Wiki FKKT - User contributions [en]

Seminarji SB 2015/16

2016-01-11T07:03:49Z

Mojca Banič:

Seminarji iz Sintezne biologije v študijskem letu 2015/16 so:

Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/2866/synthetic-biology-engineering-complexity-and-refactoring-cell-capabilities SYNTHETIC BIOLOGY: ENGINEERING COMPLEXITY AND REFACTORING CELL CAPABILITIES]

* Production of fatty acid-derived valuable chemicals in synthetic microbes ([[Proizvodnja kemikalij iz derivatov maščobnih kislin s pomočjo sintetičnih mikroorganizmov]]) (Maja Grdadolnik) 
* Optimization of the IPP precursor supply for the production of lycopene, decaprenoxanthin and astaxanthin by Corynebacterium glutamicum ([[Optimizacija sinteze IPP kot prekursorja za produkcijo likopena, dekaprenoksantina in astaksantina v Corynebacterium glutamicum]]) (Griša Prinčič) 
* Engineering sugar utilization and microbial tolerance toward lignocellulose conversion [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konverzija_lignoceluloze_s_pomočjo_izkoriščanja_mikrobne_tolerance_in_inženiringa_sladkorjev] (Kim Potočnik) 
* Cofactor engineering for enhancing the flux of metabolic pathways [[INŽENIRING KOFAKTORJEV ZA IZBOLJŠANJE METABOLIČNIH POTI]] (Nastja Štemberger) 
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4354409/ Can the natural diversity of quorum-sensing advance synthetic biology?] ([[Ali lahko naravna diverziteta quorum sensinga pripomore k napredku v sintezni biologiji?]]) (Tina Snoj) 
* [http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fbioe.2015.00093/full Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits] ([[Določanje učinkovitosti bioloških naprav in vezij z razmerjem signal-šum]]) (Jakob G. Lavrenčič) 
* A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli ([[Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli]]) (Ajda Rojc) 
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4211546/ New transposon tools tailored for metabolic engineering of Gram-negative microbial cell factories] ([[Metabolični inženiring gram-negativnih bakterij s transpozonskim sistemom]]) (Rok Razpotnik) 

Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/455/synthetic-biology-applications-in-industrial-microbiology SYNTHETIC BIOLOGY APPLICATIONS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY]

* Recent Progress in Synthetic Biology for Microbial Production of C3–C10 Alcohols (Urška Rauter) ([[Napredki v sintezni biologiji pri proizvodnji C3-C10 alkoholov v mikroorganizmih]])
* Visualizing Evolution in Real-Time Method for Strain Engineering ([[Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo]]) (Samo Zakotnik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3367458/ Engineering Microbial Consortia to Enhance Biomining and Bioremediation] ([[Načrtovanje mikrobnih konzorcijev za izboljšanje biorudarstva in bioremediacije]]) (Maja Kostanjevec)
* Engineering Microbial Chemical Factories to Produce Renewable “Biomonomers” ([[Mikrobiološka proizvodnja obnovljivih biomonomerov in bioplastike]])(Nastja Pirman)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3446811/ Application of Synthetic Biology in Cyanobacteria and Algae] ([[Uporaba sintezne biologije v cianobakterijah in algah]]) (Špela Tomaž)
* Synthetic Feedback Loop Model for Increasing Microbial Biofuel Production Using a Biosensor (Jernej Pušnik)
* Balance of XYL1 and XYL2 Expression in Different Yeast Chassis for Improved xylose Fermentation ([[Ravnotežje med ekspresijo XYL1 in XYL2 v različnih šasijah kvasovk v povezavi s povečano fermentacijo ksiloze]]) (Monika Praznik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3630320/ Design and Development of Synthetic Microbial Platform Cells for Bioenergy] ([[Načrtovanje in razvijanje sintetičnih mikrobnih celičnih platform za pridobivanje bioenergije]])(Erik Mršnik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3616241/ Microbial Production of Isoprenoids Enabled by Synthetic Biology] ([[Mikrobna produkcija izoprenoidov s sintezno biologijo]]) (Dominik Kert)
* Chemical synthetic biology: a mini-review ([[Kratki pregled kemijske sintezne biologije]]) (Anka Hotko)

Seminarji iz preglednih člankov:

* [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S002228361500618X Towards engineering biological systems in a broader context] ([[Inženiring bioloških sistemov v širšem kontekstu]]) (Aleksander Benčič)
* [http://revistes.iec.cat/index.php/IM/article/viewFile/139212/137876 Synthetic biology: Novel approaches for microbiology] ([[Sintezno biološki pristopi v mikrobiologiji]]) (Daša Janeš)
* Tools and principles for microbial gene circuit engineering (Marko Radojković)
* Sensitive cells: enabling tools for static and dynamic control of microbial metabolic pathways ([[Dinamično uravnavanje (regulacija) metabolnih poti]]) (Katja Leben)
* Chassis optimization as a cornerstone for the application of synthetic biology based strategies in microbial secondary metabolism ([[Oprimizacija šasij kot osnovni korak pri uporabi sintezno biološkega pristopa pri karakterizaciji mikrobnega sekundarnega metabolizma]]) (Jure Zabret)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4571725/ Recent advances and opportunities in synthetic logic gates engineering in living cells] ([[Napredki v načrtovanju bioloških logičnih vrat v živih celicah]]) (Monika Biasizzo)
* Programmable genetic circuits for pathway engineering (Urban Javoršek)
* [http://web.media.mit.edu/~neri/MATTER.MEDIA/Publications/Better_together-_engineering_and_application_of_microbial_symbioses.pdf Better together: engineering and application of microbial symbioses] ([[V slogi je moč: načrtovanje in uporaba mikrobne simbioze]]) (Nejc Petrišič)
* Synthetic biology for microbial production of lipid-based biofuels (Urška Pevec)
* Engineering Biosynthesis Mechanisms for Diversifying Polyhydroxyalkanoates ([[Inženiring biosintetskih mehanizmov za raznolike polihidroksialkanoate]]) (Mojca Banič)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4519758/pdf/fmicb-06-00775.pdf Synthetic biology of fungal natural products] ([[Sintezna biologija naravnih produktov (nitastih) gliv]]) (Estera Merljak)
* Synthetic biology and biomimetic chemistry as converging technologies fostering a new generation of smart biosensors ([[Sintezna biologija in biomimetika pri razvoju biosenzorjev]]) (Benjamin Bajželj)
* How Synthetic Biology Would Reconsider Natural Bioluminescence and its Application (Ana Grom & Ana Unkovič)
* Synthetic Biology-Toward Therapeutic Solutions (Tanja Korpar)
* Synthetically modified mRNA for efficient and fast human iPS cell generation and direct transdifferentiation to myoblasts (Mirjana Malnar)
* Mammalian synthetic biology: emerging medical applications (Maša Mirkovič)
* Synthetic biology devices and circuits for RNA-based ‘smart vaccines’: a propositional review (Monika Škrjanc)

Inženiring biosintetskih mehanizmov za raznolike polihidroksialkanoate

2016-01-11T07:01:23Z

Mojca Banič:

INŽENIRING BIOSINTEZNIH MEHANIZMOV ZA RAZNOLIKE POLIHIRDOKSIALKANOATE

==UVOD==
Polihidroksialkanoati (PHA) vzbujajo posebno pozornost kot trajnostna »zelena plastika« z realno možnostjo, da nadomestijo svoje tekmece, ki temeljijo na nafti. Za dosego tega cilja morajo biti PHA sposobni tekmovati tako z mehanskimi lastnostmi kot z ekonomskimi vidiki z uveljavljenimi plastikami. PHA ima značilno unikatno kombinacijo biorazgradljivosti, biokompatibilnosti, termične in mehanske lastnosti, kot tudi raznoliko molekularno maso. Te lastnosti zavisijo od same strukture PHA. Pestrost PHA je povečana s funkcionalnimi in cepljenimi PHA, naključnimi in blok kopolimeri in tiopoliestri. Povečanje PHA raznolikosti omogoča inženiring 3 osnovnih metabolnih poti: acetil-CoA pot, β-oksidacija in ''in situ'' sinteza maščobnih kislin in tudi spreminjanje specifičnosti PHA sintaze.

==INŽENIRING BAKTERIJSKIH PHA SINTEZNIH MEHANIZMOV==
PHA sintezne poti potrebujejo dodatek substratov, ki so strukturno sorodni monomerom PHA, predvsem v obliki maščobnih kislin in alkohola. Ti substrati so izredno dragi, zato so ustvarili poti, ki uporabljajo sladkorje kot relativno poceni substrat. Z uporabo spektra mikroorganizmov, ustvarjanjem novih poti in povišanjem učinkovitosti pretvorbe so izboljšali lastnosti PHA, naredili PHA sintezo bolj ekonomsko in uvedli poti za povsem nove PHA.
V ''Ralstonii eutropha'' so le iz glukoze po inženirski metabolni poti acetil-CoA sintetizirali številne PHB kopolimere: PHBLA, P3HP3HB, P3HB4HB in PHBHHx. Za sintezo P3HP pa so poleg glukoze uporabili tudi glicerol.
Omejevanje β-oksidacije maščobnih kislin v ''Pseudomonas putidi'' vodi v boljši maščobnokislinski pretok za sintezo številnih srednje dolgih verig PHA (mcl PHA). Sev je bil v prisotnosti heksanoata, heptanoata in okatanoata sposoben sintetizirat mcl PHA homopolimere: PHHx in PHHp. Z zamenjavo genov mcl PHA sintaze, ''phaC1'' in ''phaC2'', z geni, ki kodirajo manj specifične PHA sintaze iz ''Aeromonas hydrophila'' 4AK4 je ''P. putida'' kopičila homopolimer PHV, če so rasle na valeratu. Nato so to manj specifično PHA sintazo zamenjali s scl PHA sintazo iz ''Ralstonie eutrophe''. Le-ta je sintetizirala homopolimere PHB in P4HB, ko je bakterija rastla v prisotnosti butirata ali β-butirolaktona. Iz tega sledi, da inženiring β-oksidacije omogoča nastanek PHA z definirano strukturo kot so homopolimeri, naključni ali blok kopolimeri in funkcionalni polimeri.
Pot ''in situ'' sinteza maščobnih kislin omogoča sintezo PHA monomerov različnih dolžin iz sladkorjev. Na primer ''Pseudomonas putida'' KT2440 je sposobna sinteze mcl PHA medtem ko raste na nesorodnih ogljikovih virih kot je glukoza. To odpira možnosti uporabe poceni surovin za sintezo mcl PHA polimerov.

==KLJUČNI ENCIM: PHA SINTAZA DOLOČA RAZNOLIKOST PHA==
Najbolj znane PHA sintaze so scl in mcl PHA sintaze. Zelo malo pa je sintaz, ki so sposobne kopolimerizirat oba PHA monomera, tako scl in mcl. To so nizko specifične PHA sintaze. Nizko specifični sintazi sta PhaC61-3 in PhaC21317 in izvirata iz ''Pseudomonas spp''.
Za izboljšano sintezo različnih PHA v ''E. coli'' so PHA sintazo PhaC21317 kodonsko optimizirali. Njena mRNA je bila stabilizirana z uporabo zanke, kar je vodilo v stabilen transkript in povišano ekspresijo PhaC21317. Ta optimizirana PhaC21317 je povečala PHB produkcijo za 16-krat v primerjavi z divjim tipom. Če je ''E. coli'' rasla na dodekanoatu je kopolimerizirala 4x več PHA, iz 3HB in mcl 3HA monomerov, v primerjavi s kontrolo. Rezultati kažejo, da je strategija uspešna za povišanje ekspresije PHA sintaze in raznolikosti PHA.

==SISTEMSKO-BIOLOŠKI PRISTOPI==
Za izboljšenje sevov se uporabljajo tudi sistemsko-biološki pristopi. Za PHA biosintezo so uporabili ''in silico'' metabolno modeliranje s katerim so za 100% izboljšali titer PHA v sevu ''P. putida''. Z uporabo ''in silico'' metabolnih modelov so naredili dvojni knockout (''Δgcd-aco'') seva ''P. putida'' KT2440 . Sev je dosegel dvakrat višjo koncentracijo mcl PHA v primerjavi z divjim tipom in višjo za 21% v primerjavi s sevom z enim knockout (''Δgcd''). Ti rezultati sugerirajo, da lahko z uporabo sistemske biologije in metabolnega modeliranja v prihodnje dosežemo raznolike PHA.

==INŽENIRING BAKTERIJSKE PHA SINTEZE Z UPORABO CRISPR==
CRISPR sistem je moč uporabiti za nadzorovanje PHA biosintezne poti in za prilagajanje sestave PHA. V sevu ''E. coli'' so naredili pot za sintezo PH3HB4HB iz glukoze, v katero je vključen tudi cikel citronske kisline. Z uporabo petih specifičnih sgRNA so preusmerili pretok ogljika v biosintezo 4HB, kar je omogočilo nastanek PH3HB4HB. S CRISPR sistemom so negativno regulirali gene ''sdhA'', ''sdhB'', ''sucC'', ''sucD'' in ''sad''. Nastali PH3HB4HB je vseboval 1-9 mol% 4HB. Vsebnost 4HB v P3HB4HB je mogoče prilagoditi od 1,4 do 1,8 mol %, odvisno od ekspresijskega nivoja genov. Rezultati kažejo, da je CHRISPR izvedljiv pristop hkratne manipulacije številnih genov in nadzora metabolnega pretoka v E. coli.

==SINTEZNA BIOLOGIJA IN RAZNOLIKOST PHA==
To je sigurno področje v kateri bo sintezna biologija lahko prinesla izredno zmanjšanje stroškov. Le-ta omogoča načrtovanje in sestavljanje novih poti za sintezo uporabnih PHA iz poceni in nesorodnih virov ogljika. Sintezna biologija je našla vlogo tudi v konstrukciji novih robustnih industrijskih sevov, ''Halomonas spp.'', ki omogoča učinkovito kontinuirano in odprto sintezo PHA. Tudi v zaključnem postopku je lahko vključena, npr. z poenostavljenimi celičnimi separacijami, kar lahko še dodatno zmanjša stroške proizvodnje.

==ZAKLJUČEK==
Raznolikost PHA lahko dosežemo s spreminjanjem specifičnosti PHA sintaz, kot tudi z metabolnim inžiniringom poti, ki sodelujejo pri sintezi PHA. Z razvojem metode urejanje genoma in ostalih pristopov molekularne biologije lahko sintetiziramo PHA z želenimi monomeri in s tem prilagodimo PHA razgradljivost, biokompatibilnost ter termične in mehanske lastnosti. Hkrati pa lahko izboljšamo tudi ekonomski vidik proizvodnje PHA.

==VIRI==
Chen G.-Q., Hajnal I., Wu H, Lv L. in Ye J. Engineering Biosynthesis Mechanisms for Diversfying Polyhydroxyalkanoates. Trends in Biotechnology, 2015, 33, 10,565-574.

Lv L., Ren Y.-L., Chen J.-C., Wu Q., Chen G.-Q. Application of CRISPRi for prokaryotic metabolic engineering involving multiple genes, a case study: Controllable P(3HB-co-4HB) biosynthesis. Metabolic Engineering, 2015, 29, 160-168.

Borrero-de Acuna J. M., Bielecka A., Haussler S., Schobert M., Jahn M., Wittmann C., Jahn D. in Poblete-Castro I. Production of medium chain length polyhydroxyalkanoate in metabolic flux optimized Pseudomonas putida. Microbial Cell Factories, 20014, 13.

Inženiring biosintetskih mehanizmov za raznolike polihidroksialkanoate

2016-01-11T06:59:27Z

Mojca Banič: New page: INŽENIRING BIOSINTEZNIH MEHANIZMOV ZA RAZNOLIKE POLIHIRDOKSIALKANOATE ==UVOD== Polihidroksialkanoati (PHA) vzbujajo posebno pozornost kot trajnostna »zelena plastika« z realno možnost...

INŽENIRING BIOSINTEZNIH MEHANIZMOV ZA RAZNOLIKE POLIHIRDOKSIALKANOATE

==UVOD==
Polihidroksialkanoati (PHA) vzbujajo posebno pozornost kot trajnostna »zelena plastika« z realno možnostjo, da nadomestijo svoje tekmece, ki temeljijo na nafti. Za dosego tega cilja morajo biti PHA sposobni tekmovati tako z mehanskimi lastnostmi kot z ekonomskimi vidiki z uveljavljenimi plastikami. PHA ima značilno unikatno kombinacijo biorazgradljivosti, biokompatibilnosti, termične in mehanske lastnosti, kot tudi raznoliko molekularno maso. Te lastnosti zavisijo od same strukture PHA. Pestrost PHA je povečana s funkcionalnimi in cepljenimi PHA, naključnimi in blok kopolimeri in tiopoliestri. Povečanje PHA raznolikosti omogoča inženiring 3 osnovnih metabolnih poti: acetil-CoA pot, β-oksidacija in ''in situ'' sinteza maščobnih kislin in tudi spreminjanje specifičnosti PHA sintaze.

==INŽENIRING BAKTERIJSKIH PHA SINTEZNIH MEHANIZMOV==
PHA sintezne poti potrebujejo dodatek substratov, ki so strukturno sorodni monomerom PHA, predvsem v obliki maščobnih kislin in alkohola. Ti substrati so izredno dragi, zato so ustvarili poti, ki uporabljajo sladkorje kot relativno poceni substrat. Z uporabo spektra mikroorganizmov, ustvarjanjem novih poti in povišanjem učinkovitosti pretvorbe so izboljšali lastnosti PHA, naredili PHA sintezo bolj ekonomsko in uvedli poti za povsem nove PHA.
V ''Ralstonii eutropha'' so le iz glukoze po inženirski metabolni poti acetil-CoA sintetizirali številne PHB kopolimere (: PHBLA, P3HP3HB, P3HB4HB in PHBHHx. Za sintezo P3HP pa so poleg glukoze uporabili tudi glicerol.
Omejevanje β-oksidacije maščobnih kislin v ''Pseudomonas putidi'' vodi v boljši maščobnokislinski pretok za sintezo številnih srednje dolgih verig PHA (mcl PHA). Sev je bil v prisotnosti heksanoata, heptanoata in okatanoata sposoben sintetizirat mcl PHA homopolimere: PHHx in PHHp. Z zamenjavo genov mcl PHA sintaze, ''phaC1'' in ''phaC2'', z geni, ki kodirajo manj specifične PHA sintaze iz ''Aeromonas hydrophila'' 4AK4 je ''P. putida'' kopičila homopolimer PHV, če so rasle na valeratu. Nato so to manj specifično PHA sintazo zamenjali s scl PHA sintazo iz ''Ralstonie eutrophe''. Le-ta je sintetizirala homopolimere PHB in P4HB, ko je bakterija rastla v prisotnosti butirata ali β-butirolaktona. Iz tega sledi, da inženiring β-oksidacije omogoča nastanek PHA z definirano strukturo kot so homopolimeri, naključni ali blok kopolimeri in funkcionalni polimeri.
Pot ''in situ'' sinteza maščobnih kislin omogoča sintezo PHA monomerov različnih dolžin iz sladkorjev. Na primer ''Pseudomonas putida'' KT2440 je sposobna sinteze mcl PHA medtem ko raste na nesorodnih ogljikovih virih kot je glukoza. To odpira možnosti uporabe poceni surovin za sintezo mcl PHA polimerov.

==KLJUČNI ENCIM: PHA SINTAZA DOLOČA RAZNOLIKOST PHA==
Najbolj znane PHA sintaze so scl in mcl PHA sintaze. Zelo malo pa je sintaz, ki so sposobne kopolimerizirat oba PHA monomera, tako scl in mcl. To so nizko specifične PHA sintaze. Nizko specifični sintazi sta PhaC61-3 in PhaC21317 in izvirata iz ''Pseudomonas spp''.
Za izboljšano sintezo različnih PHA v ''E. coli'' so PHA sintazo PhaC21317 kodonsko optimizirali. Njena mRNA je bila stabilizirana z uporabo zanke, kar je vodilo v stabilen transkript in povišano ekspresijo PhaC21317. Ta optimizirana PhaC21317 je povečala PHB produkcijo za 16-krat v primerjavi z divjim tipom. Če je ''E. coli'' rasla na dodekanoatu je kopolimerizirala 4x več PHA, iz 3HB in mcl 3HA monomerov, v primerjavi s kontrolo. Rezultati kažejo, da je strategija uspešna za povišanje ekspresije PHA sintaze in raznolikosti PHA.

==SISTEMSKO-BIOLOŠKI PRISTOPI==
Za izboljšenje sevov se uporabljajo tudi sistemsko-biološki pristopi. Za PHA biosintezo so uporabili ''in silico'' metabolno modeliranje s katerim so za 100% izboljšali titer PHA v sevu ''P. putida''. Z uporabo ''in silico'' metabolnih modelov so naredili dvojni knockout (''Δgcd-aco'') seva ''P. putida'' KT2440 . Sev je dosegel dvakrat višjo koncentracijo mcl PHA v primerjavi z divjim tipom in višjo za 21% v primerjavi s sevom z enim knockout (''Δgcd''). Ti rezultati sugerirajo, da lahko z uporabo sistemske biologije in metabolnega modeliranja v prihodnje dosežemo raznolike PHA.

==INŽENIRING BAKTERIJSKE PHA SINTEZE Z UPORABO CRISPR==
CRISPR sistem je moč uporabiti za nadzorovanje PHA biosintezne poti in za prilagajanje sestave PHA. V sevu ''E. coli'' so naredili pot za sintezo PH3HB4HB iz glukoze, v katero je vključen tudi cikel citronske kisline. Z uporabo petih specifičnih sgRNA so preusmerili pretok ogljika v biosintezo 4HB, kar je omogočilo nastanek PH3HB4HB. S CRISPR sistemom so negativno regulirali gene ''sdhA'', ''sdhB'', ''sucC'', ''sucD'' in ''sad''. Nastali PH3HB4HB je vseboval 1-9 mol% 4HB. Vsebnost 4HB v P3HB4HB je mogoče prilagoditi od 1,4 do 1,8 mol %, odvisno od ekspresijskega nivoja genov. Rezultati kažejo, da je CHRISPR izvedljiv pristop hkratne manipulacije številnih genov in nadzora metabolnega pretoka v E. coli.

==SINTEZNA BIOLOGIJA IN RAZNOLIKOST PHA==
To je sigurno področje v kateri bo sintezna biologija lahko prinesla izredno zmanjšanje stroškov. Le-ta omogoča načrtovanje in sestavljanje novih poti za sintezo uporabnih PHA iz poceni in nesorodnih virov ogljika. Sintezna biologija je našla vlogo tudi v konstrukciji novih robustnih industrijskih sevov, ''Halomonas spp.'', ki omogoča učinkovito kontinuirano in odprto sintezo PHA. Tudi v zaključnem postopku je lahko vključena, npr. z poenostavljenimi celičnimi separacijami, kar lahko še dodatno zmanjša stroške proizvodnje.

==ZAKLJUČEK==
Raznolikost PHA lahko dosežemo s spreminjanjem specifičnosti PHA sintaz, kot tudi z metabolnim inžiniringom poti, ki sodelujejo pri sintezi PHA. Z razvojem metode urejanje genoma in ostalih pristopov molekularne biologije lahko sintetiziramo PHA z želenimi monomeri in s tem prilagodimo PHA razgradljivost, biokompatibilnost ter termične in mehanske lastnosti. Hkrati pa lahko izboljšamo tudi ekonomski vidik proizvodnje PHA.

==VIRI==
Chen G.-Q., Hajnal I., Wu H, Lv L. in Ye J. Engineering Biosynthesis Mechanisms for Diversfying Polyhydroxyalkanoates. Trends in Biotechnology, 2015, 33, 10,565-574.

Lv L., Ren Y.-L., Chen J.-C., Wu Q., Chen G.-Q. Application of CRISPRi for prokaryotic metabolic engineering involving multiple genes, a case study: Controllable P(3HB-co-4HB) biosynthesis. Metabolic Engineering, 2015, 29, 160-168.

Borrero-de Acuna J. M., Bielecka A., Haussler S., Schobert M., Jahn M., Wittmann C., Jahn D. in Poblete-Castro I. Production of medium chain length polyhydroxyalkanoate in metabolic flux optimized Pseudomonas putida. Microbial Cell Factories, 20014, 13.

Imobilizacija in nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze iz hitozanskega hidrogela

2015-04-15T20:56:01Z

Mojca Banič:

==UVOD IN OPREDELITEV PROBLEMA==

Beta galaktozidaza je encim, ki katalizira hidrolizo laktoze v glukozo in galaktozo. Najdemo jo v prebavnem sistemu sesalcev in v sadju kot so jabolka, breskve in mandeljni. Najbolj pogost komercialni vir β-galaktozidaze pa predstavljajo glive. β-galaktozidaza se v industriji najbolj uporablja za hidrolizo laktoze do monosaharidov pri proizvodnji mleka in mlečnih izdelkov brez laktoze. Hrana brez laktoze je še posebej pomembna za laktozno intolerantne posameznike, ki imajo zmanjšano sposobnost presnavljanja laktoze. Laktozna intoleranca ali hipolaktazija je presnovna motnja, ki nastopi zaradi pomanjkanja β-galaktozidaze v prebavnem sistemu. To ni zgolj motnja, ampak je lahko tudi genetsko posredovana lastnost. Pri laktozno intolerantnih posameznikih lahko zaužitje laktoze povzroči napihnjen trebuh, krče, diarejo, slabost in bruhanje. Najpogostejši pristop za zmanjšanje stranskih učinkov je izogibanje uživanja hrane, ki vsebuje laktozo, vendar hrana brez laktoze lahko povzroči pomanjkanje kalcija, fosforja in nekaterih vitaminov, kar lahko vodi v demineralizacijo kosti. Nezaželene stranske učinke lahko zmanjšamo tudi z zaužitjem β-galaktozidaze. Na tržišču le-ta obstaja v tekoči obliki ali pa je imobilizirana za oralni vnos pred zaužitjem hrane, ki vsebuje visoke koncentracije laktoze. Za ti dve obliki encimov ni nujno da hidrolizirajo 100% zaužite laktoze, saj se encimi lahko razgradijo že takoj ob stiku s prebavnim traktom, prav tako se lahko tudi matriks na katerem so imobilizirani encimi in posledično se iz njega encimi sprostijo prehitro. Alternativa temu bi bila uporaba prepustnega polimernega matriksa z aktivno površino, ki omogoča kemijsko adsorpcijo β-galaktozidaze za poznejše sproščanje encima. V tem primeru se nadzoruje sproščanje encima za povečanje življenjske dobe v prebavnem traktu. Iz tehnološkega vidika so polisaharidni hidrogeli zanimive alternative za polimerne matrice pri proizvodnji tablet z nadzorovanim sproščanjem. Biorazgradljivost, biokompatibilnost in ne toksičnost hidrogelov so odlične lastnosti za biološke, farmacevtske in medicinske aplikacije.

==CILJ RAZISKAVE==

V tem raziskovalnem projektu so sintetizirali hitozanski hidrogel in ga uporabili za imobilizacijo in nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze pri laktozno intolerantnih posameznikih in za pridelavo hrane z nizko vsebnostjo laktoze.

==POSTOPEK DELA==

Pripravili so kopolimeriziran hitozanski hidrogel z akrilno kislino, kateremu so merili kakšna je stopnja nabrekanja. Najbolj učinkovita absorpcija je pri višji temperaturi zaradi destabilizacije mrežnih stikov, kar povzroči razširjanje matriksa po tem, ko voda difundira v pore. β-galaktozidazo so imobilizirali tako, da so posušeni hidrogel potopili v raztopino β-galaktozidaze, po 240 minutah je matrica dosegla nasičenje in adsorbiralo se je 16,8 mg β-galaktozidaze na g suhega hidrogela.
Za preverjanje encimske aktivnosti so hidrogel, ki je vseboval imobilizirane β-galaktozidaze presneli v raztopino laktoze in nastalo glukozo v raztopini analizirali v časovnih intervalih. Največja encimska aktivnost je na začetku, sledi hitri upad, vendar aktivnost potem ostaja konstantna. Spremljali so tudi aktivnost β-galaktozidaze po ponovni uporabi hidrogela z imobiliziranimi encimi. Encimska aktivnost je med seboj primerljiva v petih zaporednih ciklih katalize. Nato so aktivnost preverjali tudi v mleku in s tem je nastalo mleko z nizko vsebnostjo laktoze. V industriji bi to predstavljalo nižje stroške procesa, saj so imobilizirani encimi dovolj učinkoviti, predvsem pa so lahko ponovno uporabljeni za hidrolizo laktoze.
Namen te raziskave je ugotoviti ali je hitozanski hidrogel primerna matrica za nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze. Hidrogel, ki vsebuje imobilizirane encime so prenesli v raztopino laktoze in po 240 min namakanja je bil le-ta odstranjen. Po 120 min so merili glukozno koncentracijo, ki je kontinuirano naraščala v odsotnosti imobilizirane β-galaktozidaze, za kar so predpostavljali, da so encimi difundirali iz notranjih por hidrogela v raztopino med prvimi 240 min in kasnejšo hidrolizo laktoze. Pregledali so tudi kako pH vpliva na sproščanje encimov iz hitozanskega hidrogela. Pri višjem pH se sprosti več encimov v primerjavi z nizkim pH, kar predstavlja obetajoč sistem sproščanja encimov pri kislem pH.

==ZAKLJUČEK==

Na podlagi podatkov pridobljenih v tej raziskavi je mogoče najti uporabnost hitozanskih hidrogelov za številne aplikacije, ki vključujejo hidrolizo laktoze. Imobilizirane encime, kot je β-galaktozidaza, se lahko uporablja večkrat v poroznih hidrogelih brez izgube aktivnosti in tako ustvarjajo poceni proizvodne procese pri pridelavi hrane brez laktoze. Uporabnost poleg živilske industrije obstaja v medicini in farmacevtski industriji. Nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze iz hitozanskega hidrogela bi pretvorilo laktozo v glukozo v laktozno intolerantnih posameznikih pri več kot enem ciklu katalize brez izgube encimske aktivno

Imobilizacija in nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze iz hitozanskega hidrogela

2015-04-14T08:58:19Z

Mojca Banič:

==UVOD IN OPREDELITEV PROBLEMA==

Beta galaktozidaza je encim, ki katalizira hidrolizo laktoze v glukozo in galaktozo. Najdemo jo v prebavnem sistemu sesalcev in v sadju kot so jabolka, breskve in mandeljni. Najbolj pogost komercialni vir β-galaktozidaze pa predstavljajo glive. β-galaktozidaza se v industriji najbolj uporablja za hidrolizo laktoze do monosaharidov pri proizvodnji mleka in mlečnih izdelkov brez laktoze. Hrana brez laktoze je še posebej pomembna za laktozno intolerantne posameznike, ki imajo zmanjšano sposobnost presnavljanja laktoze. Laktozna intoleranca ali hipolaktazija je presnovna motnja, ki nastopi zaradi pomanjkanja β-galaktozidaze v prebavnem sistemu. To ni zgolj motnja, ampak je lahko tudi genetsko posredovana lastnost. Pri laktozno intolerantnih posameznikih lahko zaužitje laktoze povzroči napihnjen trebuh, krče, diarejo, slabost in bruhanje. Najpogostejši pristop za zmanjšanje stranskih učinkov je izogibanje uživanja hrane, ki vsebuje laktozo, vendar hrana brez laktoze lahko povzroči pomanjkanje kalcija, fosforja in nekaterih vitaminov, kar lahko vodi v demineralizacijo kosti. Nezaželene stranske učinke lahko zmanjšamo tudi z zaužitjem β-galaktozidaze. Na tržišču le-ta obstaja v tekoči obliki ali pa je imobilizirana za oralni vnos pred zaužitjem hrane, ki vsebuje visoke koncentracije laktoze. Za ti dve obliki encimov ni nujno da hidrolizirajo 100% zaužite laktoze, saj se encimi lahko razgradijo že takoj ob stiku s prebavnim traktom, prav tako se lahko tudi matriks na katerem so imobilizirani encimi in posledično se iz njega encimi sprostijo prehitro. Alternativa temu bi bila uporaba prepustnega polimernega matriksa z aktivno površino, ki omogoča kemijsko adsorpcijo β-galaktozidaze za poznejše sproščanje encima. V tem primeru se nadzoruje sproščanje encima za povečanje življenjske dobe v prebavnem traktu. Iz tehnološkega vidika so polisaharidni hidrogeli zanimive alternative za polimerne matrice pri proizvodnji tablet z nadzorovanim sproščanjem. Biorazgradljivost, biokompatibilnost in ne toksičnost hidrogelov so odlične lastnosti za biološke, farmacevtske in medicinske aplikacije.

==CILJ RAZISKAVE==

V tem raziskovalnem projektu so sintetizirali hitozanski hidrogel in ga uporabili za imobilizacijo in nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze pri laktozno intolerantnih posameznikih in za pridelavo hrane z nizko vsebnostjo laktoze.

==POSTOPEK DELA==

Pripravili so kopolimeriziran hitozanski hidrogel z akrilno kislino, kateremu so merili kakšna je stopnja nabrekanja. Najbolj učinkovita absorpcija je pri višji temperaturi zaradi destabilizacije mrežnih stikov, kar povzroči razširjanje matriksa po tem, ko voda difundira v pore. β-galaktozidazo so imobilizirali tako, da so posušeni hidrogel potopili v raztopino β-galaktozidaze, po 240 minutah je matrica dosegla nasičenje in adsorbiralo se je 16,8 mg β-galaktozidaze na g suhega hidrogela.
Za preverjanje encimske aktivnosti so hidrogel, ki je vseboval imobilizirane β-galaktozidaze presneli v raztopino laktoze in nastalo glukozo v raztopini analizirali v časovnih intervalih. Največja encimska aktivnost je na začetku, sledi hitri upad, vendar aktivnost potem ostaja konstantna. Spremljali so tudi aktivnost β-galaktozidaze po ponovni uporabi hidrogela z imobiliziranimi encimi. Encimska aktivnost je med seboj primerljiva v petih zaporednih ciklih katalize. Nato so aktivnost preverjali tudi v mleku in s tem je nastalo mleko z nizko vsebnostjo laktoze. V industriji bi to predstavljalo nižje stroške procesa, saj so imobilizirani encimi dovolj učinkoviti, predvsem pa so lahko ponovno uporabljeni za hidrolizo laktoze.
Namen te raziskave je ugotoviti ali je hitozanski hidrogel primerna matrica za nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze. Hidrogel, ki vsebuje imobilizirane encime so prenesli v raztopino laktoze in po 240 min namakanja je bil le-ta odstranjen. Po 120 min so merili glukozno koncentracijo, ki je kontinuirano naraščala v odsotnosti imobilizirane β-galaktozidaze, za kar so predpostavljali, da so encimi difundirali iz notranjih por hidrogela v raztopino med prvimi 240 min in kasnejšo hidrolizo laktoze. Pregledali so tudi kako pH vpliva na sproščanje encimov iz hitozanskega hidrogela. Pri višjem pH se sprosti več encimov kot v primerjavi z nizkim pH, kar predstavljaj obetajoč sistem sproščanja encimov pri kislem pH.

==ZAKLJUČEK==

Na podlagi podatkov pridobljenih v tej raziskavi je mogoče najti uporabnost hitozanskih hidrogelov za številne aplikacije, ki vključujejo hidrolizo laktoze. Imobilizirane encime, kot je β-galaktozidaza, se lahko uporablja večkrat v poroznih hidrogelih brez izgube aktivnosti in tako ustvarjajo poceni proizvodne procese pri pridelavi hrane brez laktoze. Uporabnost poleg živilske industrije obstaja v medicini in farmacevtski industriji. Nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze iz hitozanskega hidrogela bi pretvorilo laktozo v glukozo v laktozno intolerantnih posameznikih pri več kot enem ciklu katalize brez izgube encimske aktivno

MBT seminarji 2015

2015-04-14T08:54:35Z

Mojca Banič:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2014/15'''

Tabela za razpored po tednih bo objavljena v spletni učilnici, vanjo pa se vpišite tudi za kratke predstavitve novic (3 min, dvakrat v semestru). Na tej strani bo samo seznam odobrenih člankov za seminar in povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje tri dni pred predstavitvijo (ponedeljek oz. torek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. lani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2014
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# Successful high-level accumulation of fish oil omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in a transgenic oilseed crop (Ruiz-Lopez, N., et al; The plant journal 77, 198-208, 2014; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24308505). [[Uspešna priprava gensko spremenjene oljne rastline z visoko vsebnostjo omega-3 polinenasičenih maščobnih kislin.]] Petra Malavašič, 20. marca 2015
#A simpliﬁed and accurate detection of the genetically modiﬁed wheat MON71800 with one calibrator plasmid (Jae Juan, S.,et al; Food Chemistry 176, 1-6, ;http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S03088146140196572015 [[Poenostavljena in točna detekcija gensko spemenjene pšenice MON71800 z enim kalibratorskim plazmidom]]. Matej Lesar, 20. marca 2015

'''Gensko spremenjene živali''' 
# [[A novel adenoviral vector carrying an all-in-one Tet-On system with an autoregulatory loop for tight, inducible transgene expresion]] (H. Chen; et all.; BMC Biotechnology 2015, 15:4, doi:10.1186/s12896-015-0121-4; http://www.biomedcentral.com/1472-6750/15/4). Edvinas Grauželis, 27. marca 2015 (in English)
# Production of functional active human growth factors in insects used as living biofactories (B. Dudognon, et al; Journal of Biotechnology 184, 229–239, 2014; http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2014.05.030). [[Proizvodnja funkcionalno aktivnih človeških rastnih faktorjev v insektih uporabljenih kot žive biotovarne]] Maxi Sagmeister, 27. marca 2015

'''Okolje''' 
# Bioremediation of pesticide contaminated water using an organophosphate degrading enzyme immobilized on nonwoven polyester textiles (Yuan Gao ''et al.'', Enzyme and Microbial Technology, vol. 54, pages 38-44, 10.1.2014, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022913002044). [[Bioremediacija s pesticidi okužene vode z uporabo encima, ki razgrajuje organofosfate in je vezan na netkan poliestrski tekstil]]. Mitja Crček, 3. aprila 2015
# Biodegradation of atrazine by three transgenic grasses and alfalfa expressing a modified bacterial atrazine chlorohydrolase gene (A. W. Vail ''et al.''; Transgenic Research, 29. 11. 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s11248-014-9851-7). [[Biorazgradnja atrazina s tremi transgenskimi travami in lucerno, ki izražajo gen za modificirano bakterijsko atrazin klorohidrolazo]]. Mirjam Kmetič, 3. aprila 2015

'''Terapevtiki''' 
# Glycosylated enfuvirtide: A long-lasting glycopeptide with potent anti-HIV activity; http://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jm5016582 Sebastian Pleško, 10. aprila
# Microbicidal effects of α- and θ-defensins against antibiotic-resistant Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa; http://ini.sagepub.com/content/21/1/17.long. [[Mikrobicidno delovanje α in θ defenzinov na antibiotik-odporne Staphylococcus aureus in Pseudomonas aeruginosa]]. Ana Kapraljević, 10. aprila

'''Encimi''' 
# Immobilization and controlled release of β-galactosidase from chitosan-grafted hydrogels; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814615001028. [[Imobilizacija in nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze iz hitozanskega hidrogela]]. Mojca Banič, 16. aprila 2015
# Construction of efficient xylose utilizing ''Pichia pastoris'' for industrial enzyme production (Li ''et al''; Microbial Cell Factories 14:22, 1-10, 2015; http://www.microbialcellfactories.com/content/14/1/22). [[Priprava Pichie pastoris, ki učinkovito uporablja ksilozo, za industrijsko proizvodnjo encimov]]. Špela Tomaž, 17. aprila 2015
# Postharvest application of a novel chitinase cloned from Metschnikowia fructicola and overexpressed in Pichia pastoris to control brown rot of peaches; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160515000033. [[Uporaba hitinaze, klonirane iz Metschnikowie fructicola in prekomerno izražene v Pichii pastoris za nadzor rjave gnilobe breskev po obiranju]] Špela Pohleven, 17. aprila 2015

'''Protitelesa''' 
# Optimization of heavy chain and light chain signal peptides for high level expression of therapeutic antibodies in CHO cells; http://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0116878. Tjaša Blatnik, 23. aprila 2015
# Ethanol precipitation for purification of recombinant antibodies (A. Tscheliessnig ''et al''; Journal of Biotechnology 188, 17-28, 2014; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165614007810). Čiščenje rekombinantnih protiteles z obarjanjem z etanolom. Urška Rauter, 24. aprila 2015
# Functional mutations in and characterization of VHH against Helicobacter pylori urease (R. Hoseinpoor ''et al''; Applied Biochemistry and Biotechnology 172, 3079-3091, 2014; http://link.springer.com/article/10.1007/s12010-014-0750-4). Funkcionalne mutacije in karakterizacija VHH proti ureazi ''Helicobacter pylori''. Marko Radojković, 7. maja 2015

'''Cepiva''' 
# Development of anti-E6 pegylated lipoplexes for mucosal application in the context of cervical preneoplastic lesions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378517315001507. Tanja Korpar, 7. maja 2015
# A novel “priming-boosting” strategy for immune interventions in cervical cancer (S. Liao et al.; Molecular Immunology 64, 295-305, 2015, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161589014003460. Nova "priming-boosting" strategija za imunsko posredovanje pri raku materničnega vratu. Anita Kustec, 8. maja 2015
# Potentiation of anthrax vaccines using protective antigen-expressing viral replicon vectors (H.C. Wang et al.; Immunology letters 163, 206-213, 2015, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25102364 ) Izboljšava cepiv proti antraksu z uporabo iz virusnih replikonov izvedenih vektorjev, ki omogočajo izražanje zaščitnega antigena. Daša Pavc, 8. maja 2015

'''Male molekule in polimeri''' 
# Methanol-induced chain termination in poly(3-hydroxybutyrate) biopolymers: Molecular weight control; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008307. Gašper Lavrenčič, 14. maja 2015
# Purification and characterization of gamma poly glutamic acid from newly Bacillus licheniformis NRC20; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813014008216. Uroš Stupar, 14. maja 2015
# Iza Ogris, 15. maja 2015
# Chromosomal integration of hyaluronic acid synthesis (''has'') genes enhances the molecular weight of hyaluronan produced in ''Lactococcus lactis'' (R. V. Hmar et al; Biotechnol. J. 9 (12), 2014; http://dx.doi.org/10.1002/biot.201400215) Integracija genov za sintezo hialuronske kisline v kromosom bakterije ''Lactococcus lactis'' izboljša sintezo visokomolekularne hialuronske kisline. Maja Grdadolnik, 15. maja 2015

'''Pretvorba biomase''' 
# Effect of pretreatment methods on the synergism of cellulase and xylanase during the hydrolysis of bagasse; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415002114. Eva Lucija Kozak, 21. maja 2015
# Third generation biohydrogen production by Clostridium butyricum and adapted mixed cultures from Scenedesmus obliquus microalga biomass; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016236115002550?np=y. Nives Naraglav, 22. maja 2015
# Bio-catalytic action of twin-screw extruder enzymatic hydrolysis on the deconstruction of annual plant material: Case of sweet corn co-products; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0926669015000436. Griša Prinčič, 22. maja 2015

'''Metabolično inženirstvo''' 
# Engineering lipid overproduction in the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717615000166. Andreja Bratovš, 28. maja 2015
# Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of fatty acid-derived biofuels and chemicals (Weerawat Runguphana, Jay D. Keasling; Metabolic Engineering, vol 21, January 2014, Pages 103–113; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717613000670). Metabolično inženirstvo ''Saccharomyces cerevisiae'' za proizvodnjo derivatov maščobnih kislin, ki so primerni za biogorivo in kemikalije. Dominik Kert, 29. maja 2015
# Metabolic engineering of Klebsiella pneumoniae for the production of cis,cis-muconic acid (Jung,H.-M. Jung,M.-Y. Oh, M.-K.;Applied Microbiology and Biotechnology, Published online: 14 February 2015; http://link.springer.com/article/10.1007/s00253-015-6442-3). Metabolno inženirstvo Klebsiella pneumoniae za produkcijo cis,cis-mukonične kisline. Jure Zabret, 29. maja 2015

'''Biološki viri energije''' 
# Anodic and cathodic microbial communities in single chamber microbial fuel cells; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1871678414021694. Tamara Marić, 4. junija 2015
# Combination of dry dark fermentation and mechanical pretreatment for lignocellulosic deconstruction: An innovative strategy for biofuels and volatile fatty acids recovery; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0306261915002196. Jernej Pušnik, 4. junija 2015
# Potential use of feedlot cattle manure for bioethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852415001960. Nastja Pirman, 5. junija 2015
# Cellulolytic enzymes produced by a newly isolated soil fungus Penicillium sp. TG2 with potential for use in cellulosic ethanol production; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960148114007022. Jana Verbančič, 5. junija 2015

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' 
# Exploring the potential of algae/bacteria interactions; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166915000269. Matja Zalar, 11. junija
# How close we are to achieving commercially viable large-scale photobiological hydrogen production by cyanobacteria: A review of the biological aspects; http://www.mdpi.com/2075-1729/5/1/997/htm. Monika Škrjanc, 11. junija
# Mind-controlled transgene expression by a wireless-powered optogenetic designer cell implant (M. Folcher; Nature Communications 5, 1–11, 2014; http://www.nature.com/ncomms/2014/141111/ncomms6392/full/ncomms6392.html) Z EEG nadzorovano izražanje transgena preko brezžično napajanega optogenetskega celičnega vsadka. Luka Smole, 11. junija 2015

Imobilizacija in nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze iz hitozanskega hidrogela

2015-04-14T08:51:10Z

Mojca Banič:

UVOD IN OPREDELITEV PROBLEMA

Beta galaktozidaza je encim, ki katalizira hidrolizo laktoze v glukozo in galaktozo. Najdemo jo v prebavnem sistemu sesalcev in v sadju kot so jabolka, breskve in mandeljni. Najbolj pogost komercialni vir β-galaktozidaze pa predstavljajo glive. β-galaktozidaza se v industriji najbolj uporablja za hidrolizo laktoze do monosaharidov pri proizvodnji mleka in mlečnih izdelkov brez laktoze. Hrana brez laktoze je še posebej pomembna za laktozno intolerantne posameznike, ki imajo zmanjšano sposobnost presnavljanja laktoze. Laktozna intoleranca ali hipolaktazija je presnovna motnja, ki nastopi zaradi pomanjkanja β-galaktozidaze v prebavnem sistemu. To ni zgolj motnja, ampak je lahko tudi genetsko posredovana lastnost. Pri laktozno intolerantnih posameznikih lahko zaužitje laktoze povzroči napihnjen trebuh, krče, diarejo, slabost in bruhanje. Najpogostejši pristop za zmanjšanje stranskih učinkov je izogibanje uživanja hrane, ki vsebuje laktozo, vendar hrana brez laktoze lahko povzroči pomanjkanje kalcija, fosforja in nekaterih vitaminov, kar lahko vodi v demineralizacijo kosti. Nezaželene stranske učinke lahko zmanjšamo tudi z zaužitjem β-galaktozidaze. Na tržišču le-ta obstaja v tekoči obliki ali pa je imobilizirana za oralni vnos pred zaužitjem hrane, ki vsebuje visoke koncentracije laktoze. Za ti dve obliki encimov ni nujno da hidrolizirajo 100% zaužite laktoze, saj se encimi lahko razgradijo že takoj ob stiku s prebavnim traktom, prav tako se lahko tudi matriks na katerem so imobilizirani encimi in posledično se iz njega encimi sprostijo prehitro. Alternativa temu bi bila uporaba prepustnega polimernega matriksa z aktivno površino, ki omogoča kemijsko adsorpcijo β-galaktozidaze za poznejše sproščanje encima. V tem primeru se nadzoruje sproščanje encima za povečanje življenjske dobe v prebavnem traktu. Iz tehnološkega vidika so polisaharidni hidrogeli zanimive alternative za polimerne matrice pri proizvodnji tablet z nadzorovanim sproščanjem. Biorazgradljivost, biokompatibilnost in ne toksičnost hidrogelov so odlične lastnosti za biološke, farmacevtske in medicinske aplikacije.

CILJ RAZISKAVE

V tem raziskovalnem projektu so sintetizirali hitozanski hidrogel in ga uporabili za imobilizacijo in nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze pri laktozno intolerantnih posameznikih in za pridelavo hrane z nizko vsebnostjo laktoze.

POSTOPEK DELA

Pripravili so kopolimeriziran hitozanski hidrogel z akrilno kislino, kateremu so merili kakšna je stopnja nabrekanja. Najbolj učinkovita absorpcija je pri višji temperaturi zaradi destabilizacije mrežnih stikov, kar povzroči razširjanje matriksa po tem, ko voda difundira v pore. β-galaktozidazo so imobilizirali tako, da so posušeni hidrogel potopili v raztopino β-galaktozidaze, po 240 minutah je matrica dosegla nasičenje in adsorbiralo se je 16,8 mg β-galaktozidaze na g suhega hidrogela.
Za preverjanje encimske aktivnosti so hidrogel, ki je vseboval imobilizirane β-galaktozidaze presneli v raztopino laktoze in nastalo glukozo v raztopini analizirali v časovnih intervalih. Največja encimska aktivnost je na začetku, sledi hitri upad, vendar aktivnost potem ostaja konstantna. Spremljali so tudi aktivnost β-galaktozidaze po ponovni uporabi hidrogela z imobiliziranimi encimi. Encimska aktivnost je med seboj primerljiva v petih zaporednih ciklih katalize. Nato so aktivnost preverjali tudi v mleku in s tem je nastalo mleko z nizko vsebnostjo laktoze. V industriji bi to predstavljalo nižje stroške procesa, saj so imobilizirani encimi dovolj učinkoviti, predvsem pa so lahko ponovno uporabljeni za hidrolizo laktoze.
Namen te raziskave je ugotoviti ali je hitozanski hidrogel primerna matrica za nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze. Hidrogel, ki vsebuje imobilizirane encime so prenesli v raztopino laktoze in po 240 min namakanja je bil le-ta odstranjen. Po 120 min so merili glukozno koncentracijo, ki je kontinuirano naraščala v odsotnosti imobilizirane β-galaktozidaze, za kar so predpostavljali, da so encimi difundirali iz notranjih por hidrogela v raztopino med prvimi 240 min in kasnejšo hidrolizo laktoze. Pregledali so tudi kako pH vpliva na sproščanje encimov iz hitozanskega hidrogela. Pri višjem pH se sprosti več encimov kot v primerjavi z nizkim pH, kar predstavljaj obetajoč sistem sproščanja encimov pri kislem pH.

ZAKLJUČEK

Na podlagi podatkov pridobljenih v tej raziskavi je mogoče najti uporabnost hitozanskih hidrogelov za številne aplikacije, ki vključujejo hidrolizo laktoze. Imobilizirane encime, kot je β-galaktozidaza, se lahko uporablja večkrat v poroznih hidrogelih brez izgube aktivnosti in tako ustvarjajo poceni proizvodne procese pri pridelavi hrane brez laktoze. Uporabnost poleg živilske industrije obstaja v medicini in farmacevtski industriji. Nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze iz hitozanskega hidrogela bi pretvorilo laktozo v glukozo v laktozno intolerantnih posameznikih pri več kot enem ciklu katalize brez izgube encimske aktivno

Imobilizacija in nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze iz hitozanskega hidrogela

2015-04-14T08:50:50Z

Mojca Banič: New page: UVOD IN OPREDELITEV PROBLEMA Beta galaktozidaza je encim, ki katalizira hidrolizo laktoze v glukozo in galaktozo. Najdemo jo v prebavnem sistemu sesalcev in v sadju kot so jabolka, breskve...

UVOD IN OPREDELITEV PROBLEMA
Beta galaktozidaza je encim, ki katalizira hidrolizo laktoze v glukozo in galaktozo. Najdemo jo v prebavnem sistemu sesalcev in v sadju kot so jabolka, breskve in mandeljni. Najbolj pogost komercialni vir β-galaktozidaze pa predstavljajo glive. β-galaktozidaza se v industriji najbolj uporablja za hidrolizo laktoze do monosaharidov pri proizvodnji mleka in mlečnih izdelkov brez laktoze. Hrana brez laktoze je še posebej pomembna za laktozno intolerantne posameznike, ki imajo zmanjšano sposobnost presnavljanja laktoze. Laktozna intoleranca ali hipolaktazija je presnovna motnja, ki nastopi zaradi pomanjkanja β-galaktozidaze v prebavnem sistemu. To ni zgolj motnja, ampak je lahko tudi genetsko posredovana lastnost. Pri laktozno intolerantnih posameznikih lahko zaužitje laktoze povzroči napihnjen trebuh, krče, diarejo, slabost in bruhanje. Najpogostejši pristop za zmanjšanje stranskih učinkov je izogibanje uživanja hrane, ki vsebuje laktozo, vendar hrana brez laktoze lahko povzroči pomanjkanje kalcija, fosforja in nekaterih vitaminov, kar lahko vodi v demineralizacijo kosti. Nezaželene stranske učinke lahko zmanjšamo tudi z zaužitjem β-galaktozidaze. Na tržišču le-ta obstaja v tekoči obliki ali pa je imobilizirana za oralni vnos pred zaužitjem hrane, ki vsebuje visoke koncentracije laktoze. Za ti dve obliki encimov ni nujno da hidrolizirajo 100% zaužite laktoze, saj se encimi lahko razgradijo že takoj ob stiku s prebavnim traktom, prav tako se lahko tudi matriks na katerem so imobilizirani encimi in posledično se iz njega encimi sprostijo prehitro. Alternativa temu bi bila uporaba prepustnega polimernega matriksa z aktivno površino, ki omogoča kemijsko adsorpcijo β-galaktozidaze za poznejše sproščanje encima. V tem primeru se nadzoruje sproščanje encima za povečanje življenjske dobe v prebavnem traktu. Iz tehnološkega vidika so polisaharidni hidrogeli zanimive alternative za polimerne matrice pri proizvodnji tablet z nadzorovanim sproščanjem. Biorazgradljivost, biokompatibilnost in ne toksičnost hidrogelov so odlične lastnosti za biološke, farmacevtske in medicinske aplikacije.

CILJ RAZISKAVE
V tem raziskovalnem projektu so sintetizirali hitozanski hidrogel in ga uporabili za imobilizacijo in nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze pri laktozno intolerantnih posameznikih in za pridelavo hrane z nizko vsebnostjo laktoze.

POSTOPEK DELA
Pripravili so kopolimeriziran hitozanski hidrogel z akrilno kislino, kateremu so merili kakšna je stopnja nabrekanja. Najbolj učinkovita absorpcija je pri višji temperaturi zaradi destabilizacije mrežnih stikov, kar povzroči razširjanje matriksa po tem, ko voda difundira v pore. β-galaktozidazo so imobilizirali tako, da so posušeni hidrogel potopili v raztopino β-galaktozidaze, po 240 minutah je matrica dosegla nasičenje in adsorbiralo se je 16,8 mg β-galaktozidaze na g suhega hidrogela.
Za preverjanje encimske aktivnosti so hidrogel, ki je vseboval imobilizirane β-galaktozidaze presneli v raztopino laktoze in nastalo glukozo v raztopini analizirali v časovnih intervalih. Največja encimska aktivnost je na začetku, sledi hitri upad, vendar aktivnost potem ostaja konstantna. Spremljali so tudi aktivnost β-galaktozidaze po ponovni uporabi hidrogela z imobiliziranimi encimi. Encimska aktivnost je med seboj primerljiva v petih zaporednih ciklih katalize. Nato so aktivnost preverjali tudi v mleku in s tem je nastalo mleko z nizko vsebnostjo laktoze. V industriji bi to predstavljalo nižje stroške procesa, saj so imobilizirani encimi dovolj učinkoviti, predvsem pa so lahko ponovno uporabljeni za hidrolizo laktoze.
Namen te raziskave je ugotoviti ali je hitozanski hidrogel primerna matrica za nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze. Hidrogel, ki vsebuje imobilizirane encime so prenesli v raztopino laktoze in po 240 min namakanja je bil le-ta odstranjen. Po 120 min so merili glukozno koncentracijo, ki je kontinuirano naraščala v odsotnosti imobilizirane β-galaktozidaze, za kar so predpostavljali, da so encimi difundirali iz notranjih por hidrogela v raztopino med prvimi 240 min in kasnejšo hidrolizo laktoze. Pregledali so tudi kako pH vpliva na sproščanje encimov iz hitozanskega hidrogela. Pri višjem pH se sprosti več encimov kot v primerjavi z nizkim pH, kar predstavljaj obetajoč sistem sproščanja encimov pri kislem pH.

ZAKLJUČEK
Na podlagi podatkov pridobljenih v tej raziskavi je mogoče najti uporabnost hitozanskih hidrogelov za številne aplikacije, ki vključujejo hidrolizo laktoze. Imobilizirane encime, kot je β-galaktozidaza, se lahko uporablja večkrat v poroznih hidrogelih brez izgube aktivnosti in tako ustvarjajo poceni proizvodne procese pri pridelavi hrane brez laktoze. Uporabnost poleg živilske industrije obstaja v medicini in farmacevtski industriji. Nadzorovano sproščanje β-galaktozidaze iz hitozanskega hidrogela bi pretvorilo laktozo v glukozo v laktozno intolerantnih posameznikih pri več kot enem ciklu katalize brez izgube encimske aktivno

Hemolizin

2010-12-13T02:20:36Z

Mojca Banič: New page: '''Hemolizin''' je eksotoksin, ki ga sproščajo bakterije in povzroča razpad rdečih krvničk. Ime hemolizin izhaja iz stališča, da povzroči propad rdečih krvnih ...

'''Hemolizin''' je [[eksotoksin]], ki ga sproščajo bakterije in povzroča razpad [[Eritrocit|rdečih krvničk]].

Ime hemolizin izhaja iz stališča, da povzroči propad rdečih krvnih celic. Če se ga uporablja v zadostnem odmerku, lahko hemolizin pronica skozi vsako sesalčevo celico. Kljub temu za večino ljudi izločanje hemolizina ne predstavlja resno tveganje za zdravje, le nekaj infekcij lahko povzroči motnje v [[homeostaza|homeostazi]].

Kristalografska struktura sestavljenga hemolizina je pokazala heptametrično organizacijo. Protein je gobasto oblikovan z 50A debelim betom. Iz njega izhaja klobuk, v naravnem okolju pa gre steblo skozi [[lipidni dvosloj]]. Klobuk proteina prekriva veliko prostora, ki je povezan z zunanjostjo celice skozi veliko odprtino na vrhu klobuka. Najožji (1,4 ~ nm v premeru), del kanala se nahaja na spodnjem delu stebla [http://www.ks.uiuc.edu/Research/hemolysin/PICTURES/alpha-hemolysin1.jpg Skica hemolizina].

Hemolizin povzroči prib. 2nm široko poro v gostiteljski celici in zato voda, ioni ter majhne organske molekule skozi njo pronicajo. Hitra razelektritev molekul kot je [[ATP]], izginjanje membranskega potenciala in ionskega gradienta ter nepovratne osmoze vodi do razgradnje in povzroči propad celice gostiteljice.

Bakterija uporablja hemolizin kot način za pridobivanje hranilnih snovi iz celic gostiteljic kot na primer železo, ki je kot omejevalni faktor rast patogenih bakterij. Brez železa se ustvarijo škodljivi radikali in ga zato vzdržujejo v nizkih koncentracijah. Eritrociti pa so bogati z železom, ta se nahaja v hemoglobinu in z razgradnjo teh celic, se sprosti hemoglobin v okolico in bakterija prevzame železo.

== Viri ==
* http://en.wikipedia.org/wiki/Hemolysin
* http://en.wikipedia.org/wiki/Hemolysin
* http://en.wikipedia.org/wiki/Pore_forming_toxins

== Zunanje povezave ==
* http://www.ks.uiuc.edu/Research/hemolysin/
* http://www.sbkb.org/KB/archives.jsp?pageshow=22
* http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9521785

[[Category:LEX]]