šumah || 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Sanja Stanković || 23 || moj naslov || Liza Ulčakar || Lara Drinovec|| 04/01/2019 || 07/01/2019 || 09/01/2019
|-
| Luka Gnidovec || 23 || moj naslov || Maja Škof || Gašper Anton Komatar || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Jernej Imperl || 23 || moj naslov || Ajda Godec || Praznik Liza || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Laura Gašperšič || 23 || moj naslov || Neža Blaznik || Lara Hrvatin || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|-
| Nika Boštic || 23 || moj naslov || Urša Štrancar || Sonja Gabrijelčič || 11/01/2019 || 14/01/2019 || 16/01/2019
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2018|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2017 Povzetki seminarjev

2018-04-23T19:22:24Z

Matija Ruparčič: /* Ana Scott: Naslov seminarja */

[[TBK2017-seminar|Nazaj na osnovno stran]]
===Ana Scott: Naslov seminarja===
Tekst ....

'''Uroš Prešern: Nukleaza, ki povzroči partanatos oziroma od PARP-1 odvisno celično smrt'''

Partanatos je ena izmed vrst celične smrti, ki nastopi zaradi prevelike aktivnosti poli(ADP-riboza) polimeraze 1 (PARP-1) v jedru. Pogost je v primeru možganske kapi, infarkta in nevrodegenerativnih boleznih, zaradi česar bi boljše poznavanje samega procesa omogočilo razvoj novih načinov zdravljenja teh obolenj. V predhodnih raziskavah so ugotovili, da partanatos nastopi, ko molekule poli-ADP-riboze, ki jih PARP-1 sintetizira, preidejo iz jedra v citosol, kjer aktivirajo premestitev indukcijskega faktorja apoptoze (AIF) iz mitohondrijev v jedro. Temu sledi razrez DNA. Nukleaza, ki povzroči razrez DNA, je bila do nedavnega manjkajoči člen v partanatosu. Skupini raziskovalcev je uspelo odkriti, da je iskana nukleaza inhibitorni dejavnik migracije makrofagov (MIF). Pokazali so, da se med partanatosom MIF veže na AIF in se skupaj z njim premesti v jedro, kjer povzroči fragmentacijo DNA. Inhibicija nukleazne aktivnosti MIF se je v modelu možganske kapi pri miših odrazila v 75-odstotnem zmanjšanju volumna prizadetega tkiva, pospešeno pa je bilo tudi okrevanje. Rezultati raziskave odpirajo potencialne možnosti za zdravljenje akutnih in kroničnih nevroloških bolezni, v katerih nastopi partanatos.

'''Doroteja Armič: Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR'''

Pluripotentne matične celice so še nediferencirane celice, ki imajo sposobnost, da se diferencirajo v skoraj vse tipe celic. Poznamo več vrst pluripotentnih matičnih celic. Ene izmed njih so inducirane pluripotentne matične celice (celice iPS). To so pluripotentne celice, ki jih umetno dediferencirajo iz odraslih somatskih celic. Leta 2006 so odkrili postopek pridobivanja celic iPS iz mišjih fibroblastov. Ugotovili so, da so za reprogramiranje somatskih celic najpomembnejši štirje transkripcijski dejavniki, in sicer Oct4, Sox2, Klf4 in c-Myc. Letos pa je skupini znanstvenikov uspelo odkriti nov, bolj enostaven postopek pridobivanja celic iPS. Ugotovili so namreč, da lahko sprožijo njihov nastanek že z aktivacijo enega samega gena – Oct4 ali Sox2. Aktivacija Sox2-promotorja oziroma Oct4-promotorja in Oct4-ojačevalca hkrati pa nato povzroči aktivacijo ostalih genov, ki sodelujejo pri vzpostavitvi pluripotentnosti v celicah. Za aktivacijo genov so uporabili tehnologijo CRISPR. Primerjali so uporabo dveh sistemov – dCas9-SunTag-VP64 in dCas9-SunTag-p300core. V obeh primerih so dobili primerljive rezultate. Uporaba celic iPS je pomembna v regenerativni medicini, saj lahko zamenja uporabo človeških embrionalnih matičnih celic. Z uporabo celic iPS, generiranih iz pacientovih lastnih celic, ne bi prišlo do zavrnitvenih reakcij, prav tako pa bi se izognili etičnih pomislekov. Znanstveniki predvidevajo, da lahko tehnologija reprogramiranja celic, ki so jo uporabili na mišjih celicah, z manjšimi spremembami deluje tudi na človeških celicah.

'''Dea Simonič: Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu'''

Avtoimunska bolezen je bolezen, ki nastane zaradi pretiranega odziva imunskega sistema na celice, ki so last organizma. Veliko vlogo pri nastanku avtoimunske bolezni imajo limfociti B, ki omogočajo humoralni imunski odziv. Transkripcijski faktor T-bet v limfocitih B povzroči razvoj ABC, te celice so pa »pogon« avtoimunske bolezni. Avtoimunska bolezen se v veliki večini primerov razširi po telesu . Vzrok tega so ravno limfociti B, ki razširijo svoj napad po telesu in pride do širjenja epitopa. Ta proces se začne, ko imunski sistem napade antigene na drugih delih telesa, ki jih na začetku ni hotel uničiti. Telo začne pospeševano uničevati lastna tkiva. Da bi razumeli, zakaj pride do tega mehanizma so raziskovalci uporabili fluorescenčne markerje beljakovin, ki razlikujejo različne celične skupke limfocitov B (oziroma germinalne centre), na miših obolelih z lupusom. V germinalnih centrih limfociti B »tekmujejo« med sabo, kateri bo naredil najboljše protitelo, ki bo nevtraliziralo zaznano grožnjo. Te germinalne skupke so s pomočjo markerjev zaznali kot 10 različnih barv. Po tednu ali dveh začne prevladovati ena sama barva. Ta germinalni skupek je ustvaril najboljše protitelo in skupaj z ostalimi limfociti aktiviral avtoimunski protinapad. S to študijo so raziskovalci naredili velik korak v smer zaustavitve oziroma zdravljenja avtoimunske bolezni.

'''Valeriya Musina: Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke'''

Uničenje mitohondrijev je eden najbolj obetavnih pristopov pri razvoju novih zdravil proti raku. Znanstveniki so sintetizirali peptid, ki vsebuje baker, ki ga zlahka sprejmejo mitohondriji v matičnih celicah raka dojk, kjer le ta učinkovito povzroča apoptozo. Rakaste celice, ki imajo povečani metabolizem, ne samo, da vsebujejo več mitohondrijev kot zdrave celice, temveč so te tudi drugačni, strukturno in funkcionalno. Zaradi posebnih značilnosti in njihove odločilne vloge v presnovi celic so maligne mitohondrije pomembne tarčej za nove terapevtske spojine. Mitohondrije je možno uničiti z uvajanjem sredstev za proizvajanje reaktivnih vrst kisika (ROS). Te reaktivne spojine ovirajo metabolizem mitohondrijev. Kot močan ROS generator je bila predlagana organokovinska spojina bakrov(II) fenantrolin. Za dostavo in prenos skozi zunanjo membrano mitohondrija pa so bakrov(II) fenantrolin vezali na specifičen peptid, ki prodira v mitohondrije. Preizkusi so bili izvedeni z dvema celicnima linijama raka dojke, ena celična linija je vsebovala matične celice raka dojk. Rezultati so bili : odvisna od količine odmerka izguba sposobnosti za preživetje, razpad membran mitohondrijev, nastanek ROS in slabši metabolizma mitohondrijev. Zdravilo je bolj vplivalo na matične celice raka, kar je bilo razloženo z večjo vsebnostjo mitohondrijev. Ta študija izpostavlja potencial metalopeptida tako za dostavo kot tudi za uničenje mitohondrijev, zlasti v matičnih celicah raka.

'''Neža Štremfelj: Delovanje inzulinskih receptorjev'''

Človeški inzulinski receptorji igrajo pomembno vlogo v človeškem telesu. Signalizacija z inzulinskimi receptorji igra ključno vlogo pri regulaciji metabolizma in pri rasti v večceličnih organizmih. Nepravilno delovanje inzulinskih receptorjev je povezano z mnogimi hujšimi obolenji, na primer z rakavim obolenjem, diabetesom in Alzheimerjevo boleznijo.
Glavna ideja raziskave, ki jo opisuje članek, ki sem si ga izbrala za osnovo moje seminarske naloge je, da vezava inzulina na inzulinski receptor preoblikuje zunajcelični del transmembranskih proteinov (ektodomeno) receptorja iz U-konformacije v T-konformacijo. Prerazporeditev v ektodomeni se razširi tudi na transmembranske domene, ki so, ko je receptor neaktiviran pomaknjene narazen, ob vezavi inzulina pa se pomaknejo skupaj, kar omogoči fosforilizacijo tirozin kinaze v citoplazmi. Pri transmembranski signalizaciji z inzulinskim receptorjem poleg dimerizacije z vezavo liganda pride tudi do strukturnih sprememb znotraj receptorskega dimera.

'''Marko Pavleković: Prehajanje imunskih celic, povzročiteljic multiple skleroze, skozi krvno-možgansko pregrado'''

Multipla skleroza je avtoimunska bolezen, pri kateri limfociti napadejo živčne celice in jih demielinizirajo ter tako škodujejo prenosu signalov med nevroni. Iz predhodnih raziskav so odkrili, da sta za multiplo sklerozo najbolj krivi celiti pomagalki T 1 in T 17. Da bi prišli do centralnega živčnega sistema morata celici najprej prečkati vaskularno pregrado. Kako to dosežeta so raziskovali znanstveniki z univerze v Kolumbiji in z univerze v Kaliforniji. Z dvo-fotonsko mikroskopijo so opazovali tesne stike pri miših obolelih za eksperimentalnim avtoimunskim encefalomielitisom, ki je živalski primer multiple skleroze. Ugotovili so, da krvno-možgansko pregrado preideta na dva različna načina: s transcitozo in skozi prekinjene tesne stike med endotelnimi celicami. S pomočjo miši, ki jim je primanjkovalo kaveol (kaveolina1) pa so dokazali, da za prehod do centralnega živčnega sistema celica T 1 izkorišča transcitozo, medtem ko celica T 17 prehaja skozi prekinjene tesne stike. Te ugotovitve bi lahko močno pomagale pri nadaljnjem zdravljenju bolezni, kjer bi se osredotočili na preprečevanje dostopa imunskih celic do centralnega živčnega sistema.

'''Rebeka Dajčman: več mehanizmov poganja dinamiko kalcijevega signala okoli lasersko povzročene rane epitelija'''

Kalcij igra ključno vlogo pri skoraj vseh procesih v celici. Razni signali, kot je na primer sinteza RNA in DNA ali pa migracija celic, je posledica spremembe intracelularne koncentracije kalcija. Spremembo koncentracije lahko zaznamo z merjenjem intenzivnosti fluorescentne svetlobe, ki jo oddajajo GCaMP proteini. Če celice poškodujemo z laserskim mehurčkom, ustvarimo rano, ki je podobna udarcu. Sledijo trije mehanizmi signaliziranja, ki so odvisni od velikosti rane. Takoj po poškodbi celične membrane uide kalcij iz ekstracelularne tekočine v citosol, kjer se koncentracija kalcija dvigne. Kalcij nato skupaj s signalnimi molekulami difundira v okoliške celice in temu pravimo prvi val oz. takojšnji odziv. Po 45 sekundah mu sledi drugi močnejši valj, ki pa se širi počasneje, ker skozi membrano prehajajo večji signalni proteini. Ti signali sprožijo sistemski odziv na poškodbo, ki poskrbi, da se celice v najkrajšem možnem času regenerirajo. Da pri regeneraciji povrhnjice kože ne nastanejo brazgotine poskušamo v tkivo, ki je bilo poškodovano, vstaviti lasne mešičke. Ti pripomorejo k nastajanju maščobe in tako preprečijo brazgotinjenje. Če se poškoduje žilna stena pa sistem poskrbi za nastanek strdkov, ki so sestavljeni iz krvnih celic in fibrina. Trombociti navijejo fibrin v toge zvitke in ti se s pomočjo posebnih encimov raztopijo v krvi. Nova odkritja o celičnemu celjenju pripomorejo k hitrejšemu in učinkovitejšemu celjenju ran.

'''Gašper Anton Komatar: Tvorba kompleksa receptorjev ApoER2, ephirinB2 in AMPAR, ki jih povezuje GRIP1, sodeluje pri vorbi spomina'''

LTP ali dolgoročna potenciacija pomeni povečanje sinaptične moči za dolgo časa in ker gre pri tvorbi spominov prav za povečanje sinaptične aktivnosti, je med znanstveniki priznan kot najverjetnejši model učenja in tvorbe spomina na celični ravni. Med LTP se poveča število receptorjev AMPA v postsinaptični membrani, kar še dodatno poveča sinaptično moč.
Kakšen je mehanizem in katere molekule sodelujejo pri prenosu in vgradnji AMPAR v postsinaptično membrano, to je bilo glavno vprašanje raziskovalcev v članku, ki sem si ga izbral za seminarsko nalogo. Že dlje časa je bilo znano, da ephirinB2, ApoER2 in Reelin sodelujejo pri razvoju možganov kot regulatorji migracije nevronov. Znanstveniki so preverili, če sodelujejo tudi pri procesih prenosa in vgradnje AMPAR v membrano. S tehniko knockout (inaktivacija določenih genov) ter z imunoprecepcijo, so selektivno inhibirali interakcije med proteini, rezultate pa so beležili s fluorescentnimi analizami in prenosom western. Ugotovili so, da tvorba kompleksa multiplih receptorjev ApoER2/ephirinB2/AMPAR in GRIP1 povzroči vgradnjo tega AMPAR na membrano dendrita in sproži signalne kaskade, ki regulirajo vgradnjo novih AMPAR. Ko je bila interakcija med temi proteini inhibirana, so bili nevroni nezmožni reagirati na spremembe v njihovem omrežju, kar je zmanjšano sinaptično aktivnost. To pomeni, da skupki teh proteinov vzdržujejo oz. ojačajo sinaptično aktivnost. S tem so znanstveniki dokazali, da zgoraj omenjen kompleks receptorjev zares sodeluje pri tvorbi spominov.

'''Laura Gašperšič: Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2'''

Pri Alzheimerjevi bolezni je glavni simptom okvara spomina, do česar pride zaradi utišanja genov, ki sodelujejo pri tvorbi novih spominov. Do utišanja pride zaradi deacetilacije histonov, ki jo povzročijo encimi histonske deacetilaze (HDAC). Pri utišanju genov za tvorbo spominov je najpomembnejši HDAC2. Njegova raven je pri bolnikih z Alzheimerjevo boleznijo povišana. Encimi HDAC so si po zgradbi podobni, poleg tega tvori en encim več različnih kompleksov, kar lahko pri inhibiciji encimov HDAC sproži tudi stranske učinke. Raziskovalci so zato želeli najti molekulo, s katero se HDAC2 veže na promotorje genov za učenje in spomin. S prvimi raziskavami so določili 3 najbolj verjetne proteine: Tdp2, Sap30 in Sp3, z meritvami pa so ugotovili, da Sp3 vpliva na delovanje sinapse. V nadaljnjih raziskavah so dokazali, da kompleks med HDAC2 in Sp3 v bolezenskem stanju z vezavo na promotorje negativno uravnava izražanje genov povezanih z delovanjem sinapse. V zadnjem delu raziskave so želeli določiti del HDAC2, ki se veže na Sp3 in inhibirati nastanek kompleksa med HDAC2 in Sp3. Ugotovili so, da se na Sp3 veže C-konec HDAC2. C-končni fragment HDAC2 se že sam veže na Sp3, s čimer se zmanjša število kompleksov med HDAC2 in Sp3 na promotorjih. Fragment HDAC2 pa se ne veže na druge proteine, s katerimi HDAC nadzorujejo druge pomembne procese. Izražanje C-končnega fragmenta HDAC2 torej predstavlja obetaven način, s katerim bi lahko zdravili nevrološke bolezni povezane z okvarami spomina.

'''Maja Škof: Pomen S-proteinov pri prilagajanju koronavirusov na okolje'''

Koronavirusi so razširjeni po vsem svetu in največkrat povzročajo okužbe dihal pri ljudeh in živalih. Spadajo med RNA viruse, za katere je značilna visoka stopnja genskih mutacij, kar jim omogoča, da se uspešno prilagajajo na okolje. S-proteini so trimerni proteini, s katerimi se koronavirusi vežejo na gostiteljsko celico, nato pa sprožijo spojitev virusne in celične membrane, kar omoči, da virusna RNA preide v celico. S-proteini so sestavljeni iz dveh podenot, S1 in S2. Pri vezavi na celični protein sodeluje zunanji del podenote S1, ki je v obliki treh podaljšanih zank (receptorsko-vezavne zanke). Med aminokislinami S-proteina in receptorskega proteina se vzpostavijo medmolekulske vezi, nato pa podenota S2 sproži spojitev s celično membrano. S1 je tudi glavna tarča protiteles, ki preprečujejo virusu, da bi vstopil v celico. A protitelo, ki se uspešno veže na sev virusa, ob ponovni okužbi virusa ne prepozna več. To je posledica naključnih genskih mutacij. Analiza genomov koronavirusov, izoliranih v zadnjih 50-ih letih, je pokazala, da se receptorsko-vezavne zanke S-proteinon med seboj občutno razlikujejo. Kar 73% aminokislin na receptorsko-vezavnih zankah variira. Odstotek je ravno dovolj velik, da se koronavirusi še vedno lahko vežejo na receptor, protitelesa pa jih ne zaznajo več.

'''Tadej Medved: Identifikacija vezavnih mest proteinov WASP na aktinski ojedritveni kompleks Arp2/3'''

Ključnega pomena za procese, kot so celično gibanje in endocitoza, so aktinski filamenti. Nastanek in prerazporeditev le-teh nadzorujejo določeni proteinski kompleksi; za razvejane aktinske filamente je to Arp2/3. Le-ta je sestavljen iz več podenot; najpomembnejši sta Arp2 in Arp3, ki sta po strukturi podobni aktinu. Na Arp2/3 se vežejo proteini družine WASP, ki spravijo proteinski kompleks v konformacijo, pri kateri lahko dejansko vrši nastanek novih filamentov. Za vse WASP-e velja, da se na Arp2/3 vežejo z odsekom VCA(verprolin, central, acidic), a do podatkov o strukturah takšnih vezi se znanost še ni dokopala. S pomočjo "cross-linking" masne spektrometrije in "reversed phase liquid" kromatografije je pred kratkim nastal model, ki zadovoljivo opisuje mesta, na katera se vežejo WASP-i. Vezava namreč poteka na dveh mestih: na hrbtni strani Arp2/3 in na spodnji strani kompleksa, pri Arp2 in poddomeno ARPC1. Na Arp2/3 se pri WASP-u veže odsek CA, konec odseka V pa ostaja prost za vezavo aktina. Izkazalo se je, da se za uspešno nukleacijo aktina vezavni mesti za aktin in CA ne smeta prekrivati; odsek WASP C pa je še zlasti pomemben za aktivacijo Arp2/3.

'''Tina Zavodnik: Disfunkcionalni mitohondriji s pomočjo ROS zavirajo translacijsko aktivnost'''

Mitohondriji so zelo kompleksni organeli, ki za normalno opravljanje svojih funkcij potrebujejo številne proteine. Večina teh proteinov se sintetizira v citoplazmi, nato pa so uvoženi nazaj v mitohondrije. Ob morebitni okvari transportnih mehanizmov in posledično okvarjenih mitohondrijih pa pride do akumulacije proteinov v citoplazmi, kar poruši celično ravnovesje. Skupina znanstvenikov iz Nemčije in Poljske pa je odkrila mehanizem, ki poškodovanim mitohondrijem omogoča nadzor nad sintezo proteinov z induciranjem reverzibilnih sprememb na translacijskem mehanizmu. Kot signal uporabijo ROS, ki povzroči oksidacijo tiolov na peptidih, ki so sestavni deli translacijskega mehanizma. Do odkritja so prišli s kvantitativno analizo cisteinskih ostankov oz. tiolnih skupin na proteomu kvasovke Saccharomyces cerevisia ter izdelali obsežno zbirko oksidacijskih stanj peptidov, ki so vsebovali tiolne skupine. Analizo so ponovili še na gojenih celicah kvasovke, ki so bile izpostavljene induciranemu oksidativnemu stresu s pomočjo H2O2, ter na mutiranih celicah z disfunkcionalnimi mitohondriji. Pri obojih so zaznali povečano oksidacijo Cys-peptidov in zmanjšano translacijsko aktivnost. Z odstranitvijo stresorskega faktorja pa se je translacijska aktivnost delno do popolnoma obnovila, kar dokazuje, da je oksidacija peptidov, ki so del mehanizmov za sintetiziranje novih proteinov, reverzibilen proces. Cisteinski ostanki torej delujejo kot nekakšni senzorji za ROS in ob oksidativnem stresu inhibirajo sintetiziranje novih proteinov.

'''Tina Kolenc Milavec: Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli'''

Alfa-sinuklein je majhen, v vodi topen protein brez stabilne terciarne strukture, ki ga genetsko in nevropatološko povezujejo s Parkinsonovo boleznijo, o njegovi vlogi pri razvoju bolezni pa še marsikaj ni znano. Nahaja se predvsem v živčnih končičih, kjer je ravnovesje med α-sinukleinom raztopljenim v citosolu in tistim vezanim na fosfolipidni dvosloj močno regulirano. Ker se α-sinuklein nahaja na območju, kjer koncentracija kalcija ves čas močno niha, so raziskovalci Lautenschläger ''et al.'' predpostavili, da je normalna fiziološka funkcija α-sinukleina odvisna od kalcija. Da bi bolje razumeli funkcijo tega proteina, so v raziskavi izvedli več ''ex vivo'' ter ''in vitro'' eksperimentov, s katerimi so skušali ugotoviti predvsem to, kako se α-sinuklein veže na membrano sinaptičnega vezikla ter kako koncentraciji kalcija in α-sinukleina vplivata na homeostazo sinaptičnih veziklov ter na združevanje α-sinukleina v fibrilarne skupke. Povečana koncentracija kalcija in/ali α-sinukleina namreč pod določenimi pogoji povzroča toksičnost in posledično celično smrt, saj α-sinuklein oligomerizira ter tvori dolge in debele netopne fibrile, ki so del Lewyjevih telesc – citoplazemskih vključkov, značilnih za Parkinsonovo bolezen. Iz medicinskega stališča pa je zanimiva ugotovitev, da isradipin (antagonist kalicevih kanalčkov) preprečuje fibrilizacijo, saj znižuje znotrajcelično koncentracijo kalcija, kar odpira nove možnosti za razvoj zdravil proti Parkinsonovi bolezni.

'''Anže Šumah: Razvoj genskega senzorja za uničevanje celic s pomanjkanjem proteina p53'''

Protein p53 je tumorski zatiralec (tumor supresor), ki je zaradi svoje nadvse pomembne vloge pri ohranjanju celovitosti celičnega genoma pogosto deležen naziva »varuh genoma«. V normalnih primerih je izražanje tega proteina na nizki ravni, v primeru celičnega stresa pa deluje kot prepisovalni dejavnik, ki uravnava izražanje genov, ki so vključeni v nadzor celičnega cikla, popravljanje DNA in apoptozo. Ugotovili so, da je okoli 50 % vseh človeških oblik raka povezanih z mutacijami gena TP53 (gena za sintezo p53), zato so v raziskavi želeli razviti genski senzor, ki bi bil sposoben uničiti celice, ki ne sintetizirajo p53 (so rakave). Na podlagi promotorjev, ki jih p53 kot prepisovalni dejavnik zavira ali aktivira, so razvili senzor, ki v primeru pomanjkanja p53 sintetizira protein »Herpes simplex virus thymidine kinase« (HSV-TK), preko katerega lahko z zdravilom Ganciclovir uničimo rakasto celico, ki je brez p53. V primeru, da je p53 prisoten (je celica »zdrava«), pa je sinteza HSV-TK zavirana preko različnih mehanizmov. Senzor so najprej testirali na celični kulturi HCT116 (rakaste človeške črevesne celice) s fluorescentnima proteinskima markerjema, nato pa še v živih organizmih, in sicer golih miših brez imunosti. Tako so dokazali tako in vitro kot tudi in vivo uporabnost izdelanega genskega senzorja, ki bi ga bilo mogoče uporabiti v terapevtske namene.

'''Liza Praznik: Vpliv šaperonov Skp in SurA na zvijanje izvenmembranskih proteinov FhuA v terciarno strukturo'''

Naloga posebne vrste proteinov, imenovanih šaperoni je, da preoblikujejo polipeptidne verige v terciarno strukturo, v kateri so ti zmožni aktivnega delovanja. Delovanje in odzivanje šaperonov na različne dejavnike je še dokaj neznano, zato je skupina znanstvenikov Univerze v Baslu raziskovalo šaperona Skp in SurA, holdaz, ki delujeta na protein FhuA. Ta se nahaja na zunanji membrani gram negativnih bakterij, kjer služi kot receptor za ferikrom in tvori obliko beta-sodčka. Z večkratnimi ponovitvami poskusov so ugotovili, da se v prisotnosti obeh šaperonov struktura proteina, vgrajenega v membrano, ne podere, če jo delno razvijemo, ne glede na to, do katere stopnje. Šaperona sta obenem zmožna delno razvit protein preoblikovati nazaj v funkcionalno obliko, ki omogoča ponovno delovanje v membrani. Naloga obeh šaperonov je, da zadržujeta zvit polipeptid v dinamični, termodinamsko najugodnejši konformaciji, s katero se posamezni beta-zavoji polipeptida lahko vstavljajo v membrano. Ugotovljeno pa je bilo, da je šaperon SurA pri tem znatno učinkovitejši. Rezultati raziskave omogočajo boljši vpogled v mehanizme delovanja šaperonov in nakazujejo, kako pomembni so za učinkovito delovanje proteinov.

'''Urša Štrancar: Predstavitev združitve avtofagosoma in lizosoma s pomočjo para fret'''

Mitofagija je kataboličen proces razgradnje mitohondrijev s pomočjo encimov v lizosomih, pri čemer se neuporabni deli mitohondrija razgradijo in reciklirajo. Da bi tak proces lahko opazovali in ga podrobno preučili, so znanstveniki v eksperimentu ob raziskovanju mitofagije uporabili eno novejših metod za prikaz celičnih procesov v živih celicah, par FRET, ki temelji na visoki vezavni afiniteti med dvema sintetičnima molekulama (kromoforoma) CB[7]-Cy3 in AdA-Cy5. Konfokalna laserska skenirna mikroskopija je pokazala, da sta bili molekuli CB[7]-Cy3 in AdA-Cy5 najprej intracelularno ločeni in zbrani v mitohondriju oz. lizosomu, nato pa sta po združitvi lizosoma in mitohondrija tvorili kompleks gost-gostitelj, prikazan kot fluorescenčni signal para FRET, ki ga človeško oko ob opazovanju na mikroskopu lahko zazna. Ta ugotovitev pa ni prikazala le zelo stabilne vezi med CB[7] in AdA v živi celici, temveč je potrdila tudi, da par FRET lahko prikaže dinamične procese spajanja celičnih organelov v mitofagiji. Kompleks, ki ga tvorita zgoraj navedeni molekuli, prav tako ni citotoksičen, zato je zelo uporaben za raziskovanje procesa mitofagije, nadaljno pa tudi procesov avtofagije v drugih celičnih organelih.

'''Neža Žerjav: Dodajanje enega samega nukleotida omejuje aktivnost človeške telomeraze'''

Telomeraza je vrsta DNA-polimeraze, ki na konce kromosomov dodaja nukleotidna zaporedja (GGTTAG) ob pomoči matrične RNA. Procesivni katabolni cikel telomeraze sestavljajo translokacija matrice, dodajanje prvega nukleotida in dodajanje preostalih petih nukleotdov. Zanimanje znanstvenikov je vzbudila zaradi počasnega delovanja v primerjavi z ostalimi DNA-polimerazami. Za pojasnitev mehanizma, ki omejuje njeno delovanje, so znanstveniki raziskovali vpliv prekinitvenega signala matrične RNA na visoko Michaelisovo konstanto prvega nukleotida, odvisnost procesivnosti in hitrosti telomeraze v odvisnosti od koncentracije dGTP, vpliv spremenjenega prvega nukleotida in posledice odstranitve prekinitvenega signala. Prišli so do zaključka, da prekinitveni signal povzroča počasnejše dodajanje prvega nukleotida v telomerno zaporedje, kar zmanjša procesivnost in hitrost telomeraze, ki pa ju lahko lahko povečano s povečano koncentracijo ustreznega deoksinukleozid fosfata.

'''Aljaž Bratina: Intrinzična destabilizacija ribosoma'''

Sinteza proteinov v celici poteka na ribosomih, ki so sestavljeni iz dveh podenot. Med prevajanjem RNA (translacija) se genski zapis pretvori v zaporedje aminokislin, ki se zvijejo v protein. Polipeptidno verigo, ki nastaja na ribosomu, in je vezana na tRNA, imenujemo nascenti polipeptid. Hitrost translacije ni vedno enaka in je podvržena mnogim anomalijam. Včasih se od ribosoma predčasno odcepi tRNA z vezanim nascentnim polipeptidom, lahko pa določeno zaporedje v nascentnem polipeptidu celo povzroči disociacijo ribosoma na dve podenoti in s tem prekine sintezo proteina. To imenujemo intrinzična destabilizacija ribosoma (IRD). IRD-inducirajoče zaporedje je ponavadi sestavljeno iz negativno nabitih aminokislin (aspartata in glutamata) ali prolina v različnih kombinacijah. Ugotovljeno je bilo, da nekatera zaporedja povzročajo IRD le in vitro, druga pa tudi in vivo. To pomeni, da ribosom vsebuje nek mehanizem, ki IRD zavira. To je protein bL31, ki povezuje podenoti ribosoma in s tem stabilizira ribosom. Celica IRD izkorišča tudi za nadzorovanje koncentracije magnezijevih ionov. Večja kot je ta koncentracija, manj proteina MgtA (prenašalec Mg2+) se bo tvorilo. Pomembno vlogo pri tem razmerju ima MgtL, polipeptid, ki je kodiran tik pred MgtA, in vsebuje IRD zaporedje. IRD je raziskana le na prokariontskih organizmih, vendar je možno, da je ta proces prisoten tudi v evkariontih.

'''Anamarija Agnič: ATP-aza P4 s premeščanjem fosfolipidov uravnava uvihanost membrane'''

ATP-azo P4 uvrščamo v skupino membranskih proteinov, ki ob hidrolizi ATP sodelujejo pri vzdrževanju asimetrične porazdelitve lipidov v membrani; omogočajo npr. prenos membranskih fosfolipidov fosfatidilserina in fosfatidiletanolamina iz monomolekularnega sloja celične membrane na zunajcelični strani v monomolekularni sloj membrane na citosolni strani membrane. Spremembe v razporeditvi lipidov v dvosloju, ki jih povzročajo flipaze, so ključnega pomena za deformacijo membrane, česar dokaz je bil tudi temeljni znanstveni problem skupine celičnih biologov iz univerze v Kjotu. V okviru raziskave so znanstveniki preko sistema, ki na membrano iz citoplazme inducirano veže t.i. domene Bin/amphiphysin/Rvs (domene BAR), natančno opazovali stopnje membranske tubulacije. S fluorescirajočimi molekulami so označili citosolne proteine BAR, ki so občutljivi na ukrivljenost membrane, in opazovali njihovo obnašanje. Povečana aktivnost flipaze za fosfatidilholin ATP10A, ki sodi v družino ATP-az P4, je zaradi vzpostavljene neuravnovešenosti med lipidnima slojema omogočila vezavo domen BAR ter s tem spodbudila proces membranske tubulacije. Povečana aktivnost flipaze ATP10A, ki omogoči uvihanost celične membrane, velja za enega pomembnih gonilnih mehanizmov endocitoze. Plazmalema drastično spreminja obliko tudi med celičnimi migracijami, invazijo rakastih celic, celično delitvijo, sprejemanjem hrane in vstopom patogenov ter virusov v celico. Ta raziskava je prvi dokaz, da imajo spremembe v trans-lipidnem dvosloju, ki jih povzročijo ATP-aze P4, pri deformiranju bioloških membran pomembno vlogo.

'''Simona Gorgievska: Optical tools to detect metabolic changes linked to diseases'''

Metabolic changes in cell can occur at the earliest stages of disease. In most cases, knowledge of those signals is limited, since we usually detect diseases only after it has done significant damage. Now, a team led by engineers at Tufts University School of Engineering has opened a window into the cell by developing an optical tool that can read metabolism at subcellular resolution, without having to perturb cells with contrasts agents or destroy them to conduct assays.The method is based on the fluorescence of two important coenzymes (biomolecules that work in concert with enzymes) when excited by a laser beam. The coenzymes –nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and Flavin adenine dinucleotide (FAD) are involved in a large number of metabolic pathways in every cell. In order to find out the specific metabolic pathways affected by disease or stress, scientists have looked at three parameters. Those are: the ratio of FAD and NADH, the fluorescence “fade” of NADH and the organization of mitochondria as revealed by the spatial distribution of NADH within a cell (the energy producing “batteries” of the cell). The first parameter-the relative amounts of FAD to NADH -can reveal how well the cell is consuming oxygen, metabolizing sugars, or producing or breaking down fat molecules. The second parameter -the fluorescence "fade" of NADH -reveals details about the local environment of the NADH. The third parameter -the spatial distribution of NADH in the cells -shows how the mitochondria split and fuse in response to cellular growth and stress.

'''Matej Jereb: Gradnja človeške pluripotentne matične celice v funkcionalno skeletno mišično tkivo'''

V študiji so razvili prvo popolnoma delujočo 3D skeletno mišično vlakno iz človeške pluripotentne matične celice. Z uporabo štirih različnih hPSC virov so razvili ponovljivo metodo za generacijo miogenskih celic prednic (iMPC), ki so sposobne učinkovite diferenciacije v večcelične miotubule v 2D kulturi. Če je gojena v 3D okolju hidrogela se iMPC strukturno preoblikuje tako, da tvori poravnano funkcionalno skeletno mišično vlakno (iSKM vretena), ki se lahko skrči in kot odgovor na električno ali nevrotransmitersko stimulacijo prenaša kalcijeve ione (Ca2+). V obdobju štirih tednov so 3D iSKM vretena doživela hipertrofijo miotubulov in funkcionalno izboljšanje ter naprednejšo stopnjo miogenske diferenciacije v primerjavi z 2D kulturo enake starosti. Pokazali so tudi, da se da iSKM vretena uspešno implantirati. Poskusi na miših nakazujejo potencial za uporabo teh metod in vitro in in vivo.

'''Neža Blaznik: Glikozilirana sialična kislina na protitelesu IgA inhibira virus influence tipa A'''

Nekateri virusi za vezavo na gostiteljsko celico uporabljajo receptorje, ki so glikozilirani s sialično kislino. V to skupino virusov spada tudi virus tipa influence A, ki povzroča gripo. Virus se prek glikoproteina hemaglutinina veže na sialično kislino v receptorjih in tako okuži gostiteljsko celico. Protitelesa imunoglobulini G (IgG), ki se uporabljajo v cepivih za gripo, imajo glikozilirane polipeptidne verige in prav tako vsebujejo nekaj sialične kisline, vendar je vsebnost sialične kisline v imunoglobulinih A (IgA) veliko večja. Znanstveniki so primerjali delovanje dveh tipov IgG in IgA na enega izmed tipov virusa influenze A (H5N3). Ugotovili so, da oba tipa IgA nevtralizirata virus v večji meri kot IgG, poleg tega pa so s križanjem komponent obeh imunoglobulinov tudi določili domeno na IgA, ki največ prispeva k povečani nevtralizaciji virusa. S tem so torej ugotovili, da glikozilirana sialična kislina na IgA inhibira virus influence tipa A, saj se veže še na dodatno mesto virusa in tako blokira povezavo med virusom in gostiteljsko telesno celico. To znanje je uporabno v razvoju novih cepiv proti gripi, vendar zaradi same zahtevnosti testiranja IgA in vivo, želijo znanstveniki v prihodnosti sintetizirati protitelo tipa IgG, ki bi vsebovalo del verige IgA, ter tako združiti prednost obeh protiteles.

'''Liza Ulčakar: Kombinirana DNA-RNA/neoantigen nanocepiva - učinkovita imunoterapevtska metoda'''

Cepiva proti raku postajajo vedno bolj raziskana tema. Znanstveniki so zato sintetizirali kombinirano zdravilo, ki vsebuje CpG (kratka enoverižna DNA), shRNA in rakave neoantigene. CpG deluje kot imunostimulator, saj se veže na receptor TLR9 v membrani endosomov antigen prezentirajočih celic in sproži imunski odgovor na rakave celice. shRNA preko RNA-interference preprečuje translacijo transkripcijskega faktorja STAT3, ki deluje imunosupresivno. Da bi zdravilo nemoteno potovalo po limfnem sistemu in prehajalo v celice, so sintetizirali kopolimer PPT-g-PEG, ki je skrčil kombinirano zdravilo. Cepivo so najprej preizkusili in vitro in ugotovili, da cepivo deluje imunostimulativno - antigen prezentirajoče celice so začele sproščati več citokinov, proizvodnja proteina STAT3 se je zmanjšala. Nato so poskus ponovili še in vivo, miših, ki so bile okužene z adenokarcinomom debelega črevesa. Mišim so nato odstranili organe z metastazami in opazili, da se je tumor pri miših, ki so bile zdravljene s kombiniranim zdravilom v primerjavi z mišmi, ki zdravila niso dobile, močno zmanjšal.

'''Matija Ruparčič: Od strupenih kompleksov do zlatih zrnc s ''Cupriavidus mellidurans'''''

Kakor voda, ogljik in dušik, tudi zlato kroži v naravi. Eden izmed organizmov, ki to omogoča, je ''Cupriavidus metallidurans''. Ta betaproteobakterija je skozi čas razvila vrsto mehanizmov, ki jo ščitijo pred velikimi koncentracijami težkih kovin. Problem pa se pojavi, ko je v prsteh prisotno zlato. To namreč inhibira glavno črpalko bakrovih ionov CupA in tako vodi do sinergistične toksičnosti bakra in zlata. Bakterija črpalk za zlato nima, zato je morala razviti mehanizem, ki bi preprečil sam vstop zlata v citoplazmo. Ker imajo bakterije, ki živijo v prsteh z večjo koncentracijo Au, v povprečju večje število encima CopA, ki ga skupaj z drugimi proteini kodirajo geni ''copABCD'', so se znanstveniki osredotočili nanj. Ugotovili so, da so produkti genov ''copABCD'' zasluženi za povečano odpornost na Cu/Au mešanice, CopA pa poleg Cu(I) oksidira tudi Au(I) ione v Au(III), nato pa pomaga pri redukciji le-teh do Au(0) nanodelcev. Rezultati raziskave tako predstavljajo nov korak k popolnemu razumevanju biogeokemičnega cikla zlata.

TBK2018-seminar

2018-04-23T09:16:29Z

Matija Ruparčič: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Doroteja Armič || Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180118162449.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Martina Lokar || Liza Ulčakar || Zoja Siter
|-
| Valeriya Musina || Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171213124751.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Nika Boštic || Tiana Karmen Kokalj || Aljaž Bratina
|-
| Dea Simonič || Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170824141207.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Sumeja Kudelić || Jernej Imperl || Anamarija Agnič
|-
| Neža Štremfelj ||Delovanje inzulinskih receptorjev||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103256.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Luka Gnidovec || Matija Ruparčič || Simona Gorgievska
|-
| Gašper Komatar || Tvorba kompleksa receptorjev ApoER2, ephirinB2 in AMPAR, ki jih povezuje GRIP1, sodeluje pri tvorbi spomina || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171009093207.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Lara Hrvatin || Tiana Karmen Kokalj || Matej Jereb
|-
| Marko Pavleković || Prehajanje imunskih celic, povzročiteljic multiple skleroze, skozi krvno-možgansko pregrado || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171121155811.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Klementina Polanec || Meta Kodrič || Lara Drinovec
|-
| Laura Gašperšič || Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170808150001.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Karmen Mlinar || Ana Menegalija || Maks Kumek
|-
| Rebeka Dajčman || Več mehanizmov poganja dinamiko kalcijevega signala okoli lasersko povzročene rane epitelija || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171003124646.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Ula Nikolaja Ratajec || Andreja Marija Belič || Neža Blaznik
|-
| Maja Škof || Pomen S-proteinov pri prilagajanju koronavirusov na okolje. || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171127105937.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Doroteja Armič || Barbara Jaklič || Liza Ulčakar
|-
| Tina Kolenc Milavec || Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219071758.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Valeriya Musina || Eva Gartner || Jana Rajchevska
|-
| Tina Zavodnik || Disfunkcionalni mitohondriji s pomočjo ROS zavirajo translacijsko aktivnost || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180202112629.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Dea Simonič || Martina Lokar || Jernej Imperl
|-
| Tadej Medved || Identifikacija vezavnih mest proteinov WASP na aktinski ojedritveni kompleks Arp2/3 || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180305130632.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Neža Štremfelj || Nika Boštic || Matija Ruparčič
|-
| Bogdan Jovićević || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Laura Gašperšič || Lara Hrvatin || Ana Menegalija
|-
| Polona Kalan || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180214111055.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Rebeka Dajčman || Klementina Polanec || Andreja Marija Belič
|-
| Liza Praznik ||Vpliv šaperono Skp in SurA na zvijanje proteinov FhuA v terciarno strukturo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2015/09/150907113757.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Maja Škof || Karmen Mlinar || Barbara Jaklič
|-
| Anže Šumah || Razvoj genskega senzorja za uničevanje celic s pomanjkanjem proteina p53 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171114104201.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Tina Kolenc Milavec || Ula Nikolaja Ratajec || Eva Gartner
|-
| Neža Žerjav|| Dodajanje enega samega nukleotida omejuje aktivnost človeške telomeraze ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180227142114.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tina Zavodnik || Doroteja Armič || Martina Lokar
|-
| Urša Štrancar || Predstavitev združitve avtofagosoma in lizosoma s pomočjo supermolekularnega para FRET || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103254.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tadej Medved || Valeriya Musina || Nika Boštic
|-
| Zoja Siter || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Neža Žerjav || Dea Simonič || Sumeja Kudelić
|-
| Aljaž Bratina || Intrinzična destabilizacija ribosoma || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171120101314.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Anastasija Nechevska || Neža Štremfelj || Luka Gnidovec
|-
| Anamarija Agnič || ATP-aza P4 s premeščanjem fosfolipidov uravnava uvihanost membrane || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180329141014.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Bogdan Jovićević || Sumeja Kudelić || Lara Hrvatin
|-
| Simona Gorgievska || Optical tools to detect metabolic changes linked to disease || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180307161351.htm|| 10.04. || 13.04. || 16.04. || Polona Kalan || Marko Pavleković || Klementina Polanec
|-
| Matej Jereb || Gradnja človeške pluripotentne matične celice v funkcionalno skeletno mišično tkivo|| https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180109104707.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Liza Praznik || Laura Gašperšič || Karmen Mlinar
|-
| Lara Drinovec || Tavrin pomaga obnoviti zaradi multiple skleroze poškodovane celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171208143024.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Anže Šumah || Rebeka Dajčman || Ula Nikolaja Ratajec
|-
| Maks Kumek || Dinamični izvor sprememb specifčne toplote v encimsko kataliziranih reakcijah || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180321090854.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Marko Pavleković || Maja Škof || Doroteja Armič
|-
| Neža Blaznik || Glikozilirana sialična kislina na protitelesu IgA inhibira virus influence tipa A || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180403111203.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Urša Štrancar || Tina Kolenc Milavec || Valeriya Musina
|-
| Liza Ulčakar || Kombinirana DNA-RNA/antigen nanocepiva - učinkovita imunoterapevtska metoda ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171129163851.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Zoja Siter || Tina Zavodnik || Dea Simonič
|-
| Anastasija Nechevska || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180319155730.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Aljaž Bratina || Tadej Medved || Neža Štremfelj
|-
| Jernej Imperl || Optimizacija protimikrobnih peptidov s pomočjo virtualnih metod || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180416085922.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Anamarija Agnič || Neža Žerjav || Luka Gnidovec
|-
| Matija Ruparčič || Od strupenih kompleksov do zlatih zrnc s ''Cupriavidus metallidurans'' || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180131095453.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Simona Gorgievska || Anastasija Nechevska || Marko Pavleković
|-
| Tiana Karmen Kokalj || B-1a limfociti spodbujajo oligodendrogenezo med razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180313091702.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Matej Jereb || Bogdan Jovićević || Laura Gašperšič
|-
| Meta Kodrič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180416155619.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Lara Drinovec || Polona Kalan || Rebeka Dajčman
|-
| Ana Menegalija || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Maks Kumek || Liza Praznik || Maja Škof
|-
| Andreja Marija Belič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Neža Blaznik || Anže Šumah || Tina Kolenc Milavec
|-
| Barbara Jaklič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180220161201.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Liza Ulčakar || Meta Kodrič || Tina Zavodnik
|-
| Eva Gartner || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Gašper Komatar || Urša Štrancar || Tadej Medved
|-
| Martina Lokar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180301144138.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Jernej Imperl || Zoja Siter || Neža Žerjav
|-
| Nika Boštic || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Matija Ruparčič || Aljaž Bratina || Anastasija Nechevska
|-
| Sumeja Kudelić || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171221122927.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Tiana Karmen Kokalj || Anamarija Agnič || Bogdan Jovićević
|-
| Luka Gnidovec || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Meta Kodrič || Simona Gorgievska || Polona Kalan
|-
| Lara Hrvatin || Mg2+ ioni omogočajo kondenzacijo kromosomov || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180201104559.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Ana Menegalija || Matej Jereb || Liza Praznik
|-
| Klementina Polanec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Andreja Marija Belič || Lara Drinovec || Anže Šumah
|-
| Karmen Mlinar || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Barbara Jaklič || Maks Kumek || Gašper Komatar
|-
| Ula Nikolaja Ratajec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Eva Gartner || Neža Blaznik || Urša Štrancar
|-
| rezerva || || || 29.05. || 01.06. || 04.06. || || ||
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2018_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2018_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2018_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2018_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2018_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2018-seminar

2018-04-16T13:06:42Z

Matija Ruparčič: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Doroteja Armič || Pretvorba mišjih fibroblastov v pluripotentne matične celice s pomočjo tehnologije CRISPR || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180118162449.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Martina Lokar || Liza Ulčakar || Zoja Siter
|-
| Valeriya Musina || Metalopeptid bakrov(II) fenantrolin tarčno onemogoči delovanje mitohondrijev v matičnih celicah raka dojke || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171213124751.htm || 27.02. || 02.03. || 05.03. || Nika Boštic || Tiana Karmen Kokalj || Aljaž Bratina
|-
| Dea Simonič || Sprožilci avtoimunskih bolezni in vzroki za nekontrolirano širjenje le-teh po telesu ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170824141207.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Sumeja Kudelić || Jernej Imperl || Anamarija Agnič
|-
| Neža Štremfelj ||Delovanje inzulinskih receptorjev||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103256.htm|| 27.02. || 02.03. || 05.03. || Luka Gnidovec || Matija Ruparčič || Simona Gorgievska
|-
| Gašper Komatar || Tvorba kompleksa receptorjev ApoER2, ephirinB2 in AMPAR, ki jih povezuje GRIP1, sodeluje pri tvorbi spomina || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171009093207.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Lara Hrvatin || Tiana Karmen Kokalj || Matej Jereb
|-
| Marko Pavleković || Prehajanje imunskih celic, povzročiteljic multiple skleroze, skozi krvno-možgansko pregrado || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171121155811.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Klementina Polanec || Meta Kodrič || Lara Drinovec
|-
| Laura Gašperšič || Alzheimerjeva bolezen: povrnitev zmožnosti pomnjenja z inhibicijo interakcije med Sp3 in HDAC2 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/08/170808150001.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Karmen Mlinar || Ana Menegalija || Maks Kumek
|-
| Rebeka Dajčman || Več mehanizmov poganja dinamiko kalcijevega signala okoli lasersko povzročene rane epitelija || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/10/171003124646.htm || 06.03. || 09.03. || 12.03. || Ula Nikolaja Ratajec || Andreja Marija Belič || Neža Blaznik
|-
| Maja Škof || Pomen S-proteinov pri prilagajanju koronavirusov na okolje. || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171127105937.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Doroteja Armič || Barbara Jaklič || Liza Ulčakar
|-
| Tina Kolenc Milavec || Vezava kalcija na karboksilni konec α-sinukleina uravnava interakcije med sinaptičnimi vezikli || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219071758.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Valeriya Musina || Eva Gartner || Jana Rajchevska
|-
| Tina Zavodnik || Disfunkcionalni mitohondriji s pomočjo ROS zavirajo translacijsko aktivnost || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180202112629.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Dea Simonič || Martina Lokar || Jernej Imperl
|-
| Tadej Medved || Identifikacija vezavnih mest proteinov WASP na aktinski ojedritveni kompleks Arp2/3 || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180305130632.htm || 13.03. || 16.03. || 19.03. || Neža Štremfelj || Nika Boštic || Matija Ruparčič
|-
| Bogdan Jovićević || || || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Laura Gašperšič || Lara Hrvatin || Ana Menegalija
|-
| Polona Kalan || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180214111055.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Rebeka Dajčman || Klementina Polanec || Andreja Marija Belič
|-
| Liza Praznik ||Vpliv šaperono Skp in SurA na zvijanje proteinov FhuA v terciarno strukturo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2015/09/150907113757.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Maja Škof || Karmen Mlinar || Barbara Jaklič
|-
| Anže Šumah || Razvoj genskega senzorja za uničevanje celic s pomanjkanjem proteina p53 || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171114104201.htm || 20.03. || 23.03. || 26.03. || Tina Kolenc Milavec || Ula Nikolaja Ratajec || Eva Gartner
|-
| Neža Žerjav|| Dodajanje enega samega nukleotida omejuje aktivnost človeške telomeraze ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180227142114.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tina Zavodnik || Doroteja Armič || Martina Lokar
|-
| Urša Štrancar || Predstavitev združitve avtofagosoma in lizosoma s pomočjo supermolekularnega para FRET || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180219103254.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Tadej Medved || Valeriya Musina || Nika Boštic
|-
| Zoja Siter || || || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Neža Žerjav || Dea Simonič || Sumeja Kudelić
|-
| Aljaž Bratina || Intrinzična destabilizacija ribosoma || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171120101314.htm || 03.04. || 06.04. || 09.04. || Anastasija Nechevska || Neža Štremfelj || Luka Gnidovec
|-
| Anamarija Agnič || ATP-aza P4 s premeščanjem fosfolipidov uravnava uvihanost membrane || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180329141014.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Bogdan Jovićević || Sumeja Kudelić || Lara Hrvatin
|-
| Simona Gorgievska || Optical tools to detect metabolic changes linked to disease || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180307161351.htm|| 10.04. || 13.04. || 16.04. || Polona Kalan || Marko Pavleković || Klementina Polanec
|-
| Matej Jereb || Gradnja človeške pluripotentne matične celice v funkcionalno skeletno mišično tkivo|| https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180109104707.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Liza Praznik || Laura Gašperšič || Karmen Mlinar
|-
| Lara Drinovec || Tavrin pomaga obnoviti zaradi multiple skleroze poškodovane celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171208143024.htm || 10.04. || 13.04. || 16.04. || Anže Šumah || Rebeka Dajčman || Ula Nikolaja Ratajec
|-
| Maks Kumek || || || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Marko Pavleković || Maja Škof || Doroteja Armič
|-
| Neža Blaznik || Glikozilirana sialična kislina na protitelesu IgA inhibira virus influence tipa A || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/04/180403111203.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Urša Štrancar || Tina Kolenc Milavec || Valeriya Musina
|-
| Liza Ulčakar || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/11/171129163851.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Zoja Siter || Tina Zavodnik || Dea Simonič
|-
| Anastasija Nechevska || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180319155730.htm || 17.04. || 20.04. || 23.04. || Aljaž Bratina || Tadej Medved || Neža Štremfelj
|-
| Jernej Imperl || || || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Anamarija Agnič || Neža Žerjav || Luka Gnidovec
|-
| Matija Ruparčič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180131095453.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Simona Gorgievska || Anastasija Nechevska || Marko Pavleković
|-
| Tiana Karmen Kokalj || B-1a limfociti spodbujajo oligodendrogenezo med razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180313091702.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Matej Jereb || Bogdan Jovićević || Laura Gašperšič
|-
| Meta Kodrič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/01/180125101321.htm || 23.04. || 26.04. || 07.05. || Lara Drinovec || Polona Kalan || Rebeka Dajčman
|-
| Ana Menegalija || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Maks Kumek || Liza Praznik || Maja Škof
|-
| Andreja Marija Belič || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Neža Blaznik || Anže Šumah || Tina Kolenc Milavec
|-
| Barbara Jaklič || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180220161201.htm || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Liza Ulčakar || Meta Kodrič || Tina Zavodnik
|-
| Eva Gartner || || || 08.05. || 11.05. || 14.05. || Gašper Komatar || Urša Štrancar || Tadej Medved
|-
| Martina Lokar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/03/180301144138.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Jernej Imperl || Zoja Siter || Neža Žerjav
|-
| Nika Boštic || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Matija Ruparčič || Aljaž Bratina || Anastasija Nechevska
|-
| Sumeja Kudelić || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/12/171221122927.htm || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Tiana Karmen Kokalj || Anamarija Agnič || Bogdan Jovićević
|-
| Luka Gnidovec || || || 15.05. || 18.05. || 21.05. || Meta Kodrič || Simona Gorgievska || Polona Kalan
|-
| Lara Hrvatin || Mg2+ ioni omogočajo kondenzacijo kromosomov || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/02/180201104559.htm || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Ana Menegalija || Matej Jereb || Liza Praznik
|-
| Klementina Polanec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Andreja Marija Belič || Lara Drinovec || Anže Šumah
|-
| Karmen Mlinar || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Barbara Jaklič || Maks Kumek || Gašper Komatar
|-
| Ula Nikolaja Ratajec || || || 22.05. || 25.05. || 28.05. || Eva Gartner || Neža Blaznik || Urša Štrancar
|-
| rezerva || || || 29.05. || 01.06. || 04.06. || || ||
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2018_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2018_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2018_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2018_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2018_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.