Wiki FKKT - User contributions [en]

Seminarji SB 2024/25

2025-05-29T10:03:37Z

Miljan01:

V študijskem letu 2024/25 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_umetnih_medvrstnih_promotorjev_z_različnimi_transkripcijskimi_močmi Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi] (Miljan Trajković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preprečevanje_nastanka_multimerov_pogosto_uporabljenih_plazmidov_v_sintezni_biologiji Preprečevanje nastanka multimerov pogosto uporabljenih plazmidov v sintezni biologiji] (Lev Jošt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_Nicotiane_benthamiane_za_proizvodnjo_krisoeriola_z_uporabo_tehnik_sintezne_biologije Priprava ''Nicotiane benthamiane'' za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije] (Nika Frelih)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gensko_spremenjeni_receptorji_za_komunikacijo_med_celicami_preko_topnih_signalov_in_zaznavanje_bolezni Gensko spremenjeni receptorji za komunikacijo med celicami preko topnih signalov in zaznavanje bolezni] (Zara Bunc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nadzor_nad_izražanjem_heterolognih_genov_pri_Bdellovibrio_bacteriovorus_z_uporabo_sintezne_biologije Nadzor nad izražanjem heterolognih genov pri Bdellovibrio bacteriovorus z uporabo sintezne biologije] (Živa Flego)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_konzorcija_kvasovk_za_de_novo_biosintezo_rastlinskih_lignanov Uporaba konzorcija kvasovk za de novo biosintezo rastlinskih lignanov] (Urša Lah)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sonogenetsko_nadzorovane_gensko_spremenjene_celice_za_zdravljenje_raka_v_mišjih_tumorskih_modelih Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih] (Pia Mencin)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Združitev_difuzijskega_modela_in_transformerja_za_sintezo_izboljšanih_promotorjev_ter_napoved_moči_sintetičnih_promotorjev_z_uporabo_globokega_učenja Združitev difuzijskega modela in transformerja za sintezo izboljšanih promotorjev ter napoved moči sintetičnih promotorjev z uporabo globokega učenja] (Tinkara Korošec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_dvojno_svetlobo_nadzirani_kokulturni_sistem_omogoča_uravnavanje_sestave_populacije Z dvojno svetlobo nadzirani sistem omogoča uravnavanje sestave populacije] (Ula Mikoš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Načrtovanje_močnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah Načrtovanje močnih inducibilnih sinteznih promotorjev v kvasovkah] (Bor Kunstelj)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolni_inženiring_E._coli_za_izboljšano_produkcijo_diolov_iz_acetata Metabolni inženiring ''E. coli'' za izboljšano produkcijo diolov iz acetata] (Teo Trost)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inkorporacija_fotosintetsko_aktivnih_kloroplastov_iz_alg_v_kultivirane_celice_sesalcev_kot_pot_k_fotosintezi_pri_Živalih Inkorporacija fotosintetsko aktivnih kloroplastov iz alg v kultivirane celice sesalcev kot pot k fotosintezi pri živalih] (Peter Gričar Vintar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izgradnja_metabolične_poti_za_biosintezo_treonina_iz_etilen_glikola Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola] (Tinkara Butara)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezava_sintezne_in_sistemske_biologije_za_in_vivo_encimatiko Povezava sintezne in sistemske biologije za ''in vivo'' encimatiko] (Gaja Starc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nanotelo_proti_Pdc1p_kot_gensko_kodiran_inhibitor_proizvodnje_etanola_omogoča_dvojni_transkripcijski_in_posttranslacijski_nadzor_fermentacije_v_kvasovkah Nanotelo proti Pdc1p kot gensko kodiran inhibitor proizvodnje etanola omogoča dvojni transkripcijski in posttranslacijski nadzor fermentacije v kvasovkah] (Lara Zupanc)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/S_fazno_separacijo_posredovano_sestavljanje_ve%C4%8Dencimskih_kompleksov_in_vivo S fazno separacijo posredovano sestavljanje večencimskih kompleksov ''in vivo''] (Lana Kores)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Umetna_nevronska_mreža_na_proteinski_ravni_v_sesalskih_celicah Umetna nevronska mreža na proteinski ravni v sesalskih celicah] (Gal Kastelic)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sintezne_virologije_za_hitro_inženirstvo_virusa_vezikularnega_stomatitisa_VSV Uporaba sintezne virologije za hitro inženirstvo virusa vezikularnega stomatitisa (VSV)] (Bine Brunec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_inženiring_funkcionalnih_siRNA Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA] (Nataša Vujović)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konstruirane_bakterije_za_z_bli%C5%BEnjo_infrarde%C4%8Do_svetlobo_inducirano_izra%C5%BEanje_protirakavih_terapevtikov Konstruirane bakterije za z bližnjo infrardečo svetlobo inducirano izražanje protirakavih terapevtikov] (Suzana Kučuk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetsko_kodiranje_in_izražanje_RNA_origami_citoskeleta_v_sintetičnih_celicah Genetsko kodiranje in izražanje RNA origami citoskeleta v sintetičnih celicah] (Maša Karčovnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Evolucija_samoreplikativne_DNA_v_sintetični_protocelici Evolucija samoreplikativne DNA v sintetični protocelici] (Teo Stupar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetični Sintetični nastavljivi promotorji za prilagodljivo uravnavanje večgenskega izražanja v sesalskih celicah] (Marjeta Milostnik)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynPlode SynPlode] (Leila Bohorč)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETal:_izdelovanje_eteričnega_olja_sandalovine_iz_PET_plastike PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike] (Lara Krampač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET_TWINS:_Praktična_uporaba_PETaze_za_učinkovitejše_recikliranje_plastike PET TWINS: Praktična uporaba PETaze za učinkovitejše recikliranje plastike] (Tina Urh)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAU-China:_Nodulska_tovarna_DHA_in_EPA CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA] (Luka Fink)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/nuCloud:_Nov_oblak_za_shranjevanje_podatkov_na_osnovi_nukleotidov nuCloud: Nov oblak za shranjevanje podatkov na osnovi nukleotidov] (Aleš Poljanšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_metoda_diagnosticiranja_multiple_skleroze_-_miRADAR Nova metoda diagnosticiranja multiple skleroze - miRADAR] (Petja Premrl)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biostimulant_za_rast_rastlin_na_Luni_–_BioMoon Biostimulant za rast rastlin na Luni – BioMoon] (Žan Žnidar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CAPTURE:_Boj_proti_oku%C5%BEbam_s_Pseudomonas_aeruginosa_z_nosilci_protimikrobnih_peptidov&action=edit&redlink=1 Boj proti okužbam s Pseudomonas aeruginosa z nosilci protimikrobnih peptidov - CAPTURE] (Metka Rus)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/REPARO REPARO] (Lina Kopač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Tarakate Tarakate] (Pia Špehar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Heartecho:_presejalni_test_za_raka_pri_pacientih_po_miokardnem_infarktu Heartecho: presejalni test za raka pri pacientih po miokardnem infarktu] (Zarja Doberšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Synhesion Synhesion] (Janja Bohte)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rebolutionaries Rebolutionaries] (Mia Kobal)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PrymDetect PrymDetect] (Pia Trošt)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PICasSO: Uporaba CRISPR/Cas v 3D genetskem inženirstvu preko programabilnih interakcij DNA-DNA] (Zarja Weingerl)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NeoMineX NeoMineX] (Vanja Ivošević)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v torek torej najkasneje v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored bo razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2023/24]].

Seminarji SB 2024/25

2025-05-29T10:03:14Z

Miljan01:

V študijskem letu 2024/25 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_umetnih_medvrstnih_promotorjev_z_različnimi_transkripcijskimi_močmi Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi] (Miljan Trajković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preprečevanje_nastanka_multimerov_pogosto_uporabljenih_plazmidov_v_sintezni_biologiji Preprečevanje nastanka multimerov pogosto uporabljenih plazmidov v sintezni biologiji] (Lev Jošt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_Nicotiane_benthamiane_za_proizvodnjo_krisoeriola_z_uporabo_tehnik_sintezne_biologije Priprava ''Nicotiane benthamiane'' za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije] (Nika Frelih)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gensko_spremenjeni_receptorji_za_komunikacijo_med_celicami_preko_topnih_signalov_in_zaznavanje_bolezni Gensko spremenjeni receptorji za komunikacijo med celicami preko topnih signalov in zaznavanje bolezni] (Zara Bunc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nadzor_nad_izražanjem_heterolognih_genov_pri_Bdellovibrio_bacteriovorus_z_uporabo_sintezne_biologije Nadzor nad izražanjem heterolognih genov pri Bdellovibrio bacteriovorus z uporabo sintezne biologije] (Živa Flego)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_konzorcija_kvasovk_za_de_novo_biosintezo_rastlinskih_lignanov Uporaba konzorcija kvasovk za de novo biosintezo rastlinskih lignanov] (Urša Lah)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sonogenetsko_nadzorovane_gensko_spremenjene_celice_za_zdravljenje_raka_v_mišjih_tumorskih_modelih Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih] (Pia Mencin)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Združitev_difuzijskega_modela_in_transformerja_za_sintezo_izboljšanih_promotorjev_ter_napoved_moči_sintetičnih_promotorjev_z_uporabo_globokega_učenja Združitev difuzijskega modela in transformerja za sintezo izboljšanih promotorjev ter napoved moči sintetičnih promotorjev z uporabo globokega učenja] (Tinkara Korošec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_dvojno_svetlobo_nadzirani_kokulturni_sistem_omogoča_uravnavanje_sestave_populacije Z dvojno svetlobo nadzirani sistem omogoča uravnavanje sestave populacije] (Ula Mikoš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Načrtovanje_močnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah Načrtovanje močnih inducibilnih sinteznih promotorjev v kvasovkah] (Bor Kunstelj)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolni_inženiring_E._coli_za_izboljšano_produkcijo_diolov_iz_acetata Metabolni inženiring ''E. coli'' za izboljšano produkcijo diolov iz acetata] (Teo Trost)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inkorporacija_fotosintetsko_aktivnih_kloroplastov_iz_alg_v_kultivirane_celice_sesalcev_kot_pot_k_fotosintezi_pri_Živalih Inkorporacija fotosintetsko aktivnih kloroplastov iz alg v kultivirane celice sesalcev kot pot k fotosintezi pri živalih] (Peter Gričar Vintar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izgradnja_metabolične_poti_za_biosintezo_treonina_iz_etilen_glikola Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola] (Tinkara Butara)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezava_sintezne_in_sistemske_biologije_za_in_vivo_encimatiko Povezava sintezne in sistemske biologije za ''in vivo'' encimatiko] (Gaja Starc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nanotelo_proti_Pdc1p_kot_gensko_kodiran_inhibitor_proizvodnje_etanola_omogoča_dvojni_transkripcijski_in_posttranslacijski_nadzor_fermentacije_v_kvasovkah Nanotelo proti Pdc1p kot gensko kodiran inhibitor proizvodnje etanola omogoča dvojni transkripcijski in posttranslacijski nadzor fermentacije v kvasovkah] (Lara Zupanc)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/S_fazno_separacijo_posredovano_sestavljanje_ve%C4%8Dencimskih_kompleksov_in_vivo S fazno separacijo posredovano sestavljanje večencimskih kompleksov ''in vivo''] (Lana Kores)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Umetna_nevronska_mreža_na_proteinski_ravni_v_sesalskih_celicah Umetna nevronska mreža na proteinski ravni v sesalskih celicah] (Gal Kastelic)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sintezne_virologije_za_hitro_inženirstvo_virusa_vezikularnega_stomatitisa_VSV Uporaba sintezne virologije za hitro inženirstvo virusa vezikularnega stomatitisa (VSV)] (Bine Brunec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_inženiring_funkcionalnih_siRNA Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA] (Nataša Vujović)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konstruirane_bakterije_za_z_bli%C5%BEnjo_infrarde%C4%8Do_svetlobo_inducirano_izra%C5%BEanje_protirakavih_terapevtikov Konstruirane bakterije za z bližnjo infrardečo svetlobo inducirano izražanje protirakavih terapevtikov] (Suzana Kučuk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetsko_kodiranje_in_izražanje_RNA_origami_citoskeleta_v_sintetičnih_celicah Genetsko kodiranje in izražanje RNA origami citoskeleta v sintetičnih celicah] (Maša Karčovnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Evolucija_samoreplikativne_DNA_v_sintetični_protocelici Evolucija samoreplikativne DNA v sintetični protocelici] (Teo Stupar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetični_nastavljivi_promotorji_za_prilagodljivo_uravnavanje_večgenskega_izražanja_v_sesalskih_celicah Sintetični nastavljivi promotorji za prilagodljivo uravnavanje večgenskega izražanja v sesalskih celicah] (Marjeta Milostnik)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynPlode SynPlode] (Leila Bohorč)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETal:_izdelovanje_eteričnega_olja_sandalovine_iz_PET_plastike PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike] (Lara Krampač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET_TWINS:_Praktična_uporaba_PETaze_za_učinkovitejše_recikliranje_plastike PET TWINS: Praktična uporaba PETaze za učinkovitejše recikliranje plastike] (Tina Urh)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAU-China:_Nodulska_tovarna_DHA_in_EPA CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA] (Luka Fink)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/nuCloud:_Nov_oblak_za_shranjevanje_podatkov_na_osnovi_nukleotidov nuCloud: Nov oblak za shranjevanje podatkov na osnovi nukleotidov] (Aleš Poljanšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_metoda_diagnosticiranja_multiple_skleroze_-_miRADAR Nova metoda diagnosticiranja multiple skleroze - miRADAR] (Petja Premrl)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biostimulant_za_rast_rastlin_na_Luni_–_BioMoon Biostimulant za rast rastlin na Luni – BioMoon] (Žan Žnidar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CAPTURE:_Boj_proti_oku%C5%BEbam_s_Pseudomonas_aeruginosa_z_nosilci_protimikrobnih_peptidov&action=edit&redlink=1 Boj proti okužbam s Pseudomonas aeruginosa z nosilci protimikrobnih peptidov - CAPTURE] (Metka Rus)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/REPARO REPARO] (Lina Kopač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Tarakate Tarakate] (Pia Špehar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Heartecho:_presejalni_test_za_raka_pri_pacientih_po_miokardnem_infarktu Heartecho: presejalni test za raka pri pacientih po miokardnem infarktu] (Zarja Doberšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Synhesion Synhesion] (Janja Bohte)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rebolutionaries Rebolutionaries] (Mia Kobal)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PrymDetect PrymDetect] (Pia Trošt)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PICasSO: Uporaba CRISPR/Cas v 3D genetskem inženirstvu preko programabilnih interakcij DNA-DNA] (Zarja Weingerl)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NeoMineX NeoMineX] (Vanja Ivošević)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v torek torej najkasneje v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored bo razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2023/24]].

Seminarji SB 2024/25

2025-05-29T10:00:16Z

Miljan01:

Seminarji SB 2024/25

2025-05-29T09:59:48Z

Miljan01:

V študijskem letu 2024/25 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_umetnih_medvrstnih_promotorjev_z_različnimi_transkripcijskimi_močmi Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi] (Miljan Trajković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preprečevanje_nastanka_multimerov_pogosto_uporabljenih_plazmidov_v_sintezni_biologiji Preprečevanje nastanka multimerov pogosto uporabljenih plazmidov v sintezni biologiji] (Lev Jošt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_Nicotiane_benthamiane_za_proizvodnjo_krisoeriola_z_uporabo_tehnik_sintezne_biologije Priprava ''Nicotiane benthamiane'' za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije] (Nika Frelih)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gensko_spremenjeni_receptorji_za_komunikacijo_med_celicami_preko_topnih_signalov_in_zaznavanje_bolezni Gensko spremenjeni receptorji za komunikacijo med celicami preko topnih signalov in zaznavanje bolezni] (Zara Bunc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nadzor_nad_izražanjem_heterolognih_genov_pri_Bdellovibrio_bacteriovorus_z_uporabo_sintezne_biologije Nadzor nad izražanjem heterolognih genov pri Bdellovibrio bacteriovorus z uporabo sintezne biologije] (Živa Flego)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_konzorcija_kvasovk_za_de_novo_biosintezo_rastlinskih_lignanov Uporaba konzorcija kvasovk za de novo biosintezo rastlinskih lignanov] (Urša Lah)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sonogenetsko_nadzorovane_gensko_spremenjene_celice_za_zdravljenje_raka_v_mišjih_tumorskih_modelih Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih] (Pia Mencin)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Združitev_difuzijskega_modela_in_transformerja_za_sintezo_izboljšanih_promotorjev_ter_napoved_moči_sintetičnih_promotorjev_z_uporabo_globokega_učenja Združitev difuzijskega modela in transformerja za sintezo izboljšanih promotorjev ter napoved moči sintetičnih promotorjev z uporabo globokega učenja] (Tinkara Korošec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_dvojno_svetlobo_nadzirani_kokulturni_sistem_omogoča_uravnavanje_sestave_populacije Z dvojno svetlobo nadzirani sistem omogoča uravnavanje sestave populacije] (Ula Mikoš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Načrtovanje_močnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah Načrtovanje močnih inducibilnih sinteznih promotorjev v kvasovkah] (Bor Kunstelj)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolni_inženiring_E._coli_za_izboljšano_produkcijo_diolov_iz_acetata Metabolni inženiring ''E. coli'' za izboljšano produkcijo diolov iz acetata] (Teo Trost)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inkorporacija_fotosintetsko_aktivnih_kloroplastov_iz_alg_v_kultivirane_celice_sesalcev_kot_pot_k_fotosintezi_pri_Živalih Inkorporacija fotosintetsko aktivnih kloroplastov iz alg v kultivirane celice sesalcev kot pot k fotosintezi pri živalih] (Peter Gričar Vintar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izgradnja_metabolične_poti_za_biosintezo_treonina_iz_etilen_glikola Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola] (Tinkara Butara)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezava_sintezne_in_sistemske_biologije_za_in_vivo_encimatiko Povezava sintezne in sistemske biologije za ''in vivo'' encimatiko] (Gaja Starc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nanotelo_proti_Pdc1p_kot_gensko_kodiran_inhibitor_proizvodnje_etanola_omogoča_dvojni_transkripcijski_in_posttranslacijski_nadzor_fermentacije_v_kvasovkah Nanotelo proti Pdc1p kot gensko kodiran inhibitor proizvodnje etanola omogoča dvojni transkripcijski in posttranslacijski nadzor fermentacije v kvasovkah] (Lara Zupanc)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/S_fazno_separacijo_posredovano_sestavljanje_ve%C4%8Dencimskih_kompleksov_in_vivo S fazno separacijo posredovano sestavljanje večencimskih kompleksov ''in vivo''] (Lana Kores)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Umetna_nevronska_mreža_na_proteinski_ravni_v_sesalskih_celicah Umetna nevronska mreža na proteinski ravni v sesalskih celicah] (Gal Kastelic)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sintezne_virologije_za_hitro_inženirstvo_virusa_vezikularnega_stomatitisa_VSV Uporaba sintezne virologije za hitro inženirstvo virusa vezikularnega stomatitisa (VSV)] (Bine Brunec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_inženiring_funkcionalnih_siRNA Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA] (Nataša Vujović)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konstruirane_bakterije_za_z_bli%C5%BEnjo_infrarde%C4%8Do_svetlobo_inducirano_izra%C5%BEanje_protirakavih_terapevtikov Konstruirane bakterije za z bližnjo infrardečo svetlobo inducirano izražanje protirakavih terapevtikov] (Suzana Kučuk)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetsko_kodiranje_in_izražanje_RNA_origami_citoskeleta_v_sintetičnih_celicah Genetsko kodiranje in izražanje RNA origami citoskeleta v sintetičnih celicah] (Maša Karčovnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Evolucija_samoreplikativne_DNA_v_sintetični_protocelici Evolucija samoreplikativne DNA v sintetični protocelici] (Teo Stupar)
NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynPlode SynPlode] (Leila Bohorč)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETal:_izdelovanje_eteričnega_olja_sandalovine_iz_PET_plastike PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike] (Lara Krampač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET_TWINS:_Praktična_uporaba_PETaze_za_učinkovitejše_recikliranje_plastike PET TWINS: Praktična uporaba PETaze za učinkovitejše recikliranje plastike] (Tina Urh)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAU-China:_Nodulska_tovarna_DHA_in_EPA CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA] (Luka Fink)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/nuCloud:_Nov_oblak_za_shranjevanje_podatkov_na_osnovi_nukleotidov nuCloud: Nov oblak za shranjevanje podatkov na osnovi nukleotidov] (Aleš Poljanšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_metoda_diagnosticiranja_multiple_skleroze_-_miRADAR Nova metoda diagnosticiranja multiple skleroze - miRADAR] (Petja Premrl)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biostimulant_za_rast_rastlin_na_Luni_–_BioMoon Biostimulant za rast rastlin na Luni – BioMoon] (Žan Žnidar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CAPTURE:_Boj_proti_oku%C5%BEbam_s_Pseudomonas_aeruginosa_z_nosilci_protimikrobnih_peptidov&action=edit&redlink=1 Boj proti okužbam s Pseudomonas aeruginosa z nosilci protimikrobnih peptidov - CAPTURE] (Metka Rus)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/REPARO REPARO] (Lina Kopač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Tarakate Tarakate] (Pia Špehar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Heartecho:_presejalni_test_za_raka_pri_pacientih_po_miokardnem_infarktu Heartecho: presejalni test za raka pri pacientih po miokardnem infarktu] (Zarja Doberšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Synhesion Synhesion] (Janja Bohte)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rebolutionaries Rebolutionaries] (Mia Kobal)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PrymDetect PrymDetect] (Pia Trošt)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PICasSO: Uporaba CRISPR/Cas v 3D genetskem inženirstvu preko programabilnih interakcij DNA-DNA] (Zarja Weingerl)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NeoMineX NeoMineX] (Vanja Ivošević)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintetični Sintetični nastavljivi promotorji za prilagodljivo uravnavanje večgenskega izražanja v sesalskih celicah] (Marjeta Milostnik)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v torek torej najkasneje v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored bo razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2023/24]].

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-14T08:38:00Z

Miljan01:

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

== Zaključek ==

== Literatura ==

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-14T08:37:08Z

Miljan01: Created page with "Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]"

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

Seminarji SB 2024/25

2025-05-14T08:34:49Z

Miljan01:

V študijskem letu 2024/25 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_umetnih_medvrstnih_promotorjev_z_različnimi_transkripcijskimi_močmi Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi] (Miljan Trajković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preprečevanje_nastanka_multimerov_pogosto_uporabljenih_plazmidov_v_sintezni_biologiji Preprečevanje nastanka multimerov pogosto uporabljenih plazmidov v sintezni biologiji] (Lev Jošt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_Nicotiane_benthamiane_za_proizvodnjo_krisoeriola_z_uporabo_tehnik_sintezne_biologije Priprava ''Nicotiane benthamiane'' za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije] (Nika Frelih)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gensko_spremenjeni_receptorji_za_komunikacijo_med_celicami_preko_topnih_signalov_in_zaznavanje_bolezni Gensko spremenjeni receptorji za komunikacijo med celicami preko topnih signalov in zaznavanje bolezni] (Zara Bunc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nadzor_nad_izražanjem_heterolognih_genov_pri_Bdellovibrio_bacteriovorus_z_uporabo_sintezne_biologije Nadzor nad izražanjem heterolognih genov pri Bdellovibrio bacteriovorus z uporabo sintezne biologije] (Živa Flego)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_konzorcija_kvasovk_za_de_novo_biosintezo_rastlinskih_lignanov Uporaba konzorcija kvasovk za de novo biosintezo rastlinskih lignanov] (Urša Lah)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sonogenetsko_nadzorovane_gensko_spremenjene_celice_za_zdravljenje_raka_v_mišjih_tumorskih_modelih Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih] (Pia Mencin)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Združitev_difuzijskega_modela_in_transformerja_za_sintezo_izboljšanih_promotorjev_ter_napoved_moči_sintetičnih_promotorjev_z_uporabo_globokega_učenja Združitev difuzijskega modela in transformerja za sintezo izboljšanih promotorjev ter napoved moči sintetičnih promotorjev z uporabo globokega učenja] (Tinkara Korošec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_dvojno_svetlobo_nadzirani_kokulturni_sistem_omogoča_uravnavanje_sestave_populacije Z dvojno svetlobo nadzirani sistem omogoča uravnavanje sestave populacije] (Ula Mikoš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Načrtovanje_močnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah Načrtovanje močnih inducibilnih sinteznih promotorjev v kvasovkah] (Bor Kunstelj)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolni_inženiring_E._coli_za_izboljšano_produkcijo_diolov_iz_acetata Metabolni inženiring ''E. coli'' za izboljšano produkcijo diolov iz acetata] (Teo Trost)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inkorporacija_fotosintetsko_aktivnih_kloroplastov_iz_alg_v_kultivirane_celice_sesalcev_kot_pot_k_fotosintezi_pri_Živalih Inkorporacija fotosintetsko aktivnih kloroplastov iz alg v kultivirane celice sesalcev kot pot k fotosintezi pri živalih] (Peter Gričar Vintar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izgradnja_metabolične_poti_za_biosintezo_treonina_iz_etilen_glikola Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola] (Tinkara Butara)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezava_sintezne_in_sistemske_biologije_za_in_vivo_encimatiko Povezava sintezne in sistemske biologije za ''in vivo'' encimatiko] (Gaja Starc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nanotelo_proti_Pdc1p_kot_gensko_kodiran_inhibitor_proizvodnje_etanola_omogoča_dvojni_transkripcijski_in_posttranslacijski_nadzor_fermentacije_v_kvasovkah Nanotelo proti Pdc1p kot gensko kodiran inhibitor proizvodnje etanola omogoča dvojni transkripcijski in posttranslacijski nadzor fermentacije v kvasovkah] (Lara Zupanc)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/S_fazno_separacijo_posredovano_sestavljanje_ve%C4%8Dencimskih_kompleksov_in_vivo S fazno separacijo posredovano sestavljanje večencimskih kompleksov ''in vivo''] (Lana Kores)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_inženiring_funkcionalnih_siRNA Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA] (Nataša Vujović)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynPlode SynPlode] (Leila Bohorč)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETal:_izdelovanje_eteričnega_olja_sandalovine_iz_PET_plastike PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike] (Lara Krampač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET_TWINS:_Praktična_uporaba_PETaze_za_učinkovitejše_recikliranje_plastike PET TWINS: Praktična uporaba PETaze za učinkovitejše recikliranje plastike] (Tina Urh)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAU-China:_Nodulska_tovarna_DHA_in_EPA CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA] (Luka Fink)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/nuCloud:_Nov_oblak_za_shranjevanje_podatkov_na_osnovi_nukleotidov nuCloud: Nov oblak za shranjevanje podatkov na osnovi nukleotidov] (Aleš Poljanšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_metoda_diagnosticiranja_multiple_skleroze_-_miRADAR Nova metoda diagnosticiranja multiple skleroze - miRADAR] (Petja Premrl)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biostimulant_za_rast_rastlin_na_Luni_–_BioMoon Biostimulant za rast rastlin na Luni – BioMoon] (Žan Žnidar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CAPTURE:_Boj_proti_oku%C5%BEbam_s_Pseudomonas_aeruginosa_z_nosilci_protimikrobnih_peptidov&action=edit&redlink=1 Boj proti okužbam s Pseudomonas aeruginosa z nosilci protimikrobnih peptidov - CAPTURE] (Metka Rus)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/REPARO REPARO] (Lina Kopač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Tarakate Tarakate] (Pia Špehar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Heartecho:_presejalni_test_za_raka_pri_pacientih_po_miokardnem_infarktu Heartecho: presejalni test za raka pri pacientih po miokardnem infarktu] (Zarja Doberšek)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v torek torej najkasneje v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored bo razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2023/24]].

Seminarji SB 2024/25

2025-05-14T08:34:22Z

Miljan01:

V študijskem letu 2024/25 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_umetnih_medvrstnih_promotorjev_z_različnimi_transkripcijskimi_močmi Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi] (Miljan Trajković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preprečevanje_nastanka_multimerov_pogosto_uporabljenih_plazmidov_v_sintezni_biologiji Preprečevanje nastanka multimerov pogosto uporabljenih plazmidov v sintezni biologiji] (Lev Jošt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_Nicotiane_benthamiane_za_proizvodnjo_krisoeriola_z_uporabo_tehnik_sintezne_biologije Priprava ''Nicotiane benthamiane'' za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije] (Nika Frelih)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gensko_spremenjeni_receptorji_za_komunikacijo_med_celicami_preko_topnih_signalov_in_zaznavanje_bolezni Gensko spremenjeni receptorji za komunikacijo med celicami preko topnih signalov in zaznavanje bolezni] (Zara Bunc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nadzor_nad_izražanjem_heterolognih_genov_pri_Bdellovibrio_bacteriovorus_z_uporabo_sintezne_biologije Nadzor nad izražanjem heterolognih genov pri Bdellovibrio bacteriovorus z uporabo sintezne biologije] (Živa Flego)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_konzorcija_kvasovk_za_de_novo_biosintezo_rastlinskih_lignanov Uporaba konzorcija kvasovk za de novo biosintezo rastlinskih lignanov] (Urša Lah)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sonogenetsko_nadzorovane_gensko_spremenjene_celice_za_zdravljenje_raka_v_mišjih_tumorskih_modelih Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih] (Pia Mencin)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Združitev_difuzijskega_modela_in_transformerja_za_sintezo_izboljšanih_promotorjev_ter_napoved_moči_sintetičnih_promotorjev_z_uporabo_globokega_učenja Združitev difuzijskega modela in transformerja za sintezo izboljšanih promotorjev ter napoved moči sintetičnih promotorjev z uporabo globokega učenja] (Tinkara Korošec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_dvojno_svetlobo_nadzirani_kokulturni_sistem_omogoča_uravnavanje_sestave_populacije Z dvojno svetlobo nadzirani sistem omogoča uravnavanje sestave populacije] (Ula Mikoš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Načrtovanje_močnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah Načrtovanje močnih inducibilnih sinteznih promotorjev v kvasovkah] (Bor Kunstelj)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolni_inženiring_E._coli_za_izboljšano_produkcijo_diolov_iz_acetata Metabolni inženiring ''E. coli'' za izboljšano produkcijo diolov iz acetata] (Teo Trost)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inkorporacija_fotosintetsko_aktivnih_kloroplastov_iz_alg_v_kultivirane_celice_sesalcev_kot_pot_k_fotosintezi_pri_Živalih Inkorporacija fotosintetsko aktivnih kloroplastov iz alg v kultivirane celice sesalcev kot pot k fotosintezi pri živalih] (Peter Gričar Vintar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izgradnja_metabolične_poti_za_biosintezo_treonina_iz_etilen_glikola Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola] (Tinkara Butara)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezava_sintezne_in_sistemske_biologije_za_in_vivo_encimatiko Povezava sintezne in sistemske biologije za ''in vivo'' encimatiko] (Gaja Starc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nanotelo_proti_Pdc1p_kot_gensko_kodiran_inhibitor_proizvodnje_etanola_omogoča_dvojni_transkripcijski_in_posttranslacijski_nadzor_fermentacije_v_kvasovkah Nanotelo proti Pdc1p kot gensko kodiran inhibitor proizvodnje etanola omogoča dvojni transkripcijski in posttranslacijski nadzor fermentacije v kvasovkah] (Lara Zupanc)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/S_fazno_separacijo_posredovano_sestavljanje_ve%C4%8Dencimskih_kompleksov_in_vivo S fazno separacijo posredovano sestavljanje večencimskih kompleksov ''in vivo''] (Lana Kores)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynPlode SynPlode] (Leila Bohorč)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETal:_izdelovanje_eteričnega_olja_sandalovine_iz_PET_plastike PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike] (Lara Krampač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET_TWINS:_Praktična_uporaba_PETaze_za_učinkovitejše_recikliranje_plastike PET TWINS: Praktična uporaba PETaze za učinkovitejše recikliranje plastike] (Tina Urh)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAU-China:_Nodulska_tovarna_DHA_in_EPA CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA] (Luka Fink)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/nuCloud:_Nov_oblak_za_shranjevanje_podatkov_na_osnovi_nukleotidov nuCloud: Nov oblak za shranjevanje podatkov na osnovi nukleotidov] (Aleš Poljanšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_metoda_diagnosticiranja_multiple_skleroze_-_miRADAR Nova metoda diagnosticiranja multiple skleroze - miRADAR] (Petja Premrl)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biostimulant_za_rast_rastlin_na_Luni_–_BioMoon Biostimulant za rast rastlin na Luni – BioMoon] (Žan Žnidar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CAPTURE:_Boj_proti_oku%C5%BEbam_s_Pseudomonas_aeruginosa_z_nosilci_protimikrobnih_peptidov&action=edit&redlink=1 Boj proti okužbam s Pseudomonas aeruginosa z nosilci protimikrobnih peptidov - CAPTURE] (Metka Rus)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/REPARO REPARO] (Lina Kopač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Tarakate Tarakate] (Pia Špehar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Heartecho:_presejalni_test_za_raka_pri_pacientih_po_miokardnem_infarktu Heartecho: presejalni test za raka pri pacientih po miokardnem infarktu] (Zarja Doberšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_inženiring_funkcionalnih_siRNA Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA] (Nataša Vujović)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v torek torej najkasneje v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored bo razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2023/24]].

2025-BNT-seminar

2025-04-23T10:53:37Z

Miljan01: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija 2025- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
V [https://docs.google.com/spreadsheets/d/1u8aRSyUh7iXiaHHJ-8fWkssvA8c9ajAK5c7oKgUWJOE/edit?usp=sharing tabelo] prosim vpišite temo vašega projekta.

{| class="wikitable"
! datum predstavitve !! predstavlja !! recenzent 1 !! recenzent 2
|-
| 19/03/25 || Kučuk, Suzana || Bunc, Zara || Kastelic, Ana
|-
| 19/03/25 || Trost, Teo || Kores, Lana || Gričar Vintar, Peter
|-
| 19/03/25 || Urh, Tina || Butara, Tinkara || Kopač, Lina
|-
| 19/03/25 || Krampač, Lara || Fink, Luka || Flego, Živa
|-
| 26/03/25 || Kunstelj, Bor || Kučuk, Suzana || Bunc, Zara
|-
| 26/03/25 || Zupanc, Lara || Trost, Teo || Kores, Lana
|-
| 26/03/25 || Poljanšek, Aleš || Weingerl, Zarja || Butara, Tinkara
|-
| 26/03/25 || Doberšek, Zarja || Krampač, Lara || Fink, Luka
|-
| 02/04/25 || Bohte, Janja || Kunstelj, Bor || Kučuk, Suzana
|-
| 02/04/25 || Špehar, Pia || Zupanc, Lara || Trost, Teo
|-
| 02/04/25 || Jošt, Lev || Poljanšek, Aleš || Weingerl, Zarja
|-
| 02/04/25 || Karčovnik, Maša || Doberšek, Zarja || Krampač, Lara
|-
| 09/04/25 || Rus, Metka || Bohte, Janja || Kunstelj, Bor
|-
| 09/04/25 || Stupar, Teo || Špehar, Pia || Zupanc, Lara
|-
| 09/04/25 || Trošt, Pia || Jošt, Lev || Poljanšek, Aleš
|-
| 09/04/25 || Brunec, Bine || Karčovnik, Maša || Doberšek, Zarja
|-
| 16/04/25 || Vujović, Nataša || Rus, Metka || Bohte, Janja
|-
| 16/04/25 || Bohorč, Leila || Stupar, Teo || Špehar, Pia
|-
| 16/04/25 || Kobal, Mia || Trošt, Pia || Jošt, Lev
|-
| 16/04/25 || Mencin, Pia || Brunec, Bine || Karčovnik, Maša
|-
| 23/04/25 || Starc, Gaja || Vujović, Nataša || Rus, Metka
|-
| 23/04/25 || Mikoš, Ula || Kobal, Mia || Trošt, Pia
|-
| 23/04/25 || Trajković, Miljan || Mencin, Pia || Brunec, Bine
|-
| 07/05/25 || Lah, Urša || Starc, Gaja || Vujović, Nataša
|-
| 07/05/25 || Frelih, Nika || Štromberger, Erik || Bohorč, Leila
|-
| 07/05/25 || Kastelic, Gal || Mikoš, Ula || Kobal, Mia
|-
| 07/05/25 || Kores, Lana || Gričar Vintar, Peter || Premrl, Petja
|-
| 14/05/25 || Korošec, Tinkara || Lah, Urša || Starc, Gaja
|-
| 14/05/25 || Weingerl, Zarja || Frelih, Nika || Štromberger, Erik
|-
| 14/05/25 || Kastelic, Ana || Kastelic, Gal || Mikoš, Ula
|-
| 14/05/25 || Gričar Vintar, Peter || Premrl, Petja || Trajković, Miljan
|-
| 21/05/25 || Kopač, Lina || Korošec, Tinkara || Lah, Urša
|-
| 21/05/25 || Flego, Živa || Urh, Tina || Frelih, Nika
|-
| 21/05/25 || Bunc, Zara || Kastelic, Ana || Kastelic, Gal
|-
| 21/05/25 || Premrl, Petja || Trajković, Miljan || Mencin, Pia
|-
| 28/05/25 || Butara, Tinkara || Kopač, Lina || Korošec, Tinkara
|-
| 28/05/25 || Fink, Luka || Flego, Živa || Urh, Tina
|-
| 28/05/25 || Štromberger, Erik || Bohorč, Leila || Stupar, Teo
|-
| 04/06/25 || kratke predstavitve || ||
|}

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte '''dva dni pred predstavitvijo,''' kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Predstavitev naj bo dolga 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 25_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 25_nano_Craik_Venter.doc
* 25_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 25_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

2025-BNT-seminar

2025-04-23T10:52:26Z

Miljan01: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija 2025- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
V [https://docs.google.com/spreadsheets/d/1u8aRSyUh7iXiaHHJ-8fWkssvA8c9ajAK5c7oKgUWJOE/edit?usp=sharing tabelo] prosim vpišite temo vašega projekta.

{| class="wikitable"
! datum predstavitve !! predstavlja !! recenzent 1 !! recenzent 2
|-
| 19/03/25 || Kučuk, Suzana || Bunc, Zara || Kastelic, Ana
|-
| 19/03/25 || Trost, Teo || Kores, Lana || Gričar Vintar, Peter
|-
| 19/03/25 || Urh, Tina || Butara, Tinkara || Kopač, Lina
|-
| 19/03/25 || Krampač, Lara || Fink, Luka || Flego, Živa
|-
| 26/03/25 || Kunstelj, Bor || Kučuk, Suzana || Bunc, Zara
|-
| 26/03/25 || Zupanc, Lara || Trost, Teo || Kores, Lana
|-
| 26/03/25 || Poljanšek, Aleš || Weingerl, Zarja || Butara, Tinkara
|-
| 26/03/25 || Doberšek, Zarja || Krampač, Lara || Fink, Luka
|-
| 02/04/25 || Bohte, Janja || Kunstelj, Bor || Kučuk, Suzana
|-
| 02/04/25 || Špehar, Pia || Zupanc, Lara || Trost, Teo
|-
| 02/04/25 || Jošt, Lev || Poljanšek, Aleš || Weingerl, Zarja
|-
| 02/04/25 || Karčovnik, Maša || Doberšek, Zarja || Krampač, Lara
|-
| 09/04/25 || Rus, Metka || Bohte, Janja || Kunstelj, Bor
|-
| 09/04/25 || Stupar, Teo || Špehar, Pia || Zupanc, Lara
|-
| 09/04/25 || Trošt, Pia || Jošt, Lev || Poljanšek, Aleš
|-
| 09/04/25 || Brunec, Bine || Karčovnik, Maša || Doberšek, Zarja
|-
| 16/04/25 || Vujović, Nataša || Rus, Metka || Bohte, Janja
|-
| 16/04/25 || Bohorč, Leila || Stupar, Teo || Špehar, Pia
|-
| 16/04/25 || Kobal, Mia || Trošt, Pia || Jošt, Lev
|-
| 16/04/25 || Mencin, Pia || Brunec, Bine || Karčovnik, Maša
|-
| 23/04/25 || Starc, Gaja || Vujović, Nataša || Rus, Metka
|-
| 23/04/25 || Mikoš, Ula || Kobal, Mia || Trošt, Pia
|-
| 23/04/25 || Trajković, Miljan || Mencin, Pia || Brunec, Bine
|-
| 07/05/25 || Lah, Urša || Starc, Gaja || Vujović, Nataša
|-
| 07/05/25 || Frelih, Nika || Štromberger, Erik || Bohorč, Leila
|-
| 07/05/25 || Kastelic, Gal || Mikoš, Ula || Kobal, Mia
|-
| 07/05/25 || Kores, Lana || Gričar Vintar, Peter || Premrl, Petja
|-
| 14/05/25 || Korošec, Tinkara || Lah, Urša || Starc, Gaja
|-
| 14/05/25 || Weingerl, Zarja || Frelih, Nika || Štromberger, Erik
|-
| 14/05/25 || Kastelic, Ana || Kastelic, Gal || Mikoš, Ula
|-
| 14/05/25 || Gričar Vintar, Peter || Premrl, Petja || Trajković, Miljan
|-
| 21/05/25 || Kopač, Lina || Korošec, Tinkara || Lah, Urša
|-
| 21/05/25 || Flego, Živa || Urh, Tina || Frelih, Nika
|-
| 21/05/25 || Bunc, Zara || Kastelic, Ana || Kastelic, Gal
|-
| 21/05/25 || Premrl, Petja || Trajković, Miljan || Mencin, Pia
|-
| 28/05/25 || Butara, Tinkara || Kopač, Lina || Korošec, Tinkara
|-
| 28/05/25 || Fink, Luka || Flego, Živa || Urh, Tina
|-
| 23/04/25 || Štromberger, Erik || Bohorč, Leila || Stupar, Teo
|-
| 04/06/25 || kratke predstavitve || ||
|}

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte '''dva dni pred predstavitvijo,''' kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Predstavitev naj bo dolga 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 25_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 25_nano_Craik_Venter.doc
* 25_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 25_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

2025-BNT-seminar

2025-04-23T10:51:46Z

Miljan01: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija 2025- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
V [https://docs.google.com/spreadsheets/d/1u8aRSyUh7iXiaHHJ-8fWkssvA8c9ajAK5c7oKgUWJOE/edit?usp=sharing tabelo] prosim vpišite temo vašega projekta.

{| class="wikitable"
! datum predstavitve !! predstavlja !! recenzent 1 !! recenzent 2
|-
| 19/03/25 || Kučuk, Suzana || Bunc, Zara || Kastelic, Ana
|-
| 19/03/25 || Trost, Teo || Kores, Lana || Gričar Vintar, Peter
|-
| 19/03/25 || Urh, Tina || Butara, Tinkara || Kopač, Lina
|-
| 19/03/25 || Krampač, Lara || Fink, Luka || Flego, Živa
|-
| 26/03/25 || Kunstelj, Bor || Kučuk, Suzana || Bunc, Zara
|-
| 26/03/25 || Zupanc, Lara || Trost, Teo || Kores, Lana
|-
| 26/03/25 || Poljanšek, Aleš || Weingerl, Zarja || Butara, Tinkara
|-
| 26/03/25 || Doberšek, Zarja || Krampač, Lara || Fink, Luka
|-
| 02/04/25 || Bohte, Janja || Kunstelj, Bor || Kučuk, Suzana
|-
| 02/04/25 || Špehar, Pia || Zupanc, Lara || Trost, Teo
|-
| 02/04/25 || Jošt, Lev || Poljanšek, Aleš || Weingerl, Zarja
|-
| 02/04/25 || Karčovnik, Maša || Doberšek, Zarja || Krampač, Lara
|-
| 09/04/25 || Rus, Metka || Bohte, Janja || Kunstelj, Bor
|-
| 09/04/25 || Stupar, Teo || Špehar, Pia || Zupanc, Lara
|-
| 09/04/25 || Trošt, Pia || Jošt, Lev || Poljanšek, Aleš
|-
| 09/04/25 || Brunec, Bine || Karčovnik, Maša || Doberšek, Zarja
|-
| 16/04/25 || Vujović, Nataša || Rus, Metka || Bohte, Janja
|-
| 16/04/25 || Bohorč, Leila || Stupar, Teo || Špehar, Pia
|-
| 16/04/25 || Kobal, Mia || Trošt, Pia || Jošt, Lev
|-
| 16/04/25 || Mencin, Pia || Brunec, Bine || Karčovnik, Maša
|-
| 23/04/25 || Starc, Gaja || Vujović, Nataša || Rus, Metka

| 23/04/25 || Mikoš, Ula || Kobal, Mia || Trošt, Pia
|-
| 23/04/25 || Trajković, Miljan || Mencin, Pia || Brunec, Bine
|-
| 07/05/25 || Lah, Urša || Starc, Gaja || Vujović, Nataša
|-
| 07/05/25 || Frelih, Nika || Štromberger, Erik || Bohorč, Leila
|-
| 07/05/25 || Kastelic, Gal || Mikoš, Ula || Kobal, Mia
|-
| 07/05/25 || Kores, Lana || Gričar Vintar, Peter || Premrl, Petja
|-
| 14/05/25 || Korošec, Tinkara || Lah, Urša || Starc, Gaja
|-
| 14/05/25 || Weingerl, Zarja || Frelih, Nika || Štromberger, Erik
|-
| 14/05/25 || Kastelic, Ana || Kastelic, Gal || Mikoš, Ula
|-
| 14/05/25 || Gričar Vintar, Peter || Premrl, Petja || Trajković, Miljan
|-
| 21/05/25 || Kopač, Lina || Korošec, Tinkara || Lah, Urša
|-
| 21/05/25 || Flego, Živa || Urh, Tina || Frelih, Nika
|-
| 21/05/25 || Bunc, Zara || Kastelic, Ana || Kastelic, Gal
|-
| 21/05/25 || Premrl, Petja || Trajković, Miljan || Mencin, Pia
|-
| 28/05/25 || Butara, Tinkara || Kopač, Lina || Korošec, Tinkara
|-
| 28/05/25 || Fink, Luka || Flego, Živa || Urh, Tina
|-
| 23/04/25 || Štromberger, Erik || Bohorč, Leila || Stupar, Teo
|-
| 04/06/25 || kratke predstavitve || ||
|}

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte '''dva dni pred predstavitvijo,''' kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Predstavitev naj bo dolga 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 25_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 25_nano_Craik_Venter.doc
* 25_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 25_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T22:56:56Z

Miljan01: /* Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter) [4], ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od mesta začetka transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. UP4 in UP6 sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s skupnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190–300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilisa'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje prepoznavno zaporedje za σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izhodiščnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen pri ''B. subtilisu'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicumu'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF-ja na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS-jev na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS-jev z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS-ja, TDH3 pa pet, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS-jev. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti.

Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS-jev lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS-jev teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti kažejo različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

[4] S. Yang, Q. Liu, Y. Zhang, G. Du, J. Chen, Z. Kang: Construction and Characterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology. ''ACS Synthetic Biology'' '''2018''', ''7'', 287–291.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T21:13:17Z

Miljan01: /* Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter) [4], ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od mesta začetka transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. UP4 in UP6 sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s skupnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190–300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilisa'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje prepoznavno zaporedje za σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izhodiščnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen pri ''B. subtilisu'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicumu'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF-ja na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS-jev na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS-jev z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS-ja, TDH3 pa pet, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS-jev. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS-jev lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS-jev teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti kažejo različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

[4] S. Yang, Q. Liu, Y. Zhang, G. Du, J. Chen, Z. Kang: Construction and Characterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology. ''ACS Synthetic Biology'' '''2018''', ''7'', 287–291.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T20:50:01Z

Miljan01: /* Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter) [4], ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od mesta začetka transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. UP4 in UP6 sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s skupnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190–300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilisa'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izhodiščnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen pri ''B. subtilisu'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicumu'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF-ja na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS-jev na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS-jev z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS-ja, TDH3 pa pet, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS-jev. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS-jev lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS-jev teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti kažejo različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

[4] S. Yang, Q. Liu, Y. Zhang, G. Du, J. Chen, Z. Kang: Construction and Characterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology. ''ACS Synthetic Biology'' '''2018''', ''7'', 287–291.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T20:49:19Z

Miljan01: /* Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter) [4], ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od mesta začetka transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. UP4 in UP6 sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s skupnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190–300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilisa'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvornim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen pri ''B. subtilisu'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicumu'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF-ja na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS-jev na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS-jev z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS-ja, TDH3 pa pet, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS-jev. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS-jev lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS-jev teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti kažejo različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

[4] S. Yang, Q. Liu, Y. Zhang, G. Du, J. Chen, Z. Kang: Construction and Characterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology. ''ACS Synthetic Biology'' '''2018''', ''7'', 287–291.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T19:45:28Z

Miljan01: /* Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v E. coli */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter) [4], ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od mesta začetka transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. UP4 in UP6 sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s skupnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190–300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilisa'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen pri ''B. subtilisu'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicumu'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF-ja na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS-jev na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS-jev z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS-ja, TDH3 pa pet, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS-jev. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS-jev lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS-jev teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti kažejo različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

[4] S. Yang, Q. Liu, Y. Zhang, G. Du, J. Chen, Z. Kang: Construction and Characterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology. ''ACS Synthetic Biology'' '''2018''', ''7'', 287–291.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T19:44:56Z

Miljan01: /* Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v E. coli */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter) [4], ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. UP4 in UP6 sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s skupnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190–300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilisa'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen pri ''B. subtilisu'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicumu'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF-ja na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS-jev na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS-jev z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS-ja, TDH3 pa pet, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS-jev. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS-jev lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS-jev teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti kažejo različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

[4] S. Yang, Q. Liu, Y. Zhang, G. Du, J. Chen, Z. Kang: Construction and Characterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology. ''ACS Synthetic Biology'' '''2018''', ''7'', 287–291.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T19:31:27Z

Miljan01: /* Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v E. coli */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter) [4], ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. UP4 in UP6 sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190–300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilisa'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen pri ''B. subtilisu'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicumu'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF-ja na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS-jev na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS-jev z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS-ja, TDH3 pa pet, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS-jev. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS-jev lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS-jev teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti kažejo različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

[4] S. Yang, Q. Liu, Y. Zhang, G. Du, J. Chen, Z. Kang: Construction and Characterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology. ''ACS Synthetic Biology'' '''2018''', ''7'', 287–291.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T19:31:09Z

Miljan01: /* Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v E. coli */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter) [4], ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. UP4 in UP6 sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilisa'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen pri ''B. subtilisu'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicumu'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF-ja na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS-jev na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS-jev z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS-ja, TDH3 pa pet, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS-jev. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS-jev lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS-jev teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti kažejo različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

[4] S. Yang, Q. Liu, Y. Zhang, G. Du, J. Chen, Z. Kang: Construction and Characterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology. ''ACS Synthetic Biology'' '''2018''', ''7'', 287–291.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T18:55:09Z

Miljan01: /* Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter) [4], ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilisa'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen pri ''B. subtilisu'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicumu'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF-ja na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS-jev na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS-jev z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS-ja, TDH3 pa pet, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS-jev. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS-jev lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS-jev teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti kažejo različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

[4] S. Yang, Q. Liu, Y. Zhang, G. Du, J. Chen, Z. Kang: Construction and Characterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology. ''ACS Synthetic Biology'' '''2018''', ''7'', 287–291.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T18:53:33Z

Miljan01: /* Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter) [4], ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za σ faktorje ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilisa'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen pri ''B. subtilisu'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicumu'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF-ja na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS-jev na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS-jev z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različne TFBS-je, TDH3 pa pet, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS-jev. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS-jev lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS-jev teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti kažejo različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

[4] S. Yang, Q. Liu, Y. Zhang, G. Du, J. Chen, Z. Kang: Construction and Characterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology. ''ACS Synthetic Biology'' '''2018''', ''7'', 287–291.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T18:42:00Z

Miljan01: /* Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter) [4], ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilisa'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen pri ''B. subtilisu'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicumu'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF-ja na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS-jev na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS-jev z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različne TFBS-je, TDH3 pa pet, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS-jev. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS-jev lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS-jev teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti kažejo različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

[4] S. Yang, Q. Liu, Y. Zhang, G. Du, J. Chen, Z. Kang: Construction and Characterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology. ''ACS Synthetic Biology'' '''2018''', ''7'', 287–291.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T18:41:09Z

Miljan01: /* Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter) [4], ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilisa'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen pri ''B. subtilisu'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF-ja na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS-jev na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS-jev z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različne TFBS-je, TDH3 pa pet, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS-jev. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS-jev lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS-jev teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti kažejo različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

[4] S. Yang, Q. Liu, Y. Zhang, G. Du, J. Chen, Z. Kang: Construction and Characterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology. ''ACS Synthetic Biology'' '''2018''', ''7'', 287–291.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T18:40:11Z

Miljan01: /* Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter) [4], ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilisa'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilisu'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF-ja na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS-jev na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS-jev z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različne TFBS-je, TDH3 pa pet, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS-jev. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS-jev lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS-jev teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti kažejo različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

[4] S. Yang, Q. Liu, Y. Zhang, G. Du, J. Chen, Z. Kang: Construction and Characterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology. ''ACS Synthetic Biology'' '''2018''', ''7'', 287–291.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T17:11:36Z

Miljan01: /* Zaključek */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter) [4], ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF-ja na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS-jev na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS-jev z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različne TFBS-je, TDH3 pa pet, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS-jev. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS-jev lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS-jev teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti kažejo različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

[4] S. Yang, Q. Liu, Y. Zhang, G. Du, J. Chen, Z. Kang: Construction and Characterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology. ''ACS Synthetic Biology'' '''2018''', ''7'', 287–291.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T17:03:44Z

Miljan01: /* Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter) [4], ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF-ja na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS-jev na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS-jev z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različne TFBS-je, TDH3 pa pet, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS-jev. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS-jev lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS-jev teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

[4] S. Yang, Q. Liu, Y. Zhang, G. Du, J. Chen, Z. Kang: Construction and Characterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology. ''ACS Synthetic Biology'' '''2018''', ''7'', 287–291.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T17:02:56Z

Miljan01: /* Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter) [4], ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS-jev na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS-jev z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različne TFBS-je, TDH3 pa pet, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS-jev. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS-jev lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS-jev teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

[4] S. Yang, Q. Liu, Y. Zhang, G. Du, J. Chen, Z. Kang: Construction and Characterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology. ''ACS Synthetic Biology'' '''2018''', ''7'', 287–291.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T17:02:11Z

Miljan01: /* Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter) [4], ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS-jev na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS-jev z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različne TFBS-je, TDH3 pa pet, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS-jev. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

[4] S. Yang, Q. Liu, Y. Zhang, G. Du, J. Chen, Z. Kang: Construction and Characterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology. ''ACS Synthetic Biology'' '''2018''', ''7'', 287–291.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T16:59:27Z

Miljan01: /* Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter) [4], ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS, TDH3 pa pet TFBS, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS-jev. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

[4] S. Yang, Q. Liu, Y. Zhang, G. Du, J. Chen, Z. Kang: Construction and Characterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology. ''ACS Synthetic Biology'' '''2018''', ''7'', 287–291.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T16:09:00Z

Miljan01: /* Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter) [4], ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS, TDH3 pa pet TFBS, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in TFBS za TF2, TF4, TF5, TF10 in TF11. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

[4] S. Yang, Q. Liu, Y. Zhang, G. Du, J. Chen, Z. Kang: Construction and Characterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology. ''ACS Synthetic Biology'' '''2018''', ''7'', 287–291.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T16:08:47Z

Miljan01: /* Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter) [4], ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS, TDH3 pa pet TFBS, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in TFBS za TF2, 4, 5, 10 in 11. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

[4] S. Yang, Q. Liu, Y. Zhang, G. Du, J. Chen, Z. Kang: Construction and Characterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology. ''ACS Synthetic Biology'' '''2018''', ''7'', 287–291.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T16:08:36Z

Miljan01: /* Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter) [4], ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS, TDH3 pa pet TFBS, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in TFBS za TF 2, 4, 5, 10 in 11. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

[4] S. Yang, Q. Liu, Y. Zhang, G. Du, J. Chen, Z. Kang: Construction and Characterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology. ''ACS Synthetic Biology'' '''2018''', ''7'', 287–291.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T13:01:41Z

Miljan01: /* Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v E. coli */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter) [4], ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP3 in UP4 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS, TDH3 pa pet TFBS, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS z 2, 4, 5, 10 in 11 vezavnimi mesti za TF. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

[4] S. Yang, Q. Liu, Y. Zhang, G. Du, J. Chen, Z. Kang: Construction and Characterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology. ''ACS Synthetic Biology'' '''2018''', ''7'', 287–291.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T11:54:51Z

Miljan01: /* Literatura */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter) [4], ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP4 in UP6 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS, TDH3 pa pet TFBS, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS z 2, 4, 5, 10 in 11 vezavnimi mesti za TF. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

[4] S. Yang, Q. Liu, Y. Zhang, G. Du, J. Chen, Z. Kang: Construction and Characterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology. ''ACS Synthetic Biology'' '''2018''', ''7'', 287–291.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T11:53:28Z

Miljan01: /* Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter) [4], ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP4 in UP6 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS, TDH3 pa pet TFBS, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS z 2, 4, 5, 10 in 11 vezavnimi mesti za TF. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

Seminarji SB 2024/25

2025-04-14T00:34:02Z

Miljan01:

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T00:24:28Z

Miljan01: /* Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter), ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP4 in UP6 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS, TDH3 pa pet TFBS, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS z 2, 4, 5, 10 in 11 vezavnimi mesti za TF. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-14T00:23:32Z

Miljan01: /* Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v E. coli */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter), ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP4 in UP6 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so 30 mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; 3 variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS, TDH3 pa pet TFBS, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS z 2, 4, 5, 10 in 11 vezavnimi mesti za TF. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-13T18:45:01Z

Miljan01: /* Literatura */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter), ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP4 in UP6 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so trideset mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; tri variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS, TDH3 pa pet TFBS, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS z 2, 4, 5, 10 in 11 vezavnimi mesti za TF. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', ''31'', 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', ''10'', 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', ''12''.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-13T18:43:59Z

Miljan01: /* Literatura */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter), ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP4 in UP6 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so trideset mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; tri variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS, TDH3 pa pet TFBS, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS z 2, 4, 5, 10 in 11 vezavnimi mesti za TF. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', 31, 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', 10, 49–57.

[3] R. K. Umarov, V. V. Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. ''PLoS One'' '''2017''', 12.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-13T18:39:55Z

Miljan01: /* Literatura */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter), ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP4 in UP6 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so trideset mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; tri variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS, TDH3 pa pet TFBS, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS z 2, 4, 5, 10 in 11 vezavnimi mesti za TF. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''Journal of Microbiology and Biotechnology'' '''2021''', 31, 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', 10, 49–57.

[3] R. Kh Umarov, V. V Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. '''2017'''.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-13T18:38:18Z

Miljan01: /* Literatura */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter), ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP4 in UP6 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so trideset mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; tri variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS, TDH3 pa pet TFBS, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS z 2, 4, 5, 10 in 11 vezavnimi mesti za TF. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''J. Microbiol. Biotechnol.'' '''2021''', 31, 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synthetic and Systems Biotechnology'' '''2025''', 10, 49–57.

[3] R. Kh Umarov, V. V Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. '''2017'''.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-13T18:37:14Z

Miljan01: /* Literatura */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter), ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP4 in UP6 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so trideset mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; tri variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS, TDH3 pa pet TFBS, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS z 2, 4, 5, 10 in 11 vezavnimi mesti za TF. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. ''J. Microbiol. Biotechnol.'' '''2021''', 31, 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. ''Synth. Syst. Biotechnol.'' '''2025''', 10, 49–57.

[3] R. Kh Umarov, V. V Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. '''2017'''.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-13T18:36:13Z

Miljan01: /* Zaključek */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter), ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP4 in UP6 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so trideset mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; tri variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS, TDH3 pa pet TFBS, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS z 2, 4, 5, 10 in 11 vezavnimi mesti za TF. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. J. Microbiol. Biotechnol. '''2021''', 31, 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. Synth. Syst. Biotechnol. '''2025''', 10, 49–57.

[3] R. Kh Umarov, V. V Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. '''2017'''.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-13T18:36:06Z

Miljan01: /* Zaključek */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter), ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP4 in UP6 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so trideset mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; tri variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS, TDH3 pa pet TFBS, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS z 2, 4, 5, 10 in 11 vezavnimi mesti za TF. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. J. Microbiol. Biotechnol. '''2021''', 31, 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. Synth. Syst. Biotechnol. '''2025''', 10, 49–57.

[3] R. Kh Umarov, V. V Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. '''2017'''.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-13T18:34:29Z

Miljan01: /* Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter), ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP4 in UP6 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so trideset mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; tri variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS, TDH3 pa pet TFBS, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS z 2, 4, 5, 10 in 11 vezavnimi mesti za TF. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3'-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti. Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. J. Microbiol. Biotechnol. '''2021''', 31, 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. Synth. Syst. Biotechnol. '''2025''', 10, 49–57.

[3] R. Kh Umarov, V. V Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. '''2017'''.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-13T18:28:52Z

Miljan01: /* Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter), ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP4 in UP6 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so trideset mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; tri variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS, TDH3 pa pet TFBS, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS z 2, 4, 5, 10 in 11 vezavnimi mesti za TF. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3′-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti.
Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. J. Microbiol. Biotechnol. '''2021''', 31, 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. Synth. Syst. Biotechnol. '''2025''', 10, 49–57.

[3] R. Kh Umarov, V. V Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. '''2017'''.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-13T18:28:30Z

Miljan01: /* Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter), ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP4 in UP6 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so trideset mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; tri variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije. Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS, TDH3 pa pet TFBS, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS z 2, 4, 5, 10 in 11 vezavnimi mesti za TF. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3′-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti.
Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. J. Microbiol. Biotechnol. '''2021''', 31, 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. Synth. Syst. Biotechnol. '''2025''', 10, 49–57.

[3] R. Kh Umarov, V. V Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. '''2017'''.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-13T18:28:18Z

Miljan01: /* Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter), ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP4 in UP6 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so trideset mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; tri variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].
Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS, TDH3 pa pet TFBS, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS z 2, 4, 5, 10 in 11 vezavnimi mesti za TF. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3′-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti.
Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. J. Microbiol. Biotechnol. '''2021''', 31, 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. Synth. Syst. Biotechnol. '''2025''', 10, 49–57.

[3] R. Kh Umarov, V. V Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. '''2017'''.

Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi

2025-04-13T18:28:08Z

Miljan01: /* Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39224149/ Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths]

== Uvod ==

Mikroorganizmi igrajo pomembno vlogo v metaboličnem inženirstvu, kjer so zaradi različnih metaboličnih poti ključni pri proizvodnji biogoriv, encimov, zdravil in farmacevtskih izdelkov. K njihovi uporabnosti prispeva možnost vnašanja oz. prilagajanja genskih elementov, vendar pa pri prenosu le-teh med različnimi vrstami, pogosto pride do težav, saj je njihovo delovanje odvisno od interakcij z gostiteljem [1]. Natančno kontrolo izražanja proteinov lahko dosežemo s spreminjanjem jakosti promotorjev, kar omogoča regulacijo transkripcije. Promotorji predstavljajo glavne regulatorne elemente v sintezni biologiji, ker nadzorujejo izražanje genov in biokemijskih procesov [2].

Sodobni pristopi v sintezni biologiji vključujejo uporabo številnih bioinformatskih orodij, umetne inteligence (npr. globokega učenja) in eksperimentalnih metod za inženiring novih promotorjev. Takšen pristop, ki se osredotoča na razvoj in optimizacijo promotorskih elementov, tako v prokariontskih kot evkariontskih sistemih, omogoča izdelavo promotorjev z različno transkripcijsko močjo. Kljub napredku v razvoju novih promotorjev za posamezne vrste manjkajo univerzalni promotorji, ki bi delovali v različnih vrstah [3].

== Razvoj in optimizacija prokariontskih in evkariontskih promotorskih elementov ==

Cilj te študije je bil razviti izboljšane različice promotorja Pbs (''angl.'' broad-spectrum promoter), ki izkazujejo visoko transkripcijsko aktivnost v petih vrstah mikroorganizmov. Nove promotorje so znanstveniki ustvarili z združevanjem ključnih elementov prokariontskih (σ faktorji, UP elementi) in evkariontskih (UAS) promotorjev. Za ta namen so uporabili tri bakterijske (''E. coli'' JM109, ''B. subtilis'' 168, ''C. glutamicum'' ATCC 13032) in dve vrsti kvasovk (''S. cerevisiae'' CEN.PK2-1C, ''P. pastoris'' GS115); celice so gojili v ustreznih gojiščih: LB za ''E. coli'' in ''B. subtilis'', BHI za ''C. glutamicum'' ter YPD za ''S. cerevisiae'' in ''P. pastoris'' [2].

=== Ustvarjanje UP elementov za izboljšanje aktivnosti promotorja Pbs v ''E. coli'' ===

UP element predstavlja zaporedje DNA, ki je locirano med -45 in -60 baznih parov navzgor od začetnega mesta transkripcije, na katerega se veže karboksilni konec α-podenote RNA-polimeraze. Ta vezava olajša prepoznavo promotorja s strani encima in poveča njegovo transkripcijsko aktivnost. Šest različnih zaporedij UP (UP1-6) so vstavili pred zapisom za promotor Pbs z namenom izboljšanja njegove moči. UP1, UP5 in UP6 izhajajo iz ''E. coli'', in sicer genov ''rrnD'', ''rybB'' in ''rpoE'', UP2 je skupno zaporedje, medtem ko sta UP4 in UP6 umetno sintetizirana. Slednja sta pokazala največjo učinkovitost, saj se je z njunim vključevanjem aktivnost Pbs povečala za 40 % oz. 60 %. Na osnovi UP4 in UP6 so pripravili knjižnico s splošnim zaporedjem 5′-NNANATGANGATCAAAAANANANNCNNNNN-3’ in knjižnico mutantov za pretočno citometrijo. Opredelili so trideset mutiranih UP zaporedij z aktivnostjo med 190-300 % glede na izhodiščni promotor; tri variante, ki so se izkazale kot najbolj učinkovite – UP-G1, UP-G2 in UP-G3 pa so uporabili za ustvarjanje medvrstnih promotorjev. Transkripcijsko aktivnost so določili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence (razmerje med intenziteto fluorescence GFP in OD600, tj. F/OD600) [2].

=== Nadgradnja promotorja Pbs z vključitvijo vezavnih mest za faktor σ ===

σ faktorji so proteini, s pomočjo katerih RNA-polimeraza prepozna specifična promotorska zaporedja, kar privede do iniciacije transkripcije. Čeprav se razlikujejo med bakterijami, so prepoznavna zaporedja, na katera se vežejo, do določene mere podobna oz. ohranjena. Da bi razširili funkcionalnost Pbs na več vrst, so s PCR vključili prepoznavno zaporedje za σ54 iz ''E. coli'', ki pripada ločeni družini σ faktorjev, ter prepoznavni zaporedji za σB in σD iz ''B. subtilis'', ker se lepo poravnata z zaporedjem izvornega Pbs [2].

Najprej so vstavili prepoznavno zaporedje za σ54, ki vključuje regiji -24 in -12 ter vmesno zaporedje med njima, navzgor od UAS1. Nato so mutirali izvorno TATA škatlo in regijo N30 promotorja Pbs, s čimer so vključili prepoznavna mesta za σB in σD. Na ta način so ustvarili novi promotor, ki so ga poimenovali Pst. Strukturna ureditev le-tega tako združuje σ54 v zgornjem delu, element UAS1 v sredini, ki ji sledi regija, bogata z adenini in timini, ter mutirano TATA-N30 regijo z vezavnim mestom za σB oz. σD. Novi promotor je pokazal izjemno povečano transkripcijsko moč v primerjavi z izvirnim Pbs. Z merjenjem relativne intenzitete fluorescence so pokazali, da se je ta močno povečala, pri čemer je najvišji porast opažen v ''B. subtilis'', in sicer 300 %. Pri ''C. glutamicum'' je, kljub odsotnosti endogenih prepoznavnih zaporedij za σ faktorje, prav tako prišlo do povečanega izražanja GFP, natančneje za 60 % [2].

=== Načrtovanje zgornjega aktivacijskega zaporedja (UAS) za inženiring evkariontskih elementov promotorja Pbs ===

Iniciacija transkripcije je pri evkariontih odvisna od interakcij med RNA-polimerazo, promotorskim zaporedjem in številnimi transkripcijskimi faktorji (TF). Osnovno raven transkripcije določa promotorsko zaporedje, medtem ko vezava TF na UAS omogoča natančno regulacijo. UAS torej izboljša prepoznavo promotorja s strani RNA-polimeraze, kar posledično vpliva na učinkovitost transkripcije [2].

Najprej so analizirali medvrstno aktivnost klasičnih evkariontskih konstitutivnih promotorjev. Preizkušeni promotorji so bili GAP, GCW14 in AOX1 iz ''P. pastoris'' ter promotor TDH3, ki izvira iz ''S. cerevisiae''. Ugotovili so, da je učinkovitost promotorja močno pogojena z vrsto. Ti so namreč bistveno bolj aktivni v celicah izvorne vrste kot v tujih gostiteljih – promotor TDH3 je v ''S. cerevisiae'' dosegel 8-krat višjo aktivnost kot v ''P. pastoris'', hkrati pa je GAP, endogeni promotor ''P. pastoris'', v ''S. cerevisiae'' izgubil približno tretjino aktivnosti. Razlike v aktivnosti so najverjetneje posledica razlik med vezavnimi mesti za transkripcijske faktorje (TFBS). Za iskanje univerzalnih oz. ohranjenih TFBS na naravnih promotorjih so uporabili podatkovno bazo YEASTRACT+, ki omogoča primerjalno genomiko regulacije transkripcije med kvasovkami. Na podlagi analize aktivnosti so izbrali 11 TFBS z optimiziranimi zaporedji. Ti transkripcijski faktorji naj bi bili transkripcijski aktivatorji. Promotor GAP je vseboval štiri različna TFBS, TDH3 pa pet TFBS, medtem ko AOX1 je vseboval le en TFBS, promotor GCW14 pa celo sedem. Za poravnavo in združevanje izbranih zaporedij so uporabili algoritem za določanje najmanjšega skupnega zaporedja, s čimer so ustvarili umetne UAS elemente. Kot rezultat je nastalo 11 različnih kombinacij z dolžinami od 25 do 109 nukleotidov, ki so jih nato vključili pred promotorjem in preverili njihovo aktivnost oz. fluorescenco v kvasovkah. V ''P. pastoris'' so zaporedja UAS2, UAS4 in UAS5 dosegla relativno intenziteto fluorescence nad 800, v ''S. cerevisiae'' pa sta UAS10 in UAS11 presegla vrednost 1400, kar jih uvršča med tri najbolj učinkovite kombinacije pri obeh kvasovkah [2].

== Inženiring medvrstnih promotorjev z združevanjem prokariontskih in evkariontskih elementov ==

Za ustvarjanje serije medvrstnih promotorjev so združili naslednje komponente: promotorsko ogrodje Pst, elemente UP (UP-G1, UP-G2, UP-G3) in kombinacije TFBS z 2, 4, 5, 10 in 11 vezavnimi mesti za TF. Kot rezultat so dobili 15 možnih kombinacij, od katerih so z validacijo izbrali 8 najučinkovitejših (2S2, 2S3, 4S2, 5S2, 5S3, 10S2, 10S3, 11S3), ki so jim na 3′-konec priključili še RBS. Dobljene medvrstne promotorje, poimenovane Psh1-8, so s pomočjo fluorescenčne mikroskopije ovrednotili glede njihove sposobnosti uravnavanja izražanja GFP v petih mikroorganizmih. V vseh petih vrstah so promotorji bili aktivni, kar so potem še kvantitativno potrdili z merjenjem relativne intenzitete fluorescence. V primerjavi s pogosto uporabljenimi promotorji so opazili, da medvrstni promotorji Psh izkazujejo določeno stopnjo učinkovitosti v različnih vrstah:
* ''E. coli'': medvrstni promotorji lahko dosežejo 10-krat (1000 %) večjo aktivnost kot promotor J23100,
* ''B. subtilis'': 1,8-krat (180 %) aktivnosti promotorja P43,
* ''C. glutamicum'': približno 80 % aktivnosti promotorja Ptrc,
* ''S. cerevisiae'': medvrstni promotor lahko doseže do 50 % aktivnosti promotorja TEF1,
* ''P. pastoris'': aktivnost promotorjev Psh1 in Psh3 je primerljiva s promotorjem GAP, Psh7 pa doseže celo 120 % njegove aktivnosti.
Promotorji Psh3, Psh7 in Psh8 so izkazali zelo visoko aktivnost v obeh vrstah kvasovk, kar kaže na to, da ustrezne razporeditve TFBS lahko povečajo transkripcijsko moč. Z analizo TFBS teh medvrstnih promotorjev so pokazali, da vsebujejo enaka na novo ustvarjena vezavna mesta za transkripcijske faktorje. Stabilno izražanje medvrstnih promotorjev Psh v ''P. pastoris'' so potrdili s 14-dnevno fermentacijo v standardnem gojišču, kjer se je izražanje GFP ohranilo skozi celoten čas [2].

== Zaključek ==

Inženiring promotorjev je bistvenega pomena na področjih sintezne biologije in molekulskega kloniranja. Z načrtovanjem in optimizacijo prokariontskih in evkariontskih elementov je mogoče ustvariti nove promotorje z večjo transkripcijsko močjo, ki se hkrati lahko uporabljajo v različnih vrstah. V študiji so torej na osnovi promotorja Pbs razvili novo različico medvrstnih promotorjev – Psh, ki vključujejo različna prepoznavna mesta za σ faktorje, UP elemente, umetna UAS zaporedja ter optimizirano promotorsko ogrodje. Ti so izkazali različno transkripcijsko moč oz. aktivnost v preiskovanih vrstah, kar je obetavno za nadaljnje raziskave in dejansko izkoriščanje pri izražanju genov, ki ne bi bilo omejeno le na posamezne vrste ali seve. Po drugi strani pa nekatera prizadevanja pri razvoju medvrstnih promotorjev še vedno ovira njihova kompleksna zgradba, zlasti pri višjih evkariontih.

== Literatura ==

[1] C. Y. Wang, L. C. Liu, Y. C. Wu, Y. X. Zhang: Identification and Validation of Four Novel Promoters for Gene Engineering with Broad Suitability across Species. J. Microbiol. Biotechnol. '''2021''', 31, 1154–1162.

[2] W. Zuo, G. Yin, L. Zhang, W. Zhang, R. Xu, Y. Wang, J. Li, Z. Kang: Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths. Synth. Syst. Biotechnol. '''2025''', 10, 49–57.

[3] R. Kh Umarov, V. V Solovyev: Recognition of prokaryotic and eukaryotic promoters using convolutional deep learning neural networks. '''2017'''.