Wiki FKKT - User contributions [en]

StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov:

2019-01-16T09:15:49Z

Milena Stojkovska: /* Pretvorba glukoze v StyGreen */

''StyGreen'' je projekt študentske ekipe iz Groningena, Nizozemska s katerem so se predstavili na IGEM 2018 tekmovanju. Namen projekta je proizvodnja eko-stirena v organizmu ''S.cervisiae'' z uporabo odpadne celuloze kot obnovljiv vir.

==UVOD==

Proizvodnja veliko kemikalij je na podlagi fosilnih goriv ki so omejen resurs v svetu. Kot že vemo in se veliko govori da ti resursi se bojo popolnoma izkoristili v naslednjih nekolk 10-ih letih, zato je velika poudarjenost da jih zamenjamo z bio-obnovljivimi resursi in trajnostnih proizvodnih procesov. Ta projekt se zalaga za razvoj bio-gospodarstva da bi imeli bolj zelen planet preko raziskave in razvoja alternativnih poteh. Eden od njih je alternativna proizvodnja stirena.
Monomerni stiren je osnova za proizvodnjo plasticnih polimerov kot so akrilonitrilni butadien stiren (ABS), guma iz stiren butadiena ali prečnopovezanega polistirena. Nepolarna in aromatična struktura stirenov omogoča želenih fizičnih, kemijskih in električnih lasnotsti ki jih ne moremo dobiti pri drugih materijalih. Imajo širok spekter uporabe kot so LEGO kocke, industrijske gume, kolesarske gume ali izolacijski materiali v elektronskih napravah. V zadnjih 70 letih so izdelki iz stirena postali del našemu življenju in so nenadomestljivi za številne industrijo. Zato se bo povpraševanje po stirenu neizogibno hitro začelo. Razvoj alternativne proizvodne poti je zato izjemno pomemben.

----

== PRISTOPI SINTEZNE BIOLOGIJE K PROIZVAJANJU StyGreen IZDELKA ==

S pomočjo SB lahko izkoristimo mikroorganizme ki nam bojo tvorili željeno spojino, kaj predstavlja močno tehnologijo v znanosti. Stiren je podoben ''Phe'', ki pa je prisoten v živih bitij in omogoča da je to pravi prekurzor v njegovi sintezi v kvasovki. Stiren se bo konstitutivno proizvajal in ta produkt so poimenovali ''StyGreen''-alternativno narejen stiren.

Mikroorganizmi lahko rastejo na sladkorjih ali odpatkih ki vsebujejo veliko sladkorjev v formi glukoznih polimerov ki jim rečemo celuloza. Cilj je ustvariti sistem bioprocesiranja s kombiniranjem vseh potrebnih korakov za pretvorbo celuloze v stiren v eni robustni celični tovarni. Molekule StyGreen-a, ki se bojo tvorile, lahko nato se uporabijo v vseh vrstah konvencionalnih industrijskih procesov, ki se nanašajo na plastiko, ki ni namenjena eni sami uporabi. Na ta način hkrati zagotavljamo trajnostno razpoložljivost stirena in zeleni planet za prihodnje generacije.

V procesu načrtovanja poti od celuloze do stirena, morajo se upoštevati veliko dejavnikov. Obstajajo nekolk načinov za razpada celuloze, metabolnih poteh do tvorbo stirena in zanimivih izvirov celuloze.

----

==='''Kaj je dober vir celuloze ?'''===

Ker je celuloza pogost vir iz narave, veliko organskih materij jo vsebujejo v veliki količini. V potragi po idealnem viru celuloze pomembni dejavniki so: široka razpoložljivost, primernost za načrtovani sistem, finančna izvedljivost in nekonkurenčnost z hrano. Podrobno raziskovanje različne vire biomase, je pokazalo da so primerni tri možni vir: les, alge in toaletni papir.

Celulozni vir, kot je rabljeni toaletni papir imajo nizko kakovost celuloznih nitk, zaradi česar so neprimerni za mnoge običajne postopke recikliranja. Zato je ta odpadni material težje valorizirati kaj pravi da je zanimiva surovina za tvorbo stirena z gospodarskega in ekološkega vidika. Do sedaj je zelo malo aplikacij za uporabljene toaletne papirje iz kanalizacije. Podjetje KNN proizvaja izdelek, imenovan ''Recell®'', ki je očiščen toaletni papir-filtriran iz kanalizacije. Ta proces lahko močno poveča vrednost novo razvitega materiala, zaradi česar je zanimiv celulozni vir ki se lahko uporabi za tvorbo stirena.<ref name="prvi" />

----

==='''Razpad celuloze na glukozne enote'''===

''S. cerevisiae'' sama ne more razgraditi celulozo na glukozne enote. Zato je nujno izražanje encimov, imenovanih celulaze, ki razbijejo ''β''-(1,4)-glikozidne vezi med molekulami glukoze v celulozi. Te celulaze so različne in kombinacija treh lahko učinkovito razgradi celulozo: ''endoglukanaza'', ''celubiohidrolaza'' in ''β-glukozidaza''. V prejšnjih študijah so se dokazali, da ta tri encima tvorijo dobro skupino za razgradnjo celuloze.<ref name="drugi" />

Dodatno, celice uporabljajo glukozo kot substrat, torej bližji so encimi celicam, hitreje se glukoza pretvori v stiren. Da bi to postigni naredili so mini-celulosomni kompleks ki vsebuje vse tri encime pripenjene na enem ogrodju preko dockerina z kohezijsko domeno, ki je nato pritrjen na celično steno kvasovke. Gradbeno ogrodje (CipA3) je pripeto na kvasovkin receptor za parjenje AGA2. <ref name="tretji" />

----

==='''Pretvorba glukoze v StyGreen'''===

Naslednja stopnja je tvorba stirena preko nekolk korakov ki se odvijajo v celici. Da bi se glukoza pretvorila v stiren, najprej je nujno vključiti se v glikolizi, pretvoriti se v fosfoenolpiruvata (PEP) ki potem se pretvori v Phe preko šikimi metabolne poti. Da bi se pretvoril Phe v trans-cinamat, potreben je katalizator ''fenilalanin amonum liaza 2.'' (PAL2) Naslednja stopnja je pretvorba trans-cinamata v stiren preko endogenega encima ''dekarboksilaza ferulne kisline 1''. (FDC1) Za večjo tvorbo stirena je bil izbran PAL2 encim iz ''A. Thaliana'' ker je bil najaktivnejši in so bili že poskusi z njim pri delu s kvasovkami. <ref name="četrti" />
----

==='''Kako narediti GSO kvasovke za to nameno?'''===

Namesto da bi v celici dali več plazmidov, ki vsebujejo zaporedje celulaze, ogrodja in PAL2, bila je predlagana uporaba ''CRISPR-Cas9'' v kombinaciji s homologno rekombinacijo za uvedbo celotnega sistema v genom in tako narediti bolj stabilni celulosom. Poleg tega bi to odpravilo zapletene korake kloniranja, ki so potrebni za ustvarjanje velikih plazmidov. Z uporabo te strategije se lahko istočasno preoblikujejo več genov (tri celulaze, ogrodje in PAL2), nato pa bo potekala homologna rekombinacija na mestu preloma dvojne verige od CRISPR-Cas9. Uporaba CRISPR-Cas9 ima dodatno korist, ker tudi odpravlja potrebo po dodajanju antibiotikov ali aminokislin na rastni medij.

Začetni mini-celulozni ekspresijski sistem je pod nadzorom promotorjev galaktoze kaj prepreči rast na celuloznih odpadkov. Sistem rabi galaktozo da se začne izražanje, a promotorji galaktoze so regulirani z negativno povratno zanko preko glukoze. Posledično celulosom bo zmanjšal takoj svojo ekspresijo. Za odpravo te težave je bil izbran promotor TEF1 ki ima lasnosti izražanja na visoki stopnji.<ref name="peti" />

----

==='''Kako poteka celotni proces ?'''===

Ker je sam projekt zamišljen da bi potem delal na veliko industrisko stopnjo, naredili so sistem bioreaktorja ki bo proizvajal StyGreen. Mini tovarna bo imela tri oddelka : celulozno preprocesiranje, glavni bioreaktorni rezervoar in odelek za čiščenje stirena.

1.Celulozno predprocesiranje se izvaja v mlinu z žogicami kot pri KNN celulozi (Recell®). Sam proces ne uporablja močne kemikalije in zviša topljivost celuloze tako da je
celulosom učinkovejši.

2.V glavnem bioreaktorju je konstantna proizvodnja stirena. Vsebuje dvofazni medij iz vode in nepolarnega topila ki je etil acetat ker ima pravo gostoto. (ne tvori micele in ne
denaturira proteine kot bi druga topila) Stiren ki se tvori ima afiniteto za nepolarno okolje (log P=2,7) in zato je v organski fazi. Razlike v gostoti omogočajo ločitev med
fazami, organska faza se lahko nato izloči in se pripelje do mesta za čiščenje stirena.

3.V delu kje je čiščenje stirena, organska faza je reverzno sprana z vodo da bi se izgonili polarnih nečistoč. Ta voda gre nazaj v bioreaktorju da ne pride do zagube. Etil acetat
se upari na srednji vakuum, pa se reciklira v glavnem bioreaktorju, pričemer dobimo stiren v olju. Stirena iz te zmesi očistimo z uparjanjem pod močnejšim vakuumom, ostanek olja
se reciklira v rezervoarju. Ko biomasa kvasovk v številnih rezervoarjih preseže idealne pogoje za fermentacijo, jo lahko izpustimo in recikliramo v nov medij, saj YPD medij
vsebuje ekstrakt kvasovk. Zato vse, kar se odstrani iz rezervoarja, razen stirena, se vrne nazaj v rezervoar. To je industrijski postopek, ki ustvarja zelo malo odpadkov, medtem
prinaša znatne količine stirena.<ref name="šesti" />

Proizvoni obrat zahteva konstantni vnos celuloznega medija, malo vnosa vode in etil acetata, mešanje in hlajenje.

----

==='''Detekcija stirena s RP-HPLC UV DAD'''===

Bilo je proverjeno če je celotni proces resno naredil stirena kot končni produkt s pomočjo ''RP-HPLC-DAD''. HPLC metod za detekcijo stirena je uporabil metanol in vodo kot mobilna faza ki je bila gradientna. Določili so retencijski čas stirena v teh pogojih ob 17,5 min. Seve so gojili dva dni na gojišču z ''2%'' glukoze in ''0,5 g / L'' fenilalanina (L-fenilalanina) kaj je omogočalo hitrejšo tvorbo stirena.

Pripravili so štiri različne kulture:

a. kontrolo s fenilalaninom (Ctrl),
b. sev, ki je vseboval PAL2 s fenilalaninom (PAL2 +),
c. sev, ki je vseboval PAL2 brez fenilalanina (PAL2-)
d. sev, ki je vseboval PAL2 in celulozo s fenilalaninom (PAL2 ++)

Po inkubaciji, celično kulturo so centrifugirali in supernatant dali na kolono.

Kot je razvidno iz slike,<ref name="sedmi" /> vrh opažen pri 17,5 min, kaže na tvorbo stirena v celicah. Drugi vrh pri 10 min, pa ni prisoten pri negativni kontroli, je trans-cinamat-prekurzor stirena. Očitno je da je vrh trans-cinamata večji od stirenskega kaj ukaže da je pretvorba trans-cinamata v stiren v tih pogojih omejena.

Pri stirenskem vrhu, lahko opazimo razlike med testiranimi sevi. Med vsemi tremi sevi, ki vsebujejo PAL2, je očitna razlika v primerjavi s kontrolo, kar kaže na uspešno proizvodnjo stirena. Primerjava PAL2 in PAL2 + kaže, da dodajanje fenilalanina ni potrebno da bi se začela sama transformacija v stiren. V spodnji tabeli je prikazan približek proizvedene količine stirena. Ti rezultati kažejo, da so uspešno proizvedli stiren v kvasovki iz glukoze.<ref name="sedmi" />

----

== ZAKLJUČEK ==

Zelo je pomembno ohraniti naš planet za generacije ki še prihajajo. Ekipa iz Groningena je naredila korak k temu z razvojem projekta StyGreen, saj pričakujejo da bo ta tehnologija spremenila trg plastike iz črne v zeleno. Lahko zaključimo da je to dobar način zmanjšanja uporabe fosilnih goriv v proizvodnji plastike, vendar pa še vedno nimamo rešitev za vprašanje ''» Kako se znebiti plastike?«
''

----
==VIRI==

<ref name="prvi" /> 1. http://www.knncellulose.nl/ pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="drugi" /> 2. Wen, F., Sun, J., & Zhao, H. (2010). Yeast surface display of trifunctional minicellulosomes for simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to ethanol. Applied and Environmental Microbiology, 76(4), 1251–60. http://doi.org/10.1128/AEM.01687-09

<ref name="tretji" /> 3. http://2018.igem.org/Team:Groningen/Model/Molecular_Dynamics ; pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="četrti" /> 4. McKenna, R., Thompson, B., Pugh, S., & Nielsen, D. R. (2014). Rational and combinatorial approaches to engineering styrene production by Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories, 13(1), 123. http://doi.org/10.1186/s12934-014-0123-2

<ref name="peti" /> 5. https://sites.tufts.edu/crispr/genome-editing/homology-directed-repair/ pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="šesti" /> 6. http://2018.igem.org/Team:Groningen/Applied_Design ; pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="sedmi" /> 7. http://2018.igem.org/Team:Groningen/Results ;pridobljeno dne 12.01.2019

StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov:

2019-01-16T09:15:27Z

Milena Stojkovska: /* Razpad celuloze na glukozne enote */

''StyGreen'' je projekt študentske ekipe iz Groningena, Nizozemska s katerem so se predstavili na IGEM 2018 tekmovanju. Namen projekta je proizvodnja eko-stirena v organizmu ''S.cervisiae'' z uporabo odpadne celuloze kot obnovljiv vir.

==UVOD==

Proizvodnja veliko kemikalij je na podlagi fosilnih goriv ki so omejen resurs v svetu. Kot že vemo in se veliko govori da ti resursi se bojo popolnoma izkoristili v naslednjih nekolk 10-ih letih, zato je velika poudarjenost da jih zamenjamo z bio-obnovljivimi resursi in trajnostnih proizvodnih procesov. Ta projekt se zalaga za razvoj bio-gospodarstva da bi imeli bolj zelen planet preko raziskave in razvoja alternativnih poteh. Eden od njih je alternativna proizvodnja stirena.
Monomerni stiren je osnova za proizvodnjo plasticnih polimerov kot so akrilonitrilni butadien stiren (ABS), guma iz stiren butadiena ali prečnopovezanega polistirena. Nepolarna in aromatična struktura stirenov omogoča želenih fizičnih, kemijskih in električnih lasnotsti ki jih ne moremo dobiti pri drugih materijalih. Imajo širok spekter uporabe kot so LEGO kocke, industrijske gume, kolesarske gume ali izolacijski materiali v elektronskih napravah. V zadnjih 70 letih so izdelki iz stirena postali del našemu življenju in so nenadomestljivi za številne industrijo. Zato se bo povpraševanje po stirenu neizogibno hitro začelo. Razvoj alternativne proizvodne poti je zato izjemno pomemben.

----

== PRISTOPI SINTEZNE BIOLOGIJE K PROIZVAJANJU StyGreen IZDELKA ==

S pomočjo SB lahko izkoristimo mikroorganizme ki nam bojo tvorili željeno spojino, kaj predstavlja močno tehnologijo v znanosti. Stiren je podoben ''Phe'', ki pa je prisoten v živih bitij in omogoča da je to pravi prekurzor v njegovi sintezi v kvasovki. Stiren se bo konstitutivno proizvajal in ta produkt so poimenovali ''StyGreen''-alternativno narejen stiren.

Mikroorganizmi lahko rastejo na sladkorjih ali odpatkih ki vsebujejo veliko sladkorjev v formi glukoznih polimerov ki jim rečemo celuloza. Cilj je ustvariti sistem bioprocesiranja s kombiniranjem vseh potrebnih korakov za pretvorbo celuloze v stiren v eni robustni celični tovarni. Molekule StyGreen-a, ki se bojo tvorile, lahko nato se uporabijo v vseh vrstah konvencionalnih industrijskih procesov, ki se nanašajo na plastiko, ki ni namenjena eni sami uporabi. Na ta način hkrati zagotavljamo trajnostno razpoložljivost stirena in zeleni planet za prihodnje generacije.

V procesu načrtovanja poti od celuloze do stirena, morajo se upoštevati veliko dejavnikov. Obstajajo nekolk načinov za razpada celuloze, metabolnih poteh do tvorbo stirena in zanimivih izvirov celuloze.

----

==='''Kaj je dober vir celuloze ?'''===

Ker je celuloza pogost vir iz narave, veliko organskih materij jo vsebujejo v veliki količini. V potragi po idealnem viru celuloze pomembni dejavniki so: široka razpoložljivost, primernost za načrtovani sistem, finančna izvedljivost in nekonkurenčnost z hrano. Podrobno raziskovanje različne vire biomase, je pokazalo da so primerni tri možni vir: les, alge in toaletni papir.

Celulozni vir, kot je rabljeni toaletni papir imajo nizko kakovost celuloznih nitk, zaradi česar so neprimerni za mnoge običajne postopke recikliranja. Zato je ta odpadni material težje valorizirati kaj pravi da je zanimiva surovina za tvorbo stirena z gospodarskega in ekološkega vidika. Do sedaj je zelo malo aplikacij za uporabljene toaletne papirje iz kanalizacije. Podjetje KNN proizvaja izdelek, imenovan ''Recell®'', ki je očiščen toaletni papir-filtriran iz kanalizacije. Ta proces lahko močno poveča vrednost novo razvitega materiala, zaradi česar je zanimiv celulozni vir ki se lahko uporabi za tvorbo stirena.<ref name="prvi" />

----

==='''Razpad celuloze na glukozne enote'''===

''S. cerevisiae'' sama ne more razgraditi celulozo na glukozne enote. Zato je nujno izražanje encimov, imenovanih celulaze, ki razbijejo ''β''-(1,4)-glikozidne vezi med molekulami glukoze v celulozi. Te celulaze so različne in kombinacija treh lahko učinkovito razgradi celulozo: ''endoglukanaza'', ''celubiohidrolaza'' in ''β-glukozidaza''. V prejšnjih študijah so se dokazali, da ta tri encima tvorijo dobro skupino za razgradnjo celuloze.<ref name="drugi" />

Dodatno, celice uporabljajo glukozo kot substrat, torej bližji so encimi celicam, hitreje se glukoza pretvori v stiren. Da bi to postigni naredili so mini-celulosomni kompleks ki vsebuje vse tri encime pripenjene na enem ogrodju preko dockerina z kohezijsko domeno, ki je nato pritrjen na celično steno kvasovke. Gradbeno ogrodje (CipA3) je pripeto na kvasovkin receptor za parjenje AGA2. <ref name="tretji" />

----

==='''Pretvorba glukoze v StyGreen'''===

Naslednja stopnja je tvorba stirena preko nekolk korakov ki se odvijajo v celici. Da bi se glukoza pretvorila v stiren, najprej je nujno vključiti se v glikolizi, pretvoriti se v fosfoenolpiruvata (PEP) ki potem se pretvori v Phe preko šikimi metabolne poti. Da bi se pretvoril Phe v trans-cinamat, potreben je katalizator ''fenilalanin amonum liaza 2.'' (PAL2) Naslednja stopnja je pretvorba trans-cinamata v stiren preko endogenega encima ''dekarboksilaza ferulne kisline 1''. (FDC1) Za večjo tvorbo stirena je bil izbran PAL2 encim iz ''A. Thaliana'' ker je bil najaktivnejši in so bili že poskusi z njim pri delu s kvasovkami. McKenna, R., Thompson, B., Pugh, S., & Nielsen, D. R. (2014). Rational and combinatorial approaches to engineering styrene production by Saccharomyces cerevisiae. <ref name="četrti" />
----

==='''Kako narediti GSO kvasovke za to nameno?'''===

Namesto da bi v celici dali več plazmidov, ki vsebujejo zaporedje celulaze, ogrodja in PAL2, bila je predlagana uporaba ''CRISPR-Cas9'' v kombinaciji s homologno rekombinacijo za uvedbo celotnega sistema v genom in tako narediti bolj stabilni celulosom. Poleg tega bi to odpravilo zapletene korake kloniranja, ki so potrebni za ustvarjanje velikih plazmidov. Z uporabo te strategije se lahko istočasno preoblikujejo več genov (tri celulaze, ogrodje in PAL2), nato pa bo potekala homologna rekombinacija na mestu preloma dvojne verige od CRISPR-Cas9. Uporaba CRISPR-Cas9 ima dodatno korist, ker tudi odpravlja potrebo po dodajanju antibiotikov ali aminokislin na rastni medij.

Začetni mini-celulozni ekspresijski sistem je pod nadzorom promotorjev galaktoze kaj prepreči rast na celuloznih odpadkov. Sistem rabi galaktozo da se začne izražanje, a promotorji galaktoze so regulirani z negativno povratno zanko preko glukoze. Posledično celulosom bo zmanjšal takoj svojo ekspresijo. Za odpravo te težave je bil izbran promotor TEF1 ki ima lasnosti izražanja na visoki stopnji.<ref name="peti" />

----

==='''Kako poteka celotni proces ?'''===

Ker je sam projekt zamišljen da bi potem delal na veliko industrisko stopnjo, naredili so sistem bioreaktorja ki bo proizvajal StyGreen. Mini tovarna bo imela tri oddelka : celulozno preprocesiranje, glavni bioreaktorni rezervoar in odelek za čiščenje stirena.

1.Celulozno predprocesiranje se izvaja v mlinu z žogicami kot pri KNN celulozi (Recell®). Sam proces ne uporablja močne kemikalije in zviša topljivost celuloze tako da je
celulosom učinkovejši.

2.V glavnem bioreaktorju je konstantna proizvodnja stirena. Vsebuje dvofazni medij iz vode in nepolarnega topila ki je etil acetat ker ima pravo gostoto. (ne tvori micele in ne
denaturira proteine kot bi druga topila) Stiren ki se tvori ima afiniteto za nepolarno okolje (log P=2,7) in zato je v organski fazi. Razlike v gostoti omogočajo ločitev med
fazami, organska faza se lahko nato izloči in se pripelje do mesta za čiščenje stirena.

3.V delu kje je čiščenje stirena, organska faza je reverzno sprana z vodo da bi se izgonili polarnih nečistoč. Ta voda gre nazaj v bioreaktorju da ne pride do zagube. Etil acetat
se upari na srednji vakuum, pa se reciklira v glavnem bioreaktorju, pričemer dobimo stiren v olju. Stirena iz te zmesi očistimo z uparjanjem pod močnejšim vakuumom, ostanek olja
se reciklira v rezervoarju. Ko biomasa kvasovk v številnih rezervoarjih preseže idealne pogoje za fermentacijo, jo lahko izpustimo in recikliramo v nov medij, saj YPD medij
vsebuje ekstrakt kvasovk. Zato vse, kar se odstrani iz rezervoarja, razen stirena, se vrne nazaj v rezervoar. To je industrijski postopek, ki ustvarja zelo malo odpadkov, medtem
prinaša znatne količine stirena.<ref name="šesti" />

Proizvoni obrat zahteva konstantni vnos celuloznega medija, malo vnosa vode in etil acetata, mešanje in hlajenje.

----

==='''Detekcija stirena s RP-HPLC UV DAD'''===

Bilo je proverjeno če je celotni proces resno naredil stirena kot končni produkt s pomočjo ''RP-HPLC-DAD''. HPLC metod za detekcijo stirena je uporabil metanol in vodo kot mobilna faza ki je bila gradientna. Določili so retencijski čas stirena v teh pogojih ob 17,5 min. Seve so gojili dva dni na gojišču z ''2%'' glukoze in ''0,5 g / L'' fenilalanina (L-fenilalanina) kaj je omogočalo hitrejšo tvorbo stirena.

Pripravili so štiri različne kulture:

a. kontrolo s fenilalaninom (Ctrl),
b. sev, ki je vseboval PAL2 s fenilalaninom (PAL2 +),
c. sev, ki je vseboval PAL2 brez fenilalanina (PAL2-)
d. sev, ki je vseboval PAL2 in celulozo s fenilalaninom (PAL2 ++)

Po inkubaciji, celično kulturo so centrifugirali in supernatant dali na kolono.

Kot je razvidno iz slike,<ref name="sedmi" /> vrh opažen pri 17,5 min, kaže na tvorbo stirena v celicah. Drugi vrh pri 10 min, pa ni prisoten pri negativni kontroli, je trans-cinamat-prekurzor stirena. Očitno je da je vrh trans-cinamata večji od stirenskega kaj ukaže da je pretvorba trans-cinamata v stiren v tih pogojih omejena.

Pri stirenskem vrhu, lahko opazimo razlike med testiranimi sevi. Med vsemi tremi sevi, ki vsebujejo PAL2, je očitna razlika v primerjavi s kontrolo, kar kaže na uspešno proizvodnjo stirena. Primerjava PAL2 in PAL2 + kaže, da dodajanje fenilalanina ni potrebno da bi se začela sama transformacija v stiren. V spodnji tabeli je prikazan približek proizvedene količine stirena. Ti rezultati kažejo, da so uspešno proizvedli stiren v kvasovki iz glukoze.<ref name="sedmi" />

----

== ZAKLJUČEK ==

Zelo je pomembno ohraniti naš planet za generacije ki še prihajajo. Ekipa iz Groningena je naredila korak k temu z razvojem projekta StyGreen, saj pričakujejo da bo ta tehnologija spremenila trg plastike iz črne v zeleno. Lahko zaključimo da je to dobar način zmanjšanja uporabe fosilnih goriv v proizvodnji plastike, vendar pa še vedno nimamo rešitev za vprašanje ''» Kako se znebiti plastike?«
''

----
==VIRI==

<ref name="prvi" /> 1. http://www.knncellulose.nl/ pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="drugi" /> 2. Wen, F., Sun, J., & Zhao, H. (2010). Yeast surface display of trifunctional minicellulosomes for simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to ethanol. Applied and Environmental Microbiology, 76(4), 1251–60. http://doi.org/10.1128/AEM.01687-09

<ref name="tretji" /> 3. http://2018.igem.org/Team:Groningen/Model/Molecular_Dynamics ; pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="četrti" /> 4. McKenna, R., Thompson, B., Pugh, S., & Nielsen, D. R. (2014). Rational and combinatorial approaches to engineering styrene production by Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories, 13(1), 123. http://doi.org/10.1186/s12934-014-0123-2

<ref name="peti" /> 5. https://sites.tufts.edu/crispr/genome-editing/homology-directed-repair/ pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="šesti" /> 6. http://2018.igem.org/Team:Groningen/Applied_Design ; pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="sedmi" /> 7. http://2018.igem.org/Team:Groningen/Results ;pridobljeno dne 12.01.2019

StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov:

2019-01-16T09:14:52Z

Milena Stojkovska: /* Razpad celuloze na glukozo */

''StyGreen'' je projekt študentske ekipe iz Groningena, Nizozemska s katerem so se predstavili na IGEM 2018 tekmovanju. Namen projekta je proizvodnja eko-stirena v organizmu ''S.cervisiae'' z uporabo odpadne celuloze kot obnovljiv vir.

==UVOD==

Proizvodnja veliko kemikalij je na podlagi fosilnih goriv ki so omejen resurs v svetu. Kot že vemo in se veliko govori da ti resursi se bojo popolnoma izkoristili v naslednjih nekolk 10-ih letih, zato je velika poudarjenost da jih zamenjamo z bio-obnovljivimi resursi in trajnostnih proizvodnih procesov. Ta projekt se zalaga za razvoj bio-gospodarstva da bi imeli bolj zelen planet preko raziskave in razvoja alternativnih poteh. Eden od njih je alternativna proizvodnja stirena.
Monomerni stiren je osnova za proizvodnjo plasticnih polimerov kot so akrilonitrilni butadien stiren (ABS), guma iz stiren butadiena ali prečnopovezanega polistirena. Nepolarna in aromatična struktura stirenov omogoča želenih fizičnih, kemijskih in električnih lasnotsti ki jih ne moremo dobiti pri drugih materijalih. Imajo širok spekter uporabe kot so LEGO kocke, industrijske gume, kolesarske gume ali izolacijski materiali v elektronskih napravah. V zadnjih 70 letih so izdelki iz stirena postali del našemu življenju in so nenadomestljivi za številne industrijo. Zato se bo povpraševanje po stirenu neizogibno hitro začelo. Razvoj alternativne proizvodne poti je zato izjemno pomemben.

----

== PRISTOPI SINTEZNE BIOLOGIJE K PROIZVAJANJU StyGreen IZDELKA ==

S pomočjo SB lahko izkoristimo mikroorganizme ki nam bojo tvorili željeno spojino, kaj predstavlja močno tehnologijo v znanosti. Stiren je podoben ''Phe'', ki pa je prisoten v živih bitij in omogoča da je to pravi prekurzor v njegovi sintezi v kvasovki. Stiren se bo konstitutivno proizvajal in ta produkt so poimenovali ''StyGreen''-alternativno narejen stiren.

Mikroorganizmi lahko rastejo na sladkorjih ali odpatkih ki vsebujejo veliko sladkorjev v formi glukoznih polimerov ki jim rečemo celuloza. Cilj je ustvariti sistem bioprocesiranja s kombiniranjem vseh potrebnih korakov za pretvorbo celuloze v stiren v eni robustni celični tovarni. Molekule StyGreen-a, ki se bojo tvorile, lahko nato se uporabijo v vseh vrstah konvencionalnih industrijskih procesov, ki se nanašajo na plastiko, ki ni namenjena eni sami uporabi. Na ta način hkrati zagotavljamo trajnostno razpoložljivost stirena in zeleni planet za prihodnje generacije.

V procesu načrtovanja poti od celuloze do stirena, morajo se upoštevati veliko dejavnikov. Obstajajo nekolk načinov za razpada celuloze, metabolnih poteh do tvorbo stirena in zanimivih izvirov celuloze.

----

==='''Kaj je dober vir celuloze ?'''===

Ker je celuloza pogost vir iz narave, veliko organskih materij jo vsebujejo v veliki količini. V potragi po idealnem viru celuloze pomembni dejavniki so: široka razpoložljivost, primernost za načrtovani sistem, finančna izvedljivost in nekonkurenčnost z hrano. Podrobno raziskovanje različne vire biomase, je pokazalo da so primerni tri možni vir: les, alge in toaletni papir.

Celulozni vir, kot je rabljeni toaletni papir imajo nizko kakovost celuloznih nitk, zaradi česar so neprimerni za mnoge običajne postopke recikliranja. Zato je ta odpadni material težje valorizirati kaj pravi da je zanimiva surovina za tvorbo stirena z gospodarskega in ekološkega vidika. Do sedaj je zelo malo aplikacij za uporabljene toaletne papirje iz kanalizacije. Podjetje KNN proizvaja izdelek, imenovan ''Recell®'', ki je očiščen toaletni papir-filtriran iz kanalizacije. Ta proces lahko močno poveča vrednost novo razvitega materiala, zaradi česar je zanimiv celulozni vir ki se lahko uporabi za tvorbo stirena.<ref name="prvi" />

----

==='''Razpad celuloze na glukozne enote'''===

''S. cerevisiae'' sama ne more razgraditi celulozo na glukozne enote. Zato je nujno izražanje encimov, imenovanih celulaze, ki razbijejo ''β''-(1,4)-glikozidne vezi med molekulami glukoze v celulozi. Te celulaze so različne in kombinacija treh lahko učinkovito razgradi celulozo: ''endoglukanaza'', ''celubiohidrolaza'' in ''β-glukozidaza''. V prejšnjih študijah so se dokazali, da ta tri encima tvorijo dobro skupino za razgradnjo celuloze.<ref name="drugi" />

Dodatno, celice uporabljajo glukozo kot substrat, torej bližji so encimi celicam, hitreje se glukoza pretvori v stiren. Da bi to postigni naredili so mini-celulosomni kompleks ki vsebuje vse tri encime pripenjene na enem ogrodju preko dockerina z kohezijsko domeno, ki je nato pritrjen na celično steno kvasovke. Gradben ogrodje (CipA3) je pripeto na kvasovkin receptor za parjenje AGA2. <ref name="tretji" />

----

==='''Pretvorba glukoze v StyGreen'''===

Naslednja stopnja je tvorba stirena preko nekolk korakov ki se odvijajo v celici. Da bi se glukoza pretvorila v stiren, najprej je nujno vključiti se v glikolizi, pretvoriti se v fosfoenolpiruvata (PEP) ki potem se pretvori v Phe preko šikimi metabolne poti. Da bi se pretvoril Phe v trans-cinamat, potreben je katalizator ''fenilalanin amonum liaza 2.'' (PAL2) Naslednja stopnja je pretvorba trans-cinamata v stiren preko endogenega encima ''dekarboksilaza ferulne kisline 1''. (FDC1) Za večjo tvorbo stirena je bil izbran PAL2 encim iz ''A. Thaliana'' ker je bil najaktivnejši in so bili že poskusi z njim pri delu s kvasovkami. McKenna, R., Thompson, B., Pugh, S., & Nielsen, D. R. (2014). Rational and combinatorial approaches to engineering styrene production by Saccharomyces cerevisiae. <ref name="četrti" />
----

==='''Kako narediti GSO kvasovke za to nameno?'''===

Namesto da bi v celici dali več plazmidov, ki vsebujejo zaporedje celulaze, ogrodja in PAL2, bila je predlagana uporaba ''CRISPR-Cas9'' v kombinaciji s homologno rekombinacijo za uvedbo celotnega sistema v genom in tako narediti bolj stabilni celulosom. Poleg tega bi to odpravilo zapletene korake kloniranja, ki so potrebni za ustvarjanje velikih plazmidov. Z uporabo te strategije se lahko istočasno preoblikujejo več genov (tri celulaze, ogrodje in PAL2), nato pa bo potekala homologna rekombinacija na mestu preloma dvojne verige od CRISPR-Cas9. Uporaba CRISPR-Cas9 ima dodatno korist, ker tudi odpravlja potrebo po dodajanju antibiotikov ali aminokislin na rastni medij.

Začetni mini-celulozni ekspresijski sistem je pod nadzorom promotorjev galaktoze kaj prepreči rast na celuloznih odpadkov. Sistem rabi galaktozo da se začne izražanje, a promotorji galaktoze so regulirani z negativno povratno zanko preko glukoze. Posledično celulosom bo zmanjšal takoj svojo ekspresijo. Za odpravo te težave je bil izbran promotor TEF1 ki ima lasnosti izražanja na visoki stopnji.<ref name="peti" />

----

==='''Kako poteka celotni proces ?'''===

Ker je sam projekt zamišljen da bi potem delal na veliko industrisko stopnjo, naredili so sistem bioreaktorja ki bo proizvajal StyGreen. Mini tovarna bo imela tri oddelka : celulozno preprocesiranje, glavni bioreaktorni rezervoar in odelek za čiščenje stirena.

1.Celulozno predprocesiranje se izvaja v mlinu z žogicami kot pri KNN celulozi (Recell®). Sam proces ne uporablja močne kemikalije in zviša topljivost celuloze tako da je
celulosom učinkovejši.

2.V glavnem bioreaktorju je konstantna proizvodnja stirena. Vsebuje dvofazni medij iz vode in nepolarnega topila ki je etil acetat ker ima pravo gostoto. (ne tvori micele in ne
denaturira proteine kot bi druga topila) Stiren ki se tvori ima afiniteto za nepolarno okolje (log P=2,7) in zato je v organski fazi. Razlike v gostoti omogočajo ločitev med
fazami, organska faza se lahko nato izloči in se pripelje do mesta za čiščenje stirena.

3.V delu kje je čiščenje stirena, organska faza je reverzno sprana z vodo da bi se izgonili polarnih nečistoč. Ta voda gre nazaj v bioreaktorju da ne pride do zagube. Etil acetat
se upari na srednji vakuum, pa se reciklira v glavnem bioreaktorju, pričemer dobimo stiren v olju. Stirena iz te zmesi očistimo z uparjanjem pod močnejšim vakuumom, ostanek olja
se reciklira v rezervoarju. Ko biomasa kvasovk v številnih rezervoarjih preseže idealne pogoje za fermentacijo, jo lahko izpustimo in recikliramo v nov medij, saj YPD medij
vsebuje ekstrakt kvasovk. Zato vse, kar se odstrani iz rezervoarja, razen stirena, se vrne nazaj v rezervoar. To je industrijski postopek, ki ustvarja zelo malo odpadkov, medtem
prinaša znatne količine stirena.<ref name="šesti" />

Proizvoni obrat zahteva konstantni vnos celuloznega medija, malo vnosa vode in etil acetata, mešanje in hlajenje.

----

==='''Detekcija stirena s RP-HPLC UV DAD'''===

Bilo je proverjeno če je celotni proces resno naredil stirena kot končni produkt s pomočjo ''RP-HPLC-DAD''. HPLC metod za detekcijo stirena je uporabil metanol in vodo kot mobilna faza ki je bila gradientna. Določili so retencijski čas stirena v teh pogojih ob 17,5 min. Seve so gojili dva dni na gojišču z ''2%'' glukoze in ''0,5 g / L'' fenilalanina (L-fenilalanina) kaj je omogočalo hitrejšo tvorbo stirena.

Pripravili so štiri različne kulture:

a. kontrolo s fenilalaninom (Ctrl),
b. sev, ki je vseboval PAL2 s fenilalaninom (PAL2 +),
c. sev, ki je vseboval PAL2 brez fenilalanina (PAL2-)
d. sev, ki je vseboval PAL2 in celulozo s fenilalaninom (PAL2 ++)

Po inkubaciji, celično kulturo so centrifugirali in supernatant dali na kolono.

Kot je razvidno iz slike,<ref name="sedmi" /> vrh opažen pri 17,5 min, kaže na tvorbo stirena v celicah. Drugi vrh pri 10 min, pa ni prisoten pri negativni kontroli, je trans-cinamat-prekurzor stirena. Očitno je da je vrh trans-cinamata večji od stirenskega kaj ukaže da je pretvorba trans-cinamata v stiren v tih pogojih omejena.

Pri stirenskem vrhu, lahko opazimo razlike med testiranimi sevi. Med vsemi tremi sevi, ki vsebujejo PAL2, je očitna razlika v primerjavi s kontrolo, kar kaže na uspešno proizvodnjo stirena. Primerjava PAL2 in PAL2 + kaže, da dodajanje fenilalanina ni potrebno da bi se začela sama transformacija v stiren. V spodnji tabeli je prikazan približek proizvedene količine stirena. Ti rezultati kažejo, da so uspešno proizvedli stiren v kvasovki iz glukoze.<ref name="sedmi" />

----

== ZAKLJUČEK ==

Zelo je pomembno ohraniti naš planet za generacije ki še prihajajo. Ekipa iz Groningena je naredila korak k temu z razvojem projekta StyGreen, saj pričakujejo da bo ta tehnologija spremenila trg plastike iz črne v zeleno. Lahko zaključimo da je to dobar način zmanjšanja uporabe fosilnih goriv v proizvodnji plastike, vendar pa še vedno nimamo rešitev za vprašanje ''» Kako se znebiti plastike?«
''

----
==VIRI==

<ref name="prvi" /> 1. http://www.knncellulose.nl/ pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="drugi" /> 2. Wen, F., Sun, J., & Zhao, H. (2010). Yeast surface display of trifunctional minicellulosomes for simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to ethanol. Applied and Environmental Microbiology, 76(4), 1251–60. http://doi.org/10.1128/AEM.01687-09

<ref name="tretji" /> 3. http://2018.igem.org/Team:Groningen/Model/Molecular_Dynamics ; pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="četrti" /> 4. McKenna, R., Thompson, B., Pugh, S., & Nielsen, D. R. (2014). Rational and combinatorial approaches to engineering styrene production by Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories, 13(1), 123. http://doi.org/10.1186/s12934-014-0123-2

<ref name="peti" /> 5. https://sites.tufts.edu/crispr/genome-editing/homology-directed-repair/ pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="šesti" /> 6. http://2018.igem.org/Team:Groningen/Applied_Design ; pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="sedmi" /> 7. http://2018.igem.org/Team:Groningen/Results ;pridobljeno dne 12.01.2019

StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov:

2019-01-16T09:14:09Z

Milena Stojkovska: /* VIRI */

''StyGreen'' je projekt študentske ekipe iz Groningena, Nizozemska s katerem so se predstavili na IGEM 2018 tekmovanju. Namen projekta je proizvodnja eko-stirena v organizmu ''S.cervisiae'' z uporabo odpadne celuloze kot obnovljiv vir.

==UVOD==

Proizvodnja veliko kemikalij je na podlagi fosilnih goriv ki so omejen resurs v svetu. Kot že vemo in se veliko govori da ti resursi se bojo popolnoma izkoristili v naslednjih nekolk 10-ih letih, zato je velika poudarjenost da jih zamenjamo z bio-obnovljivimi resursi in trajnostnih proizvodnih procesov. Ta projekt se zalaga za razvoj bio-gospodarstva da bi imeli bolj zelen planet preko raziskave in razvoja alternativnih poteh. Eden od njih je alternativna proizvodnja stirena.
Monomerni stiren je osnova za proizvodnjo plasticnih polimerov kot so akrilonitrilni butadien stiren (ABS), guma iz stiren butadiena ali prečnopovezanega polistirena. Nepolarna in aromatična struktura stirenov omogoča želenih fizičnih, kemijskih in električnih lasnotsti ki jih ne moremo dobiti pri drugih materijalih. Imajo širok spekter uporabe kot so LEGO kocke, industrijske gume, kolesarske gume ali izolacijski materiali v elektronskih napravah. V zadnjih 70 letih so izdelki iz stirena postali del našemu življenju in so nenadomestljivi za številne industrijo. Zato se bo povpraševanje po stirenu neizogibno hitro začelo. Razvoj alternativne proizvodne poti je zato izjemno pomemben.

----

== PRISTOPI SINTEZNE BIOLOGIJE K PROIZVAJANJU StyGreen IZDELKA ==

S pomočjo SB lahko izkoristimo mikroorganizme ki nam bojo tvorili željeno spojino, kaj predstavlja močno tehnologijo v znanosti. Stiren je podoben ''Phe'', ki pa je prisoten v živih bitij in omogoča da je to pravi prekurzor v njegovi sintezi v kvasovki. Stiren se bo konstitutivno proizvajal in ta produkt so poimenovali ''StyGreen''-alternativno narejen stiren.

Mikroorganizmi lahko rastejo na sladkorjih ali odpatkih ki vsebujejo veliko sladkorjev v formi glukoznih polimerov ki jim rečemo celuloza. Cilj je ustvariti sistem bioprocesiranja s kombiniranjem vseh potrebnih korakov za pretvorbo celuloze v stiren v eni robustni celični tovarni. Molekule StyGreen-a, ki se bojo tvorile, lahko nato se uporabijo v vseh vrstah konvencionalnih industrijskih procesov, ki se nanašajo na plastiko, ki ni namenjena eni sami uporabi. Na ta način hkrati zagotavljamo trajnostno razpoložljivost stirena in zeleni planet za prihodnje generacije.

V procesu načrtovanja poti od celuloze do stirena, morajo se upoštevati veliko dejavnikov. Obstajajo nekolk načinov za razpada celuloze, metabolnih poteh do tvorbo stirena in zanimivih izvirov celuloze.

----

==='''Kaj je dober vir celuloze ?'''===

Ker je celuloza pogost vir iz narave, veliko organskih materij jo vsebujejo v veliki količini. V potragi po idealnem viru celuloze pomembni dejavniki so: široka razpoložljivost, primernost za načrtovani sistem, finančna izvedljivost in nekonkurenčnost z hrano. Podrobno raziskovanje različne vire biomase, je pokazalo da so primerni tri možni vir: les, alge in toaletni papir.

Celulozni vir, kot je rabljeni toaletni papir imajo nizko kakovost celuloznih nitk, zaradi česar so neprimerni za mnoge običajne postopke recikliranja. Zato je ta odpadni material težje valorizirati kaj pravi da je zanimiva surovina za tvorbo stirena z gospodarskega in ekološkega vidika. Do sedaj je zelo malo aplikacij za uporabljene toaletne papirje iz kanalizacije. Podjetje KNN proizvaja izdelek, imenovan ''Recell®'', ki je očiščen toaletni papir-filtriran iz kanalizacije. Ta proces lahko močno poveča vrednost novo razvitega materiala, zaradi česar je zanimiv celulozni vir ki se lahko uporabi za tvorbo stirena.<ref name="prvi" />

----

==='''Razpad celuloze na glukozo'''===

''S. cerevisiae'' sama ne more razgraditi celulozo na glukozne enote. Zato je nujno izražanje encimov, imenovanih celulaze, ki razbijejo ''β''-(1,4)-glikozidne vezi med molekulami glukoze v celulozi. Te celulaze so različne in kombinacija treh lahko učinkovito razgradi celulozo: ''endoglukanaza'', ''celubiohidrolaza'' in ''β-glukozidaza''. V prejšnjih študijah so se dokazali, da ta tri encima tvorijo dobro skupino za razgradnjo celuloze.<ref name="drugi" />

Dodatno, celice uporabljajo glukozo kot substrat, torej bližji so encimi celicam, hitreje se glukoza pretvori v stiren. Da bi to postigni naredili so mini-celulosomni kompleks ki vsebuje vse tri encime pripenjene na enem ogrodju preko dockerina z kohezijsko domeno, ki je nato pritrjen na celično steno kvasovke. Gradben ogrodje (CipA3) je pripeto na kvasovkin receptor za parjenje AGA2. <ref name="tretji" />

----

==='''Pretvorba glukoze v StyGreen'''===

Naslednja stopnja je tvorba stirena preko nekolk korakov ki se odvijajo v celici. Da bi se glukoza pretvorila v stiren, najprej je nujno vključiti se v glikolizi, pretvoriti se v fosfoenolpiruvata (PEP) ki potem se pretvori v Phe preko šikimi metabolne poti. Da bi se pretvoril Phe v trans-cinamat, potreben je katalizator ''fenilalanin amonum liaza 2.'' (PAL2) Naslednja stopnja je pretvorba trans-cinamata v stiren preko endogenega encima ''dekarboksilaza ferulne kisline 1''. (FDC1) Za večjo tvorbo stirena je bil izbran PAL2 encim iz ''A. Thaliana'' ker je bil najaktivnejši in so bili že poskusi z njim pri delu s kvasovkami. McKenna, R., Thompson, B., Pugh, S., & Nielsen, D. R. (2014). Rational and combinatorial approaches to engineering styrene production by Saccharomyces cerevisiae. <ref name="četrti" />
----

==='''Kako narediti GSO kvasovke za to nameno?'''===

Namesto da bi v celici dali več plazmidov, ki vsebujejo zaporedje celulaze, ogrodja in PAL2, bila je predlagana uporaba ''CRISPR-Cas9'' v kombinaciji s homologno rekombinacijo za uvedbo celotnega sistema v genom in tako narediti bolj stabilni celulosom. Poleg tega bi to odpravilo zapletene korake kloniranja, ki so potrebni za ustvarjanje velikih plazmidov. Z uporabo te strategije se lahko istočasno preoblikujejo več genov (tri celulaze, ogrodje in PAL2), nato pa bo potekala homologna rekombinacija na mestu preloma dvojne verige od CRISPR-Cas9. Uporaba CRISPR-Cas9 ima dodatno korist, ker tudi odpravlja potrebo po dodajanju antibiotikov ali aminokislin na rastni medij.

Začetni mini-celulozni ekspresijski sistem je pod nadzorom promotorjev galaktoze kaj prepreči rast na celuloznih odpadkov. Sistem rabi galaktozo da se začne izražanje, a promotorji galaktoze so regulirani z negativno povratno zanko preko glukoze. Posledično celulosom bo zmanjšal takoj svojo ekspresijo. Za odpravo te težave je bil izbran promotor TEF1 ki ima lasnosti izražanja na visoki stopnji.<ref name="peti" />

----

==='''Kako poteka celotni proces ?'''===

Ker je sam projekt zamišljen da bi potem delal na veliko industrisko stopnjo, naredili so sistem bioreaktorja ki bo proizvajal StyGreen. Mini tovarna bo imela tri oddelka : celulozno preprocesiranje, glavni bioreaktorni rezervoar in odelek za čiščenje stirena.

1.Celulozno predprocesiranje se izvaja v mlinu z žogicami kot pri KNN celulozi (Recell®). Sam proces ne uporablja močne kemikalije in zviša topljivost celuloze tako da je
celulosom učinkovejši.

2.V glavnem bioreaktorju je konstantna proizvodnja stirena. Vsebuje dvofazni medij iz vode in nepolarnega topila ki je etil acetat ker ima pravo gostoto. (ne tvori micele in ne
denaturira proteine kot bi druga topila) Stiren ki se tvori ima afiniteto za nepolarno okolje (log P=2,7) in zato je v organski fazi. Razlike v gostoti omogočajo ločitev med
fazami, organska faza se lahko nato izloči in se pripelje do mesta za čiščenje stirena.

3.V delu kje je čiščenje stirena, organska faza je reverzno sprana z vodo da bi se izgonili polarnih nečistoč. Ta voda gre nazaj v bioreaktorju da ne pride do zagube. Etil acetat
se upari na srednji vakuum, pa se reciklira v glavnem bioreaktorju, pričemer dobimo stiren v olju. Stirena iz te zmesi očistimo z uparjanjem pod močnejšim vakuumom, ostanek olja
se reciklira v rezervoarju. Ko biomasa kvasovk v številnih rezervoarjih preseže idealne pogoje za fermentacijo, jo lahko izpustimo in recikliramo v nov medij, saj YPD medij
vsebuje ekstrakt kvasovk. Zato vse, kar se odstrani iz rezervoarja, razen stirena, se vrne nazaj v rezervoar. To je industrijski postopek, ki ustvarja zelo malo odpadkov, medtem
prinaša znatne količine stirena.<ref name="šesti" />

Proizvoni obrat zahteva konstantni vnos celuloznega medija, malo vnosa vode in etil acetata, mešanje in hlajenje.

----

==='''Detekcija stirena s RP-HPLC UV DAD'''===

Bilo je proverjeno če je celotni proces resno naredil stirena kot končni produkt s pomočjo ''RP-HPLC-DAD''. HPLC metod za detekcijo stirena je uporabil metanol in vodo kot mobilna faza ki je bila gradientna. Določili so retencijski čas stirena v teh pogojih ob 17,5 min. Seve so gojili dva dni na gojišču z ''2%'' glukoze in ''0,5 g / L'' fenilalanina (L-fenilalanina) kaj je omogočalo hitrejšo tvorbo stirena.

Pripravili so štiri različne kulture:

a. kontrolo s fenilalaninom (Ctrl),
b. sev, ki je vseboval PAL2 s fenilalaninom (PAL2 +),
c. sev, ki je vseboval PAL2 brez fenilalanina (PAL2-)
d. sev, ki je vseboval PAL2 in celulozo s fenilalaninom (PAL2 ++)

Po inkubaciji, celično kulturo so centrifugirali in supernatant dali na kolono.

Kot je razvidno iz slike,<ref name="sedmi" /> vrh opažen pri 17,5 min, kaže na tvorbo stirena v celicah. Drugi vrh pri 10 min, pa ni prisoten pri negativni kontroli, je trans-cinamat-prekurzor stirena. Očitno je da je vrh trans-cinamata večji od stirenskega kaj ukaže da je pretvorba trans-cinamata v stiren v tih pogojih omejena.

Pri stirenskem vrhu, lahko opazimo razlike med testiranimi sevi. Med vsemi tremi sevi, ki vsebujejo PAL2, je očitna razlika v primerjavi s kontrolo, kar kaže na uspešno proizvodnjo stirena. Primerjava PAL2 in PAL2 + kaže, da dodajanje fenilalanina ni potrebno da bi se začela sama transformacija v stiren. V spodnji tabeli je prikazan približek proizvedene količine stirena. Ti rezultati kažejo, da so uspešno proizvedli stiren v kvasovki iz glukoze.<ref name="sedmi" />

----

== ZAKLJUČEK ==

Zelo je pomembno ohraniti naš planet za generacije ki še prihajajo. Ekipa iz Groningena je naredila korak k temu z razvojem projekta StyGreen, saj pričakujejo da bo ta tehnologija spremenila trg plastike iz črne v zeleno. Lahko zaključimo da je to dobar način zmanjšanja uporabe fosilnih goriv v proizvodnji plastike, vendar pa še vedno nimamo rešitev za vprašanje ''» Kako se znebiti plastike?«
''

----
==VIRI==

<ref name="prvi" /> 1. http://www.knncellulose.nl/ pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="drugi" /> 2. Wen, F., Sun, J., & Zhao, H. (2010). Yeast surface display of trifunctional minicellulosomes for simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to ethanol. Applied and Environmental Microbiology, 76(4), 1251–60. http://doi.org/10.1128/AEM.01687-09

<ref name="tretji" /> 3. http://2018.igem.org/Team:Groningen/Model/Molecular_Dynamics ; pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="četrti" /> 4. McKenna, R., Thompson, B., Pugh, S., & Nielsen, D. R. (2014). Rational and combinatorial approaches to engineering styrene production by Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories, 13(1), 123. http://doi.org/10.1186/s12934-014-0123-2

<ref name="peti" /> 5. https://sites.tufts.edu/crispr/genome-editing/homology-directed-repair/ pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="šesti" /> 6. http://2018.igem.org/Team:Groningen/Applied_Design ; pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="sedmi" /> 7. http://2018.igem.org/Team:Groningen/Results ;pridobljeno dne 12.01.2019

StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov:

2019-01-15T14:53:09Z

Milena Stojkovska: /* VIRI */

''StyGreen'' je projekt študentske ekipe iz Groningena, Nizozemska s katerem so se predstavili na IGEM 2018 tekmovanju. Namen projekta je proizvodnja eko-stirena v organizmu ''S.cervisiae'' z uporabo odpadne celuloze kot obnovljiv vir.

==UVOD==

Proizvodnja veliko kemikalij je na podlagi fosilnih goriv ki so omejen resurs v svetu. Kot že vemo in se veliko govori da ti resursi se bojo popolnoma izkoristili v naslednjih nekolk 10-ih letih, zato je velika poudarjenost da jih zamenjamo z bio-obnovljivimi resursi in trajnostnih proizvodnih procesov. Ta projekt se zalaga za razvoj bio-gospodarstva da bi imeli bolj zelen planet preko raziskave in razvoja alternativnih poteh. Eden od njih je alternativna proizvodnja stirena.
Monomerni stiren je osnova za proizvodnjo plasticnih polimerov kot so akrilonitrilni butadien stiren (ABS), guma iz stiren butadiena ali prečnopovezanega polistirena. Nepolarna in aromatična struktura stirenov omogoča želenih fizičnih, kemijskih in električnih lasnotsti ki jih ne moremo dobiti pri drugih materijalih. Imajo širok spekter uporabe kot so LEGO kocke, industrijske gume, kolesarske gume ali izolacijski materiali v elektronskih napravah. V zadnjih 70 letih so izdelki iz stirena postali del našemu življenju in so nenadomestljivi za številne industrijo. Zato se bo povpraševanje po stirenu neizogibno hitro začelo. Razvoj alternativne proizvodne poti je zato izjemno pomemben.

----

== PRISTOPI SINTEZNE BIOLOGIJE K PROIZVAJANJU StyGreen IZDELKA ==

S pomočjo SB lahko izkoristimo mikroorganizme ki nam bojo tvorili željeno spojino, kaj predstavlja močno tehnologijo v znanosti. Stiren je podoben ''Phe'', ki pa je prisoten v živih bitij in omogoča da je to pravi prekurzor v njegovi sintezi v kvasovki. Stiren se bo konstitutivno proizvajal in ta produkt so poimenovali ''StyGreen''-alternativno narejen stiren.

Mikroorganizmi lahko rastejo na sladkorjih ali odpatkih ki vsebujejo veliko sladkorjev v formi glukoznih polimerov ki jim rečemo celuloza. Cilj je ustvariti sistem bioprocesiranja s kombiniranjem vseh potrebnih korakov za pretvorbo celuloze v stiren v eni robustni celični tovarni. Molekule StyGreen-a, ki se bojo tvorile, lahko nato se uporabijo v vseh vrstah konvencionalnih industrijskih procesov, ki se nanašajo na plastiko, ki ni namenjena eni sami uporabi. Na ta način hkrati zagotavljamo trajnostno razpoložljivost stirena in zeleni planet za prihodnje generacije.

V procesu načrtovanja poti od celuloze do stirena, morajo se upoštevati veliko dejavnikov. Obstajajo nekolk načinov za razpada celuloze, metabolnih poteh do tvorbo stirena in zanimivih izvirov celuloze.

----

==='''Kaj je dober vir celuloze ?'''===

Ker je celuloza pogost vir iz narave, veliko organskih materij jo vsebujejo v veliki količini. V potragi po idealnem viru celuloze pomembni dejavniki so: široka razpoložljivost, primernost za načrtovani sistem, finančna izvedljivost in nekonkurenčnost z hrano. Podrobno raziskovanje različne vire biomase, je pokazalo da so primerni tri možni vir: les, alge in toaletni papir.

Celulozni vir, kot je rabljeni toaletni papir imajo nizko kakovost celuloznih nitk, zaradi česar so neprimerni za mnoge običajne postopke recikliranja. Zato je ta odpadni material težje valorizirati kaj pravi da je zanimiva surovina za tvorbo stirena z gospodarskega in ekološkega vidika. Do sedaj je zelo malo aplikacij za uporabljene toaletne papirje iz kanalizacije. Podjetje KNN proizvaja izdelek, imenovan ''Recell®'', ki je očiščen toaletni papir-filtriran iz kanalizacije. Ta proces lahko močno poveča vrednost novo razvitega materiala, zaradi česar je zanimiv celulozni vir ki se lahko uporabi za tvorbo stirena.<ref name="prvi" />

----

==='''Razpad celuloze na glukozo'''===

''S. cerevisiae'' sama ne more razgraditi celulozo na glukozne enote. Zato je nujno izražanje encimov, imenovanih celulaze, ki razbijejo ''β''-(1,4)-glikozidne vezi med molekulami glukoze v celulozi. Te celulaze so različne in kombinacija treh lahko učinkovito razgradi celulozo: ''endoglukanaza'', ''celubiohidrolaza'' in ''β-glukozidaza''. V prejšnjih študijah so se dokazali, da ta tri encima tvorijo dobro skupino za razgradnjo celuloze.<ref name="drugi" />

Dodatno, celice uporabljajo glukozo kot substrat, torej bližji so encimi celicam, hitreje se glukoza pretvori v stiren. Da bi to postigni naredili so mini-celulosomni kompleks ki vsebuje vse tri encime pripenjene na enem ogrodju preko dockerina z kohezijsko domeno, ki je nato pritrjen na celično steno kvasovke. Gradben ogrodje (CipA3) je pripeto na kvasovkin receptor za parjenje AGA2. <ref name="tretji" />

----

==='''Pretvorba glukoze v StyGreen'''===

Naslednja stopnja je tvorba stirena preko nekolk korakov ki se odvijajo v celici. Da bi se glukoza pretvorila v stiren, najprej je nujno vključiti se v glikolizi, pretvoriti se v fosfoenolpiruvata (PEP) ki potem se pretvori v Phe preko šikimi metabolne poti. Da bi se pretvoril Phe v trans-cinamat, potreben je katalizator ''fenilalanin amonum liaza 2.'' (PAL2) Naslednja stopnja je pretvorba trans-cinamata v stiren preko endogenega encima ''dekarboksilaza ferulne kisline 1''. (FDC1) Za večjo tvorbo stirena je bil izbran PAL2 encim iz ''A. Thaliana'' ker je bil najaktivnejši in so bili že poskusi z njim pri delu s kvasovkami. McKenna, R., Thompson, B., Pugh, S., & Nielsen, D. R. (2014). Rational and combinatorial approaches to engineering styrene production by Saccharomyces cerevisiae. <ref name="četrti" />
----

==='''Kako narediti GSO kvasovke za to nameno?'''===

Namesto da bi v celici dali več plazmidov, ki vsebujejo zaporedje celulaze, ogrodja in PAL2, bila je predlagana uporaba ''CRISPR-Cas9'' v kombinaciji s homologno rekombinacijo za uvedbo celotnega sistema v genom in tako narediti bolj stabilni celulosom. Poleg tega bi to odpravilo zapletene korake kloniranja, ki so potrebni za ustvarjanje velikih plazmidov. Z uporabo te strategije se lahko istočasno preoblikujejo več genov (tri celulaze, ogrodje in PAL2), nato pa bo potekala homologna rekombinacija na mestu preloma dvojne verige od CRISPR-Cas9. Uporaba CRISPR-Cas9 ima dodatno korist, ker tudi odpravlja potrebo po dodajanju antibiotikov ali aminokislin na rastni medij.

Začetni mini-celulozni ekspresijski sistem je pod nadzorom promotorjev galaktoze kaj prepreči rast na celuloznih odpadkov. Sistem rabi galaktozo da se začne izražanje, a promotorji galaktoze so regulirani z negativno povratno zanko preko glukoze. Posledično celulosom bo zmanjšal takoj svojo ekspresijo. Za odpravo te težave je bil izbran promotor TEF1 ki ima lasnosti izražanja na visoki stopnji.<ref name="peti" />

----

==='''Kako poteka celotni proces ?'''===

Ker je sam projekt zamišljen da bi potem delal na veliko industrisko stopnjo, naredili so sistem bioreaktorja ki bo proizvajal StyGreen. Mini tovarna bo imela tri oddelka : celulozno preprocesiranje, glavni bioreaktorni rezervoar in odelek za čiščenje stirena.

1.Celulozno predprocesiranje se izvaja v mlinu z žogicami kot pri KNN celulozi (Recell®). Sam proces ne uporablja močne kemikalije in zviša topljivost celuloze tako da je
celulosom učinkovejši.

2.V glavnem bioreaktorju je konstantna proizvodnja stirena. Vsebuje dvofazni medij iz vode in nepolarnega topila ki je etil acetat ker ima pravo gostoto. (ne tvori micele in ne
denaturira proteine kot bi druga topila) Stiren ki se tvori ima afiniteto za nepolarno okolje (log P=2,7) in zato je v organski fazi. Razlike v gostoti omogočajo ločitev med
fazami, organska faza se lahko nato izloči in se pripelje do mesta za čiščenje stirena.

3.V delu kje je čiščenje stirena, organska faza je reverzno sprana z vodo da bi se izgonili polarnih nečistoč. Ta voda gre nazaj v bioreaktorju da ne pride do zagube. Etil acetat
se upari na srednji vakuum, pa se reciklira v glavnem bioreaktorju, pričemer dobimo stiren v olju. Stirena iz te zmesi očistimo z uparjanjem pod močnejšim vakuumom, ostanek olja
se reciklira v rezervoarju. Ko biomasa kvasovk v številnih rezervoarjih preseže idealne pogoje za fermentacijo, jo lahko izpustimo in recikliramo v nov medij, saj YPD medij
vsebuje ekstrakt kvasovk. Zato vse, kar se odstrani iz rezervoarja, razen stirena, se vrne nazaj v rezervoar. To je industrijski postopek, ki ustvarja zelo malo odpadkov, medtem
prinaša znatne količine stirena.<ref name="šesti" />

Proizvoni obrat zahteva konstantni vnos celuloznega medija, malo vnosa vode in etil acetata, mešanje in hlajenje.

----

==='''Detekcija stirena s RP-HPLC UV DAD'''===

Bilo je proverjeno če je celotni proces resno naredil stirena kot končni produkt s pomočjo ''RP-HPLC-DAD''. HPLC metod za detekcijo stirena je uporabil metanol in vodo kot mobilna faza ki je bila gradientna. Določili so retencijski čas stirena v teh pogojih ob 17,5 min. Seve so gojili dva dni na gojišču z ''2%'' glukoze in ''0,5 g / L'' fenilalanina (L-fenilalanina) kaj je omogočalo hitrejšo tvorbo stirena.

Pripravili so štiri različne kulture:

a. kontrolo s fenilalaninom (Ctrl),
b. sev, ki je vseboval PAL2 s fenilalaninom (PAL2 +),
c. sev, ki je vseboval PAL2 brez fenilalanina (PAL2-)
d. sev, ki je vseboval PAL2 in celulozo s fenilalaninom (PAL2 ++)

Po inkubaciji, celično kulturo so centrifugirali in supernatant dali na kolono.

Kot je razvidno iz slike,<ref name="sedmi" /> vrh opažen pri 17,5 min, kaže na tvorbo stirena v celicah. Drugi vrh pri 10 min, pa ni prisoten pri negativni kontroli, je trans-cinamat-prekurzor stirena. Očitno je da je vrh trans-cinamata večji od stirenskega kaj ukaže da je pretvorba trans-cinamata v stiren v tih pogojih omejena.

Pri stirenskem vrhu, lahko opazimo razlike med testiranimi sevi. Med vsemi tremi sevi, ki vsebujejo PAL2, je očitna razlika v primerjavi s kontrolo, kar kaže na uspešno proizvodnjo stirena. Primerjava PAL2 in PAL2 + kaže, da dodajanje fenilalanina ni potrebno da bi se začela sama transformacija v stiren. V spodnji tabeli je prikazan približek proizvedene količine stirena. Ti rezultati kažejo, da so uspešno proizvedli stiren v kvasovki iz glukoze.<ref name="sedmi" />

----

== ZAKLJUČEK ==

Zelo je pomembno ohraniti naš planet za generacije ki še prihajajo. Ekipa iz Groningena je naredila korak k temu z razvojem projekta StyGreen, saj pričakujejo da bo ta tehnologija spremenila trg plastike iz črne v zeleno. Lahko zaključimo da je to dobar način zmanjšanja uporabe fosilnih goriv v proizvodnji plastike, vendar pa še vedno nimamo rešitev za vprašanje ''» Kako se znebiti plastike?«
''

----
==VIRI==

<ref name="prvi" /> 1. [http://www.knncellulose.nl]/ pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="drugi" /> 2. Wen, F., Sun, J., & Zhao, H. (2010). Yeast surface display of trifunctional minicellulosomes for simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to ethanol. Applied and Environmental Microbiology, 76(4), 1251–60. http://doi.org/10.1128/AEM.01687-09

<ref name="tretji" /> 3. [http://2018.igem.org/Team:Groningen/Model/Molecular_Dynamics] pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="četrti" /> 4. McKenna, R., Thompson, B., Pugh, S., & Nielsen, D. R. (2014). Rational and combinatorial approaches to engineering styrene production by Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories, 13(1), 123. http://doi.org/10.1186/s12934-014-0123-2

<ref name="peti" /> 5. https://sites.tufts.edu/crispr/genome-editing/homology-directed-repair/ pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="šesti" /> 6. http://2018.igem.org/Team:Groningen/Applied_Design pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="sedmi" /> 7. http://2018.igem.org/Team:Groningen/Results pridobljeno dne 12.01.2019

StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov:

2019-01-15T14:51:09Z

Milena Stojkovska: /* VIRI */

''StyGreen'' je projekt študentske ekipe iz Groningena, Nizozemska s katerem so se predstavili na IGEM 2018 tekmovanju. Namen projekta je proizvodnja eko-stirena v organizmu ''S.cervisiae'' z uporabo odpadne celuloze kot obnovljiv vir.

==UVOD==

Proizvodnja veliko kemikalij je na podlagi fosilnih goriv ki so omejen resurs v svetu. Kot že vemo in se veliko govori da ti resursi se bojo popolnoma izkoristili v naslednjih nekolk 10-ih letih, zato je velika poudarjenost da jih zamenjamo z bio-obnovljivimi resursi in trajnostnih proizvodnih procesov. Ta projekt se zalaga za razvoj bio-gospodarstva da bi imeli bolj zelen planet preko raziskave in razvoja alternativnih poteh. Eden od njih je alternativna proizvodnja stirena.
Monomerni stiren je osnova za proizvodnjo plasticnih polimerov kot so akrilonitrilni butadien stiren (ABS), guma iz stiren butadiena ali prečnopovezanega polistirena. Nepolarna in aromatična struktura stirenov omogoča želenih fizičnih, kemijskih in električnih lasnotsti ki jih ne moremo dobiti pri drugih materijalih. Imajo širok spekter uporabe kot so LEGO kocke, industrijske gume, kolesarske gume ali izolacijski materiali v elektronskih napravah. V zadnjih 70 letih so izdelki iz stirena postali del našemu življenju in so nenadomestljivi za številne industrijo. Zato se bo povpraševanje po stirenu neizogibno hitro začelo. Razvoj alternativne proizvodne poti je zato izjemno pomemben.

----

== PRISTOPI SINTEZNE BIOLOGIJE K PROIZVAJANJU StyGreen IZDELKA ==

S pomočjo SB lahko izkoristimo mikroorganizme ki nam bojo tvorili željeno spojino, kaj predstavlja močno tehnologijo v znanosti. Stiren je podoben ''Phe'', ki pa je prisoten v živih bitij in omogoča da je to pravi prekurzor v njegovi sintezi v kvasovki. Stiren se bo konstitutivno proizvajal in ta produkt so poimenovali ''StyGreen''-alternativno narejen stiren.

Mikroorganizmi lahko rastejo na sladkorjih ali odpatkih ki vsebujejo veliko sladkorjev v formi glukoznih polimerov ki jim rečemo celuloza. Cilj je ustvariti sistem bioprocesiranja s kombiniranjem vseh potrebnih korakov za pretvorbo celuloze v stiren v eni robustni celični tovarni. Molekule StyGreen-a, ki se bojo tvorile, lahko nato se uporabijo v vseh vrstah konvencionalnih industrijskih procesov, ki se nanašajo na plastiko, ki ni namenjena eni sami uporabi. Na ta način hkrati zagotavljamo trajnostno razpoložljivost stirena in zeleni planet za prihodnje generacije.

V procesu načrtovanja poti od celuloze do stirena, morajo se upoštevati veliko dejavnikov. Obstajajo nekolk načinov za razpada celuloze, metabolnih poteh do tvorbo stirena in zanimivih izvirov celuloze.

----

==='''Kaj je dober vir celuloze ?'''===

Ker je celuloza pogost vir iz narave, veliko organskih materij jo vsebujejo v veliki količini. V potragi po idealnem viru celuloze pomembni dejavniki so: široka razpoložljivost, primernost za načrtovani sistem, finančna izvedljivost in nekonkurenčnost z hrano. Podrobno raziskovanje različne vire biomase, je pokazalo da so primerni tri možni vir: les, alge in toaletni papir.

Celulozni vir, kot je rabljeni toaletni papir imajo nizko kakovost celuloznih nitk, zaradi česar so neprimerni za mnoge običajne postopke recikliranja. Zato je ta odpadni material težje valorizirati kaj pravi da je zanimiva surovina za tvorbo stirena z gospodarskega in ekološkega vidika. Do sedaj je zelo malo aplikacij za uporabljene toaletne papirje iz kanalizacije. Podjetje KNN proizvaja izdelek, imenovan ''Recell®'', ki je očiščen toaletni papir-filtriran iz kanalizacije. Ta proces lahko močno poveča vrednost novo razvitega materiala, zaradi česar je zanimiv celulozni vir ki se lahko uporabi za tvorbo stirena.<ref name="prvi" />

----

==='''Razpad celuloze na glukozo'''===

''S. cerevisiae'' sama ne more razgraditi celulozo na glukozne enote. Zato je nujno izražanje encimov, imenovanih celulaze, ki razbijejo ''β''-(1,4)-glikozidne vezi med molekulami glukoze v celulozi. Te celulaze so različne in kombinacija treh lahko učinkovito razgradi celulozo: ''endoglukanaza'', ''celubiohidrolaza'' in ''β-glukozidaza''. V prejšnjih študijah so se dokazali, da ta tri encima tvorijo dobro skupino za razgradnjo celuloze.<ref name="drugi" />

Dodatno, celice uporabljajo glukozo kot substrat, torej bližji so encimi celicam, hitreje se glukoza pretvori v stiren. Da bi to postigni naredili so mini-celulosomni kompleks ki vsebuje vse tri encime pripenjene na enem ogrodju preko dockerina z kohezijsko domeno, ki je nato pritrjen na celično steno kvasovke. Gradben ogrodje (CipA3) je pripeto na kvasovkin receptor za parjenje AGA2. <ref name="tretji" />

----

==='''Pretvorba glukoze v StyGreen'''===

Naslednja stopnja je tvorba stirena preko nekolk korakov ki se odvijajo v celici. Da bi se glukoza pretvorila v stiren, najprej je nujno vključiti se v glikolizi, pretvoriti se v fosfoenolpiruvata (PEP) ki potem se pretvori v Phe preko šikimi metabolne poti. Da bi se pretvoril Phe v trans-cinamat, potreben je katalizator ''fenilalanin amonum liaza 2.'' (PAL2) Naslednja stopnja je pretvorba trans-cinamata v stiren preko endogenega encima ''dekarboksilaza ferulne kisline 1''. (FDC1) Za večjo tvorbo stirena je bil izbran PAL2 encim iz ''A. Thaliana'' ker je bil najaktivnejši in so bili že poskusi z njim pri delu s kvasovkami. McKenna, R., Thompson, B., Pugh, S., & Nielsen, D. R. (2014). Rational and combinatorial approaches to engineering styrene production by Saccharomyces cerevisiae. <ref name="četrti" />
----

==='''Kako narediti GSO kvasovke za to nameno?'''===

Namesto da bi v celici dali več plazmidov, ki vsebujejo zaporedje celulaze, ogrodja in PAL2, bila je predlagana uporaba ''CRISPR-Cas9'' v kombinaciji s homologno rekombinacijo za uvedbo celotnega sistema v genom in tako narediti bolj stabilni celulosom. Poleg tega bi to odpravilo zapletene korake kloniranja, ki so potrebni za ustvarjanje velikih plazmidov. Z uporabo te strategije se lahko istočasno preoblikujejo več genov (tri celulaze, ogrodje in PAL2), nato pa bo potekala homologna rekombinacija na mestu preloma dvojne verige od CRISPR-Cas9. Uporaba CRISPR-Cas9 ima dodatno korist, ker tudi odpravlja potrebo po dodajanju antibiotikov ali aminokislin na rastni medij.

Začetni mini-celulozni ekspresijski sistem je pod nadzorom promotorjev galaktoze kaj prepreči rast na celuloznih odpadkov. Sistem rabi galaktozo da se začne izražanje, a promotorji galaktoze so regulirani z negativno povratno zanko preko glukoze. Posledično celulosom bo zmanjšal takoj svojo ekspresijo. Za odpravo te težave je bil izbran promotor TEF1 ki ima lasnosti izražanja na visoki stopnji.<ref name="peti" />

----

==='''Kako poteka celotni proces ?'''===

Ker je sam projekt zamišljen da bi potem delal na veliko industrisko stopnjo, naredili so sistem bioreaktorja ki bo proizvajal StyGreen. Mini tovarna bo imela tri oddelka : celulozno preprocesiranje, glavni bioreaktorni rezervoar in odelek za čiščenje stirena.

1.Celulozno predprocesiranje se izvaja v mlinu z žogicami kot pri KNN celulozi (Recell®). Sam proces ne uporablja močne kemikalije in zviša topljivost celuloze tako da je
celulosom učinkovejši.

2.V glavnem bioreaktorju je konstantna proizvodnja stirena. Vsebuje dvofazni medij iz vode in nepolarnega topila ki je etil acetat ker ima pravo gostoto. (ne tvori micele in ne
denaturira proteine kot bi druga topila) Stiren ki se tvori ima afiniteto za nepolarno okolje (log P=2,7) in zato je v organski fazi. Razlike v gostoti omogočajo ločitev med
fazami, organska faza se lahko nato izloči in se pripelje do mesta za čiščenje stirena.

3.V delu kje je čiščenje stirena, organska faza je reverzno sprana z vodo da bi se izgonili polarnih nečistoč. Ta voda gre nazaj v bioreaktorju da ne pride do zagube. Etil acetat
se upari na srednji vakuum, pa se reciklira v glavnem bioreaktorju, pričemer dobimo stiren v olju. Stirena iz te zmesi očistimo z uparjanjem pod močnejšim vakuumom, ostanek olja
se reciklira v rezervoarju. Ko biomasa kvasovk v številnih rezervoarjih preseže idealne pogoje za fermentacijo, jo lahko izpustimo in recikliramo v nov medij, saj YPD medij
vsebuje ekstrakt kvasovk. Zato vse, kar se odstrani iz rezervoarja, razen stirena, se vrne nazaj v rezervoar. To je industrijski postopek, ki ustvarja zelo malo odpadkov, medtem
prinaša znatne količine stirena.<ref name="šesti" />

Proizvoni obrat zahteva konstantni vnos celuloznega medija, malo vnosa vode in etil acetata, mešanje in hlajenje.

----

==='''Detekcija stirena s RP-HPLC UV DAD'''===

Bilo je proverjeno če je celotni proces resno naredil stirena kot končni produkt s pomočjo ''RP-HPLC-DAD''. HPLC metod za detekcijo stirena je uporabil metanol in vodo kot mobilna faza ki je bila gradientna. Določili so retencijski čas stirena v teh pogojih ob 17,5 min. Seve so gojili dva dni na gojišču z ''2%'' glukoze in ''0,5 g / L'' fenilalanina (L-fenilalanina) kaj je omogočalo hitrejšo tvorbo stirena.

Pripravili so štiri različne kulture:

a. kontrolo s fenilalaninom (Ctrl),
b. sev, ki je vseboval PAL2 s fenilalaninom (PAL2 +),
c. sev, ki je vseboval PAL2 brez fenilalanina (PAL2-)
d. sev, ki je vseboval PAL2 in celulozo s fenilalaninom (PAL2 ++)

Po inkubaciji, celično kulturo so centrifugirali in supernatant dali na kolono.

Kot je razvidno iz slike,<ref name="sedmi" /> vrh opažen pri 17,5 min, kaže na tvorbo stirena v celicah. Drugi vrh pri 10 min, pa ni prisoten pri negativni kontroli, je trans-cinamat-prekurzor stirena. Očitno je da je vrh trans-cinamata večji od stirenskega kaj ukaže da je pretvorba trans-cinamata v stiren v tih pogojih omejena.

Pri stirenskem vrhu, lahko opazimo razlike med testiranimi sevi. Med vsemi tremi sevi, ki vsebujejo PAL2, je očitna razlika v primerjavi s kontrolo, kar kaže na uspešno proizvodnjo stirena. Primerjava PAL2 in PAL2 + kaže, da dodajanje fenilalanina ni potrebno da bi se začela sama transformacija v stiren. V spodnji tabeli je prikazan približek proizvedene količine stirena. Ti rezultati kažejo, da so uspešno proizvedli stiren v kvasovki iz glukoze.<ref name="sedmi" />

----

== ZAKLJUČEK ==

Zelo je pomembno ohraniti naš planet za generacije ki še prihajajo. Ekipa iz Groningena je naredila korak k temu z razvojem projekta StyGreen, saj pričakujejo da bo ta tehnologija spremenila trg plastike iz črne v zeleno. Lahko zaključimo da je to dobar način zmanjšanja uporabe fosilnih goriv v proizvodnji plastike, vendar pa še vedno nimamo rešitev za vprašanje ''» Kako se znebiti plastike?«
''

----
==VIRI==

<ref name="prvi" /> 1. [http://www.knncellulose.nl]/ pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="drugi" /> 2. Wen, F., Sun, J., & Zhao, H. (2010). Yeast surface display of trifunctional minicellulosomes for simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to ethanol. Applied and Environmental Microbiology, 76(4), 1251–60. http://doi.org/10.1128/AEM.01687-09

<ref name="tretji" /> 3. [http://2018.igem.org/Team:Groningen/Model/Molecular_Dynamics] pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="četrti" /> 4. McKenna, R., Thompson, B., Pugh, S., & Nielsen, D. R. (2014). Rational and combinatorial approaches to engineering styrene production by Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories, 13(1), 123. http://doi.org/10.1186/s12934-014-0123-2

<ref name="peti" /> 5. https://sites.tufts.edu/crispr/genome-editing/homology-directed-repair/ pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="šesti" /> 6. http://2018.igem.org/Team:Groningen/Applied_Design pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="sedmi" /> 7. http://2018.igem.org/Team:Groningen/Results pridobljeno dne 12.01.2019

7. http://2018.igem.org/Team:Groningen/Results pridobljeno dne 12.01.2019

StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov:

2019-01-15T14:50:22Z

Milena Stojkovska: /* VIRI */

''StyGreen'' je projekt študentske ekipe iz Groningena, Nizozemska s katerem so se predstavili na IGEM 2018 tekmovanju. Namen projekta je proizvodnja eko-stirena v organizmu ''S.cervisiae'' z uporabo odpadne celuloze kot obnovljiv vir.

==UVOD==

Proizvodnja veliko kemikalij je na podlagi fosilnih goriv ki so omejen resurs v svetu. Kot že vemo in se veliko govori da ti resursi se bojo popolnoma izkoristili v naslednjih nekolk 10-ih letih, zato je velika poudarjenost da jih zamenjamo z bio-obnovljivimi resursi in trajnostnih proizvodnih procesov. Ta projekt se zalaga za razvoj bio-gospodarstva da bi imeli bolj zelen planet preko raziskave in razvoja alternativnih poteh. Eden od njih je alternativna proizvodnja stirena.
Monomerni stiren je osnova za proizvodnjo plasticnih polimerov kot so akrilonitrilni butadien stiren (ABS), guma iz stiren butadiena ali prečnopovezanega polistirena. Nepolarna in aromatična struktura stirenov omogoča želenih fizičnih, kemijskih in električnih lasnotsti ki jih ne moremo dobiti pri drugih materijalih. Imajo širok spekter uporabe kot so LEGO kocke, industrijske gume, kolesarske gume ali izolacijski materiali v elektronskih napravah. V zadnjih 70 letih so izdelki iz stirena postali del našemu življenju in so nenadomestljivi za številne industrijo. Zato se bo povpraševanje po stirenu neizogibno hitro začelo. Razvoj alternativne proizvodne poti je zato izjemno pomemben.

----

== PRISTOPI SINTEZNE BIOLOGIJE K PROIZVAJANJU StyGreen IZDELKA ==

S pomočjo SB lahko izkoristimo mikroorganizme ki nam bojo tvorili željeno spojino, kaj predstavlja močno tehnologijo v znanosti. Stiren je podoben ''Phe'', ki pa je prisoten v živih bitij in omogoča da je to pravi prekurzor v njegovi sintezi v kvasovki. Stiren se bo konstitutivno proizvajal in ta produkt so poimenovali ''StyGreen''-alternativno narejen stiren.

Mikroorganizmi lahko rastejo na sladkorjih ali odpatkih ki vsebujejo veliko sladkorjev v formi glukoznih polimerov ki jim rečemo celuloza. Cilj je ustvariti sistem bioprocesiranja s kombiniranjem vseh potrebnih korakov za pretvorbo celuloze v stiren v eni robustni celični tovarni. Molekule StyGreen-a, ki se bojo tvorile, lahko nato se uporabijo v vseh vrstah konvencionalnih industrijskih procesov, ki se nanašajo na plastiko, ki ni namenjena eni sami uporabi. Na ta način hkrati zagotavljamo trajnostno razpoložljivost stirena in zeleni planet za prihodnje generacije.

V procesu načrtovanja poti od celuloze do stirena, morajo se upoštevati veliko dejavnikov. Obstajajo nekolk načinov za razpada celuloze, metabolnih poteh do tvorbo stirena in zanimivih izvirov celuloze.

----

==='''Kaj je dober vir celuloze ?'''===

Ker je celuloza pogost vir iz narave, veliko organskih materij jo vsebujejo v veliki količini. V potragi po idealnem viru celuloze pomembni dejavniki so: široka razpoložljivost, primernost za načrtovani sistem, finančna izvedljivost in nekonkurenčnost z hrano. Podrobno raziskovanje različne vire biomase, je pokazalo da so primerni tri možni vir: les, alge in toaletni papir.

Celulozni vir, kot je rabljeni toaletni papir imajo nizko kakovost celuloznih nitk, zaradi česar so neprimerni za mnoge običajne postopke recikliranja. Zato je ta odpadni material težje valorizirati kaj pravi da je zanimiva surovina za tvorbo stirena z gospodarskega in ekološkega vidika. Do sedaj je zelo malo aplikacij za uporabljene toaletne papirje iz kanalizacije. Podjetje KNN proizvaja izdelek, imenovan ''Recell®'', ki je očiščen toaletni papir-filtriran iz kanalizacije. Ta proces lahko močno poveča vrednost novo razvitega materiala, zaradi česar je zanimiv celulozni vir ki se lahko uporabi za tvorbo stirena.<ref name="prvi" />

----

==='''Razpad celuloze na glukozo'''===

''S. cerevisiae'' sama ne more razgraditi celulozo na glukozne enote. Zato je nujno izražanje encimov, imenovanih celulaze, ki razbijejo ''β''-(1,4)-glikozidne vezi med molekulami glukoze v celulozi. Te celulaze so različne in kombinacija treh lahko učinkovito razgradi celulozo: ''endoglukanaza'', ''celubiohidrolaza'' in ''β-glukozidaza''. V prejšnjih študijah so se dokazali, da ta tri encima tvorijo dobro skupino za razgradnjo celuloze.<ref name="drugi" />

Dodatno, celice uporabljajo glukozo kot substrat, torej bližji so encimi celicam, hitreje se glukoza pretvori v stiren. Da bi to postigni naredili so mini-celulosomni kompleks ki vsebuje vse tri encime pripenjene na enem ogrodju preko dockerina z kohezijsko domeno, ki je nato pritrjen na celično steno kvasovke. Gradben ogrodje (CipA3) je pripeto na kvasovkin receptor za parjenje AGA2. <ref name="tretji" />

----

==='''Pretvorba glukoze v StyGreen'''===

Naslednja stopnja je tvorba stirena preko nekolk korakov ki se odvijajo v celici. Da bi se glukoza pretvorila v stiren, najprej je nujno vključiti se v glikolizi, pretvoriti se v fosfoenolpiruvata (PEP) ki potem se pretvori v Phe preko šikimi metabolne poti. Da bi se pretvoril Phe v trans-cinamat, potreben je katalizator ''fenilalanin amonum liaza 2.'' (PAL2) Naslednja stopnja je pretvorba trans-cinamata v stiren preko endogenega encima ''dekarboksilaza ferulne kisline 1''. (FDC1) Za večjo tvorbo stirena je bil izbran PAL2 encim iz ''A. Thaliana'' ker je bil najaktivnejši in so bili že poskusi z njim pri delu s kvasovkami. McKenna, R., Thompson, B., Pugh, S., & Nielsen, D. R. (2014). Rational and combinatorial approaches to engineering styrene production by Saccharomyces cerevisiae. <ref name="četrti" />
----

==='''Kako narediti GSO kvasovke za to nameno?'''===

Namesto da bi v celici dali več plazmidov, ki vsebujejo zaporedje celulaze, ogrodja in PAL2, bila je predlagana uporaba ''CRISPR-Cas9'' v kombinaciji s homologno rekombinacijo za uvedbo celotnega sistema v genom in tako narediti bolj stabilni celulosom. Poleg tega bi to odpravilo zapletene korake kloniranja, ki so potrebni za ustvarjanje velikih plazmidov. Z uporabo te strategije se lahko istočasno preoblikujejo več genov (tri celulaze, ogrodje in PAL2), nato pa bo potekala homologna rekombinacija na mestu preloma dvojne verige od CRISPR-Cas9. Uporaba CRISPR-Cas9 ima dodatno korist, ker tudi odpravlja potrebo po dodajanju antibiotikov ali aminokislin na rastni medij.

Začetni mini-celulozni ekspresijski sistem je pod nadzorom promotorjev galaktoze kaj prepreči rast na celuloznih odpadkov. Sistem rabi galaktozo da se začne izražanje, a promotorji galaktoze so regulirani z negativno povratno zanko preko glukoze. Posledično celulosom bo zmanjšal takoj svojo ekspresijo. Za odpravo te težave je bil izbran promotor TEF1 ki ima lasnosti izražanja na visoki stopnji.<ref name="peti" />

----

==='''Kako poteka celotni proces ?'''===

Ker je sam projekt zamišljen da bi potem delal na veliko industrisko stopnjo, naredili so sistem bioreaktorja ki bo proizvajal StyGreen. Mini tovarna bo imela tri oddelka : celulozno preprocesiranje, glavni bioreaktorni rezervoar in odelek za čiščenje stirena.

1.Celulozno predprocesiranje se izvaja v mlinu z žogicami kot pri KNN celulozi (Recell®). Sam proces ne uporablja močne kemikalije in zviša topljivost celuloze tako da je
celulosom učinkovejši.

2.V glavnem bioreaktorju je konstantna proizvodnja stirena. Vsebuje dvofazni medij iz vode in nepolarnega topila ki je etil acetat ker ima pravo gostoto. (ne tvori micele in ne
denaturira proteine kot bi druga topila) Stiren ki se tvori ima afiniteto za nepolarno okolje (log P=2,7) in zato je v organski fazi. Razlike v gostoti omogočajo ločitev med
fazami, organska faza se lahko nato izloči in se pripelje do mesta za čiščenje stirena.

3.V delu kje je čiščenje stirena, organska faza je reverzno sprana z vodo da bi se izgonili polarnih nečistoč. Ta voda gre nazaj v bioreaktorju da ne pride do zagube. Etil acetat
se upari na srednji vakuum, pa se reciklira v glavnem bioreaktorju, pričemer dobimo stiren v olju. Stirena iz te zmesi očistimo z uparjanjem pod močnejšim vakuumom, ostanek olja
se reciklira v rezervoarju. Ko biomasa kvasovk v številnih rezervoarjih preseže idealne pogoje za fermentacijo, jo lahko izpustimo in recikliramo v nov medij, saj YPD medij
vsebuje ekstrakt kvasovk. Zato vse, kar se odstrani iz rezervoarja, razen stirena, se vrne nazaj v rezervoar. To je industrijski postopek, ki ustvarja zelo malo odpadkov, medtem
prinaša znatne količine stirena.<ref name="šesti" />

Proizvoni obrat zahteva konstantni vnos celuloznega medija, malo vnosa vode in etil acetata, mešanje in hlajenje.

----

==='''Detekcija stirena s RP-HPLC UV DAD'''===

Bilo je proverjeno če je celotni proces resno naredil stirena kot končni produkt s pomočjo ''RP-HPLC-DAD''. HPLC metod za detekcijo stirena je uporabil metanol in vodo kot mobilna faza ki je bila gradientna. Določili so retencijski čas stirena v teh pogojih ob 17,5 min. Seve so gojili dva dni na gojišču z ''2%'' glukoze in ''0,5 g / L'' fenilalanina (L-fenilalanina) kaj je omogočalo hitrejšo tvorbo stirena.

Pripravili so štiri različne kulture:

a. kontrolo s fenilalaninom (Ctrl),
b. sev, ki je vseboval PAL2 s fenilalaninom (PAL2 +),
c. sev, ki je vseboval PAL2 brez fenilalanina (PAL2-)
d. sev, ki je vseboval PAL2 in celulozo s fenilalaninom (PAL2 ++)

Po inkubaciji, celično kulturo so centrifugirali in supernatant dali na kolono.

Kot je razvidno iz slike,<ref name="sedmi" /> vrh opažen pri 17,5 min, kaže na tvorbo stirena v celicah. Drugi vrh pri 10 min, pa ni prisoten pri negativni kontroli, je trans-cinamat-prekurzor stirena. Očitno je da je vrh trans-cinamata večji od stirenskega kaj ukaže da je pretvorba trans-cinamata v stiren v tih pogojih omejena.

Pri stirenskem vrhu, lahko opazimo razlike med testiranimi sevi. Med vsemi tremi sevi, ki vsebujejo PAL2, je očitna razlika v primerjavi s kontrolo, kar kaže na uspešno proizvodnjo stirena. Primerjava PAL2 in PAL2 + kaže, da dodajanje fenilalanina ni potrebno da bi se začela sama transformacija v stiren. V spodnji tabeli je prikazan približek proizvedene količine stirena. Ti rezultati kažejo, da so uspešno proizvedli stiren v kvasovki iz glukoze.<ref name="sedmi" />

----

== ZAKLJUČEK ==

Zelo je pomembno ohraniti naš planet za generacije ki še prihajajo. Ekipa iz Groningena je naredila korak k temu z razvojem projekta StyGreen, saj pričakujejo da bo ta tehnologija spremenila trg plastike iz črne v zeleno. Lahko zaključimo da je to dobar način zmanjšanja uporabe fosilnih goriv v proizvodnji plastike, vendar pa še vedno nimamo rešitev za vprašanje ''» Kako se znebiti plastike?«
''

----
==VIRI==

<ref name="prvi" /> 1. [http://www.knncellulose.nl]/ pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="drugi" /> 2. Wen, F., Sun, J., & Zhao, H. (2010). Yeast surface display of trifunctional minicellulosomes for simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to ethanol. Applied and Environmental Microbiology, 76(4), 1251–60. http://doi.org/10.1128/AEM.01687-09

<ref name="tretji" /> 3. [http://2018.igem.org/Team:Groningen/Model/Molecular_Dynamics] pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="četrti" /> 4. McKenna, R., Thompson, B., Pugh, S., & Nielsen, D. R. (2014). Rational and combinatorial approaches to engineering styrene production by Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories, 13(1), 123. http://doi.org/10.1186/s12934-014-0123-2

<ref name="peti" /> 5. https://sites.tufts.edu/crispr/genome-editing/homology-directed-repair/ pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="šesti" /> 6. http://2018.igem.org/Team:Groningen/Applied_Design pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="sedmi" /> 7. http://2018.igem.org/Team:Groningen/Results pridobljeno dne 12.01.2019

StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov:

2019-01-15T14:48:43Z

Milena Stojkovska:

''StyGreen'' je projekt študentske ekipe iz Groningena, Nizozemska s katerem so se predstavili na IGEM 2018 tekmovanju. Namen projekta je proizvodnja eko-stirena v organizmu ''S.cervisiae'' z uporabo odpadne celuloze kot obnovljiv vir.

==UVOD==

Proizvodnja veliko kemikalij je na podlagi fosilnih goriv ki so omejen resurs v svetu. Kot že vemo in se veliko govori da ti resursi se bojo popolnoma izkoristili v naslednjih nekolk 10-ih letih, zato je velika poudarjenost da jih zamenjamo z bio-obnovljivimi resursi in trajnostnih proizvodnih procesov. Ta projekt se zalaga za razvoj bio-gospodarstva da bi imeli bolj zelen planet preko raziskave in razvoja alternativnih poteh. Eden od njih je alternativna proizvodnja stirena.
Monomerni stiren je osnova za proizvodnjo plasticnih polimerov kot so akrilonitrilni butadien stiren (ABS), guma iz stiren butadiena ali prečnopovezanega polistirena. Nepolarna in aromatična struktura stirenov omogoča želenih fizičnih, kemijskih in električnih lasnotsti ki jih ne moremo dobiti pri drugih materijalih. Imajo širok spekter uporabe kot so LEGO kocke, industrijske gume, kolesarske gume ali izolacijski materiali v elektronskih napravah. V zadnjih 70 letih so izdelki iz stirena postali del našemu življenju in so nenadomestljivi za številne industrijo. Zato se bo povpraševanje po stirenu neizogibno hitro začelo. Razvoj alternativne proizvodne poti je zato izjemno pomemben.

----

== PRISTOPI SINTEZNE BIOLOGIJE K PROIZVAJANJU StyGreen IZDELKA ==

S pomočjo SB lahko izkoristimo mikroorganizme ki nam bojo tvorili željeno spojino, kaj predstavlja močno tehnologijo v znanosti. Stiren je podoben ''Phe'', ki pa je prisoten v živih bitij in omogoča da je to pravi prekurzor v njegovi sintezi v kvasovki. Stiren se bo konstitutivno proizvajal in ta produkt so poimenovali ''StyGreen''-alternativno narejen stiren.

Mikroorganizmi lahko rastejo na sladkorjih ali odpatkih ki vsebujejo veliko sladkorjev v formi glukoznih polimerov ki jim rečemo celuloza. Cilj je ustvariti sistem bioprocesiranja s kombiniranjem vseh potrebnih korakov za pretvorbo celuloze v stiren v eni robustni celični tovarni. Molekule StyGreen-a, ki se bojo tvorile, lahko nato se uporabijo v vseh vrstah konvencionalnih industrijskih procesov, ki se nanašajo na plastiko, ki ni namenjena eni sami uporabi. Na ta način hkrati zagotavljamo trajnostno razpoložljivost stirena in zeleni planet za prihodnje generacije.

V procesu načrtovanja poti od celuloze do stirena, morajo se upoštevati veliko dejavnikov. Obstajajo nekolk načinov za razpada celuloze, metabolnih poteh do tvorbo stirena in zanimivih izvirov celuloze.

----

==='''Kaj je dober vir celuloze ?'''===

Ker je celuloza pogost vir iz narave, veliko organskih materij jo vsebujejo v veliki količini. V potragi po idealnem viru celuloze pomembni dejavniki so: široka razpoložljivost, primernost za načrtovani sistem, finančna izvedljivost in nekonkurenčnost z hrano. Podrobno raziskovanje različne vire biomase, je pokazalo da so primerni tri možni vir: les, alge in toaletni papir.

Celulozni vir, kot je rabljeni toaletni papir imajo nizko kakovost celuloznih nitk, zaradi česar so neprimerni za mnoge običajne postopke recikliranja. Zato je ta odpadni material težje valorizirati kaj pravi da je zanimiva surovina za tvorbo stirena z gospodarskega in ekološkega vidika. Do sedaj je zelo malo aplikacij za uporabljene toaletne papirje iz kanalizacije. Podjetje KNN proizvaja izdelek, imenovan ''Recell®'', ki je očiščen toaletni papir-filtriran iz kanalizacije. Ta proces lahko močno poveča vrednost novo razvitega materiala, zaradi česar je zanimiv celulozni vir ki se lahko uporabi za tvorbo stirena.<ref name="prvi" />

----

==='''Razpad celuloze na glukozo'''===

''S. cerevisiae'' sama ne more razgraditi celulozo na glukozne enote. Zato je nujno izražanje encimov, imenovanih celulaze, ki razbijejo ''β''-(1,4)-glikozidne vezi med molekulami glukoze v celulozi. Te celulaze so različne in kombinacija treh lahko učinkovito razgradi celulozo: ''endoglukanaza'', ''celubiohidrolaza'' in ''β-glukozidaza''. V prejšnjih študijah so se dokazali, da ta tri encima tvorijo dobro skupino za razgradnjo celuloze.<ref name="drugi" />

Dodatno, celice uporabljajo glukozo kot substrat, torej bližji so encimi celicam, hitreje se glukoza pretvori v stiren. Da bi to postigni naredili so mini-celulosomni kompleks ki vsebuje vse tri encime pripenjene na enem ogrodju preko dockerina z kohezijsko domeno, ki je nato pritrjen na celično steno kvasovke. Gradben ogrodje (CipA3) je pripeto na kvasovkin receptor za parjenje AGA2. <ref name="tretji" />

----

==='''Pretvorba glukoze v StyGreen'''===

Naslednja stopnja je tvorba stirena preko nekolk korakov ki se odvijajo v celici. Da bi se glukoza pretvorila v stiren, najprej je nujno vključiti se v glikolizi, pretvoriti se v fosfoenolpiruvata (PEP) ki potem se pretvori v Phe preko šikimi metabolne poti. Da bi se pretvoril Phe v trans-cinamat, potreben je katalizator ''fenilalanin amonum liaza 2.'' (PAL2) Naslednja stopnja je pretvorba trans-cinamata v stiren preko endogenega encima ''dekarboksilaza ferulne kisline 1''. (FDC1) Za večjo tvorbo stirena je bil izbran PAL2 encim iz ''A. Thaliana'' ker je bil najaktivnejši in so bili že poskusi z njim pri delu s kvasovkami. McKenna, R., Thompson, B., Pugh, S., & Nielsen, D. R. (2014). Rational and combinatorial approaches to engineering styrene production by Saccharomyces cerevisiae. <ref name="četrti" />
----

==='''Kako narediti GSO kvasovke za to nameno?'''===

Namesto da bi v celici dali več plazmidov, ki vsebujejo zaporedje celulaze, ogrodja in PAL2, bila je predlagana uporaba ''CRISPR-Cas9'' v kombinaciji s homologno rekombinacijo za uvedbo celotnega sistema v genom in tako narediti bolj stabilni celulosom. Poleg tega bi to odpravilo zapletene korake kloniranja, ki so potrebni za ustvarjanje velikih plazmidov. Z uporabo te strategije se lahko istočasno preoblikujejo več genov (tri celulaze, ogrodje in PAL2), nato pa bo potekala homologna rekombinacija na mestu preloma dvojne verige od CRISPR-Cas9. Uporaba CRISPR-Cas9 ima dodatno korist, ker tudi odpravlja potrebo po dodajanju antibiotikov ali aminokislin na rastni medij.

Začetni mini-celulozni ekspresijski sistem je pod nadzorom promotorjev galaktoze kaj prepreči rast na celuloznih odpadkov. Sistem rabi galaktozo da se začne izražanje, a promotorji galaktoze so regulirani z negativno povratno zanko preko glukoze. Posledično celulosom bo zmanjšal takoj svojo ekspresijo. Za odpravo te težave je bil izbran promotor TEF1 ki ima lasnosti izražanja na visoki stopnji.<ref name="peti" />

----

==='''Kako poteka celotni proces ?'''===

Ker je sam projekt zamišljen da bi potem delal na veliko industrisko stopnjo, naredili so sistem bioreaktorja ki bo proizvajal StyGreen. Mini tovarna bo imela tri oddelka : celulozno preprocesiranje, glavni bioreaktorni rezervoar in odelek za čiščenje stirena.

1.Celulozno predprocesiranje se izvaja v mlinu z žogicami kot pri KNN celulozi (Recell®). Sam proces ne uporablja močne kemikalije in zviša topljivost celuloze tako da je
celulosom učinkovejši.

2.V glavnem bioreaktorju je konstantna proizvodnja stirena. Vsebuje dvofazni medij iz vode in nepolarnega topila ki je etil acetat ker ima pravo gostoto. (ne tvori micele in ne
denaturira proteine kot bi druga topila) Stiren ki se tvori ima afiniteto za nepolarno okolje (log P=2,7) in zato je v organski fazi. Razlike v gostoti omogočajo ločitev med
fazami, organska faza se lahko nato izloči in se pripelje do mesta za čiščenje stirena.

3.V delu kje je čiščenje stirena, organska faza je reverzno sprana z vodo da bi se izgonili polarnih nečistoč. Ta voda gre nazaj v bioreaktorju da ne pride do zagube. Etil acetat
se upari na srednji vakuum, pa se reciklira v glavnem bioreaktorju, pričemer dobimo stiren v olju. Stirena iz te zmesi očistimo z uparjanjem pod močnejšim vakuumom, ostanek olja
se reciklira v rezervoarju. Ko biomasa kvasovk v številnih rezervoarjih preseže idealne pogoje za fermentacijo, jo lahko izpustimo in recikliramo v nov medij, saj YPD medij
vsebuje ekstrakt kvasovk. Zato vse, kar se odstrani iz rezervoarja, razen stirena, se vrne nazaj v rezervoar. To je industrijski postopek, ki ustvarja zelo malo odpadkov, medtem
prinaša znatne količine stirena.<ref name="šesti" />

Proizvoni obrat zahteva konstantni vnos celuloznega medija, malo vnosa vode in etil acetata, mešanje in hlajenje.

----

==='''Detekcija stirena s RP-HPLC UV DAD'''===

Bilo je proverjeno če je celotni proces resno naredil stirena kot končni produkt s pomočjo ''RP-HPLC-DAD''. HPLC metod za detekcijo stirena je uporabil metanol in vodo kot mobilna faza ki je bila gradientna. Določili so retencijski čas stirena v teh pogojih ob 17,5 min. Seve so gojili dva dni na gojišču z ''2%'' glukoze in ''0,5 g / L'' fenilalanina (L-fenilalanina) kaj je omogočalo hitrejšo tvorbo stirena.

Pripravili so štiri različne kulture:

a. kontrolo s fenilalaninom (Ctrl),
b. sev, ki je vseboval PAL2 s fenilalaninom (PAL2 +),
c. sev, ki je vseboval PAL2 brez fenilalanina (PAL2-)
d. sev, ki je vseboval PAL2 in celulozo s fenilalaninom (PAL2 ++)

Po inkubaciji, celično kulturo so centrifugirali in supernatant dali na kolono.

Kot je razvidno iz slike,<ref name="sedmi" /> vrh opažen pri 17,5 min, kaže na tvorbo stirena v celicah. Drugi vrh pri 10 min, pa ni prisoten pri negativni kontroli, je trans-cinamat-prekurzor stirena. Očitno je da je vrh trans-cinamata večji od stirenskega kaj ukaže da je pretvorba trans-cinamata v stiren v tih pogojih omejena.

Pri stirenskem vrhu, lahko opazimo razlike med testiranimi sevi. Med vsemi tremi sevi, ki vsebujejo PAL2, je očitna razlika v primerjavi s kontrolo, kar kaže na uspešno proizvodnjo stirena. Primerjava PAL2 in PAL2 + kaže, da dodajanje fenilalanina ni potrebno da bi se začela sama transformacija v stiren. V spodnji tabeli je prikazan približek proizvedene količine stirena. Ti rezultati kažejo, da so uspešno proizvedli stiren v kvasovki iz glukoze.<ref name="sedmi" />

----

== ZAKLJUČEK ==

Zelo je pomembno ohraniti naš planet za generacije ki še prihajajo. Ekipa iz Groningena je naredila korak k temu z razvojem projekta StyGreen, saj pričakujejo da bo ta tehnologija spremenila trg plastike iz črne v zeleno. Lahko zaključimo da je to dobar način zmanjšanja uporabe fosilnih goriv v proizvodnji plastike, vendar pa še vedno nimamo rešitev za vprašanje ''» Kako se znebiti plastike?«
''

----
==VIRI==

<ref name="prvi" /> 1. [http://www.knncellulose.nl]/ pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="drugi" />2. Wen, F., Sun, J., & Zhao, H. (2010). Yeast surface display of trifunctional minicellulosomes for simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to ethanol. Applied and Environmental Microbiology, 76(4), 1251–60. http://doi.org/10.1128/AEM.01687-09

<ref name="tretji" /> [3.http://2018.igem.org/Team:Groningen/Model/Molecular_Dynamics] pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="četrti" /> 4. McKenna, R., Thompson, B., Pugh, S., & Nielsen, D. R. (2014). Rational and combinatorial approaches to engineering styrene production by Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories, 13(1), 123. http://doi.org/10.1186/s12934-014-0123-2

<ref name="peti" /> 5. https://sites.tufts.edu/crispr/genome-editing/homology-directed-repair/ pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="šesti" />6. http://2018.igem.org/Team:Groningen/Applied_Design pridobljeno dne 12.01.2019

<ref name="sedmi" />7. http://2018.igem.org/Team:Groningen/Results pridobljeno dne 12.01.2019

StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov:

2019-01-15T14:35:06Z

Milena Stojkovska:

''StyGreen'' je projekt študentske ekipe iz Groningena, Nizozemska s katerem so se predstavili na IGEM 2018 tekmovanju. Namen projekta je proizvodnja eko-stirena v organizmu ''S.cervisiae'' z uporabo odpadne celuloze kot obnovljiv vir.

==UVOD==

Proizvodnja veliko kemikalij je na podlagi fosilnih goriv ki so omejen resurs v svetu. Kot že vemo in se veliko govori da ti resursi se bojo popolnoma izkoristili v naslednjih nekolk 10-ih letih, zato je velika poudarjenost da jih zamenjamo z bio-obnovljivimi resursi in trajnostnih proizvodnih procesov. Ta projekt se zalaga za razvoj bio-gospodarstva da bi imeli bolj zelen planet preko raziskave in razvoja alternativnih poteh. Eden od njih je alternativna proizvodnja stirena.
Monomerni stiren je osnova za proizvodnjo plasticnih polimerov kot so akrilonitrilni butadien stiren (ABS), guma iz stiren butadiena ali prečnopovezanega polistirena. Nepolarna in aromatična struktura stirenov omogoča želenih fizičnih, kemijskih in električnih lasnotsti ki jih ne moremo dobiti pri drugih materijalih. Imajo širok spekter uporabe kot so LEGO kocke, industrijske gume, kolesarske gume ali izolacijski materiali v elektronskih napravah. V zadnjih 70 letih so izdelki iz stirena postali del našemu življenju in so nenadomestljivi za številne industrijo. Zato se bo povpraševanje po stirenu neizogibno hitro začelo. Razvoj alternativne proizvodne poti je zato izjemno pomemben.

----

== PRISTOPI SINTEZNE BIOLOGIJE K PROIZVAJANJU StyGreen IZDELKA ==

S pomočjo SB lahko izkoristimo mikroorganizme ki nam bojo tvorili željeno spojino, kaj predstavlja močno tehnologijo v znanosti. Stiren je podoben ''Phe'', ki pa je prisoten v živih bitij in omogoča da je to pravi prekurzor v njegovi sintezi v kvasovki. Stiren se bo konstitutivno proizvajal in ta produkt so poimenovali ''StyGreen''-alternativno narejen stiren.

Mikroorganizmi lahko rastejo na sladkorjih ali odpatkih ki vsebujejo veliko sladkorjev v formi glukoznih polimerov ki jim rečemo celuloza. Cilj je ustvariti sistem bioprocesiranja s kombiniranjem vseh potrebnih korakov za pretvorbo celuloze v stiren v eni robustni celični tovarni. Molekule StyGreen-a, ki se bojo tvorile, lahko nato se uporabijo v vseh vrstah konvencionalnih industrijskih procesov, ki se nanašajo na plastiko, ki ni namenjena eni sami uporabi. Na ta način hkrati zagotavljamo trajnostno razpoložljivost stirena in zeleni planet za prihodnje generacije.

V procesu načrtovanja poti od celuloze do stirena, morajo se upoštevati veliko dejavnikov. Obstajajo nekolk načinov za razpada celuloze, metabolnih poteh do tvorbo stirena in zanimivih izvirov celuloze.

----

==='''Kaj je dober vir celuloze ?'''===

Ker je celuloza pogost vir iz narave, veliko organskih materij jo vsebujejo v veliki količini. V potragi po idealnem viru celuloze pomembni dejavniki so: široka razpoložljivost, primernost za načrtovani sistem, finančna izvedljivost in nekonkurenčnost z hrano. Podrobno raziskovanje različne vire biomase, je pokazalo da so primerni tri možni vir: les, alge in toaletni papir.

Celulozni vir, kot je rabljeni toaletni papir imajo nizko kakovost celuloznih nitk, zaradi česar so neprimerni za mnoge običajne postopke recikliranja. Zato je ta odpadni material težje valorizirati kaj pravi da je zanimiva surovina za tvorbo stirena z gospodarskega in ekološkega vidika. Do sedaj je zelo malo aplikacij za uporabljene toaletne papirje iz kanalizacije. Podjetje KNN proizvaja izdelek, imenovan [[Media:''Recell®'']], ki je očiščen toaletni papir-filtriran iz kanalizacije. Ta proces lahko močno poveča vrednost novo razvitega materiala, zaradi česar je zanimiv celulozni vir ki se lahko uporabi za tvorbo stirena.<ref name="prvi" />

----

==='''Razpad celuloze na glukozo'''===

''S. cerevisiae'' sama ne more razgraditi celulozo na glukozne enote. Zato je nujno izražanje encimov, imenovanih celulaze, ki razbijejo ''β''-(1,4)-glikozidne vezi med molekulami glukoze v celulozi. Te celulaze so različne in kombinacija treh lahko učinkovito razgradi celulozo: ''endoglukanaza'', ''celubiohidrolaza'' in ''β-glukozidaza''. V prejšnjih študijah so se dokazali, da ta tri encima tvorijo dobro skupino za razgradnjo celuloze.<ref name="drugi" /> Wen, F., Sun, J., & Zhao, H. (2010). Yeast surface display of trifunctional minicellulosomes for simultaneous saccharification and fermentation of cellulose to ethanol. Applied and Environmental Microbiology, 76(4), 1251–60. http://doi.org/10.1128/AEM.01687-09

Dodatno, celice uporabljajo glukozo kot substrat, torej bližji so encimi celicam, hitreje se glukoza pretvori v stiren. Da bi to postigni naredili so mini-celulosomni kompleks ki vsebuje vse tri encime pripenjene na enem ogrodju preko dockerina z kohezijsko domeno, ki je nato pritrjen na celično steno kvasovke. Gradben ogrodje (CipA3) je pripeto na kvasovkin receptor za parjenje AGA2. <ref name="tretji" />

----

==='''Pretvorba glukoze v StyGreen'''===

Naslednja stopnja je tvorba stirena preko nekolk korakov ki se odvijajo v celici. Da bi se glukoza pretvorila v stiren, najprej je nujno vključiti se v glikolizi, pretvoriti se v fosfoenolpiruvata (PEP) ki potem se pretvori v Phe preko šikimi metabolne poti. Da bi se pretvoril Phe v trans-cinamat, potreben je katalizator ''fenilalanin amonum liaza 2.'' (PAL2) Naslednja stopnja je pretvorba trans-cinamata v stiren preko endogenega encima ''dekarboksilaza ferulne kisline 1''. (FDC1) Za večjo tvorbo stirena je bil izbran PAL2 encim iz ''A. Thaliana'' ker je bil najaktivnejši in so bili že poskusi z njim pri delu s kvasovkami. McKenna, R., Thompson, B., Pugh, S., & Nielsen, D. R. (2014). Rational and combinatorial approaches to engineering styrene production by Saccharomyces cerevisiae. <ref name="četrti" /> McKenna, R., Thompson, B., Pugh, S., & Nielsen, D. R. (2014). Rational and combinatorial approaches to engineering styrene production by Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories, 13(1), 123. http://doi.org/10.1186/s12934-014-0123-2

----

==='''Kako narediti GSO kvasovke za to nameno?'''===

Namesto da bi v celici dali več plazmidov, ki vsebujejo zaporedje celulaze, ogrodja in PAL2, bila je predlagana uporaba ''CRISPR-Cas9'' v kombinaciji s homologno rekombinacijo za uvedbo celotnega sistema v genom in tako narediti bolj stabilni celulosom. Poleg tega bi to odpravilo zapletene korake kloniranja, ki so potrebni za ustvarjanje velikih plazmidov. Z uporabo te strategije se lahko istočasno preoblikujejo več genov (tri celulaze, ogrodje in PAL2), nato pa bo potekala homologna rekombinacija na mestu preloma dvojne verige od CRISPR-Cas9. Uporaba CRISPR-Cas9 ima dodatno korist, ker tudi odpravlja potrebo po dodajanju antibiotikov ali aminokislin na rastni medij.

Začetni mini-celulozni ekspresijski sistem je pod nadzorom promotorjev galaktoze kaj prepreči rast na celuloznih odpadkov. Sistem rabi galaktozo da se začne izražanje, a promotorji galaktoze so regulirani z negativno povratno zanko preko glukoze. Posledično celulosom bo zmanjšal takoj svojo ekspresijo. Za odpravo te težave je bil izbran promotor TEF1 ki ima lasnosti izražanja na visoki stopnji.<ref name="peti" />

----

==='''Kako poteka celotni proces ?'''===

Ker je sam projekt zamišljen da bi potem delal na veliko industrisko stopnjo, naredili so sistem bioreaktorja ki bo proizvajal StyGreen. Mini tovarna bo imela tri oddelka : celulozno preprocesiranje, glavni bioreaktorni rezervoar in odelek za čiščenje stirena.

1.Celulozno predprocesiranje se izvaja v mlinu z žogicami kot pri KNN celulozi (Recell®). Sam proces ne uporablja močne kemikalije in zviša topljivost celuloze tako da je
celulosom učinkovejši.

2.V glavnem bioreaktorju je konstantna proizvodnja stirena. Vsebuje dvofazni medij iz vode in nepolarnega topila ki je etil acetat ker ima pravo gostoto. (ne tvori micele in ne
denaturira proteine kot bi druga topila) Stiren ki se tvori ima afiniteto za nepolarno okolje (log P=2,7) in zato je v organski fazi. Razlike v gostoti omogočajo ločitev med
fazami, organska faza se lahko nato izloči in se pripelje do mesta za čiščenje stirena.

3.V delu kje je čiščenje stirena, organska faza je reverzno sprana z vodo da bi se izgonili polarnih nečistoč. Ta voda gre nazaj v bioreaktorju da ne pride do zagube. Etil acetat
se upari na srednji vakuum, pa se reciklira v glavnem bioreaktorju, pričemer dobimo stiren v olju. Stirena iz te zmesi očistimo z uparjanjem pod močnejšim vakuumom, ostanek olja
se reciklira v rezervoarju. Ko biomasa kvasovk v številnih rezervoarjih preseže idealne pogoje za fermentacijo, jo lahko izpustimo in recikliramo v nov medij, saj YPD medij
vsebuje ekstrakt kvasovk. Zato vse, kar se odstrani iz rezervoarja, razen stirena, se vrne nazaj v rezervoar. To je industrijski postopek, ki ustvarja zelo malo odpadkov, medtem
prinaša znatne količine stirena.<ref name="šesti" />

Proizvoni obrat zahteva konstantni vnos celuloznega medija, malo vnosa vode in etil acetata, mešanje in hlajenje.

----

==='''Detekcija stirena s RP-HPLC UV DAD'''===

Bilo je proverjeno če je celotni proces resno naredil stirena kot končni produkt s pomočjo ''RP-HPLC-DAD''. HPLC metod za detekcijo stirena je uporabil metanol in vodo kot mobilna faza ki je bila gradientna. Določili so retencijski čas stirena v teh pogojih ob 17,5 min. Seve so gojili dva dni na gojišču z ''2%'' glukoze in ''0,5 g / L'' fenilalanina (L-fenilalanina) kaj je omogočalo hitrejšo tvorbo stirena.

Pripravili so štiri različne kulture:

a. kontrolo s fenilalaninom (Ctrl),
b. sev, ki je vseboval PAL2 s fenilalaninom (PAL2 +),
c. sev, ki je vseboval PAL2 brez fenilalanina (PAL2-)
d. sev, ki je vseboval PAL2 in celulozo s fenilalaninom (PAL2 ++)

Po inkubaciji, celično kulturo so centrifugirali in supernatant dali na kolono.

Kot je razvidno iz slike,<ref name="sedmi" /> vrh opažen pri 17,5 min, kaže na tvorbo stirena v celicah. Drugi vrh pri 10 min, pa ni prisoten pri negativni kontroli, je trans-cinamat-prekurzor stirena. Očitno je da je vrh trans-cinamata večji od stirenskega kaj ukaže da je pretvorba trans-cinamata v stiren v tih pogojih omejena.

Pri stirenskem vrhu, lahko opazimo razlike med testiranimi sevi. Med vsemi tremi sevi, ki vsebujejo PAL2, je očitna razlika v primerjavi s kontrolo, kar kaže na uspešno proizvodnjo stirena. Primerjava PAL2 in PAL2 + kaže, da dodajanje fenilalanina ni potrebno da bi se začela sama transformacija v stiren. V spodnji tabeli je prikazan približek proizvedene količine stirena. Ti rezultati kažejo, da so uspešno proizvedli stiren v kvasovki iz glukoze.<ref name="sedmi" />

----

== ZAKLJUČEK ==

Zelo je pomembno ohraniti naš planet za generacije ki še prihajajo. Ekipa iz Groningena je naredila korak k temu z razvojem projekta StyGreen, saj pričakujejo da bo ta tehnologija spremenila trg plastike iz črne v zeleno. Lahko zaključimo da je to dobar način zmanjšanja uporabe fosilnih goriv v proizvodnji plastike, vendar pa še vedno nimamo rešitev za vprašanje ''» Kako se znebiti plastike?«
''

----
==VIRI==

<references/>

StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov:

2019-01-15T14:21:55Z

Milena Stojkovska:

''StyGreen'' je projekt študentske ekipe iz Groningena, Nizozemska s katerem so se predstavili na IGEM 2018 tekmovanju. Namen projekta je proizvodnja eko-stirena v organizmu ''S.cervisiae'' z uporabo odpadne celuloze kot obnovljiv vir.

==UVOD==

Proizvodnja veliko kemikalij je na podlagi fosilnih goriv ki so omejen resurs v svetu. Kot že vemo in se veliko govori da ti resursi se bojo popolnoma izkoristili v naslednjih nekolk 10-ih letih, zato je velika poudarjenost da jih zamenjamo z bio-obnovljivimi resursi in trajnostnih proizvodnih procesov. Ta projekt se zalaga za razvoj bio-gospodarstva da bi imeli bolj zelen planet preko raziskave in razvoja alternativnih poteh. Eden od njih je alternativna proizvodnja stirena.
Monomerni stiren je osnova za proizvodnjo plasticnih polimerov kot so akrilonitrilni butadien stiren (ABS), guma iz stiren butadiena ali prečnopovezanega polistirena. Nepolarna in aromatična struktura stirenov omogoča želenih fizičnih, kemijskih in električnih lasnotsti ki jih ne moremo dobiti pri drugih materijalih. Imajo širok spekter uporabe kot so LEGO kocke, industrijske gume, kolesarske gume ali izolacijski materiali v elektronskih napravah. V zadnjih 70 letih so izdelki iz stirena postali del našemu življenju in so nenadomestljivi za številne industrijo. Zato se bo povpraševanje po stirenu neizogibno hitro začelo. Razvoj alternativne proizvodne poti je zato izjemno pomemben.

----

== PRISTOPI SINTEZNE BIOLOGIJE K PROIZVAJANJU StyGreen IZDELKA ==

S pomočjo SB lahko izkoristimo mikroorganizme ki nam bojo tvorili željeno spojino, kaj predstavlja močno tehnologijo v znanosti. Stiren je podoben ''Phe'', ki pa je prisoten v živih bitij in omogoča da je to pravi prekurzor v njegovi sintezi v kvasovki. Stiren se bo konstitutivno proizvajal in ta produkt so poimenovali ''StyGreen''-alternativno narejen stiren.

Mikroorganizmi lahko rastejo na sladkorjih ali odpatkih ki vsebujejo veliko sladkorjev v formi glukoznih polimerov ki jim rečemo celuloza. Cilj je ustvariti sistem bioprocesiranja s kombiniranjem vseh potrebnih korakov za pretvorbo celuloze v stiren v eni robustni celični tovarni. Molekule StyGreen-a, ki se bojo tvorile, lahko nato se uporabijo v vseh vrstah konvencionalnih industrijskih procesov, ki se nanašajo na plastiko, ki ni namenjena eni sami uporabi. Na ta način hkrati zagotavljamo trajnostno razpoložljivost stirena in zeleni planet za prihodnje generacije.

V procesu načrtovanja poti od celuloze do stirena, morajo se upoštevati veliko dejavnikov. Obstajajo nekolk načinov za razpada celuloze, metabolnih poteh do tvorbo stirena in zanimivih izvirov celuloze.

----

==='''Kaj je dober vir celuloze ?'''===

Ker je celuloza pogost vir iz narave, veliko organskih materij jo vsebujejo v veliki količini. V potragi po idealnem viru celuloze pomembni dejavniki so: široka razpoložljivost, primernost za načrtovani sistem, finančna izvedljivost in nekonkurenčnost z hrano. Podrobno raziskovanje različne vire biomase, je pokazalo da so primerni tri možni vir: les, alge in toaletni papir.

Celulozni vir, kot je rabljeni toaletni papir imajo nizko kakovost celuloznih nitk, zaradi česar so neprimerni za mnoge običajne postopke recikliranja. Zato je ta odpadni material težje valorizirati kaj pravi da je zanimiva surovina za tvorbo stirena z gospodarskega in ekološkega vidika. Do sedaj je zelo malo aplikacij za uporabljene toaletne papirje iz kanalizacije. Podjetje KNN proizvaja izdelek, imenovan [[Media:''Recell®'']], ki je očiščen toaletni papir-filtriran iz kanalizacije. Ta proces lahko močno poveča vrednost novo razvitega materiala, zaradi česar je zanimiv celulozni vir ki se lahko uporabi za tvorbo stirena.[http://www.knncellulose.nl/]

----

==='''Razpad celuloze na glukozo'''===

''S. cerevisiae'' sama ne more razgraditi celulozo na glukozne enote. Zato je nujno izražanje encimov, imenovanih celulaze, ki razbijejo ''β''-(1,4)-glikozidne vezi med molekulami glukoze v celulozi. Te celulaze so različne in kombinacija treh lahko učinkovito razgradi celulozo: ''endoglukanaza'', ''celubiohidrolaza'' in ''β-glukozidaza''. V prejšnjih študijah so se dokazali, da ta tri encima tvorijo dobro skupino za razgradnjo celuloze.

Dodatno, celice uporabljajo glukozo kot substrat, torej bližji so encimi celicam, hitreje se glukoza pretvori v stiren. Da bi to postigni naredili so mini-celulosomni kompleks ki vsebuje vse tri encime pripenjene na enem ogrodju preko dockerina z kohezijsko domeno, ki je nato pritrjen na celično steno kvasovke. Gradben ogrodje (CipA3) je pripeto na kvasovkin receptor za parjenje AGA2. [http://2018.igem.org/Team:Groningen/Model/Molecular_Dynamics]

----

==='''Pretvorba glukoze v StyGreen'''===

Naslednja stopnja je tvorba stirena preko nekolk korakov ki se odvijajo v celici. Da bi se glukoza pretvorila v stiren, najprej je nujno vključiti se v glikolizi, pretvoriti se v fosfoenolpiruvata (PEP) ki potem se pretvori v Phe preko šikimi metabolne poti. Da bi se pretvoril Phe v trans-cinamat, potreben je katalizator ''fenilalanin amonum liaza 2.'' (PAL2) Naslednja stopnja je pretvorba trans-cinamata v stiren preko endogenega encima ''dekarboksilaza ferulne kisline 1''. (FDC1) Za večjo tvorbo stirena je bil izbran PAL2 encim iz ''A. Thaliana'' ker je bil najaktivnejši in so bili že poskusi z njim pri delu s kvasovkami.

----

==='''Kako narediti GSO kvasovke za to nameno?'''===

Namesto da bi v celici dali več plazmidov, ki vsebujejo zaporedje celulaze, ogrodja in PAL2, bila je predlagana uporaba ''CRISPR-Cas9'' v kombinaciji s homologno rekombinacijo za uvedbo celotnega sistema v genom in tako narediti bolj stabilni celulosom. Poleg tega bi to odpravilo zapletene korake kloniranja, ki so potrebni za ustvarjanje velikih plazmidov. Z uporabo te strategije se lahko istočasno preoblikujejo več genov (tri celulaze, ogrodje in PAL2), nato pa bo potekala homologna rekombinacija na mestu preloma dvojne verige od CRISPR-Cas9. Uporaba CRISPR-Cas9 ima dodatno korist, ker tudi odpravlja potrebo po dodajanju antibiotikov ali aminokislin na rastni medij.

Začetni mini-celulozni ekspresijski sistem je pod nadzorom promotorjev galaktoze kaj prepreči rast na celuloznih odpadkov. Sistem rabi galaktozo da se začne izražanje, a promotorji galaktoze so regulirani z negativno povratno zanko preko glukoze. Posledično celulosom bo zmanjšal takoj svojo ekspresijo. Za odpravo te težave je bil izbran promotor TEF1 ki ima lasnosti izražanja na visoki stopnji.[https://sites.tufts.edu/crispr/genome-editing/homology-directed-repair/]

----

==='''Kako poteka celotni proces ?'''===

Ker je sam projekt zamišljen da bi potem delal na veliko industrisko stopnjo, naredili so sistem bioreaktorja ki bo proizvajal StyGreen. Mini tovarna bo imela tri oddelka : celulozno preprocesiranje, glavni bioreaktorni rezervoar in odelek za čiščenje stirena.

1.Celulozno predprocesiranje se izvaja v mlinu z žogicami kot pri KNN celulozi (Recell®). Sam proces ne uporablja močne kemikalije in zviša topljivost celuloze tako da je
celulosom učinkovejši.

2.V glavnem bioreaktorju je konstantna proizvodnja stirena. Vsebuje dvofazni medij iz vode in nepolarnega topila ki je etil acetat ker ima pravo gostoto. (ne tvori micele in ne
denaturira proteine kot bi druga topila) Stiren ki se tvori ima afiniteto za nepolarno okolje (log P=2,7) in zato je v organski fazi. Razlike v gostoti omogočajo ločitev med
fazami, organska faza se lahko nato izloči in se pripelje do mesta za čiščenje stirena.

3.V delu kje je čiščenje stirena, organska faza je reverzno sprana z vodo da bi se izgonili polarnih nečistoč. Ta voda gre nazaj v bioreaktorju da ne pride do zagube. Etil acetat
se upari na srednji vakuum, pa se reciklira v glavnem bioreaktorju, pričemer dobimo stiren v olju. Stirena iz te zmesi očistimo z uparjanjem pod močnejšim vakuumom, ostanek olja
se reciklira v rezervoarju. Ko biomasa kvasovk v številnih rezervoarjih preseže idealne pogoje za fermentacijo, jo lahko izpustimo in recikliramo v nov medij, saj YPD medij
vsebuje ekstrakt kvasovk. Zato vse, kar se odstrani iz rezervoarja, razen stirena, se vrne nazaj v rezervoar. To je industrijski postopek, ki ustvarja zelo malo odpadkov, medtem
prinaša znatne količine stirena.[http://2018.igem.org/Team:Groningen/Applied_Design]

Proizvoni obrat zahteva konstantni vnos celuloznega medija, malo vnosa vode in etil acetata, mešanje in hlajenje.

----

==='''Detekcija stirena s RP-HPLC UV DAD'''===

Bilo je proverjeno če je celotni proces resno naredil stirena kot končni produkt s pomočjo ''RP-HPLC-DAD''. HPLC metod za detekcijo stirena je uporabil metanol in vodo kot mobilna faza ki je bila gradientna. Določili so retencijski čas stirena v teh pogojih ob 17,5 min. Seve so gojili dva dni na gojišču z ''2%'' glukoze in ''0,5 g / L'' fenilalanina (L-fenilalanina) kaj je omogočalo hitrejšo tvorbo stirena.

Pripravili so štiri različne kulture:

a. kontrolo s fenilalaninom (Ctrl),
b. sev, ki je vseboval PAL2 s fenilalaninom (PAL2 +),
c. sev, ki je vseboval PAL2 brez fenilalanina (PAL2-)
d. sev, ki je vseboval PAL2 in celulozo s fenilalaninom (PAL2 ++)

Po inkubaciji, celično kulturo so centrifugirali in supernatant dali na kolono.

Kot je razvidno iz slike,[http://2018.igem.org/Team:Groningen/Results] vrh opažen pri 17,5 min, kaže na tvorbo stirena v celicah. Drugi vrh pri 10 min, pa ni prisoten pri negativni kontroli, je trans-cinamat-prekurzor stirena. Očitno je da je vrh trans-cinamata večji od stirenskega kaj ukaže da je pretvorba trans-cinamata v stiren v tih pogojih omejena.

Pri stirenskem vrhu, lahko opazimo razlike med testiranimi sevi. Med vsemi tremi sevi, ki vsebujejo PAL2, je očitna razlika v primerjavi s kontrolo, kar kaže na uspešno proizvodnjo stirena. Primerjava PAL2 in PAL2 + kaže, da dodajanje fenilalanina ni potrebno da bi se začela sama transformacija v stiren. V spodnji tabeli je prikazan približek proizvedene količine stirena. Ti rezultati kažejo, da so uspešno proizvedli stiren v kvasovki iz glukoze.
[http://2018.igem.org/Team:Groningen/Results]

----

== ZAKLJUČEK ==

Zelo je pomembno ohraniti naš planet za generacije ki še prihajajo. Ekipa iz Groningena je naredila korak k temu z razvojem projekta StyGreen, saj pričakujejo da bo ta tehnologija spremenila trg plastike iz črne v zeleno. Lahko zaključimo da je to dobar način zmanjšanja uporabe fosilnih goriv v proizvodnji plastike, vendar pa še vedno nimamo rešitev za vprašanje ''» Kako se znebiti plastike?«
''

----
==VIRI==

<references/>

StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov:

2019-01-15T14:19:03Z

Milena Stojkovska: /* PRISTOPI SINTEZNE BIOLOGIJE K PROIZVAJANJU StyGreen IZDELKA */

''StyGreen'' je projekt študentske ekipe iz Groningena, Nizozemska s katerem so se predstavili na IGEM 2018 tekmovanju. Namen projekta je proizvodnja eko-stirena v organizmu ''S.cervisiae'' z uporabo odpadne celuloze kot obnovljiv vir.

==UVOD==

Proizvodnja veliko kemikalij je na podlagi fosilnih goriv ki so omejen resurs v svetu. Kot že vemo in se veliko govori da ti resursi se bojo popolnoma izkoristili v naslednjih nekolk 10-ih letih, zato je velika poudarjenost da jih zamenjamo z bio-obnovljivimi resursi in trajnostnih proizvodnih procesov. Ta projekt se zalaga za razvoj bio-gospodarstva da bi imeli bolj zelen planet preko raziskave in razvoja alternativnih poteh. Eden od njih je alternativna proizvodnja stirena.
Monomerni stiren je osnova za proizvodnjo plasticnih polimerov kot so akrilonitrilni butadien stiren (ABS), guma iz stiren butadiena ali prečnopovezanega polistirena. Nepolarna in aromatična struktura stirenov omogoča želenih fizičnih, kemijskih in električnih lasnotsti ki jih ne moremo dobiti pri drugih materijalih. Imajo širok spekter uporabe kot so LEGO kocke, industrijske gume, kolesarske gume ali izolacijski materiali v elektronskih napravah. V zadnjih 70 letih so izdelki iz stirena postali del našemu življenju in so nenadomestljivi za številne industrijo. Zato se bo povpraševanje po stirenu neizogibno hitro začelo. Razvoj alternativne proizvodne poti je zato izjemno pomemben.

----

== PRISTOPI SINTEZNE BIOLOGIJE K PROIZVAJANJU StyGreen IZDELKA ==

S pomočjo SB lahko izkoristimo mikroorganizme ki nam bojo tvorili željeno spojino, kaj predstavlja močno tehnologijo v znanosti. Stiren je podoben ''Phe'', ki pa je prisoten v živih bitij in omogoča da je to pravi prekurzor v njegovi sintezi v kvasovki. Stiren se bo konstitutivno proizvajal in ta produkt so poimenovali ''StyGreen''-alternativno narejen stiren.

Mikroorganizmi lahko rastejo na sladkorjih ali odpatkih ki vsebujejo veliko sladkorjev v formi glukoznih polimerov ki jim rečemo celuloza. Cilj je ustvariti sistem bioprocesiranja s kombiniranjem vseh potrebnih korakov za pretvorbo celuloze v stiren v eni robustni celični tovarni. Molekule StyGreen-a, ki se bojo tvorile, lahko nato se uporabijo v vseh vrstah konvencionalnih industrijskih procesov, ki se nanašajo na plastiko, ki ni namenjena eni sami uporabi. Na ta način hkrati zagotavljamo trajnostno razpoložljivost stirena in zeleni planet za prihodnje generacije.

V procesu načrtovanja poti od celuloze do stirena, morajo se upoštevati veliko dejavnikov. Obstajajo nekolk načinov za razpada celuloze, metabolnih poteh do tvorbo stirena in zanimivih izvirov celuloze.

----

'''Kaj je dober vir celuloze ?'''

Ker je celuloza pogost vir iz narave, veliko organskih materij jo vsebujejo v veliki količini. V potragi po idealnem viru celuloze pomembni dejavniki so: široka razpoložljivost, primernost za načrtovani sistem, finančna izvedljivost in nekonkurenčnost z hrano. Podrobno raziskovanje različne vire biomase, je pokazalo da so primerni tri možni vir: les, alge in toaletni papir.

Celulozni vir, kot je rabljeni toaletni papir imajo nizko kakovost celuloznih nitk, zaradi česar so neprimerni za mnoge običajne postopke recikliranja. Zato je ta odpadni material težje valorizirati kaj pravi da je zanimiva surovina za tvorbo stirena z gospodarskega in ekološkega vidika. Do sedaj je zelo malo aplikacij za uporabljene toaletne papirje iz kanalizacije. Podjetje KNN proizvaja izdelek, imenovan [[Media:''Recell®'']], ki je očiščen toaletni papir-filtriran iz kanalizacije. Ta proces lahko močno poveča vrednost novo razvitega materiala, zaradi česar je zanimiv celulozni vir ki se lahko uporabi za tvorbo stirena.[http://www.knncellulose.nl/]

----

'''Razpad celuloze na glukozo'''

''S. cerevisiae'' sama ne more razgraditi celulozo na glukozne enote. Zato je nujno izražanje encimov, imenovanih celulaze, ki razbijejo ''β''-(1,4)-glikozidne vezi med molekulami glukoze v celulozi. Te celulaze so različne in kombinacija treh lahko učinkovito razgradi celulozo: ''endoglukanaza'', ''celubiohidrolaza'' in ''β-glukozidaza''. V prejšnjih študijah so se dokazali, da ta tri encima tvorijo dobro skupino za razgradnjo celuloze.

Dodatno, celice uporabljajo glukozo kot substrat, torej bližji so encimi celicam, hitreje se glukoza pretvori v stiren. Da bi to postigni naredili so mini-celulosomni kompleks ki vsebuje vse tri encime pripenjene na enem ogrodju preko dockerina z kohezijsko domeno, ki je nato pritrjen na celično steno kvasovke. Gradben ogrodje (CipA3) je pripeto na kvasovkin receptor za parjenje AGA2. [http://2018.igem.org/Team:Groningen/Model/Molecular_Dynamics]

----

'''Pretvorba glukoze v StyGreen'''

Naslednja stopnja je tvorba stirena preko nekolk korakov ki se odvijajo v celici. Da bi se glukoza pretvorila v stiren, najprej je nujno vključiti se v glikolizi, pretvoriti se v fosfoenolpiruvata (PEP) ki potem se pretvori v Phe preko šikimi metabolne poti. Da bi se pretvoril Phe v trans-cinamat, potreben je katalizator ''fenilalanin amonum liaza 2.'' (PAL2) Naslednja stopnja je pretvorba trans-cinamata v stiren preko endogenega encima ''dekarboksilaza ferulne kisline 1''. (FDC1) Za večjo tvorbo stirena je bil izbran PAL2 encim iz ''A. Thaliana'' ker je bil najaktivnejši in so bili že poskusi z njim pri delu s kvasovkami.

----

'''Kako narediti GSO kvasovke za to nameno?'''

Namesto da bi v celici dali več plazmidov, ki vsebujejo zaporedje celulaze, ogrodja in PAL2, bila je predlagana uporaba ''CRISPR-Cas9'' v kombinaciji s homologno rekombinacijo za uvedbo celotnega sistema v genom in tako narediti bolj stabilni celulosom. Poleg tega bi to odpravilo zapletene korake kloniranja, ki so potrebni za ustvarjanje velikih plazmidov. Z uporabo te strategije se lahko istočasno preoblikujejo več genov (tri celulaze, ogrodje in PAL2), nato pa bo potekala homologna rekombinacija na mestu preloma dvojne verige od CRISPR-Cas9. Uporaba CRISPR-Cas9 ima dodatno korist, ker tudi odpravlja potrebo po dodajanju antibiotikov ali aminokislin na rastni medij.

Začetni mini-celulozni ekspresijski sistem je pod nadzorom promotorjev galaktoze kaj prepreči rast na celuloznih odpadkov. Sistem rabi galaktozo da se začne izražanje, a promotorji galaktoze so regulirani z negativno povratno zanko preko glukoze. Posledično celulosom bo zmanjšal takoj svojo ekspresijo. Za odpravo te težave je bil izbran promotor TEF1 ki ima lasnosti izražanja na visoki stopnji.[https://sites.tufts.edu/crispr/genome-editing/homology-directed-repair/]

----

'''Kako poteka celotni proces ?'''

Ker je sam projekt zamišljen da bi potem delal na veliko industrisko stopnjo, naredili so sistem bioreaktorja ki bo proizvajal StyGreen. Mini tovarna bo imela tri oddelka : celulozno preprocesiranje, glavni bioreaktorni rezervoar in odelek za čiščenje stirena.

1.Celulozno predprocesiranje se izvaja v mlinu z žogicami kot pri KNN celulozi (Recell®). Sam proces ne uporablja močne kemikalije in zviša topljivost celuloze tako da je
celulosom učinkovejši.

2.V glavnem bioreaktorju je konstantna proizvodnja stirena. Vsebuje dvofazni medij iz vode in nepolarnega topila ki je etil acetat ker ima pravo gostoto. (ne tvori micele in ne
denaturira proteine kot bi druga topila) Stiren ki se tvori ima afiniteto za nepolarno okolje (log P=2,7) in zato je v organski fazi. Razlike v gostoti omogočajo ločitev med
fazami, organska faza se lahko nato izloči in se pripelje do mesta za čiščenje stirena.

3.V delu kje je čiščenje stirena, organska faza je reverzno sprana z vodo da bi se izgonili polarnih nečistoč. Ta voda gre nazaj v bioreaktorju da ne pride do zagube. Etil acetat
se upari na srednji vakuum, pa se reciklira v glavnem bioreaktorju, pričemer dobimo stiren v olju. Stirena iz te zmesi očistimo z uparjanjem pod močnejšim vakuumom, ostanek olja
se reciklira v rezervoarju. Ko biomasa kvasovk v številnih rezervoarjih preseže idealne pogoje za fermentacijo, jo lahko izpustimo in recikliramo v nov medij, saj YPD medij
vsebuje ekstrakt kvasovk. Zato vse, kar se odstrani iz rezervoarja, razen stirena, se vrne nazaj v rezervoar. To je industrijski postopek, ki ustvarja zelo malo odpadkov, medtem
prinaša znatne količine stirena.[http://2018.igem.org/Team:Groningen/Applied_Design]

Proizvoni obrat zahteva konstantni vnos celuloznega medija, malo vnosa vode in etil acetata, mešanje in hlajenje.

----

'''Detekcija stirena s RP-HPLC UV DAD'''

Bilo je proverjeno če je celotni proces resno naredil stirena kot končni produkt s pomočjo ''RP-HPLC-DAD''. HPLC metod za detekcijo stirena je uporabil metanol in vodo kot mobilna faza ki je bila gradientna. Določili so retencijski čas stirena v teh pogojih ob 17,5 min. Seve so gojili dva dni na gojišču z ''2%'' glukoze in ''0,5 g / L'' fenilalanina (L-fenilalanina) kaj je omogočalo hitrejšo tvorbo stirena.

Pripravili so štiri različne kulture:

a. kontrolo s fenilalaninom (Ctrl),
b. sev, ki je vseboval PAL2 s fenilalaninom (PAL2 +),
c. sev, ki je vseboval PAL2 brez fenilalanina (PAL2-)
d. sev, ki je vseboval PAL2 in celulozo s fenilalaninom (PAL2 ++)

Po inkubaciji, celično kulturo so centrifugirali in supernatant dali na kolono.

Kot je razvidno iz slike,[http://2018.igem.org/Team:Groningen/Results] vrh opažen pri 17,5 min, kaže na tvorbo stirena v celicah. Drugi vrh pri 10 min, pa ni prisoten pri negativni kontroli, je trans-cinamat-prekurzor stirena. Očitno je da je vrh trans-cinamata večji od stirenskega kaj ukaže da je pretvorba trans-cinamata v stiren v tih pogojih omejena.

Pri stirenskem vrhu, lahko opazimo razlike med testiranimi sevi. Med vsemi tremi sevi, ki vsebujejo PAL2, je očitna razlika v primerjavi s kontrolo, kar kaže na uspešno proizvodnjo stirena. Primerjava PAL2 in PAL2 + kaže, da dodajanje fenilalanina ni potrebno da bi se začela sama transformacija v stiren. V spodnji tabeli je prikazan približek proizvedene količine stirena. Ti rezultati kažejo, da so uspešno proizvedli stiren v kvasovki iz glukoze.
[http://2018.igem.org/Team:Groningen/Results]

----

== ZAKLJUČEK ==

Zelo je pomembno ohraniti naš planet za generacije ki še prihajajo. Ekipa iz Groningena je naredila korak k temu z razvojem projekta StyGreen, saj pričakujejo da bo ta tehnologija spremenila trg plastike iz črne v zeleno. Lahko zaključimo da je to dobar način zmanjšanja uporabe fosilnih goriv v proizvodnji plastike, vendar pa še vedno nimamo rešitev za vprašanje ''» Kako se znebiti plastike?«
''

----
==VIRI==

<references/>

StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov:

2019-01-15T14:18:16Z

Milena Stojkovska: /* PRISTOPI SINTEZNE BIOLOGIJE K PROIZVAJANJU StyGreen izdelka */

''StyGreen'' je projekt študentske ekipe iz Groningena, Nizozemska s katerem so se predstavili na IGEM 2018 tekmovanju. Namen projekta je proizvodnja eko-stirena v organizmu ''S.cervisiae'' z uporabo odpadne celuloze kot obnovljiv vir.

==UVOD==

Proizvodnja veliko kemikalij je na podlagi fosilnih goriv ki so omejen resurs v svetu. Kot že vemo in se veliko govori da ti resursi se bojo popolnoma izkoristili v naslednjih nekolk 10-ih letih, zato je velika poudarjenost da jih zamenjamo z bio-obnovljivimi resursi in trajnostnih proizvodnih procesov. Ta projekt se zalaga za razvoj bio-gospodarstva da bi imeli bolj zelen planet preko raziskave in razvoja alternativnih poteh. Eden od njih je alternativna proizvodnja stirena.
Monomerni stiren je osnova za proizvodnjo plasticnih polimerov kot so akrilonitrilni butadien stiren (ABS), guma iz stiren butadiena ali prečnopovezanega polistirena. Nepolarna in aromatična struktura stirenov omogoča želenih fizičnih, kemijskih in električnih lasnotsti ki jih ne moremo dobiti pri drugih materijalih. Imajo širok spekter uporabe kot so LEGO kocke, industrijske gume, kolesarske gume ali izolacijski materiali v elektronskih napravah. V zadnjih 70 letih so izdelki iz stirena postali del našemu življenju in so nenadomestljivi za številne industrijo. Zato se bo povpraševanje po stirenu neizogibno hitro začelo. Razvoj alternativne proizvodne poti je zato izjemno pomemben.

----

== PRISTOPI SINTEZNE BIOLOGIJE K PROIZVAJANJU StyGreen IZDELKA ==

S pomočjo SB lahko izkoristimo mikroorganizme ki nam bojo tvorili željeno spojino, kaj predstavlja močno tehnologijo v znanosti. Stiren je podoben ''Phe'', ki pa je prisoten v živih bitij in omogoča da je to pravi prekurzor v njegovi sintezi v kvasovki. Stiren se bo konstitutivno proizvajal in ta produkt so poimenovali ''StyGreen''-alternativno narejen stiren.

Mikroorganizmi lahko rastejo na sladkorjih ali odpatkih ki vsebujejo veliko sladkorjev v formi glukoznih polimerov ki jim rečemo celuloza. Cilj je ustvariti sistem bioprocesiranja s kombiniranjem vseh potrebnih korakov za pretvorbo celuloze v stiren v eni robustni celični tovarni. Molekule StyGreen-a, ki se bojo tvorile, lahko nato se uporabijo v vseh vrstah konvencionalnih industrijskih procesov, ki se nanašajo na plastiko, ki ni namenjena eni sami uporabi. Na ta način hkrati zagotavljamo trajnostno razpoložljivost stirena in zeleni planet za prihodnje generacije.

V procesu načrtovanja poti od celuloze do stirena, morajo se upoštevati veliko dejavnikov. Obstajajo nekolk načinov za razpada celuloze, metabolnih poteh do tvorbo stirena in zanimivih izvirov celuloze.

----

'''Kaj je dober vir celuloze ?'''

Ker je celuloza pogost vir iz narave, veliko organskih materij jo vsebujejo v veliki količini. V potragi po idealnem viru celuloze pomembni dejavniki so: široka razpoložljivost, primernost za načrtovani sistem, finančna izvedljivost in nekonkurenčnost z hrano. Podrobno raziskovanje različne vire biomase, je pokazalo da so primerni tri možni vir: les, alge in toaletni papir.

Celulozni vir, kot je rabljeni toaletni papir imajo nizko kakovost celuloznih nitk, zaradi česar so neprimerni za mnoge običajne postopke recikliranja. Zato je ta odpadni material težje valorizirati kaj pravi da je zanimiva surovina za tvorbo stirena z gospodarskega in ekološkega vidika. Do sedaj je zelo malo aplikacij za uporabljene toaletne papirje iz kanalizacije. Podjetje KNN proizvaja izdelek, imenovan [[Media:''Recell®'']], ki je očiščen toaletni papir-filtriran iz kanalizacije. Ta proces lahko močno poveča vrednost novo razvitega materiala, zaradi česar je zanimiv celulozni vir ki se lahko uporabi za tvorbo stirena.[http://www.knncellulose.nl/]

----

'''Razpad celuloze na glukozo'''

''S. cerevisiae'' sama ne more razgraditi celulozo na glukozne enote. Zato je nujno izražanje encimov, imenovanih celulaze, ki razbijejo ''β''-(1,4)-glikozidne vezi med molekulami glukoze v celulozi. Te celulaze so različne in kombinacija treh lahko učinkovito razgradi celulozo: ''endoglukanaza'', ''celubiohidrolaza'' in ''β-glukozidaza''. V prejšnjih študijah so se dokazali, da ta tri encima tvorijo dobro skupino za razgradnjo celuloze.

Dodatno, celice uporabljajo glukozo kot substrat, torej bližji so encimi celicam, hitreje se glukoza pretvori v stiren. Da bi to postigni naredili so mini-celulosomni kompleks ki vsebuje vse tri encime pripenjene na enem ogrodju preko dockerina z kohezijsko domeno, ki je nato pritrjen na celično steno kvasovke. Gradben ogrodje (CipA3) je pripeto na kvasovkin receptor za parjenje AGA2. [http://2018.igem.org/Team:Groningen/Model/Molecular_Dynamics]

----

'''Pretvorba glukoze v StyGreen'''

Naslednja stopnja je tvorba stirena preko nekolk korakov ki se odvijajo v celici. Da bi se glukoza pretvorila v stiren, najprej je nujno vključiti se v glikolizi, pretvoriti se v fosfoenolpiruvata (PEP) ki potem se pretvori v Phe preko šikimi metabolne poti. Da bi se pretvoril Phe v trans-cinamat, potreben je katalizator ''fenilalanin amonum liaza 2.'' (PAL2) Naslednja stopnja je pretvorba trans-cinamata v stiren preko endogenega encima ''dekarboksilaza ferulne kisline 1''. (FDC1) Za večjo tvorbo stirena je bil izbran PAL2 encim iz ''A. Thaliana'' ker je bil najaktivnejši in so bili že poskusi z njim pri delu s kvasovkami.

----

'''Kako narediti GSO kvasovke za to nameno?'''

Namesto da bi v celici dali več plazmidov, ki vsebujejo zaporedje celulaze, ogrodja in PAL2, bila je predlagana uporaba ''CRISPR-Cas9'' v kombinaciji s homologno rekombinacijo za uvedbo celotnega sistema v genom in tako narediti bolj stabilni celulosom. Poleg tega bi to odpravilo zapletene korake kloniranja, ki so potrebni za ustvarjanje velikih plazmidov. Z uporabo te strategije se lahko istočasno preoblikujejo več genov (tri celulaze, ogrodje in PAL2), nato pa bo potekala homologna rekombinacija na mestu preloma dvojne verige od CRISPR-Cas9. Uporaba CRISPR-Cas9 ima dodatno korist, ker tudi odpravlja potrebo po dodajanju antibiotikov ali aminokislin na rastni medij.

Začetni mini-celulozni ekspresijski sistem je pod nadzorom promotorjev galaktoze kaj prepreči rast na celuloznih odpadkov. Sistem rabi galaktozo da se začne izražanje, a promotorji galaktoze so regulirani z negativno povratno zanko preko glukoze. Posledično celulosom bo zmanjšal takoj svojo ekspresijo. Za odpravo te težave je bil izbran promotor TEF1 ki ima lasnosti izražanja na visoki stopnji.[https://sites.tufts.edu/crispr/genome-editing/homology-directed-repair/]

----

'''Kako poteka celotni proces ?'''

Ker je sam projekt zamišljen da bi potem delal na veliko industrisko stopnjo, naredili so sistem bioreaktorja ki bo proizvajal StyGreen. Mini tovarna bo imela tri oddelka : celulozno preprocesiranje, glavni bioreaktorni rezervoar in odelek za čiščenje stirena.

1.Celulozno predprocesiranje se izvaja v mlinu z žogicami kot pri KNN celulozi (Recell®). Sam proces ne uporablja močne kemikalije in zviša topljivost celuloze tako da je
celulosom učinkovejši.

2.V glavnem bioreaktorju je konstantna proizvodnja stirena. Vsebuje dvofazni medij iz vode in nepolarnega topila ki je etil acetat ker ima pravo gostoto. (ne tvori micele in ne
denaturira proteine kot bi druga topila) Stiren ki se tvori ima afiniteto za nepolarno okolje (log P=2,7) in zato je v organski fazi. Razlike v gostoti omogočajo ločitev med
fazami, organska faza se lahko nato izloči in se pripelje do mesta za čiščenje stirena.

3.V delu kje je čiščenje stirena, organska faza je reverzno sprana z vodo da bi se izgonili polarnih nečistoč. Ta voda gre nazaj v bioreaktorju da ne pride do zagube. Etil acetat
se upari na srednji vakuum, pa se reciklira v glavnem bioreaktorju, pričemer dobimo stiren v olju. Stirena iz te zmesi očistimo z uparjanjem pod močnejšim vakuumom, ostanek olja
se reciklira v rezervoarju. Ko biomasa kvasovk v številnih rezervoarjih preseže idealne pogoje za fermentacijo, jo lahko izpustimo in recikliramo v nov medij, saj YPD medij
vsebuje ekstrakt kvasovk. Zato vse, kar se odstrani iz rezervoarja, razen stirena, se vrne nazaj v rezervoar. To je industrijski postopek, ki ustvarja zelo malo odpadkov, medtem
prinaša znatne količine stirena.[http://2018.igem.org/Team:Groningen/Applied_Design]

Proizvoni obrat zahteva konstantni vnos celuloznega medija, malo vnosa vode in etil acetata, mešanje in hlajenje.

----

'''Detekcija stirena s RP-HPLC UV DAD'''

Bilo je proverjeno če je celotni proces resno naredil stirena kot končni produkt s pomočjo ''RP-HPLC-DAD''. HPLC metod za detekcijo stirena je uporabil metanol in vodo kot mobilna faza ki je bila gradientna. Določili so retencijski čas stirena v teh pogojih ob 17,5 min. Seve so gojili dva dni na gojišču z ''2%'' glukoze in ''0,5 g / L'' fenilalanina (L-fenilalanina) kaj je omogočalo hitrejšo tvorbo stirena.

Pripravili so štiri različne kulture:

a. kontrolo s fenilalaninom (Ctrl),
b. sev, ki je vseboval PAL2 s fenilalaninom (PAL2 +),
c. sev, ki je vseboval PAL2 brez fenilalanina (PAL2-)
d. sev, ki je vseboval PAL2 in celulozo s fenilalaninom (PAL2 ++)

Po inkubaciji, celično kulturo so centrifugirali in supernatant dali na kolono.

Kot je razvidno iz slike,[http://2018.igem.org/Team:Groningen/Results] vrh opažen pri 17,5 min, kaže na tvorbo stirena v celicah. Drugi vrh pri 10 min, pa ni prisoten pri negativni kontroli, je trans-cinamat-prekurzor stirena. Očitno je da je vrh trans-cinamata večji od stirenskega kaj ukaže da je pretvorba trans-cinamata v stiren v tih pogojih omejena.

Pri stirenskem vrhu, lahko opazimo razlike med testiranimi sevi. Med vsemi tremi sevi, ki vsebujejo PAL2, je očitna razlika v primerjavi s kontrolo, kar kaže na uspešno proizvodnjo stirena. Primerjava PAL2 in PAL2 + kaže, da dodajanje fenilalanina ni potrebno da bi se začela sama transformacija v stiren. V spodnji tabeli je prikazan približek proizvedene količine stirena. Ti rezultati kažejo, da so uspešno proizvedli stiren v kvasovki iz glukoze.
[http://2018.igem.org/Team:Groningen/Results]

----

== ZAKLJUČEK ==

Zelo je pomembno ohraniti naš planet za generacije ki še prihajajo. Ekipa iz Groningena je naredila korak k temu z razvojem projekta StyGreen, saj pričakujejo da bo ta tehnologija spremenila trg plastike iz črne v zeleno. Lahko zaključimo da je to dobar način zmanjšanja uporabe fosilnih goriv v proizvodnji plastike, vendar pa še vedno nimamo rešitev za vprašanje ''» Kako se znebiti plastike?«
''

----
==VIRI==

<references/>

StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov:

2019-01-15T14:16:16Z

Milena Stojkovska:

''StyGreen'' je projekt študentske ekipe iz Groningena, Nizozemska s katerem so se predstavili na IGEM 2018 tekmovanju. Namen projekta je proizvodnja eko-stirena v organizmu ''S.cervisiae'' z uporabo odpadne celuloze kot obnovljiv vir.

==UVOD==

Proizvodnja veliko kemikalij je na podlagi fosilnih goriv ki so omejen resurs v svetu. Kot že vemo in se veliko govori da ti resursi se bojo popolnoma izkoristili v naslednjih nekolk 10-ih letih, zato je velika poudarjenost da jih zamenjamo z bio-obnovljivimi resursi in trajnostnih proizvodnih procesov. Ta projekt se zalaga za razvoj bio-gospodarstva da bi imeli bolj zelen planet preko raziskave in razvoja alternativnih poteh. Eden od njih je alternativna proizvodnja stirena.
Monomerni stiren je osnova za proizvodnjo plasticnih polimerov kot so akrilonitrilni butadien stiren (ABS), guma iz stiren butadiena ali prečnopovezanega polistirena. Nepolarna in aromatična struktura stirenov omogoča želenih fizičnih, kemijskih in električnih lasnotsti ki jih ne moremo dobiti pri drugih materijalih. Imajo širok spekter uporabe kot so LEGO kocke, industrijske gume, kolesarske gume ali izolacijski materiali v elektronskih napravah. V zadnjih 70 letih so izdelki iz stirena postali del našemu življenju in so nenadomestljivi za številne industrijo. Zato se bo povpraševanje po stirenu neizogibno hitro začelo. Razvoj alternativne proizvodne poti je zato izjemno pomemben.

----

== PRISTOPI SINTEZNE BIOLOGIJE K PROIZVAJANJU StyGreen izdelka ==

S pomočjo SB lahko izkoristimo mikroorganizme ki nam bojo tvorili željeno spojino, kaj predstavlja močno tehnologijo v znanosti. Stiren je podoben ''Phe'', ki pa je prisoten v živih bitij in omogoča da je to pravi prekurzor v njegovi sintezi v kvasovki. Stiren se bo konstitutivno proizvajal in ta produkt so poimenovali ''StyGreen''-alternativno narejen stiren.

Mikroorganizmi lahko rastejo na sladkorjih ali odpatkih ki vsebujejo veliko sladkorjev v formi glukoznih polimerov ki jim rečemo celuloza. Cilj je ustvariti sistem bioprocesiranja s kombiniranjem vseh potrebnih korakov za pretvorbo celuloze v stiren v eni robustni celični tovarni. Molekule StyGreen-a, ki se bojo tvorile, lahko nato se uporabijo v vseh vrstah konvencionalnih industrijskih procesov, ki se nanašajo na plastiko, ki ni namenjena eni sami uporabi. Na ta način hkrati zagotavljamo trajnostno razpoložljivost stirena in zeleni planet za prihodnje generacije.

V procesu načrtovanja poti od celuloze do stirena, morajo se upoštevati veliko dejavnikov. Obstajajo nekolk načinov za razpada celuloze, metabolnih poteh do tvorbo stirena in zanimivih izvirov celuloze.

----

'''Kaj je dober vir celuloze ?'''

Ker je celuloza pogost vir iz narave, veliko organskih materij jo vsebujejo v veliki količini. V potragi po idealnem viru celuloze pomembni dejavniki so: široka razpoložljivost, primernost za načrtovani sistem, finančna izvedljivost in nekonkurenčnost z hrano. Podrobno raziskovanje različne vire biomase, je pokazalo da so primerni tri možni vir: les, alge in toaletni papir.

Celulozni vir, kot je rabljeni toaletni papir imajo nizko kakovost celuloznih nitk, zaradi česar so neprimerni za mnoge običajne postopke recikliranja. Zato je ta odpadni material težje valorizirati kaj pravi da je zanimiva surovina za tvorbo stirena z gospodarskega in ekološkega vidika. Do sedaj je zelo malo aplikacij za uporabljene toaletne papirje iz kanalizacije. Podjetje KNN proizvaja izdelek, imenovan [[Media:''Recell®'']], ki je očiščen toaletni papir-filtriran iz kanalizacije. Ta proces lahko močno poveča vrednost novo razvitega materiala, zaradi česar je zanimiv celulozni vir ki se lahko uporabi za tvorbo stirena.[http://www.knncellulose.nl/]

----

'''Razpad celuloze na glukozo'''

''S. cerevisiae'' sama ne more razgraditi celulozo na glukozne enote. Zato je nujno izražanje encimov, imenovanih celulaze, ki razbijejo ''β''-(1,4)-glikozidne vezi med molekulami glukoze v celulozi. Te celulaze so različne in kombinacija treh lahko učinkovito razgradi celulozo: ''endoglukanaza'', ''celubiohidrolaza'' in ''β-glukozidaza''. V prejšnjih študijah so se dokazali, da ta tri encima tvorijo dobro skupino za razgradnjo celuloze.

Dodatno, celice uporabljajo glukozo kot substrat, torej bližji so encimi celicam, hitreje se glukoza pretvori v stiren. Da bi to postigni naredili so mini-celulosomni kompleks ki vsebuje vse tri encime pripenjene na enem ogrodju preko dockerina z kohezijsko domeno, ki je nato pritrjen na celično steno kvasovke. Gradben ogrodje (CipA3) je pripeto na kvasovkin receptor za parjenje AGA2. [http://2018.igem.org/Team:Groningen/Model/Molecular_Dynamics]

----

'''Pretvorba glukoze v StyGreen'''

Naslednja stopnja je tvorba stirena preko nekolk korakov ki se odvijajo v celici. Da bi se glukoza pretvorila v stiren, najprej je nujno vključiti se v glikolizi, pretvoriti se v fosfoenolpiruvata (PEP) ki potem se pretvori v Phe preko šikimi metabolne poti. Da bi se pretvoril Phe v trans-cinamat, potreben je katalizator ''fenilalanin amonum liaza 2.'' (PAL2) Naslednja stopnja je pretvorba trans-cinamata v stiren preko endogenega encima ''dekarboksilaza ferulne kisline 1''. (FDC1) Za večjo tvorbo stirena je bil izbran PAL2 encim iz ''A. Thaliana'' ker je bil najaktivnejši in so bili že poskusi z njim pri delu s kvasovkami.

----

'''Kako narediti GSO kvasovke za to nameno?'''

Namesto da bi v celici dali več plazmidov, ki vsebujejo zaporedje celulaze, ogrodja in PAL2, bila je predlagana uporaba ''CRISPR-Cas9'' v kombinaciji s homologno rekombinacijo za uvedbo celotnega sistema v genom in tako narediti bolj stabilni celulosom. Poleg tega bi to odpravilo zapletene korake kloniranja, ki so potrebni za ustvarjanje velikih plazmidov. Z uporabo te strategije se lahko istočasno preoblikujejo več genov (tri celulaze, ogrodje in PAL2), nato pa bo potekala homologna rekombinacija na mestu preloma dvojne verige od CRISPR-Cas9. Uporaba CRISPR-Cas9 ima dodatno korist, ker tudi odpravlja potrebo po dodajanju antibiotikov ali aminokislin na rastni medij.

Začetni mini-celulozni ekspresijski sistem je pod nadzorom promotorjev galaktoze kaj prepreči rast na celuloznih odpadkov. Sistem rabi galaktozo da se začne izražanje, a promotorji galaktoze so regulirani z negativno povratno zanko preko glukoze. Posledično celulosom bo zmanjšal takoj svojo ekspresijo. Za odpravo te težave je bil izbran promotor TEF1 ki ima lasnosti izražanja na visoki stopnji.[https://sites.tufts.edu/crispr/genome-editing/homology-directed-repair/]

----

'''Kako poteka celotni proces ?'''

Ker je sam projekt zamišljen da bi potem delal na veliko industrisko stopnjo, naredili so sistem bioreaktorja ki bo proizvajal StyGreen. Mini tovarna bo imela tri oddelka : celulozno preprocesiranje, glavni bioreaktorni rezervoar in odelek za čiščenje stirena.

1.Celulozno predprocesiranje se izvaja v mlinu z žogicami kot pri KNN celulozi (Recell®). Sam proces ne uporablja močne kemikalije in zviša topljivost celuloze tako da je
celulosom učinkovejši.

2.V glavnem bioreaktorju je konstantna proizvodnja stirena. Vsebuje dvofazni medij iz vode in nepolarnega topila ki je etil acetat ker ima pravo gostoto. (ne tvori micele in ne
denaturira proteine kot bi druga topila) Stiren ki se tvori ima afiniteto za nepolarno okolje (log P=2,7) in zato je v organski fazi. Razlike v gostoti omogočajo ločitev med
fazami, organska faza se lahko nato izloči in se pripelje do mesta za čiščenje stirena.

3.V delu kje je čiščenje stirena, organska faza je reverzno sprana z vodo da bi se izgonili polarnih nečistoč. Ta voda gre nazaj v bioreaktorju da ne pride do zagube. Etil acetat
se upari na srednji vakuum, pa se reciklira v glavnem bioreaktorju, pričemer dobimo stiren v olju. Stirena iz te zmesi očistimo z uparjanjem pod močnejšim vakuumom, ostanek olja
se reciklira v rezervoarju. Ko biomasa kvasovk v številnih rezervoarjih preseže idealne pogoje za fermentacijo, jo lahko izpustimo in recikliramo v nov medij, saj YPD medij
vsebuje ekstrakt kvasovk. Zato vse, kar se odstrani iz rezervoarja, razen stirena, se vrne nazaj v rezervoar. To je industrijski postopek, ki ustvarja zelo malo odpadkov, medtem
prinaša znatne količine stirena.[http://2018.igem.org/Team:Groningen/Applied_Design]

Proizvoni obrat zahteva konstantni vnos celuloznega medija, malo vnosa vode in etil acetata, mešanje in hlajenje.

----

'''Detekcija stirena s RP-HPLC UV DAD'''

Bilo je proverjeno če je celotni proces resno naredil stirena kot končni produkt s pomočjo ''RP-HPLC-DAD''. HPLC metod za detekcijo stirena je uporabil metanol in vodo kot mobilna faza ki je bila gradientna. Določili so retencijski čas stirena v teh pogojih ob 17,5 min. Seve so gojili dva dni na gojišču z ''2%'' glukoze in ''0,5 g / L'' fenilalanina (L-fenilalanina) kaj je omogočalo hitrejšo tvorbo stirena.

Pripravili so štiri različne kulture:

a. kontrolo s fenilalaninom (Ctrl),
b. sev, ki je vseboval PAL2 s fenilalaninom (PAL2 +),
c. sev, ki je vseboval PAL2 brez fenilalanina (PAL2-)
d. sev, ki je vseboval PAL2 in celulozo s fenilalaninom (PAL2 ++)

Po inkubaciji, celično kulturo so centrifugirali in supernatant dali na kolono.

Kot je razvidno iz slike,[http://2018.igem.org/Team:Groningen/Results] vrh opažen pri 17,5 min, kaže na tvorbo stirena v celicah. Drugi vrh pri 10 min, pa ni prisoten pri negativni kontroli, je trans-cinamat-prekurzor stirena. Očitno je da je vrh trans-cinamata večji od stirenskega kaj ukaže da je pretvorba trans-cinamata v stiren v tih pogojih omejena.

Pri stirenskem vrhu, lahko opazimo razlike med testiranimi sevi. Med vsemi tremi sevi, ki vsebujejo PAL2, je očitna razlika v primerjavi s kontrolo, kar kaže na uspešno proizvodnjo stirena. Primerjava PAL2 in PAL2 + kaže, da dodajanje fenilalanina ni potrebno da bi se začela sama transformacija v stiren. V spodnji tabeli je prikazan približek proizvedene količine stirena. Ti rezultati kažejo, da so uspešno proizvedli stiren v kvasovki iz glukoze.
[http://2018.igem.org/Team:Groningen/Results]

----

== ZAKLJUČEK ==

Zelo je pomembno ohraniti naš planet za generacije ki še prihajajo. Ekipa iz Groningena je naredila korak k temu z razvojem projekta StyGreen, saj pričakujejo da bo ta tehnologija spremenila trg plastike iz črne v zeleno. Lahko zaključimo da je to dobar način zmanjšanja uporabe fosilnih goriv v proizvodnji plastike, vendar pa še vedno nimamo rešitev za vprašanje ''» Kako se znebiti plastike?«
''

----
==VIRI==

<references/>

StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov:

2019-01-15T14:14:52Z

Milena Stojkovska:

''StyGreen'' je projekt študentske ekipe iz Groningena, Nizozemska s katerem so se predstavili na IGEM 2018 tekmovanju. Namen projekta je proizvodnja eko-stirena v organizmu ''S.cervisiae'' z uporabo odpadne celuloze kot obnovljiv vir.

==UVOD==

Proizvodnja veliko kemikalij je na podlagi fosilnih goriv ki so omejen resurs v svetu. Kot že vemo in se veliko govori da ti resursi se bojo popolnoma izkoristili v naslednjih nekolk 10-ih letih, zato je velika poudarjenost da jih zamenjamo z bio-obnovljivimi resursi in trajnostnih proizvodnih procesov. Ta projekt se zalaga za razvoj bio-gospodarstva da bi imeli bolj zelen planet preko raziskave in razvoja alternativnih poteh. Eden od njih je alternativna proizvodnja stirena.
Monomerni stiren je osnova za proizvodnjo plasticnih polimerov kot so akrilonitrilni butadien stiren (ABS), guma iz stiren butadiena ali prečnopovezanega polistirena. Nepolarna in aromatična struktura stirenov omogoča želenih fizičnih, kemijskih in električnih lasnotsti ki jih ne moremo dobiti pri drugih materijalih. Imajo širok spekter uporabe kot so LEGO kocke, industrijske gume, kolesarske gume ali izolacijski materiali v elektronskih napravah. V zadnjih 70 letih so izdelki iz stirena postali del našemu življenju in so nenadomestljivi za številne industrijo. Zato se bo povpraševanje po stirenu neizogibno hitro začelo. Razvoj alternativne proizvodne poti je zato izjemno pomemben.

----

== PRISTOPI SINTEZNE BIOLOGIJE K PROIZVAJANJU StyGreen izdelka ==

S pomočjo SB lahko izkoristimo mikroorganizme ki nam bojo tvorili željeno spojino, kaj predstavlja močno tehnologijo v znanosti. Stiren je podoben ''Phe'', ki pa je prisoten v živih bitij in omogoča da je to pravi prekurzor v njegovi sintezi v kvasovki. Stiren se bo konstitutivno proizvajal in ta produkt so poimenovali ''StyGreen''-alternativno narejen stiren.

Mikroorganizmi lahko rastejo na sladkorjih ali odpatkih ki vsebujejo veliko sladkorjev v formi glukoznih polimerov ki jim rečemo celuloza. Cilj je ustvariti sistem bioprocesiranja s kombiniranjem vseh potrebnih korakov za pretvorbo celuloze v stiren v eni robustni celični tovarni. Molekule StyGreen-a, ki se bojo tvorile, lahko nato se uporabijo v vseh vrstah konvencionalnih industrijskih procesov, ki se nanašajo na plastiko, ki ni namenjena eni sami uporabi. Na ta način hkrati zagotavljamo trajnostno razpoložljivost stirena in zeleni planet za prihodnje generacije.

V procesu načrtovanja poti od celuloze do stirena, morajo se upoštevati veliko dejavnikov. Obstajajo nekolk načinov za razpada celuloze, metabolnih poteh do tvorbo stirena in zanimivih izvirov celuloze.

----

'''Kaj je dober vir celuloze ?'''

Ker je celuloza pogost vir iz narave, veliko organskih materij jo vsebujejo v veliki količini. V potragi po idealnem viru celuloze pomembni dejavniki so: široka razpoložljivost, primernost za načrtovani sistem, finančna izvedljivost in nekonkurenčnost z hrano. Podrobno raziskovanje različne vire biomase, je pokazalo da so primerni tri možni vir: les, alge in toaletni papir.

Celulozni vir, kot je rabljeni toaletni papir imajo nizko kakovost celuloznih nitk, zaradi česar so neprimerni za mnoge običajne postopke recikliranja. Zato je ta odpadni material težje valorizirati kaj pravi da je zanimiva surovina za tvorbo stirena z gospodarskega in ekološkega vidika. Do sedaj je zelo malo aplikacij za uporabljene toaletne papirje iz kanalizacije. Podjetje KNN proizvaja izdelek, imenovan [[Media:''Recell®'']], ki je očiščen toaletni papir-filtriran iz kanalizacije. Ta proces lahko močno poveča vrednost novo razvitega materiala, zaradi česar je zanimiv celulozni vir ki se lahko uporabi za tvorbo stirena.[http://www.knncellulose.nl/]

----

'''Razpad celuloze na glukozo'''

''S. cerevisiae'' sama ne more razgraditi celulozo na glukozne enote. Zato je nujno izražanje encimov, imenovanih celulaze, ki razbijejo ''β''-(1,4)-glikozidne vezi med molekulami glukoze v celulozi. Te celulaze so različne in kombinacija treh lahko učinkovito razgradi celulozo: ''endoglukanaza'', ''celubiohidrolaza'' in ''β-glukozidaza''. V prejšnjih študijah so se dokazali, da ta tri encima tvorijo dobro skupino za razgradnjo celuloze.

Dodatno, celice uporabljajo glukozo kot substrat, torej bližji so encimi celicam, hitreje se glukoza pretvori v stiren. Da bi to postigni naredili so mini-celulosomni kompleks ki vsebuje vse tri encime pripenjene na enem ogrodju preko dockerina z kohezijsko domeno, ki je nato pritrjen na celično steno kvasovke. Gradben ogrodje (CipA3) je pripeto na kvasovkin receptor za parjenje AGA2. [http://2018.igem.org/Team:Groningen/Model/Molecular_Dynamics]

----

'''Pretvorba glukoze v StyGreen'''

Naslednja stopnja je tvorba stirena preko nekolk korakov ki se odvijajo v celici. Da bi se glukoza pretvorila v stiren, najprej je nujno vključiti se v glikolizi, pretvoriti se v fosfoenolpiruvata (PEP) ki potem se pretvori v Phe preko šikimi metabolne poti. Da bi se pretvoril Phe v trans-cinamat, potreben je katalizator ''fenilalanin amonum liaza 2.'' (PAL2) Naslednja stopnja je pretvorba trans-cinamata v stiren preko endogenega encima ''dekarboksilaza ferulne kisline 1''. (FDC1) Za večjo tvorbo stirena je bil izbran PAL2 encim iz ''A. Thaliana'' ker je bil najaktivnejši in so bili že poskusi z njim pri delu s kvasovkami.

----

'''Kako narediti GSO kvasovke za to nameno?'''

Namesto da bi v celici dali več plazmidov, ki vsebujejo zaporedje celulaze, ogrodja in PAL2, bila je predlagana uporaba ''CRISPR-Cas9'' v kombinaciji s homologno rekombinacijo za uvedbo celotnega sistema v genom in tako narediti bolj stabilni celulosom. Poleg tega bi to odpravilo zapletene korake kloniranja, ki so potrebni za ustvarjanje velikih plazmidov. Z uporabo te strategije se lahko istočasno preoblikujejo več genov (tri celulaze, ogrodje in PAL2), nato pa bo potekala homologna rekombinacija na mestu preloma dvojne verige od CRISPR-Cas9. Uporaba CRISPR-Cas9 ima dodatno korist, ker tudi odpravlja potrebo po dodajanju antibiotikov ali aminokislin na rastni medij.

Začetni mini-celulozni ekspresijski sistem je pod nadzorom promotorjev galaktoze kaj prepreči rast na celuloznih odpadkov. Sistem rabi galaktozo da se začne izražanje, a promotorji galaktoze so regulirani z negativno povratno zanko preko glukoze. Posledično celulosom bo zmanjšal takoj svojo ekspresijo. Za odpravo te težave je bil izbran promotor TEF1 ki ima lasnosti izražanja na visoki stopnji.[https://sites.tufts.edu/crispr/genome-editing/homology-directed-repair/]

----

'''Kako poteka celotni proces ?'''

Ker je sam projekt zamišljen da bi potem delal na veliko industrisko stopnjo, naredili so sistem bioreaktorja ki bo proizvajal StyGreen. Mini tovarna bo imela tri oddelka : celulozno preprocesiranje, glavni bioreaktorni rezervoar in odelek za čiščenje stirena.

1.Celulozno predprocesiranje se izvaja v mlinu z žogicami kot pri KNN celulozi (Recell®). Sam proces ne uporablja močne kemikalije in zviša topljivost celuloze tako da je
celulosom učinkovejši.

2.V glavnem bioreaktorju je konstantna proizvodnja stirena. Vsebuje dvofazni medij iz vode in nepolarnega topila ki je etil acetat ker ima pravo gostoto. (ne tvori micele in ne
denaturira proteine kot bi druga topila) Stiren ki se tvori ima afiniteto za nepolarno okolje (log P=2,7) in zato je v organski fazi. Razlike v gostoti omogočajo ločitev med
fazami, organska faza se lahko nato izloči in se pripelje do mesta za čiščenje stirena.

3.V delu kje je čiščenje stirena, organska faza je reverzno sprana z vodo da bi se izgonili polarnih nečistoč. Ta voda gre nazaj v bioreaktorju da ne pride do zagube. Etil acetat
se upari na srednji vakuum, pa se reciklira v glavnem bioreaktorju, pričemer dobimo stiren v olju. Stirena iz te zmesi očistimo z uparjanjem pod močnejšim vakuumom, ostanek olja
se reciklira v rezervoarju. Ko biomasa kvasovk v številnih rezervoarjih preseže idealne pogoje za fermentacijo, jo lahko izpustimo in recikliramo v nov medij, saj YPD medij
vsebuje ekstrakt kvasovk. Zato vse, kar se odstrani iz rezervoarja, razen stirena, se vrne nazaj v rezervoar. To je industrijski postopek, ki ustvarja zelo malo odpadkov, medtem
prinaša znatne količine stirena.[http://2018.igem.org/Team:Groningen/Applied_Design]

Proizvoni obrat zahteva konstantni vnos celuloznega medija, malo vnosa vode in etil acetata, mešanje in hlajenje.

----

'''Detekcija stirena s RP-HPLC UV DAD'''

Bilo je proverjeno če je celotni proces resno naredil stirena kot končni produkt s pomočjo ''RP-HPLC-DAD''. HPLC metod za detekcijo stirena je uporabil metanol in vodo kot mobilna faza ki je bila gradientna. Določili so retencijski čas stirena v teh pogojih ob 17,5 min. Seve so gojili dva dni na gojišču z ''2%'' glukoze in ''0,5 g / L'' fenilalanina (L-fenilalanina) kaj je omogočalo hitrejšo tvorbo stirena.

Pripravili so štiri različne kulture:

a. kontrolo s fenilalaninom (Ctrl),
b. sev, ki je vseboval PAL2 s fenilalaninom (PAL2 +),
c. sev, ki je vseboval PAL2 brez fenilalanina (PAL2-)
d. sev, ki je vseboval PAL2 in celulozo s fenilalaninom (PAL2 ++)

Po inkubaciji, celično kulturo so centrifugirali in supernatant dali na kolono.

Kot je razvidno iz slike,[http://2018.igem.org/Team:Groningen/Results] vrh opažen pri 17,5 min, kaže na tvorbo stirena v celicah. Drugi vrh pri 10 min, pa ni prisoten pri negativni kontroli, je trans-cinamat-prekurzor stirena. Očitno je da je vrh trans-cinamata večji od stirenskega kaj ukaže da je pretvorba trans-cinamata v stiren v tih pogojih omejena.

Pri stirenskem vrhu, lahko opazimo razlike med testiranimi sevi. Med vsemi tremi sevi, ki vsebujejo PAL2, je očitna razlika v primerjavi s kontrolo, kar kaže na uspešno proizvodnjo stirena. Primerjava PAL2 in PAL2 + kaže, da dodajanje fenilalanina ni potrebno da bi se začela sama transformacija v stiren. V spodnji tabeli je prikazan približek proizvedene količine stirena. Ti rezultati kažejo, da so uspešno proizvedli stiren v kvasovki iz glukoze.
[http://2018.igem.org/Team:Groningen/Results]

----

== ZAKLJUČEK ==

Zelo je pomembno ohraniti naš planet za generacije ki še prihajajo. Ekipa iz Groningena je naredila korak k temu z razvojem projekta StyGreen, saj pričakujejo da bo ta tehnologija spremenila trg plastike iz črne v zeleno. Lahko zaključimo da je to dobar način zmanjšanja uporabe fosilnih goriv v proizvodnji plastike, vendar pa še vedno nimamo rešitev za vprašanje ''» Kako se znebiti plastike?«
''

StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov:

2019-01-15T14:10:11Z

Milena Stojkovska:

''StyGreen'' je projekt študentske ekipe iz Groningena, Nizozemska s katerem so se predstavili na IGEM 2018 tekmovanju. Namen projekta je proizvodnja eko-stirena v organizmu ''S.cervisiae'' z uporabo odpadne celuloze kot obnovljiv vir.

==UVOD==

Proizvodnja veliko kemikalij je na podlagi fosilnih goriv ki so omejen resurs v svetu. Kot že vemo in se veliko govori da ti resursi se bojo popolnoma izkoristili v naslednjih nekolk 10-ih letih, zato je velika poudarjenost da jih zamenjamo z bio-obnovljivimi resursi in trajnostnih proizvodnih procesov. Ta projekt se zalaga za razvoj bio-gospodarstva da bi imeli bolj zelen planet preko raziskave in razvoja alternativnih poteh. Eden od njih je alternativna proizvodnja stirena.
Monomerni stiren je osnova za proizvodnjo plasticnih polimerov kot so akrilonitrilni butadien stiren (ABS), guma iz stiren butadiena ali prečnopovezanega polistirena. Nepolarna in aromatična struktura stirenov omogoča želenih fizičnih, kemijskih in električnih lasnotsti ki jih ne moremo dobiti pri drugih materijalih. Imajo širok spekter uporabe kot so LEGO kocke, industrijske gume, kolesarske gume ali izolacijski materiali v elektronskih napravah. V zadnjih 70 letih so izdelki iz stirena postali del našemu življenju in so nenadomestljivi za številne industrijo. Zato se bo povpraševanje po stirenu neizogibno hitro začelo. Razvoj alternativne proizvodne poti je zato izjemno pomemben.

== PRISTOPI SINTEZNE BIOLOGIJE K PROIZVAJANJU StyGreen izdelka ==

S pomočjo SB lahko izkoristimo mikroorganizme ki nam bojo tvorili željeno spojino, kaj predstavlja močno tehnologijo v znanosti. Stiren je podoben ''Phe'', ki pa je prisoten v živih bitij in omogoča da je to pravi prekurzor v njegovi sintezi v kvasovki. Stiren se bo konstitutivno proizvajal in ta produkt so poimenovali ''StyGreen''-alternativno narejen stiren.

Mikroorganizmi lahko rastejo na sladkorjih ali odpatkih ki vsebujejo veliko sladkorjev v formi glukoznih polimerov ki jim rečemo celuloza. Cilj je ustvariti sistem bioprocesiranja s kombiniranjem vseh potrebnih korakov za pretvorbo celuloze v stiren v eni robustni celični tovarni. Molekule StyGreen-a, ki se bojo tvorile, lahko nato se uporabijo v vseh vrstah konvencionalnih industrijskih procesov, ki se nanašajo na plastiko, ki ni namenjena eni sami uporabi. Na ta način hkrati zagotavljamo trajnostno razpoložljivost stirena in zeleni planet za prihodnje generacije.

V procesu načrtovanja poti od celuloze do stirena, morajo se upoštevati veliko dejavnikov. Obstajajo nekolk načinov za razpada celuloze, metabolnih poteh do tvorbo stirena in zanimivih izvirov celuloze.

'''Kaj je dober vir celuloze ?'''

Ker je celuloza pogost vir iz narave, veliko organskih materij jo vsebujejo v veliki količini. V potragi po idealnem viru celuloze pomembni dejavniki so: široka razpoložljivost, primernost za načrtovani sistem, finančna izvedljivost in nekonkurenčnost z hrano. Podrobno raziskovanje različne vire biomase, je pokazalo da so primerni tri možni vir: les, alge in toaletni papir.

Celulozni vir, kot je rabljeni toaletni papir imajo nizko kakovost celuloznih nitk, zaradi česar so neprimerni za mnoge običajne postopke recikliranja. Zato je ta odpadni material težje valorizirati kaj pravi da je zanimiva surovina za tvorbo stirena z gospodarskega in ekološkega vidika. Do sedaj je zelo malo aplikacij za uporabljene toaletne papirje iz kanalizacije. Podjetje KNN proizvaja izdelek, imenovan [[Media:''Recell®'']], ki je očiščen toaletni papir-filtriran iz kanalizacije. Ta proces lahko močno poveča vrednost novo razvitega materiala, zaradi česar je zanimiv celulozni vir ki se lahko uporabi za tvorbo stirena.[http://www.knncellulose.nl/]

'''Razpad celuloze na glukozo'''

''S. cerevisiae'' sama ne more razgraditi celulozo na glukozne enote. Zato je nujno izražanje encimov, imenovanih celulaze, ki razbijejo ''β''-(1,4)-glikozidne vezi med molekulami glukoze v celulozi. Te celulaze so različne in kombinacija treh lahko učinkovito razgradi celulozo: ''endoglukanaza'', ''celubiohidrolaza'' in ''β-glukozidaza''. V prejšnjih študijah so se dokazali, da ta tri encima tvorijo dobro skupino za razgradnjo celuloze.

Dodatno, celice uporabljajo glukozo kot substrat, torej bližji so encimi celicam, hitreje se glukoza pretvori v stiren. Da bi to postigni naredili so mini-celulosomni kompleks ki vsebuje vse tri encime pripenjene na enem ogrodju preko dockerina z kohezijsko domeno, ki je nato pritrjen na celično steno kvasovke. Gradben ogrodje (CipA3) je pripeto na kvasovkin receptor za parjenje AGA2. [http://2018.igem.org/Team:Groningen/Model/Molecular_Dynamics]

'''Pretvorba glukoze v StyGreen'''

Naslednja stopnja je tvorba stirena preko nekolk korakov ki se odvijajo v celici. Da bi se glukoza pretvorila v stiren, najprej je nujno vključiti se v glikolizi, pretvoriti se v fosfoenolpiruvata (PEP) ki potem se pretvori v Phe preko šikimi metabolne poti. Da bi se pretvoril Phe v trans-cinamat, potreben je katalizator ''fenilalanin amonum liaza 2.'' (PAL2) Naslednja stopnja je pretvorba trans-cinamata v stiren preko endogenega encima ''dekarboksilaza ferulne kisline 1''. (FDC1) Za večjo tvorbo stirena je bil izbran PAL2 encim iz ''A. Thaliana'' ker je bil najaktivnejši in so bili že poskusi z njim pri delu s kvasovkami.

'''Kako narediti GSO kvasovke za to nameno?'''

Namesto da bi v celici dali več plazmidov, ki vsebujejo zaporedje celulaze, ogrodja in PAL2, bila je predlagana uporaba ''CRISPR-Cas9'' v kombinaciji s homologno rekombinacijo za uvedbo celotnega sistema v genom in tako narediti bolj stabilni celulosom. Poleg tega bi to odpravilo zapletene korake kloniranja, ki so potrebni za ustvarjanje velikih plazmidov. Z uporabo te strategije se lahko istočasno preoblikujejo več genov (tri celulaze, ogrodje in PAL2), nato pa bo potekala homologna rekombinacija na mestu preloma dvojne verige od CRISPR-Cas9. Uporaba CRISPR-Cas9 ima dodatno korist, ker tudi odpravlja potrebo po dodajanju antibiotikov ali aminokislin na rastni medij.

Začetni mini-celulozni ekspresijski sistem je pod nadzorom promotorjev galaktoze kaj prepreči rast na celuloznih odpadkov. Sistem rabi galaktozo da se začne izražanje, a promotorji galaktoze so regulirani z negativno povratno zanko preko glukoze. Posledično celulosom bo zmanjšal takoj svojo ekspresijo. Za odpravo te težave je bil izbran promotor TEF1 ki ima lasnosti izražanja na visoki stopnji.[https://sites.tufts.edu/crispr/genome-editing/homology-directed-repair/]

'''Kako poteka celotni proces ?'''

Ker je sam projekt zamišljen da bi potem delal na veliko industrisko stopnjo, naredili so sistem bioreaktorja ki bo proizvajal StyGreen. Mini tovarna bo imela tri oddelka : celulozno preprocesiranje, glavni bioreaktorni rezervoar in odelek za čiščenje stirena.

1.Celulozno predprocesiranje se izvaja v mlinu z žogicami kot pri KNN celulozi (Recell®). Sam proces ne uporablja močne kemikalije in zviša topljivost celuloze tako da je celulosom učinkovejši.

2.V glavnem bioreaktorju je konstantna proizvodnja stirena. Vsebuje dvofazni medij iz vode in nepolarnega topila ki je etil acetat ker ima pravo gostoto. (ne tvori micele in ne denaturira proteine kot bi druga topila) Stiren ki se tvori ima afiniteto za nepolarno okolje (log P=2,7) in zato je v organski fazi. Razlike v gostoti omogočajo ločitev med fazami, organska faza se lahko nato izloči in se pripelje do mesta za čiščenje stirena.

3.V delu kje je čiščenje stirena, organska faza je reverzno sprana z vodo da bi se izgonili polarnih nečistoč. Ta voda gre nazaj v bioreaktorju da ne pride do zagube. Etil acetat se upari na srednji vakuum, pa se reciklira v glavnem bioreaktorju, pričemer dobimo stiren v olju. Stirena iz te zmesi očistimo z uparjanjem pod močnejšim vakuumom, ostanek olja se reciklira v rezervoarju. Ko biomasa kvasovk v številnih rezervoarjih preseže idealne pogoje za fermentacijo, jo lahko izpustimo in recikliramo v nov medij, saj YPD medij vsebuje ekstrakt kvasovk. Zato vse, kar se odstrani iz rezervoarja, razen stirena, se vrne nazaj v rezervoar. To je industrijski postopek, ki ustvarja zelo malo odpadkov, medtem prinaša znatne količine stirena.[http://2018.igem.org/Team:Groningen/Applied_Design]

Proizvoni obrat zahteva konstantni vnos celuloznega medija, malo vnosa vode in etil acetata, mešanje in hlajenje.

'''Detekcija stirena s RP-HPLC UV DAD'''

Bilo je proverjeno če je celotni proces resno naredil stirena kot končni produkt s pomočjo ''RP-HPLC-DAD''. HPLC metod za detekcijo stirena je uporabil metanol in vodo kot mobilna faza ki je bila gradientna. Določili so retencijski čas stirena v teh pogojih ob 17,5 min. Seve so gojili dva dni na gojišču z ''2%'' glukoze in ''0,5 g / L'' fenilalanina (L-fenilalanina) kaj je omogočalo hitrejšo tvorbo stirena.

Pripravili so štiri različne kulture:

----
a. kontrolo s fenilalaninom (Ctrl),
b. sev, ki je vseboval PAL2 s fenilalaninom (PAL2 +),
c. sev, ki je vseboval PAL2 brez fenilalanina (PAL2-)
d. sev, ki je vseboval PAL2 in celulozo s fenilalaninom (PAL2 ++)

Po inkubaciji, celično kulturo so centrifugirali in supernatant dali na kolono.

Kot je razvidno iz slike, vrh opažen pri 17,5 min, kaže na tvorbo stirena v celicah. Drugi vrh pri 10 min, pa ni prisoten pri negativni kontroli, je trans-cinamat-prekurzor stirena. Očitno je da je vrh trans-cinamata večji od stirenskega kaj ukaže da je pretvorba trans-cinamata v stiren v tih pogojih omejena.
[http://2018.igem.org/Team:Groningen/Results]
Pri stirenskem vrhu, lahko opazimo razlike med testiranimi sevi. Med vsemi tremi sevi, ki vsebujejo PAL2, je očitna razlika v primerjavi s kontrolo, kar kaže na uspešno proizvodnjo stirena. Primerjava PAL2 in PAL2 + kaže, da dodajanje fenilalanina ni potrebno da bi se začela sama transformacija v stiren. V spodnji tabeli je prikazan približek proizvedene količine stirena. Ti rezultati kažejo, da so uspešno proizvedli stiren v kvasovki iz glukoze.
[http://2018.igem.org/Team:Groningen/Results]

== ZAKLJUČEK ==

Zelo je pomembno ohraniti naš planet za generacije ki še prihajajo. Ekipa iz Groningena je naredila korak k temu z razvojem projekta StyGreen, saj pričakujejo da bo ta tehnologija spremenila trg plastike iz črne v zeleno. Lahko zaključimo da je to dobar način zmanjšanja uporabe fosilnih goriv v proizvodnji plastike, vendar pa še vedno nimamo rešitev za vprašanje ''» Kako se znebiti plastike?«
''

StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov:

2019-01-15T14:05:38Z

Milena Stojkovska:

''StyGreen'' je projekt študentske ekipe iz Groningena, Nizozemska s katerem so se predstavili na IGEM 2018 tekmovanju. Namen projekta je proizvodnja eko-stirena v organizmu ''S.cervisiae'' z uporabo odpadne celuloze kot obnovljiv vir.

==UVOD==

Proizvodnja veliko kemikalij je na podlagi fosilnih goriv ki so omejen resurs v svetu. Kot že vemo in se veliko govori da ti resursi se bojo popolnoma izkoristili v naslednjih nekolk 10-ih letih, zato je velika poudarjenost da jih zamenjamo z bio-obnovljivimi resursi in trajnostnih proizvodnih procesov. Ta projekt se zalaga za razvoj bio-gospodarstva da bi imeli bolj zelen planet preko raziskave in razvoja alternativnih poteh. Eden od njih je alternativna proizvodnja stirena.
Monomerni stiren je osnova za proizvodnjo plasticnih polimerov kot so akrilonitrilni butadien stiren (ABS), guma iz stiren butadiena ali prečnopovezanega polistirena. Nepolarna in aromatična struktura stirenov omogoča želenih fizičnih, kemijskih in električnih lasnotsti ki jih ne moremo dobiti pri drugih materijalih. Imajo širok spekter uporabe kot so LEGO kocke, industrijske gume, kolesarske gume ali izolacijski materiali v elektronskih napravah. V zadnjih 70 letih so izdelki iz stirena postali del našemu življenju in so nenadomestljivi za številne industrijo. Zato se bo povpraševanje po stirenu neizogibno hitro začelo. Razvoj alternativne proizvodne poti je zato izjemno pomemben.

== PRISTOPI SINTEZNE BIOLOGIJE K PROIZVAJANJU StyGreen izdelka ==

S pomočjo SB lahko izkoristimo mikroorganizme ki nam bojo tvorili željeno spojino, kaj predstavlja močno tehnologijo v znanosti. Stiren je podoben ''Phe'', ki pa je prisoten v živih bitij in omogoča da je to pravi prekurzor v njegovi sintezi v kvasovki. Stiren se bo konstitutivno proizvajal in ta produkt so poimenovali ''StyGreen''-alternativno narejen stiren.

Mikroorganizmi lahko rastejo na sladkorjih ali odpatkih ki vsebujejo veliko sladkorjev v formi glukoznih polimerov ki jim rečemo celuloza. Cilj je ustvariti sistem bioprocesiranja s kombiniranjem vseh potrebnih korakov za pretvorbo celuloze v stiren v eni robustni celični tovarni. Molekule StyGreen-a, ki se bojo tvorile, lahko nato se uporabijo v vseh vrstah konvencionalnih industrijskih procesov, ki se nanašajo na plastiko, ki ni namenjena eni sami uporabi. Na ta način hkrati zagotavljamo trajnostno razpoložljivost stirena in zeleni planet za prihodnje generacije.

V procesu načrtovanja poti od celuloze do stirena, morajo se upoštevati veliko dejavnikov. Obstajajo nekolk načinov za razpada celuloze, metabolnih poteh do tvorbo stirena in zanimivih izvirov celuloze.

'''Kaj je dober vir celuloze ?'''

Ker je celuloza pogost vir iz narave, veliko organskih materij jo vsebujejo v veliki količini. V potragi po idealnem viru celuloze pomembni dejavniki so: široka razpoložljivost, primernost za načrtovani sistem, finančna izvedljivost in nekonkurenčnost z hrano. Podrobno raziskovanje različne vire biomase, je pokazalo da so primerni tri možni vir: les, alge in toaletni papir.

Celulozni vir, kot je rabljeni toaletni papir imajo nizko kakovost celuloznih nitk, zaradi česar so neprimerni za mnoge običajne postopke recikliranja. Zato je ta odpadni material težje valorizirati kaj pravi da je zanimiva surovina za tvorbo stirena z gospodarskega in ekološkega vidika. Do sedaj je zelo malo aplikacij za uporabljene toaletne papirje iz kanalizacije. Podjetje KNN proizvaja izdelek, imenovan [[Media:''Recell®'']], ki je očiščen toaletni papir-filtriran iz kanalizacije. Ta proces lahko močno poveča vrednost novo razvitega materiala, zaradi česar je zanimiv celulozni vir ki se lahko uporabi za tvorbo stirena.[http://www.knncellulose.nl/]

'''Razpad celuloze na glukozo'''

''S. cerevisiae'' sama ne more razgraditi celulozo na glukozne enote. Zato je nujno izražanje encimov, imenovanih celulaze, ki razbijejo ''β''-(1,4)-glikozidne vezi med molekulami glukoze v celulozi. Te celulaze so različne in kombinacija treh lahko učinkovito razgradi celulozo: ''endoglukanaza'', ''celubiohidrolaza'' in ''β-glukozidaza''. V prejšnjih študijah so se dokazali, da ta tri encima tvorijo dobro skupino za razgradnjo celuloze.

Dodatno, celice uporabljajo glukozo kot substrat, torej bližji so encimi celicam, hitreje se glukoza pretvori v stiren. Da bi to postigni naredili so mini-celulosomni kompleks ki vsebuje vse tri encime pripenjene na enem ogrodju preko dockerina z kohezijsko domeno, ki je nato pritrjen na celično steno kvasovke. Gradben ogrodje (CipA3) je pripeto na kvasovkin receptor za parjenje AGA2. [[Image:Example.jpg]]

'''Pretvorba glukoze v StyGreen'''

Naslednja stopnja je tvorba stirena preko nekolk korakov ki se odvijajo v celici. Da bi se glukoza pretvorila v stiren, najprej je nujno vključiti se v glikolizi, pretvoriti se v fosfoenolpiruvata (PEP) ki potem se pretvori v Phe preko šikimi metabolne poti. Da bi se pretvoril Phe v trans-cinamat, potreben je katalizator ''fenilalanin amonum liaza 2.'' (PAL2) Naslednja stopnja je pretvorba trans-cinamata v stiren preko endogenega encima ''dekarboksilaza ferulne kisline 1''. (FDC1) Za večjo tvorbo stirena je bil izbran PAL2 encim iz ''A. Thaliana'' ker je bil najaktivnejši in so bili že poskusi z njim pri delu s kvasovkami.

'''Kako narediti GSO kvasovke za to nameno?'''

Namesto da bi v celici dali več plazmidov, ki vsebujejo zaporedje celulaze, ogrodja in PAL2, bila je predlagana uporaba ''CRISPR-Cas9'' v kombinaciji s homologno rekombinacijo za uvedbo celotnega sistema v genom in tako narediti bolj stabilni celulosom. Poleg tega bi to odpravilo zapletene korake kloniranja, ki so potrebni za ustvarjanje velikih plazmidov. Z uporabo te strategije se lahko istočasno preoblikujejo več genov (tri celulaze, ogrodje in PAL2), nato pa bo potekala homologna rekombinacija na mestu preloma dvojne verige od CRISPR-Cas9. Uporaba CRISPR-Cas9 ima dodatno korist, ker tudi odpravlja potrebo po dodajanju antibiotikov ali aminokislin na rastni medij.

Začetni mini-celulozni ekspresijski sistem je pod nadzorom promotorjev galaktoze kaj prepreči rast na celuloznih odpadkov. Sistem rabi galaktozo da se začne izražanje, a promotorji galaktoze so regulirani z negativno povratno zanko preko glukoze. Posledično celulosom bo zmanjšal takoj svojo ekspresijo. Za odpravo te težave je bil izbran promotor TEF1 ki ima lasnosti izražanja na visoki stopnji.

'''Kako poteka celotni proces ?'''

Ker je sam projekt zamišljen da bi potem delal na veliko industrisko stopnjo, naredili so sistem bioreaktorja ki bo proizvajal StyGreen. Mini tovarna bo imela tri oddelka : celulozno preprocesiranje, glavni bioreaktorni rezervoar in odelek za čiščenje stirena.

1.Celulozno predprocesiranje se izvaja v mlinu z žogicami kot pri KNN celulozi (Recell®). Sam proces ne uporablja močne kemikalije in zviša topljivost celuloze tako da je celulosom učinkovejši.

2.V glavnem bioreaktorju je konstantna proizvodnja stirena. Vsebuje dvofazni medij iz vode in nepolarnega topila ki je etil acetat ker ima pravo gostoto. (ne tvori micele in ne denaturira proteine kot bi druga topila) Stiren ki se tvori ima afiniteto za nepolarno okolje (log P=2,7) in zato je v organski fazi. Razlike v gostoti omogočajo ločitev med fazami, organska faza se lahko nato izloči in se pripelje do mesta za čiščenje stirena.

3.V delu kje je čiščenje stirena, organska faza je reverzno sprana z vodo da bi se izgonili polarnih nečistoč. Ta voda gre nazaj v bioreaktorju da ne pride do zagube. Etil acetat se upari na srednji vakuum, pa se reciklira v glavnem bioreaktorju, pričemer dobimo stiren v olju. Stirena iz te zmesi očistimo z uparjanjem pod močnejšim vakuumom, ostanek olja se reciklira v rezervoarju. Ko biomasa kvasovk v številnih rezervoarjih preseže idealne pogoje za fermentacijo, jo lahko izpustimo in recikliramo v nov medij, saj YPD medij vsebuje ekstrakt kvasovk. Zato vse, kar se odstrani iz rezervoarja, razen stirena, se vrne nazaj v rezervoar. To je industrijski postopek, ki ustvarja zelo malo odpadkov, medtem prinaša znatne količine stirena.[[Image:Example.jpg]]

Proizvoni obrat zahteva konstantni vnos celuloznega medija, malo vnosa vode in etil acetata, mešanje in hlajenje.

'''Detekcija stirena s RP-HPLC UV DAD'''

Bilo je proverjeno če je celotni proces resno naredil stirena kot končni produkt s pomočjo ''RP-HPLC-DAD''. HPLC metod za detekcijo stirena je uporabil metanol in vodo kot mobilna faza ki je bila gradientna. Določili so retencijski čas stirena v teh pogojih ob 17,5 min. Seve so gojili dva dni na gojišču z ''2%'' glukoze in ''0,5 g / L'' fenilalanina (L-fenilalanina) kaj je omogočalo hitrejšo tvorbo stirena.

Pripravili so štiri različne kulture:

kontrolo s fenilalaninom (Ctrl),
sev, ki je vseboval PAL2 s fenilalaninom (PAL2 +),
sev, ki je vseboval PAL2 brez fenilalanina (PAL2-)
sev, ki je vseboval PAL2 in celulozo s fenilalaninom (PAL2 ++)

Po inkubaciji, celično kulturo so centrifugirali in supernatant dali na kolono.

Kot je razvidno iz slike, vrh opažen pri 17,5 min, kaže na tvorbo stirena v celicah. Drugi vrh pri 10 min, pa ni prisoten pri negativni kontroli, je trans-cinamat-prekurzor stirena. Očitno je da je vrh trans-cinamata večji od stirenskega kaj ukaže da je pretvorba trans-cinamata v stiren v tih pogojih omejena.
[[Image:Example.jpg]]
Pri stirenskem vrhu, lahko opazimo razlike med testiranimi sevi. Med vsemi tremi sevi, ki vsebujejo PAL2, je očitna razlika v primerjavi s kontrolo, kar kaže na uspešno proizvodnjo stirena. Primerjava PAL2 in PAL2 + kaže, da dodajanje fenilalanina ni potrebno da bi se začela sama transformacija v stiren. V spodnji tabeli je prikazan približek proizvedene količine stirena. Ti rezultati kažejo, da so uspešno proizvedli stiren v kvasovki iz glukoze.
[[Image:Example.jpg]]

== ZAKLJUČEK ==

Zelo je pomembno ohraniti naš planet za generacije ki še prihajajo. Ekipa iz Groningena je naredila korak k temu z razvojem projekta StyGreen, saj pričakujejo da bo ta tehnologija spremenila trg plastike iz črne v zeleno. Lahko zaključimo da je to dobar način zmanjšanja uporabe fosilnih goriv v proizvodnji plastike, vendar pa še vedno nimamo rešitev za vprašanje ''» Kako se znebiti plastike?«
''

StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov:

2019-01-15T12:08:03Z

Milena Stojkovska: New page: StyGreen je projekt študentske ekipe iz Groningena,Nizozemska s katerem so se predstavili na IGEM 2018 tekmovanju. Namen projekta je proizvodnja eko-stirena v organizmu S.cervisiae z upor...

StyGreen je projekt študentske ekipe iz Groningena,Nizozemska s katerem so se predstavili na IGEM 2018 tekmovanju. Namen projekta je proizvodnja eko-stirena v organizmu S.cervisiae z uporabo odpadne celuloze kot obnovljiv vir.

==UVOD==
Proizvodnja veliko kemikalij je na podlagi fosilnih goriv ki so omejen resurs v svetu. Kot že vemo in se veliko govori da ti resursi se bojo popolnoma izkoristili v naslednjih nekolk 10-ih letih, zato je velika poudarjenost da jih zamenjamo z bio-obnovljivimi resursi in trajnostnih proizvodnih procesov. Ta projekt se zalaga za razvoj bio-gospodarstva da bi imeli bolj zelen planet preko raziskave in razvoja alternativnih poteh. Eden od njih je alternativna proizvodnja stirena.
Monomerni stiren je osnova za proizvodnjo plasticnih polimerov kot so akrilonitrilni butadien stiren (ABS), guma iz stiren butadiena ali prečnopovezanega polistirena. Nepolarna in aromatična struktura stirenov omogoča želenih fizičnih, kemijskih in električnih lasnotsti ki jih ne moremo dobiti pri drugih materijalih. Imajo širok spekter uporabe kot so LEGO kocke, industrijske gume, kolesarske gume ali izolacijski materiali v elektronskih napravah. Termoplastične lasnosti pa omogočajo njihovo lažje recikliranje. V zadnjih 70 letih so izdelki iz stirena postali del našemu življenju in so nenadomestljivi za številne industrijo. Zato bo povpraševanje po stirenu neizogibno trajalo dlje od razpoložljivosti fosilnih goriv. Razvoj alternativne proizvodne poti je zato izjemno pomemben.

Seminarji SB 2018/19

2019-01-15T12:07:37Z

Milena Stojkovska:

V študijskem letu 2018/19 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RNA-stikala_tipa_%C2%BBToehold%C2%AB:_de_novo_oblikovani_regulatorji_izra%C5%BEanja_genov RNA-stikala tipa Toehold: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov] (Špela Malenšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Raznoliko_in_modelno_zasnovana_priprava_sinteti%C4%8Dnih_genskih_vezij_s_predvidenimi_lastnostmi Raznoliko in modelno zasnovana priprava sintetičnih genskih vezij s predvidenimi lastnostmi] (Matej Kolarič)

[[Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage]] (Fran Krstanović)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nekaj_pogledov_na_sistemsko_biologijo_kvasovke Nekaj pogledov na sistemsko biologijo kvasovke] (Gašper Žun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organizacija_znotrajceli%C4%8Dnih_reakcij_z_razumsko_na%C4%8Drtovanimi_RNA_sestavi#Na.C4.8Drtovanje_in_sestavljanje_RNA_sestavov Organizacija znotrajceličnih reakcij z razumsko načrtovanimi RNA sestavi] (Urška Jelenovec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biolo%C5%A1ko_vezje_na_osnovi_RNA-interference_za_identifikacijo_specifi%C4%8Dnih_rakavih_celic Biološko vezje na osnovi RNA-interference za identifikacijo specifičnih rakavih celic] (Gašper Marinšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kontrola_hitrosti_translacije_preko_pomožnega_mesta_5’-UTR:_energijski_kompromis_med_dostopnostjo%2C_selektivnim_razvijanjem_RNA-struktur_in_drsenjem_30S_ribosomske_podenote_po_RNA-strukturah Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah] (Neža Koritnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_genskega_skupka_za_fiksacijo_dušika_bakterije_Klebsiella_oxytoca Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije ''Klebsiella oxytoca''] (Gašper Virant)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Negativna_samoregulacija_linearizira_odziv_na_odmerek_in_zavira_heterogenost_genskega_izražanja Negativna samoregulacija linearizira odziv na odmerek in zavira heterogenost genskega izražanja] (Primož Tič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Design_and_analysis_of_synthetic_carbon_fixation_pathways Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways] (Marija Atanasova)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pol-sinteti%C4%8Den_organizem_z_raz%C5%A1irjeno_gensko_abecedo Pol-sintetičen organizem z razširjeno gensko abecedo] (Peter Pečan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programirano_uti%C5%A1anje_in_aktivacija_izra%C5%BEanja_bakterijskega_gena_z_uporabo_konstruiranega_CRISPR-Cas_sistema Programirano utišanje in aktivacija izražanja bakterijskega gena z uporabo konstruiranega CRISPR-Cas sistema] (Tjaša Sorčan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_optogenetska_transkripcijska_naprava_za_izboljšanje_homeostaze_krvnega_sladkorja_pri_miših Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših] (Natalija Pucihar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_bakterij_Escherichia_coli_odzivnih_na_svetlobo Inženiring bakterij ''Escherichia coli'' odzivnih na svetlobo] (Karmen Žbogar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_in%C5%BEeniring_intergenskih_regij_v_operonih_uravnava_izra%C5%BEanje_ve%C4%8D_genov Kombinatorični inženiring intergenskih regij v operonih uravnava izražanje več genov] (Urška Kašnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Stohasti%C4%8Dna_oja%C4%8Ditev_in_signalizacija_v_substratnih_ciklih_s_%C5%A1umom_induciranih_bistabilnosti_z_oscilacijami Stohastična ojačitev in signalizacija v substratnih ciklih s šumom induciranih bistabilnosti z oscilacijami] (Uroš Zavrtanik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zaznavalni_niz_genetskih_biopikslov_sklopljenih_preko_radikalov Zaznavalni niz genetskih "biopikslov" sklopljenih preko radikalov] (Miha Koprivnikar Krajnc)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularna_optimizacija_večgenskih_poti_za_proizvodnjo_maščobnih_kislin_v_E._coli Modularna optimizacija večgenskih poti za proizvodnjo maščobnih kislin v ''E. coli''] (Špela Koren)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Canditect:_hitra_detekcija_vaginalne_infekcije_s_Candido_albicans_z_uporabo_sistema_CRISPR/dCas9 Canditect – hitra detekcija vaginalne infekcije s Candido albicans z uporabo sistema CRISPR/dCas9] (Jerneja Ovčar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAPOEIRA_-_razvoj_personaliziranega_cepiva_proti_raku_in_sistema_za_spremljanje_odziva_na_zdravljenje CAPOEIRA – razvoj personaliziranega cepiva proti raku in sistema za spremljanje odziva na zdravljenje] (Anamarija Habič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biotic_Blue_-_encimska_razgradnja_zdravilnih_u%C4%8Dinkovin_v_odpadnih_vodah#BIOTIC_BLUE BIOTIC BLUE - encimska razgradnja zdravilnih učinkovin v odpadnih vodah] (Tina Požun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Of_CO2urse_-_sistem_za_zmanj%C5%A1evanje_izpustov_ogljikovega_dioksida_v_industriji Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji] (Kity Požek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cockroach_terminator Cockroach terminator]] (Roberta Mulac)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MiBiome_-_probioti%C4%8Dna_bakterija_za_zdravljenje_kroni%C4%8Dne_vnetne_%C4%8Drevesne_bolezni MiBiome - probiotična bakterija za zdravljenje kronične vnetne črevesne bolezni] (Ernest Šprager)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BioWatcher_pametna_ura_za_sledenje_ravni_biomarkerjev_za_bolezni BioWatcher: Pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni] (Nina Mavec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAT-Seq:_Visokoprepustna_metoda_za_analizo_katalitske_aktivnosti_biomolekul CAT-Seq: Visokoprepustna metoda za analizo katalitske aktivnosti biomolekul] (Bine Tršavec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/VIBRIGENS:_pospe%C5%A1evanje_procesov_sintezne_biologije_z_Vibrio_natriegens VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z ''Vibrio natriegens''] (Tadej Satler)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/APIS-_nov_pristop_za_zdravljenje_oku%C5%BEbe_z_Nosema_caranae_pri_%C4%8Debelah#PROJEKT_APIS APIS- nov pristop za zdravljenje okužbe z Nosema caranae pri čebelah] (Jerneja Kocutar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/StyGreen_-_proizvodnja_stirena_iz_obnovljivih_virov: StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov] (Milena Stojkovska)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

22.11. 
1 
2 Valentina Levak 

27.11. 
1 
2 
3 
4 

29.11. 
1 Matej Kolarič 
2 Špela Malenšek 
3 
4 

4.12. 
1 Gašper Žun 
2 Fran Krstanovic 
3 
4 

6.12. 
1 Urška Jelenovec 
2 Rok Miklavčič 
3 
4 

11.12. 
1 Jerneja Ovčar 
2 Neža Koritnik 
3 Gašper Virant 
4 Gašper Marinšek 

18.12. 
1 Tina Požun 
2 Anamarija Habič 
3 Roberta Mulac 
4 Kity Požek 

3.1. 
1 Nina Mavec 
2 Primož Tič 
3 Ernest Šprager 
4 

8.1. 
1 Marija Atanasova 
2 Bine Tršavec 
3 Peter Pečan 
4 Tjaša Sorčan 

10.1. 
1 Urška Kašnik 
2 Natalija Pucihar 
3 Karmen Žbogar 
4 Uroš Zavrtanik 

15.1. 
1 Jerneja Kocutar 
2 Špela Koren 
3 Tadej Satler 
4 Miha Koprivnikar Krajnc 

17.1. 
1 Milena Stojkovska 
2 Blaž Lebar

Seminarji SB 2018/19

2019-01-15T12:06:26Z

Milena Stojkovska:

V študijskem letu 2018/19 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RNA-stikala_tipa_%C2%BBToehold%C2%AB:_de_novo_oblikovani_regulatorji_izra%C5%BEanja_genov RNA-stikala tipa Toehold: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov] (Špela Malenšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Raznoliko_in_modelno_zasnovana_priprava_sinteti%C4%8Dnih_genskih_vezij_s_predvidenimi_lastnostmi Raznoliko in modelno zasnovana priprava sintetičnih genskih vezij s predvidenimi lastnostmi] (Matej Kolarič)

[[Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage]] (Fran Krstanović)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nekaj_pogledov_na_sistemsko_biologijo_kvasovke Nekaj pogledov na sistemsko biologijo kvasovke] (Gašper Žun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organizacija_znotrajceli%C4%8Dnih_reakcij_z_razumsko_na%C4%8Drtovanimi_RNA_sestavi#Na.C4.8Drtovanje_in_sestavljanje_RNA_sestavov Organizacija znotrajceličnih reakcij z razumsko načrtovanimi RNA sestavi] (Urška Jelenovec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biolo%C5%A1ko_vezje_na_osnovi_RNA-interference_za_identifikacijo_specifi%C4%8Dnih_rakavih_celic Biološko vezje na osnovi RNA-interference za identifikacijo specifičnih rakavih celic] (Gašper Marinšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kontrola_hitrosti_translacije_preko_pomožnega_mesta_5’-UTR:_energijski_kompromis_med_dostopnostjo%2C_selektivnim_razvijanjem_RNA-struktur_in_drsenjem_30S_ribosomske_podenote_po_RNA-strukturah Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah] (Neža Koritnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_genskega_skupka_za_fiksacijo_dušika_bakterije_Klebsiella_oxytoca Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije ''Klebsiella oxytoca''] (Gašper Virant)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Negativna_samoregulacija_linearizira_odziv_na_odmerek_in_zavira_heterogenost_genskega_izražanja Negativna samoregulacija linearizira odziv na odmerek in zavira heterogenost genskega izražanja] (Primož Tič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Design_and_analysis_of_synthetic_carbon_fixation_pathways Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways] (Marija Atanasova)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pol-sinteti%C4%8Den_organizem_z_raz%C5%A1irjeno_gensko_abecedo Pol-sintetičen organizem z razširjeno gensko abecedo] (Peter Pečan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programirano_uti%C5%A1anje_in_aktivacija_izra%C5%BEanja_bakterijskega_gena_z_uporabo_konstruiranega_CRISPR-Cas_sistema Programirano utišanje in aktivacija izražanja bakterijskega gena z uporabo konstruiranega CRISPR-Cas sistema] (Tjaša Sorčan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_optogenetska_transkripcijska_naprava_za_izboljšanje_homeostaze_krvnega_sladkorja_pri_miših Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših] (Natalija Pucihar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_bakterij_Escherichia_coli_odzivnih_na_svetlobo Inženiring bakterij ''Escherichia coli'' odzivnih na svetlobo] (Karmen Žbogar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_in%C5%BEeniring_intergenskih_regij_v_operonih_uravnava_izra%C5%BEanje_ve%C4%8D_genov Kombinatorični inženiring intergenskih regij v operonih uravnava izražanje več genov] (Urška Kašnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Stohasti%C4%8Dna_oja%C4%8Ditev_in_signalizacija_v_substratnih_ciklih_s_%C5%A1umom_induciranih_bistabilnosti_z_oscilacijami Stohastična ojačitev in signalizacija v substratnih ciklih s šumom induciranih bistabilnosti z oscilacijami] (Uroš Zavrtanik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zaznavalni_niz_genetskih_biopikslov_sklopljenih_preko_radikalov Zaznavalni niz genetskih "biopikslov" sklopljenih preko radikalov] (Miha Koprivnikar Krajnc)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularna_optimizacija_večgenskih_poti_za_proizvodnjo_maščobnih_kislin_v_E._coli Modularna optimizacija večgenskih poti za proizvodnjo maščobnih kislin v ''E. coli''] (Špela Koren)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Canditect:_hitra_detekcija_vaginalne_infekcije_s_Candido_albicans_z_uporabo_sistema_CRISPR/dCas9 Canditect – hitra detekcija vaginalne infekcije s Candido albicans z uporabo sistema CRISPR/dCas9] (Jerneja Ovčar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAPOEIRA_-_razvoj_personaliziranega_cepiva_proti_raku_in_sistema_za_spremljanje_odziva_na_zdravljenje CAPOEIRA – razvoj personaliziranega cepiva proti raku in sistema za spremljanje odziva na zdravljenje] (Anamarija Habič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biotic_Blue_-_encimska_razgradnja_zdravilnih_u%C4%8Dinkovin_v_odpadnih_vodah#BIOTIC_BLUE BIOTIC BLUE - encimska razgradnja zdravilnih učinkovin v odpadnih vodah] (Tina Požun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Of_CO2urse_-_sistem_za_zmanj%C5%A1evanje_izpustov_ogljikovega_dioksida_v_industriji Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji] (Kity Požek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cockroach_terminator Cockroach terminator]] (Roberta Mulac)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MiBiome_-_probioti%C4%8Dna_bakterija_za_zdravljenje_kroni%C4%8Dne_vnetne_%C4%8Drevesne_bolezni MiBiome - probiotična bakterija za zdravljenje kronične vnetne črevesne bolezni] (Ernest Šprager)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BioWatcher_pametna_ura_za_sledenje_ravni_biomarkerjev_za_bolezni BioWatcher: Pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni] (Nina Mavec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAT-Seq:_Visokoprepustna_metoda_za_analizo_katalitske_aktivnosti_biomolekul CAT-Seq: Visokoprepustna metoda za analizo katalitske aktivnosti biomolekul] (Bine Tršavec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/VIBRIGENS:_pospe%C5%A1evanje_procesov_sintezne_biologije_z_Vibrio_natriegens VIBRIGENS: pospeševanje procesov sintezne biologije z ''Vibrio natriegens''] (Tadej Satler)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/APIS-_nov_pristop_za_zdravljenje_oku%C5%BEbe_z_Nosema_caranae_pri_%C4%8Debelah#PROJEKT_APIS APIS- nov pristop za zdravljenje okužbe z Nosema caranae pri čebelah] (Jerneja Kocutar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/StyGreen_-_proizvodnja_stirena_iz_obnovljivih_virov: proizvodnja stirena iz obnovljivih virov] (Milena Stojkovska)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

22.11. 
1 
2 Valentina Levak 

27.11. 
1 
2 
3 
4 

29.11. 
1 Matej Kolarič 
2 Špela Malenšek 
3 
4 

4.12. 
1 Gašper Žun 
2 Fran Krstanovic 
3 
4 

6.12. 
1 Urška Jelenovec 
2 Rok Miklavčič 
3 
4 

11.12. 
1 Jerneja Ovčar 
2 Neža Koritnik 
3 Gašper Virant 
4 Gašper Marinšek 

18.12. 
1 Tina Požun 
2 Anamarija Habič 
3 Roberta Mulac 
4 Kity Požek 

3.1. 
1 Nina Mavec 
2 Primož Tič 
3 Ernest Šprager 
4 

8.1. 
1 Marija Atanasova 
2 Bine Tršavec 
3 Peter Pečan 
4 Tjaša Sorčan 

10.1. 
1 Urška Kašnik 
2 Natalija Pucihar 
3 Karmen Žbogar 
4 Uroš Zavrtanik 

15.1. 
1 Jerneja Kocutar 
2 Špela Koren 
3 Tadej Satler 
4 Miha Koprivnikar Krajnc 

17.1. 
1 Milena Stojkovska 
2 Blaž Lebar

StyGreen - proizvodnja stirena iz obnovljivih virov

2019-01-15T12:04:14Z