Wiki FKKT - User contributions [en]

Visoko zmogljiv presejalni protokol na osnovi celic za raziskovanje antivirusnih inhibitorjev proti Sars-Cov-2 glavni proteazi (3CLpro)

2021-05-05T15:15:59Z

Mirsad93: /* Uvod */

===Uvod===

COVID-19 je pandemija, ki jo povzroča SARS-CoV-2. Gre za zelo nalezljiv koronavirus, ki po vsem svetu povzroča veliko zdravstveno in gospodarsko breme. Ni posebnih protivirusnih zdravil z dokazano klinično učinkovitostjo za zdravljenje ali preprečevanje okužbe s SARS-CoV-2. Virusne poliproteine predelata dve proteazi: 3C podobna proteaza (3CLpro) in papainu podobna proteaza (PLpro), ki sta dobri tarči za razvoj terapevtskih zdravil. 3CLpro je odgovoren za apoptotični signal, PLpro pa za pomoč koronavirusu pri izogibanju prirojenemu imunskemu odzivu gostitelja. Ciljanje na te encime ima lahko prednosti pri zaviranju replikacije virusov.

===3-Kimotripsinu podobna proteaza (3CLpro)===

Virusna [https://www.nature.com/articles/s41586-020-2223-y/figures/1 3CLpro] cepi virusne poliproteine na 11 mestih. Ta proteaza ima identično zaporedje med koronavirusi in nima človeškega homologa. Asimetrična enota vsebuje samo en polipeptid. Dva izmed polipeptidov (imenovana protomer A in B) se povežeta, da tvorita dimer. Vsak protomer je sestavljen iz treh domen. Domena I (ostanki 8–101) in domena II (ostanki 102–184) imata antiparalelno strukturo β-cevi. Domena III (ostanki 201–303) vsebuje pet α-vijakov, razporejenih v večinoma antiparalelno kroglasto skupino. 3CLpro ima Cys-His katalitično diado in mesto vezave substrata je v razcepu med domeno I in domeno II.

===GFP komplementacija===

GFP vsebuje 11 beta verig (β-verig) in osrednjo α-vijačnico, ki jo lahko razdelimo na tri dele. En del vsebuje devet β-pramenov in osrednjo α-vijačnico (β1–9); drugi del vsebuje 10. β verigo (β10); in tretji del vsebuje 11. β verigo (β11). β1–9 vsebuje tri aminokisline, ki tvorijo kromofor, medtem ko β11 vsebuje visoko konzerviran Glu222, ki katalizira zorenje kromoforja. Ko sta β10 in β11 povezana skupaj ali sta v neposredni bližini, se hitro vežeta na β1–9 in zelena fluorescenca se razvije v nekaj deset minutah. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6486793/figure/F1/?report=objectonly β10–11 je bil preoblikovan tako], da tvori vzporedno strukturo, potem pa ne bi več ustrezal β1–9. Za preklop β11 so uporabili heterodimerizirne tuljave E5 in K5: povezali β10 / β11 z E5; β11 je sledil K5; zaporedje cepitve proteaze je bilo vstavljeno med β11 in K5. Na podlagi te zasnove heterodimer E5 / K5 "preklopi" β11 in preprečuje samosestavljanje razdeljenega GFP. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori antiparalelno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9 in vodi do povečanja fluorescence.

===Oblikovanje presejalnega testa GFP-Split-3CLpro===

Ta tehnologija je bila uporabljena za razvoj in optimizacijo protokola za visoko zmogljivi presejalni test (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 s presejanjem knjižnice majhnih molekul. Poskus je pokazal, da je ta test preprosta in praktična strategija za pregled velikih knjižnic zdravil na zaviralce proteaz.
Načelo preskusa je odvisno od razdelitve GFP na dve enoti (GFP β1–9 in β10-11), kar ima za posledico izgubo njegove fluorescentne kapacitete. β10–11 ima visoko afiniteto za vezavo na β1–9 in hitro razvije zeleno fluorescenco. Tako je test proteaze split-GFP odvisen od preprečevanja sestavljanja enot GFP in sprožitve sklopa GFP pod aktivnostjo proteaze. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori protit vzporedno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9. Vstavitev mesta cepitve 3CLpro med heterodimer E5 / K5 in β11 omogoča, da 3CLpro sprosti β11 in nadaljuje antiparalelno strukturo z β10.
Izdelana je bila ekspresijska kaseta, sestavljena iz dveh plazmidov. Prvi plazmid vsebuje konstrukt GFP, drugi plazmid pa 3CLpro za so-ekspresijo v celicah HEK293. Celice HEK293T smo sočasno transficirali z rekombinantnim plazmidom pcDNA3.1. Za pomnožitev dveh fragmentov GFP, β-verige 1–9 in β-verige 10-11, smo uporabili standardni PCR. Deset aminokislinskih povezovalnih in cepilnih mest aminokislinskih zaporedij 3CLpro in E5 / K5 smo vstavili v konstrukt GFP z uporabo PCR s prekrivanjem in podaljšanjem. Celice, transficirane samo s konstruktom GFP, ne pa tudi 3CLpro, niso pokazale fluorescenčne aktivnosti pet dni po transfekciji. Fluorescenca GFP se je po 48 in 72 urah dramatično povečala.

===Rezultati===

Vrednotenje protokola GFP-split-3CLpro je bilo izvedeno s pregledom lastne knjižnice 50 spojin majhnih molekul. Na podlagi prejšnjih študij je imela večina spojin že potencialno protivirusno proteazno aktivnost. Boceprevir je bil uporabljen kot pozitivna kontrola. Od vseh preizkušenih spojin so derivati kinazolina povzročili rahlo do znatno zmanjšanje intenzivnosti fluorescence GFP. Med derivati kinazolina je spojina QZ4 znatno zmanjšala fluorescenco GFP. Študija molekularnega priklopa je bila opravljena, da bi ponazorila dajanje QZ4 glavni proteazi SARS-CoV-2. QZ4 se na 3CLpro veže s tremi vodikovimi vezmi z Gln 189, Gln 192 in Arg 188.

===Sklep===

Raziskovalci trdijo, da so razvili nov model celičnih linij za presejanje z visoko prepustnostjo (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 na podlagi komplementacije split-GFP. Ta nova metoda bistveno poveča varnost, prepustnost in obnovljivost protivirusnega presejanja, prav tako pomaga skrajšati čas presejanja zdravil. Z uporabo tega testa so ugotovili nove spojine inhibitorja proteaz, pridobljene iz kinazolina, ki jih je treba nadalje raziskati.

===Viri===

1. Rothan, H.A., Teoh, T.C. Cell-Based High-Throughput Screening Protocol for Discovering Antiviral Inhibitors Against SARS-COV-2 Main Protease (3CLpro). Mol Biotechnol 63, 240–248 (2021). https://doi.org/10.1007/s12033-021-00299-7

2. Milech, N., Longville, B., Cunningham, P. et al. GFP-complementation assay to detect functional CPP and protein delivery into living cells. Sci Rep 5, 18329 (2015). https://doi.org/10.1038/srep18329

3. Zhang Q, Schepis A, Huang H, et al. Designing a Green Fluorogenic Protease Reporter by Flipping a Beta Strand of GFP for Imaging Apoptosis in Animals. J Am Chem Soc. 2019;141(11):4526-4530. doi:10.1021/jacs.8b13042

4. Jin, Z., Du, X., Xu, Y. et al. Structure of Mpro from SARS-CoV-2 and discovery of its inhibitors. Nature 582, 289–293 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2223-y

5. Ruan J, Rothan HA, Zhong Y, et al. A small molecule inhibitor of ER-to-cytosol protein dislocation exhibits anti-dengue and anti-Zika virus activity. Sci Rep. 2019;9(1):10901. Published 2019 Jul 29. doi:10.1038/s41598-019-47532-7

MBT seminarji 2021

2021-05-02T20:21:46Z

Mirsad93:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah:

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.) 
# An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.) 

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)

'''Gensko spremenjene živali in celične linije''' 
# Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout "et. al"; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)
# Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse (H. Li ''et. al''; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117(52), 2021; https://doi.org/10.1073/pnas.2003991117). [[Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.]] Matija Ruparčič (8.4.)

'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti''' 
# Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered ''Corynebacterium glutamicum''. (T. Walter ''et. al.''; Microorganisms 8(6), 2020; https://doi.org/10.3390/microorganisms8060866). [[Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum]]. Saša Slabe (14.4.)
# Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from ''Pseudomonas nitroreducens'' Jin1. (Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5). [[Učinkovita biosinteza vanilina iz izoevgenola z uporabo rekombinantne izoevgenol monooksigenaze Jin1 iz bakterije Pseudomonas nitroreducens]]. Luka Gnidovec (15.4.)
# One-pot production of butyl butyrate from glucose using a cognate “diamond-shaped” ''E. coli'' consortium (J. P. Sinumvayo "et. al"; Bioresources and Bioprocessing 8, 2021; https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-021-00372-8#Sec9). [[Proizvodnja butil butirata iz glukoze z uporabo "diamantnega" konzorcija E. coli]] Liza Ulčakar (15.4.)

'''Biotehnološki polimeri''' 
# Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors (S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” ''J. Biotechnol.'', vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001). [[Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi]] Anže Karlek (21.4.)
# Complete biosynthesis of a sulfated chondroitin in ''Escherichia coli'' (Badri, A., ''et al''; Nature communications 12 (2021); https://doi.org/10.1038/s41467-021-21692-5). [[Popolna biosinteza hondroitin sulfata v E. coli]] Ana Maklin (22.4.)
# Optimization of cultivation medium and cyclic fed-batch fermentation strategy for enhanced polyhydroxyalkanoate production by Bacillus thuringiensis using a glucose-rich hydrolyzate (Singh et al. Bioresour. Bioprocess. (2021) 8:11, https://doi.org/10.1186/s40643-021-00361-x) [[Optimizacija fermentacijske proizvodnje PHA-bioplastike z b. thuringiensis in z glukozo bogatimi hidrolizati]] Urban Hribar (22.4.)

'''Biotehnološko pridobljeni encimi''' 
# Urška Fajdiga (5.5.)
# Cell-Based High-Throughput Screening Protocol for Discovering Antiviral Inhibitors Against SARS-COV-2 Main Protease (3CLpro) (Rothan, H.A., Teoh, T.C; Mol Biotechnol 63, 240–248 (2021); https://doi.org/10.1007/s12033-021-00299-7) [[Visoko zmogljiv presejalni protokol na osnovi celic za raziskovanje antivirusnih inhibitorjev proti Sars-Cov-2 glavni proteazi (3CLpro)]] Mirsad Mešić (6.5.)
# A novel cold-active type I pullulanase from a hot-spring metagenome for effective debranching and production of resistant starch (M. Thakur ''et al''.; Bioresource Technology 320, 2021; https://doi.org/10.1016/j.biortech.2020.124288). [[Pri nizkih temperaturah aktivna pululanaza tipa I iz metagenoma vročih vrelcev omogoča učinkovito klestenje in proizvodnjo odpornega škroba]] Martina Lokar (6.5.)

'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji''' 
# Jerneja Nimac (12.5.)
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)
# Klementina Polanec (13.5.)
# Ernestina Lavrih (13.5.)

'''Biomasa in biogoriva''' 
# Željka Erić (19.5.)
# Karin Dobravc Škof (20.5.)
# Katja Doberšek (20.5.)

'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija''' 
# Almina Tahirović (26.5.)
# Eva Keber (27.5.)
# Nina Lukančič (27.5.)

Visoko zmogljiv presejalni protokol na osnovi celic za raziskovanje antivirusnih inhibitorjev proti Sars-Cov-2 glavni proteazi (3CLpro)

2021-05-02T20:11:19Z

Mirsad93: /* GFP komplementacija */

===Uvod===

COVID-19 je pandemija, ki jo povzroča SARS-CoV-2. Gre za zelo nalezljiv koronavirus, ki po vsem svetu povzroča veliko zdravstveno in gospodarsko breme. Ni posebnih protivirusnih zdravil ali cepiv z dokazano klinično učinkovitostjo za zdravljenje ali preprečevanje okužbe s SARS-CoV-2. Virusne poliproteine predelata dve proteazi: 3C podobna proteaza (3CLpro) in papainu podobna proteaza (PLpro), ki sta dobri tarči za razvoj terapevtskih zdravil. 3CLpro je odgovoren za apoptotični signal, PLpro pa za pomoč koronavirusu pri izogibanju prirojenemu imunskemu odzivu gostitelja. Ciljanje na te encime ima lahko prednosti pri zaviranju replikacije virusov.

===3-Kimotripsinu podobna proteaza (3CLpro)===

Virusna [https://www.nature.com/articles/s41586-020-2223-y/figures/1 3CLpro] cepi virusne poliproteine na 11 mestih. Ta proteaza ima identično zaporedje med koronavirusi in nima človeškega homologa. Asimetrična enota vsebuje samo en polipeptid. Dva izmed polipeptidov (imenovana protomer A in B) se povežeta, da tvorita dimer. Vsak protomer je sestavljen iz treh domen. Domena I (ostanki 8–101) in domena II (ostanki 102–184) imata antiparalelno strukturo β-cevi. Domena III (ostanki 201–303) vsebuje pet α-vijakov, razporejenih v večinoma antiparalelno kroglasto skupino. 3CLpro ima Cys-His katalitično diado in mesto vezave substrata je v razcepu med domeno I in domeno II.

===GFP komplementacija===

GFP vsebuje 11 beta verig (β-verig) in osrednjo α-vijačnico, ki jo lahko razdelimo na tri dele. En del vsebuje devet β-pramenov in osrednjo α-vijačnico (β1–9); drugi del vsebuje 10. β verigo (β10); in tretji del vsebuje 11. β verigo (β11). β1–9 vsebuje tri aminokisline, ki tvorijo kromofor, medtem ko β11 vsebuje visoko konzerviran Glu222, ki katalizira zorenje kromoforja. Ko sta β10 in β11 povezana skupaj ali sta v neposredni bližini, se hitro vežeta na β1–9 in zelena fluorescenca se razvije v nekaj deset minutah. [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6486793/figure/F1/?report=objectonly β10–11 je bil preoblikovan tako], da tvori vzporedno strukturo, potem pa ne bi več ustrezal β1–9. Za preklop β11 so uporabili heterodimerizirne tuljave E5 in K5: povezali β10 / β11 z E5; β11 je sledil K5; zaporedje cepitve proteaze je bilo vstavljeno med β11 in K5. Na podlagi te zasnove heterodimer E5 / K5 "preklopi" β11 in preprečuje samosestavljanje razdeljenega GFP. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori antiparalelno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9 in vodi do povečanja fluorescence.

===Oblikovanje presejalnega testa GFP-Split-3CLpro===

Ta tehnologija je bila uporabljena za razvoj in optimizacijo protokola za visoko zmogljivi presejalni test (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 s presejanjem knjižnice majhnih molekul. Poskus je pokazal, da je ta test preprosta in praktična strategija za pregled velikih knjižnic zdravil na zaviralce proteaz.
Načelo preskusa je odvisno od razdelitve GFP na dve enoti (GFP β1–9 in β10-11), kar ima za posledico izgubo njegove fluorescentne kapacitete. β10–11 ima visoko afiniteto za vezavo na β1–9 in hitro razvije zeleno fluorescenco. Tako je test proteaze split-GFP odvisen od preprečevanja sestavljanja enot GFP in sprožitve sklopa GFP pod aktivnostjo proteaze. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori protit vzporedno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9. Vstavitev mesta cepitve 3CLpro med heterodimer E5 / K5 in β11 omogoča, da 3CLpro sprosti β11 in nadaljuje antiparalelno strukturo z β10.
Izdelana je bila ekspresijska kaseta, sestavljena iz dveh plazmidov. Prvi plazmid vsebuje konstrukt GFP, drugi plazmid pa 3CLpro za so-ekspresijo v celicah HEK293. Celice HEK293T smo sočasno transficirali z rekombinantnim plazmidom pcDNA3.1. Za pomnožitev dveh fragmentov GFP, β-verige 1–9 in β-verige 10-11, smo uporabili standardni PCR. Deset aminokislinskih povezovalnih in cepilnih mest aminokislinskih zaporedij 3CLpro in E5 / K5 smo vstavili v konstrukt GFP z uporabo PCR s prekrivanjem in podaljšanjem. Celice, transficirane samo s konstruktom GFP, ne pa tudi 3CLpro, niso pokazale fluorescenčne aktivnosti pet dni po transfekciji. Fluorescenca GFP se je po 48 in 72 urah dramatično povečala.

===Rezultati===

Vrednotenje protokola GFP-split-3CLpro je bilo izvedeno s pregledom lastne knjižnice 50 spojin majhnih molekul. Na podlagi prejšnjih študij je imela večina spojin že potencialno protivirusno proteazno aktivnost. Boceprevir je bil uporabljen kot pozitivna kontrola. Od vseh preizkušenih spojin so derivati kinazolina povzročili rahlo do znatno zmanjšanje intenzivnosti fluorescence GFP. Med derivati kinazolina je spojina QZ4 znatno zmanjšala fluorescenco GFP. Študija molekularnega priklopa je bila opravljena, da bi ponazorila dajanje QZ4 glavni proteazi SARS-CoV-2. QZ4 se na 3CLpro veže s tremi vodikovimi vezmi z Gln 189, Gln 192 in Arg 188.

===Sklep===

Raziskovalci trdijo, da so razvili nov model celičnih linij za presejanje z visoko prepustnostjo (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 na podlagi komplementacije split-GFP. Ta nova metoda bistveno poveča varnost, prepustnost in obnovljivost protivirusnega presejanja, prav tako pomaga skrajšati čas presejanja zdravil. Z uporabo tega testa so ugotovili nove spojine inhibitorja proteaz, pridobljene iz kinazolina, ki jih je treba nadalje raziskati.

===Viri===

1. Rothan, H.A., Teoh, T.C. Cell-Based High-Throughput Screening Protocol for Discovering Antiviral Inhibitors Against SARS-COV-2 Main Protease (3CLpro). Mol Biotechnol 63, 240–248 (2021). https://doi.org/10.1007/s12033-021-00299-7

2. Milech, N., Longville, B., Cunningham, P. et al. GFP-complementation assay to detect functional CPP and protein delivery into living cells. Sci Rep 5, 18329 (2015). https://doi.org/10.1038/srep18329

3. Zhang Q, Schepis A, Huang H, et al. Designing a Green Fluorogenic Protease Reporter by Flipping a Beta Strand of GFP for Imaging Apoptosis in Animals. J Am Chem Soc. 2019;141(11):4526-4530. doi:10.1021/jacs.8b13042

4. Jin, Z., Du, X., Xu, Y. et al. Structure of Mpro from SARS-CoV-2 and discovery of its inhibitors. Nature 582, 289–293 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2223-y

5. Ruan J, Rothan HA, Zhong Y, et al. A small molecule inhibitor of ER-to-cytosol protein dislocation exhibits anti-dengue and anti-Zika virus activity. Sci Rep. 2019;9(1):10901. Published 2019 Jul 29. doi:10.1038/s41598-019-47532-7

Visoko zmogljiv presejalni protokol na osnovi celic za raziskovanje antivirusnih inhibitorjev proti Sars-Cov-2 glavni proteazi (3CLpro)

2021-05-02T20:09:54Z

Mirsad93: /* GFP komplementacija */

===Uvod===

COVID-19 je pandemija, ki jo povzroča SARS-CoV-2. Gre za zelo nalezljiv koronavirus, ki po vsem svetu povzroča veliko zdravstveno in gospodarsko breme. Ni posebnih protivirusnih zdravil ali cepiv z dokazano klinično učinkovitostjo za zdravljenje ali preprečevanje okužbe s SARS-CoV-2. Virusne poliproteine predelata dve proteazi: 3C podobna proteaza (3CLpro) in papainu podobna proteaza (PLpro), ki sta dobri tarči za razvoj terapevtskih zdravil. 3CLpro je odgovoren za apoptotični signal, PLpro pa za pomoč koronavirusu pri izogibanju prirojenemu imunskemu odzivu gostitelja. Ciljanje na te encime ima lahko prednosti pri zaviranju replikacije virusov.

===3-Kimotripsinu podobna proteaza (3CLpro)===

Virusna [https://www.nature.com/articles/s41586-020-2223-y/figures/1 3CLpro] cepi virusne poliproteine na 11 mestih. Ta proteaza ima identično zaporedje med koronavirusi in nima človeškega homologa. Asimetrična enota vsebuje samo en polipeptid. Dva izmed polipeptidov (imenovana protomer A in B) se povežeta, da tvorita dimer. Vsak protomer je sestavljen iz treh domen. Domena I (ostanki 8–101) in domena II (ostanki 102–184) imata antiparalelno strukturo β-cevi. Domena III (ostanki 201–303) vsebuje pet α-vijakov, razporejenih v večinoma antiparalelno kroglasto skupino. 3CLpro ima Cys-His katalitično diado in mesto vezave substrata je v razcepu med domeno I in domeno II.

===GFP komplementacija===

GFP vsebuje 11 beta verig (β-verig) in osrednjo α-vijačnico, ki jo lahko razdelimo na tri dele. En del vsebuje devet β-pramenov in osrednjo α-vijačnico (β1–9); drugi del vsebuje 10. β verigo (β10); in tretji del vsebuje 11. β verigo (β11). β1–9 vsebuje tri aminokisline, ki tvorijo kromofor, medtem ko β11 vsebuje visoko konzerviran Glu222, ki katalizira zorenje kromoforja. Ko sta β10 in β11 povezana skupaj ali sta v neposredni bližini, se hitro vežeta na β1–9 in zelena fluorescenca se razvije v nekaj deset minutah. β10–11 je bil preoblikovan tako, da tvori vzporedno strukturo, potem pa ne bi več ustrezal β1–9. Za preklop β11 so uporabili heterodimerizirne tuljave E5 in K5: povezali β10 / β11 z E5; β11 je sledil K5; zaporedje cepitve proteaze je bilo vstavljeno med β11 in K5. Na podlagi te zasnove heterodimer E5 / K5 "preklopi" β11 in preprečuje samosestavljanje razdeljenega GFP. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori antiparalelno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9 in vodi do povečanja fluorescence.

===Oblikovanje presejalnega testa GFP-Split-3CLpro===

Ta tehnologija je bila uporabljena za razvoj in optimizacijo protokola za visoko zmogljivi presejalni test (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 s presejanjem knjižnice majhnih molekul. Poskus je pokazal, da je ta test preprosta in praktična strategija za pregled velikih knjižnic zdravil na zaviralce proteaz.
Načelo preskusa je odvisno od razdelitve GFP na dve enoti (GFP β1–9 in β10-11), kar ima za posledico izgubo njegove fluorescentne kapacitete. β10–11 ima visoko afiniteto za vezavo na β1–9 in hitro razvije zeleno fluorescenco. Tako je test proteaze split-GFP odvisen od preprečevanja sestavljanja enot GFP in sprožitve sklopa GFP pod aktivnostjo proteaze. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori protit vzporedno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9. Vstavitev mesta cepitve 3CLpro med heterodimer E5 / K5 in β11 omogoča, da 3CLpro sprosti β11 in nadaljuje antiparalelno strukturo z β10.
Izdelana je bila ekspresijska kaseta, sestavljena iz dveh plazmidov. Prvi plazmid vsebuje konstrukt GFP, drugi plazmid pa 3CLpro za so-ekspresijo v celicah HEK293. Celice HEK293T smo sočasno transficirali z rekombinantnim plazmidom pcDNA3.1. Za pomnožitev dveh fragmentov GFP, β-verige 1–9 in β-verige 10-11, smo uporabili standardni PCR. Deset aminokislinskih povezovalnih in cepilnih mest aminokislinskih zaporedij 3CLpro in E5 / K5 smo vstavili v konstrukt GFP z uporabo PCR s prekrivanjem in podaljšanjem. Celice, transficirane samo s konstruktom GFP, ne pa tudi 3CLpro, niso pokazale fluorescenčne aktivnosti pet dni po transfekciji. Fluorescenca GFP se je po 48 in 72 urah dramatično povečala.

===Rezultati===

Vrednotenje protokola GFP-split-3CLpro je bilo izvedeno s pregledom lastne knjižnice 50 spojin majhnih molekul. Na podlagi prejšnjih študij je imela večina spojin že potencialno protivirusno proteazno aktivnost. Boceprevir je bil uporabljen kot pozitivna kontrola. Od vseh preizkušenih spojin so derivati kinazolina povzročili rahlo do znatno zmanjšanje intenzivnosti fluorescence GFP. Med derivati kinazolina je spojina QZ4 znatno zmanjšala fluorescenco GFP. Študija molekularnega priklopa je bila opravljena, da bi ponazorila dajanje QZ4 glavni proteazi SARS-CoV-2. QZ4 se na 3CLpro veže s tremi vodikovimi vezmi z Gln 189, Gln 192 in Arg 188.

===Sklep===

Raziskovalci trdijo, da so razvili nov model celičnih linij za presejanje z visoko prepustnostjo (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 na podlagi komplementacije split-GFP. Ta nova metoda bistveno poveča varnost, prepustnost in obnovljivost protivirusnega presejanja, prav tako pomaga skrajšati čas presejanja zdravil. Z uporabo tega testa so ugotovili nove spojine inhibitorja proteaz, pridobljene iz kinazolina, ki jih je treba nadalje raziskati.

===Viri===

1. Rothan, H.A., Teoh, T.C. Cell-Based High-Throughput Screening Protocol for Discovering Antiviral Inhibitors Against SARS-COV-2 Main Protease (3CLpro). Mol Biotechnol 63, 240–248 (2021). https://doi.org/10.1007/s12033-021-00299-7

2. Milech, N., Longville, B., Cunningham, P. et al. GFP-complementation assay to detect functional CPP and protein delivery into living cells. Sci Rep 5, 18329 (2015). https://doi.org/10.1038/srep18329

3. Zhang Q, Schepis A, Huang H, et al. Designing a Green Fluorogenic Protease Reporter by Flipping a Beta Strand of GFP for Imaging Apoptosis in Animals. J Am Chem Soc. 2019;141(11):4526-4530. doi:10.1021/jacs.8b13042

4. Jin, Z., Du, X., Xu, Y. et al. Structure of Mpro from SARS-CoV-2 and discovery of its inhibitors. Nature 582, 289–293 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2223-y

5. Ruan J, Rothan HA, Zhong Y, et al. A small molecule inhibitor of ER-to-cytosol protein dislocation exhibits anti-dengue and anti-Zika virus activity. Sci Rep. 2019;9(1):10901. Published 2019 Jul 29. doi:10.1038/s41598-019-47532-7

Visoko zmogljiv presejalni protokol na osnovi celic za raziskovanje antivirusnih inhibitorjev proti Sars-Cov-2 glavni proteazi (3CLpro)

2021-05-02T20:06:00Z

Mirsad93: /* 3-Kimotripsinu podobna proteaza (3CLpro) */

===Uvod===

COVID-19 je pandemija, ki jo povzroča SARS-CoV-2. Gre za zelo nalezljiv koronavirus, ki po vsem svetu povzroča veliko zdravstveno in gospodarsko breme. Ni posebnih protivirusnih zdravil ali cepiv z dokazano klinično učinkovitostjo za zdravljenje ali preprečevanje okužbe s SARS-CoV-2. Virusne poliproteine predelata dve proteazi: 3C podobna proteaza (3CLpro) in papainu podobna proteaza (PLpro), ki sta dobri tarči za razvoj terapevtskih zdravil. 3CLpro je odgovoren za apoptotični signal, PLpro pa za pomoč koronavirusu pri izogibanju prirojenemu imunskemu odzivu gostitelja. Ciljanje na te encime ima lahko prednosti pri zaviranju replikacije virusov.

===3-Kimotripsinu podobna proteaza (3CLpro)===

Virusna [https://www.nature.com/articles/s41586-020-2223-y/figures/1 3CLpro] cepi virusne poliproteine na 11 mestih. Ta proteaza ima identično zaporedje med koronavirusi in nima človeškega homologa. Asimetrična enota vsebuje samo en polipeptid. Dva izmed polipeptidov (imenovana protomer A in B) se povežeta, da tvorita dimer. Vsak protomer je sestavljen iz treh domen. Domena I (ostanki 8–101) in domena II (ostanki 102–184) imata antiparalelno strukturo β-cevi. Domena III (ostanki 201–303) vsebuje pet α-vijakov, razporejenih v večinoma antiparalelno kroglasto skupino. 3CLpro ima Cys-His katalitično diado in mesto vezave substrata je v razcepu med domeno I in domeno II.

===GFP komplementacija===

GFP vsebuje 11 beta verig (β-verig) in osrednjo α-vijačnico, ki jo lahko razdelimo na tri dele. En del vsebuje devet β-pramenov in osrednjo α-vijačnico (β1–9); drugi del vsebuje 10. β verigo (β10); in tretji del vsebuje 11. β verigo (β11). β1–9 vsebuje tri aminokisline, ki tvorijo kromofor, medtem ko β11 vsebuje visoko konzerviran Glu222, ki katalizira zorenje kromoforja. Ko sta β10 in β11 povezana skupaj ali sta v neposredni bližini, se hitro vežeta na β1–9 in zelena fluorescenca se razvije v nekaj deset minutah. Β10–11 je bil preoblikovan tako, da tvori vzporedno strukturo, potem pa ne bi več ustrezal β1–9. Za preklop β11 so uporabili heterodimerizirne tuljave E5 in K5: povezali β10 / β11 z E5; β11 je sledil K5; zaporedje cepitve proteaze je bilo vstavljeno med β11 in K5. Na podlagi te zasnove heterodimer E5 / K5 "preklopi" β11 in preprečuje samosestavljanje razdeljenega GFP. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori antiparalelno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9 in vodi do povečanja fluorescence.

===Oblikovanje presejalnega testa GFP-Split-3CLpro===

Ta tehnologija je bila uporabljena za razvoj in optimizacijo protokola za visoko zmogljivi presejalni test (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 s presejanjem knjižnice majhnih molekul. Poskus je pokazal, da je ta test preprosta in praktična strategija za pregled velikih knjižnic zdravil na zaviralce proteaz.
Načelo preskusa je odvisno od razdelitve GFP na dve enoti (GFP β1–9 in β10-11), kar ima za posledico izgubo njegove fluorescentne kapacitete. β10–11 ima visoko afiniteto za vezavo na β1–9 in hitro razvije zeleno fluorescenco. Tako je test proteaze split-GFP odvisen od preprečevanja sestavljanja enot GFP in sprožitve sklopa GFP pod aktivnostjo proteaze. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori protit vzporedno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9. Vstavitev mesta cepitve 3CLpro med heterodimer E5 / K5 in β11 omogoča, da 3CLpro sprosti β11 in nadaljuje antiparalelno strukturo z β10.
Izdelana je bila ekspresijska kaseta, sestavljena iz dveh plazmidov. Prvi plazmid vsebuje konstrukt GFP, drugi plazmid pa 3CLpro za so-ekspresijo v celicah HEK293. Celice HEK293T smo sočasno transficirali z rekombinantnim plazmidom pcDNA3.1. Za pomnožitev dveh fragmentov GFP, β-verige 1–9 in β-verige 10-11, smo uporabili standardni PCR. Deset aminokislinskih povezovalnih in cepilnih mest aminokislinskih zaporedij 3CLpro in E5 / K5 smo vstavili v konstrukt GFP z uporabo PCR s prekrivanjem in podaljšanjem. Celice, transficirane samo s konstruktom GFP, ne pa tudi 3CLpro, niso pokazale fluorescenčne aktivnosti pet dni po transfekciji. Fluorescenca GFP se je po 48 in 72 urah dramatično povečala.

===Rezultati===

Vrednotenje protokola GFP-split-3CLpro je bilo izvedeno s pregledom lastne knjižnice 50 spojin majhnih molekul. Na podlagi prejšnjih študij je imela večina spojin že potencialno protivirusno proteazno aktivnost. Boceprevir je bil uporabljen kot pozitivna kontrola. Od vseh preizkušenih spojin so derivati kinazolina povzročili rahlo do znatno zmanjšanje intenzivnosti fluorescence GFP. Med derivati kinazolina je spojina QZ4 znatno zmanjšala fluorescenco GFP. Študija molekularnega priklopa je bila opravljena, da bi ponazorila dajanje QZ4 glavni proteazi SARS-CoV-2. QZ4 se na 3CLpro veže s tremi vodikovimi vezmi z Gln 189, Gln 192 in Arg 188.

===Sklep===

Raziskovalci trdijo, da so razvili nov model celičnih linij za presejanje z visoko prepustnostjo (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 na podlagi komplementacije split-GFP. Ta nova metoda bistveno poveča varnost, prepustnost in obnovljivost protivirusnega presejanja, prav tako pomaga skrajšati čas presejanja zdravil. Z uporabo tega testa so ugotovili nove spojine inhibitorja proteaz, pridobljene iz kinazolina, ki jih je treba nadalje raziskati.

===Viri===

1. Rothan, H.A., Teoh, T.C. Cell-Based High-Throughput Screening Protocol for Discovering Antiviral Inhibitors Against SARS-COV-2 Main Protease (3CLpro). Mol Biotechnol 63, 240–248 (2021). https://doi.org/10.1007/s12033-021-00299-7

2. Milech, N., Longville, B., Cunningham, P. et al. GFP-complementation assay to detect functional CPP and protein delivery into living cells. Sci Rep 5, 18329 (2015). https://doi.org/10.1038/srep18329

3. Zhang Q, Schepis A, Huang H, et al. Designing a Green Fluorogenic Protease Reporter by Flipping a Beta Strand of GFP for Imaging Apoptosis in Animals. J Am Chem Soc. 2019;141(11):4526-4530. doi:10.1021/jacs.8b13042

4. Jin, Z., Du, X., Xu, Y. et al. Structure of Mpro from SARS-CoV-2 and discovery of its inhibitors. Nature 582, 289–293 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2223-y

5. Ruan J, Rothan HA, Zhong Y, et al. A small molecule inhibitor of ER-to-cytosol protein dislocation exhibits anti-dengue and anti-Zika virus activity. Sci Rep. 2019;9(1):10901. Published 2019 Jul 29. doi:10.1038/s41598-019-47532-7

Visoko zmogljiv presejalni protokol na osnovi celic za raziskovanje antivirusnih inhibitorjev proti Sars-Cov-2 glavni proteazi (3CLpro)

2021-05-02T20:03:57Z

Mirsad93: /* 3-Kimotripsinu podobna proteaza (3CLpro) */

===Uvod===

COVID-19 je pandemija, ki jo povzroča SARS-CoV-2. Gre za zelo nalezljiv koronavirus, ki po vsem svetu povzroča veliko zdravstveno in gospodarsko breme. Ni posebnih protivirusnih zdravil ali cepiv z dokazano klinično učinkovitostjo za zdravljenje ali preprečevanje okužbe s SARS-CoV-2. Virusne poliproteine predelata dve proteazi: 3C podobna proteaza (3CLpro) in papainu podobna proteaza (PLpro), ki sta dobri tarči za razvoj terapevtskih zdravil. 3CLpro je odgovoren za apoptotični signal, PLpro pa za pomoč koronavirusu pri izogibanju prirojenemu imunskemu odzivu gostitelja. Ciljanje na te encime ima lahko prednosti pri zaviranju replikacije virusov.

===3-Kimotripsinu podobna proteaza (3CLpro)===

Virusna 3CLpro cepi virusne poliproteine na 11 mestih. Ta proteaza ima identično zaporedje med koronavirusi in nima človeškega homologa. Asimetrična enota vsebuje samo en polipeptid. Dva izmed polipeptidov (imenovana protomer A in B) se povežeta, da tvorita dimer. Vsak protomer je sestavljen iz treh domen. Domena I (ostanki 8–101) in domena II (ostanki 102–184) imata antiparalelno strukturo β-cevi. Domena III (ostanki 201–303) vsebuje pet α-vijakov, razporejenih v večinoma antiparalelno kroglasto skupino. 3CLpro ima Cys-His katalitično diado in mesto vezave substrata je v razcepu med domeno I in domeno II. Več na [https://www.nature.com/articles/s41586-020-2223-y/figures/1 sliki 1].

===GFP komplementacija===

GFP vsebuje 11 beta verig (β-verig) in osrednjo α-vijačnico, ki jo lahko razdelimo na tri dele. En del vsebuje devet β-pramenov in osrednjo α-vijačnico (β1–9); drugi del vsebuje 10. β verigo (β10); in tretji del vsebuje 11. β verigo (β11). β1–9 vsebuje tri aminokisline, ki tvorijo kromofor, medtem ko β11 vsebuje visoko konzerviran Glu222, ki katalizira zorenje kromoforja. Ko sta β10 in β11 povezana skupaj ali sta v neposredni bližini, se hitro vežeta na β1–9 in zelena fluorescenca se razvije v nekaj deset minutah. Β10–11 je bil preoblikovan tako, da tvori vzporedno strukturo, potem pa ne bi več ustrezal β1–9. Za preklop β11 so uporabili heterodimerizirne tuljave E5 in K5: povezali β10 / β11 z E5; β11 je sledil K5; zaporedje cepitve proteaze je bilo vstavljeno med β11 in K5. Na podlagi te zasnove heterodimer E5 / K5 "preklopi" β11 in preprečuje samosestavljanje razdeljenega GFP. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori antiparalelno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9 in vodi do povečanja fluorescence.

===Oblikovanje presejalnega testa GFP-Split-3CLpro===

Ta tehnologija je bila uporabljena za razvoj in optimizacijo protokola za visoko zmogljivi presejalni test (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 s presejanjem knjižnice majhnih molekul. Poskus je pokazal, da je ta test preprosta in praktična strategija za pregled velikih knjižnic zdravil na zaviralce proteaz.
Načelo preskusa je odvisno od razdelitve GFP na dve enoti (GFP β1–9 in β10-11), kar ima za posledico izgubo njegove fluorescentne kapacitete. β10–11 ima visoko afiniteto za vezavo na β1–9 in hitro razvije zeleno fluorescenco. Tako je test proteaze split-GFP odvisen od preprečevanja sestavljanja enot GFP in sprožitve sklopa GFP pod aktivnostjo proteaze. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori protit vzporedno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9. Vstavitev mesta cepitve 3CLpro med heterodimer E5 / K5 in β11 omogoča, da 3CLpro sprosti β11 in nadaljuje antiparalelno strukturo z β10.
Izdelana je bila ekspresijska kaseta, sestavljena iz dveh plazmidov. Prvi plazmid vsebuje konstrukt GFP, drugi plazmid pa 3CLpro za so-ekspresijo v celicah HEK293. Celice HEK293T smo sočasno transficirali z rekombinantnim plazmidom pcDNA3.1. Za pomnožitev dveh fragmentov GFP, β-verige 1–9 in β-verige 10-11, smo uporabili standardni PCR. Deset aminokislinskih povezovalnih in cepilnih mest aminokislinskih zaporedij 3CLpro in E5 / K5 smo vstavili v konstrukt GFP z uporabo PCR s prekrivanjem in podaljšanjem. Celice, transficirane samo s konstruktom GFP, ne pa tudi 3CLpro, niso pokazale fluorescenčne aktivnosti pet dni po transfekciji. Fluorescenca GFP se je po 48 in 72 urah dramatično povečala.

===Rezultati===

Vrednotenje protokola GFP-split-3CLpro je bilo izvedeno s pregledom lastne knjižnice 50 spojin majhnih molekul. Na podlagi prejšnjih študij je imela večina spojin že potencialno protivirusno proteazno aktivnost. Boceprevir je bil uporabljen kot pozitivna kontrola. Od vseh preizkušenih spojin so derivati kinazolina povzročili rahlo do znatno zmanjšanje intenzivnosti fluorescence GFP. Med derivati kinazolina je spojina QZ4 znatno zmanjšala fluorescenco GFP. Študija molekularnega priklopa je bila opravljena, da bi ponazorila dajanje QZ4 glavni proteazi SARS-CoV-2. QZ4 se na 3CLpro veže s tremi vodikovimi vezmi z Gln 189, Gln 192 in Arg 188.

===Sklep===

Raziskovalci trdijo, da so razvili nov model celičnih linij za presejanje z visoko prepustnostjo (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 na podlagi komplementacije split-GFP. Ta nova metoda bistveno poveča varnost, prepustnost in obnovljivost protivirusnega presejanja, prav tako pomaga skrajšati čas presejanja zdravil. Z uporabo tega testa so ugotovili nove spojine inhibitorja proteaz, pridobljene iz kinazolina, ki jih je treba nadalje raziskati.

===Viri===

1. Rothan, H.A., Teoh, T.C. Cell-Based High-Throughput Screening Protocol for Discovering Antiviral Inhibitors Against SARS-COV-2 Main Protease (3CLpro). Mol Biotechnol 63, 240–248 (2021). https://doi.org/10.1007/s12033-021-00299-7

2. Milech, N., Longville, B., Cunningham, P. et al. GFP-complementation assay to detect functional CPP and protein delivery into living cells. Sci Rep 5, 18329 (2015). https://doi.org/10.1038/srep18329

3. Zhang Q, Schepis A, Huang H, et al. Designing a Green Fluorogenic Protease Reporter by Flipping a Beta Strand of GFP for Imaging Apoptosis in Animals. J Am Chem Soc. 2019;141(11):4526-4530. doi:10.1021/jacs.8b13042

4. Jin, Z., Du, X., Xu, Y. et al. Structure of Mpro from SARS-CoV-2 and discovery of its inhibitors. Nature 582, 289–293 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2223-y

5. Ruan J, Rothan HA, Zhong Y, et al. A small molecule inhibitor of ER-to-cytosol protein dislocation exhibits anti-dengue and anti-Zika virus activity. Sci Rep. 2019;9(1):10901. Published 2019 Jul 29. doi:10.1038/s41598-019-47532-7

Visoko zmogljiv presejalni protokol na osnovi celic za raziskovanje antivirusnih inhibitorjev proti Sars-Cov-2 glavni proteazi (3CLpro)

2021-05-02T20:03:36Z

Mirsad93: /* 3-Kimotripsinu podobna proteaza (3CLpro) */

===Uvod===

COVID-19 je pandemija, ki jo povzroča SARS-CoV-2. Gre za zelo nalezljiv koronavirus, ki po vsem svetu povzroča veliko zdravstveno in gospodarsko breme. Ni posebnih protivirusnih zdravil ali cepiv z dokazano klinično učinkovitostjo za zdravljenje ali preprečevanje okužbe s SARS-CoV-2. Virusne poliproteine predelata dve proteazi: 3C podobna proteaza (3CLpro) in papainu podobna proteaza (PLpro), ki sta dobri tarči za razvoj terapevtskih zdravil. 3CLpro je odgovoren za apoptotični signal, PLpro pa za pomoč koronavirusu pri izogibanju prirojenemu imunskemu odzivu gostitelja. Ciljanje na te encime ima lahko prednosti pri zaviranju replikacije virusov.

===3-Kimotripsinu podobna proteaza (3CLpro)===

Virusna 3CLpro cepi virusne poliproteine na 11 mestih. Ta proteaza ima identično zaporedje med koronavirusi in nima človeškega homologa. Asimetrična enota vsebuje samo en polipeptid. Dva izmed polipeptidov (imenovana protomer A in B) se povežeta, da tvorita dimer. Vsak protomer je sestavljen iz treh domen. Domena I (ostanki 8–101) in domena II (ostanki 102–184) imata antiparalelno strukturo β-cevi. Domena III (ostanki 201–303) vsebuje pet α-vijakov, razporejenih v večinoma antiparalelno kroglasto skupino. 3CLpro ima Cys-His katalitično diado in mesto vezave substrata je v razcepu med domeno I in domeno II. Več [https://www.nature.com/articles/s41586-020-2223-y/figures/1 sliki 1].

===GFP komplementacija===

GFP vsebuje 11 beta verig (β-verig) in osrednjo α-vijačnico, ki jo lahko razdelimo na tri dele. En del vsebuje devet β-pramenov in osrednjo α-vijačnico (β1–9); drugi del vsebuje 10. β verigo (β10); in tretji del vsebuje 11. β verigo (β11). β1–9 vsebuje tri aminokisline, ki tvorijo kromofor, medtem ko β11 vsebuje visoko konzerviran Glu222, ki katalizira zorenje kromoforja. Ko sta β10 in β11 povezana skupaj ali sta v neposredni bližini, se hitro vežeta na β1–9 in zelena fluorescenca se razvije v nekaj deset minutah. Β10–11 je bil preoblikovan tako, da tvori vzporedno strukturo, potem pa ne bi več ustrezal β1–9. Za preklop β11 so uporabili heterodimerizirne tuljave E5 in K5: povezali β10 / β11 z E5; β11 je sledil K5; zaporedje cepitve proteaze je bilo vstavljeno med β11 in K5. Na podlagi te zasnove heterodimer E5 / K5 "preklopi" β11 in preprečuje samosestavljanje razdeljenega GFP. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori antiparalelno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9 in vodi do povečanja fluorescence.

===Oblikovanje presejalnega testa GFP-Split-3CLpro===

Ta tehnologija je bila uporabljena za razvoj in optimizacijo protokola za visoko zmogljivi presejalni test (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 s presejanjem knjižnice majhnih molekul. Poskus je pokazal, da je ta test preprosta in praktična strategija za pregled velikih knjižnic zdravil na zaviralce proteaz.
Načelo preskusa je odvisno od razdelitve GFP na dve enoti (GFP β1–9 in β10-11), kar ima za posledico izgubo njegove fluorescentne kapacitete. β10–11 ima visoko afiniteto za vezavo na β1–9 in hitro razvije zeleno fluorescenco. Tako je test proteaze split-GFP odvisen od preprečevanja sestavljanja enot GFP in sprožitve sklopa GFP pod aktivnostjo proteaze. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori protit vzporedno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9. Vstavitev mesta cepitve 3CLpro med heterodimer E5 / K5 in β11 omogoča, da 3CLpro sprosti β11 in nadaljuje antiparalelno strukturo z β10.
Izdelana je bila ekspresijska kaseta, sestavljena iz dveh plazmidov. Prvi plazmid vsebuje konstrukt GFP, drugi plazmid pa 3CLpro za so-ekspresijo v celicah HEK293. Celice HEK293T smo sočasno transficirali z rekombinantnim plazmidom pcDNA3.1. Za pomnožitev dveh fragmentov GFP, β-verige 1–9 in β-verige 10-11, smo uporabili standardni PCR. Deset aminokislinskih povezovalnih in cepilnih mest aminokislinskih zaporedij 3CLpro in E5 / K5 smo vstavili v konstrukt GFP z uporabo PCR s prekrivanjem in podaljšanjem. Celice, transficirane samo s konstruktom GFP, ne pa tudi 3CLpro, niso pokazale fluorescenčne aktivnosti pet dni po transfekciji. Fluorescenca GFP se je po 48 in 72 urah dramatično povečala.

===Rezultati===

Vrednotenje protokola GFP-split-3CLpro je bilo izvedeno s pregledom lastne knjižnice 50 spojin majhnih molekul. Na podlagi prejšnjih študij je imela večina spojin že potencialno protivirusno proteazno aktivnost. Boceprevir je bil uporabljen kot pozitivna kontrola. Od vseh preizkušenih spojin so derivati kinazolina povzročili rahlo do znatno zmanjšanje intenzivnosti fluorescence GFP. Med derivati kinazolina je spojina QZ4 znatno zmanjšala fluorescenco GFP. Študija molekularnega priklopa je bila opravljena, da bi ponazorila dajanje QZ4 glavni proteazi SARS-CoV-2. QZ4 se na 3CLpro veže s tremi vodikovimi vezmi z Gln 189, Gln 192 in Arg 188.

===Sklep===

Raziskovalci trdijo, da so razvili nov model celičnih linij za presejanje z visoko prepustnostjo (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 na podlagi komplementacije split-GFP. Ta nova metoda bistveno poveča varnost, prepustnost in obnovljivost protivirusnega presejanja, prav tako pomaga skrajšati čas presejanja zdravil. Z uporabo tega testa so ugotovili nove spojine inhibitorja proteaz, pridobljene iz kinazolina, ki jih je treba nadalje raziskati.

===Viri===

1. Rothan, H.A., Teoh, T.C. Cell-Based High-Throughput Screening Protocol for Discovering Antiviral Inhibitors Against SARS-COV-2 Main Protease (3CLpro). Mol Biotechnol 63, 240–248 (2021). https://doi.org/10.1007/s12033-021-00299-7

2. Milech, N., Longville, B., Cunningham, P. et al. GFP-complementation assay to detect functional CPP and protein delivery into living cells. Sci Rep 5, 18329 (2015). https://doi.org/10.1038/srep18329

3. Zhang Q, Schepis A, Huang H, et al. Designing a Green Fluorogenic Protease Reporter by Flipping a Beta Strand of GFP for Imaging Apoptosis in Animals. J Am Chem Soc. 2019;141(11):4526-4530. doi:10.1021/jacs.8b13042

4. Jin, Z., Du, X., Xu, Y. et al. Structure of Mpro from SARS-CoV-2 and discovery of its inhibitors. Nature 582, 289–293 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2223-y

5. Ruan J, Rothan HA, Zhong Y, et al. A small molecule inhibitor of ER-to-cytosol protein dislocation exhibits anti-dengue and anti-Zika virus activity. Sci Rep. 2019;9(1):10901. Published 2019 Jul 29. doi:10.1038/s41598-019-47532-7

Visoko zmogljiv presejalni protokol na osnovi celic za raziskovanje antivirusnih inhibitorjev proti Sars-Cov-2 glavni proteazi (3CLpro)

2021-05-02T19:58:43Z

Mirsad93: /* 3-Kimotripsinu podobna proteaza (3CLpro) */

===Uvod===

COVID-19 je pandemija, ki jo povzroča SARS-CoV-2. Gre za zelo nalezljiv koronavirus, ki po vsem svetu povzroča veliko zdravstveno in gospodarsko breme. Ni posebnih protivirusnih zdravil ali cepiv z dokazano klinično učinkovitostjo za zdravljenje ali preprečevanje okužbe s SARS-CoV-2. Virusne poliproteine predelata dve proteazi: 3C podobna proteaza (3CLpro) in papainu podobna proteaza (PLpro), ki sta dobri tarči za razvoj terapevtskih zdravil. 3CLpro je odgovoren za apoptotični signal, PLpro pa za pomoč koronavirusu pri izogibanju prirojenemu imunskemu odzivu gostitelja. Ciljanje na te encime ima lahko prednosti pri zaviranju replikacije virusov.

===3-Kimotripsinu podobna proteaza (3CLpro)===

Virusna 3CLpro cepi virusne poliproteine na 11 mestih. Ta proteaza ima identično zaporedje med koronavirusi in nima človeškega homologa. Asimetrična enota vsebuje samo en polipeptid. Dva izmed polipeptidov (imenovana protomer A in B) se povežeta, da tvorita dimer. Vsak protomer je sestavljen iz treh domen. Domena I (ostanki 8–101) in domena II (ostanki 102–184) imata antiparalelno strukturo β-cevi. Domena III (ostanki 201–303) vsebuje pet α-vijakov, razporejenih v večinoma antiparalelno kroglasto skupino. 3CLpro ima Cys-His katalitično diado in mesto vezave substrata je v razcepu med domeno I in domeno II. Več [sliki 1].

===GFP komplementacija===

GFP vsebuje 11 beta verig (β-verig) in osrednjo α-vijačnico, ki jo lahko razdelimo na tri dele. En del vsebuje devet β-pramenov in osrednjo α-vijačnico (β1–9); drugi del vsebuje 10. β verigo (β10); in tretji del vsebuje 11. β verigo (β11). β1–9 vsebuje tri aminokisline, ki tvorijo kromofor, medtem ko β11 vsebuje visoko konzerviran Glu222, ki katalizira zorenje kromoforja. Ko sta β10 in β11 povezana skupaj ali sta v neposredni bližini, se hitro vežeta na β1–9 in zelena fluorescenca se razvije v nekaj deset minutah. Β10–11 je bil preoblikovan tako, da tvori vzporedno strukturo, potem pa ne bi več ustrezal β1–9. Za preklop β11 so uporabili heterodimerizirne tuljave E5 in K5: povezali β10 / β11 z E5; β11 je sledil K5; zaporedje cepitve proteaze je bilo vstavljeno med β11 in K5. Na podlagi te zasnove heterodimer E5 / K5 "preklopi" β11 in preprečuje samosestavljanje razdeljenega GFP. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori antiparalelno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9 in vodi do povečanja fluorescence.

===Oblikovanje presejalnega testa GFP-Split-3CLpro===

Ta tehnologija je bila uporabljena za razvoj in optimizacijo protokola za visoko zmogljivi presejalni test (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 s presejanjem knjižnice majhnih molekul. Poskus je pokazal, da je ta test preprosta in praktična strategija za pregled velikih knjižnic zdravil na zaviralce proteaz.
Načelo preskusa je odvisno od razdelitve GFP na dve enoti (GFP β1–9 in β10-11), kar ima za posledico izgubo njegove fluorescentne kapacitete. β10–11 ima visoko afiniteto za vezavo na β1–9 in hitro razvije zeleno fluorescenco. Tako je test proteaze split-GFP odvisen od preprečevanja sestavljanja enot GFP in sprožitve sklopa GFP pod aktivnostjo proteaze. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori protit vzporedno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9. Vstavitev mesta cepitve 3CLpro med heterodimer E5 / K5 in β11 omogoča, da 3CLpro sprosti β11 in nadaljuje antiparalelno strukturo z β10.
Izdelana je bila ekspresijska kaseta, sestavljena iz dveh plazmidov. Prvi plazmid vsebuje konstrukt GFP, drugi plazmid pa 3CLpro za so-ekspresijo v celicah HEK293. Celice HEK293T smo sočasno transficirali z rekombinantnim plazmidom pcDNA3.1. Za pomnožitev dveh fragmentov GFP, β-verige 1–9 in β-verige 10-11, smo uporabili standardni PCR. Deset aminokislinskih povezovalnih in cepilnih mest aminokislinskih zaporedij 3CLpro in E5 / K5 smo vstavili v konstrukt GFP z uporabo PCR s prekrivanjem in podaljšanjem. Celice, transficirane samo s konstruktom GFP, ne pa tudi 3CLpro, niso pokazale fluorescenčne aktivnosti pet dni po transfekciji. Fluorescenca GFP se je po 48 in 72 urah dramatično povečala.

===Rezultati===

Vrednotenje protokola GFP-split-3CLpro je bilo izvedeno s pregledom lastne knjižnice 50 spojin majhnih molekul. Na podlagi prejšnjih študij je imela večina spojin že potencialno protivirusno proteazno aktivnost. Boceprevir je bil uporabljen kot pozitivna kontrola. Od vseh preizkušenih spojin so derivati kinazolina povzročili rahlo do znatno zmanjšanje intenzivnosti fluorescence GFP. Med derivati kinazolina je spojina QZ4 znatno zmanjšala fluorescenco GFP. Študija molekularnega priklopa je bila opravljena, da bi ponazorila dajanje QZ4 glavni proteazi SARS-CoV-2. QZ4 se na 3CLpro veže s tremi vodikovimi vezmi z Gln 189, Gln 192 in Arg 188.

===Sklep===

Raziskovalci trdijo, da so razvili nov model celičnih linij za presejanje z visoko prepustnostjo (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 na podlagi komplementacije split-GFP. Ta nova metoda bistveno poveča varnost, prepustnost in obnovljivost protivirusnega presejanja, prav tako pomaga skrajšati čas presejanja zdravil. Z uporabo tega testa so ugotovili nove spojine inhibitorja proteaz, pridobljene iz kinazolina, ki jih je treba nadalje raziskati.

===Viri===

1. Rothan, H.A., Teoh, T.C. Cell-Based High-Throughput Screening Protocol for Discovering Antiviral Inhibitors Against SARS-COV-2 Main Protease (3CLpro). Mol Biotechnol 63, 240–248 (2021). https://doi.org/10.1007/s12033-021-00299-7

2. Milech, N., Longville, B., Cunningham, P. et al. GFP-complementation assay to detect functional CPP and protein delivery into living cells. Sci Rep 5, 18329 (2015). https://doi.org/10.1038/srep18329

3. Zhang Q, Schepis A, Huang H, et al. Designing a Green Fluorogenic Protease Reporter by Flipping a Beta Strand of GFP for Imaging Apoptosis in Animals. J Am Chem Soc. 2019;141(11):4526-4530. doi:10.1021/jacs.8b13042

4. Jin, Z., Du, X., Xu, Y. et al. Structure of Mpro from SARS-CoV-2 and discovery of its inhibitors. Nature 582, 289–293 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2223-y

5. Ruan J, Rothan HA, Zhong Y, et al. A small molecule inhibitor of ER-to-cytosol protein dislocation exhibits anti-dengue and anti-Zika virus activity. Sci Rep. 2019;9(1):10901. Published 2019 Jul 29. doi:10.1038/s41598-019-47532-7

Visoko zmogljiv presejalni protokol na osnovi celic za raziskovanje antivirusnih inhibitorjev proti Sars-Cov-2 glavni proteazi (3CLpro)

2021-05-02T19:55:14Z

Mirsad93: /* 3-Kimotripsinu podobna proteaza (3CLpro) */

===Uvod===

COVID-19 je pandemija, ki jo povzroča SARS-CoV-2. Gre za zelo nalezljiv koronavirus, ki po vsem svetu povzroča veliko zdravstveno in gospodarsko breme. Ni posebnih protivirusnih zdravil ali cepiv z dokazano klinično učinkovitostjo za zdravljenje ali preprečevanje okužbe s SARS-CoV-2. Virusne poliproteine predelata dve proteazi: 3C podobna proteaza (3CLpro) in papainu podobna proteaza (PLpro), ki sta dobri tarči za razvoj terapevtskih zdravil. 3CLpro je odgovoren za apoptotični signal, PLpro pa za pomoč koronavirusu pri izogibanju prirojenemu imunskemu odzivu gostitelja. Ciljanje na te encime ima lahko prednosti pri zaviranju replikacije virusov.

===3-Kimotripsinu podobna proteaza (3CLpro)===

Virusna 3CLpro cepi virusne poliproteine na 11 mestih. Ta proteaza ima identično zaporedje med koronavirusi in nima človeškega homologa. Asimetrična enota vsebuje samo en polipeptid. Dva izmed polipeptidov (imenovana protomer A in B) se povežeta, da tvorita dimer. Vsak protomer je sestavljen iz treh domen. Domena I (ostanki 8–101) in domena II (ostanki 102–184) imata antiparalelno strukturo β-cevi. Domena III (ostanki 201–303) vsebuje pet α-vijakov, razporejenih v večinoma antiparalelno kroglasto skupino. 3CLpro ima Cys-His katalitično diado in mesto vezave substrata je v razcepu med domeno I in domeno II.

===GFP komplementacija===

GFP vsebuje 11 beta verig (β-verig) in osrednjo α-vijačnico, ki jo lahko razdelimo na tri dele. En del vsebuje devet β-pramenov in osrednjo α-vijačnico (β1–9); drugi del vsebuje 10. β verigo (β10); in tretji del vsebuje 11. β verigo (β11). β1–9 vsebuje tri aminokisline, ki tvorijo kromofor, medtem ko β11 vsebuje visoko konzerviran Glu222, ki katalizira zorenje kromoforja. Ko sta β10 in β11 povezana skupaj ali sta v neposredni bližini, se hitro vežeta na β1–9 in zelena fluorescenca se razvije v nekaj deset minutah. Β10–11 je bil preoblikovan tako, da tvori vzporedno strukturo, potem pa ne bi več ustrezal β1–9. Za preklop β11 so uporabili heterodimerizirne tuljave E5 in K5: povezali β10 / β11 z E5; β11 je sledil K5; zaporedje cepitve proteaze je bilo vstavljeno med β11 in K5. Na podlagi te zasnove heterodimer E5 / K5 "preklopi" β11 in preprečuje samosestavljanje razdeljenega GFP. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori antiparalelno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9 in vodi do povečanja fluorescence.

===Oblikovanje presejalnega testa GFP-Split-3CLpro===

Ta tehnologija je bila uporabljena za razvoj in optimizacijo protokola za visoko zmogljivi presejalni test (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 s presejanjem knjižnice majhnih molekul. Poskus je pokazal, da je ta test preprosta in praktična strategija za pregled velikih knjižnic zdravil na zaviralce proteaz.
Načelo preskusa je odvisno od razdelitve GFP na dve enoti (GFP β1–9 in β10-11), kar ima za posledico izgubo njegove fluorescentne kapacitete. β10–11 ima visoko afiniteto za vezavo na β1–9 in hitro razvije zeleno fluorescenco. Tako je test proteaze split-GFP odvisen od preprečevanja sestavljanja enot GFP in sprožitve sklopa GFP pod aktivnostjo proteaze. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori protit vzporedno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9. Vstavitev mesta cepitve 3CLpro med heterodimer E5 / K5 in β11 omogoča, da 3CLpro sprosti β11 in nadaljuje antiparalelno strukturo z β10.
Izdelana je bila ekspresijska kaseta, sestavljena iz dveh plazmidov. Prvi plazmid vsebuje konstrukt GFP, drugi plazmid pa 3CLpro za so-ekspresijo v celicah HEK293. Celice HEK293T smo sočasno transficirali z rekombinantnim plazmidom pcDNA3.1. Za pomnožitev dveh fragmentov GFP, β-verige 1–9 in β-verige 10-11, smo uporabili standardni PCR. Deset aminokislinskih povezovalnih in cepilnih mest aminokislinskih zaporedij 3CLpro in E5 / K5 smo vstavili v konstrukt GFP z uporabo PCR s prekrivanjem in podaljšanjem. Celice, transficirane samo s konstruktom GFP, ne pa tudi 3CLpro, niso pokazale fluorescenčne aktivnosti pet dni po transfekciji. Fluorescenca GFP se je po 48 in 72 urah dramatično povečala.

===Rezultati===

Vrednotenje protokola GFP-split-3CLpro je bilo izvedeno s pregledom lastne knjižnice 50 spojin majhnih molekul. Na podlagi prejšnjih študij je imela večina spojin že potencialno protivirusno proteazno aktivnost. Boceprevir je bil uporabljen kot pozitivna kontrola. Od vseh preizkušenih spojin so derivati kinazolina povzročili rahlo do znatno zmanjšanje intenzivnosti fluorescence GFP. Med derivati kinazolina je spojina QZ4 znatno zmanjšala fluorescenco GFP. Študija molekularnega priklopa je bila opravljena, da bi ponazorila dajanje QZ4 glavni proteazi SARS-CoV-2. QZ4 se na 3CLpro veže s tremi vodikovimi vezmi z Gln 189, Gln 192 in Arg 188.

===Sklep===

Raziskovalci trdijo, da so razvili nov model celičnih linij za presejanje z visoko prepustnostjo (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 na podlagi komplementacije split-GFP. Ta nova metoda bistveno poveča varnost, prepustnost in obnovljivost protivirusnega presejanja, prav tako pomaga skrajšati čas presejanja zdravil. Z uporabo tega testa so ugotovili nove spojine inhibitorja proteaz, pridobljene iz kinazolina, ki jih je treba nadalje raziskati.

===Viri===

1. Rothan, H.A., Teoh, T.C. Cell-Based High-Throughput Screening Protocol for Discovering Antiviral Inhibitors Against SARS-COV-2 Main Protease (3CLpro). Mol Biotechnol 63, 240–248 (2021). https://doi.org/10.1007/s12033-021-00299-7

2. Milech, N., Longville, B., Cunningham, P. et al. GFP-complementation assay to detect functional CPP and protein delivery into living cells. Sci Rep 5, 18329 (2015). https://doi.org/10.1038/srep18329

3. Zhang Q, Schepis A, Huang H, et al. Designing a Green Fluorogenic Protease Reporter by Flipping a Beta Strand of GFP for Imaging Apoptosis in Animals. J Am Chem Soc. 2019;141(11):4526-4530. doi:10.1021/jacs.8b13042

4. Jin, Z., Du, X., Xu, Y. et al. Structure of Mpro from SARS-CoV-2 and discovery of its inhibitors. Nature 582, 289–293 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2223-y

5. Ruan J, Rothan HA, Zhong Y, et al. A small molecule inhibitor of ER-to-cytosol protein dislocation exhibits anti-dengue and anti-Zika virus activity. Sci Rep. 2019;9(1):10901. Published 2019 Jul 29. doi:10.1038/s41598-019-47532-7

Visoko zmogljiv presejalni protokol na osnovi celic za raziskovanje antivirusnih inhibitorjev proti Sars-Cov-2 glavni proteazi (3CLpro)

2021-05-02T19:52:22Z

Mirsad93: /* Viri */

===Uvod===

COVID-19 je pandemija, ki jo povzroča SARS-CoV-2. Gre za zelo nalezljiv koronavirus, ki po vsem svetu povzroča veliko zdravstveno in gospodarsko breme. Ni posebnih protivirusnih zdravil ali cepiv z dokazano klinično učinkovitostjo za zdravljenje ali preprečevanje okužbe s SARS-CoV-2. Virusne poliproteine predelata dve proteazi: 3C podobna proteaza (3CLpro) in papainu podobna proteaza (PLpro), ki sta dobri tarči za razvoj terapevtskih zdravil. 3CLpro je odgovoren za apoptotični signal, PLpro pa za pomoč koronavirusu pri izogibanju prirojenemu imunskemu odzivu gostitelja. Ciljanje na te encime ima lahko prednosti pri zaviranju replikacije virusov.

===3-Kimotripsinu podobna proteaza (3CLpro)===

Virus 3CLpro cepi virusne poliproteine na 11 mestih. Ta proteaza ima identično zaporedje med koronavirusi in nima človeškega homologa. Asimetrična enota vsebuje samo en polipeptid. Dva izmed polipeptidov (imenovana protomer A in B) se povežeta, da tvorita dimer. Vsak protomer je sestavljen iz treh domen. Domena I (ostanki 8–101) in domena II (ostanki 102–184) imata antiparalelno strukturo β-cevi. Domena III (ostanki 201–303) vsebuje pet α-vijakov, razporejenih v večinoma antiparalelno kroglasto skupino. 3CLpro ima Cys-His katalitično diado in mesto vezave substrata je v razcepu med domeno I in domeno II.

===GFP komplementacija===

GFP vsebuje 11 beta verig (β-verig) in osrednjo α-vijačnico, ki jo lahko razdelimo na tri dele. En del vsebuje devet β-pramenov in osrednjo α-vijačnico (β1–9); drugi del vsebuje 10. β verigo (β10); in tretji del vsebuje 11. β verigo (β11). β1–9 vsebuje tri aminokisline, ki tvorijo kromofor, medtem ko β11 vsebuje visoko konzerviran Glu222, ki katalizira zorenje kromoforja. Ko sta β10 in β11 povezana skupaj ali sta v neposredni bližini, se hitro vežeta na β1–9 in zelena fluorescenca se razvije v nekaj deset minutah. Β10–11 je bil preoblikovan tako, da tvori vzporedno strukturo, potem pa ne bi več ustrezal β1–9. Za preklop β11 so uporabili heterodimerizirne tuljave E5 in K5: povezali β10 / β11 z E5; β11 je sledil K5; zaporedje cepitve proteaze je bilo vstavljeno med β11 in K5. Na podlagi te zasnove heterodimer E5 / K5 "preklopi" β11 in preprečuje samosestavljanje razdeljenega GFP. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori antiparalelno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9 in vodi do povečanja fluorescence.

===Oblikovanje presejalnega testa GFP-Split-3CLpro===

Ta tehnologija je bila uporabljena za razvoj in optimizacijo protokola za visoko zmogljivi presejalni test (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 s presejanjem knjižnice majhnih molekul. Poskus je pokazal, da je ta test preprosta in praktična strategija za pregled velikih knjižnic zdravil na zaviralce proteaz.
Načelo preskusa je odvisno od razdelitve GFP na dve enoti (GFP β1–9 in β10-11), kar ima za posledico izgubo njegove fluorescentne kapacitete. β10–11 ima visoko afiniteto za vezavo na β1–9 in hitro razvije zeleno fluorescenco. Tako je test proteaze split-GFP odvisen od preprečevanja sestavljanja enot GFP in sprožitve sklopa GFP pod aktivnostjo proteaze. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori protit vzporedno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9. Vstavitev mesta cepitve 3CLpro med heterodimer E5 / K5 in β11 omogoča, da 3CLpro sprosti β11 in nadaljuje antiparalelno strukturo z β10.
Izdelana je bila ekspresijska kaseta, sestavljena iz dveh plazmidov. Prvi plazmid vsebuje konstrukt GFP, drugi plazmid pa 3CLpro za so-ekspresijo v celicah HEK293. Celice HEK293T smo sočasno transficirali z rekombinantnim plazmidom pcDNA3.1. Za pomnožitev dveh fragmentov GFP, β-verige 1–9 in β-verige 10-11, smo uporabili standardni PCR. Deset aminokislinskih povezovalnih in cepilnih mest aminokislinskih zaporedij 3CLpro in E5 / K5 smo vstavili v konstrukt GFP z uporabo PCR s prekrivanjem in podaljšanjem. Celice, transficirane samo s konstruktom GFP, ne pa tudi 3CLpro, niso pokazale fluorescenčne aktivnosti pet dni po transfekciji. Fluorescenca GFP se je po 48 in 72 urah dramatično povečala.

===Rezultati===

Vrednotenje protokola GFP-split-3CLpro je bilo izvedeno s pregledom lastne knjižnice 50 spojin majhnih molekul. Na podlagi prejšnjih študij je imela večina spojin že potencialno protivirusno proteazno aktivnost. Boceprevir je bil uporabljen kot pozitivna kontrola. Od vseh preizkušenih spojin so derivati kinazolina povzročili rahlo do znatno zmanjšanje intenzivnosti fluorescence GFP. Med derivati kinazolina je spojina QZ4 znatno zmanjšala fluorescenco GFP. Študija molekularnega priklopa je bila opravljena, da bi ponazorila dajanje QZ4 glavni proteazi SARS-CoV-2. QZ4 se na 3CLpro veže s tremi vodikovimi vezmi z Gln 189, Gln 192 in Arg 188.

===Sklep===

Raziskovalci trdijo, da so razvili nov model celičnih linij za presejanje z visoko prepustnostjo (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 na podlagi komplementacije split-GFP. Ta nova metoda bistveno poveča varnost, prepustnost in obnovljivost protivirusnega presejanja, prav tako pomaga skrajšati čas presejanja zdravil. Z uporabo tega testa so ugotovili nove spojine inhibitorja proteaz, pridobljene iz kinazolina, ki jih je treba nadalje raziskati.

===Viri===

1. Rothan, H.A., Teoh, T.C. Cell-Based High-Throughput Screening Protocol for Discovering Antiviral Inhibitors Against SARS-COV-2 Main Protease (3CLpro). Mol Biotechnol 63, 240–248 (2021). https://doi.org/10.1007/s12033-021-00299-7

2. Milech, N., Longville, B., Cunningham, P. et al. GFP-complementation assay to detect functional CPP and protein delivery into living cells. Sci Rep 5, 18329 (2015). https://doi.org/10.1038/srep18329

3. Zhang Q, Schepis A, Huang H, et al. Designing a Green Fluorogenic Protease Reporter by Flipping a Beta Strand of GFP for Imaging Apoptosis in Animals. J Am Chem Soc. 2019;141(11):4526-4530. doi:10.1021/jacs.8b13042

4. Jin, Z., Du, X., Xu, Y. et al. Structure of Mpro from SARS-CoV-2 and discovery of its inhibitors. Nature 582, 289–293 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2223-y

5. Ruan J, Rothan HA, Zhong Y, et al. A small molecule inhibitor of ER-to-cytosol protein dislocation exhibits anti-dengue and anti-Zika virus activity. Sci Rep. 2019;9(1):10901. Published 2019 Jul 29. doi:10.1038/s41598-019-47532-7

Visoko zmogljiv presejalni protokol na osnovi celic za raziskovanje antivirusnih inhibitorjev proti Sars-Cov-2 glavni proteazi (3CLpro)

2021-05-02T19:50:53Z

Mirsad93:

===Uvod===

COVID-19 je pandemija, ki jo povzroča SARS-CoV-2. Gre za zelo nalezljiv koronavirus, ki po vsem svetu povzroča veliko zdravstveno in gospodarsko breme. Ni posebnih protivirusnih zdravil ali cepiv z dokazano klinično učinkovitostjo za zdravljenje ali preprečevanje okužbe s SARS-CoV-2. Virusne poliproteine predelata dve proteazi: 3C podobna proteaza (3CLpro) in papainu podobna proteaza (PLpro), ki sta dobri tarči za razvoj terapevtskih zdravil. 3CLpro je odgovoren za apoptotični signal, PLpro pa za pomoč koronavirusu pri izogibanju prirojenemu imunskemu odzivu gostitelja. Ciljanje na te encime ima lahko prednosti pri zaviranju replikacije virusov.

===3-Kimotripsinu podobna proteaza (3CLpro)===

Virus 3CLpro cepi virusne poliproteine na 11 mestih. Ta proteaza ima identično zaporedje med koronavirusi in nima človeškega homologa. Asimetrična enota vsebuje samo en polipeptid. Dva izmed polipeptidov (imenovana protomer A in B) se povežeta, da tvorita dimer. Vsak protomer je sestavljen iz treh domen. Domena I (ostanki 8–101) in domena II (ostanki 102–184) imata antiparalelno strukturo β-cevi. Domena III (ostanki 201–303) vsebuje pet α-vijakov, razporejenih v večinoma antiparalelno kroglasto skupino. 3CLpro ima Cys-His katalitično diado in mesto vezave substrata je v razcepu med domeno I in domeno II.

===GFP komplementacija===

GFP vsebuje 11 beta verig (β-verig) in osrednjo α-vijačnico, ki jo lahko razdelimo na tri dele. En del vsebuje devet β-pramenov in osrednjo α-vijačnico (β1–9); drugi del vsebuje 10. β verigo (β10); in tretji del vsebuje 11. β verigo (β11). β1–9 vsebuje tri aminokisline, ki tvorijo kromofor, medtem ko β11 vsebuje visoko konzerviran Glu222, ki katalizira zorenje kromoforja. Ko sta β10 in β11 povezana skupaj ali sta v neposredni bližini, se hitro vežeta na β1–9 in zelena fluorescenca se razvije v nekaj deset minutah. Β10–11 je bil preoblikovan tako, da tvori vzporedno strukturo, potem pa ne bi več ustrezal β1–9. Za preklop β11 so uporabili heterodimerizirne tuljave E5 in K5: povezali β10 / β11 z E5; β11 je sledil K5; zaporedje cepitve proteaze je bilo vstavljeno med β11 in K5. Na podlagi te zasnove heterodimer E5 / K5 "preklopi" β11 in preprečuje samosestavljanje razdeljenega GFP. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori antiparalelno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9 in vodi do povečanja fluorescence.

===Oblikovanje presejalnega testa GFP-Split-3CLpro===

Ta tehnologija je bila uporabljena za razvoj in optimizacijo protokola za visoko zmogljivi presejalni test (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 s presejanjem knjižnice majhnih molekul. Poskus je pokazal, da je ta test preprosta in praktična strategija za pregled velikih knjižnic zdravil na zaviralce proteaz.
Načelo preskusa je odvisno od razdelitve GFP na dve enoti (GFP β1–9 in β10-11), kar ima za posledico izgubo njegove fluorescentne kapacitete. β10–11 ima visoko afiniteto za vezavo na β1–9 in hitro razvije zeleno fluorescenco. Tako je test proteaze split-GFP odvisen od preprečevanja sestavljanja enot GFP in sprožitve sklopa GFP pod aktivnostjo proteaze. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori protit vzporedno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9. Vstavitev mesta cepitve 3CLpro med heterodimer E5 / K5 in β11 omogoča, da 3CLpro sprosti β11 in nadaljuje antiparalelno strukturo z β10.
Izdelana je bila ekspresijska kaseta, sestavljena iz dveh plazmidov. Prvi plazmid vsebuje konstrukt GFP, drugi plazmid pa 3CLpro za so-ekspresijo v celicah HEK293. Celice HEK293T smo sočasno transficirali z rekombinantnim plazmidom pcDNA3.1. Za pomnožitev dveh fragmentov GFP, β-verige 1–9 in β-verige 10-11, smo uporabili standardni PCR. Deset aminokislinskih povezovalnih in cepilnih mest aminokislinskih zaporedij 3CLpro in E5 / K5 smo vstavili v konstrukt GFP z uporabo PCR s prekrivanjem in podaljšanjem. Celice, transficirane samo s konstruktom GFP, ne pa tudi 3CLpro, niso pokazale fluorescenčne aktivnosti pet dni po transfekciji. Fluorescenca GFP se je po 48 in 72 urah dramatično povečala.

===Rezultati===

Vrednotenje protokola GFP-split-3CLpro je bilo izvedeno s pregledom lastne knjižnice 50 spojin majhnih molekul. Na podlagi prejšnjih študij je imela večina spojin že potencialno protivirusno proteazno aktivnost. Boceprevir je bil uporabljen kot pozitivna kontrola. Od vseh preizkušenih spojin so derivati kinazolina povzročili rahlo do znatno zmanjšanje intenzivnosti fluorescence GFP. Med derivati kinazolina je spojina QZ4 znatno zmanjšala fluorescenco GFP. Študija molekularnega priklopa je bila opravljena, da bi ponazorila dajanje QZ4 glavni proteazi SARS-CoV-2. QZ4 se na 3CLpro veže s tremi vodikovimi vezmi z Gln 189, Gln 192 in Arg 188.

===Sklep===

Raziskovalci trdijo, da so razvili nov model celičnih linij za presejanje z visoko prepustnostjo (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 na podlagi komplementacije split-GFP. Ta nova metoda bistveno poveča varnost, prepustnost in obnovljivost protivirusnega presejanja, prav tako pomaga skrajšati čas presejanja zdravil. Z uporabo tega testa so ugotovili nove spojine inhibitorja proteaz, pridobljene iz kinazolina, ki jih je treba nadalje raziskati.

===Viri===

1. Rothan, H.A., Teoh, T.C. Cell-Based High-Throughput Screening Protocol for Discovering Antiviral Inhibitors Against SARS-COV-2 Main Protease (3CLpro). Mol Biotechnol 63, 240–248 (2021). https://doi.org/10.1007/s12033-021-00299-7

2. Milech, N., Longville, B., Cunningham, P. et al. GFP-complementation assay to detect functional CPP and protein delivery into living cells. Sci Rep 5, 18329 (2015). https://doi.org/10.1038/srep18329

3. Zhang Q, Schepis A, Huang H, et al. Designing a Green Fluorogenic Protease Reporter by Flipping a Beta Strand of GFP for Imaging Apoptosis in Animals. J Am Chem Soc. 2019;141(11):4526-4530. doi:10.1021/jacs.8b13042

4. Jin, Z., Du, X., Xu, Y. et al. Structure of Mpro from SARS-CoV-2 and discovery of its inhibitors. Nature 582, 289–293 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2223-y

Visoko zmogljiv presejalni protokol na osnovi celic za raziskovanje antivirusnih inhibitorjev proti Sars-Cov-2 glavni proteazi (3CLpro)

2021-05-02T19:44:35Z

Mirsad93: /* 3-Kimotripsinu podobna proteaza */

===Uvod===

COVID-19 je pandemija, ki jo povzroča SARS-CoV-2. Gre za zelo nalezljiv koronavirus, ki po vsem svetu povzroča veliko zdravstveno in gospodarsko breme. Ni posebnih protivirusnih zdravil ali cepiv z dokazano klinično učinkovitostjo za zdravljenje ali preprečevanje okužbe s SARS-CoV-2. Virusne poliproteine predelata dve proteazi: 3C podobna proteaza (3CLpro) in papainu podobna proteaza (PLpro), ki sta dobri tarči za razvoj terapevtskih zdravil. 3CLpro je odgovoren za apoptotični signal, PLpro pa za pomoč koronavirusu pri izogibanju prirojenemu imunskemu odzivu gostitelja. Ciljanje na te encime ima lahko prednosti pri zaviranju replikacije virusov.

===3-Kimotripsinu podobna proteaza (3CLpro)===

Virus 3CLpro cepi virusne poliproteine na 11 mestih. Ta proteaza ima identično zaporedje med koronavirusi in nima človeškega homologa. Asimetrična enota vsebuje samo en polipeptid. Dva izmed polipeptidov (imenovana protomer A in B) se povežeta, da tvorita dimer. Vsak protomer je sestavljen iz treh domen. Domena I (ostanki 8–101) in domena II (ostanki 102–184) imata antiparalelno strukturo β-cevi. Domena III (ostanki 201–303) vsebuje pet α-vijakov, razporejenih v večinoma antiparalelno kroglasto skupino. 3CLpro ima Cys-His katalitično diado in mesto vezave substrata je v razcepu med domeno I in domeno II.

===GFP komplementacija===

GFP vsebuje 11 beta verig (β-verig) in osrednjo α-vijačnico, ki jo lahko razdelimo na tri dele. En del vsebuje devet β-pramenov in osrednjo α-vijačnico (β1–9); drugi del vsebuje 10. β verigo (β10); in tretji del vsebuje 11. β verigo (β11). β1–9 vsebuje tri aminokisline, ki tvorijo kromofor, medtem ko β11 vsebuje visoko konzerviran Glu222, ki katalizira zorenje kromoforja. Ko sta β10 in β11 povezana skupaj ali sta v neposredni bližini, se hitro vežeta na β1–9 in zelena fluorescenca se razvije v nekaj deset minutah. Β10–11 je bil preoblikovan tako, da tvori vzporedno strukturo, potem pa ne bi več ustrezal β1–9. Za preklop β11 so uporabili heterodimerizirne tuljave E5 in K5: povezali β10 / β11 z E5; β11 je sledil K5; zaporedje cepitve proteaze je bilo vstavljeno med β11 in K5. Na podlagi te zasnove heterodimer E5 / K5 "preklopi" β11 in preprečuje samosestavljanje razdeljenega GFP. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori antiparalelno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9 in vodi do povečanja fluorescence.

===Oblikovanje presejalnega testa GFP-Split-3CLpro===

Ta tehnologija je bila uporabljena za razvoj in optimizacijo protokola za visoko zmogljivi presejalni test (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 s presejanjem knjižnice majhnih molekul. Poskus je pokazal, da je ta test preprosta in praktična strategija za pregled velikih knjižnic zdravil na zaviralce proteaz.
Načelo preskusa je odvisno od razdelitve GFP na dve enoti (GFP β1–9 in β10-11), kar ima za posledico izgubo njegove fluorescentne kapacitete. β10–11 ima visoko afiniteto za vezavo na β1–9 in hitro razvije zeleno fluorescenco. Tako je test proteaze split-GFP odvisen od preprečevanja sestavljanja enot GFP in sprožitve sklopa GFP pod aktivnostjo proteaze. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori protit vzporedno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9. Vstavitev mesta cepitve 3CLpro med heterodimer E5 / K5 in β11 omogoča, da 3CLpro sprosti β11 in nadaljuje antiparalelno strukturo z β10.
Izdelana je bila ekspresijska kaseta, sestavljena iz dveh plazmidov. Prvi plazmid vsebuje konstrukt GFP, drugi plazmid pa 3CLpro za so-ekspresijo v celicah HEK293. Celice HEK293T smo sočasno transficirali z rekombinantnim plazmidom pcDNA3.1. Za pomnožitev dveh fragmentov GFP, β-verige 1–9 in β-verige 10-11, smo uporabili standardni PCR. Deset aminokislinskih povezovalnih in cepilnih mest aminokislinskih zaporedij 3CLpro in E5 / K5 smo vstavili v konstrukt GFP z uporabo PCR s prekrivanjem in podaljšanjem. Celice, transficirane samo s konstruktom GFP, ne pa tudi 3CLpro, niso pokazale fluorescenčne aktivnosti pet dni po transfekciji. Fluorescenca GFP se je po 48 in 72 urah dramatično povečala.

===Rezultati===

Vrednotenje protokola GFP-split-3CLpro je bilo izvedeno s pregledom lastne knjižnice 50 spojin majhnih molekul. Na podlagi prejšnjih študij je imela večina spojin že potencialno protivirusno proteazno aktivnost. Boceprevir je bil uporabljen kot pozitivna kontrola. Od vseh preizkušenih spojin so derivati kinazolina povzročili rahlo do znatno zmanjšanje intenzivnosti fluorescence GFP. Med derivati kinazolina je spojina QZ4 znatno zmanjšala fluorescenco GFP. Študija molekularnega priklopa je bila opravljena, da bi ponazorila dajanje QZ4 glavni proteazi SARS-CoV-2. QZ4 se na 3CLpro veže s tremi vodikovimi vezmi z Gln 189, Gln 192 in Arg 188.

===Sklep===

Raziskovalci trdijo, da so razvili nov model celičnih linij za presejanje z visoko prepustnostjo (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 na podlagi komplementacije split-GFP. Ta nova metoda bistveno poveča varnost, prepustnost in obnovljivost protivirusnega presejanja, prav tako pomaga skrajšati čas presejanja zdravil. Z uporabo tega testa so ugotovili nove spojine inhibitorja proteaz, pridobljene iz kinazolina, ki jih je treba nadalje raziskati.

Visoko zmogljiv presejalni protokol na osnovi celic za raziskovanje antivirusnih inhibitorjev proti Sars-Cov-2 glavni proteazi (3CLpro)

2021-05-02T19:42:52Z

Mirsad93: New page: ===Uvod=== COVID-19 je pandemija, ki jo povzroča SARS-CoV-2. Gre za zelo nalezljiv koronavirus, ki po vsem svetu povzroča veliko zdravstveno in gospodarsko breme. Ni posebnih protivirus...

===Uvod===

COVID-19 je pandemija, ki jo povzroča SARS-CoV-2. Gre za zelo nalezljiv koronavirus, ki po vsem svetu povzroča veliko zdravstveno in gospodarsko breme. Ni posebnih protivirusnih zdravil ali cepiv z dokazano klinično učinkovitostjo za zdravljenje ali preprečevanje okužbe s SARS-CoV-2. Virusne poliproteine predelata dve proteazi: 3C podobna proteaza (3CLpro) in papainu podobna proteaza (PLpro), ki sta dobri tarči za razvoj terapevtskih zdravil. 3CLpro je odgovoren za apoptotični signal, PLpro pa za pomoč koronavirusu pri izogibanju prirojenemu imunskemu odzivu gostitelja. Ciljanje na te encime ima lahko prednosti pri zaviranju replikacije virusov.

===3-Kimotripsinu podobna proteaza===

Virus 3CLpro cepi virusne poliproteine na 11 mestih. Ta proteaza ima identično zaporedje med koronavirusi in nima človeškega homologa. Asimetrična enota vsebuje samo en polipeptid. Dva izmed polipeptidov (imenovana protomer A in B) se povežeta, da tvorita dimer. Vsak protomer je sestavljen iz treh domen. Domena I (ostanki 8–101) in domena II (ostanki 102–184) imata antiparalelno strukturo β-cevi. Domena III (ostanki 201–303) vsebuje pet α-vijakov, razporejenih v večinoma antiparalelno kroglasto skupino. 3CLpro ima Cys-His katalitično diado in mesto vezave substrata je v razcepu med domeno I in domeno II.

===GFP komplementacija===

GFP vsebuje 11 beta verig (β-verig) in osrednjo α-vijačnico, ki jo lahko razdelimo na tri dele. En del vsebuje devet β-pramenov in osrednjo α-vijačnico (β1–9); drugi del vsebuje 10. β verigo (β10); in tretji del vsebuje 11. β verigo (β11). β1–9 vsebuje tri aminokisline, ki tvorijo kromofor, medtem ko β11 vsebuje visoko konzerviran Glu222, ki katalizira zorenje kromoforja. Ko sta β10 in β11 povezana skupaj ali sta v neposredni bližini, se hitro vežeta na β1–9 in zelena fluorescenca se razvije v nekaj deset minutah. Β10–11 je bil preoblikovan tako, da tvori vzporedno strukturo, potem pa ne bi več ustrezal β1–9. Za preklop β11 so uporabili heterodimerizirne tuljave E5 in K5: povezali β10 / β11 z E5; β11 je sledil K5; zaporedje cepitve proteaze je bilo vstavljeno med β11 in K5. Na podlagi te zasnove heterodimer E5 / K5 "preklopi" β11 in preprečuje samosestavljanje razdeljenega GFP. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori antiparalelno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9 in vodi do povečanja fluorescence.

===Oblikovanje presejalnega testa GFP-Split-3CLpro===

Ta tehnologija je bila uporabljena za razvoj in optimizacijo protokola za visoko zmogljivi presejalni test (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 s presejanjem knjižnice majhnih molekul. Poskus je pokazal, da je ta test preprosta in praktična strategija za pregled velikih knjižnic zdravil na zaviralce proteaz.
Načelo preskusa je odvisno od razdelitve GFP na dve enoti (GFP β1–9 in β10-11), kar ima za posledico izgubo njegove fluorescentne kapacitete. β10–11 ima visoko afiniteto za vezavo na β1–9 in hitro razvije zeleno fluorescenco. Tako je test proteaze split-GFP odvisen od preprečevanja sestavljanja enot GFP in sprožitve sklopa GFP pod aktivnostjo proteaze. Po cepitvi proteaze se β11 obrne nazaj in tvori protit vzporedno strukturo z β10, kar omogoča samosestavljanje z β1–9. Vstavitev mesta cepitve 3CLpro med heterodimer E5 / K5 in β11 omogoča, da 3CLpro sprosti β11 in nadaljuje antiparalelno strukturo z β10.
Izdelana je bila ekspresijska kaseta, sestavljena iz dveh plazmidov. Prvi plazmid vsebuje konstrukt GFP, drugi plazmid pa 3CLpro za so-ekspresijo v celicah HEK293. Celice HEK293T smo sočasno transficirali z rekombinantnim plazmidom pcDNA3.1. Za pomnožitev dveh fragmentov GFP, β-verige 1–9 in β-verige 10-11, smo uporabili standardni PCR. Deset aminokislinskih povezovalnih in cepilnih mest aminokislinskih zaporedij 3CLpro in E5 / K5 smo vstavili v konstrukt GFP z uporabo PCR s prekrivanjem in podaljšanjem. Celice, transficirane samo s konstruktom GFP, ne pa tudi 3CLpro, niso pokazale fluorescenčne aktivnosti pet dni po transfekciji. Fluorescenca GFP se je po 48 in 72 urah dramatično povečala.

===Rezultati===

Vrednotenje protokola GFP-split-3CLpro je bilo izvedeno s pregledom lastne knjižnice 50 spojin majhnih molekul. Na podlagi prejšnjih študij je imela večina spojin že potencialno protivirusno proteazno aktivnost. Boceprevir je bil uporabljen kot pozitivna kontrola. Od vseh preizkušenih spojin so derivati kinazolina povzročili rahlo do znatno zmanjšanje intenzivnosti fluorescence GFP. Med derivati kinazolina je spojina QZ4 znatno zmanjšala fluorescenco GFP. Študija molekularnega priklopa je bila opravljena, da bi ponazorila dajanje QZ4 glavni proteazi SARS-CoV-2. QZ4 se na 3CLpro veže s tremi vodikovimi vezmi z Gln 189, Gln 192 in Arg 188.

===Sklep===

Raziskovalci trdijo, da so razvili nov model celičnih linij za presejanje z visoko prepustnostjo (HTS) za identifikacijo inhibitorjev proti proteazi SARS-CoV-2 na podlagi komplementacije split-GFP. Ta nova metoda bistveno poveča varnost, prepustnost in obnovljivost protivirusnega presejanja, prav tako pomaga skrajšati čas presejanja zdravil. Z uporabo tega testa so ugotovili nove spojine inhibitorja proteaz, pridobljene iz kinazolina, ki jih je treba nadalje raziskati.

Seminarji SB 2020/21

2021-04-25T00:12:18Z

Mirsad93:

V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline]
(Liza Ulčakar) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 
6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) 
7 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) 
8 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reverzibilna_toplotna_regulacija_za_bifunkcionalno_dinamično_uravnavanje_izražanja_genov_v_E._coli Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli] (Urška Fajdiga) 
9 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dna_optogenetska_naprava_na_osnovi_BRET_za_pulzirajo%C4%8Do_ekspresijo_transgena%2C_ki_omogo%C4%8Da_glukozno_homeostazo_pri_mi%C5%A1ih Sintetična optogenetska naprava na osnovi BRET za pulzirajočo ekspresijo transgena, ki omogoča glukozno homeostazo pri miših] (Paula Horvat) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv]
(Špela Supej) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 
4 [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) 
6 [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) 
7 [[Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe]] (Mirsad Mešić) 
8 [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) 
9 [[Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata]] (Jernej Imperl) 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

RAPIDEMICS razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe

2021-04-25T00:10:01Z

Mirsad93: RAPIDEMICS razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe moved to Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe

#REDIRECT [[Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe]]

Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe

2021-04-25T00:10:01Z

Mirsad93: RAPIDEMICS razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe moved to Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe

Projekt Rapidemic je projekt šudentov Univerze v Leidnu, Nizozemska. Ideja za projekt je bila ustvariti hitar diagnostični test za detekcijo novih patogenov.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Leiden

Avtor povzetka: Mirsad Mešić

== '''Uvod''' ==

Na začetku leta 2020 je Svetovna zdravstvena organizacija (WHO) le nekaj mesecev po odkritju koronarno virusne bolezni 2019 (COVID-19) le-to razglasila za pandemijo. Nadzor nad boleznijo bi lahko ponovno pridobili z zmanjšanim številom interakcij: socialna distanca, zapiranje in sledenje stikom.
To ni samo prekinilo vsakdanjega življenja, ampak v nekaterih primerih ljudem onemogočilo pridobivanje zaslužka za preživljanje družine.
Izolacija prebivalstva zaradi svoje resnosti ni dolgoročna rešitev
Ta pandemija je pokazala pomembnost preskusne zmogljivosti, saj je izolacija okuženih posameznikov ključnega pomena za omejevanje širjenja bolezni med prebivalstvom. Omejena zmogljivost testiranja lahko povzroči premajhno diagnozo okuženih posameznikov, kar ustvari netočno oceno dejanskih okužb med izbruhom. To ogroža nadzor bolezni in lahko poglobi krivuljo.
Dokler ni na voljo učinkovito cepivo ali zdravljenje, je edina rešitev testiranje.
Krčenje gozdov hitro poveča stik med ljudmi in živalmi, kar ima za posledico lažji prenos zoonotskih patogenov.
Globalno segrevanje vpliva na številčnost in razširjenost prenašalcev bolezni, ki so posledica spremenjenih okoljskih razmer.

== '''Projekt Rapidemic''' ==

Trenutni testi se niso izkazali za zadostne za obvladovanje izbruha. Obstajajo tri glavne kategorije diagnostičnih testov: testi ojačanja nukleinske kisline (PCR), testi na osnovi antigena in testi na protitelesa. Ti testi imajo svoje prednosti in slabosti. Velika pomanjkljivost preskusa pomnoževanja nukleinske kisline PCR so drage zahteve: termocikli, laboratoriji in usposobljeni operaterji. Po drugi strani se testi na antigenih razvijajo dolgo, medtem ko je hiter diagnostični odziv ključnega pomena. Tretjič, testov na protitelesa ni mogoče uporabiti v zgodnjih fazah okužbe, kar pomeni, da je mogoče doseči negativen rezultat, čeprav bi bila oseba že kužna.
Cilj projekta je bil oblikovati test, ki je laboratorijsko neodvisen, hitro zagotavlja rezultate in ga je mogoče enostavno prilagoditi za testiranje na kakršen koli nov patogen.
Metoda zaznavanja nukleinske kisline je sestavljena iz treh reakcij:
Ojačanje rekombinazne polimeraze (RPA), linearno ojačanje premika verige (LSDA) in katalitična oksidacija z gvanin-kvadrupleksom (GQ).
Za večino poskusov RPA je bila kot tarča pomnoževanja uporabljena izolirana genomska DNA ''Saccharomyces cerevisiae''.
Prav tako se reakcija izvaja na sintetičnih predlogah, pridobljenih iz: ''Bacillus subtilis'', ''Plasmodium falciparum'', ''Mycobacterium sp.'' in gripa A H1N1.

'''Rekombinazna amplifikacija polimeraze (RPA)'''

Ojačevanje rekombinazne polimeraze (RPA) je enocevna, izotermična alternativa verižni reakciji s polimerazo (PCR). Ker je izotermičen, lahko RPA uporablja veliko preprostejšo opremo kot PCR, za kar je potreben termični cikel. Najboljše delovanje pri temperaturah 37–42 ° C. Zaradi tega je RPA odličen kandidat za razvoj poceni, hitrih molekularnih testov na mestu oskrbe. Proces RPA uporablja tri jedrne encime - rekombinazo, enojno vezavni protein, ki veže DNA (SSB), in polimerazo, ki izpodriva verigo. Rekombinaze so sposobne seznaniti oligonukleotidne prajmere s homolognim zaporedjem v dupleksni DNA. SSB se veže na izpodrinjene verige DNK in prepreči, da bi se primerki premaknili. Končno, veriga, ki izpodriva polimerazo, začne sintezo DNA, kjer se je primer primerjal na ciljno DNA.
Primarni pari, uporabljeni v tem poskusu, so bili zasnovani tako, da ciljajo na zaporedje 191 bp iz genoma ''Saccharomyces cerevisiae''.
Reverzni primerji imajo previs ~ 27 nukleotidov, ki vsebuje reverzno komplementarno zaporedje mesta prepoznavanja za nicking endonukleazo, kratek distančnik (manj kot 10 bp), in zaporedje, obratno komplementarno DNAzymu.

'''Ojačevanje linearnega premika verige (LSDA)'''

Če endonukleaza zavrže eno verigo tarče DNA, nastane primer za polimerazo, ki sproži sintezo. Med polimerizacijo se spodnji del verige premakne v enoverižno obliko, obenem pa se regenerira tudi nikirno mesto. Kombinirano neprekinjeno ponavljajoče se delovanje nikinga s pomočjo endonukleaze in sinteza izpodrivanja verige s polimerazo povzroči linearno ojačanje ene verige molekule DNA.
V reakciji ojačanja z linearnim premikom verige (LSDA) nikaza naredi enostranski rez v dvoverižnem izdelku RPA 4. Nato polimeraza, ki izpodriva verigo, začne podaljšati 3 'konec DNA na mestu reza in sprosti zaporedje GQ iz produkta RPA.

'''GQ-katalizirana oksidacija'''

V reakciji oksidacije zaporedje enoverižne DNA tvori strukturo gvanin-kvadrupleks (GQ), stabilizirano s kalijevimi ioni in heminom. Ta struktura deluje posnemajoče peroksidazo; DNAcim lahko oksidira 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) v prisotnosti vodikovega peroksida (H2O2), da povzroči spremembo barve.

== '''Hardware''' ==

Zasnova prototipa je bila sestavljena iz 3x3 reakcij, ki so omogočale naknadno ojačanje in zaznavanje (1) testnega vzorca, (2) negativne kontrole in (3) pozitivne kontrole. Te reakcije so potekale v majhnih vdolbinicah s prostornino 20 µL za RPA, 10 µL za LSDA in 100 µL za barvno reakcijo. Reakcijske jamice so zaprte v svetlobno neprepustni škatli, da se prepreči kontaminacija reagentov in zaščiti svetlobno občutljiv substrat barvne reakcije (TMB) 1 pred razgradnjo. Prototip lahko uporabimo tako, da testni vzorec dodamo v jamico prve reakcije (RPA), čemur sledita dva cikla inkubacije in prenos v naslednjo reakcijo, dokler zadnja reakcija ne privede do rezultata kolorimetričnega testa. Skozi okno na vrhu lahko s prostim očesom opazimo spremembo barve. Skupni reakcijski čas je bil 70 minut, od tega 20 minut za prvo reakcijo (RPA), 40 minut za drugo reakcijo (LSDA) in 10 minut za barvno reakcijo.
V sedanji zasnovi so domnevali, da je mogoče RPA in LSDA združiti v reakcijo z enim loncem. Njihov prototip naj bi imel dve glavni reakcijski komori, en dovod vzorca in dve komori za vmesno shranjevanje. Obe vmesni shrambi bosta povezani tudi z dvema dodatnima reakcijskima komorama, da se bosta lahko nastavili za pozitivno reakcijo nadzora.

== '''Rezultati''' ==

DTT, ki je bil neizogibno prisoten v reakcijskih mešanicah RPA in LSDA, je bil opredeljen kot glavno reducirno sredstvo, ki je preprečevalo nastanek barv med naknadnimi reakcijami oksidacije TMB.
Dodatni zapletenosti smo se izognili z izvajanjem sheme redčenja, ki omejuje koncentracijo DTT v končni reakciji oksidacije.
Čeprav so integrirali tri reakcije, je tehnika predstavila pomembne lažno pozitivne signale v odsotnosti ciljne sekvence.
Dodatek 2,5% DMSO v reakciji RPA je učinkovito zmanjšal pojav lažno pozitivnih signalov.
Predvideni stroški
Stroški reagenta so znašali 1,45 USD na reakcijo, od tega 1,30 USD za reakcijo RPA, 15 centov za reakcijo LSDA in 0,05 centa za barvno reakcijo.
Stroški za endonukleazo so se že zmanjšali 40-krat z zmanjšanjem koncentracije encima in reakcijskega volumna LSDA.
Prihodnje delo se lahko osredotoči na vključitev prvih dveh reakcij (RPA in LSDA) v reakcijo z enim loncem, kar bi zmanjšalo količino uporabljenega reagenta in skrajšalo dodaten čas za test.Parts

== '''Parts''' ==

Sekvence treh DNAzyme delov.

Part:BBa_K1614007 http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614007

Part:BBa_K3343001 http://parts.igem.org/Part:BBa_K3343001

Part:BBa_K3343000 http://parts.igem.org/Part:BBa_K3343000

== '''Zaključek''' ==

Kljub potrebi po nadaljnji optimizaciji je predstavljena metoda zaznavanja zaporedja lahko hitro diagnostično orodje. Zaznavanje, ki temelji na RPA, mu omogoča, da ga lahko preusmeri na druga zaporedja DNA s preprostim spreminjanjem začetnikov, podobno kot pri razvoju testov na osnovi PCR. To omogoča hitro prilagajanje metode za ciljanje na novo nastajajoče bolezni.
Predstavljena shema zaznavanja zaporedja je predstavila obetavno jakost kot hitro diagnostično orodje na mestu oskrbe, ki lahko prispeva k prihodnjim poskusom diagnoze, spremljanja in omejevanja širjenja nalezljive bolezni.

== '''Viri''' ==

1. Brink, M. E. van den et al. “Rapidemic, a versatile and label-free DNAzyme-based platform for visual nucleic acid detection.” bioRxiv (2020): n. pag.

2. Zanoli, L. M. & Spoto, G. Isothermal amplification methods for the detection of nucleic acids in microfluidic devices. Biosensors 3, 18–43 (2013).

3. Joneja, A. & Huang, X. Linear nicking endonuclease-mediated strand-displacement DNA amplification. Anal. Biochem. 414, 58–69 (2011).

4. Li, W. et al. Insight into G-quadruplex-hemin DNAzyme/RNAzyme: adjacent adenine as the intramolecular species for remarkable enhancement of enzymatic activity. Nucleic Acids Res. 44, 7373–7384 (2016).

5. Peeling, R. W., Murtagh, M. & Olliaro, P. L. Epidemic preparedness: why is there a need to accelerate the development of diagnostics? The Lancet Infectious Diseases 19, e172–e178 (2019).

6. Hasnain, S. et al. Climate change and infectious diseases – Impact of global warming and climate change on infectious diseases: Myth or reality?. International Journal of Medical Microbiology. 302(1), 1-3 (2012).

7. Alba S. The unemployment impacts of COVID-19: lessons from the Great Recession [Internet]. Brookings. 2020 [cited 7 October 2020]. Available from: https://www.brookings.edu/blog/up-front/2020/04/15/the-unemployment-impacts-of-covid-19-lessons-from-the-great-recession/

Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe

2021-04-25T00:07:46Z

Mirsad93: /* Projekt Rapidemic */

Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe

2021-04-25T00:07:08Z

Mirsad93: /* Projekt Rapidemic */

Projekt Rapidemic je projekt šudentov Univerze v Leidnu, Nizozemska. Ideja za projekt je bila ustvariti hitar diagnostični test za detekcijo novih patogenov.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Leiden

Avtor povzetka: Mirsad Mešić

== '''Uvod''' ==

Na začetku leta 2020 je Svetovna zdravstvena organizacija (WHO) le nekaj mesecev po odkritju koronarno virusne bolezni 2019 (COVID-19) le-to razglasila za pandemijo. Nadzor nad boleznijo bi lahko ponovno pridobili z zmanjšanim številom interakcij: socialna distanca, zapiranje in sledenje stikom.
To ni samo prekinilo vsakdanjega življenja, ampak v nekaterih primerih ljudem onemogočilo pridobivanje zaslužka za preživljanje družine.
Izolacija prebivalstva zaradi svoje resnosti ni dolgoročna rešitev
Ta pandemija je pokazala pomembnost preskusne zmogljivosti, saj je izolacija okuženih posameznikov ključnega pomena za omejevanje širjenja bolezni med prebivalstvom. Omejena zmogljivost testiranja lahko povzroči premajhno diagnozo okuženih posameznikov, kar ustvari netočno oceno dejanskih okužb med izbruhom. To ogroža nadzor bolezni in lahko poglobi krivuljo.
Dokler ni na voljo učinkovito cepivo ali zdravljenje, je edina rešitev testiranje.
Krčenje gozdov hitro poveča stik med ljudmi in živalmi, kar ima za posledico lažji prenos zoonotskih patogenov.
Globalno segrevanje vpliva na številčnost in razširjenost prenašalcev bolezni, ki so posledica spremenjenih okoljskih razmer.

== '''Projekt Rapidemic''' ==

Trenutni testi se niso izkazali za zadostne za obvladovanje izbruha. Obstajajo tri glavne kategorije diagnostičnih testov: testi ojačanja nukleinske kisline (PCR), testi na osnovi antigena in testi na protitelesa. Ti testi imajo svoje prednosti in slabosti. Velika pomanjkljivost preskusa pomnoževanja nukleinske kisline PCR so drage zahteve: termocikli, laboratoriji in usposobljeni operaterji. Po drugi strani se testi na antigenih razvijajo dolgo, medtem ko je hiter diagnostični odziv ključnega pomena. Tretjič, testov na protitelesa ni mogoče uporabiti v zgodnjih fazah okužbe, kar pomeni, da je mogoče doseči negativen rezultat, čeprav bi bila oseba že kužna.
Cilj projekta je bil oblikovati test, ki je laboratorijsko neodvisen, hitro zagotavlja rezultate in ga je mogoče enostavno prilagoditi za testiranje na kakršen koli nov patogen.
Metoda zaznavanja nukleinske kisline je sestavljena iz treh reakcij:
Ojačanje rekombinazne polimeraze (RPA), linearno ojačanje premika verige (LSDA) in katalitična oksidacija z gvanin-kvadrupleksom (GQ).
Za večino poskusov RPA je bila kot tarča pomnoževanja uporabljena izolirana genomska DNA ''Saccharomyces cerevisiae''.
Prav tako se reakcija izvaja na sintetičnih predlogah, pridobljenih iz: ''Bacillus subtilis'', ''Plasmodium falciparum'', ''Mycobacterium sp.'' in gripa A H1N1.

'''Rekombinazna amplifikacija polimeraze (RPA)'''

Ojačevanje rekombinazne polimeraze (RPA) je enocevna, izotermična alternativa verižni reakciji s polimerazo (PCR). Ker je izotermičen, lahko RPA uporablja veliko preprostejšo opremo kot PCR, za kar je potreben termični cikel. Najboljše delovanje pri temperaturah 37–42 ° C. Zaradi tega je RPA odličen kandidat za razvoj poceni, hitrih molekularnih testov na mestu oskrbe. Proces RPA uporablja tri jedrne encime - rekombinazo, enojno vezavni protein, ki veže DNA (SSB), in polimerazo, ki izpodriva verigo. Rekombinaze so sposobne seznaniti oligonukleotidne prajmere s homolognim zaporedjem v dupleksni DNA. SSB se veže na izpodrinjene verige DNK in prepreči, da bi se primerki premaknili. Končno, veriga, ki izpodriva polimerazo, začne sintezo DNA, kjer se je primer primerjal na ciljno DNA.
Primarni pari, uporabljeni v tem poskusu, so bili zasnovani tako, da ciljajo na zaporedje 191 bp iz genoma Saccharomyces cerevisiae.
Reverzni primerji imajo previs ~ 27 nukleotidov, ki vsebuje reverzno komplementarno zaporedje mesta prepoznavanja za nicking endonukleazo, kratek distančnik (manj kot 10 bp), in zaporedje, obratno komplementarno DNAzymu.

'''Ojačevanje linearnega premika verige (LSDA)'''

Če endonukleaza zavrže eno verigo tarče DNA, nastane primer za polimerazo, ki sproži sintezo. Med polimerizacijo se spodnji del verige premakne v enoverižno obliko, obenem pa se regenerira tudi nikirno mesto. Kombinirano neprekinjeno ponavljajoče se delovanje nikinga s pomočjo endonukleaze in sinteza izpodrivanja verige s polimerazo povzroči linearno ojačanje ene verige molekule DNA.
V reakciji ojačanja z linearnim premikom verige (LSDA) nikaza naredi enostranski rez v dvoverižnem izdelku RPA 4. Nato polimeraza, ki izpodriva verigo, začne podaljšati 3 'konec DNA na mestu reza in sprosti zaporedje GQ iz produkta RPA.

'''GQ-katalizirana oksidacija'''

V reakciji oksidacije zaporedje enoverižne DNA tvori strukturo gvanin-kvadrupleks (GQ), stabilizirano s kalijevimi ioni in heminom. Ta struktura deluje posnemajoče peroksidazo; DNAcim lahko oksidira 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) v prisotnosti vodikovega peroksida (H2O2), da povzroči spremembo barve.

== '''Hardware''' ==

Zasnova prototipa je bila sestavljena iz 3x3 reakcij, ki so omogočale naknadno ojačanje in zaznavanje (1) testnega vzorca, (2) negativne kontrole in (3) pozitivne kontrole. Te reakcije so potekale v majhnih vdolbinicah s prostornino 20 µL za RPA, 10 µL za LSDA in 100 µL za barvno reakcijo. Reakcijske jamice so zaprte v svetlobno neprepustni škatli, da se prepreči kontaminacija reagentov in zaščiti svetlobno občutljiv substrat barvne reakcije (TMB) 1 pred razgradnjo. Prototip lahko uporabimo tako, da testni vzorec dodamo v jamico prve reakcije (RPA), čemur sledita dva cikla inkubacije in prenos v naslednjo reakcijo, dokler zadnja reakcija ne privede do rezultata kolorimetričnega testa. Skozi okno na vrhu lahko s prostim očesom opazimo spremembo barve. Skupni reakcijski čas je bil 70 minut, od tega 20 minut za prvo reakcijo (RPA), 40 minut za drugo reakcijo (LSDA) in 10 minut za barvno reakcijo.
V sedanji zasnovi so domnevali, da je mogoče RPA in LSDA združiti v reakcijo z enim loncem. Njihov prototip naj bi imel dve glavni reakcijski komori, en dovod vzorca in dve komori za vmesno shranjevanje. Obe vmesni shrambi bosta povezani tudi z dvema dodatnima reakcijskima komorama, da se bosta lahko nastavili za pozitivno reakcijo nadzora.

== '''Rezultati''' ==

DTT, ki je bil neizogibno prisoten v reakcijskih mešanicah RPA in LSDA, je bil opredeljen kot glavno reducirno sredstvo, ki je preprečevalo nastanek barv med naknadnimi reakcijami oksidacije TMB.
Dodatni zapletenosti smo se izognili z izvajanjem sheme redčenja, ki omejuje koncentracijo DTT v končni reakciji oksidacije.
Čeprav so integrirali tri reakcije, je tehnika predstavila pomembne lažno pozitivne signale v odsotnosti ciljne sekvence.
Dodatek 2,5% DMSO v reakciji RPA je učinkovito zmanjšal pojav lažno pozitivnih signalov.
Predvideni stroški
Stroški reagenta so znašali 1,45 USD na reakcijo, od tega 1,30 USD za reakcijo RPA, 15 centov za reakcijo LSDA in 0,05 centa za barvno reakcijo.
Stroški za endonukleazo so se že zmanjšali 40-krat z zmanjšanjem koncentracije encima in reakcijskega volumna LSDA.
Prihodnje delo se lahko osredotoči na vključitev prvih dveh reakcij (RPA in LSDA) v reakcijo z enim loncem, kar bi zmanjšalo količino uporabljenega reagenta in skrajšalo dodaten čas za test.Parts

== '''Parts''' ==

Sekvence treh DNAzyme delov.

Part:BBa_K1614007 http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614007

Part:BBa_K3343001 http://parts.igem.org/Part:BBa_K3343001

Part:BBa_K3343000 http://parts.igem.org/Part:BBa_K3343000

== '''Zaključek''' ==

Kljub potrebi po nadaljnji optimizaciji je predstavljena metoda zaznavanja zaporedja lahko hitro diagnostično orodje. Zaznavanje, ki temelji na RPA, mu omogoča, da ga lahko preusmeri na druga zaporedja DNA s preprostim spreminjanjem začetnikov, podobno kot pri razvoju testov na osnovi PCR. To omogoča hitro prilagajanje metode za ciljanje na novo nastajajoče bolezni.
Predstavljena shema zaznavanja zaporedja je predstavila obetavno jakost kot hitro diagnostično orodje na mestu oskrbe, ki lahko prispeva k prihodnjim poskusom diagnoze, spremljanja in omejevanja širjenja nalezljive bolezni.

== '''Viri''' ==

1. Brink, M. E. van den et al. “Rapidemic, a versatile and label-free DNAzyme-based platform for visual nucleic acid detection.” bioRxiv (2020): n. pag.

2. Zanoli, L. M. & Spoto, G. Isothermal amplification methods for the detection of nucleic acids in microfluidic devices. Biosensors 3, 18–43 (2013).

3. Joneja, A. & Huang, X. Linear nicking endonuclease-mediated strand-displacement DNA amplification. Anal. Biochem. 414, 58–69 (2011).

4. Li, W. et al. Insight into G-quadruplex-hemin DNAzyme/RNAzyme: adjacent adenine as the intramolecular species for remarkable enhancement of enzymatic activity. Nucleic Acids Res. 44, 7373–7384 (2016).

5. Peeling, R. W., Murtagh, M. & Olliaro, P. L. Epidemic preparedness: why is there a need to accelerate the development of diagnostics? The Lancet Infectious Diseases 19, e172–e178 (2019).

6. Hasnain, S. et al. Climate change and infectious diseases – Impact of global warming and climate change on infectious diseases: Myth or reality?. International Journal of Medical Microbiology. 302(1), 1-3 (2012).

7. Alba S. The unemployment impacts of COVID-19: lessons from the Great Recession [Internet]. Brookings. 2020 [cited 7 October 2020]. Available from: https://www.brookings.edu/blog/up-front/2020/04/15/the-unemployment-impacts-of-covid-19-lessons-from-the-great-recession/

Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe

2021-04-25T00:03:06Z

Mirsad93:

Projekt Rapidemic je projekt šudentov Univerze v Leidnu, Nizozemska. Ideja za projekt je bila ustvariti hitar diagnostični test za detekcijo novih patogenov.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Leiden

Avtor povzetka: Mirsad Mešić

== '''Uvod''' ==

Na začetku leta 2020 je Svetovna zdravstvena organizacija (WHO) le nekaj mesecev po odkritju koronarno virusne bolezni 2019 (COVID-19) le-to razglasila za pandemijo. Nadzor nad boleznijo bi lahko ponovno pridobili z zmanjšanim številom interakcij: socialna distanca, zapiranje in sledenje stikom.
To ni samo prekinilo vsakdanjega življenja, ampak v nekaterih primerih ljudem onemogočilo pridobivanje zaslužka za preživljanje družine.
Izolacija prebivalstva zaradi svoje resnosti ni dolgoročna rešitev
Ta pandemija je pokazala pomembnost preskusne zmogljivosti, saj je izolacija okuženih posameznikov ključnega pomena za omejevanje širjenja bolezni med prebivalstvom. Omejena zmogljivost testiranja lahko povzroči premajhno diagnozo okuženih posameznikov, kar ustvari netočno oceno dejanskih okužb med izbruhom. To ogroža nadzor bolezni in lahko poglobi krivuljo.
Dokler ni na voljo učinkovito cepivo ali zdravljenje, je edina rešitev testiranje.
Krčenje gozdov hitro poveča stik med ljudmi in živalmi, kar ima za posledico lažji prenos zoonotskih patogenov.
Globalno segrevanje vpliva na številčnost in razširjenost prenašalcev bolezni, ki so posledica spremenjenih okoljskih razmer.

== '''Projekt Rapidemic''' ==

Trenutni testi se niso izkazali za zadostne za obvladovanje izbruha. Obstajajo tri glavne kategorije diagnostičnih testov: testi ojačanja nukleinske kisline (PCR), testi na osnovi antigena in testi na protitelesa. Ti testi imajo svoje prednosti in slabosti. Velika pomanjkljivost preskusa pomnoževanja nukleinske kisline PCR so drage zahteve: termocikli, laboratoriji in usposobljeni operaterji. Po drugi strani se testi na antigenih razvijajo dolgo, medtem ko je hiter diagnostični odziv ključnega pomena. Tretjič, testov na protitelesa ni mogoče uporabiti v zgodnjih fazah okužbe, kar pomeni, da je mogoče doseči negativen rezultat, čeprav bi bila oseba že kužna.
Cilj projekta je bil oblikovati test, ki je laboratorijsko neodvisen, hitro zagotavlja rezultate in ga je mogoče enostavno prilagoditi za testiranje na kakršen koli nov patogen.
Metoda zaznavanja nukleinske kisline je sestavljena iz treh reakcij:
Ojačanje rekombinazne polimeraze (RPA), linearno ojačanje premika verige (LSDA) in katalitična oksidacija z gvanin-kvadrupleksom (GQ).
Za večino poskusov RPA je bila kot tarča pomnoževanja uporabljena izolirana genomska DNA Saccharomyces cerevisiae.
Prav tako se reakcija izvaja na sintetičnih predlogah, pridobljenih iz: Bacillus subtilis, Plasmodium falciparum, Mycobacterium sp. in gripa A H1N1.

'''Rekombinazna amplifikacija polimeraze (RPA)'''

Ojačevanje rekombinazne polimeraze (RPA) je enocevna, izotermična alternativa verižni reakciji s polimerazo (PCR). Ker je izotermičen, lahko RPA uporablja veliko preprostejšo opremo kot PCR, za kar je potreben termični cikel. Najboljše delovanje pri temperaturah 37–42 ° C. Zaradi tega je RPA odličen kandidat za razvoj poceni, hitrih molekularnih testov na mestu oskrbe. Proces RPA uporablja tri jedrne encime - rekombinazo, enojno vezavni protein, ki veže DNA (SSB), in polimerazo, ki izpodriva verigo. Rekombinaze so sposobne seznaniti oligonukleotidne prajmere s homolognim zaporedjem v dupleksni DNA. SSB se veže na izpodrinjene verige DNK in prepreči, da bi se primerki premaknili. Končno, veriga, ki izpodriva polimerazo, začne sintezo DNA, kjer se je primer primerjal na ciljno DNA.
Primarni pari, uporabljeni v tem poskusu, so bili zasnovani tako, da ciljajo na zaporedje 191 bp iz genoma Saccharomyces cerevisiae.
Reverzni primerji imajo previs ~ 27 nukleotidov, ki vsebuje reverzno komplementarno zaporedje mesta prepoznavanja za nicking endonukleazo, kratek distančnik (manj kot 10 bp), in zaporedje, obratno komplementarno DNAzymu.

'''Ojačevanje linearnega premika verige (LSDA)'''

Če endonukleaza zavrže eno verigo tarče DNA, nastane primer za polimerazo, ki sproži sintezo. Med polimerizacijo se spodnji del verige premakne v enoverižno obliko, obenem pa se regenerira tudi nikirno mesto. Kombinirano neprekinjeno ponavljajoče se delovanje nikinga s pomočjo endonukleaze in sinteza izpodrivanja verige s polimerazo povzroči linearno ojačanje ene verige molekule DNA.
V reakciji ojačanja z linearnim premikom verige (LSDA) nikaza naredi enostranski rez v dvoverižnem izdelku RPA 4. Nato polimeraza, ki izpodriva verigo, začne podaljšati 3 'konec DNA na mestu reza in sprosti zaporedje GQ iz produkta RPA.

'''GQ-katalizirana oksidacija'''

V reakciji oksidacije zaporedje enoverižne DNA tvori strukturo gvanin-kvadrupleks (GQ), stabilizirano s kalijevimi ioni in heminom. Ta struktura deluje posnemajoče peroksidazo; DNAcim lahko oksidira 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) v prisotnosti vodikovega peroksida (H2O2), da povzroči spremembo barve.

== '''Hardware''' ==

Zasnova prototipa je bila sestavljena iz 3x3 reakcij, ki so omogočale naknadno ojačanje in zaznavanje (1) testnega vzorca, (2) negativne kontrole in (3) pozitivne kontrole. Te reakcije so potekale v majhnih vdolbinicah s prostornino 20 µL za RPA, 10 µL za LSDA in 100 µL za barvno reakcijo. Reakcijske jamice so zaprte v svetlobno neprepustni škatli, da se prepreči kontaminacija reagentov in zaščiti svetlobno občutljiv substrat barvne reakcije (TMB) 1 pred razgradnjo. Prototip lahko uporabimo tako, da testni vzorec dodamo v jamico prve reakcije (RPA), čemur sledita dva cikla inkubacije in prenos v naslednjo reakcijo, dokler zadnja reakcija ne privede do rezultata kolorimetričnega testa. Skozi okno na vrhu lahko s prostim očesom opazimo spremembo barve. Skupni reakcijski čas je bil 70 minut, od tega 20 minut za prvo reakcijo (RPA), 40 minut za drugo reakcijo (LSDA) in 10 minut za barvno reakcijo.
V sedanji zasnovi so domnevali, da je mogoče RPA in LSDA združiti v reakcijo z enim loncem. Njihov prototip naj bi imel dve glavni reakcijski komori, en dovod vzorca in dve komori za vmesno shranjevanje. Obe vmesni shrambi bosta povezani tudi z dvema dodatnima reakcijskima komorama, da se bosta lahko nastavili za pozitivno reakcijo nadzora.

== '''Rezultati''' ==

DTT, ki je bil neizogibno prisoten v reakcijskih mešanicah RPA in LSDA, je bil opredeljen kot glavno reducirno sredstvo, ki je preprečevalo nastanek barv med naknadnimi reakcijami oksidacije TMB.
Dodatni zapletenosti smo se izognili z izvajanjem sheme redčenja, ki omejuje koncentracijo DTT v končni reakciji oksidacije.
Čeprav so integrirali tri reakcije, je tehnika predstavila pomembne lažno pozitivne signale v odsotnosti ciljne sekvence.
Dodatek 2,5% DMSO v reakciji RPA je učinkovito zmanjšal pojav lažno pozitivnih signalov.
Predvideni stroški
Stroški reagenta so znašali 1,45 USD na reakcijo, od tega 1,30 USD za reakcijo RPA, 15 centov za reakcijo LSDA in 0,05 centa za barvno reakcijo.
Stroški za endonukleazo so se že zmanjšali 40-krat z zmanjšanjem koncentracije encima in reakcijskega volumna LSDA.
Prihodnje delo se lahko osredotoči na vključitev prvih dveh reakcij (RPA in LSDA) v reakcijo z enim loncem, kar bi zmanjšalo količino uporabljenega reagenta in skrajšalo dodaten čas za test.Parts

== '''Parts''' ==

Sekvence treh DNAzyme delov.

Part:BBa_K1614007 http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614007

Part:BBa_K3343001 http://parts.igem.org/Part:BBa_K3343001

Part:BBa_K3343000 http://parts.igem.org/Part:BBa_K3343000

== '''Zaključek''' ==

Kljub potrebi po nadaljnji optimizaciji je predstavljena metoda zaznavanja zaporedja lahko hitro diagnostično orodje. Zaznavanje, ki temelji na RPA, mu omogoča, da ga lahko preusmeri na druga zaporedja DNA s preprostim spreminjanjem začetnikov, podobno kot pri razvoju testov na osnovi PCR. To omogoča hitro prilagajanje metode za ciljanje na novo nastajajoče bolezni.
Predstavljena shema zaznavanja zaporedja je predstavila obetavno jakost kot hitro diagnostično orodje na mestu oskrbe, ki lahko prispeva k prihodnjim poskusom diagnoze, spremljanja in omejevanja širjenja nalezljive bolezni.

== '''Viri''' ==

1. Brink, M. E. van den et al. “Rapidemic, a versatile and label-free DNAzyme-based platform for visual nucleic acid detection.” bioRxiv (2020): n. pag.

2. Zanoli, L. M. & Spoto, G. Isothermal amplification methods for the detection of nucleic acids in microfluidic devices. Biosensors 3, 18–43 (2013).

3. Joneja, A. & Huang, X. Linear nicking endonuclease-mediated strand-displacement DNA amplification. Anal. Biochem. 414, 58–69 (2011).

4. Li, W. et al. Insight into G-quadruplex-hemin DNAzyme/RNAzyme: adjacent adenine as the intramolecular species for remarkable enhancement of enzymatic activity. Nucleic Acids Res. 44, 7373–7384 (2016).

5. Peeling, R. W., Murtagh, M. & Olliaro, P. L. Epidemic preparedness: why is there a need to accelerate the development of diagnostics? The Lancet Infectious Diseases 19, e172–e178 (2019).

6. Hasnain, S. et al. Climate change and infectious diseases – Impact of global warming and climate change on infectious diseases: Myth or reality?. International Journal of Medical Microbiology. 302(1), 1-3 (2012).

7. Alba S. The unemployment impacts of COVID-19: lessons from the Great Recession [Internet]. Brookings. 2020 [cited 7 October 2020]. Available from: https://www.brookings.edu/blog/up-front/2020/04/15/the-unemployment-impacts-of-covid-19-lessons-from-the-great-recession/

Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe

2021-04-25T00:01:28Z

Mirsad93: /* Viri */

Projekt RAPIDEMICS je projekt šudentov Univerze v Leidnu, Nizozemska. Ideja za projekt je bila ustvariti hitar diagnostični test za detekcijo novih patogenov.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Leiden

Avtor povzetka: Mirsad Mešić

== '''Uvod''' ==

Na začetku leta 2020 je Svetovna zdravstvena organizacija (WHO) le nekaj mesecev po odkritju koronarno virusne bolezni 2019 (COVID-19) le-to razglasila za pandemijo. Nadzor nad boleznijo bi lahko ponovno pridobili z zmanjšanim številom interakcij: socialna distanca, zapiranje in sledenje stikom.
To ni samo prekinilo vsakdanjega življenja, ampak v nekaterih primerih ljudem onemogočilo pridobivanje zaslužka za preživljanje družine.
Izolacija prebivalstva zaradi svoje resnosti ni dolgoročna rešitev
Ta pandemija je pokazala pomembnost preskusne zmogljivosti, saj je izolacija okuženih posameznikov ključnega pomena za omejevanje širjenja bolezni med prebivalstvom. Omejena zmogljivost testiranja lahko povzroči premajhno diagnozo okuženih posameznikov, kar ustvari netočno oceno dejanskih okužb med izbruhom. To ogroža nadzor bolezni in lahko poglobi krivuljo.
Dokler ni na voljo učinkovito cepivo ali zdravljenje, je edina rešitev testiranje.
Krčenje gozdov hitro poveča stik med ljudmi in živalmi, kar ima za posledico lažji prenos zoonotskih patogenov.
Globalno segrevanje vpliva na številčnost in razširjenost prenašalcev bolezni, ki so posledica spremenjenih okoljskih razmer.

== '''Projekt RAPIDEMICS''' ==

Trenutni testi se niso izkazali za zadostne za obvladovanje izbruha. Obstajajo tri glavne kategorije diagnostičnih testov: testi ojačanja nukleinske kisline (PCR), testi na osnovi antigena in testi na protitelesa. Ti testi imajo svoje prednosti in slabosti. Velika pomanjkljivost preskusa pomnoževanja nukleinske kisline PCR so drage zahteve: termocikli, laboratoriji in usposobljeni operaterji. Po drugi strani se testi na antigenih razvijajo dolgo, medtem ko je hiter diagnostični odziv ključnega pomena. Tretjič, testov na protitelesa ni mogoče uporabiti v zgodnjih fazah okužbe, kar pomeni, da je mogoče doseči negativen rezultat, čeprav bi bila oseba že kužna.
Cilj projekta je bil oblikovati test, ki je laboratorijsko neodvisen, hitro zagotavlja rezultate in ga je mogoče enostavno prilagoditi za testiranje na kakršen koli nov patogen.
Metoda zaznavanja nukleinske kisline je sestavljena iz treh reakcij:
Ojačanje rekombinazne polimeraze (RPA), linearno ojačanje premika verige (LSDA) in katalitična oksidacija z gvanin-kvadrupleksom (GQ).
Za večino poskusov RPA je bila kot tarča pomnoževanja uporabljena izolirana genomska DNA Saccharomyces cerevisiae.
Prav tako se reakcija izvaja na sintetičnih predlogah, pridobljenih iz: Bacillus subtilis, Plasmodium falciparum, Mycobacterium sp. in gripa A H1N1.

'''Rekombinazna amplifikacija polimeraze (RPA)'''

Ojačevanje rekombinazne polimeraze (RPA) je enocevna, izotermična alternativa verižni reakciji s polimerazo (PCR). Ker je izotermičen, lahko RPA uporablja veliko preprostejšo opremo kot PCR, za kar je potreben termični cikel. Najboljše delovanje pri temperaturah 37–42 ° C. Zaradi tega je RPA odličen kandidat za razvoj poceni, hitrih molekularnih testov na mestu oskrbe. Proces RPA uporablja tri jedrne encime - rekombinazo, enojno vezavni protein, ki veže DNA (SSB), in polimerazo, ki izpodriva verigo. Rekombinaze so sposobne seznaniti oligonukleotidne prajmere s homolognim zaporedjem v dupleksni DNA. SSB se veže na izpodrinjene verige DNK in prepreči, da bi se primerki premaknili. Končno, veriga, ki izpodriva polimerazo, začne sintezo DNA, kjer se je primer primerjal na ciljno DNA.
Primarni pari, uporabljeni v tem poskusu, so bili zasnovani tako, da ciljajo na zaporedje 191 bp iz genoma Saccharomyces cerevisiae.
Reverzni primerji imajo previs ~ 27 nukleotidov, ki vsebuje reverzno komplementarno zaporedje mesta prepoznavanja za nicking endonukleazo, kratek distančnik (manj kot 10 bp), in zaporedje, obratno komplementarno DNAzymu.

'''Ojačevanje linearnega premika verige (LSDA)'''

Če endonukleaza zavrže eno verigo tarče DNA, nastane primer za polimerazo, ki sproži sintezo. Med polimerizacijo se spodnji del verige premakne v enoverižno obliko, obenem pa se regenerira tudi nikirno mesto. Kombinirano neprekinjeno ponavljajoče se delovanje nikinga s pomočjo endonukleaze in sinteza izpodrivanja verige s polimerazo povzroči linearno ojačanje ene verige molekule DNA.
V reakciji ojačanja z linearnim premikom verige (LSDA) nikaza naredi enostranski rez v dvoverižnem izdelku RPA 4. Nato polimeraza, ki izpodriva verigo, začne podaljšati 3 'konec DNA na mestu reza in sprosti zaporedje GQ iz produkta RPA.

'''GQ-katalizirana oksidacija'''

V reakciji oksidacije zaporedje enoverižne DNA tvori strukturo gvanin-kvadrupleks (GQ), stabilizirano s kalijevimi ioni in heminom. Ta struktura deluje posnemajoče peroksidazo; DNAcim lahko oksidira 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) v prisotnosti vodikovega peroksida (H2O2), da povzroči spremembo barve.

== '''Hardware''' ==

Zasnova prototipa je bila sestavljena iz 3x3 reakcij, ki so omogočale naknadno ojačanje in zaznavanje (1) testnega vzorca, (2) negativne kontrole in (3) pozitivne kontrole. Te reakcije so potekale v majhnih vdolbinicah s prostornino 20 µL za RPA, 10 µL za LSDA in 100 µL za barvno reakcijo. Reakcijske jamice so zaprte v svetlobno neprepustni škatli, da se prepreči kontaminacija reagentov in zaščiti svetlobno občutljiv substrat barvne reakcije (TMB) 1 pred razgradnjo. Prototip lahko uporabimo tako, da testni vzorec dodamo v jamico prve reakcije (RPA), čemur sledita dva cikla inkubacije in prenos v naslednjo reakcijo, dokler zadnja reakcija ne privede do rezultata kolorimetričnega testa. Skozi okno na vrhu lahko s prostim očesom opazimo spremembo barve. Skupni reakcijski čas je bil 70 minut, od tega 20 minut za prvo reakcijo (RPA), 40 minut za drugo reakcijo (LSDA) in 10 minut za barvno reakcijo.
V sedanji zasnovi so domnevali, da je mogoče RPA in LSDA združiti v reakcijo z enim loncem. Njihov prototip naj bi imel dve glavni reakcijski komori, en dovod vzorca in dve komori za vmesno shranjevanje. Obe vmesni shrambi bosta povezani tudi z dvema dodatnima reakcijskima komorama, da se bosta lahko nastavili za pozitivno reakcijo nadzora.

== '''Rezultati''' ==

DTT, ki je bil neizogibno prisoten v reakcijskih mešanicah RPA in LSDA, je bil opredeljen kot glavno reducirno sredstvo, ki je preprečevalo nastanek barv med naknadnimi reakcijami oksidacije TMB.
Dodatni zapletenosti smo se izognili z izvajanjem sheme redčenja, ki omejuje koncentracijo DTT v končni reakciji oksidacije.
Čeprav so integrirali tri reakcije, je tehnika predstavila pomembne lažno pozitivne signale v odsotnosti ciljne sekvence.
Dodatek 2,5% DMSO v reakciji RPA je učinkovito zmanjšal pojav lažno pozitivnih signalov.
Predvideni stroški
Stroški reagenta so znašali 1,45 USD na reakcijo, od tega 1,30 USD za reakcijo RPA, 15 centov za reakcijo LSDA in 0,05 centa za barvno reakcijo.
Stroški za endonukleazo so se že zmanjšali 40-krat z zmanjšanjem koncentracije encima in reakcijskega volumna LSDA.
Prihodnje delo se lahko osredotoči na vključitev prvih dveh reakcij (RPA in LSDA) v reakcijo z enim loncem, kar bi zmanjšalo količino uporabljenega reagenta in skrajšalo dodaten čas za test.Parts

== '''Parts''' ==

Sekvence treh DNAzyme delov.

Part:BBa_K1614007 http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614007

Part:BBa_K3343001 http://parts.igem.org/Part:BBa_K3343001

Part:BBa_K3343000 http://parts.igem.org/Part:BBa_K3343000

== '''Zaključek''' ==

Kljub potrebi po nadaljnji optimizaciji je predstavljena metoda zaznavanja zaporedja lahko hitro diagnostično orodje. Zaznavanje, ki temelji na RPA, mu omogoča, da ga lahko preusmeri na druga zaporedja DNA s preprostim spreminjanjem začetnikov, podobno kot pri razvoju testov na osnovi PCR. To omogoča hitro prilagajanje metode za ciljanje na novo nastajajoče bolezni.
Predstavljena shema zaznavanja zaporedja je predstavila obetavno jakost kot hitro diagnostično orodje na mestu oskrbe, ki lahko prispeva k prihodnjim poskusom diagnoze, spremljanja in omejevanja širjenja nalezljive bolezni.

== '''Viri''' ==

1. Brink, M. E. van den et al. “Rapidemic, a versatile and label-free DNAzyme-based platform for visual nucleic acid detection.” bioRxiv (2020): n. pag.

2. Zanoli, L. M. & Spoto, G. Isothermal amplification methods for the detection of nucleic acids in microfluidic devices. Biosensors 3, 18–43 (2013).

3. Joneja, A. & Huang, X. Linear nicking endonuclease-mediated strand-displacement DNA amplification. Anal. Biochem. 414, 58–69 (2011).

4. Li, W. et al. Insight into G-quadruplex-hemin DNAzyme/RNAzyme: adjacent adenine as the intramolecular species for remarkable enhancement of enzymatic activity. Nucleic Acids Res. 44, 7373–7384 (2016).

5. Peeling, R. W., Murtagh, M. & Olliaro, P. L. Epidemic preparedness: why is there a need to accelerate the development of diagnostics? The Lancet Infectious Diseases 19, e172–e178 (2019).

6. Hasnain, S. et al. Climate change and infectious diseases – Impact of global warming and climate change on infectious diseases: Myth or reality?. International Journal of Medical Microbiology. 302(1), 1-3 (2012).

7. Alba S. The unemployment impacts of COVID-19: lessons from the Great Recession [Internet]. Brookings. 2020 [cited 7 October 2020]. Available from: https://www.brookings.edu/blog/up-front/2020/04/15/the-unemployment-impacts-of-covid-19-lessons-from-the-great-recession/

Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe

2021-04-24T23:59:33Z

Mirsad93:

Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe

2021-04-24T23:43:40Z

Mirsad93: /* Projekt RAPIDEMICS */

Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe

2021-04-24T23:43:21Z

Mirsad93: /* Projekt RAPIDEMICS */

Projekt RAPIDEMICS je projekt šudentov Univerze v Leidnu, Nizozemska. Ideja za projekt je bila ustvariti hitar diagnostični test za detekcijo novih patogenov.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Leiden

Avtor povzetka: Mirsad Mešić

== '''Uvod''' ==

Na začetku leta 2020 je Svetovna zdravstvena organizacija (WHO) le nekaj mesecev po odkritju koronarno virusne bolezni 2019 (COVID-19) le-to razglasila za pandemijo. Nadzor nad boleznijo bi lahko ponovno pridobili z zmanjšanim številom interakcij: socialna distanca, zapiranje in sledenje stikom.
To ni samo prekinilo vsakdanjega življenja, ampak v nekaterih primerih ljudem onemogočilo pridobivanje zaslužka za preživljanje družine.
Izolacija prebivalstva zaradi svoje resnosti ni dolgoročna rešitev
Ta pandemija je pokazala pomembnost preskusne zmogljivosti, saj je izolacija okuženih posameznikov ključnega pomena za omejevanje širjenja bolezni med prebivalstvom. Omejena zmogljivost testiranja lahko povzroči premajhno diagnozo okuženih posameznikov, kar ustvari netočno oceno dejanskih okužb med izbruhom. To ogroža nadzor bolezni in lahko poglobi krivuljo.
Dokler ni na voljo učinkovito cepivo ali zdravljenje, je edina rešitev testiranje.
Krčenje gozdov hitro poveča stik med ljudmi in živalmi, kar ima za posledico lažji prenos zoonotskih patogenov.
Globalno segrevanje vpliva na številčnost in razširjenost prenašalcev bolezni, ki so posledica spremenjenih okoljskih razmer.

== '''Projekt RAPIDEMICS''' ==

Trenutni testi se niso izkazali za zadostne za obvladovanje izbruha. Obstajajo tri glavne kategorije diagnostičnih testov: testi ojačanja nukleinske kisline (PCR), testi na osnovi antigena in testi na protitelesa. Ti testi imajo svoje prednosti in slabosti. Velika pomanjkljivost preskusa pomnoževanja nukleinske kisline PCR so drage zahteve: termocikli, laboratoriji in usposobljeni operaterji. Po drugi strani se testi na antigenih razvijajo dolgo, medtem ko je hiter diagnostični odziv ključnega pomena. Tretjič, testov na protitelesa ni mogoče uporabiti v zgodnjih fazah okužbe, kar pomeni, da je mogoče doseči negativen rezultat, čeprav bi bila oseba že kužna.
Cilj projekta je bil oblikovati test, ki je laboratorijsko neodvisen, hitro zagotavlja rezultate in ga je mogoče enostavno prilagoditi za testiranje na kakršen koli nov patogen.
Metoda zaznavanja nukleinske kisline je sestavljena iz treh reakcij:
Ojačanje rekombinazne polimeraze (RPA), linearno ojačanje premika verige (LSDA) in katalitična oksidacija z gvanin-kvadrupleksom (GQ).
Za večino poskusov RPA je bila kot tarča pomnoževanja uporabljena izolirana genomska DNA Saccharomyces cerevisiae.
Prav tako se reakcija izvaja na sintetičnih predlogah, pridobljenih iz: Bacillus subtilis, Plasmodium falciparum, Mycobacterium sp. in gripa A H1N1.

'''Rekombinazna amplifikacija polimeraze (RPA)'''

Ojačevanje rekombinazne polimeraze (RPA) je enocevna, izotermična alternativa verižni reakciji s polimerazo (PCR). Ker je izotermičen, lahko RPA uporablja veliko preprostejšo opremo kot PCR, za kar je potreben termični cikel. Najboljše delovanje pri temperaturah 37–42 ° C. Zaradi tega je RPA odličen kandidat za razvoj poceni, hitrih molekularnih testov na mestu oskrbe. Proces RPA uporablja tri jedrne encime - rekombinazo, enojno vezavni protein, ki veže DNA (SSB), in polimerazo, ki izpodriva verigo. Rekombinaze so sposobne seznaniti oligonukleotidne prajmere s homolognim zaporedjem v dupleksni DNA. SSB se veže na izpodrinjene verige DNK in prepreči, da bi se primerki premaknili. Končno, veriga, ki izpodriva polimerazo, začne sintezo DNA, kjer se je primer primerjal na ciljno DNA.
Primarni pari, uporabljeni v tem poskusu, so bili zasnovani tako, da ciljajo na zaporedje 191 bp iz genoma Saccharomyces cerevisiae.
Reverzni primerji imajo previs ~ 27 nukleotidov, ki vsebuje reverzno komplementarno zaporedje mesta prepoznavanja za nicking endonukleazo, kratek distančnik (manj kot 10 bp), in zaporedje, obratno komplementarno DNAzymu.

'''Ojačevanje linearnega premika verige (LSDA)'''

Če endonukleaza zavrže eno verigo tarče DNA, nastane primer za polimerazo, ki sproži sintezo. Med polimerizacijo se spodnji del verige premakne v enoverižno obliko, obenem pa se regenerira tudi nikirno mesto. Kombinirano neprekinjeno ponavljajoče se delovanje nikinga s pomočjo endonukleaze in sinteza izpodrivanja verige s polimerazo povzroči linearno ojačanje ene verige molekule DNA.
V reakciji ojačanja z linearnim premikom verige (LSDA) nikaza naredi enostranski rez v dvoverižnem izdelku RPA 4. Nato polimeraza, ki izpodriva verigo, začne podaljšati 3 'konec DNA na mestu reza in sprosti zaporedje GQ iz produkta RPA.

'''GQ-katalizirana oksidacija'''

V reakciji oksidacije zaporedje enoverižne DNA tvori strukturo gvanin-kvadrupleks (GQ), stabilizirano s kalijevimi ioni in heminom (slika 3a). Ta struktura deluje posnemajoče peroksidazo; DNAcim lahko oksidira 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) v prisotnosti vodikovega peroksida (H2O2), da povzroči spremembo barve.

== '''Hardware''' ==

Zasnova prototipa je bila sestavljena iz 3x3 reakcij, ki so omogočale naknadno ojačanje in zaznavanje (1) testnega vzorca, (2) negativne kontrole in (3) pozitivne kontrole. Te reakcije so potekale v majhnih vdolbinicah s prostornino 20 µL za RPA, 10 µL za LSDA in 100 µL za barvno reakcijo. Reakcijske jamice so zaprte v svetlobno neprepustni škatli, da se prepreči kontaminacija reagentov in zaščiti svetlobno občutljiv substrat barvne reakcije (TMB) 1 pred razgradnjo. Prototip lahko uporabimo tako, da testni vzorec dodamo v jamico prve reakcije (RPA), čemur sledita dva cikla inkubacije in prenos v naslednjo reakcijo, dokler zadnja reakcija ne privede do rezultata kolorimetričnega testa. Skozi okno na vrhu lahko s prostim očesom opazimo spremembo barve. Skupni reakcijski čas je bil 70 minut, od tega 20 minut za prvo reakcijo (RPA), 40 minut za drugo reakcijo (LSDA) in 10 minut za barvno reakcijo.
V sedanji zasnovi so domnevali, da je mogoče RPA in LSDA združiti v reakcijo z enim loncem. Njihov prototip naj bi imel dve glavni reakcijski komori, en dovod vzorca in dve komori za vmesno shranjevanje. Obe vmesni shrambi bosta povezani tudi z dvema dodatnima reakcijskima komorama, da se bosta lahko nastavili za pozitivno reakcijo nadzora.

== '''Rezultati''' ==

DTT, ki je bil neizogibno prisoten v reakcijskih mešanicah RPA in LSDA, je bil opredeljen kot glavno reducirno sredstvo, ki je preprečevalo nastanek barv med naknadnimi reakcijami oksidacije TMB.
Dodatni zapletenosti smo se izognili z izvajanjem sheme redčenja, ki omejuje koncentracijo DTT v končni reakciji oksidacije.
Čeprav so integrirali tri reakcije, je tehnika predstavila pomembne lažno pozitivne signale v odsotnosti ciljne sekvence.
Dodatek 2,5% DMSO v reakciji RPA je učinkovito zmanjšal pojav lažno pozitivnih signalov.
Predvideni stroški
Stroški reagenta so znašali 1,45 USD na reakcijo, od tega 1,30 USD za reakcijo RPA, 15 centov za reakcijo LSDA in 0,05 centa za barvno reakcijo.
Stroški za endonukleazo so se že zmanjšali 40-krat z zmanjšanjem koncentracije encima in reakcijskega volumna LSDA.
Prihodnje delo se lahko osredotoči na vključitev prvih dveh reakcij (RPA in LSDA) v reakcijo z enim loncem, kar bi zmanjšalo količino uporabljenega reagenta in skrajšalo dodaten čas za test.Parts

== '''Parts''' ==

Sekvence treh DNAzyme delov.

Part:BBa_K1614007 http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614007

Part:BBa_K3343001 http://parts.igem.org/Part:BBa_K3343001

Part:BBa_K3343000 http://parts.igem.org/Part:BBa_K3343000

== '''Zaključek''' ==

Kljub potrebi po nadaljnji optimizaciji je predstavljena metoda zaznavanja zaporedja lahko hitro diagnostično orodje. Zaznavanje, ki temelji na RPA, mu omogoča, da ga lahko preusmeri na druga zaporedja DNA s preprostim spreminjanjem začetnikov, podobno kot pri razvoju testov na osnovi PCR. To omogoča hitro prilagajanje metode za ciljanje na novo nastajajoče bolezni.
Predstavljena shema zaznavanja zaporedja je predstavila obetavno jakost kot hitro diagnostično orodje na mestu oskrbe, ki lahko prispeva k prihodnjim poskusom diagnoze, spremljanja in omejevanja širjenja nalezljive bolezni.

Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe

2021-04-24T23:42:48Z

Mirsad93: /* Projekt RAPIDEMICS */

Projekt RAPIDEMICS je projekt šudentov Univerze v Leidnu, Nizozemska. Ideja za projekt je bila ustvariti hitar diagnostični test za detekcijo novih patogenov.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Leiden

Avtor povzetka: Mirsad Mešić

== '''Uvod''' ==

Na začetku leta 2020 je Svetovna zdravstvena organizacija (WHO) le nekaj mesecev po odkritju koronarno virusne bolezni 2019 (COVID-19) le-to razglasila za pandemijo. Nadzor nad boleznijo bi lahko ponovno pridobili z zmanjšanim številom interakcij: socialna distanca, zapiranje in sledenje stikom.
To ni samo prekinilo vsakdanjega življenja, ampak v nekaterih primerih ljudem onemogočilo pridobivanje zaslužka za preživljanje družine.
Izolacija prebivalstva zaradi svoje resnosti ni dolgoročna rešitev
Ta pandemija je pokazala pomembnost preskusne zmogljivosti, saj je izolacija okuženih posameznikov ključnega pomena za omejevanje širjenja bolezni med prebivalstvom. Omejena zmogljivost testiranja lahko povzroči premajhno diagnozo okuženih posameznikov, kar ustvari netočno oceno dejanskih okužb med izbruhom. To ogroža nadzor bolezni in lahko poglobi krivuljo.
Dokler ni na voljo učinkovito cepivo ali zdravljenje, je edina rešitev testiranje.
Krčenje gozdov hitro poveča stik med ljudmi in živalmi, kar ima za posledico lažji prenos zoonotskih patogenov.
Globalno segrevanje vpliva na številčnost in razširjenost prenašalcev bolezni, ki so posledica spremenjenih okoljskih razmer.

== '''Projekt RAPIDEMICS''' ==

Trenutni testi se niso izkazali za zadostne za obvladovanje izbruha. Obstajajo tri glavne kategorije diagnostičnih testov: testi ojačanja nukleinske kisline (PCR), testi na osnovi antigena in testi na protitelesa. Ti testi imajo svoje prednosti in slabosti. Velika pomanjkljivost preskusa pomnoževanja nukleinske kisline PCR so drage zahteve: termocikli, laboratoriji in usposobljeni operaterji. Po drugi strani se testi na antigenih razvijajo dolgo, medtem ko je hiter diagnostični odziv ključnega pomena. Tretjič, testov na protitelesa ni mogoče uporabiti v zgodnjih fazah okužbe, kar pomeni, da je mogoče doseči negativen rezultat, čeprav bi bila oseba že kužna.
Cilj projekta je bil oblikovati test, ki je laboratorijsko neodvisen, hitro zagotavlja rezultate in ga je mogoče enostavno prilagoditi za testiranje na kakršen koli nov patogen.
Metoda zaznavanja nukleinske kisline je sestavljena iz treh reakcij:
Ojačanje rekombinazne polimeraze (RPA), linearno ojačanje premika verige (LSDA) in katalitična oksidacija z gvanin-kvadrupleksom (GQ).
Za večino poskusov RPA je bila kot tarča pomnoževanja uporabljena izolirana genomska DNA Saccharomyces cerevisiae.
Prav tako se reakcija izvaja na sintetičnih predlogah, pridobljenih iz: Bacillus subtilis, Plasmodium falciparum, Mycobacterium sp. in gripa A H1N1.

'''Rekombinazna amplifikacija polimeraze (RPA)'''

Ojačevanje rekombinazne polimeraze (RPA) je enocevna, izotermična alternativa verižni reakciji s polimerazo (PCR). Ker je izotermičen, lahko RPA uporablja veliko preprostejšo opremo kot PCR, za kar je potreben termični cikel. Najboljše delovanje pri temperaturah 37–42 ° C. Zaradi tega je RPA odličen kandidat za razvoj poceni, hitrih molekularnih testov na mestu oskrbe. Proces RPA uporablja tri jedrne encime - rekombinazo, enojno vezavni protein, ki veže DNA (SSB), in polimerazo, ki izpodriva verigo. Rekombinaze so sposobne seznaniti oligonukleotidne prajmere s homolognim zaporedjem v dupleksni DNA. SSB se veže na izpodrinjene verige DNK in prepreči, da bi se primerki premaknili. Končno, veriga, ki izpodriva polimerazo, začne sintezo DNA, kjer se je primer primerjal na ciljno DNA.
Primarni pari, uporabljeni v tem poskusu, so bili zasnovani tako, da ciljajo na zaporedje 191 bp iz genoma Saccharomyces cerevisiae.
Reverzni primerji imajo previs ~ 27 nukleotidov, ki vsebuje reverzno komplementarno zaporedje mesta prepoznavanja za nicking endonukleazo, kratek distančnik (manj kot 10 bp), in zaporedje, obratno komplementarno DNAzymu.

'''Ojačevanje linearnega premika verige (LSDA)'''

Če endonukleaza zavrže eno verigo tarče DNA, nastane primer za polimerazo, ki sproži sintezo. Med polimerizacijo se spodnji del verige premakne v enoverižno obliko, obenem pa se regenerira tudi nikirno mesto. Kombinirano neprekinjeno ponavljajoče se delovanje nikinga s pomočjo endonukleaze in sinteza izpodrivanja verige s polimerazo povzroči linearno ojačanje ene verige molekule DNA.
V reakciji ojačanja z linearnim premikom verige (LSDA) nikaza naredi enostranski rez v dvoverižnem izdelku RPA 4. Nato polimeraza, ki izpodriva verigo, začne podaljšati 3 'konec DNA na mestu reza in sprosti zaporedje GQ iz produkta RPA.

'''GQ-katalizirana oksidacija'''

V reakciji oksidacije zaporedje enoverižne DNA tvori strukturo gvanin-kvadrupleks (GQ), stabilizirano s kalijevimi ioni in heminom (slika 3a). Ta struktura deluje posnemajoče peroksidazo; DNAcim lahko oksidira 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) v prisotnosti vodikovega peroksida (H2O2), da povzroči spremembo barve5, 6 (slika 3b).

== '''Hardware''' ==

Zasnova prototipa je bila sestavljena iz 3x3 reakcij, ki so omogočale naknadno ojačanje in zaznavanje (1) testnega vzorca, (2) negativne kontrole in (3) pozitivne kontrole. Te reakcije so potekale v majhnih vdolbinicah s prostornino 20 µL za RPA, 10 µL za LSDA in 100 µL za barvno reakcijo. Reakcijske jamice so zaprte v svetlobno neprepustni škatli, da se prepreči kontaminacija reagentov in zaščiti svetlobno občutljiv substrat barvne reakcije (TMB) 1 pred razgradnjo. Prototip lahko uporabimo tako, da testni vzorec dodamo v jamico prve reakcije (RPA), čemur sledita dva cikla inkubacije in prenos v naslednjo reakcijo, dokler zadnja reakcija ne privede do rezultata kolorimetričnega testa. Skozi okno na vrhu lahko s prostim očesom opazimo spremembo barve. Skupni reakcijski čas je bil 70 minut, od tega 20 minut za prvo reakcijo (RPA), 40 minut za drugo reakcijo (LSDA) in 10 minut za barvno reakcijo.
V sedanji zasnovi so domnevali, da je mogoče RPA in LSDA združiti v reakcijo z enim loncem. Njihov prototip naj bi imel dve glavni reakcijski komori, en dovod vzorca in dve komori za vmesno shranjevanje. Obe vmesni shrambi bosta povezani tudi z dvema dodatnima reakcijskima komorama, da se bosta lahko nastavili za pozitivno reakcijo nadzora.

== '''Rezultati''' ==

DTT, ki je bil neizogibno prisoten v reakcijskih mešanicah RPA in LSDA, je bil opredeljen kot glavno reducirno sredstvo, ki je preprečevalo nastanek barv med naknadnimi reakcijami oksidacije TMB.
Dodatni zapletenosti smo se izognili z izvajanjem sheme redčenja, ki omejuje koncentracijo DTT v končni reakciji oksidacije.
Čeprav so integrirali tri reakcije, je tehnika predstavila pomembne lažno pozitivne signale v odsotnosti ciljne sekvence.
Dodatek 2,5% DMSO v reakciji RPA je učinkovito zmanjšal pojav lažno pozitivnih signalov.
Predvideni stroški
Stroški reagenta so znašali 1,45 USD na reakcijo, od tega 1,30 USD za reakcijo RPA, 15 centov za reakcijo LSDA in 0,05 centa za barvno reakcijo.
Stroški za endonukleazo so se že zmanjšali 40-krat z zmanjšanjem koncentracije encima in reakcijskega volumna LSDA.
Prihodnje delo se lahko osredotoči na vključitev prvih dveh reakcij (RPA in LSDA) v reakcijo z enim loncem, kar bi zmanjšalo količino uporabljenega reagenta in skrajšalo dodaten čas za test.Parts

== '''Parts''' ==

Sekvence treh DNAzyme delov.

Part:BBa_K1614007 http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614007

Part:BBa_K3343001 http://parts.igem.org/Part:BBa_K3343001

Part:BBa_K3343000 http://parts.igem.org/Part:BBa_K3343000

== '''Zaključek''' ==

Kljub potrebi po nadaljnji optimizaciji je predstavljena metoda zaznavanja zaporedja lahko hitro diagnostično orodje. Zaznavanje, ki temelji na RPA, mu omogoča, da ga lahko preusmeri na druga zaporedja DNA s preprostim spreminjanjem začetnikov, podobno kot pri razvoju testov na osnovi PCR. To omogoča hitro prilagajanje metode za ciljanje na novo nastajajoče bolezni.
Predstavljena shema zaznavanja zaporedja je predstavila obetavno jakost kot hitro diagnostično orodje na mestu oskrbe, ki lahko prispeva k prihodnjim poskusom diagnoze, spremljanja in omejevanja širjenja nalezljive bolezni.

Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe

2021-04-24T23:41:36Z

Mirsad93:

Projekt RAPIDEMICS je projekt šudentov Univerze v Leidnu, Nizozemska. Ideja za projekt je bila ustvariti hitar diagnostični test za detekcijo novih patogenov.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Leiden

Avtor povzetka: Mirsad Mešić

== '''Uvod''' ==

Na začetku leta 2020 je Svetovna zdravstvena organizacija (WHO) le nekaj mesecev po odkritju koronarno virusne bolezni 2019 (COVID-19) le-to razglasila za pandemijo. Nadzor nad boleznijo bi lahko ponovno pridobili z zmanjšanim številom interakcij: socialna distanca, zapiranje in sledenje stikom.
To ni samo prekinilo vsakdanjega življenja, ampak v nekaterih primerih ljudem onemogočilo pridobivanje zaslužka za preživljanje družine.
Izolacija prebivalstva zaradi svoje resnosti ni dolgoročna rešitev
Ta pandemija je pokazala pomembnost preskusne zmogljivosti, saj je izolacija okuženih posameznikov ključnega pomena za omejevanje širjenja bolezni med prebivalstvom. Omejena zmogljivost testiranja lahko povzroči premajhno diagnozo okuženih posameznikov, kar ustvari netočno oceno dejanskih okužb med izbruhom. To ogroža nadzor bolezni in lahko poglobi krivuljo.
Dokler ni na voljo učinkovito cepivo ali zdravljenje, je edina rešitev testiranje.
Krčenje gozdov hitro poveča stik med ljudmi in živalmi, kar ima za posledico lažji prenos zoonotskih patogenov.
Globalno segrevanje vpliva na številčnost in razširjenost prenašalcev bolezni, ki so posledica spremenjenih okoljskih razmer.

== '''Projekt RAPIDEMICS''' ==

Trenutni testi se niso izkazali za zadostne za obvladovanje izbruha. Obstajajo tri glavne kategorije diagnostičnih testov: testi ojačanja nukleinske kisline (PCR), testi na osnovi antigena in testi na protitelesa. Ti testi imajo svoje prednosti in slabosti. Velika pomanjkljivost preskusa pomnoževanja nukleinske kisline PCR so drage zahteve: termocikli, laboratoriji in usposobljeni operaterji. Po drugi strani se testi na antigenih razvijajo dolgo, medtem ko je hiter diagnostični odziv ključnega pomena. Tretjič, testov na protitelesa ni mogoče uporabiti v zgodnjih fazah okužbe, kar pomeni, da je mogoče doseči negativen rezultat, čeprav bi bila oseba že kužna.
Cilj projekta je bil oblikovati test, ki je laboratorijsko neodvisen, hitro zagotavlja rezultate in ga je mogoče enostavno prilagoditi za testiranje na kakršen koli nov patogen.
Metoda zaznavanja nukleinske kisline je sestavljena iz treh reakcij:
Ojačanje rekombinazne polimeraze (RPA), linearno ojačanje premika verige (LSDA) in katalitična oksidacija z gvanin-kvadrupleksom (GQ).
Za večino poskusov RPA je bila kot tarča pomnoževanja uporabljena izolirana genomska DNA Saccharomyces cerevisiae.
Prav tako se reakcija izvaja na sintetičnih predlogah, pridobljenih iz: Bacillus subtilis, Plasmodium falciparum, Mycobacterium sp. in gripa A H1N1.

'''Rekombinazna amplifikacija polimeraze (RPA)'''

Ojačevanje rekombinazne polimeraze (RPA) je enocevna, izotermična alternativa verižni reakciji s polimerazo (PCR). Ker je izotermičen, lahko RPA uporablja veliko preprostejšo opremo kot PCR, za kar je potreben termični cikel. Najboljše delovanje pri temperaturah 37–42 ° C. Zaradi tega je RPA odličen kandidat za razvoj poceni, hitrih molekularnih testov na mestu oskrbe. Proces RPA uporablja tri jedrne encime - rekombinazo, enojno vezavni protein, ki veže DNA (SSB), in polimerazo, ki izpodriva verigo. Rekombinaze so sposobne seznaniti oligonukleotidne prajmere s homolognim zaporedjem v dupleksni DNA. SSB se veže na izpodrinjene verige DNK in prepreči, da bi se primerki premaknili. Končno, veriga, ki izpodriva polimerazo, začne sintezo DNA, kjer se je primer primerjal na ciljno DNA.
Primarni pari, uporabljeni v tem poskusu, so bili zasnovani tako, da ciljajo na zaporedje 191 bp iz genoma Saccharomyces cerevisiae.
Reverzni primerji imajo previs ~ 27 nukleotidov, ki vsebuje reverzno komplementarno zaporedje mesta prepoznavanja za nicking endonukleazo, kratek distančnik (manj kot 10 bp), in zaporedje, obratno komplementarno DNAzymu.

'''Ojačevanje linearnega premika verige (LSDA)'''

Če endonukleaza zavrže eno verigo tarče DNA, nastane primer za polimerazo, ki sproži sintezo. Med polimerizacijo se spodnji del verige premakne v enoverižno obliko, obenem pa se regenerira tudi nikirno mesto. Kombinirano neprekinjeno ponavljajoče se delovanje nikinga s pomočjo endonukleaze in sinteza izpodrivanja verige s polimerazo povzroči linearno ojačanje ene verige molekule DNA.
V reakciji ojačanja z linearnim premikom verige (LSDA) nikaza naredi enostranski rez v dvoverižnem izdelku RPA (slika 2) 4. Nato polimeraza, ki izpodriva verigo, začne podaljšati 3 'konec DNA na mestu reza in sprosti zaporedje GQ iz produkta RPA.

'''GQ-katalizirana oksidacija'''

V reakciji oksidacije zaporedje enoverižne DNA tvori strukturo gvanin-kvadrupleks (GQ), stabilizirano s kalijevimi ioni in heminom (slika 3a). Ta struktura deluje posnemajoče peroksidazo; DNAcim lahko oksidira 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) v prisotnosti vodikovega peroksida (H2O2), da povzroči spremembo barve5, 6 (slika 3b).

== '''Hardware''' ==

Zasnova prototipa je bila sestavljena iz 3x3 reakcij, ki so omogočale naknadno ojačanje in zaznavanje (1) testnega vzorca, (2) negativne kontrole in (3) pozitivne kontrole. Te reakcije so potekale v majhnih vdolbinicah s prostornino 20 µL za RPA, 10 µL za LSDA in 100 µL za barvno reakcijo. Reakcijske jamice so zaprte v svetlobno neprepustni škatli, da se prepreči kontaminacija reagentov in zaščiti svetlobno občutljiv substrat barvne reakcije (TMB) 1 pred razgradnjo. Prototip lahko uporabimo tako, da testni vzorec dodamo v jamico prve reakcije (RPA), čemur sledita dva cikla inkubacije in prenos v naslednjo reakcijo, dokler zadnja reakcija ne privede do rezultata kolorimetričnega testa. Skozi okno na vrhu lahko s prostim očesom opazimo spremembo barve. Skupni reakcijski čas je bil 70 minut, od tega 20 minut za prvo reakcijo (RPA), 40 minut za drugo reakcijo (LSDA) in 10 minut za barvno reakcijo.
V sedanji zasnovi so domnevali, da je mogoče RPA in LSDA združiti v reakcijo z enim loncem. Njihov prototip naj bi imel dve glavni reakcijski komori, en dovod vzorca in dve komori za vmesno shranjevanje. Obe vmesni shrambi bosta povezani tudi z dvema dodatnima reakcijskima komorama, da se bosta lahko nastavili za pozitivno reakcijo nadzora.

== '''Rezultati''' ==

DTT, ki je bil neizogibno prisoten v reakcijskih mešanicah RPA in LSDA, je bil opredeljen kot glavno reducirno sredstvo, ki je preprečevalo nastanek barv med naknadnimi reakcijami oksidacije TMB.
Dodatni zapletenosti smo se izognili z izvajanjem sheme redčenja, ki omejuje koncentracijo DTT v končni reakciji oksidacije.
Čeprav so integrirali tri reakcije, je tehnika predstavila pomembne lažno pozitivne signale v odsotnosti ciljne sekvence.
Dodatek 2,5% DMSO v reakciji RPA je učinkovito zmanjšal pojav lažno pozitivnih signalov.
Predvideni stroški
Stroški reagenta so znašali 1,45 USD na reakcijo, od tega 1,30 USD za reakcijo RPA, 15 centov za reakcijo LSDA in 0,05 centa za barvno reakcijo.
Stroški za endonukleazo so se že zmanjšali 40-krat z zmanjšanjem koncentracije encima in reakcijskega volumna LSDA.
Prihodnje delo se lahko osredotoči na vključitev prvih dveh reakcij (RPA in LSDA) v reakcijo z enim loncem, kar bi zmanjšalo količino uporabljenega reagenta in skrajšalo dodaten čas za test.Parts

== '''Parts''' ==

Sekvence treh DNAzyme delov.

Part:BBa_K1614007 http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614007

Part:BBa_K3343001 http://parts.igem.org/Part:BBa_K3343001

Part:BBa_K3343000 http://parts.igem.org/Part:BBa_K3343000

== '''Zaključek''' ==

Kljub potrebi po nadaljnji optimizaciji je predstavljena metoda zaznavanja zaporedja lahko hitro diagnostično orodje. Zaznavanje, ki temelji na RPA, mu omogoča, da ga lahko preusmeri na druga zaporedja DNA s preprostim spreminjanjem začetnikov, podobno kot pri razvoju testov na osnovi PCR. To omogoča hitro prilagajanje metode za ciljanje na novo nastajajoče bolezni.
Predstavljena shema zaznavanja zaporedja je predstavila obetavno jakost kot hitro diagnostično orodje na mestu oskrbe, ki lahko prispeva k prihodnjim poskusom diagnoze, spremljanja in omejevanja širjenja nalezljive bolezni.

Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe

2021-04-24T23:33:03Z

Mirsad93:

== '''Uvod''' ==

Na začetku leta 2020 je Svetovna zdravstvena organizacija (WHO) le nekaj mesecev po odkritju koronarno virusne bolezni 2019 (COVID-19) le-to razglasila za pandemijo. Nadzor nad boleznijo bi lahko ponovno pridobili z zmanjšanim številom interakcij: socialna distanca, zapiranje in sledenje stikom.
To ni samo prekinilo vsakdanjega življenja, ampak v nekaterih primerih ljudem onemogočilo pridobivanje zaslužka za preživljanje družine.
Izolacija prebivalstva zaradi svoje resnosti ni dolgoročna rešitev
Ta pandemija je pokazala pomembnost preskusne zmogljivosti, saj je izolacija okuženih posameznikov ključnega pomena za omejevanje širjenja bolezni med prebivalstvom. Omejena zmogljivost testiranja lahko povzroči premajhno diagnozo okuženih posameznikov, kar ustvari netočno oceno dejanskih okužb med izbruhom. To ogroža nadzor bolezni in lahko poglobi krivuljo.
Dokler ni na voljo učinkovito cepivo ali zdravljenje, je edina rešitev testiranje.
Krčenje gozdov hitro poveča stik med ljudmi in živalmi, kar ima za posledico lažji prenos zoonotskih patogenov.
Globalno segrevanje vpliva na številčnost in razširjenost prenašalcev bolezni, ki so posledica spremenjenih okoljskih razmer.

== '''Projekt RAPIDEMICS''' ==

Trenutni testi se niso izkazali za zadostne za obvladovanje izbruha. Obstajajo tri glavne kategorije diagnostičnih testov: testi ojačanja nukleinske kisline (PCR), testi na osnovi antigena in testi na protitelesa. Ti testi imajo svoje prednosti in slabosti. Velika pomanjkljivost preskusa pomnoževanja nukleinske kisline PCR so drage zahteve: termocikli, laboratoriji in usposobljeni operaterji. Po drugi strani se testi na antigenih razvijajo dolgo, medtem ko je hiter diagnostični odziv ključnega pomena. Tretjič, testov na protitelesa ni mogoče uporabiti v zgodnjih fazah okužbe, kar pomeni, da je mogoče doseči negativen rezultat, čeprav bi bila oseba že kužna.
Cilj projekta je bil oblikovati test, ki je laboratorijsko neodvisen, hitro zagotavlja rezultate in ga je mogoče enostavno prilagoditi za testiranje na kakršen koli nov patogen.
Metoda zaznavanja nukleinske kisline je sestavljena iz treh reakcij:
Ojačanje rekombinazne polimeraze (RPA), linearno ojačanje premika verige (LSDA) in katalitična oksidacija z gvanin-kvadrupleksom (GQ).
Za večino poskusov RPA je bila kot tarča pomnoževanja uporabljena izolirana genomska DNA Saccharomyces cerevisiae.
Prav tako se reakcija izvaja na sintetičnih predlogah, pridobljenih iz: Bacillus subtilis, Plasmodium falciparum, Mycobacterium sp. in gripa A H1N1.

'''Rekombinazna amplifikacija polimeraze (RPA)'''

Ojačevanje rekombinazne polimeraze (RPA) je enocevna, izotermična alternativa verižni reakciji s polimerazo (PCR). Ker je izotermičen, lahko RPA uporablja veliko preprostejšo opremo kot PCR, za kar je potreben termični cikel. Najboljše delovanje pri temperaturah 37–42 ° C. Zaradi tega je RPA odličen kandidat za razvoj poceni, hitrih molekularnih testov na mestu oskrbe. Proces RPA uporablja tri jedrne encime - rekombinazo, enojno vezavni protein, ki veže DNA (SSB), in polimerazo, ki izpodriva verigo. Rekombinaze so sposobne seznaniti oligonukleotidne prajmere s homolognim zaporedjem v dupleksni DNA. SSB se veže na izpodrinjene verige DNK in prepreči, da bi se primerki premaknili. Končno, veriga, ki izpodriva polimerazo, začne sintezo DNA, kjer se je primer primerjal na ciljno DNA.
Primarni pari, uporabljeni v tem poskusu, so bili zasnovani tako, da ciljajo na zaporedje 191 bp iz genoma Saccharomyces cerevisiae.
Reverzni primerji imajo previs ~ 27 nukleotidov, ki vsebuje reverzno komplementarno zaporedje mesta prepoznavanja za nicking endonukleazo, kratek distančnik (manj kot 10 bp), in zaporedje, obratno komplementarno DNAzymu.

'''Ojačevanje linearnega premika verige (LSDA)'''

Če endonukleaza zavrže eno verigo tarče DNA, nastane primer za polimerazo, ki sproži sintezo. Med polimerizacijo se spodnji del verige premakne v enoverižno obliko, obenem pa se regenerira tudi nikirno mesto. Kombinirano neprekinjeno ponavljajoče se delovanje nikinga s pomočjo endonukleaze in sinteza izpodrivanja verige s polimerazo povzroči linearno ojačanje ene verige molekule DNA.
V reakciji ojačanja z linearnim premikom verige (LSDA) nikaza naredi enostranski rez v dvoverižnem izdelku RPA (slika 2) 4. Nato polimeraza, ki izpodriva verigo, začne podaljšati 3 'konec DNA na mestu reza in sprosti zaporedje GQ iz produkta RPA.

'''GQ-katalizirana oksidacija'''

V reakciji oksidacije zaporedje enoverižne DNA tvori strukturo gvanin-kvadrupleks (GQ), stabilizirano s kalijevimi ioni in heminom (slika 3a). Ta struktura deluje posnemajoče peroksidazo; DNAcim lahko oksidira 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) v prisotnosti vodikovega peroksida (H2O2), da povzroči spremembo barve5, 6 (slika 3b).

== '''Hardware''' ==

Zasnova prototipa je bila sestavljena iz 3x3 reakcij, ki so omogočale naknadno ojačanje in zaznavanje (1) testnega vzorca, (2) negativne kontrole in (3) pozitivne kontrole. Te reakcije so potekale v majhnih vdolbinicah s prostornino 20 µL za RPA, 10 µL za LSDA in 100 µL za barvno reakcijo. Reakcijske jamice so zaprte v svetlobno neprepustni škatli, da se prepreči kontaminacija reagentov in zaščiti svetlobno občutljiv substrat barvne reakcije (TMB) 1 pred razgradnjo. Prototip lahko uporabimo tako, da testni vzorec dodamo v jamico prve reakcije (RPA), čemur sledita dva cikla inkubacije in prenos v naslednjo reakcijo, dokler zadnja reakcija ne privede do rezultata kolorimetričnega testa. Skozi okno na vrhu lahko s prostim očesom opazimo spremembo barve. Skupni reakcijski čas je bil 70 minut, od tega 20 minut za prvo reakcijo (RPA), 40 minut za drugo reakcijo (LSDA) in 10 minut za barvno reakcijo.
V sedanji zasnovi so domnevali, da je mogoče RPA in LSDA združiti v reakcijo z enim loncem. Njihov prototip naj bi imel dve glavni reakcijski komori, en dovod vzorca in dve komori za vmesno shranjevanje. Obe vmesni shrambi bosta povezani tudi z dvema dodatnima reakcijskima komorama, da se bosta lahko nastavili za pozitivno reakcijo nadzora.

== '''Rezultati''' ==

DTT, ki je bil neizogibno prisoten v reakcijskih mešanicah RPA in LSDA, je bil opredeljen kot glavno reducirno sredstvo, ki je preprečevalo nastanek barv med naknadnimi reakcijami oksidacije TMB.
Dodatni zapletenosti smo se izognili z izvajanjem sheme redčenja, ki omejuje koncentracijo DTT v končni reakciji oksidacije.
Čeprav so integrirali tri reakcije, je tehnika predstavila pomembne lažno pozitivne signale v odsotnosti ciljne sekvence.
Dodatek 2,5% DMSO v reakciji RPA je učinkovito zmanjšal pojav lažno pozitivnih signalov.
Predvideni stroški
Stroški reagenta so znašali 1,45 USD na reakcijo, od tega 1,30 USD za reakcijo RPA, 15 centov za reakcijo LSDA in 0,05 centa za barvno reakcijo.
Stroški za endonukleazo so se že zmanjšali 40-krat z zmanjšanjem koncentracije encima in reakcijskega volumna LSDA.
Prihodnje delo se lahko osredotoči na vključitev prvih dveh reakcij (RPA in LSDA) v reakcijo z enim loncem, kar bi zmanjšalo količino uporabljenega reagenta in skrajšalo dodaten čas za test.Parts

== '''Parts''' ==

Sekvence treh DNAzyme delov.

Part:BBa_K1614007 http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614007

Part:BBa_K3343001 http://parts.igem.org/Part:BBa_K3343001

Part:BBa_K3343000 http://parts.igem.org/Part:BBa_K3343000

== '''Zaključek''' ==

Kljub potrebi po nadaljnji optimizaciji je predstavljena metoda zaznavanja zaporedja lahko hitro diagnostično orodje. Zaznavanje, ki temelji na RPA, mu omogoča, da ga lahko preusmeri na druga zaporedja DNA s preprostim spreminjanjem začetnikov, podobno kot pri razvoju testov na osnovi PCR. To omogoča hitro prilagajanje metode za ciljanje na novo nastajajoče bolezni.
Predstavljena shema zaznavanja zaporedja je predstavila obetavno jakost kot hitro diagnostično orodje na mestu oskrbe, ki lahko prispeva k prihodnjim poskusom diagnoze, spremljanja in omejevanja širjenja nalezljive bolezni.

Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe

2021-04-24T23:32:32Z

Mirsad93:

== '''Uvod''' ==

Na začetku leta 2020 je Svetovna zdravstvena organizacija (WHO) le nekaj mesecev po odkritju koronarno virusne bolezni 2019 (COVID-19) le-to razglasila za pandemijo. Nadzor nad boleznijo bi lahko ponovno pridobili z zmanjšanim številom interakcij: socialna distanca, zapiranje in sledenje stikom.
To ni samo prekinilo vsakdanjega življenja, ampak v nekaterih primerih ljudem onemogočilo pridobivanje zaslužka za preživljanje družine.
Izolacija prebivalstva zaradi svoje resnosti ni dolgoročna rešitev
Ta pandemija je pokazala pomembnost preskusne zmogljivosti, saj je izolacija okuženih posameznikov ključnega pomena za omejevanje širjenja bolezni med prebivalstvom. Omejena zmogljivost testiranja lahko povzroči premajhno diagnozo okuženih posameznikov, kar ustvari netočno oceno dejanskih okužb med izbruhom. To ogroža nadzor bolezni in lahko poglobi krivuljo.
Dokler ni na voljo učinkovito cepivo ali zdravljenje, je edina rešitev testiranje.
Krčenje gozdov hitro poveča stik med ljudmi in živalmi, kar ima za posledico lažji prenos zoonotskih patogenov.
Globalno segrevanje vpliva na številčnost in razširjenost prenašalcev bolezni, ki so posledica spremenjenih okoljskih razmer.

== '''Projekt RAPIDEMICS''' ==

Trenutni testi se niso izkazali za zadostne za obvladovanje izbruha. Obstajajo tri glavne kategorije diagnostičnih testov: testi ojačanja nukleinske kisline (PCR), testi na osnovi antigena in testi na protitelesa. Ti testi imajo svoje prednosti in slabosti. Velika pomanjkljivost preskusa pomnoževanja nukleinske kisline PCR so drage zahteve: termocikli, laboratoriji in usposobljeni operaterji. Po drugi strani se testi na antigenih razvijajo dolgo, medtem ko je hiter diagnostični odziv ključnega pomena. Tretjič, testov na protitelesa ni mogoče uporabiti v zgodnjih fazah okužbe, kar pomeni, da je mogoče doseči negativen rezultat, čeprav bi bila oseba že kužna.
Cilj projekta je bil oblikovati test, ki je laboratorijsko neodvisen, hitro zagotavlja rezultate in ga je mogoče enostavno prilagoditi za testiranje na kakršen koli nov patogen.
Metoda zaznavanja nukleinske kisline je sestavljena iz treh reakcij:
Ojačanje rekombinazne polimeraze (RPA), linearno ojačanje premika verige (LSDA) in katalitična oksidacija z gvanin-kvadrupleksom (GQ).
Za večino poskusov RPA je bila kot tarča pomnoževanja uporabljena izolirana genomska DNA Saccharomyces cerevisiae.
Prav tako se reakcija izvaja na sintetičnih predlogah, pridobljenih iz: Bacillus subtilis, Plasmodium falciparum, Mycobacterium sp. in gripa A H1N1.

'''Rekombinazna amplifikacija polimeraze (RPA)'''

Ojačevanje rekombinazne polimeraze (RPA) je enocevna, izotermična alternativa verižni reakciji s polimerazo (PCR). Ker je izotermičen, lahko RPA uporablja veliko preprostejšo opremo kot PCR, za kar je potreben termični cikel. Najboljše delovanje pri temperaturah 37–42 ° C. Zaradi tega je RPA odličen kandidat za razvoj poceni, hitrih molekularnih testov na mestu oskrbe. Proces RPA uporablja tri jedrne encime - rekombinazo, enojno vezavni protein, ki veže DNA (SSB), in polimerazo, ki izpodriva verigo. Rekombinaze so sposobne seznaniti oligonukleotidne prajmere s homolognim zaporedjem v dupleksni DNA. SSB se veže na izpodrinjene verige DNK in prepreči, da bi se primerki premaknili. Končno, veriga, ki izpodriva polimerazo, začne sintezo DNA, kjer se je primer primerjal na ciljno DNA.
Primarni pari, uporabljeni v tem poskusu, so bili zasnovani tako, da ciljajo na zaporedje 191 bp iz genoma Saccharomyces cerevisiae.
Reverzni primerji imajo previs ~ 27 nukleotidov, ki vsebuje reverzno komplementarno zaporedje mesta prepoznavanja za nicking endonukleazo, kratek distančnik (manj kot 10 bp), in zaporedje, obratno komplementarno DNAzymu.

'''Ojačevanje linearnega premika verige (LSDA)'''

Če endonukleaza zavrže eno verigo tarče DNA, nastane primer za polimerazo, ki sproži sintezo. Med polimerizacijo se spodnji del verige premakne v enoverižno obliko, obenem pa se regenerira tudi nikirno mesto. Kombinirano neprekinjeno ponavljajoče se delovanje nikinga s pomočjo endonukleaze in sinteza izpodrivanja verige s polimerazo povzroči linearno ojačanje ene verige molekule DNA.
V reakciji ojačanja z linearnim premikom verige (LSDA) nikaza naredi enostranski rez v dvoverižnem izdelku RPA (slika 2) 4. Nato polimeraza, ki izpodriva verigo, začne podaljšati 3 'konec DNA na mestu reza in sprosti zaporedje GQ iz produkta RPA.

'''GQ-katalizirana oksidacija'''

V reakciji oksidacije zaporedje enoverižne DNA tvori strukturo gvanin-kvadrupleks (GQ), stabilizirano s kalijevimi ioni in heminom (slika 3a). Ta struktura deluje posnemajoče peroksidazo; DNAcim lahko oksidira 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) v prisotnosti vodikovega peroksida (H2O2), da povzroči spremembo barve5, 6 (slika 3b).

== '''Hardware''' ==

Zasnova prototipa je bila sestavljena iz 3x3 reakcij, ki so omogočale naknadno ojačanje in zaznavanje (1) testnega vzorca, (2) negativne kontrole in (3) pozitivne kontrole. Te reakcije so potekale v majhnih vdolbinicah s prostornino 20 µL za RPA, 10 µL za LSDA in 100 µL za barvno reakcijo. Reakcijske jamice so zaprte v svetlobno neprepustni škatli, da se prepreči kontaminacija reagentov in zaščiti svetlobno občutljiv substrat barvne reakcije (TMB) 1 pred razgradnjo. Prototip lahko uporabimo tako, da testni vzorec dodamo v jamico prve reakcije (RPA), čemur sledita dva cikla inkubacije in prenos v naslednjo reakcijo, dokler zadnja reakcija ne privede do rezultata kolorimetričnega testa. Skozi okno na vrhu lahko s prostim očesom opazimo spremembo barve. Skupni reakcijski čas je bil 70 minut, od tega 20 minut za prvo reakcijo (RPA), 40 minut za drugo reakcijo (LSDA) in 10 minut za barvno reakcijo.
V sedanji zasnovi so domnevali, da je mogoče RPA in LSDA združiti v reakcijo z enim loncem. Njihov prototip naj bi imel dve glavni reakcijski komori, en dovod vzorca in dve komori za vmesno shranjevanje. Obe vmesni shrambi bosta povezani tudi z dvema dodatnima reakcijskima komorama, da se bosta lahko nastavili za pozitivno reakcijo nadzora.

== '''Rezultati''' ==

DTT, ki je bil neizogibno prisoten v reakcijskih mešanicah RPA in LSDA, je bil opredeljen kot glavno reducirno sredstvo, ki je preprečevalo nastanek barv med naknadnimi reakcijami oksidacije TMB.
Dodatni zapletenosti smo se izognili z izvajanjem sheme redčenja, ki omejuje koncentracijo DTT v končni reakciji oksidacije.
Čeprav so integrirali tri reakcije, je tehnika predstavila pomembne lažno pozitivne signale v odsotnosti ciljne sekvence.
Dodatek 2,5% DMSO v reakciji RPA je učinkovito zmanjšal pojav lažno pozitivnih signalov.
Predvideni stroški
Stroški reagenta so znašali 1,45 USD na reakcijo, od tega 1,30 USD za reakcijo RPA, 15 centov za reakcijo LSDA in 0,05 centa za barvno reakcijo.
Stroški za endonukleazo so se že zmanjšali 40-krat z zmanjšanjem koncentracije encima in reakcijskega volumna LSDA.
Prihodnje delo se lahko osredotoči na vključitev prvih dveh reakcij (RPA in LSDA) v reakcijo z enim loncem, kar bi zmanjšalo količino uporabljenega reagenta in skrajšalo dodaten čas za test.Parts

== '''Parts''' ==

Sekvence treh DNAzyme delov.

Part:BBa_K1614007 http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614007
Part:BBa_K3343001 http://parts.igem.org/Part:BBa_K3343001
Part:BBa_K3343000 http://parts.igem.org/Part:BBa_K3343000

== '''Zaključek''' ==

Kljub potrebi po nadaljnji optimizaciji je predstavljena metoda zaznavanja zaporedja lahko hitro diagnostično orodje. Zaznavanje, ki temelji na RPA, mu omogoča, da ga lahko preusmeri na druga zaporedja DNA s preprostim spreminjanjem začetnikov, podobno kot pri razvoju testov na osnovi PCR. To omogoča hitro prilagajanje metode za ciljanje na novo nastajajoče bolezni.
Predstavljena shema zaznavanja zaporedja je predstavila obetavno jakost kot hitro diagnostično orodje na mestu oskrbe, ki lahko prispeva k prihodnjim poskusom diagnoze, spremljanja in omejevanja širjenja nalezljive bolezni.

Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe

2021-04-24T23:21:44Z

Mirsad93:

Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe

2021-04-24T23:21:01Z

Mirsad93:

Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe

2021-04-24T23:18:06Z

Mirsad93: New page: == '''Uvod''' == Na začetku leta 2020 je Svetovna zdravstvena organizacija (WHO) le nekaj mesecev po odkritju koronarno virusne bolezni 2019 (COVID-19) le-to razglasila za pandemijo. Nad...

Značilnosti cepiva proizvajalca Johnson&Johnson / Jennsen (Ad26)

2021-04-06T18:58:11Z

Mirsad93:

Cepivo Johnson & Johnson / Jennsen (JNJ-78436735 ali Ad26.COV2.S) je enodozno virusno vektorsko cepivo na osnovi človeškega adenovirusa 26, ki je bilo spremenjeno tako, da vsebuje gen za izdelavo koničastega proteina virusa SARS-CoV-2. Virusni vektor, ki izraža koničasti protein (''ang. spike protein'') SARS-CoV-2 (S), je v stabilizirani konformaciji. Stabilizirana različica koničastega proteina vključuje dve mutaciji, pri katerih se običajne aminokisline nadomestijo s prolini (K986P, V987P) in se uvede mutacija mesta cepitve furina (R682S, R685G).

Po injiciranju cepiva v telo se adenovirusi priklopijo na beljakovine na površini celic. Celica virus zajame v mehurček in ga potegne vase. Ko vstopi v celico, adenovirus pobegne iz endosoma in potuje do jedra ter vanj potisne svojo DNA. To stori zato ker adenovirus ni sposoben replikacije, medtem ko lahko celica prebere zapis za protein in ta zapis kopira v mRNA. Preko mehanizma translacije celica potem začne sintetizirati koničaste proteine, ki se preselijo na njeno površino. Štrleče konice in drobce proteinov lahko potem prepozna imunski sistem.

Genomi adenovirusa so linearne, nesegmentirane dvoverižne molekule DNA z obrnjenimi zaporedji končnih ponovitev (ITR) na obeh koncih. Vektorski sistem za razmnoževanje Ad26 je sestavljen iz adapterskega plazmida in kozmida. Adapterski plazmid vsebuje levi konec genoma, ki vsebuje levi ITR in signal za pakiranje. Vsebuje tudi kaseto za ekspresijo transgena (stabilizirani koničasti protein S) namesto regije E1 in fragment 2.5 kb, ki leži navzdol od regije E1, da se omogoči homologna rekombinacija s kozmidom. Kosmid vsebuje večino genoma Ad z izbrisom regije E3 in spremenjenim odprtim bralnim okvirom E4 6 (E5orf6).
Cepiva na osnovi vektorjev Ad26 izdelujejo z uporabo celične linije človeških embrionalnih mrežničnih celic (PER.C6), neprekinjene človeške celične linije, ki lahko podpira izdelavo adenovirusnih vektorjev, ki niso sposobni replikacije.

Cepivo Janssen COVID-19 vključuje naslednje sestavine: rekombinantni adenovirus tipa 26, ki ni sposoben replikacije in ki izraža beljakovino SARS-CoV-2, monohidrat citronske kisline, trinatrijev citrat dihidrat, etanol, 2-hidroksipropil-β-ciklodekstrin (HBCD), polisorbat-80, natrijev klorid.

Klinična preskušanja so pokazala, da je imel en odmerek cepiva v ZDA 72-odstotno stopnjo učinkovitosti in nižjo učinkovitost (66% Latinska Amerika, Južna Afrika 57%) v državah, kjer so razširjene bolj nalezljive različice. Cepivo ima 85-odstotno učinkovitost pri zaščiti pred hospitalizacijo v vseh geografskih regijah. Cepivo se daje v nadlaktno mišico, imunost se razvije dva tedna po cepljenju. Cepivo je spravljeno v hladilniku na temperaturi med 2°C in 8°C. Najpogostejši neželeni učinki, ki se običajno začnejo v enem ali dveh dneh po prejemu cepiva, so: rdečica, oteklina, utrujenost, glavobol, bolečine v mišicah. Cepivo so ZDA odobrile za nujno uporabo 27. februarja in EU 11. marca 2021.

== '''Viri''' ==

1. Custers, J., Kim, D. ''et. al.'' Vaccines based on replication incompetent Ad26 viral vectors: Standardized template with key considerations for a risk/benefit assessment. Vaccine. (2020). 10.1016/j.vaccine.2020.09.018.

2. Tostanoski, L., Wegmann, F. ''et. al.'' Ad26 vaccine protects against SARS-CoV-2 severe clinical disease in hamsters. Nature Medicine. (2020). 26. 1-7. 10.1038/s41591-020-1070-6.

3. Bos R., Rutten L. ''et. al.'' Ad26 vector-based COVID-19 vaccine encoding a prefusion-stabilized SARS-CoV-2 Spike immunogen induces potent humoral and cellular immune responses. NPJ Vaccines. 2020 Sep 28;5:91. doi: 10.1038/s41541-020-00243-x. PMID: 33083026; PMCID: PMC7522255.

4. Abbink, P.L., Angelique, E. ''et. al.'' Comparative Seroprevalence and Immunogenicity of Six Rare Serotype Recombinant Adenovirus Vaccine Vectors from Subgroups B and D. Journal of virology. (2007). 81. 4654-63. 10.1128/JVI.02696-06.

5. Mercado, N.B., Zahn, R., Wegmann, F. ''et al.'' Single-shot Ad26 vaccine protects against SARS-CoV-2 in rhesus macaques. Nature 586, 583–588 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2607-z.

6. Sadoff J, L.G., Shukarev G. ''et. al.'' Interim Results of a Phase 1-2a Trial of Ad26.COV2.S Covid-19 Vaccine. N Engl J Med. 2021 Jan 13:NEJMoa2034201. doi: 10.1056/NEJMoa2034201. Epub ahead of print. PMID: 33440088; PMCID: PMC7821985.

7. Janssen Investigational COVID-19 Vaccine: Interim Analysis of Phase 3 Clinical Data Released https://www.nih.gov/news-events/news-releases/janssen-investigational-covid-19-vaccine-interim-analysis-phase-3-clinical-data-released

8. FACT SHEET FOR RECIPIENTS AND CAREGIVERS’ EMERGENCY USE AUTHORIZATION (EUA) OF THE JANSSEN COVID-19 VACCINE TO PREVENT CORONAVIRUS DISEASE 2019 (COVID-19) IN INDIVIDUALS 18 YEARS OF AGE AND OLDER https://www.fda.gov/media/146305/download

9. Johnson & Johnson COVID-19 Vaccine Authorized by U.S. FDA For Emergency Use - First Single-Shot Vaccine in Fight Against Global Pandemic https://www.jnj.com/johnson-johnson-covid-19-vaccine-authorized-by-u-s-fda-for-emergency-usefirst-single-shot-vaccine-in-fight-against-global-pandemic

10. PER.C6 Cell Lines https://www.gmp-creativebiolabs.com/per-c6-cell-lines_74.htm

11. COVID vaccine: EU regulators approve Johnson & Johnson shot https://www.dw.com/en/covid-vaccine-eu-regulators-approve-johnson-johnson-shot/a-56834858

Protikovidna cepiva

2021-04-06T17:24:16Z

Mirsad93:

Študentski seminar pri predmetu Molekularna biotehnologija 2020/21 
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo 
Magistrski študij Biokemija 

Seminar pripravljajo študentje 1. in 2. letnika magistrskega študija. Kratki povzetki morajo biti napisani na taki ravni zahtevnosti, da so razumljivi širši javnosti. Predstavitve seminarjev (6 oz. 12 minut) imajo splošen uvod in strokovno nadaljevanje. Vsebina temelji na javno dostopnih podatkih v času priprave seminarja. Po zadnji seminarski predstavitvi bomo predvidoma izdali zbornih povzetkov, ki bo vključeval tudi slikovne razlage. Poleg tega seminarja morajo študentje pripraviti tudi daljšo predstavitev teme iz znanstvene literature.

Razpored predstavitev:

# [[Molekularnobiološke značilnosti SARS-CoV-2 in aktualni mutanti (južnoafriški, britanski, nigerijski,...)]] - 11.3. (12 min) 
# [[Interakcija SARS-CoV-2 s tarčno celico]] - 11.3. (6 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca Moderna (mRNA)]] - 18.3. (12 min) 
# [[Rezultati kliničnih testiranj cepiva proizvajalca Moderna (mRNA) ]] - 18.3.(6 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)]] - 25.3. (12 min) 
# [[Rezultati kliničnih testiranj proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)]] - 25.3. (6 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca Pfizer / BioNTech (mRNA)]] - 1.4. (12 min) 
# [[Rezultati kliničnih testiranj cepiva proizvajalca Pfizer / BioNTech (mRNA)]] - 1.4. (12 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca Johnson&Johnson / Jennsen (Ad26)]] - 8.4. (6 min) 
# Opuščena cepiva: Merck (IAVI, Themix), Imperial College London, Univ. of Queensland - 8.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Sputnik V (Gamaleya) (Ad26, Ad5) - 15.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva CanSino (Ad5) - 15.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiv Sinopharm in Sinovac (inaktivirano) - 22.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Bharat Biotech (inaktivirano) - 22.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Novavax (proteinsko) - 6.5. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Vector Institute (proteinsko) - 6.5. (6 min) 
# Značilnosti cepiva EpiVacCorona (peptidno) - 13.5. (6 min) 
nerazporejeno:
# Značilnosti cepiva Zyadus Cadilla (DNA) - 13.5. 
# Značilnosti cepiva COVAXX / UBI (peptidno) - 20.5. 
 
----
Povezava do [https://www.youtube.com/watch?v=K3odScka55A videa z razlago] o načinu določanja učinkovitosti cepiv in o (ne)smislu primerjanja teh vrednosti (Vox).

Protikovidna cepiva

2021-04-06T16:36:28Z

Mirsad93:

študentski seminar pri predmetu Molekularna biotehnologija 2020/21 
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo 
Magistrski študij Biokemija 

Seminar pripravljajo študentje 1. in 2. letnika magistrskega študija. Kratki povzetki morajo biti napisani na taki ravni zahtevnosti, da so razumljivi širši javnosti. Predstavitve seminarjev (6 oz. 12 minut) imajo splošen uvod in strokovno nadaljevanje. Vsebina temelji na javno dostopnih podatkih v času priprave seminarja. Po zadnji seminarski predstavitvi bomo predvidoma izdali zbornih povzetkov, ki bo vključeval tudi slikovne razlage. Poleg tega seminarja morajo študentje pripraviti tudi daljšo predstavitev teme iz znanstvene literature.

Razpored predstavitev:

# [[Molekularnobiološke značilnosti SARS-CoV-2 in aktualni mutanti (južnoafriški, britanski, nigerijski,...)]] - 11.3. (12 min) 
# [[Interakcija SARS-CoV-2 s tarčno celico]] - 11.3. (6 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca Moderna (mRNA)]] - 18.3. (12 min) 
# [[Rezultati kliničnih testiranj cepiva proizvajalca Moderna (mRNA) ]] - 18.3.(6 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)]] - 25.3. (12 min) 
# [[Rezultati kliničnih testiranj proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)]] - 25.3. (6 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca Pfizer / BioNTech (mRNA)]] - 1.4. (12 min) 
# [[Rezultati kliničnih testiranj cepiva proizvajalca Pfizer / BioNTech (mRNA)]] - 1.4. (12 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca Johnson&Johnson / Jennsen (Ad26)]] - 8.4. (6 min) 
# Opuščena cepiva: Merck (IAVI, Themix), Imperial College London, Univ. of Queensland - 8.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Sputnik V (Gamaleya) (Ad26, Ad5) - 15.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva CanSino (Ad5) - 15.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiv Sinopharm in Sinovac (inaktivirano) - 22.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Bharat Biotech (inaktivirano) - 22.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Novavax (proteinsko) - 6.5. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Vector Institute (proteinsko) - 6.5. (6 min) 
# Značilnosti cepiva EpiVacCorona (peptidno) - 13.5. (6 min) 
nerazporejeno:
# Značilnosti cepiva Zyadus Cadilla (DNA) - 13.5. 
# Značilnosti cepiva COVAXX / UBI (peptidno) - 20.5. 
 
----
Povezava do [https://www.youtube.com/watch?v=K3odScka55A videa z razlago] o načinu določanja učinkovitosti cepiv in o (ne)smislu primerjanja teh vrednosti (Vox).

Značilnosti cepiva proizvajalca Johnson&Johnson / Jennsen (Ad26)

2021-04-06T16:32:52Z

Mirsad93:

Cepivo Johnson & Johnson / Jennsen (JNJ-78436735 ali Ad26.COV2.S) je enodozno virusno vektorsko cepivo na osnovi človeškega adenovirusa 26, ki je bilo spremenjeno tako, da vsebuje gen za izdelavo koničastega proteina virusa SARS-CoV-2. Virusni vektor, ki izraža koničasti protein (''ang. spike protein'') SARS-CoV-2 (S), je v stabilizirani konformaciji. Stabilizirana različica koničastega proteina vključuje dve mutaciji, pri katerih se običajne aminokisline nadomestijo s prolini (K986P, V987P) in se uvede mutacija mesta cepitve (R682S, R685G).

Po injiciranju cepiva v telo se adenovirusi priklopijo na beljakovine na površini celic. Celica virus zajame v mehurček in ga potegne vase. Ko vstopi v celico, adenovirus pobegne iz endosoma in potuje do jedra ter vanj potisne svojo DNA. To stori zato ker adenovirus ni sposoben replikacije, medtem ko lahko celica prebere zapis za protein in ta zapis kopira v mRNA. Preko mehanizma translacije celica potem začne sintetizirati koničaste proteine, ki se preselijo na njeno površino. Štrleče konice in drobce proteinov lahko potem prepozna imunski sistem.

Genomi adenovirusa so linearne, nesegmentirane dvoverižne molekule DNA z obrnjenimi zaporedji končnih ponovitev (ITR) na obeh koncih. Vektorski sistem za razmnoževanje Ad26 je sestavljen iz adapterskega plazmida in kozmida. Adapterski plazmid vsebuje levi konec genoma, ki vsebuje levi ITR in signal za pakiranje. Vsebuje tudi kaseto za ekspresijo transgena (stabilizirani koničasti protein S) namesto regije E1 in fragment 2.5 kb, ki leži navzdol od regije E1, da se omogoči homologna rekombinacija s kozmidom. Kosmid vsebuje večino genoma Ad z izbrisom regije E3 in spremenjenim odprtim bralnim okvirom E4 6 (E5orf6).
Cepiva na osnovi vektorjev Ad26 izdelujejo z uporabo celične linije človeških embrionalnih mrežničnih celic (PER.C6), neprekinjene človeške celične linije, ki lahko podpira izdelavo adenovirusnih vektorjev, ki niso sposobni replikacije.

Cepivo Janssen COVID-19 vključuje naslednje sestavine: rekombinantni adenovirus tipa 26, ki ni sposoben replikacije in ki izraža beljakovino SARS-CoV-2, monohidrat citronske kisline, trinatrijev citrat dihidrat, etanol, 2-hidroksipropil-β-ciklodekstrin (HBCD), polisorbat-80, natrijev klorid.

Klinična preskušanja so pokazala, da je imel en odmerek cepiva v ZDA 72-odstotno stopnjo učinkovitosti in nižjo učinkovitost (66% Latinska Amerika, Južna Afrika 57%) v državah, kjer so razširjene bolj nalezljive različice. Cepivo ima 85-odstotno učinkovitost pri zaščiti pred hospitalizacijo v vseh geografskih regijah. Cepivo se daje v nadlaktno mišico, imunost se razvije dva tedna po cepljenju. Cepivo je spravljeno v hladilniku na temperaturi med 2°C in 8°C. Najpogostejši neželeni učinki, ki se običajno začnejo v enem ali dveh dneh po prejemu cepiva, so: rdečica, oteklina, utrujenost, glavobol, bolečine v mišicah. Cepivo so ZDA odobrile za nujno uporabo 27. februarja in EU 11. marca 2021.

== '''Viri''' ==

1. Custers, J., Kim, D. ''et. al.'' Vaccines based on replication incompetent Ad26 viral vectors: Standardized template with key considerations for a risk/benefit assessment. Vaccine. (2020). 10.1016/j.vaccine.2020.09.018.

2. Tostanoski, L., Wegmann, F. ''et. al.'' Ad26 vaccine protects against SARS-CoV-2 severe clinical disease in hamsters. Nature Medicine. (2020). 26. 1-7. 10.1038/s41591-020-1070-6.

3. Bos R., Rutten L. ''et. al.'' Ad26 vector-based COVID-19 vaccine encoding a prefusion-stabilized SARS-CoV-2 Spike immunogen induces potent humoral and cellular immune responses. NPJ Vaccines. 2020 Sep 28;5:91. doi: 10.1038/s41541-020-00243-x. PMID: 33083026; PMCID: PMC7522255.

4. Abbink, P.L., Angelique, E. ''et. al.'' Comparative Seroprevalence and Immunogenicity of Six Rare Serotype Recombinant Adenovirus Vaccine Vectors from Subgroups B and D. Journal of virology. (2007). 81. 4654-63. 10.1128/JVI.02696-06.

5. Mercado, N.B., Zahn, R., Wegmann, F. ''et al.'' Single-shot Ad26 vaccine protects against SARS-CoV-2 in rhesus macaques. Nature 586, 583–588 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2607-z.

6. Sadoff J, L.G., Shukarev G. ''et. al.'' Interim Results of a Phase 1-2a Trial of Ad26.COV2.S Covid-19 Vaccine. N Engl J Med. 2021 Jan 13:NEJMoa2034201. doi: 10.1056/NEJMoa2034201. Epub ahead of print. PMID: 33440088; PMCID: PMC7821985.

7. Janssen Investigational COVID-19 Vaccine: Interim Analysis of Phase 3 Clinical Data Released https://www.nih.gov/news-events/news-releases/janssen-investigational-covid-19-vaccine-interim-analysis-phase-3-clinical-data-released

8. FACT SHEET FOR RECIPIENTS AND CAREGIVERS’ EMERGENCY USE AUTHORIZATION (EUA) OF THE JANSSEN COVID-19 VACCINE TO PREVENT CORONAVIRUS DISEASE 2019 (COVID-19) IN INDIVIDUALS 18 YEARS OF AGE AND OLDER https://www.fda.gov/media/146305/download

9. Johnson & Johnson COVID-19 Vaccine Authorized by U.S. FDA For Emergency Use - First Single-Shot Vaccine in Fight Against Global Pandemic https://www.jnj.com/johnson-johnson-covid-19-vaccine-authorized-by-u-s-fda-for-emergency-usefirst-single-shot-vaccine-in-fight-against-global-pandemic

10. PER.C6 Cell Lines https://www.gmp-creativebiolabs.com/per-c6-cell-lines_74.htm

11. COVID vaccine: EU regulators approve Johnson & Johnson shot https://www.dw.com/en/covid-vaccine-eu-regulators-approve-johnson-johnson-shot/a-56834858

Značilnosti cepiva proizvajalca Johnson&Johnson / Jennsen (Ad26)

2021-04-06T16:31:25Z

Mirsad93:

Cepivo Johnson & Johnson / Jennsen (JNJ-78436735 ali Ad26.COV2.S) je enodozno virusno vektorsko cepivo na osnovi človeškega adenovirusa 26, ki je bilo spremenjeno tako, da vsebuje gen za izdelavo koničastega proteina virusa SARS-CoV-2. Virusni vektor, ki izraža koničasti protein (''ang. spike protein'') SARS-CoV-2 (S), je v stabilizirani konformaciji. Stabilizirana različica koničastega proteina vključuje dve mutaciji, pri katerih se običajne aminokisline nadomestijo s prolini (K986P, V987P) in se uvede mutacija mesta cepitve (R682S, R685G).

Po injiciranju cepiva v telo se adenovirusi priklopijo na beljakovine na površini celic. Celica virus zajame v mehurček in ga potegne vase. Ko vstopi v celico, adenovirus pobegne iz endosoma in potuje do jedra ter vanj potisne svojo DNA. To stori zato ker adenovirus ni sposoben replikacije, medtem ko lahko celica prebere zapis za protein in ta zapis kopira v mRNA. Preko mehanizma translacije celica potem začne sintetizirati koničaste proteine, ki se preselijo na njeno površino. Štrleče konice in drobce proteinov lahko potem prepozna imunski sistem.

Genomi adenovirusa so linearne, nesegmentirane dvoverižne molekule DNA z obrnjenimi zaporedji končnih ponovitev (ITR) na obeh koncih. Vektorski sistem za razmnoževanje Ad26 je sestavljen iz adapterskega plazmida in kozmida. Adapterski plazmid vsebuje levi konec genoma, ki vsebuje levi ITR in signal za pakiranje. Vsebuje tudi kaseto za ekspresijo transgena (stabilizirani koničasti protein S) namesto regije E1 in fragment 2.5 kb, ki leži navzdol od regije E1, da se omogoči homologna rekombinacija s kozmidom. Kosmid vsebuje večino genoma Ad z izbrisom regije E3 in spremenjenim odprtim bralnim okvirom E4 6 (E5orf6).
Cepiva na osnovi vektorjev Ad26 izdelujejo z uporabo celične linije človeških embrionalnih mrežničnih celic (PER.C6), neprekinjene človeške celične linije, ki lahko podpira izdelavo adenovirusnih vektorjev, ki niso sposobni replikacije.

Cepivo Janssen COVID-19 vključuje naslednje sestavine: rekombinantni adenovirus tipa 26, ki ni sposoben replikacije in ki izraža beljakovino SARS-CoV-2, monohidrat citronske kisline, trinatrijev citrat dihidrat, etanol, 2-hidroksipropil-β-ciklodekstrin (HBCD), polisorbat-80, natrijev klorid.

Klinična preskušanja so pokazala, da je imel en odmerek cepiva v ZDA 72-odstotno stopnjo učinkovitosti in nižjo učinkovitost (66% Latinska Amerika, Južna Afrika 57%) v državah, kjer so razširjene bolj nalezljive različice. Cepivo ima 85-odstotno učinkovitost pri zaščiti pred hospitalizacijo v vseh geografskih regijah. Cepivo se daje v nadlaktno mišico. Imunost se razvije dva tedna po cepljenju. Cepivo je spravljeno v hladilniku na temperaturi med 2°C in 8°C. Najpogostejši neželeni učinki, ki se običajno začnejo v enem ali dveh dneh po prejemu cepiva, so: rdečica, oteklina, utrujenost, glavobol, bolečine v mišicah. Cepivo so ZDA odobrile za nujno uporabo 27. februarja in EU 11. marca 2021.

== '''Viri''' ==

1. Custers, J., Kim, D. ''et. al.'' Vaccines based on replication incompetent Ad26 viral vectors: Standardized template with key considerations for a risk/benefit assessment. Vaccine. (2020). 10.1016/j.vaccine.2020.09.018.

2. Tostanoski, L., Wegmann, F. ''et. al.'' Ad26 vaccine protects against SARS-CoV-2 severe clinical disease in hamsters. Nature Medicine. (2020). 26. 1-7. 10.1038/s41591-020-1070-6.

3. Bos R., Rutten L. ''et. al.'' Ad26 vector-based COVID-19 vaccine encoding a prefusion-stabilized SARS-CoV-2 Spike immunogen induces potent humoral and cellular immune responses. NPJ Vaccines. 2020 Sep 28;5:91. doi: 10.1038/s41541-020-00243-x. PMID: 33083026; PMCID: PMC7522255.

4. Abbink, P.L., Angelique, E. ''et. al.'' Comparative Seroprevalence and Immunogenicity of Six Rare Serotype Recombinant Adenovirus Vaccine Vectors from Subgroups B and D. Journal of virology. (2007). 81. 4654-63. 10.1128/JVI.02696-06.

5. Mercado, N.B., Zahn, R., Wegmann, F. ''et al.'' Single-shot Ad26 vaccine protects against SARS-CoV-2 in rhesus macaques. Nature 586, 583–588 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2607-z.

6. Sadoff J, L.G., Shukarev G. ''et. al.'' Interim Results of a Phase 1-2a Trial of Ad26.COV2.S Covid-19 Vaccine. N Engl J Med. 2021 Jan 13:NEJMoa2034201. doi: 10.1056/NEJMoa2034201. Epub ahead of print. PMID: 33440088; PMCID: PMC7821985.

7. Janssen Investigational COVID-19 Vaccine: Interim Analysis of Phase 3 Clinical Data Released https://www.nih.gov/news-events/news-releases/janssen-investigational-covid-19-vaccine-interim-analysis-phase-3-clinical-data-released

8. FACT SHEET FOR RECIPIENTS AND CAREGIVERS’ EMERGENCY USE AUTHORIZATION (EUA) OF THE JANSSEN COVID-19 VACCINE TO PREVENT CORONAVIRUS DISEASE 2019 (COVID-19) IN INDIVIDUALS 18 YEARS OF AGE AND OLDER https://www.fda.gov/media/146305/download

9. Johnson & Johnson COVID-19 Vaccine Authorized by U.S. FDA For Emergency Use - First Single-Shot Vaccine in Fight Against Global Pandemic https://www.jnj.com/johnson-johnson-covid-19-vaccine-authorized-by-u-s-fda-for-emergency-usefirst-single-shot-vaccine-in-fight-against-global-pandemic

10. PER.C6 Cell Lines https://www.gmp-creativebiolabs.com/per-c6-cell-lines_74.htm

11. COVID vaccine: EU regulators approve Johnson & Johnson shot https://www.dw.com/en/covid-vaccine-eu-regulators-approve-johnson-johnson-shot/a-56834858

Značilnosti cepiva proizvajalca Johnson&Johnson / Jennsen (Ad26)

2021-04-06T16:12:26Z

Mirsad93:

Cepivo Johnson & Johnson / Jennsen (JNJ-78436735 ali Ad26.COV2.S) je enodozno virusno vektorsko cepivo na osnovi človeškega adenovirusa 26, ki je bilo spremenjeno tako, da vsebuje gen za izdelavo koničastega proteina virusa SARS-CoV-2. Virusni vektor, ki izraža koničasti protein (''ang. spike protein'') SARS-CoV-2 (S), je v stabilizirani konformaciji. Stabilizirana različica koničastega proteina vključuje dve mutaciji, pri katerih se običajne aminokisline nadomestijo s prolini (K986P, V987P) in se uvede mutacija mesta cepitve (R682S, R685G).

Po injiciranju cepiva v telo se adenovirusi priklopijo na beljakovine na površini celic. Celica virus zajame v mehurček in ga potegne vase. Ko vstopi v celico, adenovirus pobegne iz endosoma in potuje do jedra ter vanj potisne svojo DNA. To stori zato ker adenovirus ni sposoben replikacije, medtem ko lahko celica prebere zapis za protein in ta zapis kopira v mRNA. Preko mehanizma translacije celica potem začne sintetizirati koničaste proteine, ki se preselijo na njeno površino. Štrleče konice in drobce proteinov lahko potem prepozna imunski sistem.

Genomi adenovirusa so linearne, nesegmentirane dvoverižne molekule DNA z obrnjenimi zaporedji končnih ponovitev (ITR) na obeh koncih. Vektorski sistem za razmnoževanje Ad26 je sestavljen iz adapterskega plazmida in kozmida. Adapterski plazmid vsebuje levi konec genoma, ki vsebuje levi ITR in signal za pakiranje. Vsebuje tudi kaseto za ekspresijo transgena (stabilizirani koničasti protein S) namesto regije E1 in fragment 2.5 kb, ki leži navzdol od regije E1, da se omogoči homologna rekombinacija s kozmidom. Kosmid vsebuje večino genoma Ad z izbrisom regije E3 in spremenjenim odprtim bralnim okvirom E4 6 (E5orf6).
Cepiva na osnovi vektorjev Ad26 izdelujejo z uporabo celične linije človeških embrionalnih mrežničnih celic (PER.C6), neprekinjene človeške celične linije, ki lahko podpira izdelavo adenovirusnih vektorjev, ki niso sposobni replikacije.

Cepivo Janssen COVID-19 vključuje naslednje sestavine: rekombinantni adenovirus tipa 26, ki ni sposoben replikacije in ki izraža beljakovino SARS-CoV-2, monohidrat citronske kisline, trinatrijev citrat dihidrat, etanol, 2-hidroksipropil-β-ciklodekstrin (HBCD), polisorbat-80, natrijev klorid.

Klinična preskušanja so pokazala, da je imel en odmerek cepiva v ZDA 72-odstotno stopnjo učinkovitosti in nižjo učinkovitost (66% Latinska Amerika, Južna Afrika 57%) v državah, kjer so razširjene bolj nalezljive različice. Cepivo ima 85-odstotno učinkovitost pri zaščiti pred hospitalizacijo v vseh geografskih regijah. Cepivo se daje v nadlaktno mišico. Najpogostejši neželeni učinki, ki se običajno začnejo v enem ali dveh dneh po prejemu cepiva, so: rdečica, oteklina, utrujenost, glavobol, bolečine v mišicah. Cepivo so ZDA odobrile za nujno uporabo 27. februarja in EU 11. marca 2021.

== '''Viri''' ==

1. Custers, J., Kim, D. ''et. al.'' Vaccines based on replication incompetent Ad26 viral vectors: Standardized template with key considerations for a risk/benefit assessment. Vaccine. (2020). 10.1016/j.vaccine.2020.09.018.

2. Tostanoski, L., Wegmann, F. ''et. al.'' Ad26 vaccine protects against SARS-CoV-2 severe clinical disease in hamsters. Nature Medicine. (2020). 26. 1-7. 10.1038/s41591-020-1070-6.

3. Bos R., Rutten L. ''et. al.'' Ad26 vector-based COVID-19 vaccine encoding a prefusion-stabilized SARS-CoV-2 Spike immunogen induces potent humoral and cellular immune responses. NPJ Vaccines. 2020 Sep 28;5:91. doi: 10.1038/s41541-020-00243-x. PMID: 33083026; PMCID: PMC7522255.

4. Abbink, P.L., Angelique, E. ''et. al.'' Comparative Seroprevalence and Immunogenicity of Six Rare Serotype Recombinant Adenovirus Vaccine Vectors from Subgroups B and D. Journal of virology. (2007). 81. 4654-63. 10.1128/JVI.02696-06.

5. Mercado, N.B., Zahn, R., Wegmann, F. ''et al.'' Single-shot Ad26 vaccine protects against SARS-CoV-2 in rhesus macaques. Nature 586, 583–588 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2607-z.

6. Sadoff J, L.G., Shukarev G. ''et. al.'' Interim Results of a Phase 1-2a Trial of Ad26.COV2.S Covid-19 Vaccine. N Engl J Med. 2021 Jan 13:NEJMoa2034201. doi: 10.1056/NEJMoa2034201. Epub ahead of print. PMID: 33440088; PMCID: PMC7821985.

7. Janssen Investigational COVID-19 Vaccine: Interim Analysis of Phase 3 Clinical Data Released https://www.nih.gov/news-events/news-releases/janssen-investigational-covid-19-vaccine-interim-analysis-phase-3-clinical-data-released

8. FACT SHEET FOR RECIPIENTS AND CAREGIVERS’ EMERGENCY USE AUTHORIZATION (EUA) OF THE JANSSEN COVID-19 VACCINE TO PREVENT CORONAVIRUS DISEASE 2019 (COVID-19) IN INDIVIDUALS 18 YEARS OF AGE AND OLDER https://www.fda.gov/media/146305/download

9. Johnson & Johnson COVID-19 Vaccine Authorized by U.S. FDA For Emergency Use - First Single-Shot Vaccine in Fight Against Global Pandemic https://www.jnj.com/johnson-johnson-covid-19-vaccine-authorized-by-u-s-fda-for-emergency-usefirst-single-shot-vaccine-in-fight-against-global-pandemic

10. PER.C6 Cell Lines https://www.gmp-creativebiolabs.com/per-c6-cell-lines_74.htm

11. COVID vaccine: EU regulators approve Johnson & Johnson shot https://www.dw.com/en/covid-vaccine-eu-regulators-approve-johnson-johnson-shot/a-56834858

Značilnosti cepiva proizvajalca Johnson&Johnson / Jennsen (Ad26)

2021-04-06T16:09:14Z

Mirsad93: /* Viri */

Cepivo Johnson & Johnson / Jennsen (JNJ-78436735 ali Ad26.COV2.S) je enodozno virusno vektorsko cepivo na osnovi človeškega adenovirusa 26, ki je bilo spremenjeno tako, da vsebuje gen za izdelavo koničastega proteina virusa SARS-CoV-2. Virusni vektor, ki izraža koničasti protein (''ang. spike protein'') SARS-CoV-2 (S), je v stabilizirani konformaciji. Stabilizirana različica koničastega proteina vključuje dve mutaciji, pri katerih se običajne aminokisline nadomestijo s prolini (K986P, V987P) in se uvede mutacija mesta cepitve (R682S, R685G).

Po injiciranju cepiva v telo se adenovirusi priklopijo na beljakovine na površini celic. Celica virus zajame v mehurček in ga potegne vase. Ko vstopi v celico, adenovirus pobegne iz endosoma in potuje do jedra ter vanj potisne svojo DNA. To stori zato ker adenovirus ni sposoben replikacije, medtem ko lahko celica prebere zapis za protein in ta zapis kopira v mRNA. Preko mehanizma translacije celica potem začne sintetizirati koničaste proteine, ki se preselijo na njeno površino. Štrleče konice in drobce proteinov lahko potem prepozna imunski sistem.

Genomi adenovirusa so linearne, nesegmentirane dvoverižne molekule DNA z obrnjenimi zaporedji končnih ponovitev (ITR) na obeh koncih. Vektorski sistem za razmnoževanje Ad26 je sestavljen iz adapterskega plazmida in kozmida. Adapterski plazmid vsebuje levi konec genoma, ki vsebuje levi ITR in signal za pakiranje. Vsebuje tudi kaseto za ekspresijo transgena (stabilizirani koničasti protein S) namesto regije E1 in fragment 2.5 kb, ki leži navzdol od regije E1, da se omogoči homologna rekombinacija s kozmidom. Kosmid vsebuje večino genoma Ad z izbrisom regije E3 in spremenjenim odprtim bralnim okvirom E4 6 (E5orf6).
Cepiva na osnovi vektorjev Ad26 izdelujejo z uporabo celične linije človeških embrionalnih mrežničnih celic (PER.C6), neprekinjene človeške celične linije, ki lahko podpira izdelavo adenovirusnih vektorjev, ki niso sposobni replikacije.

Cepivo Janssen COVID-19 vključuje naslednje sestavine: rekombinantni adenovirus tipa 26, ki ni sposoben replikacije in ki izraža beljakovino SARS-CoV-2, monohidrat citronske kisline, trinatrijev citrat dihidrat, etanol, 2-hidroksipropil-β-ciklodekstrin (HBCD), polisorbat-80, natrijev klorid.

Klinična preskušanja so pokazala, da je imel en odmerek cepiva v ZDA 72-odstotno stopnjo učinkovitosti in nižjo učinkovitost (66% Latinska Amerika, Južna Afrika 57%) v državah, kjer so razširjene bolj nalezljive različice. Cepivo ima 85-odstotno učinkovitost pri zaščiti pred hospitalizacijo v vseh geografskih regijah. Cepivo se daje v nadlaktno mišico. Najpogostejši neželeni učinki, ki se običajno začnejo v enem ali dveh dneh po prejemu cepiva, so: rdečica, oteklina, utrujenost, glavobol, bolečine v mišicah. Cepivo so ZDA odobrile za nujno uporabo 27. februarja in EU 11. marca 2021.

== '''Viri''' ==

1. Custers, J., Kim, D. ''et. al.'' Vaccines based on replication incompetent Ad26 viral vectors: Standardized template with key considerations for a risk/benefit assessment. Vaccine. (2020). 10.1016/j.vaccine.2020.09.018.

2. Tostanoski, L., Wegmann, F. ''et. al.'' Ad26 vaccine protects against SARS-CoV-2 severe clinical disease in hamsters. Nature Medicine. (2020). 26. 1-7. 10.1038/s41591-020-1070-6.

3. Bos R., Rutten L. ''et. al.'' Ad26 vector-based COVID-19 vaccine encoding a prefusion-stabilized SARS-CoV-2 Spike immunogen induces potent humoral and cellular immune responses. NPJ Vaccines. 2020 Sep 28;5:91. doi: 10.1038/s41541-020-00243-x. PMID: 33083026; PMCID: PMC7522255.

4. Abbink, P.L., Angelique, E. ''et. al.'' Comparative Seroprevalence and Immunogenicity of Six Rare Serotype Recombinant Adenovirus Vaccine Vectors from Subgroups B and D. Journal of virology. (2007). 81. 4654-63. 10.1128/JVI.02696-06.

5. Mercado, N.B., Zahn, R., Wegmann, F. ''et al.'' Single-shot Ad26 vaccine protects against SARS-CoV-2 in rhesus macaques. Nature 586, 583–588 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2607-z.

6. Sadoff J, L.G., Shukarev G. ''et. al.'' Interim Results of a Phase 1-2a Trial of Ad26.COV2.S Covid-19 Vaccine. N Engl J Med. 2021 Jan 13:NEJMoa2034201. doi: 10.1056/NEJMoa2034201. Epub ahead of print. PMID: 33440088; PMCID: PMC7821985.

7. Janssen Investigational COVID-19 Vaccine: Interim Analysis of Phase 3 Clinical Data Released https://www.nih.gov/news-events/news-releases/janssen-investigational-covid-19-vaccine-interim-analysis-phase-3-clinical-data-released

8. FACT SHEET FOR RECIPIENTS AND CAREGIVERS’ EMERGENCY USE AUTHORIZATION (EUA) OF THE JANSSEN COVID-19 VACCINE TO PREVENT CORONAVIRUS DISEASE 2019 (COVID-19) IN INDIVIDUALS 18 YEARS OF AGE AND OLDER https://www.fda.gov/media/146305/download

9. Johnson & Johnson COVID-19 Vaccine Authorized by U.S. FDA For Emergency Use - First Single-Shot Vaccine in Fight Against Global Pandemic https://www.jnj.com/johnson-johnson-covid-19-vaccine-authorized-by-u-s-fda-for-emergency-usefirst-single-shot-vaccine-in-fight-against-global-pandemic

Značilnosti cepiva proizvajalca Johnson&Johnson / Jennsen (Ad26)

2021-04-06T15:58:03Z

Mirsad93:

Cepivo Johnson & Johnson / Jennsen (JNJ-78436735 ali Ad26.COV2.S) je enodozno virusno vektorsko cepivo na osnovi človeškega adenovirusa 26, ki je bilo spremenjeno tako, da vsebuje gen za izdelavo koničastega proteina virusa SARS-CoV-2. Virusni vektor, ki izraža koničasti protein (''ang. spike protein'') SARS-CoV-2 (S), je v stabilizirani konformaciji. Stabilizirana različica koničastega proteina vključuje dve mutaciji, pri katerih se običajne aminokisline nadomestijo s prolini (K986P, V987P) in se uvede mutacija mesta cepitve (R682S, R685G).

Po injiciranju cepiva v telo se adenovirusi priklopijo na beljakovine na površini celic. Celica virus zajame v mehurček in ga potegne vase. Ko vstopi v celico, adenovirus pobegne iz endosoma in potuje do jedra ter vanj potisne svojo DNA. To stori zato ker adenovirus ni sposoben replikacije, medtem ko lahko celica prebere zapis za protein in ta zapis kopira v mRNA. Preko mehanizma translacije celica potem začne sintetizirati koničaste proteine, ki se preselijo na njeno površino. Štrleče konice in drobce proteinov lahko potem prepozna imunski sistem.

Genomi adenovirusa so linearne, nesegmentirane dvoverižne molekule DNA z obrnjenimi zaporedji končnih ponovitev (ITR) na obeh koncih. Vektorski sistem za razmnoževanje Ad26 je sestavljen iz adapterskega plazmida in kozmida. Adapterski plazmid vsebuje levi konec genoma, ki vsebuje levi ITR in signal za pakiranje. Vsebuje tudi kaseto za ekspresijo transgena (stabilizirani koničasti protein S) namesto regije E1 in fragment 2.5 kb, ki leži navzdol od regije E1, da se omogoči homologna rekombinacija s kozmidom. Kosmid vsebuje večino genoma Ad z izbrisom regije E3 in spremenjenim odprtim bralnim okvirom E4 6 (E5orf6).
Cepiva na osnovi vektorjev Ad26 izdelujejo z uporabo celične linije človeških embrionalnih mrežničnih celic (PER.C6), neprekinjene človeške celične linije, ki lahko podpira izdelavo adenovirusnih vektorjev, ki niso sposobni replikacije.

Cepivo Janssen COVID-19 vključuje naslednje sestavine: rekombinantni adenovirus tipa 26, ki ni sposoben replikacije in ki izraža beljakovino SARS-CoV-2, monohidrat citronske kisline, trinatrijev citrat dihidrat, etanol, 2-hidroksipropil-β-ciklodekstrin (HBCD), polisorbat-80, natrijev klorid.

Klinična preskušanja so pokazala, da je imel en odmerek cepiva v ZDA 72-odstotno stopnjo učinkovitosti in nižjo učinkovitost (66% Latinska Amerika, Južna Afrika 57%) v državah, kjer so razširjene bolj nalezljive različice. Cepivo ima 85-odstotno učinkovitost pri zaščiti pred hospitalizacijo v vseh geografskih regijah. Cepivo se daje v nadlaktno mišico. Najpogostejši neželeni učinki, ki se običajno začnejo v enem ali dveh dneh po prejemu cepiva, so: rdečica, oteklina, utrujenost, glavobol, bolečine v mišicah. Cepivo so ZDA odobrile za nujno uporabo 27. februarja in EU 11. marca 2021.

== '''Viri''' ==

1. Custers, J., Kim, D. ''et. al.'' Vaccines based on replication incompetent Ad26 viral vectors: Standardized template with key considerations for a risk/benefit assessment. Vaccine. (2020). 10.1016/j.vaccine.2020.09.018.

2. Tostanoski, L., Wegmann, F. ''et. al.'' Ad26 vaccine protects against SARS-CoV-2 severe clinical disease in hamsters. Nature Medicine. (2020). 26. 1-7. 10.1038/s41591-020-1070-6.

3. Bos R., Rutten L. ''et. al.'' Ad26 vector-based COVID-19 vaccine encoding a prefusion-stabilized SARS-CoV-2 Spike immunogen induces potent humoral and cellular immune responses. NPJ Vaccines. 2020 Sep 28;5:91. doi: 10.1038/s41541-020-00243-x. PMID: 33083026; PMCID: PMC7522255.

4. Abbink, P.L., Angelique, E. ''et. al.'' Comparative Seroprevalence and Immunogenicity of Six Rare Serotype Recombinant Adenovirus Vaccine Vectors from Subgroups B and D. Journal of virology. (2007). 81. 4654-63. 10.1128/JVI.02696-06.

5. Mercado, N.B., Zahn, R., Wegmann, F. ''et al.'' Single-shot Ad26 vaccine protects against SARS-CoV-2 in rhesus macaques. Nature 586, 583–588 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2607-z.

6. Sadoff J, L.G., Shukarev G. ''et. al.'' Interim Results of a Phase 1-2a Trial of Ad26.COV2.S Covid-19 Vaccine. N Engl J Med. 2021 Jan 13:NEJMoa2034201. doi: 10.1056/NEJMoa2034201. Epub ahead of print. PMID: 33440088; PMCID: PMC7821985.

Značilnosti cepiva proizvajalca Johnson&Johnson / Jennsen (Ad26)

2021-04-06T15:56:55Z

Mirsad93:

Cepivo Johnson & Johnson / Jennsen (JNJ-78436735 ali Ad26.COV2.S) je enodozno virusno vektorsko cepivo na osnovi človeškega adenovirusa 26, ki je bilo spremenjeno tako, da vsebuje gen za izdelavo koničastega proteina virusa SARS-CoV-2. Virusni vektor, ki izraža koničasti protein (''ang. spike protein'') SARS-CoV-2 (S), je v stabilizirani konformaciji. Stabilizirana različica koničastega proteina vključuje dve mutaciji, pri katerih se običajne aminokisline nadomestijo s prolini (K986P, V987P) in se uvede mutacija mesta cepitve (R682S, R685G).

Po injiciranju cepiva v telo se adenovirusi priklopijo na beljakovine na površini celic. Celica virus zajame v mehurček in ga potegne vase. Ko vstopi v celico, adenovirus pobegne iz endosoma in potuje do jedra ter vanj potisne svojo DNA. To stori zato ker adenovirus ni sposoben replikacije, medtem ko lahko celica prebere zapis za protein in ta zapis kopira v mRNA. Preko mehanizma translacije celica potem začne sintetizirati koničaste proteine, ki se preselijo na njeno površino. Štrleče konice in drobce proteinov lahko potem prepozna imunski sistem.

Genomi adenovirusa so linearne, nesegmentirane dvoverižne molekule DNA z obrnjenimi zaporedji končnih ponovitev (ITR) na obeh koncih. Vektorski sistem za razmnoževanje Ad26 je sestavljen iz adapterskega plazmida in kozmida. Adapterski plazmid vsebuje levi konec genoma, ki vsebuje levi ITR in signal za pakiranje. Vsebuje tudi kaseto za ekspresijo transgena (stabilizirani koničasti protein S) namesto regije E1 in fragment 2.5 kb, ki leži navzdol od regije E1, da se omogoči homologna rekombinacija s kozmidom. Kosmid vsebuje večino genoma Ad z izbrisom regije E3 in spremenjenim odprtim bralnim okvirom E4 6 (E5orf6).
Cepiva na osnovi vektorjev Ad26 izdelujejo z uporabo celične linije človeških embrionalnih mrežničnih celic (PER.C6), neprekinjene človeške celične linije, ki lahko podpira izdelavo adenovirusnih vektorjev, ki niso sposobni replikacije.

Cepivo Janssen COVID-19 vključuje naslednje sestavine: rekombinantni adenovirus tipa 26, ki ni sposoben replikacije in ki izraža beljakovino SARS-CoV-2, monohidrat citronske kisline, trinatrijev citrat dihidrat, etanol, 2-hidroksipropil-β-ciklodekstrin (HBCD), polisorbat-80, natrijev klorid.

Klinična preskušanja so pokazala, da je imel en odmerek cepiva v ZDA 72-odstotno stopnjo učinkovitosti in nižjo učinkovitost (66% Latinska Amerika, Južna Afrika 57%) v državah, kjer so razširjene bolj nalezljive različice. Cepivo ima 85-odstotno učinkovitost pri zaščiti pred hospitalizacijo v vseh geografskih regijah. Cepivo se daje v nadlaktno mišico. Najpogostejši neželeni učinki, ki se običajno začnejo v enem ali dveh dneh po prejemu cepiva, so: rdečica, oteklina, utrujenost, glavobol, bolečine v mišicah. Cepivo so ZDA odobrile za nujno uporabo 27. februarja in EU 11. marca 2021.

== '''Viri''' ==

1. Custers, J., Kim, D. et. al. Vaccines based on replication incompetent Ad26 viral vectors: Standardized template with key considerations for a risk/benefit assessment. Vaccine. (2020). 10.1016/j.vaccine.2020.09.018.

2. Tostanoski, L., Wegmann, F. et. al. Ad26 vaccine protects against SARS-CoV-2 severe clinical disease in hamsters. Nature Medicine. (2020). 26. 1-7. 10.1038/s41591-020-1070-6.

3. Bos R., Rutten L. et. al. Ad26 vector-based COVID-19 vaccine encoding a prefusion-stabilized SARS-CoV-2 Spike immunogen induces potent humoral and cellular immune responses. NPJ Vaccines. 2020 Sep 28;5:91. doi: 10.1038/s41541-020-00243-x. PMID: 33083026; PMCID: PMC7522255.

4. Abbink, P.L., Angelique, E. et. al. Comparative Seroprevalence and Immunogenicity of Six Rare Serotype Recombinant Adenovirus Vaccine Vectors from Subgroups B and D. Journal of virology. (2007). 81. 4654-63. 10.1128/JVI.02696-06.

5. Mercado, N.B., Zahn, R., Wegmann, F. et al. Single-shot Ad26 vaccine protects against SARS-CoV-2 in rhesus macaques. Nature 586, 583–588 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2607-z.

6. Sadoff J, L.G., Shukarev G. et. al. Interim Results of a Phase 1-2a Trial of Ad26.COV2.S Covid-19 Vaccine. N Engl J Med. 2021 Jan 13:NEJMoa2034201. doi: 10.1056/NEJMoa2034201. Epub ahead of print. PMID: 33440088; PMCID: PMC7821985.

Značilnosti cepiva proizvajalca Johnson&Johnson / Jennsen (Ad26)

2021-04-06T15:56:10Z

Mirsad93:

Cepivo Johnson & Johnson / Jennsen (JNJ-78436735 ali Ad26.COV2.S) je enodozno virusno vektorsko cepivo na osnovi človeškega adenovirusa 26, ki je bilo spremenjeno tako, da vsebuje gen za izdelavo koničastega proteina virusa SARS-CoV-2. Virusni vektor, ki izraža koničasti protein (''ang. spike protein'') SARS-CoV-2 (S), je v stabilizirani konformaciji. Stabilizirana različica koničastega proteina vključuje dve mutaciji, pri katerih se običajne aminokisline nadomestijo s prolini (K986P, V987P) in se uvede mutacija mesta cepitve (R682S, R685G).

Po injiciranju cepiva v telo se adenovirusi priklopijo na beljakovine na površini celic. Celica virus zajame v mehurček in ga potegne vase. Ko vstopi v celico, adenovirus pobegne iz endosoma in potuje do jedra ter vanj potisne svojo DNA. To stori zato ker adenovirus ni sposoben replikacije, medtem ko lahko celica prebere zapis za protein in ta zapis kopira v mRNA. Preko mehanizma translacije celica potem začne sintetizirati koničaste proteine, ki se preselijo na njeno površino. Štrleče konice in drobce proteinov lahko potem prepozna imunski sistem.

Genomi adenovirusa so linearne, nesegmentirane dvoverižne molekule DNA z obrnjenimi zaporedji končnih ponovitev (ITR) na obeh koncih. Vektorski sistem za razmnoževanje Ad26 je sestavljen iz adapterskega plazmida in kozmida. Adapterski plazmid vsebuje levi konec genoma, ki vsebuje levi ITR in signal za pakiranje. Vsebuje tudi kaseto za ekspresijo transgena (stabilizirani koničasti protein S) namesto regije E1 in fragment 2.5 kb, ki leži navzdol od regije E1, da se omogoči homologna rekombinacija s kozmidom. Kosmid vsebuje večino genoma Ad z izbrisom regije E3 in spremenjenim odprtim bralnim okvirom E4 6 (E5orf6).
Cepiva na osnovi vektorjev Ad26 izdelujejo z uporabo celične linije človeških embrionalnih mrežničnih celic (PER.C6), neprekinjene človeške celične linije, ki lahko podpira izdelavo adenovirusnih vektorjev, ki niso sposobni replikacije.

Cepivo Janssen COVID-19 vključuje naslednje sestavine: rekombinantni adenovirus tipa 26, ki ni sposoben replikacije in ki izraža beljakovino SARS-CoV-2, monohidrat citronske kisline, trinatrijev citrat dihidrat, etanol, 2-hidroksipropil-β-ciklodekstrin (HBCD), polisorbat-80, natrijev klorid.

Klinična preskušanja so pokazala, da je imel en odmerek cepiva v ZDA 72-odstotno stopnjo učinkovitosti in nižjo učinkovitost (66% Latinska Amerika, Južna Afrika 57%) v državah, kjer so razširjene bolj nalezljive različice. Cepivo ima 85-odstotno učinkovitost pri zaščiti pred hospitalizacijo v vseh geografskih regijah. Cepivo se daje v nadlaktno mišico. Najpogostejši neželeni učinki, ki se običajno začnejo v enem ali dveh dneh po prejemu cepiva, so: rdečica, oteklina, utrujenost, glavobol, bolečine v mišicah. Cepivo so ZDA odobrile za nujno uporabo 27. februarja in EU 11. marca 2021.

== '''Viri''' ==

1. Custers, J., Kim, D. et. al. Vaccines based on replication incompetent Ad26 viral vectors: Standardized template with key considerations for a risk/benefit assessment. Vaccine. (2020). 10.1016/j.vaccine.2020.09.018.
2. Tostanoski, L., Wegmann, F. et. al. Ad26 vaccine protects against SARS-CoV-2 severe clinical disease in hamsters. Nature Medicine. (2020). 26. 1-7. 10.1038/s41591-020-1070-6.
3. Bos R., Rutten L. et. al. Ad26 vector-based COVID-19 vaccine encoding a prefusion-stabilized SARS-CoV-2 Spike immunogen induces potent humoral and cellular immune responses. NPJ Vaccines. 2020 Sep 28;5:91. doi: 10.1038/s41541-020-00243-x. PMID: 33083026; PMCID: PMC7522255.
4. Abbink, P.L., Angelique, E. et. al. Comparative Seroprevalence and Immunogenicity of Six Rare Serotype Recombinant Adenovirus Vaccine Vectors from Subgroups B and D. Journal of virology. (2007). 81. 4654-63. 10.1128/JVI.02696-06.
5. Mercado, N.B., Zahn, R., Wegmann, F. et al. Single-shot Ad26 vaccine protects against SARS-CoV-2 in rhesus macaques. Nature 586, 583–588 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2607-z
6. Sadoff J, L.G., Shukarev G. et. al. Interim Results of a Phase 1-2a Trial of Ad26.COV2.S Covid-19 Vaccine. N Engl J Med. 2021 Jan 13:NEJMoa2034201. doi: 10.1056/NEJMoa2034201. Epub ahead of print. PMID: 33440088; PMCID: PMC7821985.

Značilnosti cepiva proizvajalca Johnson&Johnson / Jennsen (Ad26)

2021-04-06T15:32:19Z

Mirsad93:

Značilnosti cepiva proizvajalca Johnson&Johnson / Jennsen (Ad26)

2021-04-06T15:28:44Z

Mirsad93:

Značilnosti cepiva proizvajalca Johnson&Johnson / Jennsen (Ad26)

2021-04-06T15:27:47Z

Mirsad93:

Značilnosti cepiva proizvajalca Johnson&Johnson / Jennsen (Ad26)

2021-04-06T15:25:26Z

Mirsad93: New page: Cepivo Johnson & Johnson / Jennsen (JNJ-78436735 ali Ad26.COV2.S) je enodozno virusno vektorsko cepivo na osnovi človeškega adenovirusa 26, ki je bilo spremenjeno tako, da vsebuje gen za...

BNT-seminar

2021-03-16T10:31:09Z

Mirsad93: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019058 
30170022 
30200303 
30019363 
30200310 
30019057 
30170131 
30170078 
30019040 
30170177 
30200324 
30200315 
30019063 
30200312 
30170002 
30170103 
30019056 
30200319 
30200309 
30200322 
30200320 
30200311 
30200306 
30170243 
30019051 
30170141 
30170061 
30019035 
30200316 
30170222 
30200317 
30170193 
30200307 
30200321 
30200314 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
16.3.2021 
16.3.2021 
23.3.2021 
23.3.2021 
23.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
13.4.2021 
13.4.2021 
13.4.2021 
20.4.2021 
20.4.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
23.3.2021 
20.4.2020 
20.4.2020 
6.4.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
11.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
30.3.2021 
13.4.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
18.5.2021 
18.5.2021 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Aljaž Bratina 
Matija Ruparčič 
Urban Hribar 
Sabina Sladič Oblak 
Irma Zeljković 
Barbara Slapnik 
Tina Kolenc Milavec 
Klementina Polanec 
Ajda Godec 
Martin Špendl 
Tjaša Mlakar 
Urša Lovše 
Sara Laznik 
Neža Pvko 
Doroteja Armič 
Martina Lokar 
Špela Supej 
Martin Špendl 
Saša Slabe 
Eva Keber 
Mateja Žvipelj 
Urška Fajdiga 
Ernestina Lavrih 
Nika Mikulič Vernik 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Tadej Medved 
Urška Zagorc 
Nina Lukančič 
Urška Pečarič Strnad 
Anže Karlek 
Luka Gnidovec 
Almina Tahirović 
Mirsad Mešić 
Paula Horvat 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Urška Zagorc 
Ernestina Lavrih 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Paula Horvat 
Sara Laznik 
Luka Gnidovec 
Irma Zeljković 
Eva Keber 
Jernej Imperl 
Barbara Slapnik 
Mirsad Mešić 
Urša Lovše 
Anamarija Agnič 
Neža Pavko 
Mateja Žvipelj 
Saša Slabe 
Almina Tahirović 
Nika Mikulič Vernik 
Martina Lokar 
Urška Fajdiga 
Klementina Polanec 
Tjaša Mlakar 
Ajda Godec 
Jernej Imperl 
Špela Supej 
Aljaž Bratina 
Nina Lukančič 
Matija Ruparčič 
Anže Karlek 
Sabina S. Oblak 
Urban Hribar 
Tina Kolenc Milavec 
Tadej Medved 
Doroteja Armič 
|}

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BNT-seminar

2021-03-16T10:28:30Z

Mirsad93: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019058 
30170022 
30200303 
30019363 
30200310 
30019057 
30170131 
30170078 
30019040 
30170177 
30200324 
30200315 
30019063 
30200312 
30170002 
30170103 
30019056 
30200319 
30200309 
30200322 
30200320 
30200311 
30200306 
30170243 
30019051 
30170141 
30170061 
30019035 
30200316 
30170222 
30200317 
30170193 
30200307 
30200321 
30200314 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
16.3.2021 
16.3.2021 
23.3.2021 
23.3.2021 
23.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
13.4.2021 
13.4.2021 
13.4.2021 
20.4.2021 
20.4.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
23.3.2021 
20.4.2020 
20.4.2020 
6.4.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
11.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
30.3.2021 
13.4.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
18.5.2021 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Aljaž Bratina 
Matija Ruparčič 
Urban Hribar 
Sabina Sladič Oblak 
Irma Zeljković 
Barbara Slapnik 
Tina Kolenc Milavec 
Klementina Polanec 
Ajda Godec 
Martin Špendl 
Tjaša Mlakar 
Urša Lovše 
Sara Laznik 
Neža Pvko 
Doroteja Armič 
Martina Lokar 
Špela Supej 
Martin Špendl 
Saša Slabe 
Eva Keber 
Mateja Žvipelj 
Urška Fajdiga 
Ernestina Lavrih 
Nika Mikulič Vernik 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Tadej Medved 
Urška Zagorc 
Nina Lukančič 
Urška Pečarič Strnad 
Anže Karlek 
Luka Gnidovec 
Almina Tahirović 
Mirsad Mešić 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Urška Zagorc 
Ernestina Lavrih 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Paula Horvat 
Sara Laznik 
Luka Gnidovec 
Irma Zeljković 
Eva Keber 
Jernej Imperl 
Barbara Slapnik 
Mirsad Mešić 
Urša Lovše 
Anamarija Agnič 
Neža Pavko 
Mateja Žvipelj 
Saša Slabe 
Almina Tahirović 
Nika Mikulič Vernik 
Martina Lokar 
Urška Fajdiga 
Klementina Polanec 
Tjaša Mlakar 
Ajda Godec 
Jernej Imperl 
Špela Supej 
Aljaž Bratina 
Nina Lukančič 
Matija Ruparčič 
Anže Karlek 
Sabina S. Oblak 
Urban Hribar 
Tina Kolenc Milavec 
Tadej Medved 
|}

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.