Wiki FKKT - User contributions [en]

2017-bionano-seminar

2017-04-17T16:59:08Z

Mojca Kostanjevec: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Tema seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent/ka 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent/ka 2'''
|-
| Peter Prezelj||22.03.17||Spreminjanje vsebnosti in karakteristik hranilnih snovi v živilih in pripravljeni hrani z uporabo kovalentnih modifikacij, prečnega povezovanja in encimov||Vita Vidmar||Zala Gluhić
|-
| Boštjan Petrič||22.03.17||Reverzibilno tiskanje s peptidnimi /proteinskimi pigmenti, kovalentno vezanimi na celulozo prek amidne vezi||Luka Kavčič||Judita Avbelj
|-
| Ema Guštin||22.03.17||Nanoprevleka hrustanca za preprečitev osteoartritisa||Mojca Juteršek||Vid Jazbec
|-
| Tjaša Lapanja||29.03.17||Modificirana CHO celična linija prilagojena za ultrazvočno indukcijo izražanja proteinov v industrijskih bioreaktorjih||Bojana Lazović||Vita Vidmar
|-
| Maruša Prolič Kalinšek||29.03.17||Senzor za detekcijo Legionella bakterij na osnovi polidiacetilena||Eva Korošec||Luka Kavčič
|-
| Domen Klofutar||29.03.17||Novi načini prenosa informacij z izrabo kapacitet DNA: Prenos šifrirne in/ali steganografske DNA v ustni votlini preko naravno prisotnih gostiteljev Lactobacillus Casei in Veillonella Parvula||Tajda Buh||Mojca Juteršek
|-
| Simon Bolta||05.04.17||Z vezavo zunajceličnega kalcija do zmanjšanja bolečine v mišicah po treningu||Peter Prezelj||Bojana Lazović
|-
| Tomaž Rozmarič||05.04.17||Korekcija vida s pomočjo nano robotov||Boštjan Petrič||Eva Korošec
|-
| Urša Kapš||05.04.17||Nanodelci za strjevanje krvi||Ema Guštin||Tajda Buh
|-
| Julija Mazej||12.04.17||kapsule za vzpostavitev ravnovesja crevesne mikrobiote||Tjaša Lapanja||Peter Prezelj
|-
| Nataša Žigante||12.04.17||opis teme ali naslov||Maruša Prolič Kalinšek||Boštjan Petrič
|-
| Anja Herceg||12.04.17||Boj proti koroziji s pomočjo superhidrofobnega sol-gela z enkapsuliranimi zaščitnimi bakterijami||Domen Klofutar||Ema Guštin
|-
| Mirjam Kmetič||19.04.17||Nanoprotistrup na osnovi nanodelcev, ki vsebujejo inhibitor varespladib||Simon Bolta||Tjaša Lapanja
|-
| Mojca Kostanjevec||19.04.17||Nanodiski - dostavni sistem za tarčno ciljanje EpCAM na površini rakavih epitelijskih celic||Tomaž Rozmarič||Maruša Prolič Kalinšek
|-
| Jan Rozman||19.04.17||Sinteza nealergenega rekombinantnega kazeina za jedilno / biorazgradljivo embalažo||Urša Kapš||Domen Klofutar
|-
| Barbara Dušak||03.05.17||Izboljšava gojenja mesa n vitro||Julija Mazej||Simon Bolta
|-
| Mateja Cigoj||03.05.17||Probiotik z dodatkom nanodelcev za zdravljenje celiakije. Uporaba probiotičnih bakterij, ki izločajo peptidaze za razgradnjo glutena do neimunogenih fragmentov, in nanodelcev, ki vsebujejo modificirane naravne glutenske peptide specifične za HLA-DQ2 receptorje na limfocitih T, ki zavrejo Th1 posredovan avtoimunski odziv na gluten.||Nataša Žigante||Tomaž Rozmarič
|-
| Toni Nagode||03.05.17||Reverzibilno pritrjevanje predmetov (sistem avidin-biotin)||Anja Herceg||Urša Kapš
|-
| Tim Božič||10.05.17||Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)||Mirjam Kmetič||Julija Mazej
|-
| Darja Božič||10.05.17||opis teme ali naslov||Mojca Kostanjevec||Nataša Žigante
|-
| Petra Tavčar||10.05.17||Odstranjevalec škodljivih E-jev in BPA iz kupljenih pijač na osnovi kovalentno pritrjenih protiteles in aptamerov||Jan Rozman||Anja Herceg
|-
| Marjeta Horvat||17.05.17||FeO nanodelci za učinkovitejše odpravljanje zobnega kariesa||Barbara Dušak||Mirjam Kmetič
|-
| Danijela Jošić||17.05.17||Gensko spremenjen Lactobacillus, ki izloča nanodelce z spermicidnim in protimikrobnim delovanjem za dolgotrajno zaščito pred zanositvijo in spolno prenosljivimi boleznimi.||Mateja Cigoj||Mojca Kostanjevec
|-
| Tina Kuhar||17.05.17||Flaška za vodo z bionanosenzorjem za takojšnjo zaznavo kvalitete oziroma pitnosti nalite vode.||Toni Nagode||Jan Rozman
|-
| Nika Strašek||24.05.17||Uporabniku dostopen diagnostični test za zaznavo okužbe s boreliozo in klopnim meningitisom||Tim Božič||Barbara Dušak
|-
| Eva Vidak||24.05.17||Biosenzor za CO na osnovi transkripcijskega faktorja CooA iz bakterije Rhodospirillum rubrum||Darja Božič||Mateja Cigoj
|-
| Alja Zgonc||24.05.17||Senzor za zaznavanje miRNA v urinu za diagnozo nevrodegenerativnih bolezni||Petra Tavčar||Toni Nagode
|-
| Zala Gluhić||31.05.17||Varnejše uživanje alkohola z uporabo odorant-binding proteina LUSH.||Marjeta Horvat||Tim Božič
|-
| Judita Avbelj||31.05.17||Nanonaprava iz bioloških delov, ki z absorbcijo in razgradnjo delcev iz zraka preprečuje različne alergijske reakcije.||Danijela Jošić||Darja Božič
|-
| Vid Jazbec||31.05.17||Gensko spremenjene čebele odporne na insekticide.||Tina Kuhar||Petra Tavčar
|-
| Vita Vidmar||31.05.17||'Hot start' transglutaminaza za popravljanje razcepljenih lasnih konic||Nika Strašek||Marjeta Horvat
|-
| Luka Kavčič||31.05.17||Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)||Eva Vidak||Danijela Jošić
|-
| Mojca Juteršek||31.05.17||Senzor za zaznavo natančne glikozilacije proteinov (npr. eritropoetina)||Alja Zgonc||Tina Kuhar
|-
| Bojana Lazović||07.06.17||Poenostavljen pristop k razvoju novih senzorjev FRET (Förster resonance energy transfer)||Zala Gluhić||Nika Strašek
|-
| Eva Korošec||07.06.17||Tattoo biosenzor za raven alkohola v krvi na osnovi alkohol oksidaze, povezan s pametnim telefonom, računalnikom ali avtomobilskimi ključi.||Judita Avbelj||Eva Vidak
|-
| Tajda Buh||07.06.17||opis teme ali naslov||Vid Jazbec||Alja Zgonc
|}

==Naloga==
'''Vaša naloga je: '''
Študent pripravi projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt.
Predlagana struktura:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Prva stran seminarja naj vsebuje naslov projekta, avtorje, povzetek (od 130 do 160 besed) in grafični povzetek (čez približno pol strani)
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo od 2000 do 2500 besed (vključno z literaturo). Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte '''dva dneva pred datumom predstavitve''', ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Vsak recenzent predlaga izboljšavo projekta.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik dva dneva pred predstavitvijo do polnoči.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem receptu:
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.doc(x) za seminar, npr. 19_nano_Craik_Venter.docx
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.ppt(x) za prezentacijo, npr. 19_nano_Craik_Venter.pptx

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

2017-bionano-seminar

2017-03-15T20:09:03Z

Mojca Kostanjevec: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
! Ime in priimek !! Datum predstavitve !! Tema seminarja
|-
! Peter Prezelj
| 22.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Boštjan Petrič
| 22.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Ema Guštin
| 22.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Tjaša Lapanja
| 29.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Maruša Prolič Kalinšek
| 29.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Domen Klofutar
| 29.03.17 || Novi načini prenosa informacij z izrabo kapacitet DNA: Prenos šifrirne in/ali steganografske DNA v ustni votlini preko naravno prisotnih gostiteljev Lactobacillus Casei in Veillonella Parvula
|-
! Simon Bolta
| 05.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Tomaž Rozmarič
| 05.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Urša Kapš
| 05.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Julija Mazej
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Nataša Žigante
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Anja Herceg
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mirjam Kmetič
| 19.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mojca Kostanjevec
| 19.04.17 || Tarčno zdravljenje epitelijskih tumorjev (cepiva in si-RNA - EpCAM) z uporabo nanodiskov
|-
! Jan Rozman
| 19.04.17 || Sinteza nealergenega rekombinantnega kazeina za jedilno / biorazgradljivo embalažo
|-
! Barbara Dušak
| 03.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mateja Cigoj
| 03.05.17 || Probiotik z dodatkom nanodelcev za zdravljenje celiakije. Uporaba probiotičnih bakterij, ki izločajo peptidaze za razgradnjo glutena do neimunogenih fragmentov, in nanodelcev, ki vsebujejo modificirane naravne glutenske peptide specifične za HLA-DQ2 receptorje na limfocitih T, ki zavrejo Th1 posredovan avtoimunski odziv na gluten.
|-
! Toni Nagode
| 03.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Tim Božič
| 10.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Darja Božič
| 10.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Petra Tavčar
| 10.05.17 || Odstranjevalec škodljivih E-jev in BPA iz pijač na osnovi protiteles in aptamerov
|-
! Marjeta Horvat
| 17.05.17 || FeO nanodelci za učinkovitejše odpravljanje zobnega kariesa
|-
! Danijela Jošić
| 17.05.17 || Gensko spremenjen Lactobacillus, ki izloča nanodelce z spermicidnim in protimikrobnim delovanjem za dolgotrajno zaščito pred zanositvijo in spolno prenosljivimi boleznimi.
|-
! Tina Kuhar
| 17.05.17 || Flaška za vodo z bionanosenzorjem za takojšnjo zaznavo kvalitete oziroma pitnosti nalite vode.
|-
! Nika Strašek
| 24.05.17 || Uporabniku dostopen diagnostični test za zaznavo okužbe s boreliozo in klopnim meningitisom
|-
! Eva Vidak
| 24.05.17 || Biosenzor za CO na osnovi transkripcijskega faktorja CooA iz bakterije ''Rhodospirillum rubrum''
|-
! Alja Zgonc
| 24.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Zala Gluhić
| 31.05.17 || Varnejše uživanje alkohola z uporabo odorant-binding proteina LUSH.
|-
! Judita Avbelj
| 31.05.17 || Nanonaprava iz bioloških delov, ki z absorbcijo in razgradnjo delcev iz zraka preprečuje različne alergijske reakcije.
|-
! Vid Jazbec
| 31.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Vita Vidmar
| 07.06.17 || 'Hot start' transglutaminaza za popravljanje razcepljenih lasnih konic
|-
! Luka Kavčič
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mojca Juteršek
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|-
! Bojana Lazović
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|-
! Eva Korošec
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|-
! Tajda Buh
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|}

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja najdete v [http://ucilnica.fkkt.uni-lj.si/ spletni učilnici].

==Naloga==
'''Vaša naloga je: '''
Študent pripravi projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt.
Predlagana struktura:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Prva stran seminarja naj vsebuje naslov projekta, avtorje, povzetek (od 130 do 160 besed) in grafični povzetek (čez približno pol strani)
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo od 2000 do 2500 besed (vključno z literaturo). Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo pripombe k projektu in postavijo po dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik en dan pred predstavitvijo do polnoči.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem receptu:
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.doc(x) za seminar, npr. 19_nano_Craik_Venter.docx
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.ppt(x) za prezentacijo, npr. 19_nano_Craik_Venter.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1WdCXoXo1zkRrVlLKIcEV1z_MyhavU-3ERBm9n2oiawI/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do predstavitve seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1ToLPn78T9W3G6Hm5hV0mLseFYghiLQMlRPGb0J5zft8/viewform mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.
Na [http://bit.ly/bntmnenja tej strani] lahko preverite, če ste svoje mnenje za določen seminar že oddali in če je bil oddan pravočasno.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

2017-bionano-seminar

2017-03-15T20:07:46Z

Mojca Kostanjevec: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
! Ime in priimek !! Datum predstavitve !! Tema seminarja
|-
! Peter Prezelj
| 22.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Boštjan Petrič
| 22.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Ema Guštin
| 22.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Tjaša Lapanja
| 29.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Maruša Prolič Kalinšek
| 29.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Domen Klofutar
| 29.03.17 || Novi načini prenosa informacij z izrabo kapacitet DNA: Prenos šifrirne in/ali steganografske DNA v ustni votlini preko naravno prisotnih gostiteljev Lactobacillus Casei in Veillonella Parvula
|-
! Simon Bolta
| 05.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Tomaž Rozmarič
| 05.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Urša Kapš
| 05.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Julija Mazej
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Nataša Žigante
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Anja Herceg
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mirjam Kmetič
| 19.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mojca Kostanjevec
| 19.04.17 || Tarčno zdravljenje epitelijskih tumorjev (si-RNA - EpCAM) z uporabo nanodiskov
|-
! Jan Rozman
| 19.04.17 || Sinteza nealergenega rekombinantnega kazeina za jedilno / biorazgradljivo embalažo
|-
! Barbara Dušak
| 03.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mateja Cigoj
| 03.05.17 || Probiotik z dodatkom nanodelcev za zdravljenje celiakije. Uporaba probiotičnih bakterij, ki izločajo peptidaze za razgradnjo glutena do neimunogenih fragmentov, in nanodelcev, ki vsebujejo modificirane naravne glutenske peptide specifične za HLA-DQ2 receptorje na limfocitih T, ki zavrejo Th1 posredovan avtoimunski odziv na gluten.
|-
! Toni Nagode
| 03.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Tim Božič
| 10.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Darja Božič
| 10.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Petra Tavčar
| 10.05.17 || Odstranjevalec škodljivih E-jev in BPA iz pijač na osnovi protiteles in aptamerov
|-
! Marjeta Horvat
| 17.05.17 || FeO nanodelci za učinkovitejše odpravljanje zobnega kariesa
|-
! Danijela Jošić
| 17.05.17 || Gensko spremenjen Lactobacillus, ki izloča nanodelce z spermicidnim in protimikrobnim delovanjem za dolgotrajno zaščito pred zanositvijo in spolno prenosljivimi boleznimi.
|-
! Tina Kuhar
| 17.05.17 || Flaška za vodo z bionanosenzorjem za takojšnjo zaznavo kvalitete oziroma pitnosti nalite vode.
|-
! Nika Strašek
| 24.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Eva Vidak
| 24.05.17 || Biosenzor za CO na osnovi transkripcijskega faktorja CooA iz bakterije ''Rhodospirillum rubrum''
|-
! Alja Zgonc
| 24.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Zala Gluhić
| 31.05.17 || Varnejše uživanje alkohola z uporabo odorant-binding proteina LUSH.
|-
! Judita Avbelj
| 31.05.17 || Nanonaprava iz bioloških delov, ki z absorbcijo in razgradnjo delcev iz zraka preprečuje različne alergijske reakcije.
|-
! Vid Jazbec
| 31.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Vita Vidmar
| 07.06.17 || 'Hot start' transglutaminaza za popravljanje razcepljenih lasnih konic
|-
! Luka Kavčič
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mojca Juteršek
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|-
! Bojana Lazović
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|-
! Eva Korošec
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|-
! Tajda Buh
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|}

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja najdete v [http://ucilnica.fkkt.uni-lj.si/ spletni učilnici].

==Naloga==
'''Vaša naloga je: '''
Študent pripravi projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt.
Predlagana struktura:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Prva stran seminarja naj vsebuje naslov projekta, avtorje, povzetek (od 130 do 160 besed) in grafični povzetek (čez približno pol strani)
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo od 2000 do 2500 besed (vključno z literaturo). Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo pripombe k projektu in postavijo po dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik en dan pred predstavitvijo do polnoči.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem receptu:
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.doc(x) za seminar, npr. 19_nano_Craik_Venter.docx
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.ppt(x) za prezentacijo, npr. 19_nano_Craik_Venter.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1WdCXoXo1zkRrVlLKIcEV1z_MyhavU-3ERBm9n2oiawI/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do predstavitve seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1ToLPn78T9W3G6Hm5hV0mLseFYghiLQMlRPGb0J5zft8/viewform mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.
Na [http://bit.ly/bntmnenja tej strani] lahko preverite, če ste svoje mnenje za določen seminar že oddali in če je bil oddan pravočasno.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

2017-bionano-seminar

2017-03-15T20:06:07Z

Mojca Kostanjevec: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
! Ime in priimek !! Datum predstavitve !! Tema seminarja
|-
! Peter Prezelj
| 22.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Boštjan Petrič
| 22.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Ema Guštin
| 22.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Tjaša Lapanja
| 29.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Maruša Prolič Kalinšek
| 29.03.17 || opis teme ali naslov
|-
! Domen Klofutar
| 29.03.17 || Novi načini prenosa informacij z izrabo kapacitet DNA: Prenos šifrirne in/ali steganografske DNA v ustni votlini preko naravno prisotnih gostiteljev Lactobacillus Casei in Veillonella Parvula
|-
! Simon Bolta
| 05.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Tomaž Rozmarič
| 05.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Urša Kapš
| 05.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Julija Mazej
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Nataša Žigante
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Anja Herceg
| 12.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mirjam Kmetič
| 19.04.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mojca Kostanjevec
| 19.04.17 || Tarčno zdravljenje epitelijskih tumorjev (EpCAM) z uporabo nanodiskov
|-
! Jan Rozman
| 19.04.17 || Sinteza nealergenega rekombinantnega kazeina za jedilno / biorazgradljivo embalažo
|-
! Barbara Dušak
| 03.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mateja Cigoj
| 03.05.17 || Probiotik z dodatkom nanodelcev za zdravljenje celiakije. Uporaba probiotičnih bakterij, ki izločajo peptidaze za razgradnjo glutena do neimunogenih fragmentov, in nanodelcev, ki vsebujejo modificirane naravne glutenske peptide specifične za HLA-DQ2 receptorje na limfocitih T, ki zavrejo Th1 posredovan avtoimunski odziv na gluten.
|-
! Toni Nagode
| 03.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Tim Božič
| 10.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Darja Božič
| 10.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Petra Tavčar
| 10.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Marjeta Horvat
| 17.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Danijela Jošić
| 17.05.17 || Gensko spremenjen Lactobacillus, ki izloča nanodelce z spermicidnim in protimikrobnim delovanjem za dolgotrajno zaščito pred zanositvijo in spolno prenosljivimi boleznimi.
|-
! Tina Kuhar
| 17.05.17 || Flaška za vodo z bionanosenzorjem za takojšnjo zaznavo kvalitete oziroma pitnosti nalite vode.
|-
! Nika Strašek
| 24.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Eva Vidak
| 24.05.17 || Biosenzor za CO na osnovi transkripcijskega faktorja CooA iz bakterije ''Rhodospirillum rubrum''
|-
! Alja Zgonc
| 24.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Zala Gluhić
| 31.05.17 || Varnejše uživanje alkohola z uporabo odorant-binding proteina LUSH.
|-
! Judita Avbelj
| 31.05.17 || Nanonaprava iz bioloških delov, ki z absorbcijo in razgradnjo delcev iz zraka preprečuje različne alergijske reakcije.
|-
! Vid Jazbec
| 31.05.17 || opis teme ali naslov
|-
! Vita Vidmar
| 07.06.17 || 'Hot start' transglutaminaza za popravljanje razcepljenih lasnih konic
|-
! Luka Kavčič
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|-
! Mojca Juteršek
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|-
! Bojana Lazović
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|-
! Eva Korošec
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|-
! Tajda Buh
| 07.06.17 || opis teme ali naslov
|}

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja najdete v [http://ucilnica.fkkt.uni-lj.si/ spletni učilnici].

==Naloga==
'''Vaša naloga je: '''
Študent pripravi projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt.
Predlagana struktura:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Prva stran seminarja naj vsebuje naslov projekta, avtorje, povzetek (od 130 do 160 besed) in grafični povzetek (čez približno pol strani)
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo od 2000 do 2500 besed (vključno z literaturo). Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo pripombe k projektu in postavijo po dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik en dan pred predstavitvijo do polnoči.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem receptu:
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.doc(x) za seminar, npr. 19_nano_Craik_Venter.docx
* 19_nano_Priimek1_Priimek2.ppt(x) za prezentacijo, npr. 19_nano_Craik_Venter.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1WdCXoXo1zkRrVlLKIcEV1z_MyhavU-3ERBm9n2oiawI/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do predstavitve seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1ToLPn78T9W3G6Hm5hV0mLseFYghiLQMlRPGb0J5zft8/viewform mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.
Na [http://bit.ly/bntmnenja tej strani] lahko preverite, če ste svoje mnenje za določen seminar že oddali in če je bil oddan pravočasno.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

Z majhnimi molekulami regulirani ogrodni proteini

2017-01-02T13:01:07Z

Mojca Kostanjevec:

[http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

Ogrodni proteini, ki regulirajo in usmerjajo združevanje drugih proteinov v celici, igrajo izredno pomembno vlogo v celični signalizaciji. Ker obenem interferirajo s številnimi drugimi proteini in tako regulirajo tudi transkripcijo pomembnih genov, se mnogi ogrodni proteini pogosto uporabljajo v sintezni biologiji.

== Ogrodni proteini 14-3-3 ==

Proteini 14-3-3 so ogrodni proteini, ki specifično vežejo motive s fosforiliranimi oblikami aminokislinskih ostankov serina in treonina v tarčnih proteinih. Obenem gre za družino proteinov, ki je močno evolucijsko ohranjena v vseh evkariontskih celicah, večina organizmov pa vsebuje več različnih, vendar strukturno dokaj podobnih izoform, ki navadno tvorijo homo- ter heterodimere. Takšna raznolikost izoform omogoča vezavo številnih interakcijskih partnerjev – do sedaj je bilo identificiranih več kot 200 signalnih proteinov [1].

Proteini 14-3-3 iz tega razloga sodelujejo pri velikem številu bioloških procesov, kot so npr. napredovanje in kontrola celičnega cikla, apoptoza, metabolizem, transkripcija in regulacija izražanja genov ter popravljanje napak DNA [2].

Funkcije proteinov 14-3-3 lahko uvrstimo v štiri glavna področja delovanja, in sicer je najbolj osnovna funkcija teh ogrodnih proteinov združevanje komponent posamezne signalne kaskade in s tem izboljšanje njene učinkovitosti. Povezava proteina 14-3-3 in tarčnega proteina na tak način stabilizira tudi proteinske komplekse, sproži pa lahko tudi konformacijske spremembe vezanega proteina in s tem regulira njegovo encimsko aktivnost. Še ena pomembna funkcija je lokalizacija signalnih molekul na specifičnem območju oz. mestu v znotrajceličnih organelih, kar je lahko pomembno za sintezo določenih intermediatov, proteini 14-3-3 pa so pomembni tudi iz stališča regulacije pozitivnih in negativnih povratnih zank. Ne nazadnje lahko objamejo tudi določeno regijo tarčnega proteina in tako preprečijo interakcije z drugimi molekulami (npr. z DNA ali proteini) ali pa vezan protein zaščitijo pred defosforilacijo in proteolitsko razgradnjo [1,2,3].

== Projekt ==

V ekipi iGEM iz TU Eindhoven so pri svojem raziskovalnem delu na področju sintezne biologije opisane lastnosti izkoristili v ta namen, da so razvili nove variante ogrodnih proteinov – heterodimerne ter tetramerne variante, s čimer so poskušali doseči regulacijo več različnih proteinskih interakcij.

Pri tem so uporabili ogrodni protein T14-3-3, ki izvira iz rastline Nicotiana plumbaginifolia (tobak). Ta dimerni protein interagira z 52 aminokislinskih ostankov dolgim proteinom CT52, ki v resnici predstavlja izoliran C-končni citosolni del H+-ATPaze iz plazemskih membran rastlinskih celic (aminokislinski ostanki 905-956). Interakcija T14-3-3 se vzpostavi s prostim C-koncem CT52 in je stabilizirana z dodatno vezavo majhne organske molekule fuzikokcina [4].

Funkcionalnost svojih konstruktov so nato analizirali s posebnimi reporterskimi sistemi. Na prost N-končni del proteina CT52 so vezali določene proteine, ki so pod vplivom fuzikokcina dimerizirali na ogrodnih proteinih in s tem dokazali funkcionalnost le-teh.

=== Modeliranje proteinov T14-3-3 in CT52 ===

Raziskovalci so nove variante ogrodnih proteinov zasnovali na podlagi računalniških modelov in pri tem uporabili program Rosetta software package. Na proteinu T14-3-3 so tako zasnovali štiri sete mutacij. Poleg že znane mutacije T14-3-3-E19R, ki je v sledečih eksperimentih služila kot pozitivna kontrola, so v posamezna zaporedja proteinov uvedli še računalniško predvidene mutacije S71L in I72V, S71L in W237R.

Komplementarne mutacije so vnesli tudi v zaporedje proteina CT52. Poleg že znane mutacije K943D so načrtali tri nove mutacije I947F, I947H in S953K ter s tem v kasnejših eksperimentih zagotovili ustrezno ortogonalnost s proteini T14-3-3.

==== Načrtovanje dimerov T14-3-3 ====

Nove heterodimerne proteine so sestavili iz dveh monomernih enot, pri čemer je ena od teh predstavljala divji tip proteina T14-3-3, druga monomerna enota pa je vsebovala eno oz. dve mutaciji aminokislinskih ostankov, ki so ključni za vezavo proteinov CT52.

==== Načrtovanje tetramerov T14-3-3 ====

V naslednji fazi so načrtali tetramer proteina T14-3-3, ki se sicer v naravi pojavlja le v dimerni obliki. Takšni ogrodni proteini naj bi bili sposobni združiti štiri tarčne proteine CT52, poleg tega pa bi imeli številne funkcije. Med drugim bi delovali kot izboljšan sistem za sprožitev celične smrti in sistem za produkcijo ter dostavo bioloških zdravil, sodelovali pa bi naj tudi pri regulaciji sistema CRISPR/Cas9.

Pri načrtovanju so tetramere razdelili v dve skupini, in sicer v homotetramere, ki so sestavljeni iz štirih enakih monomernih enot divjega tipa proteina T14-3-3, ter v heterotetramere, ki vključujejo štiri različne monomere. V projektu so te monomerne enote predstavljali divji tip proteina T14-3-3 in tri mutirane oblike (T14-3-3-S71L-I72V, T14-3-3-W237R in T14-3-3-E19R).

Tetramere so zasnovali na podlagi povezovanja dveh dimernih enot preko povezovalne regije GGS10 z zaporedjem Gly-Gly-Ser, ki se desetkrat ponovi, tak tetramer pa na podlagi štirih vezavnih mest oz. žlebov omogoča vezavo in združevanje kar štirih tarčnih proteinov.

=== Poskusi in rezultati ===

==== Dimeri T14-3-3 ====

Funkcionalnost dimerov so analizirali s sistemom NanoLuc Luciferase. Gre za reporterski sistem, ki ga sestavljata dva različna in neaktivna fragmenta SmallBiT in LargeBiT. Proteini T14-3-3 omogočajo, da se ta posamezna fragmenta povežeta in s tem tvorita aktivno luciferazo NanoLuc, ki ob prisotnosti substrata furimazina emitira svetlobo [5].

V projektu so pripravili 10 različnih fragmentov. Fragmenta SmallBiT in LargeBiT so preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec posameznih variant proteina CT52 in te zapise vstavili v vektor pET28a. Po izražanju v E. coli so se povezani proteini ob prisotnosti fuzikokcina vezali na heterodimerne ogrodne proteine. S tem so posledično aktivirali sistem NanoLuc in omogočili emisijo bioluminiscenčne svetlobe z valovno dolžino 460 nm.

V prvi fazi so z merjenjem relativne intenzitete posameznih kompleksov dimernega ogrodnega proteina T14-3-3 in ustreznih vezavnih proteinov CT52 z mutacijami, ki so jih predvideli na podlagi predhodnega modeliranja, najprej preverili funkcionalnost in uspešnost povezovanja teh proteinov.

Pri analizi rezultatov so ugotovili, da je bila v primeru homodimera s povezanimi monomernimi enotami divjega tipa izmerjena intenziteta luminiscence bistveno manjša kot v večini ostalih primerov. Delca NanoBiT sta bila pri tem vezana na identična proteina CT52, zaradi česar je posledično lahko prišlo do vezave dveh delcev SmallBiT ali dveh delcev LargeBiT na en ogrodni dimerni protein. V primeru heterodimera T14-3-3 z mutacijo W237R se bioluminiscenca v primerjavi z negativno kontrolo ni povečala, kar nakazuje na to, da se interakcije med ogrodnim proteinom in proteinom CT52 niso vzpostavile. V ostalih primerih so heterodimeri z uvedenimi mutacijami S71L, S71L in I72V ter E19R dali visoke vrednosti bioluminiscence, kar dokazuje pravilno tvorbo kompleksa NanoLuc in s tem funkcionalnost ogrodnih proteinov.

V naslednji fazi so preverjali vpliv koncentracije ogrodnih proteinov pri tvorbi kompleksov. Pri višjih koncentracijah so pričakovali povečano vezavo CT52 in s tem uspešno dimerizacijo obeh delcev NanoBiT, posledično pa se je povečala tudi izmerjena intenziteta bioluminiscence. V primerih, ki so se v predhodni analizi heterodimerov izkazali za funkcionalne (mutacije S71L, S71L in I72V ter E19R), so tudi v tem eksperimentu ustrezali pričakovanim rezultatom, saj se je intenziteta bioluminiscence povečevala z višanjem koncentracije ogrodnih proteinov T14-3-3.

==== Tetrameri T14-3-3 ====

Skupina iGEM je načrtan tetramer poskušala izraziti in podrobno ovrednotiti z merjenjem kaspazne aktivnosti. Možnost povezovanja štirih proteinov na tetrameru T14-3-3 namreč omogoča regulacijo celične smrti, sprožitev tega procesa pa je odvisna od aktivacije prokaspaz-9, pri čemer posamezne prokaspaze dimerizirajo in s tem aktivirajo druga drugo.

V skupini so zato kaspazo-9 preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec proteina CT52, zapis ponovno vstavili v vektor pET28b in ga nato izrazili v bakterijah E. coli. Aktivnost kaspaz-9 so preučevali z uporabo fluorogenega substrata Ac-LEHD-AFC. Kaspaze-9 ta substrat razcepijo na nefluorescirajoči peptid in del, ki fluorescira, merjenje fluorescence pa tako po vezavi na ogrodni protein daje informacijo o aktivnosti kaspaz-9 in s tem posredno tudi o funkcionalnosti T14-3-3.

Člani skupine so želeli primerjati aktivnost dimerov in tetramerov ter ob tem preveriti tudi aplikacijo ogrodnih proteinov pri stikalu smrti. Pričakovali so, da bodo tetrameri učinkoviteje aktivirali kaspaze-9, saj na nek način kažejo večjo podobnost z apoptosomi, ki se v procesu apoptoze sestavijo v obliki septamera, poleg tega pa združevanje štirih hibridnih proteinov zagotovi višjo lokalno koncentracijo kaspaz-9 in posledično tudi hitrejšo ter bolj zanesljivo aktivacijo.

Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov). Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.

== Zaključek ==

Rezultati kažejo na to, da je ekipa iGEM svoj teoretični model pretvorila v uspešno delujoč in vitro sistem. Kljub temu, da so tetramer sintetizirali le na ravni DNA, pa nadaljnje raziskave in delo v tej smeri predstavljajo temelj za številne aplikacije na področju sintezne biologije, predvsem na področju regulacije proteinskih kompleksov.

Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.

== Viri ==

[1] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21920446 Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011)]

[2] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11598960 van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001)]

[3] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19104498 Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009)]

[4] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17289589 Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007)]

[5] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27144967 Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016)]

[6] [http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

----

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Seminarji_SB_12016/17 Seminarji SB 2016/17]

Z majhnimi molekulami regulirani ogrodni proteini

2017-01-02T12:59:54Z

Mojca Kostanjevec: New page: [http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds] Ogrodni proteini, ki regulirajo in usmerjajo združevanje drugih proteinov v celici, ...

[http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

Ogrodni proteini, ki regulirajo in usmerjajo združevanje drugih proteinov v celici, igrajo izredno pomembno vlogo v celični signalizaciji. Ker interferirajo s številnimi drugimi proteini in tako regulirajo tudi transkripcijo pomembnih genov, se mnogi ogrodni proteini pogosto uporabljajo v sintezni biologiji.

== Ogrodni proteini 14-3-3 ==

Proteini 14-3-3 so ogrodni proteini, ki specifično vežejo motive s fosforiliranimi oblikami aminokislinskih ostankov serina in treonina v tarčnih proteinih. Obenem gre za družino proteinov, ki je močno evolucijsko ohranjena v vseh evkariontskih celicah, večina organizmov pa vsebuje več različnih, vendar strukturno dokaj podobnih izoform, ki navadno tvorijo homo- ter heterodimere. Takšna raznolikost izoform omogoča vezavo številnih interakcijskih partnerjev – do sedaj je bilo identificiranih več kot 200 signalnih proteinov [1].

Proteini 14-3-3 iz tega razloga sodelujejo pri velikem številu bioloških procesov, kot so npr. napredovanje in kontrola celičnega cikla, apoptoza, metabolizem, transkripcija in regulacija izražanja genov ter popravljanje napak DNA [2].

Funkcije proteinov 14-3-3 lahko uvrstimo v štiri glavna področja delovanja, in sicer je najbolj osnovna funkcija teh ogrodnih proteinov združevanje komponent posamezne signalne kaskade in s tem izboljšanje njene učinkovitosti. Povezava proteina 14-3-3 in tarčnega proteina na tak način stabilizira tudi proteinske komplekse, sproži pa lahko tudi konformacijske spremembe vezanega proteina in s tem regulira njegovo encimsko aktivnost. Še ena pomembna funkcija je lokalizacija signalnih molekul na specifičnem območju oz. mestu v znotrajceličnih organelih, kar je lahko pomembno za sintezo določenih intermediatov, proteini 14-3-3 pa so pomembni tudi iz stališča regulacije pozitivnih in negativnih povratnih zank. Ne nazadnje lahko objamejo tudi določeno regijo tarčnega proteina in tako preprečijo interakcije z drugimi molekulami (npr. z DNA ali proteini) ali pa vezan protein zaščitijo pred defosforilacijo in proteolitsko razgradnjo [1,2,3].

== Projekt ==

V ekipi iGEM iz TU Eindhoven so pri svojem raziskovalnem delu na področju sintezne biologije opisane lastnosti izkoristili v ta namen, da so razvili nove variante ogrodnih proteinov – heterodimerne ter tetramerne variante, s čimer so poskušali doseči regulacijo več različnih proteinskih interakcij.

Pri tem so uporabili ogrodni protein T14-3-3, ki izvira iz rastline Nicotiana plumbaginifolia (tobak). Ta dimerni protein interagira z 52 aminokislinskih ostankov dolgim proteinom CT52, ki v resnici predstavlja izoliran C-končni citosolni del H+-ATPaze iz plazemskih membran rastlinskih celic (aminokislinski ostanki 905-956). Interakcija T14-3-3 se vzpostavi s prostim C-koncem CT52 in je stabilizirana z dodatno vezavo majhne organske molekule fuzikokcina [4].

Funkcionalnost svojih konstruktov so nato analizirali s posebnimi reporterskimi sistemi. Na prost N-končni del proteina CT52 so vezali določene proteine, ki so pod vplivom fuzikokcina dimerizirali na ogrodnih proteinih in s tem dokazali funkcionalnost le-teh.

=== Modeliranje proteinov T14-3-3 in CT52 ===

Raziskovalci so nove variante ogrodnih proteinov zasnovali na podlagi računalniških modelov in pri tem uporabili program Rosetta software package. Na proteinu T14-3-3 so tako zasnovali štiri sete mutacij. Poleg že znane mutacije T14-3-3-E19R, ki je v sledečih eksperimentih služila kot pozitivna kontrola, so v posamezna zaporedja proteinov uvedli še računalniško predvidene mutacije S71L in I72V, S71L in W237R.

Komplementarne mutacije so vnesli tudi v zaporedje proteina CT52. Poleg že znane mutacije K943D so načrtali tri nove mutacije I947F, I947H in S953K ter s tem v kasnejših eksperimentih zagotovili ustrezno ortogonalnost s proteini T14-3-3.

==== Načrtovanje dimerov T14-3-3 ====

Nove heterodimerne proteine so sestavili iz dveh monomernih enot, pri čemer je ena od teh predstavljala divji tip proteina T14-3-3, druga monomerna enota pa je vsebovala eno oz. dve mutaciji aminokislinskih ostankov, ki so ključni za vezavo proteinov CT52.

==== Načrtovanje tetramerov T14-3-3 ====

V naslednji fazi so načrtali tetramer proteina T14-3-3, ki se sicer v naravi pojavlja le v dimerni obliki. Takšni ogrodni proteini naj bi bili sposobni združiti štiri tarčne proteine CT52, poleg tega pa bi imeli številne funkcije. Med drugim bi delovali kot izboljšan sistem za sprožitev celične smrti in sistem za produkcijo ter dostavo bioloških zdravil, sodelovali pa bi naj tudi pri regulaciji sistema CRISPR/Cas9.

Pri načrtovanju so tetramere razdelili v dve skupini, in sicer v homotetramere, ki so sestavljeni iz štirih enakih monomernih enot divjega tipa proteina T14-3-3, ter v heterotetramere, ki vključujejo štiri različne monomere. V projektu so te monomerne enote predstavljali divji tip proteina T14-3-3 in tri mutirane oblike (T14-3-3-S71L-I72V, T14-3-3-W237R in T14-3-3-E19R).

Tetramere so zasnovali na podlagi povezovanja dveh dimernih enot preko povezovalne regije GGS10 z zaporedjem Gly-Gly-Ser, ki se desetkrat ponovi, tak tetramer pa na podlagi štirih vezavnih mest oz. žlebov omogoča vezavo in združevanje kar štirih tarčnih proteinov.

=== Poskusi in rezultati ===

==== Dimeri T14-3-3 ====

Funkcionalnost dimerov so analizirali s sistemom NanoLuc Luciferase. Gre za reporterski sistem, ki ga sestavljata dva različna in neaktivna fragmenta SmallBiT in LargeBiT. Proteini T14-3-3 omogočajo, da se ta posamezna fragmenta povežeta in s tem tvorita aktivno luciferazo NanoLuc, ki ob prisotnosti substrata furimazina emitira svetlobo [5].

V projektu so pripravili 10 različnih fragmentov. Fragmenta SmallBiT in LargeBiT so preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec posameznih variant proteina CT52 in te zapise vstavili v vektor pET28a. Po izražanju v E. coli so se povezani proteini ob prisotnosti fuzikokcina vezali na heterodimerne ogrodne proteine. S tem so posledično aktivirali sistem NanoLuc in omogočili emisijo bioluminiscenčne svetlobe z valovno dolžino 460 nm.

V prvi fazi so z merjenjem relativne intenzitete posameznih kompleksov dimernega ogrodnega proteina T14-3-3 in ustreznih vezavnih proteinov CT52 z mutacijami, ki so jih predvideli na podlagi predhodnega modeliranja, najprej preverili funkcionalnost in uspešnost povezovanja teh proteinov.

Pri analizi rezultatov so ugotovili, da je bila v primeru homodimera s povezanimi monomernimi enotami divjega tipa izmerjena intenziteta luminiscence bistveno manjša kot v večini ostalih primerov. Delca NanoBiT sta bila pri tem vezana na identična proteina CT52, zaradi česar je posledično lahko prišlo do vezave dveh delcev SmallBiT ali dveh delcev LargeBiT na en ogrodni dimerni protein. V primeru heterodimera T14-3-3 z mutacijo W237R se bioluminiscenca v primerjavi z negativno kontrolo ni povečala, kar nakazuje na to, da se interakcije med ogrodnim proteinom in proteinom CT52 niso vzpostavile. V ostalih primerih so heterodimeri z uvedenimi mutacijami S71L, S71L in I72V ter E19R dali visoke vrednosti bioluminiscence, kar dokazuje pravilno tvorbo kompleksa NanoLuc in s tem funkcionalnost ogrodnih proteinov.

V naslednji fazi so preverjali vpliv koncentracije ogrodnih proteinov pri tvorbi kompleksov. Pri višjih koncentracijah so pričakovali povečano vezavo CT52 in s tem uspešno dimerizacijo obeh delcev NanoBiT, posledično pa se je povečala tudi izmerjena intenziteta bioluminiscence. V primerih, ki so se v predhodni analizi heterodimerov izkazali za funkcionalne (mutacije S71L, S71L in I72V ter E19R), so tudi v tem eksperimentu ustrezali pričakovanim rezultatom, saj se je intenziteta bioluminiscence povečevala z višanjem koncentracije ogrodnih proteinov T14-3-3.

==== Tetrameri T14-3-3 ====

Skupina iGEM je načrtan tetramer poskušala izraziti in podrobno ovrednotiti z merjenjem kaspazne aktivnosti. Možnost povezovanja štirih proteinov na tetrameru T14-3-3 namreč omogoča regulacijo celične smrti, sprožitev tega procesa pa je odvisna od aktivacije prokaspaz-9, pri čemer posamezne prokaspaze dimerizirajo in s tem aktivirajo druga drugo.

V skupini so zato kaspazo-9 preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec proteina CT52, zapis ponovno vstavili v vektor pET28b in ga nato izrazili v bakterijah E. coli. Aktivnost kaspaz-9 so preučevali z uporabo fluorogenega substrata Ac-LEHD-AFC. Kaspaze-9 ta substrat razcepijo na nefluorescirajoči peptid in del, ki fluorescira, merjenje fluorescence pa tako po vezavi na ogrodni protein daje informacijo o aktivnosti kaspaz-9 in s tem posredno tudi o funkcionalnosti T14-3-3.

Člani skupine so želeli primerjati aktivnost dimerov in tetramerov ter ob tem preveriti tudi aplikacijo ogrodnih proteinov pri stikalu smrti. Pričakovali so, da bodo tetrameri učinkoviteje aktivirali kaspaze-9, saj na nek način kažejo večjo podobnost z apoptosomi, ki se v procesu apoptoze sestavijo v obliki septamera, poleg tega pa združevanje štirih hibridnih proteinov zagotovi višjo lokalno koncentracijo kaspaz-9 in posledično tudi hitrejšo ter bolj zanesljivo aktivacijo.

Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov). Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.

== Zaključek ==

Rezultati kažejo na to, da je ekipa iGEM svoj teoretični model pretvorila v uspešno delujoč in vitro sistem. Kljub temu, da so tetramer sintetizirali le na ravni DNA, pa nadaljnje raziskave in delo v tej smeri predstavljajo temelj za številne aplikacije na področju sintezne biologije, predvsem na področju regulacije proteinskih kompleksov.

Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.

== Viri ==

[1] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21920446 Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011)]

[2] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11598960 van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001)]

[3] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19104498 Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009)]

[4] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17289589 Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007)]

[5] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27144967 Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016)]

[6] [http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

----

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Seminarji_SB_12016/17 Seminarji SB 2016/17]

Seminarji SB 2016/17

2017-01-02T12:59:01Z

Mojca Kostanjevec:

V študijskem letu 2016/17 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI 
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.)
# [[Učinkovito ciljanje izraženih in utišanih genov v človeških zarodnih in induciranih pluripotentnih celicah z nukleazami z motivi cinkovih prstov]]. Angelika Vižintin (22. 11. 2016)
# [[Izdelava sintetičnega genoma s pristopom sestavljanja celotnega genoma: Bakteriofag φX174 iz sintetičnih oligonukleotidov]]. Darja Božič (22.11.2016)
# [[Modeliranje sintetične večcelične ure: Represilatorji, sklopljeni z zaznavanjem celične gostote]]. Vita Vidmar (22. 11. 2016)
# [[Začetki uporabe CRISPR-Cas9 sistema]]. Tomaž Rozmarič (6.12.2016)
# [[Robusten oscilator sinteznih genov z različnimi nastavitvami periode]]. Domen Klofutar (13.12.2016)
# [[Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov]]. Petra Tavčar (13.12.2016)
# [[Procesiranje celičnih informacij s sintetičnimi RNA napravami]]. Tim Božič (20.12.2016)
# [[Usklajeno delovanje sinteznobioloških ur z zaznavanjem celične gostote]]. Luka Kavčič (20.12.2016)
# [[Časovni in prostorski nadzor celičnega signaliziranja prek s svetlobo sprožene interakcije proteinov]]. Boštjan Petrič (3. 1. 2017)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI 
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
#[[Mezenhimske matične celice nove generacije]]. Danijela Jošić (22.11.2016)
#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bakterije%2C_ki_kelirajo_bakrove_ione%2C_v_boju_proti_Wilsonovi_bolezni Bakterije, ki kelirajo bakrove ione, v boju proti Wilsonovi bolezni. Simon Bolta (22. 11. 2016)]
#[["Training protein" - PETaze]]. Urša Kapš (29.11.2016)
#[[Plasticure: rešitev za učinkovitejšo razgradnjo plastike]]. Marjeta Horvat (29. 11. 2016)
#[[Quantifly]]. Ema Guštin (29. 11. 2016)
#[[Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur]]. Mojca Juteršek (29. 11. 2016)
#[[BeeT Beehave]]. Maja Svetličič (29.11.2016)
#[[BiotINK - nov pristop k biotiskanju tkiva]]. Mateja Cigoj (6. 12. 2016)
#[[InstaCHLAM – orodje za inženiring kloroplastov]]. Alja Zgonc (6. 12. 2016)
#[[Mos(kit)o]]. Judita Avbelj (6. 12. 2016)
#[[BioSynthAge - Kvalitetno staranje]]. Tina Kuhar (6.12.2016)
#[[PC SQUAD-Inženiring novih sistemov tarčne dostave zdravil]]. Tajda Buh (13.12.2016)
#[[Biomaterial za privzemanje urana iz okolja - "žetveni stroj" urana]]. Anja Herceg (13.12.2016)
#[[Biosenzor etilena]]. Toni Nagode (13.12.2016)
#[[aSTARice – biosinteza astaksantina v rižu]]. Eva Vidak (20. 12. 2016)
#[[PANTIDE - nov kmetijski sistem, ki ciljano uničuje določene škodljivce]]. Mirjam Kmetič (20.12.2016)
#[[Razvoj novega dostavnega sistema za gensko zdravljenje cistične fibroze]]. Bojana Lazović (20.12.2016)
#[[Z majhnimi molekulami regulirani ogrodni proteini]]. Mojca Kostanjevec (3. 1. 2017)
Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 12 minut (10-14). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini

2017-01-02T12:56:33Z

Mojca Kostanjevec: /* Viri */

[http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

Ogrodni proteini, ki regulirajo in usmerjajo združevanje drugih proteinov v celici, igrajo izredno pomembno vlogo v celični signalizaciji. Ker interferirajo s številnimi drugimi proteini in tako regulirajo tudi transkripcijo pomembnih genov, se mnogi ogrodni proteini pogosto uporabljajo v sintezni biologiji.

== Ogrodni proteini 14-3-3 ==

Proteini 14-3-3 so ogrodni proteini, ki specifično vežejo motive s fosforiliranimi oblikami aminokislinskih ostankov serina in treonina v tarčnih proteinih. Obenem gre za družino proteinov, ki je močno evolucijsko ohranjena v vseh evkariontskih celicah, večina organizmov pa vsebuje več različnih, vendar strukturno dokaj podobnih izoform, ki navadno tvorijo homo- ter heterodimere. Takšna raznolikost izoform omogoča vezavo številnih interakcijskih partnerjev – do sedaj je bilo identificiranih več kot 200 signalnih proteinov [1].

Proteini 14-3-3 iz tega razloga sodelujejo pri velikem številu bioloških procesov, kot so npr. napredovanje in kontrola celičnega cikla, apoptoza, metabolizem, transkripcija in regulacija izražanja genov ter popravljanje napak DNA [2].

Funkcije proteinov 14-3-3 lahko uvrstimo v štiri glavna področja delovanja, in sicer je najbolj osnovna funkcija teh ogrodnih proteinov združevanje komponent posamezne signalne kaskade in s tem izboljšanje njene učinkovitosti. Povezava proteina 14-3-3 in tarčnega proteina na tak način stabilizira tudi proteinske komplekse, sproži pa lahko tudi konformacijske spremembe vezanega proteina in s tem regulira njegovo encimsko aktivnost. Še ena pomembna funkcija je lokalizacija signalnih molekul na specifičnem območju oz. mestu v znotrajceličnih organelih, kar je lahko pomembno za sintezo določenih intermediatov, proteini 14-3-3 pa so pomembni tudi iz stališča regulacije pozitivnih in negativnih povratnih zank. Ne nazadnje lahko objamejo tudi določeno regijo tarčnega proteina in tako preprečijo interakcije z drugimi molekulami (npr. z DNA ali proteini) ali pa vezan protein zaščitijo pred defosforilacijo in proteolitsko razgradnjo [1,2,3].

== Projekt ==

V ekipi iGEM iz TU Eindhoven so pri svojem raziskovalnem delu na področju sintezne biologije opisane lastnosti izkoristili v ta namen, da so razvili nove variante ogrodnih proteinov – heterodimerne ter tetramerne variante, s čimer so poskušali doseči regulacijo več različnih proteinskih interakcij.

Pri tem so uporabili ogrodni protein T14-3-3, ki izvira iz rastline Nicotiana plumbaginifolia (tobak). Ta dimerni protein interagira z 52 aminokislinskih ostankov dolgim proteinom CT52, ki v resnici predstavlja izoliran C-končni citosolni del H+-ATPaze iz plazemskih membran rastlinskih celic (aminokislinski ostanki 905-956). Interakcija T14-3-3 se vzpostavi s prostim C-koncem CT52 in je stabilizirana z dodatno vezavo majhne organske molekule fuzikokcina [4].

Funkcionalnost svojih konstruktov so nato analizirali s posebnimi reporterskimi sistemi. Na prost N-končni del proteina CT52 so vezali določene proteine, ki so pod vplivom fuzikokcina dimerizirali na ogrodnih proteinih in s tem dokazali funkcionalnost le-teh.

=== Modeliranje proteinov T14-3-3 in CT52 ===

Raziskovalci so nove variante ogrodnih proteinov zasnovali na podlagi računalniških modelov in pri tem uporabili program Rosetta software package. Na proteinu T14-3-3 so tako zasnovali štiri sete mutacij. Poleg že znane mutacije T14-3-3-E19R, ki je v sledečih eksperimentih služila kot pozitivna kontrola, so v posamezna zaporedja proteinov uvedli še računalniško predvidene mutacije S71L in I72V, S71L in W237R.

Komplementarne mutacije so vnesli tudi v zaporedje proteina CT52. Poleg že znane mutacije K943D so načrtali tri nove mutacije I947F, I947H in S953K ter s tem v kasnejših eksperimentih zagotovili ustrezno ortogonalnost s proteini T14-3-3.

==== Načrtovanje dimerov T14-3-3 ====

Nove heterodimerne proteine so sestavili iz dveh monomernih enot, pri čemer je ena od teh predstavljala divji tip proteina T14-3-3, druga monomerna enota pa je vsebovala eno oz. dve mutaciji aminokislinskih ostankov, ki so ključni za vezavo proteinov CT52.

==== Načrtovanje tetramerov T14-3-3 ====

V naslednji fazi so načrtali tetramer proteina T14-3-3, ki se sicer v naravi pojavlja le v dimerni obliki. Takšni ogrodni proteini naj bi bili sposobni združiti štiri tarčne proteine CT52, poleg tega pa bi imeli številne funkcije. Med drugim bi delovali kot izboljšan sistem za sprožitev celične smrti in sistem za produkcijo ter dostavo bioloških zdravil, sodelovali pa bi naj tudi pri regulaciji sistema CRISPR/Cas9.

Pri načrtovanju so tetramere razdelili v dve skupini, in sicer v homotetramere, ki so sestavljeni iz štirih enakih monomernih enot divjega tipa proteina T14-3-3, ter v heterotetramere, ki vključujejo štiri različne monomere. V projektu so te monomerne enote predstavljali divji tip proteina T14-3-3 in tri mutirane oblike (T14-3-3-S71L-I72V, T14-3-3-W237R in T14-3-3-E19R).

Tetramere so zasnovali na podlagi povezovanja dveh dimernih enot preko povezovalne regije GGS10 z zaporedjem Gly-Gly-Ser, ki se desetkrat ponovi, tak tetramer pa na podlagi štirih vezavnih mest oz. žlebov omogoča vezavo in združevanje kar štirih tarčnih proteinov.

=== Poskusi in rezultati ===

==== Dimeri T14-3-3 ====

Funkcionalnost dimerov so analizirali s sistemom NanoLuc Luciferase. Gre za reporterski sistem, ki ga sestavljata dva različna in neaktivna fragmenta SmallBiT in LargeBiT. Proteini T14-3-3 omogočajo, da se ta posamezna fragmenta povežeta in s tem tvorita aktivno luciferazo NanoLuc, ki ob prisotnosti substrata furimazina emitira svetlobo [5].

V projektu so pripravili 10 različnih fragmentov. Fragmenta SmallBiT in LargeBiT so preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec posameznih variant proteina CT52 in te zapise vstavili v vektor pET28a. Po izražanju v E. coli so se povezani proteini ob prisotnosti fuzikokcina vezali na heterodimerne ogrodne proteine. S tem so posledično aktivirali sistem NanoLuc in omogočili emisijo bioluminiscenčne svetlobe z valovno dolžino 460 nm.

V prvi fazi so z merjenjem relativne intenzitete posameznih kompleksov dimernega ogrodnega proteina T14-3-3 in ustreznih vezavnih proteinov CT52 z mutacijami, ki so jih predvideli na podlagi predhodnega modeliranja, najprej preverili funkcionalnost in uspešnost povezovanja teh proteinov.

Pri analizi rezultatov so ugotovili, da je bila v primeru homodimera s povezanimi monomernimi enotami divjega tipa izmerjena intenziteta luminiscence bistveno manjša kot v večini ostalih primerov. Delca NanoBiT sta bila pri tem vezana na identična proteina CT52, zaradi česar je posledično lahko prišlo do vezave dveh delcev SmallBiT ali dveh delcev LargeBiT na en ogrodni dimerni protein. V primeru heterodimera T14-3-3 z mutacijo W237R se bioluminiscenca v primerjavi z negativno kontrolo ni povečala, kar nakazuje na to, da se interakcije med ogrodnim proteinom in proteinom CT52 niso vzpostavile. V ostalih primerih so heterodimeri z uvedenimi mutacijami S71L, S71L in I72V ter E19R dali visoke vrednosti bioluminiscence, kar dokazuje pravilno tvorbo kompleksa NanoLuc in s tem funkcionalnost ogrodnih proteinov.

V naslednji fazi so preverjali vpliv koncentracije ogrodnih proteinov pri tvorbi kompleksov. Pri višjih koncentracijah so pričakovali povečano vezavo CT52 in s tem uspešno dimerizacijo obeh delcev NanoBiT, posledično pa se je povečala tudi izmerjena intenziteta bioluminiscence. V primerih, ki so se v predhodni analizi heterodimerov izkazali za funkcionalne (mutacije S71L, S71L in I72V ter E19R), so tudi v tem eksperimentu ustrezali pričakovanim rezultatom, saj se je intenziteta bioluminiscence povečevala z višanjem koncentracije ogrodnih proteinov T14-3-3.

==== Tetrameri T14-3-3 ====

Skupina iGEM je načrtan tetramer poskušala izraziti in podrobno ovrednotiti z merjenjem kaspazne aktivnosti. Možnost povezovanja štirih proteinov na tetrameru T14-3-3 namreč omogoča regulacijo celične smrti, sprožitev tega procesa pa je odvisna od aktivacije prokaspaz-9, pri čemer posamezne prokaspaze dimerizirajo in s tem aktivirajo druga drugo.

V skupini so zato kaspazo-9 preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec proteina CT52, zapis ponovno vstavili v vektor pET28b in ga nato izrazili v bakterijah E. coli. Aktivnost kaspaz-9 so preučevali z uporabo fluorogenega substrata Ac-LEHD-AFC. Kaspaze-9 ta substrat razcepijo na nefluorescirajoči peptid in del, ki fluorescira, merjenje fluorescence pa tako po vezavi na ogrodni protein daje informacijo o aktivnosti kaspaz-9 in s tem posredno tudi o funkcionalnosti T14-3-3.

Člani skupine so želeli primerjati aktivnost dimerov in tetramerov ter ob tem preveriti tudi aplikacijo ogrodnih proteinov pri stikalu smrti. Pričakovali so, da bodo tetrameri učinkoviteje aktivirali kaspaze-9, saj na nek način kažejo večjo podobnost z apoptosomi, ki se v procesu apoptoze sestavijo v obliki septamera, poleg tega pa združevanje štirih hibridnih proteinov zagotovi višjo lokalno koncentracijo kaspaz-9 in posledično tudi hitrejšo ter bolj zanesljivo aktivacijo.

Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov). Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.

== Zaključek ==

Rezultati kažejo na to, da je ekipa iGEM svoj teoretični model pretvorila v uspešno delujoč in vitro sistem. Kljub temu, da so tetramer sintetizirali le na ravni DNA, pa nadaljnje raziskave in delo v tej smeri predstavljajo temelj za številne aplikacije na področju sintezne biologije, predvsem na področju regulacije proteinskih kompleksov.

Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.

== Viri ==

[1] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21920446 Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011)]

[2] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11598960 van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001)]

[3] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19104498 Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009)]

[4] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17289589 Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007)]

[5] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27144967 Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016)]

[6] [http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

----

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Seminarji_SB_12016/17 Seminarji SB 2016/17]

Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini

2017-01-02T12:55:29Z

Mojca Kostanjevec:

[http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

Ogrodni proteini, ki regulirajo in usmerjajo združevanje drugih proteinov v celici, igrajo izredno pomembno vlogo v celični signalizaciji. Ker interferirajo s številnimi drugimi proteini in tako regulirajo tudi transkripcijo pomembnih genov, se mnogi ogrodni proteini pogosto uporabljajo v sintezni biologiji.

== Ogrodni proteini 14-3-3 ==

Proteini 14-3-3 so ogrodni proteini, ki specifično vežejo motive s fosforiliranimi oblikami aminokislinskih ostankov serina in treonina v tarčnih proteinih. Obenem gre za družino proteinov, ki je močno evolucijsko ohranjena v vseh evkariontskih celicah, večina organizmov pa vsebuje več različnih, vendar strukturno dokaj podobnih izoform, ki navadno tvorijo homo- ter heterodimere. Takšna raznolikost izoform omogoča vezavo številnih interakcijskih partnerjev – do sedaj je bilo identificiranih več kot 200 signalnih proteinov [1].

Proteini 14-3-3 iz tega razloga sodelujejo pri velikem številu bioloških procesov, kot so npr. napredovanje in kontrola celičnega cikla, apoptoza, metabolizem, transkripcija in regulacija izražanja genov ter popravljanje napak DNA [2].

Funkcije proteinov 14-3-3 lahko uvrstimo v štiri glavna področja delovanja, in sicer je najbolj osnovna funkcija teh ogrodnih proteinov združevanje komponent posamezne signalne kaskade in s tem izboljšanje njene učinkovitosti. Povezava proteina 14-3-3 in tarčnega proteina na tak način stabilizira tudi proteinske komplekse, sproži pa lahko tudi konformacijske spremembe vezanega proteina in s tem regulira njegovo encimsko aktivnost. Še ena pomembna funkcija je lokalizacija signalnih molekul na specifičnem območju oz. mestu v znotrajceličnih organelih, kar je lahko pomembno za sintezo določenih intermediatov, proteini 14-3-3 pa so pomembni tudi iz stališča regulacije pozitivnih in negativnih povratnih zank. Ne nazadnje lahko objamejo tudi določeno regijo tarčnega proteina in tako preprečijo interakcije z drugimi molekulami (npr. z DNA ali proteini) ali pa vezan protein zaščitijo pred defosforilacijo in proteolitsko razgradnjo [1,2,3].

== Projekt ==

V ekipi iGEM iz TU Eindhoven so pri svojem raziskovalnem delu na področju sintezne biologije opisane lastnosti izkoristili v ta namen, da so razvili nove variante ogrodnih proteinov – heterodimerne ter tetramerne variante, s čimer so poskušali doseči regulacijo več različnih proteinskih interakcij.

Pri tem so uporabili ogrodni protein T14-3-3, ki izvira iz rastline Nicotiana plumbaginifolia (tobak). Ta dimerni protein interagira z 52 aminokislinskih ostankov dolgim proteinom CT52, ki v resnici predstavlja izoliran C-končni citosolni del H+-ATPaze iz plazemskih membran rastlinskih celic (aminokislinski ostanki 905-956). Interakcija T14-3-3 se vzpostavi s prostim C-koncem CT52 in je stabilizirana z dodatno vezavo majhne organske molekule fuzikokcina [4].

Funkcionalnost svojih konstruktov so nato analizirali s posebnimi reporterskimi sistemi. Na prost N-končni del proteina CT52 so vezali določene proteine, ki so pod vplivom fuzikokcina dimerizirali na ogrodnih proteinih in s tem dokazali funkcionalnost le-teh.

=== Modeliranje proteinov T14-3-3 in CT52 ===

Raziskovalci so nove variante ogrodnih proteinov zasnovali na podlagi računalniških modelov in pri tem uporabili program Rosetta software package. Na proteinu T14-3-3 so tako zasnovali štiri sete mutacij. Poleg že znane mutacije T14-3-3-E19R, ki je v sledečih eksperimentih služila kot pozitivna kontrola, so v posamezna zaporedja proteinov uvedli še računalniško predvidene mutacije S71L in I72V, S71L in W237R.

Komplementarne mutacije so vnesli tudi v zaporedje proteina CT52. Poleg že znane mutacije K943D so načrtali tri nove mutacije I947F, I947H in S953K ter s tem v kasnejših eksperimentih zagotovili ustrezno ortogonalnost s proteini T14-3-3.

==== Načrtovanje dimerov T14-3-3 ====

Nove heterodimerne proteine so sestavili iz dveh monomernih enot, pri čemer je ena od teh predstavljala divji tip proteina T14-3-3, druga monomerna enota pa je vsebovala eno oz. dve mutaciji aminokislinskih ostankov, ki so ključni za vezavo proteinov CT52.

==== Načrtovanje tetramerov T14-3-3 ====

V naslednji fazi so načrtali tetramer proteina T14-3-3, ki se sicer v naravi pojavlja le v dimerni obliki. Takšni ogrodni proteini naj bi bili sposobni združiti štiri tarčne proteine CT52, poleg tega pa bi imeli številne funkcije. Med drugim bi delovali kot izboljšan sistem za sprožitev celične smrti in sistem za produkcijo ter dostavo bioloških zdravil, sodelovali pa bi naj tudi pri regulaciji sistema CRISPR/Cas9.

Pri načrtovanju so tetramere razdelili v dve skupini, in sicer v homotetramere, ki so sestavljeni iz štirih enakih monomernih enot divjega tipa proteina T14-3-3, ter v heterotetramere, ki vključujejo štiri različne monomere. V projektu so te monomerne enote predstavljali divji tip proteina T14-3-3 in tri mutirane oblike (T14-3-3-S71L-I72V, T14-3-3-W237R in T14-3-3-E19R).

Tetramere so zasnovali na podlagi povezovanja dveh dimernih enot preko povezovalne regije GGS10 z zaporedjem Gly-Gly-Ser, ki se desetkrat ponovi, tak tetramer pa na podlagi štirih vezavnih mest oz. žlebov omogoča vezavo in združevanje kar štirih tarčnih proteinov.

=== Poskusi in rezultati ===

==== Dimeri T14-3-3 ====

Funkcionalnost dimerov so analizirali s sistemom NanoLuc Luciferase. Gre za reporterski sistem, ki ga sestavljata dva različna in neaktivna fragmenta SmallBiT in LargeBiT. Proteini T14-3-3 omogočajo, da se ta posamezna fragmenta povežeta in s tem tvorita aktivno luciferazo NanoLuc, ki ob prisotnosti substrata furimazina emitira svetlobo [5].

V projektu so pripravili 10 različnih fragmentov. Fragmenta SmallBiT in LargeBiT so preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec posameznih variant proteina CT52 in te zapise vstavili v vektor pET28a. Po izražanju v E. coli so se povezani proteini ob prisotnosti fuzikokcina vezali na heterodimerne ogrodne proteine. S tem so posledično aktivirali sistem NanoLuc in omogočili emisijo bioluminiscenčne svetlobe z valovno dolžino 460 nm.

V prvi fazi so z merjenjem relativne intenzitete posameznih kompleksov dimernega ogrodnega proteina T14-3-3 in ustreznih vezavnih proteinov CT52 z mutacijami, ki so jih predvideli na podlagi predhodnega modeliranja, najprej preverili funkcionalnost in uspešnost povezovanja teh proteinov.

Pri analizi rezultatov so ugotovili, da je bila v primeru homodimera s povezanimi monomernimi enotami divjega tipa izmerjena intenziteta luminiscence bistveno manjša kot v večini ostalih primerov. Delca NanoBiT sta bila pri tem vezana na identična proteina CT52, zaradi česar je posledično lahko prišlo do vezave dveh delcev SmallBiT ali dveh delcev LargeBiT na en ogrodni dimerni protein. V primeru heterodimera T14-3-3 z mutacijo W237R se bioluminiscenca v primerjavi z negativno kontrolo ni povečala, kar nakazuje na to, da se interakcije med ogrodnim proteinom in proteinom CT52 niso vzpostavile. V ostalih primerih so heterodimeri z uvedenimi mutacijami S71L, S71L in I72V ter E19R dali visoke vrednosti bioluminiscence, kar dokazuje pravilno tvorbo kompleksa NanoLuc in s tem funkcionalnost ogrodnih proteinov.

V naslednji fazi so preverjali vpliv koncentracije ogrodnih proteinov pri tvorbi kompleksov. Pri višjih koncentracijah so pričakovali povečano vezavo CT52 in s tem uspešno dimerizacijo obeh delcev NanoBiT, posledično pa se je povečala tudi izmerjena intenziteta bioluminiscence. V primerih, ki so se v predhodni analizi heterodimerov izkazali za funkcionalne (mutacije S71L, S71L in I72V ter E19R), so tudi v tem eksperimentu ustrezali pričakovanim rezultatom, saj se je intenziteta bioluminiscence povečevala z višanjem koncentracije ogrodnih proteinov T14-3-3.

==== Tetrameri T14-3-3 ====

Skupina iGEM je načrtan tetramer poskušala izraziti in podrobno ovrednotiti z merjenjem kaspazne aktivnosti. Možnost povezovanja štirih proteinov na tetrameru T14-3-3 namreč omogoča regulacijo celične smrti, sprožitev tega procesa pa je odvisna od aktivacije prokaspaz-9, pri čemer posamezne prokaspaze dimerizirajo in s tem aktivirajo druga drugo.

V skupini so zato kaspazo-9 preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec proteina CT52, zapis ponovno vstavili v vektor pET28b in ga nato izrazili v bakterijah E. coli. Aktivnost kaspaz-9 so preučevali z uporabo fluorogenega substrata Ac-LEHD-AFC. Kaspaze-9 ta substrat razcepijo na nefluorescirajoči peptid in del, ki fluorescira, merjenje fluorescence pa tako po vezavi na ogrodni protein daje informacijo o aktivnosti kaspaz-9 in s tem posredno tudi o funkcionalnosti T14-3-3.

Člani skupine so želeli primerjati aktivnost dimerov in tetramerov ter ob tem preveriti tudi aplikacijo ogrodnih proteinov pri stikalu smrti. Pričakovali so, da bodo tetrameri učinkoviteje aktivirali kaspaze-9, saj na nek način kažejo večjo podobnost z apoptosomi, ki se v procesu apoptoze sestavijo v obliki septamera, poleg tega pa združevanje štirih hibridnih proteinov zagotovi višjo lokalno koncentracijo kaspaz-9 in posledično tudi hitrejšo ter bolj zanesljivo aktivacijo.

Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov). Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.

== Zaključek ==

Rezultati kažejo na to, da je ekipa iGEM svoj teoretični model pretvorila v uspešno delujoč in vitro sistem. Kljub temu, da so tetramer sintetizirali le na ravni DNA, pa nadaljnje raziskave in delo v tej smeri predstavljajo temelj za številne aplikacije na področju sintezne biologije, predvsem na področju regulacije proteinskih kompleksov.

Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.

== Viri ==

[1] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21920446 Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011)]

[2] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11598960 van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001)]

[3] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19104498 Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009)]

[4] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17289589 Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007)]

[5] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27144967 Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016)]

[6] [http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

----

Seminarji SB 2016/17

Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini

2017-01-02T12:52:40Z

Mojca Kostanjevec:

[http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

Ogrodni proteini, ki regulirajo in usmerjajo združevanje drugih proteinov v celici, igrajo izredno pomembno vlogo v celični signalizaciji. Ker interferirajo s številnimi drugimi proteini in tako regulirajo tudi transkripcijo pomembnih genov, se mnogi ogrodni proteini pogosto uporabljajo v sintezni biologiji.

== Ogrodni proteini 14-3-3 ==

Proteini 14-3-3 so ogrodni proteini, ki specifično vežejo motive s fosforiliranimi oblikami aminokislinskih ostankov serina in treonina v tarčnih proteinih. Obenem gre za družino proteinov, ki je močno evolucijsko ohranjena v vseh evkariontskih celicah, večina organizmov pa vsebuje več različnih, vendar strukturno dokaj podobnih izoform, ki navadno tvorijo homo- ter heterodimere. Takšna raznolikost izoform omogoča vezavo številnih interakcijskih partnerjev – do sedaj je bilo identificiranih več kot 200 signalnih proteinov [1].

Proteini 14-3-3 iz tega razloga sodelujejo pri velikem številu bioloških procesov, kot so npr. napredovanje in kontrola celičnega cikla, apoptoza, metabolizem, transkripcija in regulacija izražanja genov ter popravljanje napak DNA [2].

Funkcije proteinov 14-3-3 lahko uvrstimo v štiri glavna področja delovanja, in sicer je najbolj osnovna funkcija teh ogrodnih proteinov združevanje komponent posamezne signalne kaskade in s tem izboljšanje njene učinkovitosti. Povezava proteina 14-3-3 in tarčnega proteina na tak način stabilizira tudi proteinske komplekse, sproži pa lahko tudi konformacijske spremembe vezanega proteina in s tem regulira njegovo encimsko aktivnost. Še ena pomembna funkcija je lokalizacija signalnih molekul na specifičnem območju oz. mestu v znotrajceličnih organelih, kar je lahko pomembno za sintezo določenih intermediatov, proteini 14-3-3 pa so pomembni tudi iz stališča regulacije pozitivnih in negativnih povratnih zank. Ne nazadnje lahko objamejo tudi določeno regijo tarčnega proteina in tako preprečijo interakcije z drugimi molekulami (npr. z DNA ali proteini) ali pa vezan protein zaščitijo pred defosforilacijo in proteolitsko razgradnjo [1,2,3].

== Projekt ==

V ekipi iGEM iz TU Eindhoven so pri svojem raziskovalnem delu na področju sintezne biologije opisane lastnosti izkoristili v ta namen, da so razvili nove variante ogrodnih proteinov – heterodimerne ter tetramerne variante, s čimer so poskušali doseči regulacijo več različnih proteinskih interakcij.

Pri tem so uporabili ogrodni protein T14-3-3, ki izvira iz rastline Nicotiana plumbaginifolia (tobak). Ta dimerni protein interagira z 52 aminokislinskih ostankov dolgim proteinom CT52, ki v resnici predstavlja izoliran C-končni citosolni del H+-ATPaze iz plazemskih membran rastlinskih celic (aminokislinski ostanki 905-956). Interakcija T14-3-3 se vzpostavi s prostim C-koncem CT52 in je stabilizirana z dodatno vezavo majhne organske molekule fuzikokcina [4].

Funkcionalnost svojih konstruktov so nato analizirali s posebnimi reporterskimi sistemi. Na prost N-končni del proteina CT52 so vezali določene proteine, ki so pod vplivom fuzikokcina dimerizirali na ogrodnih proteinih in s tem dokazali funkcionalnost le-teh.

=== Modeliranje proteinov T14-3-3 in CT52 ===

Raziskovalci so nove variante ogrodnih proteinov zasnovali na podlagi računalniških modelov in pri tem uporabili program Rosetta software package. Na proteinu T14-3-3 so tako zasnovali štiri sete mutacij. Poleg že znane mutacije T14-3-3-E19R, ki je v sledečih eksperimentih služila kot pozitivna kontrola, so v posamezna zaporedja proteinov uvedli še računalniško predvidene mutacije S71L in I72V, S71L in W237R.

Komplementarne mutacije so vnesli tudi v zaporedje proteina CT52. Poleg že znane mutacije K943D so načrtali tri nove mutacije I947F, I947H in S953K ter s tem v kasnejših eksperimentih zagotovili ustrezno ortogonalnost s proteini T14-3-3.

==== Načrtovanje dimerov T14-3-3 ====

Nove heterodimerne proteine so sestavili iz dveh monomernih enot, pri čemer je ena od teh predstavljala divji tip proteina T14-3-3, druga monomerna enota pa je vsebovala eno oz. dve mutaciji aminokislinskih ostankov, ki so ključni za vezavo proteinov CT52.

==== Načrtovanje tetramerov T14-3-3 ====

V naslednji fazi so načrtali tetramer proteina T14-3-3, ki se sicer v naravi pojavlja le v dimerni obliki. Takšni ogrodni proteini naj bi bili sposobni združiti štiri tarčne proteine CT52, poleg tega pa bi imeli številne funkcije. Med drugim bi delovali kot izboljšan sistem za sprožitev celične smrti in sistem za produkcijo ter dostavo bioloških zdravil, sodelovali pa bi naj tudi pri regulaciji sistema CRISPR/Cas9.

Pri načrtovanju so tetramere razdelili v dve skupini, in sicer v homotetramere, ki so sestavljeni iz štirih enakih monomernih enot divjega tipa proteina T14-3-3, ter v heterotetramere, ki vključujejo štiri različne monomere. V projektu so te monomerne enote predstavljali divji tip proteina T14-3-3 in tri mutirane oblike (T14-3-3-S71L-I72V, T14-3-3-W237R in T14-3-3-E19R).

Tetramere so zasnovali na podlagi povezovanja dveh dimernih enot preko povezovalne regije GGS10 z zaporedjem Gly-Gly-Ser, ki se desetkrat ponovi, tak tetramer pa na podlagi štirih vezavnih mest oz. žlebov omogoča vezavo in združevanje kar štirih tarčnih proteinov.

=== Poskusi in rezultati ===

==== Dimeri T14-3-3 ====

Funkcionalnost dimerov so analizirali s sistemom NanoLuc Luciferase. Gre za reporterski sistem, ki ga sestavljata dva različna in neaktivna fragmenta SmallBiT in LargeBiT. Proteini T14-3-3 omogočajo, da se ta posamezna fragmenta povežeta in s tem tvorita aktivno luciferazo NanoLuc, ki ob prisotnosti substrata furimazina emitira svetlobo [5].

V projektu so pripravili 10 različnih fragmentov. Fragmenta SmallBiT in LargeBiT so preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec posameznih variant proteina CT52 in te zapise vstavili v vektor pET28a. Po izražanju v E. coli so se povezani proteini ob prisotnosti fuzikokcina vezali na heterodimerne ogrodne proteine. S tem so posledično aktivirali sistem NanoLuc in omogočili emisijo bioluminiscenčne svetlobe z valovno dolžino 460 nm.

V prvi fazi so z merjenjem relativne intenzitete posameznih kompleksov dimernega ogrodnega proteina T14-3-3 in ustreznih vezavnih proteinov CT52 z mutacijami, ki so jih predvideli na podlagi predhodnega modeliranja, najprej preverili funkcionalnost in uspešnost povezovanja teh proteinov.

Pri analizi rezultatov so ugotovili, da je bila v primeru homodimera s povezanimi monomernimi enotami divjega tipa izmerjena intenziteta luminiscence bistveno manjša kot v večini ostalih primerov. Delca NanoBiT sta bila pri tem vezana na identična proteina CT52, zaradi česar je posledično lahko prišlo do vezave dveh delcev SmallBiT ali dveh delcev LargeBiT na en ogrodni dimerni protein. V primeru heterodimera T14-3-3 z mutacijo W237R se bioluminiscenca v primerjavi z negativno kontrolo ni povečala, kar nakazuje na to, da se interakcije med ogrodnim proteinom in proteinom CT52 niso vzpostavile. V ostalih primerih so heterodimeri z uvedenimi mutacijami S71L, S71L in I72V ter E19R dali visoke vrednosti bioluminiscence, kar dokazuje pravilno tvorbo kompleksa NanoLuc in s tem funkcionalnost ogrodnih proteinov.

V naslednji fazi so preverjali vpliv koncentracije ogrodnih proteinov pri tvorbi kompleksov. Pri višjih koncentracijah so pričakovali povečano vezavo CT52 in s tem uspešno dimerizacijo obeh delcev NanoBiT, posledično pa se je povečala tudi izmerjena intenziteta bioluminiscence. V primerih, ki so se v predhodni analizi heterodimerov izkazali za funkcionalne (mutacije S71L, S71L in I72V ter E19R), so tudi v tem eksperimentu ustrezali pričakovanim rezultatom, saj se je intenziteta bioluminiscence povečevala z višanjem koncentracije ogrodnih proteinov T14-3-3.

==== Tetrameri T14-3-3 ====

Skupina iGEM je načrtan tetramer poskušala izraziti in podrobno ovrednotiti z merjenjem kaspazne aktivnosti. Možnost povezovanja štirih proteinov na tetrameru T14-3-3 namreč omogoča regulacijo celične smrti, sprožitev tega procesa pa je odvisna od aktivacije prokaspaz-9, pri čemer posamezne prokaspaze dimerizirajo in s tem aktivirajo druga drugo.

V skupini so zato kaspazo-9 preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec proteina CT52, zapis ponovno vstavili v vektor pET28b in ga nato izrazili v bakterijah E. coli. Aktivnost kaspaz-9 so preučevali z uporabo fluorogenega substrata Ac-LEHD-AFC. Kaspaze-9 ta substrat razcepijo na nefluorescirajoči peptid in del, ki fluorescira, merjenje fluorescence pa tako po vezavi na ogrodni protein daje informacijo o aktivnosti kaspaz-9 in s tem posredno tudi o funkcionalnosti T14-3-3.

Člani skupine so želeli primerjati aktivnost dimerov in tetramerov ter ob tem preveriti tudi aplikacijo ogrodnih proteinov pri stikalu smrti. Pričakovali so, da bodo tetrameri učinkoviteje aktivirali kaspaze-9, saj na nek način kažejo večjo podobnost z apoptosomi, ki se v procesu apoptoze sestavijo v obliki septamera, poleg tega pa združevanje štirih hibridnih proteinov zagotovi višjo lokalno koncentracijo kaspaz-9 in posledično tudi hitrejšo ter bolj zanesljivo aktivacijo.

Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov). Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.

== Zaključek ==

Rezultati kažejo na to, da je ekipa iGEM svoj teoretični model pretvorila v uspešno delujoč in vitro sistem. Kljub temu, da so tetramer sintetizirali le na ravni DNA, pa nadaljnje raziskave in delo v tej smeri predstavljajo temelj za številne aplikacije na področju sintezne biologije, predvsem na področju regulacije proteinskih kompleksov.

Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.

== Viri ==

[1] [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21920446 Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011)]

[2] van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001).

[3] Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009).

[4] Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007).

[5] Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016).

[6] 2016 iGEM team from Eindhoven University of Technology

----

Seminarji SB 2016/17

Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini

2017-01-02T12:50:22Z

Mojca Kostanjevec:

[http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

Ogrodni proteini, ki regulirajo in usmerjajo združevanje drugih proteinov v celici, igrajo izredno pomembno vlogo v celični signalizaciji. Ker interferirajo s številnimi drugimi proteini in tako regulirajo tudi transkripcijo pomembnih genov, se mnogi ogrodni proteini pogosto uporabljajo v sintezni biologiji.

== Ogrodni proteini 14-3-3 ==

Proteini 14-3-3 so ogrodni proteini, ki specifično vežejo motive s fosforiliranimi oblikami aminokislinskih ostankov serina in treonina v tarčnih proteinih. Obenem gre za družino proteinov, ki je močno evolucijsko ohranjena v vseh evkariontskih celicah, večina organizmov pa vsebuje več različnih, vendar strukturno dokaj podobnih izoform, ki navadno tvorijo homo- ter heterodimere. Takšna raznolikost izoform omogoča vezavo številnih interakcijskih partnerjev – do sedaj je bilo identificiranih več kot 200 signalnih proteinov [1].

Proteini 14-3-3 iz tega razloga sodelujejo pri velikem številu bioloških procesov, kot so npr. napredovanje in kontrola celičnega cikla, apoptoza, metabolizem, transkripcija in regulacija izražanja genov ter popravljanje napak DNA [2].

Funkcije proteinov 14-3-3 lahko uvrstimo v štiri glavna področja delovanja, in sicer je najbolj osnovna funkcija teh ogrodnih proteinov združevanje komponent posamezne signalne kaskade in s tem izboljšanje njene učinkovitosti. Povezava proteina 14-3-3 in tarčnega proteina na tak način stabilizira tudi proteinske komplekse, sproži pa lahko tudi konformacijske spremembe vezanega proteina in s tem regulira njegovo encimsko aktivnost. Še ena pomembna funkcija je lokalizacija signalnih molekul na specifičnem območju oz. mestu v znotrajceličnih organelih, kar je lahko pomembno za sintezo določenih intermediatov, proteini 14-3-3 pa so pomembni tudi iz stališča regulacije pozitivnih in negativnih povratnih zank. Ne nazadnje lahko objamejo tudi določeno regijo tarčnega proteina in tako preprečijo interakcije z drugimi molekulami (npr. z DNA ali proteini) ali pa vezan protein zaščitijo pred defosforilacijo in proteolitsko razgradnjo [1,2,3].

== Projekt ==

V ekipi iGEM iz TU Eindhoven so pri svojem raziskovalnem delu na področju sintezne biologije opisane lastnosti izkoristili v ta namen, da so razvili nove variante ogrodnih proteinov – heterodimerne ter tetramerne variante, s čimer so poskušali doseči regulacijo več različnih proteinskih interakcij.

Pri tem so uporabili ogrodni protein T14-3-3, ki izvira iz rastline Nicotiana plumbaginifolia (tobak). Ta dimerni protein interagira z 52 aminokislinskih ostankov dolgim proteinom CT52, ki v resnici predstavlja izoliran C-končni citosolni del H+-ATPaze iz plazemskih membran rastlinskih celic (aminokislinski ostanki 905-956). Interakcija T14-3-3 se vzpostavi s prostim C-koncem CT52 in je stabilizirana z dodatno vezavo majhne organske molekule fuzikokcina [4].

Funkcionalnost svojih konstruktov so nato analizirali s posebnimi reporterskimi sistemi. Na prost N-končni del proteina CT52 so vezali določene proteine, ki so pod vplivom fuzikokcina dimerizirali na ogrodnih proteinih in s tem dokazali funkcionalnost le-teh.

=== Modeliranje proteinov T14-3-3 in CT52 ===

Raziskovalci so nove variante ogrodnih proteinov zasnovali na podlagi računalniških modelov in pri tem uporabili program Rosetta software package. Na proteinu T14-3-3 so tako zasnovali štiri sete mutacij. Poleg že znane mutacije T14-3-3-E19R, ki je v sledečih eksperimentih služila kot pozitivna kontrola, so v posamezna zaporedja proteinov uvedli še računalniško predvidene mutacije S71L in I72V, S71L in W237R.

Komplementarne mutacije so vnesli tudi v zaporedje proteina CT52. Poleg že znane mutacije K943D so načrtali tri nove mutacije I947F, I947H in S953K ter s tem v kasnejših eksperimentih zagotovili ustrezno ortogonalnost s proteini T14-3-3.

==== Načrtovanje dimerov T14-3-3 ====

Nove heterodimerne proteine so sestavili iz dveh monomernih enot, pri čemer je ena od teh predstavljala divji tip proteina T14-3-3, druga monomerna enota pa je vsebovala eno oz. dve mutaciji aminokislinskih ostankov, ki so ključni za vezavo proteinov CT52.

==== Načrtovanje tetramerov T14-3-3 ====

V naslednji fazi so načrtali tetramer proteina T14-3-3, ki se sicer v naravi pojavlja le v dimerni obliki. Takšni ogrodni proteini naj bi bili sposobni združiti štiri tarčne proteine CT52, poleg tega pa bi imeli številne funkcije. Med drugim bi delovali kot izboljšan sistem za sprožitev celične smrti in sistem za produkcijo ter dostavo bioloških zdravil, sodelovali pa bi naj tudi pri regulaciji sistema CRISPR/Cas9.

Pri načrtovanju so tetramere razdelili v dve skupini, in sicer v homotetramere, ki so sestavljeni iz štirih enakih monomernih enot divjega tipa proteina T14-3-3, ter v heterotetramere, ki vključujejo štiri različne monomere. V projektu so te monomerne enote predstavljali divji tip proteina T14-3-3 in tri mutirane oblike (T14-3-3-S71L-I72V, T14-3-3-W237R in T14-3-3-E19R).

Tetramere so zasnovali na podlagi povezovanja dveh dimernih enot preko povezovalne regije GGS10 z zaporedjem Gly-Gly-Ser, ki se desetkrat ponovi, tak tetramer pa na podlagi štirih vezavnih mest oz. žlebov omogoča vezavo in združevanje kar štirih tarčnih proteinov.

=== Poskusi in rezultati ===

==== Dimeri T14-3-3 ====

Funkcionalnost dimerov so analizirali s sistemom NanoLuc Luciferase. Gre za reporterski sistem, ki ga sestavljata dva različna in neaktivna fragmenta SmallBiT in LargeBiT. Proteini T14-3-3 omogočajo, da se ta posamezna fragmenta povežeta in s tem tvorita aktivno luciferazo NanoLuc, ki ob prisotnosti substrata furimazina emitira svetlobo [5].

V projektu so pripravili 10 različnih fragmentov. Fragmenta SmallBiT in LargeBiT so preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec posameznih variant proteina CT52 in te zapise vstavili v vektor pET28a. Po izražanju v E. coli so se povezani proteini ob prisotnosti fuzikokcina vezali na heterodimerne ogrodne proteine. S tem so posledično aktivirali sistem NanoLuc in omogočili emisijo bioluminiscenčne svetlobe z valovno dolžino 460 nm.

V prvi fazi so z merjenjem relativne intenzitete posameznih kompleksov dimernega ogrodnega proteina T14-3-3 in ustreznih vezavnih proteinov CT52 z mutacijami, ki so jih predvideli na podlagi predhodnega modeliranja, najprej preverili funkcionalnost in uspešnost povezovanja teh proteinov.

Pri analizi rezultatov so ugotovili, da je bila v primeru homodimera s povezanimi monomernimi enotami divjega tipa izmerjena intenziteta luminiscence bistveno manjša kot v večini ostalih primerov. Delca NanoBiT sta bila pri tem vezana na identična proteina CT52, zaradi česar je posledično lahko prišlo do vezave dveh delcev SmallBiT ali dveh delcev LargeBiT na en ogrodni dimerni protein. V primeru heterodimera T14-3-3 z mutacijo W237R se bioluminiscenca v primerjavi z negativno kontrolo ni povečala, kar nakazuje na to, da se interakcije med ogrodnim proteinom in proteinom CT52 niso vzpostavile. V ostalih primerih so heterodimeri z uvedenimi mutacijami S71L, S71L in I72V ter E19R dali visoke vrednosti bioluminiscence, kar dokazuje pravilno tvorbo kompleksa NanoLuc in s tem funkcionalnost ogrodnih proteinov.

V naslednji fazi so preverjali vpliv koncentracije ogrodnih proteinov pri tvorbi kompleksov. Pri višjih koncentracijah so pričakovali povečano vezavo CT52 in s tem uspešno dimerizacijo obeh delcev NanoBiT, posledično pa se je povečala tudi izmerjena intenziteta bioluminiscence. V primerih, ki so se v predhodni analizi heterodimerov izkazali za funkcionalne (mutacije S71L, S71L in I72V ter E19R), so tudi v tem eksperimentu ustrezali pričakovanim rezultatom, saj se je intenziteta bioluminiscence povečevala z višanjem koncentracije ogrodnih proteinov T14-3-3.

==== Tetrameri T14-3-3 ====

Skupina iGEM je načrtan tetramer poskušala izraziti in podrobno ovrednotiti z merjenjem kaspazne aktivnosti. Možnost povezovanja štirih proteinov na tetrameru T14-3-3 namreč omogoča regulacijo celične smrti, sprožitev tega procesa pa je odvisna od aktivacije prokaspaz-9, pri čemer posamezne prokaspaze dimerizirajo in s tem aktivirajo druga drugo.

V skupini so zato kaspazo-9 preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec proteina CT52, zapis ponovno vstavili v vektor pET28b in ga nato izrazili v bakterijah E. coli. Aktivnost kaspaz-9 so preučevali z uporabo fluorogenega substrata Ac-LEHD-AFC. Kaspaze-9 ta substrat razcepijo na nefluorescirajoči peptid in del, ki fluorescira, merjenje fluorescence pa tako po vezavi na ogrodni protein daje informacijo o aktivnosti kaspaz-9 in s tem posredno tudi o funkcionalnosti T14-3-3.

Člani skupine so želeli primerjati aktivnost dimerov in tetramerov ter ob tem preveriti tudi aplikacijo ogrodnih proteinov pri stikalu smrti. Pričakovali so, da bodo tetrameri učinkoviteje aktivirali kaspaze-9, saj na nek način kažejo večjo podobnost z apoptosomi, ki se v procesu apoptoze sestavijo v obliki septamera, poleg tega pa združevanje štirih hibridnih proteinov zagotovi višjo lokalno koncentracijo kaspaz-9 in posledično tudi hitrejšo ter bolj zanesljivo aktivacijo.

Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov). Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.

== Zaključek ==

Rezultati kažejo na to, da je ekipa iGEM svoj teoretični model pretvorila v uspešno delujoč in vitro sistem. Kljub temu, da so tetramer sintetizirali le na ravni DNA, pa nadaljnje raziskave in delo v tej smeri predstavljajo temelj za številne aplikacije na področju sintezne biologije, predvsem na področju regulacije proteinskih kompleksov.

Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.

== Viri ==

[1] Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011).

[2] van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001).

[3] Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009).

[4] Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007).

[5] Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016).

[6] 2016 iGEM team from Eindhoven University of Technology

----

Seminarji SB 2016/17

Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini

2017-01-02T12:48:56Z

Mojca Kostanjevec:

[http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

Ogrodni proteini, ki regulirajo in usmerjajo združevanje drugih proteinov v celici, igrajo izredno pomembno vlogo v celični signalizaciji. Ker interferirajo s številnimi drugimi proteini in tako regulirajo tudi transkripcijo pomembnih genov, se mnogi ogrodni proteini pogosto uporabljajo v sintezni biologiji.

== Ogrodni proteini 14-3-3 ==

Proteini 14-3-3 so ogrodni proteini, ki specifično vežejo motive s fosforiliranimi oblikami aminokislinskih ostankov serina in treonina v tarčnih proteinih. Obenem gre za družino proteinov, ki je močno evolucijsko ohranjena v vseh evkariontskih celicah, večina organizmov pa vsebuje več različnih, vendar strukturno dokaj podobnih izoform, ki navadno tvorijo homo- ter heterodimere. Takšna raznolikost izoform omogoča vezavo številnih interakcijskih partnerjev – do sedaj je bilo identificiranih več kot 200 signalnih proteinov [1].

Proteini 14-3-3 iz tega razloga sodelujejo pri velikem številu bioloških procesov, kot so npr. napredovanje in kontrola celičnega cikla, apoptoza, metabolizem, transkripcija in regulacija izražanja genov ter popravljanje napak DNA [2].

Funkcije proteinov 14-3-3 lahko uvrstimo v štiri glavna področja delovanja, in sicer je najbolj osnovna funkcija teh ogrodnih proteinov združevanje komponent posamezne signalne kaskade in s tem izboljšanje njene učinkovitosti. Povezava proteina 14-3-3 in tarčnega proteina na tak način stabilizira tudi proteinske komplekse, sproži pa lahko tudi konformacijske spremembe vezanega proteina in s tem regulira njegovo encimsko aktivnost. Še ena pomembna funkcija je lokalizacija signalnih molekul na specifičnem območju oz. mestu v znotrajceličnih organelih, kar je lahko pomembno za sintezo določenih intermediatov, proteini 14-3-3 pa so pomembni tudi iz stališča regulacije pozitivnih in negativnih povratnih zank. Ne nazadnje lahko objamejo tudi določeno regijo tarčnega proteina in tako preprečijo interakcije z drugimi molekulami (npr. z DNA ali proteini) ali pa vezan protein zaščitijo pred defosforilacijo in proteolitsko razgradnjo [1,2,3].

== Projekt ==

V ekipi iGEM iz TU Eindhoven so pri svojem raziskovalnem delu na področju sintezne biologije opisane lastnosti izkoristili v ta namen, da so razvili nove variante ogrodnih proteinov – heterodimerne ter tetramerne variante, s čimer so poskušali doseči regulacijo več različnih proteinskih interakcij.

Pri tem so uporabili ogrodni protein T14-3-3, ki izvira iz rastline Nicotiana plumbaginifolia (tobak). Ta dimerni protein interagira z 52 aminokislinskih ostankov dolgim proteinom CT52, ki v resnici predstavlja izoliran C-končni citosolni del H+-ATPaze iz plazemskih membran rastlinskih celic (aminokislinski ostanki 905-956). Interakcija T14-3-3 se vzpostavi s prostim C-koncem CT52 in je stabilizirana z dodatno vezavo majhne organske molekule fuzikokcina [4].

Funkcionalnost svojih konstruktov so nato analizirali s posebnimi reporterskimi sistemi. Na prost N-končni del proteina CT52 so vezali določene proteine, ki so pod vplivom fuzikokcina dimerizirali na ogrodnih proteinih in s tem dokazali funkcionalnost le-teh.

=== Modeliranje proteinov T14-3-3 in CT52 ===

Raziskovalci so nove variante ogrodnih proteinov zasnovali na podlagi računalniških modelov in pri tem uporabili program Rosetta software package. Na proteinu T14-3-3 so tako zasnovali štiri sete mutacij. Poleg že znane mutacije T14-3-3-E19R, ki je v sledečih eksperimentih služila kot pozitivna kontrola, so v posamezna zaporedja proteinov uvedli še računalniško predvidene mutacije S71L in I72V, S71L in W237R.

Komplementarne mutacije so vnesli tudi v zaporedje proteina CT52. Poleg že znane mutacije K943D so načrtali tri nove mutacije I947F, I947H in S953K ter s tem v kasnejših eksperimentih zagotovili ustrezno ortogonalnost s proteini T14-3-3.

==== Načrtovanje dimerov T14-3-3 ====

Nove heterodimerne proteine so sestavili iz dveh monomernih enot, pri čemer je ena od teh predstavljala divji tip proteina T14-3-3, druga monomerna enota pa je vsebovala eno oz. dve mutaciji aminokislinskih ostankov, ki so ključni za vezavo proteinov CT52.

==== Načrtovanje tetramerov T14-3-3 ====

V naslednji fazi so načrtali tetramer proteina T14-3-3, ki se sicer v naravi pojavlja le v dimerni obliki. Takšni ogrodni proteini naj bi bili sposobni združiti štiri tarčne proteine CT52, poleg tega pa bi imeli številne funkcije. Med drugim bi delovali kot izboljšan sistem za sprožitev celične smrti in sistem za produkcijo ter dostavo bioloških zdravil, sodelovali pa bi naj tudi pri regulaciji sistema CRISPR/Cas9.

Pri načrtovanju so tetramere razdelili v dve skupini, in sicer v homotetramere, ki so sestavljeni iz štirih enakih monomernih enot divjega tipa proteina T14-3-3, ter v heterotetramere, ki vključujejo štiri različne monomere. V projektu so te monomerne enote predstavljali divji tip proteina T14-3-3 in tri mutirane oblike (T14-3-3-S71L-I72V, T14-3-3-W237R in T14-3-3-E19R).

Tetramere so zasnovali na podlagi povezovanja dveh dimernih enot preko povezovalne regije GGS10 z zaporedjem Gly-Gly-Ser, ki se desetkrat ponovi, tak tetramer pa na podlagi štirih vezavnih mest oz. žlebov omogoča vezavo in združevanje kar štirih tarčnih proteinov.

=== Poskusi in rezultati ===

==== Dimeri T14-3-3 ====

Funkcionalnost dimerov so analizirali s sistemom NanoLuc Luciferase. Gre za reporterski sistem, ki ga sestavljata dva različna in neaktivna fragmenta SmallBiT in LargeBiT. Proteini T14-3-3 omogočajo, da se ta posamezna fragmenta povežeta in s tem tvorita aktivno luciferazo NanoLuc, ki ob prisotnosti substrata furimazina emitira svetlobo [5].

V projektu so pripravili 10 različnih fragmentov. Fragmenta SmallBiT in LargeBiT so preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec posameznih variant proteina CT52 in te zapise vstavili v vektor pET28a. Po izražanju v E. coli so se povezani proteini ob prisotnosti fuzikokcina vezali na heterodimerne ogrodne proteine. S tem so posledično aktivirali sistem NanoLuc in omogočili emisijo bioluminiscenčne svetlobe z valovno dolžino 460 nm.

V prvi fazi so z merjenjem relativne intenzitete posameznih kompleksov dimernega ogrodnega proteina T14-3-3 in ustreznih vezavnih proteinov CT52 z mutacijami, ki so jih predvideli na podlagi predhodnega modeliranja, najprej preverili funkcionalnost in uspešnost povezovanja teh proteinov.

Pri analizi rezultatov so ugotovili, da je bila v primeru homodimera s povezanimi monomernimi enotami divjega tipa izmerjena intenziteta luminiscence bistveno manjša kot v večini ostalih primerov. Delca NanoBiT sta bila pri tem vezana na identična proteina CT52, zaradi česar je posledično lahko prišlo do vezave dveh delcev SmallBiT ali dveh delcev LargeBiT na en ogrodni dimerni protein. V primeru heterodimera T14-3-3 z mutacijo W237R se bioluminiscenca v primerjavi z negativno kontrolo ni povečala, kar nakazuje na to, da se interakcije med ogrodnim proteinom in proteinom CT52 niso vzpostavile. V ostalih primerih so heterodimeri z uvedenimi mutacijami S71L, S71L in I72V ter E19R dali visoke vrednosti bioluminiscence, kar dokazuje pravilno tvorbo kompleksa NanoLuc in s tem funkcionalnost ogrodnih proteinov.

V naslednji fazi so preverjali vpliv koncentracije ogrodnih proteinov pri tvorbi kompleksov. Pri višjih koncentracijah so pričakovali povečano vezavo CT52 in s tem uspešno dimerizacijo obeh delcev NanoBiT, posledično pa se je povečala tudi izmerjena intenziteta bioluminiscence. V primerih, ki so se v predhodni analizi heterodimerov izkazali za funkcionalne (mutacije S71L, S71L in I72V ter E19R), so tudi v tem eksperimentu ustrezali pričakovanim rezultatom, saj se je intenziteta bioluminiscence povečevala z višanjem koncentracije ogrodnih proteinov T14-3-3.

==== Tetrameri T14-3-3 ====

Skupina iGEM je načrtan tetramer poskušala izraziti in podrobno ovrednotiti z merjenjem kaspazne aktivnosti. Možnost povezovanja štirih proteinov na tetrameru T14-3-3 namreč omogoča regulacijo celične smrti, sprožitev tega procesa pa je odvisna od aktivacije prokaspaz-9, pri čemer posamezne prokaspaze dimerizirajo in s tem aktivirajo druga drugo.

V skupini so zato kaspazo-9 preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec proteina CT52, zapis ponovno vstavili v vektor pET28b in ga nato izrazili v bakterijah E. coli. Aktivnost kaspaz-9 so preučevali z uporabo fluorogenega substrata Ac-LEHD-AFC. Kaspaze-9 ta substrat razcepijo na nefluorescirajoči peptid in del, ki fluorescira, merjenje fluorescence pa tako po vezavi na ogrodni protein daje informacijo o aktivnosti kaspaz-9 in s tem posredno tudi o funkcionalnosti T14-3-3.

Člani skupine so želeli primerjati aktivnost dimerov in tetramerov ter ob tem preveriti tudi aplikacijo ogrodnih proteinov pri stikalu smrti. Pričakovali so, da bodo tetrameri učinkoviteje aktivirali kaspaze-9, saj na nek način kažejo večjo podobnost z apoptosomi, ki se v procesu apoptoze sestavijo v obliki septamera, poleg tega pa združevanje štirih hibridnih proteinov zagotovi višjo lokalno koncentracijo kaspaz-9 in posledično tudi hitrejšo ter bolj zanesljivo aktivacijo.

Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov). Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.

== Zaključek ==

Rezultati kažejo na to, da je ekipa iGEM svoj teoretični model pretvorila v uspešno delujoč in vitro sistem. Kljub temu, da so tetramer sintetizirali le na ravni DNA, pa nadaljnje raziskave in delo v tej smeri predstavljajo temelj za številne aplikacije na področju sintezne biologije, predvsem na področju regulacije proteinskih kompleksov.

Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.

== Viri ==

1. Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011).

2. van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001).

3. Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009).

4. Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007).

5. Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016).

6. 2016 iGEM team from Eindhoven University of Technology

Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini

2017-01-02T12:48:28Z

Mojca Kostanjevec: /* Zaključek */

[http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

Ogrodni proteini, ki regulirajo in usmerjajo združevanje drugih proteinov v celici, igrajo izredno pomembno vlogo v celični signalizaciji. Ker interferirajo s številnimi drugimi proteini in tako regulirajo tudi transkripcijo pomembnih genov, se mnogi ogrodni proteini pogosto uporabljajo v sintezni biologiji.

== Ogrodni proteini 14-3-3 ==

Proteini 14-3-3 so ogrodni proteini, ki specifično vežejo motive s fosforiliranimi oblikami aminokislinskih ostankov serina in treonina v tarčnih proteinih. Obenem gre za družino proteinov, ki je močno evolucijsko ohranjena v vseh evkariontskih celicah, večina organizmov pa vsebuje več različnih, vendar strukturno dokaj podobnih izoform, ki navadno tvorijo homo- ter heterodimere. Takšna raznolikost izoform omogoča vezavo številnih interakcijskih partnerjev – do sedaj je bilo identificiranih več kot 200 signalnih proteinov [1].

Proteini 14-3-3 iz tega razloga sodelujejo pri velikem številu bioloških procesov, kot so npr. napredovanje in kontrola celičnega cikla, apoptoza, metabolizem, transkripcija in regulacija izražanja genov ter popravljanje napak DNA [2].

Funkcije proteinov 14-3-3 lahko uvrstimo v štiri glavna področja delovanja, in sicer je najbolj osnovna funkcija teh ogrodnih proteinov združevanje komponent posamezne signalne kaskade in s tem izboljšanje njene učinkovitosti. Povezava proteina 14-3-3 in tarčnega proteina na tak način stabilizira tudi proteinske komplekse, sproži pa lahko tudi konformacijske spremembe vezanega proteina in s tem regulira njegovo encimsko aktivnost. Še ena pomembna funkcija je lokalizacija signalnih molekul na specifičnem območju oz. mestu v znotrajceličnih organelih, kar je lahko pomembno za sintezo določenih intermediatov, proteini 14-3-3 pa so pomembni tudi iz stališča regulacije pozitivnih in negativnih povratnih zank. Ne nazadnje lahko objamejo tudi določeno regijo tarčnega proteina in tako preprečijo interakcije z drugimi molekulami (npr. z DNA ali proteini) ali pa vezan protein zaščitijo pred defosforilacijo in proteolitsko razgradnjo [1,2,3].

== Projekt ==

V ekipi iGEM iz TU Eindhoven so pri svojem raziskovalnem delu na področju sintezne biologije opisane lastnosti izkoristili v ta namen, da so razvili nove variante ogrodnih proteinov – heterodimerne ter tetramerne variante, s čimer so poskušali doseči regulacijo več različnih proteinskih interakcij.

Pri tem so uporabili ogrodni protein T14-3-3, ki izvira iz rastline Nicotiana plumbaginifolia (tobak). Ta dimerni protein interagira z 52 aminokislinskih ostankov dolgim proteinom CT52, ki v resnici predstavlja izoliran C-končni citosolni del H+-ATPaze iz plazemskih membran rastlinskih celic (aminokislinski ostanki 905-956). Interakcija T14-3-3 se vzpostavi s prostim C-koncem CT52 in je stabilizirana z dodatno vezavo majhne organske molekule fuzikokcina [4].

Funkcionalnost svojih konstruktov so nato analizirali s posebnimi reporterskimi sistemi. Na prost N-končni del proteina CT52 so vezali določene proteine, ki so pod vplivom fuzikokcina dimerizirali na ogrodnih proteinih in s tem dokazali funkcionalnost le-teh.

=== Modeliranje proteinov T14-3-3 in CT52 ===

Raziskovalci so nove variante ogrodnih proteinov zasnovali na podlagi računalniških modelov in pri tem uporabili program Rosetta software package. Na proteinu T14-3-3 so tako zasnovali štiri sete mutacij. Poleg že znane mutacije T14-3-3-E19R, ki je v sledečih eksperimentih služila kot pozitivna kontrola, so v posamezna zaporedja proteinov uvedli še računalniško predvidene mutacije S71L in I72V, S71L in W237R.

Komplementarne mutacije so vnesli tudi v zaporedje proteina CT52. Poleg že znane mutacije K943D so načrtali tri nove mutacije I947F, I947H in S953K ter s tem v kasnejših eksperimentih zagotovili ustrezno ortogonalnost s proteini T14-3-3.

==== Načrtovanje dimerov T14-3-3 ====

Nove heterodimerne proteine so sestavili iz dveh monomernih enot, pri čemer je ena od teh predstavljala divji tip proteina T14-3-3, druga monomerna enota pa je vsebovala eno oz. dve mutaciji aminokislinskih ostankov, ki so ključni za vezavo proteinov CT52.

==== Načrtovanje tetramerov T14-3-3 ====

V naslednji fazi so načrtali tetramer proteina T14-3-3, ki se sicer v naravi pojavlja le v dimerni obliki. Takšni ogrodni proteini naj bi bili sposobni združiti štiri tarčne proteine CT52, poleg tega pa bi imeli številne funkcije. Med drugim bi delovali kot izboljšan sistem za sprožitev celične smrti in sistem za produkcijo ter dostavo bioloških zdravil, sodelovali pa bi naj tudi pri regulaciji sistema CRISPR/Cas9.

Pri načrtovanju so tetramere razdelili v dve skupini, in sicer v homotetramere, ki so sestavljeni iz štirih enakih monomernih enot divjega tipa proteina T14-3-3, ter v heterotetramere, ki vključujejo štiri različne monomere. V projektu so te monomerne enote predstavljali divji tip proteina T14-3-3 in tri mutirane oblike (T14-3-3-S71L-I72V, T14-3-3-W237R in T14-3-3-E19R).

Tetramere so zasnovali na podlagi povezovanja dveh dimernih enot preko povezovalne regije GGS10 z zaporedjem Gly-Gly-Ser, ki se desetkrat ponovi, tak tetramer pa na podlagi štirih vezavnih mest oz. žlebov omogoča vezavo in združevanje kar štirih tarčnih proteinov.

=== Poskusi in rezultati ===

==== Dimeri T14-3-3 ====

Funkcionalnost dimerov so analizirali s sistemom NanoLuc Luciferase. Gre za reporterski sistem, ki ga sestavljata dva različna in neaktivna fragmenta SmallBiT in LargeBiT. Proteini T14-3-3 omogočajo, da se ta posamezna fragmenta povežeta in s tem tvorita aktivno luciferazo NanoLuc, ki ob prisotnosti substrata furimazina emitira svetlobo [5].

V projektu so pripravili 10 različnih fragmentov. Fragmenta SmallBiT in LargeBiT so preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec posameznih variant proteina CT52 in te zapise vstavili v vektor pET28a. Po izražanju v E. coli so se povezani proteini ob prisotnosti fuzikokcina vezali na heterodimerne ogrodne proteine. S tem so posledično aktivirali sistem NanoLuc in omogočili emisijo bioluminiscenčne svetlobe z valovno dolžino 460 nm.

V prvi fazi so z merjenjem relativne intenzitete posameznih kompleksov dimernega ogrodnega proteina T14-3-3 in ustreznih vezavnih proteinov CT52 z mutacijami, ki so jih predvideli na podlagi predhodnega modeliranja, najprej preverili funkcionalnost in uspešnost povezovanja teh proteinov.

Pri analizi rezultatov so ugotovili, da je bila v primeru homodimera s povezanimi monomernimi enotami divjega tipa izmerjena intenziteta luminiscence bistveno manjša kot v večini ostalih primerov. Delca NanoBiT sta bila pri tem vezana na identična proteina CT52, zaradi česar je posledično lahko prišlo do vezave dveh delcev SmallBiT ali dveh delcev LargeBiT na en ogrodni dimerni protein. V primeru heterodimera T14-3-3 z mutacijo W237R se bioluminiscenca v primerjavi z negativno kontrolo ni povečala, kar nakazuje na to, da se interakcije med ogrodnim proteinom in proteinom CT52 niso vzpostavile. V ostalih primerih so heterodimeri z uvedenimi mutacijami S71L, S71L in I72V ter E19R dali visoke vrednosti bioluminiscence, kar dokazuje pravilno tvorbo kompleksa NanoLuc in s tem funkcionalnost ogrodnih proteinov.

V naslednji fazi so preverjali vpliv koncentracije ogrodnih proteinov pri tvorbi kompleksov. Pri višjih koncentracijah so pričakovali povečano vezavo CT52 in s tem uspešno dimerizacijo obeh delcev NanoBiT, posledično pa se je povečala tudi izmerjena intenziteta bioluminiscence. V primerih, ki so se v predhodni analizi heterodimerov izkazali za funkcionalne (mutacije S71L, S71L in I72V ter E19R), so tudi v tem eksperimentu ustrezali pričakovanim rezultatom, saj se je intenziteta bioluminiscence povečevala z višanjem koncentracije ogrodnih proteinov T14-3-3.

==== Tetrameri T14-3-3 ====

Skupina iGEM je načrtan tetramer poskušala izraziti in podrobno ovrednotiti z merjenjem kaspazne aktivnosti. Možnost povezovanja štirih proteinov na tetrameru T14-3-3 namreč omogoča regulacijo celične smrti, sprožitev tega procesa pa je odvisna od aktivacije prokaspaz-9, pri čemer posamezne prokaspaze dimerizirajo in s tem aktivirajo druga drugo.

V skupini so zato kaspazo-9 preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec proteina CT52, zapis ponovno vstavili v vektor pET28b in ga nato izrazili v bakterijah E. coli. Aktivnost kaspaz-9 so preučevali z uporabo fluorogenega substrata Ac-LEHD-AFC. Kaspaze-9 ta substrat razcepijo na nefluorescirajoči peptid in del, ki fluorescira, merjenje fluorescence pa tako po vezavi na ogrodni protein daje informacijo o aktivnosti kaspaz-9 in s tem posredno tudi o funkcionalnosti T14-3-3.

Člani skupine so želeli primerjati aktivnost dimerov in tetramerov ter ob tem preveriti tudi aplikacijo ogrodnih proteinov pri stikalu smrti. Pričakovali so, da bodo tetrameri učinkoviteje aktivirali kaspaze-9, saj na nek način kažejo večjo podobnost z apoptosomi, ki se v procesu apoptoze sestavijo v obliki septamera, poleg tega pa združevanje štirih hibridnih proteinov zagotovi višjo lokalno koncentracijo kaspaz-9 in posledično tudi hitrejšo ter bolj zanesljivo aktivacijo.

Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov). Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.

== Zaključek ==

Rezultati kažejo na to, da je ekipa iGEM svoj teoretični model pretvorila v uspešno delujoč in vitro sistem. Kljub temu, da so tetramer sintetizirali le na ravni DNA, pa nadaljnje raziskave in delo v tej smeri predstavljajo temelj za številne aplikacije na področju sintezne biologije, predvsem na področju regulacije proteinskih kompleksov.

Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.

== Viri ==

1. Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011).
2. van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001).
3. Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009).
4. Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007).
5. Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016).
6. 2016 iGEM team from Eindhoven University of Technology

Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini

2017-01-02T12:47:30Z

Mojca Kostanjevec: /* Tetrameri T14-3-3 */

[http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

Ogrodni proteini, ki regulirajo in usmerjajo združevanje drugih proteinov v celici, igrajo izredno pomembno vlogo v celični signalizaciji. Ker interferirajo s številnimi drugimi proteini in tako regulirajo tudi transkripcijo pomembnih genov, se mnogi ogrodni proteini pogosto uporabljajo v sintezni biologiji.

== Ogrodni proteini 14-3-3 ==

Proteini 14-3-3 so ogrodni proteini, ki specifično vežejo motive s fosforiliranimi oblikami aminokislinskih ostankov serina in treonina v tarčnih proteinih. Obenem gre za družino proteinov, ki je močno evolucijsko ohranjena v vseh evkariontskih celicah, večina organizmov pa vsebuje več različnih, vendar strukturno dokaj podobnih izoform, ki navadno tvorijo homo- ter heterodimere. Takšna raznolikost izoform omogoča vezavo številnih interakcijskih partnerjev – do sedaj je bilo identificiranih več kot 200 signalnih proteinov [1].

Proteini 14-3-3 iz tega razloga sodelujejo pri velikem številu bioloških procesov, kot so npr. napredovanje in kontrola celičnega cikla, apoptoza, metabolizem, transkripcija in regulacija izražanja genov ter popravljanje napak DNA [2].

Funkcije proteinov 14-3-3 lahko uvrstimo v štiri glavna področja delovanja, in sicer je najbolj osnovna funkcija teh ogrodnih proteinov združevanje komponent posamezne signalne kaskade in s tem izboljšanje njene učinkovitosti. Povezava proteina 14-3-3 in tarčnega proteina na tak način stabilizira tudi proteinske komplekse, sproži pa lahko tudi konformacijske spremembe vezanega proteina in s tem regulira njegovo encimsko aktivnost. Še ena pomembna funkcija je lokalizacija signalnih molekul na specifičnem območju oz. mestu v znotrajceličnih organelih, kar je lahko pomembno za sintezo določenih intermediatov, proteini 14-3-3 pa so pomembni tudi iz stališča regulacije pozitivnih in negativnih povratnih zank. Ne nazadnje lahko objamejo tudi določeno regijo tarčnega proteina in tako preprečijo interakcije z drugimi molekulami (npr. z DNA ali proteini) ali pa vezan protein zaščitijo pred defosforilacijo in proteolitsko razgradnjo [1,2,3].

== Projekt ==

V ekipi iGEM iz TU Eindhoven so pri svojem raziskovalnem delu na področju sintezne biologije opisane lastnosti izkoristili v ta namen, da so razvili nove variante ogrodnih proteinov – heterodimerne ter tetramerne variante, s čimer so poskušali doseči regulacijo več različnih proteinskih interakcij.

Pri tem so uporabili ogrodni protein T14-3-3, ki izvira iz rastline Nicotiana plumbaginifolia (tobak). Ta dimerni protein interagira z 52 aminokislinskih ostankov dolgim proteinom CT52, ki v resnici predstavlja izoliran C-končni citosolni del H+-ATPaze iz plazemskih membran rastlinskih celic (aminokislinski ostanki 905-956). Interakcija T14-3-3 se vzpostavi s prostim C-koncem CT52 in je stabilizirana z dodatno vezavo majhne organske molekule fuzikokcina [4].

Funkcionalnost svojih konstruktov so nato analizirali s posebnimi reporterskimi sistemi. Na prost N-končni del proteina CT52 so vezali določene proteine, ki so pod vplivom fuzikokcina dimerizirali na ogrodnih proteinih in s tem dokazali funkcionalnost le-teh.

=== Modeliranje proteinov T14-3-3 in CT52 ===

Raziskovalci so nove variante ogrodnih proteinov zasnovali na podlagi računalniških modelov in pri tem uporabili program Rosetta software package. Na proteinu T14-3-3 so tako zasnovali štiri sete mutacij. Poleg že znane mutacije T14-3-3-E19R, ki je v sledečih eksperimentih služila kot pozitivna kontrola, so v posamezna zaporedja proteinov uvedli še računalniško predvidene mutacije S71L in I72V, S71L in W237R.

Komplementarne mutacije so vnesli tudi v zaporedje proteina CT52. Poleg že znane mutacije K943D so načrtali tri nove mutacije I947F, I947H in S953K ter s tem v kasnejših eksperimentih zagotovili ustrezno ortogonalnost s proteini T14-3-3.

==== Načrtovanje dimerov T14-3-3 ====

Nove heterodimerne proteine so sestavili iz dveh monomernih enot, pri čemer je ena od teh predstavljala divji tip proteina T14-3-3, druga monomerna enota pa je vsebovala eno oz. dve mutaciji aminokislinskih ostankov, ki so ključni za vezavo proteinov CT52.

==== Načrtovanje tetramerov T14-3-3 ====

V naslednji fazi so načrtali tetramer proteina T14-3-3, ki se sicer v naravi pojavlja le v dimerni obliki. Takšni ogrodni proteini naj bi bili sposobni združiti štiri tarčne proteine CT52, poleg tega pa bi imeli številne funkcije. Med drugim bi delovali kot izboljšan sistem za sprožitev celične smrti in sistem za produkcijo ter dostavo bioloških zdravil, sodelovali pa bi naj tudi pri regulaciji sistema CRISPR/Cas9.

Pri načrtovanju so tetramere razdelili v dve skupini, in sicer v homotetramere, ki so sestavljeni iz štirih enakih monomernih enot divjega tipa proteina T14-3-3, ter v heterotetramere, ki vključujejo štiri različne monomere. V projektu so te monomerne enote predstavljali divji tip proteina T14-3-3 in tri mutirane oblike (T14-3-3-S71L-I72V, T14-3-3-W237R in T14-3-3-E19R).

Tetramere so zasnovali na podlagi povezovanja dveh dimernih enot preko povezovalne regije GGS10 z zaporedjem Gly-Gly-Ser, ki se desetkrat ponovi, tak tetramer pa na podlagi štirih vezavnih mest oz. žlebov omogoča vezavo in združevanje kar štirih tarčnih proteinov.

=== Poskusi in rezultati ===

==== Dimeri T14-3-3 ====

Funkcionalnost dimerov so analizirali s sistemom NanoLuc Luciferase. Gre za reporterski sistem, ki ga sestavljata dva različna in neaktivna fragmenta SmallBiT in LargeBiT. Proteini T14-3-3 omogočajo, da se ta posamezna fragmenta povežeta in s tem tvorita aktivno luciferazo NanoLuc, ki ob prisotnosti substrata furimazina emitira svetlobo [5].

V projektu so pripravili 10 različnih fragmentov. Fragmenta SmallBiT in LargeBiT so preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec posameznih variant proteina CT52 in te zapise vstavili v vektor pET28a. Po izražanju v E. coli so se povezani proteini ob prisotnosti fuzikokcina vezali na heterodimerne ogrodne proteine. S tem so posledično aktivirali sistem NanoLuc in omogočili emisijo bioluminiscenčne svetlobe z valovno dolžino 460 nm.

V prvi fazi so z merjenjem relativne intenzitete posameznih kompleksov dimernega ogrodnega proteina T14-3-3 in ustreznih vezavnih proteinov CT52 z mutacijami, ki so jih predvideli na podlagi predhodnega modeliranja, najprej preverili funkcionalnost in uspešnost povezovanja teh proteinov.

Pri analizi rezultatov so ugotovili, da je bila v primeru homodimera s povezanimi monomernimi enotami divjega tipa izmerjena intenziteta luminiscence bistveno manjša kot v večini ostalih primerov. Delca NanoBiT sta bila pri tem vezana na identična proteina CT52, zaradi česar je posledično lahko prišlo do vezave dveh delcev SmallBiT ali dveh delcev LargeBiT na en ogrodni dimerni protein. V primeru heterodimera T14-3-3 z mutacijo W237R se bioluminiscenca v primerjavi z negativno kontrolo ni povečala, kar nakazuje na to, da se interakcije med ogrodnim proteinom in proteinom CT52 niso vzpostavile. V ostalih primerih so heterodimeri z uvedenimi mutacijami S71L, S71L in I72V ter E19R dali visoke vrednosti bioluminiscence, kar dokazuje pravilno tvorbo kompleksa NanoLuc in s tem funkcionalnost ogrodnih proteinov.

V naslednji fazi so preverjali vpliv koncentracije ogrodnih proteinov pri tvorbi kompleksov. Pri višjih koncentracijah so pričakovali povečano vezavo CT52 in s tem uspešno dimerizacijo obeh delcev NanoBiT, posledično pa se je povečala tudi izmerjena intenziteta bioluminiscence. V primerih, ki so se v predhodni analizi heterodimerov izkazali za funkcionalne (mutacije S71L, S71L in I72V ter E19R), so tudi v tem eksperimentu ustrezali pričakovanim rezultatom, saj se je intenziteta bioluminiscence povečevala z višanjem koncentracije ogrodnih proteinov T14-3-3.

==== Tetrameri T14-3-3 ====

Skupina iGEM je načrtan tetramer poskušala izraziti in podrobno ovrednotiti z merjenjem kaspazne aktivnosti. Možnost povezovanja štirih proteinov na tetrameru T14-3-3 namreč omogoča regulacijo celične smrti, sprožitev tega procesa pa je odvisna od aktivacije prokaspaz-9, pri čemer posamezne prokaspaze dimerizirajo in s tem aktivirajo druga drugo.

V skupini so zato kaspazo-9 preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec proteina CT52, zapis ponovno vstavili v vektor pET28b in ga nato izrazili v bakterijah E. coli. Aktivnost kaspaz-9 so preučevali z uporabo fluorogenega substrata Ac-LEHD-AFC. Kaspaze-9 ta substrat razcepijo na nefluorescirajoči peptid in del, ki fluorescira, merjenje fluorescence pa tako po vezavi na ogrodni protein daje informacijo o aktivnosti kaspaz-9 in s tem posredno tudi o funkcionalnosti T14-3-3.

Člani skupine so želeli primerjati aktivnost dimerov in tetramerov ter ob tem preveriti tudi aplikacijo ogrodnih proteinov pri stikalu smrti. Pričakovali so, da bodo tetrameri učinkoviteje aktivirali kaspaze-9, saj na nek način kažejo večjo podobnost z apoptosomi, ki se v procesu apoptoze sestavijo v obliki septamera, poleg tega pa združevanje štirih hibridnih proteinov zagotovi višjo lokalno koncentracijo kaspaz-9 in posledično tudi hitrejšo ter bolj zanesljivo aktivacijo.

Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov). Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.

== Zaključek ==

Rezultati kažejo na to, da je ekipa iGEM svoj teoretični model pretvorila v uspešno delujoč in vitro sistem. Kljub temu, da so tetramer sintetizirali le na ravni DNA, pa nadaljnje raziskave in delo v tej smeri predstavljajo temelj za številne aplikacije na področju sintezne biologije, predvsem na področju regulacije proteinskih kompleksov.

Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.

== Viri ==

1. Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011).
2. van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001).
3. Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009).
4. Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007).
5. Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016).
6. 2016 iGEM team from Eindhoven University of Technology

Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini

2017-01-02T12:46:42Z

Mojca Kostanjevec: /* Dimeri T14-3-3 */

[http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

Ogrodni proteini, ki regulirajo in usmerjajo združevanje drugih proteinov v celici, igrajo izredno pomembno vlogo v celični signalizaciji. Ker interferirajo s številnimi drugimi proteini in tako regulirajo tudi transkripcijo pomembnih genov, se mnogi ogrodni proteini pogosto uporabljajo v sintezni biologiji.

== Ogrodni proteini 14-3-3 ==

Proteini 14-3-3 so ogrodni proteini, ki specifično vežejo motive s fosforiliranimi oblikami aminokislinskih ostankov serina in treonina v tarčnih proteinih. Obenem gre za družino proteinov, ki je močno evolucijsko ohranjena v vseh evkariontskih celicah, večina organizmov pa vsebuje več različnih, vendar strukturno dokaj podobnih izoform, ki navadno tvorijo homo- ter heterodimere. Takšna raznolikost izoform omogoča vezavo številnih interakcijskih partnerjev – do sedaj je bilo identificiranih več kot 200 signalnih proteinov [1].

Proteini 14-3-3 iz tega razloga sodelujejo pri velikem številu bioloških procesov, kot so npr. napredovanje in kontrola celičnega cikla, apoptoza, metabolizem, transkripcija in regulacija izražanja genov ter popravljanje napak DNA [2].

Funkcije proteinov 14-3-3 lahko uvrstimo v štiri glavna področja delovanja, in sicer je najbolj osnovna funkcija teh ogrodnih proteinov združevanje komponent posamezne signalne kaskade in s tem izboljšanje njene učinkovitosti. Povezava proteina 14-3-3 in tarčnega proteina na tak način stabilizira tudi proteinske komplekse, sproži pa lahko tudi konformacijske spremembe vezanega proteina in s tem regulira njegovo encimsko aktivnost. Še ena pomembna funkcija je lokalizacija signalnih molekul na specifičnem območju oz. mestu v znotrajceličnih organelih, kar je lahko pomembno za sintezo določenih intermediatov, proteini 14-3-3 pa so pomembni tudi iz stališča regulacije pozitivnih in negativnih povratnih zank. Ne nazadnje lahko objamejo tudi določeno regijo tarčnega proteina in tako preprečijo interakcije z drugimi molekulami (npr. z DNA ali proteini) ali pa vezan protein zaščitijo pred defosforilacijo in proteolitsko razgradnjo [1,2,3].

== Projekt ==

V ekipi iGEM iz TU Eindhoven so pri svojem raziskovalnem delu na področju sintezne biologije opisane lastnosti izkoristili v ta namen, da so razvili nove variante ogrodnih proteinov – heterodimerne ter tetramerne variante, s čimer so poskušali doseči regulacijo več različnih proteinskih interakcij.

Pri tem so uporabili ogrodni protein T14-3-3, ki izvira iz rastline Nicotiana plumbaginifolia (tobak). Ta dimerni protein interagira z 52 aminokislinskih ostankov dolgim proteinom CT52, ki v resnici predstavlja izoliran C-končni citosolni del H+-ATPaze iz plazemskih membran rastlinskih celic (aminokislinski ostanki 905-956). Interakcija T14-3-3 se vzpostavi s prostim C-koncem CT52 in je stabilizirana z dodatno vezavo majhne organske molekule fuzikokcina [4].

Funkcionalnost svojih konstruktov so nato analizirali s posebnimi reporterskimi sistemi. Na prost N-končni del proteina CT52 so vezali določene proteine, ki so pod vplivom fuzikokcina dimerizirali na ogrodnih proteinih in s tem dokazali funkcionalnost le-teh.

=== Modeliranje proteinov T14-3-3 in CT52 ===

Raziskovalci so nove variante ogrodnih proteinov zasnovali na podlagi računalniških modelov in pri tem uporabili program Rosetta software package. Na proteinu T14-3-3 so tako zasnovali štiri sete mutacij. Poleg že znane mutacije T14-3-3-E19R, ki je v sledečih eksperimentih služila kot pozitivna kontrola, so v posamezna zaporedja proteinov uvedli še računalniško predvidene mutacije S71L in I72V, S71L in W237R.

Komplementarne mutacije so vnesli tudi v zaporedje proteina CT52. Poleg že znane mutacije K943D so načrtali tri nove mutacije I947F, I947H in S953K ter s tem v kasnejših eksperimentih zagotovili ustrezno ortogonalnost s proteini T14-3-3.

==== Načrtovanje dimerov T14-3-3 ====

Nove heterodimerne proteine so sestavili iz dveh monomernih enot, pri čemer je ena od teh predstavljala divji tip proteina T14-3-3, druga monomerna enota pa je vsebovala eno oz. dve mutaciji aminokislinskih ostankov, ki so ključni za vezavo proteinov CT52.

==== Načrtovanje tetramerov T14-3-3 ====

V naslednji fazi so načrtali tetramer proteina T14-3-3, ki se sicer v naravi pojavlja le v dimerni obliki. Takšni ogrodni proteini naj bi bili sposobni združiti štiri tarčne proteine CT52, poleg tega pa bi imeli številne funkcije. Med drugim bi delovali kot izboljšan sistem za sprožitev celične smrti in sistem za produkcijo ter dostavo bioloških zdravil, sodelovali pa bi naj tudi pri regulaciji sistema CRISPR/Cas9.

Pri načrtovanju so tetramere razdelili v dve skupini, in sicer v homotetramere, ki so sestavljeni iz štirih enakih monomernih enot divjega tipa proteina T14-3-3, ter v heterotetramere, ki vključujejo štiri različne monomere. V projektu so te monomerne enote predstavljali divji tip proteina T14-3-3 in tri mutirane oblike (T14-3-3-S71L-I72V, T14-3-3-W237R in T14-3-3-E19R).

Tetramere so zasnovali na podlagi povezovanja dveh dimernih enot preko povezovalne regije GGS10 z zaporedjem Gly-Gly-Ser, ki se desetkrat ponovi, tak tetramer pa na podlagi štirih vezavnih mest oz. žlebov omogoča vezavo in združevanje kar štirih tarčnih proteinov.

=== Poskusi in rezultati ===

==== Dimeri T14-3-3 ====

Funkcionalnost dimerov so analizirali s sistemom NanoLuc Luciferase. Gre za reporterski sistem, ki ga sestavljata dva različna in neaktivna fragmenta SmallBiT in LargeBiT. Proteini T14-3-3 omogočajo, da se ta posamezna fragmenta povežeta in s tem tvorita aktivno luciferazo NanoLuc, ki ob prisotnosti substrata furimazina emitira svetlobo [5].

V projektu so pripravili 10 različnih fragmentov. Fragmenta SmallBiT in LargeBiT so preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec posameznih variant proteina CT52 in te zapise vstavili v vektor pET28a. Po izražanju v E. coli so se povezani proteini ob prisotnosti fuzikokcina vezali na heterodimerne ogrodne proteine. S tem so posledično aktivirali sistem NanoLuc in omogočili emisijo bioluminiscenčne svetlobe z valovno dolžino 460 nm.

V prvi fazi so z merjenjem relativne intenzitete posameznih kompleksov dimernega ogrodnega proteina T14-3-3 in ustreznih vezavnih proteinov CT52 z mutacijami, ki so jih predvideli na podlagi predhodnega modeliranja, najprej preverili funkcionalnost in uspešnost povezovanja teh proteinov.

Pri analizi rezultatov so ugotovili, da je bila v primeru homodimera s povezanimi monomernimi enotami divjega tipa izmerjena intenziteta luminiscence bistveno manjša kot v večini ostalih primerov. Delca NanoBiT sta bila pri tem vezana na identična proteina CT52, zaradi česar je posledično lahko prišlo do vezave dveh delcev SmallBiT ali dveh delcev LargeBiT na en ogrodni dimerni protein. V primeru heterodimera T14-3-3 z mutacijo W237R se bioluminiscenca v primerjavi z negativno kontrolo ni povečala, kar nakazuje na to, da se interakcije med ogrodnim proteinom in proteinom CT52 niso vzpostavile. V ostalih primerih so heterodimeri z uvedenimi mutacijami S71L, S71L in I72V ter E19R dali visoke vrednosti bioluminiscence, kar dokazuje pravilno tvorbo kompleksa NanoLuc in s tem funkcionalnost ogrodnih proteinov.

V naslednji fazi so preverjali vpliv koncentracije ogrodnih proteinov pri tvorbi kompleksov. Pri višjih koncentracijah so pričakovali povečano vezavo CT52 in s tem uspešno dimerizacijo obeh delcev NanoBiT, posledično pa se je povečala tudi izmerjena intenziteta bioluminiscence. V primerih, ki so se v predhodni analizi heterodimerov izkazali za funkcionalne (mutacije S71L, S71L in I72V ter E19R), so tudi v tem eksperimentu ustrezali pričakovanim rezultatom, saj se je intenziteta bioluminiscence povečevala z višanjem koncentracije ogrodnih proteinov T14-3-3.

==== Tetrameri T14-3-3 ====

Skupina iGEM je načrtan tetramer poskušala izraziti in podrobno ovrednotiti z merjenjem kaspazne aktivnosti. Možnost povezovanja štirih proteinov na tetrameru T14-3-3 namreč omogoča regulacijo celične smrti, sprožitev tega procesa pa je odvisna od aktivacije prokaspaz-9, pri čemer posamezne prokaspaze dimerizirajo in s tem aktivirajo druga drugo.

V skupini so zato kaspazo-9 preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec proteina CT52, zapis ponovno vstavili v vektor pET28b in ga nato izrazili v bakterijah E. coli. Aktivnost kaspaz-9 so preučevali z uporabo fluorogenega substrata Ac-LEHD-AFC. Kaspaze-9 ta substrat razcepijo na nefluorescirajoči peptid in del, ki fluorescira, merjenje fluorescence pa tako po vezavi na ogrodni protein daje informacijo o aktivnosti kaspaz-9 in s tem posredno tudi o funkcionalnosti T14-3-3.

Člani skupine so želeli primerjati aktivnost dimerov in tetramerov ter ob tem preveriti tudi aplikacijo ogrodnih proteinov pri stikalu smrti. Pričakovali so, da bodo tetrameri učinkoviteje aktivirali kaspaze-9, saj na nek način kažejo večjo podobnost z apoptosomi, ki se v procesu apoptoze sestavijo v obliki septamera, poleg tega pa združevanje štirih hibridnih proteinov zagotovi višjo lokalno koncentracijo kaspaz-9 in posledično tudi hitrejšo ter bolj zanesljivo aktivacijo.

Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov).

Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.

== Zaključek ==

Rezultati kažejo na to, da je ekipa iGEM svoj teoretični model pretvorila v uspešno delujoč in vitro sistem. Kljub temu, da so tetramer sintetizirali le na ravni DNA, pa nadaljnje raziskave in delo v tej smeri predstavljajo temelj za številne aplikacije na področju sintezne biologije, predvsem na področju regulacije proteinskih kompleksov.

Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.

== Viri ==

1. Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011).
2. van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001).
3. Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009).
4. Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007).
5. Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016).
6. 2016 iGEM team from Eindhoven University of Technology

Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini

2017-01-02T12:45:30Z

Mojca Kostanjevec:

[http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

Ogrodni proteini, ki regulirajo in usmerjajo združevanje drugih proteinov v celici, igrajo izredno pomembno vlogo v celični signalizaciji. Ker interferirajo s številnimi drugimi proteini in tako regulirajo tudi transkripcijo pomembnih genov, se mnogi ogrodni proteini pogosto uporabljajo v sintezni biologiji.

== Ogrodni proteini 14-3-3 ==

Proteini 14-3-3 so ogrodni proteini, ki specifično vežejo motive s fosforiliranimi oblikami aminokislinskih ostankov serina in treonina v tarčnih proteinih. Obenem gre za družino proteinov, ki je močno evolucijsko ohranjena v vseh evkariontskih celicah, večina organizmov pa vsebuje več različnih, vendar strukturno dokaj podobnih izoform, ki navadno tvorijo homo- ter heterodimere. Takšna raznolikost izoform omogoča vezavo številnih interakcijskih partnerjev – do sedaj je bilo identificiranih več kot 200 signalnih proteinov [1].

Proteini 14-3-3 iz tega razloga sodelujejo pri velikem številu bioloških procesov, kot so npr. napredovanje in kontrola celičnega cikla, apoptoza, metabolizem, transkripcija in regulacija izražanja genov ter popravljanje napak DNA [2].

Funkcije proteinov 14-3-3 lahko uvrstimo v štiri glavna področja delovanja, in sicer je najbolj osnovna funkcija teh ogrodnih proteinov združevanje komponent posamezne signalne kaskade in s tem izboljšanje njene učinkovitosti. Povezava proteina 14-3-3 in tarčnega proteina na tak način stabilizira tudi proteinske komplekse, sproži pa lahko tudi konformacijske spremembe vezanega proteina in s tem regulira njegovo encimsko aktivnost. Še ena pomembna funkcija je lokalizacija signalnih molekul na specifičnem območju oz. mestu v znotrajceličnih organelih, kar je lahko pomembno za sintezo določenih intermediatov, proteini 14-3-3 pa so pomembni tudi iz stališča regulacije pozitivnih in negativnih povratnih zank. Ne nazadnje lahko objamejo tudi določeno regijo tarčnega proteina in tako preprečijo interakcije z drugimi molekulami (npr. z DNA ali proteini) ali pa vezan protein zaščitijo pred defosforilacijo in proteolitsko razgradnjo [1,2,3].

== Projekt ==

V ekipi iGEM iz TU Eindhoven so pri svojem raziskovalnem delu na področju sintezne biologije opisane lastnosti izkoristili v ta namen, da so razvili nove variante ogrodnih proteinov – heterodimerne ter tetramerne variante, s čimer so poskušali doseči regulacijo več različnih proteinskih interakcij.

Pri tem so uporabili ogrodni protein T14-3-3, ki izvira iz rastline Nicotiana plumbaginifolia (tobak). Ta dimerni protein interagira z 52 aminokislinskih ostankov dolgim proteinom CT52, ki v resnici predstavlja izoliran C-končni citosolni del H+-ATPaze iz plazemskih membran rastlinskih celic (aminokislinski ostanki 905-956). Interakcija T14-3-3 se vzpostavi s prostim C-koncem CT52 in je stabilizirana z dodatno vezavo majhne organske molekule fuzikokcina [4].

Funkcionalnost svojih konstruktov so nato analizirali s posebnimi reporterskimi sistemi. Na prost N-končni del proteina CT52 so vezali določene proteine, ki so pod vplivom fuzikokcina dimerizirali na ogrodnih proteinih in s tem dokazali funkcionalnost le-teh.

=== Modeliranje proteinov T14-3-3 in CT52 ===

Raziskovalci so nove variante ogrodnih proteinov zasnovali na podlagi računalniških modelov in pri tem uporabili program Rosetta software package. Na proteinu T14-3-3 so tako zasnovali štiri sete mutacij. Poleg že znane mutacije T14-3-3-E19R, ki je v sledečih eksperimentih služila kot pozitivna kontrola, so v posamezna zaporedja proteinov uvedli še računalniško predvidene mutacije S71L in I72V, S71L in W237R.

Komplementarne mutacije so vnesli tudi v zaporedje proteina CT52. Poleg že znane mutacije K943D so načrtali tri nove mutacije I947F, I947H in S953K ter s tem v kasnejših eksperimentih zagotovili ustrezno ortogonalnost s proteini T14-3-3.

==== Načrtovanje dimerov T14-3-3 ====

Nove heterodimerne proteine so sestavili iz dveh monomernih enot, pri čemer je ena od teh predstavljala divji tip proteina T14-3-3, druga monomerna enota pa je vsebovala eno oz. dve mutaciji aminokislinskih ostankov, ki so ključni za vezavo proteinov CT52.

==== Načrtovanje tetramerov T14-3-3 ====

V naslednji fazi so načrtali tetramer proteina T14-3-3, ki se sicer v naravi pojavlja le v dimerni obliki. Takšni ogrodni proteini naj bi bili sposobni združiti štiri tarčne proteine CT52, poleg tega pa bi imeli številne funkcije. Med drugim bi delovali kot izboljšan sistem za sprožitev celične smrti in sistem za produkcijo ter dostavo bioloških zdravil, sodelovali pa bi naj tudi pri regulaciji sistema CRISPR/Cas9.

Pri načrtovanju so tetramere razdelili v dve skupini, in sicer v homotetramere, ki so sestavljeni iz štirih enakih monomernih enot divjega tipa proteina T14-3-3, ter v heterotetramere, ki vključujejo štiri različne monomere. V projektu so te monomerne enote predstavljali divji tip proteina T14-3-3 in tri mutirane oblike (T14-3-3-S71L-I72V, T14-3-3-W237R in T14-3-3-E19R).

Tetramere so zasnovali na podlagi povezovanja dveh dimernih enot preko povezovalne regije GGS10 z zaporedjem Gly-Gly-Ser, ki se desetkrat ponovi, tak tetramer pa na podlagi štirih vezavnih mest oz. žlebov omogoča vezavo in združevanje kar štirih tarčnih proteinov.

=== Poskusi in rezultati ===

==== Dimeri T14-3-3 ====

Funkcionalnost dimerov so analizirali s sistemom NanoLuc Luciferase. Gre za reporterski sistem, ki ga sestavljata dva različna in neaktivna fragmenta SmallBiT in LargeBiT. Proteini T14-3-3 omogočajo, da se ta posamezna fragmenta povežeta in s tem tvorita aktivno luciferazo NanoLuc, ki ob prisotnosti substrata furimazina emitira svetlobo [5].

V projektu so pripravili 10 različnih fragmentov. Fragmenta SmallBiT in LargeBiT so preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec posameznih variant proteina CT52 in te zapise vstavili v vektor pET28a. Po izražanju v E. coli so se povezani proteini ob prisotnosti fuzikokcina vezali na heterodimerne ogrodne proteine. S tem so posledično aktivirali sistem NanoLuc in omogočili emisijo bioluminiscenčne svetlobe z valovno dolžino 460 nm.

V prvi fazi so z merjenjem relativne intenzitete posameznih kompleksov dimernega ogrodnega proteina T14-3-3 in ustreznih vezavnih proteinov CT52 z mutacijami, ki so jih predvideli na podlagi predhodnega modeliranja, najprej preverili funkcionalnost in uspešnost povezovanja teh proteinov.

Pri analizi rezultatov so ugotovili, da je bila v primeru homodimera s povezanimi monomernimi enotami divjega tipa izmerjena intenziteta luminiscence bistveno manjša kot v večini ostalih primerov. Delca NanoBiT sta bila pri tem vezana na identična proteina CT52, zaradi česar je posledično lahko prišlo do vezave dveh delcev SmallBiT ali dveh delcev LargeBiT na en ogrodni dimerni protein.

V primeru heterodimera T14-3-3 z mutacijo W237R se bioluminiscenca v primerjavi z negativno kontrolo ni povečala, kar nakazuje na to, da se interakcije med ogrodnim proteinom in proteinom CT52 niso vzpostavile. V ostalih primerih so heterodimeri z uvedenimi mutacijami S71L, S71L in I72V ter E19R dali visoke vrednosti bioluminiscence, kar dokazuje pravilno tvorbo kompleksa NanoLuc in s tem funkcionalnost ogrodnih proteinov.

V naslednji fazi so preverjali vpliv koncentracije ogrodnih proteinov pri tvorbi kompleksov. Pri višjih koncentracijah so pričakovali povečano vezavo CT52 in s tem uspešno dimerizacijo obeh delcev NanoBiT, posledično pa se je povečala tudi izmerjena intenziteta bioluminiscence. V primerih, ki so se v predhodni analizi heterodimerov izkazali za funkcionalne (mutacije S71L, S71L in I72V ter E19R), so tudi v tem eksperimentu ustrezali pričakovanim rezultatom, saj se je intenziteta bioluminiscence povečevala z višanjem koncentracije ogrodnih proteinov T14-3-3.

==== Tetrameri T14-3-3 ====

Skupina iGEM je načrtan tetramer poskušala izraziti in podrobno ovrednotiti z merjenjem kaspazne aktivnosti. Možnost povezovanja štirih proteinov na tetrameru T14-3-3 namreč omogoča regulacijo celične smrti, sprožitev tega procesa pa je odvisna od aktivacije prokaspaz-9, pri čemer posamezne prokaspaze dimerizirajo in s tem aktivirajo druga drugo.

V skupini so zato kaspazo-9 preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec proteina CT52, zapis ponovno vstavili v vektor pET28b in ga nato izrazili v bakterijah E. coli. Aktivnost kaspaz-9 so preučevali z uporabo fluorogenega substrata Ac-LEHD-AFC. Kaspaze-9 ta substrat razcepijo na nefluorescirajoči peptid in del, ki fluorescira, merjenje fluorescence pa tako po vezavi na ogrodni protein daje informacijo o aktivnosti kaspaz-9 in s tem posredno tudi o funkcionalnosti T14-3-3.

Člani skupine so želeli primerjati aktivnost dimerov in tetramerov ter ob tem preveriti tudi aplikacijo ogrodnih proteinov pri stikalu smrti. Pričakovali so, da bodo tetrameri učinkoviteje aktivirali kaspaze-9, saj na nek način kažejo večjo podobnost z apoptosomi, ki se v procesu apoptoze sestavijo v obliki septamera, poleg tega pa združevanje štirih hibridnih proteinov zagotovi višjo lokalno koncentracijo kaspaz-9 in posledično tudi hitrejšo ter bolj zanesljivo aktivacijo.

Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov).

Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.

== Zaključek ==

Rezultati kažejo na to, da je ekipa iGEM svoj teoretični model pretvorila v uspešno delujoč in vitro sistem. Kljub temu, da so tetramer sintetizirali le na ravni DNA, pa nadaljnje raziskave in delo v tej smeri predstavljajo temelj za številne aplikacije na področju sintezne biologije, predvsem na področju regulacije proteinskih kompleksov.

Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.

== Viri ==

1. Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011).
2. van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001).
3. Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009).
4. Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007).
5. Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016).
6. 2016 iGEM team from Eindhoven University of Technology

Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini

2017-01-02T12:44:45Z

Mojca Kostanjevec:

[http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

Ogrodni proteini, ki regulirajo in usmerjajo združevanje drugih proteinov v celici, igrajo izredno pomembno vlogo v celični signalizaciji. Ker interferirajo s številnimi drugimi proteini in tako regulirajo tudi transkripcijo pomembnih genov, se mnogi ogrodni proteini pogosto uporabljajo v sintezni biologiji.

== Ogrodni proteini 14-3-3 ==

Proteini 14-3-3 so ogrodni proteini, ki specifično vežejo motive s fosforiliranimi oblikami aminokislinskih ostankov serina in treonina v tarčnih proteinih. Obenem gre za družino proteinov, ki je močno evolucijsko ohranjena v vseh evkariontskih celicah, večina organizmov pa vsebuje več različnih, vendar strukturno dokaj podobnih izoform, ki navadno tvorijo homo- ter heterodimere. Takšna raznolikost izoform omogoča vezavo številnih interakcijskih partnerjev – do sedaj je bilo identificiranih več kot 200 signalnih proteinov [1].

Proteini 14-3-3 iz tega razloga sodelujejo pri velikem številu bioloških procesov, kot so npr. napredovanje in kontrola celičnega cikla, apoptoza, metabolizem, transkripcija in regulacija izražanja genov ter popravljanje napak DNA [2].

Funkcije proteinov 14-3-3 lahko uvrstimo v štiri glavna področja delovanja, in sicer je najbolj osnovna funkcija teh ogrodnih proteinov združevanje komponent posamezne signalne kaskade in s tem izboljšanje njene učinkovitosti. Povezava proteina 14-3-3 in tarčnega proteina na tak način stabilizira tudi proteinske komplekse, sproži pa lahko tudi konformacijske spremembe vezanega proteina in s tem regulira njegovo encimsko aktivnost. Še ena pomembna funkcija je lokalizacija signalnih molekul na specifičnem območju oz. mestu v znotrajceličnih organelih, kar je lahko pomembno za sintezo določenih intermediatov, proteini 14-3-3 pa so pomembni tudi iz stališča regulacije pozitivnih in negativnih povratnih zank. Ne nazadnje lahko objamejo tudi določeno regijo tarčnega proteina in tako preprečijo interakcije z drugimi molekulami (npr. z DNA ali proteini) ali pa vezan protein zaščitijo pred defosforilacijo in proteolitsko razgradnjo [1,2,3].

== Projekt ==

V ekipi iGEM iz TU Eindhoven so pri svojem raziskovalnem delu na področju sintezne biologije opisane lastnosti izkoristili v ta namen, da so razvili nove variante ogrodnih proteinov – heterodimerne ter tetramerne variante, s čimer so poskušali doseči regulacijo več različnih proteinskih interakcij.

Pri tem so uporabili ogrodni protein T14-3-3, ki izvira iz rastline Nicotiana plumbaginifolia (tobak). Ta dimerni protein interagira z 52 aminokislinskih ostankov dolgim proteinom CT52, ki v resnici predstavlja izoliran C-končni citosolni del H+-ATPaze iz plazemskih membran rastlinskih celic (aminokislinski ostanki 905-956). Interakcija T14-3-3 se vzpostavi s prostim C-koncem CT52 in je stabilizirana z dodatno vezavo majhne organske molekule fuzikokcina [4].

Funkcionalnost svojih konstruktov so nato analizirali s posebnimi reporterskimi sistemi. Na prost N-končni del proteina CT52 so vezali določene proteine, ki so pod vplivom fuzikokcina dimerizirali na ogrodnih proteinih in s tem dokazali funkcionalnost le-teh.

=== Modeliranje proteinov T14-3-3 in CT52 ===

Raziskovalci so nove variante ogrodnih proteinov zasnovali na podlagi računalniških modelov in pri tem uporabili program Rosetta software package. Na proteinu T14-3-3 so tako zasnovali štiri sete mutacij. Poleg že znane mutacije T14-3-3-E19R, ki je v sledečih eksperimentih služila kot pozitivna kontrola, so v posamezna zaporedja proteinov uvedli še računalniško predvidene mutacije S71L in I72V, S71L in W237R.

Komplementarne mutacije so vnesli tudi v zaporedje proteina CT52. Poleg že znane mutacije K943D so načrtali tri nove mutacije I947F, I947H ter S953K, ter s tem v kasnejših eksperimentih zagotovili ustrezno ortogonalnost s proteini T14-3-3.

==== Načrtovanje dimerov T14-3-3 ====

Nove heterodimerne proteine so sestavili iz dveh monomernih enot, pri čemer je ena od teh predstavljala divji tip proteina T14-3-3, druga monomerna enota pa je vsebovala eno oz. dve mutaciji aminokislinskih ostankov, ki so ključni za vezavo proteinov CT52.

==== Načrtovanje tetramerov T14-3-3 ====

V naslednji fazi so načrtali tetramer proteina T14-3-3, ki se sicer v naravi pojavlja le v dimerni obliki. Takšni ogrodni proteini naj bi bili sposobni združiti štiri tarčne proteine CT52, poleg tega pa bi imeli številne funkcije. Med drugim bi delovali kot izboljšan sistem za sprožitev celične smrti in sistem za produkcijo ter dostavo bioloških zdravil, sodelovali pa bi naj tudi pri regulaciji sistema CRISPR/Cas9.

Pri načrtovanju so tetramere razdelili v dve skupini, in sicer v homotetramere, ki so sestavljeni iz štirih enakih monomernih enot divjega tipa proteina T14-3-3, ter v heterotetramere, ki vključujejo štiri različne monomere. V projektu so te monomerne enote predstavljali divji tip proteina T14-3-3 in tri mutirane oblike (T14-3-3-S71L-I72V, T14-3-3-W237R in T14-3-3-E19R).

Tetramere so zasnovali na podlagi povezovanja dveh dimernih enot preko povezovalne regije GGS10 z zaporedjem Gly-Gly-Ser, ki se desetkrat ponovi, tak tetramer pa na podlagi štirih vezavnih mest oz. žlebov omogoča vezavo in združevanje kar štirih tarčnih proteinov.

=== Poskusi in rezultati ===

==== Dimeri T14-3-3 ====

Funkcionalnost dimerov so analizirali s sistemom NanoLuc Luciferase. Gre za reporterski sistem, ki ga sestavljata dva različna in neaktivna fragmenta SmallBiT in LargeBiT. Proteini T14-3-3 omogočajo, da se ta posamezna fragmenta povežeta in s tem tvorita aktivno luciferazo NanoLuc, ki ob prisotnosti substrata furimazina emitira svetlobo [5].

V projektu so pripravili 10 različnih fragmentov. Fragmenta SmallBiT in LargeBiT so preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec posameznih variant proteina CT52 in te zapise vstavili v vektor pET28a. Po izražanju v E. coli so se povezani proteini ob prisotnosti fuzikokcina vezali na heterodimerne ogrodne proteine. S tem so posledično aktivirali sistem NanoLuc in omogočili emisijo bioluminiscenčne svetlobe z valovno dolžino 460 nm.

V prvi fazi so z merjenjem relativne intenzitete posameznih kompleksov dimernega ogrodnega proteina T14-3-3 in ustreznih vezavnih proteinov CT52 z mutacijami, ki so jih predvideli na podlagi predhodnega modeliranja, najprej preverili funkcionalnost in uspešnost povezovanja teh proteinov.

Pri analizi rezultatov so ugotovili, da je bila v primeru homodimera s povezanimi monomernimi enotami divjega tipa izmerjena intenziteta luminiscence bistveno manjša kot v večini ostalih primerov. Delca NanoBiT sta bila pri tem vezana na identična proteina CT52, zaradi česar je posledično lahko prišlo do vezave dveh delcev SmallBiT ali dveh delcev LargeBiT na en ogrodni dimerni protein.

V primeru heterodimera T14-3-3 z mutacijo W237R se bioluminiscenca v primerjavi z negativno kontrolo ni povečala, kar nakazuje na to, da se interakcije med ogrodnim proteinom in proteinom CT52 niso vzpostavile. V ostalih primerih so heterodimeri z uvedenimi mutacijami S71L, S71L in I72V ter E19R dali visoke vrednosti bioluminiscence, kar dokazuje pravilno tvorbo kompleksa NanoLuc in s tem funkcionalnost ogrodnih proteinov.

V naslednji fazi so preverjali vpliv koncentracije ogrodnih proteinov pri tvorbi kompleksov. Pri višjih koncentracijah so pričakovali povečano vezavo CT52 in s tem uspešno dimerizacijo obeh delcev NanoBiT, posledično pa se je povečala tudi izmerjena intenziteta bioluminiscence. V primerih, ki so se v predhodni analizi heterodimerov izkazali za funkcionalne (mutacije S71L, S71L in I72V ter E19R), so tudi v tem eksperimentu ustrezali pričakovanim rezultatom, saj se je intenziteta bioluminiscence povečevala z višanjem koncentracije ogrodnih proteinov T14-3-3.

==== Tetrameri T14-3-3 ====

Skupina iGEM je načrtan tetramer poskušala izraziti in podrobno ovrednotiti z merjenjem kaspazne aktivnosti. Možnost povezovanja štirih proteinov na tetrameru T14-3-3 namreč omogoča regulacijo celične smrti, sprožitev tega procesa pa je odvisna od aktivacije prokaspaz-9, pri čemer posamezne prokaspaze dimerizirajo in s tem aktivirajo druga drugo.

V skupini so zato kaspazo-9 preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec proteina CT52, zapis ponovno vstavili v vektor pET28b in ga nato izrazili v bakterijah E. coli. Aktivnost kaspaz-9 so preučevali z uporabo fluorogenega substrata Ac-LEHD-AFC. Kaspaze-9 ta substrat razcepijo na nefluorescirajoči peptid in del, ki fluorescira, merjenje fluorescence pa tako po vezavi na ogrodni protein daje informacijo o aktivnosti kaspaz-9 in s tem posredno tudi o funkcionalnosti T14-3-3.

Člani skupine so želeli primerjati aktivnost dimerov in tetramerov ter ob tem preveriti tudi aplikacijo ogrodnih proteinov pri stikalu smrti. Pričakovali so, da bodo tetrameri učinkoviteje aktivirali kaspaze-9, saj na nek način kažejo večjo podobnost z apoptosomi, ki se v procesu apoptoze sestavijo v obliki septamera, poleg tega pa združevanje štirih hibridnih proteinov zagotovi višjo lokalno koncentracijo kaspaz-9 in posledično tudi hitrejšo ter bolj zanesljivo aktivacijo.

Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov).

Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.

== Zaključek ==

Rezultati kažejo na to, da je ekipa iGEM svoj teoretični model pretvorila v uspešno delujoč in vitro sistem. Kljub temu, da so tetramer sintetizirali le na ravni DNA, pa nadaljnje raziskave in delo v tej smeri predstavljajo temelj za številne aplikacije na področju sintezne biologije, predvsem na področju regulacije proteinskih kompleksov.

Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.

== Viri ==

1. Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011).
2. van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001).
3. Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009).
4. Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007).
5. Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016).
6. 2016 iGEM team from Eindhoven University of Technology

Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini

2017-01-02T12:43:52Z

Mojca Kostanjevec:

[http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

Ogrodni proteini, ki regulirajo in usmerjajo združevanje drugih proteinov v celici, igrajo izredno pomembno vlogo v celični signalizaciji. Ker interferirajo s številnimi drugimi proteini in tako regulirajo tudi transkripcijo pomembnih genov, se mnogi ogrodni proteini pogosto uporabljajo v sintezni biologiji.

== Ogrodni proteini 14-3-3 ==

Proteini 14-3-3 so ogrodni proteini, ki specifično vežejo motive s fosforiliranimi oblikami aminokislinskih ostankov serina in treonina v tarčnih proteinih. Obenem gre za družino proteinov, ki je močno evolucijsko ohranjena v vseh evkariontskih celicah, večina organizmov pa vsebuje več različnih, vendar strukturno dokaj podobnih izoform, ki navadno tvorijo homo- ter heterodimere. Takšna raznolikost izoform omogoča vezavo številnih interakcijskih partnerjev – do sedaj je bilo identificiranih več kot 200 signalnih proteinov [1].

Proteini 14-3-3 iz tega razloga sodelujejo pri velikem številu bioloških procesov, kot so npr. napredovanje in kontrola celičnega cikla, apoptoza, metabolizem, transkripcija in regulacija izražanja genov ter popravljanje napak DNA [2].

Funkcije proteinov 14-3-3 lahko uvrstimo v štiri glavna področja delovanja, in sicer je najbolj osnovna funkcija teh ogrodnih proteinov združevanje komponent posamezne signalne kaskade in s tem izboljšanje njene učinkovitosti. Povezava proteina 14-3-3 in tarčnega proteina na tak način stabilizira tudi proteinske komplekse, sproži pa lahko tudi konformacijske spremembe vezanega proteina in s tem regulira njegovo encimsko aktivnost. Še ena pomembna funkcija je lokalizacija signalnih molekul na specifičnem območju oz. mestu v znotrajceličnih organelih, kar je lahko pomembno za sintezo določenih intermediatov, proteini 14-3-3 pa so pomembni tudi iz stališča regulacije pozitivnih in negativnih povratnih zank. Ne nazadnje lahko objamejo tudi določeno regijo tarčnega proteina in tako preprečijo interakcije z drugimi molekulami (npr. z DNA ali proteini) ali pa vezan protein zaščitijo pred defosforilacijo in proteolitsko razgradnjo [1,2,3].

== Projekt ==

V ekipi iGEM iz TU Eindhoven so pri svojem raziskovalnem delu na področju sintezne biologije opisane lastnosti izkoristili v ta namen, da so razvili nove variante ogrodnih proteinov – heterodimerne ter tetramerne variante, s čimer so poskušali doseči regulacijo več različnih proteinskih interakcij.

Pri tem so uporabili ogrodni protein T14-3-3, ki izvira iz rastline Nicotiana plumbaginifolia (tobak). Ta dimerni protein interagira z 52 aminokislinskih ostankov dolgim proteinom CT52, ki v resnici predstavlja izoliran C-končni citosolni del H+-ATPaze iz plazemskih membran rastlinskih celic (aminokislinski ostanki 905-956). Interakcija T14-3-3 se vzpostavi s prostim C-koncem CT52 in je stabilizirana z dodatno vezavo majhne organske molekule fuzikokcina [4].

Funkcionalnost svojih konstruktov so nato analizirali s posebnimi reporterskimi sistemi. Na prost N-končni del proteina CT52 so vezali določene proteine, ki so pod vplivom fuzikokcina dimerizirali na ogrodnih proteinih in s tem dokazali funkcionalnost le-teh.

=== Modeliranje proteinov T14-3-3 in CT52 ===

Raziskovalci so nove variante ogrodnih proteinov zasnovali na podlagi računalniških modelov in pri tem uporabili program Rosetta software package. Na proteinu T14-3-3 so tako zasnovali štiri sete mutacij. Poleg že znane mutacije T14-3-3-E19R, ki je v sledečih eksperimentih služila kot pozitivna kontrola, so v posamezna zaporedja proteinov uvedli še računalniško predvidene mutacije S71L in I72V, S71L in W237R.

Komplementarne mutacije so vnesli tudi v zaporedje proteina CT52. Poleg že znane mutacije K943D so načrtali tri nove mutacije I947F, I947H ter S953K, ter s tem v kasnejših eksperimentih zagotovili ustrezno ortogonalnost s proteini T14-3-3.

==== Načrtovanje dimerov T14-3-3 ====

Nove heterodimerne proteine so sestavili iz dveh monomernih enot, pri čemer je ena od teh predstavljala divji tip proteina T14-3-3, druga monomerna enota pa je vsebovala eno oz. dve mutaciji aminokislinskih ostankov, ki so ključni za vezavo proteinov CT52.

==== Načrtovanje tetramerov T14-3-3 ====

V naslednji fazi so načrtali tetramer proteina T14-3-3, ki se sicer v naravi pojavlja le v dimerni obliki. Takšni ogrodni proteini naj bi bili sposobni združiti štiri tarčne proteine CT52, poleg tega pa bi imeli številne funkcije. Med drugim bi delovali kot izboljšan sistem za sprožitev celične smrti in sistem za produkcijo ter dostavo bioloških zdravil, sodelovali pa bi naj tudi pri regulaciji sistema CRISPR/Cas9.

Pri načrtovanju so tetramere razdelili v dve skupini, in sicer v homotetramere, ki so sestavljeni iz štirih enakih monomernih enot divjega tipa proteina T14-3-3, ter v heterotetramere, ki vključujejo štiri različne monomere. V projektu so te monomerne enote predstavljali divji tip proteina T14-3-3 in tri mutirane oblike (T14-3-3-S71L-I72V, T14-3-3-W237R in T14-3-3-E19R).

Tetramere so zasnovali na podlagi povezovanja dveh dimernih enot preko povezovalne regije GGS10 z zaporedjem Gly-Gly-Ser, ki se desetkrat ponovi, tak tetramer pa na podlagi štirih vezavnih mest oz. žlebov omogoča vezavo in združevanje kar štirih tarčnih proteinov.

=== Poskusi in rezultati ===

==== Dimeri T14-3-3 ====

Funkcionalnost dimerov so analizirali s sistemom NanoLuc Luciferase. Gre za reporterski sistem, ki ga sestavljata dva različna in neaktivna fragmenta SmallBiT in LargeBiT. Proteini T14-3-3 omogočajo, da se ta posamezna fragmenta povežeta in s tem tvorita aktivno luciferazo NanoLuc, ki ob prisotnosti substrata furimazina emitira svetlobo [5].

V projektu so pripravili 10 različnih fragmentov. Fragmenta SmallBiT in LargeBiT so preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec posameznih variant proteina CT52 in te zapise vstavili v vektor pET28a. Po izražanju v E. coli so se povezani proteini ob prisotnosti fuzikokcina vezali na heterodimerne ogrodne proteine. S tem so posledično aktivirali sistem NanoLuc in omogočili emisijo bioluminiscenčne svetlobe z valovno dolžino 460 nm.

V prvi fazi so z merjenjem relativne intenzitete posameznih kompleksov dimernega ogrodnega proteina T14-3-3 in ustreznih vezavnih proteinov CT52 z mutacijami, ki so jih predvideli na podlagi predhodnega modeliranja, najprej preverili funkcionalnost in uspešnost povezovanja teh proteinov.

Pri analizi rezultatov so ugotovili, da je bila v primeru homodimera s povezanimi monomernimi enotami divjega tipa izmerjena intenziteta luminiscence bistveno manjša kot v večini ostalih primerov. Delca NanoBiT sta bila pri tem vezana na identična proteina CT52, zaradi česar je posledično lahko prišlo do vezave dveh delcev SmallBiT ali dveh delcev LargeBiT na en ogrodni dimerni protein.

V primeru heterodimera T14-3-3 z mutacijo W237R se bioluminiscenca v primerjavi z negativno kontrolo ni povečala, kar nakazuje na to, da se interakcije med ogrodnim proteinom in proteinom CT52 niso vzpostavile. V ostalih primerih so heterodimeri z uvedenimi mutacijami S71L, S71L in I72V ter E19R dali visoke vrednosti bioluminiscence, kar dokazuje pravilno tvorbo kompleksa NanoLuc in s tem funkcionalnost ogrodnih proteinov.

V naslednji fazi so preverjali vpliv koncentracije ogrodnih proteinov pri tvorbi kompleksov. Pri višjih koncentracijah so pričakovali povečano vezavo CT52 in s tem uspešno dimerizacijo obeh delcev NanoBiT, posledično pa se je povečala tudi izmerjena intenziteta bioluminiscence. V primerih, ki so se v predhodni analizi heterodimerov izkazali za funkcionalne (mutacije S71L, S71L in I72V ter E19R), so tudi v tem eksperimentu ustrezali pričakovanim rezultatom, saj se je intenziteta bioluminiscence povečevala z višanjem koncentracije ogrodnih proteinov T14-3-3.

==== Tetrameri T14-3-3 ====

Skupina iGEM je načrtan tetramer poskušala izraziti in podrobno ovrednotiti z merjenjem kaspazne aktivnosti. Možnost povezovanja štirih proteinov na tetrameru T14-3-3 namreč omogoča regulacijo celične smrti, sprožitev tega procesa pa je odvisna od aktivacije prokaspaz-9, pri čemer posamezne prokaspaze dimerizirajo in s tem aktivirajo druga drugo.

V skupini so zato kaspazo-9 preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec proteina CT52, zapis ponovno vstavili v vektor pET28b in ga nato izrazili v bakterijah E. coli. Aktivnost kaspaz-9 so preučevali z uporabo fluorogenega substrata Ac-LEHD-AFC. Kaspaze-9 ta substrat razcepijo na nefluorescirajoči peptid in del, ki fluorescira, merjenje fluorescence pa tako po vezavi na ogrodni protein daje informacijo o aktivnosti kaspaz-9 in s tem posredno tudi o funkcionalnosti T14-3-3.

Člani skupine so želeli primerjati aktivnost dimerov in tetramerov ter ob tem preveriti tudi aplikacijo ogrodnih proteinov pri stikalu smrti. Pričakovali so, da bodo tetrameri učinkoviteje aktivirali kaspaze-9, saj na nek način kažejo večjo podobnost z apoptosomi, ki se v procesu apoptoze sestavijo v obliki septamera, poleg tega pa združevanje štirih hibridnih proteinov zagotovi višjo lokalno koncentracijo kaspaz-9 in posledično tudi hitrejšo ter bolj zanesljivo aktivacijo.

Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov).

Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.

== Zaključek ==

Rezultati kažejo na to, da je ekipa iGEM svoj teoretični model pretvorila v uspešno delujoč in vitro sistem. Kljub temu, da so tetramer sintetizirali le na ravni DNA, pa nadaljnje raziskave in delo v tej smeri predstavljajo temelj za številne aplikacije na področju sintezne biologije, predvsem na področju regulacije proteinskih kompleksov.

Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.

== Viri ==

1. Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011).
2. van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001).
3. Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009).
4. Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007).
5. Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016).
6. 2016 iGEM team from Eindhoven University of Technology

Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini

2017-01-02T12:43:16Z

Mojca Kostanjevec:

[http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

Ogrodni proteini, ki regulirajo in usmerjajo združevanje drugih proteinov v celici, igrajo izredno pomembno vlogo v celični signalizaciji. Ker interferirajo s številnimi drugimi proteini in tako regulirajo tudi transkripcijo pomembnih genov, se mnogi ogrodni proteini pogosto uporabljajo v sintezni biologiji.

== Ogrodni proteini 14-3-3 ==

Proteini 14-3-3 so ogrodni proteini, ki specifično vežejo motive s fosforiliranimi oblikami aminokislinskih ostankov serina in treonina v tarčnih proteinih. Obenem gre za družino proteinov, ki je močno evolucijsko ohranjena v vseh evkariontskih celicah, večina organizmov pa vsebuje več različnih, vendar strukturno dokaj podobnih izoform, ki navadno tvorijo homo- ter heterodimere. Takšna raznolikost izoform omogoča vezavo številnih interakcijskih partnerjev – do sedaj je bilo identificiranih več kot 200 signalnih proteinov [1].

Proteini 14-3-3 iz tega razloga sodelujejo pri velikem številu bioloških procesov, kot so npr. napredovanje in kontrola celičnega cikla, apoptoza, metabolizem, transkripcija in regulacija izražanja genov ter popravljanje napak DNA [2].

Funkcije proteinov 14-3-3 lahko uvrstimo v štiri glavna področja delovanja, in sicer je najbolj osnovna funkcija teh ogrodnih proteinov združevanje komponent posamezne signalne kaskade in s tem izboljšanje njene učinkovitosti. Povezava proteina 14-3-3 in tarčnega proteina na tak način stabilizira tudi proteinske komplekse, sproži pa lahko tudi konformacijske spremembe vezanega proteina in s tem regulira njegovo encimsko aktivnost. Še ena pomembna funkcija je lokalizacija signalnih molekul na specifičnem območju oz. mestu v znotrajceličnih organelih, kar je lahko pomembno za sintezo določenih intermediatov, proteini 14-3-3 pa so pomembni tudi iz stališča regulacije pozitivnih in negativnih povratnih zank. Ne nazadnje lahko objamejo tudi določeno regijo tarčnega proteina in tako preprečijo interakcije z drugimi molekulami (npr. z DNA ali proteini) ali pa vezan protein zaščitijo pred defosforilacijo in proteolitsko razgradnjo [1,2,3].

== Projekt ==

V ekipi iGEM iz TU Eindhoven so pri svojem raziskovalnem delu na področju sintezne biologije opisane lastnosti izkoristili v ta namen, da so razvili nove variante ogrodnih proteinov – heterodimerne ter tetramerne variante, s čimer so poskušali doseči regulacijo več različnih proteinskih interakcij.

Pri tem so uporabili ogrodni protein T14-3-3, ki izvira iz rastline Nicotiana plumbaginifolia (tobak). Ta dimerni protein interagira z 52 aminokislinskih ostankov dolgim proteinom CT52, ki v resnici predstavlja izoliran C-končni citosolni del H+-ATPaze iz plazemskih membran rastlinskih celic (aminokislinski ostanki 905-956). Interakcija T14-3-3 se vzpostavi s prostim C-koncem CT52 in je stabilizirana z dodatno vezavo majhne organske molekule fuzikokcina [4].

Funkcionalnost svojih konstruktov so nato analizirali s posebnimi reporterskimi sistemi. Na prost N-končni del proteina CT52 so vezali določene proteine, ki so pod vplivom fuzikokcina dimerizirali na ogrodnih proteinih in s tem dokazali funkcionalnost le-teh.

=== Modeliranje proteinov T14-3-3 in CT52 ===

Raziskovalci so nove variante ogrodnih proteinov zasnovali na podlagi računalniških modelov in pri tem uporabili program Rosetta software package. Na proteinu T14-3-3 so tako zasnovali štiri sete mutacij. Poleg že znane mutacije T14-3-3-E19R, ki je v sledečih eksperimentih služila kot pozitivna kontrola, so v posamezna zaporedja proteinov uvedli še računalniško predvidene mutacije S71L in I72V, S71L in W237R.

Komplementarne mutacije so vnesli tudi v zaporedje proteina CT52. Poleg že znane mutacije K943D so načrtali tri nove mutacije I947F, I947H ter S953K, ter s tem v kasnejših eksperimentih zagotovili ustrezno ortogonalnost s proteini T14-3-3.

==== Načrtovanje dimerov T14-3-3 ====

Nove heterodimerne proteine so sestavili iz dveh monomernih enot, pri čemer je ena od teh predstavljala divji tip proteina T14-3-3, druga monomerna enota pa je vsebovala eno oz. dve mutaciji aminokislinskih ostankov, ki so ključni za vezavo proteinov CT52.

==== Načrtovanje tetramerov T14-3-3 ====

V naslednji fazi so načrtali tetramer proteina T14-3-3, ki se sicer v naravi pojavlja le v dimerni obliki. Takšni ogrodni proteini naj bi bili sposobni združiti štiri tarčne proteine CT52, poleg tega pa bi imeli številne funkcije. Med drugim bi delovali kot izboljšan sistem za sprožitev celične smrti in sistem za produkcijo ter dostavo bioloških zdravil, sodelovali pa bi naj tudi pri regulaciji sistema CRISPR/Cas9.

Pri načrtovanju so tetramere razdelili v dve skupini, in sicer v homotetramere, ki so sestavljeni iz štirih enakih monomernih enot divjega tipa proteina T14-3-3, ter v heterotetramere, ki vključujejo štiri različne monomere. V projektu so te monomerne enote predstavljali divji tip proteina T14-3-3 in tri mutirane oblike (T14-3-3-S71L-I72V, T14-3-3-W237R in T14-3-3-E19R).

Tetramere so zasnovali na podlagi povezovanja dveh dimernih enot preko povezovalne regije GGS10 z zaporedjem Gly-Gly-Ser, ki se desetkrat ponovi, tak tetramer pa na podlagi štirih vezavnih mest oz. žlebov omogoča vezavo in združevanje kar štirih tarčnih proteinov.

=== Poskusi in rezultati ===

==== Dimeri T14-3-3 ====

Funkcionalnost dimerov so analizirali s sistemom NanoLuc Luciferase. Gre za reporterski sistem, ki ga sestavljata dva različna in neaktivna fragmenta SmallBiT in LargeBiT. Proteini T14-3-3 omogočajo, da se ta posamezna fragmenta povežeta in s tem tvorita aktivno luciferazo NanoLuc, ki ob prisotnosti substrata furimazina emitira svetlobo [5].

V projektu so pripravili 10 različnih fragmentov. Fragmenta SmallBiT in LargeBiT so preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec posameznih variant proteina CT52 in te zapise vstavili v vektor pET28a. Po izražanju v E. coli so se povezani proteini ob prisotnosti fuzikokcina vezali na heterodimerne ogrodne proteine. S tem so posledično aktivirali sistem NanoLuc in omogočili emisijo bioluminiscenčne svetlobe z valovno dolžino 460 nm.

V prvi fazi so z merjenjem relativne intenzitete posameznih kompleksov dimernega ogrodnega proteina T14-3-3 in ustreznih vezavnih proteinov CT52 z mutacijami, ki so jih predvideli na podlagi predhodnega modeliranja, najprej preverili funkcionalnost in uspešnost povezovanja teh proteinov.

Pri analizi rezultatov so ugotovili, da je bila v primeru homodimera s povezanimi monomernimi enotami divjega tipa izmerjena intenziteta luminiscence bistveno manjša kot v večini ostalih primerov. Delca NanoBiT sta bila pri tem vezana na identična proteina CT52, zaradi česar je posledično lahko prišlo do vezave dveh delcev SmallBiT ali dveh delcev LargeBiT na en ogrodni dimerni protein.

V primeru heterodimera T14-3-3 z mutacijo W237R se bioluminiscenca v primerjavi z negativno kontrolo ni povečala, kar nakazuje na to, da se interakcije med ogrodnim proteinom in proteinom CT52 niso vzpostavile.

V ostalih primerih so heterodimeri z uvedenimi mutacijami S71L, S71L in I72V ter E19R dali visoke vrednosti bioluminiscence, kar dokazuje pravilno tvorbo kompleksa NanoLuc in s tem funkcionalnost ogrodnih proteinov.

V naslednji fazi so preverjali vpliv koncentracije ogrodnih proteinov pri tvorbi kompleksov. Pri višjih koncentracijah so pričakovali povečano vezavo CT52 in s tem uspešno dimerizacijo obeh delcev NanoBiT, posledično pa se je povečala tudi izmerjena intenziteta bioluminiscence.

V primerih, ki so se v predhodni analizi heterodimerov izkazali za funkcionalne (mutacije S71L, S71L in I72V ter E19R), so tudi v tem eksperimentu ustrezali pričakovanim rezultatom, saj se je intenziteta bioluminiscence povečevala z višanjem koncentracije ogrodnih proteinov T14-3-3.

==== Tetrameri T14-3-3 ====

Skupina iGEM je načrtan tetramer poskušala izraziti in podrobno ovrednotiti z merjenjem kaspazne aktivnosti. Možnost povezovanja štirih proteinov na tetrameru T14-3-3 namreč omogoča regulacijo celične smrti, sprožitev tega procesa pa je odvisna od aktivacije prokaspaz-9, pri čemer posamezne prokaspaze dimerizirajo in s tem aktivirajo druga drugo.

V skupini so zato kaspazo-9 preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec proteina CT52, zapis ponovno vstavili v vektor pET28b in ga nato izrazili v bakterijah E. coli. Aktivnost kaspaz-9 so preučevali z uporabo fluorogenega substrata Ac-LEHD-AFC. Kaspaze-9 ta substrat razcepijo na nefluorescirajoči peptid in del, ki fluorescira, merjenje fluorescence pa tako po vezavi na ogrodni protein daje informacijo o aktivnosti kaspaz-9 in s tem posredno tudi o funkcionalnosti T14-3-3.

Člani skupine so želeli primerjati aktivnost dimerov in tetramerov ter ob tem preveriti tudi aplikacijo ogrodnih proteinov pri stikalu smrti. Pričakovali so, da bodo tetrameri učinkoviteje aktivirali kaspaze-9, saj na nek način kažejo večjo podobnost z apoptosomi, ki se v procesu apoptoze sestavijo v obliki septamera, poleg tega pa združevanje štirih hibridnih proteinov zagotovi višjo lokalno koncentracijo kaspaz-9 in posledično tudi hitrejšo ter bolj zanesljivo aktivacijo.

Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov).

Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.

== Zaključek ==

Rezultati kažejo na to, da je ekipa iGEM svoj teoretični model pretvorila v uspešno delujoč in vitro sistem. Kljub temu, da so tetramer sintetizirali le na ravni DNA, pa nadaljnje raziskave in delo v tej smeri predstavljajo temelj za številne aplikacije na področju sintezne biologije, predvsem na področju regulacije proteinskih kompleksov.

Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.

== Viri ==

1. Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011).
2. van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001).
3. Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009).
4. Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007).
5. Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016).
6. 2016 iGEM team from Eindhoven University of Technology

Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini

2017-01-02T12:42:06Z

Mojca Kostanjevec:

[http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

Ogrodni proteini, ki regulirajo in usmerjajo združevanje drugih proteinov v celici, igrajo izredno pomembno vlogo v celični signalizaciji. Ker interferirajo s številnimi drugimi proteini in tako regulirajo tudi transkripcijo pomembnih genov, se mnogi ogrodni proteini pogosto uporabljajo v sintezni biologiji.

== Ogrodni proteini 14-3-3 ==

Proteini 14-3-3 so ogrodni proteini, ki specifično vežejo motive s fosforiliranimi oblikami aminokislinskih ostankov serina in treonina v tarčnih proteinih. Obenem gre za družino proteinov, ki je močno evolucijsko ohranjena v vseh evkariontskih celicah, večina organizmov pa vsebuje več različnih, vendar strukturno dokaj podobnih izoform, ki navadno tvorijo homo- ter heterodimere. Takšna raznolikost izoform omogoča vezavo številnih interakcijskih partnerjev – do sedaj je bilo identificiranih več kot 200 signalnih proteinov [1].

Proteini 14-3-3 iz tega razloga sodelujejo pri velikem številu bioloških procesov, kot so npr. napredovanje in kontrola celičnega cikla, apoptoza, metabolizem, transkripcija in regulacija izražanja genov ter popravljanje napak DNA [2].

Funkcije proteinov 14-3-3 lahko uvrstimo v štiri glavna področja delovanja, in sicer je najbolj osnovna funkcija teh ogrodnih proteinov združevanje komponent posamezne signalne kaskade in s tem izboljšanje njene učinkovitosti. Povezava proteina 14-3-3 in tarčnega proteina na tak način stabilizira tudi proteinske komplekse, sproži pa lahko tudi konformacijske spremembe vezanega proteina in s tem regulira njegovo encimsko aktivnost. Še ena pomembna funkcija je lokalizacija signalnih molekul na specifičnem območju oz. mestu v znotrajceličnih organelih, kar je lahko pomembno za sintezo določenih intermediatov, proteini 14-3-3 pa so pomembni tudi iz stališča regulacije pozitivnih in negativnih povratnih zank. Ne nazadnje lahko objamejo tudi določeno regijo tarčnega proteina in tako preprečijo interakcije z drugimi molekulami (npr. z DNA ali proteini) ali pa vezan protein zaščitijo pred defosforilacijo in proteolitsko razgradnjo [1,2,3].

== Projekt ==

V ekipi iGEM iz TU Eindhoven so pri svojem raziskovalnem delu na področju sintezne biologije opisane lastnosti izkoristili v ta namen, da so razvili nove variante ogrodnih proteinov – heterodimerne ter tetramerne variante, s čimer so poskušali doseči regulacijo več različnih proteinskih interakcij.

Pri tem so uporabili ogrodni protein T14-3-3, ki izvira iz rastline Nicotiana plumbaginifolia (tobak). Ta dimerni protein interagira z 52 aminokislinskih ostankov dolgim proteinom CT52, ki v resnici predstavlja izoliran C-končni citosolni del H+-ATPaze iz plazemskih membran rastlinskih celic (aminokislinski ostanki 905-956). Interakcija T14-3-3 se vzpostavi s prostim C-koncem CT52 in je stabilizirana z dodatno vezavo majhne organske molekule fuzikokcina [4].

Funkcionalnost svojih konstruktov so nato analizirali s posebnimi reporterskimi sistemi. Na prost N-končni del proteina CT52 so vezali določene proteine, ki so pod vplivom fuzikokcina dimerizirali na ogrodnih proteinih in s tem dokazali funkcionalnost le-teh.

=== Modeliranje proteinov T14-3-3 in CT52 ===

Raziskovalci so nove variante ogrodnih proteinov zasnovali na podlagi računalniških modelov in pri tem uporabili program Rosetta software package. Na proteinu T14-3-3 so tako zasnovali štiri sete mutacij. Poleg že znane mutacije T14-3-3-E19R, ki je v sledečih eksperimentih služila kot pozitivna kontrola, so v posamezna zaporedja proteinov uvedli še računalniško predvidene mutacije S71L in I72V, S71L in W237R.

Komplementarne mutacije so vnesli tudi v zaporedje proteina CT52. Poleg že znane mutacije K943D so načrtali tri nove mutacije I947F, I947H ter S953K, ter s tem v kasnejših eksperimentih zagotovili ustrezno ortogonalnost s proteini T14-3-3.

==== Načrtovanje dimerov T14-3-3 ====

Nove heterodimerne proteine so sestavili iz dveh monomernih enot, pri čemer je ena od teh predstavljala divji tip proteina T14-3-3, druga monomerna enota pa je vsebovala eno oz. dve mutaciji aminokislinskih ostankov, ki so ključni za vezavo proteinov CT52.

==== Načrtovanje tetramerov T14-3-3 ====

V naslednji fazi so načrtali tetramer proteina T14-3-3, ki se sicer v naravi pojavlja le v dimerni obliki. Takšni ogrodni proteini naj bi bili sposobni združiti štiri tarčne proteine CT52, poleg tega pa bi imeli številne funkcije. Med drugim bi delovali kot izboljšan sistem za sprožitev celične smrti in sistem za produkcijo ter dostavo bioloških zdravil, sodelovali pa bi naj tudi pri regulaciji sistema CRISPR/Cas9.

Pri načrtovanju so tetramere razdelili v dve skupini, in sicer v homotetramere, ki so sestavljeni iz štirih enakih monomernih enot divjega tipa proteina T14-3-3, ter v heterotetramere, ki vključujejo štiri različne monomere. V projektu so te monomerne enote predstavljali divji tip proteina T14-3-3 in tri mutirane oblike (T14-3-3-S71L-I72V, T14-3-3-W237R in T14-3-3-E19R).

Tetramere so zasnovali na podlagi povezovanja dveh dimernih enot preko povezovalne regije GGS10 z zaporedjem Gly-Gly-Ser, ki se desetkrat ponovi, tak tetramer pa na podlagi štirih vezavnih mest oz. žlebov omogoča vezavo in združevanje kar štirih tarčnih proteinov.

=== Poskusi in rezultati ===

==== Dimeri T14-3-3 ====

Funkcionalnost dimerov so analizirali s sistemom NanoLuc Luciferase. Gre za reporterski sistem, ki ga sestavljata dva različna in neaktivna fragmenta SmallBiT in LargeBiT. Proteini T14-3-3 omogočajo, da se ta posamezna fragmenta povežeta in s tem tvorita aktivno luciferazo NanoLuc, ki ob prisotnosti substrata furimazina emitira svetlobo [5].

V projektu so pripravili 10 različnih fragmentov. Fragmenta SmallBiT in LargeBiT so preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec posameznih variant proteina CT52 in te zapise vstavili v vektor pET28a. Po izražanju v E. coli so se povezani proteini ob prisotnosti fuzikokcina vezali na heterodimerne ogrodne proteine. S tem so posledično aktivirali sistem NanoLuc in omogočili emisijo bioluminiscenčne svetlobe z valovno dolžino 460 nm.

V prvi fazi so z merjenjem relativne intenzitete posameznih kompleksov dimernega ogrodnega proteina T14-3-3 in ustreznih vezavnih proteinov CT52 z mutacijami, ki so jih predvideli na podlagi predhodnega modeliranja, najprej preverili funkcionalnost in uspešnost povezovanja teh proteinov.

Pri analizi rezultatov so ugotovili, da je bila v primeru homodimera s povezanimi monomernimi enotami divjega tipa izmerjena intenziteta luminiscence bistveno manjša kot v večini ostalih primerov. Delca NanoBiT sta bila pri tem vezana na identična proteina CT52, zaradi česar je posledično lahko prišlo do vezave dveh delcev SmallBiT ali dveh delcev LargeBiT na en ogrodni dimerni protein.

V primeru heterodimera T14-3-3 z mutacijo W237R se bioluminiscenca v primerjavi z negativno kontrolo ni povečala, kar nakazuje na to, da se interakcije med ogrodnim proteinom in proteinom CT52 niso vzpostavile.

V ostalih primerih so heterodimeri z uvedenimi mutacijami S71L, S71L in I72V ter E19R dali visoke vrednosti bioluminiscence, kar dokazuje pravilno tvorbo kompleksa NanoLuc in s tem funkcionalnost ogrodnih proteinov.

V naslednji fazi so preverjali vpliv koncentracije ogrodnih proteinov pri tvorbi kompleksov. Pri višjih koncentracijah so pričakovali povečano vezavo CT52 in s tem uspešno dimerizacijo obeh delcev NanoBiT, posledično pa se je povečala tudi izmerjena intenziteta bioluminiscence.

V primerih, ki so se v predhodni analizi heterodimerov izkazali za funkcionalne (mutacije S71L, S71L in I72V ter E19R), so tudi v tem eksperimentu ustrezali pričakovanim rezultatom, saj se je intenziteta bioluminiscence povečevala z višanjem koncentracije ogrodnih proteinov T14-3-3.

==== Tetrameri T14-3-3 ====

Skupina iGEM je načrtan tetramer poskušala izraziti in podrobno ovrednotiti z merjenjem kaspazne aktivnosti. Možnost povezovanja štirih proteinov na tetrameru T14-3-3 namreč omogoča regulacijo celične smrti, sprožitev tega procesa pa je odvisna od aktivacije prokaspaz-9, pri čemer posamezne prokaspaze dimerizirajo in s tem aktivirajo druga drugo.

V skupini so zato kaspazo-9 preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec proteina CT52, zapis ponovno vstavili v vektor pET28b in ga nato izrazili v bakterijah E. coli. Aktivnost kaspaz-9 so preučevali z uporabo fluorogenega substrata Ac-LEHD-AFC. Kaspaze-9 ta substrat razcepijo na nefluorescirajoči peptid in del, ki fluorescira, merjenje fluorescence pa tako po vezavi na ogrodni protein daje informacijo o aktivnosti kaspaz-9 in s tem posredno tudi o funkcionalnosti T14-3-3.

Člani skupine so želeli primerjati aktivnost dimerov in tetramerov ter ob tem preveriti tudi aplikacijo ogrodnih proteinov pri stikalu smrti. Pričakovali so, da bodo tetrameri učinkoviteje aktivirali kaspaze-9, saj na nek način kažejo večjo podobnost z apoptosomi, ki se v procesu apoptoze sestavijo v obliki septamera, poleg tega pa združevanje štirih hibridnih proteinov zagotovi višjo lokalno koncentracijo kaspaz-9 in posledično tudi hitrejšo ter bolj zanesljivo aktivacijo.

Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov).

Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.

== Zaključek ==

Rezultati kažejo na to, da je ekipa iGEM svoj teoretični model pretvorila v uspešno delujoč in vitro sistem. Kljub temu, da so tetramer sintetizirali le na ravni DNA, pa nadaljnje raziskave in delo v tej smeri predstavljajo temelj za številne aplikacije na področju sintezne biologije, predvsem na področju regulacije proteinskih kompleksov.

Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.

== Viri ==

1. Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011).
2. van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001).
3. Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009).
4. Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007).
5. Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016).
6. 2016 iGEM team from Eindhoven University of Technology

Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini

2017-01-02T12:38:58Z

Mojca Kostanjevec:

[http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

Ogrodni proteini, ki regulirajo in usmerjajo združevanje drugih proteinov v celici, igrajo izredno pomembno vlogo v celični signalizaciji. Ker interferirajo s številnimi drugimi proteini in tako regulirajo tudi transkripcijo pomembnih genov, se mnogi ogrodni proteini pogosto uporabljajo v sintezni biologiji.

== Ogrodni proteini 14-3-3 ==

Proteini 14-3-3 so ogrodni proteini, ki specifično vežejo motive s fosforiliranimi oblikami aminokislinskih ostankov serina in treonina v tarčnih proteinih. Obenem gre za družino proteinov, ki je močno evolucijsko ohranjena v vseh evkariontskih celicah, večina organizmov pa vsebuje več različnih, vendar strukturno dokaj podobnih izoform, ki navadno tvorijo homo- ter heterodimere. Takšna raznolikost izoform omogoča vezavo številnih interakcijskih partnerjev – do sedaj je bilo identificiranih več kot 200 signalnih proteinov [1].

Proteini 14-3-3 iz tega razloga sodelujejo pri velikem številu bioloških procesov, kot so npr. napredovanje in kontrola celičnega cikla, apoptoza, metabolizem, transkripcija in regulacija izražanja genov ter popravljanje napak DNA [2].

Funkcije proteinov 14-3-3 lahko uvrstimo v štiri glavna področja delovanja, in sicer je najbolj osnovna funkcija teh ogrodnih proteinov združevanje komponent posamezne signalne kaskade in s tem izboljšanje njene učinkovitosti. Povezava proteina 14-3-3 in tarčnega proteina na tak način stabilizira tudi proteinske komplekse, sproži pa lahko tudi konformacijske spremembe vezanega proteina in s tem regulira njegovo encimsko aktivnost. Še ena pomembna funkcija je lokalizacija signalnih molekul na specifičnem območju oz. mestu v znotrajceličnih organelih, kar je lahko pomembno za sintezo določenih intermediatov, proteini 14-3-3 pa so pomembni tudi iz stališča regulacije pozitivnih in negativnih povratnih zank. Ne nazadnje lahko objamejo tudi določeno regijo tarčnega proteina in tako preprečijo interakcije z drugimi molekulami (npr. z DNA ali proteini) ali pa vezan protein zaščitijo pred defosforilacijo in proteolitsko razgradnjo [1,2,3].

== Projekt ==

V ekipi iGEM iz TU Eindhoven so pri svojem raziskovalnem delu na področju sintezne biologije opisane lastnosti izkoristili v ta namen, da so razvili nove variante ogrodnih proteinov – heterodimerne ter tetramerne variante, s čimer so poskušali doseči regulacijo več različnih proteinskih interakcij.

Pri tem so uporabili ogrodni protein T14-3-3, ki izvira iz rastline Nicotiana plumbaginifolia (tobak). Ta dimerni protein interagira z 52 aminokislinskih ostankov dolgim proteinom CT52, ki v resnici predstavlja izoliran C-končni citosolni del H+-ATPaze iz plazemskih membran rastlinskih celic (aminokislinski ostanki 905-956). Interakcija T14-3-3 se vzpostavi s prostim C-koncem CT52 in je stabilizirana z dodatno vezavo majhne organske molekule fuzikokcina [4].

Funkcionalnost svojih konstruktov so nato analizirali s posebnimi reporterskimi sistemi. Na prost N-končni del proteina CT52 so vezali določene proteine, ki so pod vplivom fuzikokcina dimerizirali na ogrodnih proteinih in s tem dokazali funkcionalnost le-teh.

Modeliranje proteinov T14-3-3 in CT52
Raziskovalci so nove variante ogrodnih proteinov zasnovali na podlagi računalniških modelov in pri tem uporabili program Rosetta software package. Na proteinu T14-3-3 so tako zasnovali štiri sete mutacij. Poleg že znane mutacije T14-3-3-E19R, ki je v sledečih eksperimentih služila kot pozitivna kontrola, so v posamezna zaporedja proteinov uvedli še računalniško predvidene mutacije S71L in I72V, S71L in W237R.
Komplementarne mutacije so vnesli tudi v zaporedje proteina CT52. Poleg že znane mutacije K943D so načrtali tri nove mutacije I947F, I947H ter S953K, ter s tem v kasnejših eksperimentih zagotovili ustrezno ortogonalnost s proteini T14-3-3.

Načrtovanje dimerov T14-3-3

Nove heterodimerne proteine so sestavili iz dveh monomernih enot, pri čemer je ena od teh predstavljala divji tip proteina T14-3-3, druga monomerna enota pa je vsebovala eno oz. dve mutaciji aminokislinskih ostankov, ki so ključni za vezavo proteinov CT52.

Načrtovanje tetramerov T14-3-3

V naslednji fazi so načrtali tetramer proteina T14-3-3, ki se sicer v naravi pojavlja le v dimerni obliki. Takšni ogrodni proteini naj bi bili sposobni združiti štiri tarčne proteine CT52, poleg tega pa bi imeli številne funkcije. Med drugim bi delovali kot izboljšan sistem za sprožitev celične smrti in sistem za produkcijo ter dostavo bioloških zdravil, sodelovali pa bi naj tudi pri regulaciji sistema CRISPR/Cas9.
Pri načrtovanju so tetramere razdelili v dve skupini, in sicer v homotetramere, ki so sestavljeni iz štirih enakih monomernih enot divjega tipa proteina T14-3-3, ter v heterotetramere, ki vključujejo štiri različne monomere. V projektu so te monomerne enote predstavljali divji tip proteina T14-3-3 in tri mutirane oblike (T14-3-3-S71L-I72V, T14-3-3-W237R in T14-3-3-E19R).
Tetramere so zasnovali na podlagi povezovanja dveh dimernih enot preko povezovalne regije GGS10 z zaporedjem Gly-Gly-Ser, ki se desetkrat ponovi, tak tetramer pa na podlagi štirih vezavnih mest oz. žlebov omogoča vezavo in združevanje kar štirih tarčnih proteinov.

Poskusi in rezultati

Dimeri T14-3-3

Funkcionalnost dimerov so analizirali s sistemom NanoLuc Luciferase. Gre za reporterski sistem, ki ga sestavljata dva različna in neaktivna fragmenta SmallBiT in LargeBiT. Proteini T14-3-3 omogočajo, da se ta posamezna fragmenta povežeta in s tem tvorita aktivno luciferazo NanoLuc, ki ob prisotnosti substrata furimazina emitira svetlobo5.
V projektu so pripravili 10 različnih fragmentov. Fragmenta SmallBiT in LargeBiT so preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec posameznih variant proteina CT52 in te zapise vstavili v vektor pET28a. Po izražanju v E. coli so se povezani proteini ob prisotnosti fuzikokcina vezali na heterodimerne ogrodne proteine. S tem so posledično aktivirali sistem NanoLuc in omogočili emisijo bioluminiscenčne svetlobe z valovno dolžino 460 nm.
V prvi fazi so z merjenjem relativne intenzitete posameznih kompleksov dimernega ogrodnega proteina T14-3-3 in ustreznih vezavnih proteinov CT52 z mutacijami, ki so jih predvideli na podlagi predhodnega modeliranja, najprej preverili funkcionalnost in uspešnost povezovanja teh proteinov.
Pri analizi rezultatov so ugotovili, da je bila v primeru homodimera s povezanimi monomernimi enotami divjega tipa izmerjena intenziteta luminiscence bistveno manjša kot v večini ostalih primerov. Delca NanoBiT sta bila pri tem vezana na identična proteina CT52, zaradi česar je posledično lahko prišlo do vezave dveh delcev SmallBiT ali dveh delcev LargeBiT na en ogrodni dimerni protein.
V primeru heterodimera T14-3-3 z mutacijo W237R se bioluminiscenca v primerjavi z negativno kontrolo ni povečala, kar nakazuje na to, da se interakcije med ogrodnim proteinom in proteinom CT52 niso vzpostavile.
V ostalih primerih so heterodimeri z uvedenimi mutacijami S71L, S71L in I72V ter E19R dali visoke vrednosti bioluminiscence, kar dokazuje pravilno tvorbo kompleksa NanoLuc in s tem funkcionalnost ogrodnih proteinov.
V naslednji fazi so preverjali vpliv koncentracije ogrodnih proteinov pri tvorbi kompleksov. Pri višjih koncentracijah so pričakovali povečano vezavo CT52 in s tem uspešno dimerizacijo obeh delcev NanoBiT, posledično pa se je povečala tudi izmerjena intenziteta bioluminiscence.
V primerih, ki so se v predhodni analizi heterodimerov izkazali za funkcionalne (mutacije S71L, S71L in I72V ter E19R), so tudi v tem eksperimentu ustrezali pričakovanim rezultatom, saj se je intenziteta bioluminiscence povečevala z višanjem koncentracije ogrodnih proteinov T14-3-3.

Tetrameri T14-3-3

Skupina iGEM je načrtan tetramer poskušala izraziti in podrobno ovrednotiti z merjenjem kaspazne aktivnosti. Možnost povezovanja štirih proteinov na tetrameru T14-3-3 namreč omogoča regulacijo celične smrti, sprožitev tega procesa pa je odvisna od aktivacije prokaspaz-9, pri čemer posamezne prokaspaze dimerizirajo in s tem aktivirajo druga drugo.
V skupini so zato kaspazo-9 preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec proteina CT52, zapis ponovno vstavili v vektor pET28b in ga nato izrazili v bakterijah E. coli. Aktivnost kaspaz-9 so preučevali z uporabo fluorogenega substrata Ac-LEHD-AFC. Kaspaze-9 ta substrat razcepijo na nefluorescirajoči peptid in del, ki fluorescira, merjenje fluorescence pa tako po vezavi na ogrodni protein daje informacijo o aktivnosti kaspaz-9 in s tem posredno tudi o funkcionalnosti T14-3-3.
Člani skupine so želeli primerjati aktivnost dimerov in tetramerov ter ob tem preveriti tudi aplikacijo ogrodnih proteinov pri stikalu smrti. Pričakovali so, da bodo tetrameri učinkoviteje aktivirali kaspaze-9, saj na nek način kažejo večjo podobnost z apoptosomi, ki se v procesu apoptoze sestavijo v obliki septamera, poleg tega pa združevanje štirih hibridnih proteinov zagotovi višjo lokalno koncentracijo kaspaz-9 in posledično tudi hitrejšo ter bolj zanesljivo aktivacijo.
Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov).
Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.

Zaključek

Rezultati kažejo na to, da je ekipa iGEM svoj teoretični model pretvorila v uspešno delujoč in vitro sistem. Kljub temu, da so tetramer sintetizirali le na ravni DNA, pa nadaljnje raziskave in delo v tej smeri predstavljajo temelj za številne aplikacije na področju sintezne biologije, predvsem na področju regulacije proteinskih kompleksov.
Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.

Viri

1. Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011).
2. van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001).
3. Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009).
4. Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007).
5. Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016).
6. 2016 iGEM team from Eindhoven University of Technology

Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini

2017-01-02T12:37:46Z

Mojca Kostanjevec:

[http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

Ogrodni proteini, ki regulirajo in usmerjajo združevanje drugih proteinov v celici, igrajo izredno pomembno vlogo v celični signalizaciji. Ker interferirajo s številnimi drugimi proteini in tako regulirajo tudi transkripcijo pomembnih genov, se mnogi ogrodni proteini pogosto uporabljajo v sintezni biologiji.

== Ogrodni proteini 14-3-3 ==

Proteini 14-3-3 so ogrodni proteini, ki specifično vežejo motive s fosforiliranimi oblikami aminokislinskih ostankov serina in treonina v tarčnih proteinih. Obenem gre za družino proteinov, ki je močno evolucijsko ohranjena v vseh evkariontskih celicah, večina organizmov pa vsebuje več različnih, vendar strukturno dokaj podobnih izoform, ki navadno tvorijo homo- ter heterodimere. Takšna raznolikost izoform omogoča vezavo številnih interakcijskih partnerjev – do sedaj je bilo identificiranih več kot 200 signalnih proteinov [1].

Proteini 14-3-3 iz tega razloga sodelujejo pri velikem številu bioloških procesov, kot so npr. napredovanje in kontrola celičnega cikla, apoptoza, metabolizem, transkripcija in regulacija izražanja genov ter popravljanje napak DNA2.
Funkcije proteinov 14-3-3 lahko uvrstimo v štiri glavna področja delovanja, in sicer je najbolj osnovna funkcija teh ogrodnih proteinov združevanje komponent posamezne signalne kaskade in s tem izboljšanje njene učinkovitosti. Povezava proteina 14-3-3 in tarčnega proteina na tak način stabilizira tudi proteinske komplekse, sproži pa lahko tudi konformacijske spremembe vezanega proteina in s tem regulira njegovo encimsko aktivnost. Še ena pomembna funkcija je lokalizacija signalnih molekul na specifičnem območju oz. mestu v znotrajceličnih organelih, kar je lahko pomembno za sintezo določenih intermediatov, proteini 14-3-3 pa so pomembni tudi iz stališča regulacije pozitivnih in negativnih povratnih zank. Ne nazadnje lahko objamejo tudi določeno regijo tarčnega proteina in tako preprečijo interakcije z drugimi molekulami (npr. z DNA ali proteini) ali pa vezan protein zaščitijo pred defosforilacijo in proteolitsko razgradnjo1,2,3.

Projekt

V ekipi iGEM iz TU Eindhoven so pri svojem raziskovalnem delu na področju sintezne biologije opisane lastnosti izkoristili v ta namen, da so razvili nove variante ogrodnih proteinov – heterodimerne ter tetramerne variante, s čimer so poskušali doseči regulacijo več različnih proteinskih interakcij.
Pri tem so uporabili ogrodni protein T14-3-3, ki izvira iz rastline Nicotiana plumbaginifolia (tobak). Ta dimerni protein interagira z 52 aminokislinskih ostankov dolgim proteinom CT52, ki v resnici predstavlja izoliran C-končni citosolni del H+-ATPaze iz plazemskih membran rastlinskih celic (aminokislinski ostanki 905-956). Interakcija T14-3-3 se vzpostavi s prostim C-koncem CT52 in je stabilizirana z dodatno vezavo majhne organske molekule fuzikokcina4.
Funkcionalnost svojih konstruktov so nato analizirali s posebnimi reporterskimi sistemi. Na prost N-končni del proteina CT52 so vezali določene proteine, ki so pod vplivom fuzikokcina dimerizirali na ogrodnih proteinih in s tem dokazali funkcionalnost le-teh.

Modeliranje proteinov T14-3-3 in CT52
Raziskovalci so nove variante ogrodnih proteinov zasnovali na podlagi računalniških modelov in pri tem uporabili program Rosetta software package. Na proteinu T14-3-3 so tako zasnovali štiri sete mutacij. Poleg že znane mutacije T14-3-3-E19R, ki je v sledečih eksperimentih služila kot pozitivna kontrola, so v posamezna zaporedja proteinov uvedli še računalniško predvidene mutacije S71L in I72V, S71L in W237R.
Komplementarne mutacije so vnesli tudi v zaporedje proteina CT52. Poleg že znane mutacije K943D so načrtali tri nove mutacije I947F, I947H ter S953K, ter s tem v kasnejših eksperimentih zagotovili ustrezno ortogonalnost s proteini T14-3-3.

Načrtovanje dimerov T14-3-3

Nove heterodimerne proteine so sestavili iz dveh monomernih enot, pri čemer je ena od teh predstavljala divji tip proteina T14-3-3, druga monomerna enota pa je vsebovala eno oz. dve mutaciji aminokislinskih ostankov, ki so ključni za vezavo proteinov CT52.

Načrtovanje tetramerov T14-3-3

V naslednji fazi so načrtali tetramer proteina T14-3-3, ki se sicer v naravi pojavlja le v dimerni obliki. Takšni ogrodni proteini naj bi bili sposobni združiti štiri tarčne proteine CT52, poleg tega pa bi imeli številne funkcije. Med drugim bi delovali kot izboljšan sistem za sprožitev celične smrti in sistem za produkcijo ter dostavo bioloških zdravil, sodelovali pa bi naj tudi pri regulaciji sistema CRISPR/Cas9.
Pri načrtovanju so tetramere razdelili v dve skupini, in sicer v homotetramere, ki so sestavljeni iz štirih enakih monomernih enot divjega tipa proteina T14-3-3, ter v heterotetramere, ki vključujejo štiri različne monomere. V projektu so te monomerne enote predstavljali divji tip proteina T14-3-3 in tri mutirane oblike (T14-3-3-S71L-I72V, T14-3-3-W237R in T14-3-3-E19R).
Tetramere so zasnovali na podlagi povezovanja dveh dimernih enot preko povezovalne regije GGS10 z zaporedjem Gly-Gly-Ser, ki se desetkrat ponovi, tak tetramer pa na podlagi štirih vezavnih mest oz. žlebov omogoča vezavo in združevanje kar štirih tarčnih proteinov.

Poskusi in rezultati

Dimeri T14-3-3

Funkcionalnost dimerov so analizirali s sistemom NanoLuc Luciferase. Gre za reporterski sistem, ki ga sestavljata dva različna in neaktivna fragmenta SmallBiT in LargeBiT. Proteini T14-3-3 omogočajo, da se ta posamezna fragmenta povežeta in s tem tvorita aktivno luciferazo NanoLuc, ki ob prisotnosti substrata furimazina emitira svetlobo5.
V projektu so pripravili 10 različnih fragmentov. Fragmenta SmallBiT in LargeBiT so preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec posameznih variant proteina CT52 in te zapise vstavili v vektor pET28a. Po izražanju v E. coli so se povezani proteini ob prisotnosti fuzikokcina vezali na heterodimerne ogrodne proteine. S tem so posledično aktivirali sistem NanoLuc in omogočili emisijo bioluminiscenčne svetlobe z valovno dolžino 460 nm.
V prvi fazi so z merjenjem relativne intenzitete posameznih kompleksov dimernega ogrodnega proteina T14-3-3 in ustreznih vezavnih proteinov CT52 z mutacijami, ki so jih predvideli na podlagi predhodnega modeliranja, najprej preverili funkcionalnost in uspešnost povezovanja teh proteinov.
Pri analizi rezultatov so ugotovili, da je bila v primeru homodimera s povezanimi monomernimi enotami divjega tipa izmerjena intenziteta luminiscence bistveno manjša kot v večini ostalih primerov. Delca NanoBiT sta bila pri tem vezana na identična proteina CT52, zaradi česar je posledično lahko prišlo do vezave dveh delcev SmallBiT ali dveh delcev LargeBiT na en ogrodni dimerni protein.
V primeru heterodimera T14-3-3 z mutacijo W237R se bioluminiscenca v primerjavi z negativno kontrolo ni povečala, kar nakazuje na to, da se interakcije med ogrodnim proteinom in proteinom CT52 niso vzpostavile.
V ostalih primerih so heterodimeri z uvedenimi mutacijami S71L, S71L in I72V ter E19R dali visoke vrednosti bioluminiscence, kar dokazuje pravilno tvorbo kompleksa NanoLuc in s tem funkcionalnost ogrodnih proteinov.
V naslednji fazi so preverjali vpliv koncentracije ogrodnih proteinov pri tvorbi kompleksov. Pri višjih koncentracijah so pričakovali povečano vezavo CT52 in s tem uspešno dimerizacijo obeh delcev NanoBiT, posledično pa se je povečala tudi izmerjena intenziteta bioluminiscence.
V primerih, ki so se v predhodni analizi heterodimerov izkazali za funkcionalne (mutacije S71L, S71L in I72V ter E19R), so tudi v tem eksperimentu ustrezali pričakovanim rezultatom, saj se je intenziteta bioluminiscence povečevala z višanjem koncentracije ogrodnih proteinov T14-3-3.

Tetrameri T14-3-3

Skupina iGEM je načrtan tetramer poskušala izraziti in podrobno ovrednotiti z merjenjem kaspazne aktivnosti. Možnost povezovanja štirih proteinov na tetrameru T14-3-3 namreč omogoča regulacijo celične smrti, sprožitev tega procesa pa je odvisna od aktivacije prokaspaz-9, pri čemer posamezne prokaspaze dimerizirajo in s tem aktivirajo druga drugo.
V skupini so zato kaspazo-9 preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec proteina CT52, zapis ponovno vstavili v vektor pET28b in ga nato izrazili v bakterijah E. coli. Aktivnost kaspaz-9 so preučevali z uporabo fluorogenega substrata Ac-LEHD-AFC. Kaspaze-9 ta substrat razcepijo na nefluorescirajoči peptid in del, ki fluorescira, merjenje fluorescence pa tako po vezavi na ogrodni protein daje informacijo o aktivnosti kaspaz-9 in s tem posredno tudi o funkcionalnosti T14-3-3.
Člani skupine so želeli primerjati aktivnost dimerov in tetramerov ter ob tem preveriti tudi aplikacijo ogrodnih proteinov pri stikalu smrti. Pričakovali so, da bodo tetrameri učinkoviteje aktivirali kaspaze-9, saj na nek način kažejo večjo podobnost z apoptosomi, ki se v procesu apoptoze sestavijo v obliki septamera, poleg tega pa združevanje štirih hibridnih proteinov zagotovi višjo lokalno koncentracijo kaspaz-9 in posledično tudi hitrejšo ter bolj zanesljivo aktivacijo.
Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov).
Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.

Zaključek

Rezultati kažejo na to, da je ekipa iGEM svoj teoretični model pretvorila v uspešno delujoč in vitro sistem. Kljub temu, da so tetramer sintetizirali le na ravni DNA, pa nadaljnje raziskave in delo v tej smeri predstavljajo temelj za številne aplikacije na področju sintezne biologije, predvsem na področju regulacije proteinskih kompleksov.
Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.

Viri

1. Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011).
2. van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001).
3. Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009).
4. Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007).
5. Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016).
6. 2016 iGEM team from Eindhoven University of Technology

Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini

2017-01-02T12:37:02Z

Mojca Kostanjevec:

[http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

Ogrodni proteini, ki regulirajo in usmerjajo združevanje drugih proteinov v celici, igrajo izredno pomembno vlogo v celični signalizaciji. Ker interferirajo s številnimi drugimi proteini in tako regulirajo tudi transkripcijo pomembnih genov, se mnogi ogrodni proteini pogosto uporabljajo v sintezni biologiji.

== Ogrodni proteini 14-3-3 ==

Proteini 14-3-3 so ogrodni proteini, ki specifično vežejo motive s fosforiliranimi oblikami aminokislinskih ostankov serina in treonina v tarčnih proteinih. Obenem gre za družino proteinov, ki je močno evolucijsko ohranjena v vseh evkariontskih celicah, večina organizmov pa vsebuje več različnih, vendar strukturno dokaj podobnih izoform, ki navadno tvorijo homo- ter heterodimere. Takšna raznolikost izoform omogoča vezavo številnih interakcijskih partnerjev – do sedaj je bilo identificiranih več kot 200 signalnih proteinov1.

Proteini 14-3-3 iz tega razloga sodelujejo pri velikem številu bioloških procesov, kot so npr. napredovanje in kontrola celičnega cikla, apoptoza, metabolizem, transkripcija in regulacija izražanja genov ter popravljanje napak DNA2.
Funkcije proteinov 14-3-3 lahko uvrstimo v štiri glavna področja delovanja, in sicer je najbolj osnovna funkcija teh ogrodnih proteinov združevanje komponent posamezne signalne kaskade in s tem izboljšanje njene učinkovitosti. Povezava proteina 14-3-3 in tarčnega proteina na tak način stabilizira tudi proteinske komplekse, sproži pa lahko tudi konformacijske spremembe vezanega proteina in s tem regulira njegovo encimsko aktivnost. Še ena pomembna funkcija je lokalizacija signalnih molekul na specifičnem območju oz. mestu v znotrajceličnih organelih, kar je lahko pomembno za sintezo določenih intermediatov, proteini 14-3-3 pa so pomembni tudi iz stališča regulacije pozitivnih in negativnih povratnih zank. Ne nazadnje lahko objamejo tudi določeno regijo tarčnega proteina in tako preprečijo interakcije z drugimi molekulami (npr. z DNA ali proteini) ali pa vezan protein zaščitijo pred defosforilacijo in proteolitsko razgradnjo1,2,3.

Projekt

V ekipi iGEM iz TU Eindhoven so pri svojem raziskovalnem delu na področju sintezne biologije opisane lastnosti izkoristili v ta namen, da so razvili nove variante ogrodnih proteinov – heterodimerne ter tetramerne variante, s čimer so poskušali doseči regulacijo več različnih proteinskih interakcij.
Pri tem so uporabili ogrodni protein T14-3-3, ki izvira iz rastline Nicotiana plumbaginifolia (tobak). Ta dimerni protein interagira z 52 aminokislinskih ostankov dolgim proteinom CT52, ki v resnici predstavlja izoliran C-končni citosolni del H+-ATPaze iz plazemskih membran rastlinskih celic (aminokislinski ostanki 905-956). Interakcija T14-3-3 se vzpostavi s prostim C-koncem CT52 in je stabilizirana z dodatno vezavo majhne organske molekule fuzikokcina4.
Funkcionalnost svojih konstruktov so nato analizirali s posebnimi reporterskimi sistemi. Na prost N-končni del proteina CT52 so vezali določene proteine, ki so pod vplivom fuzikokcina dimerizirali na ogrodnih proteinih in s tem dokazali funkcionalnost le-teh.

Modeliranje proteinov T14-3-3 in CT52
Raziskovalci so nove variante ogrodnih proteinov zasnovali na podlagi računalniških modelov in pri tem uporabili program Rosetta software package. Na proteinu T14-3-3 so tako zasnovali štiri sete mutacij. Poleg že znane mutacije T14-3-3-E19R, ki je v sledečih eksperimentih služila kot pozitivna kontrola, so v posamezna zaporedja proteinov uvedli še računalniško predvidene mutacije S71L in I72V, S71L in W237R.
Komplementarne mutacije so vnesli tudi v zaporedje proteina CT52. Poleg že znane mutacije K943D so načrtali tri nove mutacije I947F, I947H ter S953K, ter s tem v kasnejših eksperimentih zagotovili ustrezno ortogonalnost s proteini T14-3-3.

Načrtovanje dimerov T14-3-3

Nove heterodimerne proteine so sestavili iz dveh monomernih enot, pri čemer je ena od teh predstavljala divji tip proteina T14-3-3, druga monomerna enota pa je vsebovala eno oz. dve mutaciji aminokislinskih ostankov, ki so ključni za vezavo proteinov CT52.

Načrtovanje tetramerov T14-3-3

V naslednji fazi so načrtali tetramer proteina T14-3-3, ki se sicer v naravi pojavlja le v dimerni obliki. Takšni ogrodni proteini naj bi bili sposobni združiti štiri tarčne proteine CT52, poleg tega pa bi imeli številne funkcije. Med drugim bi delovali kot izboljšan sistem za sprožitev celične smrti in sistem za produkcijo ter dostavo bioloških zdravil, sodelovali pa bi naj tudi pri regulaciji sistema CRISPR/Cas9.
Pri načrtovanju so tetramere razdelili v dve skupini, in sicer v homotetramere, ki so sestavljeni iz štirih enakih monomernih enot divjega tipa proteina T14-3-3, ter v heterotetramere, ki vključujejo štiri različne monomere. V projektu so te monomerne enote predstavljali divji tip proteina T14-3-3 in tri mutirane oblike (T14-3-3-S71L-I72V, T14-3-3-W237R in T14-3-3-E19R).
Tetramere so zasnovali na podlagi povezovanja dveh dimernih enot preko povezovalne regije GGS10 z zaporedjem Gly-Gly-Ser, ki se desetkrat ponovi, tak tetramer pa na podlagi štirih vezavnih mest oz. žlebov omogoča vezavo in združevanje kar štirih tarčnih proteinov.

Poskusi in rezultati

Dimeri T14-3-3

Funkcionalnost dimerov so analizirali s sistemom NanoLuc Luciferase. Gre za reporterski sistem, ki ga sestavljata dva različna in neaktivna fragmenta SmallBiT in LargeBiT. Proteini T14-3-3 omogočajo, da se ta posamezna fragmenta povežeta in s tem tvorita aktivno luciferazo NanoLuc, ki ob prisotnosti substrata furimazina emitira svetlobo5.
V projektu so pripravili 10 različnih fragmentov. Fragmenta SmallBiT in LargeBiT so preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec posameznih variant proteina CT52 in te zapise vstavili v vektor pET28a. Po izražanju v E. coli so se povezani proteini ob prisotnosti fuzikokcina vezali na heterodimerne ogrodne proteine. S tem so posledično aktivirali sistem NanoLuc in omogočili emisijo bioluminiscenčne svetlobe z valovno dolžino 460 nm.
V prvi fazi so z merjenjem relativne intenzitete posameznih kompleksov dimernega ogrodnega proteina T14-3-3 in ustreznih vezavnih proteinov CT52 z mutacijami, ki so jih predvideli na podlagi predhodnega modeliranja, najprej preverili funkcionalnost in uspešnost povezovanja teh proteinov.
Pri analizi rezultatov so ugotovili, da je bila v primeru homodimera s povezanimi monomernimi enotami divjega tipa izmerjena intenziteta luminiscence bistveno manjša kot v večini ostalih primerov. Delca NanoBiT sta bila pri tem vezana na identična proteina CT52, zaradi česar je posledično lahko prišlo do vezave dveh delcev SmallBiT ali dveh delcev LargeBiT na en ogrodni dimerni protein.
V primeru heterodimera T14-3-3 z mutacijo W237R se bioluminiscenca v primerjavi z negativno kontrolo ni povečala, kar nakazuje na to, da se interakcije med ogrodnim proteinom in proteinom CT52 niso vzpostavile.
V ostalih primerih so heterodimeri z uvedenimi mutacijami S71L, S71L in I72V ter E19R dali visoke vrednosti bioluminiscence, kar dokazuje pravilno tvorbo kompleksa NanoLuc in s tem funkcionalnost ogrodnih proteinov.
V naslednji fazi so preverjali vpliv koncentracije ogrodnih proteinov pri tvorbi kompleksov. Pri višjih koncentracijah so pričakovali povečano vezavo CT52 in s tem uspešno dimerizacijo obeh delcev NanoBiT, posledično pa se je povečala tudi izmerjena intenziteta bioluminiscence.
V primerih, ki so se v predhodni analizi heterodimerov izkazali za funkcionalne (mutacije S71L, S71L in I72V ter E19R), so tudi v tem eksperimentu ustrezali pričakovanim rezultatom, saj se je intenziteta bioluminiscence povečevala z višanjem koncentracije ogrodnih proteinov T14-3-3.

Tetrameri T14-3-3

Skupina iGEM je načrtan tetramer poskušala izraziti in podrobno ovrednotiti z merjenjem kaspazne aktivnosti. Možnost povezovanja štirih proteinov na tetrameru T14-3-3 namreč omogoča regulacijo celične smrti, sprožitev tega procesa pa je odvisna od aktivacije prokaspaz-9, pri čemer posamezne prokaspaze dimerizirajo in s tem aktivirajo druga drugo.
V skupini so zato kaspazo-9 preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec proteina CT52, zapis ponovno vstavili v vektor pET28b in ga nato izrazili v bakterijah E. coli. Aktivnost kaspaz-9 so preučevali z uporabo fluorogenega substrata Ac-LEHD-AFC. Kaspaze-9 ta substrat razcepijo na nefluorescirajoči peptid in del, ki fluorescira, merjenje fluorescence pa tako po vezavi na ogrodni protein daje informacijo o aktivnosti kaspaz-9 in s tem posredno tudi o funkcionalnosti T14-3-3.
Člani skupine so želeli primerjati aktivnost dimerov in tetramerov ter ob tem preveriti tudi aplikacijo ogrodnih proteinov pri stikalu smrti. Pričakovali so, da bodo tetrameri učinkoviteje aktivirali kaspaze-9, saj na nek način kažejo večjo podobnost z apoptosomi, ki se v procesu apoptoze sestavijo v obliki septamera, poleg tega pa združevanje štirih hibridnih proteinov zagotovi višjo lokalno koncentracijo kaspaz-9 in posledično tudi hitrejšo ter bolj zanesljivo aktivacijo.
Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov).
Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.

Zaključek

Rezultati kažejo na to, da je ekipa iGEM svoj teoretični model pretvorila v uspešno delujoč in vitro sistem. Kljub temu, da so tetramer sintetizirali le na ravni DNA, pa nadaljnje raziskave in delo v tej smeri predstavljajo temelj za številne aplikacije na področju sintezne biologije, predvsem na področju regulacije proteinskih kompleksov.
Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.

Viri

1. Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011).
2. van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001).
3. Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009).
4. Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007).
5. Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016).
6. 2016 iGEM team from Eindhoven University of Technology

Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini

2017-01-02T12:36:46Z

Mojca Kostanjevec:

[http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

Ogrodni proteini, ki regulirajo in usmerjajo združevanje drugih proteinov v celici, igrajo izredno pomembno vlogo v celični signalizaciji. Ker interferirajo s številnimi drugimi proteini in tako regulirajo tudi transkripcijo pomembnih genov, se mnogi ogrodni proteini pogosto uporabljajo v sintezni biologiji.

== Ogrodni proteini 14-3-3 ==

Proteini 14-3-3 so ogrodni proteini, ki specifično vežejo motive s fosforiliranimi oblikami aminokislinskih ostankov serina in treonina v tarčnih proteinih. Obenem gre za družino proteinov, ki je močno evolucijsko ohranjena v vseh evkariontskih celicah, večina organizmov pa vsebuje več različnih, vendar strukturno dokaj podobnih izoform, ki navadno tvorijo homo- ter heterodimere. Takšna raznolikost izoform omogoča vezavo številnih interakcijskih partnerjev – do sedaj je bilo identificiranih več kot 200 signalnih proteinov1.
Proteini 14-3-3 iz tega razloga sodelujejo pri velikem številu bioloških procesov, kot so npr. napredovanje in kontrola celičnega cikla, apoptoza, metabolizem, transkripcija in regulacija izražanja genov ter popravljanje napak DNA2.
Funkcije proteinov 14-3-3 lahko uvrstimo v štiri glavna področja delovanja, in sicer je najbolj osnovna funkcija teh ogrodnih proteinov združevanje komponent posamezne signalne kaskade in s tem izboljšanje njene učinkovitosti. Povezava proteina 14-3-3 in tarčnega proteina na tak način stabilizira tudi proteinske komplekse, sproži pa lahko tudi konformacijske spremembe vezanega proteina in s tem regulira njegovo encimsko aktivnost. Še ena pomembna funkcija je lokalizacija signalnih molekul na specifičnem območju oz. mestu v znotrajceličnih organelih, kar je lahko pomembno za sintezo določenih intermediatov, proteini 14-3-3 pa so pomembni tudi iz stališča regulacije pozitivnih in negativnih povratnih zank. Ne nazadnje lahko objamejo tudi določeno regijo tarčnega proteina in tako preprečijo interakcije z drugimi molekulami (npr. z DNA ali proteini) ali pa vezan protein zaščitijo pred defosforilacijo in proteolitsko razgradnjo1,2,3.

Projekt

V ekipi iGEM iz TU Eindhoven so pri svojem raziskovalnem delu na področju sintezne biologije opisane lastnosti izkoristili v ta namen, da so razvili nove variante ogrodnih proteinov – heterodimerne ter tetramerne variante, s čimer so poskušali doseči regulacijo več različnih proteinskih interakcij.
Pri tem so uporabili ogrodni protein T14-3-3, ki izvira iz rastline Nicotiana plumbaginifolia (tobak). Ta dimerni protein interagira z 52 aminokislinskih ostankov dolgim proteinom CT52, ki v resnici predstavlja izoliran C-končni citosolni del H+-ATPaze iz plazemskih membran rastlinskih celic (aminokislinski ostanki 905-956). Interakcija T14-3-3 se vzpostavi s prostim C-koncem CT52 in je stabilizirana z dodatno vezavo majhne organske molekule fuzikokcina4.
Funkcionalnost svojih konstruktov so nato analizirali s posebnimi reporterskimi sistemi. Na prost N-končni del proteina CT52 so vezali določene proteine, ki so pod vplivom fuzikokcina dimerizirali na ogrodnih proteinih in s tem dokazali funkcionalnost le-teh.

Modeliranje proteinov T14-3-3 in CT52
Raziskovalci so nove variante ogrodnih proteinov zasnovali na podlagi računalniških modelov in pri tem uporabili program Rosetta software package. Na proteinu T14-3-3 so tako zasnovali štiri sete mutacij. Poleg že znane mutacije T14-3-3-E19R, ki je v sledečih eksperimentih služila kot pozitivna kontrola, so v posamezna zaporedja proteinov uvedli še računalniško predvidene mutacije S71L in I72V, S71L in W237R.
Komplementarne mutacije so vnesli tudi v zaporedje proteina CT52. Poleg že znane mutacije K943D so načrtali tri nove mutacije I947F, I947H ter S953K, ter s tem v kasnejših eksperimentih zagotovili ustrezno ortogonalnost s proteini T14-3-3.

Načrtovanje dimerov T14-3-3

Nove heterodimerne proteine so sestavili iz dveh monomernih enot, pri čemer je ena od teh predstavljala divji tip proteina T14-3-3, druga monomerna enota pa je vsebovala eno oz. dve mutaciji aminokislinskih ostankov, ki so ključni za vezavo proteinov CT52.

Načrtovanje tetramerov T14-3-3

V naslednji fazi so načrtali tetramer proteina T14-3-3, ki se sicer v naravi pojavlja le v dimerni obliki. Takšni ogrodni proteini naj bi bili sposobni združiti štiri tarčne proteine CT52, poleg tega pa bi imeli številne funkcije. Med drugim bi delovali kot izboljšan sistem za sprožitev celične smrti in sistem za produkcijo ter dostavo bioloških zdravil, sodelovali pa bi naj tudi pri regulaciji sistema CRISPR/Cas9.
Pri načrtovanju so tetramere razdelili v dve skupini, in sicer v homotetramere, ki so sestavljeni iz štirih enakih monomernih enot divjega tipa proteina T14-3-3, ter v heterotetramere, ki vključujejo štiri različne monomere. V projektu so te monomerne enote predstavljali divji tip proteina T14-3-3 in tri mutirane oblike (T14-3-3-S71L-I72V, T14-3-3-W237R in T14-3-3-E19R).
Tetramere so zasnovali na podlagi povezovanja dveh dimernih enot preko povezovalne regije GGS10 z zaporedjem Gly-Gly-Ser, ki se desetkrat ponovi, tak tetramer pa na podlagi štirih vezavnih mest oz. žlebov omogoča vezavo in združevanje kar štirih tarčnih proteinov.

Poskusi in rezultati

Dimeri T14-3-3

Funkcionalnost dimerov so analizirali s sistemom NanoLuc Luciferase. Gre za reporterski sistem, ki ga sestavljata dva različna in neaktivna fragmenta SmallBiT in LargeBiT. Proteini T14-3-3 omogočajo, da se ta posamezna fragmenta povežeta in s tem tvorita aktivno luciferazo NanoLuc, ki ob prisotnosti substrata furimazina emitira svetlobo5.
V projektu so pripravili 10 različnih fragmentov. Fragmenta SmallBiT in LargeBiT so preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec posameznih variant proteina CT52 in te zapise vstavili v vektor pET28a. Po izražanju v E. coli so se povezani proteini ob prisotnosti fuzikokcina vezali na heterodimerne ogrodne proteine. S tem so posledično aktivirali sistem NanoLuc in omogočili emisijo bioluminiscenčne svetlobe z valovno dolžino 460 nm.
V prvi fazi so z merjenjem relativne intenzitete posameznih kompleksov dimernega ogrodnega proteina T14-3-3 in ustreznih vezavnih proteinov CT52 z mutacijami, ki so jih predvideli na podlagi predhodnega modeliranja, najprej preverili funkcionalnost in uspešnost povezovanja teh proteinov.
Pri analizi rezultatov so ugotovili, da je bila v primeru homodimera s povezanimi monomernimi enotami divjega tipa izmerjena intenziteta luminiscence bistveno manjša kot v večini ostalih primerov. Delca NanoBiT sta bila pri tem vezana na identična proteina CT52, zaradi česar je posledično lahko prišlo do vezave dveh delcev SmallBiT ali dveh delcev LargeBiT na en ogrodni dimerni protein.
V primeru heterodimera T14-3-3 z mutacijo W237R se bioluminiscenca v primerjavi z negativno kontrolo ni povečala, kar nakazuje na to, da se interakcije med ogrodnim proteinom in proteinom CT52 niso vzpostavile.
V ostalih primerih so heterodimeri z uvedenimi mutacijami S71L, S71L in I72V ter E19R dali visoke vrednosti bioluminiscence, kar dokazuje pravilno tvorbo kompleksa NanoLuc in s tem funkcionalnost ogrodnih proteinov.
V naslednji fazi so preverjali vpliv koncentracije ogrodnih proteinov pri tvorbi kompleksov. Pri višjih koncentracijah so pričakovali povečano vezavo CT52 in s tem uspešno dimerizacijo obeh delcev NanoBiT, posledično pa se je povečala tudi izmerjena intenziteta bioluminiscence.
V primerih, ki so se v predhodni analizi heterodimerov izkazali za funkcionalne (mutacije S71L, S71L in I72V ter E19R), so tudi v tem eksperimentu ustrezali pričakovanim rezultatom, saj se je intenziteta bioluminiscence povečevala z višanjem koncentracije ogrodnih proteinov T14-3-3.

Tetrameri T14-3-3

Skupina iGEM je načrtan tetramer poskušala izraziti in podrobno ovrednotiti z merjenjem kaspazne aktivnosti. Možnost povezovanja štirih proteinov na tetrameru T14-3-3 namreč omogoča regulacijo celične smrti, sprožitev tega procesa pa je odvisna od aktivacije prokaspaz-9, pri čemer posamezne prokaspaze dimerizirajo in s tem aktivirajo druga drugo.
V skupini so zato kaspazo-9 preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec proteina CT52, zapis ponovno vstavili v vektor pET28b in ga nato izrazili v bakterijah E. coli. Aktivnost kaspaz-9 so preučevali z uporabo fluorogenega substrata Ac-LEHD-AFC. Kaspaze-9 ta substrat razcepijo na nefluorescirajoči peptid in del, ki fluorescira, merjenje fluorescence pa tako po vezavi na ogrodni protein daje informacijo o aktivnosti kaspaz-9 in s tem posredno tudi o funkcionalnosti T14-3-3.
Člani skupine so želeli primerjati aktivnost dimerov in tetramerov ter ob tem preveriti tudi aplikacijo ogrodnih proteinov pri stikalu smrti. Pričakovali so, da bodo tetrameri učinkoviteje aktivirali kaspaze-9, saj na nek način kažejo večjo podobnost z apoptosomi, ki se v procesu apoptoze sestavijo v obliki septamera, poleg tega pa združevanje štirih hibridnih proteinov zagotovi višjo lokalno koncentracijo kaspaz-9 in posledično tudi hitrejšo ter bolj zanesljivo aktivacijo.
Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov).
Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.

Zaključek

Rezultati kažejo na to, da je ekipa iGEM svoj teoretični model pretvorila v uspešno delujoč in vitro sistem. Kljub temu, da so tetramer sintetizirali le na ravni DNA, pa nadaljnje raziskave in delo v tej smeri predstavljajo temelj za številne aplikacije na področju sintezne biologije, predvsem na področju regulacije proteinskih kompleksov.
Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.

Viri

1. Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011).
2. van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001).
3. Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009).
4. Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007).
5. Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016).
6. 2016 iGEM team from Eindhoven University of Technology

Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini

2017-01-02T12:36:03Z

Mojca Kostanjevec:

[http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

Ogrodni proteini, ki regulirajo in usmerjajo združevanje drugih proteinov v celici, igrajo izredno pomembno vlogo v celični signalizaciji. Ker interferirajo s številnimi drugimi proteini in tako regulirajo tudi transkripcijo pomembnih genov, se mnogi ogrodni proteini pogosto uporabljajo v sintezni biologiji.

== Ogrodni proteini 14-3-3 ==

Proteini 14-3-3 so ogrodni proteini, ki specifično vežejo motive s fosforiliranimi oblikami aminokislinskih ostankov serina in treonina v tarčnih proteinih. Obenem gre za družino proteinov, ki je močno evolucijsko ohranjena v vseh evkariontskih celicah, večina organizmov pa vsebuje več različnih, vendar strukturno dokaj podobnih izoform, ki navadno tvorijo homo- ter heterodimere. Takšna raznolikost izoform omogoča vezavo številnih interakcijskih partnerjev – do sedaj je bilo identificiranih več kot 200 signalnih proteinov1.
Proteini 14-3-3 iz tega razloga sodelujejo pri velikem številu bioloških procesov, kot so npr. napredovanje in kontrola celičnega cikla, apoptoza, metabolizem, transkripcija in regulacija izražanja genov ter popravljanje napak DNA2.
Funkcije proteinov 14-3-3 lahko uvrstimo v štiri glavna področja delovanja, in sicer je najbolj osnovna funkcija teh ogrodnih proteinov združevanje komponent posamezne signalne kaskade in s tem izboljšanje njene učinkovitosti. Povezava proteina 14-3-3 in tarčnega proteina na tak način stabilizira tudi proteinske komplekse, sproži pa lahko tudi konformacijske spremembe vezanega proteina in s tem regulira njegovo encimsko aktivnost. Še ena pomembna funkcija je lokalizacija signalnih molekul na specifičnem območju oz. mestu v znotrajceličnih organelih, kar je lahko pomembno za sintezo določenih intermediatov, proteini 14-3-3 pa so pomembni tudi iz stališča regulacije pozitivnih in negativnih povratnih zank. Ne nazadnje lahko objamejo tudi določeno regijo tarčnega proteina in tako preprečijo interakcije z drugimi molekulami (npr. z DNA ali proteini) ali pa vezan protein zaščitijo pred defosforilacijo in proteolitsko razgradnjo1,2,3.

Projekt

V ekipi iGEM iz TU Eindhoven so pri svojem raziskovalnem delu na področju sintezne biologije opisane lastnosti izkoristili v ta namen, da so razvili nove variante ogrodnih proteinov – heterodimerne ter tetramerne variante, s čimer so poskušali doseči regulacijo več različnih proteinskih interakcij.
Pri tem so uporabili ogrodni protein T14-3-3, ki izvira iz rastline Nicotiana plumbaginifolia (tobak). Ta dimerni protein interagira z 52 aminokislinskih ostankov dolgim proteinom CT52, ki v resnici predstavlja izoliran C-končni citosolni del H+-ATPaze iz plazemskih membran rastlinskih celic (aminokislinski ostanki 905-956). Interakcija T14-3-3 se vzpostavi s prostim C-koncem CT52 in je stabilizirana z dodatno vezavo majhne organske molekule fuzikokcina4.
Funkcionalnost svojih konstruktov so nato analizirali s posebnimi reporterskimi sistemi. Na prost N-končni del proteina CT52 so vezali določene proteine, ki so pod vplivom fuzikokcina dimerizirali na ogrodnih proteinih in s tem dokazali funkcionalnost le-teh.

Modeliranje proteinov T14-3-3 in CT52
Raziskovalci so nove variante ogrodnih proteinov zasnovali na podlagi računalniških modelov in pri tem uporabili program Rosetta software package. Na proteinu T14-3-3 so tako zasnovali štiri sete mutacij. Poleg že znane mutacije T14-3-3-E19R, ki je v sledečih eksperimentih služila kot pozitivna kontrola, so v posamezna zaporedja proteinov uvedli še računalniško predvidene mutacije S71L in I72V, S71L in W237R.
Komplementarne mutacije so vnesli tudi v zaporedje proteina CT52. Poleg že znane mutacije K943D so načrtali tri nove mutacije I947F, I947H ter S953K, ter s tem v kasnejših eksperimentih zagotovili ustrezno ortogonalnost s proteini T14-3-3.

Načrtovanje dimerov T14-3-3

Nove heterodimerne proteine so sestavili iz dveh monomernih enot, pri čemer je ena od teh predstavljala divji tip proteina T14-3-3, druga monomerna enota pa je vsebovala eno oz. dve mutaciji aminokislinskih ostankov, ki so ključni za vezavo proteinov CT52.

Načrtovanje tetramerov T14-3-3

V naslednji fazi so načrtali tetramer proteina T14-3-3, ki se sicer v naravi pojavlja le v dimerni obliki. Takšni ogrodni proteini naj bi bili sposobni združiti štiri tarčne proteine CT52, poleg tega pa bi imeli številne funkcije. Med drugim bi delovali kot izboljšan sistem za sprožitev celične smrti in sistem za produkcijo ter dostavo bioloških zdravil, sodelovali pa bi naj tudi pri regulaciji sistema CRISPR/Cas9.
Pri načrtovanju so tetramere razdelili v dve skupini, in sicer v homotetramere, ki so sestavljeni iz štirih enakih monomernih enot divjega tipa proteina T14-3-3, ter v heterotetramere, ki vključujejo štiri različne monomere. V projektu so te monomerne enote predstavljali divji tip proteina T14-3-3 in tri mutirane oblike (T14-3-3-S71L-I72V, T14-3-3-W237R in T14-3-3-E19R).
Tetramere so zasnovali na podlagi povezovanja dveh dimernih enot preko povezovalne regije GGS10 z zaporedjem Gly-Gly-Ser, ki se desetkrat ponovi, tak tetramer pa na podlagi štirih vezavnih mest oz. žlebov omogoča vezavo in združevanje kar štirih tarčnih proteinov.

Poskusi in rezultati

Dimeri T14-3-3

Funkcionalnost dimerov so analizirali s sistemom NanoLuc Luciferase. Gre za reporterski sistem, ki ga sestavljata dva različna in neaktivna fragmenta SmallBiT in LargeBiT. Proteini T14-3-3 omogočajo, da se ta posamezna fragmenta povežeta in s tem tvorita aktivno luciferazo NanoLuc, ki ob prisotnosti substrata furimazina emitira svetlobo5.
V projektu so pripravili 10 različnih fragmentov. Fragmenta SmallBiT in LargeBiT so preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec posameznih variant proteina CT52 in te zapise vstavili v vektor pET28a. Po izražanju v E. coli so se povezani proteini ob prisotnosti fuzikokcina vezali na heterodimerne ogrodne proteine. S tem so posledično aktivirali sistem NanoLuc in omogočili emisijo bioluminiscenčne svetlobe z valovno dolžino 460 nm.
V prvi fazi so z merjenjem relativne intenzitete posameznih kompleksov dimernega ogrodnega proteina T14-3-3 in ustreznih vezavnih proteinov CT52 z mutacijami, ki so jih predvideli na podlagi predhodnega modeliranja, najprej preverili funkcionalnost in uspešnost povezovanja teh proteinov.
Pri analizi rezultatov so ugotovili, da je bila v primeru homodimera s povezanimi monomernimi enotami divjega tipa izmerjena intenziteta luminiscence bistveno manjša kot v večini ostalih primerov. Delca NanoBiT sta bila pri tem vezana na identična proteina CT52, zaradi česar je posledično lahko prišlo do vezave dveh delcev SmallBiT ali dveh delcev LargeBiT na en ogrodni dimerni protein.
V primeru heterodimera T14-3-3 z mutacijo W237R se bioluminiscenca v primerjavi z negativno kontrolo ni povečala, kar nakazuje na to, da se interakcije med ogrodnim proteinom in proteinom CT52 niso vzpostavile.
V ostalih primerih so heterodimeri z uvedenimi mutacijami S71L, S71L in I72V ter E19R dali visoke vrednosti bioluminiscence, kar dokazuje pravilno tvorbo kompleksa NanoLuc in s tem funkcionalnost ogrodnih proteinov.
V naslednji fazi so preverjali vpliv koncentracije ogrodnih proteinov pri tvorbi kompleksov. Pri višjih koncentracijah so pričakovali povečano vezavo CT52 in s tem uspešno dimerizacijo obeh delcev NanoBiT, posledično pa se je povečala tudi izmerjena intenziteta bioluminiscence.
V primerih, ki so se v predhodni analizi heterodimerov izkazali za funkcionalne (mutacije S71L, S71L in I72V ter E19R), so tudi v tem eksperimentu ustrezali pričakovanim rezultatom, saj se je intenziteta bioluminiscence povečevala z višanjem koncentracije ogrodnih proteinov T14-3-3.

Tetrameri T14-3-3

Skupina iGEM je načrtan tetramer poskušala izraziti in podrobno ovrednotiti z merjenjem kaspazne aktivnosti. Možnost povezovanja štirih proteinov na tetrameru T14-3-3 namreč omogoča regulacijo celične smrti, sprožitev tega procesa pa je odvisna od aktivacije prokaspaz-9, pri čemer posamezne prokaspaze dimerizirajo in s tem aktivirajo druga drugo.
V skupini so zato kaspazo-9 preko povezovalne regije GGS10 vezali na prosti N-konec proteina CT52, zapis ponovno vstavili v vektor pET28b in ga nato izrazili v bakterijah E. coli. Aktivnost kaspaz-9 so preučevali z uporabo fluorogenega substrata Ac-LEHD-AFC. Kaspaze-9 ta substrat razcepijo na nefluorescirajoči peptid in del, ki fluorescira, merjenje fluorescence pa tako po vezavi na ogrodni protein daje informacijo o aktivnosti kaspaz-9 in s tem posredno tudi o funkcionalnosti T14-3-3.
Člani skupine so želeli primerjati aktivnost dimerov in tetramerov ter ob tem preveriti tudi aplikacijo ogrodnih proteinov pri stikalu smrti. Pričakovali so, da bodo tetrameri učinkoviteje aktivirali kaspaze-9, saj na nek način kažejo večjo podobnost z apoptosomi, ki se v procesu apoptoze sestavijo v obliki septamera, poleg tega pa združevanje štirih hibridnih proteinov zagotovi višjo lokalno koncentracijo kaspaz-9 in posledično tudi hitrejšo ter bolj zanesljivo aktivacijo.
Zaradi težav pri kloniranju ekipa ni uspela pravočasno dokončati analize. V vektor pET28a jim je sicer uspelo vnesti dva DNA konstrukta tetramerov – homotetramer in heterotetramer, kar so potrdili tudi s sekvenciranjem in z agarozno gelsko elektroforezo. Pri tem sta oba konstrukta predstavljala liso pri okrog 9000 baznih parov, kar se načeloma ujema z dolžino obeh tetramernih konstruktov (8929 baznih parov).
Kljub temu, da jim tetramera T14-3-3 ni uspelo izraziti, pa so aktivacijo kaspaz-9 preko ogrodnih proteinov vendarle preverili pri homodimeru in izkazalo se je, da prisotnost ogrodnih proteinov vpliva na izrazito povečanje kaspazne aktivnosti.

Zaključek

Rezultati kažejo na to, da je ekipa iGEM svoj teoretični model pretvorila v uspešno delujoč in vitro sistem. Kljub temu, da so tetramer sintetizirali le na ravni DNA, pa nadaljnje raziskave in delo v tej smeri predstavljajo temelj za številne aplikacije na področju sintezne biologije, predvsem na področju regulacije proteinskih kompleksov.
Poleg že znanih biokock SmallBit in LargeBiT, ki so jih preko vezave na protein CT52 izboljšali v smislu karakterizacije in možnosti uporabe, so člani ekipe v svojem projektu ustvarili še 6 novih biokock, ki so kompatibilne s sintezno-biološkimi standardi. Štiri biokocke so heterodimeri T14-3-3, pri katerih eno monomerno enoto predstavlja divji tip T14-3-3, drugo podenoto pa protein z mutacijo, ostali dve biokocki pa predstavljata protein, ki je pripet na prosti N-konec vezavnega proteina CT52.

Viri

1. Obsil, T. & Obsilova, V. Structural basis of 14-3-3 protein functions. Semin. Cell Dev. Biol. 22, 663–672 (2011).
2. van Hemert, M. J., Steensma, H. Y. & van Heusden, G. P. H. 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. BioEssays 23, 936–946 (2001).
3. Shaw, A. S. & Filbert, E. L. Scaffold proteins and immune-cell signalling. Nat. Rev. Immunol. 9, 47–56 (2009).
4. Ottmann, C. et al. Structure of a 14-3-3 Coordinated Hexamer of the Plant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and Electron Cryomicroscopy. Mol. Cell 25, 427–440 (2007).
5. Kim, J. & Grailhe, R. Nanoluciferase signal brightness using furimazine substrates opens bioluminescence resonance energy transfer to widefield microscopy. Cytom. Part A 89, 742–746 (2016).
6. 2016 iGEM team from Eindhoven University of Technology

Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini

2017-01-02T12:35:06Z

Mojca Kostanjevec:

[http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven iGEM 2016: TU Eindhoven - Small molecule mediated scaffolds]

Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini

2017-01-02T12:34:02Z

Mojca Kostanjevec:

[http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven Small molecule mediated scaffolds]

Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini

2017-01-02T12:32:47Z

Mojca Kostanjevec:

http://2016.igem.org/Team:TU-Eindhoven

Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini

2017-01-02T12:31:36Z

Mojca Kostanjevec: New page: Z majhnimi molekulami regulirani ogrodni proteini ----

Z majhnimi molekulami regulirani ogrodni proteini
----

Seminarji SB 2016/17

2017-01-02T12:30:04Z

Mojca Kostanjevec:

V študijskem letu 2016/17 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI 
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.)
# [[Učinkovito ciljanje izraženih in utišanih genov v človeških zarodnih in induciranih pluripotentnih celicah z nukleazami z motivi cinkovih prstov]]. Angelika Vižintin (22. 11. 2016)
# [[Izdelava sintetičnega genoma s pristopom sestavljanja celotnega genoma: Bakteriofag φX174 iz sintetičnih oligonukleotidov]]. Darja Božič (22.11.2016)
# [[Modeliranje sintetične večcelične ure: Represilatorji, sklopljeni z zaznavanjem celične gostote]]. Vita Vidmar (22. 11. 2016)
# [[Začetki uporabe CRISPR-Cas9 sistema]]. Tomaž Rozmarič (6.12.2016)
# [[Robusten oscilator sinteznih genov z različnimi nastavitvami periode]]. Domen Klofutar (13.12.2016)
# [[Sestavljanje TALEN-ov z metodo FLASH za visoko zmogljivostno urejanje genomov]]. Petra Tavčar (13.12.2016)
# [[Procesiranje celičnih informacij s sintetičnimi RNA napravami]]. Tim Božič (20.12.2016)
# [[Usklajeno delovanje sinteznobioloških ur z zaznavanjem celične gostote]]. Luka Kavčič (20.12.2016)
# [[Časovni in prostorski nadzor celičnega signaliziranja prek s svetlobo sprožene interakcije proteinov]]. Boštjan Petrič (3. 1. 2017)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI 
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
#[[Mezenhimske matične celice nove generacije]]. Danijela Jošić (22.11.2016)
#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bakterije%2C_ki_kelirajo_bakrove_ione%2C_v_boju_proti_Wilsonovi_bolezni Bakterije, ki kelirajo bakrove ione, v boju proti Wilsonovi bolezni. Simon Bolta (22. 11. 2016)]
#[["Training protein" - PETaze]]. Urša Kapš (29.11.2016)
#[[Plasticure: rešitev za učinkovitejšo razgradnjo plastike]]. Marjeta Horvat (29. 11. 2016)
#[[Quantifly]]. Ema Guštin (29. 11. 2016)
#[[Ecolibrium – razvoj ogrodja za inženiring mešanih kultur]]. Mojca Juteršek (29. 11. 2016)
#[[BeeT Beehave]]. Maja Svetličič (29.11.2016)
#[[BiotINK - nov pristop k biotiskanju tkiva]]. Mateja Cigoj (6. 12. 2016)
#[[InstaCHLAM – orodje za inženiring kloroplastov]]. Alja Zgonc (6. 12. 2016)
#[[Mos(kit)o]]. Judita Avbelj (6. 12. 2016)
#[[BioSynthAge - Kvalitetno staranje]]. Tina Kuhar (6.12.2016)
#[[PC SQUAD-Inženiring novih sistemov tarčne dostave zdravil]]. Tajda Buh (13.12.2016)
#[[Biomaterial za privzemanje urana iz okolja - "žetveni stroj" urana]]. Anja Herceg (13.12.2016)
#[[Biosenzor etilena]]. Toni Nagode (13.12.2016)
#[[aSTARice – biosinteza astaksantina v rižu]]. Eva Vidak (20. 12. 2016)
#[[PANTIDE - nov kmetijski sistem, ki ciljano uničuje določene škodljivce]]. Mirjam Kmetič (20.12.2016)
#[[Razvoj novega dostavnega sistema za gensko zdravljenje cistične fibroze]]. Bojana Lazović (20.12.2016)
#[[Z majhnimi molukulami regulirani ogrodni proteini]]. Mojca Kostanjevec (3. 1. 2017)
Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 12 minut (10-14). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Struktura kromatina

2014-04-20T17:25:52Z

Mojca Kostanjevec: /* Skupine */

Seminarji pri predmetu Molekularna biologija bodo v študijskem letu 2013/14 namenjeni obravnavi strukture kromosomov oziroma kromatina, od strukturnih do regulatornih tem. Čeprav osnovno strukturo kromosomov že poznate, je sodobna molekularna biologija ves čas na sledi novim spoznanjem, ki nam omogočajo bolj podroben vpogled v delovanje in fleksibilnost kromatina.

V nadaljevanju so navedena nekatera izhodišča oz. naslovi referatov, ki jih bomo izvedli predvidoma konec aprila in v začetku maja. Naslove lahko v okviru danih izhodišč prilagodite, ne smete pa se bistveno odmakniti od tega, kar je predlagano. Preverite, ali se morebitne spremembe, ki jih želite vnesti, ne dotikajo teme koga drugega. Prekrivanja med referati naj bo čim manj.

Vsako temo obdelata dva ali največ trije študenti. Predlagate lahko tudi dodatne teme ali spremembe naslovov, če se vam to zdi smiselno. Vsaka skupina pripravi povzetek seminarja z vsaj 1000 besedami in ga objavi na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1000 besed), ki ste jih uporabili. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda. Pripravite tudi predstavitev, dolgo pribl. 15 min. Razširjenega seminarja ni treba pripraviti v pisni obliki; napišete samo povzetek na wikiju in predstavite seminar v predavalnici.

Čeprav tema do neke mere sega na področje celične biologije, je predvsem molekularnobiološka. Zato izpostavite tiste elemente, ki so biokemijski, torej katere biološke molekule sodelujejo pri vzpostavljanju strukture kromatina, njegovi plastičnosti (kondenzacija, dekondenzacija) in dinamičnosti (aktivni/neaktivni kromatin) ter uravnavanju transkripcije. Če se srečate z zanimivimi molekularnobiološkimi tehnikami, jih poskusite na kratko razložiti, predvsem če so ključne za spoznanja, ki jih boste predstavili. Izhodišče, ki ga ni treba ponovno razlagati, je nukleosomska struktura evkariontskega kromatina ter osnovne stopnje kompaktiranja kromatina in razumevanje osnov dodatnega zvitja pri bakterijskem kromosomu.

Vse skupine morajo objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje '''20.4.''' opolnoči. Predstavitve seminarjev 1 - 4 bodo 23.4., 5 - 8 25.4., 9 - 12 7.5. in 13 - 16 9.5.2014. Vsaka skupina ima za predstavitev 14-18 minut časa, sledi pa razprava (~5 min.). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. V povzetku navedite, kdo je napisal kateri del (na wiki-strani uporabite zavihek 'discussion').

# Značilnosti bakterijskih kromosomov
# Medmolekulske interakcije znotraj nukleosomov
# Značilnosti kromosomskih ogrodij
# Kompaktiranje kromosomov
# Proteini, ki stabilizirajo kondenzirane kromosome
# Biokemijska struktura centromerov in njihove interakcije
# Biokemijska struktura telomerov
# Telomeraze
# Kromatin in replikacija genoma / nukleosomi med replikacijo
# Kromosomske domene in kontrolne regije lokusov (LCR)
# Posttranslacijske modifikacije histonov in njihov pomen
# Metilacijski vzorci na DNA: nastanek, dedovanje in pomen
# Sestava in značilnosti preurejevalnih strojčkov
# Ponavljajoča se zaporedja v genomu
# Organizacija genov v kromatinu
# Posebnosti kromosomov X in Y / bolezni, povezane s tema dvema kromosomoma

===Skupine===

Skupine za projektno nalogo - po 1 - 3 za vsako temo (skupine oblikujte do 31.3. opolnoči - imena in priimke vpišite v oklepaj za naslovom teme):

npr.: 1. Biokemijske značilnosti bakterijskih kromosomov (Janez Gorenc, Petra Novak)

# Značilnosti bakterijskih kromosomov (Matic Kovačič, Marjeta Horvat, Rok Ipšek)
# [[Medmolekulske interakcije znotraj nukleosomov]] (Boštjan Petrič, Vita Vidmar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zna%C4%8Dilnosti_kromosomskih_ogrodij Značilnosti kromosomskih ogrodij] (Aneja Tahirovič, Aljaž Omahna, Luka Krmpotić)
# Kompaktiranje kromosomov (Tajda Buh, Maruša Prolič-Kalinšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proteini%2C_ki_stabilizirajo_kondenzirane_kromosome Proteini, ki stabilizirajo kondenzirane kromosome] (Toni Nagode, Simon Bolta, Tjaša Bensa)
# Biokemijska struktura centromerov in njihove interakcije (Maja Zupančič, Alja Zgonc)
# Biokemijska struktura telomerov (Tim Božič, Ema Guštin, Luka Kavčič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Telomeraze Telomeraze] (Urša Kapš, Mojca Kostanjevec, Katjuša Triplat)
# Kromatin in replikacija genoma / nukleosomi med replikacijo (Jure Fabjan, Vid Jazbec, Mojca Juteršek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kromosomske_domene_in_kontrolne_regije_lokusov_(LCR) Kromosomske domene in kontrolne regije lokusov (LCR)] (Jakob Rupert, Jan Rozman, Domen Klofutar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Posttranslacijske_modifikacije_histonov_in_njihov_pomen#METILACIJA Posttranslacijske modifikacije histonov in njihov pomen] (Peter Prezelj, Filip Mihalič, Eva Oblak Zvonar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metilacijski_vzorci_na_DNA:_nastanek%2C_dedovanje_in_pomen Metilacijski vzorci na DNA: nastanek, dedovanje in pomen] (Rok Ferenc, Ana Cirnski, Vesna Radić)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sestava_in_zna%C4%8Dilnosti_preurejevalnih_stroj%C4%8Dkov Sestava in značilnosti preurejevalnih strojčkov] (Petra Tavčar, Helena Jakše, Nika Strašek)
# Ponavljajoča se zaporedja v genomu (Eva Vidak)
# Organizacija genov v kromatinu (Jan Taškar)
# Posebnosti kromosomov X in Y / bolezni, povezane s tema dvema kromosomoma (Sara Košenina, Ana Krišelj, Sabina Štukelj)

Naslov teme povežite z novo wiki-stranjo, na katero napišite povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki:
<nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki>

Kako so bili urejeni seminarji lani, si lahko ogledate na strani [[Reprogramiranje celic]].

Talk:Telomeraze

2014-04-20T17:20:44Z

Mojca Kostanjevec:

Mojca Kostanjevec: Uvod, Človeške telomeraze: struktura in funkcija

Katjuša Triplat: Telomeraze kvasovk

Urša Kapš: Telomeraze pri rakavih in normalnih celicah

Talk:Telomeraze

2014-04-20T17:20:07Z

Mojca Kostanjevec: New page: Mojca Kostanjevec: Uvod, Človeške telomeraze:struktura in funkcija Katjuša Triplat: Telomeraze kvasovk Urša Kapš: Telomeraze pri rakavih in normalnih celicah

Mojca Kostanjevec: Uvod, Človeške telomeraze:struktura in funkcija

Katjuša Triplat: Telomeraze kvasovk

Urša Kapš: Telomeraze pri rakavih in normalnih celicah

Telomeraze

2014-04-20T17:17:00Z

Mojca Kostanjevec: New page: ==Uvod== Telomeri, specifična ponavljajoča se zaporedja nukleotidov na koncu kromosomov, v celici in v procesu celičnega cikla opravljajo mnogo pomembnih bioloških funkcij. Kromosome v...

==Uvod==
Telomeri, specifična ponavljajoča se zaporedja nukleotidov na koncu kromosomov, v celici in v procesu celičnega cikla opravljajo mnogo pomembnih bioloških funkcij. Kromosome varujejo pred rekombinacijo, mnogo prispevajo tudi k njihovi organizaciji in regulaciji genov, ohranjanje njihove dolžine pa je bistveno za genomsko stabilnost. Vendar pa sama replikacija kromosomov za celico predstavlja težavo. Običajna DNA polimeraza namreč ni zmožna v celoti podvojiti 3' konca zastajajoče verige DNA, zaradi česar se telomeri ob vsaki delitvi skrajšajo za 50-200 baznih parov, telesne celice pa so tako podvržene le omejenemu številu celičnih ciklov. Narava je skozi evolucijo sicer razvila mnoge rešitve, ki so povezane s problemom podvojevanja koncev kromosomov. Pri veliki večini vseh evkariontskih organizmov to funkcijo opravljajo telomeraze – encimi, ki v celoti zagotovijo popolno replikacijo koncev kromosomov.

==Človeške telomeraze: struktura in funkcija==
Telomeraze so ribonukleinski encimski kompleksi, ki katalizirajo ustrezno sintezo ujemajoče verige na telomernih koncih kromosomov. Večina človeških somatskih tkiv telomerazne aktivnosti ne izvršuje, po drugi strani pa je ta precej izrazita ob prisotnosti tumorjev. Telomeraze so v zgodnjih fazah embriogeneze sicer prisotne v večini celic, tudi somatskih, njihovo nadaljnje zavrtje pa sovpada z diferenciacijo tkiv. Po rojstvu se telomeraze tako nahajajo le v kličnih in matičnih celicah, medtem ko jih v somatskih celicah večinoma ni. Izjeme so le specifične proliferirajoče epitelijske celice različnih tkiv in pa nekatere celice imunskega sistema (limfociti).

Telomeraze so sestavljene iz dveh ključnih komponent. Ena od teh je funkcionalna RNA molekula (hTR), ki služi kot matrica pri podvajanju telomerne DNA, druga komponenta pa je katalitični protein s funkcijo reverzne transkriptaze (hTERT). hTR je vedno prisotna v vseh tkivih oziroma celicah, v nasprotju s tem pa je izražanje gena hTERT natančno uravnano in povezano le s pojavom telomerazne aktivnosti.

Izgradnja aktivnega telomeraznega kompleksa sicer zahteva mnogo vmesnih stopenj. Sam proces vključuje mnogo raznih komponent in dodatnih proteinov, ki oblikujejo aktiven holoencim v obliki dimera. Glavni podenoti telomeraze sta med seboj povezani s proteinom TEP 1, pomembno funkcijo pri zgradbi človeških telomeraz pa opravljata tudi proteina Hsp90 in p23 - molekulska šaperona, vezana na podenoto hTERT, ki pomagata pri sestavljanju podenot.

===Telomerazna RNA (hTR)===
Pri ljudeh se hTR sintetizira z delovanjem RNA polimeraze II. Zrelo obliko hTR gradi 451 nukleotidov, njeno aktivno mesto pa je funkcijsko razdeljeno na dva dela. Zaporedje, ki se nahaja na 3' koncu hTR, prepoznava komplementarna telomerna zaporedja, z njimi tvori bazne pare in tako omogoči prileganje celotnega telomeraznega kompleksa. Zaporedje, ki je bližje 5' koncu, pa predstavlja matrico katalitični podenoti pri sintezi komplementarnega zaporedja telomerov.

Celotna sekundarna zgradba hTR vključuje štiri glavne strukturne elemente oziroma t.i. domene: CR2/CR3, CR4/CR5, škatlo H/ACA oziroma CR6/CR8 in CR7. Številni in vitro poskusi pa so dokazali, da za uspešno delovanje telomeraze vsi ti elementi niso tudi nujno potrebni.

===Katalitična podenota (hTERT)===
hTERT je katalitična podenota telomeraznega kompleksa s funkcijo reverzne transkripcije, ki je glede na funkcijo in strukturne lastnosti precej primerljiva z retrovirusnimi reverznimi trankriptazami. Gre za protein s približno 1100 aminokislinami, ki vsebuje več ključnih domen. Na N-terminalnem koncu se nahaja TEN domena, ki veže telomerno DNA, sledi ji upogljiva in fleksibilna povezovalna regija, ki pa se nato nadaljuje v TRBD domeno, kamor je vezana telomerazna RNA. Nadaljevanje proteina gradi ključna regija - RT domena s funkcijo reverzne transkriptaze, na koncu pa se nahaja CTE domena.

==Telomeraze kvasovk==
Telomerazni kompleks oziroma domnevne komponente telomeraze so identificirali pri S. cerevisiae, S. pombe, K. lactis, C. albicans. Gre za stabilne komplekse ribonukleoproteinov (RNP) v velikosti 1000 – 1500 kDa. Vsak encim ima TERT podenoto in matrico, ki vsebuje RNA.

Telomeraza kvasovk je encim, sestavljen iz 1157 nukleotidov RNA (TCL1) in drugih proteinskih podenot: Est2p – katalitična podenota s funkcijo reverzne transkriptaze (TERT), Est1p in Est3p – proteina, ki sodelujeta pri regulaciji dolžine telomer ter pomožnih proteinov Ku, in sedmih proteinov Sm, ki so vključeni v zorenje ribonukleoproteinov.

Razpoznavni znak funkcionalne RNA molekule kvasovk – TER (TLC1) je njihova velikost oziroma dolžina. Medtem ko je RNA migetalkarjev dolga okrog 200 nukleotidov (nt), RNA vretenčarjev pa okrog 400-500 nt, je RNA kvasovk daljša ali enaka 1000 nt. Pri funkcionalni analizi TER so večino mutacij ugotovili v regiji matrice, te mutacije pa največkrat povzročajo spremembe v zaporedju telomerov. Spremembe v zaporedju pogosto motijo nukleoproteinsko sestavo telomere, kar vodi do raznolikosti v dolžini ter strukturni deregulaciji in do okvar v stabilnosti in funkciji kromosoma.

Telomeraza kvasovk lahko doda okoli 15 nt na začetni primer, sintezo pa zaustavi oziroma zaključi preko regije matrice, kar se razlikuje od telomeraze sesalcev pri katerih se sinteza zaključi oziroma zaustavi na 5’ koncu matrice. Sinteza se lahko konča kljub temu, da je produkt še vedno vezan na encim. Za telomerazo kvasovk velja, da je omejena na en sam krog razširitve. Kot druge telomeraze, tudi telomeraza kvasovk katalizira cepitev nukleotidov.

===Katalitična podenota (Est2p)===
Protein TERT je pri kvasovki S. cerevisiae velik 134 kDa. Ima štiri strukturne in funkcionalne domene: N-konec, TRBD domena, RT domena (funkcija reverzne transkriptaze) in C-konec. Regije TERT so pomembne za aktivnost in vezavo na RNA telomerazo. N – konci so pri kvasovkah bistveno krajši kot pri človeški telomerazi ter vsebujejo šest regij.

===Proteini (Est1p, Est3p, Cdc13p, Sm)===
S telomerazo povezani proteini niso bistveni za katalitično aktivnost in vitro, vendar pa nekateri uravnavajo aktivnost telomeraze in vivo. Est1p, Est3p in Cdc13p z direktnimi in indirektnimi povezavami s telomerazno RNA in Est2p komponentami uravnavajo dostop telomeraze na telomere.

Est1p je prva klonirana podenota telomeraze kvasovk S. Cerevisiae. Bistvenega pomena je za vzdrževanje telomer. Est3p je relativno majhen protein. Natančna funkcija Est3p proteina ni znana, ni pa vključen v premestitev telomeraze na konce telomer.

Sm proteini: domnevno vezavno mesto Sm proteinov je na 3’ koncu TLC1 RNA. Smd1p je potreben za akumulacijo TLC1 RNA. Smd1p in Smd3p (ter verjetno tudi drugi Sm proteini) so povezani s telomeraznim kompleksom in potrebni za akumulacijo telomeraze RNA.

==Telomeraze pri rakavih in normalnih celicah==
Stopnja telomerazne aktivnosti je odvisna od vrste in starosti celic. Z diferenciacijo tkiv se njena aktivnost zmanjšuje in na koncu embriogeneze so telomeraze zavrte, proliferacija je prekinjena. Imamo pa tudi izjeme. Pri nekaterih celicah ostane telomeraza namreč tudi po diferenciaciji še vedno aktivna.

===Rak in telomeraze===
Nekatere celice lahko postanejo nesmrtne in sicer tako, da pride do reaktivacije telomeraze. Pri tem pride do izgube specifičnih represivnih genov, ki zavirajo izražanje telomeraze. Pri kancerogenezi (malignih tumorjih) aktivna telomeraza omogoči stabilizacijo koncev kromosomov, genomsko stabilnost, neomejeno proliferacijo in razvoj celične nesmrtnosti.

===Mortalitetni stadij 1 (M1) in mortalitetni stadij 2 (M2)===
Vsaka celica ima dve nadzorni točki, ki preprečujeta neomejeno delitveno sposobnost normalnih celic. Ti dve točki sta M1 in M2. V stanju M1 (replikativno staranje) so celice vitalne, vendar se nič več ne delijo.
Normalnim celicam se telomeri krajšajo in celični DNA popravljalni mehanizmi prepoznajo kratke telomere kot okvare v DNA in zato ustavijo celično delitev ter sprožijo celično staranje ali apoptozo. Da v M1 ustavimo celično delitev, potrebujemo normalno delovanje genov p53 in Rb (zavirata tumorje). V rakavih celicah so virusni onkoproteini (E6 in E7 humanega virusa papiloma 16, veliki T-antigen virusa SV40), ki vežejo p53 in pRb ter tako omogočijo nadaljevanje delitev celic. Te celice, ki zaobidejo M1 kontrolno točko, vstopijo v podaljšano življenjsko dobo, kjer se celice še nadalje delijo, telomeri pa se krajšajo. Ko ti postanejo kritično kratki in kromosomi izredno nestabilni, nastopi stanje krize-kontrolna točka M2. Večina celic tedaj umre. Vendar nekatere celice z reaktivacijo telomeraze preprečijo krajšanje telomer in zaobidejo tudi kontrolno točko M2. Takšne celice imajo neomejeno proliferacijsko sposobnost in postanejo nesmrtne.

===TERT: funkcija in transport===
TERT je katalitična podenota telomeraznega kompleksa. Izražanje hTERT je povezano s telomerazno aktivnostjo in nastankom ter razvojem raka. V normalnih celicah je ekspresija hTERT zavrta, med nastankom nesmrtnosti pa je ponovno aktivirana. Količina gena za hTERT je v tumorskih celicah pogosto povečana, kar prispeva k povečani aktivnosti telomeraze in nesmrtnosti celic.

TERT se v citoplazmi poveže z jedrnim faktorjem NFkBp65, ki ima pomembno vlogo pri jedrni translokaciji telomeraze in pri njeni regulacji. TNFα (tumor necrosis factor α) aktivira NFkBp65 in povzroči translokacijo kompleksa TERT- NFkBp65 iz citoplazme v jedro. V normalnih celicah se potem transport nadaljuje iz jedra v jedrce. Pri rakavih celicah pa je protein TERT razširjen predvsem v nukleoplazmi, kjer je prisotna večina substratov za sestavo telomeraznega kompleksa (TR, p23 in Hsp90). Jedrni protein hPinX1 se veže s TERT in inhibira encimsko aktivnost telomeraze. hPinX1 povzroči povečan transport TERT iz nukleoplazme v jedrce. Tu se nahajajo jedrni proteini nucleolini, ki tvorijo kompleks s telomerazo in povzročijo njen premik iz jedrca v nukleoplazmo.

===Zdravljenje raka===
Povečana stopnja aktivnosti telomeraze in količina mRNA za katalitično podenoto encima telomeraze sta ena izmed glavnih pokazateljev za razvoj raka. Razvoj zdravil za to bolezen je usmerjen predvsem na zaviralce telomerazne aktivnosti in na sestavine, ki bi delovale na telomere in posledično zavrle delovanje telomeraze.

==Viri==
*Cong, Y.-S., Wright, W. E., & Shay, J. W. (2002). Human telomerase and its regulation. Microbiology and Molecular Biology Reviews : MMBR, 66(3), 407–25.
*Legassie, J. D., & Jarstfer, M. B. (2006). The unmasking of telomerase. Structure (London, England : 1993), 14(11), 1603–9.
*Sandin, S., & Rhodes, D. (2014). Telomerase structure. Current Opinion in Structural Biology, 25C, 104–110.
*Wojtyla, A., Gladych, M., & Rubis, B. (2011). Human telomerase activity regulation. Molecular Biology Reports, 38(5), 3339–49.
*Zappulla, D. C., & Cech, T. R. (2004). Yeast telomerase RNA: a flexible scaffold for protein subunits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101(27), 10024–9.

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

BIO2 Povzetki seminarjev 2013

2013-11-22T11:00:21Z

Mojca Kostanjevec:

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2013/2014 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2013 stran]

===Mojca Kostanjevec: Mitohondrijske reaktivne kisikove spojine===

Mitohondriji so celični organel, v katerem potekajo poglavitni metabolični procesi v celici. Med celično oksidacijo molekul elektroni v elektronski prenašalni verigi omogočajo prenos protonov skozi proteinske komplekse, ta pa zagotavlja ATP sintezo in redukcijo molekularnega kisika v vodo. Med temi procesi pa nastajajo tudi stranski produkti – reaktivne kisikove spojine. To so visoko reaktivni prosti radikali, ki vsebujejo kisikove ione ali perokside. Te spojine so dolgo časa veljale le za škodljive in toksične, novejše raziskave pa dokazujejo, da so ob primerno visokih koncentracijah v celici lahko tudi pomembni intermediati in signalne molekule. Med okoljskim stresom ali preko zunanjih dejavnikov (npr. ionizirajoče sevanje) koncentracije teh spojin močno narastejo. To povzroči obsežne poškodbe celičnih struktur – tovrstno stanje imenujemo oksidativni stres, kar pa lahko vodi v celično smrt oziroma apoptozo. Toda reaktivne kisikove spojine kljub vsemu še vedno ostajajo nepogrešljiv del mnogih celičnih funkcij. V primeru hipoksije so npr. ravno te kisikove spojine tiste, ki v največji meri regulirajo primeren celični odziv. Reaktivne kisikove spojine inhibirajo aktivnost encima PHD2, kar omogoča stabilizacijo HIF-α podenot in ustrezno transkripcijsko aktivacijo. Te spojine obenem nadzorujejo tudi aktivnost AMPK. AMPK fosforilira enega izmed največjih porabnikov energije v celici – Na/K črpalko, to pa v vodi v endocitozo in deaktivacijo omenjenega proteinskega kompleksa. S tem se posledično zmanjša poraba energije v celici. Reaktivne kisikove spojine, ki nastajajo v mitohondrijih, tako na različne načine prispevajo k metabolizmu celic.

===Tajda Buh: Mutacije izocitrat dehidrogenaze 1 in 2 pri raku===

IDH sodeluje pri pomembnih presnovnih poteh. IDH je asimetričen homodimer, ki lahko prehaja iz neaktivne odprte v aktivno zaprto konformacijo. Poznamo tri vrste izocitrat dehidrogenaz. IDH3 se nahaja v mitohondriju in katalizira prehod izocitrata v α-ketoglutarat, hkrati poteče redukcija NAD+ v NADH. IDH2 se prav tako nahaja v mitohondriju, IDH1 pa najdemo v citosolu in peroksisomih. Obliki 1 in 2 reducirata NADP+ v NADPH. Mutacije se pojavljajo samo pri IDH1/2, ne pa tudi pri IDH3. Mutirana IDH lahko pridobi novo aktivnost, to je kataliziranje pretvorbe α-ketoglutarata v 2-hidroksiglutarat, aktivnost encima pa se lahko tudi močno zmanjša. Nova aktivnost povzroči prekomerno sintezo 2-hidroksiglutarata. Povečanje koncentracije slednjega pa vpliva na α-ketoglutaratno odvisne presnovne encime, kot sta prolil hidroksilaza in histonska demetilaza. Študije so do tega trenutka potrdile prisotnost mutirane IDH1 in IDH2 v nižjih stopnjah glioma, v sekundarnem glioblastomu in v akutni mieloični levkemiji.

===Vid Jazbec: Vpliv mašobnih kislin na rakave celice===

Celice ob tvorbi rakastega obolenja spremenijo svoje delovanje. Predvsem je to vidno v metabolizmu, ki je v rakastih celicah spremenjen. Novejše raziskave dokazujejo, da je odvisnost metabolima odvisna od maščobnih kislin v večji meri, kot je bilo domnevano do sedaj. Metabolizem maščobnih kislin, predvsem beta oksidacijo, rakave celice izkoristijo ob pomanjkanju ATP, kot je pokazano pri celicah z igubo stika t izvenceličnim matriksom. Proces beta oksidacije je prav tako pomemben tudi kot proces, ki vodi v nastanek NADPH, ki se potrebuje za soočanje celice z metabolnim stresom reaktivnih kisikovih zvrsti ter rast in razvoj. Za v uvodu naštete značilnosti rakavih celic pa so poleg samega procea beta oksidacije in produktov tega procesa pomembni tudi proteini, ki spremljajo ta proces. Ti so ob nastopu rakavega obolenja deregulirani in večinoma preprečujejo prehod obolele celice v apoptozo.
Raziskave pa so pokazale tudi problem dosedajšnje dogme, pri kateri sta beta oksidacija maščobnih kislin in njihova sinteza med seboj izključujoča procesa odvisna od ACC. To zavračajo raziskave rakavih celic, pri katerih se oba procesa vršita istočasno in sta enako pomemba za delovaje in ravoj celice.
Nove raziskave na področju rakavih obolenj pa so pomembne predvsem za zdravljenje bolezni.

===Rok Ferenc: Medsebojne fizične povezave encimov TCA cikla v Bacillus subtilis===

Večina proteinov živih celic deluje v kompleksih, ne posamično. Poleg stalnih proteinskih kompleksov znanstveniki po zaslugi naprednejših eksperimentalnih tehnik odkrivajo tudi medproteinske interakcije bolj prehodne narave, značilne predvsem za metabolične poti. V raziskavi se osredotočijo na formacijo metabolona (skupka proteinov) v citratnem ciklu Bacillus subtilis, ki je zelo pomemben modelni organizem in vir proizvodnje vitaminov in encimov za pralne praške. Ta bi pripomogel k organiziranosti metabolnih poti v sicer kaotični notranjosti prokariontskih celic brez organelov.
Dokazan je bil obstoj metabolona v ciklu trikarboksilnih kislin, v katerega se povezuje tudi nekaj encimov anabolizma, katerih substrati so intermediati TCA cikla (citratni cikel). V metabolonu obstaja jedro iz treh encimov: citrat sintetaze, malat dehidrogenaze in izocitrat dehidrogenaze. Interakcija med encimi glukoneogeneze, bolj natančno med malat dehidrogenazo in fosfoenol piruvat karboksikinazo je uravnavana s strani razlik v koncentracijah intermediatov glikolize in TCA cikla, torej za formacijo metabolona ni potreben noben zunanji signal, le povečana koncentracija ustreznih substratov.

===Sara Košenina: Zdravljenje hipoksije in z njo povezanega nastanka raka preko citratnega cikla===

Hipoksija je stanje, ko celice in tkiva ne dobijo dovolj kisika, zato pride do motenj v delovanju organa ali pa celo celotnega organizma. Ljudje smo za prilagoditev na hipoksijo razvili mehanizem, ki je reguliran preko heterodimernega proteinskega kompleksa HIF-1. Glavna podenota je HIF-1α, saj je občutljiva na kisik. Aktivnost HIF-1 je regulirana z različnimi mehanizmi, eni so odvisni od hipoksije, drugi pa so od nje neodvisni. Slednji so pomembni pri razvoju in napredovanju tomorjev. Eden od hipoksije neodvisnih regulatorjev je tudi piruvat, ki je začetni substrat cikla citronske kisline. V hipoksičnih pogojih pride do motenj v elektronskem transportu, zato je proizvodnja ROS (reaktivnega kisika) povečana. To je kompenzira z uravnavanjem piruvat dehidrogenaznega kompleksa (PDH) s piruvat dehidrogenazo kinazo (PDK1). Raziskave so pokazale, da etil piruvat poveča stabilnost HIF-1 s stimulacijo proizvodnje ROS v mitohondriju in blokira s pVHL regulirano razgradnjo HIF-1. Indukcija HIF-1 z etil piruvatom je povezana s pospeševanjem citratnega cikla. Etil piruvat pospeši tako citratni cikel kot tudi proizvodnjo ROS v mitohondriju. Rezultati raziskav podpirajo obstoj regulatornega mehanizma za prilagoditev na hipoksijo, pri katerem PDK1 deaktivira PDH kompleks in inhibira cikel citronske kisline in na ta način zmanjša proizvodnjo ROS. Vse te ugotovitve bi lahko pripomogle k zdravljenju hipoksije in z njo povezanega razvoja raka. Potrebnih bo še veliko raziskav, preden se bo lahko etil piruvat uporabljalo v klinične namene.

===Tjaša Bensa: α-ketoglutarat dehidrogenazni kompleks in nevrodegenerativne bolezni===

α-ketoglutarat dehidrogenazni kompleks (KGDHC) je en izmed encimov v Krebsovem ciklu. V procesu oksidativne dekarboksilacije katalizira reakcijo α-ketoglutarat + NAD+ + CoA-SH -> sukcinil-CoA + NADH + H+ + CO2.
Sestavljen je iz 3 podenot: α -ketoglutarat dehidrogenaze (E1), dihidrolipoil sukcinil transferaze (E2) in dihidrolipoil dehidrogenaze (E3). E3 podenota oksidira NADH v NAD+.
Reaktivne kisikove spojine oziroma reaktivne kisikove zvrsti (ROS) so zelo reaktivni prosti radikali, snovi ali molekule s kisikom. Najpogostejši ROS sta O2- (superoksid) in H2O2 (vodikov peroksid). ROS lahko reagirajo s sestavinami celice, zelo radi pa napadejo tudi KGDHC. Oksidativni stres se pojavi v našem telesu zaradi povečane koncentracije ROS. Povzroča različne bolezni, naprimer Alzheimerjevo bolezen, Parkinsonovo bolezen, diabetes, revmatoidni artritis in nevrodegeneracijo. Po drugi strani pa tudi sam KGDHC proizvaja kisikove spojine in tako se ustvari začarn krog. Ker je vse regulirano, že ob najmanjši spremembi v metabolizmu pride do proizvodnje ROS in povzročitve oksidativnega stresa.

===Filip Mihalič: Pomen MicroRNA molekul v metabolizmu in metabolnih nepravilnostih===

MicroRNA molekule, so vrsta nekodirajočih RNA molekul dolgih približno 22 nukleotidov, in imajo celo vrsto zelo pomembnih funkcij za razvoj organizma, ter za ohranjanje metabolne homeostaze v le tem. Primarno delujejo kot zaviralec transkripcije mRNA, s tem da se nanjo vežejo, in s tem ribosomu ne pustijo prepisovanja v proteine. Prve miRNA molekule so odkrili okoli leta 1990 v glisti Caenorhabditis elegans vendar njihove vloge kot enega pomembnejših metabolnih regulatorjev niso prepoznali do začetka dvajsetega stoletja. Najdemo jih v skoraj vseh bioloških procesih povezanih z ekspresijo mRNA, od metabolizma lipidov in holesterola do inzulinske signalizacije. Njihov vpliv je velikokrat povezan z transkripcijskimi faktorji, s katerimi sodelujejo v težnji po ravno pravšnji ekspresiji genov. So dokaj pred kratkim odkrita skupina molekul, zato še niso dobro raziskane, in mehanizmi njihovega delovanja še niso povsem pojasnjeni. Najbolje sta raziskana prav vpliva na lipidno in inzulinsko homeostazo, na kateri se bom osredotočil v seminarju. Do sedanje raziskave miRNA pa so predlagale njihovo veliko uporabnost v farmaciji ter kasneje medicini, saj njihovo nepravilno delovanje privede do bolezni kot so huda predebelost, inzulinska neodzivnost (diabetes tipa 2), zamaščena jetra itd.

===Vita Vidmar: Vloga pentozafosfatne poti v metabolizmu rakavih celic===

Pentozafosfatna pot v celicah zagotavlja NADPH, ki je potreben za ohranjanje redukcijskega okolja v celici in za redukcijske biosinteze, ter riboza 5-fosfat, ki je prekurzor za sintezo nukleotidov in se po potrebi lahko reciklira nazaj v glukoza 6-fosftat. Ta v celicah poteka v majhnem obsegu, saj je skrbno regulirana, predvsem z negativnimi regulatorji.
V rakavo spremenjenih celicah zaradi poslabšane regulacije pentozafosfatna pot poteka v povečanem obsegu, kar jim omogoča pomembne prednosti. Ker proizvedejo velike količine NADPH in riboza 5-fosfata, jim to omogoča preživetje in hitrejše razmnoževanje, vpliva pa tudi na širjenje metastaz in angiogenezo (rast novih krvnih žil proti tumorju).
Poznavanje vloge pentozafosfatne poti v metabolizmu rakavih celic lahko pripomore k odkritju učinkovitejšega načina zdravljenja rakavih obolenj.

===Gregor Gunčar: Do what you want, but post your abstract here!===

Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Suspendisse sed justo congue, faucibus metus in, sodales tellus. Nulla nec erat in mauris condimentum rutrum. Maecenas vel scelerisque velit, at tincidunt massa. Praesent molestie euismod diam quis iaculis. Etiam non diam malesuada, pellentesque massa id, feugiat nulla. Integer eget euismod purus. Sed dignissim lectus quis fermentum ultrices. Nunc quis scelerisque ligula, nec laoreet justo. Morbi vitae felis in nibh commodo iaculis quis ac turpis. Nam feugiat a dui a faucibus.

Cras et elementum urna. Proin vel tortor sit amet urna facilisis ultrices lobortis sit amet neque. Sed luctus convallis urna, pulvinar ullamcorper sem adipiscing sit amet. Nullam fringilla ante est. Praesent viverra tortor vel felis convallis, non placerat enim condimentum. Suspendisse rutrum fermentum odio, in molestie risus consectetur ac. Sed interdum neque ultricies, fermentum tortor quis, consequat est. Sed vel faucibus felis.

===Ema Guštin: Warburgov efekt in možnosti za zdravljenje raka===

Otto Heinrich Warburg je bil začetnik kvantitativnih raziskav metabolizma rakavih celic, ukvarjal pa se je tudi s fotosintezo in s celičnim dihanjem. Okoli leta 1920 je s sodelavci pokazal, da v aerobnih pogojih tumorska tkiva v mlečno kislino oz. laktat pretvorijo približno desetkrat več glukoze kot celice normalnega tkiva. Ta pojav danes imenujemo Warburgov efekt. Vendar pa je za to povečanje aerobne glikolize v rakavih celicah pogosto napačno mišljeno, da se zgodi namesto mitohondrijskega dihanja, in je bilo napačno interpretirano kot dokaz za poškodbe dihanja, čeprav gre v resnici za poškodbe v regulaciji glikolize. Pravzaprav mnoge vrste rakov kažejo Warburgov efekt in pri tem ohranijo mitohondrijsko dihanje. Warburgova opažanja v povezavi s sedanjimi koncepti metabolizma raka tesno povezujejo s spremembami na mitohondrijski DNK, onkogeni in zaviralci tumorjev, torej bi njegovo hipotezo lahko izkoristili za zdravljenje raka.

===Maja Zupančič: Menin: ogrodni protein, ki nadzoruje eksoresijo genov in celično signalizacijo===

Z razrešitvijo kristalne strukture proteina menina, sta Huang in Murai ugotovila, da spada v skupino ogrodnih proteinov. Nahaja se v jedru, v manjših koncentracijah pa ga lahko najdemo tudi v citoplami, izražen pa je v vseh tkivih. Kristalno strukturo jedrnega proteina menina lahko opišemo z obliko zavite leve roke, kjer N-domena predstavlja β-lasnično zanko, zgornja domena palec in osrednja domena predstavlja dlan. Ko menin reagira z peptidom MLL1 ali transkripcijskim faktorjem JunD, se povežeta v globoki žep, ki ga oblikuje struktura menina. Menin reagira s številnimi proteini (JunD, MLL1, TGFβ, SUMO, β-katenin,…) in tako vpliva na espresijo genov in celično signalizacijo. Menin sodeluje tudi pri številnih signalnih poteh,, kot so signalna pot transformirajočega rastnega faktorja β, kostnega morfogenetskega proteina, kanonične poti Wnt in signalizacija jedrnega receptorja. Pri ljudeh je protein menin kodiran z genom MEN1. Če pride do mutacije tega gena, se pojavi dedna bolezen multipla endokrina neoplazija ali Wermerjev sindrom, za katerim vsako leto zboli 1 na 30 000 ljudi. Pri multipli endokrini neoplaziji pride do tvorbe številnih tumorjev v različnih endokrinih organih. Bolezen ni ozdravljiva, lahko pa zdravimo tumorje, ki nastanejo. Z zgodnjim odkritjem bolezni in primernim ter efektivnim zdravljenjem, se prognoza lahko izboljša.

===Vesna Radić: Vloga betatrofina pri zdravljenju diabetesa===

Uveljavljen način zdravljenja sladkorne bolezni tipa 2 je dnevni vnos inzulina v telo z injekcijami in do nedavnega je prevladovalo mnenje, da alternative temu ni. Nova študija o delovanju beta celic trebušne slinavke pod vplivom hormona betatrofina namiguje, da so temu šteti dnevi.
Na Harvard Stem Cell Institute so z uporabo peptida, ki se veže na inzulinske receptorje spodbudili odpornost na inzulin in tako identificirali hormon betatrofin. Je peptidni hormon, najden v jetrih in maščevju miši, pri človeku pa le v jetrih. Pri ljudeh se ga da izslediti z metodo western blottinga. Posredno naj bi zvišal stopnjo razmnoževanja beta celic pankreasa v procesu celične delitve.
Za ugotovitev, ali betatrofin res vpliva na stopnjo razmnoževanja beta celic, so uporabili injekcijo v veno repa, da bi prenesli izražanje betatrofina v jetra – eno od običajnih mest njegovega delovanja - povišana stopnja pomnoževanja je bila tako drastična, da so lahko zlahka prepoznali otočke in beta celice pri majhni povečavi
Pomembna lastnost zdravljenja s tem hormonom je ta, da je betatrofin zelo specifičen; ne vpliva na druga tkiva in tako bi prišlo do manj zapletov, saj bi telo proizvajalo lasten inzulin. Poleg tega prednost tudi ta, da je ta študija podlaga za razvoj klinično uporabnih celic z reprogramiranjem odraslih beta celic trebušne slinavke brez uporabe izvornih celic.

===Luka Kavčič: Vloga glikolitičnega regulatornega encima PKM2 v metabolizmu rakave celice===

Piruvat kinaza (PK) je encim, ki katalizira zadnjo stopnjo glikolize, pretvorbo fosfoenolpiruvata (PEP) v piruvat in s tem fosforilacijo ADP v ATP. Izocimska oblika M2 je pomembna v metabolizmu rakavih celic, saj zaradi manjše aktivnosti v primerjavi z M1 obliko omogoča manjši pretok skozi glikolizo ob enaki absorpciji glukoze iz krvi, kar vodi do akumulacije glikoliznih intermediatov. Ti so tako bolj dostopni biosinteznim potem v celici, kar ji omogoča hitro celično delitev ter razvoj tumorja. Prav tako je pomemben pri odzivu na oksidativni stres, saj z svojo oksidacijo posredno omogoča aktivacijo pentoza-fosfate poti, v kateri nastaja NADPH, kar predstavlja zadosten redukcijski potencial za vzpostavitev homeostaze.
Pod določenimi pogoji se lahko PKM2 translocira v jedro, kjer deluje kot transkripcijski regulator s svojo protein kinazno aktivnostjo ter fosforilira transkripcijske faktorje, kot so Stat3, histon 1 in histon 3. Ugotovljeno je bilo, da lahko fosforilacijo proteinov izvaja le v dimerni obliki, katera je najbolj zastopana oligomerna oblika PKM2 v jedru. Zaradi svoje prisotnosti v skoraj vseh rakavih celicah, je PKM2 atraktivna tarča zdravljenja. Zadnje raziskave kažejo na testiranje različnih aktivatorjev, ki bi z povečano aktivnostjo encima preprečile kopičenje surovin za izgradnjo ter s tem zmanjšale rast tumorja.

===Ana Krišelj: Signalna pot sfingozin-1-fosfata in njegova vloga v boleznih===

Sfingozin-1-fosfat (S1P) je signalna molekula, ključna za regulacijo mnogih celičnih procesov, med katere spadajo tudi celična rast in diferenciacija, apoptoza, migracija celic in mitoza. Nastane s fosforilacijo sfingozina, proces pa je reguliran preko sfingozin kinaze (SK), ki v celicah nastopa v dveh izooblikah – SK1 in SK2.
S1P lahko deluje znotraj ali zunajcelično - lahko se veže na proteine v celicah (HDAC1/2, TRAF2..) ali na membranske receptorje S1PR1-5, ki spadajo v družino z G-proteini sklopljenih receptorjev. Zaradi kompleksne regulacije je S1P možen povzročitelj bolezni, ki se kot le-te izrazijo zaradi napak v mehanizmu delovanja same signalne poti, bodisi zaradi SK ali S1PR receptorjev. Napake se izrazijo kot vrsta kardiovaskularnih (ateroskleroza), vnetnih (astma, multipla skleroza), rakavih in nekaterih drugih obolenjih (diabetes, ishemija).
Vloga S1P in razumevanje molekularnega mehanizma teh bolezni torej ponuja nova področja in možnost raziskovanja v smeri odkrivanja potencialnih zdravil.

===Katjuša Triplat:Signalizacija s člani TGF –ß pri žilni morfogenezi in boleznih===
TGF-β je vrsta citokina, ki uravnava proliferacijo, celično diferenciacijo in druge funkcije v večini celic. Transformirajoči rastni faktor – ß (TGF–ß) naddružina je velika skupina beljakovin, ki jo sestavlja 33 različnih članov, ki vključujejo: TGFß – proteine, kostne morfogenetične proteine (BMP), rastne diferenciacijske faktorje (GDF), aktivine, inhibine, nodalne in »lefty« proteine ter Müllerjevo inhibitorno substanco (MIS). Člani družine transformirajočih rastnih faktorjev – ß (TGF–ß) igrajo pomembno vlogo pri razvoju zarodka, homeostazi odraslega in pri različnih boleznih. Ti citokini izzovejo svoje učinke na celice preko specifičnih serin/treonin kinaznih receptorjev tipa I in II ter intracelularnih transkripcijskih foktorjev Smad in s tem povzročijo signalno kaskado. Prenos signalov lahko poteka po Smad – odvisni ali Smad – neodvisni poti. TGF-ß signalna pot kontrolira celično proliferacijo, prepoznavanje, diferenciacijo, apoptozo in specifikacijo razvojne usode med embriogenezo in v zrelih tkivih. Inaktivacija te poti tako prispeva k tumorogenezi. Genetske študije na miših in ljudeh so pokazale pomembno vlogo TGF-β signalnih elementov v žilni morfogenezi in njeni disfunkciji. Izguba TGF-β signalnih elementov privede, zaradi nepravilnega nastanka kapilar ali okvarjene diferenciacije in pridobivanja gladko mišičnih celic, do nenormalnega nastanka primitivnega žilnega pleteža in zmanjšane integritete žilnih sten.

===Urša Kapš: Uravnavanje maščob: lipidi in človeške bolezni===

Za življenje je pomembno uravnavanje metabolične energije. V mnogih organizmih so celične lipidne kapljice in trigliceridi največji shranjevalci energije. Preobilica zalog ali pomanjkanje tvorjenja in obnavljanja maščob vodijo do številnih človeških bolezni, kot so lipodistrofija (genetske okvare v lipidnih zalogah), rakava kaheksija (kompleksen metabolični sindrom, povezan z nenadno izgubo zaloge lipidov), prekomerna debelost, steatoza jeter (bolezen zamaščenih jeter) in kardiovaskularne bolezni (bolezni srca in ožilja, najpogostejša je ateroskleroza = poapnenje žil). Nevaren je tudi nastanek penastih celic (makrofagi, ki imajo nakopičeno veliko količino holesterolnih estrov), ki zamašijo žilo. Maščoba je shranjena v lipidnih kapljicah, vendar je, kljub njihovi pomembnosti za celico in fiziologijo organizma, relativno malo znano o njihovih mnogih osnovnih procesih v različnih tkivih. Pomembni proteini, ki regulirajo zalogo lipidov in številni geni, ki kodirajo proteine lipidnih kapljic, ki so povezani z metaboličnimi boleznimi, so že identificirani. Na primer BSCL2 so geni, ki kodirajo transmembranski protein seipin, katerega funkcija je izražena v lipidni biosintetski poti. V zadnjem času se je zanimanje in število raziskav na področju zalog lipidov, raznih novih pristopov za zdravljenje bolezni, povezanih s premalo ali preveliko zalogo maščob, drastično povečalo, kar nas bo pripeljalo do novih dognanj in boljšega znanja na tem področju znanosti.

===Tim Božič: Motorični protein z regulacijo serotoninskega receptorja vpliva na razpoloženje ===

Hormon serotonin nastane iz triptofana s pomočjo triptofan hidroksilaze in aktivira serotoninske receptorje, ki se nahajajo v živčnih celicah. Aktivirani, regulirajo številne druge nevrotransmitorje in hormone, ki vplivajo na naše razpoloženje. Serotoninski receptorji pravilno funkcionirajo le, kadar so izraženi na površini živčnih celic. Površinsko izražanje teh je pogojeno z motoričnimi proteini, kinezini, ki so sestavljeni iz glave, pecljatega dela in repa. Ti najprej vežejo vezikel serotoninskih receptorjev na svojo FHA domeno, nato pa se s tristopenjskim procesom, pri katerem je potrebna energija (v obliki ATP), pomikajo po mikrotubulih do plazmaleme. V primeru okvare kinezinskih transporterjev se vezikli s serotoninskimi receptorji akumulirajo v citoplazmi. Posledica je abnormalno vedenje osebkov, ki kaže na simptome tesnobe. Simptome je mogoče zdraviti z antidepresivi SSRI, kot so Prozac, Celexa, Luvox, Zoloft, Paxil, Lexapro in drugi. Ti z vezanjem na serotoninski transporter povečajo raven serotonina izven celice. Kljub temu mehanizem delovanja SSRI antidepresivov v celoti še ni poznan.

===Domen Klofutar: Lipoliza - reguliran multiencimski kompleks, ki vpliva na katabolizem zalog maščobe===

Maščobne kisline, ki v našem telesu služijo kot zaloga energije, se s pomočjo različnih encimov in transporterjev prenesejo do maščobnega tkiva, kjer se shranijo v obliki maščobnih kapljic. Maščobne kapljice so strukture obdane z enojnim lipidnim slojem, v katerih so shranjeni trigliceridi. Ko telo prejme signal, da primanjkuje energije, se njihove zaloge začnejo sproščati iz maščobnih kapljic v kri, nato pa se s serumskim albuminom prenesejo do oksidativnih tkiv, kjer se z β-oksidacijo pretvorijo v acetil CoA. Proces razgradnje trigliceridov in njihovo skladiščenje je močno reguliran proces. Njihovo razgradnjo katalizirajo različni encimi. Najpomembnejši so maščobna triglicerid lipaza, od hormonov odvisna lipaza in monoglicerid lipaza. Maščobna triglicerid lipaza ATGL je regulirana z aktivatorjem CGI-58 in inhibitorjem G0S2, aktivnost od hormonov odvisne lipaze HSL pa se uravnava s fosforilacijo. Monoglicerid lipaza MGL ima vlogo v katabolizmu trigliceridov in tudi pri endokanabinoidni signalizaciji. Če v telesu nastopi kakršnakoli okvara tega regulatornega sistema lipaz, nastopijo različne bolezni. Te bolezni so posledica kopičenja trigliceridov v celicah oziroma pomanjkanja prostih maščobnih kislin, ki se lahko prenesejo v kri.

===Aneja Tahirovič: Omega-3 maščobne kisline in njihov vpliv na človeško telo===

Esencialne maščobne kisline so tiste, ki so za telo pomembne, vendar jih ni sposobno sintetizirati samo. Mednje spadajo tudi omega-3 maščobne kisline in omega-6 maščobne kisline.
Omega-3 maščobne kisline se nahajajo v morskih živalih, školjkah in nekaterih suho-zemnih rastlinah.
Omega-6 maščobne kisline pa najdemo v oljih in hrani živalskega izvora. Pomembno je uravnavanje ravnotežja, obeh maščobnih kislin, v telesu.
V primeru presežka omega-6 maščobnih kislin, pride do sinteze eikozanoidov, ki na telo delujejo provnetno. V tem primeru pride do večjega tveganja za razvoj bolezni, kot so rak, kardiovaskularne in avtoimunske bolezni.
Ob presežku omega-3 maščobnih kislin pa pride do sinteze eikozanoidov, ki na telo delujejo protivnetno in zavirajo bolezenske procese. Ugotovljeno je bilo, da omega-3 maščobne kisline dobro delujejo kot preventiva za nastanek srčno-žilnih bolezni, rakavih obolenj, za preprečitev razvoja Alzheimerjeve bolezni ter drugih nevrodegenerativnih bolezni, zmanjšajo možnost za razvoj depresije ter povečajo absorbcijo kalcija in s tem zmanjšajo možnosti za nastanek revmatoidnega artritisa in parodontitisa.
Kolikšna količina omega-3 maščobnih kislin je za telo zdrava, je odvisno od starosti. Novorojenčki in otroci do prvega leta starosti, maščobnih kislin omega-3 še ne smejo uživati, zato je pomembno, da jih toliko več, uživajo matere že med nosečnostjo.

===Jure Fabjan: Oksidativni in nitrozativni stres v nevrotoksičnosti amonijaka===

Hiperamoniemija je stanje povišane koncentracije amonijaka v krvi. Korelacija med koncentracijo amonijaka v krvi in stopnjo HA ni dobro raziskana, saj so simptomi pri obolelih z isto koncentracijo amonijaka različni. Zdravi se jo z različnimi zdravili, odvisno od njenega vzroka. Zdravljenje deluje na principu omejevanja vnosa amonijaka ter povečanja njegovega izločanja. HA lahko nato preide v možganski edem ali hepatično encefalopatijo. Hepatična encefalopatija se zdravi z antibiotiki, intermediati cikla uree in drugimi substancami, vendar so zdravila bodisi dokaj neučinkovita, ali pa imajo stranske učinke. Pri bolnikih, katerih hepatična encefalopatija je posledica akutne odpovedi jeter, je že v začetnih stopnjah potrebna presaditev jeter.
Kakšne so poti na molekulski ravni, ki vodijo do takih posledic, je še vedno v veliki meri misterij, vendar je sedaj vsaj znano, da povišana koncentracija amonijaka povzroči tvorbo reaktivnih kisikovih in dušikovih zvrsti, te pa v veliki meri povzročajo simptome, ki so enaki simptomom hepatične encefalopatije.

===Maruša Prolič-Kalinšek: Vloga PPAR pri razgradnji maščobnih kislin===

Receptorji aktivirani s proliferatorjem periksosomov ( PPARs ) so del družine z ligandom aktiviranimi transkripcijskimi faktorji. Prvotno so jih identifirali kot receptorje, ki inducirajo proliferacijo peroksisomov v celici, od tod tudi ime. PPARs imajo pomembno vlogo pri regulaciji celične diferenciacije, razvoja, metabolizma ( maščob, ogljikovih hidratov in proteinov ), karcinogeneze in vnetja. Njihovi naravno nastopajoi ligandi so maščobne kislini in razni derivati maščobnih kislin, obstaja pa tudi že več sintetičnih ligandov. Poznamo PPAR alfa, PPAR beta in PPAR gama in imajo enak osnoven mehanizem delovanja, so aktivirani z maščobnimi kislinami in njihovimi derivati ter si delijo veliko tarčnih genov. V jedru reagirajo tako, da tvorijo heterodimerje z drugimi jedrnimi receptorji RXR ( retinoid X receptor ) in se nato vežejo na regulatorne regije DNA v bližini genov, katerim potem spremenijo hitrost transkripicije ( povečajo ali zmanjšajo ). Podtipi PPARs se razlikujejo v in vivo funkcijah. PPAR gama je največ v adipocitnem tkivu in jetrih. Ima vlogo pri vklopitvi genov potrebnih za diferenciacijo adipocitov in genov za proteine, ki so potrebni pri sintezi in shrambi lipidov. PPAR alfa je izražen v jetrih, ledvicah, srcu, skeletni mišici in BAT. V jetrih PPAR vklopi gene za vnos in beta oksidacijo maščobnih kislin ter formacijo ketonskih telesc med stradanjem. PPAR beta se odziva na spremembe v prehranskih lipidih. PPAR beta je aktiven v jetrih in mišicah in stimulira veliko genov, ki kodirajo proteine za beta oksidacijo. Povzroči kurjenje maščob, izgubo teže in termogenezo.

===Jan Rozman: Proteini - alternativni vir energije rastlin ob pomanjkanju ogljikovih hidratov===

Ker je celica najmanjša gradbena enota, ki kaže znake življenja, morajo biti procesi znotraj nje kar najbolj optimizirani in dobro regulirani. Poleg tega, mora celica ves čas izvajati regulacijo procesov glede na stanje metabolitov v njej sami in glede na okolje, hranila, ki jih pridobiva iz njega. Za množico teh procesov skrbi TOR omrežje. Običajno je vir energije glukoza, ki jo rastlina proizvede s fotosintezo, a če nastopi obdobje, ko je ni, se mora celica zateči k alternativnim substratom. V tem seminarju sem se najbolj osredotočil na proteine, sicer pa so lahko nadomestek še lipidi in klorofil. Proteini se lahko razgradijo na dva načina, z avtofagijo ali v proteosomu. S tem celica pridobi aminokisline, ki jih lahko porabi za sintezo novih proteinov, ali pa jih razgradi v mitohondriju in na ta način pridobi elektrone za dihalno verigo in energijo v obliki ATP. V primerjavi z energijo, ki se jo lahko pridobi z razkrojem saharoze, je ta pri degradaciji proteinov pičla, a zadostuje, da celica in z njo rastlina preživi temno obdobje, ko primanjkuje ogljika v obliki CO2 iz zraka.

===Simon Bolta: C4 fotosinteza===

V splošnem poznamo 3 različne fotosintetske poti, ki potekajo v različnih rastlinah. To so C3, C4 in CAM fotosinteza. Najbolj razširjena je C3 fotosinteza. Pri tej se pojavi problem zaradi nespecifičnosti encima rubisko. Ta načeloma veže CO2 na ribulozo-1,5-bisfosfat. Zaradi svoje nespecifičnosti pa lahko namesto CO2 veže O2. Posledično ne pride do fiksacije ogljika, produkt 2-fosfoglikolat pa je škodljiv za celico, in je metabolni odpadek. Temu procesu pravimo fotorespiracija. Tako prihaja do velikih energetskih izgub, prav tako pa tudi do manjše učinkovitosti izrabe dušika ter vode. Zato se je razvila C4 fotosinteza. Pri tej je vzpostavljen mehanizem, preko katerega je CO2 zelo koncentriran ob rubisku. To učinkovito zavira fotorespiracijo, ter izboljšuje efektivnost rastlin pri fiksaciji dušika in porabi vode. Dandanes so je vse večja problematika glede prehrane svetovnega prebivalstva. Če bi nam uspelo inducirati C4 fotosintezo v C3 rastlinah, bi to povečalo hektarski donos, zato se v zadnjih letih precej dela na tovrstnem inženiringu. Poleg tega bi bila zadeva koristna za uporabo biogoriv. Zaenkrat znanstveniki še niso uspeli ugotoviti uspešne metode, preko katerih bi lahko potem ustvarili korist za širše množice ljudi.

===Aljaž Omahna: Sinteza melanina v celicah===

Melanin je vrsta polimernih spojin, ki da koži, lasem in očem barvo, najdemo pa ga tudi v možganih. Melanin se v tvori v posebnih celicah imenovanih melanociti. Poznamo več tipov melanina to so evmelanin, fevmelanin in nevromelanin. Evmelanin in fevmelanin nastajata v lizosomskih veziklih poimenovanih melanosomi. Med seboj se razlikujeta po strukturi. Evmelanin je izgrajen le iz aminokisline tirozin, fevmelanin pa je poleg tirozina izgrajen tudi iz cisteina. Tvorba spojin melanina pa je katalizirana preko encima tirozinaze, ki je ključna za nastanek teh pigmentov, tirozinazi sorodnem encimu (TRYP1) in dopakrom tavtomeraza (DCT). Melaninski pigmenti ščitijo celice bazalne plasti kože pred poškodbami in mutacijami. Melanom je kožna oblika raka, ki lahko nastaja v katerem koli melanocitu. Za to obliko raka umre največ ljudi, ki trpi za kožnim rakom. Albinizem je genska bolezen ali motnja, pri kateri gre za pomanjkanje pigmenta melanina. Največkrat je okvarjen genski zapis za encim tirozinazo, ki je glavni encim pri sintezi melanina.

BIO2 Povzetki seminarjev 2013

2013-11-22T10:59:53Z

Mojca Kostanjevec:

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2013/2014 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2013 stran]

===Mojca Kostanjevec: Mitohndrijske reaktivne kisikove spojine===

Mitohondriji so celični organel, v katerem potekajo poglavitni metabolični procesi v celici. Med celično oksidacijo molekul elektroni v elektronski prenašalni verigi omogočajo prenos protonov skozi proteinske komplekse, ta pa zagotavlja ATP sintezo in redukcijo molekularnega kisika v vodo. Med temi procesi pa nastajajo tudi stranski produkti – reaktivne kisikove spojine. To so visoko reaktivni prosti radikali, ki vsebujejo kisikove ione ali perokside. Te spojine so dolgo časa veljale le za škodljive in toksične, novejše raziskave pa dokazujejo, da so ob primerno visokih koncentracijah v celici lahko tudi pomembni intermediati in signalne molekule. Med okoljskim stresom ali preko zunanjih dejavnikov (npr. ionizirajoče sevanje) koncentracije teh spojin močno narastejo. To povzroči obsežne poškodbe celičnih struktur – tovrstno stanje imenujemo oksidativni stres, kar pa lahko vodi v celično smrt oziroma apoptozo. Toda reaktivne kisikove spojine kljub vsemu še vedno ostajajo nepogrešljiv del mnogih celičnih funkcij. V primeru hipoksije so npr. ravno te kisikove spojine tiste, ki v največji meri regulirajo primeren celični odziv. Reaktivne kisikove spojine inhibirajo aktivnost encima PHD2, kar omogoča stabilizacijo HIF-α podenot in ustrezno transkripcijsko aktivacijo. Te spojine obenem nadzorujejo tudi aktivnost AMPK. AMPK fosforilira enega izmed največjih porabnikov energije v celici – Na/K črpalko, to pa v vodi v endocitozo in deaktivacijo omenjenega proteinskega kompleksa. S tem se posledično zmanjša poraba energije v celici. Reaktivne kisikove spojine, ki nastajajo v mitohondrijih, tako na različne načine prispevajo k metabolizmu celic.

===Tajda Buh: Mutacije izocitrat dehidrogenaze 1 in 2 pri raku===

IDH sodeluje pri pomembnih presnovnih poteh. IDH je asimetričen homodimer, ki lahko prehaja iz neaktivne odprte v aktivno zaprto konformacijo. Poznamo tri vrste izocitrat dehidrogenaz. IDH3 se nahaja v mitohondriju in katalizira prehod izocitrata v α-ketoglutarat, hkrati poteče redukcija NAD+ v NADH. IDH2 se prav tako nahaja v mitohondriju, IDH1 pa najdemo v citosolu in peroksisomih. Obliki 1 in 2 reducirata NADP+ v NADPH. Mutacije se pojavljajo samo pri IDH1/2, ne pa tudi pri IDH3. Mutirana IDH lahko pridobi novo aktivnost, to je kataliziranje pretvorbe α-ketoglutarata v 2-hidroksiglutarat, aktivnost encima pa se lahko tudi močno zmanjša. Nova aktivnost povzroči prekomerno sintezo 2-hidroksiglutarata. Povečanje koncentracije slednjega pa vpliva na α-ketoglutaratno odvisne presnovne encime, kot sta prolil hidroksilaza in histonska demetilaza. Študije so do tega trenutka potrdile prisotnost mutirane IDH1 in IDH2 v nižjih stopnjah glioma, v sekundarnem glioblastomu in v akutni mieloični levkemiji.

===Vid Jazbec: Vpliv mašobnih kislin na rakave celice===

Celice ob tvorbi rakastega obolenja spremenijo svoje delovanje. Predvsem je to vidno v metabolizmu, ki je v rakastih celicah spremenjen. Novejše raziskave dokazujejo, da je odvisnost metabolima odvisna od maščobnih kislin v večji meri, kot je bilo domnevano do sedaj. Metabolizem maščobnih kislin, predvsem beta oksidacijo, rakave celice izkoristijo ob pomanjkanju ATP, kot je pokazano pri celicah z igubo stika t izvenceličnim matriksom. Proces beta oksidacije je prav tako pomemben tudi kot proces, ki vodi v nastanek NADPH, ki se potrebuje za soočanje celice z metabolnim stresom reaktivnih kisikovih zvrsti ter rast in razvoj. Za v uvodu naštete značilnosti rakavih celic pa so poleg samega procea beta oksidacije in produktov tega procesa pomembni tudi proteini, ki spremljajo ta proces. Ti so ob nastopu rakavega obolenja deregulirani in večinoma preprečujejo prehod obolele celice v apoptozo.
Raziskave pa so pokazale tudi problem dosedajšnje dogme, pri kateri sta beta oksidacija maščobnih kislin in njihova sinteza med seboj izključujoča procesa odvisna od ACC. To zavračajo raziskave rakavih celic, pri katerih se oba procesa vršita istočasno in sta enako pomemba za delovaje in ravoj celice.
Nove raziskave na področju rakavih obolenj pa so pomembne predvsem za zdravljenje bolezni.

===Rok Ferenc: Medsebojne fizične povezave encimov TCA cikla v Bacillus subtilis===

Večina proteinov živih celic deluje v kompleksih, ne posamično. Poleg stalnih proteinskih kompleksov znanstveniki po zaslugi naprednejših eksperimentalnih tehnik odkrivajo tudi medproteinske interakcije bolj prehodne narave, značilne predvsem za metabolične poti. V raziskavi se osredotočijo na formacijo metabolona (skupka proteinov) v citratnem ciklu Bacillus subtilis, ki je zelo pomemben modelni organizem in vir proizvodnje vitaminov in encimov za pralne praške. Ta bi pripomogel k organiziranosti metabolnih poti v sicer kaotični notranjosti prokariontskih celic brez organelov.
Dokazan je bil obstoj metabolona v ciklu trikarboksilnih kislin, v katerega se povezuje tudi nekaj encimov anabolizma, katerih substrati so intermediati TCA cikla (citratni cikel). V metabolonu obstaja jedro iz treh encimov: citrat sintetaze, malat dehidrogenaze in izocitrat dehidrogenaze. Interakcija med encimi glukoneogeneze, bolj natančno med malat dehidrogenazo in fosfoenol piruvat karboksikinazo je uravnavana s strani razlik v koncentracijah intermediatov glikolize in TCA cikla, torej za formacijo metabolona ni potreben noben zunanji signal, le povečana koncentracija ustreznih substratov.

===Sara Košenina: Zdravljenje hipoksije in z njo povezanega nastanka raka preko citratnega cikla===

Hipoksija je stanje, ko celice in tkiva ne dobijo dovolj kisika, zato pride do motenj v delovanju organa ali pa celo celotnega organizma. Ljudje smo za prilagoditev na hipoksijo razvili mehanizem, ki je reguliran preko heterodimernega proteinskega kompleksa HIF-1. Glavna podenota je HIF-1α, saj je občutljiva na kisik. Aktivnost HIF-1 je regulirana z različnimi mehanizmi, eni so odvisni od hipoksije, drugi pa so od nje neodvisni. Slednji so pomembni pri razvoju in napredovanju tomorjev. Eden od hipoksije neodvisnih regulatorjev je tudi piruvat, ki je začetni substrat cikla citronske kisline. V hipoksičnih pogojih pride do motenj v elektronskem transportu, zato je proizvodnja ROS (reaktivnega kisika) povečana. To je kompenzira z uravnavanjem piruvat dehidrogenaznega kompleksa (PDH) s piruvat dehidrogenazo kinazo (PDK1). Raziskave so pokazale, da etil piruvat poveča stabilnost HIF-1 s stimulacijo proizvodnje ROS v mitohondriju in blokira s pVHL regulirano razgradnjo HIF-1. Indukcija HIF-1 z etil piruvatom je povezana s pospeševanjem citratnega cikla. Etil piruvat pospeši tako citratni cikel kot tudi proizvodnjo ROS v mitohondriju. Rezultati raziskav podpirajo obstoj regulatornega mehanizma za prilagoditev na hipoksijo, pri katerem PDK1 deaktivira PDH kompleks in inhibira cikel citronske kisline in na ta način zmanjša proizvodnjo ROS. Vse te ugotovitve bi lahko pripomogle k zdravljenju hipoksije in z njo povezanega razvoja raka. Potrebnih bo še veliko raziskav, preden se bo lahko etil piruvat uporabljalo v klinične namene.

===Tjaša Bensa: α-ketoglutarat dehidrogenazni kompleks in nevrodegenerativne bolezni===

α-ketoglutarat dehidrogenazni kompleks (KGDHC) je en izmed encimov v Krebsovem ciklu. V procesu oksidativne dekarboksilacije katalizira reakcijo α-ketoglutarat + NAD+ + CoA-SH -> sukcinil-CoA + NADH + H+ + CO2.
Sestavljen je iz 3 podenot: α -ketoglutarat dehidrogenaze (E1), dihidrolipoil sukcinil transferaze (E2) in dihidrolipoil dehidrogenaze (E3). E3 podenota oksidira NADH v NAD+.
Reaktivne kisikove spojine oziroma reaktivne kisikove zvrsti (ROS) so zelo reaktivni prosti radikali, snovi ali molekule s kisikom. Najpogostejši ROS sta O2- (superoksid) in H2O2 (vodikov peroksid). ROS lahko reagirajo s sestavinami celice, zelo radi pa napadejo tudi KGDHC. Oksidativni stres se pojavi v našem telesu zaradi povečane koncentracije ROS. Povzroča različne bolezni, naprimer Alzheimerjevo bolezen, Parkinsonovo bolezen, diabetes, revmatoidni artritis in nevrodegeneracijo. Po drugi strani pa tudi sam KGDHC proizvaja kisikove spojine in tako se ustvari začarn krog. Ker je vse regulirano, že ob najmanjši spremembi v metabolizmu pride do proizvodnje ROS in povzročitve oksidativnega stresa.

===Filip Mihalič: Pomen MicroRNA molekul v metabolizmu in metabolnih nepravilnostih===

MicroRNA molekule, so vrsta nekodirajočih RNA molekul dolgih približno 22 nukleotidov, in imajo celo vrsto zelo pomembnih funkcij za razvoj organizma, ter za ohranjanje metabolne homeostaze v le tem. Primarno delujejo kot zaviralec transkripcije mRNA, s tem da se nanjo vežejo, in s tem ribosomu ne pustijo prepisovanja v proteine. Prve miRNA molekule so odkrili okoli leta 1990 v glisti Caenorhabditis elegans vendar njihove vloge kot enega pomembnejših metabolnih regulatorjev niso prepoznali do začetka dvajsetega stoletja. Najdemo jih v skoraj vseh bioloških procesih povezanih z ekspresijo mRNA, od metabolizma lipidov in holesterola do inzulinske signalizacije. Njihov vpliv je velikokrat povezan z transkripcijskimi faktorji, s katerimi sodelujejo v težnji po ravno pravšnji ekspresiji genov. So dokaj pred kratkim odkrita skupina molekul, zato še niso dobro raziskane, in mehanizmi njihovega delovanja še niso povsem pojasnjeni. Najbolje sta raziskana prav vpliva na lipidno in inzulinsko homeostazo, na kateri se bom osredotočil v seminarju. Do sedanje raziskave miRNA pa so predlagale njihovo veliko uporabnost v farmaciji ter kasneje medicini, saj njihovo nepravilno delovanje privede do bolezni kot so huda predebelost, inzulinska neodzivnost (diabetes tipa 2), zamaščena jetra itd.

===Vita Vidmar: Vloga pentozafosfatne poti v metabolizmu rakavih celic===

Pentozafosfatna pot v celicah zagotavlja NADPH, ki je potreben za ohranjanje redukcijskega okolja v celici in za redukcijske biosinteze, ter riboza 5-fosfat, ki je prekurzor za sintezo nukleotidov in se po potrebi lahko reciklira nazaj v glukoza 6-fosftat. Ta v celicah poteka v majhnem obsegu, saj je skrbno regulirana, predvsem z negativnimi regulatorji.
V rakavo spremenjenih celicah zaradi poslabšane regulacije pentozafosfatna pot poteka v povečanem obsegu, kar jim omogoča pomembne prednosti. Ker proizvedejo velike količine NADPH in riboza 5-fosfata, jim to omogoča preživetje in hitrejše razmnoževanje, vpliva pa tudi na širjenje metastaz in angiogenezo (rast novih krvnih žil proti tumorju).
Poznavanje vloge pentozafosfatne poti v metabolizmu rakavih celic lahko pripomore k odkritju učinkovitejšega načina zdravljenja rakavih obolenj.

===Gregor Gunčar: Do what you want, but post your abstract here!===

Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Suspendisse sed justo congue, faucibus metus in, sodales tellus. Nulla nec erat in mauris condimentum rutrum. Maecenas vel scelerisque velit, at tincidunt massa. Praesent molestie euismod diam quis iaculis. Etiam non diam malesuada, pellentesque massa id, feugiat nulla. Integer eget euismod purus. Sed dignissim lectus quis fermentum ultrices. Nunc quis scelerisque ligula, nec laoreet justo. Morbi vitae felis in nibh commodo iaculis quis ac turpis. Nam feugiat a dui a faucibus.

Cras et elementum urna. Proin vel tortor sit amet urna facilisis ultrices lobortis sit amet neque. Sed luctus convallis urna, pulvinar ullamcorper sem adipiscing sit amet. Nullam fringilla ante est. Praesent viverra tortor vel felis convallis, non placerat enim condimentum. Suspendisse rutrum fermentum odio, in molestie risus consectetur ac. Sed interdum neque ultricies, fermentum tortor quis, consequat est. Sed vel faucibus felis.

===Ema Guštin: Warburgov efekt in možnosti za zdravljenje raka===

Otto Heinrich Warburg je bil začetnik kvantitativnih raziskav metabolizma rakavih celic, ukvarjal pa se je tudi s fotosintezo in s celičnim dihanjem. Okoli leta 1920 je s sodelavci pokazal, da v aerobnih pogojih tumorska tkiva v mlečno kislino oz. laktat pretvorijo približno desetkrat več glukoze kot celice normalnega tkiva. Ta pojav danes imenujemo Warburgov efekt. Vendar pa je za to povečanje aerobne glikolize v rakavih celicah pogosto napačno mišljeno, da se zgodi namesto mitohondrijskega dihanja, in je bilo napačno interpretirano kot dokaz za poškodbe dihanja, čeprav gre v resnici za poškodbe v regulaciji glikolize. Pravzaprav mnoge vrste rakov kažejo Warburgov efekt in pri tem ohranijo mitohondrijsko dihanje. Warburgova opažanja v povezavi s sedanjimi koncepti metabolizma raka tesno povezujejo s spremembami na mitohondrijski DNK, onkogeni in zaviralci tumorjev, torej bi njegovo hipotezo lahko izkoristili za zdravljenje raka.

===Maja Zupančič: Menin: ogrodni protein, ki nadzoruje eksoresijo genov in celično signalizacijo===

Z razrešitvijo kristalne strukture proteina menina, sta Huang in Murai ugotovila, da spada v skupino ogrodnih proteinov. Nahaja se v jedru, v manjših koncentracijah pa ga lahko najdemo tudi v citoplami, izražen pa je v vseh tkivih. Kristalno strukturo jedrnega proteina menina lahko opišemo z obliko zavite leve roke, kjer N-domena predstavlja β-lasnično zanko, zgornja domena palec in osrednja domena predstavlja dlan. Ko menin reagira z peptidom MLL1 ali transkripcijskim faktorjem JunD, se povežeta v globoki žep, ki ga oblikuje struktura menina. Menin reagira s številnimi proteini (JunD, MLL1, TGFβ, SUMO, β-katenin,…) in tako vpliva na espresijo genov in celično signalizacijo. Menin sodeluje tudi pri številnih signalnih poteh,, kot so signalna pot transformirajočega rastnega faktorja β, kostnega morfogenetskega proteina, kanonične poti Wnt in signalizacija jedrnega receptorja. Pri ljudeh je protein menin kodiran z genom MEN1. Če pride do mutacije tega gena, se pojavi dedna bolezen multipla endokrina neoplazija ali Wermerjev sindrom, za katerim vsako leto zboli 1 na 30 000 ljudi. Pri multipli endokrini neoplaziji pride do tvorbe številnih tumorjev v različnih endokrinih organih. Bolezen ni ozdravljiva, lahko pa zdravimo tumorje, ki nastanejo. Z zgodnjim odkritjem bolezni in primernim ter efektivnim zdravljenjem, se prognoza lahko izboljša.

===Vesna Radić: Vloga betatrofina pri zdravljenju diabetesa===

Uveljavljen način zdravljenja sladkorne bolezni tipa 2 je dnevni vnos inzulina v telo z injekcijami in do nedavnega je prevladovalo mnenje, da alternative temu ni. Nova študija o delovanju beta celic trebušne slinavke pod vplivom hormona betatrofina namiguje, da so temu šteti dnevi.
Na Harvard Stem Cell Institute so z uporabo peptida, ki se veže na inzulinske receptorje spodbudili odpornost na inzulin in tako identificirali hormon betatrofin. Je peptidni hormon, najden v jetrih in maščevju miši, pri človeku pa le v jetrih. Pri ljudeh se ga da izslediti z metodo western blottinga. Posredno naj bi zvišal stopnjo razmnoževanja beta celic pankreasa v procesu celične delitve.
Za ugotovitev, ali betatrofin res vpliva na stopnjo razmnoževanja beta celic, so uporabili injekcijo v veno repa, da bi prenesli izražanje betatrofina v jetra – eno od običajnih mest njegovega delovanja - povišana stopnja pomnoževanja je bila tako drastična, da so lahko zlahka prepoznali otočke in beta celice pri majhni povečavi
Pomembna lastnost zdravljenja s tem hormonom je ta, da je betatrofin zelo specifičen; ne vpliva na druga tkiva in tako bi prišlo do manj zapletov, saj bi telo proizvajalo lasten inzulin. Poleg tega prednost tudi ta, da je ta študija podlaga za razvoj klinično uporabnih celic z reprogramiranjem odraslih beta celic trebušne slinavke brez uporabe izvornih celic.

===Luka Kavčič: Vloga glikolitičnega regulatornega encima PKM2 v metabolizmu rakave celice===

Piruvat kinaza (PK) je encim, ki katalizira zadnjo stopnjo glikolize, pretvorbo fosfoenolpiruvata (PEP) v piruvat in s tem fosforilacijo ADP v ATP. Izocimska oblika M2 je pomembna v metabolizmu rakavih celic, saj zaradi manjše aktivnosti v primerjavi z M1 obliko omogoča manjši pretok skozi glikolizo ob enaki absorpciji glukoze iz krvi, kar vodi do akumulacije glikoliznih intermediatov. Ti so tako bolj dostopni biosinteznim potem v celici, kar ji omogoča hitro celično delitev ter razvoj tumorja. Prav tako je pomemben pri odzivu na oksidativni stres, saj z svojo oksidacijo posredno omogoča aktivacijo pentoza-fosfate poti, v kateri nastaja NADPH, kar predstavlja zadosten redukcijski potencial za vzpostavitev homeostaze.
Pod določenimi pogoji se lahko PKM2 translocira v jedro, kjer deluje kot transkripcijski regulator s svojo protein kinazno aktivnostjo ter fosforilira transkripcijske faktorje, kot so Stat3, histon 1 in histon 3. Ugotovljeno je bilo, da lahko fosforilacijo proteinov izvaja le v dimerni obliki, katera je najbolj zastopana oligomerna oblika PKM2 v jedru. Zaradi svoje prisotnosti v skoraj vseh rakavih celicah, je PKM2 atraktivna tarča zdravljenja. Zadnje raziskave kažejo na testiranje različnih aktivatorjev, ki bi z povečano aktivnostjo encima preprečile kopičenje surovin za izgradnjo ter s tem zmanjšale rast tumorja.

===Ana Krišelj: Signalna pot sfingozin-1-fosfata in njegova vloga v boleznih===

Sfingozin-1-fosfat (S1P) je signalna molekula, ključna za regulacijo mnogih celičnih procesov, med katere spadajo tudi celična rast in diferenciacija, apoptoza, migracija celic in mitoza. Nastane s fosforilacijo sfingozina, proces pa je reguliran preko sfingozin kinaze (SK), ki v celicah nastopa v dveh izooblikah – SK1 in SK2.
S1P lahko deluje znotraj ali zunajcelično - lahko se veže na proteine v celicah (HDAC1/2, TRAF2..) ali na membranske receptorje S1PR1-5, ki spadajo v družino z G-proteini sklopljenih receptorjev. Zaradi kompleksne regulacije je S1P možen povzročitelj bolezni, ki se kot le-te izrazijo zaradi napak v mehanizmu delovanja same signalne poti, bodisi zaradi SK ali S1PR receptorjev. Napake se izrazijo kot vrsta kardiovaskularnih (ateroskleroza), vnetnih (astma, multipla skleroza), rakavih in nekaterih drugih obolenjih (diabetes, ishemija).
Vloga S1P in razumevanje molekularnega mehanizma teh bolezni torej ponuja nova področja in možnost raziskovanja v smeri odkrivanja potencialnih zdravil.

===Katjuša Triplat:Signalizacija s člani TGF –ß pri žilni morfogenezi in boleznih===
TGF-β je vrsta citokina, ki uravnava proliferacijo, celično diferenciacijo in druge funkcije v večini celic. Transformirajoči rastni faktor – ß (TGF–ß) naddružina je velika skupina beljakovin, ki jo sestavlja 33 različnih članov, ki vključujejo: TGFß – proteine, kostne morfogenetične proteine (BMP), rastne diferenciacijske faktorje (GDF), aktivine, inhibine, nodalne in »lefty« proteine ter Müllerjevo inhibitorno substanco (MIS). Člani družine transformirajočih rastnih faktorjev – ß (TGF–ß) igrajo pomembno vlogo pri razvoju zarodka, homeostazi odraslega in pri različnih boleznih. Ti citokini izzovejo svoje učinke na celice preko specifičnih serin/treonin kinaznih receptorjev tipa I in II ter intracelularnih transkripcijskih foktorjev Smad in s tem povzročijo signalno kaskado. Prenos signalov lahko poteka po Smad – odvisni ali Smad – neodvisni poti. TGF-ß signalna pot kontrolira celično proliferacijo, prepoznavanje, diferenciacijo, apoptozo in specifikacijo razvojne usode med embriogenezo in v zrelih tkivih. Inaktivacija te poti tako prispeva k tumorogenezi. Genetske študije na miših in ljudeh so pokazale pomembno vlogo TGF-β signalnih elementov v žilni morfogenezi in njeni disfunkciji. Izguba TGF-β signalnih elementov privede, zaradi nepravilnega nastanka kapilar ali okvarjene diferenciacije in pridobivanja gladko mišičnih celic, do nenormalnega nastanka primitivnega žilnega pleteža in zmanjšane integritete žilnih sten.

===Urša Kapš: Uravnavanje maščob: lipidi in človeške bolezni===

Za življenje je pomembno uravnavanje metabolične energije. V mnogih organizmih so celične lipidne kapljice in trigliceridi največji shranjevalci energije. Preobilica zalog ali pomanjkanje tvorjenja in obnavljanja maščob vodijo do številnih človeških bolezni, kot so lipodistrofija (genetske okvare v lipidnih zalogah), rakava kaheksija (kompleksen metabolični sindrom, povezan z nenadno izgubo zaloge lipidov), prekomerna debelost, steatoza jeter (bolezen zamaščenih jeter) in kardiovaskularne bolezni (bolezni srca in ožilja, najpogostejša je ateroskleroza = poapnenje žil). Nevaren je tudi nastanek penastih celic (makrofagi, ki imajo nakopičeno veliko količino holesterolnih estrov), ki zamašijo žilo. Maščoba je shranjena v lipidnih kapljicah, vendar je, kljub njihovi pomembnosti za celico in fiziologijo organizma, relativno malo znano o njihovih mnogih osnovnih procesih v različnih tkivih. Pomembni proteini, ki regulirajo zalogo lipidov in številni geni, ki kodirajo proteine lipidnih kapljic, ki so povezani z metaboličnimi boleznimi, so že identificirani. Na primer BSCL2 so geni, ki kodirajo transmembranski protein seipin, katerega funkcija je izražena v lipidni biosintetski poti. V zadnjem času se je zanimanje in število raziskav na področju zalog lipidov, raznih novih pristopov za zdravljenje bolezni, povezanih s premalo ali preveliko zalogo maščob, drastično povečalo, kar nas bo pripeljalo do novih dognanj in boljšega znanja na tem področju znanosti.

===Tim Božič: Motorični protein z regulacijo serotoninskega receptorja vpliva na razpoloženje ===

Hormon serotonin nastane iz triptofana s pomočjo triptofan hidroksilaze in aktivira serotoninske receptorje, ki se nahajajo v živčnih celicah. Aktivirani, regulirajo številne druge nevrotransmitorje in hormone, ki vplivajo na naše razpoloženje. Serotoninski receptorji pravilno funkcionirajo le, kadar so izraženi na površini živčnih celic. Površinsko izražanje teh je pogojeno z motoričnimi proteini, kinezini, ki so sestavljeni iz glave, pecljatega dela in repa. Ti najprej vežejo vezikel serotoninskih receptorjev na svojo FHA domeno, nato pa se s tristopenjskim procesom, pri katerem je potrebna energija (v obliki ATP), pomikajo po mikrotubulih do plazmaleme. V primeru okvare kinezinskih transporterjev se vezikli s serotoninskimi receptorji akumulirajo v citoplazmi. Posledica je abnormalno vedenje osebkov, ki kaže na simptome tesnobe. Simptome je mogoče zdraviti z antidepresivi SSRI, kot so Prozac, Celexa, Luvox, Zoloft, Paxil, Lexapro in drugi. Ti z vezanjem na serotoninski transporter povečajo raven serotonina izven celice. Kljub temu mehanizem delovanja SSRI antidepresivov v celoti še ni poznan.

===Domen Klofutar: Lipoliza - reguliran multiencimski kompleks, ki vpliva na katabolizem zalog maščobe===

Maščobne kisline, ki v našem telesu služijo kot zaloga energije, se s pomočjo različnih encimov in transporterjev prenesejo do maščobnega tkiva, kjer se shranijo v obliki maščobnih kapljic. Maščobne kapljice so strukture obdane z enojnim lipidnim slojem, v katerih so shranjeni trigliceridi. Ko telo prejme signal, da primanjkuje energije, se njihove zaloge začnejo sproščati iz maščobnih kapljic v kri, nato pa se s serumskim albuminom prenesejo do oksidativnih tkiv, kjer se z β-oksidacijo pretvorijo v acetil CoA. Proces razgradnje trigliceridov in njihovo skladiščenje je močno reguliran proces. Njihovo razgradnjo katalizirajo različni encimi. Najpomembnejši so maščobna triglicerid lipaza, od hormonov odvisna lipaza in monoglicerid lipaza. Maščobna triglicerid lipaza ATGL je regulirana z aktivatorjem CGI-58 in inhibitorjem G0S2, aktivnost od hormonov odvisne lipaze HSL pa se uravnava s fosforilacijo. Monoglicerid lipaza MGL ima vlogo v katabolizmu trigliceridov in tudi pri endokanabinoidni signalizaciji. Če v telesu nastopi kakršnakoli okvara tega regulatornega sistema lipaz, nastopijo različne bolezni. Te bolezni so posledica kopičenja trigliceridov v celicah oziroma pomanjkanja prostih maščobnih kislin, ki se lahko prenesejo v kri.

===Aneja Tahirovič: Omega-3 maščobne kisline in njihov vpliv na človeško telo===

Esencialne maščobne kisline so tiste, ki so za telo pomembne, vendar jih ni sposobno sintetizirati samo. Mednje spadajo tudi omega-3 maščobne kisline in omega-6 maščobne kisline.
Omega-3 maščobne kisline se nahajajo v morskih živalih, školjkah in nekaterih suho-zemnih rastlinah.
Omega-6 maščobne kisline pa najdemo v oljih in hrani živalskega izvora. Pomembno je uravnavanje ravnotežja, obeh maščobnih kislin, v telesu.
V primeru presežka omega-6 maščobnih kislin, pride do sinteze eikozanoidov, ki na telo delujejo provnetno. V tem primeru pride do večjega tveganja za razvoj bolezni, kot so rak, kardiovaskularne in avtoimunske bolezni.
Ob presežku omega-3 maščobnih kislin pa pride do sinteze eikozanoidov, ki na telo delujejo protivnetno in zavirajo bolezenske procese. Ugotovljeno je bilo, da omega-3 maščobne kisline dobro delujejo kot preventiva za nastanek srčno-žilnih bolezni, rakavih obolenj, za preprečitev razvoja Alzheimerjeve bolezni ter drugih nevrodegenerativnih bolezni, zmanjšajo možnost za razvoj depresije ter povečajo absorbcijo kalcija in s tem zmanjšajo možnosti za nastanek revmatoidnega artritisa in parodontitisa.
Kolikšna količina omega-3 maščobnih kislin je za telo zdrava, je odvisno od starosti. Novorojenčki in otroci do prvega leta starosti, maščobnih kislin omega-3 še ne smejo uživati, zato je pomembno, da jih toliko več, uživajo matere že med nosečnostjo.

===Jure Fabjan: Oksidativni in nitrozativni stres v nevrotoksičnosti amonijaka===

Hiperamoniemija je stanje povišane koncentracije amonijaka v krvi. Korelacija med koncentracijo amonijaka v krvi in stopnjo HA ni dobro raziskana, saj so simptomi pri obolelih z isto koncentracijo amonijaka različni. Zdravi se jo z različnimi zdravili, odvisno od njenega vzroka. Zdravljenje deluje na principu omejevanja vnosa amonijaka ter povečanja njegovega izločanja. HA lahko nato preide v možganski edem ali hepatično encefalopatijo. Hepatična encefalopatija se zdravi z antibiotiki, intermediati cikla uree in drugimi substancami, vendar so zdravila bodisi dokaj neučinkovita, ali pa imajo stranske učinke. Pri bolnikih, katerih hepatična encefalopatija je posledica akutne odpovedi jeter, je že v začetnih stopnjah potrebna presaditev jeter.
Kakšne so poti na molekulski ravni, ki vodijo do takih posledic, je še vedno v veliki meri misterij, vendar je sedaj vsaj znano, da povišana koncentracija amonijaka povzroči tvorbo reaktivnih kisikovih in dušikovih zvrsti, te pa v veliki meri povzročajo simptome, ki so enaki simptomom hepatične encefalopatije.

===Maruša Prolič-Kalinšek: Vloga PPAR pri razgradnji maščobnih kislin===

Receptorji aktivirani s proliferatorjem periksosomov ( PPARs ) so del družine z ligandom aktiviranimi transkripcijskimi faktorji. Prvotno so jih identifirali kot receptorje, ki inducirajo proliferacijo peroksisomov v celici, od tod tudi ime. PPARs imajo pomembno vlogo pri regulaciji celične diferenciacije, razvoja, metabolizma ( maščob, ogljikovih hidratov in proteinov ), karcinogeneze in vnetja. Njihovi naravno nastopajoi ligandi so maščobne kislini in razni derivati maščobnih kislin, obstaja pa tudi že več sintetičnih ligandov. Poznamo PPAR alfa, PPAR beta in PPAR gama in imajo enak osnoven mehanizem delovanja, so aktivirani z maščobnimi kislinami in njihovimi derivati ter si delijo veliko tarčnih genov. V jedru reagirajo tako, da tvorijo heterodimerje z drugimi jedrnimi receptorji RXR ( retinoid X receptor ) in se nato vežejo na regulatorne regije DNA v bližini genov, katerim potem spremenijo hitrost transkripicije ( povečajo ali zmanjšajo ). Podtipi PPARs se razlikujejo v in vivo funkcijah. PPAR gama je največ v adipocitnem tkivu in jetrih. Ima vlogo pri vklopitvi genov potrebnih za diferenciacijo adipocitov in genov za proteine, ki so potrebni pri sintezi in shrambi lipidov. PPAR alfa je izražen v jetrih, ledvicah, srcu, skeletni mišici in BAT. V jetrih PPAR vklopi gene za vnos in beta oksidacijo maščobnih kislin ter formacijo ketonskih telesc med stradanjem. PPAR beta se odziva na spremembe v prehranskih lipidih. PPAR beta je aktiven v jetrih in mišicah in stimulira veliko genov, ki kodirajo proteine za beta oksidacijo. Povzroči kurjenje maščob, izgubo teže in termogenezo.

===Jan Rozman: Proteini - alternativni vir energije rastlin ob pomanjkanju ogljikovih hidratov===

Ker je celica najmanjša gradbena enota, ki kaže znake življenja, morajo biti procesi znotraj nje kar najbolj optimizirani in dobro regulirani. Poleg tega, mora celica ves čas izvajati regulacijo procesov glede na stanje metabolitov v njej sami in glede na okolje, hranila, ki jih pridobiva iz njega. Za množico teh procesov skrbi TOR omrežje. Običajno je vir energije glukoza, ki jo rastlina proizvede s fotosintezo, a če nastopi obdobje, ko je ni, se mora celica zateči k alternativnim substratom. V tem seminarju sem se najbolj osredotočil na proteine, sicer pa so lahko nadomestek še lipidi in klorofil. Proteini se lahko razgradijo na dva načina, z avtofagijo ali v proteosomu. S tem celica pridobi aminokisline, ki jih lahko porabi za sintezo novih proteinov, ali pa jih razgradi v mitohondriju in na ta način pridobi elektrone za dihalno verigo in energijo v obliki ATP. V primerjavi z energijo, ki se jo lahko pridobi z razkrojem saharoze, je ta pri degradaciji proteinov pičla, a zadostuje, da celica in z njo rastlina preživi temno obdobje, ko primanjkuje ogljika v obliki CO2 iz zraka.

===Simon Bolta: C4 fotosinteza===

V splošnem poznamo 3 različne fotosintetske poti, ki potekajo v različnih rastlinah. To so C3, C4 in CAM fotosinteza. Najbolj razširjena je C3 fotosinteza. Pri tej se pojavi problem zaradi nespecifičnosti encima rubisko. Ta načeloma veže CO2 na ribulozo-1,5-bisfosfat. Zaradi svoje nespecifičnosti pa lahko namesto CO2 veže O2. Posledično ne pride do fiksacije ogljika, produkt 2-fosfoglikolat pa je škodljiv za celico, in je metabolni odpadek. Temu procesu pravimo fotorespiracija. Tako prihaja do velikih energetskih izgub, prav tako pa tudi do manjše učinkovitosti izrabe dušika ter vode. Zato se je razvila C4 fotosinteza. Pri tej je vzpostavljen mehanizem, preko katerega je CO2 zelo koncentriran ob rubisku. To učinkovito zavira fotorespiracijo, ter izboljšuje efektivnost rastlin pri fiksaciji dušika in porabi vode. Dandanes so je vse večja problematika glede prehrane svetovnega prebivalstva. Če bi nam uspelo inducirati C4 fotosintezo v C3 rastlinah, bi to povečalo hektarski donos, zato se v zadnjih letih precej dela na tovrstnem inženiringu. Poleg tega bi bila zadeva koristna za uporabo biogoriv. Zaenkrat znanstveniki še niso uspeli ugotoviti uspešne metode, preko katerih bi lahko potem ustvarili korist za širše množice ljudi.

===Aljaž Omahna: Sinteza melanina v celicah===

Melanin je vrsta polimernih spojin, ki da koži, lasem in očem barvo, najdemo pa ga tudi v možganih. Melanin se v tvori v posebnih celicah imenovanih melanociti. Poznamo več tipov melanina to so evmelanin, fevmelanin in nevromelanin. Evmelanin in fevmelanin nastajata v lizosomskih veziklih poimenovanih melanosomi. Med seboj se razlikujeta po strukturi. Evmelanin je izgrajen le iz aminokisline tirozin, fevmelanin pa je poleg tirozina izgrajen tudi iz cisteina. Tvorba spojin melanina pa je katalizirana preko encima tirozinaze, ki je ključna za nastanek teh pigmentov, tirozinazi sorodnem encimu (TRYP1) in dopakrom tavtomeraza (DCT). Melaninski pigmenti ščitijo celice bazalne plasti kože pred poškodbami in mutacijami. Melanom je kožna oblika raka, ki lahko nastaja v katerem koli melanocitu. Za to obliko raka umre največ ljudi, ki trpi za kožnim rakom. Albinizem je genska bolezen ali motnja, pri kateri gre za pomanjkanje pigmenta melanina. Največkrat je okvarjen genski zapis za encim tirozinazo, ki je glavni encim pri sintezi melanina.

BIO2 Seminar 2013

2013-11-12T20:57:07Z

Mojca Kostanjevec: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak petek od 13:00 do 16:00.

Ocena seminarjev predstavlja 30% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Tema*'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Triplat Katjuša||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0962892410001212 Signalizacija s člani TGF – β pri žilni morfogenezi in boleznih]||Ipšek Rok||Štukelj Sabina||Krmpotić Luka||04.11.2013||06.11.2013||08.11.2013
|-
| Krišelj Ana||12||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0962892411001772 Signalna pot sfingozin-1-fosfata in njegova vloga v boleznih] ||Tavčar Petra||Zgonc Alja||Petrič Boštjan||04.11.2013||06.11.2013||08.11.2013
|-
| Zupančič Maja||12||[http://www.cell.com/trends/biochemical-sciences//retrieve/pii/S0968000413000911?showall%3Dtrue&_returnURL=http%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0968000413000911%3Fshowall%3Dtrue Menin: ogrodni protein, ki nadzoruje ekspresijo genov in celično signalizacijo]||Guštin Ema||Jakše Helena||Bolta Simon||04.11.2013||06.11.2013||08.11.2013
|-
| Božič Tim||12||[http://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247%2813%2900021-1 Motorični protein z regulacijo serotoninskega receptorja vpliva na razpoloženje]||Oblak Zvonar Eva||Strašek Nika||Juteršek Mojca||04.11.2013||06.11.2013||08.11.2013
|-
| Vidmar Vita||14||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2013#Vita_Vidmar:_Vloga_pentozafosfatne_poti_v_metabolizmu_rakavih_celic Vloga pentozafosfatne poti v metabolizmu rakavih celic]||Rupert Jakob||Nagode Toni||Vidak Eva||04.11.2013||06.11.2013||08.11.2013
|-
| Radić Vesna||14||[http://www.nature.com/news/liver-hormone-offers-hope-for-diabetes-treatment-1.12878 Vloga betatrofina pri zdravljenju diabetesa]||Triplat Katjuša||Ipšek Rok||Štukelj Sabina||04.11.2013||08.11.2013||15.11.2013
|-
| Guštin Ema||14||[http://www.nature.com/nrc/journal/v11/n5/full/nrc3038.html Warburgov efekt in možnosti za zdravljenje raka]||Krišelj Ana||Tavčar Petra||Zgonc Alja||04.11.2013||08.11.2013||15.11.2013
|-
| Kapš Urša||15||[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3721468/ Uravnavanje maščob: lipidi in človeške bolezni]||Zupančič Maja||Guštin Ema||Jakše Helena||04.11.2013||08.11.2013||15.11.2013
|-
| Kavčič Luka||15||[http://www.cell.com/trends/endocrinology-metabolism//retrieve/pii/S1043276012001166?_returnURL=http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1043276012001166?showall=true Vloga glikolitičnega regulatornega encima PKM2 v metabolizmu rakave celice]||Božič Tim||Oblak Zvonar Eva||Strašek Nika||04.11.2013||08.11.2013||15.11.2013
|-
| Mihalič Filip||15||[http://www.nature.com/nrm/journal/v13/n4/full/nrm3313.html Pomen microRNA molekul v metabolizmu in metabolnih nepravilnostih]||Vidmar Vita||Rupert Jakob||Nagode Toni||04.11.2013||08.11.2013||15.11.2013
|-
| Košenina Sara||16||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S0304383510001436? Zdravljenje hipoksije in z njo povezanega nastanka raka preko citratnega cikla]||Radić Vesna||Triplat Katjuša||Ipšek Rok||08.11.2013||15.11.2013||22.11.2013
|-
| Bensa Tjaša||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925443909001926 α-ketoglutarat dehidrogenazni kompleks in nevrodegenerativne bolezni]||Horvat Marjeta||Krišelj Ana||Tavčar Petra||08.11.2013||15.11.2013||22.11.2013
|-
| Ferenc Rok||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717610000868 Medsebojne fizične povezave encimov TCA cikla v Bacillus subtilis]||Kapš Urša||Zupančič Maja||Guštin Ema||08.11.2013||15.11.2013||22.11.2013
|-
| Buh Tajda||16||[http://jnci.oxfordjournals.org/content/102/13/932.long Mutacije izocitrat dehidrogenaze 1 in 2 pri raku]||Kavčič Luka||Božič Tim||Oblak Zvonar Eva||08.11.2013||15.11.2013||22.11.2013
|-
| Jazbec Vid||17||[http://www.nature.com/nrc/journal/v13/n4/full/nrc3483.html Vpliv maščobnih kislin na rakave celice]||Mihalič Filip||Vidmar Vita||Rupert Jakob||08.11.2013||15.11.2013||22.11.2013
|-
| Tahirović Aneja||17||[http://www.nature.com/news/fish-oil-supplement-research-remains-murky-1.11484 Omega - 3 maščobne kisline in njihov vpliv na človeško telo]||Košenina Sara||Radić Vesna||Triplat Katjuša||15.11.2013||22.11.2013||29.11.2013
|-
| Klofutar Domen||17||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0163782710000524 Lipoliza - reguliran multiencimski kompleks, ki vpliva na katabolizem zalog maščobe]||Bensa Tjaša||Horvat Marjeta||Krišelj Ana||15.11.2013||22.11.2013||29.11.2013
|-
| Prolič - Kalinšek Maruša||17||[http://www.nature.com/cr/journal/v20/n2/abs/cr201013a.html Vloga PPAR pri razgradnji maščobnih kislin]||Ferenc Rok||Kapš Urša||Zupančič Maja||15.11.2013||22.11.2013||29.11.2013
|-
| Fabjan Jure||18||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0197018612003506 Oksidativni in nitrozativni stres v nevrotoksičnosti amoniaka]||Buh Tajda||Kavčič Luka||Božič Tim||15.11.2013||22.11.2013||29.11.2013
|-
| Rozman Jan||18||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1360138511001063 Proteini - Alternativni vir energije rastlin ob pomanjkanju ogljikovih hidratov]||Jazbec Vid||Mihalič Filip||Vidmar Vita||15.11.2013||22.11.2013||29.11.2013
|-
| Prezelj Peter||18||[http://ajcn.nutrition.org/content/83/2/500S.abstract?sid=e4e3425c-566d-4249-a604-0cfc846f1972 Aminokisline in regulacija proteinske sinteze v skeletnem mišičnem tkivu]||Tahirović Aneja||Košenina Sara||Radić Vesna||22.11.2013||29.11.2013||06.12.2013
|-
| Omahna Aljaž||18||Moj izbrani naslov||Klofutar Domen||Bensa Tjaša||Horvat Marjeta||22.11.2013||29.11.2013||06.12.2013
|-
| Taškar Jan||19||Moj izbrani naslov||Prolič - Kalinšek Maruša||Ferenc Rok||Kapš Urša||22.11.2013||29.11.2013||06.12.2013
|-
| Kašnik Urška||19||Moj izbrani naslov||Fabjan Jure||Buh Tajda||Kavčič Luka||22.11.2013||29.11.2013||06.12.2013
|-
| Kostanjevec Mojca||19||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S096800041000071X Mitohondrijske reaktivne kisikove spojine]||Rozman Jan||Jazbec Vid||Mihalič Filip||22.11.2013||29.11.2013||06.12.2013
|-
| Krmpotić Luka||19||Moj izbrani naslov||Prezelj Peter||Tahirović Aneja||Košenina Sara||29.11.2013||06.12.2013||13.12.2013
|-
| Petrič Boštjan||19||Moj izbrani naslov||Omahna Aljaž||Klofutar Domen||Bensa Tjaša||29.11.2013||06.12.2013||13.12.2013
|-
| Bolta Simon||20||Moj izbrani naslov||Taškar Jan||Prolič - Kalinšek Maruša||Ferenc Rok||29.11.2013||06.12.2013||13.12.2013
|-
| Juteršek Mojca||20||Moj izbrani naslov||Kašnik Urška||Fabjan Jure||Buh Tajda||29.11.2013||06.12.2013||13.12.2013
|-
| Vidak Eva||20||Moj izbrani naslov||Kostanjevec Mojca||Rozman Jan||Jazbec Vid||29.11.2013||06.12.2013||13.12.2013
|-
| Štukelj Sabina||21||Moj izbrani naslov||Krmpotić Luka||Prezelj Peter||Tahirović Aneja||20.12.2013||24.12.2013||03.01.2014
|-
| Zgonc Alja||21||Moj izbrani naslov||Petrič Boštjan||Omahna Aljaž||Klofutar Domen||20.12.2013||24.12.2013||03.01.2014
|-
| Jakše Helena||21||Moj izbrani naslov||Bolta Simon||Taškar Jan||Prolič - Kalinšek Maruša||20.12.2013||24.12.2013||03.01.2014
|-
| Strašek Nika||22||[http://bloodjournal.hematologylibrary.org/content/120/23/4496.short Porfirija: napredek v diagnostiki in zdravljenju]||Juteršek Mojca||Kašnik Urška||Fabjan Jure||20.12.2013||24.12.2013||03.01.2014
|-
| Nagode Toni||22||Moj izbrani naslov||Vidak Eva||Kostanjevec Mojca||Rozman Jan||20.12.2013||24.12.2013||03.01.2014
|-
| Ipšek Rok||22||Moj izbrani naslov||Štukelj Sabina||Krmpotić Luka||Prezelj Peter||24.12.2013||03.01.2014||10.01.2014
|-
| Tavčar Petra||23||Moj izbrani naslov||Zgonc Alja||Petrič Boštjan||Omahna Aljaž||24.12.2013||03.01.2014||10.01.2014
|-
| Horvat Marjeta||23||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S009286741000718X Uravnavanje metabolizma železa pri sesalcih] ||Jakše Helena||Bolta Simon||Taškar Jan||24.12.2013||03.01.2014||10.01.2014
|-
| Oblak Zvonar Eva||23||Moj izbrani naslov||Strašek Nika||Juteršek Mojca||Kovačič Matic||24.12.2013||03.01.2014||10.01.2014
|-
| Rupert Jakob||23||Moj izbrani naslov||Nagode Toni||Vidak Eva||Kostanjevec Mojca||24.12.2013||03.01.2014||10.01.2014
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju (peta izdaja), v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo!

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2013|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-9 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed), vsebovati mora najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25-30 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dHc2d2pCbDBWNzl5VHZaQUk1SG1HeVE6MA recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dDZZOVVFNkwxb0JMeUFaMGltOVQ4aHc6MA mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2013 Povzetki seminarjev

2013-05-06T14:13:44Z

Mojca Kostanjevec:

== Mojca Kostanjevec: Sintetični nanodelci funkcionalizirani z levkocitnimi membranami ==

Raziskovanje na področju nanotehnologije in nanodelcev je trenutno ena izmed najbolj raziskovanih vej moderne znanosti, predvsem zaradi številnih možnosti uporabe nanodelcev na različnih področjih. V znanosti se tako vedno bolj uporabljajo v povezavi z nanomedicino oziroma s ti. sistemom za dostavo zdravil v tarčne celice. Obravnavana raziskava se je v splošnem osredotočila na raziskovanje terapevtske učinkovitosti omenjenih sistemov - posledično torej na uspešnost delcev v prepoznavanju specifičnih tkiv in selektiven napad na okužena tkiva. Učinkovitost sistemov za prenos zdravil po organizmu v prvi fazi namreč temelji na preprečevanju morebitne aktivacije imunskega sistema in uspešnem izogibanju fagocitnega sistema, zahteva pa tudi ustrezno lokalizacijo in prednostno vezavo na okužene tarčne celice oziroma tkiva. Biomimetični ovoj nanodelcev, ki temelji na celicah imunskega sistema – levkocitih (LLV vektorji), omogoča bistvene prednosti v nanotehnologiji. Močno preprečuje vezavo opsoninov – specifičnih proteinov, ki jih prepoznajo celice za odstranjevanje tujkov – makrofagi, in s tem sprožitev fagocitoze, zagotavlja uspešno vezavo na okužena in obolela tkiva, hkrati pa lajša transport delcev skozi endotelijske plasti. LLV vektorji so v živih organizmih precej stabilni, saj podaljšujejo aktiven čas delovanja delcev, izboljšujejo tudi akumulacijo delcev v predelih tumorjev, hkrati pa zagotavljajo podaljšanje razpolovne dobe razpada zdravil, zmanjšanje stranskih učinkov in povečanje učinkovitosti zdravljenja.

== Eva Oblak Zvonar: Vodikov sulfid, potencialno preventivno in terapevtsko sredstvo proti staranju in starostnim boleznim ==

Staranje je biološki proces, ki se odraža kot počasno in postopno zmanjšanje fizioloških funkcij organizma, kar pa je povezano z povečanjem bolezenskih stanj. H2S je tretji najbolj razširjen gasotransmiter (poleg NO in CO). V telesih sesalcev nastaja s pomočjo proteinov CSE in CSB. CBS je najbolj izražen v možganih in živčnem sistemu, medtem ko je CSE najbolj izražen v gladkem mišičevju in srcu. Na staranje lahko s pomočjo H2S vplivamo preko treh različnih poti. Zmanjšano lahko oksidativni stres zaradi prostih radikalov, ki nastanejo med procesom oksidativne fosforilacije v mitohondrijih, le-ti pa povzročajo poškodbe v celici. H2S vpliva tudi na SIRT1, ki pripomore k večji stabilnosti celic in preprečuje napačno izražanje genov. SIRT1 tudi deacetilira FOXO transkripcijski faktor v celicah sesalcev, kar poveča celično odpornost celice proti stresu in tako podaljša življenje organizma. Poleg tega H2S posredno vpliva na gen Klotho, za katerega je bilo dokazano, da njegovo pomanjkanje povzroči predčasno staranje in smrt, povečana izraženost pa podaljša življenje organizma. H2S inhibira aktivnost angiotensina II, katerega prisotnost zmanjša izražanje gena Klotho, in inhibira katalizator reakcije za nastanek angiotensina II. H2S je potencialno preventivno in terapevtsko sredstvo za zdravljenje bolezni kardiovaskularnega sistema (hipertenzija in ateroskleroza), degenerativne bolezni živčnega sistema (Parkinsonova bolezen), diabetesa ter nekaterih tipov raka.

== Eva Vidak: Antigenska subverzija - nov mehanizem s katerim se virus Ebole izogne imunskemu odzivu gostitelja ==

Ebolavirusi so skupina virusov iz družine Filoviridae in so večinoma patogeni za človeka. Najpogostejši med njimi je virus Ebole (EBOV), katerega sevi lahko imajo tudi do 90% smrtnost. Ugotovljeno je bilo, da prvi stik gostiteljskih celic z EBOV poteka preko glikoproteina GP1,2, ki tvori pritrditvene bodice na površini virusa. Poleg tega glikoproteina okužene celice sintetizirajo tudi velike količine njegove izooblike sGP, ki še ni imela točno definirane funkcije. Obravnavana raziskava je razkrila, da je funkcija sGP povezana z mehanizmom, s katerim se virus izogne imunskemu sistemu gostitelja. Ta mehanizem so poimenovali antigenska subverzija in nanjo pomembno vpliva višja koncentracija sGP oblike, ki jo okužena celica sintetizira v 80%. Posledično obstaja večja verjetnost da limfociti B srečajo sGP obliko in začnejo tvoriti protitelesa, ki delujejo proti sGP in so neučinkovita proti GP1,2, čeprav si obe obliki delita približno 95% linearne sekvence. Ugotovitve raziskave predstavljajo nove prepreke pri razvoju cepiva, saj so znanstveniki dokazali, da lahko sGP spremeni tudi že vzpostavljen imunski odziv in s tem prepreči nevtralizacijo virusa.

== Ema Guštin: Vloga regulacije kompleksov Vps34 pri avtofagiji ==

Avtofagija je reguliran proces razgradnje poškodovanih ali odvečnih sestavin celice s pomočjo lizosomov, ki ima ključno vlogo pri ohranjanju homeostaze. S tem procesom lahko celica različne organske molekule ponovno uporabi. Gre za tvorbo avtofagosoma, znotraj katerega lizosomski encimi razgradijo organele oz. proteine na ponovno uporabne monomere. Sprožijo jo lahko tako znotrajcelični (kopičenje poškodovanih organelov in odvečnih beljakovin v citosolu) kot tudi zunajcelični signali (pomanjkanje hranil ali kisika, zvišanje temperature, okužba z mikrobi).
Raziskava, ki sem se ji posvetila, temelji na drugi izmed šestih funkcionalnih enot, ki regulirajo proces avtofagije. Pri tem ima osrednjo vlogo razred encimov Vps34. Vps34 pri sesalcih obstaja v obliki različnih kompleksov, ki sodelujejo pri običajnem transportu celičnih veziklov ali so vključeni v avtofagijo. Pri čem bodo sodelovali kompleksi Vps34, je odvisno od regulacije le-teh z AMPK. AMPK je encim, ki pod nadzorom podenot, specifičnih za avtofagijo (npr. Atg14L) neposredno fosforilira Vps34 in Beclin1 na točno določenih mestih in s tem doseže regulacijo avtofagnega in neavtofagnega kompleksa Vps34. V raziskavi je bil natančno preučen mehanizem te regulacije in vloge različnih kompleksov Vps34 za njo.

== Toni Nagode: Makromolekulski uničevalec RNA ==

V celicah poteka nenehen proces prepisovanja informacij, ki se preko molekul RNA sintetizirajo kot novo nastali proteini. Pri tem morajo biti mehanizmi prepisovanja zelo natančni, saj lahko v primeru napak pride do sinteze nefunkcionalnih ali škodljivih proteinov. Takšnim produktom je treba nemudoma onemogočiti nadaljnjo delovanje, zato celice uporabljajo mehanizme za razgradnjo odvečnih in neobičajnih makromolekul. Eksosom je glavni nukleazni kompleks, ki sodeluje pri procesu razgradnje praktično skoraj vseh vrst RNA. Eksosomski kompleksi so prisotni v celicah evkariontov in arhej, medtem ko pri baterijah podobno vlogo opravlja enostavnejši kompleks imenovan degradosom. Nahajajo se v celični citoplazmi in jedru, kjer se združujejo z različnimi proteini in na ta način regulirajo substratno specifičnost, potrebno v določenem prostoru celice. Nedavni podatki o strukturi in funkcionalnosti eksosomskega kompleksa ter njegovih številnih kofaktorjih, so razkrili različne biokemijske lastnosti in mehanizme obdelave ter razgradnje RNA molekul.

==Sara Košenina: Zdravljenje Alzheimerjeve bolezni z grelinom==
Alzheimerjeva bolezen je kronična nevrodegenerativna bolezen in je najpogostejši vzrok demence. Močno poslabša kognitivne sposobnosti bolnikov in spremeni njihove značajske lastnosti ter vedenje. Vodi do popolne odvisnosti bolnika od drugih ljudi in se konča s smrtjo. Zdravila zanjo zaenkrat še ni, zdravi in lajša se le simptome bolezni, s čimer pa lahko nekoliko zaustavijo bolezen in podaljšajo življenje bolnika. V razpravah o nastanku bolezni prevladuje hipoteza amiloidne kaskade, ki pravi, da odlaganje amiloida v bližini nevrona spodbuja nevron k sintezi transmembranskega β-amiloid prekurzorskega proteina, ki se z aksonskim transportom prenaša v aksonske končiče. Tam se izloči amiloid β, ki toksično deluje na bližnje nevrone.

V raziskavi so z grelinovim agonistom LY444711 preverjali hipotezo, da lahko lakota v odsotnosti kalorične omejitve preprečuje Alzheimerjevo bolezen in upad kognitivnih sposobnosti na mišjem modelu Alzheimerjeve bolezni. Lakota namreč povzroča blagi stres, ki bi preko metabolnih signalnih poti preprečil uničenje nevronov. Poskus so izvedli na 36 miših, ki so jih razdelili v 3 skupine. Prva je bila kontrolna in je bila normalno hranjena, druga je prejemala zdravilo in je bila normalno hranjena, tretja pa je imela kalorične omejitve. Ugotovitve so pokazale, da zdravljenje z grelinovim agonistom zadostuje za zmanjšanje kognitivnih poslabšanj in sprememb v možganih, ki jih povzroča Alzheimerjeva bolezen, potrebne pa bodo še raziskave, ki nam bodo pomagale razumeti, kako lahko »lakota« brez zmanjšanega vnosa kalorij preloži ali celo zaustavi Alzheimerjevo bolezen.

==Vid Jazbec:Interakcije seratoninskih in glutamatskih ter steratoninskih in dopaminskih receptorjev ter vpliv na psihoze==
Shizofrenija je duševna motnja, ki prizadane okrog 1% prebivalstva. Njeni vzroki so v popolnosti saj je shizofrenija multigenska bolezen odvisna močno od okolja. Z mikroskopskega stališča so zanjo pomembni predvsem nevrotransmiterji seratonin, dopain in glutamat, ki povzročajo vse tri vrste simptomov. Predvsem dopamin v mezolimbičnem sistemu je dobro poznan povzročitelj halucinacij, ki jih inducirajo prishoaktivne halucinogene druga ali psihotična stanja.

V preteklosti so bili za zdravljenje psihoz uporabljeni tipični antipsihotiki, ki so zavirali delovanje dopaminskih recceptorjev. Raziskave pa so pokazale, da za simptome niso krivi le ti, temveč so simtomi povezani tudi z drugima dvema. Predvsem seratoninski receptorji 5HT2A tvorijo heteromere tako z dopaminskimi D2, kot tudi s glutamatskimi receptorji mGluR2. Pri prvih heteromerih povezava med receptorjema povzroči večjo regulacijo obeh sistemov, medtem ko pri drugem heteromeru oba receptorja dobita novo funkcijo. Vsekakor pa je pomembno, da na te heteromerne komplekse ne delujejo regulatorno dopamin, seratonin ali glutamat, temveč protagonisti in antagonisti teh receptorjev. Ti so lahko halucinogene droge ali pa antipsihotiki.
Poleg receptorskih interakci so za molekularno psihotsko stanje odgovorne tudi interakcie teh receptorjev z ogrodnimi proteini. Ti uravnavajo prenašanje seratoninskih receptorjev po membrani in celici, hkrati pa njihovo ekspresijo uravnavajo prav dopaminski receptorji.

==Helena Šneberger: Nova imunološka terapija zdravljenja alergije na jajca==
Število ljudi, ki imajo diagnosticirano alergijo se povečuje. Danes je že kar 20 % svetovnega prebivalstva in četrtina vseh mladih boleha za eno od vrst alergij. Alergijo na hrano ima 3 % odraslega prebivalstva, pri otrocih in mladostnikih pa je odstotek višji- med 6 % in 8 %. Najbolj razširjena je alergija na mleko, sledi pa ji alergija na jajca. V Združenih državah Amerika, kjer je izbrana raziskava potekala, odstotek obolelih odraslih in otrok oziroma mladostnikov odstopa in znaša 0,2 % (pri odraslih) in 4 %(pri otrocih). Alergijo na jajca ima 2,6 % otrok starosti do 2 let in pol.
Zdravilo za alergijo na hrano, natančneje za alergijo na jajca, še ni poznano. Edini način preprečevanja simptomov je izogibanje alergenu, ki ga telo zaznava kot tujek, kar lahko poslabša kakovost življenja obolelega.
V raziskavi, ki je opisana v članku Oral Immunotherapy for Treatment of Egg Allergy in Children, so znanstveniki oblikovali in preizkusili nov način zdravljenja alergije na jajca pri otrocih.

==Rok Ipšek: Delovanje alfa hidroksi kislin kot eksfoliantov==
Ostati večno mlad - cilj, ali pa vsaj tiha želja večine ljudi. V zadnjih letih nas od vsepovsod bombardirajo z izdelki, ki naj bi omogočali upočasnitev procesov staranja, med njimi so eksfolianti (pilingi), ki pospešijo luščenje odmrlih celic s površja kože (epidermisa) in tako odkrijejo svežo, novejšo plast.

Pilingi so mehanski ali kemični, slednji so učinkovitejši. Najblažja oblika kemičnih pilingov so alfa hidroksi kisline (AHA-ji). Najmanjša in zato precej učinkovita je glikolna kislina, katere učinek na kožo in mehanizem delovanja so preučevali v izbrani raziskavi. Raziskovalna ekipa se je osredotočila na študijo ionskega kanalčka, prepustnega za kalcij, TRPV3, v celičnih membranah keratinocitov, celic z zunanje plasti kože. Ta kanalček ima pomembno vlogo pri občutljivosti na temperaturo okoli 33 °C in normalni fiziologiji kože.
Pri svojem delu so uporabili nesmrtne človeške keratinocite HaCaT in celice HEK-293 z izraženim genom TRPV3. Tega so v obliki cDNA s transfekcijo vstavili v preučevane celične linije HEK in jih označili. Napravili so serijo poskusov s t. i. tehniko vpete krpice, ki omogoča študijo enega ali več ionskih kanalčkov.

Iz rezultatov so sestavili model delovanja. Glikolna kislina povzroča dvig koncentracije znotrajceličnih protonov, kar aktivira kanalčke TRPV3, ti prepustijo preveč kalcija in hkrati še dodatne protone s strani zunaj celice, to pa vodi v celično smrt. Na tak način se keratinociti odluščijo in koža je posledično mehkejša.

==Vita Vidmar: Posttranskripcijska regulacija cirkadianega ritma pri Synechococcus elongatus==
Cirkadiani ritem je endogeni dnevno-nočni ritem značilen za evkarionte, imajo pa ga tudi nekateri prokarionti, predvsem cianobakterije, kamor spada tudi Synechococcus elongatus. Značilnosti cirkadianega ritma so približno 24-urna perioda, prilagoditev lokalnemu času (pod vplivom svetlobe) in vzdrževanje ritma v mejah fizioloških temperatur. Omenjeni ritem je na molekularni ravni uravnan s cirkadiano uro. To pri S. elongatus sestavljajo trije proteini imenovani KaiA, KaiB in KaiC. KaiA sprejema signale iz okolja prek drugih molekul in stimulira fosforilacijo KaiC. KaiB se lahko veže na hiperfosforilirano obliko KaiC in sproži defosforilacijo. Ritmična fosforilacija in defosforilacija proteina KaiC je ključnega pomena za delovanje cirkadiane ure. Ko se KaiC defosforilira, lahko KaiA ponovno začne cikel. Hitrost teh reakcij je uravnana tako, da en cikel cirkadiane ure poteče približno v 24 urah. Genska ekspresija KaiB in KaiC je regulirana z negativno povratno zanko, saj visoka koncentracija proteina KaiC zavira prepisovanje genov za KaiB in KaiC. Njuno ekspresijo pa uravnava tudi KaiA, ki pri veliki koncentraciji stimulira prepisovanje teh genov. Večina aminokislin je v genskem kodu določenih z več različnimi kodoni. Vsi organizmi lahko enako interpretirajo kodone, se pa med seboj razlikujejo po tem, da nekatere kodone lažje 'berejo' kot druge, zato je za organizem ugodnejša uporaba optimalnih kodonov. Raziskovalci pa so ugotovili, da sta KaiB in KaiC kodirana z velikim deležem neoptimalnih kodonov in odkrili, da je to posttranslacijski prilagoditveni mehanizem, s katerim lahko S. elongatus 'preklopi' med cirkadiano in necirkadiano regulacijo genske ekspresije.

== Nika Strašek: Zdravljenje avtizma s suraminom ==
Avtizem oz. spektroavtistična motnja (SAM) prizadene približno stotino svetovnega prebivalstva, simptomi se kažejo predvsem v težavah s socialno komunikacijo, interakcijo in pa s fleksibilnostjo mišljenja. Vzroki te bolezni so še zelo slabo raziskani, zagotovo je le da na razvoj bolezni vplivajo tako okoljski (izpostavljenost škodljivim snovem) kot genetski dejavniki (sindrom drobljivega kromosoma X, nevrofibromatoza). K nastanku bolezni pripomore tudi oksidativni stres in imunske motnje matere v zgodnji nosečnosti.
Avtorji objavljene raziskave so sklepali, da vse nepravilnosti delovanja pri SAM izvirajo iz metaboličnega stanja, ko se celice želijo zaščititi pred nevarnostmi, aktivirajo obrambni mehanizem in komunikacija med celicami se ustavi, kar vpliva na razvoj možganov in njihovo funkcijo. Poenostavljeno povedano, ko celice nehajo komunicirati med seboj, tudi otroci nehajo govoriti.
Mitohondrij ima pomembno vlogo pri oksidacijskem stresu, prirojeni imunosti in vnetjih in zato so avtorji članka iskali signalizacijski sistem v telesu, ki je povezan z mitohondriji in ima pomembno vlogo pri prirojeni imunosti. Našli so ga pri mitokinih, signalizacijskih molekulah, ki nastanejo v mitohondriju. Taka molekula je npr. ATP, ki zunaj celice deluje kot signalna molekula za nevarnost. Kot agonist se veže na purinergične receptorje. Skupaj ti receptorji upravljajo z obsežnim rangom bioloških karakterizacij, ki so povezane z avtizmom.
Antipurinerigična terapija zdravljenja s suraminom, ki deluje kot inhibitor purinergičnega signaliziranja je v miših z SAM izboljšala ali popolnoma odpravila kar 16 simptomov te bolezni.

== Sabina Štukelj: Struktura in pomen antifreeze proteinov ==
Antifreeze proteini so prisotni v telesnih tekočinah mnogih organizmov, ki živijo v hladnih razmerah in jih ščitijo pred zamrznitvijo. Glavna značilnost teh proteinov je vezava ledenih kristalov in s tem omejevanje rasti kristalov. V naravi obstaja velika diverziteta AFP (antifreeze) molekul, k njej pa prispeva led s svojimi številnimi različnimi površinami z drugačno geometrijsko razporeditvijo kisikovih atomov. Da se AFP molekule učinkovito vežejo na gornji sloj ledu so predvsem zaslužne vodikove vezi, ki nastanejo med kisikovimi atomi in stranskimi skupinami z vodikom. Poznamo več tipov AFP-jev, raziskovani pa so bili predvsem pri ribah, zato tu ločimo 5 znanih tipov: AFGP-ji, AFP I, AFP II, AFP III in AFP IV. Klasificirani so kot hiperaktivni ali zmerno aktivni, odvisno od aktivnosti njihove zamrzovalne histereze (FH). Znanstvena raziskava, ki je opisana v seminarju podaja neposredne dokaze, da je vezava hiperaktivne TmAFP molekule na ledene kristale nepovratna in da je FH aktivnost neodvisna od koncentracije AFP molekul v raztopini, kar pa so najnovejša odkritja na področju antifreeze proteinov in nasprotujejo dotedanjim teorijam. Rezultati raziskav njihovih lastnosti in zgradbe niso pomembni le za razumevanje interakcij z ledom in za tvorbo veznih domen na drugih proteinih, temveč tudi v praksi, saj se uporabljajo na področjih medicine, biotehnologije in prehrambene industrije kot sredstvo proti zamrzovanju.

== Simon Bolta: Vloga rjavega maščobnega tkiva pri termogenezi ==
Rjavo maščobno tkivo je v telesu ključno za regulacijo termogeneze. To je pridobivanje toplote za potrebe telesa. Za termogenezo se porablja energija, ki jo vnesemo v telo s hrano. Jasno je torej, da bolj kot termogeneza teče, višja je poraba energije. Zato se je tu hitro pokazala potencialna možnost za zdravljenje debelosti in z njo povezanih bolezni. Raziskave so sicer še precej na začetku, a določeni mehanizmi so nam že poznani. Nedavno je bila odkrita vloga proteina BMP-7. Najpomemneje pa je, da obe vrsti rjave maščobe, cBAT in rBAT komunicirata med sabo preko simpatičnega živčnega sistema. V kolikor je cBAT-a zelo malo, se to kompenzira z tvorbo več rBAT-a. Zaenkrat ni znano še niti, ali imamo tudi ljudje obe vrsti rjave maščobe, in ravno to je področje, ki bo v prihodnosti deležno še veliko raziskav, saj se kaže možnost zdravljenja raznih bolezni in jasno s tem povezani tudi zaslužki.

== Jakob Rupert: Vplivi na citotoksičnost Aβ oligomerov v povezavi z nepatogenimi prioni PrPc in vpliv na pojav Alzheimerjeve bolezni ==
Alzheimerjeva bolezen (AD) je progresivna nevrodegenerativna bolezen osrednjega živčevja, ki prizadane predvsem možgane. Simptomi so izguba spomina, motnje zavesti, oteženo gibanje in drugo. Je neozdravljiva in se vedno konča s smrtjo. V zadnjem času veliko raziskujejo povezavo med AD in nepatogenimi prioni PrPC in ugotovitve kažejo, da se amiloidni-β oligomeri radi vežejo na PrPC, z njim tvorijo komplekse, ki se nato endocitirajo v nevron in povzročijo propad celice in tvorbo značilnih amiloidnih plak v možganih, predvsem v predelih hipokampusa in pa cerebralnega korteksa. Vendar na vezavo AβO na PrPc vpliva še nekatere druge molecule, v zadnjem času pa so odkrili tudi dve molekuli. To sta ekstrakta iz rdečega vina (resveratrol) in predvsem EGCG iz zelenega čaja. Oba zmanjšata vpliv amiloidnih plak s tem da strukturno spremenita AβO, ki se mu s tem skoraj izniči toksičnost. To prinaša novo upanje za domnevnih več kot 37 milijonov bolnikov z AD po svetu. Bolezen sicer prizadane večinoma starejše od 65 let, takih pa je v starajoči družbi vedno več, zato so raziskave možnih vzrokov in zdravil za AD ene najbolj aktualnih tudi iz ekonomskega vidika.

== Helena Jakše: Resveratrol-preventiva proti raku ==
Že vrsto let preiskujejo zdravilne učinke rdečega vina in s tem povezane pomembne spojine-resveratrola. Ta se v naravi nahaja v groznih peškah in koži grozdnih jagod, v nekaterih robidnicah in še v mnogih drugih rastlinskih virih. Resveratrol vpliva na vse stopnje karcinogeneze (nastanek rakastih celic) od začetka do napredovanja raka z vplivom na signalne poti, ki kontrolirajo razvoj in rast celic, programirano celično smrt (apoptozo), metastazo in angiogenezo (nastanek novih žil v tumorjih). Mnoge študije so pokazale, da resveratrol zavira širjenje človeškega tumorja in vitro. Ta spoznanja so vodile v nove raziskave, ki so ocenile resveratrolov potencial za zdravljenje raka. In vitro raziskave so pokazale, da resveratrol vzpostavlja interakcije z večimi tarčnimi molekulami in s poškodovanimi celicami kože, dojk, prostate, trebušne slinavke, želodca, debelega črevesa in požiralnika.

Z reguliranjem več signalnih poti (NF-kB, Akt, CD95, Wnt) resveratrol aktivira signale za programirano celično smrt predrakavih in rakastih celic, brez da bi pri tem negativno vplival na zdrave celice.

Učinkovitost resveratrola v živalskih rakavih modelih je omejena zaradi njegove biološke razpoložljivosti po vstopu v organizem. Največji vpliv proti raku je bil zabeležen za tiste tumorje, s katerimi je bil resveratrol v direktnem stiku, na primer koža in prebavni trakt.

==Lenka Tomešová:Key to Controlling Toxicity of Huntington's Disease Protein May Be Cell Contents ==
Huntington‘s disease (HD) belongs to the group of neurogenerative diseases and unfortunately there are no effective therapies for these serious illnesess. HD is caused by an expansion of a CAG (cytosin-adanin-guanin - CAG is the code for an amino acid-glutamine) repeat coding for a polyglutamine in the huntingtin protein, resulting in aggragation of respective proteins. It is caused by mutation of only one gen. It is one of the reason why is HD one of the most tested diseases.
New researches suggest that the toxicity of Huntingtin protein on cell is not caused just by the lenght of the proteins expansions, but there could play an important role also other proteins which are in the cells.
In this experiment were used yest cells. Human huntingtin protein was placed into yest cells and researchers found toxicity differences due to presence of other protein aggregates which are called prions. Data showed that mechanism of polyglutamine toxicity depends on the prion composition of the cell. Polyglutamine is not the toxic reagent itself, but rather enhances the effects of the prion aggregates by sequestering them and making them more rigid. Data showed for the first time that aggresome (an internal compartment of expanded huntingting clumps) is not always protective. Now scientists have a new approach that through characterization of pre-existing proteins in the cell they can identify potencional therapeutic targets.

== Domen Klofutar: MICU1 kot esencialen regulator koncentracije Ca2+ v mitohondrijih ==
V celičnem organelu mitohondriju se odvija oksidativna fosforilacija oziroma tvorba molekul ATP, ki jih telo porablja kot energijo. Za stimuliranje omenjenega procesa je potrebna zadostna koncentracija kalcijevih dvovalentnih kationov. Molekula MICU1 je periferni membranski protein, ki v povezavi z uniporterjem, katerega del je tudi protein MCU, sestavlja enega izmed proteinskih kompleksov na notranji membrani mitohondrija. Protein MICU1 v času mirovanja pri majhnih koncentracijah kalcijevih kationov v citosolu zavira prehod kalcija skozi uniporter. Prevelika koncentracija kalcija v matriksu mitohondrija bi povzročila nastajanje reaktivnih kisikovih zvrsti, ki bi zavrle proces oksidativne fosforilacije in sprožile začetek apoptoze – vrste programirane celične smrti. Prevelika koncentracija kalcija v matriksu pa lahko povzroči tudi depolarizacijo notranje membrane mitohondrija, ki škodi delovanju tega organela. MICU1 pri visoki koncentraciji kalcija v citosolu na pretok kationov skozi uniporter nima vpliva. Prav tako ne vpliva na kinetiko procesov v mitohondriju. Vsebuje dve EF domeni, ki sta sestavljeni vsaka iz dveh regularnih struktur α-heliks, ki sta pravokotni ena na drugo. Domeni sta obrnjeni proti matriksu in specifično vežeta kalcij. S tem protein uravnava koncentracijo kalcija v mitohondriju. Vsakršna mutacija na kateri koli izmed domen poruši proces delovanja proteina, saj ena domena zaznava višje koncentracije kalcija, druga pa nižje.
== Urška Kašnik: ''Propionibacterium acnes'' - bakterija, ki povzroča akne ==

Bakterija P. acnes je je del kožne flore, torej je prisotna na koži skoraj vseh zdravih odraslih ljudi. Živi na maščobnih kislinah v loju, ki ga sintetizirajo žleze lojnice v lasnih mešičkih. Povezana je z nastankom aken.

Akne so pogosta bolezen kože oz. žlez lojnic, katerih funkcija je izločanje loja (poltekoča mešanica maščobnih kislin, trigliceridov, voskov in holesterola), kar preprečuje prekomerno izsuševanje in pokanje kože. Najpogosteje se pojavlja v času pubertete.

Aken je več vrst. Med blažjimi oblikami sta zaprt komedo (beli ogrc), ki zgleda kot mala bela bunkica, in odprt komedo (črn ogrc), ki mu daje barvo pigment melanin. Med vnetne oblike spadajo papule, pustule, nodule in ciste.

Raziskava UCLA je odkrila, da vse P. acnes bakterije ne povzročajo mozoljev – nekateri sevi lahko dejansko pomagajo ohraniti zdravo kožo. Ugotovitve, dognane s to raziskavo, bi lahko vodile do razvoja novih terapij za preprečevanje in zdravljenje težav s kožo. Upajo, da bodo njihove ugotovitve pomagale razviti nove strategije, ki bodo preprečile napake na koži, že predenj bodo te nastale.

== Maruša Prolič-Kalinšek: Živčni strupi in butirilholinesteraza ==
Živčni strupi so organofosforjeve spojine, ki inhibirajo acetilholinesterazo, kar povzroči nalaganje nevrotransmitorja acetilholina v živčno sinapso in nevromišični stik. Povzročijo odpoved živčnega in respiratornega sistema. Ena izmed snovi, ki lahko nudi zaščito pred živčnimi strupi je butirilholinesteraza (BChE). To je globularen protein, ki se sintetizira v jetrih. BChE veže večino antiholinesteraz, zato ga lahko uporabimo za odstranjevanje organofosforjevih živčnih strupov. V zadnjih 10 letih je bilo razvitih več metod pridobivanja tega encima npr. iz mleka transgenih živali pridobljen BChE, z uporabo adenovirusa. V nedavni raziskavi so s kemično polisialilacijo modificirali rekombinanten BChE. Da bi izbrali najugodnejši ekspresijski vektor so zato uporabili tri. Kot najbolj učinkovit se je izkazal pBudCE/EF/BCHE. Transfekcija tega v CHO-K1 celice, je povzročila produkcijo do 3 mg/L BChE. Po optimizaciji ekspresijskih pogojev so dosegli proizvodnjo 35 mg/L rBChE. Ker je analiza pokazala da je bil encim večinoma v monomerni obliki, so dodali tetramerizacijski peptid. Nato so izvedli modifikacija z oksidirano polisialična kislino. S tem so pridobili encim, ki je imel dolg razpolovni čas, je obdržal večino svoje aktivnosti, je bil bolj stabilen in je miši obvaroval pred učinki žuvčnega strupa VR.

== Mojca Juteršek: Sekrecijski sistem tipa III pri Pseudomonas aeruginosa in vpliv metabolizma na njegovo izražanje ==
Pseudomonas aeruginosa je oportunistična Gram-negativna bakterija, ki veliko težav povzroča predvsem bolnikom s cistično fibrozo. Svojo virulentnost izraža preko sekrecijskega sistema tipa III, ki ji omogoča direkten prenos eksotoksinov v gostiteljsko celico. Ta mehanizem je dobro reguliran preko regulatornih molekul, že nekaj časa pa je znano, da na izražanje sekrecijskega sistema tipa III vplivata tudi metabolizem in omejena količina kisika v okolju. V nedavni raziskavi so ti dve dejstvi povezali in raziskali vpliv metabolizma na izražanje sekrecijskega sistema tipa III pri bakterijah, gojenih v okolju z omejeno količino kisika, kar je še posebno pomembno za bolnike s cistično fibrozo, saj so v njihovih pljučih ravno takšne razmere. Znanstvenikom je uspelo dokazati, da ima pomembno vlogo pri regulaciji izražanja sekrecijskega sistema tipa III v razmerah z omejeno količino kisika encim izocitrat-liaza, ki je pomben encim v metabolnih poteh teh bakterij. Hkrati so odkrili, da ima omenjen mehanizme vpliv tudi na količino biofilma, ki ga bakterije tvorijo, ta pa je pomemben obrambni sistem bakterij pred delovanjem antibiotikov. To odkritje tako obljublja nove možnosti v preprečevanju okužb s P. aeruginosa.

== Tjaša Bensa: Sulforafan kot potencialni kandidat za zdravljenje levkemije ==
Sulforafan spada med izotiocianate in ga najdemo v križnicah zelenjave, kot so brokoli, cvetača, ohrovt ... Znastveniki so odkrili, da sulforafan varuje pred rakom na požiralniku, želodcu, debelem črevesu, na prostati, dojkah, jajčnikih, pred rakom na materničnem vratu in tudi proti levkemiji.
Levkemija je krvni rak, za katerega je značilno nenadzorovano razraščanje rakavih belih krvničk v kostnem mozgu. Poznamo več vrst levkemije, pri otrocih pa se najpogosteje pojavlja akutna limfoblastna levkemija (ALL). Pri ALL so lahko celice pre-B ALL ali pa T-ALL. Zaenkrat še ne poznamo terapije, ki bi popolnoma ozdravila bolnike, saj imamo slabo razumevanje o diagnozi bolezni ALL.

Znastveniki na Baylor College of Medicine so naredili vrsto poskusov, da so dokazali pozitiven učinek sulforafana na levkemične celice. Sulforafan je sprožil apoptozo v celicah pre-B ALL (Nalm-6, REH, RS-4) in T-ALL celicah (Jurkat, RPMI, DND41, KOPTK1), v zdravih celicah pa ne. Ko so zdravim celicam dodali sulforafan, so bile te bolj odporne na njegovo citotoksičnost, kot pa levkemične celice.

Poskuse so naredili tudi na miših. Z bioluminiscenčnim slikanjem so dokazali, da je po treh tednih sulforafan zmanjšal število levkemičnih celic. Tudi pri miših s tumorjem je sulforafan po sedmih dnevih zdravljenja zmanjšal obseg tumorja.

Akutna limfoblastna levkemija predstavlja najpogostejšo vrsto levkemije pri otrocih, saj zanjo zboli kar 80 % otrok z levkemijo. Če bi sulforafan postal nova terapija za zdravljenje levkemije, bi to tako pomenil velik preobrat v zdravstvu in medicini.

== Petra Tavčar: Zdravljenje Huntingtonove bolezni s proteini s cinkovimi prsti ==
Huntingtonova bolezen je monogenska dedna bolezen, ki se razvije zaradi prekomernega ponavljanja zaporedja nukleotidov CAG na genu, ki nosi zapis za protein huntingtin. Pri obolelih se zaporedje ponovi od 36 do 121-krat (normalno: 10 do 29-krat). Protein huntingtin je odgovoren za zdrav embrionalni razvoj ter razvijanje in ohranjanje nevronov pri odraslih ljudeh. Pri bolnikih nastaja protein z daljšo verigo poliglutamina, ki se z ostalimi mutiranimi huntingtin proteini združuje v proteinske agregate. Le-ti tvorijo inkluzijska telesca, ki se nalagajo na aksonih, dendritih in v jedrih nekaterih možganskih živčnih celic ter motijo normalno delovanje celic. To privede do sprememb v obnašanju, demence in horee (sunkovitih nehotenih gibov).

Trenutno še ne poznamo načina, s katerim bi zdravili ali preprečevali to bolezen. V razvoju pa je zdravljenje s proteini s cinkovimi prsti. To so regulatorni proteini, ki vsebujejo motiv cinkovega prsta. Prepoznavajo in se vežejo na določene odseke DNA in s tem regulirajo izražanje gena, na katerega se vežejo. Ker je oblikovanje proteinov s cinkovimi prsti enostavno, lahko izdelamo različne proteine, ki se vežejo na različne odseke DNA. Prav tako lahko nanje pripnemo poljubne regulacijske molekule ali vezavne elemente, kar omogoča specifično vezavo na želeni mutiran gen in preprečuje represijo nemutiranih genov.

Oblikovali so protein z enajstimi cinkovimi prsti, ki prepozna in se veže na poli 5´- GC(A/T) -3´. Sposoben je prepoznati poli-CAG ter poli-GCA, poli-GCT DNA del. Z raziskavo so dokazali, da represorji s cinkovimi prsti lahko povzročijo redukcijo na nivoju RNA in na nivoju proteinov v možganih miši, kar vodi do izboljšanja v fenotipu obolelih miši. Kombiniranje represorjev s cinkovimi prsti in promotorjev CAG in WPRE lahko omogoči selektivno represijo mutiranega gena, zmanjšano količino škodljivih proteinskih agregatov in blažitev simptomov Huntingtonove bolezni.

== Rok Ferenc: Nov način zdravljenja Androgenic alopecia ==
Androgenic alopecia oz. bolj splošno "plešavost" je bolezen, sicer značilna za moške, vendar prizadene tudi ženske in najstnike. Čeprav je izjemno razširjenja in bi uspešno zdravilo nedvomno ponovilo globalni uspeh in razvpitost modre tabletke, saj ima plešavost velike psihološke učinke na prizadetega, so do sedaj znana zdravila bodisi neučinkovita, bodisi zaradi stranskih učinkov nezaželena. Nedavno odkritje kapljic za oči, ki pospešijo rast trepalnic, je znanstvenike pripeljalo do novih raziskav, ki predvsem temeljijo na novo odkriti snovi - bimatoprost, ki bi hipotetično prek receptorjev lokalno lahko vplival na lasne folikle in pospešeno rast las. Slednje jim je uspelo potrditi. Najprej so izločili zunanji vpliv na rast dlak z gojenjem foliklov v kulturi, s poskusi na miših so teorijo prenesli na žive organizme, z opazovanjem delovanja antagonista za bimatoprost pa so dokončno potrdili obstoj receptorjev. Receptorje so z gelsko elektroforezo dokazali tudi v človeku ter jih s posebnimi tehnikami locirali v dermalni pupili, ki naprej stimulacijsko vpliva na celice, ki proizvajajo pigment in keratin. Svet je tako korak bliže k zdravljenju plešavosti in hkrati dvig ogromnega bremena z ramen marsikaterega moškega... pa tudi ženske.

== Tim Božič: HCMV z vezavo glikoproteina UL141 na smrtne receptorje TRAIL spodnese imunski odziv ==
Človeški citomegalovirus spada med herpes viruse in je zaradi različnih načinov prenašanja zelo razširjen. Zdravi ljudje sprva ne kažejo posebnih znakov okužbe, saj virus postane latenten, v daljšem časovnem obdobju pa lahko povzroči maligne bolezni. Posebno nevaren je za ljudi s šibkim imunskim sistemom (HIV pozitivni, starejši, novorojenčki) in nosečnicah, saj slednjim pusti trajne okvare vida, sluha ali pa celo vpliva na mentalni razvoj. Virus ima vsaj 3 mehanizme patogeneze in v vsakem prekine signalizacijo okuženih celic s protitelesi, torej prepreči imunski odziv. Razvoj cepiva je torej nujno potreben, saj ni omejen glede na socialni razred in geografijo.

== Jan Rozman: Ciljanje kronično levkemičnih celic z monoklonskim protitelesom specifičnim za CD44 ==
Življenja mnogih ljudi prizadane levkemija, zato si znanstveniki že dolgo časa prizadevajo najti sdravilo zanjo. Ali je znanost z raziskavo, ki sem si jo izbral naredila nov korak v boju proti tej bolezni?
CD44 je antigen vezan na B celicah levkocitov, na katerega se veže protitelo RG7356. To protitelo se veže na vse CD44, ne glede na to ali gre za zdravo B celico ali pa za CLL celico (kronično limfocitno levkemično celico), a na zdravi celici ne sproži apoptoze, na CLL celici pa jo, če ima težka veriga antigena CD44 nemutiran variabilni del, ali če je izražen protein ZAP-70. Če se na CD44 antigen CLL celice veže hialuronska kislina se v celici začnejo tvoriti antiapoptotični proteini, iz česar vidimo, da ima hialuronska kislina neželjeno delovanje (nasprotno RG7356), glede na to, da je cilj levkemične celice odstraniti in ne ohraniti. In vivo del eksperimenta je potekal v peritonealni votlini miši z knockoutiranim genom Rag2, zaradi česar te miši niso imele B in T celic ter naravnih celic ubijalk. Kljub temu je ob dodatku RG7356 prišlo do zmanjšane viabilnosti pri ZAP-70 pozitivnih in negativnih CLL celicah. Z dodatnim poskusom je bilo dokazano, da so za to odgovorni makrofagi, prisotni v peritonealni votlini teh miši.

Vabljeni na seminar, ki bo v ponedeljek 22.4.2013.

== Dominik Dekleva: Encimsko mapiranje proteinov v celici ==
Ideja o celičnem zemljevidu proteinov ni nič novega v svetu biokemije. Da bi bolje razumeli kaj se dogaja v celici, moramo dokumentirati lokacije na tisoče proteinov. Do sedaj so za dokumentiranje proteinov znanstveniki uporabljali fluorescentno ali elektronsko mikroskopijo ter masno spektrometrijo, ki pa imata v ta namen veliko pomankljivosti. Biokemiki iz MIT-a so razvili novo metodo detekcije proteinov v določenem predelu celice, ki se je izvrstno obnesla. Preizkus nove metode so izvedli na mitohondrijskem matriksu HEK (human embryonic kidney) celic. Te pogosto uporabljajo v celični biologiji, saj so enostavne za gojenje ter brez večjih problemov sprejmejo inducirane nukleinske kisline. Nova metoda izkorišča znanje o encimih, označevanju proteinov z biotinom ter mikrozrncih.

BIO1-seminar

2013-05-06T13:23:53Z

Mojca Kostanjevec: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak ponedeljek od 11:00 do 12:30.

Ocena seminarjev predstavlja ??% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.

Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/
username: tbk
password: samozameDD

== Seznam seminarjev ==
{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Link'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Rok Ferenc||Nov način zdravljenja Androgenic alopecia||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/10/121026125127.htm||04.03.||07.03.||11.03.||Jure Fabjan||Marjeta Horvat||Tadej Rozman
|-
| Mojca Juteršek||Sekrecijski sistem tipa III pri Pseudomonas aeruginosa in vpliv metabolizma na njegovo izražanje||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/01/130130083017.htm||04.03.||07.03.||11.03.||Boštjan Petrič||Maja Zupančič||Milena Jovanov
|-
| Tjaša Bensa||Sulforafan kot potencialni kandidat za zdravljenje levkemije||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/12/121212205602.htm||04.03.||07.03.||11.03.||Peter Prezelj||Luka Kavčič||Nina Pirih
|-
| Petra Tavčar||Zdravljenje Huntingtonove bolezni s proteini s cinkovimi prsti||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/10/121010131358.htm||04.03.||07.03.||11.03.||Ana Krišelj||Alja Zgonc||Urša Kapš
|-
| Tilen Komel||||||11.03.||14.03.||18.03.||Rok Ferenc||Jure Fabjan||Marjeta Horvat
|-
| Urška Kašnik||Propionibacterium acnes - bakterija, ki povzroča akne||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130228080135.htm||11.03.||14.03.||18.03.||Mojca Juteršek||Boštjan Petrič||Maja Zupančič
|-
| David Pignar||||||11.03.||14.03.||18.03.||Tjaša Bensa||Peter Prezelj||Luka Kavčič
|-
| Maruša Prolič - Kalinšek||Živčni strupi in butirilholinesteraza||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/01/130111101450.htm||11.03.||14.03.||18.03.||Petra Tavčar||Ana Krišelj||Alja Zgonc
|-
| Domen Klofutar||MICU1 kot regulator koncentracije Ca2+ v mitohondrijih||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/11/121127130025.htm||18.03.||21.03.||25.03.||Tilen Komel||Rok Ferenc||Jure Fabjan
|-
| Jakob Rupert||Vplivi na vezavo Aβ-oligomerov na nepatogene prione PrPC in povezava z nastankom Alzheimerjeve bolezni||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130205200241.htm||18.03.||21.03.||25.03.||Urška Kašnik||Mojca Juteršek||Boštjan Petrič
|-
| Helena Jakše|| Resveratrol kot preventiva proti raku||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/12/121205084419.htm||18.03.||21.03.||25.03.||David Pignar||Tjaša Bensa||Peter Prezelj
|-
| Lenka Tomešová||Key to Controlling Toxicity of Huntington's Disease Protein May Be Cell Contents
||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/06/120606092537.htm||18.03.||21.03.||25.03.||Maruša Prolič - Kalinšek||Petra Tavčar||Ana Krišelj
|-
| Simon Bolta||Vloga rjavega maščobnega tkiva pri termogenezi||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/03/130313160754.htm||25.03.||28.03.||08.04.||Domen Klofutar||Tilen Komel||Rok Ferenc
|-
| Vita Vidmar||Posttranskripcijska regulacija cirkadianega ritma pri Synechococcus elongatus||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130217134246.htm||25.03.||28.03.||08.04.||Jakob Rupert||Urška Kašnik||Mojca Juteršek
|-
| Sabina Štukelj||Struktura in pomen antifreeze proteinov||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130218092501.htm||25.03.||28.03.||08.04.||Helena Jakše||David Pignar||Tjaša Bensa
|-
| Nika Strašek||Zdravljenje avtizma s suraminom||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/03/130313182019.htm||25.03.||28.03.||08.04.||Lenka Tomešová||Maruša Prolič - Kalinšek||Petra Tavčar
|-
| Vid Jazbec||Interakcije seratoninskih in glutamatskih ter steratoninskih in dopaminskih receptorjev ter vpliv na psihoze||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/03/130307145720.htm||08.04.||11.04.||15.04.||Simon Bolta||Domen Klofutar||Tilen Komel
|-
| Aneta Atanasova||||||08.04.||11.04.||15.04.||Vita Vidmar||Jakob Rupert||Urška Kašnik
|-
| Rok Ipšek||Delovanje alfa hidroksi kislin kot eksfoliantov||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/08/120813155644.htm||08.04.||11.04.||15.04.||Sabina Štukelj||Helena Jakše||David Pignar
|-
| Helena Šneberger||Nova imunološka terapija zdravljenja alergije na jajca
||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/07/120718192044.htm||08.04.||11.04.||15.04.||Nika Strašek||Lenka Tomešová||Maruša Prolič - Kalinšek
|-
| Tim Božič||HMCV z vezavo glikoproteina UL141 na smrtne receptorje TRAIL spodnese imunski odziv||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/03/130313123504.htm||15.04.||18.04.||22.04.||Vid Jazbec||Simon Bolta||Domen Klofutar
|-
| Sara Košenina||Zdravljenje Alzheimerjeve bolezni z grelinom||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/04/130402182457.htm||15.04.||18.04.||22.04.||Aneta Atanasova||Vita Vidmar||Jakob Rupert
|-
| Eva Krivec||||||15.04.||18.04.||22.04.||Rok Ipšek||Sabina Štukelj||Helena Jakše
|-
| Jan Rozman||Ciljanje kronično levkemičnih celic z monoklonskim protitelesom specifičnim za CD44||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/03/130325160234.htm||15.04.||18.04.||22.04.||Helena Šneberger||Nika Strašek||Lenka Tomešová
|-
| Eva Vidak||Antigenska subverzija - nov mehanizem s katerim se virus Ebole izogne imunskemu odzivu gostitelja||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/12/121213172300.htm||22.04.||25.04.||06.05.||Tim Božič||Vid Jazbec||Simon Bolta
|-
| Toni Nagode||Makromolekulski uničevalec RNA||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130204094606.htm||22.04.||25.04.||06.05.||Sara Košenina||Aneta Atanasova||Vita Vidmar
|-
| Ema Guštin||Vloga regulacije kompleksov Vps34 pri avtofagiji||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/01/130117132921.htm||22.04.||25.04.||06.05.||Eva Krivec||Rok Ipšek||Sabina Štukelj
|-
| Dominik Dekleva||Encimsko mapiranje proteinov v celici||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130212210009.htm||22.04.||25.04.||06.05.||Jan Rozman||Helena Šneberger||Nika Strašek
|-
| Mojca Kostanjevec||Sintetični nanodelci funkcionalizirani z biomimetičnimi levkocitnimi membranami||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/01/130131144114.htm||06.05.||09.05.||13.05.||Eva Vidak||Tim Božič||Vid Jazbec
|-
| Eva Oblak Zvonar||Vodikov sulfid, potencialno preventivno in terapevtsko sredstvo pri staranju in s starostjo povezanih boleznih||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/01/130129121945.htm||06.05.||09.05.||13.05.||Toni Nagode||Sara Košenina||Aneta Atanasova
|-
| Barbara Sopčić||||||06.05.||09.05.||13.05.||Ema Guštin||Eva Krivec||Rok Ipšek
|-
| Tadej Rozman||||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/04/130425213758.htm||06.05.||09.05.||13.05.||Dominik Dekleva||Jan Rozman||Helena Šneberger
|-
| Milena Jovanov||||||13.05.||16.05.||20.05.||Mojca Kostanjevec||Eva Vidak||Tim Božič
|-
| Nina Pirih||||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/01/130128133820.htm||13.05.||16.05.||20.05.||Eva Oblak Zvonar||Toni Nagode||Sara Košenina
|-
| Urša Kapš||||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/04/130418100150.htm||13.05.||16.05.||20.05.||Barbara Sopčić||Ema Guštin||Eva Krivec
|-
| Marjeta Horvat||||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/04/130411123845.htm||13.05.||16.05.||20.05.||Tadej Rozman||Dominik Dekleva||Jan Rozman
|-
| Maja Zupančič||||||20.05.||23.05.||27.05.||Milena Jovanov||Mojca Kostanjevec||Eva Vidak
|-
| Luka Kavčič||||||20.05.||23.05.||27.05.||Nina Pirih||Eva Oblak Zvonar||Toni Nagode
|-
| Alja Zgonc||||||20.05.||23.05.||27.05.||Urša Kapš||Barbara Sopčić||Ema Guštin
|-
| Jure Fabjan||||||20.05.||23.05.||27.05.||Marjeta Horvat||Tadej Rozman||Dominik Dekleva
|-
| Boštjan Petrič||||||27.05.||30.05.||03.06.||Maja Zupančič||Milena Jovanov||Mojca Kostanjevec
|-
| Peter Prezelj||||||27.05.||30.05.||03.06.||Luka Kavčič||Nina Pirih||Eva Oblak Zvonar
|-
| Ana Krišelj||||||27.05.||30.05.||03.06.||Alja Zgonc||Urša Kapš||Barbara Sopčić
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2012. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka morate za seminar uporabiti še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* naslov izbrane teme in link do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2013 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 1800 do 2000 besed), vsebovati mora najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
* Seminar oddajte do roka za oddajo vsakemu od recenzentov (docentu ga pošljite po e-pošti v formatu .doc ali .docx).
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 16 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava- 6 minut. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo vsak vsaj dve vprašanji.
* En dan pred predstavitvijo oddajte končno verzijo doc. Gunčarju po e-mailu, v subject napišite TBK2013 in pripnite datoteko, ki ima ime v obliki TBK2013-Ime-Priimek.docx. Na dan predstavitve morate docentu oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dG1aMGp5bXFlQm9SMFU0X0lOaHZpQlE6MA recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dDhwMmlUUWpVRHByNUozdXVfRV9Henc6MA mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO1-seminar

2013-05-02T17:03:29Z

Mojca Kostanjevec: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak ponedeljek od 11:00 do 12:30.

Ocena seminarjev predstavlja ??% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.

Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/
username: tbk
password: samozameDD

== Seznam seminarjev ==
{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Link'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Rok Ferenc||Nov način zdravljenja Androgenic alopecia||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/10/121026125127.htm||04.03.||07.03.||11.03.||Jure Fabjan||Marjeta Horvat||Tadej Rozman
|-
| Mojca Juteršek||Sekrecijski sistem tipa III pri Pseudomonas aeruginosa in vpliv metabolizma na njegovo izražanje||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/01/130130083017.htm||04.03.||07.03.||11.03.||Boštjan Petrič||Maja Zupančič||Milena Jovanov
|-
| Tjaša Bensa||Sulforafan kot potencialni kandidat za zdravljenje levkemije||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/12/121212205602.htm||04.03.||07.03.||11.03.||Peter Prezelj||Luka Kavčič||Nina Pirih
|-
| Petra Tavčar||Zdravljenje Huntingtonove bolezni s proteini s cinkovimi prsti||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/10/121010131358.htm||04.03.||07.03.||11.03.||Ana Krišelj||Alja Zgonc||Urša Kapš
|-
| Tilen Komel||||||11.03.||14.03.||18.03.||Rok Ferenc||Jure Fabjan||Marjeta Horvat
|-
| Urška Kašnik||Propionibacterium acnes - bakterija, ki povzroča akne||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130228080135.htm||11.03.||14.03.||18.03.||Mojca Juteršek||Boštjan Petrič||Maja Zupančič
|-
| David Pignar||||||11.03.||14.03.||18.03.||Tjaša Bensa||Peter Prezelj||Luka Kavčič
|-
| Maruša Prolič - Kalinšek||Živčni strupi in butirilholinesteraza||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/01/130111101450.htm||11.03.||14.03.||18.03.||Petra Tavčar||Ana Krišelj||Alja Zgonc
|-
| Domen Klofutar||MICU1 kot regulator koncentracije Ca2+ v mitohondrijih||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/11/121127130025.htm||18.03.||21.03.||25.03.||Tilen Komel||Rok Ferenc||Jure Fabjan
|-
| Jakob Rupert||Vplivi na vezavo Aβ-oligomerov na nepatogene prione PrPC in povezava z nastankom Alzheimerjeve bolezni||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130205200241.htm||18.03.||21.03.||25.03.||Urška Kašnik||Mojca Juteršek||Boštjan Petrič
|-
| Helena Jakše|| Resveratrol kot preventiva proti raku||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/12/121205084419.htm||18.03.||21.03.||25.03.||David Pignar||Tjaša Bensa||Peter Prezelj
|-
| Lenka Tomešová||Key to Controlling Toxicity of Huntington's Disease Protein May Be Cell Contents
||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/06/120606092537.htm||18.03.||21.03.||25.03.||Maruša Prolič - Kalinšek||Petra Tavčar||Ana Krišelj
|-
| Simon Bolta||Vloga rjavega maščobnega tkiva pri termogenezi||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/03/130313160754.htm||25.03.||28.03.||08.04.||Domen Klofutar||Tilen Komel||Rok Ferenc
|-
| Vita Vidmar||Posttranskripcijska regulacija cirkadianega ritma pri Synechococcus elongatus||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130217134246.htm||25.03.||28.03.||08.04.||Jakob Rupert||Urška Kašnik||Mojca Juteršek
|-
| Sabina Štukelj||Struktura in pomen antifreeze proteinov||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130218092501.htm||25.03.||28.03.||08.04.||Helena Jakše||David Pignar||Tjaša Bensa
|-
| Nika Strašek||Zdravljenje avtizma s suraminom||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/03/130313182019.htm||25.03.||28.03.||08.04.||Lenka Tomešová||Maruša Prolič - Kalinšek||Petra Tavčar
|-
| Vid Jazbec||Interakcije seratoninskih in glutamatskih ter steratoninskih in dopaminskih receptorjev ter vpliv na psihoze||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/03/130307145720.htm||08.04.||11.04.||15.04.||Simon Bolta||Domen Klofutar||Tilen Komel
|-
| Aneta Atanasova||||||08.04.||11.04.||15.04.||Vita Vidmar||Jakob Rupert||Urška Kašnik
|-
| Rok Ipšek||Delovanje alfa hidroksi kislin kot eksfoliantov||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/08/120813155644.htm||08.04.||11.04.||15.04.||Sabina Štukelj||Helena Jakše||David Pignar
|-
| Helena Šneberger||Nova imunološka terapija zdravljenja alergije na jajca
||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/07/120718192044.htm||08.04.||11.04.||15.04.||Nika Strašek||Lenka Tomešová||Maruša Prolič - Kalinšek
|-
| Tim Božič||HMCV z vezavo glikoproteina UL141 na smrtne receptorje TRAIL spodnese imunski odziv||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/03/130313123504.htm||15.04.||18.04.||22.04.||Vid Jazbec||Simon Bolta||Domen Klofutar
|-
| Sara Košenina||Zdravljenje Alzheimerjeve bolezni z grelinom||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/04/130402182457.htm||15.04.||18.04.||22.04.||Aneta Atanasova||Vita Vidmar||Jakob Rupert
|-
| Eva Krivec||||||15.04.||18.04.||22.04.||Rok Ipšek||Sabina Štukelj||Helena Jakše
|-
| Jan Rozman||Ciljanje kronično levkemičnih celic z monoklonskim protitelesom specifičnim za CD44||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/03/130325160234.htm||15.04.||18.04.||22.04.||Helena Šneberger||Nika Strašek||Lenka Tomešová
|-
| Eva Vidak||Antigenska subverzija - nov mehanizem s katerim se virus Ebole izogne imunskemu odzivu gostitelja||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/12/121213172300.htm||22.04.||25.04.||06.05.||Tim Božič||Vid Jazbec||Simon Bolta
|-
| Toni Nagode||Makromolekulski uničevalec RNA||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130204094606.htm||22.04.||25.04.||06.05.||Sara Košenina||Aneta Atanasova||Vita Vidmar
|-
| Ema Guštin||Vloga regulacije kompleksov Vps34 pri avtofagiji||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/01/130117132921.htm||22.04.||25.04.||06.05.||Eva Krivec||Rok Ipšek||Sabina Štukelj
|-
| Dominik Dekleva||Encimsko mapiranje proteinov v celici||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130212210009.htm||22.04.||25.04.||06.05.||Jan Rozman||Helena Šneberger||Nika Strašek
|-
| Mojca Kostanjevec||Sintetični nanodelci, obdani z biomimetičnimi levkocitnimi membranami||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/01/130131144114.htm||06.05.||09.05.||13.05.||Eva Vidak||Tim Božič||Vid Jazbec
|-
| Eva Oblak Zvonar||Vodikov sulfid, potencialno preventivno in terapevtsko sredstvo pri staranju in s starostjo povezanih boleznih||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/01/130129121945.htm||06.05.||09.05.||13.05.||Toni Nagode||Sara Košenina||Aneta Atanasova
|-
| Barbara Sopčić||||||06.05.||09.05.||13.05.||Ema Guštin||Eva Krivec||Rok Ipšek
|-
| Tadej Rozman||||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/04/130425213758.htm||06.05.||09.05.||13.05.||Dominik Dekleva||Jan Rozman||Helena Šneberger
|-
| Milena Jovanov||||||13.05.||16.05.||20.05.||Mojca Kostanjevec||Eva Vidak||Tim Božič
|-
| Nina Pirih||||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/01/130128133820.htm||13.05.||16.05.||20.05.||Eva Oblak Zvonar||Toni Nagode||Sara Košenina
|-
| Urša Kapš||||||13.05.||16.05.||20.05.||Barbara Sopčić||Ema Guštin||Eva Krivec
|-
| Marjeta Horvat||||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/04/130411123845.htm||13.05.||16.05.||20.05.||Tadej Rozman||Dominik Dekleva||Jan Rozman
|-
| Maja Zupančič||||||20.05.||23.05.||27.05.||Milena Jovanov||Mojca Kostanjevec||Eva Vidak
|-
| Luka Kavčič||||||20.05.||23.05.||27.05.||Nina Pirih||Eva Oblak Zvonar||Toni Nagode
|-
| Alja Zgonc||||||20.05.||23.05.||27.05.||Urša Kapš||Barbara Sopčić||Ema Guštin
|-
| Jure Fabjan||||||20.05.||23.05.||27.05.||Marjeta Horvat||Tadej Rozman||Dominik Dekleva
|-
| Boštjan Petrič||||||27.05.||30.05.||03.06.||Maja Zupančič||Milena Jovanov||Mojca Kostanjevec
|-
| Peter Prezelj||||||27.05.||30.05.||03.06.||Luka Kavčič||Nina Pirih||Eva Oblak Zvonar
|-
| Ana Krišelj||||||27.05.||30.05.||03.06.||Alja Zgonc||Urša Kapš||Barbara Sopčić
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2012. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka morate za seminar uporabiti še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* naslov izbrane teme in link do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2013 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 1800 do 2000 besed), vsebovati mora najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
* Seminar oddajte do roka za oddajo vsakemu od recenzentov (docentu ga pošljite po e-pošti v formatu .doc ali .docx).
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 16 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava- 6 minut. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo vsak vsaj dve vprašanji.
* En dan pred predstavitvijo oddajte končno verzijo doc. Gunčarju po e-mailu, v subject napišite TBK2013 in pripnite datoteko, ki ima ime v obliki TBK2013-Ime-Priimek.docx. Na dan predstavitve morate docentu oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dG1aMGp5bXFlQm9SMFU0X0lOaHZpQlE6MA recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dDhwMmlUUWpVRHByNUozdXVfRV9Henc6MA mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO1-seminar

2013-04-30T20:25:07Z

Mojca Kostanjevec: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi doc. dr. Gregor Gunčar in so na urniku vsak ponedeljek od 11:00 do 12:30.

Ocena seminarjev predstavlja ??% končne ocene in vsebuje vse točke, ki jih študent/ka lahko zbere pri seminarju in ostalih dejavnostih, ki niso del pisnega izpita.

Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/
username: tbk
password: samozameDD

== Seznam seminarjev ==
{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Link'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Rok Ferenc||Nov način zdravljenja Androgenic alopecia||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/10/121026125127.htm||04.03.||07.03.||11.03.||Jure Fabjan||Marjeta Horvat||Tadej Rozman
|-
| Mojca Juteršek||Sekrecijski sistem tipa III pri Pseudomonas aeruginosa in vpliv metabolizma na njegovo izražanje||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/01/130130083017.htm||04.03.||07.03.||11.03.||Boštjan Petrič||Maja Zupančič||Milena Jovanov
|-
| Tjaša Bensa||Sulforafan kot potencialni kandidat za zdravljenje levkemije||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/12/121212205602.htm||04.03.||07.03.||11.03.||Peter Prezelj||Luka Kavčič||Nina Pirih
|-
| Petra Tavčar||Zdravljenje Huntingtonove bolezni s proteini s cinkovimi prsti||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/10/121010131358.htm||04.03.||07.03.||11.03.||Ana Krišelj||Alja Zgonc||Urša Kapš
|-
| Tilen Komel||||||11.03.||14.03.||18.03.||Rok Ferenc||Jure Fabjan||Marjeta Horvat
|-
| Urška Kašnik||Propionibacterium acnes - bakterija, ki povzroča akne||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130228080135.htm||11.03.||14.03.||18.03.||Mojca Juteršek||Boštjan Petrič||Maja Zupančič
|-
| David Pignar||||||11.03.||14.03.||18.03.||Tjaša Bensa||Peter Prezelj||Luka Kavčič
|-
| Maruša Prolič - Kalinšek||Živčni strupi in butirilholinesteraza||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/01/130111101450.htm||11.03.||14.03.||18.03.||Petra Tavčar||Ana Krišelj||Alja Zgonc
|-
| Domen Klofutar||MICU1 kot regulator koncentracije Ca2+ v mitohondrijih||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/11/121127130025.htm||18.03.||21.03.||25.03.||Tilen Komel||Rok Ferenc||Jure Fabjan
|-
| Jakob Rupert||Vplivi na vezavo Aβ-oligomerov na nepatogene prione PrPC in povezava z nastankom Alzheimerjeve bolezni||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130205200241.htm||18.03.||21.03.||25.03.||Urška Kašnik||Mojca Juteršek||Boštjan Petrič
|-
| Helena Jakše|| Resveratrol kot preventiva proti raku||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/12/121205084419.htm||18.03.||21.03.||25.03.||David Pignar||Tjaša Bensa||Peter Prezelj
|-
| Lenka Tomešová||Key to Controlling Toxicity of Huntington's Disease Protein May Be Cell Contents
||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/06/120606092537.htm||18.03.||21.03.||25.03.||Maruša Prolič - Kalinšek||Petra Tavčar||Ana Krišelj
|-
| Simon Bolta||Vloga rjavega maščobnega tkiva pri termogenezi||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/03/130313160754.htm||25.03.||28.03.||08.04.||Domen Klofutar||Tilen Komel||Rok Ferenc
|-
| Vita Vidmar||Posttranskripcijska regulacija cirkadianega ritma pri Synechococcus elongatus||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130217134246.htm||25.03.||28.03.||08.04.||Jakob Rupert||Urška Kašnik||Mojca Juteršek
|-
| Sabina Štukelj||Struktura in pomen antifreeze proteinov||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130218092501.htm||25.03.||28.03.||08.04.||Helena Jakše||David Pignar||Tjaša Bensa
|-
| Nika Strašek||Zdravljenje avtizma s suraminom||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/03/130313182019.htm||25.03.||28.03.||08.04.||Lenka Tomešová||Maruša Prolič - Kalinšek||Petra Tavčar
|-
| Vid Jazbec||Interakcije seratoninskih in glutamatskih ter steratoninskih in dopaminskih receptorjev ter vpliv na psihoze||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/03/130307145720.htm||08.04.||11.04.||15.04.||Simon Bolta||Domen Klofutar||Tilen Komel
|-
| Aneta Atanasova||||||08.04.||11.04.||15.04.||Vita Vidmar||Jakob Rupert||Urška Kašnik
|-
| Rok Ipšek||Delovanje alfa hidroksi kislin kot eksfoliantov||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/08/120813155644.htm||08.04.||11.04.||15.04.||Sabina Štukelj||Helena Jakše||David Pignar
|-
| Helena Šneberger||Nova imunološka terapija zdravljenja alergije na jajca
||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/07/120718192044.htm||08.04.||11.04.||15.04.||Nika Strašek||Lenka Tomešová||Maruša Prolič - Kalinšek
|-
| Tim Božič||HMCV z vezavo glikoproteina UL141 na smrtne receptorje TRAIL spodnese imunski odziv||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/03/130313123504.htm||15.04.||18.04.||22.04.||Vid Jazbec||Simon Bolta||Domen Klofutar
|-
| Sara Košenina||Zdravljenje Alzheimerjeve bolezni z grelinom||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/04/130402182457.htm||15.04.||18.04.||22.04.||Aneta Atanasova||Vita Vidmar||Jakob Rupert
|-
| Eva Krivec||||||15.04.||18.04.||22.04.||Rok Ipšek||Sabina Štukelj||Helena Jakše
|-
| Jan Rozman||Ciljanje kronično levkemičnih celic z monoklonskim protitelesom specifičnim za CD44||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/03/130325160234.htm||15.04.||18.04.||22.04.||Helena Šneberger||Nika Strašek||Lenka Tomešová
|-
| Eva Vidak||Antigenska subverzija - nov mehanizem s katerim se virus Ebole izogne imunskemu odzivu gostitelja||http://www.sciencedaily.com/releases/2012/12/121213172300.htm||22.04.||25.04.||06.05.||Tim Božič||Vid Jazbec||Simon Bolta
|-
| Toni Nagode||Makromolekulski uničevalec RNA||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130204094606.htm||22.04.||25.04.||06.05.||Sara Košenina||Aneta Atanasova||Vita Vidmar
|-
| Ema Guštin||Vloga regulacije kompleksov Vps34 pri avtofagiji||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/01/130117132921.htm||22.04.||25.04.||06.05.||Eva Krivec||Rok Ipšek||Sabina Štukelj
|-
| Dominik Dekleva||Encimsko mapiranje proteinov v celici||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/02/130212210009.htm||22.04.||25.04.||06.05.||Jan Rozman||Helena Šneberger||Nika Strašek
|-
| Mojca Kostanjevec||||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/01/130131144114.htm||06.05.||09.05.||13.05.||Eva Vidak||Tim Božič||Vid Jazbec
|-
| Eva Oblak Zvonar||Vodikov sulfid, potencialno preventivno in terapevtsko sredstvo pri staranju in s starostjo povezanih boleznih||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/01/130129121945.htm||06.05.||09.05.||13.05.||Toni Nagode||Sara Košenina||Aneta Atanasova
|-
| Barbara Sopčić||||||06.05.||09.05.||13.05.||Ema Guštin||Eva Krivec||Rok Ipšek
|-
| Tadej Rozman||||||06.05.||09.05.||13.05.||Dominik Dekleva||Jan Rozman||Helena Šneberger
|-
| Milena Jovanov||||||13.05.||16.05.||20.05.||Mojca Kostanjevec||Eva Vidak||Tim Božič
|-
| Nina Pirih||||||13.05.||16.05.||20.05.||Eva Oblak Zvonar||Toni Nagode||Sara Košenina
|-
| Urša Kapš||||||13.05.||16.05.||20.05.||Barbara Sopčić||Ema Guštin||Eva Krivec
|-
| Marjeta Horvat||||http://www.sciencedaily.com/releases/2013/04/130411123845.htm||13.05.||16.05.||20.05.||Tadej Rozman||Dominik Dekleva||Jan Rozman
|-
| Maja Zupančič||||||20.05.||23.05.||27.05.||Milena Jovanov||Mojca Kostanjevec||Eva Vidak
|-
| Luka Kavčič||||||20.05.||23.05.||27.05.||Nina Pirih||Eva Oblak Zvonar||Toni Nagode
|-
| Alja Zgonc||||||20.05.||23.05.||27.05.||Urša Kapš||Barbara Sopčić||Ema Guštin
|-
| Jure Fabjan||||||20.05.||23.05.||27.05.||Marjeta Horvat||Tadej Rozman||Dominik Dekleva
|-
| Boštjan Petrič||||||27.05.||30.05.||03.06.||Maja Zupančič||Milena Jovanov||Mojca Kostanjevec
|-
| Peter Prezelj||||||27.05.||30.05.||03.06.||Luka Kavčič||Nina Pirih||Eva Oblak Zvonar
|-
| Ana Krišelj||||||27.05.||30.05.||03.06.||Alja Zgonc||Urša Kapš||Barbara Sopčić
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2012. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka morate za seminar uporabiti še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* naslov izbrane teme in link do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2013 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 1800 do 2000 besed), vsebovati mora najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
* Seminar oddajte do roka za oddajo vsakemu od recenzentov (docentu ga pošljite po e-pošti v formatu .doc ali .docx).
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 16 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava- 6 minut. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo vsak vsaj dve vprašanji.
* En dan pred predstavitvijo oddajte končno verzijo doc. Gunčarju po e-mailu, v subject napišite TBK2013 in pripnite datoteko, ki ima ime v obliki TBK2013-Ime-Priimek.docx. Na dan predstavitve morate docentu oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dG1aMGp5bXFlQm9SMFU0X0lOaHZpQlE6MA recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/spreadsheet/viewform?formkey=dDhwMmlUUWpVRHByNUozdXVfRV9Henc6MA mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.