https://wiki.fkkt.uni-lj.si/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=MojcaH 2026-06-10T00:23:16Z User contributions MediaWiki 1.45.3 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=SynORI_%E2%80%93_ogrodje_za_ve%C4%8Dplazmidne_sisteme&diff=13824 2018-01-21T21:36:02Z

<p>MojcaH: </p> <hr /> <div>Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania SynORI] (Vilna - Litva) iz tekmovanja iGEM 2017.<br /> <br /> Avtorica: Mojca Hunski<br /> <br /> <br /> Raziskovalci se v genskem inženirstvu pri delu s plazmidi velikokrat srečajo s težavami, kot so nizko število kopij plazmida v celici ter nezmožnost sočasnega obstoja dveh ali več plazmidov v isti celici v odsotnosti selekcijskega pritiska (nekompatibilnost skupin plazmidov). Rešitev so v svojem projektu, poimenovanem SynORI, tj. sintetični ORI (mesto začetka replikacije), na tekmovanju iGEM 2017 predstavili študentje iz Vilne. Ustvarili so ogrodje, ki raziskovalcem omogoča lasten nadzor nad številom kopij določenega plazmida ter izbiro števila skupin plazmidov v celici, ki bodo med sabo kompatibilne.&lt;ref&gt;http://2017.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania (21. 1. 2018)&lt;/ref&gt; <br /> <br /> == Lasten nadzor nad številom kopij plazmida ==<br /> <br /> Plazmidi običajno dajejo gostiteljski celici marsikatero uporabno lastnost ali funkcijo (npr. odpornost na antibiotike in dodatne presnovne poti), lahko pa predstavljajo za celico tudi veliko breme, če je njihovo število kopij previsoko. Prav tako je pomembno, da se med delitvijo celic ne izgubijo, zato je nujno potrebno uravnavanje podvojevanja plazmidov.&lt;ref&gt;G. del Solar, M. Espinosa. &quot;Plasmid copy number control: an ever-growing story.&quot; Molecular Microbiology 2000, 37 (3), 492-500.&lt;/ref&gt; Različni plazmidi imajo različne načine regulacije podvojevanja ter so lahko v celici v visokem ali nizkem številu kopij. Študentje zmagovalne ekipe so se osredotočili na naravni plazmid ''E. coli'' ColE1, katerega uravnavanje podvojevanja poteka preko nastanka kompleksa med dvema komplementarnima kratkima molekulama RNA (RNA I in RNA II).<br /> <br /> === ColE1 ===<br /> <br /> Podvojevanje plazmida ColE1 se prične s prepisovanjem gena za RNA II, katerega konstitutivni promotor se nahaja 555 bp navzgor od mesta ORI. RNA II se zvije v kompleksno sekundarno strukturo, sestavljeno iz več zgradb steblo-zanka, kar omogoči tvorbo stabilnega kompleksa z matrično DNA na mestu ORI. Encim RNazaH nato napade novonastali hibrid in cepi molekulo RNA II na 3'-koncu, da se izpostavi hidroksilna skupina, da lahko tako RNA II služi kot začetni oligonukleotid za DNA-polimerazo I pri sintezi vodilne verige.<br /> <br /> Uravnavanje števila kopij plazmida poteka s kratko nekodirajočo RNA I, ki inhibira RNA II. Transkripcija gena za RNA I se prične 445 bp navzgor od mesta ORI in poteka v nasprotni smeri, kot poteka transkripcija gena za RNA II, tako da je RNA I v celoti komplementarna 5'-koncu RNA II in se lahko veže nanjo. S tem se spremeni sekundarna struktura RNA II, ki posledično ne more več tvoriti stabilnega kompleksa z DNA na mestu ORI in je tudi RNazaH ne more cepiti. Inhibicija je dodatno ojačana še s proteinom Rop, ki se veže na začetni kompleks RNA I-RNA II in ga stabilizira. Višje, kot je število kopij plazmida, večja je koncentracija RNA I v celici in tako je podvojevanje ustavljeno. &lt;ref&gt;T. Itoh, J. Tomizawa.(1980) &quot;Formation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H.&quot; Proc Natl Acad Sci USA 1980, 77, 2450–2454.&lt;/ref&gt; &lt;ref&gt;J. Tomizawa ''et al''. &quot;Inhibition of ColE1 RNA primer formation by a plasmid-specified small RNA.&quot; Proc Natl Acad Sci USA 1981, 78, 1421–1425.&lt;/ref&gt;<br /> <br /> === Modeliranje in eksperiment ===<br /> <br /> Cilj ekipe je bil pripraviti ogrodje, s katerim bi lahko vsak raziskovalec enostavno spreminjal oziroma reguliral število kopij plazmida po lastnih potrebah. To so storili tako, da so najprej popolnoma dezaktivirali promotor za RNA I, zapis za RNA I pa potem skupaj z izbranim promotorjem vstavili poleg gena za RNA II.<br /> <br /> Promotor za RNA I (pRNAI) je komplementaren ravno tistemu delu zapisa za RNA II, ki je ključen za tvorbo sekundarnih struktur, pomembnih pri nastanku kompleksa z DNA in posledično pri začetku podvojevanja. S spreminjanjem nukleotidnega zaporedja pRNAI se tako spreminja tudi sekundarna zgradba RNA II, zato so študentje s podatki iz literature in z računalniškimi analizami izbrali 5 takšnih mutiranih zaporedij za pRNAI, ki ne bi povzročila večjih sprememb v sekundarni strukturi RNA II in bi hkrati imela najnižjo afiniteto za RNA-polimerazo. Za določitev, katero izmed mutiranih zaporedij najbolje ustreza pogojem, so najprej celice transformirali z nemutiranim (wt) plazmidom oziroma s plazmidom z mutiranim pRNAI ter po inkubaciji določili število kopij plazmida (PCN) na celico s kvantitativnim PCR. Mutirane plazmide so izolirali in v njih vstavili še wt zapis za RNAI skupaj z wt pRNAI. Po transformaciji in inkubaciji so ponovno določili PCN. Za nadaljnje delo so izbrali tisto mutirano zaporedje, kjer je bila razlika med PCN celic z wt plazmidom in celic z mutiranim pRNAI največja, razlika med PCN celicah z wt plazmidom ter celic z mutiranim pRNAI in nemutiranim genom pa najmanjša. To zaporedje so poimenovali kar RNA II in pripravili tudi biokocko ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2259000 BBa_K2259000]).<br /> <br /> Nato so preverili, ali lahko s spreminjanjem moči promotorja za RNA I vplivajo na PCN. Poleg novega konstrukta RNA II so vstavili gen za RNA I pod kontrolo različnih Andersonovih konstitutivnih promotorjev. Z eksperimenti so potrdili hipotezo, da močnejši promotor v primerjavi z nemutiranim pRNA I povzroči zmanjšanje, šibkejši pa povečanje PCN. Podoben eksperiment so naredili z uporabo inducibilnega ramnoznega promotorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K914003 BBa_K914003]), le da so v tem primeru spreminjali koncentracijo ramnoze v gojišču. Hipotezo, da se z večanjem koncentracije ramnoze v gojišču PCN znižuje, so potrdili, kljub temu pa izbira ramnoznega promotorja ni bila najboljša, saj so že nizke koncentracije ramnoze v gojišču povzročile zmanjšanje PCN na le nekaj kopij, prav tako pa je prišlo do velikega zmanjšanja PCN tudi v gojišču brez ramnoze. Študentje so z ekperimenti tako dokazali, da lahko z njihovo napravo SynORI ter z izbiro ustreznega promotorja sami nadzorujemo in po želji izberemo število kopij plazmida v celici.<br /> <br /> == (Ne)kompatibilnostne skupine plazmidov ==<br /> <br /> V celici je lahko hkrati več kot 1 tip plazmida, ki morajo biti med sabo kompatibilni. Če pa vnos dodatnega plazmida v celice, ki že vsebujejo nek plazmid, povzroči destabilizacijo predhodno prisotnega plazmida, sta plazmida nekompatibilna. Običajno je vzrok za nekompatibilnost enak mehanizem kontrole replikacije med različnimi tipi plazmidov, kar lahko povzroči izgubo enega plazmida (predvsem tistega z nizkim številom kopij) skozi več generacij.<br /> <br /> === Eksperiment ===<br /> <br /> Študentje so si za naslednji cilj pri projektu zadali pripravo različnih kompatibilnih tipov plazmidov, ki bi sicer imeli enak mehanizem kontrole podvojevanja, ampak bi bil vsak tip specifičen zase. Znano je, da so za inhibicijo podvojevanja plazmida ColE1 najbolj pomembne medsebojne interakcije molekul RNA I in RNA II le med tremi zankami. S spreminjanjem zaporedij zank RNA I in RNA II, ki bi bila specifična za določen tip, bi ustvarili nove različne tipe plazmidov, ki pa bi bili med sabo kompatibilni, saj ne bi prišlo do tvorbe kompleksov med molekulami RNA različnih plazmidov. Zaradi predhodne dezaktivacije pRNAI ter vstavljanja gena za RNA I na drugo mesto ni nujno potrebno, da sta molekuli RNA popolnoma komplementarni med sabo.<br /> <br /> Iz podatkov iz literature &lt;ref&gt;W. W. Grabow ''et al''. &quot;Self-assembling RNA nanorings based on RNAI/II inverse kissing complexes.&quot; Nano Lett 2011,11(2), 878–87.&lt;/ref&gt; so pridobili različne kombinacije zaporedij zank RNA I in RNA II, ki lahko med sabo tvorijo komplekse. Izbrali so 5 različnih zaporedij RNA II (5 skupin), ki so imela mutirana zaporedja le za prvi dve zanki. Z mutiranjem tretje zanke bi namreč lahko povzročili motnje v začetku replikacije, saj je sekundarna struktura RNA II zelo občutljiva na mutacije v tem delu. Za RNA I pa so izbrali 10 različnih zaporedij (5 skupin s po dvema zaporedjema, ki sta se razlikovala samo v zapisu za tretjo zanko). <br /> <br /> Najprej so preverili, kako samo sprememba zaporedja RNA II vpliva na PCN, in izločili iz eksperimenta tista zaporedja, ki so povzročila veliko zmanjšanje PCN, saj je to pomenilo, da je prišlo do spremembe sekundarne strukture RNA II in posledično ta ni mogla služiti kot začetnik replikacije. Nato so v te plazmide vstavili še ustrezna zaporedja za RNA I (na enem plazmidu zapisa za RNA I in II iz iste skupine) ter preverili, ali je prišlo do inhibicije podvojevanja (cis-delovanje).<br /> <br /> Nato so zaporedja za RNA II ter zaporedja za RNA I ločeno vstavili v dva različna plazmida (RNA II v [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2259081 BBa_K2259081] ter RNA I v [http://parts.igem.org/Part:pSB4A5 pSB4A5]) ter transformirali celice s kombinacijami dveh različnih plazmidov. S tem so želeli ugotoviti, ali in pri katerih kombinacijah skupin je prišlo do zmanjšanja PCN (trans-delovanje). Le-te skupine so med sabo nekompatibilne. Pri projektu so uspešno pridobili dve kombinaciji skupin, ki pa sta bili med sabo kompatibilni. Nato so že s predhodno pripravljenimi plazmidi, ki so vsebovali zapisa za RNA I in RNA II iz ene skupine, transformirali celice skupaj z domnevno kompatibilnimi plazmidi z zapisom iz druge skupine ter določili PCN. Ker ni prišlo do zmanjšanja PCN pri nobeni skupini, so tako še enkrat potrdili, da je eksperiment uspel in da gre res za kompatibilni skupini.<br /> <br /> == Zaključek ==<br /> <br /> Litovski študentje so v celoti uspešno izpeljali projekt SynORI, za katerega so prejeli tudi veliko nagrado v skupini projektov dodiplomskih študentov. Pripravili so novo standardizirano ogrodje za večplazmidne sisteme, ki raziskovalcem omogoča veliko svobode pri uravnavanju podvojevanja plazmidov. Dodatno pa to ogrodje vključuje še možnost uporabe selekcijskega sistema, s katerim lahko z uporabo le enega antibiotika preverimo uspešnost transformacije celice z do 5 plazmidi, ter poseben sistem delitve celic, ki zagotavlja, da se plazmidi z nizkim številom kopij med delitvijo ne izgubijo.<br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> &lt;references /&gt;</div>

MojcaH https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2017/18&diff=13822 2018-01-21T21:02:48Z

<p>MojcaH: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2017/18 študentje predstavljajo naslednje teme:<br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola]&lt;br&gt;<br /> #[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah]&lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prostorsko-%C4%8Dasovni_nadzor_izra%C5%BEanja_genov_z_mre%C5%BEami_generatorjev_impulzov Prostorsko-časovni nadzor izražanja genov z mrežami generatorjev impulzov] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularna_in_razširljiva_platforma_na_osnovi_regulacije_izražanja_genov_z_RNA_za_inženiring_celičnih_funkcij Modularna in razširljiva platforma na osnovi regulacije izražanja genov z RNA za inženiring celičnih funkcij] - Ana Cirnski &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezceli%C4%8Dna_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni CascAID - test s Cas13a za diagnostiko nalezljivih bolezni]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Case13a_Sistem_za_zaznavanje_genov_za_odpornost_proti_antibiotiku Case13a - Sistem za zaznavanje genov za odpornost proti antibiotiku]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pospe%C5%A1ena_in_vivo_evolucija Pospešena ''in vivo'' evolucija]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pilus%2B Pilus+]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/%C5%A0irjenje_genetskega_koda Širjenje genetskega koda]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aflatoxout Aflatoxout] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Enkabcillus_-_to_je_past%21 Enkabcillus - to je past!] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Solni_trezor Solni trezor] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/H2ydroGEM_-_%C4%8Cista_energija_za_prihodnost H2ydroGEM - Čista energija za prihodnost] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Shramba_fosfata Shramba fosfata] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynORI_–_ogrodje_za_večplazmidne_sisteme SynORI – ogrodje za večplazmidne sisteme] &lt;br&gt;<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.<br /> <br /> ---------------------------<br /> Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):<br /> <br /> 27.11. &lt;br&gt;<br /> 1 Marija Srnko -[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]&lt;br&gt;<br /> 2 Neža Brezovar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SLOVO_RAKU Slovo raku]&lt;br&gt;<br /> <br /> 28.11.&lt;br&gt;<br /> 1 Tjaša Grum - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola]&lt;br&gt;<br /> 2 Urška Černe [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] &lt;br&gt;<br /> 3 Petra Vivod - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense] &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 4.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Sara Kimm Fuhrmann - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ] &lt;br&gt;<br /> 2 Anja Tanšek - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DNA_assembler - DNA assembler] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 5.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Urška Furar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah] &lt;br&gt;<br /> 2 Tina Lekan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] &lt;br&gt;<br /> 3 Katja Malovrh [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin] &lt;br&gt; <br /> 4 Jernej Vidmar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 12.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Helena Jakše - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka] &lt;br&gt;<br /> 2 Tjaša Bensa - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezcelična_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni] &lt;br&gt;<br /> 3 Sabina Štukelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MagicBlock:_interaktivna_platforma_za_sintezno_biologijo MagicBlock: interaktivna platforma za sintezno biologijo] &lt;br&gt;<br /> 4 Amadeja Lapornik [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 19.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Krišelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED] &lt;br&gt; <br /> 2 Vanna Imširović [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Beton-samoporavljaju%C4%87i_sistem Beton-samopopravljajući sistem] &lt;br&gt;<br /> 3 Dominik Dekleva - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] &lt;br&gt;<br /> 4 Neža Gaube [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni CascAID - test s Cas13a za diagnostiko nalezljivih bolezni] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 9.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Nastja Marondini - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pospe%C5%A1ena_in_vivo_evolucija Pospešena ''in vivo'' evolucija] &lt;br&gt;<br /> 2 Elizabeta Jevnikar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prostorsko-%C4%8Dasovni_nadzor_izra%C5%BEanja_genov_z_mre%C5%BEami_generatorjev_impulzov Prostorsko-časovni nadzor izražanja genov z mrežami generatorjev impulzov] &lt;br&gt;<br /> 3 Nina Roštan - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Case13a_Sistem_za_zaznavanje_genov_za_odpornost_proti_antibiotiku Case13a - Sistem za zaznavanje genov za odpornost proti antibiotiku] &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 15.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Matic Kovačič - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/%C5%A0irjenje_genetskega_koda Širjenje genetskega koda]&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 16.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Inge Sotlar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Super_tobak Super tobak] &lt;br&gt;<br /> 2 Marija Kisilak - [[Enkabcillus - to je past!]]&lt;br&gt;<br /> 3 Nataša Traven - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aflatoxout Aflatoxout] &lt;br&gt;<br /> 4 Tina Šimunović - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pilus%2B Pilus+] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 22.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Mojca Hunski - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynORI_–_ogrodje_za_večplazmidne_sisteme SynORI – ogrodje za večplazmidne sisteme] &lt;br&gt;<br /> 2 Tomaž Žagar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Solni_trezor Solni trezor] &lt;br&gt;<br /> 3 Tadej Ulčnik - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Shramba_fosfata Shramba fosfata] &lt;br&gt;<br /> 4 Jakob Rupert - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/H2ydroGEM_-_%C4%8Cista_energija_za_prihodnost H2ydroGEM - Čista energija za prihodnost] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 23.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Cirnski - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularna_in_razširljiva_platforma_na_osnovi_regulacije_izražanja_genov_z_RNA_za_inženiring_celičnih_funkcij Modularna in razširljiva platforma na osnovi regulacije izražanja genov z RNA za inženiring celičnih funkcij] &lt;br&gt;<br /> 2 Rok Ferenc &lt;br&gt;<br /> 3 Barbara Lipovšek &lt;br&gt;<br /> 4&lt;br&gt;</div>

MojcaH https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=SynORI_%E2%80%93_ogrodje_za_ve%C4%8Dplazmidne_sisteme&diff=13821 2018-01-21T20:49:34Z

<p>MojcaH: </p> <hr /> <div>Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania SynORI] (Vilna - Litva) iz tekmovanja iGEM 2017.<br /> <br /> Avtorica: Mojca Hunski<br /> <br /> <br /> Raziskovalci se v genskem inženirstvu pri delu s plazmidi velikokrat srečajo s težavami, kot so nizko število kopij plazmida v celici ter nezmožnost sočasnega obstoja dveh ali več plazmidov v isti celici v odsotnosti selekcijskega pritiska (nekompatibilnost skupin plazmidov). Rešitev so v svojem projektu, poimenovanem SynORI, tj. sintetični ORI (mesto začetka replikacije), na tekmovanju iGEM 2017 predstavili študentje iz Vilne. Ustvarili so ogrodje, ki raziskovalcem omogoča lasten nadzor nad številom kopij določenega plazmida ter izbiro števila skupin plazmidov v celici, ki bodo med sabo kompatibilne.&lt;ref&gt;http://2017.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania (21. 1. 2018)&lt;/ref&gt; <br /> <br /> == Lasten nadzor nad številom kopij plazmida ==<br /> <br /> Plazmidi običajno dajejo gostiteljski celici marsikatero uporabno lastnost ali funkcijo (npr. odpornost na antibiotike in dodatne presnovne poti), lahko pa predstavljajo za celico tudi veliko breme, če je njihovo število kopij previsoko. Prav tako je pomembno, da se med delitvijo celic ne izgubijo, zato je nujno potrebno uravnavanje podvojevanja plazmidov.&lt;ref&gt;G. del Solar, M. Espinosa. &quot;Plasmid copy number control: an ever-growing story.&quot; Molecular Microbiology 2000, 37 (3), 492-500.&lt;/ref&gt; Različni plazmidi imajo različne načine regulacije podvojevanja ter so lahko v celici v visokem ali nizkem številu kopij. Študentje zmagovalne ekipe so se osredotočili na naravni plazmid ''E. coli'' ColE1, katerega uravnavanje podvojevanja poteka preko nastanka kompleksa med dvema komplementarnima kratkima molekulama RNA (RNA I in RNA II).<br /> <br /> === ColE1 ===<br /> <br /> Podvojevanje plazmida ColE1 se prične s prepisovanjem gena za RNA II, katerega konstitutivni promotor se nahaja 555 bp navzgor od mesta ORI. RNA II se zvije v kompleksno sekundarno strukturo, sestavljeno iz več zgradb steblo-zanka, kar omogoči tvorbo stabilnega kompleksa z matrično DNA na mestu ORI. Encim RNazaH nato napade novonastali hibrid in cepi molekulo RNA II na 3'-koncu, da se izpostavi hidroksilna skupina, da lahko tako RNA II služi kot začetni oligonukleotid za DNA polimerazo I pri sintezi vodilne verige.<br /> <br /> Uravnavanje števila kopij plazmida poteka s kratko nekodirajočo RNA I, ki inhibira RNA II. Transkripcija gena za RNA I se prične 445 bp navzgor od mesta ORI in poteka v nasprotni smeri, kot poteka transkripcija gena za RNA II, tako da je RNA I v celoti komplementarna 5'-koncu RNA II in se lahko veže nanjo. S tem se spremeni sekundarna struktura RNA II, ki posledično ne more več tvoriti stabilnega kompleksa z DNA na mestu ORI in je tudi RNazaH ne more cepiti. Inhibicija je dodatno ojačana še s proteinom Rop, ki se veže na začetni kompleks RNA I-RNA II in ga stabilizira. Višje, kot je število kopij plazmida, večja je koncentracija RNA I v celici in tako je podvojevanje ustavljeno. &lt;ref&gt;T. Itoh, J. Tomizawa.(1980) &quot;Formation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H.&quot; Proc Natl Acad Sci USA 1980, 77, 2450–2454.&lt;/ref&gt; &lt;ref&gt;J. Tomizawa ''et al''. &quot;Inhibition of ColE1 RNA primer formation by a plasmid-specified small RNA.&quot; Proc Natl Acad Sci USA 1981, 78, 1421–1425.&lt;/ref&gt;<br /> <br /> === Modeliranje in eksperiment ===<br /> <br /> Cilj ekipe je bil pripraviti ogrodje, s katerim bi lahko vsak raziskovalec enostavno spreminjal oziroma reguliral število kopij plazmida po lastnih potrebah. To so storili tako, da so najprej popolnoma dezaktivirali promotor za RNA I, zapis za RNA I pa potem skupaj z izbranim promotorjem vstavili poleg gena za RNA II.<br /> <br /> Promotor za RNA I (pRNAI) je komplementaren ravno tistemu delu zapisa za RNA II, ki je ključen za tvorbo sekundarnih struktur, pomembnih pri nastanku kompleksa z DNA in posledično pri začetku podvojevanja. S spreminjanjem nukleotidnega zaporedja pRNAI se tako spreminja tudi sekundarna zgradba RNA II, zato so študentje s podatki iz literature in z računalniškimi analizami izbrali 5 takšnih mutiranih zaporedij za pRNAI, ki ne bi povzročila večjih sprememb v sekundarni strukturi RNA II in bi hkrati imela najnižjo afiniteto za RNA polimerazo. Za določitev, katero izmed mutiranih zaporedij najbolje ustreza pogojem, so najprej celice transformirali z nemutiranim (wt) plazmidom oziroma s plazmidom z mutiranim pRNAI ter po inkubaciji določili število kopij plazmida (PCN) na celico s kvantitativnim PCR. Mutirane plazmide so izolirali in v njih vstavili še wt zapis za RNAI skupaj z wt pRNAI. Po transformaciji in inkubaciji so ponovno določili PCN. Za nadaljnje delo so izbrali tisto mutirano zaporedje, kjer je bila razlika med PCN celic z wt plazmidom in celic z mutiranim pRNAI največja, razlika med PCN celicah z wt plazmidom ter celic z mutiranim pRNAI in nemutiranim genom pa najmanjša. To zaporedje so poimenovali kar RNA II in pripravili tudi biokocko ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2259000 BBa_K2259000]).<br /> <br /> Nato so preverili, ali lahko s spreminjanjem moči promotorja za RNA I vplivajo na PCN. Poleg novega konstrukta RNA II so vstavili gen za RNA I pod kontrolo različnih Andersonovih konstitutivnih promotorjev. Z eksperimenti so potrdili hipotezo, da močnejši promotor v primerjavi z nemutiranim pRNA I povzroči zmanjšanje, šibkejši pa povečanje PCN. Podoben eksperiment so naredili z uporabo inducibilnega ramnoznega promotorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K914003 BBa_K914003]), le da so v tem primeru spreminjali koncentracijo ramnoze v gojišču. Hipotezo, da se z večanjem koncentracije ramnoze v gojišču PCN znižuje, so potrdili, kljub temu pa izbira ramnoznega promotorja ni bila najboljša, saj so že nizke koncentracije ramnoze v gojišču povzročile zmanjšanje PCN na le nekaj kopij, prav tako pa je prišlo do velikega zmanjšanja PCN tudi v gojišču brez ramnoze. Študentje so z ekperimenti tako dokazali, da lahko z njihovo napravo SynORI ter z izbiro ustreznega promotorja sami nadzorujemo in po želji izberemo število kopij plazmida v celici.<br /> <br /> == (Ne)kompatibilnostne skupine plazmidov ==<br /> <br /> V celici je lahko hkrati več kot 1 tip plazmida, ki morajo biti med sabo kompatibilni. Če pa vnos dodatnega plazmida v celice, ki že vsebujejo nek plazmid, povzroči destabilizacijo predhodno prisotnega plazmida, sta plazmida nekompatibilna. Običajno je vzrok za nekompatibilnost enak mehanizem kontrole replikacije med različnimi tipi plazmidov, kar lahko povzroči izgubo enega plazmida (predvsem tistega z nizkim številom kopij) skozi več generacij.<br /> <br /> === Eksperiment ===<br /> <br /> Študentje so si za naslednji cilj pri projektu zadali pripravo različnih kompatibilnih tipov plazmidov, ki bi sicer imeli enak mehanizem kontrole podvojevanja, ampak bi bil vsak tip specifičen zase. Znano je, da so za inhibicijo podvojevanja plazmida ColE1 najbolj pomembne medsebojne interakcije molekul RNA I in RNA II le med tremi zankami. S spreminjanjem zaporedij zank RNA I in RNA II, ki bi bila specifična za določen tip, bi ustvarili nove različne tipe plazmidov, ki pa bi bili med sabo kompatibilni, saj ne bi prišlo do tvorbe kompleksov med molekulami RNA različnih plazmidov. Zaradi predhodne dezaktivacije pRNAI ter vstavljanja gena za RNA I na drugo mesto ni nujno potrebno, da sta molekuli RNA popolnoma komplementarni med sabo.<br /> <br /> Iz podatkov iz literature &lt;ref&gt;W. W. Grabow ''et al''. &quot;Self-assembling RNA nanorings based on RNAI/II inverse kissing complexes.&quot; Nano Lett 2011,11(2), 878–87.&lt;/ref&gt; so pridobili različne kombinacije zaporedij zank RNA I in RNA II, ki lahko med sabo tvorijo komplekse. Izbrali so 5 različnih zaporedij RNA II (5 skupin), ki so imela mutirana zaporedja le za prvi dve zanki. Z mutiranjem tretje zanke bi namreč lahko povzročili motnje v začetku replikacije, saj je sekundarna struktura RNA II zelo občutljiva na mutacije v tem delu. Za RNA I pa so izbrali 10 različnih zaporedij (5 skupin s po dvema zaporedjema, ki sta se razlikovala samo v zapisu za tretjo zanko). <br /> <br /> Najprej so preverili, kako samo sprememba zaporedja RNA II vpliva na PCN, in izločili iz eksperimenta tista zaporedja, ki so povzročila veliko zmanjšanje PCN, saj je to pomenilo, da je prišlo do spremembe sekundarne strukture RNA II in posledično ta ni mogla služiti kot začetnik replikacije. Nato so v te plazmide vstavili še ustrezna zaporedja za RNA I (na enem plazmidu zapisa za RNA I in II iz iste skupine) ter preverili, ali je prišlo do inhibicije podvojevanja (cis-delovanje).<br /> <br /> Nato so zaporedja za RNA II ter zaporedja za RNA I ločeno vstavili v dva različna plazmida (RNA II v [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2259081 BBa_K2259081] ter RNA I v [http://parts.igem.org/Part:pSB4A5 pSB4A5]) ter transformirali celice s kombinacijami dveh različnih plazmidov. S tem so želeli ugotoviti, ali in pri katerih kombinacijah skupin je prišlo do zmanjšanja PCN (trans-delovanje). Le-te skupine so med sabo nekompatibilne. Pri projektu so uspešno pridobili dve kombinaciji skupin, ki pa sta bili med sabo kompatibilni. Nato so že s predhodno pripravljenimi plazmidi, ki so vsebovali zapisa za RNA I in RNA II iz ene skupine, transformirali celice skupaj z domnevno kompatibilnimi plazmidi z zapisom iz druge skupine ter določili PCN. Ker ni prišlo do zmanjšanja PCN pri nobeni skupini, so tako še enkrat potrdili, da je eksperiment uspel in da gre res za kompatibilni skupini.<br /> <br /> == Zaključek ==<br /> <br /> Litovski študentje so v celoti uspešno izpeljali projekt SynORI, za katerega so prejeli tudi veliko nagrado v skupini projektov dodiplomskih študentov. Pripravili so novo standardizirano ogrodje za večplazmidne sisteme, ki raziskovalcem omogoča veliko svobode pri uravnavanju podvojevanja plazmidov. Dodatno pa to ogrodje vključuje še možnost uporabe selekcijskega sistema, s katerim lahko z uporabo le enega antibiotika preverimo uspešnost transformacije celice z do 5 plazmidi, ter poseben sistem delitve celic, ki zagotavlja, da se plazmidi z nizkim številom kopij med delitvijo ne izgubijo.<br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> &lt;references /&gt;</div>

MojcaH https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=SynORI_%E2%80%93_ogrodje_za_ve%C4%8Dplazmidne_sisteme&diff=13820 2018-01-21T20:25:02Z

<p>MojcaH: </p> <hr /> <div>Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania SynORI] (Vilna - Litva) iz tekmovanja iGEM 2017.<br /> <br /> Avtorica: Mojca Hunski<br /> <br /> <br /> Raziskovalci se v genskem inženirstvu pri delu s plazmidi velikokrat srečajo s težavami, kot so nizko število kopij plazmida v celici ter nezmožnost sočasnega obstoja dveh ali več plazmidov v isti celici v odsotnosti selekcijskega pritiska (nekompatibilnost skupin plazmidov). Rešitev so v svojem projektu, poimenovanem SynORI, tj. sintetični ORI (mesto začetka replikacije), na tekmovanju iGEM 2017 predstavili študentje iz Vilne. Ustvarili so ogrodje, ki raziskovalcem omogoča lasten nadzor nad številom kopij določenega plazmida ter izbiro števila skupin plazmidov v celici, ki bodo med sabo kompatibilne.&lt;ref&gt;http://2017.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania (21. 1. 2018)&lt;/ref&gt; <br /> <br /> == Lasten nadzor nad številom kopij plazmida ==<br /> <br /> Plazmidi običajno dajejo gostiteljski celici marsikatero uporabno lastnost ali funkcijo (npr. odpornost na antibiotike in dodatne presnovne poti), lahko pa predstavljajo za celico tudi veliko breme, če je njihovo število kopij previsoko. Prav tako je pomembno, da se med delitvijo celic ne izgubijo, zato je nujno potrebno uravnavanje podvojevanja plazmidov.&lt;ref&gt;G. del Solar, M. Espinosa. &quot;Plasmid copy number control: an ever-growing story.&quot; Molecular Microbiology 2000, 37 (3), 492-500.&lt;/ref&gt; Različni plazmidi imajo različne načine regulacije podvojevanja ter so lahko v celici v visokem ali nizkem številu kopij. Študentje zmagovalne ekipe so se osredotočili na naravni plazmid ''E. coli'' ColE1, katerega uravnavanje podvojevanja poteka preko nastanka kompleksa med dvema komplementarnima kratkima molekulama RNA (RNA I in RNA II).<br /> <br /> === ColE1 ===<br /> <br /> Podvojevanje plazmida ColE1 se prične s prepisovanjem gena za RNA II, katerega konstitutivni promotor se nahaja 555 bp navzgor od mesta ORI. RNA II se zvije v kompleksno sekundarno strukturo, sestavljeno iz več zgradb steblo-zanka, kar omogoči tvorbo stabilnega kompleksa z matrično DNA na mestu ORI. Encim RNazaH nato napade novonastali hibrid in cepi molekulo RNA II na 3'-koncu, da se izpostavi hidroksilna skupina, da lahko tako RNA II služi kot začetni oligonukleotid za DNA polimerazo I pri sintezi vodilne verige.<br /> <br /> Uravnavanje števila kopij plazmida poteka s kratko nekodirajočo RNA I, ki inhibira RNA II. Transkripcija gena za RNA I se prične 445 bp navzgor od mesta ORI in poteka v nasprotni smeri, kot poteka transkripcija gena za RNA II, tako da je RNA I v celoti komplementarna 5'-koncu RNA II in se lahko veže nanjo. S tem se spremeni sekundarna struktura RNA II, ki posledično ne more več tvoriti stabilnega kompleksa z DNA na mestu ORI in je tudi RNazaH ne more cepiti. Inhibicija je dodatno ojačana še s proteinom Rop, ki se veže na začetni kompleks RNA I-RNA II in ga stabilizira. Višje, kot je število kopij plazmida, večja je koncentracija RNA I v celici in tako je podvojevanje ustavljeno. &lt;ref&gt;T. Itoh, J. Tomizawa.(1980) &quot;Formation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H.&quot; Proc Natl Acad Sci USA 1980, 77, 2450–2454.&lt;/ref&gt; &lt;ref&gt;J. Tomizawa ''et al''. &quot;Inhibition of ColE1 RNA primer formation by a plasmid-specified small RNA.&quot; Proc Natl Acad Sci USA 1981, 78, 1421–1425.&lt;/ref&gt;<br /> <br /> === Modeliranje in eksperiment ===<br /> <br /> Cilj ekipe je bil pripraviti ogrodje, s katerim bi lahko vsak raziskovalec enostavno spreminjal/reguliral število kopij plazmida po lastnih potrebah. To so storili tako, da so najprej popolnoma dezaktivirali promotor za RNA I, zapis za RNA I pa potem skupaj z izbranim promotorjem vstavili poleg gena za RNA II.<br /> <br /> Promotor za RNA I (pRNAI) je komplementaren ravno tistemu delu zapisa za RNA II, ki je ključen za tvorbo sekundarnih struktur, pomembnih pri nastanku kompleksa z DNA in posledično pri začetku podvojevanja. S spreminjanjem nukleotidnega zaporedja pRNAI se tako spreminja tudi sekundarna zgradba RNA II, zato so študentje s podatki iz literature in z računalniškimi analizami izbrali 5 takšnih mutiranih zaporedij za pRNAI, ki ne bi povzročila večjih sprememb v sekundarni strukturi RNA II in bi hkrati imela najnižjo afiniteto za RNA polimerazo. Za določitev, katero izmed mutiranih zaporedij najbolje ustreza pogojem, so najprej celice transformirali z nemutiranim (wt) plazmidom oziroma s plazmidom z mutiranim pRNAI ter po inkubaciji določili število kopij plazmida (PCN) na celico s kvantitativnim PCR. Mutirane plazmide so izolirali in v njih vstavili še wt zapis za RNAI skupaj z wt pRNAI. Po transformaciji in inkubaciji so ponovno določili PCN. Za nadaljnje delo so izbrali tisto mutirano zaporedje, kjer je bila razlika med PCN celic z wt plazmidom in celic z mutiranim pRNAI največja, razlika med PCN celicah z wt plazmidom ter celic z mutiranim pRNAI in nemutiranim genom pa najmanjša. To zaporedje so poimenovali kar RNA II in pripravili tudi biokocko ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2259000 BBa_K2259000]).<br /> <br /> Nato so preverili, ali lahko s spreminjanjem moči promotorja za RNA I vplivajo na PCN. Poleg novega konstrukta RNA II so vstavili gen za RNA I pod kontrolo različnih Andersonovih konstitutivnih promotorjev. Z eksperimenti so potrdili hipotezo, da močnejši promotor v primerjavi z nemutiranim pRNA I povzroči zmanjšanje, šibkejši pa povečanje PCN. Podoben eksperiment so naredili z uporabo inducibilnega ramnoznega promotorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K914003 BBa_K914003]), le da so v tem primeru spreminjali koncentracijo ramnoze v gojišču. Hipotezo, da se z večanjem koncentracije ramnoze v gojišču PCN znižuje, so potrdili, kljub temu pa izbira ramnoznega promotorja ni bila najboljša, saj so že nizke koncentracije ramnoze v gojišču povzročile zmanjšanje PCN na le nekaj kopij, prav tako pa je prišlo do velikega zmanjšanja PCN tudi v gojišču brez ramnoze. Študentje so z ekperimenti tako dokazali, da lahko z njihovo napravo SynORI ter z izbiro ustreznega promotorja sami nadzorujemo in po želji izberemo število kopij plazmida v celici.<br /> <br /> == (Ne)kompatibilnostne skupine plazmidov ==<br /> <br /> V celici je lahko hkrati več kot 1 tip plazmida, ki morajo biti med sabo kompatibilni. Če pa vnos dodatnega plazmida v celice, ki že vsebujejo nek plazmid, povzroči destabilizacijo predhodno prisotnega plazmida, sta plazmida nekompatibilna. Običajno je vzrok za nekompatibilnost enak mehanizem kontrole replikacije med različnimi tipi plazmidov, kar lahko povzroči izgubo enega plazmida (predvsem tistega z nizkim številom kopij) skozi več generacij.<br /> <br /> === Eksperiment ===<br /> <br /> Študentje so si za naslednji cilj pri projektu zadali pripravo različnih kompatibilnih tipov plazmidov, ki bi sicer imeli enak mehanizem kontrole podvojevanja, ampak bi bil vsak tip specifičen zase. Znano je, da so za inhibicijo podvojevanja plazmida ColE1 najbolj pomembne medsebojne interakcije molekul RNA I in RNA II le med tremi zankami. S spreminjanjem zaporedij za zanke RNA I in RNA II, ki bi bila specifična za določen tip, bi ustvarili nove različne tipe plazmidov, ki pa bi bili med sabo kompatibilni, saj ne bi prišlo do tvorbe kompleksov med molekulami RNA različnih plazmidov. Zaradi predhodne dezaktivacije pRNAI ter vstavljanja gena za RNA I na drugo mesto ni nujno potrebno, da sta molekuli RNA popolnoma komplementarni med sabo.<br /> <br /> Iz podatkov iz literature &lt;ref&gt;W. W. Grabow ''et al''. &quot;Self-assembling RNA nanorings based on RNAI/II inverse kissing complexes.&quot; Nano Lett 2011,11(2), 878–87.&lt;/ref&gt; (so pridobili različne kombinacije zaporedij zank RNA I in RNA II, ki lahko med sabo tvorijo komplekse. Izbrali 5 različnih zaporedij RNA II (5 skupin), ki so imela mutirana zaporedja le za prvi dve zanki. Z mutiranjem tretje zanke bi namreč lahko povzročili motnje v začetku replikacije, saj je sekundarna struktura RNA II zelo občutljiva na mutacije v tem delu. Za RNA I pa so izbrali 10 različnih zaporedij (5 skupin s po dvema zaporedjema, ki sta se razlikovala samo v zapisu za tretjo zanko). <br /> <br /> Najprej so preverili, kako vpliva samo sprememba zaporedja RNA II na PCN, in izločili iz eksperimenta tista zaporedja, ki so povzročila veliko zmanjšanje PCN, saj je to pomenilo, da je prišlo do spremembe sekundarne strukture RNA II in posledično ni mogla služiti kot začetnik replikacije. Nato so v te plazmide vstavili še ustrezna zaporedja za RNA I (na enem plazmidu zapisa za RNA I in II iz iste skupine) ter preverili, ali je prišlo do inhibicije podvojevanja (cis-delovanje).<br /> <br /> Nato so zaporedja za RNA II ter zaporedja za RNA I ločeno vstavili v dva različna plazmida (RNA II v [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2259081 BBa_K2259081] ter RNA I v [http://parts.igem.org/Part:pSB4A5 pSB4A5]) ter transformirali celice s kombinacijami dveh različnih plazmidov. S tem so želeli ugotoviti, ali in pri katerih kombinacijah skupin je prišlo do zmanjšanja PCN (trans-delovanje). Le-te skupine so med sabo nekompatibilne. Pri projektu so uspešno pridobili dve kombinaciji skupin, ki pa sta bili med sabo kompatibilni. Nato so že s predhodno pripravljenimi plazmidi, ki so vsebovali zapisa za RNA I in RNA II iz ene skupine, transformirali celice skupaj z domnevno kompatibilnimi plazmidi z zapisom iz druge skupine ter določili PCN. Ker ni prišlo do zmanjšanja PCN pri nobeni skupini, so tako še enkrat potrdili, da je eksperiment uspel in da gre res za kompatibilni skupini.<br /> <br /> == Zaključek ==<br /> <br /> Litovski študentje so v celoti uspešno izpeljali projekt SynORI, za katerega so prejeli tudi veliko nagrado v skupini projektov dodiplomskih študentov. Pripravili so novo standardizirano ogrodje za večplazmidne sisteme, ki raziskovalcem omogoča veliko svobode pri uravnavanju podvojevanja plazmidov. Dodatno pa to ogrodje vključuje še možnost uporabe selekcijskega sistema, s katerim lahko z uporabo le enega antibiotika preverimo uspešnost transformacije celice z do 5 plazmidi, ter poseben sistem delitve celic, ki zagotavlja, da se plazmidi z nizkim številom kopij med delitvijo ne izgubijo.<br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> &lt;references /&gt;</div>

MojcaH https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=SynORI_%E2%80%93_ogrodje_za_ve%C4%8Dplazmidne_sisteme&diff=13819 2018-01-21T20:23:28Z

<p>MojcaH: </p> <hr /> <div>Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania SynORI] (Vilna - Litva) iz tekmovanja iGEM 2017.<br /> <br /> Avtorica: Mojca Hunski<br /> <br /> <br /> Raziskovalci se v genskem inženirstvu pri delu s plazmidi velikokrat srečajo s težavami, kot so nizko število kopij plazmida v celici ter nezmožnost sočasnega obstoja dveh ali več plazmidov v isti celici v odsotnosti selekcijskega pritiska (nekompatibilnost skupin plazmidov). Rešitev so v svojem projektu, poimenovanem SynORI, tj. sintetični ORI (mesto začetka replikacije), na tekmovanju iGEM 2017 predstavili študentje iz Vilne. Ustvarili so ogrodje, ki raziskovalcem omogoča lasten nadzor nad številom kopij določenega plazmida ter izbiro števila skupin plazmidov v celici, ki bodo med sabo kompatibilne.&lt;ref&gt;http://2017.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania (21. 1. 2018)&lt;/ref&gt; <br /> <br /> == Lasten nadzor nad številom kopij plazmida ==<br /> <br /> Plazmidi običajno dajejo gostiteljski celici marsikatero uporabno lastnost ali funkcijo (npr. odpornost na antibiotike in dodatne presnovne poti), lahko pa predstavljajo za celico tudi veliko breme, če je njihovo število kopij previsoko. Prav tako je pomembno, da se med delitvijo celic ne izgubijo, zato je nujno potrebno uravnavanje podvojevanja plazmidov.&lt;ref&gt;G. del Solar, M. Espinosa. &quot;Plasmid copy number control: an ever-growing story.&quot; Molecular Microbiology 2000, 37 (3), 492-500.&lt;/ref&gt; Različni plazmidi imajo različne načine regulacije podvojevanja ter so lahko v celici v visokem ali nizkem številu kopij. Študentje zmagovalne ekipe so se osredotočili na naravni plazmid ''E. coli'' ColE1, katerega uravnavanje podvojevanja poteka preko nastanka kompleksa med dvema komplementarnima kratkima molekulama RNA (RNA I in RNA II).<br /> <br /> === ColE1 ===<br /> <br /> Podvojevanje plazmida ColE1 se prične s prepisovanjem gena za RNA II, katerega konstitutivni promotor se nahaja 555 bp navzgor od mesta ORI. RNA II se zvije v kompleksno sekundarno strukturo, sestavljeno iz več zgradb steblo-zanka, kar omogoči tvorbo stabilnega kompleksa z matrično DNA na mestu ORI. Encim RNazaH nato napade novonastali hibrid in cepi molekulo RNA II na 3'-koncu, da se izpostavi hidroksilna skupina, da lahko tako RNA II služi kot začetni oligonukleotid za DNA polimerazo I pri sintezi vodilne verige.<br /> <br /> Uravnavanje števila kopij plazmida poteka s kratko nekodirajočo RNA I, ki inhibira RNA II. Transkripcija gena za RNA I se prične 445 bp navzgor od mesta ORI in poteka v nasprotni smeri, kot poteka transkripcija gena za RNA II, tako da je RNA I v celoti komplementarna 5'-koncu RNA II in se lahko veže nanjo. S tem se spremeni sekundarna struktura RNA II, ki posledično ne more več tvoriti stabilnega kompleksa z DNA na mestu ORI in je tudi RNazaH ne more cepiti. Inhibicija je dodatno ojačana še s proteinom Rop, ki se veže na začetni kompleks RNA I-RNA II in ga stabilizira. Višje, kot je število kopij plazmida, večja je koncentracija RNA I v celici in tako je podvojevanje ustavljeno. &lt;ref&gt;T. Itoh, J. Tomizawa.(1980) &quot;Formation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H.&quot; Proc Natl Acad Sci USA 1980, 77, 2450–2454.&lt;/ref&gt; &lt;ref&gt;J. Tomizawa et al. &quot;Inhibition of ColE1 RNA primer formation by a plasmid-specified small RNA.&quot; Proc Natl Acad Sci USA 1981, 78, 1421–1425.&lt;/ref&gt;<br /> <br /> === Modeliranje in eksperiment ===<br /> <br /> Cilj ekipe je bil pripraviti ogrodje, s katerim bi lahko vsak raziskovalec enostavno spreminjal/reguliral število kopij plazmida po lastnih potrebah. To so storili tako, da so najprej popolnoma dezaktivirali promotor za RNA I, zapis za RNA I pa potem skupaj z izbranim promotorjem vstavili poleg gena za RNA II.<br /> <br /> Promotor za RNA I (pRNAI) je komplementaren ravno tistemu delu zapisa za RNA II, ki je ključen za tvorbo sekundarnih struktur, pomembnih pri nastanku kompleksa z DNA in posledično pri začetku podvojevanja. S spreminjanjem nukleotidnega zaporedja pRNAI se tako spreminja tudi sekundarna zgradba RNA II, zato so študentje s podatki iz literature in z računalniškimi analizami izbrali 5 takšnih mutiranih zaporedij za pRNAI, ki ne bi povzročila večjih sprememb v sekundarni strukturi RNA II in bi hkrati imela najnižjo afiniteto za RNA polimerazo. Za določitev, katero izmed mutiranih zaporedij najbolje ustreza pogojem, so najprej celice transformirali z nemutiranim (wt) plazmidom oziroma s plazmidom z mutiranim pRNAI ter po inkubaciji določili število kopij plazmida (PCN) na celico s kvantitativnim PCR. Mutirane plazmide so izolirali in v njih vstavili še wt zapis za RNAI skupaj z wt pRNAI. Po transformaciji in inkubaciji so ponovno določili PCN. Za nadaljnje delo so izbrali tisto mutirano zaporedje, kjer je bila razlika med PCN celic z wt plazmidom in celic z mutiranim pRNAI največja, razlika med PCN celicah z wt plazmidom ter celic z mutiranim pRNAI in nemutiranim genom pa najmanjša. To zaporedje so poimenovali kar RNA II in pripravili tudi biokocko ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2259000 BBa_K2259000]).<br /> <br /> Nato so preverili, ali lahko s spreminjanjem moči promotorja za RNA I vplivajo na PCN. Poleg novega konstrukta RNA II so vstavili gen za RNA I pod kontrolo različnih Andersonovih konstitutivnih promotorjev. Z eksperimenti so potrdili hipotezo, da močnejši promotor v primerjavi z nemutiranim pRNA I povzroči zmanjšanje, šibkejši pa povečanje PCN. Podoben eksperiment so naredili z uporabo inducibilnega ramnoznega promotorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K914003 BBa_K914003]), le da so v tem primeru spreminjali koncentracijo ramnoze v gojišču. Hipotezo, da se z večanjem koncentracije ramnoze v gojišču PCN znižuje, so potrdili, kljub temu pa izbira ramnoznega promotorja ni bila najboljša, saj so že nizke koncentracije ramnoze v gojišču povzročile zmanjšanje PCN na le nekaj kopij, prav tako pa je prišlo do velikega zmanjšanja PCN tudi v gojišču brez ramnoze. Študentje so z ekperimenti tako dokazali, da lahko z njihovo napravo SynORI ter z izbiro ustreznega promotorja sami nadzorujemo in po želji izberemo število kopij plazmida v celici.<br /> <br /> == (Ne)kompatibilnostne skupine plazmidov ==<br /> <br /> V celici je lahko hkrati več kot 1 tip plazmida, ki morajo biti med sabo kompatibilni. Če pa vnos dodatnega plazmida v celice, ki že vsebujejo nek plazmid, povzroči destabilizacijo predhodno prisotnega plazmida, sta plazmida nekompatibilna. Običajno je vzrok za nekompatibilnost enak mehanizem kontrole replikacije med različnimi tipi plazmidov, kar lahko povzroči izgubo enega plazmida (predvsem tistega z nizkim številom kopij) skozi več generacij.<br /> <br /> === Eksperiment ===<br /> <br /> Študentje so si za naslednji cilj pri projektu zadali pripravo različnih kompatibilnih tipov plazmidov, ki bi sicer imeli enak mehanizem kontrole podvojevanja, ampak bi bil vsak tip specifičen zase. Znano je, da so za inhibicijo podvojevanja plazmida ColE1 najbolj pomembne medsebojne interakcije molekul RNA I in RNA II le med tremi zankami. S spreminjanjem zaporedij za zanke RNA I in RNA II, ki bi bila specifična za določen tip, bi ustvarili nove različne tipe plazmidov, ki pa bi bili med sabo kompatibilni, saj ne bi prišlo do tvorbe kompleksov med molekulami RNA različnih plazmidov. Zaradi predhodne dezaktivacije pRNAI ter vstavljanja gena za RNA I na drugo mesto ni nujno potrebno, da sta molekuli RNA popolnoma komplementarni med sabo.<br /> <br /> Iz podatkov iz literature &lt;ref&gt;W. W. Grabow et al. &quot;Self-assembling RNA nanorings based on RNAI/II inverse kissing complexes.&quot; Nano Lett 2011,11(2), 878–87.&lt;/ref&gt; (so pridobili različne kombinacije zaporedij zank RNA I in RNA II, ki lahko med sabo tvorijo komplekse. Izbrali 5 različnih zaporedij RNA II (5 skupin), ki so imela mutirana zaporedja le za prvi dve zanki. Z mutiranjem tretje zanke bi namreč lahko povzročili motnje v začetku replikacije, saj je sekundarna struktura RNA II zelo občutljiva na mutacije v tem delu. Za RNA I pa so izbrali 10 različnih zaporedij (5 skupin s po dvema zaporedjema, ki sta se razlikovala samo v zapisu za tretjo zanko). <br /> <br /> Najprej so preverili, kako vpliva samo sprememba zaporedja RNA II na PCN, in izločili iz eksperimenta tista zaporedja, ki so povzročila veliko zmanjšanje PCN, saj je to pomenilo, da je prišlo do spremembe sekundarne strukture RNA II in posledično ni mogla služiti kot začetnik replikacije. Nato so v te plazmide vstavili še ustrezna zaporedja za RNA I (na enem plazmidu zapisa za RNA I in II iz iste skupine) ter preverili, ali je prišlo do inhibicije podvojevanja (cis-delovanje).<br /> <br /> Nato so zaporedja za RNA II ter zaporedja za RNA I ločeno vstavili v dva različna plazmida (RNA II v [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2259081 BBa_K2259081] ter RNA I v [http://parts.igem.org/Part:pSB4A5 pSB4A5]) ter transformirali celice s kombinacijami dveh različnih plazmidov. S tem so želeli ugotoviti, ali in pri katerih kombinacijah skupin je prišlo do zmanjšanja PCN (trans-delovanje). Le-te skupine so med sabo nekompatibilne. Pri projektu so uspešno pridobili dve kombinaciji skupin, ki pa sta bili med sabo kompatibilni. Nato so že s predhodno pripravljenimi plazmidi, ki so vsebovali zapisa za RNA I in RNA II iz ene skupine, transformirali celice skupaj z domnevno kompatibilnimi plazmidi z zapisom iz druge skupine ter določili PCN. Ker ni prišlo do zmanjšanja PCN pri nobeni skupini, so tako še enkrat potrdili, da je eksperiment uspel in da gre res za kompatibilni skupini.<br /> <br /> == Zaključek ==<br /> <br /> Litovski študentje so v celoti uspešno izpeljali projekt SynORI, za katerega so prejeli tudi veliko nagrado v skupini projektov dodiplomskih študentov. Pripravili so novo standardizirano ogrodje za večplazmidne sisteme, ki raziskovalcem omogoča veliko svobode pri uravnavanju podvojevanja plazmidov. Dodatno pa to ogrodje vključuje še možnost uporabe selekcijskega sistema, s katerim lahko z uporabo le enega antibiotika preverimo uspešnost transformacije celice z do 5 plazmidi, ter poseben sistem delitve celic, ki zagotavlja, da se plazmidi z nizkim številom kopij med delitvijo ne izgubijo.<br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> &lt;references /&gt;</div>

MojcaH https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=SynORI_%E2%80%93_ogrodje_za_ve%C4%8Dplazmidne_sisteme&diff=13818 2018-01-21T20:20:55Z

<p>MojcaH: </p> <hr /> <div>Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania SynORI] (Vilna - Litva) iz tekmovanja iGEM 2017.<br /> <br /> Avtorica: Mojca Hunski<br /> <br /> <br /> Raziskovalci se v genskem inženirstvu pri delu s plazmidi velikokrat srečajo s težavami, kot so nizko število kopij plazmida v celici ter nezmožnost sočasnega obstoja dveh ali več plazmidov v isti celici v odsotnosti selekcijskega pritiska (nekompatibilnost skupin plazmidov). Rešitev so v svojem projektu, poimenovanem SynORI, tj. sintetični ORI (mesto začetka replikacije), na tekmovanju iGEM 2017 predstavili študentje iz Vilne. Ustvarili so ogrodje, ki raziskovalcem omogoča lasten nadzor nad številom kopij določenega plazmida ter izbiro števila skupin plazmidov v celici, ki bodo med sabo kompatibilne.&lt;ref&gt;http://2017.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania (21. 1. 2018)&lt;/ref&gt; <br /> <br /> == Lasten nadzor nad številom kopij plazmida ==<br /> <br /> Plazmidi običajno dajejo gostiteljski celici marsikatero uporabno lastnost ali funkcijo (npr. odpornost na antibiotike in dodatne presnovne poti), lahko pa predstavljajo za celico tudi veliko breme, če je njihovo število kopij previsoko. Prav tako je pomembno, da se med delitvijo celic ne izgubijo, zato je nujno potrebno uravnavanje podvojevanja plazmidov.&lt;ref&gt;G. del Solar, M. Espinosa. &quot;Plasmid copy number control: an ever-growing story.&quot; Molecular Microbiology 2000, 37 (3), 492-500.&lt;/ref&gt; Različni plazmidi imajo različne načine regulacije podvojevanja ter so lahko v celici v visokem ali nizkem številu kopij. Študentje zmagovalne ekipe so se osredotočili na naravni plazmid ''E. coli'' ColE1, katerega uravnavanje podvojevanja poteka preko nastanka kompleksa med dvema komplementarnima kratkima molekulama RNA (RNA I in RNA II).<br /> <br /> === ColE1 ===<br /> <br /> Podvojevanje plazmida ColE1 se prične s prepisovanjem gena za RNA II, katerega konstitutivni promotor se nahaja 555 bp navzgor od mesta ORI. RNA II se zvije v kompleksno sekundarno strukturo, sestavljeno iz več zgradb steblo-zanka, kar omogoči tvorbo stabilnega kompleksa z matrično DNA na mestu ORI. Encim RNazaH nato napade novonastali hibrid in cepi molekulo RNA II na 3'-koncu, da se izpostavi hidroksilna skupina, da lahko tako RNA II služi kot začetni oligonukleotid za DNA polimerazo I pri sintezi vodilne verige.<br /> <br /> Uravnavanje števila kopij plazmida poteka s kratko nekodirajočo RNA I, ki inhibira RNA II. Transkripcija gena za RNA I se prične 445 bp navzgor od mesta ORI in poteka v nasprotni smeri, kot poteka transkripcija gena za RNA II, tako da je RNA I v celoti komplementarna 5'-koncu RNA II in se lahko veže nanjo. S tem se spremeni sekundarna struktura RNA II, ki posledično ne more več tvoriti stabilnega kompleksa z DNA na mestu ORI in je tudi RNazaH ne more cepiti. Inhibicija je dodatno ojačana še s proteinom Rop, ki se veže na začetni kompleks RNA I-RNA II in ga stabilizira. Višje, kot je število kopij plazmida, večja je koncentracija RNA I v celici in tako je podvojevanje ustavljeno. &lt;ref&gt;T. Itoh, J. Tomizawa.(1980) &quot;Formation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H.&quot; Proc Natl Acad Sci USA 1980, 77, 2450–2454.&lt;/ref&gt; &lt;ref&gt;J. Tomizawa et al. &quot;Inhibition of ColE1 RNA primer formation by a plasmid-specified small RNA.&quot; Proc Natl Acad Sci USA 1981, 78, 1421–1425.&lt;/ref&gt;<br /> <br /> === Modeliranje in eksperiment ===<br /> <br /> Cilj ekipe je bil pripraviti ogrodje, s katerim bi lahko vsak raziskovalec enostavno spreminjal/reguliral število kopij plazmida po lastnih potrebah. To so storili tako, da so najprej popolnoma dezaktivirali promotor za RNA I, zapis za RNA I pa potem skupaj z izbranim promotorjem vstavili poleg gena za RNA II.<br /> <br /> Promotor za RNA I (pRNAI) je komplementaren ravno tistemu delu zapisa za RNA II, ki je ključen za tvorbo sekundarnih struktur, pomembnih pri nastanku kompleksa z DNA in posledično pri začetku podvojevanja. S spreminjanjem nukleotidnega zaporedja pRNAI se tako spreminja tudi sekundarna zgradba RNA II, zato so študentje s podatki iz literature in z računalniškimi analizami izbrali 5 takšnih mutiranih zaporedij za pRNAI, ki ne bi povzročila večjih sprememb v sekundarni strukturi RNA II in bi hkrati imela najnižjo afiniteto za RNA polimerazo. Za določitev, katero izmed mutiranih zaporedij najbolje ustreza pogojem, so najprej celice transformirali z nemutiranim (wt) plazmidom oziroma s plazmidom z mutiranim pRNAI ter po inkubaciji določili število kopij plazmida (PCN) na celico s kvantitativnim PCR. Mutirane plazmide so izolirali in v njih vstavili še wt zapis za RNAI skupaj z wt pRNAI. Po transformaciji in inkubaciji so ponovno določili PCN. Za nadaljnje delo so izbrali tisto mutirano zaporedje, kjer je bila razlika med PCN celic z wt plazmidom in celic z mutiranim pRNAI največja, razlika med PCN celicah z wt plazmidom ter celic z mutiranim pRNAI in nemutiranim genom pa najmanjša. To zaporedje so poimenovali kar RNA II in pripravili tudi biokocko ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K2259000 BBa_K2259000]).<br /> <br /> Nato so preverili, ali lahko s spreminjanjem moči promotorja za RNA I vplivajo na PCN. Poleg novega konstrukta RNA II so vstavili gen za RNA I pod kontrolo različnih Andersonovih konstitutivnih promotorjev. Z eksperimenti so potrdili hipotezo, da močnejši promotor v primerjavi z nemutiranim pRNA I povzroči zmanjšanje, šibkejši pa povečanje PCN. Podoben eksperiment so naredili z uporabo inducibilnega ramnoznega promotorja ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K914003 BBa_K914003]), le da so v tem primeru spreminjali koncentracijo ramnoze v gojišču. Hipotezo, da se z večanjem koncentracije ramnoze v gojišču PCN znižuje, so potrdili, kljub temu pa izbira ramnoznega promotorja ni bila najboljša, saj so že nizke koncentracije ramnoze v gojišču povzročile zmanjšanje PCN na le nekaj kopij, prav tako pa je prišlo do velikega zmanjšanja PCN tudi v gojišču brez ramnoze. Študentje so z ekperimenti tako dokazali, da lahko z njihovo napravo SynORI ter z izbiro ustreznega promotorja sami nadzorujemo in po želji izberemo število kopij plazmida v celici.<br /> <br /> == (Ne)kompatibilnostne skupine plazmidov ==<br /> <br /> V celici je lahko hkrati več kot 1 tip plazmida, ki morajo biti med sabo kompatibilni. Če pa vnos dodatnega plazmida v celice, ki že vsebujejo nek plazmid, povzroči destabilizacijo predhodno prisotnega plazmida, sta plazmida nekompatibilna. Običajno je vzrok za nekompatibilnost enak mehanizem kontrole replikacije med različnimi tipi plazmidov, kar lahko povzroči izgubo enega plazmida (predvsem tistega z nizkim številom kopij) skozi več generacij.<br /> <br /> === Eksperiment ===<br /> <br /> Študentje so si za naslednji cilj pri projektu zadali pripravo različnih kompatibilnih tipov plazmidov, ki bi sicer imeli enak mehanizem kontrole podvojevanja, ampak bi bil vsak tip specifičen zase. Znano je, da so za inhibicijo podvojevanja plazmida ColE1 najbolj pomembne medsebojne interakcije molekul RNA I in RNA II le med tremi zankami. S spreminjanjem zaporedij za zanke RNA I in RNA II, ki bi bila specifična za določen tip, bi ustvarili nove različne tipe plazmidov, ki pa bi bili med sabo kompatibilni, saj ne bi prišlo do tvorbe kompleksov med molekulami RNA različnih plazmidov. Zaradi predhodne dezaktivacije pRNAI ter vstavljanja gena za RNA I na drugo mesto ni nujno potrebno, da sta molekuli RNA popolnoma komplementarni med sabo.<br /> <br /> Iz podatkov iz literature &lt;ref&gt;W. W. Grabow et al. &quot;Self-assembling RNA nanorings based on RNAI/II inverse kissing complexes.&quot; Nano Lett 2011,11(2), 878–87.&lt;/ref&gt; (so pridobili različne kombinacije zaporedij zank RNA I in RNA II, ki lahko med sabo tvorijo komplekse. Izbrali 5 različnih zaporedij RNA II (5 skupin), ki so imela mutirana zaporedja le za prvi dve zanki. Z mutiranjem tretje zanke bi namreč lahko povzročili motnje v začetku replikacije, saj je sekundarna struktura RNA II zelo občutljiva na mutacije v tem delu. Za RNA I pa so izbrali 10 različnih zaporedij (5 skupin s po dvema zaporedjema, ki sta se razlikovala samo v zapisu za tretjo zanko). <br /> <br /> Najprej so preverili, kako vpliva samo sprememba zaporedja RNA II na PCN, in izločili iz eksperimenta tista zaporedja, ki so povzročila veliko zmanjšanje PCN, saj je to pomenilo, da je prišlo do spremembe sekundarne strukture RNA II in posledično ni mogla služiti kot začetnik replikacije. Nato so v te plazmide vstavili še ustrezna zaporedja za RNA I (na enem plazmidu zapisa za RNA I in II iz iste skupine) ter preverili, ali je prišlo do inhibicije podvojevanja (cis-delovanje).<br /> <br /> Nato so zaporedja za RNA II ter zaporedja za RNA I ločeno vstavili v dva različna plazmida (RNA II v BBa_K2259081 ter RNA I v pSB4A5) ter transformirali celice s kombinacijami dveh različnih plazmidov. S tem so želeli ugotoviti, ali in pri katerih kombinacijah skupin je prišlo do zmanjšanja PCN (trans-delovanje). Le-te skupine so med sabo nekompatibilne. Pri projektu so uspešno pridobili dve kombinaciji skupin, ki pa sta bili med sabo kompatibilni. Nato so že s predhodno pripravljenimi plazmidi, ki so vsebovali zapisa za RNA I in RNA II iz ene skupine, transformirali celice skupaj z domnevno kompatibilnimi plazmidi z zapisom iz druge skupine ter določili PCN. Ker ni prišlo do zmanjšanja PCN pri nobeni skupini, so tako še enkrat potrdili, da je eksperiment uspel in da gre res za kompatibilni skupini.<br /> <br /> == Zaključek ==<br /> <br /> Litovski študentje so v celoti uspešno izpeljali projekt SynORI, za katerega so prejeli tudi veliko nagrado v skupini projektov dodiplomskih študentov. Pripravili so novo standardizirano ogrodje za večplazmidne sisteme, ki raziskovalcem omogoča veliko svobode pri uravnavanju podvojevanja plazmidov. Dodatno pa to ogrodje vključuje še možnost uporabe selekcijskega sistema, s katerim lahko z uporabo le enega antibiotika preverimo uspešnost transformacije celice z do 5 plazmidi, ter poseben sistem delitve celic, ki zagotavlja, da se plazmidi z nizkim številom kopij med delitvijo ne izgubijo.<br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> &lt;references /&gt;</div>

MojcaH https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=SynORI_%E2%80%93_ogrodje_za_ve%C4%8Dplazmidne_sisteme&diff=13815 2018-01-21T20:01:35Z

<p>MojcaH: </p> <hr /> <div>Povzeto po projektu [http://2017.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania SynORI] (Vilna - Litva) iz tekmovanja iGEM 2017.<br /> <br /> Avtorica: Mojca Hunski<br /> <br /> <br /> Raziskovalci se v genskem inženirstvu pri delu s plazmidi velikokrat srečajo s težavami, kot so nizko število kopij plazmida v celici ter nezmožnost sočasnega obstoja dveh ali več plazmidov v isti celici v odsotnosti selekcijskega pritiska (nekompatibilnost skupin plazmidov). Rešitev so v svojem projektu, poimenovanem SynORI, tj. sintetični ORI (mesto začetka replikacije), na tekmovanju iGEM 2017 predstavili študentje iz Vilne. Ustvarili so ogrodje, ki raziskovalcem omogoča lasten nadzor nad številom kopij določenega plazmida ter izbiro števila skupin plazmidov v celici, ki bodo med sabo kompatibilne.&lt;ref&gt;http://2017.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania (21. 1. 2018)&lt;/ref&gt; <br /> <br /> == Lasten nadzor nad številom kopij plazmida ==<br /> <br /> Plazmidi običajno dajejo gostiteljski celici marsikatero uporabno lastnost ali funkcijo (npr. odpornost na antibiotike in dodatne presnovne poti), lahko pa predstavljajo za celico tudi veliko breme, če je njihovo število kopij previsoko. Prav tako je pomembno, da se med delitvijo celic ne izgubijo, zato je nujno potrebno uravnavanje podvojevanja plazmidov.&lt;ref&gt;G. del Solar, M. Espinosa. »Plasmid copy number control: an ever-growing story.« Molecular Microbiology 2000, 37 (3), 492-500.&lt;/ref&gt; Različni plazmidi imajo različne načine regulacije podvojevanja ter so lahko v celici v visokem ali nizkem številu kopij. Študentje zmagovalne ekipe so se osredotočili na naravni plazmid ''E. coli'' ColE1, katerega uravnavanje podvojevanja poteka preko nastanka kompleksa med dvema komplementarnima kratkima molekulama RNA (RNA I in RNA II).<br /> <br /> === ColE1 ===<br /> <br /> Podvojevanje plazmida ColE1 se prične s prepisovanjem gena za RNA II, katerega konstitutivni promotor se nahaja 555 bp navzgor od mesta ORI. RNA II se zvije v kompleksno sekundarno strukturo, sestavljeno iz več zgradb steblo-zanka, kar omogoči tvorbo stabilnega kompleksa z matrično DNA na mestu ORI. Encim RNazaH nato napade novonastali hibrid in cepi molekulo RNA II na 3'-koncu, da se izpostavi hidroksilna skupina, da lahko tako RNA II služi kot začetni oligonukleotid za DNA polimerazo I pri sintezi vodilne verige.<br /> <br /> Uravnavanje števila kopij plazmida poteka s kratko nekodirajočo RNA I, ki inhibira RNA II. Transkripcija gena za RNA I se prične 445 bp navzgor od mesta ORI in poteka v nasprotni smeri, kot poteka transkripcija gena za RNA II, tako da je RNA I v celoti komplementarna 5'-koncu RNA II in se lahko veže nanjo. S tem se spremeni sekundarna struktura RNA II, ki posledično ne more več tvoriti stabilnega kompleksa z DNA na mestu ORI in je tudi RNazaH ne more cepiti. Inhibicija je dodatno ojačana še s proteinom Rop, ki se veže na začetni kompleks RNA I-RNA II in ga stabilizira. Višje, kot je število kopij plazmida, večja je koncentracija RNA I v celici in tako je podvojevanje ustavljeno.<br /> <br /> === Modeliranje in eksperiment ===<br /> <br /> Cilj ekipe je bil pripraviti ogrodje, s katerim bi lahko vsak raziskovalec enostavno spreminjal/reguliral število kopij plazmida po lastnih potrebah. To so storili tako, da so najprej popolnoma dezaktivirali promotor za RNA I, zapis za RNA I pa potem skupaj z izbranim promotorjem vstavili poleg gena za RNA II.<br /> <br /> Promotor za RNA I (pRNAI) je komplementaren ravno tistemu delu zapisa za RNA II, ki je ključen za tvorbo sekundarnih struktur, pomembnih pri nastanku kompleksa z DNA in posledično pri začetku podvojevanja. S spreminjanjem nukleotidnega zaporedja pRNAI se tako spreminja tudi sekundarna zgradba RNA II, zato so študentje s podatki iz literature in z računalniškimi analizami izbrali 5 takšnih mutiranih zaporedij za pRNAI, ki ne bi povzročila večjih sprememb v sekundarni strukturi RNA II in bi hkrati imela najnižjo afiniteto za RNA polimerazo. Za določitev, katero izmed mutiranih zaporedij najbolje ustreza pogojem, so najprej celice transformirali z nemutiranim (wt) plazmidom oziroma s plazmidom z mutiranim pRNAI ter po inkubaciji določili število kopij plazmida (PCN) na celico s kvantitativnim PCR. Mutirane plazmide so izolirali in v njih vstavili še wt zapis za RNAI skupaj z wt pRNAI. Po transformaciji in inkubaciji so ponovno določili PCN. Za nadaljnje delo so izbrali tisto mutirano zaporedje, kjer je bila razlika med PCN celic z wt plazmidom in celic z mutiranim pRNAI največja, razlika med PCN celicah z wt plazmidom ter celic z mutiranim pRNAI in nemutiranim genom pa najmanjša. To zaporedje so poimenovali kar RNA II in pripravili tudi biokocko (BBa_K2259000).<br /> <br /> Nato so preverili, ali lahko s spreminjanjem moči promotorja za RNA I vplivajo na PCN. Poleg novega konstrukta RNA II so vstavili gen za RNA I pod kontrolo različnih Andersonovih konstitutivnih promotorjev. Z eksperimenti so potrdili hipotezo, da močnejši promotor v primerjavi z nemutiranim pRNA I povzroči zmanjšanje, šibkejši pa povečanje PCN. Podoben eksperiment so naredili z uporabo inducibilnega ramnoznega promotorja (BBa_K914003), le da so v tem primeru spreminjali koncentracijo ramnoze v gojišču. Hipotezo, da se z večanjem koncentracije ramnoze v gojišču PCN znižuje, so potrdili, kljub temu pa izbira ramnoznega promotorja ni bila najboljša, saj so že nizke koncentracije ramnoze v gojišču povzročile zmanjšanje PCN na le nekaj kopij, prav tako pa je prišlo do velikega zmanjšanja PCN tudi v gojišču brez ramnoze. Študentje so z ekperimenti tako dokazali, da lahko z njihovo napravo SynORI ter z izbiro ustreznega promotorja sami nadzorujemo in po želji izberemo število kopij plazmida v celici.<br /> <br /> == (Ne)kompatibilnostne skupine plazmidov ==<br /> <br /> V celici je lahko hkrati več kot 1 tip plazmida, ki morajo biti med sabo kompatibilni. Če pa vnos dodatnega plazmida v celice, ki že vsebujejo nek plazmid, povzroči destabilizacijo predhodno prisotnega plazmida, sta plazmida nekompatibilna. Običajno je vzrok za nekompatibilnost enak mehanizem kontrole replikacije med različnimi tipi plazmidov, kar lahko povzroči izgubo enega plazmida (predvsem tistega z nizkim številom kopij) skozi več generacij.<br /> <br /> === Eksperiment ===<br /> <br /> Študentje so si za naslednji cilj pri projektu zadali pripravo različnih kompatibilnih tipov plazmidov, ki bi sicer imeli enak mehanizem kontrole podvojevanja, ampak bi bil vsak tip specifičen zase. Znano je, da so za inhibicijo podvojevanja plazmida ColE1 najbolj pomembne medsebojne interakcije molekul RNA I in RNA II le med tremi zankami. S spreminjanjem zaporedij za zanke RNA I in RNA II, ki bi bila specifična za določen tip, bi ustvarili nove različne tipe plazmidov, ki pa bi bili med sabo kompatibilni, saj ne bi prišlo do tvorbe kompleksov med molekulami RNA različnih plazmidov. Zaradi predhodne dezaktivacije pRNAI ter vstavljanja gena za RNA I na drugo mesto ni nujno potrebno, da sta molekuli RNA popolnoma komplementarni med sabo.<br /> <br /> Iz podatkov iz literature so pridobili različne kombinacije zaporedij zank RNA I in RNA II, ki lahko med sabo tvorijo komplekse. Izbrali 5 različnih zaporedij RNA II (5 skupin), ki so imela mutirana zaporedja le za prvi dve zanki. Z mutiranjem tretje zanke bi namreč lahko povzročili motnje v začetku replikacije, saj je sekundarna struktura RNA II zelo občutljiva na mutacije v tem delu. Za RNA I pa so izbrali 10 različnih zaporedij (5 skupin s po dvema zaporedjema, ki sta se razlikovala samo v zapisu za tretjo zanko). <br /> <br /> Najprej so preverili, kako vpliva samo sprememba zaporedja RNA II na PCN, in izločili iz eksperimenta tista zaporedja, ki so povzročila veliko zmanjšanje PCN, saj je to pomenilo, da je prišlo do spremembe sekundarne strukture RNA II in posledično ni mogla služiti kot začetnik replikacije. Nato so v te plazmide vstavili še ustrezna zaporedja za RNA I (na enem plazmidu zapisa za RNA I in II iz iste skupine) ter preverili, ali je prišlo do inhibicije podvojevanja (cis-delovanje).<br /> <br /> Nato so zaporedja za RNA II ter zaporedja za RNA I ločeno vstavili v dva različna plazmida (RNA II v BBa_K2259081 ter RNA I v pSB4A5) ter transformirali celice s kombinacijami dveh različnih plazmidov. S tem so želeli ugotoviti, ali in pri katerih kombinacijah skupin je prišlo do zmanjšanja PCN (trans-delovanje). Le-te skupine so med sabo nekompatibilne. Pri projektu so uspešno pridobili dve kombinaciji skupin, ki pa sta bili med sabo kompatibilni. Nato so že s predhodno pripravljenimi plazmidi, ki so vsebovali zapisa za RNA I in RNA II iz ene skupine, transformirali celice skupaj z domnevno kompatibilnimi plazmidi z zapisom iz druge skupine ter določili PCN. Ker ni prišlo do zmanjšanja PCN pri nobeni skupini, so tako še enkrat potrdili, da je eksperiment uspel in da gre res za kompatibilni skupini.<br /> <br /> == Zaključek ==<br /> <br /> Litovski študentje so v celoti uspešno izpeljali projekt SynORI, za katerega so prejeli tudi veliko nagrado v skupini projektov dodiplomskih študentov. Pripravili so novo standardizirano ogrodje za večplazmidne sisteme, ki raziskovalcem omogoča veliko svobode pri uravnavanju podvojevanja plazmidov. Dodatno pa to ogrodje vključuje še možnost uporabe selekcijskega sistema, s katerim lahko z uporabo le enega antibiotika preverimo uspešnost transformacije celice z do 5 plazmidi, ter poseben sistem delitve celic, ki zagotavlja, da se plazmidi z nizkim številom kopij med delitvijo ne izgubijo.<br /> <br /> == Viri ==<br /> <br /> &lt;references /&gt;</div>

MojcaH https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=SynORI_%E2%80%93_ogrodje_za_ve%C4%8Dplazmidne_sisteme&diff=13814 2018-01-21T18:46:48Z

<p>MojcaH: </p> <hr /> <div>Povzeto po projektu SynORI (Vilna - Litva) iz tekmovanja iGEM 2017.<br /> <br /> Avtorica: Mojca Hunski<br /> <br /> <br /> Raziskovalci se v genskem inženirstvu pri delu s plazmidi velikokrat srečajo s težavami, kot so nizko število kopij plazmida v celici ter nezmožnost sočasnega obstoja dveh ali več plazmidov v isti celici v odsotnosti selekcijskega pritiska (nekompatibilnost skupin plazmidov). Rešitev so v svojem projektu, poimenovanem SynORI, tj. sintetični ORI (mesto začetka replikacije), na tekmovanju iGEM 2017 predstavili študentje iz Vilne. Ustvarili so ogrodje, ki raziskovalcem omogoča lasten nadzor nad številom kopij določenega plazmida ter izbiro števila skupin plazmidov v celici, ki bodo med sabo kompatibilne. (1)<br /> <br /> == Lasten nadzor nad številom kopij plazmida ==<br /> <br /> Plazmidi običajno dajejo gostiteljski celici marsikatero uporabno lastnost ali funkcijo (npr. odpornost na antibiotike in dodatne presnovne poti), lahko pa predstavljajo za celico tudi veliko breme, če je njihovo število kopij previsoko. Prav tako je pomembno, da se med delitvijo celic ne izgubijo, zato je nujno potrebno uravnavanje podvojevanja plazmidov. (2) Različni plazmidi imajo različne načine regulacije podvojevanja ter so lahko v celici v visokem ali nizkem številu kopij. Študentje zmagovalne ekipe so se osredotočili na naravni plazmid E.coli ColE1, katerega uravnavanje podvojevanja poteka preko nastanka kompleksa med dvema komplementarnima kratkima molekulama RNA (RNA I in RNA II).<br /> <br /> === ColE1 ===<br /> <br /> Podvojevanje plazmida ColE1 se prične s prepisovanjem gena za RNA II, katerega konstitutivni promotor se nahaja 555 bp navzgor od mesta ORI. RNA II se zvije v kompleksno sekundarno strukturo, sestavljeno iz več zgradb steblo-zanka, kar omogoči tvorbo stabilnega kompleksa z matrično DNA na mestu ORI. Encim RNazaH nato napade novonastali hibrid in cepi molekulo RNA II na 3'-koncu, da se izpostavi hidroksilna skupina, da lahko tako RNA II služi kot začetni oligonukleotid za DNA polimerazo I pri sintezi vodilne verige.<br /> <br /> Uravnavanje števila kopij plazmida poteka s kratko nekodirajočo RNA I, ki inhibira RNA II. Transkripcija gena za RNA I se prične 445 bp navzgor od mesta ORI in poteka v nasprotni smeri, kot poteka transkripcija RNA II, tako da je RNA I v celoti komplementarna 5'-koncu RNA II in se lahko veže nanjo. S tem se spremeni sekundarna struktura RNA II, ki posledično ne more več tvoriti stabilnega kompleksa z DNA na mestu ORI in je tudi RNazaH ne more cepiti. Inhibicija je dodatno ojačana še s proteinom Rop, ki se veže na začetni kompleks RNA I-RNA II in ga stabilizira. Višje, kot je število kopij plazmida, večja je koncentracija RNA I v celici in tako je podvojevanje ustavljeno.<br /> <br /> === Modeliranje in eksperiment ===<br /> <br /> Cilj ekipe je bil pripraviti ogrodje, s katerim bi lahko vsak raziskovalec enostavno spreminjal/reguliral število kopij plazmida po lastnih potrebah. To so storili tako, da so najprej popolnoma dezaktivirali promotor za RNA I, zapis za RNA I pa potem skupaj z izbranim promotorjem vstavili poleg gena za RNA II.<br /> <br /> Promotor za RNA I (pRNAI) je komplementaren ravno tistemu delu zapisa za RNA II, ki je ključen za tvorbo sekundarnih struktur, pomembnih pri nastanku kompleksa z DNA in posledično pri začetku podvojevanja. S spreminjanjem nukleotidnega zaporedja pRNAI se tako spreminja tudi sekundarna zgradba RNA II, zato so študentje s podatki iz literature in z računalniškimi analizami izbrali 5 takšnih mutiranih zaporedij za pRNAI, ki ne bi povzročila večjih sprememb v sekundarni strukturi RNA II in bi hkrati imela najnižjo afiniteto za RNA polimerazo. Za določitev, katero izmed mutiranih zaporedij najbolje ustreza pogojem, so najprej celice transformirali z nemutiranim (wt) plazmidom oziroma s plazmidom z mutiranim pRNAI ter po inkubaciji določili število kopij plazmida (PCN) na celico s kvantitativnim PCR. Mutirane plazmide so izolirali in v njih vstavili še wt zapis za RNAI skupaj z wt pRNAI. Po transformaciji in inkubaciji so ponovno določili PCN. Za nadaljnje delo so izbrali tisto mutirano zaporedje, kjer je bila razlika med PCN celic z wt plazmidom in celic z mutiranim pRNAI največja, razlika med PCN celicah z wt plazmidom ter celic z mutiranim pRNAI in nemutiranim genom pa najmanjša. To zaporedje so poimenovali kar RNA II in pripravili tudi biokocko (Part:BBa_K2259000). Nato so preverili, ali lahko s spreminjanjem moči promotorja za RNA I vplivajo na PCN. Poleg novega konstrukta RNA II so vstavili gen za RNA I pod kontrolo različnih Andersonovih konstitutivnih promotorjev. Z eksperimenti so potrdili hipotezo, da močnejši promotor v primerjavi z nemutiranim pRNA I povzroči zmanjšanje, šibkejši pa povečanje PCN. Podoben eksperiment so naredili z uporabo inducibilnega ramnoznega promotorja (biokocka), le da so v tem primeru spreminjali koncentracijo ramnoze v gojišču. Hipotezo, da se z večanjem koncentracije ramnoze v gojišču PCN znižuje, so potrdili, kljub temu pa izbira ramnoznega promotorja ni bila najboljša izbira, saj so že nizke koncentracije ramnoze v gojišču povzročile zmanjšanje PCN na le nekaj kopij, prav tako pa je prišlo do velikega zmanjšanja PCN tudi v gojišču brez ramnoze. Študentje so z ekperimenti tako dokazali, da lahko z njihovo napravo SynORI ter z izborom ustreznega promotorja sami nadzorujemo in po želji izberemo število kopij plazmida v celici.<br /> <br /> == (Ne)kompatibilnostne skupine plazmidov ==<br /> <br /> V celici je lahko hkrati več kot 1 tip plazmida, ki morajo biti med sabo kompatibilni. Če pa vnos dodatnega plazmida v celice, ki že vsebujejo nek plazmid, povzroči destabilizacijo predhodno prisotnega plazmida, sta plazmida nekompatibilna. Običajno je vzrok za nekompatibilnost enak mehanizem kontrole replikacije med različnimi tipi plazmidov, kar lahko povzroči izgubo enega plazmida (predvsem tistega z nizkim številom kopij) skozi več generacij.<br /> <br /> === Eksperiment ===<br /> <br /> Študentje so si za naslednji cilj pri projektu zadali pripravo različnih kompatibilnih tipov plazmidov, ki bi sicer imeli enak mehanizem kontrole podvojevanja, ampak bi bil vsak tip specifičen zase. Znano je, da so za inhibicijo podvojevanja plazmida ColE1 najbolj pomembne medsebojne interakcije molekul RNA I in RNA II le med tremi zankami. S spreminjanjem zaporedij za zanke RNA I in RNA II, ki bi bila specifična za določen tip, bi ustvarili nove različne tipe plazmidov, ki pa bi bili med sabo kompatibilni, saj ne bi prišlo do tvorbe kompleksov med molekulami RNA različnih plazmidov. Zaradi predhodne dezaktivacije pRNAI ter vstavljanja gena za RNA I na drugo mesto ni nujno potrebno, da sta molekuli RNA popolnoma komplementarni med sabo.<br /> <br /> Iz podatkov iz literature so pridobili različne kombinacije zaporedij zank RNA I in RNA II, ki lahko med sabo tvorijo komplekse. Izbrali 5 različnih zaporedij RNA II (5 skupin), ki so imela mutirana zaporedja le za prvi dve zanki. Z mutiranjem tretje zanke bi namreč lahko povzročili motnje v začetku replikacije, saj je sekundarna struktura RNA II zelo občutljiva na mutacije v tem delu. Za RNA I pa so izbrali 10 različnih zaporedij (5 skupin s po dvema zaporedjema, ki sta se razlikovala samo v zapisu za tretjo zanko). <br /> <br /> Najprej so preverili, kako vpliva samo sprememba zaporedja RNA II na PCN, in izločili iz eksperimenta tista zaporedja, ki so povzročila veliko zmanjšanje PCN, saj je to pomenilo, da je prišlo do spremembe sekundarne strukture RNA II in posledično ni mogla služiti kot začetnik replikacije. Nato so v te plazmide vstavili še ustrezna zaporedja za RNA I (na enem plazmidu zapisa za RNA I in II iz iste skupine) ter preverili, ali je prišlo do inhibicije podvojevanja (cis-delovanje).<br /> <br /> Nato so zaporedja za RNA II ter zaporedja za RNA I ločeno vstavili v dva različna plazmida (RNA II v BBa_K2259081 ter RNA I v pSB4A5) ter transformirali celice s kombinacijami dveh različnih plazmidov. S tem so želeli ugotoviti, ali in pri katerih kombinacijah skupin je prišlo do zmanjšanja PCN (trans-delovanje). Le-te skupine so med sabo nekompatibilne. Pri projektu so uspešno pridobili dve kombinaciji skupin, ki pa sta bili med sabo kompatibilni. Nato so že s predhodno pripravljenimi plazmidi, ki so vsebovali zapisa za RNA I in RNA II iz ene skupine, transformirali celice skupaj z domnevno kompatibilnimi plazmidi z zapisom iz druge skupine ter določili PCN. Ker ni prišlo do zmanjšanja PCN pri nobeni skupini, so tako še enkrat potrdili, da je eksperiment uspel in da gre res za kompatibilni skupini.<br /> <br /> == Zaključek ==<br /> <br /> Litovski študentje so v celoti uspešno izpeljali projekt SynORI, za katerega so prejeli tudi veliko nagrado v skupini projektov dodiplomskih študentov. Pripravili so novo standardizirano ogrodje, s katerim lahko raziskovalci ustvarijo večplazmidni sistem z lastno izbiro števila (kompatibilnih) skupin plazmidov, števila kopij posamezne skupine ter z lastno izbiro načina kontrole števila kopij. Dodatno pa to ogrodje vključuje še možnost uporabe selekcijskega sistema, s katerim lahko z uporabo le enega antibiotika preverimo uspešnost transformacije celice z do 5 plazmidi, ter poseben sistem delitve celic, ki zagotavlja, da se plazmidi z nizkim številom kopij med delitvijo ne izgubijo.</div>

MojcaH https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=SynORI_%E2%80%93_ogrodje_za_ve%C4%8Dplazmidne_sisteme&diff=13813 2018-01-21T18:40:13Z

<p>MojcaH: New page: Povzeto po projektu SynORI (Vilna - Litva) iz tekmovanja iGEM 2017. Avtorica: Mojca Hunski Raziskovalci se v genskem inženirstvu pri delu s plazmidi velikokrat srečajo s težavami, ko...</p> <hr /> <div>Povzeto po projektu SynORI (Vilna - Litva) iz tekmovanja iGEM 2017.<br /> <br /> Avtorica: Mojca Hunski<br /> <br /> <br /> Raziskovalci se v genskem inženirstvu pri delu s plazmidi velikokrat srečajo s težavami, kot so nizko število kopij plazmida v celici ter nezmožnost sočasnega obstoja dveh ali več plazmidov v isti celici v odsotnosti selekcijskega pritiska (nekompatibilnost skupin plazmidov). Rešitev so v svojem projektu, poimenovanem SynORI, tj. sintetični ORI (mesto začetka replikacije), na tekmovanju iGEM 2017 predstavili študentje iz Vilne. Ustvarili so ogrodje, ki raziskovalcem omogoča lasten nadzor nad številom kopij določenega plazmida ter izbiro števila skupin plazmidov v celici, ki bodo med sabo kompatibilne. (1)<br /> <br /> == Lasten nadzor nad številom kopij plazmida ==<br /> <br /> Plazmidi običajno dajejo gostiteljski celici marsikatero uporabno lastnost ali funkcijo (npr. odpornost na antibiotike in dodatne presnovne poti), lahko pa predstavljajo za celico tudi veliko breme, če je njihovo število kopij previsoko. Prav tako je pomembno, da se med delitvijo celic ne izgubijo, zato je nujno potrebno uravnavanje podvojevanja plazmidov. (2) Različni plazmidi imajo različne načine regulacije podvojevanja ter so lahko v celici v visokem ali nizkem številu kopij. Študentje zmagovalne ekipe so se osredotočili na naravni plazmid E.coli ColE1, katerega uravnavanje podvojevanja poteka preko nastanka kompleksa med dvema komplementarnima kratkima molekulama RNA (RNA I in RNA II).<br /> <br /> '''ColE1'''<br /> ----<br /> Podvojevanje plazmida ColE1 se prične s prepisovanjem gena za RNA II, katerega konstitutivni promotor se nahaja 555 bp navzgor od mesta ORI. RNA II se zvije v kompleksno sekundarno strukturo, sestavljeno iz več zgradb steblo-zanka, kar omogoči tvorbo stabilnega kompleksa z matrično DNA na mestu ORI. Encim RNazaH nato napade novonastali hibrid in cepi molekulo RNA II na 3'-koncu, da se izpostavi hidroksilna skupina, da lahko tako RNA II služi kot začetni oligonukleotid za DNA polimerazo I pri sintezi vodilne verige.<br /> <br /> Uravnavanje števila kopij plazmida poteka s kratko nekodirajočo RNA I, ki inhibira RNA II. Transkripcija gena za RNA I se prične 445 bp navzgor od mesta ORI in poteka v nasprotni smeri, kot poteka transkripcija RNA II, tako da je RNA I v celoti komplementarna 5'-koncu RNA II in se lahko veže nanjo. S tem se spremeni sekundarna struktura RNA II, ki posledično ne more več tvoriti stabilnega kompleksa z DNA na mestu ORI in je tudi RNazaH ne more cepiti. Inhibicija je dodatno ojačana še s proteinom Rop, ki se veže na začetni kompleks RNA I-RNA II in ga stabilizira. Višje, kot je število kopij plazmida, večja je koncentracija RNA I v celici in tako je podvojevanje ustavljeno.<br /> <br /> '''Modeliranje in eksperiment'''<br /> ----<br /> Cilj ekipe je bil pripraviti ogrodje, s katerim bi lahko vsak raziskovalec enostavno spreminjal/reguliral število kopij plazmida po lastnih potrebah. To so storili tako, da so najprej popolnoma dezaktivirali promotor za RNA I, zapis za RNA I pa potem skupaj z izbranim promotorjem vstavili poleg gena za RNA II.<br /> <br /> Promotor za RNA I (pRNAI) je komplementaren ravno tistemu delu zapisa za RNA II, ki je ključen za tvorbo sekundarnih struktur, pomembnih pri nastanku kompleksa z DNA in posledično pri začetku podvojevanja. S spreminjanjem nukleotidnega zaporedja pRNAI se tako spreminja tudi sekundarna zgradba RNA II, zato so študentje s podatki iz literature in z računalniškimi analizami izbrali 5 takšnih mutiranih zaporedij za pRNAI, ki ne bi povzročila večjih sprememb v sekundarni strukturi RNA II in bi hkrati imela najnižjo afiniteto za RNA polimerazo. Za določitev, katero izmed mutiranih zaporedij najbolje ustreza pogojem, so najprej celice transformirali z nemutiranim (wt) plazmidom oziroma s plazmidom z mutiranim pRNAI ter po inkubaciji določili število kopij plazmida (PCN) na celico s kvantitativnim PCR. Mutirane plazmide so izolirali in v njih vstavili še wt zapis za RNAI skupaj z wt pRNAI. Po transformaciji in inkubaciji so ponovno določili PCN. Za nadaljnje delo so izbrali tisto mutirano zaporedje, kjer je bila razlika med PCN celic z wt plazmidom in celic z mutiranim pRNAI največja, razlika med PCN celicah z wt plazmidom ter celic z mutiranim pRNAI in nemutiranim genom pa najmanjša. To zaporedje so poimenovali kar RNA II in pripravili tudi biokocko (Part:BBa_K2259000). Nato so preverili, ali lahko s spreminjanjem moči promotorja za RNA I vplivajo na PCN. Poleg novega konstrukta RNA II so vstavili gen za RNA I pod kontrolo različnih Andersonovih konstitutivnih promotorjev. Z eksperimenti so potrdili hipotezo, da močnejši promotor v primerjavi z nemutiranim pRNA I povzroči zmanjšanje, šibkejši pa povečanje PCN. Podoben eksperiment so naredili z uporabo inducibilnega ramnoznega promotorja (biokocka), le da so v tem primeru spreminjali koncentracijo ramnoze v gojišču. Hipotezo, da se z večanjem koncentracije ramnoze v gojišču PCN znižuje, so potrdili, kljub temu pa izbira ramnoznega promotorja ni bila najboljša izbira, saj so že nizke koncentracije ramnoze v gojišču povzročile zmanjšanje PCN na le nekaj kopij, prav tako pa je prišlo do velikega zmanjšanja PCN tudi v gojišču brez ramnoze. Študentje so z ekperimenti tako dokazali, da lahko z njihovo napravo SynORI ter z izborom ustreznega promotorja sami nadzorujemo in po želji izberemo število kopij plazmida v celici.<br /> <br /> == (Ne)kompatibilnostne skupine plazmidov ==<br /> <br /> V celici je lahko hkrati več kot 1 tip plazmida, ki morajo biti med sabo kompatibilni. Če pa vnos dodatnega plazmida v celice, ki že vsebujejo nek plazmid, povzroči destabilizacijo predhodno prisotnega plazmida, sta plazmida nekompatibilna. Običajno je vzrok za nekompatibilnost enak mehanizem kontrole replikacije med različnimi tipi plazmidov, kar lahko povzroči izgubo enega plazmida (predvsem tistega z nizkim številom kopij) skozi več generacij.<br /> <br /> '''Eksperiment'''<br /> ----<br /> Študentje so si za naslednji cilj pri projektu zadali pripravo različnih kompatibilnih tipov plazmidov, ki bi sicer imeli enak mehanizem kontrole podvojevanja, ampak bi bil vsak tip specifičen zase. Znano je, da so za inhibicijo podvojevanja plazmida ColE1 najbolj pomembne medsebojne interakcije molekul RNA I in RNA II le med tremi zankami. S spreminjanjem zaporedij za zanke RNA I in RNA II, ki bi bila specifična za določen tip, bi ustvarili nove različne tipe plazmidov, ki pa bi bili med sabo kompatibilni, saj ne bi prišlo do tvorbe kompleksov med molekulami RNA različnih plazmidov. Zaradi predhodne dezaktivacije pRNAI ter vstavljanja gena za RNA I na drugo mesto ni nujno potrebno, da sta molekuli RNA popolnoma komplementarni med sabo.<br /> <br /> Iz podatkov iz literature so pridobili različne kombinacije zaporedij zank RNA I in RNA II, ki lahko med sabo tvorijo komplekse. Izbrali 5 različnih zaporedij RNA II (5 skupin), ki so imela mutirana zaporedja le za prvi dve zanki. Z mutiranjem tretje zanke bi namreč lahko povzročili motnje v začetku replikacije, saj je sekundarna struktura RNA II zelo občutljiva na mutacije v tem delu. Za RNA I pa so izbrali 10 različnih zaporedij (5 skupin s po dvema zaporedjema, ki sta se razlikovala samo v zapisu za tretjo zanko). <br /> <br /> Najprej so preverili, kako vpliva samo sprememba zaporedja RNA II na PCN, in izločili iz eksperimenta tista zaporedja, ki so povzročila veliko zmanjšanje PCN, saj je to pomenilo, da je prišlo do spremembe sekundarne strukture RNA II in posledično ni mogla služiti kot začetnik replikacije. Nato so v te plazmide vstavili še ustrezna zaporedja za RNA I (na enem plazmidu zapisa za RNA I in II iz iste skupine) ter preverili, ali je prišlo do inhibicije podvojevanja (cis-delovanje).<br /> <br /> Nato so zaporedja za RNA II ter zaporedja za RNA I ločeno vstavili v dva različna plazmida (RNA II v BBa_K2259081 ter RNA I v pSB4A5) ter transformirali celice s kombinacijami dveh različnih plazmidov. S tem so želeli ugotoviti, ali in pri katerih kombinacijah skupin je prišlo do zmanjšanja PCN (trans-delovanje). Le-te skupine so med sabo nekompatibilne. Pri projektu so uspešno pridobili dve kombinaciji skupin, ki pa sta bili med sabo kompatibilni. Nato so že s predhodno pripravljenimi plazmidi, ki so vsebovali zapisa za RNA I in RNA II iz ene skupine, transformirali celice skupaj z domnevno kompatibilnimi plazmidi z zapisom iz druge skupine ter določili PCN. Ker ni prišlo do zmanjšanja PCN pri nobeni skupini, so tako še enkrat potrdili, da je eksperiment uspel in da gre res za kompatibilni skupini.<br /> <br /> == Zaključek ==<br /> <br /> Litovski študentje so v celoti uspešno izpeljali projekt SynORI, za katerega so prejeli tudi veliko nagrado v skupini projektov dodiplomskih študentov. Pripravili so novo standardizirano ogrodje, s katerim lahko raziskovalci ustvarijo večplazmidni sistem z lastno izbiro števila (kompatibilnih) skupin plazmidov, števila kopij posamezne skupine ter z lastno izbiro načina kontrole števila kopij. Dodatno pa to ogrodje vključuje še možnost uporabe selekcijskega sistema, s katerim lahko z uporabo le enega antibiotika preverimo uspešnost transformacije celice z do 5 plazmidi, ter poseben sistem delitve celic, ki zagotavlja, da se plazmidi z nizkim številom kopij med delitvijo ne izgubijo.</div>

MojcaH https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2017/18&diff=13413 2017-11-18T10:29:12Z

<p>MojcaH: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2017/18 študentje predstavljajo naslednje teme:<br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br /> #<br /> #<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) <br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.<br /> <br /> ---------------------------<br /> Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):<br /> <br /> 27.11. &lt;br&gt;<br /> 1 Marija Srnko &lt;br&gt;<br /> 2 Neža Brezovar&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 28.11.&lt;br&gt;<br /> 1 Tjaša Grum &lt;br&gt;<br /> 2 Ana Cirnski &lt;br&gt;<br /> 3 Petra Vivod &lt;br&gt;<br /> 4 Urška Černe &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 4.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Sara Kimm Fuhrmann &lt;br&gt;<br /> 2 Anja Tanšek &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 5.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Urška Furar&lt;br&gt;<br /> 2 Tina Lekan &lt;br&gt;<br /> 3 Katja Malovrh &lt;br&gt; <br /> 4 Jernej Vidmar &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 12.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Helena Jakše &lt;br&gt;<br /> 2 Tjaša Bensa &lt;br&gt;<br /> 3 Sabina Štukelj &lt;br&gt;<br /> 4 Amadeja Lapornik&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 19.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Krišelj &lt;br&gt;<br /> 2 Vanna Imširović &lt;br&gt;<br /> 3 Dominik Dekleva &lt;br&gt;<br /> 4 Neža Gaube &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 9.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Nastja Marondini &lt;br&gt;<br /> 2 Elizabeta Jevnikar &lt;br&gt;<br /> 3 Nina Roštan &lt;br&gt;<br /> 4 Barbara Lipovšek&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 15.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Matic Kovačič - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/%C5%A0irjenje_genetskega_koda Širjenje genetskega koda]&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 16.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Inge Sotlar &lt;br&gt;<br /> 2 Marija Kisilak&lt;br&gt;<br /> 3 Nataša Traven&lt;br&gt;<br /> 4 Tina Šimunović&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 22.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Mojca Hunski &lt;br&gt;<br /> 2&lt;br&gt;<br /> 3&lt;br&gt;<br /> 4&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 23.1.&lt;br&gt;<br /> 1&lt;br&gt;<br /> 2&lt;br&gt;<br /> 3&lt;br&gt;<br /> 4&lt;br&gt;</div>

MojcaH https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Ovrednotenje_%C5%A1estih_imunogenih_rekombinantnih_proteinov_bakterije_Vibrio_Anguillarum_kot_kandidatna_cepiva_za_ribo_Paralichthys_olivaceus&diff=12697 2017-04-17T20:34:11Z

<p>MojcaH: </p> <hr /> <div>[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857 Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'')]<br /> <br /> ''Vibrio anguillarum'' je slanoljubna ter po Gramu negativna bakterija, ki povzroča hemoragično septikemijo pri ribah po celem svetu ter zaradi pomanjkljive in neučinkovite preventive povzroča ogromne ekonomske izgube v akvakulturni industriji. Obstajajo sicer kandidatna cepiva proti ''V. anguillarum''. S pomočjo celotnega zaporedja genoma bakterije ter bioinformatskih analiz so namreč že določili zaporedje genov, ki kodirajo imunogene proteine, ter predvideli lokalizacijo teh proteinov na subcelični ravni. Tako so s tehnologijo rekombinantne DNA pripravili cepiva iz delov patogena (&quot;subunit vaccines&quot;). V študiji so izbrali šest potencialnih antigenskih determinant iz ''V. anguillarum'' in ovrednotili njihovo učinkovitost za zaščito ribe ''P. olivaceus''.<br /> <br /> == Priprava kandidatnih cepiv ==<br /> <br /> Iz podatkovne baze Genbank so pridobili zaporedja genov, ki kodirajo šest izbranih proteinov in imajo pomembno vlogo pri preživetju in patogenosti ''V. anguillarum'': virulenčni protein A (VirA), proteina K in R zunanje membrane (OmpK in OmpR), stresni protein 33 (Hsp33), flagelin C (FlaC) ter protein CheR. S pomočjo bioinformatskih analiz so določili še subcelične lokalizacije proteinov, transmembranske domene, izolelektrične točke ter molekulske mase. Zapis za specifičen protein so ligirali v vektor PEASY-E1 ter z metodo toplotnega šoka transformirali ''E. coli'' BL21 (DE3). Po uspešni selekciji so bakterije prenesli v tekoče gojišče LB bujon in jih kultivirali do sredine logaritemske faze rasti. Očiščene rekombinantne proteine so nato ločili s poliakrilamidno gelsko elektroforezo in določili njihove molekulske mase. Nato so jih prenesli na membrano in ugotavljali, ali protitelesa proti ''V. anguillarum'' (fV-ab), ki so jih izolirali iz ''P. olivaceus'', lahko interagirajo z očiščenimi proteini.<br /> Pripravili so osem različnih vzorcev, ki so jih injicirali v ribe: šest različnih vzorcev z različnim specifičnim očiščenim rekombinantnim proteinom, vzorec z ''V. anguillarum'', ki so jih predhodno inaktivirali s formalinom (FKC), ter kontrolni vzorec s PBS. Pred imunizacijo so vsakemu vzorcu dodali adjuvans.<br /> <br /> == Cepljenje rib, vzorčenje, preizkus učinkovitosti ==<br /> <br /> Ribe ''P. olivaceus'', neokužene z ''V. anguillarum'', so naključno razporedili v osem skupin (150 rib/skupina) ter jim intraperitonealno injicirali po 100 μl določenega vzorca. Vsak teden (7 tednov zapored) po imunizaciji so šestim ribam iz vsake skupine odvzeli kri, izolirali limfocite ter pripravili serume. S pretočno citometrijo so določili delež celic s površinskim imunoglobulinom (celice sIg+). S testom ELISA pa so v serumih določili titre protiteles. Določali so titer fV-ab, titer protiteles proti rekombinantnim proteinom ter titer celokupnih protiteles.<br /> Peti teden po imunizaciji so 80 ribam iz vsake skupine intraperitonealno injicirali po 100 μl žive ''V. anguillarum'' (1,0 x 10^7 CFU/ml). 15 zaporednih dni so spremljali umrljivost in izračunali relativno preživetje (RPS) po enačbi: RPS = [1 – (delež poginulih rib v preiskovani skupini/delež poginulih rib v kontrolni skupini)] x 100 %.<br /> <br /> == Rezultati in zaključki ==<br /> <br /> Uspešno so izrazili vseh šest rekombinantnih proteinov, ki so po molekulskih masah ustrezali naravnim proteinom, ter s prenosom western pokazali, da vseh šest lahko interagira s fV-ab. Injiciranje očiščenih rekombinantnih proteinov je pri ribah povzročilo namnožitev limfocitov sIg+ ter tvorbo celokupnih protiteles in specifičnih protiteles proti ''V. anguillarum'' oziroma rekombinantnim proteinom. Titri protiteles so po injiciranju vzorcev najprej naraščali, dosegli vrh in v zadnjih tednih merjenja upadli. <br /> 15 dni po injiciranju žive ''V. anguillarum'' so RPS za rekombinantne proteine FlaC, CheR, OmpR, OmpK, VirA ter Hsp33 znašali: 16,22 %, 27,03 %, 45,95 %, 62,16 %, 70,27 % ter 81,08 %. RPS za FKC je znašal 56,76 %. V vranici, jetrih ter ledvicah poginulih rib niso zaznali prisotnosti drugih bakterij, s čimer so pokazali, da je bila vzrok smrti dovzetnost za okužbo z ''V. anguillarum''.<br /> V študiji so tako pokazali, da rHsp33, rVirA ter rOmpK ribam ''P. olivaceus'' nudijo dobro zaščito pred ''V. anguillarum'', zato bi jih lahko uporabili kot kandidatna cepiva.<br /> <br /> ----<br /> <br /> <br /> == Vir ==<br /> <br /> J. Xing, H. Xu, Y. Wang, X. Tang, X. Sheng, W. Zhan. &quot;Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of Vibrio anguillarum and evaluation them as vaccine candidate for flounder (Paralichthys olivaceus).&quot; Microbial pathogenesis 2017, 107, 155-163<br /> <br /> <br /> [[MBT seminarji 2017]]</div>

MojcaH https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Ovrednotenje_%C5%A1estih_imunogenih_rekombinantnih_proteinov_bakterije_Vibrio_Anguillarum_kot_kandidatna_cepiva_za_ribo_Paralichthys_olivaceus&diff=12696 2017-04-17T20:24:00Z

<p>MojcaH: </p> <hr /> <div>[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857 Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'')]<br /> <br /> ''Vibrio anguillarum'' je slanoljubna ter po Gramu negativna bakterija, ki povzroča hemoragično septikemijo pri ribah po celem svetu ter zaradi pomanjkljive in neučinkovite preventive povzroča ogromne ekonomske izgube v akvakulturni industriji. Obstajajo sicer kandidatna cepiva proti ''V. anguillarum''. S pomočjo celotnega zaporedja genoma bakterije ter bioinformatskih analiz so namreč že določili zaporedje genov, ki kodirajo imunogene proteine, ter predvideli lokalizacijo teh proteinov na subcelični ravni. Tako so s tehnologijo rekombinantne DNA pripravili cepiva iz delov patogena (&quot;subunit vaccines&quot;). V študiji so izbrali šest potencialnih antigenskih determinant iz ''V. anguillarum'' in ovrednotili njihovo učinkovitost za zaščito ribe ''P. olivaceus''.<br /> <br /> == Priprava kandidatnih cepiv ==<br /> <br /> Iz podatkovne baze Genbank so pridobili zaporedja genov, ki kodirajo šest izbranih proteinov in imajo pomembno vlogo pri preživetju in patogenosti ''V. anguillarum'': virulenčni protein A (VirA), proteina K in R zunanje membrane (OmpK in OmpR), stresni protein 33 (Hsp33), flagelin C (FlaC) ter protein CheR. S pomočjo bioinformatskih analiz so določili še subcelične lokalizacije proteinov, transmembranske domene, izolelektrične točke ter molekulske mase. Zapis za specifičen protein so ligirali v vektor PEASY-E1 ter z metodo toplotnega šoka transformirali ''E. coli'' BL21 (DE3). Po uspešni selekciji so bakterije prenesli v tekoče gojišče LB bujon in jih kultivirali do sredine logaritemske faze rasti. Očiščene rekombinantne proteine so nato ločili s poliakrilamidno gelsko elektroforezo in določili njihove molekulske mase. Nato so jih prenesli na membrano in ugotavljali, ali protitelesa proti ''V. anguillarum'' (fV-ab), ki so jih izolirali iz ''P. olivaceus'', lahko interagirajo z očiščenimi proteini.<br /> Pripravili so osem različnih vzorcev, ki so jih injicirali v ribe: šest različnih vzorcev z različnim specifičnim očiščenim rekombinantnim proteinom, vzorec z ''V. anguillarum'', ki so jih predhodno inaktivirali s formalinom (FKC), ter kontrolni vzorec s PBS. Pred imunizacijo so vsakemu vzorcu dodali adjuvans.<br /> <br /> == Cepljenje rib, vzorčenje, preizkus učinkovitosti ==<br /> <br /> Ribe ''P. olivaceus'', neokužene z ''V. anguillarum'', so naključno razporedili v osem skupin (150 rib/skupina) ter jim intraperitonealno injicirali po 100 μl določenega vzorca. Vsak teden (7 tednov zapored) po imunizaciji so šestim ribam iz vsake skupine odvzeli kri, izolirali limfocite ter pripravili serume. S pretočno citometrijo so določili delež celic s površinskim imunoglobulinom (celice sIg+). S testom ELISA pa so v serumih določili titre protiteles. Določali so titer fV-ab, titer protiteles proti rekombinantnim proteinom ter titer celokupnih protiteles.<br /> Peti teden po imunizaciji so 80 ribam iz vsake skupine intraperitonealno injicirali po 100 μl žive ''V. anguillarum''. 15 zaporednih dni so spremljali umrljivost in izračunali relativno preživetje (RPS) po enačbi: RPS = [1 – (delež poginulih rib v preiskovani skupini/delež poginulih rib v kontrolni skupini)] x 100 %.<br /> <br /> == Rezultati in zaključki ==<br /> <br /> Uspešno so izrazili vseh šest rekombinantnih proteinov, ki so po molekulskih masah ustrezali naravnim proteinom, ter s prenosom western pokazali, da vseh šest lahko interagira s fV-ab. Injiciranje očiščenih rekombinantnih proteinov je pri ribah povzročilo namnožitev limfocitov sIg+ ter tvorbo celokupnih protiteles in specifičnih protiteles proti ''V. anguillarum'' oziroma rekombinantnim proteinom. Titri protiteles so po injiciranju vzorcev najprej naraščali, dosegli vrh in v zadnjih tednih merjenja upadli. <br /> 15 dni po injiciranju žive ''V. anguillarum'' so RPS za rekombinantne proteine FlaC, CheR, OmpR, OmpK, VirA ter Hsp33 znašali: 16,22 %, 27,03 %, 45,95 %, 62,16 %, 70,27 % ter 81,08 %. RPS za FKC je znašal 56,76 %. V vranici, jetrih ter ledvicah poginulih rib niso zaznali prisotnosti drugih bakterij, s čimer so pokazali, da je bila vzrok smrti dovzetnost za okužbo z ''V. anguillarum''.<br /> V študiji so tako pokazali, da rHsp33, rVirA ter rOmpK ribam ''P. olivaceus'' nudijo dobro zaščito pred ''V. anguillarum'', zato bi jih lahko uporabili kot kandidatna cepiva.<br /> <br /> ----<br /> <br /> <br /> == Vir ==<br /> <br /> J. Xing, H. Xu, Y. Wang, X. Tang, X. Sheng, W. Zhan. &quot;Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of Vibrio anguillarum and evaluation them as vaccine candidate for flounder (Paralichthys olivaceus).&quot; Microbial pathogenesis 2017, 107, 155-163<br /> <br /> <br /> [[MBT seminarji 2017]]</div>

MojcaH https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Ovrednotenje_%C5%A1estih_imunogenih_rekombinantnih_proteinov_bakterije_Vibrio_Anguillarum_kot_kandidatna_cepiva_za_ribo_Paralichthys_olivaceus&diff=12695 2017-04-17T19:25:19Z

<p>MojcaH: </p> <hr /> <div>[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857 Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'')]<br /> <br /> ''Vibrio anguillarum'' je slanoljubna ter po Gramu negativna bakterija, ki povzroča hemoragično septikemijo pri ribah po celem svetu ter zaradi pomanjkljive in neučinkovite preventive povzroča ogromne ekonomske izgube v akvakulturni industriji. Obstajajo pa že kandidatna cepiva proti ''V. anguillarum''. S pomočjo celotnega zaporedja genoma bakterije ter bioinformatskih analiz so namreč lahko določili zaporedje genov, ki kodirajo imunogene proteine, ter predvideli njihovo lokalizacijo na subcelični ravni. Tako so s tehnologijo rekombinantne DNA pripravili cepiva iz delov patogena (&quot;subunit vaccines&quot;). V študiji so izbrali šest potencialnih antigenskih determinant iz ''V. anguillarum'' in ovrednotili njihovo učinkovitost za zaščito ribe ''P. olivaceus''.<br /> <br /> == Priprava kandidatnih cepiv ==<br /> <br /> Iz podatkovne baze Genbank so pridobili zaporedja genov, ki kodirajo šest izbranih proteinov in imajo pomembno vlogo pri preživetju in patogenosti ''V. anguillarum'': virulenčni protein A (VirA), proteina K in R zunanje membrane (OmpK in OmpR), stresni protein 33 (Hsp33), flagelin C (FlaC) ter protein CheR. S pomočjo bioinformatskih analiz so določili še subcelično lokalizacijo proteinov, transmembranske domene, izolelektrične točke ter molekulske mase. Zapis za specifičen protein so ligirali v vektor PEASY-E1 ter z metodo toplotnega šoka transformirali ''E. coli'' BL21 (DE3). Po uspešni selekciji so bakterije prenesli v tekoče gojišče LB bujon in jih kultivirali do sredine logaritemske faze rasti. Očiščene rekombinantne proteine so nato ločili s poliakrilamidno gelsko elektroforezo in določili njihovo molekulsko maso. Nato so jih prenesli na membrano in ugotavljali, ali protitelesa proti ''V. anguillarum'' (fV-ab), ki so jih izolirali iz ''P. olivaceus'', lahko reagirajo z očiščenimi proteini.<br /> Pripravili so osem različnih vzorcev, ki so jih injicirali v ribe: šest vzorcev s specifičnim očiščenim rekombinantnim proteinom, vzorec z ''V. anguillarum'', ki so jih inaktivirali s formalinom (FKC), ter kontrolni vzorec s PBS. Pred imunizacijo so vsakemu vzorcu dodali adjuvans.<br /> <br /> == Cepljenje rib, vzorčenje, preizkus učinkovitosti ==<br /> <br /> Ribe ''P. olivaceus'', neokužene z ''V. anguillarum'', so naključno razporedili v osem skupin (150 rib/skupina) ter jim intraperitonealno injicirali po 100 μl določenega vzorca. Vsak teden (7-krat) po imunizaciji so šestim ribam iz vsake skupine odvzeli kri, izolirali limfocite ter pripravili serum. S pretočno citometrijo so določili delež celic s površinskim imunoglobulinom (celice sIg+). S testom ELISA pa so v serumu določili titer protiteles. Določali so titer fV-ab, titer protiteles proti rekombinantnim proteinom ter titer celokupnih protiteles.<br /> Peti teden po imunizaciji so 80 ribam iz vsake skupine intraperitonealno injicirali 100 μl žive ''V. anguillarum''. 15 zaporednih dni so spremljali umrljivost in izračunali relativno preživetje (RPS) po enačbi: RPS = [1 – (delež poginulih rib v preiskovani skupini/delež poginulih rib v kontrolni skupini)] x 100 %.<br /> <br /> == Rezultati in zaključki ==<br /> <br /> Uspešno so izrazili vseh šest rekombinantnih proteinov, ki so po molekulski masi ustrezali naravnim proteinom, ter s prenosom western pokazali, da vseh šest lahko reagira s fV-ab. Injiciranje očiščenih rekombinantnih proteinov je pri ribah povzročilo namnožitev limfocitov sIg+ ter tvorbo celokupnih protiteles in specifičnih protiteles proti ''V. anguillarum'' oziroma rekombinantnim proteinom. Titer protiteles je po injiciranju vzorcev najprej naraščal, dosegel vrh in v zadnjih tednih merjenja upadel. <br /> 15 dni po injiciranju žive ''V. anguillarum'' so RPS za rekombinantne proteine FlaC, CheR, OmpR, OmpK, VirA ter Hsp33 znašali: 16,22 %, 27,03 %, 45,95 %, 62,16 %, 70,27 % ter 81,08 %. RPS za FKC je znašal 56,76 %. V vranici, jetrih ter ledvicah poginulih rib niso zaznali prisotnosti drugih bakterij, s čimer so pokazali, da je bil vzrok smrti dovzetnost za okužbo z ''V. anguillarum''.<br /> V študiji so tako pokazali, da rHsp33, rVirA ter rOmpK ribam ''P. olivaceus'' nudijo dobro zaščito pred ''V. anguillarum'', zato bi jih lahko uporabili kot kandidatna cepiva.<br /> <br /> ----<br /> <br /> <br /> == Vir ==<br /> <br /> J. Xing, H. Xu, Y. Wang, X. Tang, X. Sheng, W. Zhan. &quot;Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of Vibrio anguillarum and evaluation them as vaccine candidate for flounder (Paralichthys olivaceus).&quot; Microbial pathogenesis 2017, 107, 155-163<br /> <br /> <br /> [[MBT seminarji 2017]]</div>

MojcaH https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Ovrednotenje_%C5%A1estih_imunogenih_rekombinantnih_proteinov_bakterije_Vibrio_Anguillarum_kot_kandidatna_cepiva_za_ribo_Paralichthys_olivaceus&diff=12694 2017-04-17T19:16:45Z

<p>MojcaH: </p> <hr /> <div>[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857 Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'')]<br /> <br /> ''Vibrio anguillarum'' je slanoljubna ter po Gramu negativna bakterija, ki povzroča hemoragično septikemijo pri ribah po celem svetu ter zaradi pomanjkljive in neučinkovite preventive povzroča ogromne ekonomske izgube v akvakulturni industriji. Obstajajo pa že kandidatna cepiva proti ''V. anguillarum''. S pomočjo celotnega zaporedja genoma bakterije ter bioinformatskih analiz so namreč lahko določili zaporedje genov, ki kodirajo imunogene proteine, ter predvideli njihovo lokalizacijo na subcelični ravni. Tako so s tehnologijo rekombinantne DNA pripravili cepiva iz delov patogena (»subunit vaccines«). V študiji so izbrali šest potencialnih antigenskih determinant iz ''V. angillarum'' in ovrednotili njihovo učinkovitost za zaščito ribe ''P. olivaceus''.<br /> <br /> == Priprava kandidatnih cepiv ==<br /> <br /> Iz podatkovne baze Genbank so pridobili zaporedja genov, ki kodirajo šest izbranih proteinov in imajo pomembno vlogo pri preživetju in patogenosti ''V. anguillarum'': virulenčni protein A (VirA), proteina K in R zunanje membrane (OmpK in OmpR), stresni protein 33 (Hsp33), flagelin C (FlaC) ter protein CheR. S pomočjo bioinformatskih analiz so določili še subcelično lokalizacijo proteinov, transmembranske domene, izolelektrične točke ter molekulske mase. Zapis za specifičen protein so ligirali v vektor PEASY-E1 ter z metodo toplotnega šoka transformirali ''E. coli'' BL21 (DE3). Po uspešni selekciji so bakterije prenesli v tekoče gojišče LB bujon in jih kultivirali do sredine logaritemske faze rasti. Očiščene rekombinantne proteine so nato ločili s poliakrilamidno gelsko elektroforezo in določili njihovo molekulsko maso. Nato so jih prenesli na membrano in ugotavljali, ali protitelesa proti ''V. anguillarum'' (fV-ab), ki so jih izolirali iz ''P. olivaceus'', lahko reagirajo z očiščenimi proteini.<br /> Pripravili so osem različnih vzorcev, ki so jih injicirali v ribe: šest vzorcev s specifičnim očiščenim rekombinantnim proteinom, vzorec z ''V. anguillarum'', ki so jih inaktivirali s formalinom (FKC), ter kontrolni vzorec s PBS. Pred imunizacijo so vsakemu vzorcu dodali adjuvans.<br /> <br /> == Cepljenje rib, vzorčenje, preizkus učinkovitosti ==<br /> <br /> Ribe ''P. olivaceus'', neokužene z ''V. anguillarum'', so naključno razporedili v osem skupin (150 rib/skupina) ter jim intraperitonealno injicirali po 100 μl določenega vzorca. Vsak teden (7-krat) po imunizaciji so šestim ribam iz vsake skupine odvzeli kri, izolirali limfocite ter pripravili serum. S pretočno citometrijo so določili delež celic s površinskim imunoglobulinom (celice sIg+). S testom ELISA pa so v serumu določili titer protiteles. Določali so titer fV-ab, titer protiteles proti rekombinantnim proteinom ter titer celokupnih protiteles.<br /> Peti teden po imunizaciji so 80 ribam iz vsake skupine intraperitonealno injicirali 100 μl žive ''V. anguillarum''. 15 zaporednih dni so spremljali umrljivost in izračunali relativno preživetje (RPS) po enačbi: RPS = [1 – (delež poginulih rib v skupini/delež poginulih rib v kontrolni skupini)] x 100 %.<br /> <br /> == Rezultati in zaključki ==<br /> <br /> Uspešno so izrazili vseh šest rekombinantnih proteinov, ki so po molekulski masi ustrezali naravnim proteinom, ter s prenosom western pokazali, da vseh šest lahko reagira s fV-ab. Injiciranje očiščenih rekombinantnih proteinov je pri ribah povzročilo namnožitev limfocitov sIg+ ter tvorbo celokupnih protiteles in specifičnih protiteles proti ''V. anguillarum'' oziroma rekombinantnim proteinom. Titer protiteles je po injiciranju vzorcev najprej naraščal, dosegel vrh in v zadnjih tednih merjenja upadel. <br /> 15 dni po injiciranju žive ''V. anguillarum'' so RPS za rekombinantne proteine FlaC, CheR, OmpR, OmpK, VirA ter Hsp33 znašali: 16,22 %, 27,03 %, 45,95 %, 62,16 %, 70,27 % ter 81,08 %. RPS za FKC je znašal 56,76 %. V vranici, jetrih ter ledvicah poginulih rib niso zaznali prisotnosti drugih bakterij, s čimer so pokazali, da je bil vzrok smrti dovzetnost za okužbo z ''V. anguillarum''.<br /> V študiji so tako pokazali, da rHsp33, rVirA ter OmpK ribam ''P. olivaceus'' nudijo dobro zaščito pred ''V. anguillarum'', zato bi jih lahko uporabili kot kandidatna cepiva.<br /> <br /> ----<br /> <br /> <br /> == Vir ==<br /> <br /> J. Xing, H. Xu, Y. Wang, X. Tang, X. Sheng, W. Zhan. &quot;Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of Vibrio anguillarum and evaluation them as vaccine candidate for flounder (Paralichthys olivaceus).&quot; Microbial pathogenesis 2017, 107, 155-163<br /> <br /> <br /> [[MBT seminarji 2017]]</div>

MojcaH https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2017&diff=12693 2017-04-17T18:59:06Z

<p>MojcaH: </p> <hr /> <div>'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''<br /> <br /> Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).<br /> <br /> Način vnosa:<br /> <br /> # The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops &amp; Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017<br /> (slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br /> <br /> <br /> '''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''<br /> <br /> <br /> '''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec)&lt;br&gt;<br /> # Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017<br /> # Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017<br /> # The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017<br /> <br /> <br /> '''Gensko spremenjene živali''' (15. marec)&lt;br&gt;<br /> # Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017<br /> # High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017<br /> # Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017<br /> <br /> <br /> '''Okolje''' (22. marec)&lt;br&gt;<br /> # Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017<br /> # Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017<br /> # Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017<br /> <br /> <br /> '''Terapevtski proteini''' (29. marec)&lt;br&gt;<br /> # Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017<br /> # Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017<br /> # Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017<br /> <br /> <br /> '''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april)&lt;br&gt;<br /> # Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo &quot;et al&quot;; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017<br /> # Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017<br /> # A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017<br /> <br /> <br /> '''Diagnostiki''' (12. april)&lt;br&gt; <br /> # Tjaša Košir - prestavljeno na 6.6.<br /> # Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) [[Zaznavanje zunajcelične miR-210 v urinu kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic]]. Petra Vivod, 12. april 2017<br /> # Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017<br /> <br /> <br /> '''Cepiva''' (19. april)&lt;br&gt;<br /> #Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih s cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april<br /> # A novel staphylococcal enterotoxin B subunit vaccine candidate elicits protective immune response in a mouse model (J. Y. Choi ''et al''; Toxicon 131, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041010117301071) [[Novo cepivo proti stafilokoknem enterotoksinu B izzove zaščitni imunski odziv pri miši]]. Amadeja Lapornik, 19. april 2017 <br /> #Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'') (J. Xing ''et al''; Microbial Pathogenesis 107, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857) [[Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije Vibrio Anguillarum kot kandidatna cepiva za ribo Paralichthys olivaceus]]. Mojca Hunski, 19. aprila 2017<br /> <br /> <br /> '''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april)&lt;br&gt;<br /> # Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001 Stukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v ''Mycobacterium tuberculosis'' Vid Jazbec<br /> #Zala Gluhić<br /> #Katja Malovrh<br /> <br /> <br /> '''Male molekule in polimeri''' (3. maj)&lt;br&gt;<br /> # Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola. Petra Tavčar,3. marec 2017<br /> # Tim Božič<br /> # Tajda Buh<br /> <br /> <br /> '''Encimi''' (10. maj)&lt;br&gt;<br /> # Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900) Proizvodnja obnovljive ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalist s potencialno uporabo v industriji hrane. Nataša Traven, 10. maj 2017<br /> # Bine Tršavec<br /> # Simon Bolta<br /> <br /> <br /> '''Pretvorba biomase''' (17. maj)&lt;br&gt;<br /> # Inge Sotlar<br /> # Anja Herceg<br /> # The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5). Anja Tanšek, 17. maj 2017<br /> <br /> <br /> '''Metabolno inženirstvo''' (24. maj)&lt;br&gt;<br /> # Barbara Dušak<br /> # Tjaša Grum<br /> # Sara Kimm Fuhrmann<br /> <br /> <br /> '''Biološki viri energije''' (31. maj)&lt;br&gt;<br /> # Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017<br /> # A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij)&lt;br&gt;<br /> # Matjaž Ivanuša<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].</div>

MojcaH https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=User:MojcaH&diff=12692 2017-04-17T18:54:49Z

<p>MojcaH: User:MojcaH moved to Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije Vibrio Anguillarum kot kandidatna cepiva za ribo Paralichthys olivaceus</p> <hr /> <div>#REDIRECT [[Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije Vibrio Anguillarum kot kandidatna cepiva za ribo Paralichthys olivaceus]]</div>

MojcaH https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Ovrednotenje_%C5%A1estih_imunogenih_rekombinantnih_proteinov_bakterije_Vibrio_Anguillarum_kot_kandidatna_cepiva_za_ribo_Paralichthys_olivaceus&diff=12691 2017-04-17T18:54:49Z

<p>MojcaH: User:MojcaH moved to Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije Vibrio Anguillarum kot kandidatna cepiva za ribo Paralichthys olivaceus</p> <hr /> <div>[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857 Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'')]<br /> <br /> ''Vibrio anguillarum'' je slanoljubna ter po Gramu negativna bakterija, ki povzroča hemoragično septikemijo pri ribah po celem svetu ter zaradi pomanjkljive in neučinkovite preventive povzroča ogromne ekonomske izgube v akvakulturni industriji. Obstajajo pa že kandidatna cepiva proti ''V. anguillarum''. S pomočjo celotnega zaporedja genoma bakterije ter bioinformatskih analiz so namreč lahko določili zaporedje genov, ki kodirajo imunogene proteine, ter predvideli njihovo lokalizacijo na subcelični ravni. Tako so s tehnologijo rekombinantne DNA pripravili cepiva iz delov patogena (»subunit vaccines«). V študiji so izbrali šest potencialnih antigenskih determinant iz ''V. angillarum'' in ovrednotili njihovo učinkovitost za zaščito ribe ''P. olivaceus''.<br /> <br /> == Priprava kandidatnih cepiv ==<br /> <br /> Iz podatkovne baze Genbank so pridobili zaporedja genov, ki kodirajo šest izbranih proteinov in imajo pomembno vlogo pri preživetju in patogenosti ''V. anguillarum'': virulenčni protein A (VirA), proteina K in R zunanje membrane (OmpK in OmpR), stresni protein 33 (Hsp33), flagelin C (FlaC) ter protein CheR. S pomočjo bioinformatskih analiz so določili še subcelično lokalizacijo proteinov, transmembranske domene, izolelektrične točke ter molekulske mase. Zapis za specifičen protein so ligirali v vektor PEASY-E1 ter z metodo toplotnega šoka transformirali ''E. coli'' BL21 (DE3). Po uspešni selekciji so bakterije prenesli v tekoče gojišče LB bujon in jih kultivirali do sredine logaritemske faze rasti. Očiščene rekombinantne proteine so nato ločili s poliakrilamidno gelsko elektroforezo in določili njihovo molekulsko maso. Nato so jih prenesli na membrano in ugotavljali, ali protitelesa proti ''V. anguillarum'' (fV-ab), ki so jih izolirali iz ''P. olivaceus'', lahko reagirajo z očiščenimi proteini.<br /> Pripravili so osem različnih vzorcev, ki so jih injicirali v ribe: šest vzorcev s specifičnim očiščenim rekombinantnim proteinom, vzorec z ''V. anguillarum'', ki so jih inaktivirali s formalinom (FKC), ter kontrolni vzorec s PBS. Pred imunizacijo so vsakemu vzorcu dodali adjuvans.<br /> <br /> == Cepljenje rib, vzorčenje, preizkus učinkovitosti ==<br /> <br /> Ribe ''P. olivaceus'', neokužene z ''V. anguillarum'', so naključno razporedili v osem skupin (150 rib/skupina) ter jim intraperitonealno injicirali po 100 μl določenega vzorca. Vsak teden (7-krat) po imunizaciji so šestim ribam iz vsake skupine odvzeli kri, izolirali limfocite ter pripravili serum. S pretočno citometrijo so določili delež celic s površinskim imunoglobulinom (celice sIg+). S testom ELISA pa so v serumu določili titer protiteles. Določali so titer fV-ab, titer protiteles proti rekombinantnim proteinom ter titer celokupnih protiteles.<br /> Peti teden po imunizaciji so 80 ribam iz vsake skupine intraperitonealno injicirali 100 μl žive ''V. anguillarum''. 15 zaporednih dni so spremljali umrljivost in izračunali relativno preživetje (RPS) po enačbi: RPS = [1 – (delež poginulih rib v skupini/delež poginulih rib v kontrolni skupini)] x 100 %.<br /> <br /> == Rezultati in zaključki ==<br /> <br /> Uspešno so izrazili vseh šest rekombinantnih proteinov, ki so po molekulski masi ustrezali naravnim proteinom, ter s prenosom western pokazali, da vseh šest lahko reagira s fV-ab. Injiciranje očiščenih rekombinantnih proteinov je pri ribah povzročilo namnožitev limfocitov sIg+ ter tvorbo celokupnih protiteles in specifičnih protiteles proti ''V. anguillarum'' oziroma rekombinantnim proteinom. Titer protiteles je po injiciranju vzorcev najprej naraščal, dosegel vrh in v zadnjih tednih merjenja upadel. <br /> 15 dni po injiciranju žive ''V. anguillarum'' so RPS za rekombinantne proteine FlaC, CheR, OmpR, OmpK, VirA ter Hsp33 znašali: 16,22 %, 27,03 %, 45,95 %, 62,16 %, 70,27 % ter 81,08 %. RPS za FKC je znašal 56,76 %. V vranici, jetrih ter ledvicah poginulih rib niso zaznali prisotnosti drugih bakterij, s čimer so pokazali, da je bil vzrok smrti dovzetnost za okužbo z ''V. anguillarum''.<br /> V študiji so tako pokazali, da rHsp33, rVirA ter OmpK ribam ''P. olivaceus'' nudijo dobro zaščito pred ''V. anguillarum'', zato bi jih lahko uporabili kot kandidatna cepiva.</div>

MojcaH https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2017&diff=12690 2017-04-17T18:50:56Z

<p>MojcaH: </p> <hr /> <div>'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''<br /> <br /> Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).<br /> <br /> Način vnosa:<br /> <br /> # The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops &amp; Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017<br /> (slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br /> <br /> <br /> '''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''<br /> <br /> <br /> '''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec)&lt;br&gt;<br /> # Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017<br /> # Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017<br /> # The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017<br /> <br /> <br /> '''Gensko spremenjene živali''' (15. marec)&lt;br&gt;<br /> # Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017<br /> # High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017<br /> # Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017<br /> <br /> <br /> '''Okolje''' (22. marec)&lt;br&gt;<br /> # Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017<br /> # Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017<br /> # Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017<br /> <br /> <br /> '''Terapevtski proteini''' (29. marec)&lt;br&gt;<br /> # Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017<br /> # Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017<br /> # Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017<br /> <br /> <br /> '''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april)&lt;br&gt;<br /> # Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo &quot;et al&quot;; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017<br /> # Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017<br /> # A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017<br /> <br /> <br /> '''Diagnostiki''' (12. april)&lt;br&gt; <br /> # Tjaša Košir - prestavljeno na 6.6.<br /> # Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) [[Zaznavanje zunajcelične miR-210 v urinu kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic]]. Petra Vivod, 12. april 2017<br /> # Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017<br /> <br /> <br /> '''Cepiva''' (19. april)&lt;br&gt;<br /> #Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih s cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april<br /> # A novel staphylococcal enterotoxin B subunit vaccine candidate elicits protective immune response in a mouse model (J. Y. Choi ''et al''; Toxicon 131, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041010117301071) [[Novo cepivo proti stafilokoknem enterotoksinu B izzove zaščitni imunski odziv pri miši]]. Amadeja Lapornik, 19. april 2017 <br /> #Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'') (J. Xing ''et al''; Microbial Pathogenesis 107, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857) [[Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije ''Vibrio Anguillarum'' kot kandidatna cepiva za ribo ''Paralichthys olivaceus'']]. Mojca Hunski, 19. aprila 2017<br /> <br /> <br /> '''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april)&lt;br&gt;<br /> # Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001 Stukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v ''Mycobacterium tuberculosis'' Vid Jazbec<br /> #Zala Gluhić<br /> #Katja Malovrh<br /> <br /> <br /> '''Male molekule in polimeri''' (3. maj)&lt;br&gt;<br /> # Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola. Petra Tavčar,3. marec 2017<br /> # Tim Božič<br /> # Tajda Buh<br /> <br /> <br /> '''Encimi''' (10. maj)&lt;br&gt;<br /> # Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900) Proizvodnja obnovljive ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalist s potencialno uporabo v industriji hrane. Nataša Traven, 10. maj 2017<br /> # Bine Tršavec<br /> # Simon Bolta<br /> <br /> <br /> '''Pretvorba biomase''' (17. maj)&lt;br&gt;<br /> # Inge Sotlar<br /> # Anja Herceg<br /> # The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5). Anja Tanšek, 17. maj 2017<br /> <br /> <br /> '''Metabolno inženirstvo''' (24. maj)&lt;br&gt;<br /> # Barbara Dušak<br /> # Tjaša Grum<br /> # Sara Kimm Fuhrmann<br /> <br /> <br /> '''Biološki viri energije''' (31. maj)&lt;br&gt;<br /> # Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017<br /> # A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij)&lt;br&gt;<br /> # Matjaž Ivanuša<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].</div>

MojcaH https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Ovrednotenje_%C5%A1estih_imunogenih_rekombinantnih_proteinov_bakterije_Vibrio_Anguillarum_kot_kandidatna_cepiva_za_ribo_Paralichthys_olivaceus&diff=12689 2017-04-17T18:48:36Z

<p>MojcaH: New page: [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857 Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of &#039;&#039;Vibrio anguillarum&#039;&#039; and evaluation them as vaccine can...</p> <hr /> <div>[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857 Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'')]<br /> <br /> ''Vibrio anguillarum'' je slanoljubna ter po Gramu negativna bakterija, ki povzroča hemoragično septikemijo pri ribah po celem svetu ter zaradi pomanjkljive in neučinkovite preventive povzroča ogromne ekonomske izgube v akvakulturni industriji. Obstajajo pa že kandidatna cepiva proti ''V. anguillarum''. S pomočjo celotnega zaporedja genoma bakterije ter bioinformatskih analiz so namreč lahko določili zaporedje genov, ki kodirajo imunogene proteine, ter predvideli njihovo lokalizacijo na subcelični ravni. Tako so s tehnologijo rekombinantne DNA pripravili cepiva iz delov patogena (»subunit vaccines«). V študiji so izbrali šest potencialnih antigenskih determinant iz ''V. angillarum'' in ovrednotili njihovo učinkovitost za zaščito ribe ''P. olivaceus''.<br /> <br /> == Priprava kandidatnih cepiv ==<br /> <br /> Iz podatkovne baze Genbank so pridobili zaporedja genov, ki kodirajo šest izbranih proteinov in imajo pomembno vlogo pri preživetju in patogenosti ''V. anguillarum'': virulenčni protein A (VirA), proteina K in R zunanje membrane (OmpK in OmpR), stresni protein 33 (Hsp33), flagelin C (FlaC) ter protein CheR. S pomočjo bioinformatskih analiz so določili še subcelično lokalizacijo proteinov, transmembranske domene, izolelektrične točke ter molekulske mase. Zapis za specifičen protein so ligirali v vektor PEASY-E1 ter z metodo toplotnega šoka transformirali ''E. coli'' BL21 (DE3). Po uspešni selekciji so bakterije prenesli v tekoče gojišče LB bujon in jih kultivirali do sredine logaritemske faze rasti. Očiščene rekombinantne proteine so nato ločili s poliakrilamidno gelsko elektroforezo in določili njihovo molekulsko maso. Nato so jih prenesli na membrano in ugotavljali, ali protitelesa proti ''V. anguillarum'' (fV-ab), ki so jih izolirali iz ''P. olivaceus'', lahko reagirajo z očiščenimi proteini.<br /> Pripravili so osem različnih vzorcev, ki so jih injicirali v ribe: šest vzorcev s specifičnim očiščenim rekombinantnim proteinom, vzorec z ''V. anguillarum'', ki so jih inaktivirali s formalinom (FKC), ter kontrolni vzorec s PBS. Pred imunizacijo so vsakemu vzorcu dodali adjuvans.<br /> <br /> == Cepljenje rib, vzorčenje, preizkus učinkovitosti ==<br /> <br /> Ribe ''P. olivaceus'', neokužene z ''V. anguillarum'', so naključno razporedili v osem skupin (150 rib/skupina) ter jim intraperitonealno injicirali po 100 μl določenega vzorca. Vsak teden (7-krat) po imunizaciji so šestim ribam iz vsake skupine odvzeli kri, izolirali limfocite ter pripravili serum. S pretočno citometrijo so določili delež celic s površinskim imunoglobulinom (celice sIg+). S testom ELISA pa so v serumu določili titer protiteles. Določali so titer fV-ab, titer protiteles proti rekombinantnim proteinom ter titer celokupnih protiteles.<br /> Peti teden po imunizaciji so 80 ribam iz vsake skupine intraperitonealno injicirali 100 μl žive ''V. anguillarum''. 15 zaporednih dni so spremljali umrljivost in izračunali relativno preživetje (RPS) po enačbi: RPS = [1 – (delež poginulih rib v skupini/delež poginulih rib v kontrolni skupini)] x 100 %.<br /> <br /> == Rezultati in zaključki ==<br /> <br /> Uspešno so izrazili vseh šest rekombinantnih proteinov, ki so po molekulski masi ustrezali naravnim proteinom, ter s prenosom western pokazali, da vseh šest lahko reagira s fV-ab. Injiciranje očiščenih rekombinantnih proteinov je pri ribah povzročilo namnožitev limfocitov sIg+ ter tvorbo celokupnih protiteles in specifičnih protiteles proti ''V. anguillarum'' oziroma rekombinantnim proteinom. Titer protiteles je po injiciranju vzorcev najprej naraščal, dosegel vrh in v zadnjih tednih merjenja upadel. <br /> 15 dni po injiciranju žive ''V. anguillarum'' so RPS za rekombinantne proteine FlaC, CheR, OmpR, OmpK, VirA ter Hsp33 znašali: 16,22 %, 27,03 %, 45,95 %, 62,16 %, 70,27 % ter 81,08 %. RPS za FKC je znašal 56,76 %. V vranici, jetrih ter ledvicah poginulih rib niso zaznali prisotnosti drugih bakterij, s čimer so pokazali, da je bil vzrok smrti dovzetnost za okužbo z ''V. anguillarum''.<br /> V študiji so tako pokazali, da rHsp33, rVirA ter OmpK ribam ''P. olivaceus'' nudijo dobro zaščito pred ''V. anguillarum'', zato bi jih lahko uporabili kot kandidatna cepiva.</div>

MojcaH https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2017&diff=12688 2017-04-17T18:28:47Z

<p>MojcaH: </p> <hr /> <div>'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''<br /> <br /> Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).<br /> <br /> Način vnosa:<br /> <br /> # The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops &amp; Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017<br /> (slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br /> <br /> <br /> '''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''<br /> <br /> <br /> '''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec)&lt;br&gt;<br /> # Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017<br /> # Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017<br /> # The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017<br /> <br /> <br /> '''Gensko spremenjene živali''' (15. marec)&lt;br&gt;<br /> # Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017<br /> # High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017<br /> # Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017<br /> <br /> <br /> '''Okolje''' (22. marec)&lt;br&gt;<br /> # Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017<br /> # Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017<br /> # Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017<br /> <br /> <br /> '''Terapevtski proteini''' (29. marec)&lt;br&gt;<br /> # Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017<br /> # Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) [[MGF-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za tkivno inženirstvo ligamentov]] . Peter Prezelj, 29. marca 2017<br /> # Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017<br /> <br /> <br /> '''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april)&lt;br&gt;<br /> # Therapeutic antibody targeting of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO2) inhibits autoimmune arthritis (L. M. F. Merlo &quot;et al&quot;; Clinical Immunology, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1521661616306052). [[Terapevtska protitelesa proti indolamin 2,3-dioksigenazi zavirajo avtoimunski artritis]]. Ema Guštin, 5. aprila 2017<br /> # Production of a tumor-targeting antibody with a human-compatible glycosylation profile in ''N. benthamiana'' hairy root cultures (C. Lonoce ''et al''; Biotechnology Journal, 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201500628/abstract) [[Proizvodnja protitumorskih protiteles s človeku kompatibilnim glikozilacijskim profilom v kulturah koreninskih laskov v Nicotiani benthamiani]]. Jan Rozman, 5.4.2017<br /> # A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) [[Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice]]. Alja Zgonc, 5. april 2017<br /> <br /> <br /> '''Diagnostiki''' (12. april)&lt;br&gt; <br /> # Tjaša Košir - prestavljeno na 6.6.<br /> # Detection of urinary cell-free miR-210 as a potential tool of liquid biopsy for clear cell renal cell carcinoma (G. Li ''et al''; Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.urolonc.2016.12.007) [[Zaznavanje zunajcelične miR-210 v urinu kot potencialni diagnostični test za odkrivanje svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic]]. Petra Vivod, 12. april 2017<br /> # Multiplex Detection of Extensively Drug Resistant Tuberculosis using Binary Deoxyribozyme Sensors (H. N. Bengtson ''et al''; Biosensors and Bioelectronics 94, 2017; http://dx.doi.org/10.1016/j.bios.2017.02.051) [[Multipleksna detekcija na zdravila odporne tuberkuloze z binarnimi deoksiribocimnimi senzorji]]. Marija Kisilak, 12. april 2017<br /> <br /> <br /> '''Cepiva''' (19. april)&lt;br&gt;<br /> #Enhanced humoral and CD8 + T cell immunity in mice vaccinated by DNA vaccine against human respiratory syncytial virus through targeting the encoded F protein to dendritic cells (Y. Hua ''et al''; International Immunopharmacology, Vol 46, 2017; http://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.02.023) [[Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih s cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice]]. Tomaž Rozmarič, 19. april<br /> # A novel staphylococcal enterotoxin B subunit vaccine candidate elicits protective immune response in a mouse model (J. Y. Choi ''et al''; Toxicon 131, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0041010117301071) [[Novo cepivo proti stafilokoknem enterotoksinu B izzove zaščitni imunski odziv pri miši]]. Amadeja Lapornik, 19. april 2017 <br /> #Protective efficacy of six immunogenic recombinant proteins of ''Vibrio anguillarum'' and evaluation them as vaccine candidate for flounder (''Paralichthys olivaceus'') (J. Xing ''et al''; Microbial Pathogenesis 107, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0882401017301857) Ovrednotenje šestih imunogenih rekombinantnih proteinov bakterije ''Vibrio Anguillarum'' kot kandidatna cepiva za ribo ''Paralichthys olivaceus''. Mojca Hunski, 19. aprila 2017<br /> <br /> <br /> '''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april)&lt;br&gt;<br /> # Structural Basis of ''Mycobacterium tuberculosis''Transcription and Transcription Inhibition http://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.03.001 Stukturna osnova transkripcije in transripcijske inhibicije v ''Mycobacterium tuberculosis'' Vid Jazbec<br /> #Zala Gluhić<br /> #Katja Malovrh<br /> <br /> <br /> '''Male molekule in polimeri''' (3. maj)&lt;br&gt;<br /> # Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola. Petra Tavčar,3. marec 2017<br /> # Tim Božič<br /> # Tajda Buh<br /> <br /> <br /> '''Encimi''' (10. maj)&lt;br&gt;<br /> # Production of the renewable extremophile lipase: Valuable biocatalyst with potential usage in food industry (M. Memarpoor-Yazdi ''et al''; Food and Bioproducts Processing 102, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960308516301900) Proizvodnja obnovljive ekstremofilne lipaze: dragocen biokatalist s potencialno uporabo v industriji hrane. Nataša Traven, 10. maj 2017<br /> # Bine Tršavec<br /> # Simon Bolta<br /> <br /> <br /> '''Pretvorba biomase''' (17. maj)&lt;br&gt;<br /> # Inge Sotlar<br /> # Anja Herceg<br /> # The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5). Anja Tanšek, 17. maj 2017<br /> <br /> <br /> '''Metabolno inženirstvo''' (24. maj)&lt;br&gt;<br /> # Barbara Dušak<br /> # Tjaša Grum<br /> # Sara Kimm Fuhrmann<br /> <br /> <br /> '''Biološki viri energije''' (31. maj)&lt;br&gt;<br /> # Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017<br /> # A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij)&lt;br&gt;<br /> # Matjaž Ivanuša<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].</div>

MojcaH https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2017&diff=12300 2017-03-01T14:11:41Z

<p>MojcaH: </p> <hr /> <div>'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''<br /> <br /> Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).<br /> <br /> Način vnosa:<br /> <br /> # The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops &amp; Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017<br /> (slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br /> <br /> <br /> '''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''<br /> <br /> <br /> '''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec)&lt;br&gt;<br /> # Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti ''Streptococcus pneumoniae'' v kloroplastih alge ''Chlamydomonas reinhardtii''. Eva Vidak, 8. marec 2017<br /> # Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) Bioinženiring rastlinske kulture ''Capsium frutescens'' z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina. Mojca Juteršek, 8. marec 2017<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Gensko spremenjene živali''' (15. marec)&lt;br&gt;<br /> # <br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Okolje''' (22. marec)&lt;br&gt;<br /> # Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) Okrasitev veziklov zunanje membrane z organofosforno hidrolazo in celuloza vezavno domeno za razgradnjo organofosfatnih pesticidov. Nina Roštan, 22. marec 2017<br /> # Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije. Eva Korošec, 22. marec 2017<br /> # Ana Cirnski<br /> <br /> <br /> '''Terapevtski proteini''' (29. marec)&lt;br&gt;<br /> # Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja iz sline transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev. Neža Levičnik, 29. marca 2017<br /> # Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) Mechano rastni faktor-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za inženirstvo tkiva ligamentov. Peter Prezelj, 29. marca 2017<br /> #Domen Klofutar<br /> <br /> <br /> '''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april)&lt;br&gt;<br /> # HIV antibodies for treatment of HIV infection (D. M. Margolis; Immunological reviews, 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/imr.12506/full). Protitelesa HIV za zdravljenje okužbe s HIV. Ema Guštin, 5. april 2017<br /> # Jan Rozman<br /> # Alja Zgonc<br /> <br /> <br /> '''Diagnostiki''' (12. april)&lt;br&gt; <br /> # Tjaša Košir<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Cepiva''' (19. april)&lt;br&gt;<br /> #Tomaž Rozmarič<br /> #Amadeja Lapornik<br /> #Mojca Hunski<br /> <br /> <br /> '''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april)&lt;br&gt;<br /> #Vid Jazbec &lt;3<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Male molekule in polimeri''' (3. maj)&lt;br&gt;<br /> # Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola. Petra Tavčar,3. marec 2017<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Encimi''' (10. maj)&lt;br&gt;<br /> # <br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Pretvorba biomase''' (17. maj)&lt;br&gt;<br /> #<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Metabolno inženirstvo''' (24. maj)&lt;br&gt;<br /> # Barbara Dušak<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Biološki viri energije''' (31. maj)&lt;br&gt;<br /> # Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij)&lt;br&gt;<br /> #<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].</div>

MojcaH