Wiki FKKT - User contributions [en]

Zaznavalni niz genetskih biopikslov sklopljenih preko radikalov

2019-01-15T16:27:21Z

Miha Koprivnikar Krajnc:

Izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/nature10722 A. Prindle et.al. "A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’" ''Nature'', 2011]

----

== Ozadje ==

Namen raziskovalcev je bil ustvariti biosenzor za arzen, ki izkorišča bakterijski naravni odzivni sistem na prisotnost arzenita (As3+) in koncept genetskega vezja, ki ta sistem povezuje z reporterskim proteinom na do sedaj nov način; to je preko merjenja frekvence nihanja ekspresije GFP, in ne preko same intenzitete fluorescence, kot je bilo narejeno že pred leti [1].

Ideja je bila ustvariti oscilirajoči senzor. Prednost oscilirajočih senzorjev je preprostost kvantizacije signala, tj. frekvence. V primeru klasičnih, neoscilirajočih senzorjev, pri katerih namesto frekvence merimo intenziteto optičnega signala, moramo vrednosti vedno znova normalizirati in kalibrirati, saj imajo eksperimentalni faktorji, kot je intenziteta vzbujajočega žarka in čas izpostavitve večji vpliv, prav tako nihajni čas ni odvisen od amplitude. Oscilirajoči senzorji so torej boljši za ponovljivost in preprostost meritev, kar prinaša svoje prednosti pri razvoju točnega komercialnega senzorja [2].

== Fizična zasnova in gensko vezje ==

Fizično je biosenzor sestavljeni iz urejenega niza posameznih kolonij ''E. coli'', ki so med seboj ločene s pregradami. Genetsko pa je zapis načrtovan, da je izražanje reporterja sfGFP:

1) pozitivno regulirano z arzenitom (posredno),

2) pospešeno s pomočjo pozitivnih povratnih zank v genskem vezju,

3) medcelično usklajeno na dveh ravneh.

Te dve ravni usklajevanja sta intrakolonijsko preko zaznavanja gostote (ang. »quorum sensing«) in interkolonijsko z reaktivnimi kisikovimi zvrstmi (ROS) in posledično plina H2O2, ki potuje med kolonijami in prodira v celice. Zaznavanje gostote je način regulacije ekspresije proteinov na podlagi gostote populacije celic, ker to pomeni boljši fenotip in izboljša preživetje – neke vrste bakterijski približek večceličnosti. Uporablja se za usklajevanje celic, a na dolge razdalje deluje precej počasi, zato so pri povečevanju obsega (ang. »scaling-up«) dodali usklajevanje preko hlapnega vodikovega peroksida. Obe ravni sta nepogrešljivi za zagotovitev urejenih nihanj. [3].

Namesto da so izdelali oscilirajoči senzor iz ene ogromne kolonije (ki se usklajuje počasi, samo preko zaznavanja gostote), so zvezali tisoče malih oscilirajočih kolonij – biopikslov – v mikrofluidni niz. Znotraj kolonije se oscilacije usklajujejo preko zaznavanja gostote, med kolonijami pa deluje druga, hitrejša raven signalizacije. Le-ta vključuje H2O2 in ''E.coli'' lastno »redoks mašinerijo«. Obe vrste signalizacije oz. usklajevanja oscilacij delujeta sinergistično, a zelo različno: zaznavanje gostote je močna, a deluje na kratke razdalje (pod 1 mm), redoks pa je šibkejša, a zagotavlja daljši doseg. Za mikrofluidni niz velja analogno kot za letališča: ni možno (niti koristno), da bi bila vsa letališča med seboj povezana z leti. Leti z manjših letališč so lokalno povezani preko večjih letališč, ki imajo globalne povezave, ta globalna povezava pa v tej analogiji predstavlja redoks signalizacijo.

== Konstrukcija genske platforme za ustvarjanje nihanj ==

Začeli so na intrakolonijski ravni, z uporabo t.i. avtoinduktorja (ang. »autoinducer«) Gram-negativnih bakterij AHL (N-acil homoserin lakton), ki difundira po mediju in deluje med celicami znotraj kolonije. AHL je bistven za zaznavanje gostote: produkt gena LuxI je AHL sintaza. Produkt gena AiiA (autoinducer inhibitor A) je posredni represor gena LuxI, saj deluje kot laktonaza in razgrajuje AHL [4]. AHL se poveže z LuxR in s tem ustavi utišanje genov LuxI, AiiA, sfGFP in Ndh, ki imajo lux promotorje. Povezava AHL z LuxR torej poveča ekspresijo sfGFP in pa samega LuxI – avtoinduktivna pozitivna povratna zanka omogoča pospešitev izražanja in sinhronost skupinskega vedenja. Na drugi strani pa prisotnost gena AiiA pod enakim promotorjem sistemu prinaša fino negativno regulacijo ter zaključitev nihajnega vrha in vrnitev v dno oscilacije. Gena LuxI in AiiA sta tako odgovorna za sinhronizirano nihanje AHL in s tem za oscilacije fluoresciranja biopiksla. Vpliv AHL med kolonijami ni možen, ker so le-te delno ločene, medij med njimi pa ima visok pretok [3], [5], [6].

Interkolonijska redoks signalizacija pa ne deluje s pomočjo molekul, ki difundirajo preko medija, kot je AHL, saj je edina povezava med posameznimi biopiksli preko zraka – uporabili so vodikov peroksid. To so dosegli, z vnosom kopije gena ndh (NADH dehidrogenaza II – NDH-2) pod kontrolo enakega lux promotorja, kot vsi ostali navedeni geni. Ndh je membranski encim in proizvaja H2O2 in superoksidni radikal O2-. Plinasti H2O2 potuje med kolonijami, prodira v celice in posredno aktivira lux promotorje; inaktivira ArcAB, ki je sicer del redoks kontrolnega sistema in se veže na lux promotorje ter jih utiša. Ob prisotnosti peroksida so torej lux geni aktivni. Tovrstna aktivacija omogoča dodatno pozitivno povratno zanko za sinhronizacijo populacije [3].

Ko je bil razvit ta sistem sinhronizacije nihanj v dveh ravneh, so ga poenostavili. Odstranili so gen ndh kot proizvajalec radikalov (ki nato tvorijo peroksid), to nalogo pa je prevzel sam GFP. Ob višku izražanja GFP-ja celice izpostavimo žarku fluorescentne svetlobe, kar povzroči nastanek radikalov in posledično peroksida; ob oscilatornem dnu pa GFP-ja praktično ni, kar pomeni da ob obsevanju ni tudi peroksida. GFP ima tako v poenostavljeni platformi dvojno vlogo: vlogo sklopitelja (generiranje radikalov za globalno sinhroniziranje) in vlogo reporterja [3].

== Vpliv sprememb radikalov na nihalno gensko platformo ==

Naslednji korak raziskovalcev je bil preučiti vpliv okoljskih dejavnikov, ki bi lahko motili količino radikalov, potrebnih za interkolonijsko signalizacijo. Najprej je bil preučen vpliv katalaze in vpliv superoksid dizmutaze (SOD) na nepoenostavljeno platformo – ta, ki generira radikale z ndh. Prisotnost katalaze povzroči izgubo medkolonijske sinhronizacije, ne vpliva pa na oscilacije posameznih kolonij. To pomeni, da odtegnitev peroksida prepreči drugo raven signalizacije in razklopi biopiksle. Na drugi strani pa SOD povzroči izrazit usklajen val fluorescence, kateremu sledi konstanten signal brez oscilacij. Razlog za to je dejstvo, da SOD poveča delež superoksidnega radikala, ki se pretvori v H2O2. Preveč peroksida posledično onemogoči nihanja – pride do konstantne fluorescence. Do zelo velike koncentracije H2O2 pride kljub temu, da je SOD znotrajcelični encim – razlog za to je visoka katalitična aktivnost dizmutaze [3], [7].

Vpliv katalaze in SOD na poenostavljeno platformo je bil identičen kot pri tisti z genom ndh. To potrjuje pomembnost ravno prave količine H2O2, potrebne za usklajevanje biopikslov ter zagotavlja, da sprememba vira radikalov (GFP namesto NDH-2) ne okrni kvalitete radikalne signalizacije med kolonijami. Pri tej platformi so preučili tudi vpliv tiosečnine in ampicilina; tiosečnina je dušilec radikalov in rezultati so pokazali, da kot tak onesposobi sinhronizacijo nihanj, brez da bi škodil viabilnosti. Ampicilin, ki pa proizvaja radikale, prav tako poruši usklajenost nihanj (podobno kot pri SOD), kar pomeni, da prevelika količina radikalov tudi onemogoči sinhronizacijo [3].

== Konstrukcije makroskopskega biosenzorja za arzenit ==

Naloge so se lotili na dva načina. Pri prvem se ob prisotnosti arzenita zgolj spremeni frekvenca nihanja fluorescence, pri drugem pa gre za »on-off« sistem, torej se sinhronizirano nihanje vzpostavi šele ob pražni vrednosti koncentracije arzenita [3].
=== Modulacija frekvence ===
Osnovni platformi so dodali še eno kopijo gena LuxI (gen za AHL sintazo), le da je ta pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa (ArsRE). Ko arzenita ni v mediju, so prisotne bazalne oscilacije zaradi izražanja prvotne kopije LuxI kot posledica peroksida, saj je na arzenit-odzivni element vezan represor ArsR. Ko pa je arzenit prisoten, se poveže z represorjem ArsR, povzroči njegovo oddisociacijo z ArsRE in tako prepreči nadaljnjo represijo LuxI gena – torej zaradi arzenita se izraža dodaten LuxI, kar privede do povečane količine AHL in posledično do povečanega nihajnega časa in amplitude ter zmanjšane frekvence. Testiranje tega konstrukta pri različnih količinah arzenita je pokazalo, da se je nihajni čas sorazmerno povečeval s povečevanjem koncentracije arzenita. Izkazalo se je, da je tak senzor sposoben zaznati in tudi kvantificirati koncentracije arzenita že od 0,2 µM naprej, s tem da WHO direktiva določa zgornjo mejo sprejemljive koncentracije za države v razvoju pri 0,5 µM [3].
=== Vse ali nič ===
Nihanje se zgodi le ob doseganju pražne koncentracije (ang. »thresholding«). V DNA je bil vstavljen zapis za LuxR pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa. Ta gen LuxR isto kot že pri osnovni platformi ni imel povezave s preostankom vezja, torej za razliko od ostalih genov platforme ni pod lux promotorjem; razlika je v tem, da se LuxR ne izraža več konstitutivno kot prej, ampak zgolj in samo inducibilno, in to s strani arzenita. To pomeni, da se v odsotnosti arzenita LuxR ne izraža, za aktivacijo gena LuxI pa je bistven kompleks LuxR-AHL – torej brez le-tega ni fluorescence in ni oscilacij. Ko pa arzenit je prisoten, se izrazi LuxR, zaradi njega in AHL pa tudi LuxI, kar obnovi funkcijo vezja in dobimo usklajeno nihanje. Ta sistem »vse ali nič« se vklopi pri 0,25 µM arzenitu, a to ni absolutna spodnja meja. Pražno koncentracijo se da še dodatno prilagoditi s spreminjanjem komponent genskega vezja (število kopij genov, Shine-Dalgarnovo zaporedje ipd.) [3].

== Zaključek ==

Oba načina signalizacije sta bila uporabljena za »scale-up« tega biosenzorja, a je vseeno potrebna mikroskopija za detekcijo, kar je nepraktično za komercialno uporabo. Ustvarjeni senzor z globalno sinhronizacijo je niz velikosti 24 mm x 12 mm in vsebuje 12 000 biopikslov oz. kolonij, skupno okoli 50 milijonov celic. Kljub že sicer povečanem signalu, ga je potrebno še dodatno ojačati, da bi lahko postal senzor uporaben v vsakdanjem življenju. To bi lahko dosegli s spremembami niza, kot je število biopikslov in njihova razporeditev, kar privede do različnih »output« oscilacij [3].

Za perspektivo je mogoče smiselno omeniti alternative v detekciji arzena, oz. načine, katerim je ta novi biosenzor alternativa. Prva naprava za detekcijo arzenita vodi doda Zn, ta pa katalizira nastanek plina arzina AsH3. Arzin reagira z detektorjem nad gladino, ki vsebuje HgBr (ali AgNO3), in pride do rumenega (ali sivega) obarvanja. Drug način uporablja zlate nanodelce – aptameri so v kompleksu s surfaktanti, ki sicer omogočijo agregacijo zlatih nanodelcev; ko pa pride arzenit, se tvorijo As(III)-aptamer kompleksi, prosti surfaktanti pa sprožijo obarjanje zlata, kar vodi v obarvanje. Tretji način pa je že biosenzor – kolonija ''E. coli'', ki imajo LacZ gen pod ArsRE, zaznavamo pa padec pH, ki je posledica razgradnje laktoze [1], [3], [8], [9].

Vidne prednosti te alternative so nedvoumnost detekcije (ne kot pri redukciji azenita v arzin), manj proizvedenih odpadkov in strupenih snovi (enkratna uporaba ostalih detektorjev, arzin, Hg) in potencialna cenovna konkurenčnost. Predvidena cena konceptualne naprave z biosenzorjem je pod 50$, najpomembneje pa je, da ni za enkratno uporabo kot so trenutni senzorji [1], [3], [8], [9].

== Viri ==

[1] N. Joshi, X. Wang, L. Montgomery, A. Elfick, and C. E. French, “Novel approaches to biosensors for detection of arsenic in drinking water,” Desalination, vol. 248, no. 1–3, pp. 517–523, 2009.

[2] T. Gast, “Sensors with oscillating elements,” J. Phys. E., vol. 18, no. 9, pp. 783–789, 1985.

[3] A. Prindle, P. Samayoa, I. Razinkov, T. Danino, L. S. Tsimring, and J. Hasty, “A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels,’” Nature, vol. 481, no. 7379, pp. 39–44, 2012.

[4] and L.-H. Z. Yi-Hu Dong, Jin-Ling Xu, Xian-Zhen Li, “AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 97, no. 7, pp. 3526–3531, 2000.

[5] “Quorum sensing 101: https://sites.tufts.edu/quorumsensing/quorumsensing101/,” citirano dne 6.1.2019.

[6] T. Chu et al., “In vivo programmed gene expression based on artificial quorum networks,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 81, no. 15, pp. 4984–4992, 2015.

[7] M. Balamurugan et al., “Recent trends in electrochemical biosensors of superoxide dismutases,” Biosensors and Bioelectronics, vol. 116. pp. 89–99, 2018.

[8] “Low cost open source arsenic detector: https://www.kickstarter.com/projects/1499966707/low-cost-open-source-arsenic-detector-for-drinking?ref=category,” citirano dne 6.1.2019.

[9] J. Das, P. Sarkar, J. Panda, and P. Pal, “Low-cost field test kits for arsenic detection in water,” J. Environ. Sci. Heal. - Part A Toxic/Hazardous Subst. Environ. Eng., vol. 49, no. 1, pp. 108–115, 2014.

Zaznavalni niz genetskih biopikslov sklopljenih preko radikalov

2019-01-15T16:24:54Z

Miha Koprivnikar Krajnc:

Izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/nature10722 A. Prindle et.al. "A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’" ''Nature'', 2011]

----

== Ozadje ==

Namen raziskovalcev je bil ustvariti biosenzor za arzen, ki izkorišča bakterijski naravni odzivni sistem na prisotnost arzenita (As3+) in koncept genetskega vezja, ki ta sistem povezuje z reporterskim proteinom na do sedaj nov način; to je preko merjenja frekvence nihanja ekspresije GFP, in ne preko same intenzitete fluorescence, kot je bilo narejeno že pred leti [1].

Ideja je bila ustvariti oscilirajoči senzor. Prednost oscilirajočih senzorjev je preprostost kvantizacije signala, tj. frekvence. V primeru klasičnih, neoscilirajočih senzorjev, pri katerih namesto frekvence merimo intenziteto optičnega signala, moramo vrednosti vedno znova normalizirati in kalibrirati, saj imajo eksperimentalni faktorji, kot je intenziteta vzbujajočega žarka in čas izpostavitve večji vpliv, prav tako nihajni čas ni odvisen od amplitude. Oscilirajoči senzorji so torej boljši za ponovljivost in preprostost meritev, kar prinaša svoje prednosti pri razvoju točnega komercialnega senzorja [2].

== Fizična zasnova in gensko vezje ==

Fizično je biosenzor sestavljeni iz urejenega niza posameznih kolonij E. coli, ki so med seboj ločene s pregradami. Genetsko pa je zapis načrtovan, da je izražanje reporterja sfGFP:

1) pozitivno regulirano z arzenitom (posredno),

2) pospešeno s pomočjo pozitivnih povratnih zank v genskem vezju,

3) medcelično usklajeno na dveh ravneh.

Te dve ravni usklajevanja sta intrakolonijsko preko zaznavanja gostote (ang. »quorum sensing«) in interkolonijsko z reaktivnimi kisikovimi zvrstmi (ROS) in posledično plina H2O2, ki potuje med kolonijami in prodira v celice. Zaznavanje gostote je način regulacije ekspresije proteinov na podlagi gostote populacije celic, ker to pomeni boljši fenotip in izboljša preživetje – neke vrste bakterijski približek večceličnosti. Uporablja se za usklajevanje celic, a na dolge razdalje deluje precej počasi, zato so pri povečevanju obsega (ang. »scaling-up«) dodali usklajevanje preko hlapnega vodikovega peroksida. Obe ravni sta nepogrešljivi za zagotovitev urejenih nihanj. [3].

Namesto da so izdelali oscilirajoči senzor iz ene ogromne kolonije (ki se usklajuje počasi, samo preko zaznavanja gostote), so zvezali tisoče malih oscilirajočih kolonij – biopikslov – v mikrofluidni niz. Znotraj kolonije se oscilacije usklajujejo preko zaznavanja gostote, med kolonijami pa deluje druga, hitrejša raven signalizacije. Le-ta vključuje H2O2 in E.coli lastno »redoks mašinerijo«. Obe vrste signalizacije oz. usklajevanja oscilacij delujeta sinergistično, a zelo različno: zaznavanje gostote je močna, a deluje na kratke razdalje (pod 1 mm), redoks pa je šibkejša, a zagotavlja daljši doseg. Za mikrofluidni niz velja analogno kot za letališča: ni možno (niti koristno), da bi bila vsa letališča med seboj povezana z leti. Leti z manjših letališč so lokalno povezani preko večjih letališč, ki imajo globalne povezave, ta globalna povezava pa v tej analogiji predstavlja redoks signalizacijo.

== Konstrukcija genske platforme za ustvarjanje nihanj ==

Začeli so na intrakolonijski ravni, z uporabo t.i. avtoinduktorja (ang. »autoinducer«) Gram-negativnih bakterij AHL (N-acil homoserin lakton), ki difundira po mediju in deluje med celicami znotraj kolonije. AHL je bistven za zaznavanje gostote: produkt gena LuxI je AHL sintaza. Produkt gena AiiA (autoinducer inhibitor A) je posredni represor gena LuxI, saj deluje kot laktonaza in razgrajuje AHL [4]. AHL se poveže z LuxR in s tem ustavi utišanje genov LuxI, AiiA, sfGFP in Ndh, ki imajo lux promotorje. Povezava AHL z LuxR torej poveča ekspresijo sfGFP in pa samega LuxI – avtoinduktivna pozitivna povratna zanka omogoča pospešitev izražanja in sinhronost skupinskega vedenja. Na drugi strani pa prisotnost gena AiiA pod enakim promotorjem sistemu prinaša fino negativno regulacijo ter zaključitev nihajnega vrha in vrnitev v dno oscilacije. Gena LuxI in AiiA sta tako odgovorna za sinhronizirano nihanje AHL in s tem za oscilacije fluoresciranja biopiksla. Vpliv AHL med kolonijami ni možen, ker so le-te delno ločene, medij med njimi pa ima visok pretok [3], [5], [6].

Interkolonijska redoks signalizacija pa ne deluje s pomočjo molekul, ki difundirajo preko medija, kot je AHL, saj je edina povezava med posameznimi biopiksli preko zraka – uporabili so vodikov peroksid. To so dosegli, z vnosom kopije gena ndh (NADH dehidrogenaza II – NDH-2) pod kontrolo enakega lux promotorja, kot vsi ostali navedeni geni. Ndh je membranski encim in proizvaja H2O2 in superoksidni radikal O2-. Plinasti H2O2 potuje med kolonijami, prodira v celice in posredno aktivira lux promotorje; inaktivira ArcAB, ki je sicer del redoks kontrolnega sistema in se veže na lux promotorje ter jih utiša. Ob prisotnosti peroksida so torej lux geni aktivni. Tovrstna aktivacija omogoča dodatno pozitivno povratno zanko za sinhronizacijo populacije [3].

Ko je bil razvit ta sistem sinhronizacije nihanj v dveh ravneh, so ga poenostavili. Odstranili so gen ndh kot proizvajalec radikalov (ki nato tvorijo peroksid), to nalogo pa je prevzel sam GFP. Ob višku izražanja GFP-ja celice izpostavimo žarku fluorescentne svetlobe, kar povzroči nastanek radikalov in posledično peroksida; ob oscilatornem dnu pa GFP-ja praktično ni, kar pomeni da ob obsevanju ni tudi peroksida. GFP ima tako v poenostavljeni platformi dvojno vlogo: vlogo sklopitelja (generiranje radikalov za globalno sinhroniziranje) in vlogo reporterja [3].

== Vpliv sprememb radikalov na nihalno gensko platformo ==

Naslednji korak raziskovalcev je bil preučiti vpliv okoljskih dejavnikov, ki bi lahko motili količino radikalov, potrebnih za interkolonijsko signalizacijo. Najprej je bil preučen vpliv katalaze in vpliv superoksid dizmutaze (SOD) na nepoenostavljeno platformo – ta, ki generira radikale z ndh. Prisotnost katalaze povzroči izgubo medkolonijske sinhronizacije, ne vpliva pa na oscilacije posameznih kolonij. To pomeni, da odtegnitev peroksida prepreči drugo raven signalizacije in razklopi biopiksle. Na drugi strani pa SOD povzroči izrazit usklajen val fluorescence, kateremu sledi konstanten signal brez oscilacij. Razlog za to je dejstvo, da SOD poveča delež superoksidnega radikala, ki se pretvori v H2O2. Preveč peroksida posledično onemogoči nihanja – pride do konstantne fluorescence. Do zelo velike koncentracije H2O2 pride kljub temu, da je SOD znotrajcelični encim – razlog za to je visoka katalitična aktivnost dizmutaze [3], [7].

Vpliv katalaze in SOD na poenostavljeno platformo je bil identičen kot pri tisti z genom ndh. To potrjuje pomembnost ravno prave količine H2O2, potrebne za usklajevanje biopikslov ter zagotavlja, da sprememba vira radikalov (GFP namesto NDH-2) ne okrni kvalitete radikalne signalizacije med kolonijami. Pri tej platformi so preučili tudi vpliv tiosečnine in ampicilina; tiosečnina je dušilec radikalov in rezultati so pokazali, da kot tak onesposobi sinhronizacijo nihanj, brez da bi škodil viabilnosti. Ampicilin, ki pa proizvaja radikale, prav tako poruši usklajenost nihanj (podobno kot pri SOD), kar pomeni, da prevelika količina radikalov tudi onemogoči sinhronizacijo [3].

== Konstrukcije makroskopskega biosenzorja za arzenit ==

Naloge so se lotili na dva načina. Pri prvem se ob prisotnosti arzenita zgolj spremeni frekvenca nihanja fluorescence, pri drugem pa gre za »on-off« sistem, torej se sinhronizirano nihanje vzpostavi šele ob pražni vrednosti koncentracije arzenita [3].
=== Modulacija frekvence ===
Osnovni platformi so dodali še eno kopijo gena LuxI (gen za AHL sintazo), le da je ta pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa (ArsRE). Ko arzenita ni v mediju, so prisotne bazalne oscilacije zaradi izražanja prvotne kopije LuxI kot posledica peroksida, saj je na arzenit-odzivni element vezan represor ArsR. Ko pa je arzenit prisoten, se poveže z represorjem ArsR, povzroči njegovo oddisociacijo z ArsRE in tako prepreči nadaljnjo represijo LuxI gena – torej zaradi arzenita se izraža dodaten LuxI, kar privede do povečane količine AHL in posledično do povečanega nihajnega časa in amplitude ter zmanjšane frekvence. Testiranje tega konstrukta pri različnih količinah arzenita je pokazalo, da se je nihajni čas sorazmerno povečeval s povečevanjem koncentracije arzenita. Izkazalo se je, da je tak senzor sposoben zaznati in tudi kvantificirati koncentracije arzenita že od 0,2 µM naprej, s tem da WHO direktiva določa zgornjo mejo sprejemljive koncentracije za države v razvoju pri 0,5 µM [3].
=== Vse ali nič ===
Nihanje se zgodi le ob doseganju pražne koncentracije (ang. »thresholding«). V DNA je bil vstavljen zapis za LuxR pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa. Ta gen LuxR isto kot že pri osnovni platformi ni imel povezave s preostankom vezja, torej za razliko od ostalih genov platforme ni pod lux promotorjem; razlika je v tem, da se LuxR ne izraža več konstitutivno kot prej, ampak zgolj in samo inducibilno, in to s strani arzenita. To pomeni, da se v odsotnosti arzenita LuxR ne izraža, za aktivacijo gena LuxI pa je bistven kompleks LuxR-AHL – torej brez le-tega ni fluorescence in ni oscilacij. Ko pa arzenit je prisoten, se izrazi LuxR, zaradi njega in AHL pa tudi LuxI, kar obnovi funkcijo vezja in dobimo usklajeno nihanje. Ta sistem »vse ali nič« se vklopi pri 0,25 µM arzenitu, a to ni absolutna spodnja meja. Pražno koncentracijo se da še dodatno prilagoditi s spreminjanjem komponent genskega vezja (število kopij genov, Shine-Dalgarnovo zaporedje ipd.) [3].

== Zaključek ==

Oba načina signalizacije sta bila uporabljena za »scale-up« tega biosenzorja, a je vseeno potrebna mikroskopija za detekcijo, kar je nepraktično za komercialno uporabo. Ustvarjeni senzor z globalno sinhronizacijo je niz velikosti 24 mm x 12 mm in vsebuje 12 000 biopikslov oz. kolonij, skupno okoli 50 milijonov celic. Kljub že sicer povečanem signalu, ga je potrebno še dodatno ojačati, da bi lahko postal senzor uporaben v vsakdanjem življenju. To bi lahko dosegli s spremembami niza, kot je število biopikslov in njihova razporeditev, kar privede do različnih »output« oscilacij [3].

Za perspektivo je mogoče smiselno omeniti alternative v detekciji arzena, oz. načine, katerim je ta novi biosenzor alternativa. Prva naprava za detekcijo arzenita vodi doda Zn, ta pa katalizira nastanek plina arzina AsH3. Arzin reagira z detektorjem nad gladino, ki vsebuje HgBr (ali AgNO3), in pride do rumenega (ali sivega) obarvanja. Drug način uporablja zlate nanodelce – aptameri so v kompleksu s surfaktanti, ki sicer omogočijo agregacijo zlatih nanodelcev; ko pa pride arzenit, se tvorijo As(III)-aptamer kompleksi, prosti surfaktanti pa sprožijo obarjanje zlata, kar vodi v obarvanje. Tretji način pa je že biosenzor – kolonija E. coli, ki imajo LacZ gen pod ArsRE, zaznavamo pa padec pH, ki je posledica razgradnje laktoze [1], [3], [8], [9].

Vidne prednosti te alternative so nedvoumnost detekcije (ne kot pri redukciji azenita v arzin), manj proizvedenih odpadkov in strupenih snovi (enkratna uporaba ostalih detektorjev, arzin, Hg) in potencialna cenovna konkurenčnost. Predvidena cena konceptualne naprave z biosenzorjem je pod 50$, najpomembneje pa je, da ni za enkratno uporabo kot so trenutni senzorji [1], [3], [8], [9].

== Viri ==

[1] N. Joshi, X. Wang, L. Montgomery, A. Elfick, and C. E. French, “Novel approaches to biosensors for detection of arsenic in drinking water,” Desalination, vol. 248, no. 1–3, pp. 517–523, 2009.

[2] T. Gast, “Sensors with oscillating elements,” J. Phys. E., vol. 18, no. 9, pp. 783–789, 1985.

[3] A. Prindle, P. Samayoa, I. Razinkov, T. Danino, L. S. Tsimring, and J. Hasty, “A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels,’” Nature, vol. 481, no. 7379, pp. 39–44, 2012.

[4] and L.-H. Z. Yi-Hu Dong, Jin-Ling Xu, Xian-Zhen Li, “AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 97, no. 7, pp. 3526–3531, 2000.

[5] “Quorum sensing 101: https://sites.tufts.edu/quorumsensing/quorumsensing101/,” citirano dne 6.1.2019.

[6] T. Chu et al., “In vivo programmed gene expression based on artificial quorum networks,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 81, no. 15, pp. 4984–4992, 2015.

[7] M. Balamurugan et al., “Recent trends in electrochemical biosensors of superoxide dismutases,” Biosensors and Bioelectronics, vol. 116. pp. 89–99, 2018.

[8] “Low cost open source arsenic detector: https://www.kickstarter.com/projects/1499966707/low-cost-open-source-arsenic-detector-for-drinking?ref=category,” citirano dne 6.1.2019.

[9] J. Das, P. Sarkar, J. Panda, and P. Pal, “Low-cost field test kits for arsenic detection in water,” J. Environ. Sci. Heal. - Part A Toxic/Hazardous Subst. Environ. Eng., vol. 49, no. 1, pp. 108–115, 2014.

Zaznavalni niz genetskih biopikslov sklopljenih preko radikalov

2019-01-15T16:23:40Z

Miha Koprivnikar Krajnc:

Izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/nature10722 A. Prindle et.al. "A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’" ''Nature'', 2011]

----

== Ozadje ==

Namen raziskovalcev je bil ustvariti biosenzor za arzen, ki izkorišča bakterijski naravni odzivni sistem na prisotnost arzenita (As3+) in koncept genetskega vezja, ki ta sistem povezuje z reporterskim proteinom na do sedaj nov način; to je preko merjenja frekvence nihanja ekspresije GFP, in ne preko same intenzitete fluorescence, kot je bilo narejeno že pred leti [1].

Ideja je bila ustvariti oscilirajoči senzor. Prednost oscilirajočih senzorjev je preprostost kvantizacije signala, tj. frekvence. V primeru klasičnih, neoscilirajočih senzorjev, pri katerih namesto frekvence merimo intenziteto optičnega signala, moramo vrednosti vedno znova normalizirati in kalibrirati, saj imajo eksperimentalni faktorji, kot je intenziteta vzbujajočega žarka in čas izpostavitve večji vpliv, prav tako nihajni čas ni odvisen od amplitude. Oscilirajoči senzorji so torej boljši za ponovljivost in preprostost meritev, kar prinaša svoje prednosti pri razvoju točnega komercialnega senzorja [2].

== Fizična zasnova in gensko vezje ==

Fizično je biosenzor sestavljeni iz urejenega niza posameznih kolonij E. coli, ki so med seboj ločene s pregradami. Genetsko pa je zapis načrtovan, da je izražanje reporterja sfGFP:

1) pozitivno regulirano z arzenitom (posredno),

2) pospešeno s pomočjo pozitivnih povratnih zank v genskem vezju,

3) medcelično usklajeno na dveh nivojih.

Ta dva nivoja usklajevanja sta intrakolonijsko preko zaznavanja gostote (ang. »quorum sensing«) in interkolonijsko z reaktivnimi kisikovimi zvrstmi (ROS) in posledično plina H2O2, ki potuje med kolonijami in prodira v celice. Zaznavanje gostote je način regulacije ekspresije proteinov na podlagi gostote populacije celic, ker to pomeni boljši fenotip in izboljša preživetje – neke vrste bakterijski približek večceličnosti. Uporablja se za usklajevanje celic, a na dolge razdalje deluje precej počasi, zato so pri povečevanju obsega (ang. »scaling-up«) dodali usklajevanje preko hlapnega vodikovega peroksida. Oba nivoja sta nepogrešljiva za zagotovitev urejenih nihanj. [3].

Namesto da so izdelali oscilirajoči senzor iz ene ogromne kolonije (ki se usklajuje počasi, samo preko zaznavanja gostote), so zvezali tisoče malih oscilirajočih kolonij – biopikslov – v mikrofluidni niz. Znotraj kolonije se oscilacije usklajujejo preko zaznavanja gostote, med kolonijami pa deluje druga, hitrejša raven signalizacije. Le-ta vključuje H2O2 in E.coli lastno »redoks mašinerijo«. Obe vrste signalizacije oz. usklajevanja oscilacij delujeta sinergistično, a zelo različno: zaznavanje gostote je močna, a deluje na kratke razdalje (pod 1 mm), redoks pa je šibkejša, a zagotavlja daljši doseg. Za mikrofluidni niz velja analogno kot za letališča: ni možno (niti koristno), da bi bila vsa letališča med seboj povezana z leti. Leti z manjših letališč so lokalno povezani preko večjih letališč, ki imajo globalne povezave, ta globalna povezava pa v tej analogiji predstavlja redoks signalizacijo.

== Konstrukcija genske platforme za ustvarjanje nihanj ==

Začeli so na intrakolonijskem nivoju, z uporabo t.i. avtoinduktorja (ang. »autoinducer«) Gram-negativnih bakterij AHL (N-acil homoserin lakton), ki difundira po mediju in deluje med celicami znotraj kolonije. AHL je bistven za zaznavanje gostote: produkt gena LuxI je AHL sintaza. Produkt gena AiiA (autoinducer inhibitor A) je posredni represor gena LuxI, saj deluje kot laktonaza in razgrajuje AHL [4]. AHL se poveže z LuxR in s tem ustavi utišanje genov LuxI, AiiA, sfGFP in Ndh, ki imajo lux promotorje. Povezava AHL z LuxR torej poveča ekspresijo sfGFP in pa samega LuxI – avtoinduktivna pozitivna povratna zanka omogoča pospešitev izražanja in sinhronost skupinskega vedenja. Na drugi strani pa prisotnost gena AiiA pod enakim promotorjem sistemu prinaša fino negativno regulacijo ter zaključitev nihajnega vrha in vrnitev v dno oscilacije. Gena LuxI in AiiA sta tako odgovorna za sinhronizirano nihanje AHL in s tem za oscilacije fluoresciranja biopiksla. Vpliv AHL med kolonijami ni možen, ker so le-te delno ločene, medij med njimi pa ima visok pretok [3], [5], [6].

Interkolonijska redoks signalizacija pa ne deluje s pomočjo molekul, ki difundirajo preko medija, kot je AHL, saj je edina povezava med posameznimi biopiksli preko zraka – uporabili so vodikov peroksid. To so dosegli, z vnosom kopije gena ndh (NADH dehidrogenaza II – NDH-2) pod kontrolo enakega lux promotorja, kot vsi ostali navedeni geni. Ndh je membranski encim in proizvaja H2O2 in superoksidni radikal O2-. Plinasti H2O2 potuje med kolonijami, prodira v celice in posredno aktivira lux promotorje; inaktivira ArcAB, ki je sicer del redoks kontrolnega sistema in se veže na lux promotorje ter jih utiša. Ob prisotnosti peroksida so torej lux geni aktivni. Tovrstna aktivacija omogoča dodatno pozitivno povratno zanko za sinhronizacijo populacije [3].

Ko je bil razvit ta sistem sinhronizacije nihanj v dveh nivojih, so ga poenostavili. Odstranili so gen ndh kot proizvajalec radikalov (ki nato tvorijo peroksid), to nalogo pa je prevzel sam GFP. Ob višku izražanja GFP-ja celice izpostavimo žarku fluorescentne svetlobe, kar povzroči nastanek radikalov in posledično peroksida; ob oscilatornem dnu pa GFP-ja praktično ni, kar pomeni da ob obsevanju ni tudi peroksida. GFP ima tako v poenostavljeni platformi dvojno vlogo: vlogo sklopitelja (generiranje radikalov za globalno sinhroniziranje) in vlogo reporterja [3].

== Vpliv sprememb radikalov na nihalno gensko platformo ==

Naslednji korak raziskovalcev je bil preučiti vpliv okoljskih dejavnikov, ki bi lahko motili količino radikalov, potrebnih za interkolonijsko signalizacijo. Najprej je bil preučen vpliv katalaze in vpliv superoksid dizmutaze (SOD) na nepoenostavljeno platformo – ta, ki generira radikale z ndh. Prisotnost katalaze povzroči izgubo medkolonijske sinhronizacije, ne vpliva pa na oscilacije posameznih kolonij. To pomeni, da odtegnitev peroksida prepreči drugo raven signalizacije in razklopi biopiksle. Na drugi strani pa SOD povzroči izrazit usklajen val fluorescence, kateremu sledi konstanten signal brez oscilacij. Razlog za to je dejstvo, da SOD poveča delež superoksidnega radikala, ki se pretvori v H2O2. Preveč peroksida posledično onemogoči nihanja – pride do konstantne fluorescence. Do zelo velike koncentracije H2O2 pride kljub temu, da je SOD znotrajcelični encim – razlog za to je visoka katalitična aktivnost dizmutaze [3], [7].

Vpliv katalaze in SOD na poenostavljeno platformo je bil identičen kot pri tisti z genom ndh. To potrjuje pomembnost ravno prave količine H2O2, potrebne za usklajevanje biopikslov ter zagotavlja, da sprememba vira radikalov (GFP namesto NDH-2) ne okrni kvalitete radikalne signalizacije med kolonijami. Pri tej platformi so preučili tudi vpliv tiosečnine in ampicilina; tiosečnina je dušilec radikalov in rezultati so pokazali, da kot tak onesposobi sinhronizacijo nihanj, brez da bi škodil viabilnosti. Ampicilin, ki pa proizvaja radikale, prav tako poruši usklajenost nihanj (podobno kot pri SOD), kar pomeni, da prevelika količina radikalov tudi onemogoči sinhronizacijo [3].

== Konstrukcije makroskopskega biosenzorja za arzenit ==

Naloge so se lotili na dva načina. Pri prvem se ob prisotnosti arzenita zgolj spremeni frekvenca nihanja fluorescence, pri drugem pa gre za »on-off« sistem, torej se sinhronizirano nihanje vzpostavi šele ob pražni vrednosti koncentracije arzenita [3].
=== Modulacija frekvence ===
Osnovni platformi so dodali še eno kopijo gena LuxI (gen za AHL sintazo), le da je ta pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa (ArsRE). Ko arzenita ni v mediju, so prisotne bazalne oscilacije zaradi izražanja prvotne kopije LuxI kot posledica peroksida, saj je na arzenit-odzivni element vezan represor ArsR. Ko pa je arzenit prisoten, se poveže z represorjem ArsR, povzroči njegovo oddisociacijo z ArsRE in tako prepreči nadaljnjo represijo LuxI gena – torej zaradi arzenita se izraža dodaten LuxI, kar privede do povečane količine AHL in posledično do povečanega nihajnega časa in amplitude ter zmanjšane frekvence. Testiranje tega konstrukta pri različnih količinah arzenita je pokazalo, da se je nihajni čas sorazmerno povečeval s povečevanjem koncentracije arzenita. Izkazalo se je, da je tak senzor sposoben zaznati in tudi kvantificirati koncentracije arzenita že od 0,2 µM naprej, s tem da WHO direktiva določa zgornjo mejo sprejemljive koncentracije za države v razvoju pri 0,5 µM [3].
=== Vse ali nič ===
Nihanje se zgodi le ob doseganju pražne koncentracije (ang. »thresholding«). V DNA je bil vstavljen zapis za LuxR pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa. Ta gen LuxR isto kot že pri osnovni platformi ni imel povezave s preostankom vezja, torej za razliko od ostalih genov platforme ni pod lux promotorjem; razlika je v tem, da se LuxR ne izraža več konstitutivno kot prej, ampak zgolj in samo inducibilno, in to s strani arzenita. To pomeni, da se v odsotnosti arzenita LuxR ne izraža, za aktivacijo gena LuxI pa je bistven kompleks LuxR-AHL – torej brez le-tega ni fluorescence in ni oscilacij. Ko pa arzenit je prisoten, se izrazi LuxR, zaradi njega in AHL pa tudi LuxI, kar obnovi funkcijo vezja in dobimo usklajeno nihanje. Ta sistem »vse ali nič« se vklopi pri 0,25 µM arzenitu, a to ni absolutna spodnja meja. Pražno koncentracijo se da še dodatno prilagoditi s spreminjanjem komponent genskega vezja (število kopij genov, Shine-Dalgarnovo zaporedje ipd.) [3].

== Zaključek ==

Oba načina signalizacije sta bila uporabljena za »scale-up« tega biosenzorja, a je vseeno potrebna mikroskopija za detekcijo, kar je nepraktično za komercialno uporabo. Ustvarjeni senzor z globalno sinhronizacijo je niz velikosti 24 mm x 12 mm in vsebuje 12 000 biopikslov oz. kolonij, skupno okoli 50 milijonov celic. Kljub že sicer povečanem signalu, ga je potrebno še dodatno ojačati, da bi lahko postal senzor uporaben v vsakdanjem življenju. To bi lahko dosegli s spremembami niza, kot je število biopikslov in njihova razporeditev, kar privede do različnih »output« oscilacij [3].

Za perspektivo je mogoče smiselno omeniti alternative v detekciji arzena, oz. načine, katerim je ta novi biosenzor alternativa. Prva naprava za detekcijo arzenita vodi doda Zn, ta pa katalizira nastanek plina arzina AsH3. Arzin reagira z detektorjem nad gladino, ki vsebuje HgBr (ali AgNO3), in pride do rumenega (ali sivega) obarvanja. Drug način uporablja zlate nanodelce – aptameri so v kompleksu s surfaktanti, ki sicer omogočijo agregacijo zlatih nanodelcev; ko pa pride arzenit, se tvorijo As(III)-aptamer kompleksi, prosti surfaktanti pa sprožijo obarjanje zlata, kar vodi v obarvanje. Tretji način pa je že biosenzor – kolonija E. coli, ki imajo LacZ gen pod ArsRE, zaznavamo pa padec pH, ki je posledica razgradnje laktoze [1], [3], [8], [9].

Vidne prednosti te alternative so nedvoumnost detekcije (ne kot pri redukciji azenita v arzin), manj proizvedenih odpadkov in strupenih snovi (enkratna uporaba ostalih detektorjev, arzin, Hg) in potencialna cenovna konkurenčnost. Predvidena cena konceptualne naprave z biosenzorjem je pod 50$, najpomembneje pa je, da ni za enkratno uporabo kot so trenutni senzorji [1], [3], [8], [9].

== Viri ==

[1] N. Joshi, X. Wang, L. Montgomery, A. Elfick, and C. E. French, “Novel approaches to biosensors for detection of arsenic in drinking water,” Desalination, vol. 248, no. 1–3, pp. 517–523, 2009.

[2] T. Gast, “Sensors with oscillating elements,” J. Phys. E., vol. 18, no. 9, pp. 783–789, 1985.

[3] A. Prindle, P. Samayoa, I. Razinkov, T. Danino, L. S. Tsimring, and J. Hasty, “A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels,’” Nature, vol. 481, no. 7379, pp. 39–44, 2012.

[4] and L.-H. Z. Yi-Hu Dong, Jin-Ling Xu, Xian-Zhen Li, “AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 97, no. 7, pp. 3526–3531, 2000.

[5] “Quorum sensing 101: https://sites.tufts.edu/quorumsensing/quorumsensing101/,” citirano dne 6.1.2019.

[6] T. Chu et al., “In vivo programmed gene expression based on artificial quorum networks,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 81, no. 15, pp. 4984–4992, 2015.

[7] M. Balamurugan et al., “Recent trends in electrochemical biosensors of superoxide dismutases,” Biosensors and Bioelectronics, vol. 116. pp. 89–99, 2018.

[8] “Low cost open source arsenic detector: https://www.kickstarter.com/projects/1499966707/low-cost-open-source-arsenic-detector-for-drinking?ref=category,” citirano dne 6.1.2019.

[9] J. Das, P. Sarkar, J. Panda, and P. Pal, “Low-cost field test kits for arsenic detection in water,” J. Environ. Sci. Heal. - Part A Toxic/Hazardous Subst. Environ. Eng., vol. 49, no. 1, pp. 108–115, 2014.

Zaznavalni niz genetskih biopikslov sklopljenih preko radikalov

2019-01-15T16:22:18Z

Miha Koprivnikar Krajnc:

Izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/nature10722 A. Prindle et.al. "A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’" ''Nature'', 2011]

----

== Ozadje ==

Namen raziskovalcev je bil ustvariti biosenzor za arzen, ki izkorišča bakterijski naravni odzivni sistem na prisotnost arzenita (As3+) in koncept genetskega vezja, ki ta sistem povezuje z reporterskim proteinom na do sedaj nov način; to je preko merjenja frekvence nihanja ekspresije GFP, in ne preko same intenzitete fluorescence, kot je bilo narejeno že pred leti [1].

Ideja je bila ustvariti oscilirajoči senzor. Prednost oscilirajočih senzorjev je preprostost kvantizacije signala, tj. frekvence. V primeru klasičnih, neoscilirajočih senzorjev, pri katerih namesto frekvence merimo intenziteto optičnega signala, moramo vrednosti vedno znova normalizirati in kalibrirati, saj imajo eksperimentalni faktorji, kot je intenziteta vzbujajočega žarka in čas izpostavitve večji vpliv, prav tako nihajni čas ni odvisen od amplitude. Oscilirajoči senzorji so torej boljši za ponovljivost in preprostost meritev, kar prinaša svoje prednosti pri razvoju točnega komercialnega senzorja [2].

== Fizična zasnova in gensko vezje ==

Fizično je biosenzor sestavljeni iz urejenega niza posameznih kolonij E. coli, ki so med seboj ločene s pregradami. Genetsko pa je zapis načrtovan, da je izražanje reporterja sfGFP:

1) pozitivno regulirano z arzenitom (posredno),

2) pospešeno s pomočjo pozitivnih povratnih zank v genskem vezju,

3) medcelično usklajeno na dveh nivojih.

Ta dva nivoja usklajevanja sta intrakolonijsko preko zaznavanja gostote (ang. »quorum sensing«) in interkolonijsko z reaktivnimi kisikovimi zvrstmi (ROS) in posledično plina H2O2, ki potuje med kolonijami in prodira v celice. Zaznavanje gostote je način regulacije ekspresije proteinov na podlagi gostote populacije celic, ker to pomeni boljši fenotip in izboljša preživetje – neke vrste bakterijski približek večceličnosti. Uporablja se za usklajevanje celic, a na dolge razdalje deluje precej počasi, zato so pri povečevanju obsega (ang. »scaling-up«) dodali usklajevanje preko hlapnega vodikovega peroksida. Oba nivoja sta nepogrešljiva za zagotovitev urejenih nihanj. [3].

Namesto da so izdelali oscilirajoči senzor iz ene ogromne kolonije (ki se usklajuje počasi, samo preko zaznavanja gostote), so zvezali tisoče malih oscilirajočih kolonij – biopikslov – v mikrofluidni niz. Znotraj kolonije se oscilacije usklajujejo preko zaznavanja gostote, med kolonijami pa deluje druga, hitrejša raven signalizacije. Le-ta vključuje H2O2 in E.coli lastno »redoks mašinerijo«. Obe vrste signalizacije oz. usklajevanja oscilacij delujeta sinergistično, a zelo različno: zaznavanje gostote je močna, a deluje na kratke razdalje (pod 1 mm), redoks pa je šibkejša, a zagotavlja daljši doseg. Za mikrofluidni niz velja analogno kot za letališča: ni možno (niti koristno), da bi bila vsa letališča med seboj povezana z leti. Leti z manjših letališč so lokalno povezani preko večjih letališč, ki imajo globalne povezave, ta globalna povezava pa v tej analogiji predstavlja redoks signalizacijo.

== Konstrukcija genske platforme za ustvarjanje nihanj ==

Začeli so na intrakolonijskem nivoju, z uporabo t.i. avtoinduktorja (ang. »autoinducer«) Gram-negativnih bakterij AHL (N-acil homoserin lakton), ki difundira po mediju in deluje med celicami znotraj kolonije. AHL je bistven za zaznavanje gostote: produkt gena LuxI je AHL sintaza. Produkt gena AiiA (autoinducer inhibitor A) je posredni represor gena LuxI, saj deluje kot laktonaza in razgrajuje AHL [4]. AHL se poveže z LuxR in s tem ustavi utišanje genov LuxI, AiiA, sfGFP in Ndh, ki imajo lux promotorje. Povezava AHL z LuxR torej poveča ekspresijo sfGFP in pa samega LuxI – avtoinduktivna pozitivna povratna zanka omogoča pospešitev izražanja in sinhronost skupinskega vedenja. Na drugi strani pa prisotnost gena AiiA pod enakim promotorjem sistemu prinaša fino negativno regulacijo ter zaključitev nihajnega vrha in vrnitev v dno oscilacije. Gena LuxI in AiiA sta tako odgovorna za sinhronizirano nihanje AHL in s tem za oscilacije fluoresciranja biopiksla. Vpliv AHL med kolonijami ni možen, ker so le-te delno ločene, medij med njimi pa ima visok pretok [3], [5], [6].

Interkolonijska redoks signalizacija pa ne deluje s pomočjo molekul, ki difundirajo preko medija, kot je AHL, saj je edina povezava med posameznimi biopiksli preko zraka – uporabili so vodikov peroksid. To so dosegli, z vnosom kopije gena ndh (NADH dehidrogenaza II – NDH-2) pod kontrolo enakega lux promotorja, kot vsi ostali navedeni geni. Ndh je membranski encim in proizvaja H2O2 in superoksidni radikal O2-. Plinasti H2O2 potuje med kolonijami, prodira v celice in posredno aktivira lux promotorje; inaktivira ArcAB, ki je sicer del redoks kontrolnega sistema in se veže na lux promotorje ter jih utiša. Ob prisotnosti peroksida so torej lux geni aktivni. Tovrstna aktivacija omogoča dodatno pozitivno povratno zanko za sinhronizacijo populacije [3].

Ko je bil razvit ta sistem sinhronizacije nihanj v dveh nivojih, so ga poenostavili. Odstranili so gen ndh kot proizvajalec radikalov (ki nato tvorijo peroksid), to nalogo pa je prevzel sam GFP. Ob višku izražanja GFP-ja celice izpostavimo žarku fluorescentne svetlobe, kar povzroči nastanek radikalov in posledično peroksida; ob oscilatornem dnu pa GFP-ja praktično ni, kar pomeni da ob obsevanju ni tudi peroksida. GFP ima tako v poenostavljeni platformi dvojno vlogo: vlogo sklopitelja (generiranje radikalov za globalno sinhroniziranje) in vlogo reporterja [3].

== Vpliv sprememb radikalov na nihalno gensko platformo ==

Naslednji korak raziskovalcev je bil preučiti vpliv okoljskih dejavnikov, ki bi lahko motili količino radikalov, potrebnih za interkolonijsko signalizacijo. Najprej je bil preučen vpliv katalaze in vpliv superoksid dizmutaze (SOD) na nepoenostavljeno platformo – ta, ki generira radikale z ndh. Prisotnost katalaze povzroči izgubo medkolonijske sinhronizacije, ne vpliva pa na oscilacije posameznih kolonij. To pomeni, da odtegnitev peroksida prepreči drugo raven signalizacije in razklopi biopiksle. Na drugi strani pa SOD povzroči izrazit usklajen val fluorescence, kateremu sledi konstanten signal brez oscilacij. Razlog za to je dejstvo, da SOD poveča delež superoksidnega radikala, ki se pretvori v H2O2. Preveč peroksida posledično onemogoči nihanja – pride do konstantne fluorescence. Do zelo velike koncentracije H2O2 pride kljub temu, da je SOD znotrajcelični encim – razlog za to je visoka katalitična aktivnost dizmutaze [3], [7].

Vpliv katalaze in SOD na poenostavljeno platformo je bil identičen kot pri tisti z genom ndh. To potrjuje pomembnost ravno prave količine H2O2, potrebne za usklajevanje biopikslov ter zagotavlja, da sprememba vira radikalov (GFP namesto NDH-2) ne okrni kvalitete radikalne signalizacije med kolonijami. Pri tej platformi so preučili tudi vpliv tiosečnine in ampicilina; tiosečnina je dušilec radikalov in rezultati so pokazali, da kot tak onesposobi sinhronizacijo nihanj, brez da bi škodil viabilnosti. Ampicilin, ki pa proizvaja radikale, prav tako poruši usklajenost nihanj (podobno kot pri SOD), kar pomeni, da prevelika količina radikalov tudi onemogoči sinhronizacijo [3].

== Konstrukcije makroskopskega biosenzorja za arzenit ==

Naloge so se lotili na dva načina. Pri prvem se ob prisotnosti arzenita zgolj spremeni frekvenca nihanja fluorescence, pri drugem pa gre za »on-off« sistem, torej se sinhronizirano nihanje vzpostavi šele ob pražni vrednosti koncentracije arzenita [3].
=== Modulacija frekvence ===
Osnovni platformi so dodali še eno kopijo gena LuxI (gen za AHL sintazo), le da je ta pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa (ArsRE). Ko arzenita ni v mediju, so prisotne bazalne oscilacije zaradi izražanja prvotne kopije LuxI kot posledica peroksida, saj je na arzenit-odzivni element vezan represor ArsR. Ko pa je arzenit prisoten, se poveže z represorjem ArsR, povzroči njegovo oddisociacijo z ArsRE in tako prepreči nadaljnjo represijo LuxI gena – torej zaradi arzenita se izraža dodaten LuxI, kar privede do povečane količine AHL in posledično do povečanega nihajnega časa in amplitude ter zmanjšane frekvence. Testiranje tega konstrukta pri različnih količinah arzenita je pokazalo, da se je nihajni čas sorazmerno povečeval s povečevanjem koncentracije arzenita. Izkazalo se je, da je tak senzor sposoben zaznati in tudi kvantificirati koncentracije arzenita že od 0,2 µM naprej, s tem da WHO direktiva določa zgornjo mejo sprejemljive koncentracije za države v razvoju pri 0,5 µM [3].
=== Vse ali nič ===
Nihanje se zgodi le ob doseganju pražne koncentracije (ang. »thresholding«). V DNA je bil vstavljen zapis za LuxR pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa. Ta gen LuxR isto kot že pri osnovni platformi ni imel povezave s preostankom vezja, torej za razliko od ostalih genov platforme ni pod lux promotorjem; razlika je v tem, da se LuxR ne izraža več konstitutivno kot prej, ampak zgolj in samo inducibilno, in to s strani arzenita. To pomeni, da se v odsotnosti arzenita LuxR ne izraža, za aktivacijo gena LuxI pa je bistven kompleks LuxR-AHL – torej brez le-tega ni fluorescence in ni oscilacij. Ko pa arzenit je prisoten, se izrazi LuxR, zaradi njega in AHL pa tudi LuxI, kar obnovi funkcijo vezja in dobimo usklajeno nihanje. Ta sistem »vse ali nič« se vklopi pri 0,25 µM arzenitu, a to ni absolutna spodnja meja. Pražno koncentracijo se da še dodatno prilagoditi s spreminjanjem komponent genskega vezja (število kopij genov, Shine-Dalgarnovo zaporedje ipd.) [3].

== Zaključek ==

Oba načina signalizacije sta bila uporabljena za »scale-up« tega biosenzorja, a je vseeno potrebna mikroskopija za detekcijo, kar je nepraktično za komercialno uporabo. Ustvarjeni senzor z globalno sinhronizacijo je niz velikosti 24 mm x 12 mm in vsebuje 12 000 biopikslov oz. kolonij, skupno okoli 50 milijonov celic. Kljub že sicer povečanem signalu, ga je potrebno še dodatno ojačati, da bi lahko postal senzor uporaben v vsakdanjem življenju. To bi lahko dosegli s spremembami niza, kot je število biopikslov in njihova razporeditev, kar privede do različnih »output« oscilacij [3].

Za perspektivo je mogoče smiselno omeniti alternative v detekciji arzena, oz. načine, katerim je ta novi biosenzor alternativa. Prva naprava za detekcijo arzenita vodi doda Zn, ta pa katalizira nastanek plina arzina AsH3. Arzin reagira z detektorjem nad gladino, ki vsebuje HgBr (ali AgNO3), in pride do rumenega (ali sivega) obarvanja. Drug način uporablja zlate nanodelce – aptameri so v kompleksu s surfaktanti, ki sicer omogočijo agregacijo zlatih nanodelcev; ko pa pride arzenit, se tvorijo As(III)-aptamer kompleksi, prosti surfaktanti pa sprožijo obarjanje zlata, kar vodi v obarvanje. Tretji način pa je že biosenzor – kolonija E. coli, ki imajo LacZ gen pod ArsRE, zaznavamo pa padec pH, ki je posledica razgradnje laktoze [1], [3], [8], [9].

Vidne prednosti te alternative so nedvoumnost detekcije (ne kot pri redukciji azenita v arzin), manj proizvedenih odpadkov in strupenih snovi (enkratna uporaba ostalih detektorjev, arzin, Hg) in potencialna cenovna konkurenčnost. Predvidena cena konceptualne naprave z biosenzorjem je pod 50$, najpomembneje pa je, da ni za enkratno uporabo kot so trenutni senzorji [1], [3], [8], [9].

== Viri ==

[1] N. Joshi, X. Wang, L. Montgomery, A. Elfick, and C. E. French, “Novel approaches to biosensors for detection of arsenic in drinking water,” Desalination, vol. 248, no. 1–3, pp. 517–523, 2009.

[2] T. Gast, “Sensors with oscillating elements,” J. Phys. E., vol. 18, no. 9, pp. 783–789, 1985.

[3] A. Prindle, P. Samayoa, I. Razinkov, T. Danino, L. S. Tsimring, and J. Hasty, “A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels,’” Nature, vol. 481, no. 7379, pp. 39–44, 2012.

[4] and L.-H. Z. Yi-Hu Dong, Jin-Ling Xu, Xian-Zhen Li, “AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 97, no. 7, pp. 3526–3531, 2000.

[5] “Quorum sensing 101: https://sites.tufts.edu/quorumsensing/quorumsensing101/,” citirano dne 6.1.2019.

[6] T. Chu et al., “In vivo programmed gene expression based on artificial quorum networks,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 81, no. 15, pp. 4984–4992, 2015.

[7] M. Balamurugan et al., “Recent trends in electrochemical biosensors of superoxide dismutases,” Biosensors and Bioelectronics, vol. 116. pp. 89–99, 2018.

[8] “Low cost open source arsenic detector: https://www.kickstarter.com/projects/1499966707/low-cost-open-source-arsenic-detector-for-drinking?ref=category,” citirano dne 6.1.2019.

[9] J. Das, P. Sarkar, J. Panda, and P. Pal, “Low-cost field test kits for arsenic detection in water,” J. Environ. Sci. Heal. - Part A Toxic/Hazardous Subst. Environ. Eng., vol. 49, no. 1, pp. 108–115, 2014.

Seminarji SB 2018/19

2019-01-15T16:21:43Z

Miha Koprivnikar Krajnc:

V študijskem letu 2018/19 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RNA-stikala_tipa_%C2%BBToehold%C2%AB:_de_novo_oblikovani_regulatorji_izra%C5%BEanja_genov RNA-stikala tipa Toehold: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov] (Špela Malenšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Raznoliko_in_modelno_zasnovana_priprava_sinteti%C4%8Dnih_genskih_vezij_s_predvidenimi_lastnostmi Raznoliko in modelno zasnovana priprava sintetičnih genskih vezij s predvidenimi lastnostmi] (Matej Kolarič)

[[Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage]] (Fran Krstanović)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nekaj_pogledov_na_sistemsko_biologijo_kvasovke Nekaj pogledov na sistemsko biologijo kvasovke] (Gašper Žun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organizacija_znotrajceli%C4%8Dnih_reakcij_z_razumsko_na%C4%8Drtovanimi_RNA_sestavi#Na.C4.8Drtovanje_in_sestavljanje_RNA_sestavov Organizacija znotrajceličnih reakcij z razumsko načrtovanimi RNA sestavi] (Urška Jelenovec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biolo%C5%A1ko_vezje_na_osnovi_RNA-interference_za_identifikacijo_specifi%C4%8Dnih_rakavih_celic Biološko vezje na osnovi RNA-interference za identifikacijo specifičnih rakavih celic] (Gašper Marinšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kontrola_hitrosti_translacije_preko_pomožnega_mesta_5’-UTR:_energijski_kompromis_med_dostopnostjo%2C_selektivnim_razvijanjem_RNA-struktur_in_drsenjem_30S_ribosomske_podenote_po_RNA-strukturah Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah] (Neža Koritnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_genskega_skupka_za_fiksacijo_dušika_bakterije_Klebsiella_oxytoca Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije ''Klebsiella oxytoca''] (Gašper Virant)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Negativna_samoregulacija_linearizira_odziv_na_odmerek_in_zavira_heterogenost_genskega_izražanja Negativna samoregulacija linearizira odziv na odmerek in zavira heterogenost genskega izražanja] (Primož Tič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Design_and_analysis_of_synthetic_carbon_fixation_pathways Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways] (Marija Atanasova)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pol-sinteti%C4%8Den_organizem_z_raz%C5%A1irjeno_gensko_abecedo Pol-sintetičen organizem z razširjeno gensko abecedo] (Peter Pečan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programirano_uti%C5%A1anje_in_aktivacija_izra%C5%BEanja_bakterijskega_gena_z_uporabo_konstruiranega_CRISPR-Cas_sistema Programirano utišanje in aktivacija izražanja bakterijskega gena z uporabo konstruiranega CRISPR-Cas sistema] (Tjaša Sorčan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_optogenetska_transkripcijska_naprava_za_izboljšanje_homeostaze_krvnega_sladkorja_pri_miših Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših] (Natalija Pucihar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_bakterij_Escherichia_coli_odzivnih_na_svetlobo Inženiring bakterij ''Escherichia coli'' odzivnih na svetlobo] (Karmen Žbogar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_in%C5%BEeniring_intergenskih_regij_v_operonih_uravnava_izra%C5%BEanje_ve%C4%8D_genov Kombinatorični inženiring intergenskih regij v operonih uravnava izražanje več genov] (Urška Kašnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Stohasti%C4%8Dna_oja%C4%8Ditev_in_signalizacija_v_substratnih_ciklih_s_%C5%A1umom_induciranih_bistabilnosti_z_oscilacijami Stohastična ojačitev in signalizacija v substratnih ciklih s šumom induciranih bistabilnosti z oscilacijami] (Uroš Zavrtanik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zaznavalni_niz_genetskih_biopikslov_sklopljenih_preko_radikalov Zaznavalni niz genetskih "biopikslov", sklopljenih preko radikalov] (Miha Koprivnikar Krajnc)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularna_optimizacija_večgenskih_poti_za_proizvodnjo_maščobnih_kislin_v_E._coli Modularna optimizacija večgenskih poti za proizvodnjo maščobnih kislin v ''E. coli''] (Špela Koren)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Canditect:_hitra_detekcija_vaginalne_infekcije_s_Candido_albicans_z_uporabo_sistema_CRISPR/dCas9 Canditect – hitra detekcija vaginalne infekcije s Candido albicans z uporabo sistema CRISPR/dCas9] (Jerneja Ovčar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAPOEIRA_-_razvoj_personaliziranega_cepiva_proti_raku_in_sistema_za_spremljanje_odziva_na_zdravljenje CAPOEIRA – razvoj personaliziranega cepiva proti raku in sistema za spremljanje odziva na zdravljenje] (Anamarija Habič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biotic_Blue_-_encimska_razgradnja_zdravilnih_u%C4%8Dinkovin_v_odpadnih_vodah#BIOTIC_BLUE BIOTIC BLUE - encimska razgradnja zdravilnih učinkovin v odpadnih vodah] (Tina Požun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Of_CO2urse_-_sistem_za_zmanj%C5%A1evanje_izpustov_ogljikovega_dioksida_v_industriji Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji] (Kity Požek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cockroach_terminator Cockroach terminator]] (Roberta Mulac)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MiBiome_-_probioti%C4%8Dna_bakterija_za_zdravljenje_kroni%C4%8Dne_vnetne_%C4%8Drevesne_bolezni MiBiome - probiotična bakterija za zdravljenje kronične vnetne črevesne bolezni] (Ernest Šprager)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BioWatcher_pametna_ura_za_sledenje_ravni_biomarkerjev_za_bolezni BioWatcher: Pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni] (Nina Mavec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAT-Seq:_Visokoprepustna_metoda_za_analizo_katalitske_aktivnosti_biomolekul CAT-Seq: Visokoprepustna metoda za analizo katalitske aktivnosti biomolekul] (Bine Tršavec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/VIBRIGENS:_pospe%C5%A1evanje_procesov_sintezne_biologije_z_Vibrio_natriegens VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z ''Vibrio natriegens''] (Tadej Satler)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/APIS-_nov_pristop_za_zdravljenje_oku%C5%BEbe_z_Nosema_caranae_pri_%C4%8Debelah#PROJEKT_APIS APIS- nov pristop za zdravljenje okužbe z Nosema caranae pri čebelah] (Jerneja Kocutar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/StyGreen_-_proizvodnja_stirena_iz_obnovljivih_virov: StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov] (Milena Stojkovska)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

22.11. 
1 
2 Valentina Levak 

27.11. 
1 
2 
3 
4 

29.11. 
1 Matej Kolarič 
2 Špela Malenšek 
3 
4 

4.12. 
1 Gašper Žun 
2 Fran Krstanovic 
3 
4 

6.12. 
1 Urška Jelenovec 
2 Rok Miklavčič 
3 
4 

11.12. 
1 Jerneja Ovčar 
2 Neža Koritnik 
3 Gašper Virant 
4 Gašper Marinšek 

18.12. 
1 Tina Požun 
2 Anamarija Habič 
3 Roberta Mulac 
4 Kity Požek 

3.1. 
1 Nina Mavec 
2 Primož Tič 
3 Ernest Šprager 
4 

8.1. 
1 Marija Atanasova 
2 Bine Tršavec 
3 Peter Pečan 
4 Tjaša Sorčan 

10.1. 
1 Urška Kašnik 
2 Natalija Pucihar 
3 Karmen Žbogar 
4 Uroš Zavrtanik 

15.1. 
1 Jerneja Kocutar 
2 Špela Koren 
3 Tadej Satler 
4 Miha Koprivnikar Krajnc 

17.1. 
1 Milena Stojkovska 
2 Blaž Lebar

Seminarji SB 2018/19

2019-01-15T16:21:03Z

Miha Koprivnikar Krajnc:

V študijskem letu 2018/19 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RNA-stikala_tipa_%C2%BBToehold%C2%AB:_de_novo_oblikovani_regulatorji_izra%C5%BEanja_genov RNA-stikala tipa Toehold: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov] (Špela Malenšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Raznoliko_in_modelno_zasnovana_priprava_sinteti%C4%8Dnih_genskih_vezij_s_predvidenimi_lastnostmi Raznoliko in modelno zasnovana priprava sintetičnih genskih vezij s predvidenimi lastnostmi] (Matej Kolarič)

[[Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage]] (Fran Krstanović)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nekaj_pogledov_na_sistemsko_biologijo_kvasovke Nekaj pogledov na sistemsko biologijo kvasovke] (Gašper Žun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organizacija_znotrajceli%C4%8Dnih_reakcij_z_razumsko_na%C4%8Drtovanimi_RNA_sestavi#Na.C4.8Drtovanje_in_sestavljanje_RNA_sestavov Organizacija znotrajceličnih reakcij z razumsko načrtovanimi RNA sestavi] (Urška Jelenovec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biolo%C5%A1ko_vezje_na_osnovi_RNA-interference_za_identifikacijo_specifi%C4%8Dnih_rakavih_celic Biološko vezje na osnovi RNA-interference za identifikacijo specifičnih rakavih celic] (Gašper Marinšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kontrola_hitrosti_translacije_preko_pomožnega_mesta_5’-UTR:_energijski_kompromis_med_dostopnostjo%2C_selektivnim_razvijanjem_RNA-struktur_in_drsenjem_30S_ribosomske_podenote_po_RNA-strukturah Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah] (Neža Koritnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_genskega_skupka_za_fiksacijo_dušika_bakterije_Klebsiella_oxytoca Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije ''Klebsiella oxytoca''] (Gašper Virant)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Negativna_samoregulacija_linearizira_odziv_na_odmerek_in_zavira_heterogenost_genskega_izražanja Negativna samoregulacija linearizira odziv na odmerek in zavira heterogenost genskega izražanja] (Primož Tič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Design_and_analysis_of_synthetic_carbon_fixation_pathways Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways] (Marija Atanasova)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pol-sinteti%C4%8Den_organizem_z_raz%C5%A1irjeno_gensko_abecedo Pol-sintetičen organizem z razširjeno gensko abecedo] (Peter Pečan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programirano_uti%C5%A1anje_in_aktivacija_izra%C5%BEanja_bakterijskega_gena_z_uporabo_konstruiranega_CRISPR-Cas_sistema Programirano utišanje in aktivacija izražanja bakterijskega gena z uporabo konstruiranega CRISPR-Cas sistema] (Tjaša Sorčan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_optogenetska_transkripcijska_naprava_za_izboljšanje_homeostaze_krvnega_sladkorja_pri_miših Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših] (Natalija Pucihar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_bakterij_Escherichia_coli_odzivnih_na_svetlobo Inženiring bakterij ''Escherichia coli'' odzivnih na svetlobo] (Karmen Žbogar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_in%C5%BEeniring_intergenskih_regij_v_operonih_uravnava_izra%C5%BEanje_ve%C4%8D_genov Kombinatorični inženiring intergenskih regij v operonih uravnava izražanje več genov] (Urška Kašnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Stohasti%C4%8Dna_oja%C4%8Ditev_in_signalizacija_v_substratnih_ciklih_s_%C5%A1umom_induciranih_bistabilnosti_z_oscilacijami Stohastična ojačitev in signalizacija v substratnih ciklih s šumom induciranih bistabilnosti z oscilacijami] (Uroš Zavrtanik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zaznavalni_niz_genetskih_biopikslov,_sklopljenih_preko_radikalov Zaznavalni niz genetskih "biopikslov", sklopljenih preko radikalov] (Miha Koprivnikar Krajnc)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularna_optimizacija_večgenskih_poti_za_proizvodnjo_maščobnih_kislin_v_E._coli Modularna optimizacija večgenskih poti za proizvodnjo maščobnih kislin v ''E. coli''] (Špela Koren)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Canditect:_hitra_detekcija_vaginalne_infekcije_s_Candido_albicans_z_uporabo_sistema_CRISPR/dCas9 Canditect – hitra detekcija vaginalne infekcije s Candido albicans z uporabo sistema CRISPR/dCas9] (Jerneja Ovčar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAPOEIRA_-_razvoj_personaliziranega_cepiva_proti_raku_in_sistema_za_spremljanje_odziva_na_zdravljenje CAPOEIRA – razvoj personaliziranega cepiva proti raku in sistema za spremljanje odziva na zdravljenje] (Anamarija Habič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biotic_Blue_-_encimska_razgradnja_zdravilnih_u%C4%8Dinkovin_v_odpadnih_vodah#BIOTIC_BLUE BIOTIC BLUE - encimska razgradnja zdravilnih učinkovin v odpadnih vodah] (Tina Požun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Of_CO2urse_-_sistem_za_zmanj%C5%A1evanje_izpustov_ogljikovega_dioksida_v_industriji Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji] (Kity Požek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cockroach_terminator Cockroach terminator]] (Roberta Mulac)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MiBiome_-_probioti%C4%8Dna_bakterija_za_zdravljenje_kroni%C4%8Dne_vnetne_%C4%8Drevesne_bolezni MiBiome - probiotična bakterija za zdravljenje kronične vnetne črevesne bolezni] (Ernest Šprager)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BioWatcher_pametna_ura_za_sledenje_ravni_biomarkerjev_za_bolezni BioWatcher: Pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni] (Nina Mavec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAT-Seq:_Visokoprepustna_metoda_za_analizo_katalitske_aktivnosti_biomolekul CAT-Seq: Visokoprepustna metoda za analizo katalitske aktivnosti biomolekul] (Bine Tršavec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/VIBRIGENS:_pospe%C5%A1evanje_procesov_sintezne_biologije_z_Vibrio_natriegens VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z ''Vibrio natriegens''] (Tadej Satler)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/APIS-_nov_pristop_za_zdravljenje_oku%C5%BEbe_z_Nosema_caranae_pri_%C4%8Debelah#PROJEKT_APIS APIS- nov pristop za zdravljenje okužbe z Nosema caranae pri čebelah] (Jerneja Kocutar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/StyGreen_-_proizvodnja_stirena_iz_obnovljivih_virov: StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov] (Milena Stojkovska)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

22.11. 
1 
2 Valentina Levak 

27.11. 
1 
2 
3 
4 

29.11. 
1 Matej Kolarič 
2 Špela Malenšek 
3 
4 

4.12. 
1 Gašper Žun 
2 Fran Krstanovic 
3 
4 

6.12. 
1 Urška Jelenovec 
2 Rok Miklavčič 
3 
4 

11.12. 
1 Jerneja Ovčar 
2 Neža Koritnik 
3 Gašper Virant 
4 Gašper Marinšek 

18.12. 
1 Tina Požun 
2 Anamarija Habič 
3 Roberta Mulac 
4 Kity Požek 

3.1. 
1 Nina Mavec 
2 Primož Tič 
3 Ernest Šprager 
4 

8.1. 
1 Marija Atanasova 
2 Bine Tršavec 
3 Peter Pečan 
4 Tjaša Sorčan 

10.1. 
1 Urška Kašnik 
2 Natalija Pucihar 
3 Karmen Žbogar 
4 Uroš Zavrtanik 

15.1. 
1 Jerneja Kocutar 
2 Špela Koren 
3 Tadej Satler 
4 Miha Koprivnikar Krajnc 

17.1. 
1 Milena Stojkovska 
2 Blaž Lebar

Seminarji SB 2018/19

2019-01-15T16:20:23Z

Miha Koprivnikar Krajnc:

Zaznavalni niz genetskih biopikslov sklopljenih preko radikalov

2019-01-15T16:19:26Z

Miha Koprivnikar Krajnc:

Izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/nature10722 A. Prindle et.al. "A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’" ''Nature'', 2011]

----

== Ozadje ==

Namen raziskovalcev je bil ustvariti biosenzor za arzen, ki izkorišča bakterijski naravni odzivni sistem na prisotnost arzenita (As3+) in koncept genetskega vezja, ki ta sistem povezuje z reporterskim proteinom na do sedaj nov način; to je preko merjenja frekvence nihanja ekspresije GFP, in ne preko same intenzitete fluorescence, kot je bilo narejeno že pred leti [1].

Ideja je bila ustvariti oscilirajoči senzor. Prednost oscilirajočih senzorjev je preprostost kvantizacije signala, tj. frekvence. V primeru klasičnih, neoscilirajočih senzorjev, pri katerih namesto frekvence merimo intenziteto optičnega signala, moramo vrednosti vedno znova normalizirati in kalibrirati, saj imajo eksperimentalni faktorji, kot je intenziteta vzbujajočega žarka in čas izpostavitve večji vpliv, prav tako nihajni čas ni odvisen od amplitude. Oscilirajoči senzorji so torej boljši za ponovljivost in preprostost meritev, kar prinaša svoje prednosti pri razvoju točnega komercialnega senzorja [2].

== Fizična zasnova in gensko vezje ==

Fizično je biosenzor sestavljeni iz urejenega niza posameznih kolonij E. coli, ki so med seboj ločene s pregradami. Genetsko pa je zapis načrtovan, da je izražanje reporterja sfGFP:

1) pozitivno regulirano z arzenitom (posredno),

2) pospešeno s pomočjo pozitivnih povratnih zank v genskem vezju,

3) medcelično usklajeno na dveh nivojih.

Ta dva nivoja usklajevanja sta intrakolonijsko preko zaznavanja gostote (ang. »quorum sensing«) in interkolonijsko z reaktivnimi kisikovimi zvrstmi (ROS) in posledično plina H2O2, ki potuje med kolonijami in prodira v celice. Zaznavanje gostote je način regulacije ekspresije proteinov na podlagi gostote populacije celic, ker to pomeni boljši fenotip in izboljša preživetje – neke vrste bakterijski približek večceličnosti. Uporablja se za usklajevanje celic, a na dolge razdalje deluje precej počasi, zato so pri povečevanju obsega (ang. »scaling-up«) dodali usklajevanje preko hlapnega vodikovega peroksida. Oba nivoja sta nepogrešljiva za zagotovitev urejenih nihanj. [3].

Namesto da so izdelali oscilirajoči senzor iz ene ogromne kolonije (ki se usklajuje počasi, samo preko zaznavanja gostote), so zvezali tisoče malih oscilirajočih kolonij – biopikslov – v mikrofluidni niz. Znotraj kolonije se oscilacije usklajujejo preko zaznavanja gostote, med kolonijami pa deluje druga, hitrejša raven signalizacije. Le-ta vključuje H2O2 in E.coli lastno »redoks mašinerijo«. Obe vrste signalizacije oz. usklajevanja oscilacij delujeta sinergistično, a zelo različno: zaznavanje gostote je močna, a deluje na kratke razdalje (pod 1 mm), redoks pa je šibkejša, a zagotavlja daljši doseg. Za mikrofluidni niz velja analogno kot za letališča: ni možno (niti koristno), da bi bila vsa letališča med seboj povezana z leti. Leti z manjših letališč so lokalno povezani preko večjih letališč, ki imajo globalne povezave, ta globalna povezava pa v tej analogiji predstavlja redoks signalizacijo.

== Konstrukcija genske platforme za ustvarjanje nihanj ==

Začeli so na intrakolonijskem nivoju, z uporabo t.i. avtoinduktorja (ang. »autoinducer«) Gram-negativnih bakterij AHL (N-acil homoserin lakton), ki difundira po mediju in deluje med celicami znotraj kolonije. AHL je bistven za zaznavanje gostote: produkt gena LuxI je AHL sintaza. Produkt gena AiiA (autoinducer inhibitor A) je posredni represor gena LuxI, saj deluje kot laktonaza in razgrajuje AHL [4]. AHL se poveže z LuxR in s tem ustavi utišanje genov LuxI, AiiA, sfGFP in Ndh, ki imajo lux promotorje. Povezava AHL z LuxR torej poveča ekspresijo sfGFP in pa samega LuxI – avtoinduktivna pozitivna povratna zanka omogoča pospešitev izražanja in sinhronost skupinskega vedenja. Na drugi strani pa prisotnost gena AiiA pod enakim promotorjem sistemu prinaša fino negativno regulacijo ter zaključitev nihajnega vrha in vrnitev v dno oscilacije. Gena LuxI in AiiA sta tako odgovorna za sinhronizirano nihanje AHL in s tem za oscilacije fluoresciranja biopiksla. Vpliv AHL med kolonijami ni možen, ker so le-te delno ločene, medij med njimi pa ima visok pretok [3], [5], [6].

Interkolonijska redoks signalizacija pa ne deluje s pomočjo molekul, ki difundirajo preko medija, kot je AHL, saj je edina povezava med posameznimi biopiksli preko zraka – uporabili so vodikov peroksid. To so dosegli, z vnosom kopije gena ndh (NADH dehidrogenaza II – NDH-2) pod kontrolo enakega lux promotorja, kot vsi ostali navedeni geni. Ndh je membranski encim in proizvaja H2O2 in superoksidni radikal O2-. Plinasti H2O2 potuje med kolonijami, prodira v celice in posredno aktivira lux promotorje; inaktivira ArcAB, ki je sicer del redoks kontrolnega sistema in se veže na lux promotorje ter jih utiša. Ob prisotnosti peroksida so torej lux geni aktivni. Tovrstna aktivacija omogoča dodatno pozitivno povratno zanko za sinhronizacijo populacije [3].

Ko je bil razvit ta sistem sinhronizacije nihanj v dveh nivojih, so ga poenostavili. Odstranili so gen ndh kot proizvajalec radikalov (ki nato tvorijo peroksid), to nalogo pa je prevzel sam GFP. Ob višku izražanja GFP-ja celice izpostavimo žarku fluorescentne svetlobe, kar povzroči nastanek radikalov in posledično peroksida; ob oscilatornem dnu pa GFP-ja praktično ni, kar pomeni da ob obsevanju ni tudi peroksida. GFP ima tako v poenostavljeni platformi dvojno vlogo: vlogo sklopitelja (generiranje radikalov za globalno sinhroniziranje) in vlogo reporterja [3].

== Vpliv sprememb radikalov na nihalno gensko platformo ==

Naslednji korak raziskovalcev je bil preučiti vpliv okoljskih dejavnikov, ki bi lahko motili količino radikalov, potrebnih za interkolonijsko signalizacijo. Najprej je bil preučen vpliv katalaze in vpliv superoksid dizmutaze (SOD) na nepoenostavljeno platformo – ta, ki generira radikale z ndh. Prisotnost katalaze povzroči izgubo medkolonijske sinhronizacije, ne vpliva pa na oscilacije posameznih kolonij. To pomeni, da odtegnitev peroksida prepreči drugo raven signalizacije in razklopi biopiksle. Na drugi strani pa SOD povzroči izrazit usklajen val fluorescence, kateremu sledi konstanten signal brez oscilacij. Razlog za to je dejstvo, da SOD poveča delež superoksidnega radikala, ki se pretvori v H2O2. Preveč peroksida posledično onemogoči nihanja – pride do konstantne fluorescence. Do zelo velike koncentracije H2O2 pride kljub temu, da je SOD znotrajcelični encim – razlog za to je visoka katalitična aktivnost dizmutaze [3], [7].

Vpliv katalaze in SOD na poenostavljeno platformo je bil identičen kot pri tisti z genom ndh. To potrjuje pomembnost ravno prave količine H2O2, potrebne za usklajevanje biopikslov ter zagotavlja, da sprememba vira radikalov (GFP namesto NDH-2) ne okrni kvalitete radikalne signalizacije med kolonijami. Pri tej platformi so preučili tudi vpliv tiosečnine in ampicilina; tiosečnina je dušilec radikalov in rezultati so pokazali, da kot tak onesposobi sinhronizacijo nihanj, brez da bi škodil viabilnosti. Ampicilin, ki pa proizvaja radikale, prav tako poruši usklajenost nihanj (podobno kot pri SOD), kar pomeni, da prevelika količina radikalov tudi onemogoči sinhronizacijo [3].

== Konstrukcije makroskopskega biosenzorja za arzenit ==

Naloge so se lotili na dva načina. Pri prvem se ob prisotnosti arzenita zgolj spremeni frekvenca nihanja fluorescence, pri drugem pa gre za »on-off« sistem, torej se sinhronizirano nihanje vzpostavi šele ob pražni vrednosti koncentracije arzenita [3].
=== Modulacija frekvence ===
Osnovni platformi so dodali še eno kopijo gena LuxI (gen za AHL sintazo), le da je ta pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa (ArsRE). Ko arzenita ni v mediju, so prisotne bazalne oscilacije zaradi izražanja prvotne kopije LuxI kot posledica peroksida, saj je na arzenit-odzivni element vezan represor ArsR. Ko pa je arzenit prisoten, se poveže z represorjem ArsR, povzroči njegovo oddisociacijo z ArsRE in tako prepreči nadaljnjo represijo LuxI gena – torej zaradi arzenita se izraža dodaten LuxI, kar privede do povečane količine AHL in posledično do povečanega nihajnega časa in amplitude ter zmanjšane frekvence. Testiranje tega konstrukta pri različnih količinah arzenita je pokazalo, da se je nihajni čas sorazmerno povečeval s povečevanjem koncentracije arzenita. Izkazalo se je, da je tak senzor sposoben zaznati in tudi kvantificirati koncentracije arzenita že od 0,2 µM naprej, s tem da WHO direktiva določa zgornjo mejo sprejemljive koncentracije za države v razvoju pri 0,5 µM [3].
=== Vse ali nič ===
Nihanje se zgodi le ob doseganju pražne koncentracije (ang. »thresholding«). V DNA je bil vstavljen zapis za LuxR pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa. Ta gen LuxR isto kot že pri osnovni platformi ni imel povezave s preostankom vezja, torej za razliko od ostalih genov platforme ni pod lux promotorjem; razlika je v tem, da se LuxR ne izraža več konstitutivno kot prej, ampak zgolj in samo inducibilno, in to s strani arzenita. To pomeni, da se v odsotnosti arzenita LuxR ne izraža, za aktivacijo gena LuxI pa je bistven kompleks LuxR-AHL – torej brez le-tega ni fluorescence in ni oscilacij. Ko pa arzenit je prisoten, se izrazi LuxR, zaradi njega in AHL pa tudi LuxI, kar obnovi funkcijo vezja in dobimo usklajeno nihanje. Ta sistem »vse ali nič« se vklopi pri 0,25 µM arzenitu, a to ni absolutna spodnja meja. Pražno koncentracijo se da še dodatno prilagoditi s spreminjanjem komponent genskega vezja (število kopij genov, Shine-Dalgarnovo zaporedje ipd.) [3].

== Zaključek ==

Oba načina signalizacije sta bila uporabljena za »scale-up« tega biosenzorja, a je vseeno potrebna mikroskopija za detekcijo, kar je nepraktično za komercialno uporabo. Ustvarjeni senzor z globalno sinhronizacijo je niz velikosti 24 mm x 12 mm in vsebuje 12 000 biopikslov oz. kolonij, skupno okoli 50 milijonov celic. Kljub že sicer povečanem signalu, ga je potrebno še dodatno ojačati, da bi lahko postal senzor uporaben v vsakdanjem življenju. To bi lahko dosegli s spremembami niza, kot je število biopikslov in njihova razporeditev, kar privede do različnih »output« oscilacij [3].

Za perspektivo je mogoče smiselno omeniti alternative v detekciji arzena, oz. načine, katerim je ta novi biosenzor alternativa. Prva naprava za detekcijo arzenita vodi doda Zn, ta pa katalizira nastanek plina arzina AsH3. Arzin reagira z detektorjem nad gladino, ki vsebuje HgBr (ali AgNO3), in pride do rumenega (ali sivega) obarvanja. Drug način uporablja zlate nanodelce – aptameri so v kompleksu s surfaktanti, ki sicer omogočijo agregacijo zlatih nanodelcev; ko pa pride arzenit, se tvorijo As(III)-aptamer kompleksi, prosti surfaktanti pa sprožijo obarjanje zlata, kar vodi v obarvanje. Tretji način pa je že biosenzor – kolonija E. coli, ki imajo LacZ gen pod ArsRE, zaznavamo pa padec pH, ki je posledica razgradnje laktoze [1], [3], [8], [9].

Vidne prednosti te alternative so nedvoumnost detekcije (ne kot pri redukciji azenita v arzin), manj proizvedenih odpadkov in strupenih snovi (enkratna uporaba ostalih detektorjev, arzin, Hg) in potencialna cenovna konkurenčnost. Predvidena cena konceptualne naprave z biosenzorjem je pod 50$, najpomembneje pa je, da ni za enkratno uporabo kot so trenutni senzorji [1], [3], [8], [9].

== Viri ==

[1] N. Joshi, X. Wang, L. Montgomery, A. Elfick, and C. E. French, “Novel approaches to biosensors for detection of arsenic in drinking water,” Desalination, vol. 248, no. 1–3, pp. 517–523, 2009.

[2] T. Gast, “Sensors with oscillating elements,” J. Phys. E., vol. 18, no. 9, pp. 783–789, 1985.

[3] A. Prindle, P. Samayoa, I. Razinkov, T. Danino, L. S. Tsimring, and J. Hasty, “A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels,’” Nature, vol. 481, no. 7379, pp. 39–44, 2012.

[4] and L.-H. Z. Yi-Hu Dong, Jin-Ling Xu, Xian-Zhen Li, “AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 97, no. 7, pp. 3526–3531, 2000.

[5] “Quorum sensing 101: https://sites.tufts.edu/quorumsensing/quorumsensing101/,” citirano dne 6.1.2019.

[6] T. Chu et al., “In vivo programmed gene expression based on artificial quorum networks,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 81, no. 15, pp. 4984–4992, 2015.

[7] M. Balamurugan et al., “Recent trends in electrochemical biosensors of superoxide dismutases,” Biosensors and Bioelectronics, vol. 116. pp. 89–99, 2018.

[8] “Low cost open source arsenic detector: https://www.kickstarter.com/projects/1499966707/low-cost-open-source-arsenic-detector-for-drinking?ref=category,” citirano dne 6.1.2019.

[9] J. Das, P. Sarkar, J. Panda, and P. Pal, “Low-cost field test kits for arsenic detection in water,” J. Environ. Sci. Heal. - Part A Toxic/Hazardous Subst. Environ. Eng., vol. 49, no. 1, pp. 108–115, 2014.

Zaznavalni niz genetskih biopikslov sklopljenih preko radikalov

2019-01-15T16:18:55Z

Miha Koprivnikar Krajnc:

Izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/nature10722 A. Prindle et.al. "A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’" ''Nature'', 2011]

----

== Ozadje ==

Namen raziskovalcev je bil ustvariti biosenzor za arzen, ki izkorišča bakterijski naravni odzivni sistem na prisotnost arzenita (As3+) in koncept genetskega vezja, ki ta sistem povezuje z reporterskim proteinom na do sedaj nov način; to je preko merjenja frekvence nihanja ekspresije GFP, in ne preko same intenzitete fluorescence, kot je bilo narejeno že pred leti [1].

Ideja je bila ustvariti oscilirajoči senzor. Prednost oscilirajočih senzorjev je preprostost kvantizacije signala, tj. frekvence. V primeru klasičnih, neoscilirajočih senzorjev, pri katerih namesto frekvence merimo intenziteto optičnega signala, moramo vrednosti vedno znova normalizirati in kalibrirati, saj imajo eksperimentalni faktorji, kot je intenziteta vzbujajočega žarka in čas izpostavitve večji vpliv, prav tako nihajni čas ni odvisen od amplitude. Oscilirajoči senzorji so torej boljši za ponovljivost in preprostost meritev, kar prinaša svoje prednosti pri razvoju točnega komercialnega senzorja [2].

== Fizična zasnova in gensko vezje ==

Fizično je biosenzor sestavljeni iz urejenega niza posameznih kolonij E. coli, ki so med seboj ločene s pregradami. Genetsko pa je zapis načrtovan, da je izražanje reporterja sfGFP:

1) pozitivno regulirano z arzenitom (posredno),

2) pospešeno s pomočjo pozitivnih povratnih zank v genskem vezju,

3) medcelično usklajeno na dveh nivojih.

Ta dva nivoja usklajevanja sta intrakolonijsko preko zaznavanja gostote (ang. »quorum sensing«) in interkolonijsko z reaktivnimi kisikovimi zvrstmi (ROS) in posledično plina H2O2, ki potuje med kolonijami in prodira v celice. Zaznavanje gostote je način regulacije ekspresije proteinov na podlagi gostote populacije celic, ker to pomeni boljši fenotip in izboljša preživetje – neke vrste bakterijski približek večceličnosti. Uporablja se za usklajevanje celic, a na dolge razdalje deluje precej počasi, zato so pri povečevanju obsega (ang. »scaling-up«) dodali usklajevanje preko hlapnega vodikovega peroksida. Oba nivoja sta nepogrešljiva za zagotovitev urejenih nihanj. [3].

Namesto da so izdelali oscilirajoči senzor iz ene ogromne kolonije (ki se usklajuje počasi, samo preko zaznavanja gostote), so zvezali tisoče malih oscilirajočih kolonij – biopikslov – v mikrofluidni niz. Znotraj kolonije se oscilacije usklajujejo preko zaznavanja sklepčnosti, med kolonijami pa deluje druga, hitrejša raven signalizacije. Le-ta vključuje H2O2 in E.coli lastno »redoks mašinerijo«. Obe vrste signalizacije oz. usklajevanja oscilacij delujeta sinergistično, a zelo različno: zaznavanje gostote je močna, a deluje na kratke razdalje (pod 1 mm), redoks pa je šibkejša, a zagotavlja daljši doseg. Za mikrofluidni niz velja analogno kot za letališča: ni možno (niti koristno), da bi bila vsa letališča med seboj povezana z leti. Leti z manjših letališč so lokalno povezani preko večjih letališč, ki imajo globalne povezave, ta globalna povezava pa v tej analogiji predstavlja redoks signalizacijo.

== Konstrukcija genske platforme za ustvarjanje nihanj ==

Začeli so na intrakolonijskem nivoju, z uporabo t.i. avtoinduktorja (ang. »autoinducer«) Gram-negativnih bakterij AHL (N-acil homoserin lakton), ki difundira po mediju in deluje med celicami znotraj kolonije. AHL je bistven za zaznavanje gostote: produkt gena LuxI je AHL sintaza. Produkt gena AiiA (autoinducer inhibitor A) je posredni represor gena LuxI, saj deluje kot laktonaza in razgrajuje AHL [4]. AHL se poveže z LuxR in s tem ustavi utišanje genov LuxI, AiiA, sfGFP in Ndh, ki imajo lux promotorje. Povezava AHL z LuxR torej poveča ekspresijo sfGFP in pa samega LuxI – avtoinduktivna pozitivna povratna zanka omogoča pospešitev izražanja in sinhronost skupinskega vedenja. Na drugi strani pa prisotnost gena AiiA pod enakim promotorjem sistemu prinaša fino negativno regulacijo ter zaključitev nihajnega vrha in vrnitev v dno oscilacije. Gena LuxI in AiiA sta tako odgovorna za sinhronizirano nihanje AHL in s tem za oscilacije fluoresciranja biopiksla. Vpliv AHL med kolonijami ni možen, ker so le-te delno ločene, medij med njimi pa ima visok pretok [3], [5], [6].

Interkolonijska redoks signalizacija pa ne deluje s pomočjo molekul, ki difundirajo preko medija, kot je AHL, saj je edina povezava med posameznimi biopiksli preko zraka – uporabili so vodikov peroksid. To so dosegli, z vnosom kopije gena ndh (NADH dehidrogenaza II – NDH-2) pod kontrolo enakega lux promotorja, kot vsi ostali navedeni geni. Ndh je membranski encim in proizvaja H2O2 in superoksidni radikal O2-. Plinasti H2O2 potuje med kolonijami, prodira v celice in posredno aktivira lux promotorje; inaktivira ArcAB, ki je sicer del redoks kontrolnega sistema in se veže na lux promotorje ter jih utiša. Ob prisotnosti peroksida so torej lux geni aktivni. Tovrstna aktivacija omogoča dodatno pozitivno povratno zanko za sinhronizacijo populacije [3].

Ko je bil razvit ta sistem sinhronizacije nihanj v dveh nivojih, so ga poenostavili. Odstranili so gen ndh kot proizvajalec radikalov (ki nato tvorijo peroksid), to nalogo pa je prevzel sam GFP. Ob višku izražanja GFP-ja celice izpostavimo žarku fluorescentne svetlobe, kar povzroči nastanek radikalov in posledično peroksida; ob oscilatornem dnu pa GFP-ja praktično ni, kar pomeni da ob obsevanju ni tudi peroksida. GFP ima tako v poenostavljeni platformi dvojno vlogo: vlogo sklopitelja (generiranje radikalov za globalno sinhroniziranje) in vlogo reporterja [3].

== Vpliv sprememb radikalov na nihalno gensko platformo ==

Naslednji korak raziskovalcev je bil preučiti vpliv okoljskih dejavnikov, ki bi lahko motili količino radikalov, potrebnih za interkolonijsko signalizacijo. Najprej je bil preučen vpliv katalaze in vpliv superoksid dizmutaze (SOD) na nepoenostavljeno platformo – ta, ki generira radikale z ndh. Prisotnost katalaze povzroči izgubo medkolonijske sinhronizacije, ne vpliva pa na oscilacije posameznih kolonij. To pomeni, da odtegnitev peroksida prepreči drugo raven signalizacije in razklopi biopiksle. Na drugi strani pa SOD povzroči izrazit usklajen val fluorescence, kateremu sledi konstanten signal brez oscilacij. Razlog za to je dejstvo, da SOD poveča delež superoksidnega radikala, ki se pretvori v H2O2. Preveč peroksida posledično onemogoči nihanja – pride do konstantne fluorescence. Do zelo velike koncentracije H2O2 pride kljub temu, da je SOD znotrajcelični encim – razlog za to je visoka katalitična aktivnost dizmutaze [3], [7].

Vpliv katalaze in SOD na poenostavljeno platformo je bil identičen kot pri tisti z genom ndh. To potrjuje pomembnost ravno prave količine H2O2, potrebne za usklajevanje biopikslov ter zagotavlja, da sprememba vira radikalov (GFP namesto NDH-2) ne okrni kvalitete radikalne signalizacije med kolonijami. Pri tej platformi so preučili tudi vpliv tiosečnine in ampicilina; tiosečnina je dušilec radikalov in rezultati so pokazali, da kot tak onesposobi sinhronizacijo nihanj, brez da bi škodil viabilnosti. Ampicilin, ki pa proizvaja radikale, prav tako poruši usklajenost nihanj (podobno kot pri SOD), kar pomeni, da prevelika količina radikalov tudi onemogoči sinhronizacijo [3].

== Konstrukcije makroskopskega biosenzorja za arzenit ==

Naloge so se lotili na dva načina. Pri prvem se ob prisotnosti arzenita zgolj spremeni frekvenca nihanja fluorescence, pri drugem pa gre za »on-off« sistem, torej se sinhronizirano nihanje vzpostavi šele ob pražni vrednosti koncentracije arzenita [3].
=== Modulacija frekvence ===
Osnovni platformi so dodali še eno kopijo gena LuxI (gen za AHL sintazo), le da je ta pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa (ArsRE). Ko arzenita ni v mediju, so prisotne bazalne oscilacije zaradi izražanja prvotne kopije LuxI kot posledica peroksida, saj je na arzenit-odzivni element vezan represor ArsR. Ko pa je arzenit prisoten, se poveže z represorjem ArsR, povzroči njegovo oddisociacijo z ArsRE in tako prepreči nadaljnjo represijo LuxI gena – torej zaradi arzenita se izraža dodaten LuxI, kar privede do povečane količine AHL in posledično do povečanega nihajnega časa in amplitude ter zmanjšane frekvence. Testiranje tega konstrukta pri različnih količinah arzenita je pokazalo, da se je nihajni čas sorazmerno povečeval s povečevanjem koncentracije arzenita. Izkazalo se je, da je tak senzor sposoben zaznati in tudi kvantificirati koncentracije arzenita že od 0,2 µM naprej, s tem da WHO direktiva določa zgornjo mejo sprejemljive koncentracije za države v razvoju pri 0,5 µM [3].
=== Vse ali nič ===
Nihanje se zgodi le ob doseganju pražne koncentracije (ang. »thresholding«). V DNA je bil vstavljen zapis za LuxR pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa. Ta gen LuxR isto kot že pri osnovni platformi ni imel povezave s preostankom vezja, torej za razliko od ostalih genov platforme ni pod lux promotorjem; razlika je v tem, da se LuxR ne izraža več konstitutivno kot prej, ampak zgolj in samo inducibilno, in to s strani arzenita. To pomeni, da se v odsotnosti arzenita LuxR ne izraža, za aktivacijo gena LuxI pa je bistven kompleks LuxR-AHL – torej brez le-tega ni fluorescence in ni oscilacij. Ko pa arzenit je prisoten, se izrazi LuxR, zaradi njega in AHL pa tudi LuxI, kar obnovi funkcijo vezja in dobimo usklajeno nihanje. Ta sistem »vse ali nič« se vklopi pri 0,25 µM arzenitu, a to ni absolutna spodnja meja. Pražno koncentracijo se da še dodatno prilagoditi s spreminjanjem komponent genskega vezja (število kopij genov, Shine-Dalgarnovo zaporedje ipd.) [3].

== Zaključek ==

Oba načina signalizacije sta bila uporabljena za »scale-up« tega biosenzorja, a je vseeno potrebna mikroskopija za detekcijo, kar je nepraktično za komercialno uporabo. Ustvarjeni senzor z globalno sinhronizacijo je niz velikosti 24 mm x 12 mm in vsebuje 12 000 biopikslov oz. kolonij, skupno okoli 50 milijonov celic. Kljub že sicer povečanem signalu, ga je potrebno še dodatno ojačati, da bi lahko postal senzor uporaben v vsakdanjem življenju. To bi lahko dosegli s spremembami niza, kot je število biopikslov in njihova razporeditev, kar privede do različnih »output« oscilacij [3].

Za perspektivo je mogoče smiselno omeniti alternative v detekciji arzena, oz. načine, katerim je ta novi biosenzor alternativa. Prva naprava za detekcijo arzenita vodi doda Zn, ta pa katalizira nastanek plina arzina AsH3. Arzin reagira z detektorjem nad gladino, ki vsebuje HgBr (ali AgNO3), in pride do rumenega (ali sivega) obarvanja. Drug način uporablja zlate nanodelce – aptameri so v kompleksu s surfaktanti, ki sicer omogočijo agregacijo zlatih nanodelcev; ko pa pride arzenit, se tvorijo As(III)-aptamer kompleksi, prosti surfaktanti pa sprožijo obarjanje zlata, kar vodi v obarvanje. Tretji način pa je že biosenzor – kolonija E. coli, ki imajo LacZ gen pod ArsRE, zaznavamo pa padec pH, ki je posledica razgradnje laktoze [1], [3], [8], [9].

Vidne prednosti te alternative so nedvoumnost detekcije (ne kot pri redukciji azenita v arzin), manj proizvedenih odpadkov in strupenih snovi (enkratna uporaba ostalih detektorjev, arzin, Hg) in potencialna cenovna konkurenčnost. Predvidena cena konceptualne naprave z biosenzorjem je pod 50$, najpomembneje pa je, da ni za enkratno uporabo kot so trenutni senzorji [1], [3], [8], [9].

== Viri ==

[1] N. Joshi, X. Wang, L. Montgomery, A. Elfick, and C. E. French, “Novel approaches to biosensors for detection of arsenic in drinking water,” Desalination, vol. 248, no. 1–3, pp. 517–523, 2009.

[2] T. Gast, “Sensors with oscillating elements,” J. Phys. E., vol. 18, no. 9, pp. 783–789, 1985.

[3] A. Prindle, P. Samayoa, I. Razinkov, T. Danino, L. S. Tsimring, and J. Hasty, “A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels,’” Nature, vol. 481, no. 7379, pp. 39–44, 2012.

[4] and L.-H. Z. Yi-Hu Dong, Jin-Ling Xu, Xian-Zhen Li, “AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 97, no. 7, pp. 3526–3531, 2000.

[5] “Quorum sensing 101: https://sites.tufts.edu/quorumsensing/quorumsensing101/,” citirano dne 6.1.2019.

[6] T. Chu et al., “In vivo programmed gene expression based on artificial quorum networks,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 81, no. 15, pp. 4984–4992, 2015.

[7] M. Balamurugan et al., “Recent trends in electrochemical biosensors of superoxide dismutases,” Biosensors and Bioelectronics, vol. 116. pp. 89–99, 2018.

[8] “Low cost open source arsenic detector: https://www.kickstarter.com/projects/1499966707/low-cost-open-source-arsenic-detector-for-drinking?ref=category,” citirano dne 6.1.2019.

[9] J. Das, P. Sarkar, J. Panda, and P. Pal, “Low-cost field test kits for arsenic detection in water,” J. Environ. Sci. Heal. - Part A Toxic/Hazardous Subst. Environ. Eng., vol. 49, no. 1, pp. 108–115, 2014.

Zaznavalni niz genetskih biopikslov sklopljenih preko radikalov

2019-01-14T16:21:19Z

Miha Koprivnikar Krajnc:

Izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/nature10722 A. Prindle et.al. "A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’" ''Nature'', 2011]

----

== Ozadje ==

Namen raziskovalcev je bil ustvariti biosenzor za arzen, ki izkorišča bakterijski naravni odzivni sistem na prisotnost arzenita (As3+) in koncept genetskega vezja, ki ta sistem povezuje z reporterskim proteinom na do sedaj nov način; to je preko merjenja frekvence nihanja ekspresije GFP, in ne preko same intenzitete fluorescence, kot je bilo narejeno že pred leti [1].

Ideja je bila ustvariti oscilirajoči senzor. Prednost oscilirajočih senzorjev je preprostost kvantizacije signala, tj. frekvence. V primeru klasičnih, neoscilirajočih senzorjev, pri katerih namesto frekvence merimo intenziteto optičnega signala, moramo vrednosti vedno znova normalizirati in kalibrirati, saj imajo eksperimentalni faktorji, kot je intenziteta vzbujajočega žarka in čas izpostavitve večji vpliv, prav tako nihajni čas ni odvisen od amplitude. Oscilirajoči senzorji so torej boljši za ponovljivost in preprostost meritev, kar prinaša svoje prednosti pri razvoju točnega komercialnega senzorja [2].

== Fizična zasnova in gensko vezje ==

Fizično je biosenzor sestavljeni iz urejenega niza posameznih kolonij E.coli, ki so med seboj ločene s pregradami. Genetsko pa je zapis načrtovan, da je izražanje reporterja sfGFP:

1) pozitivno regulirano z arzenitom (posredno),

2) pospešeno s pomočjo pozitivnih povratnih zank v genskem vezju,

3) medcelično usklajeno na dveh nivojih.

Ta dva nivoja usklajevanja sta intrakolonijsko preko zaznavanja sklepčnosti (ang. »quorum sensing«) in interkolonijsko z reaktivnimi kisikovimi zvrstmi (ROS) in posledično plina H2O2, ki potuje med kolonijami in prodira v celice. Zaznavanje sklepčnosti je način regulacije ekspresije proteinov na podlagi gostote populacije celic, ker to pomeni boljši fenotip in izboljša preživetje – neke vrste bakterijski približek večceličnosti. Uporablja se za usklajevanje celic, a na dolge razdalje deluje precej počasi, zato so pri povečevanju obsega (ang. »scaling-up«) dodali usklajevanje preko hlapnega vodikovega peroksida. Oba nivoja sta nepogrešljiva za zagotovitev urejenih nihanj. [3].

Namesto da so izdelali oscilirajoči senzor iz ene ogromne kolonije (ki se usklajuje počasi, samo preko zaznavanja sklepčnosti), so zvezali tisoče malih oscilirajočih kolonij – biopikslov – v mikrofluidni niz. Znotraj kolonije se oscilacije usklajujejo preko zaznavanja sklepčnosti, med kolonijami pa deluje druga, hitrejša raven signalizacije. Le-ta vključuje H2O2 in E.coli lastno »redoks mašinerijo«. Obe vrste signalizacije oz. usklajevanja oscilacij delujeta sinergistično, a zelo različno: sklepčnost je močna, a deluje na kratke razdalje (pod 1 mm), redoks pa je šibkejša, a zagotavlja daljši doseg. Za mikrofluidni niz velja analogno kot za letališča: ni možno (niti koristno), da bi bila vsa letališča med seboj povezana z leti. Leti z manjših letališč so lokalno povezani preko večjih letališč, ki imajo globalne povezave, ta globalna povezava pa v tej analogiji predstavlja redoks signalizacijo.

== Konstrukcija genske platforme za ustvarjanje nihanj ==

Začeli so na intrakolonijskem nivoju, z uporabo t.i. avtoinduktorja (ang. »autoinducer«) Gram-negativnih bakterij AHL (N-acil homoserin lakton), ki difundira po mediju in deluje med celicami znotraj kolonije. AHL je bistven za zaznavanje sklepčnosti: produkt gena LuxI je AHL sintaza. Produkt gena AiiA (autoinducer inhibitor A) je posredni represor gena LuxI, saj deluje kot laktonaza in razgrajuje AHL [4]. AHL se poveže z LuxR in s tem ustavi utišanje genov LuxI, AiiA, sfGFP in Ndh, ki imajo lux promotorje. Povezava AHL z LuxR torej poveča ekspresijo sfGFP in pa samega LuxI – avtoinduktivna pozitivna povratna zanka omogoča pospešitev izražanja in sinhronost skupinskega vedenja. Na drugi strani pa prisotnost gena AiiA pod enakim promotorjem sistemu prinaša fino negativno regulacijo ter zaključitev nihajnega vrha in vrnitev v dno oscilacije. Gena LuxI in AiiA sta tako odgovorna za sinhronizirano nihanje AHL in s tem za oscilacije fluoresciranja biopiksla. Vpliv AHL med kolonijami ni možen, ker so le-te delno ločene, medij med njimi pa ima visok pretok [3], [5], [6].

Interkolonijska redoks signalizacija pa ne deluje s pomočjo molekul, ki difundirajo preko medija, kot je AHL, saj je edina povezava med posameznimi biopiksli preko zraka – uporabili so vodikov peroksid. To so dosegli, z vnosom kopije gena ndh (NADH dehidrogenaza II – NDH-2) pod kontrolo enakega lux promotorja, kot vsi ostali navedeni geni. Ndh je membranski encim in proizvaja H2O2 in superoksidni radikal O2-. Plinasti H2O2 potuje med kolonijami, prodira v celice in posredno aktivira lux promotorje; inaktivira ArcAB, ki je sicer del redoks kontrolnega sistema in se veže na lux promotorje ter jih utiša. Ob prisotnosti peroksida so torej lux geni aktivni. Tovrstna aktivacija omogoča dodatno pozitivno povratno zanko za sinhronizacijo populacije [3].

Ko je bil razvit ta sistem sinhronizacije nihanj v dveh nivojih, so ga poenostavili. Odstranili so gen ndh kot proizvajalec radikalov (ki nato tvorijo peroksid), to nalogo pa je prevzel sam GFP. Ob višku izražanja GFP-ja celice izpostavimo žarku fluorescentne svetlobe, kar povzroči nastanek radikalov in posledično peroksida; ob oscilatornem dnu pa GFP-ja praktično ni, kar pomeni da ob obsevanju ni tudi peroksida. GFP ima tako v poenostavljeni platformi dvojno vlogo: vlogo sklopitelja (generiranje radikalov za globalno sinhroniziranje) in vlogo reporterja [3].

== Vpliv sprememb radikalov na nihalno gensko platformo ==

Naslednji korak raziskovalcev je bil preučiti vpliv okoljskih dejavnikov, ki bi lahko motili količino radikalov, potrebnih za interkolonijsko signalizacijo. Najprej je bil preučen vpliv katalaze in vpliv superoksid dizmutaze (SOD) na nepoenostavljeno platformo – ta, ki generira radikale z ndh. Prisotnost katalaze povzroči izgubo medkolonijske sinhronizacije, ne vpliva pa na oscilacije posameznih kolonij. To pomeni, da odtegnitev peroksida prepreči drugo raven signalizacije in razklopi biopiksle. Na drugi strani pa SOD povzroči izrazit usklajen val fluorescence, kateremu sledi konstanten signal brez oscilacij. Razlog za to je dejstvo, da SOD poveča delež superoksidnega radikala, ki se pretvori v H2O2. Preveč peroksida posledično onemogoči nihanja – pride do konstantne fluorescence. Do zelo velike koncentracije H2O2 pride kljub temu, da je SOD znotrajcelični encim – razlog za to je visoka katalitična aktivnost dizmutaze [3], [7].

Vpliv katalaze in SOD na poenostavljeno platformo je bil identičen kot pri tisti z genom ndh. To potrjuje pomembnost ravno prave količine H2O2, potrebne za usklajevanje biopikslov ter zagotavlja, da sprememba vira radikalov (GFP namesto NDH-2) ne okrni kvalitete radikalne signalizacije med kolonijami. Pri tej platformi so preučili tudi vpliv tiosečnine in ampicilina; tiosečnina je dušilec radikalov in rezultati so pokazali, da kot tak onesposobi sinhronizacijo nihanj, brez da bi škodil viabilnosti. Ampicilin, ki pa proizvaja radikale, prav tako poruši usklajenost nihanj (podobno kot pri SOD), kar pomeni, da prevelika količina radikalov tudi onemogoči sinhronizacijo [3].

== Konstrukcije makroskopskega biosenzorja za arzenit ==

Naloge so se lotili na dva načina. Pri prvem se ob prisotnosti arzenita zgolj spremeni frekvenca nihanja fluorescence, pri drugem pa gre za »on-off« sistem, torej se sinhronizirano nihanje vzpostavi šele ob pražni vrednosti koncentracije arzenita [3].
=== Modulacija frekvence ===
Osnovni platformi so dodali še eno kopijo gena LuxI (gen za AHL sintazo), le da je ta pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa (ArsRE). Ko arzenita ni v mediju, so prisotne bazalne oscilacije zaradi izražanja prvotne kopije LuxI kot posledica peroksida, saj je na arzenit-odzivni element vezan represor ArsR. Ko pa je arzenit prisoten, se poveže z represorjem ArsR, povzroči njegovo oddisociacijo z ArsRE in tako prepreči nadaljnjo represijo LuxI gena – torej zaradi arzenita se izraža dodaten LuxI, kar privede do povečane količine AHL in posledično do povečanega nihajnega časa in amplitude ter zmanjšane frekvence. Testiranje tega konstrukta pri različnih količinah arzenita je pokazalo, da se je nihajni čas sorazmerno povečeval s povečevanjem koncentracije arzenita. Izkazalo se je, da je tak senzor sposoben zaznati in tudi kvantificirati koncentracije arzenita že od 0,2 µM naprej, s tem da WHO direktiva določa zgornjo mejo sprejemljive koncentracije za države v razvoju pri 0,5 µM [3].
=== Vse ali nič ===
Nihanje se zgodi le ob doseganju pražne koncentracije (ang. »thresholding«). V DNA je bil vstavljen zapis za LuxR pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa. Ta gen LuxR isto kot že pri osnovni platformi ni imel povezave s preostankom vezja, torej za razliko od ostalih genov platforme ni pod lux promotorjem; razlika je v tem, da se LuxR ne izraža več konstitutivno kot prej, ampak zgolj in samo inducibilno, in to s strani arzenita. To pomeni, da se v odsotnosti arzenita LuxR ne izraža, za aktivacijo gena LuxI pa je bistven kompleks LuxR-AHL – torej brez le-tega ni fluorescence in ni oscilacij. Ko pa arzenit je prisoten, se izrazi LuxR, zaradi njega in AHL pa tudi LuxI, kar obnovi funkcijo vezja in dobimo usklajeno nihanje. Ta sistem »vse ali nič« se vklopi pri 0,25 µM arzenitu, a to ni absolutna spodnja meja. Pražno koncentracijo se da še dodatno prilagoditi s spreminjanjem komponent genskega vezja (število kopij genov, Shine-Dalgarnovo zaporedje ipd.) [3].

== Zaključek ==

Oba načina signalizacije sta bila uporabljena za »scale-up« tega biosenzorja, a je vseeno potrebna mikroskopija za detekcijo, kar je nepraktično za komercialno uporabo. Ustvarjeni senzor z globalno sinhronizacijo je niz velikosti 24 mm x 12 mm in vsebuje 12 000 biopikslov oz. kolonij, skupno okoli 50 milijonov celic. Kljub že sicer povečanem signalu, ga je potrebno še dodatno ojačati, da bi lahko postal senzor uporaben v vsakdanjem življenju. To bi lahko dosegli s spremembami niza, kot je število biopikslov in njihova razporeditev, kar privede do različnih »output« oscilacij [3].

Za perspektivo je mogoče smiselno omeniti alternative v detekciji arzena, oz. načine, katerim je ta novi biosenzor alternativa. Prva naprava za detekcijo arzenita vodi doda Zn, ta pa katalizira nastanek plina arzina AsH3. Arzin reagira z detektorjem nad gladino, ki vsebuje HgBr (ali AgNO3), in pride do rumenega (ali sivega) obarvanja. Drug način uporablja zlate nanodelce – aptameri so v kompleksu s surfaktanti, ki sicer omogočijo agregacijo zlatih nanodelcev; ko pa pride arzenit, se tvorijo As(III)-aptamer kompleksi, prosti surfaktanti pa sprožijo obarjanje zlata, kar vodi v obarvanje. Tretji način pa je že biosenzor – kolonija E.coli, ki imajo LacZ gen pod ArsRE, zaznavamo pa padec pH, ki je posledica razgradnje laktoze [1], [3], [8], [9].

Vidne prednosti te alternative so nedvoumnost detekcije (ne kot pri redukciji azenita v arzin), manj proizvedenih odpadkov in strupenih snovi (enkratna uporaba ostalih detektorjev, arzin, Hg) in potencialna cenovna konkurenčnost. Predvidena cena konceptualne naprave z biosenzorjem je pod 50$, najpomembneje pa je, da ni za enkratno uporabo kot so trenutni senzorji [1], [3], [8], [9].

== Viri ==

[1] N. Joshi, X. Wang, L. Montgomery, A. Elfick, and C. E. French, “Novel approaches to biosensors for detection of arsenic in drinking water,” Desalination, vol. 248, no. 1–3, pp. 517–523, 2009.

[2] T. Gast, “Sensors with oscillating elements,” J. Phys. E., vol. 18, no. 9, pp. 783–789, 1985.

[3] A. Prindle, P. Samayoa, I. Razinkov, T. Danino, L. S. Tsimring, and J. Hasty, “A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels,’” Nature, vol. 481, no. 7379, pp. 39–44, 2012.

[4] and L.-H. Z. Yi-Hu Dong, Jin-Ling Xu, Xian-Zhen Li, “AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 97, no. 7, pp. 3526–3531, 2000.

[5] “Quorum sensing 101: https://sites.tufts.edu/quorumsensing/quorumsensing101/,” citirano dne 6.1.2019.

[6] T. Chu et al., “In vivo programmed gene expression based on artificial quorum networks,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 81, no. 15, pp. 4984–4992, 2015.

[7] M. Balamurugan et al., “Recent trends in electrochemical biosensors of superoxide dismutases,” Biosensors and Bioelectronics, vol. 116. pp. 89–99, 2018.

[8] “Low cost open source arsenic detector: https://www.kickstarter.com/projects/1499966707/low-cost-open-source-arsenic-detector-for-drinking?ref=category,” citirano dne 6.1.2019.

[9] J. Das, P. Sarkar, J. Panda, and P. Pal, “Low-cost field test kits for arsenic detection in water,” J. Environ. Sci. Heal. - Part A Toxic/Hazardous Subst. Environ. Eng., vol. 49, no. 1, pp. 108–115, 2014.

Zaznavalni niz genetskih biopikslov sklopljenih preko radikalov

2019-01-14T16:03:43Z

Miha Koprivnikar Krajnc:

Izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/nature10722 A. Prindle et.al. "A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’" ''Nature'', 2011]

----

== Ozadje ==

Namen raziskovalcev je bil ustvariti biosenzor za arzen, ki izkorišča bakterijski naravni odzivni sistem na prisotnost arzenita (As3+) in koncept genetskega vezja, ki ta sistem povezuje z reporterskim proteinom na do sedaj nov način; to je preko merjenja frekvence nihanja ekspresije GFP, in ne preko same intenzitete fluorescence, kot je bilo narejeno že pred leti [1].

Ideja je bila ustvariti oscilirajoči senzor. Prednost oscilirajočih senzorjev je preprostost kvantizacije signala, tj. frekvence. V primeru klasičnih, neoscilirajočih senzorjev, pri katerih namesto frekvence merimo intenziteto optičnega signala, moramo vrednosti vedno znova normalizirati in kalibrirati, saj imajo eksperimentalni faktorji, kot je intenziteta vzbujajočega žarka in čas izpostavitve večji vpliv, prav tako nihajni čas ni odvisen od amplitude. Oscilirajoči senzorji so torej boljši za ponovljivost in preprostost meritev, kar prinaša svoje prednosti pri razvoju točnega komercialnega senzorja [2].

== Fizična zasnova in gensko vezje ==

Fizično je biosenzor sestavljeni iz urejenega niza posameznih kolonij E.coli, ki so med seboj ločene s pregradami. Genetsko pa je zapis načrtovan, da je izražanje reporterja sfGFP:

1) pozitivno regulirano z arzenitom (posredno),

2) pospešeno s pomočjo pozitivnih povratnih zank v genskem vezju,

3) medcelično usklajeno na dveh nivojih.

Ta dva nivoja usklajevanja sta intrakolonijsko preko zaznavanja sklepčnosti (ang. »quorum sensing«) in interkolonijsko z reaktivnimi kisikovimi zvrstmi (ROS) in posledično plina H2O2, ki potuje med kolonijami in prodira v celice. Zaznavanje sklepčnosti je način regulacije ekspresije proteinov na podlagi gostote populacije celic, ker to pomeni boljši fenotip in izboljša preživetje – neke vrste bakterijski približek večceličnosti. Uporablja se za usklajevanje celic, a na dolge razdalje deluje precej počasi, zato so pri povečevanju obsega (ang. »scaling-up«) dodali usklajevanje preko hlapnega vodikovega peroksida. Oba nivoja sta nepogrešljiva za zagotovitev urejenih nihanj. [3].

Namesto da so izdelali oscilirajoči senzor iz ene ogromne kolonije (ki se usklajuje počasi, samo preko zaznavanja sklepčnosti), so zvezali tisoče malih oscilirajočih kolonij – biopikslov – v mikrofluidni niz. Znotraj kolonije se oscilacije usklajujejo preko zaznavanja sklepčnosti, med kolonijami pa deluje druga, hitrejša raven signalizacije. Le-ta vključuje H2O2 in E.coli lastno »redoks mašinerijo«. Obe vrste signalizacije oz. usklajevanja oscilacij delujeta sinergistično, a zelo različno: sklepčnost je močna, a deluje na kratke razdalje (pod 1 mm), redoks pa je šibkejša, a zagotavlja daljši doseg. Avtorji so uporabili analogijo z letališči: prav tako pri celicah, tudi pri letališčih ni možno (niti koristno), da bi bila vsa letališča med seboj povezana z leti. Leti z manjših letališč so lokalno povezani preko večjih letališč, ki imajo globalne povezave, ta globalna povezava pa v tej analogiji predstavlja redoks signalizacijo.

== Konstrukcija genske platforme za ustvarjanje nihanj ==

Začeli so na intrakolonijskem nivoju, z uporabo t.i. avtoinduktorja (ang. »autoinducer«) Gram-negativnih bakterij AHL (N-acil homoserin lakton), ki difundira po mediju in deluje med celicami znotraj kolonije. AHL je bistven za zaznavanje sklepčnosti: produkt gena LuxI je AHL sintaza. Produkt gena AiiA (autoinducer inhibitor A) je posredni represor gena LuxI, saj deluje kot laktonaza in razgrajuje AHL [4]. AHL se poveže z LuxR in s tem ustavi utišanje genov LuxI, AiiA, sfGFP in Ndh, ki imajo lux promotorje. Povezava AHL z LuxR torej poveča ekspresijo sfGFP in pa samega LuxI – avtoinduktivna pozitivna povratna zanka omogoča pospešitev izražanja in sinhronost skupinskega vedenja. Na drugi strani pa prisotnost gena AiiA pod enakim promotorjem sistemu prinaša fino negativno regulacijo ter zaključitev nihajnega vrha in vrnitev v dno oscilacije. Gena LuxI in AiiA sta tako odgovorna za sinhronizirano nihanje AHL in s tem za oscilacije fluoresciranja biopiksla. Vpliv AHL med kolonijami ni možen, ker so le-te delno ločene, medij med njimi pa ima visok pretok [3], [5], [6].

Interkolonijska redoks signalizacija pa ne deluje s pomočjo molekul, ki difundirajo preko medija, kot je AHL, saj je edina povezava med posameznimi biopiksli preko zraka – uporabili so vodikov peroksid. To so dosegli, z vnosom kopije gena ndh (NADH dehidrogenaza II – NDH-2) pod kontrolo enakega lux promotorja, kot vsi ostali navedeni geni. Ndh je membranski encim in proizvaja H2O2 in superoksidni radikal O2-. Plinasti H2O2 potuje med kolonijami, prodira v celice in posredno aktivira lux promotorje; inaktivira ArcAB, ki je sicer del redoks kontrolnega sistema in se veže na lux promotorje ter jih utiša. Ob prisotnosti peroksida so torej lux geni aktivni. Tovrstna aktivacija omogoča dodatno pozitivno povratno zanko za sinhronizacijo populacije [3].

Ko je bil razvit ta sistem sinhronizacije nihanj v dveh nivojih, so ga poenostavili. Odstranili so gen ndh kot proizvajalec radikalov (ki nato tvorijo peroksid), to nalogo pa je prevzel sam GFP. Ob višku izražanja GFP-ja celice izpostavimo žarku fluorescentne svetlobe, kar povzroči nastanek radikalov in posledično peroksida; ob oscilatornem dnu pa GFP-ja praktično ni, kar pomeni da ob obsevanju ni tudi peroksida. GFP ima tako v poenostavljeni platformi dvojno vlogo: vlogo sklopitelja (generiranje radikalov za globalno sinhroniziranje) in vlogo reporterja [3].

== Vpliv sprememb radikalov na nihalno gensko platformo ==

Naslednji korak raziskovalcev je bil preučiti vpliv okoljskih dejavnikov, ki bi lahko motili količino radikalov, potrebnih za interkolonijsko signalizacijo. Najprej je bil preučen vpliv katalaze in vpliv superoksid dizmutaze (SOD) na nepoenostavljeno platformo – ta, ki generira radikale z ndh. Prisotnost katalaze povzroči izgubo medkolonijske sinhronizacije, ne vpliva pa na oscilacije posameznih kolonij. To pomeni, da odtegnitev peroksida prepreči drugo raven signalizacije in razklopi biopiksle. Na drugi strani pa SOD povzroči izrazit usklajen val fluorescence, kateremu sledi konstanten signal brez oscilacij. Razlog za to je dejstvo, da SOD poveča delež superoksidnega radikala, ki se pretvori v H2O2. Preveč peroksida posledično onemogoči nihanja – pride do konstantne fluorescence. Do zelo velike koncentracije H2O2 pride kljub temu, da je SOD znotrajcelični encim – razlog za to je visoka katalitična aktivnost dizmutaze [3], [7].

Vpliv katalaze in SOD na poenostavljeno platformo je bil identičen kot pri tisti z genom ndh. To potrjuje pomembnost ravno prave količine H2O2, potrebne za usklajevanje biopikslov ter zagotavlja, da sprememba vira radikalov (GFP namesto NDH-2) ne okrni kvalitete radikalne signalizacije med kolonijami. Pri tej platformi so preučili tudi vpliv tiosečnine in ampicilina; tiosečnina je dušilec radikalov in rezultati so pokazali, da kot tak onesposobi sinhronizacijo nihanj, brez da bi škodil viabilnosti. Ampicilin, ki pa proizvaja radikale, prav tako poruši usklajenost nihanj (podobno kot pri SOD), kar pomeni, da prevelika količina radikalov tudi onemogoči sinhronizacijo [3].

== Konstrukcije makroskopskega biosenzorja za arzenit ==

Naloge so se lotili na dva načina. Pri prvem se ob prisotnosti arzenita zgolj spremeni frekvenca nihanja fluorescence, pri drugem pa gre za »on-off« sistem, torej se sinhronizirano nihanje vzpostavi šele ob pražni vrednosti koncentracije arzenita [3].
=== Modulacija frekvence ===
Osnovni platformi so dodali še eno kopijo gena LuxI (gen za AHL sintazo), le da je ta pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa (ArsRE). Ko arzenita ni v mediju, so prisotne bazalne oscilacije zaradi izražanja prvotne kopije LuxI kot posledica peroksida, saj je na arzenit-odzivni element vezan represor ArsR. Ko pa je arzenit prisoten, se poveže z represorjem ArsR, povzroči njegovo oddisociacijo z ArsRE in tako prepreči nadaljnjo represijo LuxI gena – torej zaradi arzenita se izraža dodaten LuxI, kar privede do povečane količine AHL in posledično do povečanega nihajnega časa in amplitude ter zmanjšane frekvence. Testiranje tega konstrukta pri različnih količinah arzenita je pokazalo, da se je nihajni čas sorazmerno povečeval s povečevanjem koncentracije arzenita. Izkazalo se je, da je tak senzor sposoben zaznati in tudi kvantificirati koncentracije arzenita že od 0,2 µM naprej, s tem da WHO direktiva določa zgornjo mejo sprejemljive koncentracije za države v razvoju pri 0,5 µM [3].
=== Vse ali nič ===
Nihanje se zgodi le ob doseganju pražne koncentracije (ang. »thresholding«). V DNA je bil vstavljen zapis za LuxR pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa. Ta gen LuxR isto kot že pri osnovni platformi ni imel povezave s preostankom vezja, torej za razliko od ostalih genov platforme ni pod lux promotorjem; razlika je v tem, da se LuxR ne izraža več konstitutivno kot prej, ampak zgolj in samo inducibilno, in to s strani arzenita. To pomeni, da se v odsotnosti arzenita LuxR ne izraža, za aktivacijo gena LuxI pa je bistven kompleks LuxR-AHL – torej brez le-tega ni fluorescence in ni oscilacij. Ko pa arzenit je prisoten, se izrazi LuxR, zaradi njega in AHL pa tudi LuxI, kar obnovi funkcijo vezja in dobimo usklajeno nihanje. Ta sistem »vse ali nič« se vklopi pri 0,25 µM arzenitu, a to ni absolutna spodnja meja. Pražno koncentracijo se da še dodatno prilagoditi s spreminjanjem komponent genskega vezja (število kopij genov, Shine-Dalgarnovo zaporedje ipd.) [3].

== Zaključek ==

Oba načina signalizacije sta bila uporabljena za »scale-up« tega biosenzorja, a je vseeno potrebna mikroskopija za detekcijo, kar je nepraktično za komercialno uporabo. Ustvarjeni senzor z globalno sinhronizacijo je niz velikosti 24 mm x 12 mm in vsebuje 12 000 biopikslov oz. kolonij, skupno okoli 50 milijonov celic. Kljub že sicer povečanem signalu, ga je potrebno še dodatno ojačati, da bi lahko postal senzor uporaben v vsakdanjem življenju. To bi lahko dosegli s spremembami niza, kot je število biopikslov in njihova razporeditev, kar privede do različnih »output« oscilacij [3].

Za perspektivo je mogoče smiselno omeniti alternative v detekciji arzena, oz. načine, katerim je ta novi biosenzor alternativa. Prva naprava za detekcijo arzenita vodi doda Zn, ta pa katalizira nastanek plina arzina AsH3. Arzin reagira z detektorjem nad gladino, ki vsebuje HgBr (ali AgNO3), in pride do rumenega (ali sivega) obarvanja. Drug način uporablja zlate nanodelce – aptameri so v kompleksu s surfaktanti, ki sicer omogočijo agregacijo zlatih nanodelcev; ko pa pride arzenit, se tvorijo As(III)-aptamer kompleksi, prosti surfaktanti pa sprožijo obarjanje zlata, kar vodi v obarvanje. Tretji način pa je že biosenzor – kolonija E.coli, ki imajo LacZ gen pod ArsRE, zaznavamo pa padec pH, ki je posledica razgradnje laktoze [1], [3], [8], [9].

Vidne prednosti te alternative so nedvoumnost detekcije (ne kot pri redukciji azenita v arzin), manj proizvedenih odpadkov in strupenih snovi (enkratna uporaba ostalih detektorjev, arzin, Hg) in potencialna cenovna konkurenčnost. Predvidena cena konceptualne naprave z biosenzorjem je pod 50$, najpomembneje pa je, da ni za enkratno uporabo kot so trenutni senzorji [1], [3], [8], [9].

== Viri ==

[1] N. Joshi, X. Wang, L. Montgomery, A. Elfick, and C. E. French, “Novel approaches to biosensors for detection of arsenic in drinking water,” Desalination, vol. 248, no. 1–3, pp. 517–523, 2009.

[2] T. Gast, “Sensors with oscillating elements,” J. Phys. E., vol. 18, no. 9, pp. 783–789, 1985.

[3] A. Prindle, P. Samayoa, I. Razinkov, T. Danino, L. S. Tsimring, and J. Hasty, “A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels,’” Nature, vol. 481, no. 7379, pp. 39–44, 2012.

[4] and L.-H. Z. Yi-Hu Dong, Jin-Ling Xu, Xian-Zhen Li, “AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 97, no. 7, pp. 3526–3531, 2000.

[5] “Quorum sensing 101: https://sites.tufts.edu/quorumsensing/quorumsensing101/,” citirano dne 6.1.2019.

[6] T. Chu et al., “In vivo programmed gene expression based on artificial quorum networks,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 81, no. 15, pp. 4984–4992, 2015.

[7] M. Balamurugan et al., “Recent trends in electrochemical biosensors of superoxide dismutases,” Biosensors and Bioelectronics, vol. 116. pp. 89–99, 2018.

[8] “Low cost open source arsenic detector: https://www.kickstarter.com/projects/1499966707/low-cost-open-source-arsenic-detector-for-drinking?ref=category,” citirano dne 6.1.2019.

[9] J. Das, P. Sarkar, J. Panda, and P. Pal, “Low-cost field test kits for arsenic detection in water,” J. Environ. Sci. Heal. - Part A Toxic/Hazardous Subst. Environ. Eng., vol. 49, no. 1, pp. 108–115, 2014.

Zaznavalni niz genetskih biopikslov sklopljenih preko radikalov

2019-01-14T15:59:42Z

Miha Koprivnikar Krajnc:

Izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/nature10722 A. Prindle et.al. "A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’" ''Nature'', 2011]

----

== Ozadje ==

Namen raziskovalcev je bil ustvariti biosenzor za arzen, ki izkorišča bakterijski naravni odzivni sistem na prisotnost arzenita (As3+) in koncept genetskega vezja, ki ta sistem povezuje z reporterskim proteinom na do sedaj nov način; to je preko merjenja frekvence nihanja ekspresije GFP, in ne preko same intenzitete fluorescence, kot je bilo narejeno že pred leti [1].

Ideja je bila ustvariti oscilirajoči senzor. Prednost oscilirajočih senzorjev je preprostost kvantizacije signala, tj. frekvence. V primeru klasičnih, neoscilirajočih senzorjev, pri katerih namesto frekvence merimo intenziteto optičnega signala, moramo vrednosti vedno znova normalizirati in kalibrirati, saj imajo eksperimentalni faktorji, kot je intenziteta vzbujajočega žarka in čas izpostavitve večji vpliv, prav tako nihajni čas ni odvisen od amplitude. Oscilirajoči senzorji so torej boljši za ponovljivost in preprostost meritev, kar prinaša svoje prednosti pri razvoju točnega komercialnega senzorja [2].

== Fizična zasnova in gensko vezje ==

Fizično je biosenzor sestavljeni iz urejenega niza posameznih kolonij E.coli, ki so med seboj ločene s pregradami. Genetsko pa je zapis načrtovan, da je izražanje reporterja sfGFP:

1) pozitivno regulirano z arzenitom (posredno),

2) pospešeno s pomočjo pozitivnih povratnih zank v genskem vezju,

3) medcelično usklajeno na dveh nivojih.

Ta dva nivoja usklajevanja sta intrakolonijsko preko zaznavanja sklepčnosti (ang. »quorum sensing«) in interkolonijsko z reaktivnimi kisikovimi zvrstmi (ROS) in posledično plina H2O2, ki potuje med kolonijami in prodira v celice. Zaznavanje sklepčnosti je način regulacije ekspresije proteinov na podlagi gostote populacije celic, ker to pomeni boljši fenotip in izboljša preživetje – neke vrste bakterijski približek večceličnosti. Uporablja se za usklajevanje celic, a na dolge razdalje deluje precej počasi, zato so pri povečevanju obsega (ang. »scaling-up«) dodali usklajevanje preko hlapnega vodikovega peroksida. Oba nivoja sta nepogrešljiva za zagotovitev urejenih nihanj. [3].

Eden večjih izzivov sintezne biologije je izdelava genetskih vezij, ki se karseda približajo binarnosti klasičnih vezij. To ni enostavno, saj je v kompleksnem celične okolju ogromno 'ekspresijskega šuma' (naključni vrhovi transkripcije in translacije). Pogoj za premostitev tega izziva je poenotenje vseh celic, da so kolonije, tj. biopiksli, homogene in funkcionalne v vezju [3].

Namesto da so izdelali oscilirajoči senzor iz ene ogromne kolonije (ki se usklajuje počasi, samo preko zaznavanja sklepčnosti), so zvezali tisoče malih oscilirajočih kolonij – biopikslov – v mikrofluidni niz. Znotraj kolonije se oscilacije usklajujejo preko zaznavanja sklepčnosti, med kolonijami pa deluje druga, hitrejša raven signalizacije. Le-ta vključuje H2O2 in E.coli lastno »redoks mašinerijo«. Obe vrste signalizacije oz. usklajevanja oscilacij delujeta sinergistično, a zelo različno: sklepčnost je močna, a deluje na kratke razdalje (pod 1 mm), redoks pa je šibkejša, a zagotavlja daljši doseg. Avtorji so uporabili analogijo z letališči: prav tako pri celicah, tudi pri letališčih ni možno (niti koristno), da bi bila vsa letališča med seboj povezana z leti. Leti z manjših letališč so lokalno povezani preko večjih letališč, ki imajo globalne povezave, ta globalna povezava pa v tej analogiji predstavlja redoks signalizacijo.

== Konstrukcija genske platforme za ustvarjanje nihanj ==

Začeli so na intrakolonijskem nivoju, z uporabo t.i. avtoinduktorja (ang. »autoinducer«) Gram-negativnih bakterij AHL (N-acil homoserin lakton), ki difundira po mediju in deluje med celicami znotraj kolonije. AHL je bistven za zaznavanje sklepčnosti: produkt gena LuxI je AHL sintaza. Produkt gena AiiA (autoinducer inhibitor A) je posredni represor gena LuxI, saj deluje kot laktonaza in razgrajuje AHL [4]. AHL se poveže z LuxR in s tem ustavi utišanje genov LuxI, AiiA, sfGFP in Ndh, ki imajo lux promotorje. Povezava AHL z LuxR torej poveča ekspresijo sfGFP in pa samega LuxI – avtoinduktivna pozitivna povratna zanka omogoča pospešitev izražanja in sinhronost skupinskega vedenja. Na drugi strani pa prisotnost gena AiiA pod enakim promotorjem sistemu prinaša fino negativno regulacijo ter zaključitev nihajnega vrha in vrnitev v dno oscilacije. Gena LuxI in AiiA sta tako odgovorna za sinhronizirano nihanje AHL in s tem za oscilacije fluoresciranja biopiksla. Vpliv AHL med kolonijami ni možen, ker so le-te delno ločene, medij med njimi pa ima visok pretok [3], [5], [6].

Interkolonijska redoks signalizacija pa ne deluje s pomočjo molekul, ki difundirajo preko medija, kot je AHL, saj je edina povezava med posameznimi biopiksli preko zraka – uporabili so vodikov peroksid. To so dosegli, z vnosom kopije gena ndh (NADH dehidrogenaza II – NDH-2) pod kontrolo enakega lux promotorja, kot vsi ostali navedeni geni. Ndh je membranski encim in proizvaja H2O2 in superoksidni radikal O2-. Plinasti H2O2 potuje med kolonijami, prodira v celice in posredno aktivira lux promotorje; inaktivira ArcAB, ki je sicer del redoks kontrolnega sistema in se veže na lux promotorje ter jih utiša. Ob prisotnosti peroksida so torej lux geni aktivni. Tovrstna aktivacija omogoča dodatno pozitivno povratno zanko za sinhronizacijo populacije [3].

Ko je bil razvit ta sistem sinhronizacije nihanj v dveh nivojih, so ga poenostavili. Odstranili so gen ndh kot proizvajalec radikalov (ki nato tvorijo peroksid), to nalogo pa je prevzel sam GFP. Ob višku izražanja GFP-ja celice izpostavimo žarku fluorescentne svetlobe, kar povzroči nastanek radikalov in posledično peroksida; ob oscilatornem dnu pa GFP-ja praktično ni, kar pomeni da ob obsevanju ni tudi peroksida. GFP ima tako v poenostavljeni platformi dvojno vlogo: vlogo sklopitelja (generiranje radikalov za globalno sinhroniziranje) in vlogo reporterja [3].

== Vpliv sprememb radikalov na nihalno gensko platformo ==

Naslednji korak raziskovalcev je bil preučiti vpliv okoljskih dejavnikov, ki bi lahko motili količino radikalov, potrebnih za interkolonijsko signalizacijo. Najprej je bil preučen vpliv katalaze in vpliv superoksid dizmutaze (SOD) na nepoenostavljeno platformo – ta, ki generira radikale z ndh. Prisotnost katalaze povzroči izgubo medkolonijske sinhronizacije, ne vpliva pa na oscilacije posameznih kolonij. To pomeni, da odtegnitev peroksida prepreči drugo raven signalizacije in razklopi biopiksle. Na drugi strani pa SOD povzroči izrazit usklajen val fluorescence, kateremu sledi konstanten signal brez oscilacij. Razlog za to je dejstvo, da SOD poveča delež superoksidnega radikala, ki se pretvori v H2O2. Preveč peroksida posledično onemogoči nihanja – pride do konstantne fluorescence. Do zelo velike koncentracije H2O2 pride kljub temu, da je SOD znotrajcelični encim – razlog za to je visoka katalitična aktivnost dizmutaze [3], [7].

Vpliv katalaze in SOD na poenostavljeno platformo je bil identičen kot pri tisti z genom ndh. To potrjuje pomembnost ravno prave količine H2O2, potrebne za usklajevanje biopikslov ter zagotavlja, da sprememba vira radikalov (GFP namesto NDH-2) ne okrni kvalitete radikalne signalizacije med kolonijami. Pri tej platformi so preučili tudi vpliv tiosečnine in ampicilina; tiosečnina je dušilec radikalov in rezultati so pokazali, da kot tak onesposobi sinhronizacijo nihanj, brez da bi škodil viabilnosti. Ampicilin, ki pa proizvaja radikale, prav tako poruši usklajenost nihanj (podobno kot pri SOD), kar pomeni, da prevelika količina radikalov tudi onemogoči sinhronizacijo [3].

== Konstrukcije makroskopskega biosenzorja za arzenit ==

Naloge so se lotili na dva načina. Pri prvem se ob prisotnosti arzenita zgolj spremeni frekvenca nihanja fluorescence, pri drugem pa gre za »on-off« sistem, torej se sinhronizirano nihanje vzpostavi šele ob pražni vrednosti koncentracije arzenita [3].
=== Modulacija frekvence ===
Osnovni platformi so dodali še eno kopijo gena LuxI (gen za AHL sintazo), le da je ta pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa (ArsRE). Ko arzenita ni v mediju, so prisotne bazalne oscilacije zaradi izražanja prvotne kopije LuxI kot posledica peroksida, saj je na arzenit-odzivni element vezan represor ArsR. Ko pa je arzenit prisoten, se poveže z represorjem ArsR, povzroči njegovo oddisociacijo z ArsRE in tako prepreči nadaljnjo represijo LuxI gena – torej zaradi arzenita se izraža dodaten LuxI, kar privede do povečane količine AHL in posledično do povečanega nihajnega časa in amplitude ter zmanjšane frekvence. Testiranje tega konstrukta pri različnih količinah arzenita je pokazalo, da se je nihajni čas sorazmerno povečeval s povečevanjem koncentracije arzenita. Izkazalo se je, da je tak senzor sposoben zaznati in tudi kvantificirati koncentracije arzenita že od 0,2 µM naprej, s tem da WHO direktiva določa zgornjo mejo sprejemljive koncentracije za države v razvoju pri 0,5 µM [3].
=== Vse ali nič ===
Nihanje se zgodi le ob doseganju pražne koncentracije (ang. »thresholding«). V DNA je bil vstavljen zapis za LuxR pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa. Ta gen LuxR isto kot že pri osnovni platformi ni imel povezave s preostankom vezja, torej za razliko od ostalih genov platforme ni pod lux promotorjem; razlika je v tem, da se LuxR ne izraža več konstitutivno kot prej, ampak zgolj in samo inducibilno, in to s strani arzenita. To pomeni, da se v odsotnosti arzenita LuxR ne izraža, za aktivacijo gena LuxI pa je bistven kompleks LuxR-AHL – torej brez le-tega ni fluorescence in ni oscilacij. Ko pa arzenit je prisoten, se izrazi LuxR, zaradi njega in AHL pa tudi LuxI, kar obnovi funkcijo vezja in dobimo usklajeno nihanje. Ta sistem »vse ali nič« se vklopi pri 0,25 µM arzenitu, a to ni absolutna spodnja meja. Pražno koncentracijo se da še dodatno prilagoditi s spreminjanjem komponent genskega vezja (število kopij genov, Shine-Dalgarnovo zaporedje ipd.) [3].

== Zaključek ==

Oba načina signalizacije sta bila uporabljena za »scale-up« tega biosenzorja, a je vseeno potrebna mikroskopija za detekcijo, kar je nepraktično za komercialno uporabo. Ustvarjeni senzor z globalno sinhronizacijo je niz velikosti 24 mm x 12 mm in vsebuje 12 000 biopikslov oz. kolonij, skupno okoli 50 milijonov celic. Kljub že sicer povečanem signalu, ga je potrebno še dodatno ojačati, da bi lahko postal senzor uporaben v vsakdanjem življenju. To bi lahko dosegli s spremembami niza, kot je število biopikslov in njihova razporeditev, kar privede do različnih »output« oscilacij [3].

Za perspektivo je mogoče smiselno omeniti alternative v detekciji arzena, oz. načine, katerim je ta novi biosenzor alternativa. Prva naprava za detekcijo arzenita vodi doda Zn, ta pa katalizira nastanek plina arzina AsH3. Arzin reagira z detektorjem nad gladino, ki vsebuje HgBr (ali AgNO3), in pride do rumenega (ali sivega) obarvanja. Drug način uporablja zlate nanodelce – aptameri so v kompleksu s surfaktanti, ki sicer omogočijo agregacijo zlatih nanodelcev; ko pa pride arzenit, se tvorijo As(III)-aptamer kompleksi, prosti surfaktanti pa sprožijo obarjanje zlata, kar vodi v obarvanje. Tretji način pa je že biosenzor – kolonija E.coli, ki imajo LacZ gen pod ArsRE, zaznavamo pa padec pH, ki je posledica razgradnje laktoze [1], [3], [8], [9].

Vidne prednosti te alternative so nedvoumnost detekcije (ne kot pri redukciji azenita v arzin), manj proizvedenih odpadkov in strupenih snovi (enkratna uporaba ostalih detektorjev, arzin, Hg) in potencialna cenovna konkurenčnost. Predvidena cena konceptualne naprave z biosenzorjem je pod 50$, najpomembneje pa je, da ni za enkratno uporabo kot so trenutni senzorji [1], [3], [8], [9].

== Viri ==

[1] N. Joshi, X. Wang, L. Montgomery, A. Elfick, and C. E. French, “Novel approaches to biosensors for detection of arsenic in drinking water,” Desalination, vol. 248, no. 1–3, pp. 517–523, 2009.

[2] T. Gast, “Sensors with oscillating elements,” J. Phys. E., vol. 18, no. 9, pp. 783–789, 1985.

[3] A. Prindle, P. Samayoa, I. Razinkov, T. Danino, L. S. Tsimring, and J. Hasty, “A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels,’” Nature, vol. 481, no. 7379, pp. 39–44, 2012.

[4] and L.-H. Z. Yi-Hu Dong, Jin-Ling Xu, Xian-Zhen Li, “AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 97, no. 7, pp. 3526–3531, 2000.

[5] “Quorum sensing 101: https://sites.tufts.edu/quorumsensing/quorumsensing101/,” citirano dne 6.1.2019.

[6] T. Chu et al., “In vivo programmed gene expression based on artificial quorum networks,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 81, no. 15, pp. 4984–4992, 2015.

[7] M. Balamurugan et al., “Recent trends in electrochemical biosensors of superoxide dismutases,” Biosensors and Bioelectronics, vol. 116. pp. 89–99, 2018.

[8] “Low cost open source arsenic detector: https://www.kickstarter.com/projects/1499966707/low-cost-open-source-arsenic-detector-for-drinking?ref=category,” citirano dne 6.1.2019.

[9] J. Das, P. Sarkar, J. Panda, and P. Pal, “Low-cost field test kits for arsenic detection in water,” J. Environ. Sci. Heal. - Part A Toxic/Hazardous Subst. Environ. Eng., vol. 49, no. 1, pp. 108–115, 2014.

Zaznavalni niz genetskih biopikslov sklopljenih preko radikalov

2019-01-14T15:55:20Z

Miha Koprivnikar Krajnc:

Izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/nature10722 A. Prindle et.al. "A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’" ''Nature'', 2011]

----

== Ozadje ==

Namen raziskovalcev je bil ustvariti biosenzor za arzen, ki izkorišča bakterijski naravni odzivni sistem na prisotnost arzenita (As3+) in koncept genetskega vezja, ki ta sistem povezuje z reporterskim proteinom na do sedaj nov način; to je preko merjenja frekvence nihanja ekspresije GFP, in ne preko same intenzitete fluorescence, kot je bilo narejeno že pred leti [1].
Ideja je bila ustvariti oscilirajoči senzor. Prednost oscilirajočih senzorjev je preprostost kvantizacije signala, tj. frekvence. V primeru klasičnih, neoscilirajočih senzorjev, pri katerih namesto frekvence merimo intenziteto optičnega signala, moramo vrednosti vedno znova normalizirati in kalibrirati, saj imajo eksperimentalni faktorji, kot je intenziteta vzbujajočega žarka in čas izpostavitve večji vpliv, prav tako nihajni čas ni odvisen od amplitude. Oscilirajoči senzorji so torej boljši za ponovljivost in preprostost meritev, kar prinaša svoje prednosti pri razvoju točnega komercialnega senzorja [2].

== Fizična zasnova in gensko vezje ==

Fizično je biosenzor sestavljeni iz urejenega niza posameznih kolonij E.coli, ki so med seboj ločene s pregradami. Genetsko pa je zapis načrtovan, da je izražanje reporterja sfGFP:
1) pozitivno regulirano z arzenitom (posredno),
2) pospešeno s pomočjo pozitivnih povratnih zank v genskem vezju,
3) medcelično usklajeno na dveh nivojih.
Ta dva nivoja usklajevanja sta intrakolonijsko preko zaznavanja sklepčnosti (ang. »quorum sensing«) in interkolonijsko z reaktivnimi kisikovimi zvrstmi (ROS) in posledično plina H2O2, ki potuje med kolonijami in prodira v celice. Zaznavanje sklepčnosti je način regulacije ekspresije proteinov na podlagi gostote populacije celic, ker to pomeni boljši fenotip in izboljša preživetje – neke vrste bakterijski približek večceličnosti. Uporablja se za usklajevanje celic, a na dolge razdalje deluje precej počasi, zato so pri povečevanju obsega (ang. »scaling-up«) dodali usklajevanje preko hlapnega vodikovega peroksida. Oba nivoja sta nepogrešljiva za zagotovitev urejenih nihanj. [3].
Eden večjih izzivov sintezne biologije je izdelava genetskih vezij, ki se karseda približajo binarnosti klasičnih vezij. To ni enostavno, saj je v kompleksnem celične okolju ogromno 'ekspresijskega šuma' (naključni vrhovi transkripcije in translacije). Pogoj za premostitev tega izziva je poenotenje vseh celic, da so kolonije, tj. biopiksli, homogene in funkcionalne v vezju [3].
Namesto da so izdelali oscilirajoči senzor iz ene ogromne kolonije (ki se usklajuje počasi, samo preko zaznavanja sklepčnosti), so zvezali tisoče malih oscilirajočih kolonij – biopikslov – v mikrofluidni niz. Znotraj kolonije se oscilacije usklajujejo preko zaznavanja sklepčnosti, med kolonijami pa deluje druga, hitrejša raven signalizacije. Le-ta vključuje H2O2 in E.coli lastno »redoks mašinerijo«. Obe vrste signalizacije oz. usklajevanja oscilacij delujeta sinergistično, a zelo različno: sklepčnost je močna, a deluje na kratke razdalje (pod 1 mm), redoks pa je šibkejša, a zagotavlja daljši doseg. Avtorji so uporabili analogijo z letališči: prav tako pri celicah, tudi pri letališčih ni možno (niti koristno), da bi bila vsa letališča med seboj povezana z leti. Leti z manjših letališč so lokalno povezani preko večjih letališč, ki imajo globalne povezave, ta globalna povezava pa v tej analogiji predstavlja redoks signalizacijo.

== Konstrukcija genske platforme za ustvarjanje nihanj ==

Začeli so na intrakolonijskem nivoju, z uporabo t.i. avtoinduktorja (ang. »autoinducer«) Gram-negativnih bakterij AHL (N-acil homoserin lakton), ki difundira po mediju in deluje med celicami znotraj kolonije. AHL je bistven za zaznavanje sklepčnosti: produkt gena LuxI je AHL sintaza. Produkt gena AiiA (autoinducer inhibitor A) je posredni represor gena LuxI, saj deluje kot laktonaza in razgrajuje AHL [4]. AHL se poveže z LuxR in s tem ustavi utišanje genov LuxI, AiiA, sfGFP in Ndh, ki imajo lux promotorje. Povezava AHL z LuxR torej poveča ekspresijo sfGFP in pa samega LuxI – avtoinduktivna pozitivna povratna zanka omogoča pospešitev izražanja in sinhronost skupinskega vedenja. Na drugi strani pa prisotnost gena AiiA pod enakim promotorjem sistemu prinaša fino negativno regulacijo ter zaključitev nihajnega vrha in vrnitev v dno oscilacije. Gena LuxI in AiiA sta tako odgovorna za sinhronizirano nihanje AHL in s tem za oscilacije fluoresciranja biopiksla. Vpliv AHL med kolonijami ni možen, ker so le-te delno ločene, medij med njimi pa ima visok pretok [3], [5], [6].
Interkolonijska redoks signalizacija pa ne deluje s pomočjo molekul, ki difundirajo preko medija, kot je AHL, saj je edina povezava med posameznimi biopiksli preko zraka – uporabili so vodikov peroksid. To so dosegli, z vnosom kopije gena ndh (NADH dehidrogenaza II – NDH-2) pod kontrolo enakega lux promotorja, kot vsi ostali navedeni geni. Ndh je membranski encim in proizvaja H2O2 in superoksidni radikal O2-. Plinasti H2O2 potuje med kolonijami, prodira v celice in posredno aktivira lux promotorje; inaktivira ArcAB, ki je sicer del redoks kontrolnega sistema in se veže na lux promotorje ter jih utiša. Ob prisotnosti peroksida so torej lux geni aktivni. Tovrstna aktivacija omogoča dodatno pozitivno povratno zanko za sinhronizacijo populacije [3].
Ko je bil razvit ta sistem sinhronizacije nihanj v dveh nivojih, so ga poenostavili. Odstranili so gen ndh kot proizvajalec radikalov (ki nato tvorijo peroksid), to nalogo pa je prevzel sam GFP. Ob višku izražanja GFP-ja celice izpostavimo žarku fluorescentne svetlobe, kar povzroči nastanek radikalov in posledično peroksida; ob oscilatornem dnu pa GFP-ja praktično ni, kar pomeni da ob obsevanju ni tudi peroksida. GFP ima tako v poenostavljeni platformi dvojno vlogo: vlogo sklopitelja (generiranje radikalov za globalno sinhroniziranje) in vlogo reporterja [3].

== Vpliv sprememb radikalov na nihalno gensko platformo ==

Naslednji korak raziskovalcev je bil preučiti vpliv okoljskih dejavnikov, ki bi lahko motili količino radikalov, potrebnih za interkolonijsko signalizacijo. Najprej je bil preučen vpliv katalaze in vpliv superoksid dizmutaze (SOD) na nepoenostavljeno platformo – ta, ki generira radikale z ndh. Prisotnost katalaze povzroči izgubo medkolonijske sinhronizacije, ne vpliva pa na oscilacije posameznih kolonij. To pomeni, da odtegnitev peroksida prepreči drugo raven signalizacije in razklopi biopiksle. Na drugi strani pa SOD povzroči izrazit usklajen val fluorescence, kateremu sledi konstanten signal brez oscilacij. Razlog za to je dejstvo, da SOD poveča delež superoksidnega radikala, ki se pretvori v H2O2. Preveč peroksida posledično onemogoči nihanja – pride do konstantne fluorescence. Do zelo velike koncentracije H2O2 pride kljub temu, da je SOD znotrajcelični encim – razlog za to je visoka katalitična aktivnost dizmutaze [3], [7].
Vpliv katalaze in SOD na poenostavljeno platformo je bil identičen kot pri tisti z genom ndh. To potrjuje pomembnost ravno prave količine H2O2, potrebne za usklajevanje biopikslov ter zagotavlja, da sprememba vira radikalov (GFP namesto NDH-2) ne okrni kvalitete radikalne signalizacije med kolonijami. Pri tej platformi so preučili tudi vpliv tiosečnine in ampicilina; tiosečnina je dušilec radikalov in rezultati so pokazali, da kot tak onesposobi sinhronizacijo nihanj, brez da bi škodil viabilnosti. Ampicilin, ki pa proizvaja radikale, prav tako poruši usklajenost nihanj (podobno kot pri SOD), kar pomeni, da prevelika količina radikalov tudi onemogoči sinhronizacijo [3].

== Konstrukcije makroskopskega biosenzorja za arzenit ==

Naloge so se lotili na dva načina. Pri prvem se ob prisotnosti arzenita zgolj spremeni frekvenca nihanja fluorescence, pri drugem pa gre za »on-off« sistem, torej se sinhronizirano nihanje vzpostavi šele ob pražni vrednosti koncentracije arzenita [3].
=== Modulacija frekvence ===
Osnovni platformi so dodali še eno kopijo gena LuxI (gen za AHL sintazo), le da je ta pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa (ArsRE). Ko arzenita ni v mediju, so prisotne bazalne oscilacije zaradi izražanja prvotne kopije LuxI kot posledica peroksida, saj je na arzenit-odzivni element vezan represor ArsR. Ko pa je arzenit prisoten, se poveže z represorjem ArsR, povzroči njegovo oddisociacijo z ArsRE in tako prepreči nadaljnjo represijo LuxI gena – torej zaradi arzenita se izraža dodaten LuxI, kar privede do povečane količine AHL in posledično do povečanega nihajnega časa in amplitude ter zmanjšane frekvence. Testiranje tega konstrukta pri različnih količinah arzenita je pokazalo, da se je nihajni čas sorazmerno povečeval s povečevanjem koncentracije arzenita. Izkazalo se je, da je tak senzor sposoben zaznati in tudi kvantificirati koncentracije arzenita že od 0,2 µM naprej, s tem da WHO direktiva določa zgornjo mejo sprejemljive koncentracije za države v razvoju pri 0,5 µM [3].
=== Vse ali nič ===
Nihanje se zgodi le ob doseganju pražne koncentracije (ang. »thresholding«). V DNA je bil vstavljen zapis za LuxR pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa. Ta gen LuxR isto kot že pri osnovni platformi ni imel povezave s preostankom vezja, torej za razliko od ostalih genov platforme ni pod lux promotorjem; razlika je v tem, da se LuxR ne izraža več konstitutivno kot prej, ampak zgolj in samo inducibilno, in to s strani arzenita. To pomeni, da se v odsotnosti arzenita LuxR ne izraža, za aktivacijo gena LuxI pa je bistven kompleks LuxR-AHL – torej brez le-tega ni fluorescence in ni oscilacij. Ko pa arzenit je prisoten, se izrazi LuxR, zaradi njega in AHL pa tudi LuxI, kar obnovi funkcijo vezja in dobimo usklajeno nihanje. Ta sistem »vse ali nič« se vklopi pri 0,25 µM arzenitu, a to ni absolutna spodnja meja. Pražno koncentracijo se da še dodatno prilagoditi s spreminjanjem komponent genskega vezja (število kopij genov, Shine-Dalgarnovo zaporedje ipd.) [3].

== Zaključek ==

Oba načina signalizacije sta bila uporabljena za »scale-up« tega biosenzorja, a je vseeno potrebna mikroskopija za detekcijo, kar je nepraktično za komercialno uporabo. Ustvarjeni senzor z globalno sinhronizacijo je niz velikosti 24 mm x 12 mm in vsebuje 12 000 biopikslov oz. kolonij, skupno okoli 50 milijonov celic. Kljub že sicer povečanem signalu, ga je potrebno še dodatno ojačati, da bi lahko postal senzor uporaben v vsakdanjem življenju. To bi lahko dosegli s spremembami niza, kot je število biopikslov in njihova razporeditev, kar privede do različnih »output« oscilacij [3].
Za perspektivo je mogoče smiselno omeniti alternative v detekciji arzena, oz. načine, katerim je ta novi biosenzor alternativa. Prva naprava za detekcijo arzenita vodi doda Zn, ta pa katalizira nastanek plina arzina AsH3. Arzin reagira z detektorjem nad gladino, ki vsebuje HgBr (ali AgNO3), in pride do rumenega (ali sivega) obarvanja. Drug način uporablja zlate nanodelce – aptameri so v kompleksu s surfaktanti, ki sicer omogočijo agregacijo zlatih nanodelcev; ko pa pride arzenit, se tvorijo As(III)-aptamer kompleksi, prosti surfaktanti pa sprožijo obarjanje zlata, kar vodi v obarvanje. Tretji način pa je že biosenzor – kolonija E.coli, ki imajo LacZ gen pod ArsRE, zaznavamo pa padec pH, ki je posledica razgradnje laktoze [1], [3], [8], [9].
Vidne prednosti te alternative so nedvoumnost detekcije (ne kot pri redukciji azenita v arzen), manj proizvedenih odpadkov in strupenih snovi (enkratna uporaba ostalih detektorjev, arzin, Hg) in potencialna cenovna konkurenčnost. Predvidena cena konceptualne naprave z biosenzorjem je pod 50$, najpomembneje pa je, da ni za enkratno uporabo kot so trenutni senzorji [1], [3], [8], [9].

== Viri ==

[1] N. Joshi, X. Wang, L. Montgomery, A. Elfick, and C. E. French, “Novel approaches to biosensors for detection of arsenic in drinking water,” Desalination, vol. 248, no. 1–3, pp. 517–523, 2009.

[2] T. Gast, “Sensors with oscillating elements,” J. Phys. E., vol. 18, no. 9, pp. 783–789, 1985.

[3] A. Prindle, P. Samayoa, I. Razinkov, T. Danino, L. S. Tsimring, and J. Hasty, “A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels,’” Nature, vol. 481, no. 7379, pp. 39–44, 2012.

[4] and L.-H. Z. Yi-Hu Dong, Jin-Ling Xu, Xian-Zhen Li, “AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 97, no. 7, pp. 3526–3531, 2000.

[5] “Quorum sensing 101: https://sites.tufts.edu/quorumsensing/quorumsensing101/,” citirano dne 6.1.2019.

[6] T. Chu et al., “In vivo programmed gene expression based on artificial quorum networks,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 81, no. 15, pp. 4984–4992, 2015.

[7] M. Balamurugan et al., “Recent trends in electrochemical biosensors of superoxide dismutases,” Biosensors and Bioelectronics, vol. 116. pp. 89–99, 2018.

[8] “Low cost open source arsenic detector: https://www.kickstarter.com/projects/1499966707/low-cost-open-source-arsenic-detector-for-drinking?ref=category,” citirano dne 6.1.2019.

[9] J. Das, P. Sarkar, J. Panda, and P. Pal, “Low-cost field test kits for arsenic detection in water,” J. Environ. Sci. Heal. - Part A Toxic/Hazardous Subst. Environ. Eng., vol. 49, no. 1, pp. 108–115, 2014.

Zaznavalni niz genetskih biopikslov sklopljenih preko radikalov

2019-01-14T15:51:03Z

Miha Koprivnikar Krajnc:

Izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/nature10722 A. Prindle et.al. "A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’" ''Nature'', 2011]

----

== Ozadje ==

Namen raziskovalcev je bil ustvariti biosenzor za arzen, ki izkorišča bakterijski naravni odzivni sistem na prisotnost arzenita (As3+) in koncept genetskega vezja, ki ta sistem povezuje z reporterskim proteinom na do sedaj nov način; to je preko merjenja frekvence nihanja ekspresije GFP, in ne preko same intenzitete fluorescence, kot je bilo narejeno že pred leti [1].
Ideja je bila ustvariti oscilirajoči senzor. Prednost oscilirajočih senzorjev je preprostost kvantizacije signala, tj. frekvence. V primeru klasičnih, neoscilirajočih senzorjev, pri katerih namesto frekvence merimo intenziteto optičnega signala, moramo vrednosti vedno znova normalizirati in kalibrirati, saj imajo eksperimentalni faktorji, kot je intenziteta vzbujajočega žarka in čas izpostavitve večji vpliv, prav tako nihajni čas ni odvisen od amplitude. Oscilirajoči senzorji so torej boljši za ponovljivost in preprostost meritev, kar prinaša svoje prednosti pri razvoju točnega komercialnega senzorja [2].

== Fizična zasnova in gensko vezje ==

Fizično je biosenzor sestavljeni iz urejenega niza posameznih kolonij E.coli, ki so med seboj ločene s pregradami. Genetsko pa je zapis načrtovan, da je izražanje reporterja sfGFP:
1) pozitivno regulirano z arzenitom (posredno),
2) pospešeno s pomočjo pozitivnih povratnih zank v genskem vezju,
3) medcelično usklajeno na dveh nivojih.
Ta dva nivoja usklajevanja sta intrakolonijsko preko zaznavanja sklepčnosti (ang. »quorum sensing«) in interkolonijsko z reaktivnimi kisikovimi zvrstmi (ROS) in posledično plina H2O2, ki potuje med kolonijami in prodira v celice. Zaznavanje sklepčnosti je način regulacije ekspresije proteinov na podlagi gostote populacije celic, ker to pomeni boljši fenotip in izboljša preživetje – neke vrste bakterijski približek večceličnosti. Uporablja se za usklajevanje celic, a na dolge razdalje deluje precej počasi, zato so pri povečevanju obsega (ang. »scaling-up«) dodali usklajevanje preko hlapnega vodikovega peroksida. Oba nivoja sta nepogrešljiva za zagotovitev urejenih nihanj. [3].
Eden večjih izzivov sintezne biologije je izdelava genetskih vezij, ki se karseda približajo binarnosti klasičnih vezij. To ni enostavno, saj je v kompleksnem celične okolju ogromno 'ekspresijskega šuma' (naključni vrhovi transkripcije in translacije). Pogoj za premostitev tega izziva je poenotenje vseh celic, da so kolonije, tj. biopiksli, homogene in funkcionalne v vezju [3].
Namesto da so izdelali oscilirajoči senzor iz ene ogromne kolonije (ki se usklajuje počasi, samo preko zaznavanja sklepčnosti), so zvezali tisoče malih oscilirajočih kolonij – biopikslov – v mikrofluidni niz. Znotraj kolonije se oscilacije usklajujejo preko zaznavanja sklepčnosti, med kolonijami pa deluje druga, hitrejša raven signalizacije. Le-ta vključuje H2O2 in E.coli lastno »redoks mašinerijo«. Obe vrste signalizacije oz. usklajevanja oscilacij delujeta sinergistično, a zelo različno: sklepčnost je močna, a deluje na kratke razdalje (pod 1 mm), redoks pa je šibkejša, a zagotavlja daljši doseg. Avtorji so uporabili analogijo z letališči: prav tako pri celicah, tudi pri letališčih ni možno (niti koristno), da bi bila vsa letališča med seboj povezana z leti. Leti z manjših letališč so lokalno povezani preko večjih letališč, ki imajo globalne povezave, ta globalna povezava pa v tej analogiji predstavlja redoks signalizacijo.

== Konstrukcija genske platforme za ustvarjanje nihanj ==

Začeli so na intrakolonijskem nivoju, z uporabo t.i. avtoinduktorja (ang. »autoinducer«) Gram-negativnih bakterij AHL (N-acil homoserin lakton), ki difundira po mediju in deluje med celicami znotraj kolonije. AHL je bistven za zaznavanje sklepčnosti: produkt gena LuxI je AHL sintaza. Produkt gena AiiA (autoinducer inhibitor A) je posredni represor gena LuxI, saj deluje kot laktonaza in razgrajuje AHL [4]. AHL se poveže z LuxR in s tem ustavi utišanje genov LuxI, AiiA, sfGFP in Ndh, ki imajo lux promotorje. Povezava AHL z LuxR torej poveča ekspresijo sfGFP in pa samega LuxI – avtoinduktivna pozitivna povratna zanka omogoča pospešitev izražanja in sinhronost skupinskega vedenja. Na drugi strani pa prisotnost gena AiiA pod enakim promotorjem sistemu prinaša fino negativno regulacijo ter zaključitev nihajnega vrha in vrnitev v dno oscilacije. Gena LuxI in AiiA sta tako odgovorna za sinhronizirano nihanje AHL in s tem za oscilacije fluoresciranja biopiksla. Vpliv AHL med kolonijami ni možen, ker so le-te delno ločene, medij med njimi pa ima visok pretok [3], [5], [6].
Interkolonijska redoks signalizacija pa ne deluje s pomočjo molekul, ki difundirajo preko medija, kot je AHL, saj je edina povezava med posameznimi biopiksli preko zraka – uporabili so vodikov peroksid. To so dosegli, z vnosom kopije gena ndh (NADH dehidrogenaza II – NDH-2) pod kontrolo enakega lux promotorja, kot vsi ostali navedeni geni. Ndh je membranski encim in proizvaja H2O2 in superoksidni radikal O2-. Plinasti H2O2 potuje med kolonijami, prodira v celice in posredno aktivira lux promotorje; inaktivira ArcAB, ki je sicer del redoks kontrolnega sistema in se veže na lux promotorje ter jih utiša. Ob prisotnosti peroksida so torej lux geni aktivni. Tovrstna aktivacija omogoča dodatno pozitivno povratno zanko za sinhronizacijo populacije [3].
Ko je bil razvit ta sistem sinhronizacije nihanj v dveh nivojih, so ga poenostavili. Odstranili so gen ndh kot proizvajalec radikalov (ki nato tvorijo peroksid), to nalogo pa je prevzel sam GFP. Ob višku izražanja GFP-ja celice izpostavimo žarku fluorescentne svetlobe, kar povzroči nastanek radikalov in posledično peroksida; ob oscilatornem dnu pa GFP-ja praktično ni, kar pomeni da ob obsevanju ni tudi peroksida. GFP ima tako v poenostavljeni platformi dvojno vlogo: vlogo sklopitelja (generiranje radikalov za globalno sinhroniziranje) in vlogo reporterja [3].

== Vpliv sprememb radikalov na nihalno gensko platformo ==

Naslednji korak raziskovalcev je bil preučiti vpliv okoljskih dejavnikov, ki bi lahko motili količino radikalov, potrebnih za interkolonijsko signalizacijo. Najprej je bil preučen vpliv katalaze in vpliv superoksid dizmutaze (SOD) na nepoenostavljeno platformo – ta, ki generira radikale z ndh. Prisotnost katalaze povzroči izgubo medkolonijske sinhronizacije, ne vpliva pa na oscilacije posameznih kolonij. To pomeni, da odtegnitev peroksida prepreči drugo raven signalizacije in razklopi biopiksle. Na drugi strani pa SOD povzroči izrazit usklajen val fluorescence, kateremu sledi konstanten signal brez oscilacij. Razlog za to je dejstvo, da SOD poveča delež superoksidnega radikala, ki se pretvori v H2O2. Preveč peroksida posledično onemogoči nihanja – pride do konstantne fluorescence. Do zelo velike koncentracije H2O2 pride kljub temu, da je SOD znotrajcelični encim – razlog za to je visoka katalitična aktivnost dizmutaze [3], [7].
Vpliv katalaze in SOD na poenostavljeno platformo je bil identičen kot pri tisti z genom ndh. To potrjuje pomembnost ravno prave količine H2O2, potrebne za usklajevanje biopikslov ter zagotavlja, da sprememba vira radikalov (GFP namesto NDH-2) ne okrni kvalitete radikalne signalizacije med kolonijami. Pri tej platformi so preučili tudi vpliv tiosečnine in ampicilina; tiosečnina je dušilec radikalov in rezultati so pokazali, da kot tak onesposobi sinhronizacijo nihanj, brez da bi škodil viabilnosti. Ampicilin, ki pa proizvaja radikale, prav tako poruši usklajenost nihanj (podobno kot pri SOD), kar pomeni, da prevelika količina radikalov tudi onemogoči sinhronizacijo [3].

== Konstrukcije makroskopskega biosenzorja za arzenit ==

Naloge so se lotili na dva načina. Pri prvem se ob prisotnosti arzenita zgolj spremeni frekvenca nihanja fluorescence, pri drugem pa gre za »on-off« sistem, torej se ob prisotnosti pražne vrednosti arzenita šele vzpostavi sinhronizirano nihanje [3].
=== Modulacija frekvence ===
Osnovni platformi so dodali še eno kopijo gena LuxI (gen za AHL sintazo), le da je ta pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa (ArsRE). Ko arzenita ni v mediju, so prisotne bazalne oscilacije zaradi izražanja prvotne kopije LuxI kot posledica peroksida, saj je na arzenit-odzivni element vezan represor ArsR. Ko pa je arzenit prisoten, se poveže z represorjem ArsR, povzroči njegovo oddisociacijo z ArsRE in tako prepreči nadaljnjo represijo LuxI gena – torej zaradi arzenita se izraža dodaten LuxI, kar privede do povečane količine AHL in posledično do povečanega nihajnega časa in amplitude ter zmanjšane frekvence. Testiranje tega konstrukta pri različnih količinah arzenita je pokazalo, da se je nihajni čas sorazmerno povečeval s povečevanjem koncentracije arzenita. Izkazalo se je, da je tak senzor sposoben zaznati in tudi kvantificirati koncentracije arzenita že od 0,2 µM naprej, s tem da WHO direktiva določa zgornjo mejo sprejemljive koncentracije za države v razvoju pri 0,5 µM [3].
=== Vse ali nič ===
Nihanje se zgodi le ob doseganju pražne koncentracije (ang. »thresholding«). V DNA je bil vstavljen zapis za LuxR pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa. Ta gen LuxR isto kot že pri osnovni platformi ni imel povezave s preostankom vezja, torej za razliko od ostalih genov platforme ni pod lux promotorjem; razlika je v tem, da se LuxR ne izraža več konstitutivno kot prej, ampak zgolj in samo inducibilno, in to s strani arzenita. To pomeni, da se v odsotnosti arzenita LuxR ne izraža, za aktivacijo gena LuxI pa je bistven kompleks LuxR-AHL – torej brez le-tega ni fluorescence in ni oscilacij. Ko pa arzenit je prisoten, se izrazi LuxR, zaradi njega in AHL pa tudi LuxI, kar obnovi funkcijo vezja in dobimo usklajeno nihanje. Ta sistem »vse ali nič« se vklopi pri 0,25 µM arzenitu, a to ni absolutna spodnja meja. Pražno koncentracijo se da še dodatno prilagoditi s spreminjanjem komponent genskega vezja (število kopij genov, Shine-Dalgarnovo zaporedje ipd.) [3].

== Zaključek ==

Oba načina signalizacije sta bila uporabljena za »scale-up« tega biosenzorja, a je vseeno potrebna mikroskopija za detekcijo, kar je nepraktično za komercialno uporabo. Ustvarjeni senzor z globalno sinhronizacijo je niz velikosti 24 mm x 12 mm in vsebuje 12 000 biopikslov oz. kolonij, skupno okoli 50 milijonov celic. Kljub že sicer povečanem signalu, ga je potrebno še dodatno ojačati, da bi lahko postal senzor uporaben v vsakdanjem življenju. To bi lahko dosegli s spremembami niza, kot je število biopikslov in njihova razporeditev, kar privede do različnih »output« oscilacij [3].
Za perspektivo je mogoče smiselno omeniti alternative v detekciji arzena, oz. načine, katerim je ta novi biosenzor alternativa. Prva naprava za detekcijo arzenita vodi doda Zn, ta pa katalizira nastanek plina arzina AsH3. Arzin reagira z detektorjem nad gladino, ki vsebuje HgBr (ali AgNO3), in pride do rumenega (ali sivega) obarvanja. Drug način uporablja zlate nanodelce – aptameri so v kompleksu s surfaktanti, ki sicer omogočijo agregacijo zlatih nanodelcev; ko pa pride arzenit, se tvorijo As(III)-aptamer kompleksi, prosti surfaktanti pa sprožijo obarjanje zlata, kar vodi v obarvanje. Tretji način pa je že biosenzor – kolonija E.coli, ki imajo LacZ gen pod ArsRE, zaznavamo pa padec pH, ki je posledica razgradnje laktoze [1], [3], [8], [9].
Vidne prednosti te alternative so nedvoumnost detekcije (ne kot pri redukciji azenita v arzen), manj proizvedenih odpadkov in strupenih snovi (enkratna uporaba ostalih detektorjev, arzin, Hg) in potencialna cenovna konkurenčnost. Predvidena cena konceptualne naprave z biosenzorjem je pod 50$, najpomembneje pa je, da ni za enkratno uporabo kot so trenutni senzorji [1], [3], [8], [9].

== Viri ==

[1] N. Joshi, X. Wang, L. Montgomery, A. Elfick, and C. E. French, “Novel approaches to biosensors for detection of arsenic in drinking water,” Desalination, vol. 248, no. 1–3, pp. 517–523, 2009.

[2] T. Gast, “Sensors with oscillating elements,” J. Phys. E., vol. 18, no. 9, pp. 783–789, 1985.

[3] A. Prindle, P. Samayoa, I. Razinkov, T. Danino, L. S. Tsimring, and J. Hasty, “A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels,’” Nature, vol. 481, no. 7379, pp. 39–44, 2012.

[4] and L.-H. Z. Yi-Hu Dong, Jin-Ling Xu, Xian-Zhen Li, “AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 97, no. 7, pp. 3526–3531, 2000.

[5] “Quorum sensing 101: https://sites.tufts.edu/quorumsensing/quorumsensing101/,” citirano dne 6.1.2019.

[6] T. Chu et al., “In vivo programmed gene expression based on artificial quorum networks,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 81, no. 15, pp. 4984–4992, 2015.

[7] M. Balamurugan et al., “Recent trends in electrochemical biosensors of superoxide dismutases,” Biosensors and Bioelectronics, vol. 116. pp. 89–99, 2018.

[8] “Low cost open source arsenic detector: https://www.kickstarter.com/projects/1499966707/low-cost-open-source-arsenic-detector-for-drinking?ref=category,” citirano dne 6.1.2019.

[9] J. Das, P. Sarkar, J. Panda, and P. Pal, “Low-cost field test kits for arsenic detection in water,” J. Environ. Sci. Heal. - Part A Toxic/Hazardous Subst. Environ. Eng., vol. 49, no. 1, pp. 108–115, 2014.

Zaznavalni niz genetskih biopikslov sklopljenih preko radikalov

2019-01-14T15:50:14Z

Miha Koprivnikar Krajnc:

Izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/nature10722 A. Prindle et.al. "A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’" ''Nature'', 2011]

----

== Ozadje ==

Namen raziskovalcev je bil ustvariti biosenzor za arzen, ki izkorišča bakterijski naravni odzivni sistem na prisotnost arzenita (As3+) in koncept genetskega vezja, ki ta sistem povezuje z reporterskim proteinom na do sedaj nov način; to je preko merjenja frekvence nihanja ekspresije GFP, in ne preko same intenzitete fluorescence, kot je bilo narejeno že pred leti [1].
Ideja je bila ustvariti oscilirajoči senzor. Prednost oscilirajočih senzorjev je preprostost kvantizacije signala, tj. frekvence. V primeru klasičnih, neoscilirajočih senzorjev, pri katerih namesto frekvence merimo intenziteto optičnega signala, moramo vrednosti vedno znova normalizirati in kalibrirati, saj imajo eksperimentalni faktorji, kot je intenziteta vzbujajočega žarka in čas izpostavitve večji vpliv, prav tako nihajni čas ni odvisen od amplitude. Oscilirajoči senzorji so torej boljši za ponovljivost in preprostost meritev, kar prinaša svoje prednosti pri razvoju točnega komercialnega senzorja [2].

== Fizična zasnova in gensko vezje ==

Fizično je biosenzor sestavljeni iz urejenega niza posameznih kolonij E.coli, ki so med seboj ločene s pregradami. Genetsko pa je zapis načrtovan, da je izražanje reporterja sfGFP:
1) pozitivno regulirano z arzenitom (posredno),
2) pospešeno s pomočjo pozitivnih povratnih zank v genskem vezju,
3) medcelično usklajeno na dveh nivojih.
Ta dva nivoja usklajevanja sta intrakolonijsko preko zaznavanja sklepčnosti (ang. »quorum sensing«) in interkolonijsko z reaktivnimi kisikovimi zvrstmi (ROS) in posledično plina H2O2, ki potuje med kolonijami in prodira v celice. Zaznavanje sklepčnosti je način regulacije ekspresije proteinov na podlagi gostote populacije celic, ker to pomeni boljši fenotip in izboljša preživetje – neke vrste bakterijski približek večceličnosti. Uporablja se za usklajevanje celic, a na dolge razdalje deluje precej počasi, zato so pri povečevanju obsega (ang. »scaling-up«) dodali usklajevanje preko hlapnega vodikovega peroksida. Oba nivoja sta nepogrešljiva za zagotovitev urejenih nihanj. [3].
Eden večjih izzivov sintezne biologije je izdelava genetskih vezij, ki se karseda približajo binarnosti klasičnih vezij. To ni enostavno, saj je v kompleksnem celične okolju ogromno 'ekspresijskega šuma' (naključni vrhovi transkripcije in translacije). Pogoj za premostitev tega izziva je poenotenje vseh celic, da so kolonije, tj. biopiksli, homogene in funkcionalne v vezju [3].
Namesto da so izdelali oscilirajoči senzor iz ene ogromne kolonije (ki se usklajuje počasi, samo preko zaznavanja sklepčnosti), so zvezali tisoče malih oscilirajočih kolonij – biopikslov – v mikrofluidni niz. Znotraj kolonije se oscilacije usklajujejo preko zaznavanja sklepčnosti, med kolonijami pa deluje druga, hitrejša raven signalizacije. Le-ta vključuje H2O2 in E.coli lastno »redoks mašinerijo«. Obe vrste signalizacije oz. usklajevanja oscilacij delujeta sinergistično, a zelo različno: sklepčnost je močna, a deluje na kratke razdalje (pod 1 mm), redoks pa je šibkejša, a zagotavlja daljši doseg. Avtorji so uporabili analogijo z letališči: prav tako pri celicah, tudi pri letališčih ni možno (niti koristno), da bi bila vsa letališča med seboj povezana z leti. Leti z manjših letališč so lokalno povezani preko večjih letališč, ki imajo globalne povezave, ta globalna povezava pa v tej analogiji predstavlja redoks signalizacijo.

== Konstrukcija genske platforme za ustvarjanje nihanj ==

Začeli so na intrakolonijskem nivoju, z uporabo t.i. avtoinduktorja (ang. »autoinducer«) Gram-negativnih bakterij AHL (N-acil homoserin lakton), ki difundira po mediju in deluje med celicami znotraj kolonije. AHL je bistven za zaznavanje sklepčnosti: produkt gena LuxI je AHL sintaza. Produkt gena AiiA (autoinducer inhibitor A) je posredni represor gena LuxI, saj deluje kot laktonaza in razgrajuje AHL [4]. AHL se poveže z LuxR in s tem ustavi utišanje genov LuxI, AiiA, sfGFP in Ndh, ki imajo lux promotorje. Povezava AHL z LuxR torej poveča ekspresijo sfGFP in pa samega LuxI – avtoinduktivna pozitivna povratna zanka omogoča pospešitev izražanja in sinhronost skupinskega vedenja. Na drugi strani pa prisotnost gena AiiA pod enakim promotorjem sistemu prinaša fino negativno regulacijo ter zaključitev nihajnega vrha in vrnitev v dno oscilacije. Gena LuxI in AiiA sta tako odgovorna za sinhronizirano nihanje AHL in s tem za oscilacije fluoresciranja biopiksla. Vpliv AHL med kolonijami ni možen, ker so le-te delno ločene, medij med njimi pa ima visok pretok [3], [5], [6].
Interkolonijska redoks signalizacija pa ne deluje s pomočjo molekul, ki difundirajo preko medija, kot je AHL, saj je edina povezava med posameznimi biopiksli preko zraka – uporabili so vodikov peroksid. To so dosegli, z vnosom kopije gena ndh (NADH dehidrogenaza II – NDH-2) pod kontrolo enakega lux promotorja, kot vsi ostali navedeni geni. Ndh je membranski encim in proizvaja H2O2 in superoksidni radikal O2-. Plinasti H2O2 potuje med kolonijami, prodira v celice in posredno aktivira lux promotorje; inaktivira ArcAB, ki je sicer del redoks kontrolnega sistema in se veže na lux promotorje ter jih utiša. Ob prisotnosti peroksida so torej lux geni aktivni. Tovrstna aktivacija omogoča dodatno pozitivno povratno zanko za sinhronizacijo populacije [3].
Ko je bil razvit ta sistem sinhronizacije nihanj v dveh nivojih, so ga poenostavili. Odstranili so gen ndh kot proizvajalec radikalov (ki nato tvorijo peroksid), to nalogo pa je prevzel sam GFP. Ob višku izražanja GFP-ja celice izpostavimo žarku fluorescentne svetlobe, kar povzroči nastanek radikalov in posledično peroksida; ob oscilatornem dnu pa GFP-ja praktično ni, kar pomeni da ob obsevanju ni tudi peroksida. GFP ima tako v poenostavljeni platformi dvojno vlogo: vlogo sklopitelja (generiranje radikalov za globalno sinhroniziranje) in vlogo reporterja [3].

== Vpliv sprememb radikalov na nihalno gensko platformo ==

Naslednji korak raziskovalcev je bil preučiti vpliv okoljskih dejavnikov, ki bi lahko motili količino radikalov, potrebnih za interkolonijsko signalizacijo. Najprej je bil preučen vpliv katalaze in vpliv superoksid dizmutaze (SOD) na nepoenostavljeno platformo – ta, ki generira radikale z ndh. Prisotnost katalaze povzroči izgubo medkolonijske sinhronizacije, ne vpliva pa na oscilacije posameznih kolonij. To pomeni, da odtegnitev peroksida prepreči drugo raven signalizacije in razklopi biopiksle. Na drugi strani pa SOD povzroči izrazit usklajen val fluorescence, kateremu sledi konstanten signal brez oscilacij. Razlog za to je dejstvo, da SOD poveča delež superoksidnega radikala, ki se pretvori v H2O2. Preveč peroksida posledično onemogoči nihanja – pride do konstantne fluorescence. Do zelo velike koncentracije H2O2 pride kljub temu, da je SOD znotrajcelični encim – razlog za to je visoka katalitična aktivnost dizmutaze [3], [7].
Vpliv katalaze in SOD na poenostavljeno platformo je bil identičen kot pri tisti z genom ndh. To potrjuje pomembnost ravno prave količine H2O2, potrebne za usklajevanje biopikslov ter zagotavlja, da sprememba vira radikalov (GFP namesto NDH-2) ne okrni kvalitete radikalne signalizacije med kolonijami. Pri tej platformi so preučili tudi vpliv tiosečnine in ampicilina; tiosečnina je dušilec radikalov in rezultati so pokazali, da kot tak onesposobi sinhronizacijo nihanj, brez da bi škodil viabilnosti. Ampicilin, ki pa proizvaja radikale, prav tako poruši usklajenost nihanj (podobno kot pri SOD), kar pomeni, da prevelika količina radikalov tudi onemogoči sinhronizacijo [3].

== Konstrukcije makroskopskega biosenzorja za arzenit ==

Naloge so se lotili na dva načina. Pri prvem se ob prisotnosti arzenita zgolj spremeni frekvenca nihanja fluorescence, pri drugem pa gre za »on-off« sistem, torej se ob prisotnosti pražne vrednosti arzenita šele vzpostavi sinhronizirano nihanje [3].
=== Modulacija frekvence ===
Osnovni platformi so dodali še eno kopijo gena LuxI (gen za AHL sintazo), le da je ta pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa (ArsRE). Ko arzenita ni v mediju, so prisotne bazalne oscilacije zaradi izražanja prvotne kopije LuxI kot posledica peroksida, saj je na arzenit-odzivni element vezan represor ArsR. Ko pa je arzenit prisoten, se poveže z represorjem ArsR, povzroči njegovo oddisociacijo z ArsRE in tako prepreči nadaljnjo represijo LuxI gena – torej zaradi arzenita se izraža dodaten LuxI, kar privede do povečane količine AHL in posledično do povečanega nihajnega časa in amplitude ter zmanjšane frekvence. Testiranje tega konstrukta pri različnih količinah arzenita je pokazalo, da se je nihajni čas sorazmerno povečeval s povečevanjem koncentracije arzenita. Izkazalo se je, da je tak senzor sposoben zaznati in tudi kvantificirati koncentracije arzenita že od 0,2 µM naprej, s tem da WHO direktiva določa zgornjo mejo sprejemljive koncentracije za države v razvoju pri 0,5 µM [3].
=== Vse ali nič ===
Nihanje se zgodi le ob doseganju pražne koncentracije (ang. »thresholding«). V DNA je bil vstavljen zapis za LuxR pod kontrolo arzenit-odzivnega elementa. Ta gen LuxR isto kot že pri osnovni platformi ni imel povezave s preostankom vezja, torej za razliko od ostalih genov platforme ni pod lux promotorjem; razlika je v tem, da se LuxR ne izraža več konstitutivno kot prej, ampak zgolj in samo inducibilno, in to s strani arzenita. To pomeni, da se v odsotnosti arzenita LuxR ne izraža, za aktivacijo gena LuxI pa je bistven kompleks LuxR-AHL – torej brez le-tega ni fluorescence in ni oscilacij. Ko pa arzenit je prisoten, se izrazi LuxR, zaradi njega in AHL pa tudi LuxI, kar obnovi funkcijo vezja in dobimo usklajeno nihanje. Ta sistem »vse ali nič« se vklopi pri 0,25 µM arzenitu, a to ni absolutna spodnja meja. Pražno koncentracijo se da še dodatno prilagoditi s spreminjanjem komponent genskega vezja (število kopij genov, Shine-Dalgarnovo zaporedje ipd.) [3].

== Zaključek ==

Oba načina signalizacije sta bila uporabljena za »scale-up« tega biosenzorja, a je vseeno potrebna mikroskopija za detekcijo, kar je nepraktično za komercialno uporabo. Ustvarjeni senzor z globalno sinhronizacijo je niz velikosti 24 mm x 12 mm in vsebuje 12 000 biopikslov oz. kolonij, skupno okoli 50 milijonov celic. Kljub že sicer povečanem signalu, ga je potrebno še dodatno ojačati, da bi lahko postal senzor uporaben v vsakdanjem življenju. To bi lahko dosegli s spremembami niza, kot je število biopikslov in njihova razporeditev, kar privede do različnih »output« oscilacij [3].
Za perspektivo je mogoče smiselno omeniti alternative v detekciji arzena, oz. načine, katerim je ta novi biosenzor alternativa. Prva naprava za detekcijo arzenita vodi doda Zn, ta pa katalizira nastanek plina arzina AsH3. Arzin reagira z detektorjem nad gladino, ki vsebuje HgBr (ali AgNO3), in pride do rumenega (ali sivega) obarvanja. Drug način uporablja zlate nanodelce – aptameri so v kompleksu s surfaktanti, ki sicer omogočijo agregacijo zlatih nanodelcev; ko pa pride arzenit, se tvorijo As(III)-aptamer kompleksi, prosti surfaktanti pa sprožijo obarjanje zlata, kar vodi v obarvanje. Tretji način pa je že biosenzor – kolonija E.coli, ki imajo LacZ gen pod ArsRE, zaznavamo pa padec pH, ki je posledica razgradnje laktoze [1], [3], [8], [9].
Vidne prednosti te alternative so nedvoumnost detekcije (ne kot pri redukciji azenita v arzen), manj proizvedenih odpadkov in strupenih snovi (enkratna uporaba ostalih detektorjev, arzin, Hg) in potencialna cenovna konkurenčnost. Predvidena cena konceptualne naprave z biosenzorjem je pod 50$, najpomembneje pa je, da ni za enkratno uporabo kot so trenutni senzorji [1], [3], [8], [9].

== Viri ==

[1] N. Joshi, X. Wang, L. Montgomery, A. Elfick, and C. E. French, “Novel approaches to biosensors for detection of arsenic in drinking water,” Desalination, vol. 248, no. 1–3, pp. 517–523, 2009.
[2] T. Gast, “Sensors with oscillating elements,” J. Phys. E., vol. 18, no. 9, pp. 783–789, 1985.
[3] A. Prindle, P. Samayoa, I. Razinkov, T. Danino, L. S. Tsimring, and J. Hasty, “A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels,’” Nature, vol. 481, no. 7379, pp. 39–44, 2012.
[4] and L.-H. Z. Yi-Hu Dong, Jin-Ling Xu, Xian-Zhen Li, “AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 97, no. 7, pp. 3526–3531, 2000.
[5] “Quorum sensing 101: https://sites.tufts.edu/quorumsensing/quorumsensing101/,” citirano dne 6.1.2019. .
[6] T. Chu et al., “In vivo programmed gene expression based on artificial quorum networks,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 81, no. 15, pp. 4984–4992, 2015.
[7] M. Balamurugan et al., “Recent trends in electrochemical biosensors of superoxide dismutases,” Biosensors and Bioelectronics, vol. 116. pp. 89–99, 2018.
[8] “Low cost open source arsenic detector: https://www.kickstarter.com/projects/1499966707/low-cost-open-source-arsenic-detector-for-drinking?ref=category,” citirano dne 6.1.2019.
[9] J. Das, P. Sarkar, J. Panda, and P. Pal, “Low-cost field test kits for arsenic detection in water,” J. Environ. Sci. Heal. - Part A Toxic/Hazardous Subst. Environ. Eng., vol. 49, no. 1, pp. 108–115, 2014.

Zaznavalni niz genetskih biopikslov sklopljenih preko radikalov

2019-01-14T15:43:08Z

Miha Koprivnikar Krajnc: New page: Izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/nature10722 A. Prindle et.al. "A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’" ''Nature'', 2011]

Izhodiščni članek: [https://www.nature.com/articles/nature10722 A. Prindle et.al. "A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’" ''Nature'', 2011]

Seminarji SB 2018/19

2019-01-14T15:38:44Z

Miha Koprivnikar Krajnc:

V študijskem letu 2018/19 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RNA-stikala_tipa_%C2%BBToehold%C2%AB:_de_novo_oblikovani_regulatorji_izra%C5%BEanja_genov RNA-stikala tipa Toehold: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov] (Špela Malenšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Raznoliko_in_modelno_zasnovana_priprava_sinteti%C4%8Dnih_genskih_vezij_s_predvidenimi_lastnostmi Raznoliko in modelno zasnovana priprava sintetičnih genskih vezij s predvidenimi lastnostmi] (Matej Kolarič)

[[Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage]] (Fran Krstanović)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nekaj_pogledov_na_sistemsko_biologijo_kvasovke Nekaj pogledov na sistemsko biologijo kvasovke] (Gašper Žun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organizacija_znotrajceli%C4%8Dnih_reakcij_z_razumsko_na%C4%8Drtovanimi_RNA_sestavi#Na.C4.8Drtovanje_in_sestavljanje_RNA_sestavov Organizacija znotrajceličnih reakcij z razumsko načrtovanimi RNA sestavi] (Urška Jelenovec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biolo%C5%A1ko_vezje_na_osnovi_RNA-interference_za_identifikacijo_specifi%C4%8Dnih_rakavih_celic Biološko vezje na osnovi RNA-interference za identifikacijo specifičnih rakavih celic] (Gašper Marinšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kontrola_hitrosti_translacije_preko_pomožnega_mesta_5’-UTR:_energijski_kompromis_med_dostopnostjo%2C_selektivnim_razvijanjem_RNA-struktur_in_drsenjem_30S_ribosomske_podenote_po_RNA-strukturah Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah] (Neža Koritnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_genskega_skupka_za_fiksacijo_dušika_bakterije_Klebsiella_oxytoca Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije ''Klebsiella oxytoca''] (Gašper Virant)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Negativna_samoregulacija_linearizira_odziv_na_odmerek_in_zavira_heterogenost_genskega_izražanja Negativna samoregulacija linearizira odziv na odmerek in zavira heterogenost genskega izražanja] (Primož Tič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Design_and_analysis_of_synthetic_carbon_fixation_pathways Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways] (Marija Atanasova)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pol-sinteti%C4%8Den_organizem_z_raz%C5%A1irjeno_gensko_abecedo Pol-sintetičen organizem z razširjeno gensko abecedo] (Peter Pečan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programirano_uti%C5%A1anje_in_aktivacija_izra%C5%BEanja_bakterijskega_gena_z_uporabo_konstruiranega_CRISPR-Cas_sistema Programirano utišanje in aktivacija izražanja bakterijskega gena z uporabo konstruiranega CRISPR-Cas sistema] (Tjaša Sorčan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_optogenetska_transkripcijska_naprava_za_izboljšanje_homeostaze_krvnega_sladkorja_pri_miših Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših] (Natalija Pucihar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_bakterij_Escherichia_coli_odzivnih_na_svetlobo Inženiring bakterij ''Escherichia coli'' odzivnih na svetlobo] (Karmen Žbogar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_in%C5%BEeniring_intergenskih_regij_v_operonih_uravnava_izra%C5%BEanje_ve%C4%8D_genov Kombinatorični inženiring intergenskih regij v operonih uravnava izražanje več genov] (Urška Kašnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Stohasti%C4%8Dna_oja%C4%8Ditev_in_signalizacija_v_substratnih_ciklih_s_%C5%A1umom_induciranih_bistabilnosti_z_oscilacijami Stohastična ojačitev in signalizacija v substratnih ciklih s šumom induciranih bistabilnosti z oscilacijami] (Uroš Zavrtanik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zaznavalni_niz_genetskih_biopikslov_sklopljenih_preko_radikalov Zaznavalni niz genetskih "biopikslov" sklopljenih preko radikalov] (Miha Koprivnikar Krajnc)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Canditect:_hitra_detekcija_vaginalne_infekcije_s_Candido_albicans_z_uporabo_sistema_CRISPR/dCas9 Canditect – hitra detekcija vaginalne infekcije s Candido albicans z uporabo sistema CRISPR/dCas9] (Jerneja Ovčar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAPOEIRA_-_razvoj_personaliziranega_cepiva_proti_raku_in_sistema_za_spremljanje_odziva_na_zdravljenje CAPOEIRA – razvoj personaliziranega cepiva proti raku in sistema za spremljanje odziva na zdravljenje] (Anamarija Habič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biotic_Blue_-_encimska_razgradnja_zdravilnih_u%C4%8Dinkovin_v_odpadnih_vodah#BIOTIC_BLUE BIOTIC BLUE - encimska razgradnja zdravilnih učinkovin v odpadnih vodah] (Tina Požun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Of_CO2urse_-_sistem_za_zmanj%C5%A1evanje_izpustov_ogljikovega_dioksida_v_industriji Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji] (Kity Požek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cockroach_terminator Cockroach terminator]] (Roberta Mulac)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MiBiome_-_probioti%C4%8Dna_bakterija_za_zdravljenje_kroni%C4%8Dne_vnetne_%C4%8Drevesne_bolezni MiBiome - probiotična bakterija za zdravljenje kronične vnetne črevesne bolezni] (Ernest Šprager)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BioWatcher_pametna_ura_za_sledenje_ravni_biomarkerjev_za_bolezni BioWatcher: Pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni] (Nina Mavec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAT-Seq:_Visokoprepustna_metoda_za_analizo_katalitske_aktivnosti_biomolekul CAT-Seq: Visokoprepustna metoda za analizo katalitske aktivnosti biomolekul] (Bine Tršavec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/VIBRIGENS:_pospe%C5%A1evanje_procesov_sintezne_biologije_z_Vibrio_natriegens VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z ''Vibrio natriegens''] (Tadej Satler)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

22.11. 
1 
2 Valentina Levak 

27.11. 
1 
2 
3 
4 

29.11. 
1 Matej Kolarič 
2 Špela Malenšek 
3 
4 

4.12. 
1 Gašper Žun 
2 Fran Krstanovic 
3 
4 

6.12. 
1 Urška Jelenovec 
2 Rok Miklavčič 
3 
4 

11.12. 
1 Jerneja Ovčar 
2 Neža Koritnik 
3 Gašper Virant 
4 Gašper Marinšek 

18.12. 
1 Tina Požun 
2 Anamarija Habič 
3 Roberta Mulac 
4 Kity Požek 

3.1. 
1 Nina Mavec 
2 Primož Tič 
3 Ernest Šprager 
4 

8.1. 
1 Marija Atanasova 
2 Bine Tršavec 
3 Peter Pečan 
4 Tjaša Sorčan 

10.1. 
1 Urška Kašnik 
2 Natalija Pucihar 
3 Karmen Žbogar 
4 Uroš Zavrtanik 

15.1. 
1 Jerneja Kocutar 
2 Špela Koren 
3 Tadej Satler 
4 Miha Koprivnikar Krajnc 

17.1. 
1 Milena Stojkovska 
2 Blaž Lebar

Popravljanje mutacij in rekombinacijski procesi

2016-05-31T17:19:50Z

Miha Koprivnikar Krajnc:

V študijskem letu 2015/16 bodo seminarji obsegali dve med seboj povezani temi: Popravljanje okvar in mutacij ter mehanizme rekombinacije genetskega materiala. Tema je razdeljena na 18 poglavij, pri čemer zadnja poglavja zajemajo posebne primere in mehanizme popravljanja, ki niso vezani na DNA, pač pa na proces translacije pri poškodovani RNA, zadnji dve temi pa sta dodani kasneje in bosta predstavljeni v angleščini kot individualna seminarja. Kot izhodišče za pripravo si najprej preberite ustrezna poglavja v učbeniku, kjer so ta navedena na spodnjem seznamu. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se odmakniti od osnovne teme seminarja.

Vsako temo obdelajo praviloma dva ali trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ne več kot 1500 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min. Razširjenega seminarja ni treba pripraviti v pisni obliki; napišete samo povzetek na wikiju in predstavite seminar v predavalnici.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje en dan pred predstavitvijo (do polnoči), torej najkasneje v nedeljo ali v torek za ponedeljkove oziroma sredine seminarje. Predstavitve seminarjev 1-4 bodo 23. maja, 5-8 25. maja, 9-12 30. maja, 13-16 1. junija 2016, 17-18 pa sta kratka seminarja in bosta na vrsti 6. junija. Za vsak seminar imate na voljo 14-18 minut časa, da ga predstavite, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki strani uporabite zavihek 'discussion').

Vsebina seminarjev je izpitna snov, razen seminarjev št. 4 ter 13-18.

Poglavja za seminarje so:

# Direktno popravljanje mutacij (Principles of Molecular Biology: 9.7)
# Popravljanje z izcepom baze (9.8)
# Popravljanje z izcepom nukleotida (9.9)
# Xeroderma pigmentosum
# Popravljanje neujemanja (9.10)
# SOS-popravljanje (9.11)
# Popravljanje kolapsa replikacijskih vilic (10.1)
# Mitozna rekombinacija (10.2)
# Nehomologno povezovanje koncev (10.4)
# Mejozna rekombinacija (10.5)
# Razreševanje Hollidayevega križišča (Lewin's Essential Genes: 15.6)
# Popravljanje DNA v kontekstu kromatina (Lewin's Essential Genes: 16.9)
# Menjava spola pri kvasovki (Lewin's Essential Genes: 15.9)
# Vloga p53 pri ohranjanju genoma (Lewin's Essential Genes: str. 400)
# Trans-translacija (translacija pri poškodovani mRNA)
# Od RNA neodvisna elongacija (Science 347, 75 (2015))
# Mehanizmi izjemne odpornosti proti radioaktivnemu sevanju pri prokariontih
# Kompleksne preureditve kromosomov

----

Vpišite se v oklepaj za naslovom seminarja:

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Neposredno_popravljanje_mutacij Direktno popravljanje mutacij] (Matej Hvalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/POPRAVLJANJE_Z_IZCEPOM_BAZE_%28BER%29 Popravljanje z izcepom baze (BER)] (Urša Čerček, Urša Kopač, Ema Gašperšič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Popravljanje_z_izcepom_nukleotida#Sklopitev_GG-NER_in_TC-NER Popravljanje z izcepom nukleotida] (Petra Hruševar, Gašper Žun, Uroš Zavrtanik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Xeroderma_pigmentosum Xeroderma pigmentosum] (Maja Zupanc, Elvira Boršič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Popravljanje_neujemanja Popravljanje neujemanja] Popravljanje neujemanja (Kristjan Stibilj, Rok Miklavčič, Sara Tekavec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SOS-popravljanje SOS-popravljanje] (Tadej Satler, Gašper Virant)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Popravljanje_kolapsa_replikacijskih_vilic Popravljanje kolapsa replikacijskih vilic] (Klara Lenart, Tilen Tršelič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mitozna_rekombinacija Mitozna rekombinacija] (Peter Pečan, Valentina Levak, Janja Krapež)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nehomologno_povezovanje_koncev Nehomologno povezovanje koncev] (Klara Kuret, Blaž Lebar, Neža Koritnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mejozna_rekombinacija Mejozna rekombinacija] (Eva Rajh, Katja Čop)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razreševanje_Hollidayevega_križišča#Viri Razreševanje Hollidayevega križišča] (Nejc Kejžar, Lovro Kotnik)
# [[Popravljanje DNA v kontekstu kromatina|Popravljanje DNA v kontekstu kromatina]] (Špela Malenšek, Tjaša Lukšič)
# Menjava spola pri kvasovki
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vloga_p53_pri_ohranjanju_genoma Vloga p53 pri ohranjanju genoma] (Miha Koprivnikar Krajnc, Katja Brezovar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Trans-translacija ''Trans''-translacija] (Lara Jerman, Aleksandra Uzar, Simon Aleksič)
# Od RNA neodvisna elongacija
# "Unraveling the mechanisms of extreme radioresistance in prokaryotes: Lessons from nature"(Fran Krstanović)
# "Mechanisms of origin, phenotypic effects and diagnostic implications of complex chromosome rearrangements" (Javier Fraguas)

Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki:
<nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki>

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Reprogramiranje celic]].

Popravljanje mutacij in rekombinacijski procesi

2016-05-31T17:18:39Z

Miha Koprivnikar Krajnc:

V študijskem letu 2015/16 bodo seminarji obsegali dve med seboj povezani temi: Popravljanje okvar in mutacij ter mehanizme rekombinacije genetskega materiala. Tema je razdeljena na 18 poglavij, pri čemer zadnja poglavja zajemajo posebne primere in mehanizme popravljanja, ki niso vezani na DNA, pač pa na proces translacije pri poškodovani RNA, zadnji dve temi pa sta dodani kasneje in bosta predstavljeni v angleščini kot individualna seminarja. Kot izhodišče za pripravo si najprej preberite ustrezna poglavja v učbeniku, kjer so ta navedena na spodnjem seznamu. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se odmakniti od osnovne teme seminarja.

Vsako temo obdelajo praviloma dva ali trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ne več kot 1500 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min. Razširjenega seminarja ni treba pripraviti v pisni obliki; napišete samo povzetek na wikiju in predstavite seminar v predavalnici.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje en dan pred predstavitvijo (do polnoči), torej najkasneje v nedeljo ali v torek za ponedeljkove oziroma sredine seminarje. Predstavitve seminarjev 1-4 bodo 23. maja, 5-8 25. maja, 9-12 30. maja, 13-16 1. junija 2016, 17-18 pa sta kratka seminarja in bosta na vrsti 6. junija. Za vsak seminar imate na voljo 14-18 minut časa, da ga predstavite, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki strani uporabite zavihek 'discussion').

Vsebina seminarjev je izpitna snov, razen seminarjev št. 4 ter 13-18.

Poglavja za seminarje so:

# Direktno popravljanje mutacij (Principles of Molecular Biology: 9.7)
# Popravljanje z izcepom baze (9.8)
# Popravljanje z izcepom nukleotida (9.9)
# Xeroderma pigmentosum
# Popravljanje neujemanja (9.10)
# SOS-popravljanje (9.11)
# Popravljanje kolapsa replikacijskih vilic (10.1)
# Mitozna rekombinacija (10.2)
# Nehomologno povezovanje koncev (10.4)
# Mejozna rekombinacija (10.5)
# Razreševanje Hollidayevega križišča (Lewin's Essential Genes: 15.6)
# Popravljanje DNA v kontekstu kromatina (Lewin's Essential Genes: 16.9)
# Menjava spola pri kvasovki (Lewin's Essential Genes: 15.9)
# Vloga p53 pri ohranjanju genoma (Lewin's Essential Genes: str. 400)
# Trans-translacija (translacija pri poškodovani mRNA)
# Od RNA neodvisna elongacija (Science 347, 75 (2015))
# Mehanizmi izjemne odpornosti proti radioaktivnemu sevanju pri prokariontih
# Kompleksne preureditve kromosomov

----

Vpišite se v oklepaj za naslovom seminarja:

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Neposredno_popravljanje_mutacij Direktno popravljanje mutacij] (Matej Hvalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/POPRAVLJANJE_Z_IZCEPOM_BAZE_%28BER%29 Popravljanje z izcepom baze (BER)] (Urša Čerček, Urša Kopač, Ema Gašperšič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Popravljanje_z_izcepom_nukleotida#Sklopitev_GG-NER_in_TC-NER Popravljanje z izcepom nukleotida] (Petra Hruševar, Gašper Žun, Uroš Zavrtanik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Xeroderma_pigmentosum Xeroderma pigmentosum] (Maja Zupanc, Elvira Boršič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Popravljanje_neujemanja Popravljanje neujemanja] Popravljanje neujemanja (Kristjan Stibilj, Rok Miklavčič, Sara Tekavec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SOS-popravljanje SOS-popravljanje] (Tadej Satler, Gašper Virant)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Popravljanje_kolapsa_replikacijskih_vilic Popravljanje kolapsa replikacijskih vilic] (Klara Lenart, Tilen Tršelič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mitozna_rekombinacija Mitozna rekombinacija] (Peter Pečan, Valentina Levak, Janja Krapež)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nehomologno_povezovanje_koncev Nehomologno povezovanje koncev] (Klara Kuret, Blaž Lebar, Neža Koritnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mejozna_rekombinacija Mejozna rekombinacija] (Eva Rajh, Katja Čop)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razreševanje_Hollidayevega_križišča#Viri Razreševanje Hollidayevega križišča] (Nejc Kejžar, Lovro Kotnik)
# [[Popravljanje DNA v kontekstu kromatina|Popravljanje DNA v kontekstu kromatina]] (Špela Malenšek, Tjaša Lukšič)
# Menjava spola pri kvasovki
# Vloga p53 pri ohranjanju genoma [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vloga_p53_pri_ohranjanju_genoma] (Miha Koprivnikar Krajnc, Katja Brezovar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Trans-translacija ''Trans''-translacija] (Lara Jerman, Aleksandra Uzar, Simon Aleksič)
# Od RNA neodvisna elongacija
# "Unraveling the mechanisms of extreme radioresistance in prokaryotes: Lessons from nature"(Fran Krstanović)
# "Mechanisms of origin, phenotypic effects and diagnostic implications of complex chromosome rearrangements" (Javier Fraguas)

Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki:
<nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki>

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Reprogramiranje celic]].

Popravljanje mutacij in rekombinacijski procesi

2016-05-31T17:16:01Z

Miha Koprivnikar Krajnc:

V študijskem letu 2015/16 bodo seminarji obsegali dve med seboj povezani temi: Popravljanje okvar in mutacij ter mehanizme rekombinacije genetskega materiala. Tema je razdeljena na 18 poglavij, pri čemer zadnja poglavja zajemajo posebne primere in mehanizme popravljanja, ki niso vezani na DNA, pač pa na proces translacije pri poškodovani RNA, zadnji dve temi pa sta dodani kasneje in bosta predstavljeni v angleščini kot individualna seminarja. Kot izhodišče za pripravo si najprej preberite ustrezna poglavja v učbeniku, kjer so ta navedena na spodnjem seznamu. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se odmakniti od osnovne teme seminarja.

Vsako temo obdelajo praviloma dva ali trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ne več kot 1500 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min. Razširjenega seminarja ni treba pripraviti v pisni obliki; napišete samo povzetek na wikiju in predstavite seminar v predavalnici.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje en dan pred predstavitvijo (do polnoči), torej najkasneje v nedeljo ali v torek za ponedeljkove oziroma sredine seminarje. Predstavitve seminarjev 1-4 bodo 23. maja, 5-8 25. maja, 9-12 30. maja, 13-16 1. junija 2016, 17-18 pa sta kratka seminarja in bosta na vrsti 6. junija. Za vsak seminar imate na voljo 14-18 minut časa, da ga predstavite, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki strani uporabite zavihek 'discussion').

Vsebina seminarjev je izpitna snov, razen seminarjev št. 4 ter 13-18.

Poglavja za seminarje so:

# Direktno popravljanje mutacij (Principles of Molecular Biology: 9.7)
# Popravljanje z izcepom baze (9.8)
# Popravljanje z izcepom nukleotida (9.9)
# Xeroderma pigmentosum
# Popravljanje neujemanja (9.10)
# SOS-popravljanje (9.11)
# Popravljanje kolapsa replikacijskih vilic (10.1)
# Mitozna rekombinacija (10.2)
# Nehomologno povezovanje koncev (10.4)
# Mejozna rekombinacija (10.5)
# Razreševanje Hollidayevega križišča (Lewin's Essential Genes: 15.6)
# Popravljanje DNA v kontekstu kromatina (Lewin's Essential Genes: 16.9)
# Menjava spola pri kvasovki (Lewin's Essential Genes: 15.9)
# Vloga p53 pri ohranjanju genoma (Lewin's Essential Genes: str. 400)
# Trans-translacija (translacija pri poškodovani mRNA)
# Od RNA neodvisna elongacija (Science 347, 75 (2015))
# Mehanizmi izjemne odpornosti proti radioaktivnemu sevanju pri prokariontih
# Kompleksne preureditve kromosomov

----

Vpišite se v oklepaj za naslovom seminarja:

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Neposredno_popravljanje_mutacij Direktno popravljanje mutacij] (Matej Hvalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/POPRAVLJANJE_Z_IZCEPOM_BAZE_%28BER%29 Popravljanje z izcepom baze (BER)] (Urša Čerček, Urša Kopač, Ema Gašperšič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Popravljanje_z_izcepom_nukleotida#Sklopitev_GG-NER_in_TC-NER Popravljanje z izcepom nukleotida] (Petra Hruševar, Gašper Žun, Uroš Zavrtanik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Xeroderma_pigmentosum Xeroderma pigmentosum] (Maja Zupanc, Elvira Boršič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Popravljanje_neujemanja Popravljanje neujemanja] Popravljanje neujemanja (Kristjan Stibilj, Rok Miklavčič, Sara Tekavec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SOS-popravljanje SOS-popravljanje] (Tadej Satler, Gašper Virant)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Popravljanje_kolapsa_replikacijskih_vilic Popravljanje kolapsa replikacijskih vilic] (Klara Lenart, Tilen Tršelič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mitozna_rekombinacija Mitozna rekombinacija] (Peter Pečan, Valentina Levak, Janja Krapež)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nehomologno_povezovanje_koncev Nehomologno povezovanje koncev] (Klara Kuret, Blaž Lebar, Neža Koritnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mejozna_rekombinacija Mejozna rekombinacija] (Eva Rajh, Katja Čop)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razreševanje_Hollidayevega_križišča#Viri Razreševanje Hollidayevega križišča] (Nejc Kejžar, Lovro Kotnik)
# [[Popravljanje DNA v kontekstu kromatina|Popravljanje DNA v kontekstu kromatina]] (Špela Malenšek, Tjaša Lukšič)
# Menjava spola pri kvasovki
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vloga_p53_pri_ohranjanju_genoma] (Miha Koprivnikar Krajnc, Katja Brezovar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Trans-translacija ''Trans''-translacija] (Lara Jerman, Aleksandra Uzar, Simon Aleksič)
# Od RNA neodvisna elongacija
# "Unraveling the mechanisms of extreme radioresistance in prokaryotes: Lessons from nature"(Fran Krstanović)
# "Mechanisms of origin, phenotypic effects and diagnostic implications of complex chromosome rearrangements" (Javier Fraguas)

Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki:
<nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki>

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Reprogramiranje celic]].

Vloga p53 pri ohranjanju genoma

2016-05-31T17:14:21Z

Miha Koprivnikar Krajnc: New page: p53 je tumor supresor, ki pogosto dobiva naziv varuha genoma, saj ima pomembno vlogo pri vzdrževanju integritete celičnega genoma. == STRUKTURA p53 == Je molekula, sestavljena iz 4 i...

p53 je tumor supresor, ki pogosto dobiva naziv varuha genoma, saj ima pomembno vlogo pri vzdrževanju integritete celičnega genoma.

== STRUKTURA p53 ==

Je molekula, sestavljena iz 4 identičnih proteinskih verig. V osrednjem delu p53 je tetramerizacijska domena, ki povezuje vse štiri verige. Sledi ji dalja fleksibilna regija, ki se nato poveže z naslednjo stabilno domeno, t.j. DNA vezavna domena. Tretja stabilna domena verige je transaktivacijska, ki je pozicionirana na koncu vsake roke. P53 se na DNA veže s pomočjo vseh štirih rok, na vezavno domeno, ki je običajno zgrajena iz naslednjih komponent:
1.) Specifično vezavno mesto za dve od štirih domen p53, ki vežejo DNA
2.) Variabilen del dolg 0 do 13 baznih parov
3.) Drugo specifično vezavno mesto za drugi dve od štirih domen p53, ki vežejo DNA

== POŠKODBA DNA ==

Ob poškodbi DNA, ki je lahko posledica raznovrstnega stresa (sevanje, hipoksija, pomanjkanje ribonukleozid trifosfatov), kateremu je celica izpostavljena, začnejo delovati proteini, ki aktivirajo p53 bodisi preko fosforilacije ali z inhibicijo ubikvitinacija ki jo povzroča Mdm2. Tako fosforilacija kot preprečitev ubikvitinacija pomenita povišano raven p53, zaradi samega podaljšanja razpolovne dobe proteina. Kaskada dogodkov se nadaljuje z različnimi modifikacijami s strani acetiltransferaz in metiltransferaz, ki nadaljno zagotovijo stabilizacijo p53 in povečajo specifičnost vezave p53 na DNA. Temu sledijo številni koraki, ki lahko inhibirajo delovanje p53 ali pa pride do mobilizacije kofaktorjev in nadaljne transaktivacije tarčnih genov proteina p53.
Vsi dogodki vodijo, k cilju, ki je popravljanje DNA, zaustavitev celičnega cikla, senescenca ali pa apoptoza.

== ZAUSTAVITEV CELIČNEGA CIKLA ==

Ena izmed pomembnih vlog p53 je njegova regulacija celičnega cikla. Ob poškodbi DNA pride do fosforilacije p53 s strani različnih možnih protein kinaz, ki modificirajo N-končno domeno, kar p53 omogoči, da aktivira transkripcijo specifičnih genov. Posledica tega lahko pomeni ustavitev celičnega cikla preden sploh pride do replikacije DNA v fazi G1, ali pa zaustavitev pred mitozo v fazi G2. Gre torej za inhibicijo nadaljevanja celičnega cikla v različnih kontrolnih točkah. Kot primer lahko vzamemo zaustavitev v kontrolni točki G1, ki je posledica transaktivacije waf1 gena, ki kodira kinazni inhibitor p21. Ta prepreči, da bi cikel šel v S fazo, tako, da blokira aktivnost od ciklina odvisne kinaze ali Cdk (“Cyclin-dependant kinase”). To so evolucijsko zelo dobro ohranjena družina protein kinaz, ki vežejo molekule imenovane ciklini in s tem aktivirajo lastno kinazno aktivnost. Cdk-ciklin kompleksi omogočajo napredovanje preko kontrolnih točk v celičnem ciklu.

V G1 fazi pride do akumulacije visokih ravni Cdk2-ciklin E kompleksov, ki se inaktivirajo, ko z njimi interagira p21, ki je, kot omenjeno, prisoten, ko pride do poškodbe DNA. P21 pa inhibira tudi kompleks Cdk4/6-ciklin D. Ko ta kompleks ni fosforiliran, ima kinazno aktivnost in fosforili pRb, ki je tako neaktiven. Neaktiven kompleks Cdk2,4/ciklin D pomeni, da je retinoblastoma protein (pRb) aktiven in opravlja funkcijo inhibicije E2F. E2F je namreč transkripcijski faktor in zagotavlja sintezo produktov, potrebnih za nadaljevanje celičnega cikla (na primer ciklin E, ciklin A in tudi transkripcijo samega sebe). Ob prisotnosti p21 celica torej ne more napredovati v fazo S.

== POPRAVLJANJE DNA ==

p53 pa ne sodeluje le pri zaustavitvi celičnega cikla, temveč tudi pri samem popravljanju DNA. Ta sposobnost izhaja iz lastnosti osrednje domene p53.
p53 ima sposobnost interakcije z DNA na mnoge različne načine: vezava na tako dvoverižno kot enoverižo DNA, na Hollidayjeve stike in na izbokline DNA, ki nastanejo zaradi napačno podvojenega dela DNA. Napačno zaporedje je lahko posledica mutacije enega nukleotida, bodisi zaradi zamenjave, delecije ali insercije. Druga pomembna in znana biokemijska aktivnost p53 je njegova intrinzična 3'->5' eksonukleazna aktivnost. Eksonukleaze so pomembne pri podvajanju in popravljanju DNA ter pri rekombinaciji. p53 lahko prepozna napako in zamenja napačen nukleotid, ali pa popravi prelom dvoverižne DNA. Zaradi takega kontrolnega branja je pri osebkih z motnjami na p53 večja verjetnost, da pride do mutacije, prav tako pa je zaradi nezmožnosti zaustavitve cikla večja verjetnost, da bo neka mutacija razvila raka.
Vemo, da p53 deluje tudi kot transkripcijski faktor in omogoči izražanje drugih popravljalnih proteinov. Pomemben primer takega popravljalnega proteina je ribonukleotid reduktaza p53R2, ki se nahaja v jedru. Funkcija tega proteina je redukcija ribonukleotidov (NTP) v deoksiribonukleotide (2'-dNTP). Ta reakcija je pomembna za omogočanje zadostne količine nukleotidov tako pri replikaciji kot pri popravljanju DNA. dNTP so potrebni za vgradnjo v dvojno vijačnico na mesto napačno sparjenih baz. V primeru motnje p53, ko je aktivacija p53R2 neuspešna, se poveča frekvenca napačno sparjenih nukleotidov in genomska nestabilnost. To so potrdila dognanja, da je pri celicah s slabo ribonukleotid-redukcijo večji deleže celic, ki podležejo intrinzično sproženi apoptozi.
Ko govorimo o vlogi p53 pri popravljanju DNA, pa moramo upoštevati tudi njegovo delovanje v neinduciranem stanju. Aktivno sodelovanje p53 pri popravljanju DNA ni omejeno le na dogodke, kjer pride do napak zaradi zunanjega stresa. Omenili smo gen waf1, kot enega izmed glavnih tarčnih genov p53 in njuno sodelovanje pri zaustavitvi celičnega cikla. Čeprav je dejstvo, da waf1 igra pomembno vlogo pri zaustavitvi celičnega cikla v točki G1 ob poškodbi DNA, se je vseeno izkazalo, da pri miših, ki so jim ta gen izbili, ne pride do povečane frekvence mutacij. p53, ki ni aktiviran kot posledica poškodbe DNA, ne mora zagotoviti transaktivacije specifičnih genov, saj je to posledica posttranslacijskih modifikacij, do katerih pride zaradi poškodbe. Vseeno pa lahko sklepamo, da ima p53 nekakšno funcionalnost, ki prepreči akumulacijo mutacij. To naj bi p53 dosegal s svojo 3'-5' eksonukleazno aktivnostjo oz. kontrolnim branjem, ki skrbi za preprečitev napak pri DNA replikaciji, ne le, ko pride do poškodb.

== SPROŽITEV APOPTOZE ==

Kot odgovor na poškodbo pa p53 lahko sproži tudi apoptozo. Sprožitev intrinzične poti apoptoze je proces, na potek katerega prav tako vpliva p53 in je reverzibilna. Točka brez povratka je za celico aktivacija efektorske kaspaze 3, saj takrat pride do razgradnje celičnih proteinov. Mehanizem sprožitve je tudi tu transkripcijska aktivacija genov, in sicer za Bax in Apaf1 (apoptotsko proteazo aktivirajoč faktor 1), s strani p53. Bax je protein iz družine apoptotskih faktorjev Bcl-2 in povzroči premik citokroma c z membrane mitohondrija v citosol, kjer se poveže z Apaf1 in prokaspazo 9. Slednja se ob povezavi teh treh v tako imenovani apoptosom aktivira in lahko aktivira kaspazo 3, ki pa je glavni efektorski encim apoptoze. Lahko bi rekli, da je sprožitev apopoze dobro regulirana, saj se zaradi p53 poveča izražanje obeh faktorjev posredno potrebnih za sprožitev apoptoze, ne pa izražanje prokaspaze same. Kot omenjeno, sprožitev procesa apoptoze ni dokončna in je odvisna od uspešnosti poprave DNA; če je le-ta uspela, se p53 deaktivira, kar povzroči, da ostanejo efektorske kaspaze (kaspaze 3, 6 in 7) neaktivne

== REGULACIJA p53 ==

Regulacija p53 je bistvena, saj pretirano izražanje pomeni prekomerno apoptozo, na drugi strani pa zmanjšana aktivnost lahko pomeni razvoj raka. Že na začetku smo omenili Mdm2, ki je glavni antagonist in regulator aktivnosti p53. Gre za ubikvitin ligazo, specifično za p53, ki veže in onesposobi p53 v jedru in ga prenese v citosol, kjer gre v razgradnjo v proteasom, saj ima določene lizine označene z poliubikvitinskimi verigami. Njegovo izražanje regulira p53 sam, torej gre za negativno povratno zvezo, kar je smotrno, glede na to, da celica želi koncentracijo p53 v nestresnih obdobjih vzdrževati na minimumu. Nizke koncentracije so zagotavljene tudi preko njegove nizke razpolovne dobe, ki traja le nekaj minut.
Stabilizacija tega proteina ob pojavu potencialne onkogene grožnje je fosforilacija N-končne domene p53, ki onemogoči interakcijo z Mdm2, hkrati pa to predstavlja aktivacijo proteina kot transkripcijskega faktorja. Fosforilacija p53 pomeni odpornosti na Mdm2, kar pomeni da koncentracija p53 naraste, zaradi regulacije transkripcije pa posledično naraste tudi koncentracija Mdm2, a ta na fosforiliran p53 nima učinka. Čim pride do poprave mutacije na DNA, se protein kinaze inaktivirajo, p53 je v manjši meri fosforiliran in zato ga akumulirani Mdm2 v hipu pošlje v razgradnjo. Kot odziv na stres, ki povzroča motnje v dednem zapisu, se torej poveča razpolovni čas p53 in dvigne njegova koncentracija, prav tako pa se aktivira in stabilizira s fosforilacijo in lahko tudi z drugimi modifikacijami

p53 torej preprečuje širjenje poškodovanega dednega materiala, ki nosi potencialno onkogene mutacije. Njegove tri funkcije pri vzdrževanju integritete genoma so preprečitev celične delitve, sprožitev poprave DNA in sprožitev apoptoze, hkrati pa kaže aktivnost tudi v neinduciranem stanju. Motnje tega proteina lahko pomenijo pojav pretirane proliferacije celic oziroma nastanek raka.

== VIRI ==

- https://en.wikipedia.org/wiki/P53
- http://www.bioinformatics.org/p53/introduction.html
- Moll, U. and Petrenko, O. (2003). The MDM2-p53 Interaction. Molecular Cancer Research, [online] 1(14), pp.1001-1008.
- T. Mummenbrauer, F. Janus, B. Müller et al. (1996). p53 Protein Exhibits 3′-to-5′ Exonuclease Activity. Cell, Volume 85, Issue 7, p1089-1099
- Geske, F., Nelson, A., Lieberman, R., Strange, R., Sun, T. and Gerschenson, L. (2000). DNA repair is activated in early stages of p53-induced apoptosis. Cell Death Differ, 7(4), pp.393-401.
- Yamaguchi, T., Matsuda, K., Sagiya, Y., Iwadate, M., Fujino, M., Nakamura, Y. and Arakawa, H. (2001). p53R2-dependent Pathway for DNA Synthesis in a p53-regulated Cell Cycle Checkpoint. Cancer Research, [online] 61(22), pp.8256-8262.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Popravljanje mutacij in rekombinacijski procesi

2016-04-04T09:23:26Z

Miha Koprivnikar Krajnc:

BIO2 Seminar 2015

2015-11-23T17:19:41Z

Miha Koprivnikar Krajnc: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Kristjan Stibilj||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Kristjan_Stibilj:_Inhibicija PI3k/AKT/mTOR signalne poti kot orožje proti raku||Lovro Kotnik||Blaž Lebar]||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Tjaša Lukšič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tjasa_Luksic: Alternativno izrezovanje GPCR-jev s poudarkom na sekretinski družini]||Karmen Žbogar||Aleksandra Uzar||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Klara Kuret||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Klara_Kuret: Vpliv bakterijskih efektorjev na celični ubikvitinacijski sistem in rastlinski imunski odziv]||Klara Lenart||Petra Hruševar||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Rok Miklavčič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Rok_Miklavčič: Preusmeritve signalnih poti preko TNFR1 v boju s patogeni]||Katja Čop||Lovro Kotnik||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Ema Gašperšič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Ema_Gaspersic: PKC in njihov vpliv na raka ter Alzheimerjevo bolezen]||Nejc Kejžar||Karmen Žbogar||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Tadej Satler||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tadej_Satler: PD-1 limfocitov in melanomskih celic]||Neža Brezovar||Klara Lenart||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Tina Šimunović||14-15||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tina_Simunovic: Pentoza-fosfatna pot, njena regulacija in povezava z rakom]||Kristjan Stibilj||Katja Čop||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Maja Zupanc||14-15||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Maja_Zupanc: Kako dolge nekodirajoče RNA vplivajo na metabolizem]||Tjaša Lukšič||Nejc Kejžar||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Tilen Tršelič||14-15||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tilen_Trselic: PKM2 in njegova vloga pri razvoju rakavih celic]||Klara Kuret||Dorotea Borković||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Lara Jerman||16||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Lara_Jerman: Warburgov učinek: od raka do avtoimunosti]||Rok Miklavčič||Neža Brezovar||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Eva Rajh||16||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Eva_Rajh: Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na modifikacije DNK in histonov ter vpliv na staranje]||Ema Gašperšič||Kristjan Stibilj||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Sara Tekavec||16||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Sara_Tekavec: Mutacije encimov Krebsovega cikla in vpliv na razvoj ter rast tumorjev]||Tadej Satler||Tjaša Lukšič||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Fran Krstanović||17||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Fran_Krstanovic: L-Carnitine enhances exercise endurance capacity]||Tina Šimunović||Klara Kuret||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Elvira Boršić||17||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Elvira_Boršić: Posledice spremenjenega metabolizma maščobnih kislin v kardiomiocitih]||Maja Zupanc||Rok Miklavčič||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Janja Krapež||17||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Janja_Krapež: Vpliv metabolizma maščobnih kisln na povišan krvni tlak v pljučnih arterijah]||Tilen Tršelič||Ema Gašperšič||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Janez Javornik||18||||Lara Jerman||Tadej Satler||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Miha Koprivnikar Krajnc||18||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Miha_Koprivnikar_Krajnc: Pomanjkanje karbamoil-fosfat sintetaze]||Eva Rajh||Tina Šimunović||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Špela Malenšek||18|| Aminokislinska regulacija mTORC1||Sara Tekavec||Maja Zupanc||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Urša Kopač||19||Mutacije TMEM70 vplivajo na obstoj ATP sintaze||Fran Krstanović||Tilen Tršelič||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Neža Koritnik||19||Uravnavanje koncentracije ROS v mitohondriju z glutationilacijo||Dorotea Borković||Lara Jerman||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Gašper Virant||19||||Elvira Boršić||Eva Rajh||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Uroš Zavrtanik||20||||Janja Krapež||Sara Tekavec||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Simon Aleksič||20||||Janez Javornik||Fran Krstanović||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Matej Hvalec||20||||Miha Koprivnikar Krajnc||Elvira Boršić||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Urša Čerček||21||||Špela Malenšek||Janja Krapež||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Katja Brezovar||21||Vloga sfingolipidov pri fagocitozi ''Candide albicans''||Urša Kopač||Janez Javornik||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Gašper Žun||21||||Neža Koritnik||Miha Koprivnikar Krajnc||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Blaž Lebar||22||||Gašper Virant||Špela Malenšek||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Aleksandra Uzar||22||Nucleoside antibiotics||Uroš Zavrtanik||Urša Kopač||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Petra Hruševar||22||Vloga metabolizma serina in glicina pri raku||Simon Aleksič||Neža Koritnik||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Dorotea Borković||23||||Matej Hvalec||Gašper Virant||06/01/16||08/01/16||12/01/16
|-
| Karmen Žbogar||23||||Katja Brezovar||Simon Aleksič||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Klara Lenart||23||||Gašper Žun||Matej Hvalec||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Lovro Kotnik||23||||Urša Čerček||Uroš Zavrtanik||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Katja Čop||23||||Blaž Lebar||Urša Čerček||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|-
| Nejc Kejžar||23||Hormonska regulacija razvoja T-celic||Aleksandra Uzar||Katja Brezovar||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|-
| Neža Brezovar||23||||Petra Hruševar||Gašper Žun||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2015|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši
* 116_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, ki je napisan na novo in je bil prijavljen v shemo 50%

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Povzetki seminarjev 2015

2015-11-23T17:17:29Z

Miha Koprivnikar Krajnc: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2015/2016 */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2015/2016 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2015 stran]

=== Kristjan Stibilj: PI3K kaskada in njihova vloga pri rakavih obolenjih ===
Dandanes je zdravljenje rakavih obolenj poglavitna točka v razvoju farmacevtskih zdravil. Velike multinacionalke vlagajo ogromno denarja v razvoj zdravila, ki bi ozdravil tumorje oz. omilil njihovo delovanje. Za nastanek rakavih obolenj so v veliki meri krivi receptorji tirozin kinaze (RTK) in njihova PI3K/AKT/mTOR signalna pot. Ta namreč nadzoruje celično proliferacijo, metabolizem, premikanje in preživetje. Mutacije ključnih proteinov v PI3K kaskadi vodijo do nenadzorovane rasti in delitve celic, kar privede do nastanka tumorjev. Glavni princip zdravljenja oz. iskanje zdravila za rakava obolenja je torej poiskati takšno molekulo, ki bi uspešno inhibirala mutiran protein in s tem ustavila njegovo hiperaktivacjo. Znanstveniki so v zadnjih letih odkrili precej inhibitorjev, ki so bolj ali majn specifični in so sedaj v preiskavah kot morebitno zdravilo. Za inhibiranje PI3K molekule sta se v predkličninih študijah pokazala kot uspešna pictilisib in buparlisib, ki se vežeta na ATP-vezavno mesto. Na enak način deluje tudi večina AKT inhibitorjev, kamor spada tudi dobro raziskan Inhibitor VIII. mTOR, zadnja molekula v PI3K kaskadi, pa ima prav tako kar nekaj sintetičnih inhibitorjev, ki so analogni naravni molekuli rapamcin. Vsi našteti inhibitorji pa žal še niso zdravila za raka, saj so interakcije z ostalimi encimi v celici še vedno nepoznane.

=== Klara Kuret: Vpliv bakterijskih efektorjev na celični ubikvitinacijski sistem in rastlinski imunski odziv ===
Patogene bakterije uporabljajo efektorje za zatiranje imunskega odziva gostitelja. Tarča mnogih efektorskih proteinov je celični ubikvitinacijski sistem (UBS), ki je pomemben regulator imunskega odgovora. Ubikvitinska signalizacija poteka preko treh encimskih kompleksov, ki na proteinske substrate vežejo molekule ubikvitina. Dolžina in oblika ubikvitinske verige narekujeta, kakšen bo biološki odgovor celice na ubikvitinacijo oz. kaj se bo s substratom zgodilo. Ker prokarionti nimajo lastnega ubikvitinacijskega sistema, so morali razviti drugačne mehanizme, ki jim omogočajo interakcijo z evkariontskimi proteini, kateri nastopajo pri ubikvitinaciji. Efektorji lahko gostiteljski UBS izkoriščajo tako, da strukturno ali funkcijsko posnemajo evkariontske komponente UBS, ali pa so homologi evkariontskih proteinov. Lahko tudi pospešujejo ali inhibirajo delovanje 26S proteasoma. Efektorski proteini torej izkoriščajo evkariontske strategije za nadzor in manipulacijo gostiteljevih celičnih procesov, v smeri, ki patogenu omogoča čim boljšo možnost razvoja in množitve. Efektorji AvrPtoB, HopM1 ter VirF so nastali z različnim evolucijskim razvojem, zato se tudi mehanizmi njihovega delovanja na UBS razlikujejo. Patogeni efektorji lahko preko ubikvitinacije pomembnih signalnih proteinov v imunskih kaskadah povzročijo nezmožnost celice, da aktivira PAMP ter ETI imunost. Razgradnja gostiteljevih proteinov vodi lahko do motenj v izražanju genov, motenj v vezikularnem transportu in številnih drugih nepravilnosti v celičnih procesih, ki pripeljejo do večje dovzetnosti celice za okužbo.

=== Tjaša Lukšič: Alternativno izrezovanje GPCR-jev s poudarkom na sekretinski družini ===
Alternativno izrezovanje GPCR-jev je pogost pojav, še posebej pri sekretinski in nekaterih sorodnih družinah. Receptorji sekretinske družine se pojavljajo v zanimivih izooblikah, ki odstirajo nove poglede na regulacijo celične signalizacije. V sedmi transmembranski vijačnici sekretinskih GPCR-jev je dobro ohranjen ekson 12 oz. zaporedje 14 aminokislin, ki je tarča izrezovalno-povezovalnega kompleksa pri nekaterih receptorjih. Delecija eksona 12 nima izrazitega vpliva na vezavo primarnih sporočevalcev, ima pa zato toliko večje posledice pri prenosu signalov. Povezovanje z G-proteini je onemogočeno, ker skrajšana TMD7 ne omogoča normalne konformacijske spremembe. Le-ta se v običajnih izooblikah zgodi zaradi premika TMD6 in TMD7 proti statični TMD3, kar razkrije intracelularno vezavno domeno za navzdolnje efektorje. Poleg omenjene funkcije lažnega receptorja, se oslabi tudi membranska ekspresija kratkih-TMD7 receptorjev, saj je izbrisan transportni motiv v eksonu 12 in zmanjšana hidrofobnost C konca. Najbolj fascinantna posledica je zagotovo dominantno negativna regulacija membranske ekspresije ostalih izooblik. Za transport GPCR-jev iz kontrolnega sistema endoplazmatskega retikuluma je potrebna oligomerizacija. Hetero-oligomeri določenih kombinacij s kratkim-TMD7 receptorjem ne uspejo zapustiti ER, število delujočih receptorjev v membrani se zmanjšuje in celica je slabše odzivna na njihove primarne sporočevalce. Med tem pa nekateri receptorji nimajo težav pri transportu skupaj s skrajšanimi izooblikami. Številna bolezenska stanja so povezana s patološkimi izooblikami ali z neuspešnim transportom proteinov iz ER, za kar obstaja potencialna rešitev v farmakoloških šaperonih.

=== Rok Miklavčič: Preusmeritve signalnih poti preko TNFR1 v boju s patogeni ===
Celice so se skozi čas prilagodile na življenje v okolju, polnem potencialno škodljivih patogenov. Razvilo se je mnogo mehanizmov celičnega odgovora, ki so prilagojeni tako, da lahko ustrezen odgovor na patogene pripravijo v različnih situacijah. En takih mehanizmov predstavlja tudi signalna kaskada preko TNFR1, receptorja za citokin TNFα. TNFα sprostijo celice imunskega sistema, ko zaznajo prisotnost patogena. Osnovni celični odgovor pri stimulaciji TNFR1 je kaskada, ki preko zaporedja ubikvitinacij sodelujočih proteinov, privede do translokacije transkripcijskega faktorja NF-κB v jedro. NF-κB tam sproži prepisovanje genov za vnetne citokine, ki ob kasnejšem sproščanju v okolico celice povzročijo vnetni odziv sosednjih celic ter s tem omejitev okužbe. Nekateri patogeni pa so na ta odziv prilagojeni tako, da inhibirajo ključne proteine v začetni kaskadi in s tem zmanjšajo vnetje, vendar pa imajo na to prilagoditev odgovor tudi gostiteljske celice. Pri taki inhibiciji pride do prenosa signala po drugi poti, ki privede do apoptoze napadene celice, kar ubije tudi patogene v njej, in tako omeji okužbo. Patogeni lahko inhibirajo tudi samo apoptozo, zaradi česar obstaja tudi zasilni celični mehanizem odgovora nanje. V primeru inhibicije apoptoze se kaskada konča z aktivacijo psevdokinaze MLKL, ki je glavni efektor za mehanizem programirane nekroze z imenom nekroptoza. Pri nekroptozi pride kot pri nekrozi do celične lize, pri čemer se v okolico sprostijo DAMP-i, ki sprožijo vnetni odziv okoliškega tkiva.

=== Ema Gašperšič: PKC in njihov vpliv na raka ter Alzheimerjevo bolezen ===
Protein kinaze C (PKC) so družina encimov, ki sodelujejo v številnih signalnih poteh v celici. S fosforilacijo serina ali treonina nekega drugega proteina regulira njegovo aktivnost. Vplivajo na proliferacijo in diferenciacijo celice, apoptozo, oblikovanje sinaps, učenje ter shranjevanje spominov, nevrološke motnje in mnogo drugih procesov v celici. Za aktivacijo PKC sta ključni povečani koncentraciji diacilglicerola (DAG) in kalcijevih ionov Ca2+, ki z vezavo na PKC povzročita prehod iz neaktivne v aktivno obliko. Aktivacija PKC vpliva na spodbujanje oziroma inhibiranje razvoja raznih bolezni, kot so rak, ishemična možganska kap ali Alzheimerjeva bolezen in druge nevrodegenerativne bolezni. Problem je v tem, da je pri zdravljenju raka potrebno rast celic čim prej zaustaviti, med tem ko morajo pri nevrodegenerativnih boleznih nevroni ostajati živi. Poleg tega je zanimivo, da naj bi nekateri aktivatorji protein kinaz C rast rakavih celic spodbujali, drugi pa zavirali. Običajen mehanizem delovanja PKC je težko opisati, saj obstaja več oblik PKC izoencimov, ki so po različnih tkivih različno razporejeni, v celici imajo različne funkcije, poleg tega pa obstaja več signalnih poti, ki vodijo do aktivacije PKC. Vse to so razlogi za oteženo delo raziskovalcev, ki želijo odkriti načine zdravljenja prej omenjenih boleznih, zato torej to področje zahteva še precej raziskav, ki bi posledično lahko olajšale njihovo zdravljenje.

=== Tadej Satler: PD-1 limfocitov in melanomskih celic ===
Melanom je najnevarnejša oblika kožnega raka in znanstveniki že desetletja borijo izboljšali rezultate zdravljenja. Vzpodbuditi želijo proti-tumorski odziv imunskega sistema, vendar so zaradi kontrolnih točk neuspešni. Kontrolne točke so ključne za ohranjanje imunske homeostaze, saj bi brez njih bili žrtev številnim avtoimunskim boleznim in poškodbam tkiva ob prevelikem odzivu sistema na patogene vnetje. Med imunske kontrolne točke spada tudi receptor PD-1. Je monomer sestavljen iz imunoglobulinske in citoplazemske domene. Zanj sta značilna tudi dva liganda (PD-L1 in PD-L2), ki sta potrebna za njegovo aktivacijo. Najdemo ga predvsem pri limfocitih T in nekaterih melanomskih celicah. Izražanje PD-1 je raziskano predvsem pri limfocitih T, kjer ob interakciji z ligandoma inhibira delovanje in funkcije limfocitov ter povzroča njihovo apoptozo. To doseže s pomočjo zaviranja številnih ključnih procesov znotraj celice, ki so potrebni za njeno normalno delovanje. Pri melanomskih celicah je pa delovanje PD-1 še dokaj neraziskano. Do zdaj njegova prisotnost ni bila znana, vendar so nedavne raziskave pokazale njegovo izražanje na nekaterih celicah limfocitov. Obnašanje PD-1 melanomskih celic je drugačno kot pa pri limfocitih, saj njegovo izražanje spodbuja rast tumorja. S pomočjo boljšega poznavanja delovanja PD-1 v limfocitih T in melanomskih celicah, bo lažje razviti učinkovitejše metode boja proti raku.

=== Tilen Tršelič: PKM2 in njegova vloga pri razvoju rakavih celic ===
Piruvat kinaza (PK) je pomemben glikolitski encim, ki se pojavlja v štirih različnih oblikah. Oblika M2 je posebno zanimiva, saj poleg svoje glikolitske funkcije opravlja še mnoge druge, nemetabolične funkcije. Poleg tega je PKM2 prevladujoča oblika encima v rakavih celicah. Razlog za povečano izražanje le-tega verjeno izhaja iz dejstva, da lahko PKM2 zavzema aktivno tetramerno obliko ali skoraj neaktivno dimerno obliko. Možnost menjavanja svojih oblik celicam, bodisi zdravim ali rakavim, omogoča prilagajanje delovanja njihovim potrebam. Če celici primanjkuje energije, lahko encim zavzema pretežno aktivno tetramerno obliko in tako spodbuja proizvodnjo ATP. Če celica potrebuje nove makromolekule za proliferacijo, tu encim lahko zavzame pretežno neaktivno dimerno obliko in spodbuja kopičenje intermediatov glikolize. Te so ključni za sintezo novih snovi, saj služijo kot njihovi prekurzorji.
Aktivnost encima PKM2 se regulira na več načinov. Vlogo regulatorjev po navadi opravljajo post-translacijske modifikacije encima, lahko pa tudi nekatere druge spremembe v celičnem okolju.
PKM2 v svoji manj aktivni dimerni obliki prav tako lahko regulira druge procese. Predvsem pospešuje celično rast in razvoj prek reakcij z pomembnimi transkripcijskimi faktorji v jedru. Izkazalo se je, da delovanje encima PKM2 močno koristi rakavim celicam.
Ker je encim PKM2 zelo pomemben za razvoj takšnih celic, predstavlja dobro potencialno tarčo za zdravljenje. Raziskave potrjujejo, da bi bilo slednje možno, ne ponujajo pa konkretnega odgovora na vprašanje, kako bi takšno zdravljenje potekalo.

=== Tina Šimunović: Pentoza-fosfatna pot, njena regulacija in povezava z rakom ===
Pod imenom rak razumemo bolezen, za katero je značilna nenadzorovana rast in celična delitev. Rakave celice imajo tako večjo potrebo po biosintezi pomembnih makromolekul, ki jo zadostijo s prilagoditvijo in spremembo svojih metaboličnih poti. Ena izmed prilagoditev je lahko sprememba pentoza-fosfatne poti (PPP). To je ena izmed metaboličnih poti glukoze, katere glavna produkta sta riboza-5-fosfat in NADPH. Prva se naprej uporablja pri sintezi nukleinskih kislin, NADPH pa je pomemben za sintezo makromolekul in za detoksikacijo. Regulacija PPP poteka preko njenih metabolnih encimov. V rakavih celicah je predvsem izražena povišana aktivnost glukoza-6-fosfat dehidrogenaze in s tem aktivnost PPP. Pri tem encimu sta, poleg mnogih drugih, najpomembnejša regulatorja NADPH in tumorski supresor p53. Aktivnost PPP lahko poveča tudi acetilacija 6-fosfoglukonat dehidrogenaze ali pa povečano izražanje transketolaze. Na pospešeno proliferacijo rakavih celic vplivajo tudi inaktivirani tumorski supresorji in aktivirani onkoproteini, npr. p53, TIGAR, ATM, Ras, mTORC1 in Nrf2. Največji pomen PPP pri rakavih celicah, je v zaščiti pred celično smrtjo, saj se s povečano aktivnostjo PPP pospeši tvorba njenih produktov, ki so ključni pri preživetju celice. Z inhibicijo te poti, bi lahko tudi inhibirali rast tumorjev. PPP je tako postala potenciala tarča za zdravljenje raka, vendar je za to potrebnih še veliko raziskav in boljše razumevanje metabolizma rakavih celic.

=== Maja Zupanc: Kako dolge nekodirajoče RNA vplivajo na regulacijo metabolizma ===
Ena najbolj fascinantnih lastnosti metabolizma je njegova regulacija. Za homeostazo metabolizma hranil in energije v telesu je nujna specializirana regulacija centralnega živčnega sistema, Langerhansovih otočkov trebušne slinavke in glavnih metabolnih tkiv (maščobno tkivo, skeletne mišice in jetra). Dolge nekodirajoče molekule RNA (lncRNA) so RNA molekule dolge več kot 200 nukleotidov, ki ne kodirajo proteinov. Njihov spekter delovanja je izredno širok, na metabolizem vplivajo prek regulacije procesov adipogeneze in hepatičnega metabolizma, nadzora funkcionalnosti Langerhansovih otočkastih celic, regulacije razvoja skeletnih mišic, in energijske homeostaze. Do sedaj je bilo odkritih že več kot 60000 dolgih nekodirajočih RNA molekul in repetuar njihovih funkcij se z vsako novo raziskavo širi. Vloga lncRNA je še pred desetimi leti bila neznanka, od takrat pa nam je že postalo jasno, da so pomembni regulatorji izražanja DNA, diferenciacije in razvoja celic, razvoja tkiva in tumorogeneze. V resnici pa vemo zelo malo, oziroma smo šele na začetku razumevanja lncRNA. Ker se zaradi tega z vsakim novim odkritjem pojavlja še več vprašanj (o podrobnih principih delovanja lncRNA in njihovega sodelovanja z drugimi molekulami, o še nepoznanih funkcijah, vpletenosti v bolezni in možnosti razvoja novih tehnik zdravljenja…), so raziskave na tem področju zelo aktualne.

=== Lara Jerman: Warburgov učinek: od raka do avtoimunosti ===
V dvajsetih letih prejšnjega stoletja je Otto Warburg s svojimi sodelavci meril porabo kisika in sintezo laktata v rakastem tkivu. Pri tem je prišel do zelo pomembnega opažanja, ki ostaja zelo aktualno – da celice rakastega tkiva tudi ob normoksičnih pogojih vztrajajo pri močno povečani glikolizi. Danes vemo, da se Warburgov učinek v rakastih tkivi pojavlja skoraj univerzalno. Večina Warburgovih opažanj in meritev je bila kvantitativno pravilna. Njegova razlaga vzroka pojava pa se je izkazala za napačno, saj povečano stopnjo glikolize zasledimo v mnogih rakastih tkivih brez določljivih mitohondrijskih mutacij ali motenj oksidativno-fosforilacijske metabolne poti. V takih tkivih sinteza ATP v mitohondrijih poteka nemoteno in enako učinkovito kot pri normalnih tkivih z enako koncentracijo kisika. Raziskave zadnjih let kažejo na to, da je povečana glikoliza strateška poteza rakastih celic, ki zadovoljuje predvsem njihove potrebe po sintezi biomase. V skoraj stoletju od Warburgovega prvotnega odkritja je postalo jasno, da metabolična stikala omogočajo celici, da se prilagaja svojim bioenergetskim in biosintetskim potrebam. Zmožnost hitrega prilagajanje potrebam je še posebej pomembna pri imunskih celicah, ki morajo ob imunskem odzivu hitro preiti iz mirujočega stanja. Zato ni presenetljivo, da so si rakaste in imunske celice glede zagotavljanja metabolnih tokov in bionenergetike za rast in širjenje v marsičem podobne.

=== Sara Tekavec: Mutacije encimov Krebsovega cikla in vpliv na razvoj ter rast tumorjev ===
Encimi izocitrat dehidrogenaza (IDH), sukcinat dehidrogenaza (SDH) in fumarat hidrataza (FH) sodelujejo v Krebsovem ciklu. Prvi omogoča pretvorbo izocitrata v α-ketoglutarat (α-KG), drugi pretvorbo sukcinata v fumarat, tretji pa pretvorbo fumarata v malat. Za gene, ki kodirajo te encime, so značilne mutacije, ki vodijo v nastanek in rast tumorjev. Mutacije so lahko onkogen-aktivirajoče (mutacija IDH) ali tumor-supresor deaktivirajoče (mutacije SDH in FH). Mutacija IDH tako v encimu vzpodbudi novo funkcijo, in sicer pretvorbo α-ketoglutarata ob prisotnosti NADPH v onkometabolit 2-hidroksiglutarat (2-HG). Pri drugih dveh mutacijah pa gre za to, da je aktivnost encima zmanjšana oz. je sploh ni, kar ima za posledico kopičenje sukcinata ali fumarata. To ugodno vpliva na rast tumorja, saj lahko te tri omenjene molekule na različne načine inducirajo izražanje genov, pomembnih za celično rast in preživetje. Vse tri na primer stabilizirajo hipoksični inducibilni faktor (HIF), ki nato sproži transkripcijo in angiogenezo (rast krvnih žil). Z zmanjšano koncentracijo dveh antioksidantov NADPH in α-ketoglutarata se poveča tudi tveganje za nove mutacije, povzročene s strani reaktivnih kisikovih zvrsti. Poleg tega lahko α-KG sam deluje kot mutagen ali pa tudi inhibira metilacijo DNA in histonov, zaradi česar je izražanje onkogenov povečano. Kljub temu, da je ta metabolična pot pri tumorjih precej kompleksna, nam bodo nove metode detekcije tumorjev kmalu omogočile tudi boljše razumevanje samih mutacij in mehanizma nastanka tumorjev, ki tiči v ozadju.

=== Fran Krstanović: L-Carnitine enhances exercise endurance capacity ===
Our energy metabolism is working constantly to cover energy need of our body. ATP represents the first line of action. With cellular ATP concentration low, our body needs other sources of energy as fuel. Fats carbs and proteins play that part. To get energy from fats they need to be oxidase. The process of fat oxidation is situated in the mitochondria. Fats need a special transporter to get into the cell, l-carnitine.
Apart from fat transportation l-carnitine has many other roles; enhancing exercise endurance capacity is believed to be one of them. Mice fed with L-carnitine showed great promise to confirm this theory. Glycogen concentrations were higher, all important parameters for fatty acid intake and mitochondria biogenesis were higher and do additional AMPK was activated. The most important parameter was higher endurance capacity was reached. The problem lies in implicating the theory on humans; consuming concentrations are unknown (high can lead to problems, low won’t have affect). Further experiments will surely be held as carnitine provides great attention from sports industries as a supplement for fat burning or maybe for greater athletes’ fatigue.

=== Janja Krapež: Vpliv metabolizma maščobnih kislin na povišan krvni tlak v plučnih arterijah ===
Povišan krvni tlak v pljučnih arterijah (PAH) je huda bolezen, ki posledično zelo vpliva tudi na srce, predvsem na desni prekat, ki se zaradi prevelike obremenjenosti poveča. To lahko privede tudi do odpovedi srca. Zakaj pride do nepravilnega delovanja desnega prekata, je še neznano, prav tako kako do tega pride. Zadnje raziskave sklepajo, da je z nedelovanje povezan tudi metabolizem maščobnih kislin in glukoze. Problem predstavlja kopičenje maščobnih kislin znotraj mišičnih celic srca. Za transport maščobnih kislin z dolgimi verigami poskrbi protein CD36 skupaj s FATP (v miocitih FATP6). Kopičenje maščobnih kislin v celici je povezano tudi s favoriziranjem oksidacije glukoze. Preklop med ß-oksidacijo maščobnih kislin in oksidacijo glukoze poteka v Randlovem ciklu, kjer intermediati ene oksidacije inhibirajo drugo. Ključni pri inhibiciji ß-oksidacije je malonil-CoA, ki inhibira CAP encim na mitohondrjski membrani in je ključni prenašalec maščobnih kislin v mitohondrij, kjer se nadalje oksidirajo. Trenutne raziskave želijo izboljšati delovanje desnega prekata prav preko oksidacije maščobnih kislin. Šele razumevanje zapletenih mehanizmov metabolizma bo omogočilo nadaljnji razvoj potencialnih zdravil za zdravljenje PAH in posledično tudi izboljšalo delovanje desnega prekata.

=== Elvira Boršić: Posledice spremenjenega metabolizma maščobnih kislin v kardiomiocitih ===
V fetusu kardiomiociti pridobivajo energijo z oksidacijo glukoze in laktata zaradi pomanjkanja kisika. Ko se rodimo pa postanejo maščobne kisline preferenčni substrat pridobivanja ATP-ja. Do sprememb glavnega substrata pride zaradi večjih telesnih obremenitev, bolezni in okoliščin zunaj celice. Pri tem imajo osrednjo vlogo razni transkripcijski faktorji, npr. receptor, aktiviran s peroksisomskim proliferatorjem α (PPARα), in transkripcijski koaktivatorji, npr. PPARγ koaktivator 1α (PGC1α). Dokazali so, da lahko nedelovanje vsaj 22 encimov in transporterjev udeleženih pri metabolizmu maščobnih kislin povzroči razne bolezni, ki zmanjšajo delovanje srca. Vsaka od teh pa lahko povzroči srčno popuščanje. Do tega pride, ko srce ni več zmožno črpati krvi iz pljuč po telesu. Najpogostejša vzroka sta zvišan krvni tlak in ishemija. Slednjo povzroči hipoksija, zaradi česar se ustavi tok elektronov v dihalni verigi. V anaerobnih pogojih je tako glikoliza edini vir energije in proizvede le 5 % celotnega ATP-ja, ki ga imajo kardiomiociti v normalnih pogojih. Produkti glikolize porušijo homeostazo in za ohranjanje le-te celice porabijo veliko energije, ki bi se sicer porabila pri kontrakciji. Raven kisika se obnovi pri reperfuziji, ki pa naredi še več škode kot ishemija. Zaradi srčnega popuščanja umre vsako leto več tisoč ljudi, saj še ne poznamo zdravila, ki bi to bolezen preprečilo. Ker še ne razumemo vseh mehanizmov, poteka na tem področju veliko raziskav.

=== Miha Koprivnikar Krajnc: Pomanjkanje karbamoil-fosfat sintetaze ===
Pomanjkanje karbamoil fosfat sintetaze (CPS1) je ena izmed motenj cikla sečnine, torej poslabša zmožnost proizvodnje sečnine, ki ima pomembno vlogo pri regulaciji pH. CPS1 katalizira nastanek vstopne spojine cikla sečnine, karbamoil fosfat, in jo regulirajo Mg2+, Ca2+, NAG, ter tudi druge snovi posredno, preko NAG sintetaze. Mutacij, ki povzročajo spremembo strukture CPS1 je kar nekaj in povzročajo spremembe v aktivnosti encima različnih jakosti (od milih sprememb do popolne inaktivacije). To je razlog, da nekateri oboleli velikokrat sploh ne dočakajo otroštva, medtem ko pri ostalih bolezen pride na dan kasneje v življenju ob nekem stresu za organizem. Simptomi pomanjkanja CPS1 so predvsem nevropatološke narave in vključujejo poslabšanje kognitivnih sposobnosti, epizode delirija, utrujenost in druge simptome. Pri pacientih s hujšimi motnjami lahko bolezen tudi po zdravljenju pusti trajne posledice, saj pride do poškodb možganov v procesu razvoja. Razlog za nevrotoksičnost je osmotska aktivnost glutamina, ki se v velikih količinah nabira v astrocitah možganov. To povzroča hipertonično okolje v celicah in otekanje možganov. Brez ukrepov to privede do kome in smrti. Zdravljenje akutnih primerov motnje se začne z uporabo lovilcev amonijaka in dializo krvi, nadaljnji ukrepi pa so za enkrat omejeni na dieto z malo proteinov in citrulin. Za prihodnost je obetavno zdravljenje s stimulacijo encima z aktivatorjem oziroma njegovim analogom ali pa kar s stimulacijo sintetaze aktivatorja.

BIO2 Seminar 2015

2015-11-23T17:05:10Z

Miha Koprivnikar Krajnc: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Kristjan Stibilj||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Kristjan_Stibilj:_Inhibicija PI3k/AKT/mTOR signalne poti kot orožje proti raku||Lovro Kotnik||Blaž Lebar]||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Tjaša Lukšič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tjasa_Luksic: Alternativno izrezovanje GPCR-jev s poudarkom na sekretinski družini]||Karmen Žbogar||Aleksandra Uzar||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Klara Kuret||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Klara_Kuret: Vpliv bakterijskih efektorjev na celični ubikvitinacijski sistem in rastlinski imunski odziv]||Klara Lenart||Petra Hruševar||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Rok Miklavčič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Rok_Miklavčič: Preusmeritve signalnih poti preko TNFR1 v boju s patogeni]||Katja Čop||Lovro Kotnik||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Ema Gašperšič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Ema_Gaspersic: PKC in njihov vpliv na raka ter Alzheimerjevo bolezen]||Nejc Kejžar||Karmen Žbogar||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Tadej Satler||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tadej_Satler: PD-1 limfocitov in melanomskih celic]||Neža Brezovar||Klara Lenart||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Tina Šimunović||14-15||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tina_Simunovic: Pentoza-fosfatna pot, njena regulacija in povezava z rakom]||Kristjan Stibilj||Katja Čop||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Maja Zupanc||14-15||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Maja_Zupanc: Kako dolge nekodirajoče RNA vplivajo na metabolizem]||Tjaša Lukšič||Nejc Kejžar||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Tilen Tršelič||14-15||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tilen_Trselic: PKM2 in njegova vloga pri razvoju rakavih celic]||Klara Kuret||Dorotea Borković||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Lara Jerman||16||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Lara_Jerman: Warburgov učinek: od raka do avtoimunosti]||Rok Miklavčič||Neža Brezovar||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Eva Rajh||16||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Eva_Rajh: Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na modifikacije DNK in histonov ter vpliv na staranje]||Ema Gašperšič||Kristjan Stibilj||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Sara Tekavec||16||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Sara_Tekavec: Mutacije encimov Krebsovega cikla in vpliv na razvoj ter rast tumorjev]||Tadej Satler||Tjaša Lukšič||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Fran Krstanović||17||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Fran_Krstanovic: L-Carnitine enhances exercise endurance capacity]||Tina Šimunović||Klara Kuret||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Elvira Boršić||17||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Elvira_Boršić: Posledice spremenjenega metabolizma maščobnih kislin v kardiomiocitih]||Maja Zupanc||Rok Miklavčič||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Janja Krapež||17||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Janja_Krapež: Vpliv metabolizma maščobnih kisln na povišan krvni tlak v pljučnih arterijah]||Tilen Tršelič||Ema Gašperšič||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Janez Javornik||18||||Lara Jerman||Tadej Satler||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Miha Koprivnikar Krajnc||18||Pomanjkanje karbamoil-fosfat sintetaze||Eva Rajh||Tina Šimunović||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Špela Malenšek||18|| Aminokislinska regulacija mTORC1||Sara Tekavec||Maja Zupanc||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Urša Kopač||19||Mutacije TMEM70 vplivajo na obstoj ATP sintaze||Fran Krstanović||Tilen Tršelič||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Neža Koritnik||19||Uravnavanje koncentracije ROS v mitohondriju z glutationilacijo||Dorotea Borković||Lara Jerman||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Gašper Virant||19||||Elvira Boršić||Eva Rajh||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Uroš Zavrtanik||20||||Janja Krapež||Sara Tekavec||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Simon Aleksič||20||||Janez Javornik||Fran Krstanović||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Matej Hvalec||20||||Miha Koprivnikar Krajnc||Elvira Boršić||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Urša Čerček||21||||Špela Malenšek||Janja Krapež||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Katja Brezovar||21||Vloga sfingolipidov pri fagocitozi ''Candide albicans''||Urša Kopač||Janez Javornik||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Gašper Žun||21||||Neža Koritnik||Miha Koprivnikar Krajnc||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Blaž Lebar||22||||Gašper Virant||Špela Malenšek||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Aleksandra Uzar||22||Nucleoside antibiotics||Uroš Zavrtanik||Urša Kopač||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Petra Hruševar||22||Vloga metabolizma serina in glicina pri raku||Simon Aleksič||Neža Koritnik||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Dorotea Borković||23||||Matej Hvalec||Gašper Virant||06/01/16||08/01/16||12/01/16
|-
| Karmen Žbogar||23||||Katja Brezovar||Simon Aleksič||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Klara Lenart||23||||Gašper Žun||Matej Hvalec||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Lovro Kotnik||23||||Urša Čerček||Uroš Zavrtanik||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Katja Čop||23||||Blaž Lebar||Urša Čerček||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|-
| Nejc Kejžar||23||Hormonska regulacija razvoja T-celic||Aleksandra Uzar||Katja Brezovar||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|-
| Neža Brezovar||23||||Petra Hruševar||Gašper Žun||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2015|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši
* 116_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, ki je napisan na novo in je bil prijavljen v shemo 50%

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2015 Povzetki seminarjev

2015-05-19T15:39:47Z

Miha Koprivnikar Krajnc:

[[TBK2015-seminar|Nazaj na osnovno stran]]

=== Uroš Zavrtanik: Mehanizem popravljanja DNA: NER (faktor XPC) ===

Od samega nastanka naprej se življenje spopada s fundamentalnim problemom kemijske nestabilnosti genetske informacije, shranjene v DNA. Molekula DNA je izpostavljena številnim fizikalnim ter kemijskim dejavnikom, ki lahko vplivajo na njeno strukturo in posredno ali neposredno tudi na samo informacijo. Ker pa predstavlja ohranjanje informacije eden izmed ključnih in pomembnejših aspektov življenja samega, so se tekom evolucije razvili številni mehanizmi popravljanja DNA. Eden izmed teh mehanizmov je popravljanje DNA z izrezom nukleotidov (ang. Nucleotide Excision Repair-NER). NER je popravljalni proces za odstranjevanje in popravo večjih strukturnih nepravilnosti v strukturi DNA, ki so v glavnem posledica radiacije (UV, gama) ter okolijskih dejavnikov (specifične molekule, ki lahko strukturno poškodujejo DNA). NER predstavlja pri človeku edini mehanizem za popravljanje poškodb povzročenih zaradi UV radiacije. Največji izziv NER je, kako najti vse poškodovane dele DNA v celotnem genomu. Na podlagi eksperimentalnih ugotovitev raziskovalci ugotavljajo, da bi lahko bil ''ključ do uspeha'' naključna vezava proteina XPC (začetni faktor NER) na nespecifično mesto v DNA ter nato vzdolžna difuzija XPC do poškodovanega (specifičnega) mesta, kjer XPC za trenutek obstane, kar je signal za sprožitev popravljalnega procesa. Odkritje bi lahko predstavljalo generalni koncept mehanizma še vedno malo raziskane interakcije protein-DNA.

=== Gašper Virant: Vezava agonista na adenozinske receptorje lajša kronično bolečino ===
Kronična bolečina je posledica okvare živčevja. Ločimo nociceptivno kronično bolečino, ki jo povzroča draženje bolečinskih receptorjev (nociceptorjev) v tkivih notranjih organov ter mišičnoskeletnega sistema, in nevropatsko kronično bolečino, ki nastane kot posledica okvare, poškodbe ali motenega delovanja perifernega ali osrednjega živčevja . Najbolj uspešni pristopi lajšanja tovrstne bolečine temeljijo na uporabi mehanizma kalcijevih kanalčkov, opioidov, in adrenergikov. Pogosto pa imajo ta zdravila stranske učinke, ki nastopijo ob neprestani uporabi. Prav tako telo razvije toleranco do njih, kar pomeni, da je za enak učinek potreben vedno večji odmerek, kar vodi v zmanjšano učinkovanje zdravila. Kot močno ne-narkotično in ne-opoidno sredstvo za lajšanje tovrstne bolečine se je izkazal adenozin. Adenozin oz. nekateri še bolj selektivni agonisti se vežejo na zunajcelične adenozinske receptorje in s tem zmanjšajo zaznavanje bolečine. Adenozin v zunajceličem prostoru ni obstojen, vendar lahko njegovo življensko dobo podaljšamo z inhibicijo andenozin kinaz in deaminaz ter tako posledično podaljšamo tudi protibolečinsko delovanje. Visoko selektiven agonist z veliko afiniteto do A3 podskupine adenozinskih receptorjev bi tudi pomembno odpravil neželene stranske učinke.

=== Klara Lenart: Permanentno označevanje nevronskih povezav ===

Preučevanje nevronskih povezav je precej neraziskano področje. Za raziskave teh povezav uporabljajo proteine, najpogosteje skupino proteinov imenovano GCaMP, ki oddajajo fluorescenčno svetlobo kratek čas po zaznavi spremembe v koncentraciji kalcijevih ionov v celici. Skupina znanstvenikov z medicinskega inštituta Howard Hughes je razvila nov protein, imenovan CaMPARI(podoben je skupini GCaMP-jev), ki označuje aktivne nevrone glede na spremembo koncentracije Ca2+ v njih. Proteini, podobni CaMPARI-ju obstajajo že zadnjih 20 let, a posebnost novega proteina je permanentna fluorescenca, ki jo oddaja ob povečanju koncentracije kalcija v celici ter sočasnem obsevanju z vijolično svetlobo. Glavni del CaMPARI-ja je fluorescenten protein EosFP, ki spremeni barvo iz zelene v rdečo ob obsvetljevanju z vijolično svetlobo. Ko so EosFP spojili z kalmodulinom in peptidom M13, katera sta potrebna za vezavo kalcijevih ionov, je nastal CaMPARI. Ponuja možnost raziskav nevronskih povezav med kompleksnejšim vedenjem, na primer med učenjem. Prav tako je uporaben, ker lahko z reguliranim obsvetljevanjem vplivamo, kdaj bo potekala pretvorba iz zelene v rdečo in kdaj ne. Preizkusili so ga v štirih poskusih; na ličinkah in odraslih osebkih vinske mušice, na ličinkah cebrice in na odraslih miših. Vsi poskusi so potrdili že znana dejstva, kar dokazuje njegovo zanesljivost, ter ponuja mnogo možnosti za nadaljnje raziskave.

=== Blaž Lebar: Preučitev imunskega odziva komarja po piku ===

Malarija je bolezen, ki jo prenaša komar mrzličar ali Anopheles. Na leto se okuži na stotine milijonov ljudi, nekaj milijonov jih tudi umre. Povzročitelj te bolezni so različne vrste plazmodijev, ki se uspešno množijo v komarju, ki nato po piku okuži svojo žrtev. Vendar kako uspe tako inferiorno bitje kot je komar okužiti tako kompleksno bitje kot je človek, morda celo smrtno, sam komar pa normalno funkcionira navkljub patogenom v lastnem v organizmu?
Za komarjev imunski sistem so odgovorni LRIMi, bilo naj bi jih nekaj več kot 24, vendar delovanja večine še ne poznajo. Najpomembnejša za imunski sistem komarja naj bi bila člena sistema komplementa: LRIM1 in APL1C v hemolimfi, ki se z LRRji povežeta z TEP1cut in tako izvedeta uspešno lizo in melanizacijo patogenov, vendar sta se izkazala kot popolnoma neučinkovita pri eliminaciji P. berghei. V tej študiji pa so se osredotočili na LRIM9, protein v imunskem sistemu, ki naj bi imel najpomembnejšo vlogo pri borbi z plazmodiji. Najpogostejša tehnika je bila qRT-PCR, preverjali pa so namnožitev, reprodukcijo in melanizacijo P. berghei pri komarjih vrste A. gambiae ob prehranjevanju s krvjo miši, ter različne vplive na izražanje LRIM9 (prehranjevanje, bakterije, imunost…). Ugotovili so tudi povezavo izražanja LRIM9 in hormona »ecdysone«, ki se izloča iz jajčnikov samic.
Danih je bilo veliko odgovorov, ki pa so odprli nova vprašanja, katera bodo zahtevala še veliko raziskav.

=== Ema Gašperšič: Dvojedrni bakrov kompleks naj bi preprečil širjenje raka ===
Čeprav je v zadnjem času opazen napredek na področju zdravljenja raka, še vedno obstajajo določene pomanjkljivosti. Eno izmed najbolj pogosto uporabljenih zdravil za različne vrste raka je cisplatin, ki se veže na dušikove baze DNA in s tem povzroči celično smrt oz. apoptozo. Cisplatin pa kljub vsemu ni vedno učinkovit in ima precej stranskih učinkov, zato so raziskovalci želeli razviti alternativno zdravilo. Razvili so citotoksični dvojedrni kompleks z bakrom, ki se s pomočjo molekularne prepoznave veže na dve sosednji fosfatni skupini na vijačnici DNA, kar prepreči celične delitve in uniči patološko celico. Z različnimi anorganskimi in biokemijskimi metodami, spektroskopijo in metodami na posameznih molekulah so dokazali, da dvojedrni Cu2 kompleks zavira sintezo DNA in je citotoksična za človeške rakave celice. V članku je predstavljena sinteza prvega kompleksa iz te družine molekul, bakrovega Cu2 kompleksa ter različne metode, s katerimi so dokazali sposobnost ustrezne koordinacije Cu2(2+), sposobnost močne vezave Cu2(2+) na DNA, sposobnost inhibicije sinteze DNA ter citotoksičnost kompleksa. Iz dobljenih rezultatov znanstveniki predpostavljajo učinkovito interakcijo med Cu2(2+) in DNA in vitro ter v živih celicah. Nadaljnje klinične in medicinske raziskave pa bodo še odločale o tem, kako, in če sploh, bo bakrov kompleks resnično preizkušen na pacientih z rakom.

=== Tjaša Lukšič: Ključne biološke funkcije skakajočih genov ===

Dobro polovico človeškega genoma sestavljajo ponavljajoči se genetski elementi, katerim v preteklosti niso pripisovali posebne vloge, danes pa vse bolj postaja jasno, da njihova prisotnost v genomu prinaša svojevrstne biološke funkcije. Alu sekvence so primer takšnih transpozicijskih elementov, katerih prepisovanje je običajno minimalizirano, vendar se ob virusnih infekcijah ali stresu močno poveča. Po klasifikaciji so podvrsta kratkih razpršenih jedrnih elementov (SINE), ki se lahko transponirajo po genomu prek RNA intermediata, vendar ne kodirajo proteinov. Alu sekvence prepisuje RNA polimeraza III, Alu RNA pa ima značilno sekundarno strukturo dveh rok, ki omogoča tvorbo kompleksov s proteinskimi dimeri SRP9/14. Nastanek takšnih Alu ribonukleoproteinov (RNP) v običajnih celičnih razmerah ni pogost, saj je kljub veliki količini monomerov SRP9 in SRP14 stopnja pojavljanja Alu RNA-jev veliko manjša. Tvorba Alu RNP-jev prepreči iniciacijo prevajanja mRNA v aminokislinsko zaporedje in tvorbo polisomov. Po vezavi Alu RNP-ja na ribosomsko podenoto 40S, Alu RNA lahko zapusti kompleks in sodeluje v nadaljnjih prenosih novih SRP9/14. Mehanizem delovanja takšnih kompleksov je relativno nepoznan in odpira nove poglede na smisel ohranitve transpozicijskih elementov skozi evolucijo. Alu sekvence je predstavljajo perspektivno področje za preučevanje ravno zaradi njihovega prispevka k zaščiti translacijskih procesov celice v neugodnih razmerah in zaradi drugih še neodkritih, potencialnih bioloških funkcij.

=== Špela Malenšek: Smo zaradi endogenih retrovirusov pametnejši? ===

Človeški endogeni retrovirusi (ERV), genetsko podedovani ostanki preteklih virusnih infekcij, so klasično obravnavani kot človeku oziroma gostitelju neuporabni del genoma, tako imenovani "junk DNA". Njihovo delovanje je v običajnih somatskih celicah (fibroblasti, hepatocite, bele krvne celice …) nadzorovano z epigenetskim mehanizmom metilacije DNA, kjer se metilna skupina doda citozinu ali adeninu in tako prepreči izražanje virusnih delov genoma. V nevronskih izvornih celicah naj bi med drugim izražanje endogenih retrovirusnih elementov nadzoroval tudi protein TRIM28. Deluje namreč kot korepresor, ki z modifikacijo histonov zatre prepisovanje genetskega materiala. Raziskave na univerzah Lund in EPLF so pokazale, da se ob izbrisu TRIM28 v celicah nakopičita dve večji skupini ERV, ki pri miših vplivata na izražanje gena BC048671 in služita kot startni točki za IncRNA (dolga nekodirajoča RNA). Hkrati izbris proteina TRIM28 povzroči tako kompleksne vedenjske spremembe kot tudi abnormalne vedenjske fenotipe modelnih organizmov (miši), ki se izkažejo podobne nekaterim človeškim psihološkim motnjam. Klasični hipotezi o nefunkcionalnosti ERV se tako zoperstavlja nova ideja, ki trdi, da aktivnost ERV vpliva na izražanje genov v nevronskih izvornih celicah in na kompleksnost nevronske mreže v možganih. S tem se odpira popolnoma nova molekularna perspektiva na analizo kompleksnih vedenjskih vzorcev, možganskih motenj in samega delovanja nevronske mreže.

=== Nejc Kejžar: Novi 'pametni' inzulin ===

Z odkritjem biotehnoloških metod za umetno sintezo inzulina s pomočjo bakterije E. coli ali kvasovk je življenje s sladkorno boleznijo postalo mogoče, še vedno pa so prisotni zapleti, ki jih povzročata hipoglikemija in hiperglikemija. Današnje inzulinske terapije se osredotočajo na konstanto merjenje koncentracij glukoze v krvi in intravenozni vnos inzulina glede na izmerjeno koncentracijo, kar pa je kljub nujnosti (še posebej za paciente diabetesa tipa 1) zelo nadležno. Do težav lahko pride zaradi neupoštevanja terapije ali slabe glikemične kontrole, kar lahko v resnih stanjih hipoglikemije privede do kome ali smrti, hiperglikemija pa lahko vodi do kardiovaskularnih obolenj, težav s celjenjem ran ali celo do raka. Za učinkovitejše nadziranje krvne koncentracije glukoze in olajšano življenje pacientov je skupina znanstvenikov iz MIT razvila ‘pametni’ inzulin, ki ima nase pritrjen konjugat sestavljen iz alifatske verige 11 ogljikovih atomov in fenilborove kisline. Alifatska veriga povzroča podaljšano delovanje inzulina, fenilborova kislina pa služi kot ‘stikalo’, ki aktivira delovanje inzulina samo ob povečani koncentracije glukoze v krvi. Ta sintetični derivat je zmožen hitrejšega obnavljanja normalnih koncentracij krvne glukoze kot naravni in klinični inzulin, večkratnega zaporednega odziva na porast glukoze, prav tako pa ima nižji hipoglikemični indeks ob administraciji v času normalnih koncentracij glukoze, kar pomeni, da je tveganje za hipoglikemijo manjše. V najbolj zgovornem testu je bilo pokazano, da je učinkovitost pametnega inzulina primerljiva z delovanjem zdravega pankreasa.

=== Simon Aleksič: Zorenje mRNA pri lignjih zaznamujejo A-I deaminacije ===

Informacijska RNA je po prepisu iz DNA podvržena dodatnim procesom, tako v jedru kot tudi v citoplazmi. Izrezovanje intronov je le en izmed procesov, ki zagotavlja strukturno variabilnost proteinov. Za variabilnost strukture poskrbijo tudi malo raziskane deaminacije nukleotidov . Deaminacije nukleotidov so katalitski kemijski procesi, ki omogočajo spreminjanje tripletov kodonov v zapisih mRNA s pomočjo proteinov ADAR. Za takšne procese so predvidevali, da so v organizmih redki in nimajo posebnega vpliva na delovanje proteinov v telesu. A študija univerze v Tel Avivu je pokazala, da so deaminacije adenozina v inozin v živčnih tkivih lignjev eden poglavitnih procesov, ki se zgodijo pred translacijo mRNA v proteine. Deaminacije s spremembami tripletov povzročijo zamenjave aminokislin v proteinih, raziskava pa dokaže, da se stabilnejše aminokisline zamenjajo z manj stabilnimi. Manj stabilne aminokisline v območju aktivnega mesta in hidrofobnega jedra povzročijo, da je protein sam manj občutljiv na nižje temperature okolja in lahko ostane delujoč pri spremenjenih razmerah okolja. Deaminacije so posebno pogoste v mRNA prepisih genov, ki zapisujejo proteine vključene v živčni sistem in citoskelet. Novejše raziskave mutacije genov za protein ADAR pri človeku povezujejo z različnimi imunskimi boleznimi, kot so ADA-SCID in sindrom Aicardi–Goutières.

=== Gašper Žun: Antibiotiki betalaktami uničujejo bakterije z okvaro mehanizma za izgradnjo celične stene ===
Antibiotiki β-laktami, med katere spada tudi penicilin, predstavljajo eno izmed najdlje in najsplošneje uporabnih terapij pri bakterijskih okužbah. Učinkujejo tako, da z vezavo na penicilin-vezavne proteine (PBP) okvarijo mehanizem za sintezo celične stene. S tem onemogočijo zamreženje nastajajočih verig peptidoglikanov (PG) v matriks, v manjši meri pa se nove verige še vedno lahko sintetizirajo. Celična stena takih bakterij je zato neobičajnih oblik, med delitvijo pa se lahko na določenih mestih pretrga in celica propade. Zaradi nastajanja enoverižnih PG se vključijo v proces encimi (Slt), ki take neobičajne verige razgrajujejo. Lastnosti celične stene na tak način ostajajo funkcionalne, vendar pa zaradi vključenega brezuspešnega cikla sinteze in razgradnje celične stene pride do prekomerne porabe za celico pomembnih snovi, kar le še prispeva k toksičnemu delovanja antibiotikov. Obrambni mehanizmi proti antibiotični aktivnosti vključujejo encime (β-laktamaze), ki razgrajujejo β-laktame. Vse večja odpornost bakterij na antibiotike je posledica povečane frekvence genskega zapisa za β-laktamaze, ki se med bakterijami prenaša s plazmidi. Ker je za uspešen boj proti bakterijam potreben nenehen razvoj novih zdravil in terapij, je potrebno dodobra spoznati tako način učinkovanja antibiotikov kot način delovanja bakterij. Članek prispeva nov vpogled v delovanje encima Slt za razgradnjo nezamreženega novo nastalega PG, saj mu pripisuje vlogo kontrole nad kvaliteto izgradnje celične stene, kar pa v resnici potencira uničujoče posledice antibiotikov.

=== Rok Miklavčič: Kontrola prenašalnih RNA na CCA-dodajajočem encimu ===
tRNA je ena od biološko najpomembnejših molekul v živih organizmih in ima ključno vlogo pri sintezi proteinov, zato je pomembno, da so vse tRNA, ki na ribosome prinašajo aminokisline, funkcionalne. Od prepisa dalje grejo zato tRNA prepisi skozi serijo procesov in modifikacij, ki na koncu privedejo do popolnoma funkcionalnih tRNA. V predzadnji fazi urejanja tRNA sodeluje CCA-dodajajoči encim, ki na 3'-konec prepisov tRNA pripne končno nukleotidno zaporedje CCA, v zadnji fazi pa se na zadnji adenin nukleotid veže še ustrezna aminokislina. CCA-dodajajoči encim pa ima v sintezi tRNA še eno nedavno odkrito funkcijo: nestabilnim prepisom tRNA pripne nukleotidno zaporedje CCACCA, ki je signal za razgradnjo. Na ta način encim kontrolira kvaliteto tRNA in pripomore k optimizaciji same sinteze proteinov. Na CCA-dodajajočem encimu se razlike med stabilnimi in nestabilnimi tRNA prepisi pokažejo po vezavi prvega zaporedja CCA, in sicer pri premiku encima. Stabilne tRNA se ob premiku odcepijo z encima, medtem ko pri nestabilnih tRNA premik povzroči transformacijo njihove sekundarne strukture, ob tem pa nastane na tRNA izboklina. Za transformirane nestabilne tRNA se cikel dodajanja zaporedja CCA nato izvede še enkrat, kar privede do končnega zaporedja CCACCA. Po končanem drugem ciklu se ob nadaljnjem premiku encima z njega odcepijo tudi nestabilne tRNA.

=== Tilen Tršelič: Transport proteinov v celico s pomočjo nanodelcev ===
Nanotehnologija v moderni znanosti že dolgo igra pomembno vlogo. Raziskovalci so ugotovili, da lahko s pomočjo nanodelcev v celice dostavljajo nukleotide in nekatere druge manjše molekule. Medicina je zato kmalu izrazila željo, da bi v celico lahko dostavljali tudi delujoče, zaključene proteine, ki bi pomagali pri zdravljenju različnih bolezni.
Na Univerzi v Kaliforniji so nedavno odkrili način, kako bi nanotehnologijo res lahko uporabljali za transport proteinov v celice. Ugotovili so, da obstajajo delci, ki so zmožni vezati protein, ga prenašati in ob laserskem obsevanju sprostiti v celico. Podobne metode so že bile testirane, a je njihova uporabna vrednost majhna, saj je lasersko obsevanje zaradi visoke energije pogosto poškodovalo tkiva in organizme.
Raziskava, predstavljena v seminarju, je z uporabo zlatih nanodelcev in posebnega fluorescentnega proteina GFP dokazala, da je neškodljiv, natančen transport proteinov v celice le mogoč. Izbrana metoda transporta prav tako omogoča velik nadzor nad lokacijo in časom sprostitve izbranega proteina v okolje. Znanstveniki so na zlat nanodelec vezali poseben prenašalec, ki je sposoben vezati histidinizirane proteine, jih dostaviti v celico in jih nato ob laserskem obsevanju z nizko energijo sprostiti v okolje.
Raziskava in njeni izsledki imajo velik pomen, saj bi predstavljena metoda lahko omogočila vodeno diferenciacijo matičnih celic ali vodeno celično smrt in s tem zdravljenje nekaterih težjih bolezni.

=== Lovro Kotnik: Acetilacija lizina in spremembe v proteomu astrocitov možganske skorje pri okužbi s Toxoplasma gondii ===
Toxoplasma gondii je znotrajcelični zajedavec, ki ga lahko najdemo pri večini vrst toplokrvnih živali. Tudi človek ni izjema, okužena pa naj bi bila kar tretjina svetovne populacije. V zdravih ljudeh to ne predstavlja nevarnosti, saj lahko zdrav organizem popolnoma ustavi razmnoževanje Toxoplasma gondii in prepreči s tem zajedavcem povezano bolezen toksoplazmozo. Bolezen je nevarna samo za ljudi z oslabljenim imunskim sistemom in za nosečnice (Toxoplazma gondii lahko okuži tudi otroka in povzroči hude deformacije).
Pri tem zajedavcu je znano , da lahko spremeni obnašanje miši in podgan, vendar do sedaj mehanizem teh sprememb v obnašanju še ni bil znan. Nedavna raziskava je pokazala, da ob infekciji s Toxoplasma gondii v celicah potečejo določene spremembe. Spreminjati se začne izražanje genske kode, koncentracije proteinov in oblika proteinov. Do danes točen mehanizem še ni znan, možna pa je povezava z eno od post-translacijskih sprememb na proteinih: acetilacijo lizina.
Študija, na osnovi katere sem napisal svoj seminar je izvedla raziskavo proteoma astrocitov možganske skorje v miših (Rattus norvegicus), poiskala število proteinov, ki so vsebovali lizin z acetilno skupino in dokumentirala natančne položaje teh lizinov na vsakem izmed proteinov, nato pa podobno raziskavo izvedla še na astrocitih okuženih s Toxoplasmo gondii in primerjala rezultate obeh raziskav.

=== Katja Brezovar: HIV nadzoruje svojo aktivnost neodvisno od gostiteljske celice ===
HIV je retrovirus, ki napada limfocite T, predvsem CD4+ T celice in spada pod skupino lentivirusov. Problematičnost zdravljenja HIV-a je posledica virusne latence, ki virusu omogoča dolgoročno prisotnost v gostiteljski celici, ne glede na dolgoletno izpostavljenost protiretrovirusnim zdravilom. Do nedavnega je veljalo prepričanje, da je latentnost virusa HIV odvisna od stanja celice – torej ali je celica v aktivnem ali mirujočem stanju. Sedaj je bilo, z računalniškim modeliranjem in sintetičnim kontroliranjem HIV Tat pozitivne povratne zanke, predstavljeno, da je latentnost virusa neodvisna od celičnega stanja. Avtonomnost virusnega delovanja nam pomaga pri razlagi zakaj agenti, ki naj bi prekinjali latentnost niso delovali – ti so to poskušali storiti z vplivom na celično stanje, ki pa po najnovejših raziskavah nima vpliva na virusno aktivnost. Razlaga, da je latenca posledica avtonomnega virusnega vezja, postavi tudi vprašanje kakšen je evolucijski izvor in pomen le te. Latenca naj bi bila evolucijska strategija, katere cilj je maksimalni virusni prenos in zmanjševanje virusnega izumrtja med mukoznimi okužbami. Razumevanje latence in tega, kaj jo nadzoruje predstavlja pomemben korak za iskanje novih pristopov k zdravljenju bolezni AIDS.

=== Urša Čerček: Odkrita struktura encima Dbr1 predstavlja nove možnosti za zdravljenje ALS in FTD ===
ALS in FTD sta neurodegenerativni bolezni, ki ju povzročata proteina TDP-43 in FUS. Do sedaj so odkrili le zdravilo, ki blaži njune učinke ne pozdravi pa bolezni v celoti. Že nekaj let nazaj so znanstveniki dokazali, da odsotnost encima Dbr1 zavira delovanje mutiranih proteinov TDP-43. Dbr1 hidrolizira 2',5'-fosfodiestersko vez v ciklični strukturi nekodirajoče mRNA imenovani lariat. Lariatna struktura deluje kot vaba, na katero se protein TDP-43 veže raje kot na prosto mRNA in tako prepreči škodljive interakcije, ki vodijo do pojava bolezni. Z uporabo inhibitorjev encima Dbr1, s katerimi bi preprečili razgradnjo lariatnih struktur in posledično zavrli delovanje toksičnih TDP-43, bi lahko zdravili ti dve do sedaj neozdravljivi bolezni. Da bi lahko našli primerne inhibitorje, so znanstveniki analizirali strukturo encima in tako poskušali dobiti boljši vpogled v njegovo funkcijo in najti povezave med funkcijo in strukturo. Ugotovili so, da se Dbr1 loči od ostalih, podobnih encimov v treh ključnih strukturnih lastnostih. Te so prisotnost LRL in posebne CTD skupine ter Cys14 ostanka v aktivnem mestu. Da bi do sedaj znana dejstva lahko uporabili za zdravljenje ALS in FTD so potrebne še nadaljnje raziskave, potrebno pa je tudi preveriti, kakšne posledice bi imela delna inhibicija encima Dbr1 in kako bi do nje prišli.

=== Niko Šetar: Preprečevanje širjenja raka z inhibicijo ERK1/2 kaskade ===
Rak je v splošnem definiran kot maligen tumor, ki nastane kot posledica pretirane rasti celic, ta pretirana rast pa je večinoma posledica okvare oz. mutacije v signalnih poteh celice. Iz tega razloga se večina do sedaj razvitih zdravil fokusira na inhibicijo teh signalnih poteh, praviloma v inhibicijo t.i. ERK1/2 kaskade, ki je odgovorna predvsem za proliferacijo in apoptozo svoje tarčne celice. Na primer, PLX4032, eno izmed najbolj razširjenih zdravil proti raku, inhibira ERK1/2 kaskado le specifično v primeru mutiranega proteina B-Raf, kar vključuje zelo ozek spekter rakov. Drugo zdravilo, U0126, pa inhibira ERK1/2 in MAPK kaskado že v zelo zgodnjih fazah kar vodi do nizke učinkovitosti in mnogih stranskih učinkov. Znanstveniki, ki so se ukvarjali z razvojem novega zdravila, so sintetizirali tri nove peptide, ki temeljijo na strukturi NTS (Nuclear Translocation Signal), peptid Scr (SPS), fosfomimetični peptid EPE in nefosforilabilni peptid APA, vsi izmed katerih naj bi preprečevali vezavo ERK2 na Importin 7 in s tem njegov vstop v jedro tarčne celice. Takšna pozna inhibicija naj bi bila bolj učinkovita kot zgodnejše, nudila zdravljenje širšega spektra rakov in imela manj stranskih učinkov. Izmed testiranih peptidov se je najbolje obnesel EPE, in do sedaj izvedeni eksperimenti tako v kulturi, kot na laboratorijskih miših s človeškimi tumorskimi ksenografti, so pokazali rezultate v prid tej hipotezi.

=== Aleksandra Uzar: Optogenetska aktivacija holinergičnih nevronov vzbuja REM fazo ===
Dober spanec je ključnega pomena, da lahko človeško telo pravilno deluje. Naraven spanec je sestavljen iz ciklov REM/non-REM faze, pri katerem je REM faza pomembna za učenje, sanjanje. Gre za intervale spanca za katerega je značilno hitro in naklučno premikanje oči. Cilj raziskave je bil ugotoviti, kakšni sta vloga in vpliv holinergičnih nevronov – nevroni, ki sproščajo nevrotransmiter acetilholin – na REM fazo. Osnova za raziskavo je bila optogenetika. To je metoda pri kateri aktivirajo določene nevrone s pomočjo svetlobo. Z izrazitvijo ionskega kanala rodopsina-2, ki se pod vplivom modre svetlobe aktivira (odpre), so s stimulacijami vplivali le na holinergične nevrone v PPT in LDT – strukturi v možganskem deblu. Raziskava je pokazala, da ti nevroni povzročajo REM fazo ter z daljšanjem stimulacij med non-REM fazo ugotovili, da se poveča število intervalov REM faze, vendar ne njihovo trajanje. S pomočjo sorodnih raziskav so ugotovitve pokazale, da naj bi bili holinergični nevroni v PPT in LDT pomembni sprožilci REM faze, ne pa glavni vzdrževalci. Raziskovalci poudarjajo, da je za potrditev potrebno več raziskav, saj so celotni mehanizmi faze se vedno dokaj nerazumljivi. S podrobnim znanjem o delovanju bi lahko ugotovitve aplicirali na ljudi s motnjami spanja.

=== Tadej Satler: Določanje zaporedja DNK s pomočjo grafena ===
V letih, odkar je bilo prvič znano celotno zaporedje človeškega genoma, je prišlo do hitrega razvoja tehnologije , ki omogočajo dobro analizo zaporedja DNK (imenovano "next-generation sequencing "). Ti novi pristopi k določanju zaporedja obljubljajo popolno genomsko analizo, ki bi bila izvajana s strani rutinske klinične diagnostike. Električni senzorji iz grafena lahko zaradi svoje izjemne občutljivosti zaznajo adsorbirane molekule na njegovi površini, na čemer temelji tudi zaznavanje zaporedja DNK, ki je odvisno od molekularno specifičnih interakcij s površino grafena. Tako lahko veliko hitreje, bolj zanesljivo, natančneje in ceneje določamo zaporedja DNK v primerjavi s trenutnimi metodami, kar vodi vposodobitev in razvoj raznih medicinskih raziskav in testov. Avstralski znanstveniki so to tudi dokazali, saj so s pomočjo grafena zaznali tri osnovne nukleotide, ki tvorijo DNK , ter jih prepoznali na podlagi specifičnih interakcij med grafitom in njimi. Na grafenu so posamezno izpostavili vse štiri osnovne dušikove baze, ki gradijo DNK (adenin, citozin, timin in gvanin) in opazovali učinke molekularne adsorpcije individualne baze na njem.

=== Samo Purič: Dešifrirana enigma virusne infekcije ===
Od rinovirusa, ki povzroča vsem znan prehlad, do virusa hepaptitisa C ali HIV-a, virusna obolenja v večini primerov povzročajo nelagodje, v nekaterih primerih pa huda bolezenjska stanja. Enoverižni RNA virusi (med katere spadajo zgoraj našteti) so se razvili med prvimi in še dandanes ostajajo med najnevarnejšimi za človekovo zdravje. Virusi so v osnovi zgrajeni iz nukleinske kilsine in proteinskega ovoja, ki ga imenujemo kapsida. Virus injecira svoj DNA/RNA v gostiteljsko celico in prevzame delovanje celotne celice za proizvodnjo novih virusov. Že desetletja razumemo, da mRNA nosi genetska navodila, ki omogočajo nastanek novih virusnih proteinov (tako kapsidnih kot tudi glikoproteinov ki tvorijo dodatno virusno ovojnico) potem ko virus vstopi v celico. Znastveniki iz univerz v Leedsu in Yorku pa so šele nedavno ugotovili, da se v zaporedju črk, ki jih uporabljamo za označevanje genetskih informacij, skriva šifra, ki narekuje kako se bo virus v gostiteljski celici ponovno sestavil. Do odkritja so prišli z opazovanjem enkapsidacije enoverižnega RNA virusa v zunanjo lupino/ovojnico nato pa so sestavili matematične algoritme s katerimi so razbili šifro in posledično razvili računalniški model, ki je sposoben dešifrirati zaporedja rastlinskih virusov. Ob tem so raziskovalci naredili še korak naprej in namignili na možnost razvijanja molekul, ki bi interfirale z kodo in efektivno ustavile delovanje virusa.

=== Lija Srnovršnik: Zaviranje rasti tumorjev z rušenjem strukture tumorskega stromalnega mikrookolja ===
Mednarodna ekipa znanstvenikov je dokazala, da protitelo za protein EphA3, ki ga najdemo v mikrookolju trdnih oblik raka, učinkuje proti tumorjem. EphA3 je v zdravih organih prisoten, ko se zarodek razvija, v odraslih tkivih pa je prisoten v krvnih rakavih obolenjih ter v trdnih tumorjih in je lahko pristop, ki temelji na učinku protiteles, primerna terapija za trdne oblike tumorjev. Celice tumorja pošiljajo okoliškim celicam signale, ko potrebujejo zalogo krvi in temeljno strukturo, na kateri se potem širijo. Raziskava je dokazala, da stromalne matične celice, v katerih je izražen EphA3 in nastajajo v kostnem mozgu, oblikujejo celice, ki podpirajo in ustvarijo krvne žile v tumorjih. V mišje modele so vstavili človeške celice raka prostate, da bi poustvarili potek bolezni v ljudeh. EphA3 so našli v stromalnih celicah in žilah v okolici tumorja. Opazovali so tudi zdravljenje s protitelesom proti EphA3 (chIIIA4), ki je vidno upočasnilo rast tumorjev. Protitelo je poškodovalo tumorjeve žile in porušilo stromalno mikrookolje, celice so odmrle, saj je bila poškodovana njihova življenjska funkcija. Napad EphA3 s protitelesi je tako možna terapija za zmanjšanje ter uničenje tumorjev in krvnih rakavih bolezni.

=== Sara Tekavec: Cistična fibroza: odkrita dodatna okvara imunskega sistema ===
Cistična fibroza je avtosomna recesivna genetska bolezen, kar pomeni, da se v potomcu bolezen izrazi le v primeru homozigotnega stanja, ko sta kopiji gena identični. Bolezen se pojavi kot posledica mutacije gena CFTR, ki kodira zapis za membranski protein CFTR. Slednji je odgovoren za prehajanje kloridnih ionov v zunajcelični prostor. Ker se na različne organe (predvsem pljuča, trebušno slinavko, črevesje) nalaga gosta, lepljiva sluz so le-ti podvrženi kroničnim okužbam, delovanje imunskega sistema pa kmalu postane neučinkovito. Delovanje imunskega sistema so preučevali tudi nemški raziskovalci. Odkrili so dodatno okvaro, in sicer zmanjšano izražanje molekul HLA-DQ. Te spadajo v skupino poglavitnega histokompatibilnostnega kompleksa (PHK) razreda II in imajo nalogo razločevanja med lastnimi in tujimi antigeni ter predstavljanja le-teh celicam pomagalkam. V poskusih uporabljena tehnika je bila pretočna citometrija, s katero so merili izražanje molekul HLA-DQ na monocitih, makrofagih, dendritičnih celicah ter raven prepisovanja mRNK za obe podenoti molekule HLA-DQ. Z raziskavo so odkrili tudi del molekularnega mehanizma, na katerem temelji imunski odziv. Vsi testi so pokazali, da je izražanje molekul HLA-DQ pri bolnikih s CF močno zmanjšano, v nekaterih primerih celo odsotno. To je v neki meri mogoče razložiti z zmanjšanim odzivom gena CIITA na signale kot je npr. IFNγ, ki so ga uporabili pri analizi. Glede na to, da je bolezen za zdaj še neozdravljiva in je z respiratorno fizioterapijo možno le lajšanje simptomov, bo potrebnih še veliko raziskav, ki bi pripomogle k razvoju tehnik zdravljenja.

=== Klara Kuret: Novo odkriti biosenzor omogoča vpogled v delovanje rastlinskega obrambnega sistema ===
Rastline na biotske in abiotske strese odgovarjajo z raznimi obrambnimi mehanizmi. Znanstveniki so sintetizirali nov biosenzor Jas9-VENUS, s katerim lahko v času in planta sledijo rastlinskemu odzivu na poškodbo. Biosenzor (BS) je molekula, ki je sposobna pretvoriti neko dogajanje v celici v signal, ki ga lahko zaznamo. BS mora odgovarjati specifično na svojo tarčo, dajati kvantitativne podatke o dogajanju v organizmu ter zagotavljati dinamično in prostorsko sledenje dogajanja in vivo. Jas9-VENUS je fluorescentni protein, ki deluje kot BS za fitohormon jasmonično kislino (JA) ter njene derivate jasmonate. Jas9-VENUS so uspeli sintetizirati s translacijsko fuzijo iz zapisa za protein JAZ9, kateri zavira transkripcijske faktorje, ki se odzivajo na JA. JAZ9 se zaradi specifičnega zaporedja aminokislin (imenovanega Jas domena) ob prisotnosti JA razgrajuje prek proteosoma, kar vodi v sprostitev transkripcijskih faktorjev, povečano ekspresijo JA-odzivnih genov ter posledično do aktivacije ustreznih obrambnih odgovorov rastline. Ker se zaradi analogije s proteinom JAZ9 ob prisotnosti JA razgrajuje tudi novo sintetizirani BS, lahko z njim merimo koncentracijo JA v rastlinskih organih, tkivih in celicah. Kjer je koncentracija JA največja, bo rumena fluorescenca Jas9-VENUS najmanjša. Biosenzorji so pomembno orodje za preučevanje signalizacije znotraj organizmov. Na podlagi poznavanja le te, bo mogoče v prihodnosti vzgajati poljščine, ki bodo bolj odporne proti biotskim ter abiotskim stresom.

=== Neža Koritnik: Vpliv nekodirajoče DNA na tvorbo raka: interakcije na dolge razdalje ===
V molekuli DNA je le 2% področja, ki vsebuje gensko informacijo. Preostalih 98% t.i. nekodirajoče DNA pa naj ne bi imelo nobenega vpliva na izražanje genov. Glede na zadnje raziskave pa to ne drži popolnoma. Odkrili so, da ima nekodirajoča DNA vseeno posreden vpliv na gensko ekspresijo - preko DNA zank. Mutacije, ki se pojavijo v nekodirajočem delu, lahko na dolge razdalje efektirajo transkripcijo RNA, če so locirane ob sekvencah, ki se vežejo z regulatornimi elementi transkripcije. Že prej je bilo ugotovljeno, da eno-nukleotidne mutacije (SNP-ji), ki kodirajo kompleksne bolezni velikokrat ležijo ob takšnih sekvencah. S tvorjenjem zank se zbližajo oddaljeni predeli molekule DNA. Če se zbližajo sekvence promotorjev in ojačevalcev (na te sekvence se vežejo proteini, transkripcijski faktorji, ki regulirajo delovanje RNA-polimeraze II), se to odraža v ekspresiji genov. Znanstveniki so s z metodo cHi-C opazovali interakcije na dolge razdalje v nekodirajočem delu genoma na 14 SNP-jih povezanih z nastankom raka na debelem črevesju. SNP-ji, locirani ob regulatornih elementih, lahko preko zank interagirajo z oddaljenimi transkripcijskimi faktorji. Zanke jim dovoljujejo, da vplivajo na transkripcijo v oddaljenih kodirajočih delih genoma, kar se na koncu odraža v rakavem obolenju črevesja.

=== Urša Kopač: Protein SOD5 prisoten v obrambnem sistemu gliv ===
Znanstveniki iz univerze Johns Hopkins v Baltimoru so odkrili, kako se patogene glive odzovejo na ovire, ki jih predstavlja gostiteljev imunski sistem. Obrambni mehanizem predstavljajo membranski proteini, ki so podobni Cu|Zn superoksid dismutazam (SOD). Predvsem so raziskovali protein vezan v celično steno: SOD5 iz Candida albicans. Proteini SOD5 se od Cu|Zn SOD encimov (npr. SOD1) razlikujejo že v sami primarni zgradbi. Razlikujejo se po tem, da v njih ni dveh od štirih histidinov, ki tvorijo kompleks s cinkom, manjka tudi 17 aminokislinskih ostankov, ki pri SOD1 tvorijo elektrostatsko zanko. To se nato odraža v 3D strukturi proteina. SOD5 ima v primerjavi s SOD1na C-koncu še devet dodatnih aminokislinskih ostankov, ki služijo kot GPI pritrdišče na celično steno. Proučevanje kristalne strukture je pokazalo, da je SOD5 monomer v nasprotju z dimernimi oz. tetramernimi SOD1 in EC-SOD. Razlog je razširitev disulfidne zanke in posledičnih steričnih interakcij. Gostitelj se pred invazivnimi mikrobi brani tudi s povečano, toksično količino bakrovih ionov. Na SOD5 to ne vpliva, saj velike količine bakra izkoristi sebi v prid in se iz neaktivnega apo-stanja pretvori v aktivno obliko. Zgradba SOD5 je posebna kar se tiče kofaktorjev – stran proteina, kjer se nahaja baker je zelo odprta in dostopna, cinkovega kofaktorja v tej vrsti encimov sploh ni. Te posebnosti bi bile lahko ključne pri razvoju novih zdravil in tehnik zdravljenja proti patogenim glivam in ostalim invazivnim organizmom.

=== Katja Čop: Ključna vloga proteina RBFox2 pri srčnem popuščanju ===
Kaj je ključni dogodek na molekularni ravni, ki privede do točke, ko srce ni več zmožno zadostno opravljati svoje funkcije, je bilo do sedaj še precej neraziskano. Moja izbrana raziskava se je osredotočila na protein RBFox2, poznan kot pomemben za razvoj in funkcijo srca. Želeli so raziskati, če je možno, da pripomore tudi k tako imenovani dekompenzaciji-oslabljeni zmogljivosti organa, ki privede do srčnega popuščanja. Raziskave so izvajali na miših. V prvem sklopu so izvedli dva poskusa. Najprej so s tehniko TAC v srcu vzpostavili podobne pogoje, kot nastanejo pri srčnem popuščanju in izkazalo se je, da se je količina RBFox2 zmanjšala. Pri drugem poskusu pa so miši utišali gen za RBFox2 in pojavili so se značilni bolezenski znaki predhodnega stanja srčnega popuščanja. Ta dva izida so želeli razložiti in povezati s še enim znanim dejstvom; da je RBFox2 znan kot regulator alternativnega izrezovanja. Po drugem sklopu raziskav se je izkazalo, da sta dogodka povezana, pa tudi, da je RBFox2 ključni regulator, ob čigar odsotnosti se celoten program alternativnega izrezovanja v nekaterih genih, pomembnih v različnih srčnih funkcijah obrne v nasprotno smer, kot je potekal v prvem mesecu življenja miši, ko se je srce krepilo.

=== Kristjan Stibilj: Uporaba nanožicno-bakterijskih hibridov pri samostojni svetlobno odvisni fiksaciji CO2 na umetne organske spojine ===
Fotosinteza je biokemijski proces, ki je nujen za preživetje vseh živih bitij na našem planetu. Rastline letno izkoristijo 130TW sončne energije, ki jo pretvorijo v kemično energijo. Znanstveniki iz univerze v Berkley-ju so uspeli poustvariti ta proces z uporabo nanožično-bakterijskega hibrida. Anaerobne bakterije S. ovata so nacepili direktno na silicijeve nanožičke, ki so služile kot fotokatoda, za fotokanodo pa so uporabili TiO2 , na kateri je ob osvetljevanju s svetlobo nastajal kisik. Tako zasnovana naprava imitira naravni kompleks dveh fotosistemov, ki se nahajata na tilakoidni membrani , kjer poteka fotosinteza. Bakterije S. ovata lahko z uporabo vodika kot donor elektrona preko Wood-Ljungdhalove poti uspešno pretvorijo CO2 v acetat, ki pa se nato v gensko sintetizirani in modificirani E. Coli lahko pretvori v acetil-CoA, ki je pomembna molekula za sintezo številnih biokemijskih polimerov. Z različnimi modifikacijami bakterije E. coli so znanstveniki sintetizirali n-butanol, PHB polimer, amorfadien, epi.aristolocen in kadinen. S tem so dokazali, da je mogoče izkoriščati sončno energijo za direktno sintezo molekul in tako na nek način poustvariti fotosintezo. Za enkrat je izkoristek sončne energije in posledično koncentracija produktov še precej nizka, vendar je trenuten razvoj usmerjen k povečanju izkoristka.

=== Lara Jerman: Dedovanje: ni za vse kriva DNA ===
Celični genom – celokupna DNA celice – je razdeljen na enega ali več kromosomov, ki organizirajo, shranjujejo in prenašajo informacije za sintezo proteinov in RNA molekul. Kromosom je sestavljen iz kromatina – kompleksa DNA, proteinov (histonov) in RNA. Poznamo evkromatin (aktivna transkripcija) in heterokrimatin (bolj zgoščen, utišan). Posttranslacijske modifikacije histonov v kromatinu naj bi omogočale epigenetski prenos kromatinskih stanj. Metilacija lizina 9 na histonu 3 je nujna za tvorbo heterokromatina, a dosedaj še ni bila dokazana njena dednost. Organizem S. Pombe ima za eno samo metiltransferazo, Clr4, ki usmerja vso metilacijo na tem mestu in ves heterokromatin. Znanstveniki z Univerze v Edinburghu so z uporabo pritrjanja in sproščanja Clr4 na evkromatin ugotovili, da v celici poteka aktiven proces, ki briše metilacijo na tem mestu. Ob inaktivaciji domnevne demetilaze Epe1 sta metilacija in utišanje (tvorba heterokromosoma) trajna in se ohranita skozi več mitotskih delitev in mejozo, tudi ob izgubi začetnega faktorja priptrjene Clr4 . Metilacija na tem mestu je torej epigenetsko dedna, njen prenos pa je običajno onemogočen z aktivnom procesom. Tak se preprečuje naključno dedovanje heterokromatina in s tem nenamerno utišanje genov.

=== Miha Koprivnikar Krajnc: Boj za železo ===
Kovine oziroma kovinski ioni so izrednega pomena za organizme, saj se vključujejo v življenjsko pomembne proteine proteine. Zato je odstranjevanje prostih (serumskih) kovinski ionov in njihovo shranjevanje v celice bistvenega pomena pri imunskem odzivu, saj s tem organizem odtegne patogenom nujno potrebne kofaktorje metaloproteinov in s tem zavira proliferacijo takih organizmov. Bistven igralec pri tem je hepcidin, protein, ki inaktivira eksporter železa feroportin in s te povzroči kopičenje železa v določenih celicah in pomanjkanje le-tega v medceličnini. Hepcidin je sprožen kot odziv na stimuliran TLR4, ki zazna molekule patogenov. Vendar pa so raziskovalci odkrili, da se da feroportin utišati neposredno, in sicer s stimulacijo TLR6 z lipoproteinom FSL1. In ker je ta, novi, odziv neposreden je tudi hitrejši in zato bolj primeren pri vnetjih za zatiranje rasti bakterij in drugih škodljivih organizmov. Z izsledki raziskav se odpirajo vrata zdravljenjem boleznim, kot sta hemokromatoza in beta talasemija, pri katerih je v tkivih železa preveč in ima toksičen učinek.

TBK2015-seminar

2015-05-03T14:57:44Z

Miha Koprivnikar Krajnc: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prištejeh končnipisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.

== Seznam seminarjev ==
{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Klara Lenart||Permanentno označevanje nevronskih povezav||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150212141453.htm||10.03.||13.03.||16.03.||Maja Zupanc||Matej Hvalec||Urša Kopač
|-
| Uroš Zavrtanik||Popravljalni mehanizem DNA (NER)||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/01/150128141423.htm||10.03.||13.03.||16.03.||Eva Rajh||Lara Jerman||Neža Koritnik
|-
| Blaž Lebar||Preučitev imunskega odziva komarja po piku||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150206174850.htm||10.03.||13.03.||16.03.||Elvira Boršić||Kristjan Stibilj||Katja Čop
|-
| Gašper Žun||Antibiotiki uničujejo bakterije z okvaro izgradnje celične stene||http://www.sciencedaily.com/releases/2014/12/141205114011.htm||17.03.||20.03.||23.03.||Nejc Kejžar||Samo Smole||Klara Kuret
|-
| Rok Miklavčič||Kontrola prenašalnih RNA na CCA-dodajajočem encimu||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/01/150129151612.htm||17.03.||20.03.||23.03.||Tilen Tršelič||Miha Koprivnikar Krajnc||Matej Hvalec
|-
| Simon Aleksič||Zorenje mRNA pri lignjih zaznamujejo A-I deaminacije ||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150212114327.htm||17.03.||20.03.||23.03.||Klara Lenart||Maja Zupanc||Lara Jerman
|-
| Tjaša Lukšič||Ključne biološke funkcije skakajočih genov||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150219133102.htm||17.03.||20.03.||23.03.||Uroš Zavrtanik||Eva Rajh||Kristjan Stibilj
|-
| Špela Malenšek||Smo zaradi endogenih retrovirusov pametnejši?||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/01/150112093129.htm||24.03.||27.03.||30.03.||Blaž Lebar||Elvira Boršić||Samo Smole
|-
| Ema Gašperšič||Dvojedrni bakrov kompleks naj bi preprečil širjenje raka||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/03/150302071134.htm||24.03.||27.03.||30.03.||Gašper Žun||Nejc Kejžar||Miha Koprivnikar Krajnc
|-
| Tilen Tršelič||Transport proteinov v celico s pomočjo nanodelcev||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/01/150108141444.htm||24.03.||27.03.||30.03.||Miha Koprivnikar Krajnc||Klara Kuret||Samo Purič
|-
| Gašper Virant||Vezava agonista na adenozinske receptorje lajša kronično bolečino||http://www.sciencedaily.com/releases/2014/11/141126132639.htm||24.03.||27.03.||30.03.||Simon Aleksič||Klara Lenart||Eva Rajh
|-
| Manca Zupan||||||07.04.||10.04.||13.04.||Tjaša Lukšič||Uroš Zavrtanik||Elvira Boršić
|-
| Urša Čerček||Odkrita struktura encima Dbr1 predstavlja nove možnosti za zdravljenje ALS in FTD ||http://www.sciencedaily.com/releases/2014/09/140911094721.htm||07.04.||10.04.||13.04.||Špela Malenšek||Blaž Lebar||Nejc Kejžar
|-
| Katja Brezovar||HIV nadzoruje svojo aktivnost neodvisno od gostiteljske celice||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150227112749.htm||07.04.||10.04.||13.04.||Ema Gašperšič||Gašper Žun||Tilen Tršelič
|-
| Lovro Kotnik||Acetilacija lizina in spremembe v proteomu astrocitov možganske skorje pri okužbi s Toxoplasma gondii||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/03/150318153918.htm||07.04.||10.04.||13.04.||Petra Hruševar||Rok Miklavčič||Klara Lenart
|-
| Maruša Grošelj||||||14.04.||17.04.||20.04.||Gašper Virant||Simon Aleksič||Uroš Zavrtanik
|-
| Tadej Satler|| Določanje zaporedja DNK s pomočjo grafena ||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/03/150330095403.htm||14.04.||17.04.||20.04.||Manca Zupan||Tjaša Lukšič||Blaž Lebar
|-
| Aleksandra Uzar||Vzbujanje REM faze z aktivacijo holinergičnih nevronov||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150203123423.htm||14.04.||17.04.||20.04.||Urša Čerček||Špela Malenšek||Gašper Žun
|-
| Niko Šetar||Preprečevanje širjenja raka z inhibicijo ERK1/2 kaskade.||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/03/150330122615.htm||14.04.||17.04.||20.04.||Katja Brezovar||Ema Gašperšič||Rok Miklavčič
|-
| Lija Srnovršnik||Zaviranje rasti malignih tumorjev z oviranjem tumorskega stromalnega mikrookolja||http://www.sciencedaily.com/releases/2014/08/140815102231.htm||24.04.||30.04.||04.05.||Lovro Kotnik||Petra Hruševar||Simon Aleksič
|-
| Sara Tekavec||Cistična fibroza: odkrita dodatna okvara imunskega sistema||http://www.sciencedaily.com/releases/2014/09/140904084508.htm||24.04.||30.04.||04.05.||Maruša Grošelj||Gašper Virant||Tjaša Lukšič
|-
| Jaka Kos||||||24.04.||30.04.||04.05.||Tadej Satler||Manca Zupan||Špela Malenšek
|-
| Samo Purič||Desifrirana enigma: virusne infekcije||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150204075224.htm||24.04.||30.04.||04.05.||Aleksandra Uzar||Urša Čerček||Ema Gašperšič
|-
| Urša Kopač||Protein SOD5 prisoten v obrambnem sistemu gliv||http://www.sciencedaily.com/releases/2014/04/140416143311.htm||05.05.||08.05.||11.05.||Niko Šetar||Katja Brezovar||Petra Hruševar
|-
| Neža Koritnik||Vpliv nekodirajoče DNA na tvorbo raka: interakcije na dolge razdalje||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150219090349.htm||05.05.||08.05.||11.05.||Lija Srnovršnik||Lovro Kotnik||Gašper Virant
|-
| Katja Čop||Ključna vloga proteina RBFox2 pri srčnem popuščanju||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/03/150305125144.htm||05.05.||08.05.||11.05.||Sara Tekavec||Maruša Grošelj||Manca Zupan
|-
| Klara Kuret||Novo odkriti biosenzor omogoča vpogled v delovanje rastlinskega obrambnega sistema||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/01/150116115436.htm||05.05.||08.05.||11.05.||Jaka Kos||Tadej Satler||Urša Čerček
|-
| Matej Hvalec||||||12.05.||15.05.||18.05.||Samo Purič||Aleksandra Uzar||Katja Brezovar
|-
| Lara Jerman||||||12.05.||15.05.||18.05.||Urša Kopač||Niko Šetar||Lovro Kotnik
|-
| Kristjan Stibilj|||||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/04/150416132638.htm||12.05.||15.05.||18.05.||Neža Koritnik||Lija Srnovršnik||Maruša Grošelj
|-
| Samo Smole||||||12.05.||15.05.||18.05.||Katja Čop||Sara Tekavec||Tadej Satler
|-
| Miha Koprivnikar Krajnc||Boj za železo||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150206111519.htm||19.05.||22.05.||25.05.||Klara Kuret||Jaka Kos||Aleksandra Uzar
|-
| Maja Zupanc||||||19.05.||22.05.||25.05.||Matej Hvalec||Samo Purič||Niko Šetar
|-
| Eva Rajh||||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/03/150323162358.htm||19.05.||22.05.||25.05.||Lara Jerman||Urša Kopač||Lija Srnovršnik
|-
| Elvira Boršić||||||19.05.||22.05.||25.05.||Kristjan Stibilj||Neža Koritnik||Sara Tekavec
|-
| Nejc Kejžar||Novi 'pametni' inzulin||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150209161141.htm||26.05.||29.05.||01.06.||Samo Smole||Katja Čop||Jaka Kos
|-
| Petra Hruševar||||||26.05.||29.05.||01.06.||Rok Miklavčič||Tilen Tršelič||Maja Zupanc
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2014. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete v PubMed povezavi [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ tukaj]
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2015 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
* TBK_2015_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2015_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2015_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2015_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2015_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2015_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2015_Guncar_Gregor.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).'''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.