https://wiki.fkkt.uni-lj.si/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=Meta+Kodri%C4%8D 2026-05-22T14:19:28Z User contributions MediaWiki 1.45.3 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izbolj%C5%A1anje_proizvodnje_%C5%A1ikimske_kisline_v_E._coli&diff=20458 2022-04-25T16:51:30Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-022-02111-3#citeas I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod.'' 2022, 15(13), str. 1–14.]<br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Šikimska kislina je intermediat šikimatne poti, ki se v farmacevtski industriji uporablja kot izhodna surovina za sintezo protivirusne učinkovine oseltamivir, ta pa se uporablja za zdravljenje gripe. Iz industrijskega vidika je zato pridobivanje večjih količin šikimske kisline izredno pomembno, kar pa je mogoče doseči z izolacijo spojine iz naravnih virov, s kemijsko sintezo ali z mikrobno fermentacijo [1]. Za slednje se uporabljajo sevi ''E. coli'', ki so gensko spremenjeni tako, da omogočajo usmeritev metabolnega fluksa v sintezo šikimske kisline. Pri tem so bili do sedaj v ospredju predvsem različni statični sistemi regulacije (izbijanje tarčnih genov, itd.) pri katerih metabolni fluks sicer usmerimo v želeno biosintezno pot, lahko pa takšne modifikacije obenem vodijo v ustavitev celične rasti zaradi blokade v sintezi esencialnih metabolitov [2]. Šikimatna pot se namreč pri šikimski kislini ne ustavi, pač pa se nadaljuje naprej do korizmata, ki je prekurzor za nastanek različnih spojin, pomembnih za rast in delovanje celic, kot so aromatske aminokisline, folna kislina, itd. [3] Reševanje tega problema je sicer možno z dodajanjem aromatskih aminokislin k minimalnemu gojišču, v katerem gojimo celice, vendar so le-te drage. Vedno bolj zato v ospredje prihajajo dinamični sistemi regulacije, ki omogočajo kontrolo nad več konkurenčnimi metabolnimi potmi, s čimer po eni strani zagotavljajo pripravo zadostne količine želenega produkta, po drugi strani pa ohranjanje viabilnosti celic. <br /> <br /> Med dinamične sisteme regulacije sodijo različna sinteznobiološka vezja, med katerimi imajo posebno velik potencial vezja, ki temeljijo na optogenetiki – regulaciji celičnih procesov s pomočjo svetlobe. Le-ta namreč predstavlja reverzibilen vir, ki je v primerjavi s kemičnimi induktorji, ki se jih sicer uporablja za regulacijo, cenejši in celicam netoksičen, poleg tega pa lahko s spreminjanjem njegove jakosti dosežemo različno močne celične odzive [2].<br /> <br /> Optogenetika deluje na principu na-svetlobo-odzivnih proteinov, ki ob osvetljevanju s svetlobo karakteristične valovne dolžine spremenijo svoje lastnosti. Takšen je na primer protein VIVID iz nitaste glive ''Neurospora crasa'', ki deluje kot fotoreceptor za modro svetlobo [4]. V svoji strukturi ima vezan kofaktor FAD, ki na svetlobi tvori cisteinil-flavinski adukt, kar vodi v večje konformacijske spremembe proteina in njegovo dimerizacijo [5, 6]. <br /> <br /> == Potek ==<br /> <br /> Ideja raziskovalne skupine je bila, da bi s pomočjo svetlobe nadzirali delovanje encimov šikimatne poti, s čimer bi povečali proizvodnjo šikimske kisline, obenem pa zagotovili zadostno količino esencialnih metabolitov v celicah, da ne bi prišlo do zaustavitve rasti. To so dosegli z bifunkcionalnim optogenetskim stikalom, ki je bil obenem dvoslojen - vseboval je tako transkripcijske kot post-transkripcijske regulacijske enote. Prve delujejo neposredno na DNA, tako da vplivajo na prepisovanje tarčnih genov, vendar pa pri njih prihaja do zakasnjenega in nepopolnega celičnega odziva, saj nimajo vpliva na že nastale proteine. Boljšo učinkovitost se zato doseže s hkratno uporabo post-trasnkripcijskih regulacijskih enot, katerih tarča so RNA, oziroma že nastali proteini. Razgradnjo slednjih lahko npr. dosežemo preko uvedbe N- ali C-končnih razgradnih oznak (degronov), ki proteine usmerjajo v razgradnjo [2, 7].<br /> <br /> Sam bifunkcionalni sistem so razvili po manjših korakih, sprva z reporterskim proteinom GFP:<br /> <br /> === Priprava transkripcijske regulacijske enote === <br /> <br /> Transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru transkripcije reporterskega gena s pomočjo represorja TetR. Sestavljali sta jo tako transkripcijska represijska enota (TRU), ki je bila namenjena zaustavitvi transkripcije gena za GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter transkripcijske aktivacijske enote (TAU) z nasprotnim učinkom. Obe enoti sta kot vhodno vezje vsebovali zapis za razcepljeni represor TetR, pri čemer sta bila tako N-končni kot C-končni del represorja fuzirana s proteinom VIVID, kar je omogočilo njuno nadzorovanje s pomočjo svetlobe. Izhodno vezje je v primeru TRU vsebovalo zapis za GFP pod promotorjem PTet, v primeru TAU pa zapis za LacI pod promotorjem PTet ter zapis za GFP pod promotorjem PTrc.<br /> <br /> Pri obeh enotah sta v temi nastala N- in C-končni del razcepljenega TetR, vsak v fuziji s proteinom VIVID. Ker se slednji v temi nahaja v monomernem stanju, ni prišlo do povezave razcepljenih delov TetR, zato je bil le-ta neaktiven. V primeru TRU je zato transkripcija GFP potekala nemoteno, v primeru TAU pa je nemoteno potekala transkripcija LacI. Ta je preko vezave na operatorsko mesto na promotoju PTrc onemogočal nastanek GFP.<br /> <br /> Ob osvetljevanju z modro svetlobo je prišlo do dimerizacije proteina VIVID, kar je vodilo v povezavo razcepljenih delov TetR in njegovo aktivacijo. V primeru TRU se je TetR vezal na operatorsko regijo promotorja PTet, zaradi česar se je zaustavilo prepisovanje GFP, v primeru TAU pa je aktivirani TetR blokiral transkripcijo LacI, zato je transkripcija GFP pričela potekati [2].<br /> <br /> === Priprava post-transkripcijske regulacijske enote === <br /> <br /> Post-transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru količine že nastalih reporterskih proteinov s pomočjo N- in C-končnih razgradnih oznak ter proteaze TEVp. Sestavljena je bila iz post-transkripcijske represijske enote (PRU), ki je bila namenjena razgradnji proteina GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter aktivacijske enote (PAU) z nasprotnim učinkom. Samo vhodno vezje je bilo pri enotah enako kot pri TRU in TAU, le da je namesto razcepljenega represorja TetR vsebovalo razcepljeno proteazo TEVp. Izhodno vezje pri PRU je bilo enako tistemu pri TRU, le da je bil zapis za GFP fuziran še z N-končnim degronom teF. Izhodno vezje pri PAU pa je vsebovalo zapis za GFP v fuziji s C-končnim degronom teLAA pod promotorjem PTet.<br /> <br /> V temi je bila razcepljena TEVp neaktivna. Pri PRU zato do razgradnje nastalega GFP ni prišlo, saj je bil N-končni degron neizpostavljen. Ob izpostavitvi modri svetlobi je dimerizacija proteina VIVID omogočila povezavo ter aktivacijo proteaze TEVp, ki je nato preko proteolitične cepitve izpostavila N-končni degron na GFP, zaradi česar je prišlo do njegove razgradnje. Pri PAU je bil efekt nasproten. V temi je C-končna oznaka teLAA na proteinu GFP le-tega vodila v razgradnjo, ob osvetljevanju z modro svetlobo pa je aktivirana proteaza TEVp oznako odstranila, zato se GFP ni razgradil [2]. <br /> <br /> === Združitev enot v dvoslojno stikalo === <br /> <br /> Združitev regulacijskih enot v dvoslojno optogenetsko stikalo je omogočalo hkratno kontrolo nad transkripcijo gena za GFP in regulacijo količine že nastalega proteina. Zgrajeno je bilo iz transkripcijskega in post-transkripcijskega represijskega sistema (TPRS) ter aktivacijskega sistema (TPAS). Oba sta vsebovala tako vhodna vezja transkripcijske kot post-transkripcijske regulacijske enote, razlikovala pa sta se po izhodnih vezjih:<br /> <br /> * TPRS je vseboval enakega kot PRU. Ob osvetljevanju celic z modro svetlobo je aktivirani represor TetR zaustavil transkripcijo gena za GFP, ki se je nahajal pod promotorjem PTet, aktivirana TEVp pa je s proteolitično cepitvijo izpostavila N-končni degron teF na GFP, zato se je nivo GFP znižal.<br /> * Izhodno vezje TPAS je bilo podobno izhodnemu vezju TAU, le da je bil zapis za LacI prisoten v N-končni fuziji z degronom teF, zapis za GFP pa v C-končni fuziji z degronom DAS. Ob osvetljevanju z modro svetlobo je tako aktivirani TetR zaustavil transkripcijo LacI, aktivirana TEVp pa je s cepitvijo izpostavila N-končni degron, zato se je količina LacI znižala, transkripcija GFP pa je lahko potekala. GFP je sicer nastajal v C-končni fuziji z degronom DAS, ki bi protein načeloma vodil v razgradnjo, vendar je proteaza TEVp oznako odcepila.<br /> <br /> === Priprava bifunkcionalnega optogenetskega stikala za regulacijo proizvodnje šikimske kisline === <br /> <br /> Vključitev na novo razvitih sistemov TPRS in TPAS v šikimatno pot je omogočila nadzor nad delovanjem encimov v le-tej s pomočjo modre svetlobe. Vhodni vezji z razcepljenima TetR in TEVp sta pri tem ostali enaki, v izhodnih vezjih pa je prišlo do zamenjave GFP z encimi šikimatne poti:<br /> <br /> * V izhodnem vezju sistema TPRS je zapis za GFP nadomestil zapis za šikimat kinazo (AroK), ki šikimsko kislino pretvarja v šikimat 3-fosfat [8]. V temi, ko je AroK nastajala, je zato šikimatna pot potekala vse do aromatskih aminokislin, zaradi česar so celice neovirano rastle. Na svetlobi pa je transkripcija gena zaradi vezave TetR prenehala potekati, že nastali encimi AroK pa so se razgradili zaradi izpostavitve degronske oznake teF na N-koncu encima zaradi delovanja TEVp [2].<br /> * V izhodnem vezju sistema TPAS sta zapis za GFP zamenjala zapisa za 3-deoksi-D-arabinoheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sintazo (AroG) ter 3-dehidrokinat (DHQ) sintazo (AroB), ki sta pomembna pri sami sintezi šikimske kisline [2, 8]. V temi je bil nastanek encimov onemogočen zaradi delovanja represorja LacI, nekontrolirano nastali encimi pa so se razgradili zaradi C-končne degronske oznake DAS. Ob osvetljevanju je prišlo do razgradnje represorja LacI in zaustavitve njegovega nastanka, zato je transkripcija genov za AroG in AroB pričela potekati, nastala encima pa se nista razgradila, saj je aktivirana TEVp odstranila njuno degronsko oznako.<br /> <br /> Sistema TPRS in TPAS sta torej zagotovila bifunkcionalnost samega stikala, pri čemer je TPRS omogočal neovirano rast celic v temi, TPAS pa je ob osvetljevanju z modro svetlobo metabolni fluks preusmeril v proizvodnjo šikimske kisline, kar je povečalo njen izplen in zmanjšalo količino stranskih produktov. <br /> <br /> Vključitev bifunkcionalnega stikala v šasijo ''E. coli'' S5 je omogočila nastanek 4,2 g/L šikimske kisline v minimalnem gojišču NBS z dodatkom 20 g/L glukoze, kar je 1,6-krat več kot v celicah brez sinteznobiološkega vezja. Kot optimalni pogoji za gojenje celic so se izkazali temperatura 37 °C, koncentracija glukoze 40 g/L ter pričetek osvetljevanja po 24-urnem gojenju celic v temi. V takšnih pogojih so celice v 72 urah v 5 litrskem bioreaktorju proizvedle 35 g/L šikimske kisline, kar je največji titer šikimske kisline v minimalnem gojišču do zdaj [2]. <br /> <br /> == Viri in literatura ==<br /> <br /> [1] A. Ramazani, A. Shahkarami, Fatemeh Zarei, S. Rezayati, A. Rezaei, A. Bodaghi, L. Youseftabar-Miri: Shikimic acid from staranise (Illicium verum Hook): Extraction, purification and determination. ''Eurasian Chem. Commun''. 2021, 3(7), str. 452–460.<br /> <br /> [2] I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod''. 2022, 15(13), str. 1–14.<br /> <br /> [3] V. Tzin, G. Galili: New Insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants. ''Mol. Plant'' 2010, 3(6), str. 956–972.<br /> <br /> [4] J. M. Hurley, C. H. Chen, J. J. Loros, J. C. Dunlap: Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa. ''G3 Genes, Genomes, Genet.'' 2012, 2(10), str. 1207–1212.<br /> <br /> [5] A. T. Vaidya, C. H. Chen, J. C. Dunlap, J. J. Loros, B. R. Crane: Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. ''Sci. Signal.'' 2011, 4(184).<br /> <br /> [6] B. D. Zoltowski, B. R. Crane: Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. ''Biochemistry'' 2008, 47(27), str. 7012–7019.<br /> <br /> [7] A. Stikāne: Degrons, http://2014.igem.org/Team:Edinburgh/project/degrons (pridobljeno 23. 4. 2022).<br /> <br /> [8] D. F. Liu, G. M. Ai, Q. X. Zheng, C. Liu, C. Y. Jiang, L. X. Liu, B. Zhang, Y. M. Liu, C. Yang, S. J. Liu: Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by B''acillus subtilis'' strains. ''Microb. Cell Fact.'' 2014, 13(1), str. 1–11.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izbolj%C5%A1anje_proizvodnje_%C5%A1ikimske_kisline_v_E._coli&diff=20457 2022-04-25T16:21:41Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-022-02111-3#citeas I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod.'' 2022, 15(13), str. 1–14.]<br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Šikimska kislina je intermediat šikimatne poti, ki se v farmacevtski industriji uporablja kot izhodna surovina za sintezo protivirusne učinkovine oseltamivir, ta pa se uporablja za zdravljenje gripe. Iz industrijskega vidika je zato pridobivanje večjih količin šikimske kisline izredno pomembno, kar pa je mogoče doseči z izolacijo spojine iz naravnih virov, s kemijsko sintezo ali z mikrobno fermentacijo [1]. Za slednje se uporabljajo sevi ''E. coli'', ki so gensko spremenjeni tako, da omogočajo usmeritev metabolnega fluksa v sintezo šikimske kisline. Pri tem so bili do sedaj v ospredju predvsem različni statični sistemi regulacije (izbijanje tarčnih genov, itd.) pri katerih metabolni fluks sicer usmerimo v želeno biosintezno pot, lahko pa takšne modifikacije obenem vodijo v ustavitev celične rasti zaradi blokade v sintezi esencialnih metabolitov [2]. Šikimatna pot se namreč pri šikimski kislini ne ustavi, pač pa se nadaljuje naprej do korizmata, ki je prekurzor za nastanek različnih spojin, pomembnih za rast in delovanje celic, kot so aromatske aminokisline, folna kislina, itd. [3] Reševanje tega problema je sicer možno z dodajanjem aromatskih aminokislin k minimalnemu gojišču, v katerem gojimo celice, vendar so le-te drage. Vedno bolj zato v ospredje prihajajo dinamični sistemi regulacije, ki omogočajo kontrolo nad več konkurenčnimi metabolnimi potmi, s čimer po eni strani zagotavljajo pripravo zadostne količine želenega produkta, po drugi strani pa ohranjanje viabilnosti celic. <br /> <br /> Med dinamične sisteme regulacije sodijo različna sinteznobiološka vezja, med katerimi imajo posebno velik potencial vezja, ki temeljijo na optogenetiki – regulaciji celičnih procesov s pomočjo svetlobe. Le-ta namreč predstavlja reverzibilen vir, ki je v primerjavi s kemičnimi induktorji, ki se jih sicer uporablja za regulacijo, cenejši in celicam netoksičen, poleg tega pa lahko s spreminjanjem njegove jakosti dosežemo različno močne celične odzive [2].<br /> <br /> Optogenetika deluje na principu na-svetlobo-odzivnih proteinov, ki ob osvetljevanju s svetlobo karakteristične valovne dolžine spremenijo svoje lastnosti. Takšen je na primer protein VIVID iz nitaste glive ''Neurospora crasa'', ki deluje kot fotoreceptor za modro svetlobo [4]. V svoji strukturi ima vezan kofaktor FAD, ki na svetlobi tvori cisteinil-flavinski adukt, kar vodi v večje konformacijske spremembe proteina in njegovo dimerizacijo [5, 6]. <br /> <br /> == Potek ==<br /> <br /> Ideja raziskovalne skupine je bila, da bi s pomočjo svetlobe nadzirali delovanje encimov šikimatne poti, s čimer bi povečali proizvodnjo šikimske kisline, obenem pa zagotovili zadostno količino esencialnih metabolitov v celicah, da ne bi prišlo do zaustavitve rasti. To so dosegli z bifunkcionalnim optogenetskim stikalom, ki je bil obenem dvoslojen - vseboval je tako transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote. Prve delujejo neposredno na DNA, tako da vplivajo na prepisovanje tarčnih genov, vendar pa pri njih prihaja do zakasnjenega in nepopolnega celičnega odziva, saj nimajo vpliva na že nastale proteine. Boljšo učinkovitost se zato doseže s hkratno uporabo post-trasnkripcijskih regulatornih enot, katerih tarča so RNA, oziroma že nastali proteini. Razgradnjo slednjih lahko npr. dosežemo preko uvedbe N- ali C-končnih razgradnih oznak (degronov), ki proteine usmerjajo v razgradnjo [2, 7].<br /> <br /> Sam bifunkcionalni sistem so razvili po manjših korakih, sprva z reporterskim proteinom GFP:<br /> <br /> === Priprava transkripcijske regulacijske enote === <br /> <br /> Transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru transkripcije reporterskega gena s pomočjo represorja TetR. Sestavljali sta jo tako transkripcijska represijska enota (TRU), ki je bila namenjena zaustavitvi transkripcije gena za GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter transkripcijske aktivacijske enote (TAU) z nasprotnim učinkom. Obe enoti sta kot kontrolno vezje vsebovali zapis za razcepljeni represor TetR, pri čemer sta bila tako N-končni kot C-končni del represorja fuzirana s proteinom VIVID, kar je omogočilo njuno nadzorovanje s pomočjo svetlobe. Izhodno vezje je v primeru TRU vsebovalo zapis za GFP pod promotorjem PTet, v primeru TAU pa zapis za LacI pod promotorjem PTet ter zapis za GFP pod promotorjem PTrc.<br /> <br /> Pri obeh enotah sta v temi nastala N- in C-končni del razcepljenega TetR, vsak v fuziji s proteinom VIVID. Ker se slednji v temi nahaja v monomernem stanju, ni prišlo do povezave razcepljenih delov TetR, zato je bil le-ta neaktiven. V primeru TRU je zato transkripcija GFP potekala nemoteno, v primeru TAU pa je nemoteno potekala transkripcija LacI. Ta je preko vezave na operatorsko mesto na promotoju PTrc onemogočal nastanek GFP.<br /> <br /> Ob osvetljevanju z modro svetlobo je prišlo do dimerizacije proteina VIVID, kar je vodilo v povezavo razcepljenih delov TetR in njegovo aktivacijo. V primeru TRU se je TetR vezal na operatorsko regijo promotorja PTet, zaradi česar se je zaustavilo prepisovanje GFP, v primeru TAU pa je aktivirani TetR blokiral transkripcijo LacI, zato je transkripcija GFP pričela potekati [2].<br /> <br /> === Priprava post-transkripcijske regulacijske enote === <br /> <br /> Post-transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru količine že nastalih reporterskih proteinov s pomočjo N- in C-končnih razgradnih oznak ter proteaze TEVp. Sestavljena je bila iz post-transkripcijske represijske enote (PRU), ki je bila namenjena razgradnji proteina GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter aktivacijske enote (PAU) z nasprotnim učinkom. Samo kontrolno vezje je bilo pri enotah enako kot pri TRU in TAU, le da je namesto razcepljenega represorja TetR vsebovalo razcepljeno proteazo TEVp. Izhodno vezje pri PRU je bilo enako tistemu pri TRU, le da je bil zapis za GFP fuziran še z N-končnim degronom teF. Izhodno vezje pri PAU pa je vsebovalo zapis za GFP v fuziji s C-končnim degronom teLAA pod promotorjem PTet.<br /> <br /> V temi je bila razcepljena TEVp neaktivna. Pri PRU zato do razgradnje nastalega GFP ni prišlo, saj je bil N-končni degron neizpostavljen. Ob izpostavitvi modri svetlobi je dimerizacija proteina VIVID omogočila povezavo ter aktivacijo proteaze TEVp, ki je nato preko proteolitične cepitve izpostavila N-končni degron na GFP, zaradi česar je prišlo do njegove razgradnje. Pri PAU je bil efekt nasproten. V temi je C-končna oznaka teLAA na proteinu GFP le-tega vodila v razgradnjo, ob osvetljevanju z modro svetlobo pa je aktivirana proteaza TEVp oznako odstranila, zato se GFP ni razgradil [2]. <br /> <br /> === Združitev enot v dvoslojno stikalo === <br /> <br /> Združitev regulatornih enot v dvoslojno optogenetsko stikalo je omogočalo hkratno kontrolo nad transkripcijo gena za GFP in regulacijo količine že nastalega proteina. Zgrajeno je bilo iz transkripcijskega in post-transkripcijskega represijskega sistema (TPRS) ter aktivacijskega sistema (TPAS). Oba sta vsebovala tako kontrolna vezja transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote, razlikovala pa sta se po izhodnih vezjih:<br /> <br /> * TPRS je vseboval enakega kot PRU. Ob osvetljevanju celic z modro svetlobo je aktivirani represor TetR zaustavil transkripcijo gena za GFP, ki se je nahajal pod promotorjem PTet, aktivirana TEVp pa je s proteolitično cepitvijo izpostavila N-končni degron teF na GFP, zato se je nivo GFP znižal.<br /> * Izhodno vezje TPAS je bilo podobno izhodnemu vezju TAU, le da je bil zapis za LacI prisoten v N-končni fuziji z degronom teF, zapis za GFP pa v C-končni fuziji z degronom DAS. Ob osvetljevanju z modro svetlobo je tako aktivirani TetR zaustavil transkripcijo LacI, aktivirana TEVp pa je s cepitvijo izpostavila N-končni degron, zato se je količina LacI znižala, transkripcija GFP pa je lahko potekala. GFP je sicer nastajal v C-končni fuziji z degronom DAS, ki bi protein načeloma vodil v razgradnjo, vendar je proteaza TEVp oznako odcepila.<br /> <br /> === Priprava bifunkcionalnega optogenetskega stikala za regulacijo proizvodnje šikimske kisline === <br /> <br /> Vključitev na novo razvitih sistemov TPRS in TPAS v šikimatno pot je omogočila nadzor nad delovanjem encimov v le-tej s pomočjo modre svetlobe. Kontrolni vezji z razcepljenima TetR in TEVp sta pri tem ostali enaki, v izhodnih vezjih pa je prišlo do zamenjave GFP z encimi šikimatne poti:<br /> <br /> * V izhodnem vezju sistema TPRS je zapis za GFP nadomestil zapis za šikimat kinazo (AroK), ki šikimsko kislino pretvarja v šikimat 3-fosfat [8]. V temi, ko je AroK nastajala, je zato šikimatna pot potekala vse do aromatskih aminokislin, zaradi česar so celice neovirano rastle. Na svetlobi pa je transkripcija gena zaradi vezave TetR prenehala potekati, že nastali encimi AroK pa so se razgradili zaradi izpostavitve degronske oznake teF na N-koncu encima zaradi delovanja TEVp [2].<br /> * V izhodnem vezju sistema TPAS sta zapis za GFP zamenjala zapisa za 3-deoksi-D-arabinoheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sintazo (AroG) ter 3-dehidrokinat (DHQ) sintazo (AroB), ki sta pomembna pri sami sintezi šikimske kisline [2, 8]. V temi je bil nastanek encimov onemogočen zaradi delovanja represorja LacI, nekontrolirano nastali encimi pa so se razgradili zaradi C-končne degronske oznake DAS. Ob osvetljevanju je prišlo do razgradnje represorja LacI in zaustavitve njegovega nastanka, zato je transkripcija genov za AroG in AroB pričela potekati, nastala encima pa se nista razgradila, saj je aktivirana TEVp odstranila njuno degronsko oznako.<br /> <br /> Sistema TPRS in TPAS sta torej zagotovila bifunkcionalnost samega stikala, pri čemer je TPRS omogočal neovirano rast celic v temi, TPAS pa je ob osvetljevanju z modro svetlobo metabolni fluks preusmeril v proizvodnjo šikimske kisline, kar je povečalo njen izplen in zmanjšalo količino stranskih produktov. <br /> <br /> Vključitev bifunkcionalnega stikala v šasijo ''E. coli'' S5 je omogočila nastanek 4,2 g/L šikimske kisline v minimalnem gojišču NBS z dodatkom 20 g/L glukoze, kar je 1,6-krat več kot v celicah brez sinteznobiološkega vezja. Kot optimalni pogoji za gojenje celic so se izkazali temperatura 37 °C, koncentracija glukoze 40 g/L ter pričetek osvetljevanja po 24-urnem gojenju celic v temi. V takšnih pogojih so celice v 72 urah v 5 litrskem bioreaktorju proizvedle 35 g/L šikimske kisline, kar je največji titer šikimske kisline v minimalnem gojišču do zdaj [2]. <br /> <br /> == Viri in literatura ==<br /> <br /> [1] A. Ramazani, A. Shahkarami, Fatemeh Zarei, S. Rezayati, A. Rezaei, A. Bodaghi, L. Youseftabar-Miri: Shikimic acid from staranise (Illicium verum Hook): Extraction, purification and determination. ''Eurasian Chem. Commun''. 2021, 3(7), str. 452–460.<br /> <br /> [2] I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod''. 2022, 15(13), str. 1–14.<br /> <br /> [3] V. Tzin, G. Galili: New Insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants. ''Mol. Plant'' 2010, 3(6), str. 956–972.<br /> <br /> [4] J. M. Hurley, C. H. Chen, J. J. Loros, J. C. Dunlap: Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa. ''G3 Genes, Genomes, Genet.'' 2012, 2(10), str. 1207–1212.<br /> <br /> [5] A. T. Vaidya, C. H. Chen, J. C. Dunlap, J. J. Loros, B. R. Crane: Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. ''Sci. Signal.'' 2011, 4(184).<br /> <br /> [6] B. D. Zoltowski, B. R. Crane: Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. ''Biochemistry'' 2008, 47(27), str. 7012–7019.<br /> <br /> [7] A. Stikāne: Degrons, http://2014.igem.org/Team:Edinburgh/project/degrons (pridobljeno 23. 4. 2022).<br /> <br /> [8] D. F. Liu, G. M. Ai, Q. X. Zheng, C. Liu, C. Y. Jiang, L. X. Liu, B. Zhang, Y. M. Liu, C. Yang, S. J. Liu: Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by B''acillus subtilis'' strains. ''Microb. Cell Fact.'' 2014, 13(1), str. 1–11.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izbolj%C5%A1anje_proizvodnje_%C5%A1ikimske_kisline_v_E._coli&diff=20436 2022-04-25T12:20:42Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-022-02111-3#citeas I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod.'' 2022, 15(13), str. 1–14.]<br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Šikimska kislina je intermediat šikimatne poti, ki se v farmacevtski industriji uporablja kot izhodna surovina za sintezo protivirusne učinkovine oseltamivir, ta pa se uporablja za zdravljenje gripe. Iz industrijskega vidika je zato pridobivanje večjih količin šikimske kisline izredno pomembno, kar pa je mogoče doseči z izolacijo spojine iz naravnih virov, s kemijsko sintezo ali z mikrobno fermentacijo [1]. Za slednje se uporabljajo sevi ''E. coli'', ki so gensko spremenjeni tako, da omogočajo usmeritev metabolnega fluksa v sintezo šikimske kisline. Pri tem so bili do sedaj v ospredju predvsem različni statični sistemi regulacije (izbijanje tarčnih genov, itd.) pri katerih metabolni fluks sicer usmerimo v želeno biosintezno pot, lahko pa takšne modifikacije obenem vodijo v ustavitev celične rasti zaradi blokade v sintezi esencialnih metabolitov ali nabiranja toksičnih intermediatov [2]. Šikimatna pot se namreč pri šikimski kislini ne ustavi, pač pa se nadaljuje naprej do korizmata, ki je prekurzor za nastanek različnih spojin, pomembnih za rast in delovanje celic, kot so aromatske aminokisline, folna kislina, itd. [3] Reševanje tega problema je sicer možno z dodajanjem aromatskih aminokislin k minimalnemu gojišču, v katerem gojimo celice, vendar so le-te drage. Vedno bolj zato v ospredje prihajajo dinamični sistemi regulacije, ki omogočajo kontrolo nad več konkurenčnimi metabolnimi potmi, s čimer po eni strani zagotavljajo pripravo zadostne količine želenega produkta, po drugi strani pa ohranjanje viabilnosti celic. <br /> <br /> Med dinamične sisteme regulacije sodijo različna sinteznobiološka vezja, med katerimi imajo posebno velik potencial vezja, ki temeljijo na optogenetiki – regulaciji celičnih procesov s pomočjo svetlobe. Le-ta namreč predstavlja reverzibilen vir, ki je v primerjavi s kemičnimi induktorji, ki se jih sicer uporablja za regulacijo, cenejši in celicam netoksičen, poleg tega pa lahko s spreminjanjem njegove jakosti dosežemo različno močne celične odzive [2].<br /> <br /> Optogenetika deluje na principu na-svetlobo-odzivnih proteinov, ki ob osvetljevanju s svetlobo karakteristične valovne dolžine spremenijo svoje lastnosti. Takšen je na primer protein VIVID iz nitaste glive ''Neurospora crasa'', ki deluje kot fotoreceptor za modro svetlobo [4]. V svoji strukturi ima vezan kofaktor FAD, ki na svetlobi tvori cisteinil-flavinski adukt, kar vodi v večje konformacijske spremembe proteina in njegovo dimerizacijo [5, 6]. <br /> <br /> == Potek ==<br /> <br /> Ideja raziskovalne skupine je bila, da bi s pomočjo svetlobe nadzirali delovanje encimov šikimatne poti, s čimer bi povečali proizvodnjo šikimske kisline, obenem pa zagotovili zadostno količino esencialnih metabolitov v celicah, da ne bi prišlo do zaustavitve rasti. To so dosegli z bifunkcionalnim optogenetskim stikalom, ki je bil obenem dvoslojen - vseboval je tako transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote. Prve delujejo neposredno na DNA, tako da vplivajo na prepisovanje tarčnih genov, vendar pa pri njih prihaja do zakasnjenega in nepopolnega celičnega odziva, saj nimajo vpliva na že nastale proteine. Boljšo učinkovitost se zato doseže s hkratno uporabo post-trasnkripcijskih regulatornih enot, katerih tarča so RNA, oziroma že nastali proteini. Razgradnjo slednjih lahko npr. dosežemo preko uvedbe N- ali C-končnih razgradnih oznak (degronov), ki proteine usmerjajo v razgradnjo [2, 7].<br /> <br /> Sam bifunkcionalni sistem so razvili po manjših korakih, sprva z reporterskim proteinom GFP:<br /> <br /> === Priprava transkripcijske regulacijske enote === <br /> <br /> Transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru transkripcije reporterskega gena s pomočjo represorja TetR. Sestavljali sta jo tako transkripcijska represijska enota (TRU), ki je bila namenjena zaustavitvi transkripcije gena za GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter transkripcijske aktivacijske enote (TAU) z nasprotnim učinkom. Obe enoti sta kot kontrolno vezje vsebovali zapis za razcepljeni represor TetR, pri čemer sta bila tako N-končni kot C-končni del represorja fuzirana s proteinom VIVID, kar je omogočilo njuno nadzorovanje s pomočjo svetlobe. Izhodno vezje je v primeru TRU vsebovalo zapis za GFP pod promotorjem PTet, v primeru TAU pa zapis za LacI pod promotorjem PTet ter zapis za GFP pod promotorjem PTrc.<br /> <br /> Pri obeh enotah sta v temi nastala N- in C-končni del razcepljenega TetR, vsak v fuziji s proteinom VIVID. Ker se slednji v temi nahaja v monomernem stanju, ni prišlo do povezave razcepljenih delov TetR, zato je bil le-ta neaktiven. V primeru TRU je zato transkripcija GFP potekala nemoteno, v primeru TAU pa je nemoteno potekala transkripcija LacI. Ta je preko vezave na operatorsko mesto na promotoju PTrc onemogočal nastanek GFP.<br /> <br /> Ob osvetljevanju z modro svetlobo je prišlo do dimerizacije proteina VIVID, kar je vodilo v povezavo razcepljenih delov TetR in njegovo aktivacijo. V primeru TRU se je TetR vezal na operatorsko regijo promotorja PTet, zaradi česar se je zaustavilo prepisovanje GFP, v primeru TAU pa je aktivirani TetR blokiral transkripcijo LacI, zato je transkripcija GFP pričela potekati [2].<br /> <br /> === Priprava post-transkripcijske regulacijske enote === <br /> <br /> Post-transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru količine že nastalih reporterskih proteinov s pomočjo N- in C-končnih razgradnih oznak ter proteaze TEVp. Sestavljena je bila iz post-transkripcijske represijske enote (PRU), ki je bila namenjena razgradnji proteina GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter aktivacijske enote (PAU) z nasprotnim učinkom. Samo kontrolno vezje je bilo pri enotah enako kot pri TRU in TAU, le da je namesto razcepljenega represorja TetR vsebovalo razcepljeno proteazo TEVp. Izhodno vezje pri PRU je bilo enako tistemu pri TRU, le da je bil zapis za GFP fuziran še z N-končnim degronom teF. Izhodno vezje pri PAU pa je vsebovalo zapis za GFP v fuziji s C-končnim degronom teLAA pod promotorjem PTet.<br /> <br /> V temi je bila razcepljena TEVp neaktivna. Pri PRU zato do razgradnje nastalega GFP ni prišlo, saj je bil N-končni degron neizpostavljen. Ob izpostavitvi modri svetlobi je dimerizacija proteina VIVID omogočila povezavo ter aktivacijo proteaze TEVp, ki je nato preko proteolitične cepitve izpostavila N-končni degron na GFP, zaradi česar je prišlo do njegove razgradnje. Pri PAU je bil efekt nasproten. V temi je C-končna oznaka teLAA na proteinu GFP le-tega vodila v razgradnjo, ob osvetljevanju z modro svetlobo pa je aktivirana proteaza TEVp oznako odstranila, zato se GFP ni razgradil [2]. <br /> <br /> === Združitev enot v dvoslojno stikalo === <br /> <br /> Združitev regulatornih enot v dvoslojno optogenetsko stikalo je omogočalo hkratno kontrolo nad transkripcijo gena za GFP in regulacijo količine že nastalega proteina. Zgrajeno je bilo iz transkripcijskega in post-transkripcijskega represijskega sistema (TPRS) ter aktivacijskega sistema (TPAS). Oba sta vsebovala tako kontrolna vezja transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote, razlikovala pa sta se po izhodnih vezjih:<br /> <br /> * TPRS je vseboval enakega kot PRU. Ob osvetljevanju celic z modro svetlobo je aktivirani represor TetR zaustavil transkripcijo gena za GFP, ki se je nahajal pod promotorjem PTet, aktivirana TEVp pa je s proteolitično cepitvijo izpostavila N-končni degron teF na GFP, zato se je nivo GFP znižal.<br /> * Izhodno vezje TPAS je bilo podobno izhodnemu vezju TAU, le da je bil zapis za LacI prisoten v N-končni fuziji z degronom teF, zapis za GFP pa v C-končni fuziji z degronom DAS. Ob osvetljevanju z modro svetlobo je tako aktivirani TetR zaustavil transkripcijo LacI, aktivirana TEVp pa je s cepitvijo izpostavila N-končni degron, zato se je količina LacI znižala, transkripcija GFP pa je lahko potekala. GFP je sicer nastajal v C-končni fuziji z degronom DAS, ki bi protein načeloma vodil v razgradnjo, vendar je proteaza TEVp oznako odcepila.<br /> <br /> === Priprava bifunkcionalnega optogenetskega stikala za regulacijo proizvodnje šikimske kisline === <br /> <br /> Vključitev na novo razvitih sistemov TPRS in TPAS v šikimatno pot je omogočila nadzor nad delovanjem encimov v le-tej s pomočjo modre svetlobe. Kontrolni vezji z razcepljenima TetR in TEVp sta pri tem ostali enaki, v izhodnih vezjih pa je prišlo do zamenjave GFP z encimi šikimatne poti:<br /> <br /> * V izhodnem vezju sistema TPRS je zapis za GFP nadomestil zapis za šikimat kinazo (AroK), ki šikimsko kislino pretvarja v šikimat 3-fosfat [8]. V temi, ko je AroK nastajala, je zato šikimatna pot potekala vse do aromatskih aminokislin, zaradi česar so celice neovirano rastle. Na svetlobi pa je transkripcija gena zaradi vezave TetR prenehala potekati, že nastali encimi AroK pa so se razgradili zaradi izpostavitve degronske oznake teF na N-koncu encima zaradi delovanja TEVp [2].<br /> * V izhodnem vezju sistema TPAS sta zapis za GFP zamenjala zapisa za 3-deoksi-D-arabinoheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sintazo (AroG) ter 3-dehidrokinat (DHQ) sintazo (AroB), ki sta pomembna pri sami sintezi šikimske kisline [2, 8]. V temi je bil nastanek encimov onemogočen zaradi delovanja represorja LacI, nekontrolirano nastali encimi pa so se razgradili zaradi C-končne degronske oznake DAS. Ob osvetljevanju je prišlo do razgradnje represorja LacI in zaustavitve njegovega nastanka, zato je transkripcija genov za AroG in AroB pričela potekati, nastala encima pa se nista razgradila, saj je aktivirana TEVp odstranila njuno degronsko oznako.<br /> <br /> Sistema TPRS in TPAS sta torej zagotovila bifunkcionalnost samega stikala, pri čemer je TPRS omogočal neovirano rast celic v temi, TPAS pa je ob osvetljevanju z modro svetlobo metabolni fluks preusmeril v proizvodnjo šikimske kisline, kar je povečalo njen izplen in zmanjšalo količino stranskih produktov. <br /> <br /> Vključitev bifunkcionalnega stikala v šasijo ''E. coli'' S5 je omogočila nastanek 4,2 g/L šikimske kisline v minimalnem gojišču NBS z dodatkom 20 g/L glukoze, kar je 1,6-krat več kot v celicah brez sinteznobiološkega vezja. Kot optimalni pogoji za gojenje celic so se izkazali temperatura 37 °C, koncentracija glukoze 40 g/L ter pričetek osvetljevanja po 24-urnem gojenju celic v temi. V takšnih pogojih so celice v 72 urah v 5 litrskem bioreaktorju proizvedle 35 g/L šikimske kisline, kar je največji titer šikimske kisline v minimalnem gojišču do zdaj [2]. <br /> <br /> == Viri in literatura ==<br /> <br /> [1] A. Ramazani, A. Shahkarami, Fatemeh Zarei, S. Rezayati, A. Rezaei, A. Bodaghi, L. Youseftabar-Miri: Shikimic acid from staranise (Illicium verum Hook): Extraction, purification and determination. ''Eurasian Chem. Commun''. 2021, 3(7), str. 452–460.<br /> <br /> [2] I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod''. 2022, 15(13), str. 1–14.<br /> <br /> [3] V. Tzin, G. Galili: New Insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants. ''Mol. Plant'' 2010, 3(6), str. 956–972.<br /> <br /> [4] J. M. Hurley, C. H. Chen, J. J. Loros, J. C. Dunlap: Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa. ''G3 Genes, Genomes, Genet.'' 2012, 2(10), str. 1207–1212.<br /> <br /> [5] A. T. Vaidya, C. H. Chen, J. C. Dunlap, J. J. Loros, B. R. Crane: Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. ''Sci. Signal.'' 2011, 4(184).<br /> <br /> [6] B. D. Zoltowski, B. R. Crane: Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. ''Biochemistry'' 2008, 47(27), str. 7012–7019.<br /> <br /> [7] A. Stikāne: Degrons, http://2014.igem.org/Team:Edinburgh/project/degrons (pridobljeno 23. 4. 2022).<br /> <br /> [8] D. F. Liu, G. M. Ai, Q. X. Zheng, C. Liu, C. Y. Jiang, L. X. Liu, B. Zhang, Y. M. Liu, C. Yang, S. J. Liu: Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by B''acillus subtilis'' strains. ''Microb. Cell Fact.'' 2014, 13(1), str. 1–11.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izbolj%C5%A1anje_proizvodnje_%C5%A1ikimske_kisline_v_E._coli&diff=20435 2022-04-25T12:19:49Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-022-02111-3#citeas I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod.'' 2022, 15(13), str. 1–14.]<br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Šikimska kislina je intermediat šikimatne poti, ki se v farmacevtski industriji uporablja kot izhodna surovina za sintezo protivirusne učinkovine oseltamivir, ta pa se uporablja za zdravljenje gripe. Iz industrijskega vidika je zato pridobivanje večjih količin šikimske kisline izredno pomembno, kar pa je mogoče doseči z izolacijo spojine iz naravnih virov, s kemijsko sintezo ali z mikrobno fermentacijo [1]. Za slednje se uporabljajo sevi ''E. coli'', ki so gensko spremenjeni tako, da omogočajo usmeritev metabolnega fluksa v sintezo šikimske kisline. Pri tem so bili do sedaj v ospredju predvsem različni statični sistemi regulacije (izbijanje tarčnih genov, itd.) pri katerih metabolni fluks sicer usmerimo v želeno biosintezno pot, lahko pa takšne modifikacije obenem vodijo v ustavitev celične rasti zaradi blokade v sintezi esencialnih metabolitov ali nabiranja toksičnih intermediatov [2]. Šikimatna pot se namreč pri šikimski kislini ne ustavi, pač pa se nadaljuje naprej do korizmata, ki je prekurzor za nastanek različnih spojin, pomembnih za rast in delovanje celic, kot so aromatske aminokisline, folna kislina, itd. [3] Reševanje tega problema je sicer možno z dodajanjem aromatskih aminokislin k minimalnemu gojišču, v katerem gojimo celice, vendar so le-te drage. Vedno bolj zato v ospredje prihajajo dinamični sistemi regulacije, ki omogočajo kontrolo nad več konkurenčnimi metabolnimi potmi, s čimer po eni strani zagotavljajo pripravo zadostne količine želenega produkta, po drugi strani pa ohranjanje viabilnosti celic. <br /> <br /> Med dinamične sisteme regulacije sodijo različna sinteznobiološka vezja, med katerimi imajo posebno velik potencial vezja, ki temeljijo na optogenetiki – regulaciji celičnih procesov s pomočjo svetlobe. Le-ta namreč predstavlja reverzibilen vir, ki je v primerjavi s kemičnimi induktorji, ki se jih sicer uporablja za regulacijo, cenejši in celicam netoksičen, poleg tega pa lahko s spreminjanjem njegove jakosti dosežemo različno močne celične odzive [2].<br /> <br /> Optogenetika deluje na principu na-svetlobo-odzivnih proteinov, ki ob osvetljevanju s svetlobo karakteristične valovne dolžine spremenijo svoje lastnosti. Takšen je na primer protein VIVID iz nitaste glive ''Neurospora crasa'', ki deluje kot fotoreceptor za modro svetlobo [4]. V svoji strukturi ima vezan kofaktor FAD, ki na svetlobi tvori cisteinil-flavinski adukt, kar vodi v večje konformacijske spremembe proteina in njegovo dimerizacijo [5, 6]. <br /> <br /> == Potek ==<br /> <br /> Ideja raziskovalne skupine je bila, da bi s pomočjo svetlobe nadzirali delovanje encimov šikimatne poti, s čimer bi povečali proizvodnjo šikimske kisline, obenem pa zagotovili zadostno količino esencialnih metabolitov v celicah, da ne bi prišlo do zaustavitve rasti. To so dosegli z bifunkcionalnim optogenetskim stikalom, ki je bil obenem dvoslojen - vseboval je tako transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote. Prve delujejo neposredno na DNA, tako da vplivajo na prepisovanje tarčnih genov, vendar pa pri njih prihaja do zakasnjenega in nepopolnega celičnega odziva, saj nimajo vpliva na že nastale proteine. Boljšo učinkovitost se zato doseže s hkratno uporabo post-trasnkripcijskih regulatornih enot, katerih tarča so RNA, oziroma že nastali proteini. Razgradnjo slednjih lahko npr. dosežemo preko uvedbe N- ali C-končnih razgradnih oznak (degronov), ki proteine usmerjajo v razgradnjo [2, 7].<br /> <br /> Sam bifunkcionalni sistem so razvili po manjših korakih, sprva z reporterskim proteinom GFP:<br /> <br /> === 1) Priprava transkripcijske regulacijske enote === <br /> <br /> Transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru transkripcije reporterskega gena s pomočjo represorja TetR. Sestavljali sta jo tako transkripcijska represijska enota (TRU), ki je bila namenjena zaustavitvi transkripcije gena za GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter transkripcijske aktivacijske enote (TAU) z nasprotnim učinkom. Obe enoti sta kot kontrolno vezje vsebovali zapis za razcepljeni represor TetR, pri čemer sta bila tako N-končni kot C-končni del represorja fuzirana s proteinom VIVID, kar je omogočilo njuno nadzorovanje s pomočjo svetlobe. Izhodno vezje je v primeru TRU vsebovalo zapis za GFP pod promotorjem PTet, v primeru TAU pa zapis za LacI pod promotorjem PTet ter zapis za GFP pod promotorjem PTrc.<br /> <br /> Pri obeh enotah sta v temi nastala N- in C-končni del razcepljenega TetR, vsak v fuziji s proteinom VIVID. Ker se slednji v temi nahaja v monomernem stanju, ni prišlo do povezave razcepljenih delov TetR, zato je bil le-ta neaktiven. V primeru TRU je zato transkripcija GFP potekala nemoteno, v primeru TAU pa je nemoteno potekala transkripcija LacI. Ta je preko vezave na operatorsko mesto na promotoju PTrc onemogočal nastanek GFP.<br /> <br /> Ob osvetljevanju z modro svetlobo je prišlo do dimerizacije proteina VIVID, kar je vodilo v povezavo razcepljenih delov TetR in njegovo aktivacijo. V primeru TRU se je TetR vezal na operatorsko regijo promotorja PTet, zaradi česar se je zaustavilo prepisovanje GFP, v primeru TAU pa je aktivirani TetR blokiral transkripcijo LacI, zato je transkripcija GFP pričela potekati [2].<br /> <br /> === 2) Priprava post-transkripcijske regulacijske enote === <br /> <br /> Post-transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru količine že nastalih reporterskih proteinov s pomočjo N- in C-končnih razgradnih oznak ter proteaze TEVp. Sestavljena je bila iz post-transkripcijske represijske enote (PRU), ki je bila namenjena razgradnji proteina GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter aktivacijske enote (PAU) z nasprotnim učinkom. Samo kontrolno vezje je bilo pri enotah enako kot pri TRU in TAU, le da je namesto razcepljenega represorja TetR vsebovalo razcepljeno proteazo TEVp. Izhodno vezje pri PRU je bilo enako tistemu pri TRU, le da je bil zapis za GFP fuziran še z N-končnim degronom teF. Izhodno vezje pri PAU pa je vsebovalo zapis za GFP v fuziji s C-končnim degronom teLAA pod promotorjem PTet.<br /> <br /> V temi je bila razcepljena TEVp neaktivna. Pri PRU zato do razgradnje nastalega GFP ni prišlo, saj je bil N-končni degron neizpostavljen. Ob izpostavitvi modri svetlobi je dimerizacija proteina VIVID omogočila povezavo ter aktivacijo proteaze TEVp, ki je nato preko proteolitične cepitve izpostavila N-končni degron na GFP, zaradi česar je prišlo do njegove razgradnje. Pri PAU je bil efekt nasproten. V temi je C-končna oznaka teLAA na proteinu GFP le-tega vodila v razgradnjo, ob osvetljevanju z modro svetlobo pa je aktivirana proteaza TEVp oznako odstranila, zato se GFP ni razgradil [2]. <br /> <br /> === 3) Združitev enot v dvoslojno stikalo === <br /> <br /> Združitev regulatornih enot v dvoslojno optogenetsko stikalo je omogočalo hkratno kontrolo nad transkripcijo gena za GFP in regulacijo količine že nastalega proteina. Zgrajeno je bilo iz transkripcijskega in post-transkripcijskega represijskega sistema (TPRS) ter aktivacijskega sistema (TPAS). Oba sta vsebovala tako kontrolna vezja transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote, razlikovala pa sta se po izhodnih vezjih:<br /> <br /> * TPRS je vseboval enakega kot PRU. Ob osvetljevanju celic z modro svetlobo je aktivirani represor TetR zaustavil transkripcijo gena za GFP, ki se je nahajal pod promotorjem PTet, aktivirana TEVp pa je s proteolitično cepitvijo izpostavila N-končni degron teF na GFP, zato se je nivo GFP znižal.<br /> * Izhodno vezje TPAS je bilo podobno izhodnemu vezju TAU, le da je bil zapis za LacI prisoten v N-končni fuziji z degronom teF, zapis za GFP pa v C-končni fuziji z degronom DAS. Ob osvetljevanju z modro svetlobo je tako aktivirani TetR zaustavil transkripcijo LacI, aktivirana TEVp pa je s cepitvijo izpostavila N-končni degron, zato se je količina LacI znižala, transkripcija GFP pa je lahko potekala. GFP je sicer nastajal v C-končni fuziji z degronom DAS, ki bi protein načeloma vodil v razgradnjo, vendar je proteaza TEVp oznako odcepila.<br /> <br /> === 4) Priprava bifunkcionalnega optogenetskega stikala za regulacijo proizvodnje šikimske kisline === <br /> <br /> Vključitev na novo razvitih sistemov TPRS in TPAS v šikimatno pot je omogočila nadzor nad delovanjem encimov v le-tej s pomočjo modre svetlobe. Kontrolni vezji z razcepljenima TetR in TEVp sta pri tem ostali enaki, v izhodnih vezjih pa je prišlo do zamenjave GFP z encimi šikimatne poti:<br /> <br /> * V izhodnem vezju sistema TPRS je zapis za GFP nadomestil zapis za šikimat kinazo (AroK), ki šikimsko kislino pretvarja v šikimat 3-fosfat [8]. V temi, ko je AroK nastajala, je zato šikimatna pot potekala vse do aromatskih aminokislin, zaradi česar so celice neovirano rastle. Na svetlobi pa je transkripcija gena zaradi vezave TetR prenehala potekati, že nastali encimi AroK pa so se razgradili zaradi izpostavitve degronske oznake teF na N-koncu encima zaradi delovanja TEVp [2].<br /> * V izhodnem vezju sistema TPAS sta zapis za GFP zamenjala zapisa za 3-deoksi-D-arabinoheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sintazo (AroG) ter 3-dehidrokinat (DHQ) sintazo (AroB), ki sta pomembna pri sami sintezi šikimske kisline [2, 8]. V temi je bil nastanek encimov onemogočen zaradi delovanja represorja LacI, nekontrolirano nastali encimi pa so se razgradili zaradi C-končne degronske oznake DAS. Ob osvetljevanju je prišlo do razgradnje represorja LacI in zaustavitve njegovega nastanka, zato je transkripcija genov za AroG in AroB pričela potekati, nastala encima pa se nista razgradila, saj je aktivirana TEVp odstranila njuno degronsko oznako.<br /> <br /> Sistema TPRS in TPAS sta torej zagotovila bifunkcionalnost samega stikala, pri čemer je TPRS omogočal neovirano rast celic v temi, TPAS pa je ob osvetljevanju z modro svetlobo metabolni fluks preusmeril v proizvodnjo šikimske kisline, kar je povečalo njen izplen in zmanjšalo količino stranskih produktov. <br /> <br /> Vključitev bifunkcionalnega stikala v šasijo ''E. coli'' S5 je omogočila nastanek 4,2 g/L šikimske kisline v minimalnem gojišču NBS z dodatkom 20 g/L glukoze, kar je 1,6-krat več kot v celicah brez sinteznobiološkega vezja. Kot optimalni pogoji za gojenje celic so se izkazali temperatura 37 °C, koncentracija glukoze 40 g/L ter pričetek osvetljevanja po 24-urnem gojenju celic v temi. V takšnih pogojih so celice v 72 urah v 5 litrskem bioreaktorju proizvedle 35 g/L šikimske kisline, kar je največji titer šikimske kisline v minimalnem gojišču do zdaj [2]. <br /> <br /> == Viri in literatura ==<br /> <br /> [1] A. Ramazani, A. Shahkarami, Fatemeh Zarei, S. Rezayati, A. Rezaei, A. Bodaghi, L. Youseftabar-Miri: Shikimic acid from staranise (Illicium verum Hook): Extraction, purification and determination. ''Eurasian Chem. Commun''. 2021, 3(7), str. 452–460.<br /> <br /> [2] I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod''. 2022, 15(13), str. 1–14.<br /> <br /> [3] V. Tzin, G. Galili: New Insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants. ''Mol. Plant'' 2010, 3(6), str. 956–972.<br /> <br /> [4] J. M. Hurley, C. H. Chen, J. J. Loros, J. C. Dunlap: Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa. ''G3 Genes, Genomes, Genet.'' 2012, 2(10), str. 1207–1212.<br /> <br /> [5] A. T. Vaidya, C. H. Chen, J. C. Dunlap, J. J. Loros, B. R. Crane: Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. ''Sci. Signal.'' 2011, 4(184).<br /> <br /> [6] B. D. Zoltowski, B. R. Crane: Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. ''Biochemistry'' 2008, 47(27), str. 7012–7019.<br /> <br /> [7] A. Stikāne: Degrons, http://2014.igem.org/Team:Edinburgh/project/degrons (pridobljeno 23. 4. 2022).<br /> <br /> [8] D. F. Liu, G. M. Ai, Q. X. Zheng, C. Liu, C. Y. Jiang, L. X. Liu, B. Zhang, Y. M. Liu, C. Yang, S. J. Liu: Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by B''acillus subtilis'' strains. ''Microb. Cell Fact.'' 2014, 13(1), str. 1–11.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izbolj%C5%A1anje_proizvodnje_%C5%A1ikimske_kisline_v_E._coli&diff=20396 2022-04-24T20:50:52Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-022-02111-3#citeas I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod.'' 2022, 15(13), str. 1–14.]<br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Šikimska kislina je intermediat šikimatne poti, ki se v farmacevtski industriji uporablja kot izhodna surovina za sintezo protivirusne učinkovine oseltamivir, ta pa se uporablja za zdravljenje gripe. Iz industrijskega vidika je zato pridobivanje večjih količin šikimske kisline izredno pomembno, kar pa je mogoče doseči z izolacijo spojine iz naravnih virov, s kemijsko sintezo ali z mikrobno fermentacijo [1]. Za slednje se uporabljajo sevi ''E. coli'', ki so gensko spremenjeni tako, da omogočajo usmeritev metabolnega fluksa v sintezo šikimske kisline. Pri tem so bili do sedaj v ospredju predvsem različni statični sistemi regulacije (izbijanje tarčnih genov, itd.) pri katerih metabolni fluks sicer usmerimo v želeno biosintezno pot, lahko pa takšne modifikacije obenem vodijo v ustavitev celične rasti zaradi blokade v sintezi esencialnih metabolitov ali nabiranja toksičnih intermediatov [2]. Šikimatna pot se namreč pri šikimski kislini ne ustavi, pač pa se nadaljuje naprej do korizmata, ki je prekurzor za nastanek različnih spojin, pomembnih za rast in delovanje celic, kot so aromatske aminokisline, folna kislina, itd. [3] Reševanje tega problema je sicer možno z dodajanjem aromatskih aminokislin k minimalnemu gojišču, v katerem gojimo celice, vendar so le-te drage. Vedno bolj zato v ospredje prihajajo dinamični sistemi regulacije, ki omogočajo kontrolo nad več konkurenčnimi metabolnimi potmi, s čimer po eni strani zagotavljajo pripravo zadostne količine želenega produkta, po drugi strani pa ohranjanje viabilnosti celic. <br /> <br /> Med dinamične sisteme regulacije sodijo različna sinteznobiološka vezja, med katerimi imajo posebno velik potencial vezja, ki temeljijo na optogenetiki – regulaciji celičnih procesov s pomočjo svetlobe. Le-ta namreč predstavlja reverzibilen vir, ki je v primerjavi s kemičnimi induktorji, ki se jih sicer uporablja za regulacijo, cenejši in celicam netoksičen, poleg tega pa lahko s spreminjanjem njegove jakosti dosežemo različno močne celične odzive [2].<br /> <br /> Optogenetika deluje na principu na-svetlobo-odzivnih proteinov, ki ob osvetljevanju s svetlobo karakteristične valovne dolžine spremenijo svoje lastnosti. Takšen je na primer protein VIVID iz nitaste glive ''Neurospora crasa'', ki deluje kot fotoreceptor za modro svetlobo [4]. V svoji strukturi ima vezan kofaktor FAD, ki na svetlobi tvori cisteinil-flavinski adukt, kar vodi v večje konformacijske spremembe proteina in njegovo dimerizacijo [5, 6]. <br /> <br /> == Potek ==<br /> <br /> Ideja raziskovalne skupine je bila, da bi s pomočjo svetlobe nadzirali delovanje encimov šikimatne poti, s čimer bi povečali proizvodnjo šikimske kisline, obenem pa zagotovili zadostno količino esencialnih metabolitov v celicah, da ne bi prišlo do zaustavitve rasti. To so dosegli z bifunkcionalnim optogenetskim stikalom, ki je bil obenem dvoslojen - vseboval je tako transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote. Prve delujejo neposredno na DNA, tako da vplivajo na prepisovanje tarčnih genov, vendar pa pri njih prihaja do zakasnjenega in nepopolnega celičnega odziva, saj nimajo vpliva na že nastale proteine. Boljšo učinkovitost se zato doseže s hkratno uporabo post-trasnkripcijskih regulatornih enot, katerih tarča so RNA, oziroma že nastali proteini. Razgradnjo slednjih lahko npr. dosežemo preko uvedbe N- ali C-končnih razgradnih oznak (degronov), ki proteine usmerjajo v razgradnjo [2, 7].<br /> <br /> Sam bifunkcionalni sistem so razvili po manjših korakih, sprva z reporterskim proteinom GFP:<br /> <br /> '''1) Priprava transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru transkripcije reporterskega gena s pomočjo represorja TetR. Sestavljali sta jo tako transkripcijska represijska enota (TRU), ki je bila namenjena zaustavitvi transkripcije gena za GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter transkripcijske aktivacijske enote (TAU) z nasprotnim učinkom. Obe enoti sta kot kontrolno vezje vsebovali zapis za razcepljeni represor TetR, pri čemer sta bila tako N-končni kot C-končni del represorja fuzirana s proteinom VIVID, kar je omogočilo njuno nadzorovanje s pomočjo svetlobe. Izhodno vezje je v primeru TRU vsebovalo zapis za GFP pod promotorjem PTet, v primeru TAU pa zapis za LacI pod promotorjem PTet ter zapis za GFP pod promotorjem PTrc.<br /> <br /> Pri obeh enotah sta v temi nastala N- in C-končni del razcepljenega TetR, vsak v fuziji s proteinom VIVID. Ker se slednji v temi nahaja v monomernem stanju, ni prišlo do povezave razcepljenih delov TetR, zato je bil le-ta neaktiven. V primeru TRU je zato transkripcija GFP potekala nemoteno, v primeru TAU pa je nemoteno potekala transkripcija LacI. Ta je preko vezave na operatorsko mesto na promotoju PTrc onemogočal nastanek GFP.<br /> <br /> Ob osvetljevanju z modro svetlobo je prišlo do dimerizacije proteina VIVID, kar je vodilo v povezavo razcepljenih delov TetR in njegovo aktivacijo. V primeru TRU se je TetR vezal na operatorsko regijo promotorja PTet, zaradi česar se je zaustavilo prepisovanje GFP, v primeru TAU pa je aktivirani TetR blokiral transkripcijo LacI, zato je transkripcija GFP pričela potekati [2].<br /> <br /> '''2) Priprava post-transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Post-transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru količine že nastalih reporterskih proteinov s pomočjo N- in C-končnih razgradnih oznak ter proteaze TEVp. Sestavljena je bila iz post-transkripcijske represijske enote (PRU), ki je bila namenjena razgradnji proteina GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter aktivacijske enote (PAU) z nasprotnim učinkom. Samo kontrolno vezje je bilo pri enotah enako kot pri TRU in TAU, le da je namesto razcepljenega represorja TetR vsebovalo razcepljeno proteazo TEVp. Izhodno vezje pri PRU je bilo enako tistemu pri TRU, le da je bil zapis za GFP fuziran še z N-končnim degronom teF. Izhodno vezje pri PAU pa je vsebovalo zapis za GFP v fuziji s C-končnim degronom teLAA pod promotorjem PTet.<br /> <br /> V temi je bila razcepljena TEVp neaktivna. Pri PRU zato do razgradnje nastalega GFP ni prišlo, saj je bil N-končni degron neizpostavljen. Ob izpostavitvi modri svetlobi je dimerizacija proteina VIVID omogočila povezavo ter aktivacijo proteaze TEVp, ki je nato preko proteolitične cepitve izpostavila N-končni degron na GFP, zaradi česar je prišlo do njegove razgradnje. Pri PAU je bil efekt nasproten. V temi je C-končna oznaka teLAA na proteinu GFP le-tega vodila v razgradnjo, ob osvetljevanju z modro svetlobo pa je aktivirana proteaza TEVp oznako odstranila, zato se GFP ni razgradil [2]. <br /> <br /> '''3) Združitev enot v dvoslojno stikalo'''<br /> <br /> Združitev regulatornih enot v dvoslojno optogenetsko stikalo je omogočalo hkratno kontrolo nad transkripcijo gena za GFP in regulacijo količine že nastalega proteina. Zgrajeno je bilo iz transkripcijskega in post-transkripcijskega represijskega sistema (TPRS) ter aktivacijskega sistema (TPAS). Oba sta vsebovala tako kontrolna vezja transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote, razlikovala pa sta se po izhodnih vezjih:<br /> <br /> * TPRS je vseboval enakega kot PRU. Ob osvetljevanju celic z modro svetlobo je aktivirani represor TetR zaustavil transkripcijo gena za GFP, ki se je nahajal pod promotorjem PTet, aktivirana TEVp pa je s proteolitično cepitvijo izpostavila N-končni degron teF na GFP, zato se je nivo GFP znižal.<br /> * Izhodno vezje TPAS je bilo podobno izhodnemu vezju TAU, le da je bil zapis za LacI prisoten v N-končni fuziji z degronom teF, zapis za GFP pa v C-končni fuziji z degronom DAS. Ob osvetljevanju z modro svetlobo je tako aktivirani TetR zaustavil transkripcijo LacI, aktivirana TEVp pa je s cepitvijo izpostavila N-končni degron, zato se je količina LacI znižala, transkripcija GFP pa je lahko potekala. GFP je sicer nastajal v C-končni fuziji z degronom DAS, ki bi protein načeloma vodil v razgradnjo, vendar je proteaza TEVp oznako odcepila.<br /> <br /> '''4) Priprava bifunkcionalnega optogenetskega stikala za regulacijo proizvodnje šikimske kisline'''<br /> <br /> Vključitev na novo razvitih sistemov TPRS in TPAS v šikimatno pot je omogočila nadzor nad delovanjem encimov v le-tej s pomočjo modre svetlobe. Kontrolni vezji z razcepljenima TetR in TEVp sta pri tem ostali enaki, v izhodnih vezjih pa je prišlo do zamenjave GFP z encimi šikimatne poti:<br /> <br /> * V izhodnem vezju sistema TPRS je zapis za GFP nadomestil zapis za šikimat kinazo (AroK), ki šikimsko kislino pretvarja v šikimat 3-fosfat [8]. V temi, ko je AroK nastajala, je zato šikimatna pot potekala vse do aromatskih aminokislin, zaradi česar so celice neovirano rastle. Na svetlobi pa je transkripcija gena zaradi vezave TetR prenehala potekati, že nastali encimi AroK pa so se razgradili zaradi izpostavitve degronske oznake teF na N-koncu encima zaradi delovanja TEVp [2].<br /> * V izhodnem vezju sistema TPAS sta zapis za GFP zamenjala zapisa za 3-deoksi-D-arabinoheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sintazo (AroG) ter 3-dehidrokinat (DHQ) sintazo (AroB), ki sta pomembna pri sami sintezi šikimske kisline [2, 8]. V temi je bil nastanek encimov onemogočen zaradi delovanja represorja LacI, nekontrolirano nastali encimi pa so se razgradili zaradi C-končne degronske oznake DAS. Ob osvetljevanju je prišlo do razgradnje represorja LacI in zaustavitve njegovega nastanka, zato je transkripcija genov za AroG in AroB pričela potekati, nastala encima pa se nista razgradila, saj je aktivirana TEVp odstranila njuno degronsko oznako.<br /> <br /> Sistema TPRS in TPAS sta torej zagotovila bifunkcionalnost samega stikala, pri čemer je TPRS omogočal neovirano rast celic v temi, TPAS pa je ob osvetljevanju z modro svetlobo metabolni fluks preusmeril v proizvodnjo šikimske kisline, kar je povečalo njen izplen in zmanjšalo količino stranskih produktov. <br /> <br /> Vključitev bifunkcionalnega stikala v šasijo ''E. coli'' S5 je omogočila nastanek 4,2 g/L šikimske kisline v minimalnem gojišču NBS z dodatkom 20 g/L glukoze, kar je 1,6-krat več kot v celicah brez sinteznobiološkega vezja. Kot optimalni pogoji za gojenje celic so se izkazali temperatura 37 °C, koncentracija glukoze 40 g/L ter pričetek osvetljevanja po 24-urnem gojenju celic v temi. V takšnih pogojih so celice v 72 urah v 5 litrskem bioreaktorju proizvedle 35 g/L šikimske kisline, kar je največji titer šikimske kisline v minimalnem gojišču do zdaj [2]. <br /> <br /> == Viri in literatura ==<br /> <br /> [1] A. Ramazani, A. Shahkarami, Fatemeh Zarei, S. Rezayati, A. Rezaei, A. Bodaghi, L. Youseftabar-Miri: Shikimic acid from staranise (Illicium verum Hook): Extraction, purification and determination. ''Eurasian Chem. Commun''. 2021, 3(7), str. 452–460.<br /> <br /> [2] I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod''. 2022, 15(13), str. 1–14.<br /> <br /> [3] V. Tzin, G. Galili: New Insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants. ''Mol. Plant'' 2010, 3(6), str. 956–972.<br /> <br /> [4] J. M. Hurley, C. H. Chen, J. J. Loros, J. C. Dunlap: Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa. ''G3 Genes, Genomes, Genet.'' 2012, 2(10), str. 1207–1212.<br /> <br /> [5] A. T. Vaidya, C. H. Chen, J. C. Dunlap, J. J. Loros, B. R. Crane: Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. ''Sci. Signal.'' 2011, 4(184).<br /> <br /> [6] B. D. Zoltowski, B. R. Crane: Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. ''Biochemistry'' 2008, 47(27), str. 7012–7019.<br /> <br /> [7] A. Stikāne: Degrons, http://2014.igem.org/Team:Edinburgh/project/degrons (pridobljeno 23. 4. 2022).<br /> <br /> [8] D. F. Liu, G. M. Ai, Q. X. Zheng, C. Liu, C. Y. Jiang, L. X. Liu, B. Zhang, Y. M. Liu, C. Yang, S. J. Liu: Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by B''acillus subtilis'' strains. ''Microb. Cell Fact.'' 2014, 13(1), str. 1–11.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izbolj%C5%A1anje_proizvodnje_%C5%A1ikimske_kisline_v_E._coli&diff=20395 2022-04-24T20:50:17Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-022-02111-3#citeas I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod.'' 2022, 15(13), str. 1–14.]<br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Šikimska kislina je intermediat šikimatne poti, ki se v farmacevtski industriji uporablja kot izhodna surovina za sintezo protivirusne učinkovine oseltamivir, ta pa se uporablja za zdravljenje gripe. Iz industrijskega vidika je zato pridobivanje večjih količin šikimske kisline izredno pomembno, kar pa je mogoče doseči z izolacijo spojine iz naravnih virov, s kemijsko sintezo ali z mikrobno fermentacijo [1]. Za slednje se uporabljajo sevi ''E. coli'', ki so gensko spremenjeni tako, da omogočajo usmeritev metabolnega fluksa v sintezo šikimske kisline. Pri tem so bili do sedaj v ospredju predvsem različni statični sistemi regulacije (izbijanje tarčnih genov, itd.) pri katerih metabolni fluks sicer usmerimo v želeno biosintezno pot, lahko pa takšne modifikacije obenem vodijo v ustavitev celične rasti zaradi blokade v sintezi esencialnih metabolitov ali nabiranja toksičnih intermediatov [2]. Šikimatna pot se namreč pri šikimski kislini ne ustavi, pač pa se nadaljuje naprej do korizmata, ki je prekurzor za nastanek različnih spojin, pomembnih za rast in delovanje celic, kot so aromatske aminokisline, folna kislina, itd. [3] Reševanje tega problema je sicer možno z dodajanjem aromatskih aminokislin k minimalnemu gojišču, v katerem gojimo celice, vendar so le-te drage. Vedno bolj zato v ospredje prihajajo dinamični sistemi regulacije, ki omogočajo kontrolo nad več konkurenčnimi metabolnimi potmi, s čimer po eni strani zagotavljajo pripravo zadostne količine želenega produkta, po drugi strani pa ohranjanje viabilnosti celic. <br /> <br /> Med dinamične sisteme regulacije sodijo različna sinteznobiološka vezja, med katerimi imajo posebno velik potencial vezja, ki temeljijo na optogenetiki – regulaciji celičnih procesov s pomočjo svetlobe. Le-ta namreč predstavlja reverzibilen vir, ki je v primerjavi s kemičnimi induktorji, ki se jih sicer uporablja za regulacijo, cenejši in celicam netoksičen, poleg tega pa lahko s spreminjanjem njegove jakosti dosežemo različno močne celične odzive [2].<br /> <br /> Optogenetika deluje na principu na-svetlobo-odzivnih proteinov, ki ob osvetljevanju s svetlobo karakteristične valovne dolžine spremenijo svoje lastnosti. Takšen je na primer protein VIVID iz nitaste glive ''Neurospora crasa'', ki deluje kot fotoreceptor za modro svetlobo [4]. V svoji strukturi ima vezan kofaktor FAD, ki na svetlobi tvori cisteinil-flavinski adukt, kar vodi v večje konformacijske spremembe proteina in njegovo dimerizacijo [5, 6]. <br /> <br /> == Potek ==<br /> <br /> Ideja raziskovalne skupine je bila, da bi s pomočjo svetlobe nadzirali delovanje encimov šikimatne poti, s čimer bi povečali proizvodnjo šikimske kisline, obenem pa zagotovili zadostno količino esencialnih metabolitov v celicah, da ne bi prišlo do zaustavitve rasti. To so dosegli z bifunkcionalnim optogenetskim stikalom, ki je bil obenem dvoslojen - vseboval je tako transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote. Prve delujejo neposredno na DNA, tako da vplivajo na prepisovanje tarčnih genov, vendar pa pri njih prihaja do zakasnjenega in nepopolnega celičnega odziva, saj nimajo vpliva na že nastale proteine. Boljšo učinkovitost se zato doseže s hkratno uporabo post-trasnkripcijskih regulatornih enot, katerih tarča so RNA, oziroma že nastali proteini. Razgradnjo slednjih lahko npr. dosežemo preko uvedbe N- ali C-končnih razgradnih oznak (degronov), ki proteine usmerjajo v razgradnjo [2, 7].<br /> <br /> Sam bifunkcionalni sistem so razvili po manjših korakih, sprva z reporterskim proteinom GFP:<br /> <br /> '''1) Priprava transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru transkripcije reporterskega gena s pomočjo represorja TetR. Sestavljali sta jo tako transkripcijska represijska enota (TRU), ki je bila namenjena zaustavitvi transkripcije gena za GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter transkripcijske aktivacijske enote (TAU) z nasprotnim učinkom. Obe enoti sta kot kontrolno vezje vsebovali zapis za razcepljeni represor TetR, pri čemer sta bila tako N-končni kot C-končni del represorja fuzirana s proteinom VIVID, kar je omogočilo njuno nadzorovanje s pomočjo svetlobe. Izhodno vezje je v primeru TRU vsebovalo zapis za GFP pod promotorjem PTet, v primeru TAU pa zapis za LacI pod promotorjem PTet ter zapis za GFP pod promotorjem PTrc.<br /> <br /> Pri obeh enotah sta v temi nastala N- in C-končni del razcepljenega TetR, vsak v fuziji s proteinom VIVID. Ker se slednji v temi nahaja v monomernem stanju, ni prišlo do povezave razcepljenih delov TetR, zato je bil le-ta neaktiven. V primeru TRU je zato transkripcija GFP potekala nemoteno, v primeru TAU pa je nemoteno potekala transkripcija LacI. Ta je preko vezave na operatorsko mesto na promotoju PTrc onemogočal nastanek GFP.<br /> <br /> Ob osvetljevanju z modro svetlobo je prišlo do dimerizacije proteina VIVID, kar je vodilo v povezavo razcepljenih delov TetR in njegovo aktivacijo. V primeru TRU se je TetR vezal na operatorsko regijo promotorja PTet, zaradi česar se je zaustavilo prepisovanje GFP, v primeru TAU pa je aktivirani TetR blokiral transkripcijo LacI, zato je transkripcija GFP pričela potekati [2].<br /> <br /> '''2) Priprava post-transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Post-transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru količine že nastalih reporterskih proteinov s pomočjo N- in C-končnih razgradnih oznak ter proteaze TEVp. Sestavljena je bila iz post-transkripcijske represijske enote (PRU), ki je bila namenjena razgradnji proteina GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter aktivacijske enote (PAU) z nasprotnim učinkom. Samo kontrolno vezje je bilo pri enotah enako kot pri TRU in TAU, le da je namesto razcepljenega represorja TetR vsebovalo razcepljeno proteazo TEVp. Izhodno vezje pri PRU je bilo enako tistemu pri TRU, le da je bil zapis za GFP fuziran še z N-končnim degronom teF. Izhodno vezje pri PAU pa je vsebovalo zapis za GFP v fuziji s C-končnim degronom teLAA pod promotorjem PTet.<br /> <br /> V temi je bila razcepljena TEVp neaktivna. Pri PRU zato do razgradnje nastalega GFP ni prišlo, saj je bil N-končni degron neizpostavljen. Ob izpostavitvi modri svetlobi je dimerizacija proteina VIVID omogočila povezavo ter aktivacijo proteaze TEVp, ki je nato preko proteolitične cepitve izpostavila N-končni degron na GFP, zaradi česar je prišlo do njegove razgradnje. Pri PAU je bil efekt nasproten. V temi je C-končna oznaka teLAA na proteinu GFP le-tega vodila v razgradnjo, ob osvetljevanju z modro svetlobo pa je aktivirana proteaza TEVp oznako odstranila, zato se GFP ni razgradil [2]. <br /> <br /> '''3) Združitev enot v dvoslojno stikalo'''<br /> <br /> Združitev regulatornih enot v dvoslojno optogenetsko stikalo je omogočalo hkratno kontrolo nad transkripcijo gena za GFP in regulacijo količine že nastalega proteina. Zgrajeno je bilo iz transkripcijskega in post-transkripcijskega represijskega sistema (TPRS) ter aktivacijskega sistema (TPAS). Oba sta vsebovala tako kontrolna vezja transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote, razlikovala pa sta se po izhodnih vezjih:<br /> <br /> * TPRS je vseboval enakega kot PRU. Ob osvetljevanju celic z modro svetlobo je aktivirani represor TetR zaustavil transkripcijo gena za GFP, ki se je nahajal pod promotorjem PTet, aktivirana TEVp pa je s proteolitično cepitvijo izpostavila N-končni degron teF na GFP, zato se je nivo GFP znižal.<br /> * Izhodno vezje TPAS je bilo podobno izhodnemu vezju TAU, le da je bil zapis za LacI prisoten v N-končni fuziji z degronom teF, zapis za GFP pa v C-končni fuziji z degronom DAS. Ob osvetljevanju z modro svetlobo je tako aktiviran TetR zaustavil transkripcijo LacI, aktivirana TEVp pa je s cepitvijo izpostavila N-končni degron, zato se je količina LacI znižala, transkripcija GFP pa je lahko potekala. GFP je sicer nastajal v C-končni fuziji z degronom DAS, ki bi protein načeloma vodil v razgradnjo, vendar je proteaza TEVp oznako odcepila.<br /> <br /> '''4) Priprava bifunkcionalnega optogenetskega stikala za regulacijo proizvodnje šikimske kisline'''<br /> <br /> Vključitev na novo razvitih sistemov TPRS in TPAS v šikimatno pot je omogočila nadzor nad delovanjem encimov v le-tej s pomočjo modre svetlobe. Kontrolni vezji z razcepljenima TetR in TEVp sta pri tem ostali enaki, v izhodnih vezjih pa je prišlo do zamenjave GFP z encimi šikimatne poti:<br /> <br /> * V izhodnem vezju sistema TPRS je zapis za GFP nadomestil zapis za šikimat kinazo (AroK), ki šikimsko kislino pretvarja v šikimat 3-fosfat [8]. V temi, ko je AroK nastajala, je zato šikimatna pot potekala vse do aromatskih aminokislin, zaradi česar so celice neovirano rastle. Na svetlobi pa je transkripcija gena zaradi vezave TetR prenehala potekati, že nastali encimi AroK pa so se razgradili zaradi izpostavitve degronske oznake teF na N-koncu encima zaradi delovanja TEVp [2].<br /> * V izhodnem vezju sistema TPAS sta zapis za GFP zamenjala zapisa za 3-deoksi-D-arabinoheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sintazo (AroG) ter 3-dehidrokinat (DHQ) sintazo (AroB), ki sta pomembna pri sami sintezi šikimske kisline [2, 8]. V temi je bil nastanek encimov onemogočen zaradi delovanja represorja LacI, nekontrolirano nastali encimi pa so se razgradili zaradi C-končne degronske oznake DAS. Ob osvetljevanju je prišlo do razgradnje represorja LacI in zaustavitve njegovega nastanka, zato je transkripcija genov za AroG in AroB pričela potekati, nastala encima pa se nista razgradila, saj je aktivirana TEVp odstranila njuno degronsko oznako.<br /> <br /> Sistema TPRS in TPAS sta torej zagotovila bifunkcionalnost samega stikala, pri čemer je TPRS omogočal neovirano rast celic v temi, TPAS pa je ob osvetljevanju z modro svetlobo metabolni fluks preusmeril v proizvodnjo šikimske kisline, kar je povečalo njen izplen in zmanjšalo količino stranskih produktov. <br /> <br /> Vključitev bifunkcionalnega stikala v šasijo ''E. coli'' S5 je omogočila nastanek 4,2 g/L šikimske kisline v minimalnem gojišču NBS z dodatkom 20 g/L glukoze, kar je 1,6-krat več kot v celicah brez sinteznobiološkega vezja. Kot optimalni pogoji za gojenje celic so se izkazali temperatura 37 °C, koncentracija glukoze 40 g/L ter pričetek osvetljevanja po 24-urnem gojenju celic v temi. V takšnih pogojih so celice v 72 urah v 5 litrskem bioreaktorju proizvedle 35 g/L šikimske kisline, kar je največji titer šikimske kisline v minimalnem gojišču do zdaj [2]. <br /> <br /> == Viri in literatura ==<br /> <br /> [1] A. Ramazani, A. Shahkarami, Fatemeh Zarei, S. Rezayati, A. Rezaei, A. Bodaghi, L. Youseftabar-Miri: Shikimic acid from staranise (Illicium verum Hook): Extraction, purification and determination. ''Eurasian Chem. Commun''. 2021, 3(7), str. 452–460.<br /> <br /> [2] I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod''. 2022, 15(13), str. 1–14.<br /> <br /> [3] V. Tzin, G. Galili: New Insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants. ''Mol. Plant'' 2010, 3(6), str. 956–972.<br /> <br /> [4] J. M. Hurley, C. H. Chen, J. J. Loros, J. C. Dunlap: Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa. ''G3 Genes, Genomes, Genet.'' 2012, 2(10), str. 1207–1212.<br /> <br /> [5] A. T. Vaidya, C. H. Chen, J. C. Dunlap, J. J. Loros, B. R. Crane: Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. ''Sci. Signal.'' 2011, 4(184).<br /> <br /> [6] B. D. Zoltowski, B. R. Crane: Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. ''Biochemistry'' 2008, 47(27), str. 7012–7019.<br /> <br /> [7] A. Stikāne: Degrons, http://2014.igem.org/Team:Edinburgh/project/degrons (pridobljeno 23. 4. 2022).<br /> <br /> [8] D. F. Liu, G. M. Ai, Q. X. Zheng, C. Liu, C. Y. Jiang, L. X. Liu, B. Zhang, Y. M. Liu, C. Yang, S. J. Liu: Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by B''acillus subtilis'' strains. ''Microb. Cell Fact.'' 2014, 13(1), str. 1–11.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izbolj%C5%A1anje_proizvodnje_%C5%A1ikimske_kisline_v_E._coli&diff=20394 2022-04-24T20:49:39Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-022-02111-3#citeas I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod.'' 2022, 15(13), str. 1–14.]<br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Šikimska kislina je intermediat šikimatne poti, ki se v farmacevtski industriji uporablja kot izhodna surovina za sintezo protivirusne učinkovine oseltamivir, ta pa se uporablja za zdravljenje gripe. Iz industrijskega vidika je zato pridobivanje večjih količin šikimske kisline izredno pomembno, kar pa je mogoče doseči z izolacijo spojine iz naravnih virov, s kemijsko sintezo ali z mikrobno fermentacijo [1]. Za slednje se uporabljajo sevi ''E. coli'', ki so gensko spremenjeni tako, da omogočajo usmeritev metabolnega fluksa v sintezo šikimske kisline. Pri tem so bili do sedaj v ospredju predvsem različni statični sistemi regulacije (izbijanje tarčnih genov, itd.) pri katerih metabolni fluks sicer usmerimo v želeno biosintezno pot, lahko pa takšne modifikacije obenem vodijo v ustavitev celične rasti zaradi blokade v sintezi esencialnih metabolitov ali nabiranja toksičnih intermediatov [2]. Šikimatna pot se namreč pri šikimski kislini ne ustavi, pač pa se nadaljuje naprej do korizmata, ki je prekurzor za nastanek različnih spojin, pomembnih za rast in delovanje celic, kot so aromatske aminokisline, folna kislina, itd. [3] Reševanje tega problema je sicer možno z dodajanjem aromatskih aminokislin k minimalnemu gojišču, v katerem gojimo celice, vendar so le-te drage. Vedno bolj zato v ospredje prihajajo dinamični sistemi regulacije, ki omogočajo kontrolo nad več konkurenčnimi metabolnimi potmi, s čimer po eni strani zagotavljajo pripravo zadostne količine želenega produkta, po drugi strani pa ohranjanje viabilnosti celic. <br /> <br /> Med dinamične sisteme regulacije sodijo različna sinteznobiološka vezja, med katerimi imajo posebno velik potencial vezja, ki temeljijo na optogenetiki – regulaciji celičnih procesov s pomočjo svetlobe. Le-ta namreč predstavlja reverzibilen vir, ki je v primerjavi s kemičnimi induktorji, ki se jih sicer uporablja za regulacijo, cenejši in celicam netoksičen, poleg tega pa lahko s spreminjanjem njegove jakosti dosežemo različno močne celične odzive [2].<br /> <br /> Optogenetika deluje na principu na-svetlobo-odzivnih proteinov, ki ob osvetljevanju s svetlobo karakteristične valovne dolžine spremenijo svoje lastnosti. Takšen je na primer protein VIVID iz nitaste glive ''Neurospora crasa'', ki deluje kot fotoreceptor za modro svetlobo [4]. V svoji strukturi ima vezan kofaktor FAD, ki na svetlobi tvori cisteinil-flavinski adukt, kar vodi v večje konformacijske spremembe proteina in njegovo dimerizacijo [5, 6]. <br /> <br /> == Potek ==<br /> <br /> Ideja raziskovalne skupine je bila, da bi s pomočjo svetlobe nadzirali delovanje encimov šikimatne poti, s čimer bi povečali proizvodnjo šikimske kisline, obenem pa zagotovili zadostno količino esencialnih metabolitov v celicah, da ne bi prišlo do zaustavitve rasti. To so dosegli z bifunkcionalnim optogenetskim stikalom, ki je bil obenem dvoslojen - vseboval je tako transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote. Prve delujejo neposredno na DNA, tako da vplivajo na prepisovanje tarčnih genov, vendar pa pri njih prihaja do zakasnjenega in nepopolnega celičnega odziva, saj nimajo vpliva na že nastale proteine. Boljšo učinkovitost se zato doseže s hkratno uporabo post-trasnkripcijskih regulatornih enot, katerih tarča so RNA, oziroma že nastali proteini. Razgradnjo slednjih lahko npr. dosežemo preko uvedbe N- ali C-končnih razgradnih oznak (degronov), ki proteine usmerjajo v razgradnjo [2, 7].<br /> <br /> Sam bifunkcionalni sistem so razvili po manjših korakih, sprva z reporterskim proteinom GFP:<br /> <br /> '''1) Priprava transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru transkripcije reporterskega gena s pomočjo represorja TetR. Sestavljali sta jo tako transkripcijska represijska enota (TRU), ki je bila namenjena zaustavitvi transkripcije gena za GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter transkripcijske aktivacijske enote (TAU) z nasprotnim učinkom. Obe enoti sta kot kontrolno vezje vsebovali zapis za razcepljeni represor TetR, pri čemer sta bila tako N-končni kot C-končni del represorja fuzirana s proteinom VIVID, kar je omogočilo njuno nadzorovanje s pomočjo svetlobe. Izhodno vezje je v primeru TRU vsebovalo zapis za GFP pod promotorjem PTet, v primeru TAU pa zapis za LacI pod promotorjem PTet ter zapis za GFP pod promotorjem PTrc.<br /> <br /> Pri obeh enotah sta v temi nastala N- in C-končni del razcepljenega TetR, vsak v fuziji s proteinom VIVID. Ker se slednji v temi nahaja v monomernem stanju, ni prišlo do povezave razcepljenih delov TetR, zato je bil le-ta neaktiven. V primeru TRU je zato transkripcija GFP potekala nemoteno, v primeru TAU pa je nemoteno potekala transkripcija LacI. Ta je preko vezave na operatorsko mesto na promotoju PTrc onemogočal nastanek GFP.<br /> <br /> Ob osvetljevanju z modro svetlobo je prišlo do dimerizacije proteina VIVID, kar je vodilo v povezavo razcepljenih delov TetR in njegovo aktivacijo. V primeru TRU se je TetR vezal na operatorsko regijo promotorja PTet, zaradi česar se je zaustavilo prepisovanje GFP, v primeru TAU pa je aktivirani TetR blokiral transkripcijo LacI, zato je transkripcija GFP pričela potekati [2].<br /> <br /> '''2) Priprava post-transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Post-transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru količine že nastalih reporterskih proteinov s pomočjo N- in C-končnih razgradnih oznak ter proteaze TEVp. Sestavljena je bila iz post-transkripcijske represijske enote (PRU), ki je bila namenjena razgradnji proteina GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter aktivacijske enote (PAU) z nasprotnim učinkom. Samo kontrolno vezje je bilo pri enotah enako kot pri TRU in TAU, le da je namesto razcepljenega represorja TetR vsebovalo razcepljeno proteazo TEVp. Izhodno vezje pri PRU je bilo enako tistemu pri TRU, le da je bil zapis za GFP fuziran še z N-končnim degronom teF. Izhodno vezje pri PAU pa je vsebovalo zapis za GFP v fuziji s C-končnim degronom teLAA pod promotorjem PTet.<br /> <br /> V temi je bila razcepljena TEVp neaktivna. Pri PRU zato do razgradnje nastalega GFP ni prišlo, saj je bil N-končni degron neizpostavljen. Ob izpostavitvi modri svetlobi je dimerizacija proteina VIVID omogočila povezavo ter aktivacijo proteaze TEVp, ki je nato preko proteolitične cepitve izpostavila N-končni degron na GFP, zaradi česar je prišlo do njegove razgradnje. Pri PAU je bil efekt nasproten. V temi je C-končna oznaka teLAA na proteinu GFP le-tega vodila v razgradnjo, ob osvetljevanju z modro svetlobo pa je aktivirana proteaza TEVp oznako odstranila, zato se GFP ni razgradil [2]. <br /> <br /> '''3) Združitev enot v dvoslojno stikalo'''<br /> <br /> Združitev regulatornih enot v dvoslojno optogenetsko stikalo je omogočalo hkratno kontrolo nad transkripcijo gena za GFP in regulacijo količine že nastalega proteina. Zgrajeno je bilo iz transkripcijskega in post-transkripcijskega represijskega sistema (TPRS) ter aktivacijskega sistema (TPAS). Oba sta vsebovala tako kontrolna vezja transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote, razlikovala pa sta se po izhodnih vezjih:<br /> <br /> * TPRS je vseboval enakega kot PRU. Ob osvetljevanju celic z modro svetlobo je aktivirani represor TetR zaustavil transkripcijo gena za GFP, ki se je nahajal pod promotorjem PTet, aktivirana proteaza TEVp pa je s proteolitično cepitvijo izpostavila N-končni degron teF na GFP, zato se je nivo GFP znižal.<br /> * Izhodno vezje TPAS je bilo podobno izhodnemu vezju TAU, le da je bil zapis za LacI prisoten v N-končni fuziji z degronom teF, zapis za GFP pa v C-končni fuziji z degronom DAS. Ob osvetljevanju z modro svetlobo je tako aktiviran TetR zaustavil transkripcijo LacI, aktivirana TEVp pa je s cepitvijo izpostavila N-končni degron, zato se je količina LacI znižala, transkripcija GFP pa je lahko potekala. GFP je sicer nastajal v C-končni fuziji z degronom DAS, ki bi protein načeloma vodil v razgradnjo, vendar je proteaza TEVp oznako odcepila.<br /> <br /> '''4) Priprava bifunkcionalnega optogenetskega stikala za regulacijo proizvodnje šikimske kisline'''<br /> <br /> Vključitev na novo razvitih sistemov TPRS in TPAS v šikimatno pot je omogočila nadzor nad delovanjem encimov v le-tej s pomočjo modre svetlobe. Kontrolni vezji z razcepljenima TetR in TEVp sta pri tem ostali enaki, v izhodnih vezjih pa je prišlo do zamenjave GFP z encimi šikimatne poti:<br /> <br /> * V izhodnem vezju sistema TPRS je zapis za GFP nadomestil zapis za šikimat kinazo (AroK), ki šikimsko kislino pretvarja v šikimat 3-fosfat [8]. V temi, ko je AroK nastajala, je zato šikimatna pot potekala vse do aromatskih aminokislin, zaradi česar so celice neovirano rastle. Na svetlobi pa je transkripcija gena zaradi vezave TetR prenehala potekati, že nastali encimi AroK pa so se razgradili zaradi izpostavitve degronske oznake teF na N-koncu encima zaradi delovanja TEVp [2].<br /> * V izhodnem vezju sistema TPAS sta zapis za GFP zamenjala zapisa za 3-deoksi-D-arabinoheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sintazo (AroG) ter 3-dehidrokinat (DHQ) sintazo (AroB), ki sta pomembna pri sami sintezi šikimske kisline [2, 8]. V temi je bil nastanek encimov onemogočen zaradi delovanja represorja LacI, nekontrolirano nastali encimi pa so se razgradili zaradi C-končne degronske oznake DAS. Ob osvetljevanju je prišlo do razgradnje represorja LacI in zaustavitve njegovega nastanka, zato je transkripcija genov za AroG in AroB pričela potekati, nastala encima pa se nista razgradila, saj je aktivirana TEVp odstranila njuno degronsko oznako.<br /> <br /> Sistema TPRS in TPAS sta torej zagotovila bifunkcionalnost samega stikala, pri čemer je TPRS omogočal neovirano rast celic v temi, TPAS pa je ob osvetljevanju z modro svetlobo metabolni fluks preusmeril v proizvodnjo šikimske kisline, kar je povečalo njen izplen in zmanjšalo količino stranskih produktov. <br /> <br /> Vključitev bifunkcionalnega stikala v šasijo ''E. coli'' S5 je omogočila nastanek 4,2 g/L šikimske kisline v minimalnem gojišču NBS z dodatkom 20 g/L glukoze, kar je 1,6-krat več kot v celicah brez sinteznobiološkega vezja. Kot optimalni pogoji za gojenje celic so se izkazali temperatura 37 °C, koncentracija glukoze 40 g/L ter pričetek osvetljevanja po 24-urnem gojenju celic v temi. V takšnih pogojih so celice v 72 urah v 5 litrskem bioreaktorju proizvedle 35 g/L šikimske kisline, kar je največji titer šikimske kisline v minimalnem gojišču do zdaj [2]. <br /> <br /> == Viri in literatura ==<br /> <br /> [1] A. Ramazani, A. Shahkarami, Fatemeh Zarei, S. Rezayati, A. Rezaei, A. Bodaghi, L. Youseftabar-Miri: Shikimic acid from staranise (Illicium verum Hook): Extraction, purification and determination. ''Eurasian Chem. Commun''. 2021, 3(7), str. 452–460.<br /> <br /> [2] I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod''. 2022, 15(13), str. 1–14.<br /> <br /> [3] V. Tzin, G. Galili: New Insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants. ''Mol. Plant'' 2010, 3(6), str. 956–972.<br /> <br /> [4] J. M. Hurley, C. H. Chen, J. J. Loros, J. C. Dunlap: Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa. ''G3 Genes, Genomes, Genet.'' 2012, 2(10), str. 1207–1212.<br /> <br /> [5] A. T. Vaidya, C. H. Chen, J. C. Dunlap, J. J. Loros, B. R. Crane: Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. ''Sci. Signal.'' 2011, 4(184).<br /> <br /> [6] B. D. Zoltowski, B. R. Crane: Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. ''Biochemistry'' 2008, 47(27), str. 7012–7019.<br /> <br /> [7] A. Stikāne: Degrons, http://2014.igem.org/Team:Edinburgh/project/degrons (pridobljeno 23. 4. 2022).<br /> <br /> [8] D. F. Liu, G. M. Ai, Q. X. Zheng, C. Liu, C. Y. Jiang, L. X. Liu, B. Zhang, Y. M. Liu, C. Yang, S. J. Liu: Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by B''acillus subtilis'' strains. ''Microb. Cell Fact.'' 2014, 13(1), str. 1–11.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izbolj%C5%A1anje_proizvodnje_%C5%A1ikimske_kisline_v_E._coli&diff=20393 2022-04-24T20:48:40Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-022-02111-3#citeas I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod.'' 2022, 15(13), str. 1–14.]<br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Šikimska kislina je intermediat šikimatne poti, ki se v farmacevtski industriji uporablja kot izhodna surovina za sintezo protivirusne učinkovine oseltamivir, ta pa se uporablja za zdravljenje gripe. Iz industrijskega vidika je zato pridobivanje večjih količin šikimske kisline izredno pomembno, kar pa je mogoče doseči z izolacijo spojine iz naravnih virov, s kemijsko sintezo ali z mikrobno fermentacijo [1]. Za slednje se uporabljajo sevi ''E. coli'', ki so gensko spremenjeni tako, da omogočajo usmeritev metabolnega fluksa v sintezo šikimske kisline. Pri tem so bili do sedaj v ospredju predvsem različni statični sistemi regulacije (izbijanje tarčnih genov, itd.) pri katerih metabolni fluks sicer usmerimo v želeno biosintezno pot, lahko pa takšne modifikacije obenem vodijo v ustavitev celične rasti zaradi blokade v sintezi esencialnih metabolitov ali nabiranja toksičnih intermediatov [2]. Šikimatna pot se namreč pri šikimski kislini ne ustavi, pač pa se nadaljuje naprej do korizmata, ki je prekurzor za nastanek različnih spojin, pomembnih za rast in delovanje celic, kot so aromatske aminokisline, folna kislina, itd. [3] Reševanje tega problema je sicer možno z dodajanjem aromatskih aminokislin k minimalnemu gojišču, v katerem gojimo celice, vendar so le-te drage. Vedno bolj zato v ospredje prihajajo dinamični sistemi regulacije, ki omogočajo kontrolo nad več konkurenčnimi metabolnimi potmi, s čimer po eni strani zagotavljajo pripravo zadostne količine želenega produkta, po drugi strani pa ohranjanje viabilnosti celic. <br /> <br /> Med dinamične sisteme regulacije sodijo različna sinteznobiološka vezja, med katerimi imajo posebno velik potencial vezja, ki temeljijo na optogenetiki – regulaciji celičnih procesov s pomočjo svetlobe. Le-ta namreč predstavlja reverzibilen vir, ki je v primerjavi s kemičnimi induktorji, ki se jih sicer uporablja za regulacijo, cenejši in celicam netoksičen, poleg tega pa lahko s spreminjanjem njegove jakosti dosežemo različno močne celične odzive [2].<br /> <br /> Optogenetika deluje na principu na-svetlobo-odzivnih proteinov, ki ob osvetljevanju s svetlobo karakteristične valovne dolžine spremenijo svoje lastnosti. Takšen je na primer protein VIVID iz nitaste glive ''Neurospora crasa'', ki deluje kot fotoreceptor za modro svetlobo [4]. V svoji strukturi ima vezan kofaktor FAD, ki na svetlobi tvori cisteinil-flavinski adukt, kar vodi v večje konformacijske spremembe proteina in njegovo dimerizacijo [5, 6]. <br /> <br /> == Potek ==<br /> <br /> Ideja raziskovalne skupine je bila, da bi s pomočjo svetlobe nadzirali delovanje encimov šikimatne poti, s čimer bi povečali proizvodnjo šikimske kisline, obenem pa zagotovili zadostno količino esencialnih metabolitov v celicah, da ne bi prišlo do zaustavitve rasti. To so dosegli z bifunkcionalnim optogenetskim stikalom, ki je bil obenem dvoslojen - vseboval je tako transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote. Prve delujejo neposredno na DNA, tako da vplivajo na prepisovanje tarčnih genov, vendar pa pri njih prihaja do zakasnjenega in nepopolnega celičnega odziva, saj nimajo vpliva na že nastale proteine. Boljšo učinkovitost se zato doseže s hkratno uporabo post-trasnkripcijskih regulatornih enot, katerih tarča so RNA, oziroma že nastali proteini. Razgradnjo slednjih lahko npr. dosežemo preko uvedbe N- ali C-končnih razgradnih oznak (degronov), ki proteine usmerjajo v razgradnjo [2, 7].<br /> <br /> Sam bifunkcionalni sistem so razvili po manjših korakih, sprva z reporterskim proteinom GFP:<br /> <br /> '''1) Priprava transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru transkripcije reporterskega gena s pomočjo represorja TetR. Sestavljali sta jo tako transkripcijska represijska enota (TRU), ki je bila namenjena zaustavitvi transkripcije gena za GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter transkripcijske aktivacijske enote (TAU) z nasprotnim učinkom. Obe enoti sta kot kontrolno vezje vsebovali zapis za razcepljeni represor TetR, pri čemer sta bila tako N-končni kot C-končni del represorja fuzirana s proteinom VIVID, kar je omogočilo njuno nadzorovanje s pomočjo svetlobe. Izhodno vezje je v primeru TRU vsebovalo zapis za GFP pod promotorjem PTet, v primeru TAU pa zapis za LacI pod promotorjem PTet ter zapis za GFP pod promotorjem PTrc.<br /> <br /> Pri obeh enotah sta v temi nastala N- in C-končni del razcepljenega TetR, vsak v fuziji s proteinom VIVID. Ker se slednji v temi nahaja v monomernem stanju, ni prišlo do povezave razcepljenih delov TetR, zato je bil le-ta neaktiven. V primeru TRU je zato transkripcija GFP potekala nemoteno, v primeru TAU pa je nemoteno potekala transkripcija LacI. Ta je preko vezave na operatorsko mesto na promotoju PTrc onemogočal nastanek GFP.<br /> <br /> Ob osvetljevanju z modro svetlobo je prišlo do dimerizacije proteina VIVID, kar je vodilo v povezavo razcepljenih delov TetR in njegovo aktivacijo. V primeru TRU se je TetR vezal na operatorsko regijo promotorja PTet, zaradi česar se je zaustavilo prepisovanje GFP, v primeru TAU pa je aktivirani TetR blokiral transkripcijo LacI, zato je transkripcija GFP pričela potekati [2].<br /> <br /> '''2) Priprava post-transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Post-transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru količine že nastalih reporterskih proteinov s pomočjo N- in C-končnih razgradnih oznak ter proteaze TEVp. Sestavljena je bila iz post-transkripcijske represijske enote (PRU), ki je bila namenjena razgradnji proteina GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter aktivacijske enote (PAU) z nasprotnim učinkom. Samo kontrolno vezje je bilo pri enotah enako kot pri TRU in TAU, le da je namesto razcepljenega represorja TetR vsebovalo razcepljeno proteazo TEVp. Izhodno vezje pri PRU je bilo enako tistemu pri TRU, le da je bil zapis za GFP fuziran še z N-končnim degronom teF. Izhodno vezje pri PAU pa je vsebovalo zapis za GFP v fuziji s C-končnim degronom teLAA pod promotorjem PTet.<br /> <br /> V temi je bila razcepljena TEVp neaktivna. Pri PRU zato do razgradnje nastalega GFP ni prišlo, saj je bil N-končni degron neizpostavljen. Ob izpostavitvi modri svetlobi je dimerizacija proteina VIVID omogočila povezavo ter aktivacijo proteaze TEVp, ki je nato preko proteolitične cepitve izpostavila N-končni degron na GFP, zaradi česar je prišlo do njegove razgradnje. Pri PAU je bil efekt nasproten. V temi je C-končna oznaka teLAA na proteinu GFP le-tega vodila v razgradnjo, ob osvetljevanju z modro svetlobo pa je aktivirana proteaza TEVp oznako odstranila, zato se GFP ni razgradil [2]. <br /> <br /> '''3) Združitev enot v dvoslojno stikalo'''<br /> <br /> Združitev regulatornih enot v dvoslojno optogenetsko stikalo je omogočalo hkratno kontrolo nad transkripcijo gena za GFP in regulacijo količine že nastalega proteina. Zgrajeno je bilo iz transkripcijskega in post-transkripcijskega represijskega sistema (TPRS) ter aktivacijskega sistema (TPAS). Oba sta vsebovala tako kontrolna vezja transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote, razlikovala pa sta se po izhodnih vezjih:<br /> <br /> * TPRS je vseboval enakega kot PRU. Ob osvetljevanju celic z modro svetlobo je aktivirani represor TetR zaustavil transkripcijo GFP, ki se je nahajal pod promotorjem PTet, aktivirana proteaza TEVp pa je s proteolitično cepitvijo izpostavila N-končni degron teF na GFP, zato se je nivo GFP znižal.<br /> * Izhodno vezje TPAS je bilo podobno izhodnemu vezju TAU, le da je bil zapis za LacI prisoten v N-končni fuziji z degronom teF, zapis za GFP pa v C-končni fuziji z degronom DAS. Ob osvetljevanju z modro svetlobo je tako aktiviran TetR zaustavil transkripcijo LacI, aktivirana TEVp pa je s cepitvijo izpostavila N-končni degron, zato se je količina LacI znižala, transkripcija GFP pa je lahko potekala. GFP je sicer nastajal v C-končni fuziji z degronom DAS, ki bi protein načeloma vodil v razgradnjo, vendar je proteaza TEVp oznako odcepila.<br /> <br /> '''4) Priprava bifunkcionalnega optogenetskega stikala za regulacijo proizvodnje šikimske kisline'''<br /> <br /> Vključitev na novo razvitih sistemov TPRS in TPAS v šikimatno pot je omogočila nadzor nad delovanjem encimov v le-tej s pomočjo modre svetlobe. Kontrolni vezji z razcepljenima TetR in TEVp sta pri tem ostali enaki, v izhodnih vezjih pa je prišlo do zamenjave GFP z encimi šikimatne poti:<br /> <br /> * V izhodnem vezju sistema TPRS je zapis za GFP nadomestil zapis za šikimat kinazo (AroK), ki šikimsko kislino pretvarja v šikimat 3-fosfat [8]. V temi, ko je AroK nastajala, je zato šikimatna pot potekala vse do aromatskih aminokislin, zaradi česar so celice neovirano rastle. Na svetlobi pa je transkripcija gena zaradi vezave TetR prenehala potekati, že nastali encimi AroK pa so se razgradili zaradi izpostavitve degronske oznake teF na N-koncu encima zaradi delovanja TEVp [2].<br /> * V izhodnem vezju sistema TPAS sta zapis za GFP zamenjala zapisa za 3-deoksi-D-arabinoheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sintazo (AroG) ter 3-dehidrokinat (DHQ) sintazo (AroB), ki sta pomembna pri sami sintezi šikimske kisline [2, 8]. V temi je bil nastanek encimov onemogočen zaradi delovanja represorja LacI, nekontrolirano nastali encimi pa so se razgradili zaradi C-končne degronske oznake DAS. Ob osvetljevanju je prišlo do razgradnje represorja LacI in zaustavitve njegovega nastanka, zato je transkripcija genov za AroG in AroB pričela potekati, nastala encima pa se nista razgradila, saj je aktivirana TEVp odstranila njuno degronsko oznako.<br /> <br /> Sistema TPRS in TPAS sta torej zagotovila bifunkcionalnost samega stikala, pri čemer je TPRS omogočal neovirano rast celic v temi, TPAS pa je ob osvetljevanju z modro svetlobo metabolni fluks preusmeril v proizvodnjo šikimske kisline, kar je povečalo njen izplen in zmanjšalo količino stranskih produktov. <br /> <br /> Vključitev bifunkcionalnega stikala v šasijo ''E. coli'' S5 je omogočila nastanek 4,2 g/L šikimske kisline v minimalnem gojišču NBS z dodatkom 20 g/L glukoze, kar je 1,6-krat več kot v celicah brez sinteznobiološkega vezja. Kot optimalni pogoji za gojenje celic so se izkazali temperatura 37 °C, koncentracija glukoze 40 g/L ter pričetek osvetljevanja po 24-urnem gojenju celic v temi. V takšnih pogojih so celice v 72 urah v 5 litrskem bioreaktorju proizvedle 35 g/L šikimske kisline, kar je največji titer šikimske kisline v minimalnem gojišču do zdaj [2]. <br /> <br /> == Viri in literatura ==<br /> <br /> [1] A. Ramazani, A. Shahkarami, Fatemeh Zarei, S. Rezayati, A. Rezaei, A. Bodaghi, L. Youseftabar-Miri: Shikimic acid from staranise (Illicium verum Hook): Extraction, purification and determination. ''Eurasian Chem. Commun''. 2021, 3(7), str. 452–460.<br /> <br /> [2] I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod''. 2022, 15(13), str. 1–14.<br /> <br /> [3] V. Tzin, G. Galili: New Insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants. ''Mol. Plant'' 2010, 3(6), str. 956–972.<br /> <br /> [4] J. M. Hurley, C. H. Chen, J. J. Loros, J. C. Dunlap: Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa. ''G3 Genes, Genomes, Genet.'' 2012, 2(10), str. 1207–1212.<br /> <br /> [5] A. T. Vaidya, C. H. Chen, J. C. Dunlap, J. J. Loros, B. R. Crane: Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. ''Sci. Signal.'' 2011, 4(184).<br /> <br /> [6] B. D. Zoltowski, B. R. Crane: Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. ''Biochemistry'' 2008, 47(27), str. 7012–7019.<br /> <br /> [7] A. Stikāne: Degrons, http://2014.igem.org/Team:Edinburgh/project/degrons (pridobljeno 23. 4. 2022).<br /> <br /> [8] D. F. Liu, G. M. Ai, Q. X. Zheng, C. Liu, C. Y. Jiang, L. X. Liu, B. Zhang, Y. M. Liu, C. Yang, S. J. Liu: Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by B''acillus subtilis'' strains. ''Microb. Cell Fact.'' 2014, 13(1), str. 1–11.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izbolj%C5%A1anje_proizvodnje_%C5%A1ikimske_kisline_v_E._coli&diff=20392 2022-04-24T20:48:11Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-022-02111-3#citeas I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod.'' 2022, 15(13), str. 1–14.]<br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Šikimska kislina je intermediat šikimatne poti, ki se v farmacevtski industriji uporablja kot izhodna surovina za sintezo protivirusne učinkovine oseltamivir, ta pa se uporablja za zdravljenje gripe. Iz industrijskega vidika je zato pridobivanje večjih količin šikimske kisline izredno pomembno, kar pa je mogoče doseči z izolacijo spojine iz naravnih virov, s kemijsko sintezo ali z mikrobno fermentacijo [1]. Za slednje se uporabljajo sevi ''E. coli'', ki so gensko spremenjeni tako, da omogočajo usmeritev metabolnega fluksa v sintezo šikimske kisline. Pri tem so bili do sedaj v ospredju predvsem različni statični sistemi regulacije (izbijanje tarčnih genov, itd.) pri katerih metabolni fluks sicer usmerimo v želeno biosintezno pot, lahko pa takšne modifikacije obenem vodijo v ustavitev celične rasti zaradi blokade v sintezi esencialnih metabolitov ali nabiranja toksičnih intermediatov [2]. Šikimatna pot se namreč pri šikimski kislini ne ustavi, pač pa se nadaljuje naprej do korizmata, ki je prekurzor za nastanek različnih spojin, pomembnih za rast in delovanje celic, kot so aromatske aminokisline, folna kislina, itd. [3] Reševanje tega problema je sicer možno z dodajanjem aromatskih aminokislin k minimalnemu gojišču, v katerem gojimo celice, vendar so le-te drage. Vedno bolj zato v ospredje prihajajo dinamični sistemi regulacije, ki omogočajo kontrolo nad več konkurenčnimi metabolnimi potmi, s čimer po eni strani zagotavljajo pripravo zadostne količine želenega produkta, po drugi strani pa ohranjanje viabilnosti celic. <br /> <br /> Med dinamične sisteme regulacije sodijo različna sinteznobiološka vezja, med katerimi imajo posebno velik potencial vezja, ki temeljijo na optogenetiki – regulaciji celičnih procesov s pomočjo svetlobe. Le-ta namreč predstavlja reverzibilen vir, ki je v primerjavi s kemičnimi induktorji, ki se jih sicer uporablja za regulacijo, cenejši in celicam netoksičen, poleg tega pa lahko s spreminjanjem njegove jakosti dosežemo različno močne celične odzive [2].<br /> <br /> Optogenetika deluje na principu na-svetlobo-odzivnih proteinov, ki ob osvetljevanju s svetlobo karakteristične valovne dolžine spremenijo svoje lastnosti. Takšen je na primer protein VIVID iz nitaste glive ''Neurospora crasa'', ki deluje kot fotoreceptor za modro svetlobo [4]. V svoji strukturi ima vezan kofaktor FAD, ki na svetlobi tvori cisteinil-flavinski adukt, kar vodi v večje konformacijske spremembe proteina in njegovo dimerizacijo [5, 6]. <br /> <br /> == Potek ==<br /> <br /> Ideja raziskovalne skupine je bila, da bi s pomočjo svetlobe nadzirali delovanje encimov šikimatne poti, s čimer bi povečali proizvodnjo šikimske kisline, obenem pa zagotovili zadostno količino esencialnih metabolitov v celicah, da ne bi prišlo do zaustavitve rasti. To so dosegli z bifunkcionalnim optogenetskim stikalom, ki je bil obenem dvoslojen - vseboval je tako transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote. Prve delujejo neposredno na DNA, tako da vplivajo na prepisovanje tarčnih genov, vendar pa pri njih prihaja do zakasnjenega in nepopolnega celičnega odziva, saj nimajo vpliva na že nastale proteine. Boljšo učinkovitost se zato doseže s hkratno uporabo post-trasnkripcijskih regulatornih enot, katerih tarča so RNA, oziroma že nastali proteini. Razgradnjo slednjih lahko npr. dosežemo preko uvedbe N- ali C-končnih razgradnih oznak (degronov), ki proteine usmerjajo v razgradnjo [2, 7].<br /> <br /> Sam bifunkcionalni sistem so razvili po manjših korakih, sprva z reporterskim proteinom GFP:<br /> <br /> '''1) Priprava transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru transkripcije reporterskega gena s pomočjo represorja TetR. Sestavljali sta jo tako transkripcijska represijska enota (TRU), ki je bila namenjena zaustavitvi transkripcije gena za GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter transkripcijske aktivacijske enote (TAU) z nasprotnim učinkom. Obe enoti sta kot kontrolno vezje vsebovali zapis za razcepljeni represor TetR, pri čemer sta bila tako N-končni kot C-končni del represorja fuzirana s proteinom VIVID, kar je omogočilo njuno nadzorovanje s pomočjo svetlobe. Izhodno vezje je v primeru TRU vsebovalo zapis za GFP pod promotorjem PTet, v primeru TAU pa zapis za LacI pod promotorjem PTet ter zapis za GFP pod promotorjem PTrc.<br /> <br /> Pri obeh enotah sta v temi nastala N- in C-končni del razcepljenega TetR, vsak v fuziji s proteinom VIVID. Ker se slednji v temi nahaja v monomernem stanju, ni prišlo do povezave razcepljenih delov TetR, zato je bil le-ta neaktiven. V primeru TRU je zato transkripcija GFP potekala nemoteno, v primeru TAU pa je nemoteno potekala transkripcija LacI. Ta je preko vezave na operatorsko mesto na promotoju PTrc onemogočal nastanek GFP.<br /> <br /> Ob osvetljevanju z modro svetlobo je prišlo do dimerizacije proteina VIVID, kar je vodilo v povezavo razcepljenih delov TetR in njegovo aktivacijo. V primeru TRU se je TetR vezal na operatorsko regijo promotorja PTet, zaradi česar se je zaustavilo prepisovanje GFP, v primeru TAU pa je aktivirani TetR blokiral transkripcijo LacI, zato je transkripcija GFP pričela potekati [2].<br /> <br /> '''2) Priprava post-transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Post-transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru količine že nastalih reporterskih proteinov s pomočjo N- in C-končnih razgradnih oznak ter proteaze TEVp. Sestavljena je bila iz post-transkripcijske represijske enote (PRU), ki je bila namenjena razgradnji proteina GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter aktivacijske enote (PAU) z nasprotnim učinkom. Samo kontrolno vezje je bilo pri enotah enako kot pri TRU in TAU, le da je namesto razcepljenega represorja TetR vsebovalo razcepljeno proteazo TEVp. Izhodno vezje pri PRU je bilo enako tistemu pri TRU, le da je bil zapis za GFP fuziran še z N-končnim degronom teF. Izhodno vezje pri PAU pa je vsebovalo zapis za GFP v fuziji s C-končnim degronom teLAA pod promotorjem PTet.<br /> <br /> V temi je bila razcepljena TEVp neaktivna. Pri PRU zato do razgradnje nastalega GFP ni prišlo, saj je bil N-končni degron neizpostavljen. Ob izpostavitvi modri svetlobi je dimerizacija proteina VIVID omogočila povezavo ter aktivacijo proteaze TEVp, ki je nato preko proteolitične cepitve izpostavila N-končni degron na GFP, zaradi česar je prišlo do njegove razgradnje. Pri PAU je bil efekt nasproten. V temi je C-končna oznaka teLAA na proteinu GFP le-tega vodila v razgradnjo, ob osvetljevanju z modro svetlobo pa je aktivirana proteaza TEVp oznako odstranila, zato se GFP ni razgradil [2]. <br /> <br /> '''3) Združitev enot v dvoslojno stikalo'''<br /> <br /> Združitev regulatornih enot v dvoslojno optogenetsko stikalo je omogočalo hkratno kontrolo nad transkripcijo proteina GFP in regulacijo količine že nastalega proteina. Zgrajeno je bilo iz transkripcijskega in post-transkripcijskega represijskega sistema (TPRS) ter aktivacijskega sistema (TPAS). Oba sta vsebovala tako kontrolna vezja transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote, razlikovala pa sta se po izhodnih vezjih:<br /> <br /> * TPRS je vseboval enakega kot PRU. Ob osvetljevanju celic z modro svetlobo je aktivirani represor TetR zaustavil transkripcijo GFP, ki se je nahajal pod promotorjem PTet, aktivirana proteaza TEVp pa je s proteolitično cepitvijo izpostavila N-končni degron teF na GFP, zato se je nivo GFP znižal.<br /> * Izhodno vezje TPAS je bilo podobno izhodnemu vezju TAU, le da je bil zapis za LacI prisoten v N-končni fuziji z degronom teF, zapis za GFP pa v C-končni fuziji z degronom DAS. Ob osvetljevanju z modro svetlobo je tako aktiviran TetR zaustavil transkripcijo LacI, aktivirana TEVp pa je s cepitvijo izpostavila N-končni degron, zato se je količina LacI znižala, transkripcija GFP pa je lahko potekala. GFP je sicer nastajal v C-končni fuziji z degronom DAS, ki bi protein načeloma vodil v razgradnjo, vendar je proteaza TEVp oznako odcepila.<br /> <br /> '''4) Priprava bifunkcionalnega optogenetskega stikala za regulacijo proizvodnje šikimske kisline'''<br /> <br /> Vključitev na novo razvitih sistemov TPRS in TPAS v šikimatno pot je omogočila nadzor nad delovanjem encimov v le-tej s pomočjo modre svetlobe. Kontrolni vezji z razcepljenima TetR in TEVp sta pri tem ostali enaki, v izhodnih vezjih pa je prišlo do zamenjave GFP z encimi šikimatne poti:<br /> <br /> * V izhodnem vezju sistema TPRS je zapis za GFP nadomestil zapis za šikimat kinazo (AroK), ki šikimsko kislino pretvarja v šikimat 3-fosfat [8]. V temi, ko je AroK nastajala, je zato šikimatna pot potekala vse do aromatskih aminokislin, zaradi česar so celice neovirano rastle. Na svetlobi pa je transkripcija gena zaradi vezave TetR prenehala potekati, že nastali encimi AroK pa so se razgradili zaradi izpostavitve degronske oznake teF na N-koncu encima zaradi delovanja TEVp [2].<br /> * V izhodnem vezju sistema TPAS sta zapis za GFP zamenjala zapisa za 3-deoksi-D-arabinoheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sintazo (AroG) ter 3-dehidrokinat (DHQ) sintazo (AroB), ki sta pomembna pri sami sintezi šikimske kisline [2, 8]. V temi je bil nastanek encimov onemogočen zaradi delovanja represorja LacI, nekontrolirano nastali encimi pa so se razgradili zaradi C-končne degronske oznake DAS. Ob osvetljevanju je prišlo do razgradnje represorja LacI in zaustavitve njegovega nastanka, zato je transkripcija genov za AroG in AroB pričela potekati, nastala encima pa se nista razgradila, saj je aktivirana TEVp odstranila njuno degronsko oznako.<br /> <br /> Sistema TPRS in TPAS sta torej zagotovila bifunkcionalnost samega stikala, pri čemer je TPRS omogočal neovirano rast celic v temi, TPAS pa je ob osvetljevanju z modro svetlobo metabolni fluks preusmeril v proizvodnjo šikimske kisline, kar je povečalo njen izplen in zmanjšalo količino stranskih produktov. <br /> <br /> Vključitev bifunkcionalnega stikala v šasijo ''E. coli'' S5 je omogočila nastanek 4,2 g/L šikimske kisline v minimalnem gojišču NBS z dodatkom 20 g/L glukoze, kar je 1,6-krat več kot v celicah brez sinteznobiološkega vezja. Kot optimalni pogoji za gojenje celic so se izkazali temperatura 37 °C, koncentracija glukoze 40 g/L ter pričetek osvetljevanja po 24-urnem gojenju celic v temi. V takšnih pogojih so celice v 72 urah v 5 litrskem bioreaktorju proizvedle 35 g/L šikimske kisline, kar je največji titer šikimske kisline v minimalnem gojišču do zdaj [2]. <br /> <br /> == Viri in literatura ==<br /> <br /> [1] A. Ramazani, A. Shahkarami, Fatemeh Zarei, S. Rezayati, A. Rezaei, A. Bodaghi, L. Youseftabar-Miri: Shikimic acid from staranise (Illicium verum Hook): Extraction, purification and determination. ''Eurasian Chem. Commun''. 2021, 3(7), str. 452–460.<br /> <br /> [2] I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod''. 2022, 15(13), str. 1–14.<br /> <br /> [3] V. Tzin, G. Galili: New Insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants. ''Mol. Plant'' 2010, 3(6), str. 956–972.<br /> <br /> [4] J. M. Hurley, C. H. Chen, J. J. Loros, J. C. Dunlap: Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa. ''G3 Genes, Genomes, Genet.'' 2012, 2(10), str. 1207–1212.<br /> <br /> [5] A. T. Vaidya, C. H. Chen, J. C. Dunlap, J. J. Loros, B. R. Crane: Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. ''Sci. Signal.'' 2011, 4(184).<br /> <br /> [6] B. D. Zoltowski, B. R. Crane: Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. ''Biochemistry'' 2008, 47(27), str. 7012–7019.<br /> <br /> [7] A. Stikāne: Degrons, http://2014.igem.org/Team:Edinburgh/project/degrons (pridobljeno 23. 4. 2022).<br /> <br /> [8] D. F. Liu, G. M. Ai, Q. X. Zheng, C. Liu, C. Y. Jiang, L. X. Liu, B. Zhang, Y. M. Liu, C. Yang, S. J. Liu: Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by B''acillus subtilis'' strains. ''Microb. Cell Fact.'' 2014, 13(1), str. 1–11.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izbolj%C5%A1anje_proizvodnje_%C5%A1ikimske_kisline_v_E._coli&diff=20391 2022-04-24T20:47:07Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-022-02111-3#citeas I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod.'' 2022, 15(13), str. 1–14.]<br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Šikimska kislina je intermediat šikimatne poti, ki se v farmacevtski industriji uporablja kot izhodna surovina za sintezo protivirusne učinkovine oseltamivir, ta pa se uporablja za zdravljenje gripe. Iz industrijskega vidika je zato pridobivanje večjih količin šikimske kisline izredno pomembno, kar pa je mogoče doseči z izolacijo spojine iz naravnih virov, s kemijsko sintezo ali z mikrobno fermentacijo [1]. Za slednje se uporabljajo sevi ''E. coli'', ki so gensko spremenjeni tako, da omogočajo usmeritev metabolnega fluksa v sintezo šikimske kisline. Pri tem so bili do sedaj v ospredju predvsem različni statični sistemi regulacije (izbijanje tarčnih genov, itd.) pri katerih metabolni fluks sicer usmerimo v želeno biosintezno pot, lahko pa takšne modifikacije obenem vodijo v ustavitev celične rasti zaradi blokade v sintezi esencialnih metabolitov ali nabiranja toksičnih intermediatov [2]. Šikimatna pot se namreč pri šikimski kislini ne ustavi, pač pa se nadaljuje naprej do korizmata, ki je prekurzor za nastanek različnih spojin, pomembnih za rast in delovanje celic, kot so aromatske aminokisline, folna kislina, itd. [3] Reševanje tega problema je sicer možno z dodajanjem aromatskih aminokislin k minimalnemu gojišču, v katerem gojimo celice, vendar so le-te drage. Vedno bolj zato v ospredje prihajajo dinamični sistemi regulacije, ki omogočajo kontrolo nad več konkurenčnimi metabolnimi potmi, s čimer po eni strani zagotavljajo pripravo zadostne količine želenega produkta, po drugi strani pa ohranjanje viabilnosti celic. <br /> <br /> Med dinamične sisteme regulacije sodijo različna sinteznobiološka vezja, med katerimi imajo posebno velik potencial vezja, ki temeljijo na optogenetiki – regulaciji celičnih procesov s pomočjo svetlobe. Le-ta namreč predstavlja reverzibilen vir, ki je v primerjavi s kemičnimi induktorji, ki se jih sicer uporablja za regulacijo, cenejši in celicam netoksičen, poleg tega pa lahko s spreminjanjem njegove jakosti dosežemo različno močne celične odzive [2].<br /> <br /> Optogenetika deluje na principu na-svetlobo-odzivnih proteinov, ki ob osvetljevanju s svetlobo karakteristične valovne dolžine spremenijo svoje lastnosti. Takšen je na primer protein VIVID iz nitaste glive ''Neurospora crasa'', ki deluje kot fotoreceptor za modro svetlobo [4]. V svoji strukturi ima vezan kofaktor FAD, ki na svetlobi tvori cisteinil-flavinski adukt, kar vodi v večje konformacijske spremembe proteina in njegovo dimerizacijo [5, 6]. <br /> <br /> == Potek ==<br /> <br /> Ideja raziskovalne skupine je bila, da bi s pomočjo svetlobe nadzirali delovanje encimov šikimatne poti, s čimer bi povečali proizvodnjo šikimske kisline, obenem pa zagotovili zadostno količino esencialnih metabolitov v celicah, da ne bi prišlo do zaustavitve rasti. To so dosegli z bifunkcionalnim optogenetskim stikalom, ki je bil obenem dvoslojen - vseboval je tako transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote. Prve delujejo neposredno na DNA, tako da vplivajo na prepisovanje tarčnih genov, vendar pa pri njih prihaja do zakasnjenega in nepopolnega celičnega odziva, saj nimajo vpliva na že nastale proteine. Boljšo učinkovitost se zato doseže s hkratno uporabo post-trasnkripcijskih regulatornih enot, katerih tarča so RNA, oziroma že nastali proteini. Razgradnjo slednjih lahko npr. dosežemo preko uvedbe N- ali C-končnih razgradnih oznak (degronov), ki proteine usmerjajo v razgradnjo [2, 7].<br /> <br /> Sam bifunkcionalni sistem so razvili po manjših korakih, sprva z reporterskim proteinom GFP:<br /> <br /> '''1) Priprava transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru transkripcije reporterskega gena s pomočjo represorja TetR. Sestavljali sta jo tako transkripcijska represijska enota (TRU), ki je bila namenjena zaustavitvi transkripcije gena za GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter transkripcijske aktivacijske enote (TAU) z nasprotnim učinkom. Obe enoti sta kot kontrolno vezje vsebovali zapis za razcepljeni represor TetR, pri čemer sta bila tako N-končni kot C-končni del represorja fuzirana s proteinom VIVID, kar je omogočilo njuno nadzorovanje s pomočjo svetlobe. Izhodno vezje je v primeru TRU vsebovalo zapis za GFP pod promotorjem PTet, v primeru TAU pa zapis za LacI pod promotorjem PTet ter zapis za GFP pod promotorjem PTrc.<br /> <br /> Pri obeh enotah sta v temi nastala N- in C-končni del razcepljenega TetR, vsak v fuziji s proteinom VIVID. Ker se slednji v temi nahaja v monomernem stanju, ni prišlo do povezave razcepljenih delov TetR, zato je bil le-ta neaktiven. V primeru TRU je zato transkripcija GFP potekala nemoteno, v primeru TAU pa je nemoteno potekala transkripcija LacI. Ta je preko vezave na operatorsko mesto na promotoju PTrc onemogočal nastanek GFP.<br /> <br /> Ob osvetljevanju z modro svetlobo je prišlo do dimerizacije proteina VIVID, kar je vodilo v povezavo razcepljenih delov TetR in njegovo aktivacijo. V primeru TRU se je TetR vezal na operatorsko regijo promotorja PTet, zaradi česar se je zaustavilo prepisovanje GFP, v primeru TAU pa je aktivirani TetR blokiral transkripcijo LacI, zato je transkripcija GFP pričela potekati [2].<br /> <br /> '''2) Priprava post-transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Post-transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru količine že nastalih reporterskih proteinov s pomočjo N- in C-končnih razgradnih oznak ter proteaze TEVp. Sestavljena je bila iz post-transkripcijske represijske enote (PRU), ki je bila namenjena razgradnji proteina GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter aktivacijske enote (PAU) z nasprotnim učinkom. Samo kontrolno vezje je bilo pri enotah enako kot pri TRU in TAU, le da je namesto razcepljenega represorja TetR vsebovalo razcepljeno proteazo TEVp. Izhodno vezje pri PRU je bilo enako tistemu pri TRU, le da je bil zapis za GFP fuziran še z N-končnim degronom teF. Izhodno vezje pri PAU pa je vsebovalo zapis za GFP v fuziji s C-končnim degronom teLAA pod promotorjem PTet.<br /> <br /> V temi je bila razcepljena TEVp neaktivna. Pri PRU zato do razgradnje nastalega GFP ni prišlo, saj je bil N-končni degron neizpostavljen. Ob izpostavitvi modri svetlobi je dimerizacija proteina VIVID omogočila povezavo ter aktivacijo proteaze TEVp, ki je nato preko proteolitične cepitve izpostavila N-končni degron na GFP, zaradi česar je prišlo do njegove razgradnje. Pri PAU je bil efekt nasproten. V temi je C-končna oznaka teLAA na proteinu GFP le-tega vodila v razgradnjo, ob osvetljevanju z modro svetlobo pa je aktivirana proteaza TEVp oznako odstranila, zato se GFP ni razgradil [2]. <br /> <br /> '''3) Združitev enot v dvoslojno stikalo'''<br /> <br /> Združitev regulatornih enot v dvoslojno optogenetsko stikalo je omogočalo hkratno kontrolo nad transkripcijo regulatornega proteina GFP in regulacijo količine že nastalega proteina. Zgrajeno je bilo iz transkripcijskega in post-transkripcijskega represijskega sistema (TPRS) ter aktivacijskega sistema (TPAS). Oba sta vsebovala tako kontrolna vezja transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote, razlikovala pa sta se po izhodnih vezjih:<br /> <br /> * TPRS je vseboval enakega kot PRU. Ob osvetljevanju celic z modro svetlobo je aktivirani represor TetR zaustavil transkripcijo GFP, ki se je nahajal pod promotorjem PTet, aktivirana proteaza TEVp pa je s proteolitično cepitvijo izpostavila N-končni degron teF na GFP, zato se je nivo GFP znižal.<br /> * Izhodno vezje TPAS je bilo podobno izhodnemu vezju TAU, le da je bil zapis za LacI prisoten v N-končni fuziji z degronom teF, zapis za GFP pa v C-končni fuziji z degronom DAS. Ob osvetljevanju z modro svetlobo je tako aktiviran TetR zaustavil transkripcijo LacI, aktivirana TEVp pa je s cepitvijo izpostavila N-končni degron, zato se je količina LacI znižala, transkripcija GFP pa je lahko potekala. GFP je sicer nastajal v C-končni fuziji z degronom DAS, ki bi protein načeloma vodil v razgradnjo, vendar je proteaza TEVp oznako odcepila.<br /> <br /> '''4) Priprava bifunkcionalnega optogenetskega stikala za regulacijo proizvodnje šikimske kisline'''<br /> <br /> Vključitev na novo razvitih sistemov TPRS in TPAS v šikimatno pot je omogočila nadzor nad delovanjem encimov v le-tej s pomočjo modre svetlobe. Kontrolni vezji z razcepljenima TetR in TEVp sta pri tem ostali enaki, v izhodnih vezjih pa je prišlo do zamenjave GFP z encimi šikimatne poti:<br /> <br /> * V izhodnem vezju sistema TPRS je zapis za GFP nadomestil zapis za šikimat kinazo (AroK), ki šikimsko kislino pretvarja v šikimat 3-fosfat [8]. V temi, ko je AroK nastajala, je zato šikimatna pot potekala vse do aromatskih aminokislin, zaradi česar so celice neovirano rastle. Na svetlobi pa je transkripcija gena zaradi vezave TetR prenehala potekati, že nastali encimi AroK pa so se razgradili zaradi izpostavitve degronske oznake teF na N-koncu encima zaradi delovanja TEVp [2].<br /> * V izhodnem vezju sistema TPAS sta zapis za GFP zamenjala zapisa za 3-deoksi-D-arabinoheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sintazo (AroG) ter 3-dehidrokinat (DHQ) sintazo (AroB), ki sta pomembna pri sami sintezi šikimske kisline [2, 8]. V temi je bil nastanek encimov onemogočen zaradi delovanja represorja LacI, nekontrolirano nastali encimi pa so se razgradili zaradi C-končne degronske oznake DAS. Ob osvetljevanju je prišlo do razgradnje represorja LacI in zaustavitve njegovega nastanka, zato je transkripcija genov za AroG in AroB pričela potekati, nastala encima pa se nista razgradila, saj je aktivirana TEVp odstranila njuno degronsko oznako.<br /> <br /> Sistema TPRS in TPAS sta torej zagotovila bifunkcionalnost samega stikala, pri čemer je TPRS omogočal neovirano rast celic v temi, TPAS pa je ob osvetljevanju z modro svetlobo metabolni fluks preusmeril v proizvodnjo šikimske kisline, kar je povečalo njen izplen in zmanjšalo količino stranskih produktov. <br /> <br /> Vključitev bifunkcionalnega stikala v šasijo ''E. coli'' S5 je omogočila nastanek 4,2 g/L šikimske kisline v minimalnem gojišču NBS z dodatkom 20 g/L glukoze, kar je 1,6-krat več kot v celicah brez sinteznobiološkega vezja. Kot optimalni pogoji za gojenje celic so se izkazali temperatura 37 °C, koncentracija glukoze 40 g/L ter pričetek osvetljevanja po 24-urnem gojenju celic v temi. V takšnih pogojih so celice v 72 urah v 5 litrskem bioreaktorju proizvedle 35 g/L šikimske kisline, kar je največji titer šikimske kisline v minimalnem gojišču do zdaj [2]. <br /> <br /> == Viri in literatura ==<br /> <br /> [1] A. Ramazani, A. Shahkarami, Fatemeh Zarei, S. Rezayati, A. Rezaei, A. Bodaghi, L. Youseftabar-Miri: Shikimic acid from staranise (Illicium verum Hook): Extraction, purification and determination. ''Eurasian Chem. Commun''. 2021, 3(7), str. 452–460.<br /> <br /> [2] I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod''. 2022, 15(13), str. 1–14.<br /> <br /> [3] V. Tzin, G. Galili: New Insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants. ''Mol. Plant'' 2010, 3(6), str. 956–972.<br /> <br /> [4] J. M. Hurley, C. H. Chen, J. J. Loros, J. C. Dunlap: Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa. ''G3 Genes, Genomes, Genet.'' 2012, 2(10), str. 1207–1212.<br /> <br /> [5] A. T. Vaidya, C. H. Chen, J. C. Dunlap, J. J. Loros, B. R. Crane: Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. ''Sci. Signal.'' 2011, 4(184).<br /> <br /> [6] B. D. Zoltowski, B. R. Crane: Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. ''Biochemistry'' 2008, 47(27), str. 7012–7019.<br /> <br /> [7] A. Stikāne: Degrons, http://2014.igem.org/Team:Edinburgh/project/degrons (pridobljeno 23. 4. 2022).<br /> <br /> [8] D. F. Liu, G. M. Ai, Q. X. Zheng, C. Liu, C. Y. Jiang, L. X. Liu, B. Zhang, Y. M. Liu, C. Yang, S. J. Liu: Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by B''acillus subtilis'' strains. ''Microb. Cell Fact.'' 2014, 13(1), str. 1–11.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izbolj%C5%A1anje_proizvodnje_%C5%A1ikimske_kisline_v_E._coli&diff=20390 2022-04-24T20:45:11Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-022-02111-3#citeas I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod.'' 2022, 15(13), str. 1–14.]<br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Šikimska kislina je intermediat šikimatne poti, ki se v farmacevtski industriji uporablja kot izhodna surovina za sintezo protivirusne učinkovine oseltamivir, ta pa se uporablja za zdravljenje gripe. Iz industrijskega vidika je zato pridobivanje večjih količin šikimske kisline izredno pomembno, kar pa je mogoče doseči z izolacijo spojine iz naravnih virov, s kemijsko sintezo ali z mikrobno fermentacijo [1]. Za slednje se uporabljajo sevi ''E. coli'', ki so gensko spremenjeni tako, da omogočajo usmeritev metabolnega fluksa v sintezo šikimske kisline. Pri tem so bili do sedaj v ospredju predvsem različni statični sistemi regulacije (izbijanje tarčnih genov, itd.) pri katerih metabolni fluks sicer usmerimo v želeno biosintezno pot, lahko pa takšne modifikacije obenem vodijo v ustavitev celične rasti zaradi blokade v sintezi esencialnih metabolitov ali nabiranja toksičnih intermediatov [2]. Šikimatna pot se namreč pri šikimski kislini ne ustavi, pač pa se nadaljuje naprej do korizmata, ki je prekurzor za nastanek različnih spojin, pomembnih za rast in delovanje celic, kot so aromatske aminokisline, folna kislina, itd. [3] Reševanje tega problema je sicer možno z dodajanjem aromatskih aminokislin k minimalnemu gojišču, v katerem gojimo celice, vendar so le-te drage. Vedno bolj zato v ospredje prihajajo dinamični sistemi regulacije, ki omogočajo kontrolo nad več konkurenčnimi metabolnimi potmi, s čimer po eni strani zagotavljajo pripravo zadostne količine želenega produkta, po drugi strani pa ohranjanje viabilnosti celic. <br /> <br /> Med dinamične sisteme regulacije sodijo različna sinteznobiološka vezja, med katerimi imajo posebno velik potencial vezja, ki temeljijo na optogenetiki – regulaciji celičnih procesov s pomočjo svetlobe. Le-ta namreč predstavlja reverzibilen vir, ki je v primerjavi s kemičnimi induktorji, ki se jih sicer uporablja za regulacijo, cenejši in celicam netoksičen, poleg tega pa lahko s spreminjanjem njegove jakosti dosežemo različno močne celične odzive [2].<br /> <br /> Optogenetika deluje na principu na-svetlobo-odzivnih proteinov, ki ob osvetljevanju s svetlobo karakteristične valovne dolžine spremenijo svoje lastnosti. Takšen je na primer protein VIVID iz nitaste glive ''Neurospora crasa'', ki deluje kot fotoreceptor za modro svetlobo [4]. V svoji strukturi ima vezan kofaktor FAD, ki na svetlobi tvori cisteinil-flavinski adukt, kar vodi v večje konformacijske spremembe proteina in njegovo dimerizacijo [5, 6]. <br /> <br /> == Potek ==<br /> <br /> Ideja raziskovalne skupine je bila, da bi s pomočjo svetlobe nadzirali delovanje encimov šikimatne poti, s čimer bi povečali proizvodnjo šikimske kisline, obenem pa zagotovili zadostno količino esencialnih metabolitov v celicah, da ne bi prišlo do zaustavitve rasti. To so dosegli z bifunkcionalnim optogenetskim stikalom, ki je bil obenem dvoslojen - vseboval je tako transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote. Prve delujejo neposredno na DNA, tako da vplivajo na prepisovanje tarčnih genov, vendar pa pri njih prihaja do zakasnjenega in nepopolnega celičnega odziva, saj nimajo vpliva na že nastale proteine. Boljšo učinkovitost se zato doseže s hkratno uporabo post-trasnkripcijskih regulatornih enot, katerih tarča so RNA, oziroma že nastali proteini. Razgradnjo slednjih lahko npr. dosežemo preko uvedbe N- ali C-končnih razgradnih oznak (degronov), ki proteine usmerjajo v razgradnjo [2, 7].<br /> <br /> Sam bifunkcionalni sistem so razvili po manjših korakih, sprva z reporterskim proteinom GFP:<br /> <br /> '''1) Priprava transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru transkripcije reporterskega gena s pomočjo represorja TetR. Sestavljali sta jo tako transkripcijska represijska enota (TRU), ki je bila namenjena zaustavitvi transkripcije gena za GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter transkripcijske aktivacijske enote (TAU) z nasprotnim učinkom. Obe enoti sta kot kontrolno vezje vsebovali zapis za razcepljeni represor TetR, pri čemer sta bila tako N-končni kot C-končni del represorja fuzirana s proteinom VIVID, kar je omogočilo njuno nadzorovanje s pomočjo svetlobe. Izhodno vezje je v primeru TRU vsebovalo zapis za GFP pod promotorjem PTet, v primeru TAU pa zapis za LacI pod promotorjem PTet ter zapis za GFP pod promotorjem PTrc.<br /> <br /> Pri obeh enotah sta v temi nastala N- in C-končni del razcepljenega TetR, vsak v fuziji s proteinom VIVID. Ker se slednji v temi nahaja v monomernem stanju, ni prišlo do povezave razcepljenih delov TetR, zato je bil le-ta neaktiven. V primeru TRU je zato transkripcija GFP potekala nemoteno, v primeru TAU pa je nemoteno potekala transkripcija LacI. Ta je preko vezave na operatorsko mesto na promotoju PTrc onemogočal nastanek GFP.<br /> <br /> Ob osvetljevanju z modro svetlobo je prišlo do dimerizacije proteina VIVID, kar je vodilo v povezavo razcepljenih delov TetR in njegovo aktivacijo. V primeru TRU se je TetR vezal na operatorsko regijo promotorja PTet, zaradi česar se je zaustavilo prepisovanje GFP, v primeru TAU pa je aktivirani TetR blokiral transkripcijo LacI, zato je transkripcija GFP pričela potekati [2].<br /> <br /> '''2) Priprava post-transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Post-transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru količine že nastalih reporterskih proteinov s pomočjo N- in C-končnih razgradnih oznak ter proteaze TEVp. Sestavljena je bila iz post-transkripcijske represijske enote (PRU), ki je bila namenjena razgradnji proteina GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter aktivacijske enote (PAU) z nasprotnim učinkom. Samo kontrolno vezje je bilo pri enotah enako kot pri TRU in TAU, le da je namesto razcepljenega represorja TetR vsebovalo razcepljeno proteazo TEVp. Izhodno vezje pri PRU je bilo enako tistemu pri TRU, le da je bil zapis za GFP fuziran še z N-končnim degronom teF. Izhodno vezje pri PAU je vsebovalo zapis za GFP v fuziji s C-končnim degronom teLAA pod promotorjem PTet.<br /> <br /> V temi je bila razcepljena TEVp neaktivna. Pri PRU zato do razgradnje nastalega GFP ni prišlo, saj je bil N-končni degron neizpostavljen. Ob izpostavitvi modri svetlobi je dimerizacija proteina VIVID omogočila povezavo ter aktivacijo proteaze TEVp, ki je nato preko proteolitične cepitve izpostavila N-končni degron na GFP, zaradi česar je prišlo do njegove razgradnje. Pri PAU je bil efekt nasproten. V temi je C-končna oznaka teLAA na proteinu GFP le-tega vodila v razgradnjo, ob osvetljevanju z modro svetlobo pa je aktivirana proteaza TEVp oznako odstranila, zato se GFP ni razgradil [2]. <br /> <br /> '''3) Združitev enot v dvoslojno stikalo'''<br /> <br /> Združitev regulatornih enot v dvoslojno optogenetsko stikalo je omogočalo hkratno kontrolo nad transkripcijo regulatornega proteina GFP in regulacijo količine že nastalega proteina. Zgrajeno je bilo iz transkripcijskega in post-transkripcijskega represijskega sistema (TPRS) ter aktivacijskega sistema (TPAS). Oba sta vsebovala tako kontrolna vezja transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote, razlikovala pa sta se po izhodnih vezjih:<br /> <br /> * TPRS je vseboval enakega kot PRU. Ob osvetljevanju celic z modro svetlobo je aktivirani represor TetR zaustavil transkripcijo GFP, ki se je nahajal pod promotorjem PTet, aktivirana proteaza TEVp pa je s proteolitično cepitvijo izpostavila N-končni degron teF na GFP, zato se je nivo GFP znižal.<br /> * Izhodno vezje TPAS je bilo podobno izhodnemu vezju TAU, le da je bil zapis za LacI prisoten v N-končni fuziji z degronom teF, zapis za GFP pa v C-končni fuziji z degronom DAS. Ob osvetljevanju z modro svetlobo je tako aktiviran TetR zaustavil transkripcijo LacI, aktivirana TEVp pa je s cepitvijo izpostavila N-končni degron, zato se je količina LacI znižala, transkripcija GFP pa je lahko potekala. GFP je sicer nastajal v C-končni fuziji z degronom DAS, ki bi protein načeloma vodil v razgradnjo, vendar je proteaza TEVp oznako odcepila.<br /> <br /> '''4) Priprava bifunkcionalnega optogenetskega stikala za regulacijo proizvodnje šikimske kisline'''<br /> <br /> Vključitev na novo razvitih sistemov TPRS in TPAS v šikimatno pot je omogočila nadzor nad delovanjem encimov v le-tej s pomočjo modre svetlobe. Kontrolni vezji z razcepljenima TetR in TEVp sta pri tem ostali enaki, v izhodnih vezjih pa je prišlo do zamenjave GFP z encimi šikimatne poti:<br /> <br /> * V izhodnem vezju sistema TPRS je zapis za GFP nadomestil zapis za šikimat kinazo (AroK), ki šikimsko kislino pretvarja v šikimat 3-fosfat [8]. V temi, ko je AroK nastajala, je zato šikimatna pot potekala vse do aromatskih aminokislin, zaradi česar so celice neovirano rastle. Na svetlobi pa je transkripcija gena zaradi vezave TetR prenehala potekati, že nastali encimi AroK pa so se razgradili zaradi izpostavitve degronske oznake teF na N-koncu encima zaradi delovanja TEVp [2].<br /> * V izhodnem vezju sistema TPAS sta zapis za GFP zamenjala zapisa za 3-deoksi-D-arabinoheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sintazo (AroG) ter 3-dehidrokinat (DHQ) sintazo (AroB), ki sta pomembna pri sami sintezi šikimske kisline [2, 8]. V temi je bil nastanek encimov onemogočen zaradi delovanja represorja LacI, nekontrolirano nastali encimi pa so se razgradili zaradi C-končne degronske oznake DAS. Ob osvetljevanju je prišlo do razgradnje represorja LacI in zaustavitve njegovega nastanka, zato je transkripcija genov za AroG in AroB pričela potekati, nastala encima pa se nista razgradila, saj je aktivirana TEVp odstranila njuno degronsko oznako.<br /> <br /> Sistema TPRS in TPAS sta torej zagotovila bifunkcionalnost samega stikala, pri čemer je TPRS omogočal neovirano rast celic v temi, TPAS pa je ob osvetljevanju z modro svetlobo metabolni fluks preusmeril v proizvodnjo šikimske kisline, kar je povečalo njen izplen in zmanjšalo količino stranskih produktov. <br /> <br /> Vključitev bifunkcionalnega stikala v šasijo ''E. coli'' S5 je omogočila nastanek 4,2 g/L šikimske kisline v minimalnem gojišču NBS z dodatkom 20 g/L glukoze, kar je 1,6-krat več kot v celicah brez sinteznobiološkega vezja. Kot optimalni pogoji za gojenje celic so se izkazali temperatura 37 °C, koncentracija glukoze 40 g/L ter pričetek osvetljevanja po 24-urnem gojenju celic v temi. V takšnih pogojih so celice v 72 urah v 5 litrskem bioreaktorju proizvedle 35 g/L šikimske kisline, kar je največji titer šikimske kisline v minimalnem gojišču do zdaj [2]. <br /> <br /> == Viri in literatura ==<br /> <br /> [1] A. Ramazani, A. Shahkarami, Fatemeh Zarei, S. Rezayati, A. Rezaei, A. Bodaghi, L. Youseftabar-Miri: Shikimic acid from staranise (Illicium verum Hook): Extraction, purification and determination. ''Eurasian Chem. Commun''. 2021, 3(7), str. 452–460.<br /> <br /> [2] I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod''. 2022, 15(13), str. 1–14.<br /> <br /> [3] V. Tzin, G. Galili: New Insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants. ''Mol. Plant'' 2010, 3(6), str. 956–972.<br /> <br /> [4] J. M. Hurley, C. H. Chen, J. J. Loros, J. C. Dunlap: Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa. ''G3 Genes, Genomes, Genet.'' 2012, 2(10), str. 1207–1212.<br /> <br /> [5] A. T. Vaidya, C. H. Chen, J. C. Dunlap, J. J. Loros, B. R. Crane: Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. ''Sci. Signal.'' 2011, 4(184).<br /> <br /> [6] B. D. Zoltowski, B. R. Crane: Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. ''Biochemistry'' 2008, 47(27), str. 7012–7019.<br /> <br /> [7] A. Stikāne: Degrons, http://2014.igem.org/Team:Edinburgh/project/degrons (pridobljeno 23. 4. 2022).<br /> <br /> [8] D. F. Liu, G. M. Ai, Q. X. Zheng, C. Liu, C. Y. Jiang, L. X. Liu, B. Zhang, Y. M. Liu, C. Yang, S. J. Liu: Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by B''acillus subtilis'' strains. ''Microb. Cell Fact.'' 2014, 13(1), str. 1–11.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izbolj%C5%A1anje_proizvodnje_%C5%A1ikimske_kisline_v_E._coli&diff=20385 2022-04-24T20:38:47Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-022-02111-3#citeas I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod.'' 2022, 15(13), str. 1–14.]<br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Šikimska kislina je intermediat šikimatne poti, ki se v farmacevtski industriji uporablja kot izhodna surovina za sintezo protivirusne učinkovine oseltamivir, ta pa se uporablja za zdravljenje gripe. Iz industrijskega vidika je zato pridobivanje večjih količin šikimske kisline izredno pomembno, kar pa je mogoče doseči z izolacijo spojine iz naravnih virov, s kemijsko sintezo ali z mikrobno fermentacijo [1]. Za slednje se uporabljajo sevi ''E. coli'', ki so gensko spremenjeni tako, da omogočajo usmeritev metabolnega fluksa v sintezo šikimske kisline. Pri tem so bili do sedaj v ospredju predvsem različni statični sistemi regulacije (izbijanje tarčnih genov, itd.) pri katerih metabolni fluks sicer usmerimo v želeno biosintezno pot, lahko pa takšne modifikacije obenem vodijo v ustavitev celične rasti zaradi blokade v sintezi esencialnih metabolitov ali nabiranja toksičnih intermediatov [2]. Šikimatna pot se namreč pri šikimski kislini ne ustavi, pač pa se nadaljuje naprej do korizmata, ki je prekurzor za nastanek različnih spojin, pomembnih za rast in delovanje celic, kot so aromatske aminokisline, folna kislina, itd. [3] Reševanje tega problema je sicer možno z dodajanjem aromatskih aminokislin k minimalnemu gojišču, v katerem gojimo celice, vendar so le-te drage. Vedno bolj zato v ospredje prihajajo dinamični sistemi regulacije, ki omogočajo kontrolo nad več konkurenčnimi metabolnimi potmi, s čimer po eni strani zagotavljajo pripravo zadostne količine želenega produkta, po drugi strani pa ohranjanje viabilnosti celic. <br /> <br /> Med dinamične sisteme regulacije sodijo različna sinteznobiološka vezja, med katerimi imajo posebno velik potencial vezja, ki temeljijo na optogenetiki – regulaciji celičnih procesov s pomočjo svetlobe. Le-ta namreč predstavlja reverzibilen vir, ki je v primerjavi s kemičnimi induktorji, ki se jih sicer uporablja za regulacijo, cenejši in celicam netoksičen, poleg tega pa lahko s spreminjanjem njegove jakosti dosežemo različno močne celične odzive [2].<br /> <br /> Optogenetika deluje na principu na-svetlobo-odzivnih proteinov, ki ob osvetljevanju s svetlobo karakteristične valovne dolžine spremenijo svoje lastnosti. Takšen je na primer protein VIVID iz nitaste glive ''Neurospora crasa'', ki deluje kot fotoreceptor za modro svetlobo [4]. V svoji strukturi ima vezan kofaktor FAD, ki na svetlobi tvori cisteinil-flavinski adukt, kar vodi v večje konformacijske spremembe proteina in njegovo dimerizacijo [5, 6]. <br /> <br /> == Potek ==<br /> <br /> Ideja raziskovalne skupine je bila, da bi s pomočjo svetlobe nadzirali delovanje encimov šikimatne poti, s čimer bi povečali proizvodnjo šikimske kisline, obenem pa zagotovili zadostno količino esencialnih metabolitov v celicah, da ne bi prišlo do zaustavitve rasti. To so dosegli z bifunkcionalnim optogenetskim stikalom, ki je bil obenem dvoslojen - vseboval je tako transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote. Prve delujejo neposredno na DNA, tako da vplivajo na prepisovanje tarčnih genov, vendar pa pri njih prihaja do zakasnjenega in nepopolnega celičnega odziva, saj nimajo vpliva na že nastale proteine. Boljšo učinkovitost se zato doseže s hkratno uporabo post-trasnkripcijskih regulatornih enot, katerih tarča so RNA, oziroma že nastali proteini. Razgradnjo slednjih lahko npr. dosežemo preko uvedbe N- ali C-končnih razgradnih oznak (degronov), ki proteine usmerjajo v razgradnjo [2, 7].<br /> <br /> Sam bifunkcionalni sistem so razvili po manjših korakih, sprva z reporterskim protein GFP:<br /> <br /> '''1) Priprava transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru transkripcije reporterskega gena s pomočjo represorja TetR. Sestavljali sta jo tako transkripcijska represijska enota (TRU), ki je bila namenjena zaustavitvi transkripcije gena za GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter transkripcijske aktivacijske enote (TAU) z nasprotnim učinkom. Obe enoti sta kot kontrolno vezje vsebovali zapis za razcepljeni represor TetR, pri čemer sta bila tako N-končni kot C-končni del represorja fuzirana s proteinom VIVID, kar je omogočilo njuno nadzorovanje s pomočjo svetlobe. Izhodno vezje je v primeru TRU vsebovalo zapis za GFP pod promotorjem PTet, v primeru TAU pa zapis za LacI pod promotorjem PTet ter zapis za GFP pod promotorjem PTrc.<br /> <br /> Pri obeh enotah sta v temi nastala N- in C-končni del razcepljenega TetR, vsak v fuziji s proteinom VIVID. Ker se slednji v temi nahaja v monomernem stanju, ni prišlo do povezave razcepljenih delov TetR, zato je bil le-ta neaktiven. V primeru TRU je zato transkripcija GFP potekala nemoteno, v primeru TAU pa je nemoteno potekala transkripcija LacI. Ta je preko vezave na operatorsko mesto na promotoju PTrc onemogočal nastanek GFP.<br /> <br /> Ob osvetljevanju z modro svetlobo je prišlo do dimerizacije proteina VIVID, kar je vodilo v povezavo razcepljenih delov TetR in njegovo aktivacijo. V primeru TRU se je TetR vezal na operatorsko regijo promotorja PTet, zaradi česar se je zaustavilo prepisovanje GFP, v primeru TAU pa je aktivirani TetR blokiral transkripcijo LacI, zato je transkripcija GFP pričela potekati [2].<br /> <br /> '''2) Priprava post-transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Post-transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru količine že nastalih reporterskih proteinov s pomočjo N- in C-končnih razgradnih oznak ter proteaze TEVp. Sestavljena je bila iz post-transkripcijske represijske enote (PRU), ki je bila namenjena razgradnji proteina GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter aktivacijske enote (PAU) z nasprotnim učinkom. Samo kontrolno vezje je bilo pri enotah enako kot pri TRU in TAU, le da je namesto razcepljenega represorja TetR vsebovalo razcepljeno proteazo TEVp. Izhodno vezje pri PRU je bilo enako tistemu pri TRU, le da je bil zapis za GFP fuziran še z N-končnim degronom teF. Izhodno vezje pri PAU je vsebovalo zapis za GFP v fuziji s C-končnim degronom teLAA pod promotorjem PTet.<br /> <br /> V temi je bila razcepljena TEVp neaktivna. Pri PRU zato do razgradnje nastalega GFP ni prišlo, saj je bil N-končni degron neizpostavljen. Ob izpostavitvi modri svetlobi je dimerizacija proteina VIVID omogočila povezavo ter aktivacijo proteaze TEVp, ki je nato preko proteolitične cepitve izpostavila N-končni degron na GFP, zaradi česar je prišlo do njegove razgradnje. Pri PAU je bil efekt nasproten. V temi je C-končna oznaka teLAA na proteinu GFP le-tega vodila v razgradnjo, ob osvetljevanju z modro svetlobo pa je aktivirana proteaza TEVp oznako odstranila, zato se GFP ni razgradil [2]. <br /> <br /> '''3) Združitev enot v dvoslojno stikalo'''<br /> <br /> Združitev regulatornih enot v dvoslojno optogenetsko stikalo je omogočalo hkratno kontrolo nad transkripcijo regulatornega proteina GFP in regulacijo količine že nastalega proteina. Zgrajeno je bilo iz transkripcijskega in post-transkripcijskega represijskega sistema (TPRS) ter aktivacijskega sistema (TPAS). Oba sta vsebovala tako kontrolna vezja transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote, razlikovala pa sta se po izhodnih vezjih:<br /> <br /> * TPRS je vseboval enakega kot PRU. Ob osvetljevanju celic z modro svetlobo je aktivirani represor TetR zaustavil transkripcijo GFP, ki se je nahajal pod promotorjem PTet, aktivirana proteaza TEVp pa je s proteolitično cepitvijo izpostavila N-končni degron teF na GFP, zato se je nivo GFP znižal.<br /> * Izhodno vezje TPAS je bilo podobno izhodnemu vezju TAU, le da je bil zapis za LacI prisoten v N-končni fuziji z degronom teF, zapis za GFP pa v C-končni fuziji z degronom DAS. Ob osvetljevanju z modro svetlobo je tako aktiviran TetR zaustavil transkripcijo LacI, aktivirana TEVp pa je s cepitvijo izpostavila N-končni degron, zato se je količina LacI znižala, transkripcija GFP pa je lahko potekala. GFP je sicer nastajal v C-končni fuziji z degronom DAS, ki bi protein načeloma vodil v razgradnjo, vendar je proteaza TEVp oznako odcepila.<br /> <br /> '''4) Priprava bifunkcionalnega optogenetskega stikala za regulacijo proizvodnje šikimske kisline'''<br /> <br /> Vključitev na novo razvitih sistemov TPRS in TPAS v šikimatno pot je omogočila nadzor nad delovanjem encimov v le-tej s pomočjo modre svetlobe. Kontrolni vezji z razcepljenima TetR in TEVp sta pri tem ostali enaki, v izhodnih vezjih pa je prišlo do zamenjave GFP z encimi šikimatne poti:<br /> <br /> * V izhodnem vezju sistema TPRS je zapis za GFP nadomestil zapis za šikimat kinazo (AroK), ki šikimsko kislino pretvarja v šikimat 3-fosfat [8]. V temi, ko je AroK nastajala, je zato šikimatna pot potekala vse do aromatskih aminokislin, zaradi česar so celice neovirano rastle. Na svetlobi pa je transkripcija gena zaradi vezave TetR prenehala potekati, že nastali encimi AroK pa so se razgradili zaradi izpostavitve degronske oznake teF na N-koncu encima zaradi delovanja TEVp [2].<br /> * V izhodnem vezju sistema TPAS sta zapis za GFP zamenjala zapisa za 3-deoksi-D-arabinoheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sintazo (AroG) ter 3-dehidrokinat (DHQ) sintazo (AroB), ki sta pomembna pri sami sintezi šikimske kisline [2, 8]. V temi je bil nastanek encimov onemogočen zaradi delovanja represorja LacI, nekontrolirano nastali encimi pa so se razgradili zaradi C-končne degronske oznake DAS. Ob osvetljevanju je prišlo do razgradnje represorja LacI in zaustavitve njegovega nastanka, zato je transkripcija genov za AroG in AroB pričela potekati, nastala encima pa se nista razgradila, saj je aktivirana TEVp odstranila njuno degronsko oznako.<br /> <br /> Sistema TPRS in TPAS sta torej zagotovila bifunkcionalnost samega stikala, pri čemer je TPRS omogočal neovirano rast celic v temi, TPAS pa je ob osvetljevanju z modro svetlobo metabolni fluks preusmeril v proizvodnjo šikimske kisline, kar je povečalo njen izplen in zmanjšalo količino stranskih produktov. <br /> <br /> Vključitev bifunkcionalnega stikala v šasijo ''E. coli'' S5 je omogočila nastanek 4,2 g/L šikimske kisline v minimalnem gojišču NBS z dodatkom 20 g/L glukoze, kar je 1,6-krat več kot v celicah brez sinteznobiološkega vezja. Kot optimalni pogoji za gojenje celic so se izkazali temperatura 37 °C, koncentracija glukoze 40 g/L ter pričetek osvetljevanja po 24-urnem gojenju celic v temi. V takšnih pogojih so celice v 72 urah v 5 litrskem bioreaktorju proizvedle 35 g/L šikimske kisline, kar je največji titer šikimske kisline v minimalnem gojišču do zdaj [2]. <br /> <br /> == Viri in literatura ==<br /> <br /> [1] A. Ramazani, A. Shahkarami, Fatemeh Zarei, S. Rezayati, A. Rezaei, A. Bodaghi, L. Youseftabar-Miri: Shikimic acid from staranise (Illicium verum Hook): Extraction, purification and determination. ''Eurasian Chem. Commun''. 2021, 3(7), str. 452–460.<br /> <br /> [2] I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod''. 2022, 15(13), str. 1–14.<br /> <br /> [3] V. Tzin, G. Galili: New Insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants. ''Mol. Plant'' 2010, 3(6), str. 956–972.<br /> <br /> [4] J. M. Hurley, C. H. Chen, J. J. Loros, J. C. Dunlap: Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa. ''G3 Genes, Genomes, Genet.'' 2012, 2(10), str. 1207–1212.<br /> <br /> [5] A. T. Vaidya, C. H. Chen, J. C. Dunlap, J. J. Loros, B. R. Crane: Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. ''Sci. Signal.'' 2011, 4(184).<br /> <br /> [6] B. D. Zoltowski, B. R. Crane: Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. ''Biochemistry'' 2008, 47(27), str. 7012–7019.<br /> <br /> [7] A. Stikāne: Degrons, http://2014.igem.org/Team:Edinburgh/project/degrons (pridobljeno 23. 4. 2022).<br /> <br /> [8] D. F. Liu, G. M. Ai, Q. X. Zheng, C. Liu, C. Y. Jiang, L. X. Liu, B. Zhang, Y. M. Liu, C. Yang, S. J. Liu: Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by B''acillus subtilis'' strains. ''Microb. Cell Fact.'' 2014, 13(1), str. 1–11.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izbolj%C5%A1anje_proizvodnje_%C5%A1ikimske_kisline_v_E._coli&diff=20384 2022-04-24T20:38:21Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-022-02111-3#citeas I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod.'' 2022, 15(13), str. 1–14.]<br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Šikimska kislina je intermediat šikimatne poti, ki se v farmacevtski industriji uporablja kot izhodna surovina za sintezo protivirusne učinkovine oseltamivir, ki se uporablja za zdravljenje gripe. Iz industrijskega vidika je zato pridobivanje večjih količin šikimske kisline izredno pomembno, kar pa je mogoče doseči z izolacijo spojine iz naravnih virov, s kemijsko sintezo ali z mikrobno fermentacijo [1]. Za slednje se uporabljajo sevi ''E. coli'', ki so gensko spremenjeni tako, da omogočajo usmeritev metabolnega fluksa v sintezo šikimske kisline. Pri tem so bili do sedaj v ospredju predvsem različni statični sistemi regulacije (izbijanje tarčnih genov, itd.) pri katerih metabolni fluks sicer usmerimo v želeno biosintezno pot, lahko pa takšne modifikacije obenem vodijo v ustavitev celične rasti zaradi blokade v sintezi esencialnih metabolitov ali nabiranja toksičnih intermediatov [2]. Šikimatna pot se namreč pri šikimski kislini ne ustavi, pač pa se nadaljuje naprej do korizmata, ki je prekurzor za nastanek različnih spojin, pomembnih za rast in delovanje celic, kot so aromatske aminokisline, folna kislina, itd. [3] Reševanje tega problema je sicer možno z dodajanjem aromatskih aminokislin k minimalnemu gojišču, v katerem gojimo celice, vendar so le-te drage. Vedno bolj zato v ospredje prihajajo dinamični sistemi regulacije, ki omogočajo kontrolo nad več konkurenčnimi metabolnimi potmi, s čimer po eni strani zagotavljajo pripravo zadostne količine želenega produkta, po drugi strani pa ohranjanje viabilnosti celic. <br /> <br /> Med dinamične sisteme regulacije sodijo različna sinteznobiološka vezja, med katerimi imajo posebno velik potencial vezja, ki temeljijo na optogenetiki – regulaciji celičnih procesov s pomočjo svetlobe. Le-ta namreč predstavlja reverzibilen vir, ki je v primerjavi s kemičnimi induktorji, ki se jih sicer uporablja za regulacijo, cenejši in celicam netoksičen, poleg tega pa lahko s spreminjanjem njegove jakosti dosežemo različno močne celične odzive [2].<br /> <br /> Optogenetika deluje na principu na-svetlobo-odzivnih proteinov, ki ob osvetljevanju s svetlobo karakteristične valovne dolžine spremenijo svoje lastnosti. Takšen je na primer protein VIVID iz nitaste glive ''Neurospora crasa'', ki deluje kot fotoreceptor za modro svetlobo [4]. V svoji strukturi ima vezan kofaktor FAD, ki na svetlobi tvori cisteinil-flavinski adukt, kar vodi v večje konformacijske spremembe proteina in njegovo dimerizacijo [5, 6]. <br /> <br /> == Potek ==<br /> <br /> Ideja raziskovalne skupine je bila, da bi s pomočjo svetlobe nadzirali delovanje encimov šikimatne poti, s čimer bi povečali proizvodnjo šikimske kisline, obenem pa zagotovili zadostno količino esencialnih metabolitov v celicah, da ne bi prišlo do zaustavitve rasti. To so dosegli z bifunkcionalnim optogenetskim stikalom, ki je bil obenem dvoslojen - vseboval je tako transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote. Prve delujejo neposredno na DNA, tako da vplivajo na prepisovanje tarčnih genov, vendar pa pri njih prihaja do zakasnjenega in nepopolnega celičnega odziva, saj nimajo vpliva na že nastale proteine. Boljšo učinkovitost se zato doseže s hkratno uporabo post-trasnkripcijskih regulatornih enot, katerih tarča so RNA, oziroma že nastali proteini. Razgradnjo slednjih lahko npr. dosežemo preko uvedbe N- ali C-končnih razgradnih oznak (degronov), ki proteine usmerjajo v razgradnjo [2, 7].<br /> <br /> Sam bifunkcionalni sistem so razvili po manjših korakih, sprva z reporterskim protein GFP:<br /> <br /> '''1) Priprava transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru transkripcije reporterskega gena s pomočjo represorja TetR. Sestavljali sta jo tako transkripcijska represijska enota (TRU), ki je bila namenjena zaustavitvi transkripcije gena za GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter transkripcijske aktivacijske enote (TAU) z nasprotnim učinkom. Obe enoti sta kot kontrolno vezje vsebovali zapis za razcepljeni represor TetR, pri čemer sta bila tako N-končni kot C-končni del represorja fuzirana s proteinom VIVID, kar je omogočilo njuno nadzorovanje s pomočjo svetlobe. Izhodno vezje je v primeru TRU vsebovalo zapis za GFP pod promotorjem PTet, v primeru TAU pa zapis za LacI pod promotorjem PTet ter zapis za GFP pod promotorjem PTrc.<br /> <br /> Pri obeh enotah sta v temi nastala N- in C-končni del razcepljenega TetR, vsak v fuziji s proteinom VIVID. Ker se slednji v temi nahaja v monomernem stanju, ni prišlo do povezave razcepljenih delov TetR, zato je bil le-ta neaktiven. V primeru TRU je zato transkripcija GFP potekala nemoteno, v primeru TAU pa je nemoteno potekala transkripcija LacI. Ta je preko vezave na operatorsko mesto na promotoju PTrc onemogočal nastanek GFP.<br /> <br /> Ob osvetljevanju z modro svetlobo je prišlo do dimerizacije proteina VIVID, kar je vodilo v povezavo razcepljenih delov TetR in njegovo aktivacijo. V primeru TRU se je TetR vezal na operatorsko regijo promotorja PTet, zaradi česar se je zaustavilo prepisovanje GFP, v primeru TAU pa je aktivirani TetR blokiral transkripcijo LacI, zato je transkripcija GFP pričela potekati [2].<br /> <br /> '''2) Priprava post-transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Post-transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru količine že nastalih reporterskih proteinov s pomočjo N- in C-končnih razgradnih oznak ter proteaze TEVp. Sestavljena je bila iz post-transkripcijske represijske enote (PRU), ki je bila namenjena razgradnji proteina GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter aktivacijske enote (PAU) z nasprotnim učinkom. Samo kontrolno vezje je bilo pri enotah enako kot pri TRU in TAU, le da je namesto razcepljenega represorja TetR vsebovalo razcepljeno proteazo TEVp. Izhodno vezje pri PRU je bilo enako tistemu pri TRU, le da je bil zapis za GFP fuziran še z N-končnim degronom teF. Izhodno vezje pri PAU je vsebovalo zapis za GFP v fuziji s C-končnim degronom teLAA pod promotorjem PTet.<br /> <br /> V temi je bila razcepljena TEVp neaktivna. Pri PRU zato do razgradnje nastalega GFP ni prišlo, saj je bil N-končni degron neizpostavljen. Ob izpostavitvi modri svetlobi je dimerizacija proteina VIVID omogočila povezavo ter aktivacijo proteaze TEVp, ki je nato preko proteolitične cepitve izpostavila N-končni degron na GFP, zaradi česar je prišlo do njegove razgradnje. Pri PAU je bil efekt nasproten. V temi je C-končna oznaka teLAA na proteinu GFP le-tega vodila v razgradnjo, ob osvetljevanju z modro svetlobo pa je aktivirana proteaza TEVp oznako odstranila, zato se GFP ni razgradil [2]. <br /> <br /> '''3) Združitev enot v dvoslojno stikalo'''<br /> <br /> Združitev regulatornih enot v dvoslojno optogenetsko stikalo je omogočalo hkratno kontrolo nad transkripcijo regulatornega proteina GFP in regulacijo količine že nastalega proteina. Zgrajeno je bilo iz transkripcijskega in post-transkripcijskega represijskega sistema (TPRS) ter aktivacijskega sistema (TPAS). Oba sta vsebovala tako kontrolna vezja transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote, razlikovala pa sta se po izhodnih vezjih:<br /> <br /> * TPRS je vseboval enakega kot PRU. Ob osvetljevanju celic z modro svetlobo je aktivirani represor TetR zaustavil transkripcijo GFP, ki se je nahajal pod promotorjem PTet, aktivirana proteaza TEVp pa je s proteolitično cepitvijo izpostavila N-končni degron teF na GFP, zato se je nivo GFP znižal.<br /> * Izhodno vezje TPAS je bilo podobno izhodnemu vezju TAU, le da je bil zapis za LacI prisoten v N-končni fuziji z degronom teF, zapis za GFP pa v C-končni fuziji z degronom DAS. Ob osvetljevanju z modro svetlobo je tako aktiviran TetR zaustavil transkripcijo LacI, aktivirana TEVp pa je s cepitvijo izpostavila N-končni degron, zato se je količina LacI znižala, transkripcija GFP pa je lahko potekala. GFP je sicer nastajal v C-končni fuziji z degronom DAS, ki bi protein načeloma vodil v razgradnjo, vendar je proteaza TEVp oznako odcepila.<br /> <br /> '''4) Priprava bifunkcionalnega optogenetskega stikala za regulacijo proizvodnje šikimske kisline'''<br /> <br /> Vključitev na novo razvitih sistemov TPRS in TPAS v šikimatno pot je omogočila nadzor nad delovanjem encimov v le-tej s pomočjo modre svetlobe. Kontrolni vezji z razcepljenima TetR in TEVp sta pri tem ostali enaki, v izhodnih vezjih pa je prišlo do zamenjave GFP z encimi šikimatne poti:<br /> <br /> * V izhodnem vezju sistema TPRS je zapis za GFP nadomestil zapis za šikimat kinazo (AroK), ki šikimsko kislino pretvarja v šikimat 3-fosfat [8]. V temi, ko je AroK nastajala, je zato šikimatna pot potekala vse do aromatskih aminokislin, zaradi česar so celice neovirano rastle. Na svetlobi pa je transkripcija gena zaradi vezave TetR prenehala potekati, že nastali encimi AroK pa so se razgradili zaradi izpostavitve degronske oznake teF na N-koncu encima zaradi delovanja TEVp [2].<br /> * V izhodnem vezju sistema TPAS sta zapis za GFP zamenjala zapisa za 3-deoksi-D-arabinoheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sintazo (AroG) ter 3-dehidrokinat (DHQ) sintazo (AroB), ki sta pomembna pri sami sintezi šikimske kisline [2, 8]. V temi je bil nastanek encimov onemogočen zaradi delovanja represorja LacI, nekontrolirano nastali encimi pa so se razgradili zaradi C-končne degronske oznake DAS. Ob osvetljevanju je prišlo do razgradnje represorja LacI in zaustavitve njegovega nastanka, zato je transkripcija genov za AroG in AroB pričela potekati, nastala encima pa se nista razgradila, saj je aktivirana TEVp odstranila njuno degronsko oznako.<br /> <br /> Sistema TPRS in TPAS sta torej zagotovila bifunkcionalnost samega stikala, pri čemer je TPRS omogočal neovirano rast celic v temi, TPAS pa je ob osvetljevanju z modro svetlobo metabolni fluks preusmeril v proizvodnjo šikimske kisline, kar je povečalo njen izplen in zmanjšalo količino stranskih produktov. <br /> <br /> Vključitev bifunkcionalnega stikala v šasijo ''E. coli'' S5 je omogočila nastanek 4,2 g/L šikimske kisline v minimalnem gojišču NBS z dodatkom 20 g/L glukoze, kar je 1,6-krat več kot v celicah brez sinteznobiološkega vezja. Kot optimalni pogoji za gojenje celic so se izkazali temperatura 37 °C, koncentracija glukoze 40 g/L ter pričetek osvetljevanja po 24-urnem gojenju celic v temi. V takšnih pogojih so celice v 72 urah v 5 litrskem bioreaktorju proizvedle 35 g/L šikimske kisline, kar je največji titer šikimske kisline v minimalnem gojišču do zdaj [2]. <br /> <br /> == Viri in literatura ==<br /> <br /> [1] A. Ramazani, A. Shahkarami, Fatemeh Zarei, S. Rezayati, A. Rezaei, A. Bodaghi, L. Youseftabar-Miri: Shikimic acid from staranise (Illicium verum Hook): Extraction, purification and determination. ''Eurasian Chem. Commun''. 2021, 3(7), str. 452–460.<br /> <br /> [2] I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod''. 2022, 15(13), str. 1–14.<br /> <br /> [3] V. Tzin, G. Galili: New Insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants. ''Mol. Plant'' 2010, 3(6), str. 956–972.<br /> <br /> [4] J. M. Hurley, C. H. Chen, J. J. Loros, J. C. Dunlap: Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa. ''G3 Genes, Genomes, Genet.'' 2012, 2(10), str. 1207–1212.<br /> <br /> [5] A. T. Vaidya, C. H. Chen, J. C. Dunlap, J. J. Loros, B. R. Crane: Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. ''Sci. Signal.'' 2011, 4(184).<br /> <br /> [6] B. D. Zoltowski, B. R. Crane: Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. ''Biochemistry'' 2008, 47(27), str. 7012–7019.<br /> <br /> [7] A. Stikāne: Degrons, http://2014.igem.org/Team:Edinburgh/project/degrons (pridobljeno 23. 4. 2022).<br /> <br /> [8] D. F. Liu, G. M. Ai, Q. X. Zheng, C. Liu, C. Y. Jiang, L. X. Liu, B. Zhang, Y. M. Liu, C. Yang, S. J. Liu: Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by B''acillus subtilis'' strains. ''Microb. Cell Fact.'' 2014, 13(1), str. 1–11.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2021/22&diff=20377 2022-04-24T20:01:00Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_E._coli Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) &lt;br&gt;<br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2021/22&diff=20376 2022-04-24T20:00:34Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_'_'_E._coli_'_' Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) &lt;br&gt;<br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2021/22&diff=20375 2022-04-24T20:00:18Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_''_E._coli_'' Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) &lt;br&gt;<br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izbolj%C5%A1anje_proizvodnje_%C5%A1ikimske_kisline_v_E._coli&diff=20374 2022-04-24T19:57:16Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-022-02111-3#citeas I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod.'' 2022, 15(13), str. 1–14.]<br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Šikimska kislina je intermediat šikimatne poti, v farmacevtski industriji pa se uporablja kot izhodna surovina za sintezo protivirusne učinkovine oseltamivir, ki se uporablja za zdravljenje gripe. Iz industrijskega vidika je zato pridobivanje večjih količin šikimske kisline izredno pomembno, kar pa je mogoče doseči z izolacijo spojine iz naravnih virov, s kemijsko sintezo ali z mikrobno fermentacijo [1]. Za slednje se uporabljajo sevi ''E. coli'', ki so gensko spremenjeni tako, da omogočajo usmeritev metabolnega fluksa v sintezo šikimske kisline. Pri tem so bili do sedaj v ospredju predvsem različni statični sistemi regulacije (izbijanje tarčnih genov, itd.) pri katerih metabolni fluks sicer usmerimo v želeno biosintezno pot, lahko pa takšne modifikacije obenem vodijo v ustavitev celične rasti zaradi blokade v sintezi esencialnih metabolitov ali nabiranja toksičnih intermediatov [2]. Šikimatna pot se namreč pri šikimski kislini ne ustavi, pač pa se nadaljuje naprej do korizmata, ki je prekurzor za nastanek različnih spojin, pomembnih za rast in delovanje celic, kot so aromatske aminokisline, folna kislina, itd. [3] Reševanje tega problema je sicer možno z dodajanjem aromatskih aminokislin k minimalnemu gojišču, v katerem gojimo celice, vendar so le-te drage. Vedno bolj zato v ospredje prihajajo dinamični sistemi regulacije, ki omogočajo kontrolo nad več konkurenčnimi metabolnimi potmi, s čimer po eni strani zagotavljajo pripravo zadostne količine želenega produkta, po drugi strani pa ohranjanje viabilnosti celic. <br /> <br /> Med dinamične sisteme regulacije sodijo različna sinteznobiološka vezja, med katerimi imajo posebno velik potencial vezja, ki temeljijo na optogenetiki – regulaciji celičnih procesov s pomočjo svetlobe. Le-ta namreč predstavlja reverzibilen vir, ki je v primerjavi s kemičnimi induktorji, ki se jih sicer uporablja za regulacijo, cenejši in celicam netoksičen, poleg tega pa lahko s spreminjanjem njegove jakosti dosežemo različno močne celične odzive [2].<br /> <br /> Optogenetika deluje na principu na-svetlobo-odzivnih proteinov, ki ob osvetljevanju s svetlobo karakteristične valovne dolžine spremenijo svoje lastnosti. Takšen je na primer protein VIVID iz nitaste glive ''Neurospora crasa'', ki deluje kot fotoreceptor za modro svetlobo [4]. V svoji strukturi ima vezan kofaktor FAD, ki na svetlobi tvori cisteinil-flavinski adukt, kar vodi v večje konformacijske spremembe proteina in njegovo dimerizacijo [5, 6]. <br /> <br /> == Potek ==<br /> <br /> Ideja raziskovalne skupine je bila, da bi s pomočjo svetlobe nadzirali delovanje encimov šikimatne poti, s čimer bi povečali proizvodnjo šikimske kisline, obenem pa zagotovili zadostno količino esencialnih metabolitov v celicah, da ne bi prišlo do zaustavitve rasti. To so dosegli z bifunkcionalnim optogenetskim stikalom, ki je bil obenem dvoslojen - vseboval je tako transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote. Prve delujejo neposredno na DNA, tako da vplivajo na prepisovanje tarčnih genov, vendar pa pri njih prihaja do zakasnjenega in nepopolnega celičnega odziva, saj nimajo vpliva na že nastale proteine. Boljšo učinkovitost se zato doseže s hkratno uporabo post-trasnkripcijskih regulatornih enot, katerih tarča so RNA, oziroma že nastali proteini. Razgradnjo slednjih lahko npr. dosežemo preko uvedbe N- ali C-končnih razgradnih oznak (degronov), ki proteine usmerjajo v razgradnjo [2, 7].<br /> <br /> Sam bifunkcionalni sistem so razvili po manjših korakih, sprva z reporterskim protein GFP:<br /> <br /> '''1) Priprava transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru transkripcije reporterskega gena s pomočjo represorja TetR. Sestavljali sta jo tako transkripcijska represijska enota (TRU), ki je bila namenjena zaustavitvi transkripcije gena za GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter transkripcijske aktivacijske enote (TAU) z nasprotnim učinkom. Obe enoti sta kot kontrolno vezje vsebovali zapis za razcepljeni represor TetR, pri čemer sta bila tako N-končni kot C-končni del represorja fuzirana s proteinom VIVID, kar je omogočilo njuno nadzorovanje s pomočjo svetlobe. Izhodno vezje je v primeru TRU vsebovalo zapis za GFP pod promotorjem PTet, v primeru TAU pa zapis za LacI pod promotorjem PTet ter zapis za GFP pod promotorjem PTrc.<br /> <br /> Pri obeh enotah sta v temi nastala N- in C-končni del razcepljenega TetR, vsak v fuziji s proteinom VIVID. Ker se slednji v temi nahaja v monomernem stanju, ni prišlo do povezave razcepljenih delov TetR, zato je bil le-ta neaktiven. V primeru TRU je zato transkripcija GFP potekala nemoteno, v primeru TAU pa je nemoteno potekala transkripcija LacI. Ta je preko vezave na operatorsko mesto na promotoju PTrc onemogočal nastanek GFP.<br /> <br /> Ob osvetljevanju z modro svetlobo je prišlo do dimerizacije proteina VIVID, kar je vodilo v povezavo razcepljenih delov TetR in njegovo aktivacijo. V primeru TRU se je TetR vezal na operatorsko regijo promotorja PTet, zaradi česar se je zaustavilo prepisovanje GFP, v primeru TAU pa je aktivirani TetR blokiral transkripcijo LacI, zato je transkripcija GFP pričela potekati [2].<br /> <br /> '''2) Priprava post-transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Post-transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru količine že nastalih reporterskih proteinov s pomočjo N- in C-končnih razgradnih oznak ter proteaze TEVp. Sestavljena je bila iz post-transkripcijske represijske enote (PRU), ki je bila namenjena razgradnji proteina GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter aktivacijske enote (PAU) z nasprotnim učinkom. Samo kontrolno vezje je bilo pri enotah enako kot pri TRU in TAU, le da je namesto razcepljenega represorja TetR vsebovalo razcepljeno proteazo TEVp. Izhodno vezje pri PRU je bilo enako tistemu pri TRU, le da je bil zapis za GFP fuziran še z N-končnim degronom teF. Izhodno vezje pri PAU je vsebovalo zapis za GFP v fuziji s C-končnim degronom teLAA pod promotorjem PTet.<br /> <br /> V temi je bila razcepljena TEVp neaktivna. Pri PRU zato do razgradnje nastalega GFP ni prišlo, saj je bil N-končni degron neizpostavljen. Ob izpostavitvi modri svetlobi je dimerizacija proteina VIVID omogočila povezavo ter aktivacijo proteaze TEVp, ki je nato preko proteolitične cepitve izpostavila N-končni degron na GFP, zaradi česar je prišlo do njegove razgradnje. Pri PAU je bil efekt nasproten. V temi je C-končna oznaka teLAA na proteinu GFP le-tega vodila v razgradnjo, ob osvetljevanju z modro svetlobo pa je aktivirana proteaza TEVp oznako odstranila, zato se GFP ni razgradil [2]. <br /> <br /> '''3) Združitev enot v dvoslojno stikalo'''<br /> <br /> Združitev regulatornih enot v dvoslojno optogenetsko stikalo je omogočalo hkratno kontrolo nad transkripcijo regulatornega proteina GFP in regulacijo količine že nastalega proteina. Zgrajeno je bilo iz transkripcijskega in post-transkripcijskega represijskega sistema (TPRS) ter aktivacijskega sistema (TPAS). Oba sta vsebovala tako kontrolna vezja transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote, razlikovala pa sta se po izhodnih vezjih:<br /> <br /> * TPRS je vseboval enakega kot PRU. Ob osvetljevanju celic z modro svetlobo je aktivirani represor TetR zaustavil transkripcijo GFP, ki se je nahajal pod promotorjem PTet, aktivirana proteaza TEVp pa je s proteolitično cepitvijo izpostavila N-končni degron teF na GFP, zato se je nivo GFP znižal.<br /> * Izhodno vezje TPAS je bilo podobno izhodnemu vezju TAU, le da je bil zapis za LacI prisoten v N-končni fuziji z degronom teF, zapis za GFP pa v C-končni fuziji z degronom DAS. Ob osvetljevanju z modro svetlobo je tako aktiviran TetR zaustavil transkripcijo LacI, aktivirana TEVp pa je s cepitvijo izpostavila N-končni degron, zato se je količina LacI znižala, transkripcija GFP pa je lahko potekala. GFP je sicer nastajal v C-končni fuziji z degronom DAS, ki bi protein načeloma vodil v razgradnjo, vendar je proteaza TEVp oznako odcepila.<br /> <br /> '''4) Priprava bifunkcionalnega optogenetskega stikala za regulacijo proizvodnje šikimske kisline'''<br /> <br /> Vključitev na novo razvitih sistemov TPRS in TPAS v šikimatno pot je omogočila nadzor nad delovanjem encimov v le-tej s pomočjo modre svetlobe. Kontrolni vezji z razcepljenima TetR in TEVp sta pri tem ostali enaki, v izhodnih vezjih pa je prišlo do zamenjave GFP z encimi šikimatne poti:<br /> <br /> * V izhodnem vezju sistema TPRS je zapis za GFP nadomestil zapis za šikimat kinazo (AroK), ki šikimsko kislino pretvarja v šikimat 3-fosfat [8]. V temi, ko je AroK nastajala, je zato šikimatna pot potekala vse do aromatskih aminokislin, zaradi česar so celice neovirano rastle. Na svetlobi pa je transkripcija gena zaradi vezave TetR prenehala potekati, že nastali encimi AroK pa so se razgradili zaradi izpostavitve degronske oznake teF na N-koncu encima zaradi delovanja TEVp [2].<br /> * V izhodnem vezju sistema TPAS sta zapis za GFP zamenjala zapisa za 3-deoksi-D-arabinoheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sintazo (AroG) ter 3-dehidrokinat (DHQ) sintazo (AroB), ki sta pomembna pri sami sintezi šikimske kisline [2, 8]. V temi je bil nastanek encimov onemogočen zaradi delovanja represorja LacI, nekontrolirano nastali encimi pa so se razgradili zaradi C-končne degronske oznake DAS. Ob osvetljevanju je prišlo do razgradnje represorja LacI in zaustavitve njegovega nastanka, zato je transkripcija genov za AroG in AroB pričela potekati, nastala encima pa se nista razgradila, saj je aktivirana TEVp odstranila njuno degronsko oznako.<br /> <br /> Sistema TPRS in TPAS sta torej zagotovila bifunkcionalnost samega stikala, pri čemer je TPRS omogočal neovirano rast celic v temi, TPAS pa je ob osvetljevanju z modro svetlobo metabolni fluks preusmeril v proizvodnjo šikimske kisline, kar je povečalo njen izplen in zmanjšalo količino stranskih produktov. <br /> <br /> Vključitev bifunkcionalnega stikala v šasijo ''E. coli'' S5 je omogočila nastanek 4,2 g/L šikimske kisline v minimalnem gojišču NBS z dodatkom 20 g/L glukoze, kar je 1,6-krat več kot v celicah brez sinteznobiološkega vezja. Kot optimalni pogoji za gojenje celic so se izkazali temperatura 37 °C, koncentracija glukoze 40 g/L ter pričetek osvetljevanja po 24-urnem gojenju celic v temi. V takšnih pogojih so celice v 72 urah v 5 litrskem bioreaktorju proizvedle 35 g/L šikimske kisline, kar je največji titer šikimske kisline v minimalnem gojišču do zdaj [2]. <br /> <br /> == Viri in literatura ==<br /> <br /> [1] A. Ramazani, A. Shahkarami, Fatemeh Zarei, S. Rezayati, A. Rezaei, A. Bodaghi, L. Youseftabar-Miri: Shikimic acid from staranise (Illicium verum Hook): Extraction, purification and determination. ''Eurasian Chem. Commun''. 2021, 3(7), str. 452–460.<br /> <br /> [2] I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod''. 2022, 15(13), str. 1–14.<br /> <br /> [3] V. Tzin, G. Galili: New Insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants. ''Mol. Plant'' 2010, 3(6), str. 956–972.<br /> <br /> [4] J. M. Hurley, C. H. Chen, J. J. Loros, J. C. Dunlap: Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa. ''G3 Genes, Genomes, Genet.'' 2012, 2(10), str. 1207–1212.<br /> <br /> [5] A. T. Vaidya, C. H. Chen, J. C. Dunlap, J. J. Loros, B. R. Crane: Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. ''Sci. Signal.'' 2011, 4(184).<br /> <br /> [6] B. D. Zoltowski, B. R. Crane: Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. ''Biochemistry'' 2008, 47(27), str. 7012–7019.<br /> <br /> [7] A. Stikāne: Degrons, http://2014.igem.org/Team:Edinburgh/project/degrons (pridobljeno 23. 4. 2022).<br /> <br /> [8] D. F. Liu, G. M. Ai, Q. X. Zheng, C. Liu, C. Y. Jiang, L. X. Liu, B. Zhang, Y. M. Liu, C. Yang, S. J. Liu: Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by B''acillus subtilis'' strains. ''Microb. Cell Fact.'' 2014, 13(1), str. 1–11.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izbolj%C5%A1anje_proizvodnje_%C5%A1ikimske_kisline_v_E._coli&diff=20373 2022-04-24T19:55:36Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-022-02111-3#citeas I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod.'' 2022, 15(13), str. 1–14.]<br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Šikimska kislina je intermediat šikimatne poti, v farmacevtski industriji pa se uporablja kot izhodna surovina za sintezo protivirusne učinkovine oseltamivir, ki se uporablja za zdravljenje gripe. Iz industrijskega vidika je zato pridobivanje večjih količin šikimske kisline izredno pomembno, kar pa je mogoče doseči z izolacijo spojine iz naravnih virov, s kemijsko sintezo ali z mikrobno fermentacijo [1]. Za slednje se uporabljajo sevi ''E. coli'', ki so gensko spremenjeni tako, da omogočajo usmeritev metabolnega fluksa v sintezo šikimske kisline. Pri tem so bili do sedaj v ospredju predvsem različni statični sistemi regulacije (izbijanje tarčnih genov, itd.) pri katerih metabolni fluks sicer usmerimo v želeno biosintezno pot, lahko pa takšne modifikacije obenem vodijo v ustavitev celične rasti zaradi blokade v sintezi esencialnih metabolitov ali nabiranja toksičnih intermediatov [2]. Šikimatna pot se namreč pri šikimski kislini ne ustavi, pač pa se nadaljuje naprej do korizmata, ki je prekurzor za nastanek različnih spojin, pomembnih za rast in delovanje celic, kot so aromatske aminokisline, folna kislina, itd. [3] Reševanje tega problema je sicer možno z dodajanjem aromatskih aminokislin k minimalnemu gojišču, v katerem gojimo celice, vendar so le-te drage. Vedno bolj zato v ospredje prihajajo dinamični sistemi regulacije, ki omogočajo kontrolo nad več konkurenčnimi metabolnimi potmi, s čimer po eni strani zagotavljajo pripravo zadostne količine želenega produkta, po drugi strani pa ohranjanje viabilnosti celic. <br /> <br /> Med dinamične sisteme regulacije sodijo različna sinteznobiološka vezja, med katerimi imajo posebno velik potencial vezja, ki temeljijo na optogenetiki – regulaciji celičnih procesov s pomočjo svetlobe. Le-ta namreč predstavlja reverzibilen vir, ki je v primerjavi s kemičnimi induktorji, ki se jih sicer uporablja za regulacijo, cenejši in celicam netoksičen, poleg tega pa lahko s spreminjanjem njegove jakosti dosežemo različno močne celične odzive [2].<br /> <br /> Optogenetika deluje na principu na-svetlobo-odzivnih proteinov, ki ob osvetljevanju s svetlobo karakteristične valovne dolžine spremenijo svoje lastnosti. Takšen je na primer protein VIVID iz nitaste glive Neurospora crasa, ki deluje kot fotoreceptor za modro svetlobo [4]. V svoji strukturi ima vezan kofaktor FAD, ki na svetlobi tvori cisteinil-flavinski adukt, kar vodi v večje konformacijske spremembe proteina in njegovo dimerizacijo [5, 6]. <br /> <br /> == Potek ==<br /> <br /> Ideja raziskovalne skupine je bila, da bi s pomočjo svetlobe nadzirali delovanje encimov šikimatne poti, s čimer bi povečali proizvodnjo šikimske kisline, obenem pa zagotovili zadostno količino esencialnih metabolitov v celicah, da ne bi prišlo do zaustavitve rasti. To so dosegli z bifunkcionalnim optogenetskim stikalom, ki je bil obenem dvoslojen - vseboval je tako transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote. Prve delujejo neposredno na DNA, tako da vplivajo na prepisovanje tarčnih genov, vendar pa pri njih prihaja do zakasnjenega in nepopolnega celičnega odziva, saj nimajo vpliva na že nastale proteine. Boljšo učinkovitost se zato doseže s hkratno uporabo post-trasnkripcijskih regulatornih enot, katerih tarča so RNA, oziroma že nastali proteini. Razgradnjo slednjih lahko npr. dosežemo preko uvedbe N- ali C-končnih razgradnih oznak (degronov), ki proteine usmerjajo v razgradnjo [2, 7].<br /> <br /> Sam bifunkcionalni sistem so razvili po manjših korakih, sprva z reporterskim protein GFP:<br /> <br /> '''1) Priprava transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru transkripcije reporterskega gena s pomočjo represorja TetR. Sestavljali sta jo tako transkripcijska represijska enota (TRU), ki je bila namenjena zaustavitvi transkripcije gena za GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter transkripcijske aktivacijske enote (TAU) z nasprotnim učinkom. Obe enoti sta kot kontrolno vezje vsebovali zapis za razcepljeni represor TetR, pri čemer sta bila tako N-končni kot C-končni del represorja fuzirana s proteinom VIVID, kar je omogočilo njuno nadzorovanje s pomočjo svetlobe. Izhodno vezje je v primeru TRU vsebovalo zapis za GFP pod promotorjem PTet, v primeru TAU pa zapis za LacI pod promotorjem PTet ter zapis za GFP pod promotorjem PTrc.<br /> <br /> Pri obeh enotah sta v temi nastala N- in C-končni del razcepljenega TetR, vsak v fuziji s proteinom VIVID. Ker se slednji v temi nahaja v monomernem stanju, ni prišlo do povezave razcepljenih delov TetR, zato je bil le-ta neaktiven. V primeru TRU je zato transkripcija GFP potekala nemoteno, v primeru TAU pa je nemoteno potekala transkripcija LacI. Ta je preko vezave na operatorsko mesto na promotoju PTrc onemogočal nastanek GFP.<br /> <br /> Ob osvetljevanju z modro svetlobo je prišlo do dimerizacije proteina VIVID, kar je vodilo v povezavo razcepljenih delov TetR in njegovo aktivacijo. V primeru TRU se je TetR vezal na operatorsko regijo promotorja PTet, zaradi česar se je zaustavilo prepisovanje GFP, v primeru TAU pa je aktivirani TetR blokiral transkripcijo LacI, zato je transkripcija GFP pričela potekati [2].<br /> <br /> '''2) Priprava post-transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Post-transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru količine že nastalih reporterskih proteinov s pomočjo N- in C-končnih razgradnih oznak ter proteaze TEVp. Sestavljena je bila iz post-transkripcijske represijske enote (PRU), ki je bila namenjena razgradnji proteina GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter aktivacijske enote (PAU) z nasprotnim učinkom. Samo kontrolno vezje je bilo pri enotah enako kot pri TRU in TAU, le da je namesto razcepljenega represorja TetR vsebovalo razcepljeno proteazo TEVp. Izhodno vezje pri PRU je bilo enako tistemu pri TRU, le da je bil zapis za GFP fuziran še z N-končnim degronom teF. Izhodno vezje pri PAU je vsebovalo zapis za GFP v fuziji s C-končnim degronom teLAA pod promotorjem PTet.<br /> <br /> V temi je bila razcepljena TEVp neaktivna. Pri PRU zato do razgradnje nastalega GFP ni prišlo, saj je bil N-končni degron neizpostavljen. Ob izpostavitvi modri svetlobi je dimerizacija proteina VIVID omogočila povezavo ter aktivacijo proteaze TEVp, ki je nato preko proteolitične cepitve izpostavila N-končni degron na GFP, zaradi česar je prišlo do njegove razgradnje. Pri PAU je bil efekt nasproten. V temi je C-končna oznaka teLAA na proteinu GFP le-tega vodila v razgradnjo, ob osvetljevanju z modro svetlobo pa je aktivirana proteaza TEVp oznako odstranila, zato se GFP ni razgradil [2]. <br /> <br /> '''3) Združitev enot v dvoslojno stikalo'''<br /> <br /> Združitev regulatornih enot v dvoslojno optogenetsko stikalo je omogočalo hkratno kontrolo nad transkripcijo regulatornega proteina GFP in regulacijo količine že nastalega proteina. Zgrajeno je bilo iz transkripcijskega in post-transkripcijskega represijskega sistema (TPRS) ter aktivacijskega sistema (TPAS). Oba sta vsebovala tako kontrolna vezja transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote, razlikovala pa sta se po izhodnih vezjih:<br /> <br /> * TPRS je vseboval enakega kot PRU. Ob osvetljevanju celic z modro svetlobo je aktivirani represor TetR zaustavil transkripcijo GFP, ki se je nahajal pod promotorjem PTet, aktivirana proteaza TEVp pa je s proteolitično cepitvijo izpostavila N-končni degron teF na GFP, zato se je nivo GFP znižal.<br /> * Izhodno vezje TPAS je bilo podobno izhodnemu vezju TAU, le da je bil zapis za LacI prisoten v N-končni fuziji z degronom teF, zapis za GFP pa v C-končni fuziji z degronom DAS. Ob osvetljevanju z modro svetlobo je tako aktiviran TetR zaustavil transkripcijo LacI, aktivirana TEVp pa je s cepitvijo izpostavila N-končni degron, zato se je količina LacI znižala, transkripcija GFP pa je lahko potekala. GFP je sicer nastajal v C-končni fuziji z degronom DAS, ki bi protein načeloma vodil v razgradnjo, vendar je proteaza TEVp oznako odcepila.<br /> <br /> '''4) Priprava bifunkcionalnega optogenetskega stikala za regulacijo proizvodnje šikimske kisline'''<br /> <br /> Vključitev na novo razvitih sistemov TPRS in TPAS v šikimatno pot je omogočila nadzor nad delovanjem encimov v le-tej s pomočjo modre svetlobe. Kontrolni vezji z razcepljenima TetR in TEVp sta pri tem ostali enaki, v izhodnih vezjih pa je prišlo do zamenjave GFP z encimi šikimatne poti:<br /> <br /> * V izhodnem vezju sistema TPRS je zapis za GFP nadomestil zapis za šikimat kinazo (AroK), ki šikimsko kislino pretvarja v šikimat 3-fosfat [8]. V temi, ko je AroK nastajala, je zato šikimatna pot potekala vse do aromatskih aminokislin, zaradi česar so celice neovirano rastle. Na svetlobi pa je transkripcija gena zaradi vezave TetR prenehala potekati, že nastali encimi AroK pa so se razgradili zaradi izpostavitve degronske oznake teF na N-koncu encima zaradi delovanja TEVp [2].<br /> * V izhodnem vezju sistema TPAS sta zapis za GFP zamenjala zapisa za 3-deoksi-D-arabinoheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sintazo (AroG) ter 3-dehidrokinat (DHQ) sintazo (AroB), ki sta pomembna pri sami sintezi šikimske kisline [2, 8]. V temi je bil nastanek encimov onemogočen zaradi delovanja represorja LacI, nekontrolirano nastali encimi pa so se razgradili zaradi C-končne degronske oznake DAS. Ob osvetljevanju je prišlo do razgradnje represorja LacI in zaustavitve njegovega nastanka, zato je transkripcija genov za AroG in AroB pričela potekati, nastala encima pa se nista razgradila, saj je aktivirana TEVp odstranila njuno degronsko oznako.<br /> <br /> Sistema TPRS in TPAS sta torej zagotovila bifunkcionalnost samega stikala, pri čemer je TPRS omogočal neovirano rast celic v temi, TPAS pa je ob osvetljevanju z modro svetlobo metabolni fluks preusmeril v proizvodnjo šikimske kisline, kar je povečalo njen izplen in zmanjšalo količino stranskih produktov. <br /> <br /> Vključitev bifunkcionalnega stikala v šasijo ''E. coli'' S5 je omogočila nastanek 4,2 g/L šikimske kisline v minimalnem gojišču NBS z dodatkom 20 g/L glukoze, kar je 1,6-krat več kot v celicah brez sinteznobiološkega vezja. Kot optimalni pogoji za gojenje celic so se izkazali temperatura 37 °C, koncentracija glukoze 40 g/L ter pričetek osvetljevanja po 24-urnem gojenju celic v temi. V takšnih pogojih so celice v 72 urah v 5 litrskem bioreaktorju proizvedle 35 g/L šikimske kisline, kar je največji titer šikimske kisline v minimalnem gojišču do zdaj [2]. <br /> <br /> == Viri in literatura ==<br /> <br /> [1] A. Ramazani, A. Shahkarami, Fatemeh Zarei, S. Rezayati, A. Rezaei, A. Bodaghi, L. Youseftabar-Miri: Shikimic acid from staranise (Illicium verum Hook): Extraction, purification and determination. ''Eurasian Chem. Commun''. 2021, 3(7), str. 452–460.<br /> <br /> [2] I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod''. 2022, 15(13), str. 1–14.<br /> <br /> [3] V. Tzin, G. Galili: New Insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants. ''Mol. Plant'' 2010, 3(6), str. 956–972.<br /> <br /> [4] J. M. Hurley, C. H. Chen, J. J. Loros, J. C. Dunlap: Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa. ''G3 Genes, Genomes, Genet.'' 2012, 2(10), str. 1207–1212.<br /> <br /> [5] A. T. Vaidya, C. H. Chen, J. C. Dunlap, J. J. Loros, B. R. Crane: Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. ''Sci. Signal.'' 2011, 4(184).<br /> <br /> [6] B. D. Zoltowski, B. R. Crane: Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. ''Biochemistry'' 2008, 47(27), str. 7012–7019.<br /> <br /> [7] A. Stikāne: Degrons, http://2014.igem.org/Team:Edinburgh/project/degrons (pridobljeno 23. 4. 2022).<br /> <br /> [8] D. F. Liu, G. M. Ai, Q. X. Zheng, C. Liu, C. Y. Jiang, L. X. Liu, B. Zhang, Y. M. Liu, C. Yang, S. J. Liu: Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by B''acillus subtilis'' strains. ''Microb. Cell Fact.'' 2014, 13(1), str. 1–11.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izbolj%C5%A1anje_proizvodnje_%C5%A1ikimske_kisline_v_E._coli&diff=20372 2022-04-24T19:52:19Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-022-02111-3#citeas I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod.'' 2022, 15(13), str. 1–14.]<br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Šikimska kislina je intermediat šikimatne poti, v farmacevtski industriji pa se uporablja kot izhodna surovina za sintezo protivirusne učinkovine oseltamivir, ki se uporablja za zdravljenje gripe. Iz industrijskega vidika je zato pridobivanje večjih količin šikimske kisline izredno pomembno, kar pa je mogoče doseči z izolacijo spojine iz naravnih virov, s kemijsko sintezo ali z mikrobno fermentacijo [1]. Za slednje se uporabljajo sevi ''E. coli'', ki so gensko spremenjeni tako, da omogočajo usmeritev metabolnega fluksa v sintezo šikimske kisline. Pri tem so bili do sedaj v ospredju predvsem različni statični sistemi regulacije (izbijanje tarčnih genov, itd.) pri katerih metabolni fluks sicer usmerimo v želeno biosintezno pot, lahko pa takšne modifikacije obenem vodijo v ustavitev celične rasti zaradi blokade v sintezi esencialnih metabolitov ali nabiranja toksičnih intermediatov [2]. Šikimatna pot se namreč pri šikimski kislini ne ustavi, pač pa se nadaljuje naprej do korizmata, ki je prekurzor za nastanek različnih spojin, pomembnih za rast in delovanje celic, kot so aromatske aminokisline, folna kislina, itd. [3] Reševanje tega problema je sicer možno z dodajanjem aromatskih aminokislin k minimalnemu gojišču, v katerem gojimo celice, vendar so le-te drage. Vedno bolj zato v ospredje prihajajo dinamični sistemi regulacije, ki omogočajo kontrolo nad več konkurenčnimi metabolnimi potmi, s čimer po eni strani zagotavljajo pripravo zadostne količine želenega produkta, po drugi strani pa ohranjanje viabilnosti celic. <br /> <br /> Med dinamične sisteme regulacije sodijo različna sinteznobiološka vezja, med katerimi imajo posebno velik potencial vezja, ki temeljijo na optogenetiki – regulaciji celičnih procesov s pomočjo svetlobe. Le-ta namreč predstavlja reverzibilen vir, ki je v primerjavi s kemičnimi induktorji, ki se jih sicer uporablja za regulacijo, cenejši in celicam netoksičen, poleg tega pa lahko s spreminjanjem njegove jakosti dosežemo različno močne celične odzive [2].<br /> <br /> Optogenetika deluje na principu na-svetlobo-odzivnih proteinov, ki ob osvetljevanju s svetlobo karakteristične valovne dolžine spremenijo svoje lastnosti. Takšen je na primer protein VIVID iz nitaste glive Neurospora crasa, ki deluje kot fotoreceptor za modro svetlobo [4]. V svoji strukturi ima vezan kofaktor FAD, ki na svetlobi tvori cisteinil-flavinski adukt, kar vodi v večje konformacijske spremembe proteina in njegovo dimerizacijo [5, 6]. <br /> <br /> == Potek ==<br /> <br /> Ideja raziskovalne skupine je bila, da bi s pomočjo svetlobe nadzirali delovanje encimov šikimatne poti, s čimer bi povečali proizvodnjo šikimske kisline, obenem pa zagotovili zadostno količino esencialnih metabolitov v celicah, da ne bi prišlo do zaustavitve rasti. To so dosegli z bifunkcionalnim optogenetskim stikalom, ki je bil obenem dvoslojen - vseboval je tako transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote. Prve delujejo neposredno na DNA, tako da vplivajo na prepisovanje tarčnih genov, vendar pa pri njih prihaja do zakasnjenega in nepopolnega celičnega odziva, saj nimajo vpliva na že nastale proteine. Boljšo učinkovitost se zato doseže s hkratno uporabo post-trasnkripcijskih regulatornih enot, katerih tarča so RNA, oziroma že nastali proteini. Razgradnjo slednjih lahko npr. dosežemo preko uvedbe N- ali C-končnih razgradnih oznak (degronov), ki proteine usmerjajo v razgradnjo [2, 7].<br /> <br /> Sam bifunkcionalni sistem so razvili po manjših korakih, sprva z reporterskim protein GFP:<br /> <br /> '''1) Priprava transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru transkripcije reporterskega gena s pomočjo represorja TetR. Sestavljali sta jo tako transkripcijska represijska enota (TRU), ki je bila namenjena zaustavitvi transkripcije gena za GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter transkripcijske aktivacijske enote (TAU) z nasprotnim učinkom. Obe enoti sta kot kontrolno vezje vsebovali zapis za razcepljeni represor TetR, pri čemer sta bila tako N-končni kot C-končni del represorja fuzirana s proteinom VIVID, kar je omogočilo njuno nadzorovanje s pomočjo svetlobe. Izhodno vezje je v primeru TRU vsebovalo zapis za GFP pod promotorjem PTet, v primeru TAU pa zapis za LacI pod promotorjem PTet ter zapis za GFP pod promotorjem PTrc.<br /> <br /> Pri obeh enotah sta v temi nastala N- in C-končni del razcepljenega TetR, vsak v fuziji s proteinom VIVID. Ker se slednji v temi nahaja v monomernem stanju, ni prišlo do povezave razcepljenih delov TetR, zato je bil le-ta neaktiven. V primeru TRU je zato transkripcija GFP potekala nemoteno, v primeru TAU pa je nemoteno potekala transkripcija LacI. Ta je preko vezave na operatorsko mesto na promotoju PTrc onemogočal nastanek GFP.<br /> <br /> Ob osvetljevanju z modro svetlobo je prišlo do dimerizacije proteina VIVID, kar je vodilo v povezavo razcepljenih delov TetR in njegovo aktivacijo. V primeru TRU se je TetR vezal na operatorsko regijo promotorja PTet, zaradi česar se je zaustavilo prepisovanje GFP, v primeru TAU pa je aktivirani TetR blokiral transkripcijo LacI, zato je transkripcija GFP pričela potekati [2].<br /> <br /> '''2) Priprava post-transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Post-transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru količine že nastalih reporterskih proteinov s pomočjo N- in C-končnih razgradnih oznak ter proteaze TEVp. Sestavljena je bila iz post-transkripcijske represijske enote (PRU), ki je bila namenjena razgradnji proteina GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter aktivacijske enote (PAU) z nasprotnim učinkom. Samo kontrolno vezje je bilo pri enotah enako kot pri TRU in TAU, le da je namesto razcepljenega represorja TetR vsebovalo razcepljeno proteazo TEVp. Izhodno vezje pri PRU je bilo enako tistemu pri TRU, le da je bil zapis za GFP fuziran še z N-končnim degronom teF. Izhodno vezje pri PAU je vsebovalo zapis za GFP v fuziji s C-končnim degronom teLAA pod promotorjem PTet.<br /> <br /> V temi je bila razcepljena TEVp neaktivna. Pri PRU zato do razgradnje nastalega GFP ni prišlo, saj je bil N-končni degron neizpostavljen. Ob izpostavitvi modri svetlobi je dimerizacija proteina VIVID omogočila povezavo ter aktivacijo proteaze TEVp, ki je nato preko proteolitične cepitve izpostavila N-končni degron na GFP, zaradi česar je prišlo do njegove razgradnje. Pri PAU je bil efekt nasproten. V temi je C-končna oznaka teLAA na proteinu GFP le-tega vodila v razgradnjo, ob osvetljevanju z modro svetlobo pa je aktivirana proteaza TEVp oznako odstranila, zato se GFP ni razgradil [2]. <br /> <br /> '''3) Združitev enot v dvoslojno stikalo'''<br /> <br /> Združitev regulatornih enot v dvoslojno optogenetsko stikalo je omogočalo hkratno kontrolo nad transkripcijo regulatornega proteina GFP in regulacijo količine že nastalega proteina. Zgrajeno je bilo iz transkripcijskega in post-transkripcijskega represijskega sistema (TPRS) ter aktivacijskega sistema (TPAS). Oba sta vsebovala tako kontrolna vezja transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote, razlikovala pa sta se po izhodnih vezjih:<br /> <br /> * TPRS je vseboval enakega kot PRU. Ob osvetljevanju celic z modro svetlobo je aktivirani represor TetR zaustavil transkripcijo GFP, ki se je nahajal pod promotorjem PTet, aktivirana proteaza TEVp pa je s proteolitično cepitvijo izpostavila N-končni degron teF na GFP, zato se je nivo GFP znižal.<br /> * Izhodno vezje TPAS je bilo podobno izhodnemu vezju TAU, le da je bil zapis za LacI prisoten v N-končni fuziji z degronom teF, zapis za GFP pa v C-končni fuziji z degronom DAS. Ob osvetljevanju z modro svetlobo je tako aktiviran TetR zaustavil transkripcijo LacI, aktivirana TEVp pa je s cepitvijo izpostavila N-končni degron, zato se je količina LacI znižala, transkripcija GFP pa je lahko potekala. GFP je sicer nastajal v C-končni fuziji z degronom DAS, ki bi protein načeloma vodil v razgradnjo, vendar je proteaza TEVp oznako odcepila.<br /> <br /> == Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za regulacijo proizvodnje šikimske kisline ==<br /> <br /> Vključitev na novo razvitih sistemov TPRS in TPAS v šikimatno pot je omogočila nadzor nad delovanjem encimov v le-tej s pomočjo modre svetlobe. Kontrolni vezji z razcepljenima TetR in TEVp sta pri tem ostali enaki, v izhodnih vezjih pa je prišlo do zamenjave GFP z encimi šikimatne poti:<br /> <br /> * V izhodnem vezju sistema TPRS je zapis za GFP nadomestil zapis za šikimat kinazo (AroK), ki šikimsko kislino pretvarja v šikimat 3-fosfat [8]. V temi, ko je AroK nastajala, je zato šikimatna pot potekala vse do aromatskih aminokislin, zaradi česar so celice neovirano rastle. Na svetlobi pa je transkripcija gena zaradi vezave TetR prenehala potekati, že nastali encimi AroK pa so se razgradili zaradi izpostavitve degronske oznake teF na N-koncu encima zaradi delovanja TEVp [2].<br /> * V izhodnem vezju sistema TPAS sta zapis za GFP zamenjala zapisa za 3-deoksi-D-arabinoheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sintazo (AroG) ter 3-dehidrokinat (DHQ) sintazo (AroB), ki sta pomembna pri sami sintezi šikimske kisline [2, 8]. V temi je bil nastanek encimov onemogočen zaradi delovanja represorja LacI, nekontrolirano nastali encimi pa so se razgradili zaradi C-končne degronske oznake DAS. Ob osvetljevanju je prišlo do razgradnje represorja LacI in zaustavitve njegovega nastanka, zato je transkripcija genov za AroG in AroB pričela potekati, nastala encima pa se nista razgradila, saj je aktivirana TEVp odstranila njuno degronsko oznako.<br /> <br /> Sistema TPRS in TPAS sta torej zagotovila bifunkcionalnost samega stikala, pri čemer je TPRS omogočal neovirano rast celic v temi, TPAS pa je ob osvetljevanju z modro svetlobo metabolni fluks preusmeril v proizvodnjo šikimske kisline, kar je povečalo njen izplen in zmanjšalo količino stranskih produktov. <br /> <br /> Vključitev bifunkcionalnega stikala v šasijo ''E. coli'' S5 je omogočila nastanek 4,2 g/L šikimske kisline v minimalnem gojišču NBS z dodatkom 20 g/L glukoze, kar je 1,6-krat več kot v celicah brez sinteznobiološkega vezja. Kot optimalni pogoji za gojenje celic so se izkazali temperatura 37 °C, koncentracija glukoze 40 g/L ter pričetek osvetljevanja po 24-urnem gojenju celic v temi. V takšnih pogojih so celice v 72 urah v 5 litrskem bioreaktorju proizvedle 35 g/L šikimske kisline, kar je največji titer šikimske kisline v minimalnem gojišču do zdaj [2]. <br /> <br /> == Viri in literatura ==<br /> <br /> [1] A. Ramazani, A. Shahkarami, Fatemeh Zarei, S. Rezayati, A. Rezaei, A. Bodaghi, L. Youseftabar-Miri: Shikimic acid from staranise (Illicium verum Hook): Extraction, purification and determination. ''Eurasian Chem. Commun''. 2021, 3(7), str. 452–460.<br /> <br /> [2] I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod''. 2022, 15(13), str. 1–14.<br /> <br /> [3] V. Tzin, G. Galili: New Insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants. ''Mol. Plant'' 2010, 3(6), str. 956–972.<br /> <br /> [4] J. M. Hurley, C. H. Chen, J. J. Loros, J. C. Dunlap: Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa. ''G3 Genes, Genomes, Genet.'' 2012, 2(10), str. 1207–1212.<br /> <br /> [5] A. T. Vaidya, C. H. Chen, J. C. Dunlap, J. J. Loros, B. R. Crane: Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. ''Sci. Signal.'' 2011, 4(184).<br /> <br /> [6] B. D. Zoltowski, B. R. Crane: Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. ''Biochemistry'' 2008, 47(27), str. 7012–7019.<br /> <br /> [7] A. Stikāne: Degrons, http://2014.igem.org/Team:Edinburgh/project/degrons (pridobljeno 23. 4. 2022).<br /> <br /> [8] D. F. Liu, G. M. Ai, Q. X. Zheng, C. Liu, C. Y. Jiang, L. X. Liu, B. Zhang, Y. M. Liu, C. Yang, S. J. Liu: Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by B''acillus subtilis'' strains. ''Microb. Cell Fact.'' 2014, 13(1), str. 1–11.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izbolj%C5%A1anje_proizvodnje_%C5%A1ikimske_kisline_v_E._coli&diff=20371 2022-04-24T19:52:02Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-022-02111-3#citeas I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod.'' 2022, 15(13), str. 1–14.]<br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Šikimska kislina je intermediat šikimatne poti, v farmacevtski industriji pa se uporablja kot izhodna surovina za sintezo protivirusne učinkovine oseltamivir, ki se uporablja za zdravljenje gripe. Iz industrijskega vidika je zato pridobivanje večjih količin šikimske kisline izredno pomembno, kar pa je mogoče doseči z izolacijo spojine iz naravnih virov, s kemijsko sintezo ali z mikrobno fermentacijo [1]. Za slednje se uporabljajo sevi ''E. coli'', ki so gensko spremenjeni tako, da omogočajo usmeritev metabolnega fluksa v sintezo šikimske kisline. Pri tem so bili do sedaj v ospredju predvsem različni statični sistemi regulacije (izbijanje tarčnih genov, itd.) pri katerih metabolni fluks sicer usmerimo v želeno biosintezno pot, lahko pa takšne modifikacije obenem vodijo v ustavitev celične rasti zaradi blokade v sintezi esencialnih metabolitov ali nabiranja toksičnih intermediatov [2]. Šikimatna pot se namreč pri šikimski kislini ne ustavi, pač pa se nadaljuje naprej do korizmata, ki je prekurzor za nastanek različnih spojin, pomembnih za rast in delovanje celic, kot so aromatske aminokisline, folna kislina, itd. [3] Reševanje tega problema je sicer možno z dodajanjem aromatskih aminokislin k minimalnemu gojišču, v katerem gojimo celice, vendar so le-te drage. Vedno bolj zato v ospredje prihajajo dinamični sistemi regulacije, ki omogočajo kontrolo nad več konkurenčnimi metabolnimi potmi, s čimer po eni strani zagotavljajo pripravo zadostne količine želenega produkta, po drugi strani pa ohranjanje viabilnosti celic. <br /> <br /> Med dinamične sisteme regulacije sodijo različna sinteznobiološka vezja, med katerimi imajo posebno velik potencial vezja, ki temeljijo na optogenetiki – regulaciji celičnih procesov s pomočjo svetlobe. Le-ta namreč predstavlja reverzibilen vir, ki je v primerjavi s kemičnimi induktorji, ki se jih sicer uporablja za regulacijo, cenejši in celicam netoksičen, poleg tega pa lahko s spreminjanjem njegove jakosti dosežemo različno močne celične odzive [2].<br /> <br /> Optogenetika deluje na principu na-svetlobo-odzivnih proteinov, ki ob osvetljevanju s svetlobo karakteristične valovne dolžine spremenijo svoje lastnosti. Takšen je na primer protein VIVID iz nitaste glive Neurospora crasa, ki deluje kot fotoreceptor za modro svetlobo [4]. V svoji strukturi ima vezan kofaktor FAD, ki na svetlobi tvori cisteinil-flavinski adukt, kar vodi v večje konformacijske spremembe proteina in njegovo dimerizacijo [5, 6]. <br /> <br /> == Potek ==<br /> <br /> Ideja raziskovalne skupine je bila, da bi s pomočjo svetlobe nadzirali delovanje encimov šikimatne poti, s čimer bi povečali proizvodnjo šikimske kisline, obenem pa zagotovili zadostno količino esencialnih metabolitov v celicah, da ne bi prišlo do zaustavitve rasti. To so dosegli z bifunkcionalnim optogenetskim stikalom, ki je bil obenem dvoslojen - vseboval je tako transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote. Prve delujejo neposredno na DNA, tako da vplivajo na prepisovanje tarčnih genov, vendar pa pri njih prihaja do zakasnjenega in nepopolnega celičnega odziva, saj nimajo vpliva na že nastale proteine. Boljšo učinkovitost se zato doseže s hkratno uporabo post-trasnkripcijskih regulatornih enot, katerih tarča so RNA, oziroma že nastali proteini. Razgradnjo slednjih lahko npr. dosežemo preko uvedbe N- ali C-končnih razgradnih oznak (degronov), ki proteine usmerjajo v razgradnjo [2, 7].<br /> <br /> Sam bifunkcionalni sistem so razvili po manjših korakih, sprva z reporterskim protein GFP:<br /> <br /> '''1) Priprava transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru transkripcije reporterskega gena s pomočjo represorja TetR. Sestavljali sta jo tako transkripcijska represijska enota (TRU), ki je bila namenjena zaustavitvi transkripcije gena za GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter transkripcijske aktivacijske enote (TAU) z nasprotnim učinkom. Obe enoti sta kot kontrolno vezje vsebovali zapis za razcepljeni represor TetR, pri čemer sta bila tako N-končni kot C-končni del represorja fuzirana s proteinom VIVID, kar je omogočilo njuno nadzorovanje s pomočjo svetlobe. Izhodno vezje je v primeru TRU vsebovalo zapis za GFP pod promotorjem PTet, v primeru TAU pa zapis za LacI pod promotorjem PTet ter zapis za GFP pod promotorjem PTrc.<br /> <br /> Pri obeh enotah sta v temi nastala N- in C-končni del razcepljenega TetR, vsak v fuziji s proteinom VIVID. Ker se slednji v temi nahaja v monomernem stanju, ni prišlo do povezave razcepljenih delov TetR, zato je bil le-ta neaktiven. V primeru TRU je zato transkripcija GFP potekala nemoteno, v primeru TAU pa je nemoteno potekala transkripcija LacI. Ta je preko vezave na operatorsko mesto na promotoju PTrc onemogočal nastanek GFP.<br /> <br /> Ob osvetljevanju z modro svetlobo je prišlo do dimerizacije proteina VIVID, kar je vodilo v povezavo razcepljenih delov TetR in njegovo aktivacijo. V primeru TRU se je TetR vezal na operatorsko regijo promotorja PTet, zaradi česar se je zaustavilo prepisovanje GFP, v primeru TAU pa je aktivirani TetR blokiral transkripcijo LacI, zato je transkripcija GFP pričela potekati [2].<br /> <br /> '''2) Priprava post-transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Post-transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru količine že nastalih reporterskih proteinov s pomočjo N- in C-končnih razgradnih oznak ter proteaze TEVp. Sestavljena je bila iz post-transkripcijske represijske enote (PRU), ki je bila namenjena razgradnji proteina GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter aktivacijske enote (PAU) z nasprotnim učinkom. Samo kontrolno vezje je bilo pri enotah enako kot pri TRU in TAU, le da je namesto razcepljenega represorja TetR vsebovalo razcepljeno proteazo TEVp. Izhodno vezje pri PRU je bilo enako tistemu pri TRU, le da je bil zapis za GFP fuziran še z N-končnim degronom teF. Izhodno vezje pri PAU je vsebovalo zapis za GFP v fuziji s C-končnim degronom teLAA pod promotorjem PTet.<br /> <br /> V temi je bila razcepljena TEVp neaktivna. Pri PRU zato do razgradnje nastalega GFP ni prišlo, saj je bil N-končni degron neizpostavljen. Ob izpostavitvi modri svetlobi je dimerizacija proteina VIVID omogočila povezavo ter aktivacijo proteaze TEVp, ki je nato preko proteolitične cepitve izpostavila N-končni degron na GFP, zaradi česar je prišlo do njegove razgradnje. Pri PAU je bil efekt nasproten. V temi je C-končna oznaka teLAA na proteinu GFP le-tega vodila v razgradnjo, ob osvetljevanju z modro svetlobo pa je aktivirana proteaza TEVp oznako odstranila, zato se GFP ni razgradil [2]. <br /> <br /> '''3) Združitev enot v dvoslojno stikalo'''<br /> <br /> Združitev regulatornih enot v dvoslojno optogenetsko stikalo je omogočalo hkratno kontrolo nad transkripcijo regulatornega proteina GFP in regulacijo količine že nastalega proteina. Zgrajeno je bilo iz transkripcijskega in post-transkripcijskega represijskega sistema (TPRS) ter aktivacijskega sistema (TPAS). Oba sta vsebovala tako kontrolna vezja transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote, razlikovala pa sta se po izhodnih vezjih:<br /> <br /> * TPRS je vseboval enakega kot PRU. Ob osvetljevanju celic z modro svetlobo je aktivirani represor TetR zaustavil transkripcijo GFP, ki se je nahajal pod promotorjem PTet, aktivirana proteaza TEVp pa je s proteolitično cepitvijo izpostavila N-končni degron teF na GFP, zato se je nivo GFP znižal.<br /> * Izhodno vezje TPAS je bilo podobno izhodnemu vezju TAU, le da je bil zapis za LacI prisoten v N-končni fuziji z degronom teF, zapis za GFP pa v C-končni fuziji z degronom DAS. Ob osvetljevanju z modro svetlobo je tako aktiviran TetR zaustavil transkripcijo LacI, aktivirana TEVp pa je s cepitvijo izpostavila N-končni degron, zato se je količina LacI znižala, transkripcija GFP pa je lahko potekala. GFP je sicer nastajal v C-končni fuziji z degronom DAS, ki bi protein načeloma vodil v razgradnjo, vendar je proteaza TEVp oznako odcepila.<br /> <br /> == Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za regulacijo proizvodnje šikimske kisline ==<br /> <br /> Vključitev na novo razvitih sistemov TPRS in TPAS v šikimatno pot je omogočila nadzor nad delovanjem encimov v le-tej s pomočjo modre svetlobe. Kontrolni vezji z razcepljenima TetR in TEVp sta pri tem ostali enaki, v izhodnih vezjih pa je prišlo do zamenjave GFP z encimi šikimatne poti:<br /> <br /> * V izhodnem vezju sistema TPRS je zapis za GFP nadomestil zapis za šikimat kinazo (AroK), ki šikimsko kislino pretvarja v šikimat 3-fosfat [8]. V temi, ko je AroK nastajala, je zato šikimatna pot potekala vse do aromatskih aminokislin, zaradi česar so celice neovirano rastle. Na svetlobi pa je transkripcija gena zaradi vezave TetR prenehala potekati, že nastali encimi AroK pa so se razgradili zaradi izpostavitve degronske oznake teF na N-koncu encima zaradi delovanja TEVp [2].<br /> * V izhodnem vezju sistema TPAS sta zapis za GFP zamenjala zapisa za 3-deoksi-D-arabinoheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sintazo (AroG) ter 3-dehidrokinat (DHQ) sintazo (AroB), ki sta pomembna pri sami sintezi šikimske kisline [2, 8]. V temi je bil nastanek encimov onemogočen zaradi delovanja represorja LacI, nekontrolirano nastali encimi pa so se razgradili zaradi C-končne degronske oznake DAS. Ob osvetljevanju je prišlo do razgradnje represorja LacI in zaustavitve njegovega nastanka, zato je transkripcija genov za AroG in AroB pričela potekati, nastala encima pa se nista razgradila, saj je aktivirana TEVp odstranila njuno degronsko oznako.<br /> <br /> Sistema TPRS in TPAS sta torej zagotovila bifunkcionalnost samega stikala, pri čemer je TPRS omogočal neovirano rast celic v temi, TPAS pa je ob osvetljevanju z modro svetlobo metabolni fluks preusmeril v proizvodnjo šikimske kisline, kar je povečalo njen izplen in zmanjšalo količino stranskih produktov. <br /> <br /> Vključitev bifunkcionalnega stikala v šasijo ''E. coli'' S5 je omogočila nastanek 4,2 g/L šikimske kisline v minimalnem gojišču NBS z dodatkom 20 g/L glukoze, kar je 1,6-krat več kot v celicah brez sinteznobiološkega vezja. Kot optimalni pogoji za gojenje celic so se izkazali temperatura 37 °C, koncentracija glukoze 40 g/L ter pričetek osvetljevanja po 24-urnem gojenju celic v temi. V takšnih pogojih so celice v 72 urah v 5 litrskem bioreaktorju proizvedle 35 g/L šikimske kisline, kar je največji titer šikimske kisline v minimalnem gojišču do zdaj [2]. <br /> <br /> == Viri in literatura ==<br /> <br /> [1] A. Ramazani, A. Shahkarami, Fatemeh Zarei, S. Rezayati, A. Rezaei, A. Bodaghi, L. Youseftabar-Miri: Shikimic acid from staranise (Illicium verum Hook): Extraction, purification and determination. ''Eurasian Chem. Commun''. 2021, 3(7), str. 452–460.<br /> <br /> [2] I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod''. 2022, 15(13), str. 1–14.<br /> <br /> [3] V. Tzin, G. Galili: New Insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants. ''Mol. Plant'' 2010, 3(6), str. 956–972.<br /> <br /> [4] J. M. Hurley, C. H. Chen, J. J. Loros, J. C. Dunlap: Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa. ''G3 Genes, Genomes, Genet.'' 2012, 2(10), str. 1207–1212.<br /> <br /> [5] A. T. Vaidya, C. H. Chen, J. C. Dunlap, J. J. Loros, B. R. Crane: Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. ''Sci. Signal.'' 2011, 4(184).<br /> <br /> [6] B. D. Zoltowski, B. R. Crane: Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. ''Biochemistry'' 2008, 47(27), str. 7012–7019.<br /> <br /> [7] A. Stikāne: Degrons, http://2014.igem.org/Team:Edinburgh/project/degrons (pridobljeno 23. 4. 2022).<br /> <br /> [8] D. F. Liu, G. M. Ai, Q. X. Zheng, C. Liu, C. Y. Jiang, L. X. Liu, B. Zhang, Y. M. Liu, C. Yang, S. J. Liu: Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by Bacillus subtilis strains. ''Microb. Cell Fact.'' 2014, 13(1), str. 1–11.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izbolj%C5%A1anje_proizvodnje_%C5%A1ikimske_kisline_v_E._coli&diff=20370 2022-04-24T19:50:33Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-022-02111-3#citeas I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod.'' 2022, 15(13), str. 1–14.]<br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Šikimska kislina je intermediat šikimatne poti, v farmacevtski industriji pa se uporablja kot izhodna surovina za sintezo protivirusne učinkovine oseltamivir, ki se uporablja za zdravljenje gripe. Iz industrijskega vidika je zato pridobivanje večjih količin šikimske kisline izredno pomembno, kar pa je mogoče doseči z izolacijo spojine iz naravnih virov, s kemijsko sintezo ali z mikrobno fermentacijo [1]. Za slednje se uporabljajo sevi ''E. coli'', ki so gensko spremenjeni tako, da omogočajo usmeritev metabolnega fluksa v sintezo šikimske kisline. Pri tem so bili do sedaj v ospredju predvsem različni statični sistemi regulacije (izbijanje tarčnih genov, itd.) pri katerih metabolni fluks sicer usmerimo v želeno biosintezno pot, lahko pa takšne modifikacije obenem vodijo v ustavitev celične rasti zaradi blokade v sintezi esencialnih metabolitov ali nabiranja toksičnih intermediatov [2]. Šikimatna pot se namreč pri šikimski kislini ne ustavi, pač pa se nadaljuje naprej do korizmata, ki je prekurzor za nastanek različnih spojin, pomembnih za rast in delovanje celic, kot so aromatske aminokisline, folna kislina, itd. [3] Reševanje tega problema je sicer možno z dodajanjem aromatskih aminokislin k minimalnemu gojišču, v katerem gojimo celice, vendar so le-te drage. Vedno bolj zato v ospredje prihajajo dinamični sistemi regulacije, ki omogočajo kontrolo nad več konkurenčnimi metabolnimi potmi, s čimer po eni strani zagotavljajo pripravo zadostne količine želenega produkta, po drugi strani pa ohranjanje viabilnosti celic. <br /> <br /> Med dinamične sisteme regulacije sodijo različna sinteznobiološka vezja, med katerimi imajo posebno velik potencial vezja, ki temeljijo na optogenetiki – regulaciji celičnih procesov s pomočjo svetlobe. Le-ta namreč predstavlja reverzibilen vir, ki je v primerjavi s kemičnimi induktorji, ki se jih sicer uporablja za regulacijo, cenejši in celicam netoksičen, poleg tega pa lahko s spreminjanjem njegove jakosti dosežemo različno močne celične odzive [2].<br /> <br /> Optogenetika deluje na principu na-svetlobo-odzivnih proteinov, ki ob osvetljevanju s svetlobo karakteristične valovne dolžine spremenijo svoje lastnosti. Takšen je na primer protein VIVID iz nitaste glive Neurospora crasa, ki deluje kot fotoreceptor za modro svetlobo [4]. V svoji strukturi ima vezan kofaktor FAD, ki na svetlobi tvori cisteinil-flavinski adukt, kar vodi v večje konformacijske spremembe proteina in njegovo dimerizacijo [5, 6]. <br /> <br /> == Potek ==<br /> <br /> Ideja raziskovalne skupine je bila, da bi s pomočjo svetlobe nadzirali delovanje encimov šikimatne poti, s čimer bi povečali proizvodnjo šikimske kisline, obenem pa zagotovili zadostno količino esencialnih metabolitov v celicah, da ne bi prišlo do zaustavitve rasti. To so dosegli z bifunkcionalnim optogenetskim stikalom, ki je bil obenem dvoslojen - vseboval je tako transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote. Prve delujejo neposredno na DNA, tako da vplivajo na prepisovanje tarčnih genov, vendar pa pri njih prihaja do zakasnjenega in nepopolnega celičnega odziva, saj nimajo vpliva na že nastale proteine. Boljšo učinkovitost se zato doseže s hkratno uporabo post-trasnkripcijskih regulatornih enot, katerih tarča so RNA, oziroma že nastali proteini. Razgradnjo slednjih lahko npr. dosežemo preko uvedbe N- ali C-končnih razgradnih oznak (degronov), ki proteine usmerjajo v razgradnjo [2, 7].<br /> <br /> Sam bifunkcionalni sistem so razvili po manjših korakih, sprva z reporterskim protein GFP:<br /> <br /> '''1) Priprava transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru transkripcije reporterskega gena s pomočjo represorja TetR. Sestavljali sta jo tako transkripcijska represijska enota (TRU), ki je bila namenjena zaustavitvi transkripcije gena za GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter transkripcijske aktivacijske enote (TAU) z nasprotnim učinkom. Obe enoti sta kot kontrolno vezje vsebovali zapis za razcepljeni represor TetR, pri čemer sta bila tako N-končni kot C-končni del represorja fuzirana s proteinom VIVID, kar je omogočilo njuno nadzorovanje s pomočjo svetlobe. Izhodno vezje je v primeru TRU vsebovalo zapis za GFP pod promotorjem PTet, v primeru TAU pa zapis za LacI pod promotorjem PTet ter zapis za GFP pod promotorjem PTrc.<br /> <br /> Pri obeh enotah sta v temi nastala N- in C-končni del razcepljenega TetR, vsak v fuziji s proteinom VIVID. Ker se slednji v temi nahaja v monomernem stanju, ni prišlo do povezave razcepljenih delov TetR, zato je bil le-ta neaktiven. V primeru TRU je zato transkripcija GFP potekala nemoteno, v primeru TAU pa je nemoteno potekala transkripcija LacI. Ta je preko vezave na operatorsko mesto na promotoju PTrc onemogočal nastanek GFP.<br /> <br /> Ob osvetljevanju z modro svetlobo je prišlo do dimerizacije proteina VIVID, kar je vodilo v povezavo razcepljenih delov TetR in njegovo aktivacijo. V primeru TRU se je TetR vezal na operatorsko regijo promotorja PTet, zaradi česar se je zaustavilo prepisovanje GFP, v primeru TAU pa je aktivirani TetR blokiral transkripcijo LacI, zato je transkripcija GFP pričela potekati [2].<br /> <br /> '''2) Priprava post-transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Post-transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru količine že nastalih reporterskih proteinov s pomočjo N- in C-končnih razgradnih oznak ter proteaze TEVp. Sestavljena je bila iz post-transkripcijske represijske enote (PRU), ki je bila namenjena razgradnji proteina GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter aktivacijske enote (PAU) z nasprotnim učinkom. Samo kontrolno vezje je bilo pri enotah enako kot pri TRU in TAU, le da je namesto razcepljenega represorja TetR vsebovalo razcepljeno proteazo TEVp. Izhodno vezje pri PRU je bilo enako tistemu pri TRU, le da je bil zapis za GFP fuziran še z N-končnim degronom teF. Izhodno vezje pri PAU je vsebovalo zapis za GFP v fuziji s C-končnim degronom teLAA pod promotorjem PTet.<br /> <br /> V temi je bila razcepljena TEVp neaktivna. Pri PRU zato do razgradnje nastalega GFP ni prišlo, saj je bil N-končni degron neizpostavljen. Ob izpostavitvi modri svetlobi je dimerizacija proteina VIVID omogočila povezavo ter aktivacijo proteaze TEVp, ki je nato preko proteolitične cepitve izpostavila N-končni degron na GFP, zaradi česar je prišlo do njegove razgradnje. Pri PAU je bil efekt nasproten. V temi je C-končna oznaka teLAA na proteinu GFP le-tega vodila v razgradnjo, ob osvetljevanju z modro svetlobo pa je aktivirana proteaza TEVp oznako odstranila, zato se GFP ni razgradil [2]. <br /> <br /> '''3) Združitev enot v dvoslojno stikalo'''<br /> <br /> Združitev regulatornih enot v dvoslojno optogenetsko stikalo je omogočalo hkratno kontrolo nad transkripcijo regulatornega proteina GFP in regulacijo količine že nastalega proteina. Zgrajeno je bilo iz transkripcijskega in post-transkripcijskega represijskega sistema (TPRS) ter aktivacijskega sistema (TPAS). Oba sta vsebovala tako kontrolna vezja transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote, razlikovala pa sta se po izhodnih vezjih:<br /> <br /> * TPRS je vseboval enakega kot PRU. Ob osvetljevanju celic z modro svetlobo je aktivirani represor TetR zaustavil transkripcijo GFP, ki se je nahajal pod promotorjem PTet, aktivirana proteaza TEVp pa je s proteolitično cepitvijo izpostavila N-končni degron teF na GFP, zato se je nivo GFP znižal.<br /> * Izhodno vezje TPAS je bilo podobno izhodnemu vezju TAU, le da je bil zapis za LacI prisoten v N-končni fuziji z degronom teF, zapis za GFP pa v C-končni fuziji z degronom DAS. Ob osvetljevanju z modro svetlobo je tako aktiviran TetR zaustavil transkripcijo LacI, aktivirana TEVp pa je s cepitvijo izpostavila N-končni degron, zato se je količina LacI znižala, transkripcija GFP pa je lahko potekala. GFP je sicer nastajal v C-končni fuziji z degronom DAS, ki bi protein načeloma vodil v razgradnjo, vendar je proteaza TEVp oznako odcepila.<br /> <br /> == Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za regulacijo proizvodnje šikimske kisline ==<br /> <br /> Vključitev na novo razvitih sistemov TPRS in TPAS v šikimatno pot je omogočila nadzor nad delovanjem encimov v le-tej s pomočjo modre svetlobe. Kontrolni vezji z razcepljenima TetR in TEVp sta pri tem ostali enaki, v izhodnih vezjih pa je prišlo do zamenjave GFP z encimi šikimatne poti:<br /> <br /> * V izhodnem vezju sistema TPRS je zapis za GFP nadomestil zapis za šikimat kinazo (AroK), ki šikimsko kislino pretvarja v šikimat 3-fosfat [8]. V temi, ko je AroK nastajala, je zato šikimatna pot potekala vse do aromatskih aminokislin, zaradi česar so celice neovirano rastle. Na svetlobi pa je transkripcija gena zaradi vezave TetR prenehala potekati, že nastali encimi AroK pa so se razgradili zaradi izpostavitve degronske oznake teF na N-koncu encima zaradi delovanja TEVp [2].<br /> * V izhodnem vezju sistema TPAS sta zapis za GFP zamenjala zapisa za 3-deoksi-D-arabinoheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sintazo (AroG) ter 3-dehidrokinat (DHQ) sintazo (AroB), ki sta pomembna pri sami sintezi šikimske kisline [2, 8]. V temi je bil nastanek encimov onemogočen zaradi delovanja represorja LacI, nekontrolirano nastali encimi pa so se razgradili zaradi C-končne degronske oznake DAS. Ob osvetljevanju je prišlo do razgradnje represorja LacI in zaustavitve njegovega nastanka, zato je transkripcija genov za AroG in AroB pričela potekati, nastala encima pa se nista razgradila, saj je aktivirana TEVp odstranila njuno degronsko oznako.<br /> <br /> Sistema TPRS in TPAS sta torej zagotovila bifunkcionalnost samega stikala, pri čemer je TPRS omogočal neovirano rast celic v temi, TPAS pa je ob osvetljevanju z modro svetlobo metabolni fluks preusmeril v proizvodnjo šikimske kisline, kar je povečalo njen izplen in zmanjšalo količino stranskih produktov. <br /> <br /> Vključitev bifunkcionalnega stikala v šasijo ''E. coli'' S5 je omogočila nastanek 4,2 g/L šikimske kisline v minimalnem gojišču NBS z dodatkom 20 g/L glukoze, kar je 1,6-krat več kot v celicah brez sinteznobiološkega vezja. Kot optimalni pogoji za gojenje celic so se izkazali temperatura 37 °C, koncentracija glukoze 40 g/L ter pričetek osvetljevanja po 24-urnem gojenju celic v temi. V takšnih pogojih so celice v 72 urah v 5 litrskem bioreaktorju proizvedle 35 g/L šikimske kisline, kar je največji titer šikimske kisline v minimalnem gojišču do zdaj [2]. <br /> <br /> == Viri in literatura ==<br /> <br /> [1] A. Ramazani, A. Shahkarami, Fatemeh Zarei, S. Rezayati, A. Rezaei, A. Bodaghi, L. Youseftabar-Miri: Shikimic acid from staranise (Illicium verum Hook): Extraction, purification and determination. Eurasian Chem. Commun. 2021, 3(7), str. 452–460.<br /> <br /> [2] I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in E. coli. Biotechnol. Biofuels Bioprod. 2022, 15(13), str. 1–14.<br /> <br /> [3] V. Tzin, G. Galili: New Insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants. Mol. Plant 2010, 3(6), str. 956–972.<br /> <br /> [4] J. M. Hurley, C. H. Chen, J. J. Loros, J. C. Dunlap: Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa. G3 Genes, Genomes, Genet. 2012, 2(10), str. 1207–1212.<br /> <br /> [5] A. T. Vaidya, C. H. Chen, J. C. Dunlap, J. J. Loros, B. R. Crane: Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. Sci. Signal. 2011, 4(184).<br /> <br /> [6] B. D. Zoltowski, B. R. Crane: Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. Biochemistry 2008, 47(27), str. 7012–7019.<br /> <br /> [7] A. Stikāne: Degrons, http://2014.igem.org/Team:Edinburgh/project/degrons (pridobljeno 23. 4. 2022).<br /> <br /> [8] D. F. Liu, G. M. Ai, Q. X. Zheng, C. Liu, C. Y. Jiang, L. X. Liu, B. Zhang, Y. M. Liu, C. Yang, S. J. Liu: Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by Bacillus subtilis strains. Microb. Cell Fact. 2014, 13(1), str. 1–11.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izbolj%C5%A1anje_proizvodnje_%C5%A1ikimske_kisline_v_E._coli&diff=20369 2022-04-24T19:48:59Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-022-02111-3#citeas I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod.'' 2022, 15(13), str. 1–14.]<br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Šikimska kislina je intermediat šikimatne poti, v farmacevtski industriji pa se uporablja kot izhodna surovina za sintezo protivirusne učinkovine oseltamivir, ki se uporablja za zdravljenje gripe. Iz industrijskega vidika je zato pridobivanje večjih količin šikimske kisline izredno pomembno, kar pa je mogoče doseči z izolacijo spojine iz naravnih virov, s kemijsko sintezo ali z mikrobno fermentacijo [1]. Za slednje se uporabljajo sevi ''E. coli'', ki so gensko spremenjeni tako, da omogočajo usmeritev metabolnega fluksa v sintezo šikimske kisline. Pri tem so bili do sedaj v ospredju predvsem različni statični sistemi regulacije (izbijanje tarčnih genov, itd.) pri katerih metabolni fluks sicer usmerimo v želeno biosintezno pot, lahko pa takšne modifikacije obenem vodijo v ustavitev celične rasti zaradi blokade v sintezi esencialnih metabolitov ali nabiranja toksičnih intermediatov [2]. Šikimatna pot se namreč pri šikimski kislini ne ustavi, pač pa se nadaljuje naprej do korizmata, ki je prekurzor za nastanek različnih spojin, pomembnih za rast in delovanje celic, kot so aromatske aminokisline, folna kislina, itd. [3] Reševanje tega problema je sicer možno z dodajanjem aromatskih aminokislin k minimalnemu gojišču, v katerem gojimo celice, vendar so le-te drage. Vedno bolj zato v ospredje prihajajo dinamični sistemi regulacije, ki omogočajo kontrolo nad več konkurenčnimi metabolnimi potmi, s čimer po eni strani zagotavljajo pripravo zadostne količine želenega produkta, po drugi strani pa ohranjanje viabilnosti celic. <br /> <br /> Med dinamične sisteme regulacije sodijo različna sinteznobiološka vezja, med katerimi imajo posebno velik potencial vezja, ki temeljijo na optogenetiki – regulaciji celičnih procesov s pomočjo svetlobe. Le-ta namreč predstavlja reverzibilen vir, ki je v primerjavi s kemičnimi induktorji, ki se jih sicer uporablja za regulacijo, cenejši in celicam netoksičen, poleg tega pa lahko s spreminjanjem njegove jakosti dosežemo različno močne celične odzive [2].<br /> <br /> Optogenetika deluje na principu na-svetlobo-odzivnih proteinov, ki ob osvetljevanju s svetlobo karakteristične valovne dolžine spremenijo svoje lastnosti. Takšen je na primer protein VIVID iz nitaste glive Neurospora crasa, ki deluje kot fotoreceptor za modro svetlobo [4]. V svoji strukturi ima vezan kofaktor FAD, ki na svetlobi tvori cisteinil-flavinski adukt, kar vodi v večje konformacijske spremembe proteina in njegovo dimerizacijo [5, 6]. <br /> <br /> == Potek ==<br /> <br /> Ideja raziskovalne skupine je bila, da bi s pomočjo svetlobe nadzirali delovanje encimov šikimatne poti, s čimer bi povečali proizvodnjo šikimske kisline, obenem pa zagotovili zadostno količino esencialnih metabolitov v celicah, da ne bi prišlo do zaustavitve rasti. To so dosegli z bifunkcionalnim optogenetskim stikalom, ki je bil obenem dvoslojen - vseboval je tako transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote. Prve delujejo neposredno na DNA, tako da vplivajo na prepisovanje tarčnih genov, vendar pa pri njih prihaja do zakasnjenega in nepopolnega celičnega odziva, saj nimajo vpliva na že nastale proteine. Boljšo učinkovitost se zato doseže s hkratno uporabo post-trasnkripcijskih regulatornih enot, katerih tarča so RNA, oziroma že nastali proteini. Razgradnjo slednjih lahko npr. dosežemo preko uvedbe N- ali C-končnih razgradnih oznak (degronov), ki proteine usmerjajo v razgradnjo [2, 7].<br /> <br /> Sam bifunkcionalni sistem so razvili po manjših korakih, sprva z reporterskim protein GFP:<br /> <br /> '''1) Priprava transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru transkripcije reporterskega gena s pomočjo represorja TetR. Sestavljali sta jo tako transkripcijska represijska enota (TRU), ki je bila namenjena zaustavitvi transkripcije gena za GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter transkripcijske aktivacijske enote (TAU) z nasprotnim učinkom. Obe enoti sta kot kontrolno vezje vsebovali zapis za razcepljeni represor TetR, pri čemer sta bila tako N-končni kot C-končni del represorja fuzirana s proteinom VIVID, kar je omogočilo njuno nadzorovanje s pomočjo svetlobe. Izhodno vezje je v primeru TRU vsebovalo zapis za GFP pod promotorjem PTet, v primeru TAU pa zapis za LacI pod promotorjem PTet ter zapis za GFP pod promotorjem PTrc.<br /> <br /> Pri obeh enotah sta v temi nastala N- in C-končni del razcepljenega TetR, vsak v fuziji s proteinom VIVID. Ker se slednji v temi nahaja v monomernem stanju, ni prišlo do povezave razcepljenih delov TetR, zato je bil le-ta neaktiven. V primeru TRU je zato transkripcija GFP potekala nemoteno, v primeru TAU pa je nemoteno potekala transkripcija LacI. Ta je preko vezave na operatorsko mesto na promotoju PTrc onemogočal nastanek GFP.<br /> <br /> Ob osvetljevanju z modro svetlobo je prišlo do dimerizacije proteina VIVID, kar je vodilo v povezavo razcepljenih delov TetR in njegovo aktivacijo. V primeru TRU se je TetR vezal na operatorsko regijo promotorja PTet, zaradi česar se je zaustavilo prepisovanje GFP, v primeru TAU pa je aktivirani TetR blokiral transkripcijo LacI, zato je transkripcija GFP pričela potekati [2].<br /> <br /> '''2) Priprava post-transkripcijske regulacijske enote'''<br /> <br /> Post-transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru količine že nastalih reporterskih proteinov s pomočjo N- in C-končnih razgradnih oznak ter proteaze TEVp. Sestavljena je bila iz post-transkripcijske represijske enote (PRU), ki je bila namenjena razgradnji proteina GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter aktivacijske enote (PAU) z nasprotnim učinkom. Samo kontrolno vezje je bilo pri enotah enako kot pri TRU in TAU, le da je namesto razcepljenega represorja TetR vsebovalo razcepljeno proteazo TEVp. Izhodno vezje pri PRU je bilo enako tistemu pri TRU, le da je bil zapis za GFP fuziran še z N-končnim degronom teF. Izhodno vezje pri PAU je vsebovalo zapis za GFP v fuziji s C-končnim degronom teLAA pod promotorjem PTet.<br /> <br /> V temi je bila razcepljena TEVp neaktivna. Pri PRU zato do razgradnje nastalega GFP ni prišlo, saj je bil N-končni degron neizpostavljen. Ob izpostavitvi modri svetlobi je dimerizacija proteina VIVID omogočila povezavo ter aktivacijo proteaze TEVp, ki je nato preko proteolitične cepitve izpostavila N-končni degron na GFP, zaradi česar je prišlo do njegove razgradnje. Pri PAU je bil efekt nasproten. V temi je C-končna oznaka teLAA na proteinu GFP le-tega vodila v razgradnjo, ob osvetljevanju z modro svetlobo pa je aktivirana proteaza TEVp oznako odstranila, zato se GFP ni razgradil [2]. <br /> <br /> '''3) Združitev enot v dvoslojno stikalo'''<br /> <br /> Združitev regulatornih enot v dvoslojno optogenetsko stikalo je omogočalo hkratno kontrolo nad transkripcijo regulatornega proteina GFP in regulacijo količine že nastalega proteina. Zgrajeno je bilo iz transkripcijskega in post-transkripcijskega represijskega sistema (TPRS) ter aktivacijskega sistema (TPAS). Oba sta vsebovala tako kontrolna vezja transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote, razlikovala pa sta se po izhodnih vezjih:<br /> <br /> • TPRS je vseboval enakega kot PRU. Ob osvetljevanju celic z modro svetlobo je aktivirani represor TetR zaustavil transkripcijo GFP, ki se je nahajal pod promotorjem PTet, aktivirana proteaza TEVp pa je s proteolitično cepitvijo izpostavila N-končni degron teF na GFP, zato se je nivo GFP znižal.<br /> • Izhodno vezje TPAS je bilo podobno izhodnemu vezju TAU, le da je bil zapis za LacI prisoten v N-končni fuziji z degronom teF, zapis za GFP pa v C-končni fuziji z degronom DAS. Ob osvetljevanju z modro svetlobo je tako aktiviran TetR zaustavil transkripcijo LacI, aktivirana TEVp pa je s cepitvijo izpostavila N-končni degron, zato se je količina LacI znižala, transkripcija GFP pa je lahko potekala. GFP je sicer nastajal v C-končni fuziji z degronom DAS, ki bi protein načeloma vodil v razgradnjo, vendar je proteaza TEVp oznako odcepila.<br /> <br /> == Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za regulacijo proizvodnje šikimske kisline ==<br /> <br /> Vključitev na novo razvitih sistemov TPRS in TPAS v šikimatno pot je omogočila nadzor nad delovanjem encimov v le-tej s pomočjo modre svetlobe. Kontrolni vezji z razcepljenima TetR in TEVp sta pri tem ostali enaki, v izhodnih vezjih pa je prišlo do zamenjave GFP z encimi šikimatne poti:<br /> <br /> • V izhodnem vezju sistema TPRS je zapis za GFP nadomestil zapis za šikimat kinazo (AroK), ki šikimsko kislino pretvarja v šikimat 3-fosfat [8]. V temi, ko je AroK nastajala, je zato šikimatna pot potekala vse do aromatskih aminokislin, zaradi česar so celice neovirano rastle. Na svetlobi pa je transkripcija gena zaradi vezave TetR prenehala potekati, že nastali encimi AroK pa so se razgradili zaradi izpostavitve degronske oznake teF na N-koncu encima zaradi delovanja TEVp [2].<br /> • V izhodnem vezju sistema TPAS sta zapis za GFP zamenjala zapisa za 3-deoksi-D-arabinoheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sintazo (AroG) ter 3-dehidrokinat (DHQ) sintazo (AroB), ki sta pomembna pri sami sintezi šikimske kisline [2, 8]. V temi je bil nastanek encimov onemogočen zaradi delovanja represorja LacI, nekontrolirano nastali encimi pa so se razgradili zaradi C-končne degronske oznake DAS. Ob osvetljevanju je prišlo do razgradnje represorja LacI in zaustavitve njegovega nastanka, zato je transkripcija genov za AroG in AroB pričela potekati, nastala encima pa se nista razgradila, saj je aktivirana TEVp odstranila njuno degronsko oznako.<br /> <br /> Sistema TPRS in TPAS sta torej zagotovila bifunkcionalnost samega stikala, pri čemer je TPRS omogočal neovirano rast celic v temi, TPAS pa je ob osvetljevanju z modro svetlobo metabolni fluks preusmeril v proizvodnjo šikimske kisline, kar je povečalo njen izplen in zmanjšalo količino stranskih produktov. <br /> <br /> Vključitev bifunkcionalnega stikala v šasijo ''E. coli'' S5 je omogočila nastanek 4,2 g/L šikimske kisline v minimalnem gojišču NBS z dodatkom 20 g/L glukoze, kar je 1,6-krat več kot v celicah brez sinteznobiološkega vezja. Kot optimalni pogoji za gojenje celic so se izkazali temperatura 37 °C, koncentracija glukoze 40 g/L ter pričetek osvetljevanja po 24-urnem gojenju celic v temi. V takšnih pogojih so celice v 72 urah v 5 litrskem bioreaktorju proizvedle 35 g/L šikimske kisline, kar je največji titer šikimske kisline v minimalnem gojišču do zdaj [2]. <br /> <br /> == Viri in literatura ==<br /> <br /> [1] A. Ramazani, A. Shahkarami, Fatemeh Zarei, S. Rezayati, A. Rezaei, A. Bodaghi, L. Youseftabar-Miri: Shikimic acid from staranise (Illicium verum Hook): Extraction, purification and determination. Eurasian Chem. Commun. 2021, 3(7), str. 452–460.<br /> <br /> [2] I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in E. coli. Biotechnol. Biofuels Bioprod. 2022, 15(13), str. 1–14.<br /> <br /> [3] V. Tzin, G. Galili: New Insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants. Mol. Plant 2010, 3(6), str. 956–972.<br /> <br /> [4] J. M. Hurley, C. H. Chen, J. J. Loros, J. C. Dunlap: Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa. G3 Genes, Genomes, Genet. 2012, 2(10), str. 1207–1212.<br /> <br /> [5] A. T. Vaidya, C. H. Chen, J. C. Dunlap, J. J. Loros, B. R. Crane: Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. Sci. Signal. 2011, 4(184).<br /> <br /> [6] B. D. Zoltowski, B. R. Crane: Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. Biochemistry 2008, 47(27), str. 7012–7019.<br /> <br /> [7] A. Stikāne: Degrons, http://2014.igem.org/Team:Edinburgh/project/degrons (pridobljeno 23. 4. 2022).<br /> <br /> [8] D. F. Liu, G. M. Ai, Q. X. Zheng, C. Liu, C. Y. Jiang, L. X. Liu, B. Zhang, Y. M. Liu, C. Yang, S. J. Liu: Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by Bacillus subtilis strains. Microb. Cell Fact. 2014, 13(1), str. 1–11.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izbolj%C5%A1anje_proizvodnje_%C5%A1ikimske_kisline_v_E._coli&diff=20368 2022-04-24T19:48:23Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-022-02111-3#citeas I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod.'' 2022, 15(13), str. 1–14.]<br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Šikimska kislina je intermediat šikimatne poti, v farmacevtski industriji pa se uporablja kot izhodna surovina za sintezo protivirusne učinkovine oseltamivir, ki se uporablja za zdravljenje gripe. Iz industrijskega vidika je zato pridobivanje večjih količin šikimske kisline izredno pomembno, kar pa je mogoče doseči z izolacijo spojine iz naravnih virov, s kemijsko sintezo ali z mikrobno fermentacijo [1]. Za slednje se uporabljajo sevi ''E. coli'', ki so gensko spremenjeni tako, da omogočajo usmeritev metabolnega fluksa v sintezo šikimske kisline. Pri tem so bili do sedaj v ospredju predvsem različni statični sistemi regulacije (izbijanje tarčnih genov, itd.) pri katerih metabolni fluks sicer usmerimo v želeno biosintezno pot, lahko pa takšne modifikacije obenem vodijo v ustavitev celične rasti zaradi blokade v sintezi esencialnih metabolitov ali nabiranja toksičnih intermediatov [2]. Šikimatna pot se namreč pri šikimski kislini ne ustavi, pač pa se nadaljuje naprej do korizmata, ki je prekurzor za nastanek različnih spojin, pomembnih za rast in delovanje celic, kot so aromatske aminokisline, folna kislina, itd. [3] Reševanje tega problema je sicer možno z dodajanjem aromatskih aminokislin k minimalnemu gojišču, v katerem gojimo celice, vendar so le-te drage. Vedno bolj zato v ospredje prihajajo dinamični sistemi regulacije, ki omogočajo kontrolo nad več konkurenčnimi metabolnimi potmi, s čimer po eni strani zagotavljajo pripravo zadostne količine želenega produkta, po drugi strani pa ohranjanje viabilnosti celic. <br /> <br /> Med dinamične sisteme regulacije sodijo različna sinteznobiološka vezja, med katerimi imajo posebno velik potencial vezja, ki temeljijo na optogenetiki – regulaciji celičnih procesov s pomočjo svetlobe. Le-ta namreč predstavlja reverzibilen vir, ki je v primerjavi s kemičnimi induktorji, ki se jih sicer uporablja za regulacijo, cenejši in celicam netoksičen, poleg tega pa lahko s spreminjanjem njegove jakosti dosežemo različno močne celične odzive [2].<br /> <br /> Optogenetika deluje na principu na-svetlobo-odzivnih proteinov, ki ob osvetljevanju s svetlobo karakteristične valovne dolžine spremenijo svoje lastnosti. Takšen je na primer protein VIVID iz nitaste glive Neurospora crasa, ki deluje kot fotoreceptor za modro svetlobo [4]. V svoji strukturi ima vezan kofaktor FAD, ki na svetlobi tvori cisteinil-flavinski adukt, kar vodi v večje konformacijske spremembe proteina in njegovo dimerizacijo [5, 6]. <br /> <br /> == Potek ==<br /> <br /> Ideja raziskovalne skupine je bila, da bi s pomočjo svetlobe nadzirali delovanje encimov šikimatne poti, s čimer bi povečali proizvodnjo šikimske kisline, obenem pa zagotovili zadostno količino esencialnih metabolitov v celicah, da ne bi prišlo do zaustavitve rasti. To so dosegli z bifunkcionalnim optogenetskim stikalom, ki je bil obenem dvoslojen - vseboval je tako transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote. Prve delujejo neposredno na DNA, tako da vplivajo na prepisovanje tarčnih genov, vendar pa pri njih prihaja do zakasnjenega in nepopolnega celičnega odziva, saj nimajo vpliva na že nastale proteine. Boljšo učinkovitost se zato doseže s hkratno uporabo post-trasnkripcijskih regulatornih enot, katerih tarča so RNA, oziroma že nastali proteini. Razgradnjo slednjih lahko npr. dosežemo preko uvedbe N- ali C-končnih razgradnih oznak (degronov), ki proteine usmerjajo v razgradnjo [2, 7].<br /> <br /> Sam bifunkcionalni sistem so razvili po manjših korakih, sprva z reporterskim protein GFP:<br /> <br /> '''1) Priprava transkripcijske regulacijske enote'''<br /> Transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru transkripcije reporterskega gena s pomočjo represorja TetR. Sestavljali sta jo tako transkripcijska represijska enota (TRU), ki je bila namenjena zaustavitvi transkripcije gena za GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter transkripcijske aktivacijske enote (TAU) z nasprotnim učinkom. Obe enoti sta kot kontrolno vezje vsebovali zapis za razcepljeni represor TetR, pri čemer sta bila tako N-končni kot C-končni del represorja fuzirana s proteinom VIVID, kar je omogočilo njuno nadzorovanje s pomočjo svetlobe. Izhodno vezje je v primeru TRU vsebovalo zapis za GFP pod promotorjem PTet, v primeru TAU pa zapis za LacI pod promotorjem PTet ter zapis za GFP pod promotorjem PTrc.<br /> <br /> Pri obeh enotah sta v temi nastala N- in C-končni del razcepljenega TetR, vsak v fuziji s proteinom VIVID. Ker se slednji v temi nahaja v monomernem stanju, ni prišlo do povezave razcepljenih delov TetR, zato je bil le-ta neaktiven. V primeru TRU je zato transkripcija GFP potekala nemoteno, v primeru TAU pa je nemoteno potekala transkripcija LacI. Ta je preko vezave na operatorsko mesto na promotoju PTrc onemogočal nastanek GFP.<br /> <br /> Ob osvetljevanju z modro svetlobo je prišlo do dimerizacije proteina VIVID, kar je vodilo v povezavo razcepljenih delov TetR in njegovo aktivacijo. V primeru TRU se je TetR vezal na operatorsko regijo promotorja PTet, zaradi česar se je zaustavilo prepisovanje GFP, v primeru TAU pa je aktivirani TetR blokiral transkripcijo LacI, zato je transkripcija GFP pričela potekati [2].<br /> <br /> '''2) Priprava post-transkripcijske regulacijske enote'''<br /> Post-transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru količine že nastalih reporterskih proteinov s pomočjo N- in C-končnih razgradnih oznak ter proteaze TEVp. Sestavljena je bila iz post-transkripcijske represijske enote (PRU), ki je bila namenjena razgradnji proteina GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter aktivacijske enote (PAU) z nasprotnim učinkom. Samo kontrolno vezje je bilo pri enotah enako kot pri TRU in TAU, le da je namesto razcepljenega represorja TetR vsebovalo razcepljeno proteazo TEVp. Izhodno vezje pri PRU je bilo enako tistemu pri TRU, le da je bil zapis za GFP fuziran še z N-končnim degronom teF. Izhodno vezje pri PAU je vsebovalo zapis za GFP v fuziji s C-končnim degronom teLAA pod promotorjem PTet.<br /> <br /> V temi je bila razcepljena TEVp neaktivna. Pri PRU zato do razgradnje nastalega GFP ni prišlo, saj je bil N-končni degron neizpostavljen. Ob izpostavitvi modri svetlobi je dimerizacija proteina VIVID omogočila povezavo ter aktivacijo proteaze TEVp, ki je nato preko proteolitične cepitve izpostavila N-končni degron na GFP, zaradi česar je prišlo do njegove razgradnje. Pri PAU je bil efekt nasproten. V temi je C-končna oznaka teLAA na proteinu GFP le-tega vodila v razgradnjo, ob osvetljevanju z modro svetlobo pa je aktivirana proteaza TEVp oznako odstranila, zato se GFP ni razgradil [2]. <br /> <br /> '''3) Združitev enot v dvoslojno stikalo'''<br /> Združitev regulatornih enot v dvoslojno optogenetsko stikalo je omogočalo hkratno kontrolo nad transkripcijo regulatornega proteina GFP in regulacijo količine že nastalega proteina. Zgrajeno je bilo iz transkripcijskega in post-transkripcijskega represijskega sistema (TPRS) ter aktivacijskega sistema (TPAS). Oba sta vsebovala tako kontrolna vezja transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote, razlikovala pa sta se po izhodnih vezjih:<br /> <br /> • TPRS je vseboval enakega kot PRU. Ob osvetljevanju celic z modro svetlobo je aktivirani represor TetR zaustavil transkripcijo GFP, ki se je nahajal pod promotorjem PTet, aktivirana proteaza TEVp pa je s proteolitično cepitvijo izpostavila N-končni degron teF na GFP, zato se je nivo GFP znižal.<br /> • Izhodno vezje TPAS je bilo podobno izhodnemu vezju TAU, le da je bil zapis za LacI prisoten v N-končni fuziji z degronom teF, zapis za GFP pa v C-končni fuziji z degronom DAS. Ob osvetljevanju z modro svetlobo je tako aktiviran TetR zaustavil transkripcijo LacI, aktivirana TEVp pa je s cepitvijo izpostavila N-končni degron, zato se je količina LacI znižala, transkripcija GFP pa je lahko potekala. GFP je sicer nastajal v C-končni fuziji z degronom DAS, ki bi protein načeloma vodil v razgradnjo, vendar je proteaza TEVp oznako odcepila.<br /> <br /> == Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za regulacijo proizvodnje šikimske kisline ==<br /> <br /> Vključitev na novo razvitih sistemov TPRS in TPAS v šikimatno pot je omogočila nadzor nad delovanjem encimov v le-tej s pomočjo modre svetlobe. Kontrolni vezji z razcepljenima TetR in TEVp sta pri tem ostali enaki, v izhodnih vezjih pa je prišlo do zamenjave GFP z encimi šikimatne poti:<br /> <br /> • V izhodnem vezju sistema TPRS je zapis za GFP nadomestil zapis za šikimat kinazo (AroK), ki šikimsko kislino pretvarja v šikimat 3-fosfat [8]. V temi, ko je AroK nastajala, je zato šikimatna pot potekala vse do aromatskih aminokislin, zaradi česar so celice neovirano rastle. Na svetlobi pa je transkripcija gena zaradi vezave TetR prenehala potekati, že nastali encimi AroK pa so se razgradili zaradi izpostavitve degronske oznake teF na N-koncu encima zaradi delovanja TEVp [2].<br /> • V izhodnem vezju sistema TPAS sta zapis za GFP zamenjala zapisa za 3-deoksi-D-arabinoheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sintazo (AroG) ter 3-dehidrokinat (DHQ) sintazo (AroB), ki sta pomembna pri sami sintezi šikimske kisline [2, 8]. V temi je bil nastanek encimov onemogočen zaradi delovanja represorja LacI, nekontrolirano nastali encimi pa so se razgradili zaradi C-končne degronske oznake DAS. Ob osvetljevanju je prišlo do razgradnje represorja LacI in zaustavitve njegovega nastanka, zato je transkripcija genov za AroG in AroB pričela potekati, nastala encima pa se nista razgradila, saj je aktivirana TEVp odstranila njuno degronsko oznako.<br /> <br /> Sistema TPRS in TPAS sta torej zagotovila bifunkcionalnost samega stikala, pri čemer je TPRS omogočal neovirano rast celic v temi, TPAS pa je ob osvetljevanju z modro svetlobo metabolni fluks preusmeril v proizvodnjo šikimske kisline, kar je povečalo njen izplen in zmanjšalo količino stranskih produktov. <br /> <br /> Vključitev bifunkcionalnega stikala v šasijo ''E. coli'' S5 je omogočila nastanek 4,2 g/L šikimske kisline v minimalnem gojišču NBS z dodatkom 20 g/L glukoze, kar je 1,6-krat več kot v celicah brez sinteznobiološkega vezja. Kot optimalni pogoji za gojenje celic so se izkazali temperatura 37 °C, koncentracija glukoze 40 g/L ter pričetek osvetljevanja po 24-urnem gojenju celic v temi. V takšnih pogojih so celice v 72 urah v 5 litrskem bioreaktorju proizvedle 35 g/L šikimske kisline, kar je največji titer šikimske kisline v minimalnem gojišču do zdaj [2]. <br /> <br /> == Viri in literatura ==<br /> <br /> [1] A. Ramazani, A. Shahkarami, Fatemeh Zarei, S. Rezayati, A. Rezaei, A. Bodaghi, L. Youseftabar-Miri: Shikimic acid from staranise (Illicium verum Hook): Extraction, purification and determination. Eurasian Chem. Commun. 2021, 3(7), str. 452–460.<br /> <br /> [2] I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in E. coli. Biotechnol. Biofuels Bioprod. 2022, 15(13), str. 1–14.<br /> <br /> [3] V. Tzin, G. Galili: New Insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants. Mol. Plant 2010, 3(6), str. 956–972.<br /> <br /> [4] J. M. Hurley, C. H. Chen, J. J. Loros, J. C. Dunlap: Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa. G3 Genes, Genomes, Genet. 2012, 2(10), str. 1207–1212.<br /> <br /> [5] A. T. Vaidya, C. H. Chen, J. C. Dunlap, J. J. Loros, B. R. Crane: Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. Sci. Signal. 2011, 4(184).<br /> <br /> [6] B. D. Zoltowski, B. R. Crane: Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. Biochemistry 2008, 47(27), str. 7012–7019.<br /> <br /> [7] A. Stikāne: Degrons, http://2014.igem.org/Team:Edinburgh/project/degrons (pridobljeno 23. 4. 2022).<br /> <br /> [8] D. F. Liu, G. M. Ai, Q. X. Zheng, C. Liu, C. Y. Jiang, L. X. Liu, B. Zhang, Y. M. Liu, C. Yang, S. J. Liu: Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by Bacillus subtilis strains. Microb. Cell Fact. 2014, 13(1), str. 1–11.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izbolj%C5%A1anje_proizvodnje_%C5%A1ikimske_kisline_v_E._coli&diff=20367 2022-04-24T19:47:55Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-022-02111-3#citeas I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod.'' 2022, 15(13), str. 1–14.]<br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Šikimska kislina je intermediat šikimatne poti, v farmacevtski industriji pa se uporablja kot izhodna surovina za sintezo protivirusne učinkovine oseltamivir, ki se uporablja za zdravljenje gripe. Iz industrijskega vidika je zato pridobivanje večjih količin šikimske kisline izredno pomembno, kar pa je mogoče doseči z izolacijo spojine iz naravnih virov, s kemijsko sintezo ali z mikrobno fermentacijo [1]. Za slednje se uporabljajo sevi ''E. coli'', ki so gensko spremenjeni tako, da omogočajo usmeritev metabolnega fluksa v sintezo šikimske kisline. Pri tem so bili do sedaj v ospredju predvsem različni statični sistemi regulacije (izbijanje tarčnih genov, itd.) pri katerih metabolni fluks sicer usmerimo v želeno biosintezno pot, lahko pa takšne modifikacije obenem vodijo v ustavitev celične rasti zaradi blokade v sintezi esencialnih metabolitov ali nabiranja toksičnih intermediatov [2]. Šikimatna pot se namreč pri šikimski kislini ne ustavi, pač pa se nadaljuje naprej do korizmata, ki je prekurzor za nastanek različnih spojin, pomembnih za rast in delovanje celic, kot so aromatske aminokisline, folna kislina, itd. [3] Reševanje tega problema je sicer možno z dodajanjem aromatskih aminokislin k minimalnemu gojišču, v katerem gojimo celice, vendar so le-te drage. Vedno bolj zato v ospredje prihajajo dinamični sistemi regulacije, ki omogočajo kontrolo nad več konkurenčnimi metabolnimi potmi, s čimer po eni strani zagotavljajo pripravo zadostne količine želenega produkta, po drugi strani pa ohranjanje viabilnosti celic. <br /> <br /> Med dinamične sisteme regulacije sodijo različna sinteznobiološka vezja, med katerimi imajo posebno velik potencial vezja, ki temeljijo na optogenetiki – regulaciji celičnih procesov s pomočjo svetlobe. Le-ta namreč predstavlja reverzibilen vir, ki je v primerjavi s kemičnimi induktorji, ki se jih sicer uporablja za regulacijo, cenejši in celicam netoksičen, poleg tega pa lahko s spreminjanjem njegove jakosti dosežemo različno močne celične odzive [2].<br /> <br /> Optogenetika deluje na principu na-svetlobo-odzivnih proteinov, ki ob osvetljevanju s svetlobo karakteristične valovne dolžine spremenijo svoje lastnosti. Takšen je na primer protein VIVID iz nitaste glive Neurospora crasa, ki deluje kot fotoreceptor za modro svetlobo [4]. V svoji strukturi ima vezan kofaktor FAD, ki na svetlobi tvori cisteinil-flavinski adukt, kar vodi v večje konformacijske spremembe proteina in njegovo dimerizacijo [5, 6]. <br /> <br /> == Potek ==<br /> <br /> Sama ideja raziskovalne skupine je bila, da bi s pomočjo svetlobe nadzirali delovanje encimov šikimatne poti, s čimer bi povečali proizvodnjo šikimske kisline, obenem pa zagotovili zadostno količino esencialnih metabolitov v celicah, da ne bi prišlo do zaustavitve rasti. To so dosegli z bifunkcionalnim optogenetskim stikalom, ki je bil obenem dvoslojen - vseboval je tako transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote. Prve delujejo neposredno na DNA, tako da vplivajo na prepisovanje tarčnih genov, vendar pa pri njih prihaja do zakasnjenega in nepopolnega celičnega odziva, saj nimajo vpliva na že nastale proteine. Boljšo učinkovitost se zato doseže s hkratno uporabo post-trasnkripcijskih regulatornih enot, katerih tarča so RNA, oziroma že nastali proteini. Razgradnjo slednjih lahko npr. dosežemo preko uvedbe N- ali C-končnih razgradnih oznak (degronov), ki proteine usmerjajo v razgradnjo [2, 7].<br /> <br /> Sam bifunkcionalni sistem so razvili po manjših korakih, sprva z reporterskim protein GFP:<br /> <br /> '''1) Priprava transkripcijske regulacijske enote'''<br /> Transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru transkripcije reporterskega gena s pomočjo represorja TetR. Sestavljali sta jo tako transkripcijska represijska enota (TRU), ki je bila namenjena zaustavitvi transkripcije gena za GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter transkripcijske aktivacijske enote (TAU) z nasprotnim učinkom. Obe enoti sta kot kontrolno vezje vsebovali zapis za razcepljeni represor TetR, pri čemer sta bila tako N-končni kot C-končni del represorja fuzirana s proteinom VIVID, kar je omogočilo njuno nadzorovanje s pomočjo svetlobe. Izhodno vezje je v primeru TRU vsebovalo zapis za GFP pod promotorjem PTet, v primeru TAU pa zapis za LacI pod promotorjem PTet ter zapis za GFP pod promotorjem PTrc.<br /> <br /> Pri obeh enotah sta v temi nastala N- in C-končni del razcepljenega TetR, vsak v fuziji s proteinom VIVID. Ker se slednji v temi nahaja v monomernem stanju, ni prišlo do povezave razcepljenih delov TetR, zato je bil le-ta neaktiven. V primeru TRU je zato transkripcija GFP potekala nemoteno, v primeru TAU pa je nemoteno potekala transkripcija LacI. Ta je preko vezave na operatorsko mesto na promotoju PTrc onemogočal nastanek GFP.<br /> <br /> Ob osvetljevanju z modro svetlobo je prišlo do dimerizacije proteina VIVID, kar je vodilo v povezavo razcepljenih delov TetR in njegovo aktivacijo. V primeru TRU se je TetR vezal na operatorsko regijo promotorja PTet, zaradi česar se je zaustavilo prepisovanje GFP, v primeru TAU pa je aktivirani TetR blokiral transkripcijo LacI, zato je transkripcija GFP pričela potekati [2].<br /> <br /> '''2) Priprava post-transkripcijske regulacijske enote'''<br /> Post-transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru količine že nastalih reporterskih proteinov s pomočjo N- in C-končnih razgradnih oznak ter proteaze TEVp. Sestavljena je bila iz post-transkripcijske represijske enote (PRU), ki je bila namenjena razgradnji proteina GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter aktivacijske enote (PAU) z nasprotnim učinkom. Samo kontrolno vezje je bilo pri enotah enako kot pri TRU in TAU, le da je namesto razcepljenega represorja TetR vsebovalo razcepljeno proteazo TEVp. Izhodno vezje pri PRU je bilo enako tistemu pri TRU, le da je bil zapis za GFP fuziran še z N-končnim degronom teF. Izhodno vezje pri PAU je vsebovalo zapis za GFP v fuziji s C-končnim degronom teLAA pod promotorjem PTet.<br /> <br /> V temi je bila razcepljena TEVp neaktivna. Pri PRU zato do razgradnje nastalega GFP ni prišlo, saj je bil N-končni degron neizpostavljen. Ob izpostavitvi modri svetlobi je dimerizacija proteina VIVID omogočila povezavo ter aktivacijo proteaze TEVp, ki je nato preko proteolitične cepitve izpostavila N-končni degron na GFP, zaradi česar je prišlo do njegove razgradnje. Pri PAU je bil efekt nasproten. V temi je C-končna oznaka teLAA na proteinu GFP le-tega vodila v razgradnjo, ob osvetljevanju z modro svetlobo pa je aktivirana proteaza TEVp oznako odstranila, zato se GFP ni razgradil [2]. <br /> <br /> '''3) Združitev enot v dvoslojno stikalo'''<br /> Združitev regulatornih enot v dvoslojno optogenetsko stikalo je omogočalo hkratno kontrolo nad transkripcijo regulatornega proteina GFP in regulacijo količine že nastalega proteina. Zgrajeno je bilo iz transkripcijskega in post-transkripcijskega represijskega sistema (TPRS) ter aktivacijskega sistema (TPAS). Oba sta vsebovala tako kontrolna vezja transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote, razlikovala pa sta se po izhodnih vezjih:<br /> <br /> • TPRS je vseboval enakega kot PRU. Ob osvetljevanju celic z modro svetlobo je aktivirani represor TetR zaustavil transkripcijo GFP, ki se je nahajal pod promotorjem PTet, aktivirana proteaza TEVp pa je s proteolitično cepitvijo izpostavila N-končni degron teF na GFP, zato se je nivo GFP znižal.<br /> • Izhodno vezje TPAS je bilo podobno izhodnemu vezju TAU, le da je bil zapis za LacI prisoten v N-končni fuziji z degronom teF, zapis za GFP pa v C-končni fuziji z degronom DAS. Ob osvetljevanju z modro svetlobo je tako aktiviran TetR zaustavil transkripcijo LacI, aktivirana TEVp pa je s cepitvijo izpostavila N-končni degron, zato se je količina LacI znižala, transkripcija GFP pa je lahko potekala. GFP je sicer nastajal v C-končni fuziji z degronom DAS, ki bi protein načeloma vodil v razgradnjo, vendar je proteaza TEVp oznako odcepila.<br /> <br /> <br /> == Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za regulacijo proizvodnje šikimske kisline ==<br /> <br /> Vključitev na novo razvitih sistemov TPRS in TPAS v šikimatno pot je omogočila nadzor nad delovanjem encimov v le-tej s pomočjo modre svetlobe. Kontrolni vezji z razcepljenima TetR in TEVp sta pri tem ostali enaki, v izhodnih vezjih pa je prišlo do zamenjave GFP z encimi šikimatne poti:<br /> <br /> • V izhodnem vezju sistema TPRS je zapis za GFP nadomestil zapis za šikimat kinazo (AroK), ki šikimsko kislino pretvarja v šikimat 3-fosfat [8]. V temi, ko je AroK nastajala, je zato šikimatna pot potekala vse do aromatskih aminokislin, zaradi česar so celice neovirano rastle. Na svetlobi pa je transkripcija gena zaradi vezave TetR prenehala potekati, že nastali encimi AroK pa so se razgradili zaradi izpostavitve degronske oznake teF na N-koncu encima zaradi delovanja TEVp [2].<br /> • V izhodnem vezju sistema TPAS sta zapis za GFP zamenjala zapisa za 3-deoksi-D-arabinoheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sintazo (AroG) ter 3-dehidrokinat (DHQ) sintazo (AroB), ki sta pomembna pri sami sintezi šikimske kisline [2, 8]. V temi je bil nastanek encimov onemogočen zaradi delovanja represorja LacI, nekontrolirano nastali encimi pa so se razgradili zaradi C-končne degronske oznake DAS. Ob osvetljevanju je prišlo do razgradnje represorja LacI in zaustavitve njegovega nastanka, zato je transkripcija genov za AroG in AroB pričela potekati, nastala encima pa se nista razgradila, saj je aktivirana TEVp odstranila njuno degronsko oznako.<br /> <br /> Sistema TPRS in TPAS sta torej zagotovila bifunkcionalnost samega stikala, pri čemer je TPRS omogočal neovirano rast celic v temi, TPAS pa je ob osvetljevanju z modro svetlobo metabolni fluks preusmeril v proizvodnjo šikimske kisline, kar je povečalo njen izplen in zmanjšalo količino stranskih produktov. <br /> <br /> Vključitev bifunkcionalnega stikala v šasijo ''E. coli'' S5 je omogočila nastanek 4,2 g/L šikimske kisline v minimalnem gojišču NBS z dodatkom 20 g/L glukoze, kar je 1,6-krat več kot v celicah brez sinteznobiološkega vezja. Kot optimalni pogoji za gojenje celic so se izkazali temperatura 37 °C, koncentracija glukoze 40 g/L ter pričetek osvetljevanja po 24-urnem gojenju celic v temi. V takšnih pogojih so celice v 72 urah v 5 litrskem bioreaktorju proizvedle 35 g/L šikimske kisline, kar je največji titer šikimske kisline v minimalnem gojišču do zdaj [2]. <br /> <br /> == Viri in literatura ==<br /> <br /> [1] A. Ramazani, A. Shahkarami, Fatemeh Zarei, S. Rezayati, A. Rezaei, A. Bodaghi, L. Youseftabar-Miri: Shikimic acid from staranise (Illicium verum Hook): Extraction, purification and determination. Eurasian Chem. Commun. 2021, 3(7), str. 452–460.<br /> <br /> [2] I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in E. coli. Biotechnol. Biofuels Bioprod. 2022, 15(13), str. 1–14.<br /> <br /> [3] V. Tzin, G. Galili: New Insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants. Mol. Plant 2010, 3(6), str. 956–972.<br /> <br /> [4] J. M. Hurley, C. H. Chen, J. J. Loros, J. C. Dunlap: Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa. G3 Genes, Genomes, Genet. 2012, 2(10), str. 1207–1212.<br /> <br /> [5] A. T. Vaidya, C. H. Chen, J. C. Dunlap, J. J. Loros, B. R. Crane: Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. Sci. Signal. 2011, 4(184).<br /> <br /> [6] B. D. Zoltowski, B. R. Crane: Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. Biochemistry 2008, 47(27), str. 7012–7019.<br /> <br /> [7] A. Stikāne: Degrons, http://2014.igem.org/Team:Edinburgh/project/degrons (pridobljeno 23. 4. 2022).<br /> <br /> [8] D. F. Liu, G. M. Ai, Q. X. Zheng, C. Liu, C. Y. Jiang, L. X. Liu, B. Zhang, Y. M. Liu, C. Yang, S. J. Liu: Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by Bacillus subtilis strains. Microb. Cell Fact. 2014, 13(1), str. 1–11.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izbolj%C5%A1anje_proizvodnje_%C5%A1ikimske_kisline_v_E._coli&diff=20366 2022-04-24T19:46:44Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-022-02111-3#citeas I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in ''E. coli''. ''Biotechnol. Biofuels Bioprod.'' 2022, 15(13), str. 1–14.]<br /> <br /> == Uvod ==<br /> <br /> Šikimska kislina je intermediat šikimatne poti, v farmacevtski industriji pa se uporablja kot izhodna surovina za sintezo protivirusne učinkovine oseltamivir, ki se uporablja za zdravljenje gripe. Iz industrijskega vidika je zato pridobivanje večjih količin šikimske kisline izredno pomembno, kar pa je mogoče doseči z izolacijo spojine iz naravnih virov, s kemijsko sintezo ali z mikrobno fermentacijo [1]. Za slednje se uporabljajo sevi ''E. coli'', ki so gensko spremenjeni tako, da omogočajo usmeritev metabolnega fluksa v sintezo šikimske kisline. Pri tem so bili do sedaj v ospredju predvsem različni statični sistemi regulacije (izbijanje tarčnih genov, itd.) pri katerih metabolni fluks sicer usmerimo v želeno biosintezno pot, lahko pa takšne modifikacije obenem vodijo v ustavitev celične rasti zaradi blokade v sintezi esencialnih metabolitov ali nabiranja toksičnih intermediatov [2]. Šikimatna pot se namreč pri šikimski kislini ne ustavi, pač pa se nadaljuje naprej do korizmata, ki je prekurzor za nastanek različnih spojin, pomembnih za rast in delovanje celic, kot so aromatske aminokisline, folna kislina, itd. [3] Reševanje tega problema je sicer možno z dodajanjem aromatskih aminokislin k minimalnemu gojišču, v katerem gojimo celice, vendar so le-te drage. Vedno bolj zato v ospredje prihajajo dinamični sistemi regulacije, ki omogočajo kontrolo nad več konkurenčnimi metabolnimi potmi, s čimer po eni strani zagotavljajo pripravo zadostne količine želenega produkta, po drugi strani pa ohranjanje viabilnosti celic. <br /> <br /> Med dinamične sisteme regulacije sodijo različna sinteznobiološka vezja, med katerimi imajo posebno velik potencial vezja, ki temeljijo na optogenetiki – regulaciji celičnih procesov s pomočjo svetlobe. Le-ta namreč predstavlja reverzibilen vir, ki je v primerjavi s kemičnimi induktorji, ki se jih sicer uporablja za regulacijo, cenejši in celicam netoksičen, poleg tega pa lahko s spreminjanjem njegove jakosti dosežemo različno močne celične odzive [2].<br /> <br /> Optogenetika deluje na principu na-svetlobo-odzivnih proteinov, ki ob osvetljevanju s svetlobo karakteristične valovne dolžine spremenijo svoje lastnosti. Takšen je na primer protein VIVID iz nitaste glive Neurospora crasa, ki deluje kot fotoreceptor za modro svetlobo [4]. V svoji strukturi ima vezan kofaktor FAD, ki na svetlobi tvori cisteinil-flavinski adukt, kar vodi v večje konformacijske spremembe proteina in njegovo dimerizacijo [5, 6]. <br /> <br /> == Potek ==<br /> <br /> Sama ideja raziskovalne skupine je bila, da bi s pomočjo svetlobe nadzirali delovanje encimov šikimatne poti, s čimer bi povečali proizvodnjo šikimske kisline, obenem pa zagotovili zadostno količino esencialnih metabolitov v celicah, da ne bi prišlo do zaustavitve rasti. To so dosegli z bifunkcionalnim optogenetskim stikalom, ki je bil obenem dvoslojen - vseboval je tako transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote. Prve delujejo neposredno na DNA, tako da vplivajo na prepisovanje tarčnih genov, vendar pa pri njih prihaja do zakasnjenega in nepopolnega celičnega odziva, saj nimajo vpliva na že nastale proteine. Boljšo učinkovitost se zato doseže s hkratno uporabo post-trasnkripcijskih regulatornih enot, katerih tarča so RNA, oziroma že nastali proteini. Razgradnjo slednjih lahko npr. dosežemo preko uvedbe N- ali C-končnih razgradnih oznak (degronov), ki proteine usmerjajo v razgradnjo [2, 7].<br /> <br /> Sam bifunkcionalni sistem so razvili po manjših korakih, sprva z reporterskim protein GFP:<br /> <br /> ===Priprava transkripcijske regulacijske enote===<br /> Transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru transkripcije reporterskega gena s pomočjo represorja TetR. Sestavljali sta jo tako transkripcijska represijska enota (TRU), ki je bila namenjena zaustavitvi transkripcije gena za GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter transkripcijske aktivacijske enote (TAU) z nasprotnim učinkom. Obe enoti sta kot kontrolno vezje vsebovali zapis za razcepljeni represor TetR, pri čemer sta bila tako N-končni kot C-končni del represorja fuzirana s proteinom VIVID, kar je omogočilo njuno nadzorovanje s pomočjo svetlobe. Izhodno vezje je v primeru TRU vsebovalo zapis za GFP pod promotorjem PTet, v primeru TAU pa zapis za LacI pod promotorjem PTet ter zapis za GFP pod promotorjem PTrc.<br /> <br /> Pri obeh enotah sta v temi nastala N- in C-končni del razcepljenega TetR, vsak v fuziji s proteinom VIVID. Ker se slednji v temi nahaja v monomernem stanju, ni prišlo do povezave razcepljenih delov TetR, zato je bil le-ta neaktiven. V primeru TRU je zato transkripcija GFP potekala nemoteno, v primeru TAU pa je nemoteno potekala transkripcija LacI. Ta je preko vezave na operatorsko mesto na promotoju PTrc onemogočal nastanek GFP.<br /> <br /> Ob osvetljevanju z modro svetlobo je prišlo do dimerizacije proteina VIVID, kar je vodilo v povezavo razcepljenih delov TetR in njegovo aktivacijo. V primeru TRU se je TetR vezal na operatorsko regijo promotorja PTet, zaradi česar se je zaustavilo prepisovanje GFP, v primeru TAU pa je aktivirani TetR blokiral transkripcijo LacI, zato je transkripcija GFP pričela potekati [2].<br /> <br /> ===Priprava post-transkripcijske regulacijske enote ===<br /> Post-transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru količine že nastalih reporterskih proteinov s pomočjo N- in C-končnih razgradnih oznak ter proteaze TEVp. Sestavljena je bila iz post-transkripcijske represijske enote (PRU), ki je bila namenjena razgradnji proteina GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter aktivacijske enote (PAU) z nasprotnim učinkom. Samo kontrolno vezje je bilo pri enotah enako kot pri TRU in TAU, le da je namesto razcepljenega represorja TetR vsebovalo razcepljeno proteazo TEVp. Izhodno vezje pri PRU je bilo enako tistemu pri TRU, le da je bil zapis za GFP fuziran še z N-končnim degronom teF. Izhodno vezje pri PAU je vsebovalo zapis za GFP v fuziji s C-končnim degronom teLAA pod promotorjem PTet.<br /> <br /> V temi je bila razcepljena TEVp neaktivna. Pri PRU zato do razgradnje nastalega GFP ni prišlo, saj je bil N-končni degron neizpostavljen. Ob izpostavitvi modri svetlobi je dimerizacija proteina VIVID omogočila povezavo ter aktivacijo proteaze TEVp, ki je nato preko proteolitične cepitve izpostavila N-končni degron na GFP, zaradi česar je prišlo do njegove razgradnje. Pri PAU je bil efekt nasproten. V temi je C-končna oznaka teLAA na proteinu GFP le-tega vodila v razgradnjo, ob osvetljevanju z modro svetlobo pa je aktivirana proteaza TEVp oznako odstranila, zato se GFP ni razgradil [2]. <br /> <br /> ===Združitev enot v dvoslojno stikalo===<br /> Združitev regulatornih enot v dvoslojno optogenetsko stikalo je omogočalo hkratno kontrolo nad transkripcijo regulatornega proteina GFP in regulacijo količine že nastalega proteina. Zgrajeno je bilo iz transkripcijskega in post-transkripcijskega represijskega sistema (TPRS) ter aktivacijskega sistema (TPAS). Oba sta vsebovala tako kontrolna vezja transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote, razlikovala pa sta se po izhodnih vezjih:<br /> <br /> • TPRS je vseboval enakega kot PRU. Ob osvetljevanju celic z modro svetlobo je aktivirani represor TetR zaustavil transkripcijo GFP, ki se je nahajal pod promotorjem PTet, aktivirana proteaza TEVp pa je s proteolitično cepitvijo izpostavila N-končni degron teF na GFP, zato se je nivo GFP znižal.<br /> • Izhodno vezje TPAS je bilo podobno izhodnemu vezju TAU, le da je bil zapis za LacI prisoten v N-končni fuziji z degronom teF, zapis za GFP pa v C-končni fuziji z degronom DAS. Ob osvetljevanju z modro svetlobo je tako aktiviran TetR zaustavil transkripcijo LacI, aktivirana TEVp pa je s cepitvijo izpostavila N-končni degron, zato se je količina LacI znižala, transkripcija GFP pa je lahko potekala. GFP je sicer nastajal v C-končni fuziji z degronom DAS, ki bi protein načeloma vodil v razgradnjo, vendar je proteaza TEVp oznako odcepila.<br /> <br /> <br /> == Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za regulacijo proizvodnje šikimske kisline ==<br /> <br /> Vključitev na novo razvitih sistemov TPRS in TPAS v šikimatno pot je omogočila nadzor nad delovanjem encimov v le-tej s pomočjo modre svetlobe. Kontrolni vezji z razcepljenima TetR in TEVp sta pri tem ostali enaki, v izhodnih vezjih pa je prišlo do zamenjave GFP z encimi šikimatne poti:<br /> <br /> • V izhodnem vezju sistema TPRS je zapis za GFP nadomestil zapis za šikimat kinazo (AroK), ki šikimsko kislino pretvarja v šikimat 3-fosfat [8]. V temi, ko je AroK nastajala, je zato šikimatna pot potekala vse do aromatskih aminokislin, zaradi česar so celice neovirano rastle. Na svetlobi pa je transkripcija gena zaradi vezave TetR prenehala potekati, že nastali encimi AroK pa so se razgradili zaradi izpostavitve degronske oznake teF na N-koncu encima zaradi delovanja TEVp [2].<br /> • V izhodnem vezju sistema TPAS sta zapis za GFP zamenjala zapisa za 3-deoksi-D-arabinoheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sintazo (AroG) ter 3-dehidrokinat (DHQ) sintazo (AroB), ki sta pomembna pri sami sintezi šikimske kisline [2, 8]. V temi je bil nastanek encimov onemogočen zaradi delovanja represorja LacI, nekontrolirano nastali encimi pa so se razgradili zaradi C-končne degronske oznake DAS. Ob osvetljevanju je prišlo do razgradnje represorja LacI in zaustavitve njegovega nastanka, zato je transkripcija genov za AroG in AroB pričela potekati, nastala encima pa se nista razgradila, saj je aktivirana TEVp odstranila njuno degronsko oznako.<br /> <br /> Sistema TPRS in TPAS sta torej zagotovila bifunkcionalnost samega stikala, pri čemer je TPRS omogočal neovirano rast celic v temi, TPAS pa je ob osvetljevanju z modro svetlobo metabolni fluks preusmeril v proizvodnjo šikimske kisline, kar je povečalo njen izplen in zmanjšalo količino stranskih produktov. <br /> <br /> Vključitev bifunkcionalnega stikala v šasijo E. coli S5 je omogočila nastanek 4,2 g/L šikimske kisline v minimalnem gojišču NBS z dodatkom 20 g/L glukoze, kar je 1,6-krat več kot v celicah brez sinteznobiološkega vezja. Kot optimalni pogoji za gojenje celic so se izkazali temperatura 37 °C, koncentracija glukoze 40 g/L ter pričetek osvetljevanja po 24-urnem gojenju celic v temi. V takšnih pogojih so celice v 72 urah v 5 litrskem bioreaktorju proizvedle 35 g/L šikimske kisline, kar je največji titer šikimske kisline v minimalnem gojišču do zdaj [2]. <br /> <br /> == Viri in literatura ==<br /> <br /> [1] A. Ramazani, A. Shahkarami, Fatemeh Zarei, S. Rezayati, A. Rezaei, A. Bodaghi, L. Youseftabar-Miri: Shikimic acid from staranise (Illicium verum Hook): Extraction, purification and determination. Eurasian Chem. Commun. 2021, 3(7), str. 452–460.<br /> <br /> [2] I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in E. coli. Biotechnol. Biofuels Bioprod. 2022, 15(13), str. 1–14.<br /> <br /> [3] V. Tzin, G. Galili: New Insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants. Mol. Plant 2010, 3(6), str. 956–972.<br /> <br /> [4] J. M. Hurley, C. H. Chen, J. J. Loros, J. C. Dunlap: Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa. G3 Genes, Genomes, Genet. 2012, 2(10), str. 1207–1212.<br /> <br /> [5] A. T. Vaidya, C. H. Chen, J. C. Dunlap, J. J. Loros, B. R. Crane: Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. Sci. Signal. 2011, 4(184).<br /> <br /> [6] B. D. Zoltowski, B. R. Crane: Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. Biochemistry 2008, 47(27), str. 7012–7019.<br /> <br /> [7] A. Stikāne: Degrons, http://2014.igem.org/Team:Edinburgh/project/degrons (pridobljeno 23. 4. 2022).<br /> <br /> [8] D. F. Liu, G. M. Ai, Q. X. Zheng, C. Liu, C. Y. Jiang, L. X. Liu, B. Zhang, Y. M. Liu, C. Yang, S. J. Liu: Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by Bacillus subtilis strains. Microb. Cell Fact. 2014, 13(1), str. 1–11.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izbolj%C5%A1anje_proizvodnje_%C5%A1ikimske_kisline_v_E._coli&diff=20365 2022-04-24T19:44:27Z

<p>Meta Kodrič: New page: Izhodiščni članek: [https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-022-02111-3#citeas I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogen...</p> <hr /> <div>Izhodiščni članek: [https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-022-02111-3#citeas I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in E. coli. Biotechnol. Biofuels Bioprod. 2022, 15(13), str. 1–14.]<br /> <br /> == UVOD ==<br /> <br /> Šikimska kislina je intermediat šikimatne poti, v farmacevtski industriji pa se uporablja kot izhodna surovina za sintezo protivirusne učinkovine oseltamivir, ki se uporablja za zdravljenje gripe. Iz industrijskega vidika je zato pridobivanje večjih količin šikimske kisline izredno pomembno, kar pa je mogoče doseči z izolacijo spojine iz naravnih virov, s kemijsko sintezo ali z mikrobno fermentacijo [1]. Za slednje se uporabljajo sevi E. coli, ki so gensko spremenjeni tako, da omogočajo usmeritev metabolnega fluksa v sintezo šikimske kisline. Pri tem so bili do sedaj v ospredju predvsem različni statični sistemi regulacije (izbijanje tarčnih genov, itd.) pri katerih metabolni fluks sicer usmerimo v želeno biosintezno pot, lahko pa takšne modifikacije obenem vodijo v ustavitev celične rasti zaradi blokade v sintezi esencialnih metabolitov ali nabiranja toksičnih intermediatov [2]. Šikimatna pot se namreč pri šikimski kislini ne ustavi, pač pa se nadaljuje naprej do korizmata, ki je prekurzor za nastanek različnih spojin, pomembnih za rast in delovanje celic, kot so aromatske aminokisline, folna kislina, itd. [3] Reševanje tega problema je sicer možno z dodajanjem aromatskih aminokislin k minimalnemu gojišču, v katerem gojimo celice, vendar so le-te drage. Vedno bolj zato v ospredje prihajajo dinamični sistemi regulacije, ki omogočajo kontrolo nad več konkurenčnimi metabolnimi potmi, s čimer po eni strani zagotavljajo pripravo zadostne količine želenega produkta, po drugi strani pa ohranjanje viabilnosti celic. <br /> <br /> Med dinamične sisteme regulacije sodijo različna sinteznobiološka vezja, med katerimi imajo posebno velik potencial vezja, ki temeljijo na optogenetiki – regulaciji celičnih procesov s pomočjo svetlobe. Le-ta namreč predstavlja reverzibilen vir, ki je v primerjavi s kemičnimi induktorji, ki se jih sicer uporablja za regulacijo, cenejši in celicam netoksičen, poleg tega pa lahko s spreminjanjem njegove jakosti dosežemo različno močne celične odzive [2].<br /> <br /> Optogenetika deluje na principu na-svetlobo-odzivnih proteinov, ki ob osvetljevanju s svetlobo karakteristične valovne dolžine spremenijo svoje lastnosti. Takšen je na primer protein VIVID iz nitaste glive Neurospora crasa, ki deluje kot fotoreceptor za modro svetlobo [4]. V svoji strukturi ima vezan kofaktor FAD, ki na svetlobi tvori cisteinil-flavinski adukt, kar vodi v večje konformacijske spremembe proteina in njegovo dimerizacijo [5, 6]. <br /> <br /> <br /> == POTEK ==<br /> <br /> Sama ideja raziskovalne skupine je bila, da bi s pomočjo svetlobe nadzirali delovanje encimov šikimatne poti, s čimer bi povečali proizvodnjo šikimske kisline, obenem pa zagotovili zadostno količino esencialnih metabolitov v celicah, da ne bi prišlo do zaustavitve rasti. To so dosegli z bifunkcionalnim optogenetskim stikalom, ki je bil obenem dvoslojen - vseboval je tako transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote. Prve delujejo neposredno na DNA, tako da vplivajo na prepisovanje tarčnih genov, vendar pa pri njih prihaja do zakasnjenega in nepopolnega celičnega odziva, saj nimajo vpliva na že nastale proteine. Boljšo učinkovitost se zato doseže s hkratno uporabo post-trasnkripcijskih regulatornih enot, katerih tarča so RNA, oziroma že nastali proteini. Razgradnjo slednjih lahko npr. dosežemo preko uvedbe N- ali C-končnih razgradnih oznak (degronov), ki proteine usmerjajo v razgradnjo [2, 7].<br /> <br /> Sam bifunkcionalni sistem so razvili po manjših korakih, sprva z reporterskim protein GFP:<br /> <br /> ===Priprava transkripcijske regulacijske enote===<br /> Transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru transkripcije reporterskega gena s pomočjo represorja TetR. Sestavljali sta jo tako transkripcijska represijska enota (TRU), ki je bila namenjena zaustavitvi transkripcije gena za GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter transkripcijske aktivacijske enote (TAU) z nasprotnim učinkom. Obe enoti sta kot kontrolno vezje vsebovali zapis za razcepljeni represor TetR, pri čemer sta bila tako N-končni kot C-končni del represorja fuzirana s proteinom VIVID, kar je omogočilo njuno nadzorovanje s pomočjo svetlobe. Izhodno vezje je v primeru TRU vsebovalo zapis za GFP pod promotorjem PTet, v primeru TAU pa zapis za LacI pod promotorjem PTet ter zapis za GFP pod promotorjem PTrc.<br /> <br /> Pri obeh enotah sta v temi nastala N- in C-končni del razcepljenega TetR, vsak v fuziji s proteinom VIVID. Ker se slednji v temi nahaja v monomernem stanju, ni prišlo do povezave razcepljenih delov TetR, zato je bil le-ta neaktiven. V primeru TRU je zato transkripcija GFP potekala nemoteno, v primeru TAU pa je nemoteno potekala transkripcija LacI. Ta je preko vezave na operatorsko mesto na promotoju PTrc onemogočal nastanek GFP.<br /> <br /> Ob osvetljevanju z modro svetlobo je prišlo do dimerizacije proteina VIVID, kar je vodilo v povezavo razcepljenih delov TetR in njegovo aktivacijo. V primeru TRU se je TetR vezal na operatorsko regijo promotorja PTet, zaradi česar se je zaustavilo prepisovanje GFP, v primeru TAU pa je aktivirani TetR blokiral transkripcijo LacI, zato je transkripcija GFP pričela potekati [2].<br /> <br /> ===Priprava post-transkripcijske regulacijske enote ===<br /> Post-transkripcijska regulacijska enota je temeljila na nadzoru količine že nastalih reporterskih proteinov s pomočjo N- in C-končnih razgradnih oznak ter proteaze TEVp. Sestavljena je bila iz post-transkripcijske represijske enote (PRU), ki je bila namenjena razgradnji proteina GFP ob osvetljevanju z modro svetlobo, ter aktivacijske enote (PAU) z nasprotnim učinkom. Samo kontrolno vezje je bilo pri enotah enako kot pri TRU in TAU, le da je namesto razcepljenega represorja TetR vsebovalo razcepljeno proteazo TEVp. Izhodno vezje pri PRU je bilo enako tistemu pri TRU, le da je bil zapis za GFP fuziran še z N-končnim degronom teF. Izhodno vezje pri PAU je vsebovalo zapis za GFP v fuziji s C-končnim degronom teLAA pod promotorjem PTet.<br /> <br /> V temi je bila razcepljena TEVp neaktivna. Pri PRU zato do razgradnje nastalega GFP ni prišlo, saj je bil N-končni degron neizpostavljen. Ob izpostavitvi modri svetlobi je dimerizacija proteina VIVID omogočila povezavo ter aktivacijo proteaze TEVp, ki je nato preko proteolitične cepitve izpostavila N-končni degron na GFP, zaradi česar je prišlo do njegove razgradnje. Pri PAU je bil efekt nasproten. V temi je C-končna oznaka teLAA na proteinu GFP le-tega vodila v razgradnjo, ob osvetljevanju z modro svetlobo pa je aktivirana proteaza TEVp oznako odstranila, zato se GFP ni razgradil [2]. <br /> <br /> ===Združitev enot v dvoslojno stikalo===<br /> Združitev regulatornih enot v dvoslojno optogenetsko stikalo je omogočalo hkratno kontrolo nad transkripcijo regulatornega proteina GFP in regulacijo količine že nastalega proteina. Zgrajeno je bilo iz transkripcijskega in post-transkripcijskega represijskega sistema (TPRS) ter aktivacijskega sistema (TPAS). Oba sta vsebovala tako kontrolna vezja transkripcijske kot post-transkripcijske regulatorne enote, razlikovala pa sta se po izhodnih vezjih:<br /> <br /> • TPRS je vseboval enakega kot PRU. Ob osvetljevanju celic z modro svetlobo je aktivirani represor TetR zaustavil transkripcijo GFP, ki se je nahajal pod promotorjem PTet, aktivirana proteaza TEVp pa je s proteolitično cepitvijo izpostavila N-končni degron teF na GFP, zato se je nivo GFP znižal.<br /> • Izhodno vezje TPAS je bilo podobno izhodnemu vezju TAU, le da je bil zapis za LacI prisoten v N-končni fuziji z degronom teF, zapis za GFP pa v C-končni fuziji z degronom DAS. Ob osvetljevanju z modro svetlobo je tako aktiviran TetR zaustavil transkripcijo LacI, aktivirana TEVp pa je s cepitvijo izpostavila N-končni degron, zato se je količina LacI znižala, transkripcija GFP pa je lahko potekala. GFP je sicer nastajal v C-končni fuziji z degronom DAS, ki bi protein načeloma vodil v razgradnjo, vendar je proteaza TEVp oznako odcepila.<br /> <br /> <br /> == Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za regulacijo proizvodnje šikimske kisline ==<br /> <br /> Vključitev na novo razvitih sistemov TPRS in TPAS v šikimatno pot je omogočila nadzor nad delovanjem encimov v le-tej s pomočjo modre svetlobe. Kontrolni vezji z razcepljenima TetR in TEVp sta pri tem ostali enaki, v izhodnih vezjih pa je prišlo do zamenjave GFP z encimi šikimatne poti:<br /> <br /> • V izhodnem vezju sistema TPRS je zapis za GFP nadomestil zapis za šikimat kinazo (AroK), ki šikimsko kislino pretvarja v šikimat 3-fosfat [8]. V temi, ko je AroK nastajala, je zato šikimatna pot potekala vse do aromatskih aminokislin, zaradi česar so celice neovirano rastle. Na svetlobi pa je transkripcija gena zaradi vezave TetR prenehala potekati, že nastali encimi AroK pa so se razgradili zaradi izpostavitve degronske oznake teF na N-koncu encima zaradi delovanja TEVp [2].<br /> • V izhodnem vezju sistema TPAS sta zapis za GFP zamenjala zapisa za 3-deoksi-D-arabinoheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sintazo (AroG) ter 3-dehidrokinat (DHQ) sintazo (AroB), ki sta pomembna pri sami sintezi šikimske kisline [2, 8]. V temi je bil nastanek encimov onemogočen zaradi delovanja represorja LacI, nekontrolirano nastali encimi pa so se razgradili zaradi C-končne degronske oznake DAS. Ob osvetljevanju je prišlo do razgradnje represorja LacI in zaustavitve njegovega nastanka, zato je transkripcija genov za AroG in AroB pričela potekati, nastala encima pa se nista razgradila, saj je aktivirana TEVp odstranila njuno degronsko oznako.<br /> <br /> Sistema TPRS in TPAS sta torej zagotovila bifunkcionalnost samega stikala, pri čemer je TPRS omogočal neovirano rast celic v temi, TPAS pa je ob osvetljevanju z modro svetlobo metabolni fluks preusmeril v proizvodnjo šikimske kisline, kar je povečalo njen izplen in zmanjšalo količino stranskih produktov. <br /> <br /> Vključitev bifunkcionalnega stikala v šasijo E. coli S5 je omogočila nastanek 4,2 g/L šikimske kisline v minimalnem gojišču NBS z dodatkom 20 g/L glukoze, kar je 1,6-krat več kot v celicah brez sinteznobiološkega vezja. Kot optimalni pogoji za gojenje celic so se izkazali temperatura 37 °C, koncentracija glukoze 40 g/L ter pričetek osvetljevanja po 24-urnem gojenju celic v temi. V takšnih pogojih so celice v 72 urah v 5 litrskem bioreaktorju proizvedle 35 g/L šikimske kisline, kar je največji titer šikimske kisline v minimalnem gojišču do zdaj [2]. <br /> <br /> == Viri in literatura ==<br /> <br /> [1] A. Ramazani, A. Shahkarami, Fatemeh Zarei, S. Rezayati, A. Rezaei, A. Bodaghi, L. Youseftabar-Miri: Shikimic acid from staranise (Illicium verum Hook): Extraction, purification and determination. Eurasian Chem. Commun. 2021, 3(7), str. 452–460.<br /> <br /> [2] I. Komera, C. Gao, L. Guo, G. Hu, X. Chen, L. Liu: Bifunctional optogenetic switch for improving shikimic acid production in E. coli. Biotechnol. Biofuels Bioprod. 2022, 15(13), str. 1–14.<br /> <br /> [3] V. Tzin, G. Galili: New Insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants. Mol. Plant 2010, 3(6), str. 956–972.<br /> <br /> [4] J. M. Hurley, C. H. Chen, J. J. Loros, J. C. Dunlap: Light-inducible system for tunable protein expression in neurospora crassa. G3 Genes, Genomes, Genet. 2012, 2(10), str. 1207–1212.<br /> <br /> [5] A. T. Vaidya, C. H. Chen, J. C. Dunlap, J. J. Loros, B. R. Crane: Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. Sci. Signal. 2011, 4(184).<br /> <br /> [6] B. D. Zoltowski, B. R. Crane: Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. Biochemistry 2008, 47(27), str. 7012–7019.<br /> <br /> [7] A. Stikāne: Degrons, http://2014.igem.org/Team:Edinburgh/project/degrons (pridobljeno 23. 4. 2022).<br /> <br /> [8] D. F. Liu, G. M. Ai, Q. X. Zheng, C. Liu, C. Y. Jiang, L. X. Liu, B. Zhang, Y. M. Liu, C. Yang, S. J. Liu: Metabolic flux responses to genetic modification for shikimic acid production by Bacillus subtilis strains. Microb. Cell Fact. 2014, 13(1), str. 1–11.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2021/22&diff=20364 2022-04-24T19:34:08Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_E._coli Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) &lt;br&gt;<br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2021/22&diff=20363 2022-04-24T19:33:55Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_''E._coli'' Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) &lt;br&gt;<br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2021/22&diff=20362 2022-04-24T19:33:33Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_E._coli Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) &lt;br&gt;<br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2021/22&diff=20361 2022-04-24T19:33:05Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_''E. coli'' Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) &lt;br&gt;<br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2021/22&diff=20360 2022-04-24T19:31:29Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) &lt;br&gt;<br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2021/22&diff=20359 2022-04-24T19:31:13Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v E. coli] (Meta Kodrič)<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) &lt;br&gt;<br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2021/22&diff=20358 2022-04-24T19:30:49Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v E. coli] (Meta Kodrič)<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) &lt;br&gt;<br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2021/22&diff=20357 2022-04-24T19:29:37Z

<p>Meta Kodrič: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_E._coli] (Meta Kodrič)<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) &lt;br&gt;<br /> <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) &lt;br&gt;<br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Struktura_in_mehanizem_restriktaz_tipa_II&diff=15582 2019-04-14T09:20:53Z

<p>Meta Kodrič: /* Struktura */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo. <br /> <br /> Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.<br /> <br /> ==Restriktaze tipa II==<br /> Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.<br /> <br /> Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).<br /> <br /> Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.<br /> <br /> • Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve. <br /> <br /> • Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP. <br /> <br /> • Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti. <br /> <br /> • Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.<br /> <br /> • Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja. <br /> <br /> • Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.<br /> <br /> ==Struktura==<br /> Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.<br /> <br /> V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).<br /> <br /> S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD...D/ExK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze in endonukleaze ''Mut''H, ''Rec''B, VSR ter T7I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom, zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi . <br /> <br /> Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.<br /> Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.<br /> <br /> ==Mehanizem==<br /> Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere več kot 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.<br /> <br /> Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene. <br /> <br /> Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II pri vezavi na DNA in njeni cepitvi sodelujeta. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati. <br /> <br /> Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.<br /> <br /> ==Viri in literatura==<br /> <br /> *Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327. DOI: https://doi.org/10.1038/nrmicro2315.<br /> *Pingoud, A., Wilson, G. G., Wende, W. Type II restriction endonucleases – a historical perspective and more. ''Nucleic Acids Research'', 2014, let. 42 (12), str. 7489–7527. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gku447<br /> *Pingoud, A., Jeltsch, A. Structure and function of type II restriction endonucleases. ''Nucleic Acids Research'', 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727.<br /> *Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ''et. al.'' Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. ''Cellular and Molecular Life Science''s, 2005, let. 62, str. 685-707. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-004-4513-1.<br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Struktura_in_mehanizem_restriktaz_tipa_II&diff=15560 2019-04-14T07:51:12Z

<p>Meta Kodrič: /* Viri in literatura */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo. <br /> <br /> Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.<br /> <br /> ==Restriktaze tipa II==<br /> Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.<br /> <br /> Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).<br /> <br /> Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.<br /> <br /> • Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve. <br /> <br /> • Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP. <br /> <br /> • Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti. <br /> <br /> • Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.<br /> <br /> • Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja. <br /> <br /> • Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.<br /> <br /> ==Struktura==<br /> Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.<br /> <br /> V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).<br /> <br /> S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB endonukleaze, VSR endonukleaze in T7 nukleazo I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom, zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi . <br /> <br /> Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.<br /> Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.<br /> <br /> ==Mehanizem==<br /> Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere več kot 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.<br /> <br /> Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene. <br /> <br /> Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II pri vezavi na DNA in njeni cepitvi sodelujeta. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati. <br /> <br /> Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.<br /> <br /> ==Viri in literatura==<br /> <br /> *Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327. DOI: https://doi.org/10.1038/nrmicro2315.<br /> *Pingoud, A., Wilson, G. G., Wende, W. Type II restriction endonucleases – a historical perspective and more. ''Nucleic Acids Research'', 2014, let. 42 (12), str. 7489–7527. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gku447<br /> *Pingoud, A., Jeltsch, A. Structure and function of type II restriction endonucleases. ''Nucleic Acids Research'', 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727.<br /> *Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ''et. al.'' Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. ''Cellular and Molecular Life Science''s, 2005, let. 62, str. 685-707. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-004-4513-1.<br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Struktura_in_mehanizem_restriktaz_tipa_II&diff=15559 2019-04-14T07:50:55Z

<p>Meta Kodrič: /* Viri in literatura */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo. <br /> <br /> Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.<br /> <br /> ==Restriktaze tipa II==<br /> Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.<br /> <br /> Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).<br /> <br /> Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.<br /> <br /> • Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve. <br /> <br /> • Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP. <br /> <br /> • Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti. <br /> <br /> • Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.<br /> <br /> • Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja. <br /> <br /> • Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.<br /> <br /> ==Struktura==<br /> Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.<br /> <br /> V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).<br /> <br /> S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB endonukleaze, VSR endonukleaze in T7 nukleazo I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom, zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi . <br /> <br /> Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.<br /> Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.<br /> <br /> ==Mehanizem==<br /> Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere več kot 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.<br /> <br /> Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene. <br /> <br /> Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II pri vezavi na DNA in njeni cepitvi sodelujeta. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati. <br /> <br /> Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.<br /> <br /> ==Viri in literatura==<br /> <br /> *Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327. DOI: https://doi.org/10.1038/nrmicro2315.<br /> *Pingoud, A., Wilson G. G., Wende W. Type II restriction endonucleases – a historical perspective and more. ''Nucleic Acids Research'', 2014, let. 42 (12), str. 7489–7527. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gku447<br /> *Pingoud, A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases. ''Nucleic Acids Research'', 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727.<br /> *Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ''et. al.'' Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. ''Cellular and Molecular Life Science''s, 2005, let. 62, str. 685-707. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-004-4513-1.<br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Struktura_in_mehanizem_restriktaz_tipa_II&diff=15555 2019-04-14T07:37:35Z

<p>Meta Kodrič: /* Viri in literatura */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo. <br /> <br /> Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.<br /> <br /> ==Restriktaze tipa II==<br /> Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.<br /> <br /> Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).<br /> <br /> Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.<br /> <br /> • Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve. <br /> <br /> • Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP. <br /> <br /> • Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti. <br /> <br /> • Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.<br /> <br /> • Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja. <br /> <br /> • Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.<br /> <br /> ==Struktura==<br /> Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.<br /> <br /> V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki, ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).<br /> <br /> S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB endonukleaze, VSR endonukleaze in T7 nukleazo I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama [3]. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom , zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi . <br /> <br /> Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.<br /> Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.<br /> <br /> ==Mehanizem==<br /> Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere več kot 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.<br /> <br /> Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene. <br /> <br /> Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II pri vezavi na DNA in njeni cepitvi sodelujeta. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati. <br /> <br /> Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.<br /> <br /> ==Viri in literatura==<br /> <br /> *Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327. DOI: https://doi.org/10.1038/nrmicro2315.<br /> *Pingoud A., Wilson G. G., Wende W. Type II restriction endonucleases – a historical perspective and more. ''Nucleic Acids Research'', 2014, let. 42 (12), str. 7489–7527. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gku447<br /> *Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases. ''Nucleic Acids Research'', 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727. PubMed PMID: 11557805; PubMed Central PMCID: PMC55916.<br /> *Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ''et. al.'' Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. ''Cellular and Molecular Life Science''s, 2005, let. 62, str. 685-707. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-004-4513-1.<br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Struktura_in_mehanizem_restriktaz_tipa_II&diff=15554 2019-04-14T07:36:22Z

<p>Meta Kodrič: /* Viri in literatura */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo. <br /> <br /> Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.<br /> <br /> ==Restriktaze tipa II==<br /> Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.<br /> <br /> Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).<br /> <br /> Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.<br /> <br /> • Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve. <br /> <br /> • Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP. <br /> <br /> • Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti. <br /> <br /> • Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.<br /> <br /> • Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja. <br /> <br /> • Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.<br /> <br /> ==Struktura==<br /> Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.<br /> <br /> V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki, ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).<br /> <br /> S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB endonukleaze, VSR endonukleaze in T7 nukleazo I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama [3]. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom , zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi . <br /> <br /> Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.<br /> Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.<br /> <br /> ==Mehanizem==<br /> Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere več kot 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.<br /> <br /> Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene. <br /> <br /> Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II pri vezavi na DNA in njeni cepitvi sodelujeta. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati. <br /> <br /> Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.<br /> <br /> ==Viri in literatura==<br /> <br /> *Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327. DOI: https://doi.org/10.1038/nrmicro2315.<br /> *Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases. ''Nucleic Acids Research'', 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727. PubMed PMID: 11557805; PubMed Central PMCID: PMC55916.<br /> *Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ''et. al.'' Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. ''Cellular and Molecular Life Science''s, 2005, let. 62, str. 685-707. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-004-4513-1.<br /> *Pingoud A., Wilson G. G., Wende W. Type II restriction endonucleases – a historical perspective and more. ''Nucleic Acids Research'', 2014, let. 42 (12), str. 7489–7527. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gku447<br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Struktura_in_mehanizem_restriktaz_tipa_II&diff=15552 2019-04-14T07:35:25Z

<p>Meta Kodrič: /* Restriktaze tipa II */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo. <br /> <br /> Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.<br /> <br /> ==Restriktaze tipa II==<br /> Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.<br /> <br /> Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).<br /> <br /> Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.<br /> <br /> • Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve. <br /> <br /> • Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP. <br /> <br /> • Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti. <br /> <br /> • Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.<br /> <br /> • Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja. <br /> <br /> • Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.<br /> <br /> ==Struktura==<br /> Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.<br /> <br /> V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki, ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).<br /> <br /> S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB endonukleaze, VSR endonukleaze in T7 nukleazo I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama [3]. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom , zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi . <br /> <br /> Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.<br /> Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.<br /> <br /> ==Mehanizem==<br /> Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere več kot 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.<br /> <br /> Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene. <br /> <br /> Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II pri vezavi na DNA in njeni cepitvi sodelujeta. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati. <br /> <br /> Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.<br /> <br /> ==Viri in literatura==<br /> <br /> *Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327. DOI: https://doi.org/10.1038/nrmicro2315.<br /> *Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases. ''Nucleic Acids Research'', 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727.<br /> *Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ''et. al.'' Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. ''Cellular and Molecular Life Science''s, 2005, let. 62, str. 685-707. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-004-4513-1.<br /> *Pingoud A., Wilson G. G., Wende W. Type II restriction endonucleases – a historical perspective and more. ''Nucleic Acids Research'', 2014, let. 42 (12), str. 7489–7527.<br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Struktura_in_mehanizem_restriktaz_tipa_II&diff=15551 2019-04-14T07:35:05Z

<p>Meta Kodrič: /* Restriktaze tipa II */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo. <br /> <br /> Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.<br /> <br /> ==Restriktaze tipa II==<br /> Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.<br /> <br /> Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).<br /> <br /> Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.<br /> *• Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve. <br /> *• Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP. <br /> *• Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti. <br /> *• Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.<br /> *• Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja. <br /> *• Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.<br /> <br /> ==Struktura==<br /> Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.<br /> <br /> V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki, ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).<br /> <br /> S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB endonukleaze, VSR endonukleaze in T7 nukleazo I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama [3]. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom , zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi . <br /> <br /> Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.<br /> Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.<br /> <br /> ==Mehanizem==<br /> Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere več kot 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.<br /> <br /> Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene. <br /> <br /> Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II pri vezavi na DNA in njeni cepitvi sodelujeta. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati. <br /> <br /> Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.<br /> <br /> ==Viri in literatura==<br /> <br /> *Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327. DOI: https://doi.org/10.1038/nrmicro2315.<br /> *Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases. ''Nucleic Acids Research'', 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727.<br /> *Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ''et. al.'' Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. ''Cellular and Molecular Life Science''s, 2005, let. 62, str. 685-707. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-004-4513-1.<br /> *Pingoud A., Wilson G. G., Wende W. Type II restriction endonucleases – a historical perspective and more. ''Nucleic Acids Research'', 2014, let. 42 (12), str. 7489–7527.<br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Struktura_in_mehanizem_restriktaz_tipa_II&diff=15550 2019-04-14T07:34:29Z

<p>Meta Kodrič: /* Viri in literatura */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo. <br /> <br /> Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.<br /> <br /> ==Restriktaze tipa II==<br /> Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.<br /> <br /> Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).<br /> <br /> Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.<br /> <br /> • Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve. <br /> <br /> • Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP. <br /> <br /> • Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti. <br /> <br /> • Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.<br /> <br /> • Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja. <br /> <br /> • Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.<br /> <br /> ==Struktura==<br /> Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.<br /> <br /> V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki, ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).<br /> <br /> S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB endonukleaze, VSR endonukleaze in T7 nukleazo I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama [3]. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom , zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi . <br /> <br /> Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.<br /> Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.<br /> <br /> ==Mehanizem==<br /> Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere več kot 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.<br /> <br /> Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene. <br /> <br /> Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II pri vezavi na DNA in njeni cepitvi sodelujeta. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati. <br /> <br /> Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.<br /> <br /> ==Viri in literatura==<br /> <br /> *Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327. DOI: https://doi.org/10.1038/nrmicro2315.<br /> *Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases. ''Nucleic Acids Research'', 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727.<br /> *Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ''et. al.'' Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. ''Cellular and Molecular Life Science''s, 2005, let. 62, str. 685-707. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-004-4513-1.<br /> *Pingoud A., Wilson G. G., Wende W. Type II restriction endonucleases – a historical perspective and more. ''Nucleic Acids Research'', 2014, let. 42 (12), str. 7489–7527.<br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Struktura_in_mehanizem_restriktaz_tipa_II&diff=15549 2019-04-14T07:34:11Z

<p>Meta Kodrič: /* Viri in literatura */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo. <br /> <br /> Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.<br /> <br /> ==Restriktaze tipa II==<br /> Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.<br /> <br /> Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).<br /> <br /> Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.<br /> <br /> • Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve. <br /> <br /> • Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP. <br /> <br /> • Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti. <br /> <br /> • Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.<br /> <br /> • Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja. <br /> <br /> • Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.<br /> <br /> ==Struktura==<br /> Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.<br /> <br /> V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki, ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).<br /> <br /> S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB endonukleaze, VSR endonukleaze in T7 nukleazo I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama [3]. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom , zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi . <br /> <br /> Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.<br /> Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.<br /> <br /> ==Mehanizem==<br /> Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere več kot 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.<br /> <br /> Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene. <br /> <br /> Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II pri vezavi na DNA in njeni cepitvi sodelujeta. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati. <br /> <br /> Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.<br /> <br /> ==Viri in literatura==<br /> <br /> *Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327. DOI: https://doi.org/10.1038/nrmicro2315.<br /> *Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases. ''Nucleic Acids Research'', 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727.<br /> *Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ''et. al.'' Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. ''Cellular and Molecular Life Science''s, 2005, let. 62, str. 685-707. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-004-4513-1.<br /> *Pingoud A., Wilson G. G., Wende W. Type II restriction endonucleases – a historical perspective and more. ''Nucleic Acids Research'', 2014, let. 42 (12), str. 7489–7527. DOI: https://doi: 10.1093/nar/gkw513.<br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Struktura_in_mehanizem_restriktaz_tipa_II&diff=15547 2019-04-14T07:32:05Z

<p>Meta Kodrič: /* Viri in literatura */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo. <br /> <br /> Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.<br /> <br /> ==Restriktaze tipa II==<br /> Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.<br /> <br /> Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).<br /> <br /> Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.<br /> <br /> • Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve. <br /> <br /> • Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP. <br /> <br /> • Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti. <br /> <br /> • Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.<br /> <br /> • Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja. <br /> <br /> • Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.<br /> <br /> ==Struktura==<br /> Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.<br /> <br /> V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki, ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).<br /> <br /> S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB endonukleaze, VSR endonukleaze in T7 nukleazo I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama [3]. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom , zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi . <br /> <br /> Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.<br /> Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.<br /> <br /> ==Mehanizem==<br /> Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere več kot 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.<br /> <br /> Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene. <br /> <br /> Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II pri vezavi na DNA in njeni cepitvi sodelujeta. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati. <br /> <br /> Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.<br /> <br /> ==Viri in literatura==<br /> <br /> *Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327.<br /> *Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases. ''Nucleic Acids Research'', 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727.<br /> *Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ''et. al.'' Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. ''Cellular and Molecular Life Science''s, 2005, let. 62, str. 685-707. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-004-4513-1.<br /> *Pingoud A., Wilson G. G., Wende W. Type II restriction endonucleases – a historical perspective and more. ''Nucleic Acids Research'', 2014, let. 42 (12), str. 7489–7527.<br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Struktura_in_mehanizem_restriktaz_tipa_II&diff=15546 2019-04-14T07:31:55Z

<p>Meta Kodrič: /* Viri in literatura */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo. <br /> <br /> Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.<br /> <br /> ==Restriktaze tipa II==<br /> Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.<br /> <br /> Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).<br /> <br /> Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.<br /> <br /> • Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve. <br /> <br /> • Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP. <br /> <br /> • Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti. <br /> <br /> • Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.<br /> <br /> • Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja. <br /> <br /> • Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.<br /> <br /> ==Struktura==<br /> Prvo kristalno strukturo restrikcijske endonukleaze so uspeli določiti leta 1986, in sicer strukturo kompleksa DNA in restriktaze ''Eco''RI, ki je predstavnica podtipa IIP. Izolirana je bila v obliki oligomerov iz 12 oziroma 13 med sabo komplementarnih domen in brez prisotnosti magnezijevega iona, ki bi lahko povzročil cepitev DNA. Čeprav je bila resolucija za današnje razmere precej slaba, je struktura prikazovala interakcije med proteinom in prepoznavnim zaporedjem DNA na atomskem nivoju. Kristalografske metode so od takrat močno napredovale, tako je bilo leta 2005 določenih okrog 20 kristalnih struktur, do danes pa jih je znanih že preko 30.<br /> <br /> V izolirani kristalni strukturi se restrikcijske endonukleaze večinoma nahajajo kot monomeri, v resnici pa v nativnem stanju dimerizirajo. Do dimerizacije lahko pride že v prosti obliki, ali šele ob stiku z DNA (na primer pri restriktazi tipa IIS ''Fok''I). Poznane so tudi vrste, kjer naj bi bilo prisotno ravnotežje med monomernim in dimernim stanjem, saj vsaka od podenot cepi samo 1 verigo DNA. Tipične restriktaze tipa II so homodimeri, katerih vsaka podenota ja iz ene domene, ki jo sestavljajo poddomene za prepoznavo DNA, cepitev DNA in dimerizacijo. Za podtipa IIE in IIS pa je značilno, da vsako podenoto sestavljata katalitična domena PD...D/ExK in DNA-vezavna domena, ki se nadalje deli na efektorsko in prepoznavno poddomeno ter spominja na DNA-vezavno domeno CAP proteinov (vijačnica-zavoj-vijačnica).<br /> <br /> S študijem kristalnih in kokristalnih struktur je bilo ugotovljeno, da večino restriktaz spada v naddružino fosfodiesteraz PD-D/EXK, ki poleg restrikcijkih endonukleaz zajema še λ-eksonukleaze, MutH, RecB endonukleaze, VSR endonukleaze in T7 nukleazo I. Za vse je značilno podobno jedro, ki zajema aktivno mesto in predstavlja stabilizacijski center proteina. Sestavlja ga mešana β-ploskev iz štirih trakov, obdana z 2 α-vijačnicama [3]. Ker je bila takšna topologija (αβββαβ) z nekaterimi variacijami najdena v skoraj vseh do sedaj določenih strukturah restriktaz tipa II, je v podatkovni bazi SCOP (''ang. Structural Classification of Proteins'') klasificirana kot zvitje značilno za restrikcijske endonukleaze (''ang. R Ease-like fold''). Znano je, da drugi in tretji β-trak predstavljata ogrodje katalitičnega mesta, saj so njuni aminokislinski ostanki direktno vključeni v katalitični mehanizem cepitve. Orientacija petega β-traku pa predstavlja tipično razliko med restriktazama podtipa IIP ''Eco''RI in ''Eco''RV, katerih struktura je najbolje raziskana. V jedru EcoRI je peti trak paralelen ostalim trakom , zato se ta restriktaza lažje približa velikemu žlebu DNA in prepozna specifično zaporedje preko α-vijačnice in zanke ter večinoma tvori lepljive konce s 5'-previsi. Pri EcoRV pa je peti β-trak antiparalelen, zato restriktaza lažje dostopa do malega žleba DNA, prepoznavno domeno pa sestavljata značilen β-trak in zavoj. Ta vrsta restirktaze za razliko od prejšnje tvori tope konce ali lepljive s 3'-previsi . <br /> <br /> Poleg naddružine fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD...D/ExK spadajo nekatere restriktaze tipa II tudi med fosfodiesteraze, ki za katalitsko cepitev ne potrebujejo Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Bioinformatika pa nakazuje, da naj bi obstajale še restriktaze sorodne H-N-H in GIY-YIG sledilnim endonukleazam, ki so aktivne v prisotnosti Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.<br /> Pomembna strukturna značilnost restrikcijskih endonukleaz tipa II je, da obstajajo v dveh konformacijskih oblikah. Struktura prostega encima je tako zaprta, da je DNA-vezavno mesto nedostopno, zato mora encim za uspešno vezavo in katalitično cepitev preiti v tako imenovano odprto strukturo. Prehod med zaprto in odprto strukturo je deloma posledica oscilacije, odvisen pa je tudi od asociacije z DNA. Za ''Eco''RV je značilno, da ima dve ločeni vezavni mesti, vezava DNA na zunanje mesto odpre vrata do notranjega mesta, kamor se veže drug del DNA in s tem je omogočena katalitična cepitev.<br /> <br /> ==Mehanizem==<br /> Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere več kot 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.<br /> <br /> Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene. <br /> <br /> Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II pri vezavi na DNA in njeni cepitvi sodelujeta. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati. <br /> <br /> Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.<br /> <br /> ==Viri in literatura==<br /> <br /> *Labrie, S. J. ''et. al.'' Bacteriophage resistance mechanisms. ''Nature Reviews Microbiology'', 2010, let. 8, str. 317-327.<br /> *Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases. ''Nucleic Acids Research'', 2001, let. 29 (18), str. 3705-3727.<br /> *Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ''et. al.'' Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. ''Cellular and Molecular Life Science''s, 2005, let. 62, str. 685-707. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-004-4513-1.<br /> **Pingoud A., Wilson G. G., Wende W. Type II restriction endonucleases – a historical perspective and more. ''Nucleic Acids Research'', 2014, let. 42 (12), str. 7489–7527.<br /> [[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Struktura_in_mehanizem_restriktaz_tipa_II&diff=15532 2019-04-14T07:06:24Z

<p>Meta Kodrič: /* Restriktaze tipa II */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo. <br /> <br /> Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.<br /> <br /> ==Restriktaze tipa II==<br /> Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg2+, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.<br /> <br /> Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).<br /> <br /> Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.<br /> <br /> • Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve. <br /> <br /> • Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP. <br /> <br /> • Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti. <br /> <br /> • Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.<br /> <br /> • Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja. <br /> <br /> • Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.<br /> <br /> ==Mehanizem==<br /> Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere nad 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.<br /> <br /> Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene. <br /> <br /> Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II sodelujeta pri vezavi na DNA in njeni cepitvi. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati. <br /> <br /> Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2-. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg2+. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Struktura_in_mehanizem_restriktaz_tipa_II&diff=15531 2019-04-14T07:05:20Z

<p>Meta Kodrič: /* Restriktaze tipa II */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo. <br /> <br /> Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.<br /> <br /> ==Restriktaze tipa II==<br /> Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg2+, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.<br /> <br /> Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. ''Eco''RI in ''Rsr''I: G|AATTC).<br /> <br /> Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.<br /> <br /> •Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve. <br /> <br /> •Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP. <br /> <br /> •Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti. <br /> <br /> •Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.<br /> <br /> •Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja. <br /> <br /> •Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.<br /> <br /> ==Mehanizem==<br /> Nespecifičnih mest na DNA je v primerjavi s specifičnimi veliko več, zato se restrikcijska endonukleaza najprej veže na neko nespecifično mesto in se nato z olajšano difuzijo premika do prepoznavnega mesta. Z olajšano difuzijo je proces iskanja precej hitrejši, pri tem pa lahko ob eni vezavi restriktaza prebere nad 1000 baznih parov. Trije najbolj verjetni mehanizmi olajšane difuzije so drsenje, skakanje in preskakovanje odsekov. Pri drsenju ostane encim med iskanjem specifičnega mesta ves čas vezan na DNA, s čimer encim ne more zgrešiti specifičnega mesta. Prisotnost drugih proteinov, nenavadne strukture DNA ali trojna vijačnica pri tem predstavljajo veliko oviro. Pri skakanju gre za disociacijo encima in nato ponovno asociacijo z isto molekulo DNA, običajno nekje blizu mesta disociacije. Glede na velikost skoka lahko encim spregleda specifično mesto, vendar pa na ta način restriktaza lažje preide ovire. Nekateri viri zato navajajo, da je način premikanja kombinacija obeh mehanizmov. Tretji način pa je možen le pri restriktazah z dvema DNA-vezavnima domenama, pri čemer se ena domena odcepi od DNA, z drugo pa je encim še vedno vezan. Prosta domena se nato lahko ponovno veže na DNA, tudi na bolj oddaljeno mesto, pri čemer se pogosto tvorijo zanke v strukturi DNA. Ta način je učinkovit predvsem pri premikanju preko daljših razdalj.<br /> <br /> Pri prehodu med specifično in nespecifično vezavo pride do sprememb v solvataciji. Ocenjeno je, da pri nespecifični vezavi sodeluje približno 100 molekul vode več, kar nakazuje na to, da je specifična vezava precej močnejša od nespecifične. Pri specifični vezavi nastane veliko vodikovih vezi med encimom in bazami ter encimom in ogrodjem DNA, poleg tega pa so prisotne še van der Waalsove in hidrofobne interakcije z bazami. Ob specifični vezavi med encimom in DNA pride do konformacijskih sprememb tako na DNA kot tudi na encimu, s čimer postane vezava močnejša, funkcionalne skupine, ki sodelujejo pri sami hidrolizi, pa so za reakcijo bolje razporejene. <br /> <br /> Podenoti homodimera pri večini restriktaz tipa II sodelujeta pri vezavi na DNA in njeni cepitvi. Po prepoznanem specifičnem mestu in vezavi pride do reakcije, ki pri večini poteka v dveh katalitičnih mestih. Do cepitve pride le ob vzpostavitvi vseh bazno specifičnih interakcij, cepitev pa poteče na obeh vijačnicah hkrati. <br /> <br /> Mehanizem reakcije je nukleofilna substitucija, pri kateri molekula vode predstavlja nukleofil. Molekula se mora za napad najprej deprotonirati, kar predstavlja prvi korak hidrolize. Za najbolj verjetno pot deprotonacije se je izkazala deprotonacija z drugo molekulo vode. V drugi stopnji hidroksidni ion napade fosfat, pri čemer nastane petvalentni intermediat z nabojem 2-. Prebitek negativnega naboja stabilizirajo dvovalentni kovinski ioni, običajno Mg2+. Zadnji korak hidrolize je izstop 3'-oksianiona, ki se nato s pomočjo kisline še protonira. Mehanizmi se kljub podobnosti v zgradbi aktivnega mesta med restriktazami precej razlikujejo. Do največjih razhajanj prihaja pri določevanju števila kovinskih kationov, ki sodelujejo pri reakciji. Predlagani so trije modeli mehanizma cepitve: mehanizem z enim, dvema ali tremi kovinskimi ioni. Najbolj verjetno je, da je za cepitev potreben le en kovinski ion, dodatni pa lahko spodbujajo ali inhibirajo delovanje restriktaze.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Struktura_in_mehanizem_restriktaz_tipa_II&diff=15529 2019-04-14T07:04:50Z

<p>Meta Kodrič: /* Restriktaze tipa II */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo. <br /> <br /> Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.<br /> <br /> ==Restriktaze tipa II==<br /> Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg2+, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.<br /> <br /> Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. EcoRI in RsrI: G|AATTC).<br /> <br /> Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.<br /> <br /> •Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve. <br /> <br /> •Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP. <br /> <br /> •Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti. <br /> <br /> •Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.<br /> <br /> •Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja. <br /> <br /> •Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Struktura_in_mehanizem_restriktaz_tipa_II&diff=15528 2019-04-14T07:04:07Z

<p>Meta Kodrič: /* Uvod */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo. <br /> <br /> Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.<br /> <br /> ==Restriktaze tipa II==<br /> Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg2+, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.<br /> Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. EcoRI in RsrI: G|AATTC).<br /> Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.<br /> <br /> •Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve. <br /> <br /> •Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP. <br /> <br /> •Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti. <br /> <br /> •Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.<br /> <br /> •Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja. <br /> <br /> •Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.</div>

Meta Kodrič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Struktura_in_mehanizem_restriktaz_tipa_II&diff=15527 2019-04-14T07:03:24Z

<p>Meta Kodrič: /* Restriktaze tipa II */</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Restrikcijske endonukleaze so encimi, prisotni v prokariontskih organizmih, ki se kot del restrikcijsko-modifikacijskega sistema bojujejo proti okužbi s tujo DNA. Po vstopu bakteriofagne DNA v notranjost gostiteljske celice restriktaze le-to na specifičnih mestih cepijo. S tem onemogočijo potek nadaljnjih stopenj v replikacijskem ciklu bakteriofaga. Dedni zapis bakterije mora biti pred delovanjem restriktaz ustrezno zaščiten, za kar poskrbijo encimi metiltransferaze, ki gostiteljsko DNA metilirajo. Hemimetilirane oziroma metilirane DNA restriktaze namreč načeloma ne cepijo. <br /> Znanih je pet tipov restrikcijskih endonukleaz, ki se med seboj razlikujejo po strukturi, mehanizmu cepitve DNA in potrebnih kofaktorjih, ki pri cepitvi sodelujejo.<br /> <br /> ==Restriktaze tipa II==<br /> Restrikcijske endonukleaze tipa II so najbolj številčna skupina restriktaz. Znanih je več kot 3000 encimov, ki jih lahko uvrstimo v ta tip. Vsem njenim predstavnikom je skupno, da molekulo DNA cepijo na prepoznavnem zaporedju ali v njegovi neposredni bližini. Po cepitvi nastaneta dva fragmenta dvoverižne DNA s 5'-fosfatnim in 3'-OH koncem. Konci so lahko lepljivi s 5'-previsi ali 3'-previsi oziroma topi. Za svoje delovanje potrebujejo Mg2+, za razliko od ostalih tipov restriktaz pa ne potrebujejo kofaktorja ATP.<br /> Primerjava aminokislinskega zaporedja več predstavnikov restriktaz tipa II pokaže, da so si le-ti med seboj precej različni. Nekoliko bolj podobni so si le v aminokislinskem zaporedju katalitskega mesta. Večina restriktaz tipa II namreč sodi v naddružino fosfodiesteraz s katalitskim mestom PD…D/ExK. Gre torej za zelo heterogeno skupino encimov, velika raznolikost pa je odraz divergentne evolucije in horizontalnega prenosa genov med bakterijami. Večjo podobnost v aminokislinskem zaporedju kažejo izoshizomeri. To so encimi, ki prepoznavajo enako nukleotidno zaporedje in DNA cepijo na enakem mestu (npr. EcoRI in RsrI: G|AATTC).<br /> Precej bolj kot v aminokislinskem zaporedju so si restriktaze tipa II podobne po fenotipu – strukturi in mehanizmu delovanja. Razdelimo jih lahko na 11 podtipov: A, B, C, E, F, G, H, M, P, S in T, ki pa se med seboj ne izključujejo. Določen encim lahko torej uvrščamo v več podtipov hkrati.<br /> <br /> •Najbolj zastopan je podtip IIP, ki je obenem tudi najbolj heterogen. Znani predstavniki so ''Eco''RI, ''Eco''RV in ''Bgl''I. Encimi podtipa IIP se večinoma pojavljajo v obliki homodimerov, oziroma homotetramerov. Oligomerizacija jim omogoča hkratno prepoznavanje in kasneje tudi hkratno cepitev obeh verig dvojne vijačnice. Restriktaze tipa IIP na molekuli DNA prepoznajo specifična palindromska zaporedja, dolga 4-8 baznih parov, ki obenem predstavljajo mesto cepitve. <br /> <br /> •Nepalindromska zaporedja prepoznavajo restriktaze tipa IIA. Asimetrična zaporedja nukleotidov se sicer pojavljajo precej pogosteje kot simetrična, vendar je ugodnost in specifičnost interakcije homodimerov s palindromskim zaporedjem toliko večja, da so se skozi čas najbolj razvijale in ohranile restriktaze tipa IIP. <br /> <br /> •Predstavniki tipa IIT se ne pojavljajo v obliki homodimerov pač pa so heterodimeri oziroma heterotetrameri in so tako sestavljene iz različnih podenot z različnimi katalitskimi mesti. <br /> <br /> •Restriktaze tipa IIS molekulo DNA cepijo na mestu, ki je oddaljeno od prepoznavnega zaporedja. Najbolj znan predstavnik je ''Fok''I. Za razliko od restriktaz tipa IIP, katerih DNA-vezavno mesto in katalitsko mesto sta del iste domene, se pri restriktazah tipa IIS omenjeni mesti nahajata kot del dveh različnih domen, med seboj povezanih z ročico. Od dolžine ročice je odvisno, kako daleč od prepoznavnega zaporedja restriktaza DNA cepi.<br /> <br /> •Podtipi IIB, IIC in IIG v polipeptidni verigi združujejo restriktazno (R) in metiltransferazno (M) aktivnost. Restriktaze podtipa IIB so še posebej zanimive, saj DNA režejo dvakrat, in sicer na začetku in koncu prepoznavnega zaporedja. <br /> <br /> •Poseben podtip restriktaz so tudi restriktaze IIM, katerih substrat je metilirana DNA. Razvile so se po prilagoditvi fagov na bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem. Fagi so namreč z metilacijo lastne DNA le-to zavarovali pred restriktazami gostiteljske celice, ki je sedaj niso prepoznale kot substrata za cepitev. Bakterije so v odgovor razvile nov tip restriktaz, ki lahko cepijo metilirano DNA, svoj dedni zapis pa so dodatno zavarovale. Najbolj znan predstavnik omenjenega tipa je ''Dpn''I.</div>

Meta Kodrič