Wiki FKKT - User contributions [en]

2015-bionano-seminar

2015-04-28T12:57:07Z

Maxi Sagmeister: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Avtor 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Avtor 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
|-
| Anže Prašnikar||Monika Praznik ||||29.03.||31.03.||Aneja Tuljak||Angelika Vižintin
|-
| Varja Božič||Eva Knapič||Razgradljivi kondomi s protimikrobno zaščito||29.03.||31.03.||Eva Udovič||Maja Grdadolnik
|-
| Belkisa Velagić||Aleksander Benčič||Avtomobilski encimski katalizator||29.03.||31.03.||Nika Kurinčič||Tjaša Goričan
|-
| Naja Vrankar||Valter Bergant||||31.03.||02.04.||Nataša Žigante||Luka Smole
|-
| Tilen Volčanšek||Veronika Jarc||||31.03.||02.04.||Anže Prašnikar||Jakob Gašper Lavrenčič
|-
| Tanja Lipec||Iza Ogris||Test občutljivosti na gluten z neprebavljivo kapsulo||31.03.||02.04.||Varja Božič||Klara Tereza Novoselc
|-
| Katja Lovrin||Mitja Crček||Uporaba nitrifikacijskih encimov pri kmetovanju||05.04.||07.04.||Belkisa Velagić||Monika Praznik
|-
| Saša Balažic||Urban Javoršek ||||05.04.||07.04.||Naja Vrankar||Eva Knapič
|-
| Urban Borštnik||Sara Primec||||05.04.||07.04.||Tilen Volčanšek||Aleksander Benčič
|-
| Nives Ahlin||Kim Kos||||12.04.||14.04.||Tanja Lipec||Valter Bergant
|-
| Matic Bevec||Estera Merljak||Antimaček®||12.04.||14.04.||Katja Lovrin||Veronika Jarc
|-
| Vida Špindler||Jernej Pušnik||||12.04.||14.04.||Saša Balažic||Iza Ogris
|-
| Jasmina Sedmak||Maxi Sagmeister||Brezžični zobni nanobiosenzor ||19.04.||21.04.||Urban Borštnik||Mitja Crček
|-
| Sanja Popović||Benjamin Bajželj||||19.04.||21.04.||Nives Ahlin||Urban Javoršek
|-
| Blaž Komar||Alja Zottel||||19.04.||21.04.||Matic Bevec||Sara Primec
|-
| Blaž Perič||Katarina Uršič||||03.05.||05.05.||Simon Preložnik||Kim Kos
|-
| Simon Preložnik||Maja Remškar||||03.05.||05.05.||Jasmina Sedmak||Estera Merljak
|-
| Aneja Tuljak||Tina Gregorič||||03.05.||05.05.||Sanja Popović||Jernej Pušnik
|-
| Damir Hamulić||Anita Kustec||||10.05.||12.05.||Blaž Komar||Maxi Sagmeister
|-
| Janja Fortin||Tina Snoj||||10.05.||12.05.||Blaž Perič||Benjamin Bajželj
|-
| Rajko Vnuk||Mojca Banič||||10.05.||12.05.||Vida Špindler||Alja Zottel
|-
| Rok Grm||Ajda Rojc||||17.05.||19.05.||Kaja Javoršek||Katarina Uršič
|-
| Kristina Gavranić||Barbara Žužek||||17.05.||19.05.||Damir Hamulić||Maja Remškar
|-
| Urška Mohorič||Griša Prinčič||||17.05.||19.05.||Janja Fortin||Tina Gregorič
|-
| Maja Ramić||Nejc Petrišič||||24.05.||26.05.||Rajko Vnuk||Anita Kustec
|-
| Barbara Jeras||Tamara Marić||||24.05.||26.05.||Rok Grm||Tina Snoj
|-
| Matic Urlep||Samo Zakotnik||||24.05.||26.05.||Kristina Gavranić||Mojca Banič
|-
| Urban Verbič||Angelika Vižintin||||31.05.||02.06.||Urška Mohorič||Ajda Rojc
|-
| Nataša Žigante||Maja Grdadolnik||||31.05.||02.06.||Maja Ramić||Barbara Žužek
|-
| Kaja Javoršek||Tjaša Goričan||||31.05.||02.06.||Barbara Jeras||Griša Prinčič
|-
| Eva Udovič||Luka Smole||||07.06.||09.06.||Matic Urlep||Nejc Petrišič
|-
| Nika Kurinčič||Jakob Gašper Lavrenčič||||07.06.||09.06.||Urban Verbič||Tamara Marić
|-
| Klara Tereza Novoselc||||||07.06.||09.06.||Samo Zakotnik||
|}

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja najdete v [http://ucilnica.fkkt.uni-lj.si/ spletni učilnici].

==Naloga==
'''Vaša naloga je: '''
Po dva študenta skupaj pripravita projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt.
Predlagana struktura:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Prva stran seminarja naj vsebuje naslov projekta, avtorje, povzetek (od 130 do 160 besed) in grafični povzetek (čez približno pol strani)
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 1500 do 2000 besed . Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut, predstavitev pa ne sme biti krajša od 15 minut (popust :-)). Nalogo predstavita oba študenta (razdelita si čas). Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo pripombe k projektu in postavijo po dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem receptu:
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.doc(x) za seminar, npr. 19_nano_Craik_Venter.docx
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.ppt(x) za prezentacijo, npr. 19_nano_Craik_Venter.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1WdCXoXo1zkRrVlLKIcEV1z_MyhavU-3ERBm9n2oiawI/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do predstavitve seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1ToLPn78T9W3G6Hm5hV0mLseFYghiLQMlRPGb0J5zft8/viewform mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

Proizvodnja funkcionalno aktivnih človeških rastnih faktorjev v insektih uporabljenih kot žive biotovarne

2015-03-24T23:08:05Z

Maxi Sagmeister: /* BIOAKTIVNOST RF */

== UVOD ==

Rastni faktorji (RF) so endogeni signalni peptidi, ki se specifično vežejo na receptorje na celični površini. So pomembni aktivni mediatorji pri celični rasti, proliferaciji, diferenciaciji in signaliziranju. Trenutne raziskave o celjenju ran so osredotočene na rastne faktorje, ki sodelujejo pri procesu celjenja ran, celični proliferaciji in migraciji. Pojavljajo se vprašanja zmanjševanja časa celjenja s vplivanjem na potek vnetja in možnostjo pospeševanja proliferativne faze.

== IZBOR PRIMERNIH REKOMBINANTNIH RF ==

V raziskavi so se osredotočili na pripravo treh rekombinantnih človeških RF, ki dokazano sodelujejo pri procesu celjenja ran in pri celični proliferaciji. To so bili: epidermalni (huEGF), fibroblastni (huFGF2) in keratinocitni rastni faktor (huKGF1).
Za vsak RF so pripravili različne genske konstrukte, nekateri so imeli na terminalnem delu zapis za signalno zaporedje KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) ali pa signalni peptid melitin. Vsi so vsebovali His-tag zaporedje in na 5' koncu Kozakovo zaporedje za členonožce (CAAATG), ki igra pomembno vlogo pri iniciaciji translacije. Pripravljena nukleotidna zaporedja so klonirali v homologna restrikcijska mesta pFastBac1™ vektorja. S tem so dobili donorske plazmide, ki so jih klonirali v celice ''E.coli'', v katerih sta že bila pomožni plazmid z zapisom za transpozazo in bakmid, bakulovirusni vektor. Opisani sistem imenujemo Bac-to-Bac® bakulovirusni sistem, v katerem pride do mestno-specifičnega prenosa genskega zapisa z donorskega plazmida na bakmid. Tako dobimo rekombinantne bakuloviruse. Nadalje so bakuloviruse pomnoževali v Sf21 insektnih celicah. Rekombinante bakuloviruse so injekcirali v ličinke insekta ''Trichoplusia ni''. Po 72 ur gojenja v rastnih komorah, so iz ekstraktov ličink pridobili proteine.
Glede na stopnjo topnosti proteinov in stopnjo smrtnosti okuženih ličink za vsak posamezen primer, so za nadaljevanje raziskave izbrali inokulacijsko dozo 5000 pfu/ ličinko in sicer z bakulovirusi bacMelEGFHis, bacFGF2His in bacKGF1HisKDEL. Izbrane 3 rekombinantne proteine so očistili in uporabili za testiranje funkcionalnosti. Ekspresijski izkupiček je bil 4.1 mg (za huEGF), 1.9 mg (za huFGF) in 0.5 mg (za huKGF) / g mase insekta.
Za nadaljno optimizacijo izkoristka produkcije človeških RF v ličinkah insektov so pripravili še različne konstrukte fuzirane z modificirano Fc regijo človeškega protitelesa IgG. Do povečanja izražanja fuzijskih proteinov v primerjavi z nefuzijskimi je prišlo samo v primerih konstruktov za človeški keratinocitni RF (huKGF1). Ekspresijsko najbolj produktiven je bil konstrukt bacMelKGF1Hinge-, dobili so kar 1.6 mg/g mase insekta.

== BIOAKTIVNOST REKOMBINANTNIH RF ==

Vsi trije rekombinanti RF so biološko aktivni, kar so dokazali s tremi testi. V prvem so preverjali njihovo sposobnost aktivacije ERK 1/2 poti (pride do fosforilacije). Tri vrste dermalnih celic so stimulirali z dodatkom očiščenih rekombinantnih RF. Celice so nato sprali, ekstrahirali njihove proteine in jih analizirali z NaDS-PAGE in naredili western prenos z uporabo anti-p-ERK 1/2 monoklonskimi protitelesi. RF so aktivirali fosforilacijo ERK 1/2. V drugem testu so celice stimulirali z naraščajočimi koncentracijami očiščenih RF. Določevanje celične proliferacije je potekalo z MTT metodo, ki je potrdila biološko aktivnost RF. V tretjem testu so preverjali uspešnost celjenja rane in vitro, dodani rekombinantni RF so aktivirali migracijo epitelijskih celic na mesto poškodbe in po 48 urah je bila dosežena skoraj popolna zacelitev rane.

== ZAKLJUČEK ==

Znanstvenikom je uspelo prikazati ekspresijo treh funkcionalno aktivnih človeških RF v ličinkah insekta ''T. ni'' v količinah, ki jih doslej z konvencionalnimi metodami še ni uspelo doseči. Dokazali so, da je predstavljena metoda uporabe bakulovirusnega vektorskega sistema in insektov kot žive biotovarne, lahko odličen alternativen ne-fermentacijski sistem za pridobivanje večjih količin človeških rastnih faktorjev, ki bi se lahko razširil na industrijsko proizvodnjo za namene regenerativne medicine ali kozmetike. Uporaba insektov namesto insektnih celičnih kultur omogoča poleg povečanje izkupička same ekspresije in krajšega razvojnega časa, stroškovno učinkovitejšo proizvodnjo proteinov brez uporabe tehnološko zahtevnih fermentacijskih postopkov.

Proizvodnja funkcionalno aktivnih človeških rastnih faktorjev v insektih uporabljenih kot žive biotovarne

2015-03-24T23:07:39Z

Maxi Sagmeister: /* IZBOR PRIMERNIH RF */

== UVOD ==

Rastni faktorji (RF) so endogeni signalni peptidi, ki se specifično vežejo na receptorje na celični površini. So pomembni aktivni mediatorji pri celični rasti, proliferaciji, diferenciaciji in signaliziranju. Trenutne raziskave o celjenju ran so osredotočene na rastne faktorje, ki sodelujejo pri procesu celjenja ran, celični proliferaciji in migraciji. Pojavljajo se vprašanja zmanjševanja časa celjenja s vplivanjem na potek vnetja in možnostjo pospeševanja proliferativne faze.

== IZBOR PRIMERNIH REKOMBINANTNIH RF ==

V raziskavi so se osredotočili na pripravo treh rekombinantnih človeških RF, ki dokazano sodelujejo pri procesu celjenja ran in pri celični proliferaciji. To so bili: epidermalni (huEGF), fibroblastni (huFGF2) in keratinocitni rastni faktor (huKGF1).
Za vsak RF so pripravili različne genske konstrukte, nekateri so imeli na terminalnem delu zapis za signalno zaporedje KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) ali pa signalni peptid melitin. Vsi so vsebovali His-tag zaporedje in na 5' koncu Kozakovo zaporedje za členonožce (CAAATG), ki igra pomembno vlogo pri iniciaciji translacije. Pripravljena nukleotidna zaporedja so klonirali v homologna restrikcijska mesta pFastBac1™ vektorja. S tem so dobili donorske plazmide, ki so jih klonirali v celice ''E.coli'', v katerih sta že bila pomožni plazmid z zapisom za transpozazo in bakmid, bakulovirusni vektor. Opisani sistem imenujemo Bac-to-Bac® bakulovirusni sistem, v katerem pride do mestno-specifičnega prenosa genskega zapisa z donorskega plazmida na bakmid. Tako dobimo rekombinantne bakuloviruse. Nadalje so bakuloviruse pomnoževali v Sf21 insektnih celicah. Rekombinante bakuloviruse so injekcirali v ličinke insekta ''Trichoplusia ni''. Po 72 ur gojenja v rastnih komorah, so iz ekstraktov ličink pridobili proteine.
Glede na stopnjo topnosti proteinov in stopnjo smrtnosti okuženih ličink za vsak posamezen primer, so za nadaljevanje raziskave izbrali inokulacijsko dozo 5000 pfu/ ličinko in sicer z bakulovirusi bacMelEGFHis, bacFGF2His in bacKGF1HisKDEL. Izbrane 3 rekombinantne proteine so očistili in uporabili za testiranje funkcionalnosti. Ekspresijski izkupiček je bil 4.1 mg (za huEGF), 1.9 mg (za huFGF) in 0.5 mg (za huKGF) / g mase insekta.
Za nadaljno optimizacijo izkoristka produkcije človeških RF v ličinkah insektov so pripravili še različne konstrukte fuzirane z modificirano Fc regijo človeškega protitelesa IgG. Do povečanja izražanja fuzijskih proteinov v primerjavi z nefuzijskimi je prišlo samo v primerih konstruktov za človeški keratinocitni RF (huKGF1). Ekspresijsko najbolj produktiven je bil konstrukt bacMelKGF1Hinge-, dobili so kar 1.6 mg/g mase insekta.

== BIOAKTIVNOST RF ==

Vsi trije rekombinanti RF so biološko aktivni, kar so dokazali s tremi testi. V prvem so preverjali njihovo sposobnost aktivacije ERK 1/2 poti (pride do fosforilacije). Tri vrste dermalnih celic so stimulirali z dodatkom očiščenih rekombinantnih RF. Celice so nato sprali, ekstrahirali njihove proteine in jih analizirali z NaDS-PAGE in naredili western prenos z uporabo anti-p-ERK 1/2 monoklonskimi protitelesi. RF so aktivirali fosforilacijo ERK 1/2. V drugem testu so celice stimulirali z naraščajočimi koncentracijami očiščenih RF. Določevanje celične proliferacije je potekalo z MTT metodo, ki je potrdila biološko aktivnost RF. V tretjem testu so preverjali uspešnost celjenja rane in vitro, dodani rekombinantni RF so aktivirali migracijo epitelijskih celic na mesto poškodbe in po 48 urah je bila dosežena skoraj popolna zacelitev rane.

== ZAKLJUČEK ==

Znanstvenikom je uspelo prikazati ekspresijo treh funkcionalno aktivnih človeških RF v ličinkah insekta ''T. ni'' v količinah, ki jih doslej z konvencionalnimi metodami še ni uspelo doseči. Dokazali so, da je predstavljena metoda uporabe bakulovirusnega vektorskega sistema in insektov kot žive biotovarne, lahko odličen alternativen ne-fermentacijski sistem za pridobivanje večjih količin človeških rastnih faktorjev, ki bi se lahko razširil na industrijsko proizvodnjo za namene regenerativne medicine ali kozmetike. Uporaba insektov namesto insektnih celičnih kultur omogoča poleg povečanje izkupička same ekspresije in krajšega razvojnega časa, stroškovno učinkovitejšo proizvodnjo proteinov brez uporabe tehnološko zahtevnih fermentacijskih postopkov.

Proizvodnja funkcionalno aktivnih človeških rastnih faktorjev v insektih uporabljenih kot žive biotovarne

2015-03-24T23:01:01Z

Maxi Sagmeister:

== UVOD ==

Rastni faktorji (RF) so endogeni signalni peptidi, ki se specifično vežejo na receptorje na celični površini. So pomembni aktivni mediatorji pri celični rasti, proliferaciji, diferenciaciji in signaliziranju. Trenutne raziskave o celjenju ran so osredotočene na rastne faktorje, ki sodelujejo pri procesu celjenja ran, celični proliferaciji in migraciji. Pojavljajo se vprašanja zmanjševanja časa celjenja s vplivanjem na potek vnetja in možnostjo pospeševanja proliferativne faze.

== IZBOR PRIMERNIH RF ==

V raziskavi so se osredotočili na pripravo treh rekombinantnih človeških RF, ki dokazano sodelujejo pri procesu celjenja ran in pri celični proliferaciji. To so bili: epidermalni (huEGF), fibroblastni (huFGF2) in keratinocitni rastni faktor (huKGF1).
Za vsak RF so pripravili različne genske konstrukte, nekateri so imeli na terminalnem delu zapis za signalno zaporedje KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) ali pa signalni peptid melitin. Vsi so vsebovali His-tag zaporedje in na 5' koncu Kozakovo zaporedje za členonožce (CAAATG), ki igra pomembno vlogo pri iniciaciji translacije. Pripravljena nukleotidna zaporedja so klonirali v homologna restrikcijska mesta pFastBac1™ vektorja. S tem so dobili donorske plazmide, ki so jih klonirali v celice ''E.coli'', v katerih sta že bila pomožni plazmid z zapisom za transpozazo in bakmid, bakulovirusni vektor. Opisani sistem imenujemo Bac-to-Bac® bakulovirusni sistem, v katerem pride do mestno-specifičnega prenosa genskega zapisa z donorskega plazmida na bakmid. Tako dobimo rekombinantne bakuloviruse. Nadalje so bakuloviruse pomnoževali v Sf21 insektnih celicah. Rekombinante bakuloviruse so injekcirali v ličinke insekta ''Trichoplusia ni''. Po 72 ur gojenja v rastnih komorah, so iz ekstraktov ličink pridobili proteine.
Glede na stopnjo topnosti proteinov in stopnjo smrtnosti okuženih ličink za vsak posamezen primer, so za nadaljevanje raziskave izbrali inokulacijsko dozo 5000 pfu/ ličinko in sicer z bakulovirusi bacMelEGFHis, bacFGF2His in bacKGF1HisKDEL. Izbrane 3 rekombinantne proteine so očistili in uporabili za testiranje funkcionalnosti. Ekspresijski izkupiček je bil 4.1 mg (za huEGF), 1.9 mg (za huFGF) in 0.5 mg (za huKGF) / g mase insekta.
Za nadaljno optimizacijo izkoristka produkcije človeških RF v ličinkah insektov so pripravili še različne konstrukte fuzirane z modificirano Fc regijo človeškega protitelesa IgG. Do povečanja izražanja fuzijskih proteinov v primerjavi z nefuzijskimi je prišlo samo v primerih konstruktov za človeški keratinocitni RF (huKGF1). Ekspresijsko najbolj produktiven je bil konstrukt bacMelKGF1Hinge-, dobili so kar 1.6 mg/g mase insekta.

== BIOAKTIVNOST RF ==

Vsi trije rekombinanti RF so biološko aktivni, kar so dokazali s tremi testi. V prvem so preverjali njihovo sposobnost aktivacije ERK 1/2 poti (pride do fosforilacije). Tri vrste dermalnih celic so stimulirali z dodatkom očiščenih rekombinantnih RF. Celice so nato sprali, ekstrahirali njihove proteine in jih analizirali z NaDS-PAGE in naredili western prenos z uporabo anti-p-ERK 1/2 monoklonskimi protitelesi. RF so aktivirali fosforilacijo ERK 1/2. V drugem testu so celice stimulirali z naraščajočimi koncentracijami očiščenih RF. Določevanje celične proliferacije je potekalo z MTT metodo, ki je potrdila biološko aktivnost RF. V tretjem testu so preverjali uspešnost celjenja rane in vitro, dodani rekombinantni RF so aktivirali migracijo epitelijskih celic na mesto poškodbe in po 48 urah je bila dosežena skoraj popolna zacelitev rane.

== ZAKLJUČEK ==

Znanstvenikom je uspelo prikazati ekspresijo treh funkcionalno aktivnih človeških RF v ličinkah insekta ''T. ni'' v količinah, ki jih doslej z konvencionalnimi metodami še ni uspelo doseči. Dokazali so, da je predstavljena metoda uporabe bakulovirusnega vektorskega sistema in insektov kot žive biotovarne, lahko odličen alternativen ne-fermentacijski sistem za pridobivanje večjih količin človeških rastnih faktorjev, ki bi se lahko razširil na industrijsko proizvodnjo za namene regenerativne medicine ali kozmetike. Uporaba insektov namesto insektnih celičnih kultur omogoča poleg povečanje izkupička same ekspresije in krajšega razvojnega časa, stroškovno učinkovitejšo proizvodnjo proteinov brez uporabe tehnološko zahtevnih fermentacijskih postopkov.

MBT seminarji 2015

2015-03-24T22:59:21Z

Maxi Sagmeister:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2014/15'''

Tabela za razpored po tednih bo objavljena v spletni učilnici, vanjo pa se vpišite tudi za kratke predstavitve novic (3 min, dvakrat v semestru). Na tej strani bo samo seznam odobrenih člankov za seminar in povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje tri dni pred predstavitvijo (ponedeljek oz. torek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. lani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2014
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' 

# Successful high-level accumulation of fish oil omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in a transgenic oilseed crop (Ruiz-Lopez, N., et al; The plant journal 77, 198-208, 2014; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24308505). [[Uspešna priprava gensko spremenjene oljne rastline z visoko vsebnostjo omega-3 polinenasičenih maščobnih kislin.]] Petra Malavašič, 20. marca 2015
#A simpliﬁed and accurate detection of the genetically modiﬁed wheat MON71800 with one calibrator plasmid (Jae Juan, S.,et al; Food Chemistry 176, 1-6, ;http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S03088146140196572015 [[Poenostavljena in točna detekcija gensko spemenjene pšenice MON71800 z enim kalibratorskim plazmidom]] Matej Lesar, 20.marca 2015

'''Gensko spremenjene živali''' 

# A novel adenoviral vector carrying an all-in-one Tet-On system with an autoregulatory loop for tight, inducible transgene expresion (H. Chen; et all.; BMC Biotechnology 2015, 15:4, doi:10.1186/s12896-015-0121-4; http://www.biomedcentral.com/1472-6750/15/4). Edvinas Grauželis, 27. marca 2015 (in English)
# Production of functional active human growth factors in insects used as living biofactories (B. Dudognon, et al; Journal of Biotechnology 184, 229–239, 2014; http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2014.05.030). [[Proizvodnja funkcionalno aktivnih človeških rastnih faktorjev v insektih uporabljenih kot žive biotovarne]] Maxi Sagmeister, 27. marca 2015

'''Okolje''' 
# Bioremediation of pesticide contaminated water using an organophosphate degrading enzyme immobilized on nonwoven polyester textiles (Yuan Gao ''et al.'', Enzyme and Microbial Technology, vol. 54, pages 38-44, 10.1.2014, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022913002044). Bioremediacija s pesticidi okužene vode z uporabo encima, ki razgrajuje organofosfate in je vezan na netkan poliesterski tekstil. Mitja Crček,
# Biodegradation of atrazine by three transgenic grasses and alfalfa expressing a modified bacterial atrazine chlorohydrolase gene (A. W. Vail ''et al.''; Transgenic Research, 29. 11. 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s11248-014-9851-7). Biorazgradnja atrazina s tremi transgenskimi travami in alfalfo, ki izražajo gen za modificirano bakterijsko atrazin klorohidrolazo. Mirjam Kmetič,

'''Terapevtiki''' 
# Mind-controlled transgene expression by a wireless-powered optogenetic designer cell implant (M. Folcher; Nature Communications 5, 1–11, 2014; http://www.nature.com/ncomms/2014/141111/ncomms6392/full/ncomms6392.html) Z EEG nadzorovano izražanje transgena preko brezžično napajanega optogenetskega celičnega vsadka. Luka Smole, 9. marca 2015

'''Encimi''' 

# Construction of efficient xylose utilizing ''Pichia pastoris'' for industrial enzyme production (Li ''et al''; Microbial Cell Factories 14:22, 1-10, 2015; http://www.microbialcellfactories.com/content/14/1/22). Priprava ''Pichie pastoris'', ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov. Špela Tomaž

'''Protitelesa''' 

# Functional mutations in and characterization of VHH against Helicobacter pylori urease (R. Hoseinpoor ''et al''; Applied Biochemistry and Biotechnology 172, 3079-3091, 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s12010-014-0750-4). Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi ''Helicobacter pylori''. Marko Radojković, 9. marca 2015
#Ethanol precipitation for purification of recombinant antibodies (A. Tscheliessnig ''et al''; Journal of Biotechnology 188, 17-28, 2014; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165614007810). Čiščenje rekombinantnih protiteles z obarjanjem z etanolom. Urška Rauter, 10. marca 2015

'''Cepiva''' 

# A novel “priming-boosting” strategy for immune interventions in cervical cancer (S. Liao et al.; Molecular Immunology 64, 295-305, 2015, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161589014003460. Nova "priming-boosting" strategija za imunsko posredovanje pri raku materničnega vratu. Anita Kustec, 11. marca 2015
# Potentiation of anthrax vaccines using protective antigen-expressing viral replicon vectors (H.C. Wang et al.; Immunology letters 163, 206-213, 2015, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25102364 ) Izboljšava cepiv proti antraksu z uporabo iz virusnih replikonov izvedenih vektorjev, ki omogočajo izražanje zaščitnega antigena. Daša Pavc

'''Male molekule in polimeri''' 
Iza Ogris 

# Chromosomal integration of hyaluronic acid synthesis (''has'') genes enhances the molecular weight of hyaluronan produced in ''Lactococcus lactis'' (R. V. Hmar et al; Biotechnol. J. 9 (12), 2014; http://dx.doi.org/10.1002/biot.201400215) Integracija genov za sintezo hialuronske kisline v kromosom bakterije ''Lactococcus lactis'' izboljša sintezo visokomolekularne hialuronske kisline. Maja Grdadolnik.

'''Pretvorba biomase''' 

'''Metabolično inženirstvo''' 

# Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of fatty acid-derived biofuels and chemicals (Weerawat Runguphana, Jay D. Keasling; Metabolic Engineering, vol 21, January 2014, Pages 103–113; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717613000670). Metabolično inženirstvo ''Saccharomyces cerevisiae'' za proizvodnjo derivatov maščobnih kislin, ki so primerni za biogorivo in kemikalije. Dominik Kert, 9. marca 2015

# Metabolic engineering of Klebsiella pneumoniae for the production of cis,cis-muconic acid (Jung,H.-M. Jung,M.-Y. Oh, M.-K.;Applied Microbiology and Biotechnology, Published online: 14 February 2015; http://link.springer.com/article/10.1007/s00253-015-6442-3). Metabolno inženirstvo Klebsiella pneumoniae za produkcijo cis,cis-mukonične kisline. Jure Zabret, 15. marca 2015
'''Biološki viri energije'''

Proizvodnja funkcionalno aktivnih človeških rastnih faktorjev v insektih uporabljenih kot žive biotovarne

2015-03-24T22:59:13Z

Maxi Sagmeister: New page: == UVOD == Rastni faktorji (RF) so endogeni signalni peptidi, ki se specifično vežejo na receptorje na celični površini. So pomembni aktivni mediatorji pri celični rasti, proliferaci...

== UVOD ==

Rastni faktorji (RF) so endogeni signalni peptidi, ki se specifično vežejo na receptorje na celični površini. So pomembni aktivni mediatorji pri celični rasti, proliferaciji, diferenciaciji in signaliziranju. Trenutne raziskave o celjenju ran so osredotočene na rastne faktorje, ki sodelujejo pri procesu celjenja ran, celični proliferaciji in migraciji. Pojavljajo se vprašanja zmanjševanja časa celjenja s vplivanjem na potek vnetja in možnostjo pospeševanja proliferativne faze.

== IZBOR PRIMERNIH RF ==

V raziskavi so se osredotočili na pripravo treh rekombinantnih človeških RF, ki dokazano sodelujejo pri procesu celjenja ran in pri celični proliferaciji. To so bili: epidermalni (huEGF), fibroblastni (huFGF2) in keratinocitni rastni faktor (huKGF1).
Za vsak RF so pripravili različne genske konstrukte, nekateri so imeli na terminalnem delu zapis za signalno zaporedje KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) ali pa signalni peptid melitin. Vsi so vsebovali His-tag zaporedje in na 5' koncu Kozakovo zaporedje za členonožce (CAAATG), ki igra pomembno vlogo pri iniciaciji translacije. Pripravljena nukleotidna zaporedja so klonirali v homologna restrikcijska mesta pFastBac1™ vektorja. S tem so dobili donorske plazmide, ki so jih klonirali v celice E.coli, v katerih sta že bila pomožni plazmid z zapisom za transpozazo in bakmid, bakulovirusni vektor. Opisani sistem imenujemo Bac-to-Bac® bakulovirusni sistem, v katerem pride do mestno-specifičnega prenosa genskega zapisa z donorskega plazmida na bakmid. Tako dobimo rekombinantne bakuloviruse. Nadalje so bakuloviruse pomnoževali v Sf21 insektnih celicah. Rekombinante bakuloviruse so injekcirali v ličinke insekta Trichoplusia ni. Po 72 ur gojenja v rastnih komorah, so iz ekstraktov ličink pridobili proteine.
Glede na stopnjo topnosti proteinov in stopnjo smrtnosti okuženih ličink za vsak posamezen primer, so za nadaljevanje raziskave izbrali inokulacijsko dozo 5000 pfu/ ličinko in sicer z bakulovirusi bacMelEGFHis, bacFGF2His in bacKGF1HisKDEL. Izbrane 3 rekombinantne proteine so očistili in uporabili za testiranje funkcionalnosti. Ekspresijski izkupiček je bil 4.1 mg (za huEGF), 1.9 mg (za huFGF) in 0.5 mg (za huKGF) / g mase insekta.
Za nadaljno optimizacijo izkoristka produkcije človeških RF v ličinkah insektov so pripravili še različne konstrukte fuzirane z modificirano Fc regijo človeškega protitelesa IgG. Do povečanja izražanja fuzijskih proteinov v primerjavi z nefuzijskimi je prišlo samo v primerih konstruktov za človeški keratinocitni RF (huKGF1). Ekspresijsko najbolj produktiven je bil konstrukt bacMelKGF1Hinge-, dobili so kar 1.6 mg/g mase insekta.

== BIOAKTIVNOST RF ==

Vsi trije rekombinanti RF so biološko aktivni, kar so dokazali s tremi testi. V prvem so preverjali njihovo sposobnost aktivacije ERK 1/2 poti (pride do fosforilacije). Tri vrste dermalnih celic so stimulirali z dodatkom očiščenih rekombinantnih RF. Celice so nato sprali, ekstrahirali njihove proteine in jih analizirali z NaDS-PAGE in naredili western prenos z uporabo anti-p-ERK 1/2 monoklonskimi protitelesi. RF so aktivirali fosforilacijo ERK 1/2. V drugem testu so celice stimulirali z naraščajočimi koncentracijami očiščenih RF. Določevanje celične proliferacije je potekalo z MTT metodo, ki je potrdila biološko aktivnost RF. V tretjem testu so preverjali uspešnost celjenja rane in vitro, dodani rekombinantni RF so aktivirali migracijo epitelijskih celic na mesto poškodbe in po 48 urah je bila dosežena skoraj popolna zacelitev rane.

== ZAKLJUČEK ==

Znanstvenikom je uspelo prikazati ekspresijo treh funkcionalno aktivnih človeških RF v ličinkah insekta T. ni v količinah, ki jih doslej z konvencionalnimi metodami še ni uspelo doseči. Dokazali so, da je predstavljena metoda uporabe bakulovirusnega vektorskega sistema in insektov kot žive biotovarne, lahko odličen alternativen ne-fermentacijski sistem za pridobivanje večjih količin človeških rastnih faktorjev, ki bi se lahko razširil na industrijsko proizvodnjo za namene regenerativne medicine ali kozmetike. Uporaba insektov namesto insektnih celičnih kultur omogoča poleg povečanje izkupička same ekspresije in krajšega razvojnega časa, stroškovno učinkovitejšo proizvodnjo proteinov brez uporabe tehnološko zahtevnih fermentacijskih postopkov.

MBT seminarji 2015

2015-03-09T16:00:58Z

Maxi Sagmeister: