Wiki FKKT - User contributions [en]

KrCRISPR: enostavna in učinkovita strategija generiranja pogojnega izbijanja esencialnih genov

2019-05-30T07:11:39Z

Miazganjar:

Ključni pristop določanja celične funkcije genov je tehnologija izbijanja genov, ki pa je za esencialne gene omejena zaradi letalnosti. Za njihovo preučevanje se uporablja pogojno ali inducibilno izbijanje genov. Od običajnega izbijanja se razlikuje v tem, da je časovno in/ali tkivno specifično. Klasični pristopi pogojnega izbijanja ali inaktivacije zajemajo Cre/loxP in Tet-Off sisteme. Izražanje CRISPR/Cas9 sistema z episomskega vektorja tako predstavlja alternativo pogojnega izbijanja esencialnih genov <ref name="prvi"> Wang, B. et al. (2019): krCRISPR: an easy and efficient strategy for generating conditional knockout of essential genes in cells. Journal of Biological Engineering, 13(1). doi:10.1186/s13036-019-0150-y </ref> <ref name="drugi"> Lewandoski, M. (2001):Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics, 2(10), 743–755. doi:10.1038/35093537 </ref>.

== krCRISPR tehnologija ==

Tehnologijo pogojnega izbijanja na osnovi CRISPR/Cas9 sistema, imenujemo '''krCRISPR (ang. »knockout-rescue CRISPR)'''. Temelji na kotransfekciji dveh episomskih vektorjev, ki omogočajo dolgotrajno urejanje genoma, selekcijo in eksogeno,inducibilno izražanje izbitih genov. '''Plazmid za izbijanje (KO ali ang. knockout plasmid)''' nosi zapis za SpCas9 endonukleazo, vodilno RNA (gRNA) za uvajanje premika bralnega okvirja in zapis za tetraciklinski transaktivator tTA, ki omogoča regulirano izražane genov iz '''reševalnega plazmida (RP ali ang. rescue plasmid)'''. Slednji nosi zapis za izbiti protein rezistenco proti puromicinu ter zapis za zeleni fluorescenčni protein (GFP). Gena sta pod kontrolo tetraciklinskega indukcijskega sistema (pTRE) in ločena s T2A peptidom.
Za živost celic je potrebno vzdrževanje obeh plazmidov. To zagotavlja EBNA1 protein, ki s svojo vezavo na mesto začetka podvojevanja iz Epstein-Barr virusa (oriP) pozitivno regulira podvojevanje plazmida.
Episomalno ohranjanje RP je tako odvisno od izražanja EBNA1 s KO plazmida <ref name="prvi"/>.

== Preverjanje sistema ==

Odvisnost plazmidov za ohranjanje v celičnih linijah (HEK293T, A375, H9, Hela) so preverjali s posamično transfekcijo plazmidov in kotransfekcijo obeh. Kot pričakovano, je živost celic bilo mogoče zaznati samo pri kotransfeciranih celičnih linijah.
Analiza polimorfizma dolžin restrikcijskih fragmentov (RFLP) je pokazala ohranjanje obeh plazmidov tudi po 10 dneh, njuna kvantifikacija pa kaže na preferenčno podvojevanje KO plazmida, kar razlagajo z intaktnim zapisom za oriP/EBNA1.
Izražanje z RP so preko merjenja GFP signala, zaznali in kvantificirali, s pomočjo pretočne citometrije. Pod puromicinsko selekcijo se je izražanje povečalo, po dodatku doksiciklina pa zmanjšalo.
Učinkovitost izbijanja genov so preverili z izbijanjem gena za poli-ADP-riboza polimerazni protein 1 ('''PARP1'''). Frekvenco klonov z izbitimi geni so določili s pomočjo T7E1 testa. Frekvenca se je s časom povečala. Homozigotne klone so potrdili s sekvenciranjem po Sangerju <ref name="prvi"/>.

== Izbijanje esencialnih genov ==

Učinkovitost izbijanja so preverili s pogojim izbijanjem dveh znanih esencialnih genov; gen za histonsko deacetilazo 3 ('''HDAC3''') in gen za DNA metil transferzao 1 ('''DNMT1'''). Da ne bi prišlo do prepoznave protovmesnika in protovmesniku bližnjega motiva (PAM) v eksogenem zapisu gena na RP, so vanj vnesli 5-7 tihih točkovnih mutacij.
Podobno kot za PARP1, so tudi za HDAC3 in DNMT1 preverili frekvenco izbijanja ter tudi zanje ugotovili povečano frekvenco po času.
Z dodatkom doksiciklina v gojišče so nato inhibirali izražanje eksogenih proteinov, stopnji izražanja pa so sledili z merjenem GFP signala in s kvantifikacijo mRNA s PCR v realnem času (Q-PCR). Za določanje izražanja DNTM1 so dodatno izvedli še prenos western, z metodo LUMA (luminumetrični metilacijski test) pa določili stopnjo metilacije.
Tako so za klone z eksogeno izraženo DNTM1 ter za divji tip določili enako stopnjo metilacije. Klon z doksiciklinom inhibiranim izražanjem pa je v primerjavi imel signifikantno znižano stopnjo metilacije <ref name="prvi"/>.

== Preučevanje točkovnih mutacij ==

Za krCRISPR so predpostavili, da omogoča tudi preučevanje vpliva točkovnih mutacij. To so dokazali z zamenjavo reševalnega plazmida 1 z reševalnim plazmidom 2, ki nosil zapis za variacijo izbitega gena. Zraven slednjega še nosi zapis za rezistenco proti zeomicinu in zapis za rdeči fluorescenčni protein (RFP).
Prej pripravljene klone z endogeno izbitim DNTM1 so prenesli v gojišče z zeomicinom, da bi prišlo do zamenjave med reševalnim plazmidom 1 in 2. Po 22 dneh so določili 17,5-29,4% GFP pozitivnih celic in 75,5-97,2% RFP pozitivnih celicah.
V zapis za DNTM1 so uvedli 3 znane mutacije ('''Y15C, A570V in P507L'''), ki jih povezujejo s patološkimi stanji ter eno ('''H79R'''), katero ne povezujejo s patološkimi stanji. Stopnja metilacije se je v primeru Y15C, A570V in P507L zmanjšala za približno 10%, mutacija H79R ni pokazala spremembe v stopnji metilacije <ref name="prvi"/>.

== Preverjanje izventarčnih učinkov ==

Dolgotrajno izražanje CRISPR/Cas9 sistema povezujejo z izventarčno aktivnostjo. Da bi določili, če je z načrtovanim sistemom prišlo do izventarčnih učinkov so, s pomočjo spletnega orodja [http://www.rgenome.net/cas-offinder/ »Cas-offinder«], poiskali potencialna izventarčna mesta ter izbrali 5 najverjetnejših za gRNA-HDAC3 ter 5 za gRNA-DNTM1. Od tarčnih zaporedij se vse gRNA razlikujejo le za 2 do 3 mest neujemanja. V pripravljene klone z endogeno izbitimi geni so prenesli posamezne gRNA in pričakovana izventarčna mesta sekvencirali po Sangerju. Tako pri HDAC3 in DNTM1 niso zaznali izventarčnih učinkov, venadr niso izvedli sekvenciranja celega genoma (WGS) <ref name="prvi"/>.

== Zaključek ==

Znanstvenikom je uspelo vzpostaviti metodo za pogojno izbijanje esencialnih genov, s katero je možno preučevati tudi vpliv točkovnih mutacij. V tem sistemu KO plazmid služi izbijanju in ohranjanju plazmida RP, ki omogoča eksogeno inducibilno izražanje izbitega gena.

== Viri ==
<references/>

MBT seminarji 2019

2019-05-28T07:04:28Z

Miazganjar:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2018/19'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (14. marec) 
# Production of functional human interleukin 37 using plants (N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma; Plant Cell Rep. 38 (3), Mar. 2019; https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_funkcionalnega_%C4%8Dlove%C5%A1kega_IL37_v_rastlinah Proizvodnja funkcionalnega človeškega interlevkina 37 v rastlinah. Špela Malenšek]

'''Gensko spremenjene živali''' (21. marec) 
# Myopia disease mouse models: a missense point mutation (S673G) and a protein-truncating mutation of the ''Zfp644'' mimic human disease phenotype. (K. I. Szczerkowska ''et al.''; Cell Biosci. 9, 2019; https://doi.org/10.1186/s13578-019-0280-4). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mi%C5%A1ji_modeli_kratkovidnosti:_druga%C4%8Dnopomenska_to%C4%8Dkovna_mutacija_%28S673G%29_in_skraj%C5%A1evalna_mutacija_v_Zfp644_posnemata_fenotip_%C4%8Dlove%C5%A1ke_bolezni Mišji modeli kratkovidnosti: drugačnopomenska točkovna mutacija (S673G) in skrajševalna mutacija v ''Zfp644'' posnemata fenotip človeške bolezni] Rok Miklavčič
# A chicken bioreactor for efficient production of functional cytokines (Herron L.R. ''et al.''; BMC Biotechnol. 18 (1), Dec. 2018; https://doi.org/10.1186/s12896-018-0495-1).[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_kokošjega_bioreaktorja_za_učinkovito_proizvodnjo_funkcionalnih_citokinov Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov] Blaž Lebar
# Influence of a growth hormone transgene on the genetic architecture of growth-related traits: A comparative analysis between transgenic and wild-type coho salmon (M. Kodama, K. A. Naish in R. H. Devlin; Evol Appl. 11(10), 2018; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6231474/). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vpliv_transgena_rastnega_hormona_na_genetsko_arhitekturo_lastnosti_povezanimi_z_rastjo Vpliv transgena rastnega hormona na genetsko arhitekturo lastnosti povezanimi z rastjo: primerjalna analiza transgenega srebrnega lososa in srebrnega lososa divjega tipa] Nuša Kelhar

'''Okolje''' (4. april) 
# Bioremediation of soil long-term contaminated with PAHs by algal-bacterial synergy of Chlorella sp. MM3 and Rhodococcus wratislaviensis strain 9 in slurry phase (S.R.Subashchandrabose, K. Venkateswarlu in K. Venkidusamy; Sci. Total Environ., 2019; https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S004896971835349X). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bioremediacija_zemlje%2C_dolgotrajno_kontaminirane_s_PAH Bioremediacija zemlje, dolgotrajno kontaminirane s policikličnimi aromatskimi ogljikovodiki z sinergijo alge Chlorella sp. MM3 in seva 9 bakterije Rhodococcus wratislaviensis v suspenziji.] Eva Rajh
# Anaerobic degradation of xenobiotic isophthalate by the fermenting bacterium ''Syntrophorhabdus aromaticivorans'' (M. Junghare, D. Spiteller in B. Schink; ISME J, 2019; https://doi.org/10.1038/s41396-019-0348-5). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Anaerobna_razgradnja_izoftalata_pri_fermentacijski_bakteriji_Syntrophorhabdus_aromaticivorans Anaerobna razgradnja ksenobiotika izoftalata pri fermentirajoči bakteriji ''Syntrophorhabdus aromaticivorans'']. Elvira Boršič
# Biodegradation and toxicity of emerging contaminants: Isolation of an exopolysaccharide-producing ''Sphingomonas sp.'' for ionic liquids bioremediation. (M. Koutinas ''et al.''; J. Haz. Mat. 365, Mar. 2019; https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2018.10.059). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biorazgradnja_in_toksičnost_nastalih_produktov Biorazgradnja in toksičnost nastalih produktov: izolacija mikroorganizma Sphingomonas MKIV, ki proizvaja eksopolisaharide, za bioremediacijo ionskih tekočin] Katja Dolenc

'''Terapevtski proteini in protitelesa''' (11. april) 
# Constructive approach for synthesis of a functional IgG using a reconstituted cell-free protein synthesis system (S. Murakami ''et al''; Scientific Reports 9, 2019; https://doi.org/10.1038/s41598-018-36691-8). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovit_pristop_za_sintezo_funkcionalnega_IgG_z_uporabo_rekonstruiranega_brezceli%C4%8Dnega_sistema_za_sintezo_proteinov Učinkovit pristop za sintezo funkcionalnega IgG z uporabo rekonstruiranega brezceličnega sistema za sintezo proteinov.] Vida Štrancar
# New therapeutic approach for targeting Hippo signalling pathway (L. Dominguez-Berrocal ''et al''; Scientific Reports 9(4771), 2019; https://www.nature.com/articles/s41598-019-41404-w). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nov_terapevtski_pristop_za_ciljanje_signalne_poti_Hippo Nov terapevtski pristop za ciljanje signalne poti Hippo.] Ana Halužan Vasle
# Use of a design of experiments approach to optimise production of a recombinant antibody fragment in the periplasm of Escherichia coli: selection of signal peptide and optimal growth conditions (Kasli ''et al''. AMB Expr (2019) 9:5; https://doi.org/10.1186/s13568-018-0727-8). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_pristopa_načrtovanja_eksperimentov_za_optimizacijo_proizvodnje_rekombinantnega_fragmenta_protitelesa_v_periplazmi_Escherichie_coli:_izbira_signalnega_peptida_in_optimalnih_pogojev_rasti Uporaba pristopa načrtovanja eksperimentov za optimizacijo proizvodnje rekombinantnega fragmenta protitelesa v periplazmi ''Escherichie coli'': izbira signalnega peptida in optimalnih pogojev rasti.] Nina Mavec

'''Diagnostiki in cepiva''' (18. april) 
# A viral-vectored RSV vaccine induces long-lived humoral immunity in cotton rats (J. Grieves, Z. Yin, A. Garcia-Sastre et al.; Vaccine 36(26), 2018; https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2018.04.089) [[Cepivo proti RSV, pripravljeno z virusnim vektorjem, inducira dolgotrajno humoralno imunost pri bombažnih podganah]]. Nina Kobe
# Optimization of a multivalent peptide vaccine for nicotine addiction (D. F. Zeigler, R. Roque, C. H. Clegg; Vaccine 37(12), 2019; https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.02.003) [[Optimizacija večvalentnega peptidnega cepiva za nikotinsko odvisnost]]. Iza Oblak
# Design of a Type-1 Diabetes Vaccine Candidate Using Edible Plants Expressing a Major Autoantigen (E. Bertini ''et al''., Front. Plant Sci. 9, 2018 https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00572) [[Načrtovanje kandidatnega cepiva za diabetes tipa I s pomočjo užitnih rastlin, ki izražajo pomemben avtoantigen]]. Katarina Petra van Midden

'''LMW učinkovine''' (25. april) 
# Metabolic engineering of ''Escherichia coli'' for de novo biosynthesis of vitamin B12 (H. Fang ''et al.'', Nat Commun. 9(1), 2018 https://doi.org/10.1038/s41467-018-07412-6). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_bakterije_Escherichia_coli_za_de_novo_sintezo_vitamina_B12 Metabolno inženirstvo bakterije ''Escherichia coli'' za ''de novo'' sintezo vitamina B12]. Valentina Novak
# Genome-Wide Mutagenesis Links Multiple Metabolic Pathways with Actinorhodin Production in ''Streptomyces coelicolor'' (Z. Xu ''et al'', Appl. Environ. Microbiol. 85(7), 2019, https://doi.org/10.1128/AEM.03005-18). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mutageneza_celotnega_genoma_odkriva_povezave_med_metabolnimi_potmi_in_produkcijo_aktinorhodina_v_Streptomyces_coelicolor Mutageneza celotnega genoma odkriva povezave med metabolnimi potmi in produkcijo aktinorhodina v ''Streptomyces coelicolor''.] David Titovšek
# Cost-effective production of recombinant peptides in ''Escherichia coli'' (A. Gaglione ''et al'', N. Biotechnol. 51, 2019, https://doi.org/10.1016/j.nbt.2019.02.004.) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Stro%C5%A1kovno_u%C4%8Dinkovita_proizvodnja_rekombinantnih_peptidov_v_Escherichia_coli Stroškovno učinkovita proizvodnja rekombinantnih peptidov v ''Escherichia coli''] Bor Klančnik

'''Male molekule in polimeri''' (9. maj) 
# Metabolic engineering of the thermophilic filamentous fungus ''Myceliophthora thermophila'' to produce fumaric acid (S. Gu et al.; Biotechnology for Biofuels, 11(1), 2019; https://doi.org/10.1186/s13068-018-1319-1)[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolni_inženiring_termofilne_filamentozne_glive_Myceliophthora_thermophila_za_proizvodnjo_fumarne_kisline Metabolni inženiring termofilne filamentozne glive ''Myceliophthora thermophila'' za proizvodnjo fumarne kisline]Primož Bembič
# Karin Dobravc Škof

'''Pretvorba biomase in bioenergenti''' (16. maj) 
# Potential of sustainable bioenergy production from ''Synechocystis'' sp. cultivated in wastewater at large scale – A low cost biorefinery approach (V. Ashokkumar, W.-H. Shen, C. Ngamcharussrivichai, E. Agila in F. N. Ani; Energy Conversion and Management 186, 2019; https://doi.org/10.1016/j.enconman.2019.02.056) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Potencial_trajnostne_proizvodnje_bioenergije_iz_Synechocystis_sp.%2C_gojene_v_odpadnih_vodah_v_velikem_merilu_%E2%80%93_pristop_nizkocenovne_biorafinerije Potencial trajnostne proizvodnje bioenergije iz ''Synechocystis'' sp., gojene v odpadnih vodah v velikem merilu – pristop nizkocenovne biorafinerije] Maksimiljan Adamek
# Life-cycle assessment of biofuel production from microalgae via various bioenergy conversion systems (C.-H. Sun ''et al.''; Energy 171, 2019; https://doi.org/10.1016/j.energy.2019.01.074) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Napoved_%C5%BEivljenjskega_cikla_proizvodnje_biogoriva_iz_mikroalg_preko_razli%C4%8Dnih_sistemov_pretvorbe_bioenergije Napoved življenjskega cikla proizvodnje biogoriva iz mikroalg preko različnih sistemov pretvorbe bioenergije] Aljoša Marinko
# ''n''-Butanol and ethanol production from cellulose by ''Clostridium cellulovorans'' overexpressing heterologous aldehyde/alcohol dehydrogenases (T. Bao, J. Zhao, J. Li, X. Liu in S.-T. Yang; Bioresource Technology 285, 2019; https://doi.org/10.1016/j.biortech.2019.121316) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_n-butanola_in_etanola_iz_celuloze_v_bakteriji_Clostridium_cellulovorans_s_prekomernim_izra%C5%BEanjem_aldehid_in_alkohol_dehidrogenaz Proizvodnja ''n''-butanola in etanola iz celuloze v bakteriji ''Clostridium cellulovorans'' s prekomernim izražanjem aldehid in alkohol dehidrogenaz] Jošt Hočevar

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (23. maj) 
# Transgenic rhesus monkeys carrying the human MCPH1 gene copies show human-like neoteny of brain development (Shi L, Luo X, Jiang J, Hu T, et al. National Science Review, nwz043, https://doi.org/10.1093/nsr/nwz043)[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/V_transgenskih_opicah_rhesus%2C_ki_so_prena%C5%A1alke_vstavljenega_%C4%8Dlove%C5%A1kega_gena_MCPH1%2C_je_opazen_podoben_razvoj_mo%C5%BEganov%2C_kot_pri_%C4%8Dloveku V transgenskih opicah rhesus, ki so prenašalke vstavljenega človeškega gena MCPH1, je opazen podoben razvoj možganov, kot pri človeku] Katja Kunčič
# Dynamic DNA material with emergent locomotion behavior powered by artificial metabolism (Hamada in sod., Sci. Robotics, 2019; https://doi.org/10.1126/scirobotics.aaw3512) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Dinami%C4%8Den_DNA_nanomaterial_s_porajajo%C4%8Dim_se_obna%C5%A1anjem_lokomocije Dinamičen DNA nanomaterial s porajajočim se obnašanjem lokomocije] Peter Pečan
# Role of contacts in long-range protein conductance (B. Zhang et al.; PNAS 119 (13), 2019) https://www.pnas.org/content/116/13/5886) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vloga_stikov_pri_proteinski_prevodnosti_na_velike_razdalnje Vloga stikov pri proteinski prevodnosti na velike razdalnje] Jaka Kos

'''Rezervni termin''' (30. maj) 
# krCRISPR: an easy and efficient strategy for generating conditional knockout of essential genes in cells (B. Wang ''et al.'', JBE 13:35, 2019; https://doi.org/10.1186/s13036-019-0150-y) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/KrCRISPR:_enostavna_in_u%C4%8Dinkovita_strategija_generiranja_pogojnega_izbijanja_esencialnih_genov krCRISPR: enostavna in učinkovita strategija generiranja pogojnega izbijanja esencialnih genov] Mia Žganjar
# Engineering Protein-Secreting Plasma Cells by Homology-Directed Repair in Primary Human B Cells (Hung ''et al.'', Mol Ther. 7;26(2):456-467. <noinclude>https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.11.012.</noinclude>). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirstvo_spreminjanja_plazmatk_s_popravljanjem_primarnih_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celic_B_na_osnovi_homologije Inženirstvo spreminjanja plazmatk s popravljanjem primarnih človeških celic B na osnovi homologije]. Nives Ražnjević
# Ana Müller

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

KrCRISPR: enostavna in učinkovita strategija generiranja pogojnega izbijanja esencialnih genov

2019-05-28T06:59:15Z

Miazganjar: New page: Ključni pristop določanja celične funkcije genov je tehnologija izbijanja genov, ki pa je za esencialne gene omejena zaradi letalnosti. Za njihovo preučevanje se uporablja pogojno ali ...

Ključni pristop določanja celične funkcije genov je tehnologija izbijanja genov, ki pa je za esencialne gene omejena zaradi letalnosti. Za njihovo preučevanje se uporablja pogojno ali inducibilno izbijanje genov. Od običajnega izbijanja se razlikuje v tem, da je časovno in/ali tkivno specifično. Klasični pristopi pogojnega izbijanja ali inaktivacije zajemajo Cre/loxP in Tet-Off sisteme. Izražanje CRISPR/Cas9 sistema z episomskega vektorja tako predstavlja alternativo pogojnega izbijanja esencialnih genov <ref name="prvi"> Wang, B. et al. (2019): krCRISPR: an easy and efficient strategy for generating conditional knockout of essential genes in cells. Journal of Biological Engineering, 13(1). doi:10.1186/s13036-019-0150-y </ref> <ref name="drugi"> Lewandoski, M. (2001):Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics, 2(10), 743–755. doi:10.1038/35093537 </ref>.

== krCRISPR tehnologija ==

Tehnologijo pogojnega izbijanja na osnovi CRISPR/Cas9 sistema, imenujemo '''krCRISPR (ang. »knockout-rescue CRISPR)'''. Temelji na kotransfekciji dveh episomskih vektorjev, ki omogočajo dolgotrajno urejanje genoma, selekcijo in eksogeno,inducibilno izražanje izbitih genov. '''Plazmid za izbijanje (KO ali ang. knockout plasmid)''' nosi zapis za SpCas9 endonukleazo, vodilno RNA (gRNA) za uvajanje premika bralnega okvirja in zapis za tetraciklinski transaktivator tTA, ki omogoča regulirano izražane genov iz '''reševalnega plazmida (RP ali ang. rescue plasmid)'''. Slednji nosi zapis za izbiti protein rezistenco proti puromicinu ter zapis za zeleni fluorescenčni protein (GFP). Gena sta pod kontrolo tetraciklinskega indukcijskega sistema (pTEF) in ločena s T2A peptidom.
Za živost celic je potrebno vzdrževanje obeh plazmidov. To zagotavlja EBNA1 protein, ki s svojo vezavo na mesto začetka podvojevanja iz Epstein-Barr virusa (oriP) pozitivno regulira podvojevanje plazmida.
Episomalno ohranjanje RP je tako odvisno od izražanja EBNA1 s KO plazmida <ref name="prvi"/>.

== Preverjanje sistema ==

Odvisnost plazmidov za ohranjanje v celičnih linijah (HEK293T, A375, H9, Hela) so preverjali s posamično transfekcijo plazmidov in kotransfekcijo obeh. Kot pričakovano, je živost celic bilo mogoče zaznati samo pri kotransfeciranih celičnih linijah.
Analiza polimorfizma dolžin restrikcijskih fragmentov (RFLP) je pokazala ohranjanje obeh plazmidov tudi po 10 dneh, njuna kvantifikacija pa kaže na preferenčno podvojevanje KO plazmida, kar razlagajo z intaktnim zapisom za oriP/EBNA1.
Izražanje z RP so preko merjenja GFP signala, zaznali in kvantificirali, s pomočjo pretočne citometrije. Pod puromicinsko selekcijo se je izražanje povečalo, po dodatku doksiciklina pa zmanjšalo.
Učinkovitost izbijanja genov so preverili z izbijanjem gena za poli-ADP-riboza polimerazni protein 1 ('''PARP1'''). Frekvenco klonov z izbitimi geni so določili s pomočjo T7E1 testa. Frekvenca se je s časom povečala. Homozigotne klone so potrdili s sekvenciranjem po Sangerju <ref name="prvi"/>.

== Izbijanje esencialnih genov ==

Učinkovitost izbijanja so preverili s pogojim izbijanjem dveh znanih esencialnih genov; gen za histonsko deacetilazo 3 ('''HDAC3''') in gen za DNA metil transferzao 1 ('''DNMT1'''). Da ne bi prišlo do prepoznave protovmesnika in protovmesniku bližnjega motiva (PAM) v eksogenem zapisu gena na RP, so vanj vnesli 5-7 tihih točkovnih mutacij.
Podobno kot za PARP1, so tudi za HDAC3 in DNMT1 preverili frekvenco izbijanja ter tudi zanje ugotovili povečano frekvenco po času.
Z dodatkom doksiciklina v gojišče so nato inhibirali izražanje eksogenih proteinov, stopnji izražanja pa so sledili z merjenem GFP signala in s kvantifikacijo mRNA s PCR v realnem času (Q-PCR). Za določanje izražanja DNTM1 so dodatno izvedli še prenos western, z metodo LUMA (luminumetrični metilacijski test) pa določili stopnjo metilacije.
Tako so za klone z eksogeno izraženo DNTM1 ter za divji tip določili enako stopnjo metilacije. Klon z doksiciklinom inhibiranim izražanjem pa je v primerjavi imel signifikantno znižano stopnjo metilacije <ref name="prvi"/>.

== Preučevanje točkovnih mutacij ==

Za krCRISPR so predpostavili, da omogoča tudi preučevanje vpliva točkovnih mutacij. To so dokazali z zamenjavo reševalnega plazmida 1 z reševalnim plazmidom 2, ki nosil zapis za variacijo izbitega gena. Zraven slednjega še nosi zapis za rezistenco proti zeomicinu in zapis za rdeči fluorescenčni protein (RFP).
Prej pripravljene klone z endogeno izbitim DNTM1 so prenesli v gojišče z zeomicinom, da bi prišlo do zamenjave med reševalnim plazmidom 1 in 2. Po 22 dneh so določili 17,5-29,4% GFP pozitivnih celic in 75,5-97,2% RFP pozitivnih celicah.
V zapis za DNTM1 so uvedli 3 znane mutacije ('''Y15C, A570V in P507L'''), ki jih povezujejo s patološkimi stanji ter eno ('''H79R'''), katero ne povezujejo s patološkimi stanji. Stopnja metilacije se je v primeru Y15C, A570V in P507L zmanjšala za približno 10%, mutacija H79R ni pokazala spremembe v stopnji metilacije <ref name="prvi"/>.

== Preverjanje izventarčnih učinkov ==

Dolgotrajno izražanje CRISPR/Cas9 sistema povezujejo z izventarčno aktivnostjo. Da bi določili, če je z načrtovanim sistemom prišlo do izventarčnih učinkov so, s pomočjo spletnega orodja [http://www.rgenome.net/cas-offinder/ »Cas-offinder«], poiskali potencialna izventarčna mesta ter izbrali 5 najverjetnejših za gRNA-HDAC3 ter 5 za gRNA-DNTM1. Od tarčnih zaporedij se vse gRNA razlikujejo le za 2 do 3 mest neujemanja. V pripravljene klone z endogeno izbitimi geni so prenesli posamezne gRNA in pričakovana izventarčna mesta sekvencirali po Sangerju. Tako pri HDAC3 in DNTM1 niso zaznali izventarčnih učinkov, venadr niso izvedli sekvenciranja celega genoma (WGS) <ref name="prvi"/>.

== Zaključek ==

Znanstvenikom je uspelo vzpostaviti metodo za pogojno izbijanje esencialnih genov, s katero je možno preučevati tudi vpliv točkovnih mutacij. V tem sistemu KO plazmid služi izbijanju in ohranjanju plazmida RP, ki omogoča eksogeno inducibilno izražanje izbitega gena.

== Viri ==
<references/>