2016-11-28T22:37:36Z

Mojca Juteršek: /* A.L.I.C.E */

Imperial College London, Ecolibrium – developing a framework for engineering co-cultures [http://2016.igem.org/Team:Imperial_College]

==Uvod==

Za bazično raziskovanje in tudi pri tehnoloških bioprocesih večinoma uporabljamo čiste kulture mikroorganizmov, čeprav se ti v naravi povezujejo v združbe, v katerih interagirajo in sodelujejo, na primer s proizvajanjem metabolitov, ki jih drugi organizmi uporabijo kot substrat. Takšne dinamične in simbiotske interakcije omogočajo učinkovit pretok ogljika in energije, hkrati pa izboljšujejo odziv združbe na hitre in neugodne okoljske spremembe. Sicer so monokulture trenutno enostavnejše za uporabo, saj sta za enkrat nadzor procesa in priprava kulture z genetskih inženiringom lažja, vendar so lahko prisotni problemi, kot je nabiranje stranskih produktov in neučinkovit pretok energije in ogljika. Uporaba sinteznih mešanih kultur oz. večceličnega inženiringa je zato lahko učinkovita rešitev, ki bi izboljšala ekonomičnost bioprocesov. Vendar je gojenje mešanih kultur pogosto oteženo, saj imajo različne celice različne optimalne pogoje rasti, kar lahko vodi v preraščanje ene vrste celic preko drugih. Trenutno se raziskovalci teh problemov lotevajo z različnimi metodami kontrole rasti, ki temeljijo na avksotrofiji in sistemih toksin-antitoksin. Ampak te metode niso robustne in ne omogočajo natančnega nadzora razmerja med različnimi populacijami v mešani kulturi ter hkrati niso prenosljive med različnimi organizmi.

Ekipa iz Imperial College-a v Londonu je v ta namen razvila genetsko vezje G.E.A.R. (Genetically Engineered Artificial Ratio), ki bi omogočalo stabilno ohranjanje razmerja rasti različnih celic v kulturi. Hkrati so izdelali tudi podatkovno bazo A.L.I.C.E. (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki omogoča podporo pri načrtovanju in optimizaciji procesov z mešanimi kulturami.

==G.E.A.R==
Genetsko vezje G.E.A.R. je sestavljeno iz treh modulov:
*'''komunikacijskega''', sestavljenega iz dveh ortogonalnih sistemov, ki temeljita na zaznavanju celične gostote,
*'''primerjalnega''', ki povezuje signale iz sistema za zaznavanje celične gostote z RNA logičnim omrežjem in omogoča celicam primerjavo gostote lastne populacije z gostoto populacij drugih celic in
*'''modula za uravnavanje rasti''', ki se v primeru ustreznega signala iz primerjalnega sistema odzove z zaustavitvijo rasti v celicah določene populacije.

===Komunikacijski modul===

Prvi modul omogoča komunikacijo med celicami znotraj populacije in med populacijami ter temelji na v naravi prisotnem mehanizmu zaznavanja celične gostote (angl. quorum sensing), pri katerem celice proizvajajo signalne molekule, kor so na primer N-acil homoserin laktoni (AHL). Ti se vežejo na ustrezne transkripcijske faktorje, ki spremenijo vzorec izražanja genov. Ker so pri eksperimentih uporabili mešanico dveh kultur ''E. coli'', so potrebovali sistem za dvosmerno komunikacijo z dvema edinstvenima in ortogonalnima sistemoma AHL z ustreznim odzivnim proteinom, tako da je vsaka populacija lahko zaznavala lastno gostoto in gostoto druge populacije.

Analizirali so 4 sisteme:
*'''Cin''' s transkripcijskim aktivatorjem CinR in signalno molekulo 3O-C14 AHL,
*'''Las''' s transkripcijskim aktivatorjem LasR in signalno molekulo 3O-C12 AHL,
*'''Lux''' s transkripcijskim aktivatorjem LuxR in signalno molekulo 3O-C6 AHL in
*'''Rhl''' s transkripcijskim aktivatorjem RhIR in signalno molekulo C4 AHL.

Signalno molekulo v vsakem sistemu sintetizira različen induktorski protein.
Za vsak sistem so izdelali dva sestavljena dela. Prvi del je predstavljal AHL odzivni sistem s transkripcijskim aktivatorjem (CinR, LasR, LuxR ali RhIR) pod kontrolo konstitutivnega promotorja, ki mu je sledil odgovarjajoči promotor za odziv na celično gostoto. Pri tem sistemu se v ustrezni AHL veže na konstitutivno izražen aktivator, ki aktivira transkripcijo gena navzdol od promotorja, odzivnega na aktivator. Drugi sestavljeni del je reporterski in se od odzivnega razlikuje po tem, da je za promotorjem odzivnim na celično gostoto zapis za GFP. Ta del so uporabili za karakterizacijo odziva posameznega sistema na različne koncentracije AHL in tudi za analizo navzkrižne reaktivnosti.
Pri analizah koncentracijskega območja vsakega sistema so ugotovili, da se sistemi razlikujejo glede na območja, v katerih je sistem aktiven in glede na pridobljene podatke lahko ustrezno spremenili moč uporabljenega promotorja, bodisi konstitutivnega promotorja navzgor od gena za transkripcijski aktivator ali navzgor od gena za protein, ki sintetizira signalni AHL. Pri analizah navzkrižne reaktivnosti, kjer so spremljali jakost fluorescence enega sistema pri indukciji z AHL iz drugih sistemov, so ugotovili, da sta sistema Rhl in Las najbolj ortogonalna in zato najbolj uporabna za končno vezje G.E.A.R. Hkrati so iz literature imeli podatek, da sta ortogonalna tudi sistema Cin in Rhl .

===Primerjalni modul===
Primerjalni modul primerja količino AHL iz dveh sistemov in ustvari signal, ki deluje na končni, rastni modul.
Temelji na RNA-tehnologiji STAR (Small Transcriptional-Activating RNA), pri kateri male molekule RNA uravnavajo transkripcijo genov tako, da se vežejo na promotorske regije s komplementarnimi zaporedji. Ta zaporedja tvorijo lasnično zanko, ki preprečuje vezavo RNA-polimeraze in s tem transkripcijo. Vezava STAR strukturo spremeni tako, da se RNA-polimeraza lahko veže in zato transkripcija lahko poteče.
V svojem vezju so uporabili dva sistema. Prvi sistem je vključeval zapis za STAR pod kontrolo promotorja, ki se odziva na transkripcijski aktivator, odziven na AHL lastne populacije. Za drugi sistem so načrtali zaporedje, katerega produkt je anti-STAR, molekula RNA komplementarna STAR. Ko je anti-STAR prisoten, veže STAR in prepreči aktivacijo transkripcije. Zapis za anti-STAR so vstavili za zaporedje promotorja odzivnega na AHL, ki ga proizvaja populacija drugih celic. Razmerje med med STAR in anti-STAR je zato enako razmerju med dvema AHL v mešani kulturi. V primeru, da je gostota celic enaka, sta enaki tudi količini STAR in anti-STAR, in obe populaciji rasteta normalno. Če pa pride do neenakovredne hitrosti rasti populacije, se poveča količina STAR v celicah te populacije, ki se veže na lasnično zanko v modulu za uravnavanje rasti in sproži zaustavitev rasti.
Sestavili so tudi sistem za karakterizacijo, ki je vključeval plazmid z zapisom za STAR pod kontrolo konstitutivnega promotorja in plazmid za zapisom za SFGFP (superfolder GFP) navzdol od tarčnega zaporedja za STAR. Ugotovili so, da se izražanje reporterskega proteina poveča za 17-krat že v prvih 100 minutah gojenja, kar pomeni, da je sistem sposoben hitrega odzivanja. Ugotovili so tudi, da je učinkovitost aktivacije izražanja približno 5-krat večja pri 37°C kot pri 30°C, kar je pomembno za prilagajanje sistema za uporabo pri različnih pogojih rasti.

Uporaba sistema STAR naj bi imela številne prednosti pred klasičnimi regulatornimi sistemi, ki temeljijo na proteinih:
*pri RNA ni translacije, ki sicer obremeni celico;
*sistem ''trans''-delujočih RNA je prenosljiv med različnimi organizmi;
*izražanje gena navzdol od zaporedja komplementarnega STAR je v odsotnosti STAR zelo nizko v prisotnosti pa precej visoko, torej je regulacija zelo robustna;
*načrtovanje komplementarnih interakcij DNA-RNA je precej bolj enostavno od interakcij med proteini;
*hitra razgradnja RNA izboljšuje odzivost sistema.

===Modul za uravnavanje rasti===
Modul za uravnavanje rasti se odziva na signal iz sistema STAR, pri čemer se v primeru, da je rast ene populacije hitrejša, sproži prepisovanje gena, katerega produkt povzroči hitro zaustavitev rasti, brez da bi celica umrla.
Analizirali so 4 možne gene, katerih produkti zaustavijo celično rast:
*''cat'', ki zapisuje za kloramfenikol acetiltransferazo in
*''leuB'', ki zapisuje za encim v biosintezni poti levcina.
Pri obeh zgornjih proteinih je njuno izražanje potrebno za normalno rast, zato bi vezava STAR morala sprožiti transkripcijo proteina, ki bi deloval kot inhibitor izražanja ''cat'' ali ''leuB'' (inverter).
*''Gp2'', ki je gen iz bakteriofaga T7 in inhibira celično rast tako, da se veže na kompleks RNA-polimeraze v ''E. coli'' in s tem inhibira transkripcijo in
*''Gp0.4'', ki je prav tako gen iz bakteriofaga T7 in se veže na obroč FtsZ med mitozo, s čimer prepreči citokinezo.
Po prvih analizah so se osredotičili na ''Gp2'', ki za razliko od ''cat'' in ''leuB'' ne potrebuje uvajanja dodatnega inverterja v sistem in je od obeh genov tudi precej krajši, kar omogoča hitrejše izražanje in hitrejši odziv. Za razliko od ''leuB'' tudi nismo omejeni na avksotrofne seve oz. nam ni potrebno pripraviti mutant z izbitimi geni. Gen ''cat'' tudi ni idealen zaradi uporabe antibiotika in nevarnosti razvoja bakterijske odposrnosti. Pri obeh je potrebno uporabiti tudi posebno gojišče. ''Gp0.4'' zaradi težav z ligacijo niso uporabili, vendar ga načrtujejo v prihodnosti okarakterizirati.

==A.L.I.C.E==
Sistem G.E.A.R odgovarja na problem uravnavanja rasti različnih populacij v mešanih kulturah, vendar moramo za uspešno gojenje še vedno določiti optimalne pogoje rasti mešane kulture. Zato so ustvarili bazo podatkov A.L.I.C.E (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki vključuje eksperimentalne podatke o optimalni pogojih rasti za monokulture in tudi za mešane kulture, protokole in druge podatke.

==Zaključek==
Uporaba mešanih kultur lahko precej izboljša obstoječe bioprocese in odpira možnosti za razvoj novih. Genetsko vezje G.E.A.R ponuja zanimiv način razvoja stabilnih mešanih kultur, ki pa mora biti še preizkušen in optimiziran kot celota. Ekipa iz Imperial College-a je prispevala nove konstrukte in njihove karakterizacije ter karakterizacije že obstoječih konstruktov, ki so uporabni v sistemu za nadzor rasti populacij in s tem pomembno prispevala k napredku uporabe mešanih kultur.

==Literatura==
*[http://2016.igem.org/Team:Imperial_College Wiki stran ekipe]

*Santala, S., Karp, M. in Santala V. (2014) Rationally Engineered Synthetic Coculture for Improved Biomass and Product Formation. PLOS ONE 9(12): e113786. doi: 10.1371/journal.pone.0113786.

[[Seminarji SB 12016/17]]

Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur

2016-11-28T22:30:04Z

Mojca Juteršek: /* Primerjalni modul */

Imperial College London, Ecolibrium – developing a framework for engineering co-cultures [http://2016.igem.org/Team:Imperial_College]

==Uvod==

Za bazično raziskovanje in tudi pri tehnoloških bioprocesih večinoma uporabljamo čiste kulture mikroorganizmov, čeprav se ti v naravi povezujejo v združbe, v katerih interagirajo in sodelujejo, na primer s proizvajanjem metabolitov, ki jih drugi organizmi uporabijo kot substrat. Takšne dinamične in simbiotske interakcije omogočajo učinkovit pretok ogljika in energije, hkrati pa izboljšujejo odziv združbe na hitre in neugodne okoljske spremembe. Sicer so monokulture trenutno enostavnejše za uporabo, saj sta za enkrat nadzor procesa in priprava kulture z genetskih inženiringom lažja, vendar so lahko prisotni problemi, kot je nabiranje stranskih produktov in neučinkovit pretok energije in ogljika. Uporaba sinteznih mešanih kultur oz. večceličnega inženiringa je zato lahko učinkovita rešitev, ki bi izboljšala ekonomičnost bioprocesov. Vendar je gojenje mešanih kultur pogosto oteženo, saj imajo različne celice različne optimalne pogoje rasti, kar lahko vodi v preraščanje ene vrste celic preko drugih. Trenutno se raziskovalci teh problemov lotevajo z različnimi metodami kontrole rasti, ki temeljijo na avksotrofiji in sistemih toksin-antitoksin. Ampak te metode niso robustne in ne omogočajo natančnega nadzora razmerja med različnimi populacijami v mešani kulturi ter hkrati niso prenosljive med različnimi organizmi.

Ekipa iz Imperial College-a v Londonu je v ta namen razvila genetsko vezje G.E.A.R. (Genetically Engineered Artificial Ratio), ki bi omogočalo stabilno ohranjanje razmerja rasti različnih celic v kulturi. Hkrati so izdelali tudi podatkovno bazo A.L.I.C.E. (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki omogoča podporo pri načrtovanju in optimizaciji procesov z mešanimi kulturami.

==G.E.A.R==
Genetsko vezje G.E.A.R. je sestavljeno iz treh modulov:
*'''komunikacijskega''', sestavljenega iz dveh ortogonalnih sistemov, ki temeljita na zaznavanju celične gostote,
*'''primerjalnega''', ki povezuje signale iz sistema za zaznavanje celične gostote z RNA logičnim omrežjem in omogoča celicam primerjavo gostote lastne populacije z gostoto populacij drugih celic in
*'''modula za uravnavanje rasti''', ki se v primeru ustreznega signala iz primerjalnega sistema odzove z zaustavitvijo rasti v celicah določene populacije.

===Komunikacijski modul===

Prvi modul omogoča komunikacijo med celicami znotraj populacije in med populacijami ter temelji na v naravi prisotnem mehanizmu zaznavanja celične gostote (angl. quorum sensing), pri katerem celice proizvajajo signalne molekule, kor so na primer N-acil homoserin laktoni (AHL). Ti se vežejo na ustrezne transkripcijske faktorje, ki spremenijo vzorec izražanja genov. Ker so pri eksperimentih uporabili mešanico dveh kultur ''E. coli'', so potrebovali sistem za dvosmerno komunikacijo z dvema edinstvenima in ortogonalnima sistemoma AHL z ustreznim odzivnim proteinom, tako da je vsaka populacija lahko zaznavala lastno gostoto in gostoto druge populacije.

Analizirali so 4 sisteme:
*'''Cin''' s transkripcijskim aktivatorjem CinR in signalno molekulo 3O-C14 AHL,
*'''Las''' s transkripcijskim aktivatorjem LasR in signalno molekulo 3O-C12 AHL,
*'''Lux''' s transkripcijskim aktivatorjem LuxR in signalno molekulo 3O-C6 AHL in
*'''Rhl''' s transkripcijskim aktivatorjem RhIR in signalno molekulo C4 AHL.

Signalno molekulo v vsakem sistemu sintetizira različen induktorski protein.
Za vsak sistem so izdelali dva sestavljena dela. Prvi del je predstavljal AHL odzivni sistem s transkripcijskim aktivatorjem (CinR, LasR, LuxR ali RhIR) pod kontrolo konstitutivnega promotorja, ki mu je sledil odgovarjajoči promotor za odziv na celično gostoto. Pri tem sistemu se v ustrezni AHL veže na konstitutivno izražen aktivator, ki aktivira transkripcijo gena navzdol od promotorja, odzivnega na aktivator. Drugi sestavljeni del je reporterski in se od odzivnega razlikuje po tem, da je za promotorjem odzivnim na celično gostoto zapis za GFP. Ta del so uporabili za karakterizacijo odziva posameznega sistema na različne koncentracije AHL in tudi za analizo navzkrižne reaktivnosti.
Pri analizah koncentracijskega območja vsakega sistema so ugotovili, da se sistemi razlikujejo glede na območja, v katerih je sistem aktiven in glede na pridobljene podatke lahko ustrezno spremenili moč uporabljenega promotorja, bodisi konstitutivnega promotorja navzgor od gena za transkripcijski aktivator ali navzgor od gena za protein, ki sintetizira signalni AHL. Pri analizah navzkrižne reaktivnosti, kjer so spremljali jakost fluorescence enega sistema pri indukciji z AHL iz drugih sistemov, so ugotovili, da sta sistema Rhl in Las najbolj ortogonalna in zato najbolj uporabna za končno vezje G.E.A.R. Hkrati so iz literature imeli podatek, da sta ortogonalna tudi sistema Cin in Rhl .

===Primerjalni modul===
Primerjalni modul primerja količino AHL iz dveh sistemov in ustvari signal, ki deluje na končni, rastni modul.
Temelji na RNA-tehnologiji STAR (Small Transcriptional-Activating RNA), pri kateri male molekule RNA uravnavajo transkripcijo genov tako, da se vežejo na promotorske regije s komplementarnimi zaporedji. Ta zaporedja tvorijo lasnično zanko, ki preprečuje vezavo RNA-polimeraze in s tem transkripcijo. Vezava STAR strukturo spremeni tako, da se RNA-polimeraza lahko veže in zato transkripcija lahko poteče.
V svojem vezju so uporabili dva sistema. Prvi sistem je vključeval zapis za STAR pod kontrolo promotorja, ki se odziva na transkripcijski aktivator, odziven na AHL lastne populacije. Za drugi sistem so načrtali zaporedje, katerega produkt je anti-STAR, molekula RNA komplementarna STAR. Ko je anti-STAR prisoten, veže STAR in prepreči aktivacijo transkripcije. Zapis za anti-STAR so vstavili za zaporedje promotorja odzivnega na AHL, ki ga proizvaja populacija drugih celic. Razmerje med med STAR in anti-STAR je zato enako razmerju med dvema AHL v mešani kulturi. V primeru, da je gostota celic enaka, sta enaki tudi količini STAR in anti-STAR, in obe populaciji rasteta normalno. Če pa pride do neenakovredne hitrosti rasti populacije, se poveča količina STAR v celicah te populacije, ki se veže na lasnično zanko v modulu za uravnavanje rasti in sproži zaustavitev rasti.
Sestavili so tudi sistem za karakterizacijo, ki je vključeval plazmid z zapisom za STAR pod kontrolo konstitutivnega promotorja in plazmid za zapisom za SFGFP (superfolder GFP) navzdol od tarčnega zaporedja za STAR. Ugotovili so, da se izražanje reporterskega proteina poveča za 17-krat že v prvih 100 minutah gojenja, kar pomeni, da je sistem sposoben hitrega odzivanja. Ugotovili so tudi, da je učinkovitost aktivacije izražanja približno 5-krat večja pri 37°C kot pri 30°C, kar je pomembno za prilagajanje sistema za uporabo pri različnih pogojih rasti.

Uporaba sistema STAR naj bi imela številne prednosti pred klasičnimi regulatornimi sistemi, ki temeljijo na proteinih:
*pri RNA ni translacije, ki sicer obremeni celico;
*sistem ''trans''-delujočih RNA je prenosljiv med različnimi organizmi;
*izražanje gena navzdol od zaporedja komplementarnega STAR je v odsotnosti STAR zelo nizko v prisotnosti pa precej visoko, torej je regulacija zelo robustna;
*načrtovanje komplementarnih interakcij DNA-RNA je precej bolj enostavno od interakcij med proteini;
*hitra razgradnja RNA izboljšuje odzivost sistema.

===Modul za uravnavanje rasti===
Modul za uravnavanje rasti se odziva na signal iz sistema STAR, pri čemer se v primeru, da je rast ene populacije hitrejša, sproži prepisovanje gena, katerega produkt povzroči hitro zaustavitev rasti, brez da bi celica umrla.
Analizirali so 4 možne gene, katerih produkti zaustavijo celično rast:
*''cat'', ki zapisuje za kloramfenikol acetiltransferazo in
*''leuB'', ki zapisuje za encim v biosintezni poti levcina.
Pri obeh zgornjih proteinih je njuno izražanje potrebno za normalno rast, zato bi vezava STAR morala sprožiti transkripcijo proteina, ki bi deloval kot inhibitor izražanja ''cat'' ali ''leuB'' (inverter).
*''Gp2'', ki je gen iz bakteriofaga T7 in inhibira celično rast tako, da se veže na kompleks RNA-polimeraze v ''E. coli'' in s tem inhibira transkripcijo in
*''Gp0.4'', ki je prav tako gen iz bakteriofaga T7 in se veže na obroč FtsZ med mitozo, s čimer prepreči citokinezo.
Po prvih analizah so se osredotičili na ''Gp2'', ki za razliko od ''cat'' in ''leuB'' ne potrebuje uvajanja dodatnega inverterja v sistem in je od obeh genov tudi precej krajši, kar omogoča hitrejše izražanje in hitrejši odziv. Za razliko od ''leuB'' tudi nismo omejeni na avksotrofne seve oz. nam ni potrebno pripraviti mutant z izbitimi geni. Gen ''cat'' tudi ni idealen zaradi uporabe antibiotika in nevarnosti razvoja bakterijske odposrnosti. Pri obeh je potrebno uporabiti tudi posebno gojišče. ''Gp0.4'' zaradi težav z ligacijo niso uporabili, vendar ga načrtujejo v prihodnosti okarakterizirati.

==A.L.I.C.E==
Sistem G.E.A.R odgovarja na problem uravnavanja rasti različnih populacij v mešanih kulturah, vendar moramo za uspešno gojenje še vedno določiti optimalne pogoje rasti mešane kulture. Zato so ustvarili bazo podatkov A.L.I.C.E (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki vključuje eksperimentalne podatke o optimalni pogojih rasti za monokulture in tudi za mešane kulture, protokole in druge podatke.

==Literatura==
*[http://2016.igem.org/Team:Imperial_College Wiki stran ekipe]

*Santala, S., Karp, M. in Santala V. (2014) Rationally Engineered Synthetic Coculture for Improved Biomass and Product Formation. PLOS ONE 9(12): e113786. doi: 10.1371/journal.pone.0113786.

[[Seminarji SB 12016/17]]

Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur

2016-11-28T22:20:42Z

Mojca Juteršek: /* G.E.A.R */

Imperial College London, Ecolibrium – developing a framework for engineering co-cultures [http://2016.igem.org/Team:Imperial_College]

==Uvod==

Za bazično raziskovanje in tudi pri tehnoloških bioprocesih večinoma uporabljamo čiste kulture mikroorganizmov, čeprav se ti v naravi povezujejo v združbe, v katerih interagirajo in sodelujejo, na primer s proizvajanjem metabolitov, ki jih drugi organizmi uporabijo kot substrat. Takšne dinamične in simbiotske interakcije omogočajo učinkovit pretok ogljika in energije, hkrati pa izboljšujejo odziv združbe na hitre in neugodne okoljske spremembe. Sicer so monokulture trenutno enostavnejše za uporabo, saj sta za enkrat nadzor procesa in priprava kulture z genetskih inženiringom lažja, vendar so lahko prisotni problemi, kot je nabiranje stranskih produktov in neučinkovit pretok energije in ogljika. Uporaba sinteznih mešanih kultur oz. večceličnega inženiringa je zato lahko učinkovita rešitev, ki bi izboljšala ekonomičnost bioprocesov. Vendar je gojenje mešanih kultur pogosto oteženo, saj imajo različne celice različne optimalne pogoje rasti, kar lahko vodi v preraščanje ene vrste celic preko drugih. Trenutno se raziskovalci teh problemov lotevajo z različnimi metodami kontrole rasti, ki temeljijo na avksotrofiji in sistemih toksin-antitoksin. Ampak te metode niso robustne in ne omogočajo natančnega nadzora razmerja med različnimi populacijami v mešani kulturi ter hkrati niso prenosljive med različnimi organizmi.

Ekipa iz Imperial College-a v Londonu je v ta namen razvila genetsko vezje G.E.A.R. (Genetically Engineered Artificial Ratio), ki bi omogočalo stabilno ohranjanje razmerja rasti različnih celic v kulturi. Hkrati so izdelali tudi podatkovno bazo A.L.I.C.E. (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki omogoča podporo pri načrtovanju in optimizaciji procesov z mešanimi kulturami.

==G.E.A.R==
Genetsko vezje G.E.A.R. je sestavljeno iz treh modulov:
*'''komunikacijskega''', sestavljenega iz dveh ortogonalnih sistemov, ki temeljita na zaznavanju celične gostote,
*'''primerjalnega''', ki povezuje signale iz sistema za zaznavanje celične gostote z RNA logičnim omrežjem in omogoča celicam primerjavo gostote lastne populacije z gostoto populacij drugih celic in
*'''modula za uravnavanje rasti''', ki se v primeru ustreznega signala iz primerjalnega sistema odzove z zaustavitvijo rasti v celicah določene populacije.

===Komunikacijski modul===

Prvi modul omogoča komunikacijo med celicami znotraj populacije in med populacijami ter temelji na v naravi prisotnem mehanizmu zaznavanja celične gostote (angl. quorum sensing), pri katerem celice proizvajajo signalne molekule, kor so na primer N-acil homoserin laktoni (AHL). Ti se vežejo na ustrezne transkripcijske faktorje, ki spremenijo vzorec izražanja genov. Ker so pri eksperimentih uporabili mešanico dveh kultur ''E. coli'', so potrebovali sistem za dvosmerno komunikacijo z dvema edinstvenima in ortogonalnima sistemoma AHL z ustreznim odzivnim proteinom, tako da je vsaka populacija lahko zaznavala lastno gostoto in gostoto druge populacije.

Analizirali so 4 sisteme:
*'''Cin''' s transkripcijskim aktivatorjem CinR in signalno molekulo 3O-C14 AHL,
*'''Las''' s transkripcijskim aktivatorjem LasR in signalno molekulo 3O-C12 AHL,
*'''Lux''' s transkripcijskim aktivatorjem LuxR in signalno molekulo 3O-C6 AHL in
*'''Rhl''' s transkripcijskim aktivatorjem RhIR in signalno molekulo C4 AHL.

Signalno molekulo v vsakem sistemu sintetizira različen induktorski protein.
Za vsak sistem so izdelali dva sestavljena dela. Prvi del je predstavljal AHL odzivni sistem s transkripcijskim aktivatorjem (CinR, LasR, LuxR ali RhIR) pod kontrolo konstitutivnega promotorja, ki mu je sledil odgovarjajoči promotor za odziv na celično gostoto. Pri tem sistemu se v ustrezni AHL veže na konstitutivno izražen aktivator, ki aktivira transkripcijo gena navzdol od promotorja, odzivnega na aktivator. Drugi sestavljeni del je reporterski in se od odzivnega razlikuje po tem, da je za promotorjem odzivnim na celično gostoto zapis za GFP. Ta del so uporabili za karakterizacijo odziva posameznega sistema na različne koncentracije AHL in tudi za analizo navzkrižne reaktivnosti.
Pri analizah koncentracijskega območja vsakega sistema so ugotovili, da se sistemi razlikujejo glede na območja, v katerih je sistem aktiven in glede na pridobljene podatke lahko ustrezno spremenili moč uporabljenega promotorja, bodisi konstitutivnega promotorja navzgor od gena za transkripcijski aktivator ali navzgor od gena za protein, ki sintetizira signalni AHL. Pri analizah navzkrižne reaktivnosti, kjer so spremljali jakost fluorescence enega sistema pri indukciji z AHL iz drugih sistemov, so ugotovili, da sta sistema Rhl in Las najbolj ortogonalna in zato najbolj uporabna za končno vezje G.E.A.R. Hkrati so iz literature imeli podatek, da sta ortogonalna tudi sistema Cin in Rhl .

===Primerjalni modul===
Primerjalni modul primerja količino AHL iz dveh sistemov in ustvari signal, ki deluje na končni, rastni modul.
Temelji na RNA-tehnologiji STAR (Small Transcriptional-Activating RNA), pri kateri male molekule RNA uravnavajo transkripcijo genov tako, da se vežejo na promotorske regije s komplementarnimi zaporedji. Ta zaporedja tvorijo lasnično zanko, ki preprečuje vezavo RNA-polimeraze in s tem transkripcijo. Vezava STAR strukturo spremeni tako, da se RNA-polimeraza lahko veže in zato transkripcija lahko poteče.
V svojem vezju so uporabili dva sistema. Prvi sistem je vključeval zapis za STAR pod kontrolo promotorja, ki se odziva na transkripcijski aktivator, odziven na AHL lastne populacije. Za drugi sistem so načrtali zaporedje, katerega produkt je anti-STAR, molekula RNA komplementarna STAR. Ko je anti-STAR prisoten, veže STAR in prepreči aktivacijo transkripcije. Zapis za anti-STAR so vstavili za zaporedje promotorja odzivnega na AHL, ki ga proizvaja populacija drugih celic. Razmerje med med STAR in anti-STAR je zato enako razmerju med dvema AHL v mešani kulturi. V primeru, da je gostota celic enaka, sta enaki tudi količini STAR in anti-STAR, in obe populaciji rasteta normalno. Če pa pride do neenakovredne hitrosti rasti populacije, se poveča količina STAR v celicah te populacije, ki se veže na lasnično zanko v modulu za uravnavanje rasti in sproži zaustavitev rasti.
Sestavili so tudi sistem za karakterizacijo, ki je vključeval plazmid z zapisom za STAR pod kontrolo konstitutivnega promotorja in plazmid za zapisom za SFGFP (superfolder GFP) navzdol od tarčnega zaporedja za STAR. Ugotovili so, da se izražanje reporterskega proteina poveča za 17-krat že v prvih 100 minutah gojenja, kar pomeni, da je sistem sposoben hitrega odzivanja. Ugotovili so tudi, da je učinkovitost aktivacije izražanja približno 5-krat večja pri 37°C kot pri 30°C, kar je pomembno za prilagajanje sistema za uporabo pri različnih pogojih rasti.

===Modul za uravnavanje rasti===
Modul za uravnavanje rasti se odziva na signal iz sistema STAR, pri čemer se v primeru, da je rast ene populacije hitrejša, sproži prepisovanje gena, katerega produkt povzroči hitro zaustavitev rasti, brez da bi celica umrla.
Analizirali so 4 možne gene, katerih produkti zaustavijo celično rast:
*''cat'', ki zapisuje za kloramfenikol acetiltransferazo in
*''leuB'', ki zapisuje za encim v biosintezni poti levcina.
Pri obeh zgornjih proteinih je njuno izražanje potrebno za normalno rast, zato bi vezava STAR morala sprožiti transkripcijo proteina, ki bi deloval kot inhibitor izražanja ''cat'' ali ''leuB'' (inverter).
*''Gp2'', ki je gen iz bakteriofaga T7 in inhibira celično rast tako, da se veže na kompleks RNA-polimeraze v ''E. coli'' in s tem inhibira transkripcijo in
*''Gp0.4'', ki je prav tako gen iz bakteriofaga T7 in se veže na obroč FtsZ med mitozo, s čimer prepreči citokinezo.
Po prvih analizah so se osredotičili na ''Gp2'', ki za razliko od ''cat'' in ''leuB'' ne potrebuje uvajanja dodatnega inverterja v sistem in je od obeh genov tudi precej krajši, kar omogoča hitrejše izražanje in hitrejši odziv. Za razliko od ''leuB'' tudi nismo omejeni na avksotrofne seve oz. nam ni potrebno pripraviti mutant z izbitimi geni. Gen ''cat'' tudi ni idealen zaradi uporabe antibiotika in nevarnosti razvoja bakterijske odposrnosti. Pri obeh je potrebno uporabiti tudi posebno gojišče. ''Gp0.4'' zaradi težav z ligacijo niso uporabili, vendar ga načrtujejo v prihodnosti okarakterizirati.

==A.L.I.C.E==
Sistem G.E.A.R odgovarja na problem uravnavanja rasti različnih populacij v mešanih kulturah, vendar moramo za uspešno gojenje še vedno določiti optimalne pogoje rasti mešane kulture. Zato so ustvarili bazo podatkov A.L.I.C.E (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki vključuje eksperimentalne podatke o optimalni pogojih rasti za monokulture in tudi za mešane kulture, protokole in druge podatke.

==Literatura==
*[http://2016.igem.org/Team:Imperial_College Wiki stran ekipe]

*Santala, S., Karp, M. in Santala V. (2014) Rationally Engineered Synthetic Coculture for Improved Biomass and Product Formation. PLOS ONE 9(12): e113786. doi: 10.1371/journal.pone.0113786.

[[Seminarji SB 12016/17]]

Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur

2016-11-28T22:20:02Z

Mojca Juteršek: /* Komunikacijski modul */

Imperial College London, Ecolibrium – developing a framework for engineering co-cultures [http://2016.igem.org/Team:Imperial_College]

==Uvod==

Za bazično raziskovanje in tudi pri tehnoloških bioprocesih večinoma uporabljamo čiste kulture mikroorganizmov, čeprav se ti v naravi povezujejo v združbe, v katerih interagirajo in sodelujejo, na primer s proizvajanjem metabolitov, ki jih drugi organizmi uporabijo kot substrat. Takšne dinamične in simbiotske interakcije omogočajo učinkovit pretok ogljika in energije, hkrati pa izboljšujejo odziv združbe na hitre in neugodne okoljske spremembe. Sicer so monokulture trenutno enostavnejše za uporabo, saj sta za enkrat nadzor procesa in priprava kulture z genetskih inženiringom lažja, vendar so lahko prisotni problemi, kot je nabiranje stranskih produktov in neučinkovit pretok energije in ogljika. Uporaba sinteznih mešanih kultur oz. večceličnega inženiringa je zato lahko učinkovita rešitev, ki bi izboljšala ekonomičnost bioprocesov. Vendar je gojenje mešanih kultur pogosto oteženo, saj imajo različne celice različne optimalne pogoje rasti, kar lahko vodi v preraščanje ene vrste celic preko drugih. Trenutno se raziskovalci teh problemov lotevajo z različnimi metodami kontrole rasti, ki temeljijo na avksotrofiji in sistemih toksin-antitoksin. Ampak te metode niso robustne in ne omogočajo natančnega nadzora razmerja med različnimi populacijami v mešani kulturi ter hkrati niso prenosljive med različnimi organizmi.

Ekipa iz Imperial College-a v Londonu je v ta namen razvila genetsko vezje G.E.A.R. (Genetically Engineered Artificial Ratio), ki bi omogočalo stabilno ohranjanje razmerja rasti različnih celic v kulturi. Hkrati so izdelali tudi podatkovno bazo A.L.I.C.E. (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki omogoča podporo pri načrtovanju in optimizaciji procesov z mešanimi kulturami.

==G.E.A.R==
Genetsko vezje G.E.A.R. je sestavljeno iz treh modulov:
*komunikacijskega, sestavljenega iz dveh ortogonalnih sistemov, ki temeljita na zaznavanju celične gostote,
*primerjalnega, ki povezuje signale iz sistema za zaznavanje celične gostote z RNA logičnim omrežjem in omogoča celicam primerjavo gostote lastne populacije z gostoto populacij drugih celic in
*modula za uravnavanje rasti, ki se v primeru ustreznega signala iz primerjalnega sistema odzove z zaustavitvijo rasti v celicah določene populacije.

===Komunikacijski modul===

Prvi modul omogoča komunikacijo med celicami znotraj populacije in med populacijami ter temelji na v naravi prisotnem mehanizmu zaznavanja celične gostote (angl. quorum sensing), pri katerem celice proizvajajo signalne molekule, kor so na primer N-acil homoserin laktoni (AHL). Ti se vežejo na ustrezne transkripcijske faktorje, ki spremenijo vzorec izražanja genov. Ker so pri eksperimentih uporabili mešanico dveh kultur ''E. coli'', so potrebovali sistem za dvosmerno komunikacijo z dvema edinstvenima in ortogonalnima sistemoma AHL z ustreznim odzivnim proteinom, tako da je vsaka populacija lahko zaznavala lastno gostoto in gostoto druge populacije.

Analizirali so 4 sisteme:
*'''Cin''' s transkripcijskim aktivatorjem CinR in signalno molekulo 3O-C14 AHL,
*'''Las''' s transkripcijskim aktivatorjem LasR in signalno molekulo 3O-C12 AHL,
*'''Lux''' s transkripcijskim aktivatorjem LuxR in signalno molekulo 3O-C6 AHL in
*'''Rhl''' s transkripcijskim aktivatorjem RhIR in signalno molekulo C4 AHL.

Signalno molekulo v vsakem sistemu sintetizira različen induktorski protein.
Za vsak sistem so izdelali dva sestavljena dela. Prvi del je predstavljal AHL odzivni sistem s transkripcijskim aktivatorjem (CinR, LasR, LuxR ali RhIR) pod kontrolo konstitutivnega promotorja, ki mu je sledil odgovarjajoči promotor za odziv na celično gostoto. Pri tem sistemu se v ustrezni AHL veže na konstitutivno izražen aktivator, ki aktivira transkripcijo gena navzdol od promotorja, odzivnega na aktivator. Drugi sestavljeni del je reporterski in se od odzivnega razlikuje po tem, da je za promotorjem odzivnim na celično gostoto zapis za GFP. Ta del so uporabili za karakterizacijo odziva posameznega sistema na različne koncentracije AHL in tudi za analizo navzkrižne reaktivnosti.
Pri analizah koncentracijskega območja vsakega sistema so ugotovili, da se sistemi razlikujejo glede na območja, v katerih je sistem aktiven in glede na pridobljene podatke lahko ustrezno spremenili moč uporabljenega promotorja, bodisi konstitutivnega promotorja navzgor od gena za transkripcijski aktivator ali navzgor od gena za protein, ki sintetizira signalni AHL. Pri analizah navzkrižne reaktivnosti, kjer so spremljali jakost fluorescence enega sistema pri indukciji z AHL iz drugih sistemov, so ugotovili, da sta sistema Rhl in Las najbolj ortogonalna in zato najbolj uporabna za končno vezje G.E.A.R. Hkrati so iz literature imeli podatek, da sta ortogonalna tudi sistema Cin in Rhl .

===Primerjalni modul===
Primerjalni modul primerja količino AHL iz dveh sistemov in ustvari signal, ki deluje na končni, rastni modul.
Temelji na RNA-tehnologiji STAR (Small Transcriptional-Activating RNA), pri kateri male molekule RNA uravnavajo transkripcijo genov tako, da se vežejo na promotorske regije s komplementarnimi zaporedji. Ta zaporedja tvorijo lasnično zanko, ki preprečuje vezavo RNA-polimeraze in s tem transkripcijo. Vezava STAR strukturo spremeni tako, da se RNA-polimeraza lahko veže in zato transkripcija lahko poteče.
V svojem vezju so uporabili dva sistema. Prvi sistem je vključeval zapis za STAR pod kontrolo promotorja, ki se odziva na transkripcijski aktivator, odziven na AHL lastne populacije. Za drugi sistem so načrtali zaporedje, katerega produkt je anti-STAR, molekula RNA komplementarna STAR. Ko je anti-STAR prisoten, veže STAR in prepreči aktivacijo transkripcije. Zapis za anti-STAR so vstavili za zaporedje promotorja odzivnega na AHL, ki ga proizvaja populacija drugih celic. Razmerje med med STAR in anti-STAR je zato enako razmerju med dvema AHL v mešani kulturi. V primeru, da je gostota celic enaka, sta enaki tudi količini STAR in anti-STAR, in obe populaciji rasteta normalno. Če pa pride do neenakovredne hitrosti rasti populacije, se poveča količina STAR v celicah te populacije, ki se veže na lasnično zanko v modulu za uravnavanje rasti in sproži zaustavitev rasti.
Sestavili so tudi sistem za karakterizacijo, ki je vključeval plazmid z zapisom za STAR pod kontrolo konstitutivnega promotorja in plazmid za zapisom za SFGFP (superfolder GFP) navzdol od tarčnega zaporedja za STAR. Ugotovili so, da se izražanje reporterskega proteina poveča za 17-krat že v prvih 100 minutah gojenja, kar pomeni, da je sistem sposoben hitrega odzivanja. Ugotovili so tudi, da je učinkovitost aktivacije izražanja približno 5-krat večja pri 37°C kot pri 30°C, kar je pomembno za prilagajanje sistema za uporabo pri različnih pogojih rasti.

===Modul za uravnavanje rasti===
Modul za uravnavanje rasti se odziva na signal iz sistema STAR, pri čemer se v primeru, da je rast ene populacije hitrejša, sproži prepisovanje gena, katerega produkt povzroči hitro zaustavitev rasti, brez da bi celica umrla.
Analizirali so 4 možne gene, katerih produkti zaustavijo celično rast:
*''cat'', ki zapisuje za kloramfenikol acetiltransferazo in
*''leuB'', ki zapisuje za encim v biosintezni poti levcina.
Pri obeh zgornjih proteinih je njuno izražanje potrebno za normalno rast, zato bi vezava STAR morala sprožiti transkripcijo proteina, ki bi deloval kot inhibitor izražanja ''cat'' ali ''leuB'' (inverter).
*''Gp2'', ki je gen iz bakteriofaga T7 in inhibira celično rast tako, da se veže na kompleks RNA-polimeraze v ''E. coli'' in s tem inhibira transkripcijo in
*''Gp0.4'', ki je prav tako gen iz bakteriofaga T7 in se veže na obroč FtsZ med mitozo, s čimer prepreči citokinezo.
Po prvih analizah so se osredotičili na ''Gp2'', ki za razliko od ''cat'' in ''leuB'' ne potrebuje uvajanja dodatnega inverterja v sistem in je od obeh genov tudi precej krajši, kar omogoča hitrejše izražanje in hitrejši odziv. Za razliko od ''leuB'' tudi nismo omejeni na avksotrofne seve oz. nam ni potrebno pripraviti mutant z izbitimi geni. Gen ''cat'' tudi ni idealen zaradi uporabe antibiotika in nevarnosti razvoja bakterijske odposrnosti. Pri obeh je potrebno uporabiti tudi posebno gojišče. ''Gp0.4'' zaradi težav z ligacijo niso uporabili, vendar ga načrtujejo v prihodnosti okarakterizirati.

==A.L.I.C.E==
Sistem G.E.A.R odgovarja na problem uravnavanja rasti različnih populacij v mešanih kulturah, vendar moramo za uspešno gojenje še vedno določiti optimalne pogoje rasti mešane kulture. Zato so ustvarili bazo podatkov A.L.I.C.E (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki vključuje eksperimentalne podatke o optimalni pogojih rasti za monokulture in tudi za mešane kulture, protokole in druge podatke.

==Literatura==
*[http://2016.igem.org/Team:Imperial_College Wiki stran ekipe]

*Santala, S., Karp, M. in Santala V. (2014) Rationally Engineered Synthetic Coculture for Improved Biomass and Product Formation. PLOS ONE 9(12): e113786. doi: 10.1371/journal.pone.0113786.

[[Seminarji SB 12016/17]]

Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur

2016-11-28T22:18:55Z

Mojca Juteršek: /* Modul za uravnavanje rasti */

Imperial College London, Ecolibrium – developing a framework for engineering co-cultures [http://2016.igem.org/Team:Imperial_College]

==Uvod==

Za bazično raziskovanje in tudi pri tehnoloških bioprocesih večinoma uporabljamo čiste kulture mikroorganizmov, čeprav se ti v naravi povezujejo v združbe, v katerih interagirajo in sodelujejo, na primer s proizvajanjem metabolitov, ki jih drugi organizmi uporabijo kot substrat. Takšne dinamične in simbiotske interakcije omogočajo učinkovit pretok ogljika in energije, hkrati pa izboljšujejo odziv združbe na hitre in neugodne okoljske spremembe. Sicer so monokulture trenutno enostavnejše za uporabo, saj sta za enkrat nadzor procesa in priprava kulture z genetskih inženiringom lažja, vendar so lahko prisotni problemi, kot je nabiranje stranskih produktov in neučinkovit pretok energije in ogljika. Uporaba sinteznih mešanih kultur oz. večceličnega inženiringa je zato lahko učinkovita rešitev, ki bi izboljšala ekonomičnost bioprocesov. Vendar je gojenje mešanih kultur pogosto oteženo, saj imajo različne celice različne optimalne pogoje rasti, kar lahko vodi v preraščanje ene vrste celic preko drugih. Trenutno se raziskovalci teh problemov lotevajo z različnimi metodami kontrole rasti, ki temeljijo na avksotrofiji in sistemih toksin-antitoksin. Ampak te metode niso robustne in ne omogočajo natančnega nadzora razmerja med različnimi populacijami v mešani kulturi ter hkrati niso prenosljive med različnimi organizmi.

Ekipa iz Imperial College-a v Londonu je v ta namen razvila genetsko vezje G.E.A.R. (Genetically Engineered Artificial Ratio), ki bi omogočalo stabilno ohranjanje razmerja rasti različnih celic v kulturi. Hkrati so izdelali tudi podatkovno bazo A.L.I.C.E. (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki omogoča podporo pri načrtovanju in optimizaciji procesov z mešanimi kulturami.

==G.E.A.R==
Genetsko vezje G.E.A.R. je sestavljeno iz treh modulov:
*komunikacijskega, sestavljenega iz dveh ortogonalnih sistemov, ki temeljita na zaznavanju celične gostote,
*primerjalnega, ki povezuje signale iz sistema za zaznavanje celične gostote z RNA logičnim omrežjem in omogoča celicam primerjavo gostote lastne populacije z gostoto populacij drugih celic in
*modula za uravnavanje rasti, ki se v primeru ustreznega signala iz primerjalnega sistema odzove z zaustavitvijo rasti v celicah določene populacije.

===Komunikacijski modul===

Prvi modul omogoča komunikacijo med celicami znotraj populacije in med populacijami ter temelji na v naravi prisotnem mehanizmu zaznavanja celične gostote (angl. quorum sensing), pri katerem celice proizvajajo signalne molekule, kor so na primer N-acil homoserin laktoni (AHL). Ti se vežejo na ustrezne transkripcijske faktorje, ki spremenijo vzorec izražanja genov. Ker so pri eksperimentih uporabili mešanico dveh kultur E. coli, so potrebovali sistem za dvosmerno komunikacijo z dvema edinstvenima in ortogonalnima sistemoma AHL z ustreznim odzivnim proteinom, tako da je vsaka populacija lahko zaznavala lastno gostoto in gostoto druge populacije.

Analizirali so 4 sisteme:
*Cin s transkripcijskim aktivatorjem CinR in signalno molekulo 3O-C14 AHL,
*Las s transkripcijskim aktivatorjem LasR in signalno molekulo 3O-C12 AHL,
*Lux s transkripcijskim aktivatorjem LuxR in signalno molekulo 3O-C6 AHL in
*Rhl s transkripcijskim aktivatorjem RhIR in signalno molekulo C4 AHL.

Signalno molekulo v vsakem sistemu sintetizira različen induktorski protein.
Za vsak sistem so izdelali dva sestavljena dela. Prvi del je predstavljal AHL odzivni sistem s transkripcijskim aktivatorjem (CinR, LasR, LuxR ali RhIR) pod kontrolo konstitutivnega promotorja, ki mu je sledil odgovarjajoči promotor za odziv na celično gostoto. Pri tem sistemu se v ustrezni AHL veže na konstitutivno izražen aktivator, ki aktivira transkripcijo gena navzdol od promotorja, odzivnega na aktivator. Drugi sestavljeni del je reporterski in se od odzivnega razlikuje po tem, da je za promotorjem odzivnim na celično gostoto zapis za GFP. Ta del so uporabili za karakterizacijo odziva posameznega sistema na različne koncentracije AHL in tudi za analizo navzkrižne reaktivnosti.
Pri analizah koncentracijskega območja vsakega sistema so ugotovili, da se sistemi razlikujejo glede na območja, v katerih je sistem aktiven in glede na pridobljene podatke lahko ustrezno spremenili moč uporabljenega promotorja, bodisi konstitutivnega promotorja navzgor od gena za transkripcijski aktivator ali navzgor od gena za protein, ki sintetizira signalni AHL. Pri analizah navzkrižne reaktivnosti, kjer so spremljali jakost fluorescence enega sistema pri indukciji z AHL iz drugih sistemov, so ugotovili, da sta sistema Rhl in Las najbolj ortogonalna in zato najbolj uporabna za končno vezje G.E.A.R. Hkrati so iz literature imeli podatek, da sta ortogonalna tudi sistema Cin in Rhl .

===Primerjalni modul===
Primerjalni modul primerja količino AHL iz dveh sistemov in ustvari signal, ki deluje na končni, rastni modul.
Temelji na RNA-tehnologiji STAR (Small Transcriptional-Activating RNA), pri kateri male molekule RNA uravnavajo transkripcijo genov tako, da se vežejo na promotorske regije s komplementarnimi zaporedji. Ta zaporedja tvorijo lasnično zanko, ki preprečuje vezavo RNA-polimeraze in s tem transkripcijo. Vezava STAR strukturo spremeni tako, da se RNA-polimeraza lahko veže in zato transkripcija lahko poteče.
V svojem vezju so uporabili dva sistema. Prvi sistem je vključeval zapis za STAR pod kontrolo promotorja, ki se odziva na transkripcijski aktivator, odziven na AHL lastne populacije. Za drugi sistem so načrtali zaporedje, katerega produkt je anti-STAR, molekula RNA komplementarna STAR. Ko je anti-STAR prisoten, veže STAR in prepreči aktivacijo transkripcije. Zapis za anti-STAR so vstavili za zaporedje promotorja odzivnega na AHL, ki ga proizvaja populacija drugih celic. Razmerje med med STAR in anti-STAR je zato enako razmerju med dvema AHL v mešani kulturi. V primeru, da je gostota celic enaka, sta enaki tudi količini STAR in anti-STAR, in obe populaciji rasteta normalno. Če pa pride do neenakovredne hitrosti rasti populacije, se poveča količina STAR v celicah te populacije, ki se veže na lasnično zanko v modulu za uravnavanje rasti in sproži zaustavitev rasti.
Sestavili so tudi sistem za karakterizacijo, ki je vključeval plazmid z zapisom za STAR pod kontrolo konstitutivnega promotorja in plazmid za zapisom za SFGFP (superfolder GFP) navzdol od tarčnega zaporedja za STAR. Ugotovili so, da se izražanje reporterskega proteina poveča za 17-krat že v prvih 100 minutah gojenja, kar pomeni, da je sistem sposoben hitrega odzivanja. Ugotovili so tudi, da je učinkovitost aktivacije izražanja približno 5-krat večja pri 37°C kot pri 30°C, kar je pomembno za prilagajanje sistema za uporabo pri različnih pogojih rasti.

===Modul za uravnavanje rasti===
Modul za uravnavanje rasti se odziva na signal iz sistema STAR, pri čemer se v primeru, da je rast ene populacije hitrejša, sproži prepisovanje gena, katerega produkt povzroči hitro zaustavitev rasti, brez da bi celica umrla.
Analizirali so 4 možne gene, katerih produkti zaustavijo celično rast:
*''cat'', ki zapisuje za kloramfenikol acetiltransferazo in
*''leuB'', ki zapisuje za encim v biosintezni poti levcina.
Pri obeh zgornjih proteinih je njuno izražanje potrebno za normalno rast, zato bi vezava STAR morala sprožiti transkripcijo proteina, ki bi deloval kot inhibitor izražanja ''cat'' ali ''leuB'' (inverter).
*''Gp2'', ki je gen iz bakteriofaga T7 in inhibira celično rast tako, da se veže na kompleks RNA-polimeraze v ''E. coli'' in s tem inhibira transkripcijo in
*''Gp0.4'', ki je prav tako gen iz bakteriofaga T7 in se veže na obroč FtsZ med mitozo, s čimer prepreči citokinezo.
Po prvih analizah so se osredotičili na ''Gp2'', ki za razliko od ''cat'' in ''leuB'' ne potrebuje uvajanja dodatnega inverterja v sistem in je od obeh genov tudi precej krajši, kar omogoča hitrejše izražanje in hitrejši odziv. Za razliko od ''leuB'' tudi nismo omejeni na avksotrofne seve oz. nam ni potrebno pripraviti mutant z izbitimi geni. Gen ''cat'' tudi ni idealen zaradi uporabe antibiotika in nevarnosti razvoja bakterijske odposrnosti. Pri obeh je potrebno uporabiti tudi posebno gojišče. ''Gp0.4'' zaradi težav z ligacijo niso uporabili, vendar ga načrtujejo v prihodnosti okarakterizirati.

==A.L.I.C.E==
Sistem G.E.A.R odgovarja na problem uravnavanja rasti različnih populacij v mešanih kulturah, vendar moramo za uspešno gojenje še vedno določiti optimalne pogoje rasti mešane kulture. Zato so ustvarili bazo podatkov A.L.I.C.E (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki vključuje eksperimentalne podatke o optimalni pogojih rasti za monokulture in tudi za mešane kulture, protokole in druge podatke.

==Literatura==
*[http://2016.igem.org/Team:Imperial_College Wiki stran ekipe]

*Santala, S., Karp, M. in Santala V. (2014) Rationally Engineered Synthetic Coculture for Improved Biomass and Product Formation. PLOS ONE 9(12): e113786. doi: 10.1371/journal.pone.0113786.

[[Seminarji SB 12016/17]]

Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur

2016-11-28T22:18:07Z

Mojca Juteršek: /* Modul za uravnavanje rasti */

Imperial College London, Ecolibrium – developing a framework for engineering co-cultures [http://2016.igem.org/Team:Imperial_College]

==Uvod==

Za bazično raziskovanje in tudi pri tehnoloških bioprocesih večinoma uporabljamo čiste kulture mikroorganizmov, čeprav se ti v naravi povezujejo v združbe, v katerih interagirajo in sodelujejo, na primer s proizvajanjem metabolitov, ki jih drugi organizmi uporabijo kot substrat. Takšne dinamične in simbiotske interakcije omogočajo učinkovit pretok ogljika in energije, hkrati pa izboljšujejo odziv združbe na hitre in neugodne okoljske spremembe. Sicer so monokulture trenutno enostavnejše za uporabo, saj sta za enkrat nadzor procesa in priprava kulture z genetskih inženiringom lažja, vendar so lahko prisotni problemi, kot je nabiranje stranskih produktov in neučinkovit pretok energije in ogljika. Uporaba sinteznih mešanih kultur oz. večceličnega inženiringa je zato lahko učinkovita rešitev, ki bi izboljšala ekonomičnost bioprocesov. Vendar je gojenje mešanih kultur pogosto oteženo, saj imajo različne celice različne optimalne pogoje rasti, kar lahko vodi v preraščanje ene vrste celic preko drugih. Trenutno se raziskovalci teh problemov lotevajo z različnimi metodami kontrole rasti, ki temeljijo na avksotrofiji in sistemih toksin-antitoksin. Ampak te metode niso robustne in ne omogočajo natančnega nadzora razmerja med različnimi populacijami v mešani kulturi ter hkrati niso prenosljive med različnimi organizmi.

Ekipa iz Imperial College-a v Londonu je v ta namen razvila genetsko vezje G.E.A.R. (Genetically Engineered Artificial Ratio), ki bi omogočalo stabilno ohranjanje razmerja rasti različnih celic v kulturi. Hkrati so izdelali tudi podatkovno bazo A.L.I.C.E. (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki omogoča podporo pri načrtovanju in optimizaciji procesov z mešanimi kulturami.

==G.E.A.R==
Genetsko vezje G.E.A.R. je sestavljeno iz treh modulov:
*komunikacijskega, sestavljenega iz dveh ortogonalnih sistemov, ki temeljita na zaznavanju celične gostote,
*primerjalnega, ki povezuje signale iz sistema za zaznavanje celične gostote z RNA logičnim omrežjem in omogoča celicam primerjavo gostote lastne populacije z gostoto populacij drugih celic in
*modula za uravnavanje rasti, ki se v primeru ustreznega signala iz primerjalnega sistema odzove z zaustavitvijo rasti v celicah določene populacije.

===Komunikacijski modul===

Prvi modul omogoča komunikacijo med celicami znotraj populacije in med populacijami ter temelji na v naravi prisotnem mehanizmu zaznavanja celične gostote (angl. quorum sensing), pri katerem celice proizvajajo signalne molekule, kor so na primer N-acil homoserin laktoni (AHL). Ti se vežejo na ustrezne transkripcijske faktorje, ki spremenijo vzorec izražanja genov. Ker so pri eksperimentih uporabili mešanico dveh kultur E. coli, so potrebovali sistem za dvosmerno komunikacijo z dvema edinstvenima in ortogonalnima sistemoma AHL z ustreznim odzivnim proteinom, tako da je vsaka populacija lahko zaznavala lastno gostoto in gostoto druge populacije.

Analizirali so 4 sisteme:
*Cin s transkripcijskim aktivatorjem CinR in signalno molekulo 3O-C14 AHL,
*Las s transkripcijskim aktivatorjem LasR in signalno molekulo 3O-C12 AHL,
*Lux s transkripcijskim aktivatorjem LuxR in signalno molekulo 3O-C6 AHL in
*Rhl s transkripcijskim aktivatorjem RhIR in signalno molekulo C4 AHL.

Signalno molekulo v vsakem sistemu sintetizira različen induktorski protein.
Za vsak sistem so izdelali dva sestavljena dela. Prvi del je predstavljal AHL odzivni sistem s transkripcijskim aktivatorjem (CinR, LasR, LuxR ali RhIR) pod kontrolo konstitutivnega promotorja, ki mu je sledil odgovarjajoči promotor za odziv na celično gostoto. Pri tem sistemu se v ustrezni AHL veže na konstitutivno izražen aktivator, ki aktivira transkripcijo gena navzdol od promotorja, odzivnega na aktivator. Drugi sestavljeni del je reporterski in se od odzivnega razlikuje po tem, da je za promotorjem odzivnim na celično gostoto zapis za GFP. Ta del so uporabili za karakterizacijo odziva posameznega sistema na različne koncentracije AHL in tudi za analizo navzkrižne reaktivnosti.
Pri analizah koncentracijskega območja vsakega sistema so ugotovili, da se sistemi razlikujejo glede na območja, v katerih je sistem aktiven in glede na pridobljene podatke lahko ustrezno spremenili moč uporabljenega promotorja, bodisi konstitutivnega promotorja navzgor od gena za transkripcijski aktivator ali navzgor od gena za protein, ki sintetizira signalni AHL. Pri analizah navzkrižne reaktivnosti, kjer so spremljali jakost fluorescence enega sistema pri indukciji z AHL iz drugih sistemov, so ugotovili, da sta sistema Rhl in Las najbolj ortogonalna in zato najbolj uporabna za končno vezje G.E.A.R. Hkrati so iz literature imeli podatek, da sta ortogonalna tudi sistema Cin in Rhl .

===Primerjalni modul===
Primerjalni modul primerja količino AHL iz dveh sistemov in ustvari signal, ki deluje na končni, rastni modul.
Temelji na RNA-tehnologiji STAR (Small Transcriptional-Activating RNA), pri kateri male molekule RNA uravnavajo transkripcijo genov tako, da se vežejo na promotorske regije s komplementarnimi zaporedji. Ta zaporedja tvorijo lasnično zanko, ki preprečuje vezavo RNA-polimeraze in s tem transkripcijo. Vezava STAR strukturo spremeni tako, da se RNA-polimeraza lahko veže in zato transkripcija lahko poteče.
V svojem vezju so uporabili dva sistema. Prvi sistem je vključeval zapis za STAR pod kontrolo promotorja, ki se odziva na transkripcijski aktivator, odziven na AHL lastne populacije. Za drugi sistem so načrtali zaporedje, katerega produkt je anti-STAR, molekula RNA komplementarna STAR. Ko je anti-STAR prisoten, veže STAR in prepreči aktivacijo transkripcije. Zapis za anti-STAR so vstavili za zaporedje promotorja odzivnega na AHL, ki ga proizvaja populacija drugih celic. Razmerje med med STAR in anti-STAR je zato enako razmerju med dvema AHL v mešani kulturi. V primeru, da je gostota celic enaka, sta enaki tudi količini STAR in anti-STAR, in obe populaciji rasteta normalno. Če pa pride do neenakovredne hitrosti rasti populacije, se poveča količina STAR v celicah te populacije, ki se veže na lasnično zanko v modulu za uravnavanje rasti in sproži zaustavitev rasti.
Sestavili so tudi sistem za karakterizacijo, ki je vključeval plazmid z zapisom za STAR pod kontrolo konstitutivnega promotorja in plazmid za zapisom za SFGFP (superfolder GFP) navzdol od tarčnega zaporedja za STAR. Ugotovili so, da se izražanje reporterskega proteina poveča za 17-krat že v prvih 100 minutah gojenja, kar pomeni, da je sistem sposoben hitrega odzivanja. Ugotovili so tudi, da je učinkovitost aktivacije izražanja približno 5-krat večja pri 37°C kot pri 30°C, kar je pomembno za prilagajanje sistema za uporabo pri različnih pogojih rasti.

===Modul za uravnavanje rasti===
Modul za uravnavanje rasti se odziva na signal iz sistema STAR, pri čemer se v primeru, da je rast ene populacije hitrejša, sproži prepisovanje gena, katerega produkt povzroči hitro zaustavitev rasti, brez da bi celica umrla.
Analizirali so 4 možne gene, katerih produkti zaustavijo celično rast:
*''cat'', ki zapisuje za kloramfenikol acetiltransferazo in
*''leuB'', ki zapisuje za encim v biosintezni poti levcina.
Pri obeh zgornjih proteinih je njuno izražanje potrebno za normalno rast, zato bi vezava STAR morala sprožiti transkripcijo proteina, ki bi deloval kot inhibitor izražanja cat ali leuB (inverter).
*''Gp2'', ki je gen iz bakteriofaga T7 in inhibira celično rast tako, da se veže na kompleks RNA-polimeraze v ''E. coli'' in s tem inhibira transkripcijo in
*''Gp0.4'', ki je prav tako gen iz bakteriofaga T7 in se veže na obroč FtsZ med mitozo, s čimer prepreči citokinezo.
Po prvih analizah so se osredotičili na ''Gp2'', ki za razliko od cat in leuB ne potrebuje uvajanja dodatnega inverterja v sistem in je od obeh genov tudi precej krajši, kar omogoča hitrejše izražanje in hitrejši odziv. Za razliko od leuB tudi nismo omejeni na avksotrofne seve oz. nam ni potrebno pripraviti mutant z izbitimi geni. Gen ''cat'' tudi ni idealen zaradi uporabe antibiotika in nevarnosti razvoja bakterijske odposrnosti. Pri obeh je potrebno uporabiti tudi posebno gojišče. ''Gp0.4'' zaradi težav z ligacijo niso uporabili, vendar ga načrtujejo v prihodnosti okarakterizirati.

==A.L.I.C.E==
Sistem G.E.A.R odgovarja na problem uravnavanja rasti različnih populacij v mešanih kulturah, vendar moramo za uspešno gojenje še vedno določiti optimalne pogoje rasti mešane kulture. Zato so ustvarili bazo podatkov A.L.I.C.E (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki vključuje eksperimentalne podatke o optimalni pogojih rasti za monokulture in tudi za mešane kulture, protokole in druge podatke.

==Literatura==
*[http://2016.igem.org/Team:Imperial_College Wiki stran ekipe]

*Santala, S., Karp, M. in Santala V. (2014) Rationally Engineered Synthetic Coculture for Improved Biomass and Product Formation. PLOS ONE 9(12): e113786. doi: 10.1371/journal.pone.0113786.

[[Seminarji SB 12016/17]]

Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur

2016-11-28T22:13:08Z

Mojca Juteršek: /* Primerjalni modul */

Imperial College London, Ecolibrium – developing a framework for engineering co-cultures [http://2016.igem.org/Team:Imperial_College]

==Uvod==

Za bazično raziskovanje in tudi pri tehnoloških bioprocesih večinoma uporabljamo čiste kulture mikroorganizmov, čeprav se ti v naravi povezujejo v združbe, v katerih interagirajo in sodelujejo, na primer s proizvajanjem metabolitov, ki jih drugi organizmi uporabijo kot substrat. Takšne dinamične in simbiotske interakcije omogočajo učinkovit pretok ogljika in energije, hkrati pa izboljšujejo odziv združbe na hitre in neugodne okoljske spremembe. Sicer so monokulture trenutno enostavnejše za uporabo, saj sta za enkrat nadzor procesa in priprava kulture z genetskih inženiringom lažja, vendar so lahko prisotni problemi, kot je nabiranje stranskih produktov in neučinkovit pretok energije in ogljika. Uporaba sinteznih mešanih kultur oz. večceličnega inženiringa je zato lahko učinkovita rešitev, ki bi izboljšala ekonomičnost bioprocesov. Vendar je gojenje mešanih kultur pogosto oteženo, saj imajo različne celice različne optimalne pogoje rasti, kar lahko vodi v preraščanje ene vrste celic preko drugih. Trenutno se raziskovalci teh problemov lotevajo z različnimi metodami kontrole rasti, ki temeljijo na avksotrofiji in sistemih toksin-antitoksin. Ampak te metode niso robustne in ne omogočajo natančnega nadzora razmerja med različnimi populacijami v mešani kulturi ter hkrati niso prenosljive med različnimi organizmi.

Ekipa iz Imperial College-a v Londonu je v ta namen razvila genetsko vezje G.E.A.R. (Genetically Engineered Artificial Ratio), ki bi omogočalo stabilno ohranjanje razmerja rasti različnih celic v kulturi. Hkrati so izdelali tudi podatkovno bazo A.L.I.C.E. (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki omogoča podporo pri načrtovanju in optimizaciji procesov z mešanimi kulturami.

==G.E.A.R==
Genetsko vezje G.E.A.R. je sestavljeno iz treh modulov:
*komunikacijskega, sestavljenega iz dveh ortogonalnih sistemov, ki temeljita na zaznavanju celične gostote,
*primerjalnega, ki povezuje signale iz sistema za zaznavanje celične gostote z RNA logičnim omrežjem in omogoča celicam primerjavo gostote lastne populacije z gostoto populacij drugih celic in
*modula za uravnavanje rasti, ki se v primeru ustreznega signala iz primerjalnega sistema odzove z zaustavitvijo rasti v celicah določene populacije.

===Komunikacijski modul===

Prvi modul omogoča komunikacijo med celicami znotraj populacije in med populacijami ter temelji na v naravi prisotnem mehanizmu zaznavanja celične gostote (angl. quorum sensing), pri katerem celice proizvajajo signalne molekule, kor so na primer N-acil homoserin laktoni (AHL). Ti se vežejo na ustrezne transkripcijske faktorje, ki spremenijo vzorec izražanja genov. Ker so pri eksperimentih uporabili mešanico dveh kultur E. coli, so potrebovali sistem za dvosmerno komunikacijo z dvema edinstvenima in ortogonalnima sistemoma AHL z ustreznim odzivnim proteinom, tako da je vsaka populacija lahko zaznavala lastno gostoto in gostoto druge populacije.

Analizirali so 4 sisteme:
*Cin s transkripcijskim aktivatorjem CinR in signalno molekulo 3O-C14 AHL,
*Las s transkripcijskim aktivatorjem LasR in signalno molekulo 3O-C12 AHL,
*Lux s transkripcijskim aktivatorjem LuxR in signalno molekulo 3O-C6 AHL in
*Rhl s transkripcijskim aktivatorjem RhIR in signalno molekulo C4 AHL.

Signalno molekulo v vsakem sistemu sintetizira različen induktorski protein.
Za vsak sistem so izdelali dva sestavljena dela. Prvi del je predstavljal AHL odzivni sistem s transkripcijskim aktivatorjem (CinR, LasR, LuxR ali RhIR) pod kontrolo konstitutivnega promotorja, ki mu je sledil odgovarjajoči promotor za odziv na celično gostoto. Pri tem sistemu se v ustrezni AHL veže na konstitutivno izražen aktivator, ki aktivira transkripcijo gena navzdol od promotorja, odzivnega na aktivator. Drugi sestavljeni del je reporterski in se od odzivnega razlikuje po tem, da je za promotorjem odzivnim na celično gostoto zapis za GFP. Ta del so uporabili za karakterizacijo odziva posameznega sistema na različne koncentracije AHL in tudi za analizo navzkrižne reaktivnosti.
Pri analizah koncentracijskega območja vsakega sistema so ugotovili, da se sistemi razlikujejo glede na območja, v katerih je sistem aktiven in glede na pridobljene podatke lahko ustrezno spremenili moč uporabljenega promotorja, bodisi konstitutivnega promotorja navzgor od gena za transkripcijski aktivator ali navzgor od gena za protein, ki sintetizira signalni AHL. Pri analizah navzkrižne reaktivnosti, kjer so spremljali jakost fluorescence enega sistema pri indukciji z AHL iz drugih sistemov, so ugotovili, da sta sistema Rhl in Las najbolj ortogonalna in zato najbolj uporabna za končno vezje G.E.A.R. Hkrati so iz literature imeli podatek, da sta ortogonalna tudi sistema Cin in Rhl .

===Primerjalni modul===
Primerjalni modul primerja količino AHL iz dveh sistemov in ustvari signal, ki deluje na končni, rastni modul.
Temelji na RNA-tehnologiji STAR (Small Transcriptional-Activating RNA), pri kateri male molekule RNA uravnavajo transkripcijo genov tako, da se vežejo na promotorske regije s komplementarnimi zaporedji. Ta zaporedja tvorijo lasnično zanko, ki preprečuje vezavo RNA-polimeraze in s tem transkripcijo. Vezava STAR strukturo spremeni tako, da se RNA-polimeraza lahko veže in zato transkripcija lahko poteče.
V svojem vezju so uporabili dva sistema. Prvi sistem je vključeval zapis za STAR pod kontrolo promotorja, ki se odziva na transkripcijski aktivator, odziven na AHL lastne populacije. Za drugi sistem so načrtali zaporedje, katerega produkt je anti-STAR, molekula RNA komplementarna STAR. Ko je anti-STAR prisoten, veže STAR in prepreči aktivacijo transkripcije. Zapis za anti-STAR so vstavili za zaporedje promotorja odzivnega na AHL, ki ga proizvaja populacija drugih celic. Razmerje med med STAR in anti-STAR je zato enako razmerju med dvema AHL v mešani kulturi. V primeru, da je gostota celic enaka, sta enaki tudi količini STAR in anti-STAR, in obe populaciji rasteta normalno. Če pa pride do neenakovredne hitrosti rasti populacije, se poveča količina STAR v celicah te populacije, ki se veže na lasnično zanko v modulu za uravnavanje rasti in sproži zaustavitev rasti.
Sestavili so tudi sistem za karakterizacijo, ki je vključeval plazmid z zapisom za STAR pod kontrolo konstitutivnega promotorja in plazmid za zapisom za SFGFP (superfolder GFP) navzdol od tarčnega zaporedja za STAR. Ugotovili so, da se izražanje reporterskega proteina poveča za 17-krat že v prvih 100 minutah gojenja, kar pomeni, da je sistem sposoben hitrega odzivanja. Ugotovili so tudi, da je učinkovitost aktivacije izražanja približno 5-krat večja pri 37°C kot pri 30°C, kar je pomembno za prilagajanje sistema za uporabo pri različnih pogojih rasti.

===Modul za uravnavanje rasti===
Modul za uravnavanje rasti se odziva na signal iz sistema STAR, pri čemer se v primeru, da je rast ene populacije hitrejša, sproži prepisovanje gena, katerega produkt povzroči hitro zaustavitev rasti, brez da bi celica umrla.
Analizirali so 4 možne gene, katerih produkti zaustavijo celično rast:
*cat, ki zapisuje za kloramfenikol acetiltransferazo in
*leuB, ki zapisuje za encim v biosintezni poti levcina.
Pri obeh zgornjih proteinih je njuno izražanje potrebno za normalno rast, zato bi vezava STAR morala sprožiti transkripcijo proteina, ki bi deloval kot inhibitor izražanja Cat ali LeuB (inverter).
*Gp2, ki je gen iz bakteriofaga T7 in inhibira celično rast tako, da se veže na kompleks RNA-polimeraze v E. coli in s tem inhibira transkripcijo in
*Gp0.4, ki je prav tako gen iz bakteriofaga T7 in se veže na obroč FtsZ med mitozo, s čimer prepreči citokinezo.
Po prvih analizah so se osredotičili na Gp2, ki za razliko od cat in leuB ne potrebuje uvajanja dodatnega inverterja v sistem in je od obeh genov tudi precej krajši, kar omogoča hitrejše izražanje in hitrejši odziv. Za razliko od leuB tudi nismo omejeni na avksotrofne seve oz. nam ni potrebno pripraviti mutant z izbitimi geni. Gen cat tudi ni idealen zaradi uporabe antibiotika in nevarnosti razvoja bakterijske odposrnosti. Pri obeh je potrebno uporabiti tudi posebno gojišče. Gp0.4 zaradi težav z ligacijo niso uporabili, vendar ga načrtujejo v prihodnosti tudi okarakterizirati.

==A.L.I.C.E==
Sistem G.E.A.R odgovarja na problem uravnavanja rasti različnih populacij v mešanih kulturah, vendar moramo za uspešno gojenje še vedno določiti optimalne pogoje rasti mešane kulture. Zato so ustvarili bazo podatkov A.L.I.C.E (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki vključuje eksperimentalne podatke o optimalni pogojih rasti za monokulture in tudi za mešane kulture, protokole in druge podatke.

==Literatura==
*[http://2016.igem.org/Team:Imperial_College Wiki stran ekipe]

*Santala, S., Karp, M. in Santala V. (2014) Rationally Engineered Synthetic Coculture for Improved Biomass and Product Formation. PLOS ONE 9(12): e113786. doi: 10.1371/journal.pone.0113786.

[[Seminarji SB 12016/17]]

Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur

2016-11-28T22:10:50Z

Mojca Juteršek: /* Komunikacijski modul */

Imperial College London, Ecolibrium – developing a framework for engineering co-cultures [http://2016.igem.org/Team:Imperial_College]

==Uvod==

Za bazično raziskovanje in tudi pri tehnoloških bioprocesih večinoma uporabljamo čiste kulture mikroorganizmov, čeprav se ti v naravi povezujejo v združbe, v katerih interagirajo in sodelujejo, na primer s proizvajanjem metabolitov, ki jih drugi organizmi uporabijo kot substrat. Takšne dinamične in simbiotske interakcije omogočajo učinkovit pretok ogljika in energije, hkrati pa izboljšujejo odziv združbe na hitre in neugodne okoljske spremembe. Sicer so monokulture trenutno enostavnejše za uporabo, saj sta za enkrat nadzor procesa in priprava kulture z genetskih inženiringom lažja, vendar so lahko prisotni problemi, kot je nabiranje stranskih produktov in neučinkovit pretok energije in ogljika. Uporaba sinteznih mešanih kultur oz. večceličnega inženiringa je zato lahko učinkovita rešitev, ki bi izboljšala ekonomičnost bioprocesov. Vendar je gojenje mešanih kultur pogosto oteženo, saj imajo različne celice različne optimalne pogoje rasti, kar lahko vodi v preraščanje ene vrste celic preko drugih. Trenutno se raziskovalci teh problemov lotevajo z različnimi metodami kontrole rasti, ki temeljijo na avksotrofiji in sistemih toksin-antitoksin. Ampak te metode niso robustne in ne omogočajo natančnega nadzora razmerja med različnimi populacijami v mešani kulturi ter hkrati niso prenosljive med različnimi organizmi.

Ekipa iz Imperial College-a v Londonu je v ta namen razvila genetsko vezje G.E.A.R. (Genetically Engineered Artificial Ratio), ki bi omogočalo stabilno ohranjanje razmerja rasti različnih celic v kulturi. Hkrati so izdelali tudi podatkovno bazo A.L.I.C.E. (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki omogoča podporo pri načrtovanju in optimizaciji procesov z mešanimi kulturami.

==G.E.A.R==
Genetsko vezje G.E.A.R. je sestavljeno iz treh modulov:
*komunikacijskega, sestavljenega iz dveh ortogonalnih sistemov, ki temeljita na zaznavanju celične gostote,
*primerjalnega, ki povezuje signale iz sistema za zaznavanje celične gostote z RNA logičnim omrežjem in omogoča celicam primerjavo gostote lastne populacije z gostoto populacij drugih celic in
*modula za uravnavanje rasti, ki se v primeru ustreznega signala iz primerjalnega sistema odzove z zaustavitvijo rasti v celicah določene populacije.

===Komunikacijski modul===

Prvi modul omogoča komunikacijo med celicami znotraj populacije in med populacijami ter temelji na v naravi prisotnem mehanizmu zaznavanja celične gostote (angl. quorum sensing), pri katerem celice proizvajajo signalne molekule, kor so na primer N-acil homoserin laktoni (AHL). Ti se vežejo na ustrezne transkripcijske faktorje, ki spremenijo vzorec izražanja genov. Ker so pri eksperimentih uporabili mešanico dveh kultur E. coli, so potrebovali sistem za dvosmerno komunikacijo z dvema edinstvenima in ortogonalnima sistemoma AHL z ustreznim odzivnim proteinom, tako da je vsaka populacija lahko zaznavala lastno gostoto in gostoto druge populacije.

Analizirali so 4 sisteme:
*Cin s transkripcijskim aktivatorjem CinR in signalno molekulo 3O-C14 AHL,
*Las s transkripcijskim aktivatorjem LasR in signalno molekulo 3O-C12 AHL,
*Lux s transkripcijskim aktivatorjem LuxR in signalno molekulo 3O-C6 AHL in
*Rhl s transkripcijskim aktivatorjem RhIR in signalno molekulo C4 AHL.

Signalno molekulo v vsakem sistemu sintetizira različen induktorski protein.
Za vsak sistem so izdelali dva sestavljena dela. Prvi del je predstavljal AHL odzivni sistem s transkripcijskim aktivatorjem (CinR, LasR, LuxR ali RhIR) pod kontrolo konstitutivnega promotorja, ki mu je sledil odgovarjajoči promotor za odziv na celično gostoto. Pri tem sistemu se v ustrezni AHL veže na konstitutivno izražen aktivator, ki aktivira transkripcijo gena navzdol od promotorja, odzivnega na aktivator. Drugi sestavljeni del je reporterski in se od odzivnega razlikuje po tem, da je za promotorjem odzivnim na celično gostoto zapis za GFP. Ta del so uporabili za karakterizacijo odziva posameznega sistema na različne koncentracije AHL in tudi za analizo navzkrižne reaktivnosti.
Pri analizah koncentracijskega območja vsakega sistema so ugotovili, da se sistemi razlikujejo glede na območja, v katerih je sistem aktiven in glede na pridobljene podatke lahko ustrezno spremenili moč uporabljenega promotorja, bodisi konstitutivnega promotorja navzgor od gena za transkripcijski aktivator ali navzgor od gena za protein, ki sintetizira signalni AHL. Pri analizah navzkrižne reaktivnosti, kjer so spremljali jakost fluorescence enega sistema pri indukciji z AHL iz drugih sistemov, so ugotovili, da sta sistema Rhl in Las najbolj ortogonalna in zato najbolj uporabna za končno vezje G.E.A.R. Hkrati so iz literature imeli podatek, da sta ortogonalna tudi sistema Cin in Rhl .

===Primerjalni modul===
Primerjalni modul primerja količino AHL oz. transkripcijskega aktivatorja odzivnega na AHL iz dveh sistemov in ustvari signal, ki deluje na končni, rastni modul.
Temelji na RNA-tehnologiji STAR (Small Transcriptional-Activating RNA) , pri kateri male molekule RNA uravnavajo transkripcijo genov tako, da se vežejo na promotorske regije s komplementarnimi zaporedji. Ta zaporedja tvorijo lasnično zanko, ki preprečuje vezavo RNA-polimeraze in s tem transkripcijo. Vezava STAR strukturo spremeni tako, da se RNA-polimeraza lahko veže in zato transkripcija lahko poteče.
V svojem vezju so uporabili dva sistema. Prvi sistem je vključeval zapis za STAR pod kontrolo promotorja, ki se odziva na transkripcijski aktivator, odziven na AHL lastne populacije. Za drugi sistem so načrtali zaporedje, katerega produkt je anti-STAR, molekula RNA komplementarna STAR. Ko je anti-STAR prisoten veže STAR in prepreči aktivacijo transkripcije. Zapis za anti-STAR so vstavili za zaporedje promotorja odzivnega na AHL, ki ga proizvaja populacija drugih celic. Razmerje med med STAR in anti-STAR je zato enako razmerju med dvema AHL v mešani kulturi. V primeru, da je gostota celic enaka, sta enaki tudi količini STAR in anti-STAR, in obe populaciji rasteta normalno. Če pa pride do neenakovredne hitrosti rasti populacije, se poveča količina STAR v celicah te populacije, ki se veže na lasnično zanko v modulu za uravnavanje rasti in sproži zaustavitev rasti.
Sestavili so tudi sistem za karakterizacijo, ki je vključeval plazmid z zapisom za STAR pod kontrolo konstitutivnega promotorja in plazmid za zapisom za SFGFP (superfolder GFP) navzdol od tarčnega zaporedja za STAR. Ugotovili so, da se izražanje reporterskega proteina poveča za 17-krat že v prvih 100 minutah gojenja, kar pomeni, da je sistem sposoben hitrega odzivanja. Ugotovili so tudi, da je učinkovitost aktivacije izražanja približno 5-krat večja pri 37°C kot pri 30°C, kar je pomembno za prilagajanje sistema za uporabo pri različnih pogojih rasti.

===Modul za uravnavanje rasti===
Modul za uravnavanje rasti se odziva na signal iz sistema STAR, pri čemer se v primeru, da je rast ene populacije hitrejša, sproži prepisovanje gena, katerega produkt povzroči hitro zaustavitev rasti, brez da bi celica umrla.
Analizirali so 4 možne gene, katerih produkti zaustavijo celično rast:
*cat, ki zapisuje za kloramfenikol acetiltransferazo in
*leuB, ki zapisuje za encim v biosintezni poti levcina.
Pri obeh zgornjih proteinih je njuno izražanje potrebno za normalno rast, zato bi vezava STAR morala sprožiti transkripcijo proteina, ki bi deloval kot inhibitor izražanja Cat ali LeuB (inverter).
*Gp2, ki je gen iz bakteriofaga T7 in inhibira celično rast tako, da se veže na kompleks RNA-polimeraze v E. coli in s tem inhibira transkripcijo in
*Gp0.4, ki je prav tako gen iz bakteriofaga T7 in se veže na obroč FtsZ med mitozo, s čimer prepreči citokinezo.
Po prvih analizah so se osredotičili na Gp2, ki za razliko od cat in leuB ne potrebuje uvajanja dodatnega inverterja v sistem in je od obeh genov tudi precej krajši, kar omogoča hitrejše izražanje in hitrejši odziv. Za razliko od leuB tudi nismo omejeni na avksotrofne seve oz. nam ni potrebno pripraviti mutant z izbitimi geni. Gen cat tudi ni idealen zaradi uporabe antibiotika in nevarnosti razvoja bakterijske odposrnosti. Pri obeh je potrebno uporabiti tudi posebno gojišče. Gp0.4 zaradi težav z ligacijo niso uporabili, vendar ga načrtujejo v prihodnosti tudi okarakterizirati.

==A.L.I.C.E==
Sistem G.E.A.R odgovarja na problem uravnavanja rasti različnih populacij v mešanih kulturah, vendar moramo za uspešno gojenje še vedno določiti optimalne pogoje rasti mešane kulture. Zato so ustvarili bazo podatkov A.L.I.C.E (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki vključuje eksperimentalne podatke o optimalni pogojih rasti za monokulture in tudi za mešane kulture, protokole in druge podatke.

==Literatura==
*[http://2016.igem.org/Team:Imperial_College Wiki stran ekipe]

*Santala, S., Karp, M. in Santala V. (2014) Rationally Engineered Synthetic Coculture for Improved Biomass and Product Formation. PLOS ONE 9(12): e113786. doi: 10.1371/journal.pone.0113786.

[[Seminarji SB 12016/17]]

Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur

2016-11-28T22:06:33Z

Mojca Juteršek: /* G.E.A.R */

Imperial College London, Ecolibrium – developing a framework for engineering co-cultures [http://2016.igem.org/Team:Imperial_College]

==Uvod==

Za bazično raziskovanje in tudi pri tehnoloških bioprocesih večinoma uporabljamo čiste kulture mikroorganizmov, čeprav se ti v naravi povezujejo v združbe, v katerih interagirajo in sodelujejo, na primer s proizvajanjem metabolitov, ki jih drugi organizmi uporabijo kot substrat. Takšne dinamične in simbiotske interakcije omogočajo učinkovit pretok ogljika in energije, hkrati pa izboljšujejo odziv združbe na hitre in neugodne okoljske spremembe. Sicer so monokulture trenutno enostavnejše za uporabo, saj sta za enkrat nadzor procesa in priprava kulture z genetskih inženiringom lažja, vendar so lahko prisotni problemi, kot je nabiranje stranskih produktov in neučinkovit pretok energije in ogljika. Uporaba sinteznih mešanih kultur oz. večceličnega inženiringa je zato lahko učinkovita rešitev, ki bi izboljšala ekonomičnost bioprocesov. Vendar je gojenje mešanih kultur pogosto oteženo, saj imajo različne celice različne optimalne pogoje rasti, kar lahko vodi v preraščanje ene vrste celic preko drugih. Trenutno se raziskovalci teh problemov lotevajo z različnimi metodami kontrole rasti, ki temeljijo na avksotrofiji in sistemih toksin-antitoksin. Ampak te metode niso robustne in ne omogočajo natančnega nadzora razmerja med različnimi populacijami v mešani kulturi ter hkrati niso prenosljive med različnimi organizmi.

Ekipa iz Imperial College-a v Londonu je v ta namen razvila genetsko vezje G.E.A.R. (Genetically Engineered Artificial Ratio), ki bi omogočalo stabilno ohranjanje razmerja rasti različnih celic v kulturi. Hkrati so izdelali tudi podatkovno bazo A.L.I.C.E. (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki omogoča podporo pri načrtovanju in optimizaciji procesov z mešanimi kulturami.

==G.E.A.R==
Genetsko vezje G.E.A.R. je sestavljeno iz treh modulov:
*komunikacijskega, sestavljenega iz dveh ortogonalnih sistemov, ki temeljita na zaznavanju celične gostote,
*primerjalnega, ki povezuje signale iz sistema za zaznavanje celične gostote z RNA logičnim omrežjem in omogoča celicam primerjavo gostote lastne populacije z gostoto populacij drugih celic in
*modula za uravnavanje rasti, ki se v primeru ustreznega signala iz primerjalnega sistema odzove z zaustavitvijo rasti v celicah določene populacije.

===Komunikacijski modul===

Prvi modul omogoča komunikacijo med celicami znotraj populacije in med populacijami in temelji na naravno prisotnem mehanizmu zaznavanja celične gostote (angl. quorum sensing), pri katerem celice proizvajajo signalne molekule, kor so na primer N-acil homoserin laktoni (AHL). Ti se vežejo na ustrezne transkripcijske faktorje, ki spremenijo vzorec izražanja genov. Ker so pri eksperimentih uporabili mešanico dveh kultur E. coli, so potrebovali sistem za dvosmerno komunikacijo z dvema edinstvenima in ortogonalnima sistemoma AHL z ustreznim odzivnim proteinom, tako da je vsaka populacija lahko zaznavala lastno gostoto in gostoto druge populacije.

Analizirali so 4 sisteme:
*Cin s transkripcijskim aktivatorjem CinR in signalno molekulo 3O-C14 AHL,
*Las s transkripcijskim aktivatorjem LasR in signalno molekulo 3O-C12 AHL,
*Lux s transkripcijskim aktivatorjem LuxR in signalno molekulo 3O-C6 AHL in
*RhI s transkripcijskim aktivatorjem RhIR in signalno molekulo C4 AHL.

Signalno molekulo v vsakem sistemu sintetizira različen induktorski protein.
Za vsak sistem so izdelali dva sestavljena dela. Prvi del je predstavljal AHL odzivni sistem s transkripcijskim aktivatorjem (CinR, LasR, LuxR ali RhIR) pod kontrolo konstitutivnega promotorja, ki mu je sledil odgovarjajoči promotor za odziv na celično gostoto. Pri tem sistemu se v prisotnosti ustreznega AHL ta veže na konstitutivno izražen aktivator, ki aktivira transkripcijo gena navzdol od promotorja, odzivnega na aktivator. Drugi sestavljeni del je reporterski in se od odzivnega razlikuje po tem, da je za promotorjem odzivnim na celično gostoto zapis za GFP. Ta del so uporabili za karakterizacijo odziva posameznega sistema na različne koncentracije AHL in tudi za analizo navzkrižne reaktivnosti.
Pri analizah koncentracijskega območja vsakega sistema so ugotovili, da se sistemi razlikujejo glede na območja, v katerih je sistem aktiven in glede na pridobljene podatke lahko ustrezno spremenili moč uporabljenega promotorja, bodisi konstitutivnega promotorja navzgor od gena za transkripcijski aktivator ali navzgor od gena za protein, ki sintetizira signalni AHL. Pri analizah navzkrižne reaktivnosti, kjer so spremljali jakost fluorescence enega sistema pri indukciji z AHL iz drugih sistemov, so ugotovili, da sta sistema RhI in Las najbolj ortogonalna in zato najuporabnejša za končno vezje G.E.A.R. Hkrati so iz literature imeli podatek, da sta tudi sistema Cin in RhI ortogonalna.

===Primerjalni modul===
Primerjalni modul primerja količino AHL oz. transkripcijskega aktivatorja odzivnega na AHL iz dveh sistemov in ustvari signal, ki deluje na končni, rastni modul.
Temelji na RNA-tehnologiji STAR (Small Transcriptional-Activating RNA) , pri kateri male molekule RNA uravnavajo transkripcijo genov tako, da se vežejo na promotorske regije s komplementarnimi zaporedji. Ta zaporedja tvorijo lasnično zanko, ki preprečuje vezavo RNA-polimeraze in s tem transkripcijo. Vezava STAR strukturo spremeni tako, da se RNA-polimeraza lahko veže in zato transkripcija lahko poteče.
V svojem vezju so uporabili dva sistema. Prvi sistem je vključeval zapis za STAR pod kontrolo promotorja, ki se odziva na transkripcijski aktivator, odziven na AHL lastne populacije. Za drugi sistem so načrtali zaporedje, katerega produkt je anti-STAR, molekula RNA komplementarna STAR. Ko je anti-STAR prisoten veže STAR in prepreči aktivacijo transkripcije. Zapis za anti-STAR so vstavili za zaporedje promotorja odzivnega na AHL, ki ga proizvaja populacija drugih celic. Razmerje med med STAR in anti-STAR je zato enako razmerju med dvema AHL v mešani kulturi. V primeru, da je gostota celic enaka, sta enaki tudi količini STAR in anti-STAR, in obe populaciji rasteta normalno. Če pa pride do neenakovredne hitrosti rasti populacije, se poveča količina STAR v celicah te populacije, ki se veže na lasnično zanko v modulu za uravnavanje rasti in sproži zaustavitev rasti.
Sestavili so tudi sistem za karakterizacijo, ki je vključeval plazmid z zapisom za STAR pod kontrolo konstitutivnega promotorja in plazmid za zapisom za SFGFP (superfolder GFP) navzdol od tarčnega zaporedja za STAR. Ugotovili so, da se izražanje reporterskega proteina poveča za 17-krat že v prvih 100 minutah gojenja, kar pomeni, da je sistem sposoben hitrega odzivanja. Ugotovili so tudi, da je učinkovitost aktivacije izražanja približno 5-krat večja pri 37°C kot pri 30°C, kar je pomembno za prilagajanje sistema za uporabo pri različnih pogojih rasti.

===Modul za uravnavanje rasti===
Modul za uravnavanje rasti se odziva na signal iz sistema STAR, pri čemer se v primeru, da je rast ene populacije hitrejša, sproži prepisovanje gena, katerega produkt povzroči hitro zaustavitev rasti, brez da bi celica umrla.
Analizirali so 4 možne gene, katerih produkti zaustavijo celično rast:
*cat, ki zapisuje za kloramfenikol acetiltransferazo in
*leuB, ki zapisuje za encim v biosintezni poti levcina.
Pri obeh zgornjih proteinih je njuno izražanje potrebno za normalno rast, zato bi vezava STAR morala sprožiti transkripcijo proteina, ki bi deloval kot inhibitor izražanja Cat ali LeuB (inverter).
*Gp2, ki je gen iz bakteriofaga T7 in inhibira celično rast tako, da se veže na kompleks RNA-polimeraze v E. coli in s tem inhibira transkripcijo in
*Gp0.4, ki je prav tako gen iz bakteriofaga T7 in se veže na obroč FtsZ med mitozo, s čimer prepreči citokinezo.
Po prvih analizah so se osredotičili na Gp2, ki za razliko od cat in leuB ne potrebuje uvajanja dodatnega inverterja v sistem in je od obeh genov tudi precej krajši, kar omogoča hitrejše izražanje in hitrejši odziv. Za razliko od leuB tudi nismo omejeni na avksotrofne seve oz. nam ni potrebno pripraviti mutant z izbitimi geni. Gen cat tudi ni idealen zaradi uporabe antibiotika in nevarnosti razvoja bakterijske odposrnosti. Pri obeh je potrebno uporabiti tudi posebno gojišče. Gp0.4 zaradi težav z ligacijo niso uporabili, vendar ga načrtujejo v prihodnosti tudi okarakterizirati.

==A.L.I.C.E==
Sistem G.E.A.R odgovarja na problem uravnavanja rasti različnih populacij v mešanih kulturah, vendar moramo za uspešno gojenje še vedno določiti optimalne pogoje rasti mešane kulture. Zato so ustvarili bazo podatkov A.L.I.C.E (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki vključuje eksperimentalne podatke o optimalni pogojih rasti za monokulture in tudi za mešane kulture, protokole in druge podatke.

==Literatura==
*[http://2016.igem.org/Team:Imperial_College Wiki stran ekipe]

*Santala, S., Karp, M. in Santala V. (2014) Rationally Engineered Synthetic Coculture for Improved Biomass and Product Formation. PLOS ONE 9(12): e113786. doi: 10.1371/journal.pone.0113786.

[[Seminarji SB 12016/17]]

Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur

2016-11-28T22:05:25Z

Mojca Juteršek: /* Uvod */

Imperial College London, Ecolibrium – developing a framework for engineering co-cultures [http://2016.igem.org/Team:Imperial_College]

==Uvod==

Za bazično raziskovanje in tudi pri tehnoloških bioprocesih večinoma uporabljamo čiste kulture mikroorganizmov, čeprav se ti v naravi povezujejo v združbe, v katerih interagirajo in sodelujejo, na primer s proizvajanjem metabolitov, ki jih drugi organizmi uporabijo kot substrat. Takšne dinamične in simbiotske interakcije omogočajo učinkovit pretok ogljika in energije, hkrati pa izboljšujejo odziv združbe na hitre in neugodne okoljske spremembe. Sicer so monokulture trenutno enostavnejše za uporabo, saj sta za enkrat nadzor procesa in priprava kulture z genetskih inženiringom lažja, vendar so lahko prisotni problemi, kot je nabiranje stranskih produktov in neučinkovit pretok energije in ogljika. Uporaba sinteznih mešanih kultur oz. večceličnega inženiringa je zato lahko učinkovita rešitev, ki bi izboljšala ekonomičnost bioprocesov. Vendar je gojenje mešanih kultur pogosto oteženo, saj imajo različne celice različne optimalne pogoje rasti, kar lahko vodi v preraščanje ene vrste celic preko drugih. Trenutno se raziskovalci teh problemov lotevajo z različnimi metodami kontrole rasti, ki temeljijo na avksotrofiji in sistemih toksin-antitoksin. Ampak te metode niso robustne in ne omogočajo natančnega nadzora razmerja med različnimi populacijami v mešani kulturi ter hkrati niso prenosljive med različnimi organizmi.

Ekipa iz Imperial College-a v Londonu je v ta namen razvila genetsko vezje G.E.A.R. (Genetically Engineered Artificial Ratio), ki bi omogočalo stabilno ohranjanje razmerja rasti različnih celic v kulturi. Hkrati so izdelali tudi podatkovno bazo A.L.I.C.E. (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki omogoča podporo pri načrtovanju in optimizaciji procesov z mešanimi kulturami.

==G.E.A.R==
Genetsko vezje G.E.A.R. je sestavljeno iz treh modulov:
*komunikacijskega, sestavljenega iz dveh ortogonalnih sistemov, ki temeljita na zaznavanju celične gostote,
*primerjalnega, ki povezuje signale iz sistema za zaznavanje celične gostote z RNA logičnim omrežjem in omogoča celicam primerjavo lastne populacije s populacijami drugih celic in
*modula za uravnavanje rasti, ki se v primeru ustreznega signala iz primerjalnega sistema odzove z zaustavitvijo rasti v celicah določene populacije.

===Komunikacijski modul===

Prvi modul omogoča komunikacijo med celicami znotraj populacije in med populacijami in temelji na naravno prisotnem mehanizmu zaznavanja celične gostote (angl. quorum sensing), pri katerem celice proizvajajo signalne molekule, kor so na primer N-acil homoserin laktoni (AHL). Ti se vežejo na ustrezne transkripcijske faktorje, ki spremenijo vzorec izražanja genov. Ker so pri eksperimentih uporabili mešanico dveh kultur E. coli, so potrebovali sistem za dvosmerno komunikacijo z dvema edinstvenima in ortogonalnima sistemoma AHL z ustreznim odzivnim proteinom, tako da je vsaka populacija lahko zaznavala lastno gostoto in gostoto druge populacije.

Analizirali so 4 sisteme:
*Cin s transkripcijskim aktivatorjem CinR in signalno molekulo 3O-C14 AHL,
*Las s transkripcijskim aktivatorjem LasR in signalno molekulo 3O-C12 AHL,
*Lux s transkripcijskim aktivatorjem LuxR in signalno molekulo 3O-C6 AHL in
*RhI s transkripcijskim aktivatorjem RhIR in signalno molekulo C4 AHL.

Signalno molekulo v vsakem sistemu sintetizira različen induktorski protein.
Za vsak sistem so izdelali dva sestavljena dela. Prvi del je predstavljal AHL odzivni sistem s transkripcijskim aktivatorjem (CinR, LasR, LuxR ali RhIR) pod kontrolo konstitutivnega promotorja, ki mu je sledil odgovarjajoči promotor za odziv na celično gostoto. Pri tem sistemu se v prisotnosti ustreznega AHL ta veže na konstitutivno izražen aktivator, ki aktivira transkripcijo gena navzdol od promotorja, odzivnega na aktivator. Drugi sestavljeni del je reporterski in se od odzivnega razlikuje po tem, da je za promotorjem odzivnim na celično gostoto zapis za GFP. Ta del so uporabili za karakterizacijo odziva posameznega sistema na različne koncentracije AHL in tudi za analizo navzkrižne reaktivnosti.
Pri analizah koncentracijskega območja vsakega sistema so ugotovili, da se sistemi razlikujejo glede na območja, v katerih je sistem aktiven in glede na pridobljene podatke lahko ustrezno spremenili moč uporabljenega promotorja, bodisi konstitutivnega promotorja navzgor od gena za transkripcijski aktivator ali navzgor od gena za protein, ki sintetizira signalni AHL. Pri analizah navzkrižne reaktivnosti, kjer so spremljali jakost fluorescence enega sistema pri indukciji z AHL iz drugih sistemov, so ugotovili, da sta sistema RhI in Las najbolj ortogonalna in zato najuporabnejša za končno vezje G.E.A.R. Hkrati so iz literature imeli podatek, da sta tudi sistema Cin in RhI ortogonalna.

===Primerjalni modul===
Primerjalni modul primerja količino AHL oz. transkripcijskega aktivatorja odzivnega na AHL iz dveh sistemov in ustvari signal, ki deluje na končni, rastni modul.
Temelji na RNA-tehnologiji STAR (Small Transcriptional-Activating RNA) , pri kateri male molekule RNA uravnavajo transkripcijo genov tako, da se vežejo na promotorske regije s komplementarnimi zaporedji. Ta zaporedja tvorijo lasnično zanko, ki preprečuje vezavo RNA-polimeraze in s tem transkripcijo. Vezava STAR strukturo spremeni tako, da se RNA-polimeraza lahko veže in zato transkripcija lahko poteče.
V svojem vezju so uporabili dva sistema. Prvi sistem je vključeval zapis za STAR pod kontrolo promotorja, ki se odziva na transkripcijski aktivator, odziven na AHL lastne populacije. Za drugi sistem so načrtali zaporedje, katerega produkt je anti-STAR, molekula RNA komplementarna STAR. Ko je anti-STAR prisoten veže STAR in prepreči aktivacijo transkripcije. Zapis za anti-STAR so vstavili za zaporedje promotorja odzivnega na AHL, ki ga proizvaja populacija drugih celic. Razmerje med med STAR in anti-STAR je zato enako razmerju med dvema AHL v mešani kulturi. V primeru, da je gostota celic enaka, sta enaki tudi količini STAR in anti-STAR, in obe populaciji rasteta normalno. Če pa pride do neenakovredne hitrosti rasti populacije, se poveča količina STAR v celicah te populacije, ki se veže na lasnično zanko v modulu za uravnavanje rasti in sproži zaustavitev rasti.
Sestavili so tudi sistem za karakterizacijo, ki je vključeval plazmid z zapisom za STAR pod kontrolo konstitutivnega promotorja in plazmid za zapisom za SFGFP (superfolder GFP) navzdol od tarčnega zaporedja za STAR. Ugotovili so, da se izražanje reporterskega proteina poveča za 17-krat že v prvih 100 minutah gojenja, kar pomeni, da je sistem sposoben hitrega odzivanja. Ugotovili so tudi, da je učinkovitost aktivacije izražanja približno 5-krat večja pri 37°C kot pri 30°C, kar je pomembno za prilagajanje sistema za uporabo pri različnih pogojih rasti.

===Modul za uravnavanje rasti===
Modul za uravnavanje rasti se odziva na signal iz sistema STAR, pri čemer se v primeru, da je rast ene populacije hitrejša, sproži prepisovanje gena, katerega produkt povzroči hitro zaustavitev rasti, brez da bi celica umrla.
Analizirali so 4 možne gene, katerih produkti zaustavijo celično rast:
*cat, ki zapisuje za kloramfenikol acetiltransferazo in
*leuB, ki zapisuje za encim v biosintezni poti levcina.
Pri obeh zgornjih proteinih je njuno izražanje potrebno za normalno rast, zato bi vezava STAR morala sprožiti transkripcijo proteina, ki bi deloval kot inhibitor izražanja Cat ali LeuB (inverter).
*Gp2, ki je gen iz bakteriofaga T7 in inhibira celično rast tako, da se veže na kompleks RNA-polimeraze v E. coli in s tem inhibira transkripcijo in
*Gp0.4, ki je prav tako gen iz bakteriofaga T7 in se veže na obroč FtsZ med mitozo, s čimer prepreči citokinezo.
Po prvih analizah so se osredotičili na Gp2, ki za razliko od cat in leuB ne potrebuje uvajanja dodatnega inverterja v sistem in je od obeh genov tudi precej krajši, kar omogoča hitrejše izražanje in hitrejši odziv. Za razliko od leuB tudi nismo omejeni na avksotrofne seve oz. nam ni potrebno pripraviti mutant z izbitimi geni. Gen cat tudi ni idealen zaradi uporabe antibiotika in nevarnosti razvoja bakterijske odposrnosti. Pri obeh je potrebno uporabiti tudi posebno gojišče. Gp0.4 zaradi težav z ligacijo niso uporabili, vendar ga načrtujejo v prihodnosti tudi okarakterizirati.

==A.L.I.C.E==
Sistem G.E.A.R odgovarja na problem uravnavanja rasti različnih populacij v mešanih kulturah, vendar moramo za uspešno gojenje še vedno določiti optimalne pogoje rasti mešane kulture. Zato so ustvarili bazo podatkov A.L.I.C.E (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki vključuje eksperimentalne podatke o optimalni pogojih rasti za monokulture in tudi za mešane kulture, protokole in druge podatke.

==Literatura==
*[http://2016.igem.org/Team:Imperial_College Wiki stran ekipe]

*Santala, S., Karp, M. in Santala V. (2014) Rationally Engineered Synthetic Coculture for Improved Biomass and Product Formation. PLOS ONE 9(12): e113786. doi: 10.1371/journal.pone.0113786.

[[Seminarji SB 12016/17]]

Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur

2016-11-27T14:33:01Z

Mojca Juteršek: /* Literatura */

Imperial College London, Ecolibrium – developing a framework for engineering co-cultures [http://2016.igem.org/Team:Imperial_College]

==Uvod==

Za bazično raziskovanje in tudi pri tehnoloških bioprocesih večinoma uporabljamo čiste kulture mikroorganizmov, čeprav se ti v naravi povezujejo v združbe, v katerih interagirajo in sodelujejo, na primer s proizvajanjem metabolitov, ki jih drugi organizmi uporabijo kot substrat. Takšne dinamične in simbiotske interakcije omogočajo učinkovit pretok ogljika in energije, hkrati pa izboljšujejo odziv združbe na hitre in neugodne okoljske spremembe. Sicer so monokulture trenutno enostavnejše za uporabo, saj sta za enkrat nadzor procesa in priprava kulture z genetskih inženiringom lažja, vendar so lahko prisotni problemi kot je nabiranje stranskih produktov in neučinkovit pretok energije in ogljika. Uporaba sinteznih mešanih kultur oz. večceličnega inženiringa je zato lahko učinkovita rešitev, ki bo izboljšala ekonomičnost bioprocesov. Vendar je gojenje mešanih kultur je pogosto oteženo, saj imajo različne celice različne optimalne pogoje rasti, kar lahko vodi v preraščanje ene vrste celic preko drugih. Trenutno se raziskovalci teh problemov lotevajo z različnimi metodami kontrole rasti, ki temeljijo na avksotrofiji in sistemih toksin-antitoksin. Vendar te metode niso robustne in ne omogočajo natančnega nadzora razmerja med različnimi populacijami v mešani kulturi ter hkrati niso prenosljive med različnimi organizmi.

Ekipa iz Imperial College-a v Londonu so v ta namen razvili genetsko vezje G.E.A.R. (Genetically Engineered Artificial Ratio), ki bi omogočala stabilno ohranjanje razmerja rasti različnih celic v kulturi. Hkrati so izdelali tudi podatkovno bazo A.L.I.C.E. (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki omogoča podporo pri načrtovanju in optimizaciji procesov z mešanimi kulturami.

==G.E.A.R==
Genetsko vezje G.E.A.R. je sestavljeno iz treh modulov:
*komunikacijskega, sestavljenega iz dveh ortogonalnih sistemov, ki temeljita na zaznavanju celične gostote,
*primerjalnega, ki povezuje signale iz sistema za zaznavanje celične gostote z RNA logičnim omrežjem in omogoča celicam primerjavo lastne populacije s populacijami drugih celic in
*modula za uravnavanje rasti, ki se v primeru ustreznega signala iz primerjalnega sistema odzove z zaustavitvijo rasti v celicah določene populacije.

===Komunikacijski modul===

Prvi modul omogoča komunikacijo med celicami znotraj populacije in med populacijami in temelji na naravno prisotnem mehanizmu zaznavanja celične gostote (angl. quorum sensing), pri katerem celice proizvajajo signalne molekule, kor so na primer N-acil homoserin laktoni (AHL). Ti se vežejo na ustrezne transkripcijske faktorje, ki spremenijo vzorec izražanja genov. Ker so pri eksperimentih uporabili mešanico dveh kultur E. coli, so potrebovali sistem za dvosmerno komunikacijo z dvema edinstvenima in ortogonalnima sistemoma AHL z ustreznim odzivnim proteinom, tako da je vsaka populacija lahko zaznavala lastno gostoto in gostoto druge populacije.

Analizirali so 4 sisteme:
*Cin s transkripcijskim aktivatorjem CinR in signalno molekulo 3O-C14 AHL,
*Las s transkripcijskim aktivatorjem LasR in signalno molekulo 3O-C12 AHL,
*Lux s transkripcijskim aktivatorjem LuxR in signalno molekulo 3O-C6 AHL in
*RhI s transkripcijskim aktivatorjem RhIR in signalno molekulo C4 AHL.

Signalno molekulo v vsakem sistemu sintetizira različen induktorski protein.
Za vsak sistem so izdelali dva sestavljena dela. Prvi del je predstavljal AHL odzivni sistem s transkripcijskim aktivatorjem (CinR, LasR, LuxR ali RhIR) pod kontrolo konstitutivnega promotorja, ki mu je sledil odgovarjajoči promotor za odziv na celično gostoto. Pri tem sistemu se v prisotnosti ustreznega AHL ta veže na konstitutivno izražen aktivator, ki aktivira transkripcijo gena navzdol od promotorja, odzivnega na aktivator. Drugi sestavljeni del je reporterski in se od odzivnega razlikuje po tem, da je za promotorjem odzivnim na celično gostoto zapis za GFP. Ta del so uporabili za karakterizacijo odziva posameznega sistema na različne koncentracije AHL in tudi za analizo navzkrižne reaktivnosti.
Pri analizah koncentracijskega območja vsakega sistema so ugotovili, da se sistemi razlikujejo glede na območja, v katerih je sistem aktiven in glede na pridobljene podatke lahko ustrezno spremenili moč uporabljenega promotorja, bodisi konstitutivnega promotorja navzgor od gena za transkripcijski aktivator ali navzgor od gena za protein, ki sintetizira signalni AHL. Pri analizah navzkrižne reaktivnosti, kjer so spremljali jakost fluorescence enega sistema pri indukciji z AHL iz drugih sistemov, so ugotovili, da sta sistema RhI in Las najbolj ortogonalna in zato najuporabnejša za končno vezje G.E.A.R. Hkrati so iz literature imeli podatek, da sta tudi sistema Cin in RhI ortogonalna.

===Primerjalni modul===
Primerjalni modul primerja količino AHL oz. transkripcijskega aktivatorja odzivnega na AHL iz dveh sistemov in ustvari signal, ki deluje na končni, rastni modul.
Temelji na RNA-tehnologiji STAR (Small Transcriptional-Activating RNA) , pri kateri male molekule RNA uravnavajo transkripcijo genov tako, da se vežejo na promotorske regije s komplementarnimi zaporedji. Ta zaporedja tvorijo lasnično zanko, ki preprečuje vezavo RNA-polimeraze in s tem transkripcijo. Vezava STAR strukturo spremeni tako, da se RNA-polimeraza lahko veže in zato transkripcija lahko poteče.
V svojem vezju so uporabili dva sistema. Prvi sistem je vključeval zapis za STAR pod kontrolo promotorja, ki se odziva na transkripcijski aktivator, odziven na AHL lastne populacije. Za drugi sistem so načrtali zaporedje, katerega produkt je anti-STAR, molekula RNA komplementarna STAR. Ko je anti-STAR prisoten veže STAR in prepreči aktivacijo transkripcije. Zapis za anti-STAR so vstavili za zaporedje promotorja odzivnega na AHL, ki ga proizvaja populacija drugih celic. Razmerje med med STAR in anti-STAR je zato enako razmerju med dvema AHL v mešani kulturi. V primeru, da je gostota celic enaka, sta enaki tudi količini STAR in anti-STAR, in obe populaciji rasteta normalno. Če pa pride do neenakovredne hitrosti rasti populacije, se poveča količina STAR v celicah te populacije, ki se veže na lasnično zanko v modulu za uravnavanje rasti in sproži zaustavitev rasti.
Sestavili so tudi sistem za karakterizacijo, ki je vključeval plazmid z zapisom za STAR pod kontrolo konstitutivnega promotorja in plazmid za zapisom za SFGFP (superfolder GFP) navzdol od tarčnega zaporedja za STAR. Ugotovili so, da se izražanje reporterskega proteina poveča za 17-krat že v prvih 100 minutah gojenja, kar pomeni, da je sistem sposoben hitrega odzivanja. Ugotovili so tudi, da je učinkovitost aktivacije izražanja približno 5-krat večja pri 37°C kot pri 30°C, kar je pomembno za prilagajanje sistema za uporabo pri različnih pogojih rasti.

===Modul za uravnavanje rasti===
Modul za uravnavanje rasti se odziva na signal iz sistema STAR, pri čemer se v primeru, da je rast ene populacije hitrejša, sproži prepisovanje gena, katerega produkt povzroči hitro zaustavitev rasti, brez da bi celica umrla.
Analizirali so 4 možne gene, katerih produkti zaustavijo celično rast:
*cat, ki zapisuje za kloramfenikol acetiltransferazo in
*leuB, ki zapisuje za encim v biosintezni poti levcina.
Pri obeh zgornjih proteinih je njuno izražanje potrebno za normalno rast, zato bi vezava STAR morala sprožiti transkripcijo proteina, ki bi deloval kot inhibitor izražanja Cat ali LeuB (inverter).
*Gp2, ki je gen iz bakteriofaga T7 in inhibira celično rast tako, da se veže na kompleks RNA-polimeraze v E. coli in s tem inhibira transkripcijo in
*Gp0.4, ki je prav tako gen iz bakteriofaga T7 in se veže na obroč FtsZ med mitozo, s čimer prepreči citokinezo.
Po prvih analizah so se osredotičili na Gp2, ki za razliko od cat in leuB ne potrebuje uvajanja dodatnega inverterja v sistem in je od obeh genov tudi precej krajši, kar omogoča hitrejše izražanje in hitrejši odziv. Za razliko od leuB tudi nismo omejeni na avksotrofne seve oz. nam ni potrebno pripraviti mutant z izbitimi geni. Gen cat tudi ni idealen zaradi uporabe antibiotika in nevarnosti razvoja bakterijske odposrnosti. Pri obeh je potrebno uporabiti tudi posebno gojišče. Gp0.4 zaradi težav z ligacijo niso uporabili, vendar ga načrtujejo v prihodnosti tudi okarakterizirati.

==A.L.I.C.E==
Sistem G.E.A.R odgovarja na problem uravnavanja rasti različnih populacij v mešanih kulturah, vendar moramo za uspešno gojenje še vedno določiti optimalne pogoje rasti mešane kulture. Zato so ustvarili bazo podatkov A.L.I.C.E (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki vključuje eksperimentalne podatke o optimalni pogojih rasti za monokulture in tudi za mešane kulture, protokole in druge podatke.

==Literatura==
*[http://2016.igem.org/Team:Imperial_College Wiki stran ekipe]

*Santala, S., Karp, M. in Santala V. (2014) Rationally Engineered Synthetic Coculture for Improved Biomass and Product Formation. PLOS ONE 9(12): e113786. doi: 10.1371/journal.pone.0113786.

[[Seminarji SB 12016/17]]

Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur

2016-11-27T14:32:38Z

Mojca Juteršek:

Imperial College London, Ecolibrium – developing a framework for engineering co-cultures [http://2016.igem.org/Team:Imperial_College]

==Uvod==

Za bazično raziskovanje in tudi pri tehnoloških bioprocesih večinoma uporabljamo čiste kulture mikroorganizmov, čeprav se ti v naravi povezujejo v združbe, v katerih interagirajo in sodelujejo, na primer s proizvajanjem metabolitov, ki jih drugi organizmi uporabijo kot substrat. Takšne dinamične in simbiotske interakcije omogočajo učinkovit pretok ogljika in energije, hkrati pa izboljšujejo odziv združbe na hitre in neugodne okoljske spremembe. Sicer so monokulture trenutno enostavnejše za uporabo, saj sta za enkrat nadzor procesa in priprava kulture z genetskih inženiringom lažja, vendar so lahko prisotni problemi kot je nabiranje stranskih produktov in neučinkovit pretok energije in ogljika. Uporaba sinteznih mešanih kultur oz. večceličnega inženiringa je zato lahko učinkovita rešitev, ki bo izboljšala ekonomičnost bioprocesov. Vendar je gojenje mešanih kultur je pogosto oteženo, saj imajo različne celice različne optimalne pogoje rasti, kar lahko vodi v preraščanje ene vrste celic preko drugih. Trenutno se raziskovalci teh problemov lotevajo z različnimi metodami kontrole rasti, ki temeljijo na avksotrofiji in sistemih toksin-antitoksin. Vendar te metode niso robustne in ne omogočajo natančnega nadzora razmerja med različnimi populacijami v mešani kulturi ter hkrati niso prenosljive med različnimi organizmi.

Ekipa iz Imperial College-a v Londonu so v ta namen razvili genetsko vezje G.E.A.R. (Genetically Engineered Artificial Ratio), ki bi omogočala stabilno ohranjanje razmerja rasti različnih celic v kulturi. Hkrati so izdelali tudi podatkovno bazo A.L.I.C.E. (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki omogoča podporo pri načrtovanju in optimizaciji procesov z mešanimi kulturami.

==G.E.A.R==
Genetsko vezje G.E.A.R. je sestavljeno iz treh modulov:
*komunikacijskega, sestavljenega iz dveh ortogonalnih sistemov, ki temeljita na zaznavanju celične gostote,
*primerjalnega, ki povezuje signale iz sistema za zaznavanje celične gostote z RNA logičnim omrežjem in omogoča celicam primerjavo lastne populacije s populacijami drugih celic in
*modula za uravnavanje rasti, ki se v primeru ustreznega signala iz primerjalnega sistema odzove z zaustavitvijo rasti v celicah določene populacije.

===Komunikacijski modul===

Prvi modul omogoča komunikacijo med celicami znotraj populacije in med populacijami in temelji na naravno prisotnem mehanizmu zaznavanja celične gostote (angl. quorum sensing), pri katerem celice proizvajajo signalne molekule, kor so na primer N-acil homoserin laktoni (AHL). Ti se vežejo na ustrezne transkripcijske faktorje, ki spremenijo vzorec izražanja genov. Ker so pri eksperimentih uporabili mešanico dveh kultur E. coli, so potrebovali sistem za dvosmerno komunikacijo z dvema edinstvenima in ortogonalnima sistemoma AHL z ustreznim odzivnim proteinom, tako da je vsaka populacija lahko zaznavala lastno gostoto in gostoto druge populacije.

Analizirali so 4 sisteme:
*Cin s transkripcijskim aktivatorjem CinR in signalno molekulo 3O-C14 AHL,
*Las s transkripcijskim aktivatorjem LasR in signalno molekulo 3O-C12 AHL,
*Lux s transkripcijskim aktivatorjem LuxR in signalno molekulo 3O-C6 AHL in
*RhI s transkripcijskim aktivatorjem RhIR in signalno molekulo C4 AHL.

Signalno molekulo v vsakem sistemu sintetizira različen induktorski protein.
Za vsak sistem so izdelali dva sestavljena dela. Prvi del je predstavljal AHL odzivni sistem s transkripcijskim aktivatorjem (CinR, LasR, LuxR ali RhIR) pod kontrolo konstitutivnega promotorja, ki mu je sledil odgovarjajoči promotor za odziv na celično gostoto. Pri tem sistemu se v prisotnosti ustreznega AHL ta veže na konstitutivno izražen aktivator, ki aktivira transkripcijo gena navzdol od promotorja, odzivnega na aktivator. Drugi sestavljeni del je reporterski in se od odzivnega razlikuje po tem, da je za promotorjem odzivnim na celično gostoto zapis za GFP. Ta del so uporabili za karakterizacijo odziva posameznega sistema na različne koncentracije AHL in tudi za analizo navzkrižne reaktivnosti.
Pri analizah koncentracijskega območja vsakega sistema so ugotovili, da se sistemi razlikujejo glede na območja, v katerih je sistem aktiven in glede na pridobljene podatke lahko ustrezno spremenili moč uporabljenega promotorja, bodisi konstitutivnega promotorja navzgor od gena za transkripcijski aktivator ali navzgor od gena za protein, ki sintetizira signalni AHL. Pri analizah navzkrižne reaktivnosti, kjer so spremljali jakost fluorescence enega sistema pri indukciji z AHL iz drugih sistemov, so ugotovili, da sta sistema RhI in Las najbolj ortogonalna in zato najuporabnejša za končno vezje G.E.A.R. Hkrati so iz literature imeli podatek, da sta tudi sistema Cin in RhI ortogonalna.

===Primerjalni modul===
Primerjalni modul primerja količino AHL oz. transkripcijskega aktivatorja odzivnega na AHL iz dveh sistemov in ustvari signal, ki deluje na končni, rastni modul.
Temelji na RNA-tehnologiji STAR (Small Transcriptional-Activating RNA) , pri kateri male molekule RNA uravnavajo transkripcijo genov tako, da se vežejo na promotorske regije s komplementarnimi zaporedji. Ta zaporedja tvorijo lasnično zanko, ki preprečuje vezavo RNA-polimeraze in s tem transkripcijo. Vezava STAR strukturo spremeni tako, da se RNA-polimeraza lahko veže in zato transkripcija lahko poteče.
V svojem vezju so uporabili dva sistema. Prvi sistem je vključeval zapis za STAR pod kontrolo promotorja, ki se odziva na transkripcijski aktivator, odziven na AHL lastne populacije. Za drugi sistem so načrtali zaporedje, katerega produkt je anti-STAR, molekula RNA komplementarna STAR. Ko je anti-STAR prisoten veže STAR in prepreči aktivacijo transkripcije. Zapis za anti-STAR so vstavili za zaporedje promotorja odzivnega na AHL, ki ga proizvaja populacija drugih celic. Razmerje med med STAR in anti-STAR je zato enako razmerju med dvema AHL v mešani kulturi. V primeru, da je gostota celic enaka, sta enaki tudi količini STAR in anti-STAR, in obe populaciji rasteta normalno. Če pa pride do neenakovredne hitrosti rasti populacije, se poveča količina STAR v celicah te populacije, ki se veže na lasnično zanko v modulu za uravnavanje rasti in sproži zaustavitev rasti.
Sestavili so tudi sistem za karakterizacijo, ki je vključeval plazmid z zapisom za STAR pod kontrolo konstitutivnega promotorja in plazmid za zapisom za SFGFP (superfolder GFP) navzdol od tarčnega zaporedja za STAR. Ugotovili so, da se izražanje reporterskega proteina poveča za 17-krat že v prvih 100 minutah gojenja, kar pomeni, da je sistem sposoben hitrega odzivanja. Ugotovili so tudi, da je učinkovitost aktivacije izražanja približno 5-krat večja pri 37°C kot pri 30°C, kar je pomembno za prilagajanje sistema za uporabo pri različnih pogojih rasti.

===Modul za uravnavanje rasti===
Modul za uravnavanje rasti se odziva na signal iz sistema STAR, pri čemer se v primeru, da je rast ene populacije hitrejša, sproži prepisovanje gena, katerega produkt povzroči hitro zaustavitev rasti, brez da bi celica umrla.
Analizirali so 4 možne gene, katerih produkti zaustavijo celično rast:
*cat, ki zapisuje za kloramfenikol acetiltransferazo in
*leuB, ki zapisuje za encim v biosintezni poti levcina.
Pri obeh zgornjih proteinih je njuno izražanje potrebno za normalno rast, zato bi vezava STAR morala sprožiti transkripcijo proteina, ki bi deloval kot inhibitor izražanja Cat ali LeuB (inverter).
*Gp2, ki je gen iz bakteriofaga T7 in inhibira celično rast tako, da se veže na kompleks RNA-polimeraze v E. coli in s tem inhibira transkripcijo in
*Gp0.4, ki je prav tako gen iz bakteriofaga T7 in se veže na obroč FtsZ med mitozo, s čimer prepreči citokinezo.
Po prvih analizah so se osredotičili na Gp2, ki za razliko od cat in leuB ne potrebuje uvajanja dodatnega inverterja v sistem in je od obeh genov tudi precej krajši, kar omogoča hitrejše izražanje in hitrejši odziv. Za razliko od leuB tudi nismo omejeni na avksotrofne seve oz. nam ni potrebno pripraviti mutant z izbitimi geni. Gen cat tudi ni idealen zaradi uporabe antibiotika in nevarnosti razvoja bakterijske odposrnosti. Pri obeh je potrebno uporabiti tudi posebno gojišče. Gp0.4 zaradi težav z ligacijo niso uporabili, vendar ga načrtujejo v prihodnosti tudi okarakterizirati.

==A.L.I.C.E==
Sistem G.E.A.R odgovarja na problem uravnavanja rasti različnih populacij v mešanih kulturah, vendar moramo za uspešno gojenje še vedno določiti optimalne pogoje rasti mešane kulture. Zato so ustvarili bazo podatkov A.L.I.C.E (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki vključuje eksperimentalne podatke o optimalni pogojih rasti za monokulture in tudi za mešane kulture, protokole in druge podatke.

==Literatura==
*[http://2016.igem.org/Team:Imperial_College Wiki stran ekipe]

*Santala, S., Karp, M. in Santala V. (2014) Rationally Engineered Synthetic Coculture for Improved Biomass and Product Formation. PLOS ONE 9(12): e113786. doi: 10.1371/journal.pone.0113786.

[[Seminarji SB 12016/17]]

Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur

2016-11-27T14:30:47Z

Mojca Juteršek: New page: Imperial College London, Ecolibrium – developing a framework for engineering co-cultures [http://2016.igem.org/Team:Imperial_College] ==Uvod== Za bazično raziskovanje in tudi pri teh...

Imperial College London, Ecolibrium – developing a framework for engineering co-cultures [http://2016.igem.org/Team:Imperial_College]

==Uvod==

Za bazično raziskovanje in tudi pri tehnoloških bioprocesih večinoma uporabljamo čiste kulture mikroorganizmov, čeprav se ti v naravi povezujejo v združbe, v katerih interagirajo in sodelujejo, na primer s proizvajanjem metabolitov, ki jih drugi organizmi uporabijo kot substrat. Takšne dinamične in simbiotske interakcije omogočajo učinkovit pretok ogljika in energije, hkrati pa izboljšujejo odziv združbe na hitre in neugodne okoljske spremembe. Sicer so monokulture trenutno enostavnejše za uporabo, saj sta za enkrat nadzor procesa in priprava kulture z genetskih inženiringom lažja, vendar so lahko prisotni problemi kot je nabiranje stranskih produktov in neučinkovit pretok energije in ogljika. Uporaba sinteznih mešanih kultur oz. večceličnega inženiringa je zato lahko učinkovita rešitev, ki bo izboljšala ekonomičnost bioprocesov. Vendar je gojenje mešanih kultur je pogosto oteženo, saj imajo različne celice različne optimalne pogoje rasti, kar lahko vodi v preraščanje ene vrste celic preko drugih. Trenutno se raziskovalci teh problemov lotevajo z različnimi metodami kontrole rasti, ki temeljijo na avksotrofiji in sistemih toksin-antitoksin. Vendar te metode niso robustne in ne omogočajo natančnega nadzora razmerja med različnimi populacijami v mešani kulturi ter hkrati niso prenosljive med različnimi organizmi.

Ekipa iz Imperial College-a v Londonu so v ta namen razvili genetsko vezje G.E.A.R. (Genetically Engineered Artificial Ratio), ki bi omogočala stabilno ohranjanje razmerja rasti različnih celic v kulturi. Hkrati so izdelali tudi podatkovno bazo A.L.I.C.E. (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki omogoča podporo pri načrtovanju in optimizaciji procesov z mešanimi kulturami.

==G.E.A.R==
Genetsko vezje G.E.A.R. je sestavljeno iz treh modulov:
*komunikacijskega, sestavljenega iz dveh ortogonalnih sistemov, ki temeljita na zaznavanju celične gostote,
*primerjalnega, ki povezuje signale iz sistema za zaznavanje celične gostote z RNA logičnim omrežjem in omogoča celicam primerjavo lastne populacije s populacijami drugih celic in
*modula za uravnavanje rasti, ki se v primeru ustreznega signala iz primerjalnega sistema odzove z zaustavitvijo rasti v celicah določene populacije.

===Komunikacijski modul===

Prvi modul omogoča komunikacijo med celicami znotraj populacije in med populacijami in temelji na naravno prisotnem mehanizmu zaznavanja celične gostote (angl. quorum sensing), pri katerem celice proizvajajo signalne molekule, kor so na primer N-acil homoserin laktoni (AHL). Ti se vežejo na ustrezne transkripcijske faktorje, ki spremenijo vzorec izražanja genov. Ker so pri eksperimentih uporabili mešanico dveh kultur E. coli, so potrebovali sistem za dvosmerno komunikacijo z dvema edinstvenima in ortogonalnima sistemoma AHL z ustreznim odzivnim proteinom, tako da je vsaka populacija lahko zaznavala lastno gostoto in gostoto druge populacije.

Analizirali so 4 sisteme:
*Cin s transkripcijskim aktivatorjem CinR in signalno molekulo 3O-C14 AHL,
*Las s transkripcijskim aktivatorjem LasR in signalno molekulo 3O-C12 AHL,
*Lux s transkripcijskim aktivatorjem LuxR in signalno molekulo 3O-C6 AHL in
*RhI s transkripcijskim aktivatorjem RhIR in signalno molekulo C4 AHL.

Signalno molekulo v vsakem sistemu sintetizira različen induktorski protein.
Za vsak sistem so izdelali dva sestavljena dela. Prvi del je predstavljal AHL odzivni sistem s transkripcijskim aktivatorjem (CinR, LasR, LuxR ali RhIR) pod kontrolo konstitutivnega promotorja, ki mu je sledil odgovarjajoči promotor za odziv na celično gostoto. Pri tem sistemu se v prisotnosti ustreznega AHL ta veže na konstitutivno izražen aktivator, ki aktivira transkripcijo gena navzdol od promotorja, odzivnega na aktivator. Drugi sestavljeni del je reporterski in se od odzivnega razlikuje po tem, da je za promotorjem odzivnim na celično gostoto zapis za GFP. Ta del so uporabili za karakterizacijo odziva posameznega sistema na različne koncentracije AHL in tudi za analizo navzkrižne reaktivnosti.
Pri analizah koncentracijskega območja vsakega sistema so ugotovili, da se sistemi razlikujejo glede na območja, v katerih je sistem aktiven in glede na pridobljene podatke lahko ustrezno spremenili moč uporabljenega promotorja, bodisi konstitutivnega promotorja navzgor od gena za transkripcijski aktivator ali navzgor od gena za protein, ki sintetizira signalni AHL. Pri analizah navzkrižne reaktivnosti, kjer so spremljali jakost fluorescence enega sistema pri indukciji z AHL iz drugih sistemov, so ugotovili, da sta sistema RhI in Las najbolj ortogonalna in zato najuporabnejša za končno vezje G.E.A.R. Hkrati so iz literature imeli podatek, da sta tudi sistema Cin in RhI ortogonalna.

===Primerjalni modul===
Primerjalni modul primerja količino AHL oz. transkripcijskega aktivatorja odzivnega na AHL iz dveh sistemov in ustvari signal, ki deluje na končni, rastni modul.
Temelji na RNA-tehnologiji STAR (Small Transcriptional-Activating RNA) , pri kateri male molekule RNA uravnavajo transkripcijo genov tako, da se vežejo na promotorske regije s komplementarnimi zaporedji. Ta zaporedja tvorijo lasnično zanko, ki preprečuje vezavo RNA-polimeraze in s tem transkripcijo. Vezava STAR strukturo spremeni tako, da se RNA-polimeraza lahko veže in zato transkripcija lahko poteče.
V svojem vezju so uporabili dva sistema. Prvi sistem je vključeval zapis za STAR pod kontrolo promotorja, ki se odziva na transkripcijski aktivator, odziven na AHL lastne populacije. Za drugi sistem so načrtali zaporedje, katerega produkt je anti-STAR, molekula RNA komplementarna STAR. Ko je anti-STAR prisoten veže STAR in prepreči aktivacijo transkripcije. Zapis za anti-STAR so vstavili za zaporedje promotorja odzivnega na AHL, ki ga proizvaja populacija drugih celic. Razmerje med med STAR in anti-STAR je zato enako razmerju med dvema AHL v mešani kulturi. V primeru, da je gostota celic enaka, sta enaki tudi količini STAR in anti-STAR, in obe populaciji rasteta normalno. Če pa pride do neenakovredne hitrosti rasti populacije, se poveča količina STAR v celicah te populacije, ki se veže na lasnično zanko v modulu za uravnavanje rasti in sproži zaustavitev rasti.
Sestavili so tudi sistem za karakterizacijo, ki je vključeval plazmid z zapisom za STAR pod kontrolo konstitutivnega promotorja in plazmid za zapisom za SFGFP (superfolder GFP) navzdol od tarčnega zaporedja za STAR. Ugotovili so, da se izražanje reporterskega proteina poveča za 17-krat že v prvih 100 minutah gojenja, kar pomeni, da je sistem sposoben hitrega odzivanja. Ugotovili so tudi, da je učinkovitost aktivacije izražanja približno 5-krat večja pri 37°C kot pri 30°C, kar je pomembno za prilagajanje sistema za uporabo pri različnih pogojih rasti.

===Modul za uravnavanje rasti===
Modul za uravnavanje rasti se odziva na signal iz sistema STAR, pri čemer se v primeru, da je rast ene populacije hitrejša, sproži prepisovanje gena, katerega produkt povzroči hitro zaustavitev rasti, brez da bi celica umrla.
Analizirali so 4 možne gene, katerih produkti zaustavijo celično rast:
*cat, ki zapisuje za kloramfenikol acetiltransferazo in
*leuB, ki zapisuje za encim v biosintezni poti levcina.
Pri obeh zgornjih proteinih je njuno izražanje potrebno za normalno rast, zato bi vezava STAR morala sprožiti transkripcijo proteina, ki bi deloval kot inhibitor izražanja Cat ali LeuB (inverter).
*Gp2, ki je gen iz bakteriofaga T7 in inhibira celično rast tako, da se veže na kompleks RNA-polimeraze v E. coli in s tem inhibira transkripcijo in
*Gp0.4, ki je prav tako gen iz bakteriofaga T7 in se veže na obroč FtsZ med mitozo, s čimer prepreči citokinezo.
Po prvih analizah so se osredotičili na Gp2, ki za razliko od cat in leuB ne potrebuje uvajanja dodatnega inverterja v sistem in je od obeh genov tudi precej krajši, kar omogoča hitrejše izražanje in hitrejši odziv. Za razliko od leuB tudi nismo omejeni na avksotrofne seve oz. nam ni potrebno pripraviti mutant z izbitimi geni. Gen cat tudi ni idealen zaradi uporabe antibiotika in nevarnosti razvoja bakterijske odposrnosti. Pri obeh je potrebno uporabiti tudi posebno gojišče. Gp0.4 zaradi težav z ligacijo niso uporabili, vendar ga načrtujejo v prihodnosti tudi okarakterizirati.

==A.L.I.C.E==
Sistem G.E.A.R odgovarja na problem uravnavanja rasti različnih populacij v mešanih kulturah, vendar moramo za uspešno gojenje še vedno določiti optimalne pogoje rasti mešane kulture. Zato so ustvarili bazo podatkov A.L.I.C.E (Advanced Logging Interface for Culture Experiments), ki vključuje eksperimentalne podatke o optimalni pogojih rasti za monokulture in tudi za mešane kulture, protokole in druge podatke.

==Literatura==
*[http://2016.igem.org/Team:Imperial_College Wiki stran ekipe]

*Santala, S., Karp, M. in Santala V. (2014) Rationally Engineered Synthetic Coculture for Improved Biomass and Product Formation. PLOS ONE 9(12): e113786. doi: 10.1371/journal.pone.0113786.

Seminarji SB 2016/17

2016-11-27T14:08:44Z

Mojca Juteršek:

V študijskem letu 2016/17 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI 
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.)
# [[Učinkovito ciljanje izraženih in utišanih genov v človeških zarodnih in induciranih pluripotentnih celicah z nukleazami z motivi cinkovih prstov]]. Angelika Vižintin (22. 11. 2016)
# [[Izdelava sintetičnega genoma s pristopom sestavljanja celotnega genoma: Bakteriofag φX174 iz sintetičnih oligonukleotidov]]. Darja Božič (22.11.2016)
# [[Modeliranje sintetične večcelične ure: Represilatorji, sklopljeni z zaznavanjem celične gostote]]. Vita Vidmar (22. 11. 2016)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI 
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
#[[Mezenhimske matične celice nove generacije]]. Danijela Jošić (22.11.2016)
#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bakterije%2C_ki_kelirajo_bakrove_ione%2C_v_boju_proti_Wilsonovi_bolezni Bakterije, ki kelirajo bakrove ione, v boju proti Wilsonovi bolezni. Simon Bolta (22. 11. 2016)]
#[["Training protein" - PETaze]]. Urša Kapš (29.11.2016)
#[[Plasticure: rešitev za učinkovitejšo razgradnjo plastike]]. Marjeta Horvat (29. 11. 2016)
#[[Quantifly]]. Ema Guštin (29. 11. 2016)
#[[Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur]]. Mojca Juteršek (29. 11. 2016)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 12 minut (10-14). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Nukleosomi med replikacijo

2014-04-20T20:18:39Z

Mojca Juteršek: /* Viri */

==Uvod==
Kromatin je kompleks DNA in proteinov. Osnovne strukturne enote kromosoma so nukleosomi. Ti so sestavljeni iz histonskega oktamernega kompleksa, okoli katerega naredi DNA 1,6 obrata, dolgega približno 147 baznih parov.(Li, Burgess, & Zhang, 2012) Osnovna naloga histonov v nukleosomih je zgoščevanje DNA verige v kompaktno strukturo ter omogočanje organizacije DNA v evkromatin in heterokromatin. To je v večini primerov doseženo z metilacijo in acetilacijo histonov, predvsem na lizinskih ostankih. (Whitehouse & Smith, 2013)

Vendar kromatin in z njim nukleosomi niso le stacionarna struktura. Pred vsako celično delitvijo mora celica skozi proces replikacije celotnega genoma, pri čemer nukleosomi predstavljajo oviro za replikacijske vilice. Hkrati imajo histoni pomembno strukturno in funkcionalno vlogo, zato za uspešno replikacijo dednega materiala ni pomembna le natančna podvojitev nukleotidnega zaporedja materinske verige, temveč tudi, da se na obe hčerinski verigi prenesejo informacije, ki jih nosijo histoni.

Raziskovanje dinamike nukleosomov med replikacijo je pokazalo, da se starševski nukleosomi po predhodni disociaciji prerazporedijo po hčerinskih verigah, preostalo pa zapolnijo histoni sintetizirani de novo. Pri tem imajo pomembno vlogo dve skupini proteinov. Prvi so histonski šaperoni, ki omogočajo urejeno izgrajevanje nukleosomov, saj ob vezavi na histone nevtralizirajo njihov naboj in preprečijo nespecifične interakcije z DNA (Mello & Almouzni, 2001). V drugo skupino pa sodijo kromatin preoblikovalni kompleksi, ki s pomočjo hidrolize ATP pretrgajo vezi med histoni in DNA med razgradnjo kromatina ter jih ponovno tvorijo med izgradnjo. (Ransom, Dennehey, & Tyler, 2010)

==Razpad nukleosomov==

Proteini replisoma so v tesni interakciji z verigo DNA, zato se zdi smiselno, da morajo histoni pred replikacijskimi vilicami popolnoma oddisociirati iz DNA. Raziskave so pokazale, da je 300 bp pred replikacijskami vilicami golih, torej brez vezanih histonov.(Ransom et al., 2010)

Disociacija histonov z DNA poteka v dveh delih. V prvem z nukleosoma disociirata kompleksa H2A-H2B, kar v nasledjem koraku omogoči disociacijo bolj stabilnega (H3-H4)2 tetramera. Predlagana sta dva mehanizma disociacije dimerov H2A-H2B iz nukleosoma. Po prvem na bi se na nukleosom vezal histonski šaperon FACT (facilitates chromatin transcription), ki naj bi omogočil disociacijo dimera. FACT se povezuje tudi s proteini replisoma, predvsem s helikazo MCM in DNA polimerazo 1. Po drugi poti naj bi v disociaciji sodeloval histonski šaperon Nap1, ki naj bi se vezal zgolj na dimera in jih v povezavi z ATP-aznim faktorjem RSC (chromatin structure remodeling complex) ločil iz nukleosoma. (Ransom et al., 2010)Po odcepu dimerov H2A-H2B se iz DNA odcepi še tetramer (H3-H4)2. V tem procesu naj bi sodeloval šaperon Asf1 (anti-silencing factor-1), ki bi tetramere v celoti odcepil.

Bolje raziskana tema je dogajanje, povezano s histoni po njihovi disociaciji iz starševske verige. Ob opazovanju le starih histonov se je izkazalo, da se že obstoječi histoni in s tem modifikacije, ki jih nosijo, razporedijo naključno med obe hčerinski verigi. Po disociaciji dimerov H2A-H2B so (H3-H4)2 tetrameri še vedno stabilni in se prenašajo na novonastali vijačnici brez da bi razpadli.(Annunziato, 2005) Tako naj bi se med replikacijo na novo nastajajoči verigi najprej vezali tetrameri [H3-H4]2, šele kasneje pa dimeri H2A-H2B.(Ransom et al., 2010)

Tak mehanizem bi omogočil tudi prenos epigenetske informacije. Obstoječe modifikacije na starševskih histonih vežejo preoblikovalne komplekse, ki modificirajo bližnje de novo sintetizirane kromosome. (Whitehouse & Smith, 2013)

==Sestavljanje novih histonov==

Takoj po sintezi se histoni postranslacijsko modificirajo. Med temi modifikacijami so večinoma acetilacije, metilacije so redke. Modifikacije bi lahko pomagale bodisi pri interakcijah s histonskimi šaperoni, bodisi pri prenosu histonov v jedro.(Li, Burgess, & Zhang, 2012)

Najbolj konservativna oznaka je diacetilacija histona H4 na lizinih na mestih 5 in 12. Ta modifikacija se zgodi preden histon interagira s histonskim šaperonom Asf1 v citoplazmi in je katalizirana s Hat1 acetiltransferaznim kompleksom. Funkcija diacetilacije histona H4 še ni popolnoma znana. Obstaja možnost, da regulira funkcijo CAF-1 (chromatin assembly factor-1) pri sestavljanju nukleosomov in omogoča lažji prenos H3-H4 kompleksa v jedro. (Li et al., 2012)

Acetilacije histonov H3 se med vrstami sicer ohranjajo, vendar so mesta teh modifikacij drugačna. Nekateri organizmi, kot so S. cerevisae in kvasovke, imajo acetiliran lizin na mestu 56. To modifikacijo katalizira Rtt109-Vps75 kompleks, ki za substrat uporabi Asf1-H3-H4. Za acetilacijo je potreben samo Rtt109, Vps75 pa slednjega stabilizira in je pomemben za njegov prenos v jedro. Modifikacija lizina na mestu 56 igra pomembno vlogo pri sestavljanju nukleosomov, saj se histoni s to modifikacijo v zgodnji S fazi celičnega cikla, ko je njihova koncentracija najvišja, vežejo le na replicirajočo DNA. Druga funkcija te modifikacije je tudi povečanje afinitete H3-H4 kompleksa do CAF-1 in Rtt106. Histon H3 se lahko modificira tudi na N-terminalnem koncu, kar pa vpliva samo na interakcijo med CAF-1 in H3-H4 kompleksom. Mesto slednje modifikacije se med organizmi razlikuje.(Li et al., 2012)

Prvi šaperon, ki se veže na H3-H4 kompleks je Asf1 , ki je vpleten v acetilacijo histonov ter njihov prenos v jedro. Asf1 je pomemben tudi pri razstavljanju histonov na materinski verigi. Pri sesalcih sta prisotna dva homologa (Asf1a in Asf1b), ki se vežeta tudi na helikazo, zato sta zelo pomembna pri napredovanju replikacijskih vilic. (Li et al., 2012)

Pomemben šaperon pri izgradnji nukleosoma je CAF-1, ki se veže na novonastali histonski kompleks H3-H4. Ali ima kakšno funkcijo pri prenašanju histonov iz materinske verige na hčerinski še ni znano.(Li et al., 2012) Sestavljen je iz treh domen (p150, p60 in p50). Histoni se vežejo na p150 podenoto.(Krude, 1995) CAF-1 interagira s PCNA (proliferating cell nuclear antigen). To je homotrimerni obroč okoli hčerinskih verig DNA, na katerega se lahko veže p150 podenota CAF-1.(Mello & Almouzni, 2001) Ta interakcija je med vrstami zelo konservativna. Podobno funkcijo kot CAF-1 ima tudi Rtt106, vendar delovanje slednjega v primerjavi s CAF-1 še ni dobro znano. Možno je, da odlaga histone samo na eni od sestrskih verig, lahko pa samo na določenih zaporedjih. Prav tako ni še znano, kako Rtt106 interagira z replikacijskimi vilicami.(Li et al., 2012)

==Izgradnja nukleosomov==

Postopek izgradnje nukleosomov pri replikaciji DNA je podoben njihovemu razpadu. V prvi stopnji se na vijačnico DNA veže tetramer (H3-H4)2 , temu pa nato sledi še dogradnja z dimeri H2A-H2B.(Annunziato, 2005)

Ker se (H3-H4)2 tetrameri pridobijo iz dveh različnih izvorov - starševske dsDNA in de novo histoni, poteka vezava tetramerov prek dveh različnih poti.(Akey & Luger, 2003) Tetramer s starševske DNA se veže na protein Asf1, čeprav nekateri poskusi nakazujejo, da naj bi se v vmesnem nevezanem času tetramer razdelil na dva z Asf1 vezana dimera, ki naj bi se vezala na DNA s pomočjo MCM-Asf1- (H3-H4)2 kompleksa kot tetramer. Temu naj bi sledila vezava dimerov H2A-H2B s pomočjo šaperonov FACT ali pa Nap1.(Annunziato, 2005)

Vezava novonastalih histonov naj bi potekala s pomočjo CAF-1. Na tem šaperonu naj bi se najprej tvoril tetramer, ki se nato veže na DNA. Dogradnja nukleosomov poteče na enak način kot pri prej opisanih starševskih histonih.(Annunziato, 2005)

==Viri==

Akey, C. W., & Luger, K. (2003). Histone chaperones and nucleosome assembly. Current Opinion in Structural Biology, 13(1), 6–14. doi:10.1016/S0959-440X(03)00002-2

Annunziato, A. T. (2005). Split decision: what happens to nucleosomes during DNA replication? The Journal of Biological Chemistry, 280(13), 12065–8. doi:10.1074/jbc.R400039200

Krude, T. (1995). Chromatin: Nucleosome assembly during DNA replication. Current Biology, 5(11), 1232–1234. doi:10.1016/S0960-9822(95)00245-4

Li, Q., Burgess, R., & Zhang, Z. (2012). All roads lead to chromatin: Multiple pathways for histone deposition. Biochimica et Biophysica Acta, 1819(3-4), 238–46. doi:10.1016/j.bbagrm.2011.06.013

Mello, J. A., & Almouzni, G. (2001). The ins and outs of nucleosome assembly. Current Opinion in Genetics & Development, 11(2), 136–141. doi:10.1016/S0959-437X(00)00170-2

Ransom, M., Dennehey, B. K., & Tyler, J. K. (2010). Chaperoning histones during DNA replication and repair. Cell, 140(2), 183–95. doi:10.1016/j.cell.2010.01.004

Whitehouse, I., & Smith, D. J. (2013). Chromatin dynamics at the replication fork: there’s more to life than histones. Current Opinion in Genetics & Development, 23(2), 140–6. doi:10.1016/j.gde.2012.12.007

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Talk:Nukleosomi med replikacijo

2014-04-20T20:16:46Z

Mojca Juteršek: New page: Pri pisanju celotnega povzetka smo sodelovali vsi enakovredno.

Pri pisanju celotnega povzetka smo sodelovali vsi enakovredno.