Wiki FKKT - User contributions [en]

Genetska vezja v metabolnem inženiringu

2016-01-17T15:08:28Z

Monika Praznik:

'''UVOD'''

Orodja in principi, ki jih ponuja sintezna biologija imajo velik potencial za uporabo v metabolnem inženiringu, hkrati pa je za njihovo uspešno uporabo potrebno premagati še mnogo preprek. Omenjene prepreke lahko razdelimo v tri skupine, ki zajemajo: senzorje, logična vezja in tarčenje večih genov. Robustnost le teh komponent je pri metabolnem inženiringu poglavitnega pomena, saj kot rezultat želimo specifičen metabolit v visokih koncentracijah s čim manjšimi izgubami.

'''POMEN METABOLNO RELEVANTNIH SENZORJEV'''

Celice so polne senzorjev, ki omogočajo stalno kontrolo notranjega in zunanjega okolja, s posredovanjem signala pa omogočijo tudi ustrezen odziv na zaznan signal. Tak način delovanja se je ohranil tekom evolucije in ga je zato smiselno posnemati.
Veliko vezij uporablja inducibilne promotorje, ki so odvisni od induktorjev dodanih v gojišče s strani raziskovalca, kar zahteva natančnejše spremljanje procesa, hkrati pa predstavlja dodaten strošek. Zaradi tega so bolj zaželjeni promotorji, ki posredno zaznavajo metabolite udeležene v željeni metabolni poti. Takšna strategija omogoča manj natančno spremljanje procesa in hkrati zniža njegove stroške. Biosenzorje je tako mogoče uporabljati za spremljanje metabolnih poti in določanje ozkih grl, nadzor pretoka metabolitov skozi metabolno pot in sintezo določenih produktov ob pravem času, kar zmanjša celični stres. Nenazadnje je cilj izboljšati donos željenega produkta, z ustvarjanjem medseboj povezanih, natančno uravnavanih vezij, ki so podobni naravnim metabolnim zankam.
Senzorji so lahko pridobljeni iz narave, naravne senzorje lahko spremenimo po meri ali pa jih sintetiziramo de novo. Cilj je ustvariti knjižnico ustrezno karakteriziranih senzorjev, ki se čim bolj uspešno odzovejo na širok izbor celičnih signalov. Seveda ni nujno, da senzorji služijo le zaznavanju specifičnih metabolitov, temveč jih je potrebno razvijati tudi v smeri drugih okoljskih dejavnikov (npr. prisotnost kisika, temperatura, svetloba...). Ustrezna uporaba senzorjev bi tako omogočila prekinitev oziroma omejitev sinteze produkta v stresnih razmerah (npr. pregrevanje fotobioreaktorjev v popoldanskih urah) in s tem omogočila nepotrebno trošenje energije za sintezo proteinov. Prav zaradi tega je uporaba senzorjev, ki zaznavajo intermediatov v željeni poti ustreznejša, kar pa bi lahko izboljšali z uporabo večjega števila takih senzorjev. Poleg omejitve nepotrebnega trošenja energije lahko s tem povečamo pretok skozi metabolno pot (odvajanje produkta).

'''KOMPLEKSNA VEZJA'''

Uporaba enega senzorja za uravnavanje metabolnih poti je že uveljavljena in je že prinesla zvišanje produktivnosti. Z uporabo večih senzorjev pa pride do potrebe po kompleksnejših vezij z večimi vhodi, kar omogoča finejšo uravnavanje metabolnih in s tem izboljša specifičnost odgovora in izloči lažne pozitivne ter lažne negativne signale. Zaradi povečane kompleksnosti takih vezij pa je njihova izgradnja izjemno zahtevna, zaradi česar velikokrat ne delujejo ustrezno. Neustrezno uravnavanje lahko vodi do celičnega stresa in s tem v evolucijsko nestabilnost in nižjo produkcijo. Problematična je tudi navzkrižna reaktivnost med posameznimi komponentami, ki prav tako vodi v nepredvideno delovanje vezja. Razvoj po mnenju avtorjev ovirajo tudi tehnične pomankljivosti, med katerimi prednjačita pomankljivost pravil načrtovanja in uporaba bioloških delov v različnih sistemih, kot so tisti v katerih so bili karakterizirani. Mehanizmi s katerimi se uravnavajo vezja so številna in se neprestano dopolnjujejo. Od začetne regulacije s transkripcijskimi dejavniki se je do danes razvilo veliko novih pristopov, ki vključujejo DNA rekombinacijo, posttranskripcijsko, posttranslacijsko regulacijo in tudi medsebojne kombinacije. Raziskave z multipli vhodi so že pokazale, da se pri uspešno načrtovanih vezijh taka dinamična kontrola pokaže z višjo produkcijo.
Pomembna lastnost takih vezij je, kot že prej omenjeno, tudi njihova robustnost in je zato le ta prioritetna lastnost pri načrtovanju kompleksnih vezij. Ker je večina vezij testiranih v kontroliranih pogojih taka karakterizacija ne pokaže morebitnih odstopanj v primeru sprememb, ki so večkrat prisotne ob povečevanju obsega. Dodatna težava so spontane mutacije vezja, ki lahko celici povzročijo breme, hkrati pa izgubijo načrtovano uravnavanje željene poti.
Za razvoj novih načinov vezij se je zato smiselno vprašati, kakšna ne-naravna vezja so glede na razpoložljive dele možna in pa morebitne prednosti naravnih vezij pred sinteznimi (v nekaterih primerih je rezultat delovanja naravnega in sintetičnega vezja enak, vendar se je smiselno vprašati zakaj se je tekom evolucije ohranil obstoječi naraven mehanizem).

'''STRATEGIJE TARČENJA VEČIH GENOV'''

Ker metabolne poti sestavljajo številni encimi, je potrebno upoštevati dejstvo, da mora naš sistem vplivati na izražanje večih genov. Tako lahko kontroliramo tok skozi metabolne poti preko regulacije prekurzorjev, odvajanje produkta in utišanjem kompetitivnih metabolnih poti, ko so razmere v celici optimalne. Za uspešno izvedbo takšnega načina je potrebna simultana in ortogonalna regulacija.
Ortogonalnost je ključnega pomena, saj želimo vplivati le na specifičen tarčen gen, nikakor pa ne želimo navzkrižne reaktivnosti. Najobetavnejši pristop so trenutno RNA molekule, saj njene interakcije potekajo preko komplementarnega parjenja, zato je njihova izdelava enostavna, hkrati pa jih je enostavno implementirati. Eden izmed načinov uporabe RNA je tudi CRISPR/Cas, ki je že bil uporabljen za konstrukcijo vezij za tarčenje večih genov. Kot nadgradnja obstaja tudi sistem kjer sgRNA vsebuje tudi vezavna mesta za druge proteine, ki lahko aktivirajo ali zavrejo ekspresijo gena. Ortogonalnost lahko dosežemo tudi pri proteinih (transkripcijski faktorji, polimeraza), kar so dokazali s proizvodnjo več variant polimeraze T7. Polimeraze so razstavili v fragmente, ki so se izražale glede na vhodne signale in se bolj ali manj selektivno vezale na svoje promotorje. Sestavili so tudi vezje, ki je omogočalo enako izražanje reporterskega proteina, kljub temu da se je nahajal enkrat na plazmidu, ki je v eni kopiji, enkrat pa na plazmidu, ki se v celici nahaja v več kopijah. Takšne strategije tarčenja več genov bi lahko skupaj z metabolno ustreznimi senzorji in kompleksnejšimi vezij kombinirali v celoto in bi služili k nadaljnem napredku metabolnega inženiringa.

'''STRATEGIJE NADALJNEGA RAZVOJA'''

S kombinacijo vseh treh komponent lahko pričakujemo razvoj metabolnih poti v smeri neodvisnosti od ostalih regulatornih komponent v celici. S skrbnim načrtovanjem bi celice, ki vsebujejo takšna vezja, lahko zaznavale spremembe v okolju (zunanjem in notranjem) in regulirale tok metabolitov v smeri željenega produkta, brez da bi ogrožale lasten obstoj. Takšna vezja naj bi glede na dosedanje raziskave olajšala delo raziskovalcem in rezultirala v višji produktivnosti. Napredovanje sintezne biologije do te stopnje pa zahteva spremembe v načinu oblikovanja, konstrukcije in testiranja vezij. Kot prvo je potrebno nadomestiti standardno uporabljene senzorje (pLac) in jih nadomestiti s takšnimi, ki imajo glede na željeni cilj večji pomen. V primeru metabolnih poti so to senzorji za intermediate in okoljske parametre. Kljub temu, da nekatere raziskave na tem področju dokazujejo izboljšanje z uporabo te strategije, so biološki deli večinoma nedostopni. Za povečanje diverzitete senzorjev in ostalih komponent vezij je zato potrebno najprej izpostaviti uspešne sisteme iskanja/izumljanja, karakterizacije in implementacije.
Nadaljna pomembna lastnost kompleksnejših vezij je večkrat omenjena robustnost. Kompleksnejša vezja so namreč manj robustna, kar na krajši rok lahko pomeni stresne razmere v celici, na daljši rok pa to vodi v izgubo kontrole nad delom ali kar celotnim sistemom. V kontroliranih pogojih so nekateri že uspeli implementirati kompleksnejša vezja, vendar bi jih bilo za razširjeno uporabo potrebno prilagoditi tudi spreminjajočem se okolju. Za rešitev omenjenih problemov je pomembno raziskati tudi natančnejše mehanizme, ki pripeljejo do metabolnega bremena. Kot je razvidno iz opisanih sestavnih delov vezja: senzorja, logičnih vrat in tarčenja več genov hkrati, so naštete komponente dobro razvite in uspešno uporabljene potrebno pa jih je uspešno združiti, da bodo služile potrebam metabolnega inženiringa. Sintezna biologija tako zagotavlja ustrezna orodja za sestavo takšnih vezij, ne smemo pa zanemariti tudi razvoj orodji, ki omogočajo sestavljanje in vstavljanje vedno bolj kompleksnih vezij v tarčnih organizmih in odkrivanje kritičnih genov in njihove regulacije v posameznih metabolnih poteh.

'''VIRI'''

Hoynes-O’Connor A. in Moon T.S. Programmable genetic circuits for pathway engineering. Current Oppinion in Biotechnology, 2015, 36:115 –121

David Sprinzak D. In Elowitz M.B. Reconstruction of genetic circuits. Nature, 2005 438, 443-448 doi:10.1038/nature04335

Michener J.K., Thodey K., Liang J.C. in Smolke C.D. Applications of Genetically-Encoded Biosensors for the Construction and Control of Biosynthetic Pathways. Metab Eng. 2012 May ; 14(3): 212–222. doi:10.1016/j.ymben.2011.09.004

Nielsen A.A.K. , Segall-Shapiro T.H. in Christopher A Voigt C.A. Advances in genetic circuit design: novel biochemistries, deep part mining, and precision gene expression. Current Opinion in Chemical Biology 2013, 17:878 –892

Genetska vezja v metabolnem inženiringu

2016-01-17T15:07:25Z

Monika Praznik: New page: '''GENETSKA VEZJA V METABOLNEM INŽENIRINGU''' '''UVOD''' Orodja in principi, ki jih ponuja sintezna biologija imajo velik potencial za uporabo v metabolnem inženiringu, hkrati pa je za...

'''GENETSKA VEZJA V METABOLNEM INŽENIRINGU'''

'''UVOD'''

Orodja in principi, ki jih ponuja sintezna biologija imajo velik potencial za uporabo v metabolnem inženiringu, hkrati pa je za njihovo uspešno uporabo potrebno premagati še mnogo preprek. Omenjene prepreke lahko razdelimo v tri skupine, ki zajemajo: senzorje, logična vezja in tarčenje večih genov. Robustnost le teh komponent je pri metabolnem inženiringu poglavitnega pomena, saj kot rezultat želimo specifičen metabolit v visokih koncentracijah s čim manjšimi izgubami.

'''POMEN METABOLNO RELEVANTNIH SENZORJEV'''

Celice so polne senzorjev, ki omogočajo stalno kontrolo notranjega in zunanjega okolja, s posredovanjem signala pa omogočijo tudi ustrezen odziv na zaznan signal. Tak način delovanja se je ohranil tekom evolucije in ga je zato smiselno posnemati.
Veliko vezij uporablja inducibilne promotorje, ki so odvisni od induktorjev dodanih v gojišče s strani raziskovalca, kar zahteva natančnejše spremljanje procesa, hkrati pa predstavlja dodaten strošek. Zaradi tega so bolj zaželjeni promotorji, ki posredno zaznavajo metabolite udeležene v željeni metabolni poti. Takšna strategija omogoča manj natančno spremljanje procesa in hkrati zniža njegove stroške. Biosenzorje je tako mogoče uporabljati za spremljanje metabolnih poti in določanje ozkih grl, nadzor pretoka metabolitov skozi metabolno pot in sintezo določenih produktov ob pravem času, kar zmanjša celični stres. Nenazadnje je cilj izboljšati donos željenega produkta, z ustvarjanjem medseboj povezanih, natančno uravnavanih vezij, ki so podobni naravnim metabolnim zankam.
Senzorji so lahko pridobljeni iz narave, naravne senzorje lahko spremenimo po meri ali pa jih sintetiziramo de novo. Cilj je ustvariti knjižnico ustrezno karakteriziranih senzorjev, ki se čim bolj uspešno odzovejo na širok izbor celičnih signalov. Seveda ni nujno, da senzorji služijo le zaznavanju specifičnih metabolitov, temveč jih je potrebno razvijati tudi v smeri drugih okoljskih dejavnikov (npr. prisotnost kisika, temperatura, svetloba...). Ustrezna uporaba senzorjev bi tako omogočila prekinitev oziroma omejitev sinteze produkta v stresnih razmerah (npr. pregrevanje fotobioreaktorjev v popoldanskih urah) in s tem omogočila nepotrebno trošenje energije za sintezo proteinov. Prav zaradi tega je uporaba senzorjev, ki zaznavajo intermediatov v željeni poti ustreznejša, kar pa bi lahko izboljšali z uporabo večjega števila takih senzorjev. Poleg omejitve nepotrebnega trošenja energije lahko s tem povečamo pretok skozi metabolno pot (odvajanje produkta).

'''KOMPLEKSNA VEZJA'''

Uporaba enega senzorja za uravnavanje metabolnih poti je že uveljavljena in je že prinesla zvišanje produktivnosti. Z uporabo večih senzorjev pa pride do potrebe po kompleksnejših vezij z večimi vhodi, kar omogoča finejšo uravnavanje metabolnih in s tem izboljša specifičnost odgovora in izloči lažne pozitivne ter lažne negativne signale. Zaradi povečane kompleksnosti takih vezij pa je njihova izgradnja izjemno zahtevna, zaradi česar velikokrat ne delujejo ustrezno. Neustrezno uravnavanje lahko vodi do celičnega stresa in s tem v evolucijsko nestabilnost in nižjo produkcijo. Problematična je tudi navzkrižna reaktivnost med posameznimi komponentami, ki prav tako vodi v nepredvideno delovanje vezja. Razvoj po mnenju avtorjev ovirajo tudi tehnične pomankljivosti, med katerimi prednjačita pomankljivost pravil načrtovanja in uporaba bioloških delov v različnih sistemih, kot so tisti v katerih so bili karakterizirani. Mehanizmi s katerimi se uravnavajo vezja so številna in se neprestano dopolnjujejo. Od začetne regulacije s transkripcijskimi dejavniki se je do danes razvilo veliko novih pristopov, ki vključujejo DNA rekombinacijo, posttranskripcijsko, posttranslacijsko regulacijo in tudi medsebojne kombinacije. Raziskave z multipli vhodi so že pokazale, da se pri uspešno načrtovanih vezijh taka dinamična kontrola pokaže z višjo produkcijo.
Pomembna lastnost takih vezij je, kot že prej omenjeno, tudi njihova robustnost in je zato le ta prioritetna lastnost pri načrtovanju kompleksnih vezij. Ker je večina vezij testiranih v kontroliranih pogojih taka karakterizacija ne pokaže morebitnih odstopanj v primeru sprememb, ki so večkrat prisotne ob povečevanju obsega. Dodatna težava so spontane mutacije vezja, ki lahko celici povzročijo breme, hkrati pa izgubijo načrtovano uravnavanje željene poti.
Za razvoj novih načinov vezij se je zato smiselno vprašati, kakšna ne-naravna vezja so glede na razpoložljive dele možna in pa morebitne prednosti naravnih vezij pred sinteznimi (v nekaterih primerih je rezultat delovanja naravnega in sintetičnega vezja enak, vendar se je smiselno vprašati zakaj se je tekom evolucije ohranil obstoječi naraven mehanizem).

'''
STRATEGIJE TARČENJA VEČIH GENOV'''

Ker metabolne poti sestavljajo številni encimi, je potrebno upoštevati dejstvo, da mora naš sistem vplivati na izražanje večih genov. Tako lahko kontroliramo tok skozi metabolne poti preko regulacije prekurzorjev, odvajanje produkta in utišanjem kompetitivnih metabolnih poti, ko so razmere v celici optimalne. Za uspešno izvedbo takšnega načina je potrebna simultana in ortogonalna regulacija.
Ortogonalnost je ključnega pomena, saj želimo vplivati le na specifičen tarčen gen, nikakor pa ne želimo navzkrižne reaktivnosti. Najobetavnejši pristop so trenutno RNA molekule, saj njene interakcije potekajo preko komplementarnega parjenja, zato je njihova izdelava enostavna, hkrati pa jih je enostavno implementirati. Eden izmed načinov uporabe RNA je tudi CRISPR/Cas, ki je že bil uporabljen za konstrukcijo vezij za tarčenje večih genov. Kot nadgradnja obstaja tudi sistem kjer sgRNA vsebuje tudi vezavna mesta za druge proteine, ki lahko aktivirajo ali zavrejo ekspresijo gena. Ortogonalnost lahko dosežemo tudi pri proteinih (transkripcijski faktorji, polimeraza), kar so dokazali s proizvodnjo več variant polimeraze T7. Polimeraze so razstavili v fragmente, ki so se izražale glede na vhodne signale in se bolj ali manj selektivno vezale na svoje promotorje. Sestavili so tudi vezje, ki je omogočalo enako izražanje reporterskega proteina, kljub temu da se je nahajal enkrat na plazmidu, ki je v eni kopiji, enkrat pa na plazmidu, ki se v celici nahaja v več kopijah. Takšne strategije tarčenja več genov bi lahko skupaj z metabolno ustreznimi senzorji in kompleksnejšimi vezij kombinirali v celoto in bi služili k nadaljnem napredku metabolnega inženiringa.

'''STRATEGIJE NADALJNEGA RAZVOJA'''

S kombinacijo vseh treh komponent lahko pričakujemo razvoj metabolnih poti v smeri neodvisnosti od ostalih regulatornih komponent v celici. S skrbnim načrtovanjem bi celice, ki vsebujejo takšna vezja, lahko zaznavale spremembe v okolju (zunanjem in notranjem) in regulirale tok metabolitov v smeri željenega produkta, brez da bi ogrožale lasten obstoj. Takšna vezja naj bi glede na dosedanje raziskave olajšala delo raziskovalcem in rezultirala v višji produktivnosti. Napredovanje sintezne biologije do te stopnje pa zahteva spremembe v načinu oblikovanja, konstrukcije in testiranja vezij. Kot prvo je potrebno nadomestiti standardno uporabljene senzorje (pLac) in jih nadomestiti s takšnimi, ki imajo glede na željeni cilj večji pomen. V primeru metabolnih poti so to senzorji za intermediate in okoljske parametre. Kljub temu, da nekatere raziskave na tem področju dokazujejo izboljšanje z uporabo te strategije, so biološki deli večinoma nedostopni. Za povečanje diverzitete senzorjev in ostalih komponent vezij je zato potrebno najprej izpostaviti uspešne sisteme iskanja/izumljanja, karakterizacije in implementacije.
Nadaljna pomembna lastnost kompleksnejših vezij je večkrat omenjena robustnost. Kompleksnejša vezja so namreč manj robustna, kar na krajši rok lahko pomeni stresne razmere v celici, na daljši rok pa to vodi v izgubo kontrole nad delom ali kar celotnim sistemom. V kontroliranih pogojih so nekateri že uspeli implementirati kompleksnejša vezja, vendar bi jih bilo za razširjeno uporabo potrebno prilagoditi tudi spreminjajočem se okolju. Za rešitev omenjenih problemov je pomembno raziskati tudi natančnejše mehanizme, ki pripeljejo do metabolnega bremena. Kot je razvidno iz opisanih sestavnih delov vezja: senzorja, logičnih vrat in tarčenja več genov hkrati, so naštete komponente dobro razvite in uspešno uporabljene potrebno pa jih je uspešno združiti, da bodo služile potrebam metabolnega inženiringa. Sintezna biologija tako zagotavlja ustrezna orodja za sestavo takšnih vezij, ne smemo pa zanemariti tudi razvoj orodji, ki omogočajo sestavljanje in vstavljanje vedno bolj kompleksnih vezij v tarčnih organizmih in odkrivanje kritičnih genov in njihove regulacije v posameznih metabolnih poteh.

'''VIRI'''

Hoynes-O’Connor A. in Moon T.S. Programmable genetic circuits for pathway engineering. Current Oppinion in Biotechnology, 2015, 36:115 –121

David Sprinzak D. In Elowitz M.B. Reconstruction of genetic circuits. Nature, 2005 438, 443-448 doi:10.1038/nature04335

Michener J.K., Thodey K., Liang J.C. in Smolke C.D. Applications of Genetically-Encoded Biosensors for the Construction and Control of Biosynthetic Pathways. Metab Eng. 2012 May ; 14(3): 212–222. doi:10.1016/j.ymben.2011.09.004

Nielsen A.A.K. , Segall-Shapiro T.H. in Christopher A Voigt C.A. Advances in genetic circuit design: novel biochemistries, deep part mining, and precision gene expression. Current Opinion in Chemical Biology 2013, 17:878 –892

Seminarji SB 2015/16

2016-01-17T15:02:16Z

Monika Praznik:

Seminarji iz Sintezne biologije v študijskem letu 2015/16 so:

Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/2866/synthetic-biology-engineering-complexity-and-refactoring-cell-capabilities SYNTHETIC BIOLOGY: ENGINEERING COMPLEXITY AND REFACTORING CELL CAPABILITIES]

* Production of fatty acid-derived valuable chemicals in synthetic microbes ([[Proizvodnja kemikalij iz derivatov maščobnih kislin s pomočjo sintetičnih mikroorganizmov]]) (Maja Grdadolnik) 
* Optimization of the IPP precursor supply for the production of lycopene, decaprenoxanthin and astaxanthin by Corynebacterium glutamicum ([[Optimizacija sinteze IPP kot prekursorja za produkcijo likopena, dekaprenoksantina in astaksantina v Corynebacterium glutamicum]]) (Griša Prinčič) 
* Engineering sugar utilization and microbial tolerance toward lignocellulose conversion [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konverzija_lignoceluloze_s_pomočjo_izkoriščanja_mikrobne_tolerance_in_inženiringa_sladkorjev] (Kim Potočnik) 
* Cofactor engineering for enhancing the flux of metabolic pathways [[INŽENIRING KOFAKTORJEV ZA IZBOLJŠANJE METABOLIČNIH POTI]] (Nastja Štemberger) 
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4354409/ Can the natural diversity of quorum-sensing advance synthetic biology?] ([[Ali lahko naravna diverziteta quorum sensinga pripomore k napredku v sintezni biologiji?]]) (Tina Snoj) 
* [http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fbioe.2015.00093/full Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits] ([[Določanje učinkovitosti bioloških naprav in vezij z razmerjem signal-šum]]) (Jakob G. Lavrenčič) 
* A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli ([[Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli]]) (Ajda Rojc) 
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4211546/ New transposon tools tailored for metabolic engineering of Gram-negative microbial cell factories] ([[Metabolični inženiring gram-negativnih bakterij s transpozonskim sistemom]]) (Rok Razpotnik) 

Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/455/synthetic-biology-applications-in-industrial-microbiology SYNTHETIC BIOLOGY APPLICATIONS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY]

* Recent Progress in Synthetic Biology for Microbial Production of C3–C10 Alcohols (Urška Rauter) ([[Napredki v sintezni biologiji pri proizvodnji C3-C10 alkoholov v mikroorganizmih]])
* Visualizing Evolution in Real-Time Method for Strain Engineering ([[Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo]]) (Samo Zakotnik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3367458/ Engineering Microbial Consortia to Enhance Biomining and Bioremediation] ([[Načrtovanje mikrobnih konzorcijev za izboljšanje biorudarstva in bioremediacije]]) (Maja Kostanjevec)
* Engineering Microbial Chemical Factories to Produce Renewable “Biomonomers” ([[Mikrobiološka proizvodnja obnovljivih biomonomerov in bioplastike]])(Nastja Pirman)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3446811/ Application of Synthetic Biology in Cyanobacteria and Algae] ([[Uporaba sintezne biologije v cianobakterijah in algah]]) (Špela Tomaž)
* Synthetic Feedback Loop Model for Increasing Microbial Biofuel Production Using a Biosensor ([[Model s povratno zanko za povečanje mikrobne produkcije biogoriva z uporabo biosenzorja]])(Jernej Pušnik)
* Balance of XYL1 and XYL2 Expression in Different Yeast Chassis for Improved xylose Fermentation ([[Ravnotežje med ekspresijo XYL1 in XYL2 v različnih šasijah kvasovk v povezavi s povečano fermentacijo ksiloze]]) (Monika Praznik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3630320/ Design and Development of Synthetic Microbial Platform Cells for Bioenergy] ([[Načrtovanje in razvijanje sintetičnih mikrobnih celičnih platform za pridobivanje bioenergije]])(Erik Mršnik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3616241/ Microbial Production of Isoprenoids Enabled by Synthetic Biology] ([[Mikrobna produkcija izoprenoidov s sintezno biologijo]]) (Dominik Kert)
* Chemical synthetic biology: a mini-review ([[Kratki pregled kemijske sintezne biologije]]) (Anka Hotko)

Seminarji iz preglednih člankov:

* [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S002228361500618X Towards engineering biological systems in a broader context] ([[Inženiring bioloških sistemov v širšem kontekstu]]) (Aleksander Benčič)
* [http://revistes.iec.cat/index.php/IM/article/viewFile/139212/137876 Synthetic biology: Novel approaches for microbiology] ([[Sintezno biološki pristopi v mikrobiologiji]]) (Daša Janeš)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26463592 Tools and principles for microbial gene circuit engineering] (Marko Radojković)
* Sensitive cells: enabling tools for static and dynamic control of microbial metabolic pathways ([[Dinamično uravnavanje (regulacija) metabolnih poti]]) (Katja Leben)
* Chassis optimization as a cornerstone for the application of synthetic biology based strategies in microbial secondary metabolism ([[Oprimizacija šasij kot osnovni korak pri uporabi sintezno biološkega pristopa pri karakterizaciji mikrobnega sekundarnega metabolizma]]) (Jure Zabret)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4571725/ Recent advances and opportunities in synthetic logic gates engineering in living cells] ([[Napredki v načrtovanju bioloških logičnih vrat v živih celicah]]) (Monika Biasizzo)
* Programmable genetic circuits for pathway engineering ([[Genetska vezja v metabolnem inženiringu]])(Urban Javoršek)
* [http://web.media.mit.edu/~neri/MATTER.MEDIA/Publications/Better_together-_engineering_and_application_of_microbial_symbioses.pdf Better together: engineering and application of microbial symbioses] ([[V slogi je moč: načrtovanje in uporaba mikrobne simbioze]]) (Nejc Petrišič)
* Synthetic biology for microbial production of lipid-based biofuels ([[Produkcija lipidnih biogoriv s sintezno biologijo]]) (Urška Pevec)
* Engineering Biosynthesis Mechanisms for Diversifying Polyhydroxyalkanoates ([[Inženiring biosintetskih mehanizmov za raznolike polihidroksialkanoate]]) (Mojca Banič)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4519758/pdf/fmicb-06-00775.pdf Synthetic biology of fungal natural products] ([[Sintezna biologija naravnih produktov (nitastih) gliv]]) (Estera Merljak)
* Synthetic biology and biomimetic chemistry as converging technologies fostering a new generation of smart biosensors ([[Sintezna biologija in biomimetika pri razvoju biosenzorjev]]) (Benjamin Bajželj)
* [http://splasho.com/blog/papers/Bioluminescence.pdf How Synthetic Biology Would Reconsider Natural Bioluminescence and its Application] (Ana Grom & Ana Unkovič) 
* Synthetic Biology-Toward Therapeutic Solutions ([[Uporaba sintezne biologije v terapevtske namene]]) (Tanja Korpar)
* Synthetically modified mRNA for efficient and fast human iPS cell generation and direct transdifferentiation to myoblasts (Mirjana Malnar)
* Mammalian synthetic biology: emerging medical applications([[Sintezna biologija sesalcev in medicinske aplikacije]]) ( Maša Mirkoviić)
biology devices and circuits for RNA-based ‘smart vaccines’: a propositional review (Monika Škrjanc)

Ravnotežje med ekspresijo XYL1 in XYL2 v različnih šasijah kvasovk v povezavi s povečano fermentacijo ksiloze

2016-01-07T15:50:50Z

Monika Praznik:

'''UVOD S POVZETKOM'''

''Saccharomyces cerevisiae'' se v industriji pogosto uporablja za fermentacijo etanola. Ksiloza je ena izmed glavnih sestavin biomase in je derivat hemiceluloze. Vendar pa naravni sev ni sposoben asimilirati ksiloze in zato je v zadnjih letih veliko zanimanja za rekombinantno ''S. cerevisiae'', ki je sposobna fermentacije ksiloze. Z njeno optimizacijo bi lahko izboljšali izkoristek ksiloze v proizvodnji goriv in kemikalij. Omenjena rekombinantna kvasovka vsebuje ksilozno pot iz kvasovke, ki ksilozno pot vsebuje naravno (na primer ''Scheffersomyces stipitis''). V tej poti pride do redukcije ksiloze do ksilitola s pomočjo od NADPH odvisne ksiloza reduktaze (XR), ki je kodirana z genom ''XYL1''. Nato se ksilitol pretvori do ksiluloze s pomočjo od NAD+ odvisne ksilitol dehidrogenaze (XDH), za katero kodira gen ''XYL2''. Ksiluloza se lahko s pomočjo ksilulokonaze (XK) fosforilira do ksiluloza 5-fosfata (X-5P) in nadaljuje svoj metabolizem v pentoza fosfatni poti in glikolizi. Druga pot, po kateri lahko v enem koraku pride do pretvorbe ksiloze do ksiluloze, pa je ksiloza izomerazna pot. Uspešno so klonirali ksiloza izomerazo iz glive ''Pyromyces sp.''; produktivnost etanola je bila 1,6 - krat nižja kot pri poti XR-XDH (ksiloza reduktazna-ksilitol dehidrogenazna pot), celotna proizvodnja etanola (0,43 g/g) pa 30,0 % višja. Kljub temu se trenutno veliko znanstvenikov ukvarja z XR-XDH metabolno potjo z namenom izboljšati produkcijo etanola. Količina etanola, ki ga dobimo s fermentacijo ksiloze je zelo nizka, ker se veliko ksiloze izloči v svoji reducirani obliki, kot ksilitol. Tvorba ksilitola je povezana s preferenco kofaktorjev do XR in XDH, kar povzroči redoksno neravnotežje in vodi do akumulacije ksilitola. Produkcija ksilitola je povezana s porabo NADPH in uničuje ravnotežje reduktivnih vodikovih zvrsti. Poleg spreminjanja preference kofaktorjev, lahko izkoristek ksiloze povečamo tudi z ravnotežjem aktivnosti XR in XDH, kar bi omogočilo recikliranje NADPH in izboljšalo produkcijo etanola. Pomemben faktor pa je tudi izbira šasije kvasovk, kajti encimi ne-oksidativne pentoza fosfatne poti imajo različno aktivnost pri različnih šasijah, to pa pomeni različne sposobnosti metabolizma ksiluloze. V tej študiji so uporabili dve osnovni šasiji, W303a ter L2612.
V tej študiji so želeli rekombinantne kvasovke ''Saccharomyces cerevisiae'' uporabiti za bolj učinkovito proizvodnjo etanola iz ksiloze s pomočjo ksiloza reduktazne-ksilitol dehidrogenazne poti (XR-XDH pot). Za čimboljši izkoristek ksiloze so morali zmanjšati tvorbo ksilitola. To so naredili s kontroliranim izražanjem genov ''XYL1'' (kodira za ksiloza reduktazo - XR) in mutiranim ''XYL2'' (kodira za od NADP+ odvisno ksilotol dehidrogenazo - XDH). Za manipulacijo ekspresijskega nivolja ''XYL1'' so uporabili tri promotorje, za regulacijo izražanja ''XYL2'' pa dva plazmida z različnim številom kopij tega gena. Uporabili so dve šasiji kvasovk in sicer W303a ter L2612. Kot najuspešnejši se je izkazal sev pridobljen iz šasije L2612, ki je imel ''XYL1'' pod promotorjem PGK1 (fosfoglicerat kinaza 1) in dve kopiji ''XYL2''. Proizvajal je 21,3 % manj ksilitola in 40,0 % več etanola kot kontrolna linija.
Za ugotavljanje primerne ekspresijske ravni ''XYL1'', ki bi bila kompatibilna z ''mXYL2'', so za ekspresijo ''XYL1'' uporabili tri promotorje (celoten ADH1, ADH1; skrajšan ADH1, tADH1; PGK1) v povezavi z ''XYL2'' pod promotorjem PGK1. ADH1 je konstitutivni promotor, ki naravno v kvasovki uravnava ekspresijo alkohol dehidrogenaze. Promotor PGK1 naravno kontrolira ekspresijo fosfoglicerat kinaze, v sintezni biologiji pa je najbolj učinkovit promotor v ''S. cerevisiae'', ko želimo zagotoviti konstitutivno in visoko ekspresijo določenega gena.
Celično gostoto so spremljali z merjenjem absorbance na spektrometru pri valovni dolžini 600 nm. Iz kulture so v enakomernih časovnih intervalih odvzemali vzorce, jih centrifugirali (9600x g, 5 min) in supernatant uporabili za meritve na HPLC.

'''REZULTATI'''

''ŠASIJE W303C, W303tAR, W303AR in W303PR''

Linije, ki so jih pripravili iz šasije W303a, so bile W303tAR, W303AR in W303PR, pri njih je bil XYL1 pod kontrolo bodisi tADH1, ADH1 ali PGK1. Te linije so v aerobnih pogojih asimilirale 74,5 %, 146,3 % in 14,8-krat več ksiloze kot kontrola (W303C). Količina ksilitola je bila pri W303tAR in W303C približno enaka, pri W303AR in W303PR pa višja (73,5 % in 30,6 %) kot pri kontroli W303C. Kljub temu, da je bil privzem ksiloze pri W303AR večji kot pri kontroli W303C in W303tAR, pa ni nastalo skoraj nič biomase, ker se je večina ksiloze izločila v obliki ksilitola med rastjo. Za najbolj uspešnega se je pri privzemu ksiloze v šasiji W303a torej izkazal promotor PGK1. Da bi ugotovili sposobnost linije W303PR za produkcijo etanola iz ksiloze so izvajali ksilozno fermentacijo pri različnih koncentracijah ksiloze (do 50 g/l) in različnih aeracijah. Žal se je izkazalo, da do produkcije etanola ne pride, tvori pa se veliko ksilitola in zato so zaključili, da šasija W303a ni primerna za proizvodnjo etanola iz ksiloze. Razlog za ničelno produkcijo etanola bi lahko bil ta, da ksiloza inducira preusmeritev metabolizma v Krebsov cikel, kar je združljivo s celično rastjo med ksilozno fermentacijo. V nadaljevanju so se osredotočili na šasijo L2612.

''PRIMERJAVA DVEH ŠASIJ ZA EKSPRESIJO POTI XR-XDH''

Tudi v šasijo L2612 so vstavili enake tri promotroje kot v W303a in dobili nove linije L2612AR, L2612tAR in L2612PR. Samo linija L2612PR, ki je vsebovala najmočnejši promotor PGK1, je dovolj hitro rastla pod aerobnimi pogoji in konzumirala vso ksilozo. Liniji L2612AR in L2612tAR nista bili uspešni, ker je bila njuna rast počasna, konzumirali pa sta le 17,3 % in 15,7 % ksiloze. V nadaljevanju so zato primerjali liniji L2612PR in W303PR v pogojih z različno dostopnostjo kisika. Linija L2612PR je v vseh pogojih proizvajala manj ksilitola kot W303PR, kar kaže na večjo usklajenost med XR in XDH pri liniji L2612PR. Poleg tega je bilo v aerobnih pogojih pri L2612PR približno polovico manj glicerola kot pri W303PR. Ob zmanjšanju kisika se je asimilacija ksiloze zmanjšala tako pri L2612PR (za 44,8 %) kot pri W303PR (za 20,3 %), kar kaže na to, da je metabolizem ksiloze v liniji L2612PR bolj odvisen od prisotnosti kisika. Ob pomanjkanju kisika je blokirana respiratorna pot kar vodi v zmanjšan metabolizem ksiloze.
Glede na produkcijo ksilitola in glicerola so zaključili, da je šasija L2612 boljša za ekspresijo ksilozne poti za produkcijo etanola. L2612 bi lahko bila začetna linija, pri kateri bi z modifikacijami dosegli zmanjšano produkcijo ksilitola in povečali produkcijo etanola v anaerobnih pogojih.

''VPLIV RAZLIČNIH NIVOJEV ''XYL2'' NA FERMENTACIJO KSILOZE''

Od NAD+ odvisna ksilitol dehidrogenaza (XDH) je direktno povezana s pretvorbo ksilitola do ksiluloze, ki je v nadaljevanju metabolizirana v ne-oksidativni pentoza fosfatni poti (PPP). Zato so sklepali, da bo povečanje ekspresije ''mXYL2'' zmanjšalo sekrecijo ksilitola, pospešilo metabolizem v smeri ne-oksidativne PPP in posledično vodilo do povečane produkcije etanola. V liniji L2612PR so overekspresionirali ''mXYL2'' in dobili štiri linije; L2612PR-MD, L2612PR-MC, L2612PR-D in L2612PR-C. L2612PR-MD je vsebovala več kopij plazmida z ''mXYL2'', L2612PR-MC je predstavljala njeno kontrolo. L2612PR-D je imela v genom vstavljeno eno kopijo ''mXYL2'' več kot njena kontrola L2612PR-C. Najprej so asimilacijo ksiloze ter produkcijo ksilitola, glicerola in etanola testirali v aerobnih, nato pa še v anaerobnih pogojih pri vseh štirih linijah. Ugotovili so, da overekspresija ''mXYL2'' v linijah L2612PR povzroči povečano produkcijo etanola in zmanjšano tvorbo ksilitola iz ksiloze, kar kaže na to, da ima ekspresija ''mXYL2'' pomembno vlogo pri regulaciji metabolizma ksiloze.

'''ZAKLJUČKI'''

Rezultati so pokazali, da je samo najmočnejši izmed uporabljenih promotorjev (PGK1) povečal privzem ksiloze in njen metabolizem, zato sklepamo, da je nujen za visoko aktivnost XR pri fermentaciji ksiloze. Pri primerjavi fermentacijskih sposobnosti med rekombinantnimi linijami iz šasij W303a in L2612 so ugotovili, da je najbolj učinkovita linija L2612PR, razvita iz šasije L2612. Za povečanje ekspresije ''mXYL2'' so ustvarili linije z eno dodatno kopijo ''mXYL2'' (L2612PR-D) in več dodatnimi kopijami ''mXYL2'' (L2612-MD), kar je rezultiralo v 21 % nižji produkciji ksilitola in 35-40 % višji produkciji etanola. To kaže na pomembno vlogo XDH pri zmanjšani akumulaciji ksilitola in pospeševanju metabolizma ksiloze v kasnejših fazah fermentacije. Pokazali so, da je optimizacija šasij v kombinaciji z ravnotežjem metabolnih encimov primeren pristop za konstruiranje kvasovk ''S. cerevisiae'', ki fermentirajo ksilozo v etanol.

'''VIRI'''

- Zha J., Hu M., Shen M., Li B., Wang J., Yuan Y. 2012. Balance of XYL1 and XYL2 expression in different yeast chassis for improved xylose fermentation. Frontiers in microbiology, 3, 355: 68–76

- Graham I., Chambers A. 1997. Constitutive Expression Vectors: PGK. Recombinant gene expression protocols, 62: 159–169

Ravnotežje med ekspresijo XYL1 in XYL2 v različnih šasijah kvasovk v povezavi s povečano fermentacijo ksiloze

2016-01-07T15:47:01Z

Monika Praznik:

'''UVOD S POVZETKOM'''

''Saccharomyces cerevisiae'' se v industriji pogosto uporablja za fermentacijo etanola. Ksiloza je ena izmed glavnih sestavin biomase in je derivat hemiceluloze. Vendar pa naravni sev ni sposoben asimilirati ksiloze in zato je v zadnjih letih veliko zanimanja za rekombinantno ''S. cerevisiae'', ki je sposobna fermentacije ksiloze. Z njeno optimizacijo bi lahko izboljšali izkoristek ksiloze v proizvodnji goriv in kemikalij. Omenjena rekombinantna kvasovka vsebuje ksilozno pot iz kvasovke, ki ksilozno pot vsebuje naravno (na primer ''Scheffersomyces stipitis''). V tej poti pride do redukcije ksiloze do ksilitola s pomočjo od NADPH odvisne ksiloza reduktaze (XR), ki je kodirana z genom ''XYL1''. Nato se ksilitol pretvori do ksiluloze s pomočjo od NAD+ odvisne ksilitol dehidrogenaze (XDH), za katero kodira gen ''XYL2''. Ksiluloza se lahko s pomočjo ksilulokonaze (XK) fosforilira do ksiluloza 5-fosfata (X-5P) in nadaljuje svoj metabolizem v pentoza fosfatni poti in glikolizi. Druga pot, po kateri lahko v enem koraku pride do pretvorbe ksiloze do ksiluloze, pa je ksiloza izomerazna pot. Uspešno so klonirali ksiloza izomerazo iz glive ''Pyromyces sp.''; produktivnost etanola je bila 1,6 - krat nižja kot pri poti XR-XDH (ksiloza reduktazna-ksilitol dehidrogenazna pot), celotna proizvodnja etanola (0,43 g/g) pa 30,0 % višja. Kljub temu se trenutno veliko znanstvenikov ukvarja z XR-XDH metabolno potjo z namenom izboljšati produkcijo etanola. Količina etanola, ki ga dobimo s fermentacijo ksiloze je zelo nizka, ker se veliko ksiloze izloči v svoji reducirani obliki, kot ksilitol. Tvorba ksilitola je povezana s preferenco kofaktorjev do XR in XDH, kar povzroči redoksno neravnotežje in vodi do akumulacije ksilitola. Produkcija ksilitola je povezana s porabo NADPH in uničuje ravnotežje reduktivnih vodikovih zvrsti. Poleg spreminjanja preference kofaktorjev, lahko izkoristek ksiloze povečamo tudi z ravnotežjem aktivnosti XR in XDH, kar bi omogočilo recikliranje NADPH in izboljšalo produkcijo etanola. Pomemben faktor pa je tudi izbira šasije kvasovk, kajti encimi ne-oksidativne pentoza fosfatne poti imajo različno aktivnost pri različnih šasijah, to pa pomeni različne sposobnosti metabolizma ksiluloze. V tej študiji so uporabili dve osnovni šasiji, W303a ter L2612.
V tej študiji so želeli rekombinantne kvasovke Saccharomyces cerevisiae uporabiti za bolj učinkovito proizvodnjo etanola iz ksiloze s pomočjo ksiloza reduktazne-ksilitol dehidrogenazne poti (XR-XDH pot). Za čimboljši izkoristek ksiloze so morali zmanjšati tvorbo ksilitola. To so naredili s kontroliranim izražanjem genov ''XYL1'' (kodira za ksiloza reduktazo - XR) in mutiranim ''XYL2'' (kodira za od NADP+ odvisno ksilotol dehidrogenazo - XDH). Za manipulacijo ekspresijskega nivolja ''XYL1'' so uporabili tri promotorje, za regulacijo izražanja ''XYL2'' pa dva plazmida z različnim številom kopij tega gena. Uporabili so dve šasiji kvasovk in sicer W303a ter L2612. Kot najuspešnejši se je izkazal sev pridobljen iz šasije L2612, ki je imel ''XYL1'' pod promotorjem PGK1 (fosfoglicerat kinaza 1) in dve kopiji ''XYL2''. Proizvajal je 21,3 % manj ksilitola in 40,0 % več etanola kot kontrolna linija.
Za ugotavljanje primerne ekspresijske ravni ''XYL1'', ki bi bila kompatibilna z ''mXYL2'', so za ekspresijo ''XYL1'' uporabili tri promotorje (celoten ADH1, ADH1; skrajšan ADH1, tADH1; PGK1) v povezavi z ''XYL2'' pod promotorjem PGK1. ADH1 je konstitutivni promotor, ki naravno v kvasovki uravnava ekspresijo alkohol dehidrogenaze. Promotor PGK1 naravno kontrolira ekspresijo fosfoglicerat kinaze, v sintezni biologiji pa je najbolj učinkovit promotor v ''S. cerevisiae'', ko želimo zagotoviti konstitutivno in visoko ekspresijo določenega gena.
Celično gostoto so spremljali z merjenjem absorbance na spektrometru pri valovni dolžini 600 nm. Iz kulture so v enakomernih časovnih intervalih odvzemali vzorce, jih centrifugirali (9600x g, 5 min) in supernatant uporabili za meritve na HPLC.

'''REZULTATI'''

''ŠASIJE W303C, W303tAR, W303AR in W303PR''

Linije, ki so jih pripravili iz šasije W303a, so bile W303tAR, W303AR in W303PR, pri njih je bil XYL1 pod kontrolo bodisi tADH1, ADH1 ali PGK1. Te linije so v aerobnih pogojih asimilirale 74,5 %, 146,3 % in 14,8-krat več ksiloze kot kontrola (W303C). Količina ksilitola je bila pri W303tAR in W303C približno enaka, pri W303AR in W303PR pa višja (73,5 % in 30,6 %) kot pri kontroli W303C. Kljub temu, da je bil privzem ksiloze pri W303AR večji kot pri kontroli W303C in W303tAR, pa ni nastalo skoraj nič biomase, ker se je večina ksiloze izločila v obliki ksilitola med rastjo. Za najbolj uspešnega se je pri privzemu ksiloze v šasiji W303a torej izkazal promotor PGK1. Da bi ugotovili sposobnost linije W303PR za produkcijo etanola iz ksiloze so izvajali ksilozno fermentacijo pri različnih koncentracijah ksiloze (do 50 g/l) in različnih aeracijah. Žal se je izkazalo, da do produkcije etanola ne pride, tvori pa se veliko ksilitola in zato so zaključili, da šasija W303a ni primerna za proizvodnjo etanola iz ksiloze. Razlog za ničelno produkcijo etanola bi lahko bil ta, da ksiloza inducira preusmeritev metabolizma v Krebsov cikel, kar je združljivo s celično rastjo med ksilozno fermentacijo. V nadaljevanju so se osredotočili na šasijo L2612.

''PRIMERJAVA DVEH ŠASIJ ZA EKSPRESIJO POTI XR-XDH''

Tudi v šasijo L2612 so vstavili enake tri promotroje kot v W303a in dobili nove linije L2612AR, L2612tAR in L2612PR. Samo linija L2612PR, ki je vsebovala najmočnejši promotor PGK1, je dovolj hitro rastla pod aerobnimi pogoji in konzumirala vso ksilozo. Liniji L2612AR in L2612tAR nista bili uspešni, ker je bila njuna rast počasna, konzumirali pa sta le 17,3 % in 15,7 % ksiloze. V nadaljevanju so zato primerjali liniji L2612PR in W303PR v pogojih z različno dostopnostjo kisika. Linija L2612PR je v vseh pogojih proizvajala manj ksilitola kot W303PR, kar kaže na večjo usklajenost med XR in XDH pri liniji L2612PR. Poleg tega je bilo v aerobnih pogojih pri L2612PR približno polovico manj glicerola kot pri W303PR. Ob zmanjšanju kisika se je asimilacija ksiloze zmanjšala tako pri L2612PR (za 44,8 %) kot pri W303PR (za 20,3 %), kar kaže na to, da je metabolizem ksiloze v liniji L2612PR bolj odvisen od prisotnosti kisika. Ob pomanjkanju kisika je blokirana respiratorna pot kar vodi v zmanjšan metabolizem ksiloze.
Glede na produkcijo ksilitola in glicerola so zaključili, da je šasija L2612 boljša za ekspresijo ksilozne poti za produkcijo etanola. L2612 bi lahko bila začetna linija, pri kateri bi z modifikacijami dosegli zmanjšano produkcijo ksilitola in povečali produkcijo etanola v anaerobnih pogojih.

''VPLIV RAZLIČNIH NIVOJEV ''XYL2'' NA FERMENTACIJO KSILOZE''

Od NAD+ odvisna ksilitol dehidrogenaza (XDH) je direktno povezana s pretvorbo ksilitola do ksiluloze, ki je v nadaljevanju metabolizirana v ne-oksidativni pentoza fosfatni poti (PPP). Zato so sklepali, da bo povečanje ekspresije ''mXYL2'' zmanjšalo sekrecijo ksilitola, pospešilo metabolizem v smeri ne-oksidativne PPP in posledično vodilo do povečane produkcije etanola. V liniji L2612PR so overekspresionirali ''mXYL2'' in dobili štiri linije; L2612PR-MD, L2612PR-MC, L2612PR-D in L2612PR-C. L2612PR-MD je vsebovala več kopij plazmida z ''mXYL2'', L2612PR-MC je predstavljala njeno kontrolo. L2612PR-D je imela v genom vstavljeno eno kopijo ''mXYL2'' več kot njena kontrola L2612PR-C. Najprej so asimilacijo ksiloze ter produkcijo ksilitola, glicerola in etanola testirali v aerobnih, nato pa še v anaerobnih pogojih pri vseh štirih linijah. Ugotovili so, da overekspresija ''mXYL2'' v linijah L2612PR povzroči povečano produkcijo etanola in zmanjšano tvorbo ksilitola iz ksiloze, kar kaže na to, da ima ekspresija ''mXYL2'' pomembno vlogo pri regulaciji metabolizma ksiloze.

'''ZAKLJUČKI'''

Rezultati so pokazali, da je samo najmočnejši izmed uporabljenih promotorjev (PGK1) povečal privzem ksiloze in njen metabolizem, zato sklepamo, da je nujen za visoko aktivnost XR pri fermentaciji ksiloze. Pri primerjavi fermentacijskih sposobnosti med rekombinantnimi linijami iz šasij W303a in L2612 so ugotovili, da je najbolj učinkovita linija L2612PR, razvita iz šasije L2612. Za povečanje ekspresije ''mXYL2'' so ustvarili linije z eno dodatno kopijo ''mXYL2'' (L2612PR-D) in več dodatnimi kopijami ''mXYL2'' (L2612-MD), kar je rezultiralo v 21 % nižji produkciji ksilitola in 35-40 % višji produkciji etanola. To kaže na pomembno vlogo XDH pri zmanjšani akumulaciji ksilitola in pospeševanju metabolizma ksiloze v kasnejših fazah fermentacije. Pokazali so, da je optimizacija šasij v kombinaciji z ravnotežjem metabolnih encimov primeren pristop za konstruiranje kvasovk ''S. cerevisiae'', ki fermentirajo ksilozo v etanol.

'''VIRI'''

- Zha J., Hu M., Shen M., Li B., Wang J., Yuan Y. 2012. Balance of XYL1 and XYL2 expression in different yeast chassis for improved xylose fermentation. Frontiers in microbiology, 3, 355: 68–76

- Graham I., Chambers A. 1997. Constitutive Expression Vectors: PGK. Recombinant gene expression protocols, 62: 159–169

Ravnotežje med ekspresijo XYL1 in XYL2 v različnih šasijah kvasovk v povezavi s povečano fermentacijo ksiloze

2016-01-07T15:46:21Z

Monika Praznik:

'''UVOD S POVZETKOM'''

''Saccharomyces cerevisiae'' se v industriji pogosto uporablja za fermentacijo etanola. Ksiloza je ena izmed glavnih sestavin biomase in je derivat hemiceluloze. Vendar pa naravni sev ni sposoben asimilirati ksiloze in zato je v zadnjih letih veliko zanimanja za rekombinantno ''S. cerevisiae'', ki je sposobna fermentacije ksiloze. Z njeno optimizacijo bi lahko izboljšali izkoristek ksiloze v proizvodnji goriv in kemikalij. Omenjena rekombinantna kvasovka vsebuje ksilozno pot iz kvasovke, ki ksilozno pot vsebuje naravno (na primer ''Scheffersomyces stipitis''). V tej poti pride do redukcije ksiloze do ksilitola s pomočjo od NADPH odvisne ksiloza reduktaze (XR), ki je kodirana z genom ''XYL1''. Nato se ksilitol pretvori do ksiluloze s pomočjo od NAD+ odvisne ksilitol dehidrogenaze (XDH), za katero kodira gen ''XYL2''. Ksiluloza se lahko s pomočjo ksilulokonaze (XK) fosforilira do ksiluloza 5-fosfata (X-5P) in nadaljuje svoj metabolizem v pentoza fosfatni poti in glikolizi. Druga pot, po kateri lahko v enem koraku pride do pretvorbe ksiloze do ksiluloze, pa je ksiloza izomerazna pot. Uspešno so klonirali ksiloza izomerazo iz glive ''Pyromyces sp.''; produktivnost etanola je bila 1,6 - krat nižja kot pri poti XR-XDH (ksiloza reduktazna-ksilitol dehidrogenazna pot), celotna proizvodnja etanola (0,43 g/g) pa 30,0 % višja. Kljub temu se trenutno veliko znanstvenikov ukvarja z XR-XDH metabolno potjo z namenom izboljšati produkcijo etanola. Količina etanola, ki ga dobimo s fermentacijo ksiloze je zelo nizka, ker se veliko ksiloze izloči v svoji reducirani obliki, kot ksilitol. Tvorba ksilitola je povezana s preferenco kofaktorjev do XR in XDH, kar povzroči redoksno neravnotežje in vodi do akumulacije ksilitola. Produkcija ksilitola je povezana s porabo NADPH in uničuje ravnotežje reduktivnih vodikovih zvrsti. Poleg spreminjanja preference kofaktorjev, lahko izkoristek ksiloze povečamo tudi z ravnotežjem aktivnosti XR in XDH, kar bi omogočilo recikliranje NADPH in izboljšalo produkcijo etanola. Pomemben faktor pa je tudi izbira šasije kvasovk, kajti encimi ne-oksidativne pentoza fosfatne poti imajo različno aktivnost pri različnih šasijah, to pa pomeni različne sposobnosti metabolizma ksiluloze. V tej študiji so uporabili dve osnovni šasiji, W303a ter L2612.
V tej študiji so želeli rekombinantne kvasovke Saccharomyces cerevisiae uporabiti za bolj učinkovito proizvodnjo etanola iz ksiloze s pomočjo ksiloza reduktazne-ksilitol dehidrogenazne poti (XR-XDH pot). Za čimboljši izkoristek ksiloze so morali zmanjšati tvorbo ksilitola. To so naredili s kontroliranim izražanjem genov ''XYL1'' (kodira za ksiloza reduktazo - XR) in mutiranim ''XYL2'' (kodira za od NADP+ odvisno ksilotol dehidrogenazo - XDH). Za manipulacijo ekspresijskega nivolja ''XYL1'' so uporabili tri promotorje, za regulacijo izražanja ''XYL2'' pa dva plazmida z različnim številom kopij tega gena. Uporabili so dve šasiji kvasovk in sicer W303a ter L2612. Kot najuspešnejši se je izkazal sev pridobljen iz šasije L2612, ki je imel ''XYL1'' pod promotorjem PGK1 (fosfoglicerat kinaza 1) in dve kopiji ''XYL2''. Proizvajal je 21,3 % manj ksilitola in 40,0 % več etanola kot kontrolna linija.
Za ugotavljanje primerne ekspresijske ravni ''XYL1'', ki bi bila kompatibilna z ''mXYL2'', so za ekspresijo ''XYL1'' uporabili tri promotorje (celoten ADH1, ADH1; skrajšan ADH1, tADH1; PGK1) v povezavi z ''XYL2'' pod promotorjem PGK1. ADH1 je konstitutivni promotor, ki naravno v kvasovki uravnava ekspresijo alkohol dehidrogenaze. Promotor PGK1 naravno kontrolira ekspresijo fosfoglicerat kinaze, v sintezni biologiji pa je najbolj učinkovit promotor v ''S. cerevisiae'', ko želimo zagotoviti konstitutivno in visoko ekspresijo določenega gena (Graham in Chambers, 1997).
Celično gostoto so spremljali z merjenjem absorbance na spektrometru pri valovni dolžini 600 nm. Iz kulture so v enakomernih časovnih intervalih odvzemali vzorce, jih centrifugirali (9600x g, 5 min) in supernatant uporabili za meritve na HPLC.

'''REZULTATI'''

''ŠASIJE W303C, W303tAR, W303AR in W303PR''

Linije, ki so jih pripravili iz šasije W303a, so bile W303tAR, W303AR in W303PR, pri njih je bil XYL1 pod kontrolo bodisi tADH1, ADH1 ali PGK1. Te linije so v aerobnih pogojih asimilirale 74,5 %, 146,3 % in 14,8-krat več ksiloze kot kontrola (W303C). Količina ksilitola je bila pri W303tAR in W303C približno enaka, pri W303AR in W303PR pa višja (73,5 % in 30,6 %) kot pri kontroli W303C. Kljub temu, da je bil privzem ksiloze pri W303AR večji kot pri kontroli W303C in W303tAR, pa ni nastalo skoraj nič biomase, ker se je večina ksiloze izločila v obliki ksilitola med rastjo. Za najbolj uspešnega se je pri privzemu ksiloze v šasiji W303a torej izkazal promotor PGK1. Da bi ugotovili sposobnost linije W303PR za produkcijo etanola iz ksiloze so izvajali ksilozno fermentacijo pri različnih koncentracijah ksiloze (do 50 g/l) in različnih aeracijah. Žal se je izkazalo, da do produkcije etanola ne pride, tvori pa se veliko ksilitola in zato so zaključili, da šasija W303a ni primerna za proizvodnjo etanola iz ksiloze. Razlog za ničelno produkcijo etanola bi lahko bil ta, da ksiloza inducira preusmeritev metabolizma v Krebsov cikel, kar je združljivo s celično rastjo med ksilozno fermentacijo. V nadaljevanju so se osredotočili na šasijo L2612.

''PRIMERJAVA DVEH ŠASIJ ZA EKSPRESIJO POTI XR-XDH''

Tudi v šasijo L2612 so vstavili enake tri promotroje kot v W303a in dobili nove linije L2612AR, L2612tAR in L2612PR. Samo linija L2612PR, ki je vsebovala najmočnejši promotor PGK1, je dovolj hitro rastla pod aerobnimi pogoji in konzumirala vso ksilozo. Liniji L2612AR in L2612tAR nista bili uspešni, ker je bila njuna rast počasna, konzumirali pa sta le 17,3 % in 15,7 % ksiloze. V nadaljevanju so zato primerjali liniji L2612PR in W303PR v pogojih z različno dostopnostjo kisika. Linija L2612PR je v vseh pogojih proizvajala manj ksilitola kot W303PR, kar kaže na večjo usklajenost med XR in XDH pri liniji L2612PR. Poleg tega je bilo v aerobnih pogojih pri L2612PR približno polovico manj glicerola kot pri W303PR. Ob zmanjšanju kisika se je asimilacija ksiloze zmanjšala tako pri L2612PR (za 44,8 %) kot pri W303PR (za 20,3 %), kar kaže na to, da je metabolizem ksiloze v liniji L2612PR bolj odvisen od prisotnosti kisika. Ob pomanjkanju kisika je blokirana respiratorna pot kar vodi v zmanjšan metabolizem ksiloze.
Glede na produkcijo ksilitola in glicerola so zaključili, da je šasija L2612 boljša za ekspresijo ksilozne poti za produkcijo etanola. L2612 bi lahko bila začetna linija, pri kateri bi z modifikacijami dosegli zmanjšano produkcijo ksilitola in povečali produkcijo etanola v anaerobnih pogojih.

''VPLIV RAZLIČNIH NIVOJEV ''XYL2'' NA FERMENTACIJO KSILOZE''

Od NAD+ odvisna ksilitol dehidrogenaza (XDH) je direktno povezana s pretvorbo ksilitola do ksiluloze, ki je v nadaljevanju metabolizirana v ne-oksidativni pentoza fosfatni poti (PPP). Zato so sklepali, da bo povečanje ekspresije ''mXYL2'' zmanjšalo sekrecijo ksilitola, pospešilo metabolizem v smeri ne-oksidativne PPP in posledično vodilo do povečane produkcije etanola. V liniji L2612PR so overekspresionirali ''mXYL2'' in dobili štiri linije; L2612PR-MD, L2612PR-MC, L2612PR-D in L2612PR-C. L2612PR-MD je vsebovala več kopij plazmida z ''mXYL2'', L2612PR-MC je predstavljala njeno kontrolo. L2612PR-D je imela v genom vstavljeno eno kopijo ''mXYL2'' več kot njena kontrola L2612PR-C. Najprej so asimilacijo ksiloze ter produkcijo ksilitola, glicerola in etanola testirali v aerobnih, nato pa še v anaerobnih pogojih pri vseh štirih linijah. Ugotovili so, da overekspresija ''mXYL2'' v linijah L2612PR povzroči povečano produkcijo etanola in zmanjšano tvorbo ksilitola iz ksiloze, kar kaže na to, da ima ekspresija ''mXYL2'' pomembno vlogo pri regulaciji metabolizma ksiloze.

'''ZAKLJUČKI'''

Rezultati so pokazali, da je samo najmočnejši izmed uporabljenih promotorjev (PGK1) povečal privzem ksiloze in njen metabolizem, zato sklepamo, da je nujen za visoko aktivnost XR pri fermentaciji ksiloze. Pri primerjavi fermentacijskih sposobnosti med rekombinantnimi linijami iz šasij W303a in L2612 so ugotovili, da je najbolj učinkovita linija L2612PR, razvita iz šasije L2612. Za povečanje ekspresije ''mXYL2'' so ustvarili linije z eno dodatno kopijo ''mXYL2'' (L2612PR-D) in več dodatnimi kopijami ''mXYL2'' (L2612-MD), kar je rezultiralo v 21 % nižji produkciji ksilitola in 35-40 % višji produkciji etanola. To kaže na pomembno vlogo XDH pri zmanjšani akumulaciji ksilitola in pospeševanju metabolizma ksiloze v kasnejših fazah fermentacije. Pokazali so, da je optimizacija šasij v kombinaciji z ravnotežjem metabolnih encimov primeren pristop za konstruiranje kvasovk ''S. cerevisiae'', ki fermentirajo ksilozo v etanol.

'''VIRI'''

- Zha J., Hu M., Shen M., Li B., Wang J., Yuan Y. 2012. Balance of XYL1 and XYL2 expression in different yeast chassis for improved xylose fermentation. Frontiers in microbiology, 3, 355: 68–76

- Graham I., Chambers A. 1997. Constitutive Expression Vectors: PGK. Recombinant gene expression protocols, 62: 159–169

Ravnotežje med ekspresijo XYL1 in XYL2 v različnih šasijah kvasovk v povezavi s povečano fermentacijo ksiloze

2016-01-07T15:36:58Z

Monika Praznik:

'''UVOD S POVZETKOM'''

Saccharomyces cerevisiae se v industriji pogosto uporablja za fermentacijo etanola. Ksiloza je ena izmed glavnih sestavin biomase in je derivat hemiceluloze. Vendar pa naravni sev ni sposoben asimilirati ksiloze in zato je v zadnjih letih veliko zanimanja za rekombinantno S. cerevisiae, ki je sposobna fermentacije ksiloze. Z njeno optimizacijo bi lahko izboljšali izkoristek ksiloze v proizvodnji goriv in kemikalij. Omenjena rekombinantna kvasovka vsebuje ksilozno pot iz kvasovke, ki ksilozno pot vsebuje naravno (na primer Scheffersomyces stipitis). V tej poti pride do redukcije ksiloze do ksilitola s pomočjo od NADPH odvisne ksiloza reduktaze (XR), ki je kodirana z genom XYL1. Nato se ksilitol pretvori do ksiluloze s pomočjo od NAD+ odvisne ksilitol dehidrogenaze (XDH), za katero kodira gen XYL2. Ksiluloza se lahko s pomočjo ksilulokonaze (XK) fosforilira do ksiluloza 5-fosfata (X-5P) in nadaljuje svoj metabolizem v pentoza fosfatni poti in glikolizi. Druga pot, po kateri lahko v enem koraku pride do pretvorbe ksiloze do ksiluloze, pa je ksiloza izomerazna pot. Uspešno so klonirali ksiloza izomerazo iz glive Pyromyces sp.; produktivnost etanola je bila 1,6 - krat nižja kot pri poti XR-XDH (ksiloza reduktazna-ksilitol dehidrogenazna pot), celotna proizvodnja etanola (0,43 g/g) pa 30,0 % višja. Kljub temu se trenutno veliko znanstvenikov ukvarja z XR-XDH metabolno potjo z namenom izboljšati produkcijo etanola. Količina etanola, ki ga dobimo s fermentacijo ksiloze je zelo nizka, ker se veliko ksiloze izloči v svoji reducirani obliki, kot ksilitol. Tvorba ksilitola je povezana s preferenco kofaktorjev do XR in XDH, kar povzroči redoksno neravnotežje in vodi do akumulacije ksilitola. Produkcija ksilitola je povezana s porabo NADPH in uničuje ravnotežje reduktivnih vodikovih zvrsti. Poleg spreminjanja preference kofaktorjev, lahko izkoristek ksiloze povečamo tudi z ravnotežjem aktivnosti XR in XDH, kar bi omogočilo recikliranje NADPH in izboljšalo produkcijo etanola. Pomemben faktor pa je tudi izbira šasije kvasovk, kajti encimi ne-oksidativne pentoza fosfatne poti imajo različno aktivnost pri različnih šasijah, to pa pomeni različne sposobnosti metabolizma ksiluloze. V tej študiji so uporabili dve osnovni šasiji, W303a ter L2612.
V tej študiji so želeli rekombinantne kvasovke Saccharomyces cerevisiae uporabiti za bolj učinkovito proizvodnjo etanola iz ksiloze s pomočjo ksiloza reduktazne-ksilitol dehidrogenazne poti (XR-XDH pot). Za čimboljši izkoristek ksiloze so morali zmanjšati tvorbo ksilitola. To so naredili s kontroliranim izražanjem genov XYL1 (kodira za ksiloza reduktazo - XR) in mutiranim XYL2 (kodira za od NADP+ odvisno ksilotol dehidrogenazo - XDH). Za manipulacijo ekspresijskega nivolja XYL1 so uporabili tri promotorje, za regulacijo izražanja XYL2 pa dva plazmida z različnim številom kopij tega gena. Uporabili so dve šasiji kvasovk in sicer W303a ter L2612. Kot najuspešnejši se je izkazal sev pridobljen iz šasije L2612, ki je imel XYL1 pod promotorjem PGK1 (fosfoglicerat kinaza 1) in dve kopiji XYL2. Proizvajal je 21,3 % manj ksilitola in 40,0 % več etanola kot kontrolna linija.
Za ugotavljanje primerne ekspresijske ravni XYL1, ki bi bila kompatibilna z mXYL2, so za ekspresijo XYL1 uporabili tri promotorje (celoten ADH1, ADH1; skrajšan ADH1, tADH1; PGK1) v povezavi z XYL2 pod promotorjem PGK1. ADH1 je konstitutivni promotor, ki naravno v kvasovki uravnava ekspresijo alkohol dehidrogenaze. Promotor PGK1 naravno kontrolira ekspresijo fosfoglicerat kinaze, v sintezni biologiji pa je najbolj učinkovit promotor v S. cerevisiae, ko želimo zagotoviti konstitutivno in visoko ekspresijo določenega gena (Graham in Chambers, 1997).
Celično gostoto so spremljali z merjenjem absorbance na spektrometru pri valovni dolžini 600 nm. Iz kulture so v enakomernih časovnih intervalih odvzemali vzorce, jih centrifugirali (9600x g, 5 min) in supernatant uporabili za meritve na HPLC.

'''REZULTATI'''

''ŠASIJE W303C, W303tAR, W303AR in W303PR''

Linije, ki so jih pripravili iz šasije W303a, so bile W303tAR, W303AR in W303PR, pri njih je bil XYL1 pod kontrolo bodisi tADH1, ADH1 ali PGK1. Te linije so v aerobnih pogojih asimilirale 74,5 %, 146,3 % in 14,8-krat več ksiloze kot kontrola (W303C). Količina ksilitola je bila pri W303tAR in W303C približno enaka, pri W303AR in W303PR pa višja (73,5 % in 30,6 %) kot pri kontroli W303C. Kljub temu, da je bil privzem ksiloze pri W303AR večji kot pri kontroli W303C in W303tAR, pa ni nastalo skoraj nič biomase, ker se je večina ksiloze izločila v obliki ksilitola med rastjo. Za najbolj uspešnega se je pri privzemu ksiloze v šasiji W303a torej izkazal promotor PGK1. Da bi ugotovili sposobnost linije W303PR za produkcijo etanola iz ksiloze so izvajali ksilozno fermentacijo pri različnih koncentracijah ksiloze (do 50 g/l) in različnih aeracijah. Žal se je izkazalo, da do produkcije etanola ne pride, tvori pa se veliko ksilitola in zato so zaključili, da šasija W303a ni primerna za proizvodnjo etanola iz ksiloze. Razlog za ničelno produkcijo etanola bi lahko bil ta, da ksiloza inducira preusmeritev metabolizma v Krebsov cikel, kar je združljivo s celično rastjo med ksilozno fermentacijo. V nadaljevanju so se osredotočili na šasijo L2612.

''PRIMERJAVA DVEH ŠASIJ ZA EKSPRESIJO POTI XR-XDH''

Tudi v šasijo L2612 so vstavili enake tri promotroje kot v W303a in dobili nove linije L2612AR, L2612tAR in L2612PR. Samo linija L2612PR, ki je vsebovala najmočnejši promotor PGK1, je dovolj hitro rastla pod aerobnimi pogoji in konzumirala vso ksilozo. Liniji L2612AR in L2612tAR nista bili uspešni, ker je bila njuna rast počasna, konzumirali pa sta le 17,3 % in 15,7 % ksiloze. V nadaljevanju so zato primerjali liniji L2612PR in W303PR v pogojih z različno dostopnostjo kisika. Linija L2612PR je v vseh pogojih proizvajala manj ksilitola kot W303PR, kar kaže na večjo usklajenost med XR in XDH pri liniji L2612PR. Poleg tega je bilo v aerobnih pogojih pri L2612PR približno polovico manj glicerola kot pri W303PR. Ob zmanjšanju kisika se je asimilacija ksiloze zmanjšala tako pri L2612PR (za 44,8 %) kot pri W303PR (za 20,3 %), kar kaže na to, da je metabolizem ksiloze v liniji L2612PR bolj odvisen od prisotnosti kisika. Ob pomanjkanju kisika je blokirana respiratorna pot kar vodi v zmanjšan metabolizem ksiloze.
Glede na produkcijo ksilitola in glicerola so zaključili, da je šasija L2612 boljša za ekspresijo ksilozne poti za produkcijo etanola. L2612 bi lahko bila začetna linija, pri kateri bi z modifikacijami dosegli zmanjšano produkcijo ksilitola in povečali produkcijo etanola v anaerobnih pogojih.

''VPLIV RAZLIČNIH NIVOJEV XYL2 NA FERMENTACIJO KSILOZE''

Od NAD+ odvisna ksilitol dehidrogenaza (XDH) je direktno povezana s pretvorbo ksilitola do ksiluloze, ki je v nadaljevanju metabolizirana v ne-oksidativni pentoza fosfatni poti (PPP). Zato so sklepali, da bo povečanje ekspresije mXYL2 zmanjšalo sekrecijo ksilitola, pospešilo metabolizem v smeri ne-oksidativne PPP in posledično vodilo do povečane produkcije etanola. V liniji L2612PR so overekspresionirali mXYL2 in dobili štiri linije; L2612PR-MD, L2612PR-MC, L2612PR-D in L2612PR-C. L2612PR-MD je vsebovala več kopij plazmida z mXYL2, L2612PR-MC je predstavljala njeno kontrolo. L2612PR-D je imela v genom vstavljeno eno kopijo mXYL2 več kot njena kontrola L2612PR-C. Najprej so asimilacijo ksiloze ter produkcijo ksilitola, glicerola in etanola testirali v aerobnih, nato pa še v anaerobnih pogojih pri vseh štirih linijah. Ugotovili so, da overekspresija mXYL2 v linijah L2612PR povzroči povečano produkcijo etanola in zmanjšano tvorbo ksilitola iz ksiloze, kar kaže na to, da ima ekspresija mXYL2 pomembno vlogo pri regulaciji metabolizma ksiloze.

'''ZAKLJUČKI'''

Rezultati so pokazali, da je samo najmočnejši izmed uporabljenih promotorjev (PGK1) povečal privzem ksiloze in njen metabolizem, zato sklepamo, da je nujen za visoko aktivnost XR pri fermentaciji ksiloze. Pri primerjavi fermentacijskih sposobnosti med rekombinantnimi linijami iz šasij W303a in L2612 so ugotovili, da je najbolj učinkovita linija L2612PR, razvita iz šasije L2612. Za povečanje ekspresije mXYL2 so ustvarili linije z eno dodatno kopijo mXYL2 (L2612PR-D) in več dodatnimi kopijami mXYL2 (L2612-MD), kar je rezultiralo v 21 % nižji produkciji ksilitola in 35-40 % višji produkciji etanola. To kaže na pomembno vlogo XDH pri zmanjšani akumulaciji ksilitola in pospeševanju metabolizma ksiloze v kasnejših fazah fermentacije. Pokazali so, da je optimizacija šasij v kombinaciji z ravnotežjem metabolnih encimov primeren pristop za konstruiranje kvasovk S. cerevisiae, ki fermentirajo ksilozo v etanol.

'''VIRI'''

- Zha J., Hu M., Shen M., Li B., Wang J., Yuan Y. 2012. Balance of XYL1 and XYL2 expression in different yeast chassis for improved xylose fermentation. Frontiers in microbiology, 3, 355: 68–76
- Graham I., Chambers A. 1997. Constitutive Expression Vectors: PGK. Recombinant gene expression protocols, 62: 159–169

Ravnotežje med ekspresijo XYL1 in XYL2 v različnih šasijah kvasovk v povezavi s povečano fermentacijo ksiloze

2016-01-07T15:35:31Z

Monika Praznik: New page: '''UVOD S POVZETKOM''' Saccharomyces cerevisiae se v industriji pogosto uporablja za fermentacijo etanola. Ksiloza je ena izmed glavnih sestavin biomase in je derivat hemiceluloze. Vendar ...

'''UVOD S POVZETKOM'''
Saccharomyces cerevisiae se v industriji pogosto uporablja za fermentacijo etanola. Ksiloza je ena izmed glavnih sestavin biomase in je derivat hemiceluloze. Vendar pa naravni sev ni sposoben asimilirati ksiloze in zato je v zadnjih letih veliko zanimanja za rekombinantno S. cerevisiae, ki je sposobna fermentacije ksiloze. Z njeno optimizacijo bi lahko izboljšali izkoristek ksiloze v proizvodnji goriv in kemikalij. Omenjena rekombinantna kvasovka vsebuje ksilozno pot iz kvasovke, ki ksilozno pot vsebuje naravno (na primer Scheffersomyces stipitis). V tej poti pride do redukcije ksiloze do ksilitola s pomočjo od NADPH odvisne ksiloza reduktaze (XR), ki je kodirana z genom XYL1. Nato se ksilitol pretvori do ksiluloze s pomočjo od NAD+ odvisne ksilitol dehidrogenaze (XDH), za katero kodira gen XYL2. Ksiluloza se lahko s pomočjo ksilulokonaze (XK) fosforilira do ksiluloza 5-fosfata (X-5P) in nadaljuje svoj metabolizem v pentoza fosfatni poti in glikolizi. Druga pot, po kateri lahko v enem koraku pride do pretvorbe ksiloze do ksiluloze, pa je ksiloza izomerazna pot. Uspešno so klonirali ksiloza izomerazo iz glive Pyromyces sp.; produktivnost etanola je bila 1,6 - krat nižja kot pri poti XR-XDH (ksiloza reduktazna-ksilitol dehidrogenazna pot), celotna proizvodnja etanola (0,43 g/g) pa 30,0 % višja. Kljub temu se trenutno veliko znanstvenikov ukvarja z XR-XDH metabolno potjo z namenom izboljšati produkcijo etanola. Količina etanola, ki ga dobimo s fermentacijo ksiloze je zelo nizka, ker se veliko ksiloze izloči v svoji reducirani obliki, kot ksilitol. Tvorba ksilitola je povezana s preferenco kofaktorjev do XR in XDH, kar povzroči redoksno neravnotežje in vodi do akumulacije ksilitola. Produkcija ksilitola je povezana s porabo NADPH in uničuje ravnotežje reduktivnih vodikovih zvrsti. Poleg spreminjanja preference kofaktorjev, lahko izkoristek ksiloze povečamo tudi z ravnotežjem aktivnosti XR in XDH, kar bi omogočilo recikliranje NADPH in izboljšalo produkcijo etanola. Pomemben faktor pa je tudi izbira šasije kvasovk, kajti encimi ne-oksidativne pentoza fosfatne poti imajo različno aktivnost pri različnih šasijah, to pa pomeni različne sposobnosti metabolizma ksiluloze. V tej študiji so uporabili dve osnovni šasiji, W303a ter L2612.
V tej študiji so želeli rekombinantne kvasovke Saccharomyces cerevisiae uporabiti za bolj učinkovito proizvodnjo etanola iz ksiloze s pomočjo ksiloza reduktazne-ksilitol dehidrogenazne poti (XR-XDH pot). Za čimboljši izkoristek ksiloze so morali zmanjšati tvorbo ksilitola. To so naredili s kontroliranim izražanjem genov XYL1 (kodira za ksiloza reduktazo - XR) in mutiranim XYL2 (kodira za od NADP+ odvisno ksilotol dehidrogenazo - XDH). Za manipulacijo ekspresijskega nivolja XYL1 so uporabili tri promotorje, za regulacijo izražanja XYL2 pa dva plazmida z različnim številom kopij tega gena. Uporabili so dve šasiji kvasovk in sicer W303a ter L2612. Kot najuspešnejši se je izkazal sev pridobljen iz šasije L2612, ki je imel XYL1 pod promotorjem PGK1 (fosfoglicerat kinaza 1) in dve kopiji XYL2. Proizvajal je 21,3 % manj ksilitola in 40,0 % več etanola kot kontrolna linija.
Za ugotavljanje primerne ekspresijske ravni XYL1, ki bi bila kompatibilna z mXYL2, so za ekspresijo XYL1 uporabili tri promotorje (celoten ADH1, ADH1; skrajšan ADH1, tADH1; PGK1) v povezavi z XYL2 pod promotorjem PGK1. ADH1 je konstitutivni promotor, ki naravno v kvasovki uravnava ekspresijo alkohol dehidrogenaze. Promotor PGK1 naravno kontrolira ekspresijo fosfoglicerat kinaze, v sintezni biologiji pa je najbolj učinkovit promotor v S. cerevisiae, ko želimo zagotoviti konstitutivno in visoko ekspresijo določenega gena (Graham in Chambers, 1997).
Celično gostoto so spremljali z merjenjem absorbance na spektrometru pri valovni dolžini 600 nm. Iz kulture so v enakomernih časovnih intervalih odvzemali vzorce, jih centrifugirali (9600x g, 5 min) in supernatant uporabili za meritve na HPLC.

'''REZULTATI'''
''ŠASIJE W303C, W303tAR, W303AR in W303PR''
Linije, ki so jih pripravili iz šasije W303a, so bile W303tAR, W303AR in W303PR, pri njih je bil XYL1 pod kontrolo bodisi tADH1, ADH1 ali PGK1. Te linije so v aerobnih pogojih asimilirale 74,5 %, 146,3 % in 14,8-krat več ksiloze kot kontrola (W303C). Količina ksilitola je bila pri W303tAR in W303C približno enaka, pri W303AR in W303PR pa višja (73,5 % in 30,6 %) kot pri kontroli W303C. Kljub temu, da je bil privzem ksiloze pri W303AR večji kot pri kontroli W303C in W303tAR, pa ni nastalo skoraj nič biomase, ker se je večina ksiloze izločila v obliki ksilitola med rastjo. Za najbolj uspešnega se je pri privzemu ksiloze v šasiji W303a torej izkazal promotor PGK1. Da bi ugotovili sposobnost linije W303PR za produkcijo etanola iz ksiloze so izvajali ksilozno fermentacijo pri različnih koncentracijah ksiloze (do 50 g/l) in različnih aeracijah. Žal se je izkazalo, da do produkcije etanola ne pride, tvori pa se veliko ksilitola in zato so zaključili, da šasija W303a ni primerna za proizvodnjo etanola iz ksiloze. Razlog za ničelno produkcijo etanola bi lahko bil ta, da ksiloza inducira preusmeritev metabolizma v Krebsov cikel, kar je združljivo s celično rastjo med ksilozno fermentacijo. V nadaljevanju so se osredotočili na šasijo L2612.
''PRIMERJAVA DVEH ŠASIJ ZA EKSPRESIJO POTI XR-XDH''
Tudi v šasijo L2612 so vstavili enake tri promotroje kot v W303a in dobili nove linije L2612AR, L2612tAR in L2612PR. Samo linija L2612PR, ki je vsebovala najmočnejši promotor PGK1, je dovolj hitro rastla pod aerobnimi pogoji in konzumirala vso ksilozo. Liniji L2612AR in L2612tAR nista bili uspešni, ker je bila njuna rast počasna, konzumirali pa sta le 17,3 % in 15,7 % ksiloze. V nadaljevanju so zato primerjali liniji L2612PR in W303PR v pogojih z različno dostopnostjo kisika. Linija L2612PR je v vseh pogojih proizvajala manj ksilitola kot W303PR, kar kaže na večjo usklajenost med XR in XDH pri liniji L2612PR. Poleg tega je bilo v aerobnih pogojih pri L2612PR približno polovico manj glicerola kot pri W303PR. Ob zmanjšanju kisika se je asimilacija ksiloze zmanjšala tako pri L2612PR (za 44,8 %) kot pri W303PR (za 20,3 %), kar kaže na to, da je metabolizem ksiloze v liniji L2612PR bolj odvisen od prisotnosti kisika. Ob pomanjkanju kisika je blokirana respiratorna pot kar vodi v zmanjšan metabolizem ksiloze.
Glede na produkcijo ksilitola in glicerola so zaključili, da je šasija L2612 boljša za ekspresijo ksilozne poti za produkcijo etanola. L2612 bi lahko bila začetna linija, pri kateri bi z modifikacijami dosegli zmanjšano produkcijo ksilitola in povečali produkcijo etanola v anaerobnih pogojih.
''VPLIV RAZLIČNIH NIVOJEV XYL2 NA FERMENTACIJO KSILOZE''
Od NAD+ odvisna ksilitol dehidrogenaza (XDH) je direktno povezana s pretvorbo ksilitola do ksiluloze, ki je v nadaljevanju metabolizirana v ne-oksidativni pentoza fosfatni poti (PPP). Zato so sklepali, da bo povečanje ekspresije mXYL2 zmanjšalo sekrecijo ksilitola, pospešilo metabolizem v smeri ne-oksidativne PPP in posledično vodilo do povečane produkcije etanola. V liniji L2612PR so overekspresionirali mXYL2 in dobili štiri linije; L2612PR-MD, L2612PR-MC, L2612PR-D in L2612PR-C. L2612PR-MD je vsebovala več kopij plazmida z mXYL2, L2612PR-MC je predstavljala njeno kontrolo. L2612PR-D je imela v genom vstavljeno eno kopijo mXYL2 več kot njena kontrola L2612PR-C. Najprej so asimilacijo ksiloze ter produkcijo ksilitola, glicerola in etanola testirali v aerobnih, nato pa še v anaerobnih pogojih pri vseh štirih linijah. Ugotovili so, da overekspresija mXYL2 v linijah L2612PR povzroči povečano produkcijo etanola in zmanjšano tvorbo ksilitola iz ksiloze, kar kaže na to, da ima ekspresija mXYL2 pomembno vlogo pri regulaciji metabolizma ksiloze.

'''ZAKLJUČKI'''
Rezultati so pokazali, da je samo najmočnejši izmed uporabljenih promotorjev (PGK1) povečal privzem ksiloze in njen metabolizem, zato sklepamo, da je nujen za visoko aktivnost XR pri fermentaciji ksiloze. Pri primerjavi fermentacijskih sposobnosti med rekombinantnimi linijami iz šasij W303a in L2612 so ugotovili, da je najbolj učinkovita linija L2612PR, razvita iz šasije L2612. Za povečanje ekspresije mXYL2 so ustvarili linije z eno dodatno kopijo mXYL2 (L2612PR-D) in več dodatnimi kopijami mXYL2 (L2612-MD), kar je rezultiralo v 21 % nižji produkciji ksilitola in 35-40 % višji produkciji etanola. To kaže na pomembno vlogo XDH pri zmanjšani akumulaciji ksilitola in pospeševanju metabolizma ksiloze v kasnejših fazah fermentacije. Pokazali so, da je optimizacija šasij v kombinaciji z ravnotežjem metabolnih encimov primeren pristop za konstruiranje kvasovk S. cerevisiae, ki fermentirajo ksilozo v etanol.

'''VIRI'''
- Zha J., Hu M., Shen M., Li B., Wang J., Yuan Y. 2012. Balance of XYL1 and XYL2 expression in different yeast chassis for improved xylose fermentation. Frontiers in microbiology, 3, 355: 68–76
- Graham I., Chambers A. 1997. Constitutive Expression Vectors: PGK. Recombinant gene expression protocols, 62: 159–169

Seminarji SB 2015/16

2016-01-07T15:32:17Z

Monika Praznik:

Seminarji iz Sintezne biologije v študijskem letu 2015/16 so:

Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/2866/synthetic-biology-engineering-complexity-and-refactoring-cell-capabilities SYNTHETIC BIOLOGY: ENGINEERING COMPLEXITY AND REFACTORING CELL CAPABILITIES]

* Production of fatty acid-derived valuable chemicals in synthetic microbes ([[Proizvodnja kemikalij iz derivatov maščobnih kislin s pomočjo sintetičnih mikroorganizmov]]) (Maja Grdadolnik) 
* Optimization of the IPP precursor supply for the production of lycopene, decaprenoxanthin and astaxanthin by Corynebacterium glutamicum ([[Optimizacija sinteze IPP kot prekursorja za produkcijo likopena, dekaprenoksantina in astaksantina v Corynebacterium glutamicum]]) (Griša Prinčič) 
* Engineering sugar utilization and microbial tolerance toward lignocellulose conversion [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konverzija_lignoceluloze_s_pomočjo_izkoriščanja_mikrobne_tolerance_in_inženiringa_sladkorjev] (Kim Potočnik) 
* Cofactor engineering for enhancing the flux of metabolic pathways [[INŽENIRING KOFAKTORJEV ZA IZBOLJŠANJE METABOLIČNIH POTI]] (Nastja Štemberger) 
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4354409/ Can the natural diversity of quorum-sensing advance synthetic biology?] ([[Ali lahko naravna diverziteta quorum sensinga pripomore k napredku v sintezni biologiji?]]) (Tina Snoj) 
* [http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fbioe.2015.00093/full Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits] ([[Določanje učinkovitosti bioloških naprav in vezij z razmerjem signal-šum]]) (Jakob G. Lavrenčič) 
* A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli ([[Senzor za malonil-CoA v bakteriji Escherichia coli]]) (Ajda Rojc) 
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4211546/ New transposon tools tailored for metabolic engineering of Gram-negative microbial cell factories] ([[Metabolični inženiring gram-negativnih bakterij s transpozonskim sistemom]]) (Rok Razpotnik) 

Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/455/synthetic-biology-applications-in-industrial-microbiology SYNTHETIC BIOLOGY APPLICATIONS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY]

* Recent Progress in Synthetic Biology for Microbial Production of C3–C10 Alcohols (Urška Rauter) ([[Napredki v sintezni biologiji pri proizvodnji C3-C10 alkoholov v mikroorganizmih]])
* Visualizing Evolution in Real-Time Method for Strain Engineering ([[Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo]]) (Samo Zakotnik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3367458/ Engineering Microbial Consortia to Enhance Biomining and Bioremediation] ([[Načrtovanje mikrobnih konzorcijev za izboljšanje biorudarstva in bioremediacije]]) (Maja Kostanjevec)
* Engineering Microbial Chemical Factories to Produce Renewable “Biomonomers” ([[Mikrobiološka proizvodnja obnovljivih biomonomerov in bioplastike]])(Nastja Pirman)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3446811/ Application of Synthetic Biology in Cyanobacteria and Algae] ([[Uporaba sintezne biologije v cianobakterijah in algah]]) (Špela Tomaž)
* Synthetic Feedback Loop Model for Increasing Microbial Biofuel Production Using a Biosensor (Jernej Pušnik)
* Balance of XYL1 and XYL2 Expression in Different Yeast Chassis for Improved xylose Fermentation ([[Ravnotežje med ekspresijo XYL1 in XYL2 v različnih šasijah kvasovk v povezavi s povečano fermentacijo ksiloze]]) (Monika Praznik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3630320/ Design and Development of Synthetic Microbial Platform Cells for Bioenergy] ([[Načrtovanje in razvijanje sintetičnih mikrobnih celičnih platform za pridobivanje bioenergije]])(Erik Mršnik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3616241/ Microbial Production of Isoprenoids Enabled by Synthetic Biology] ([[Mikrobna produkcija izoprenoidov s sintezno biologijo]]) (Dominik Kert)
* Chemical synthetic biology: a mini-review ([[Kratki pregled kemijske sintezne biologije]]) (Anka Hotko)

Seminarji iz preglednih člankov:

* [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S002228361500618X Towards engineering biological systems in a broader context] ([[Inženiring bioloških sistemov v širšem kontekstu]]) (Aleksander Benčič)
* [http://revistes.iec.cat/index.php/IM/article/viewFile/139212/137876 Synthetic biology: Novel approaches for microbiology] ([[Sintezno biološki pristopi v mikrobiologiji]]) (Daša Janeš)
* Tools and principles for microbial gene circuit engineering (Marko Radojković)
* Sensitive cells: enabling tools for static and dynamic control of microbial metabolic pathways ([[Dinamično uravnavanje (regulacija) metabolnih poti]]) (Katja Leben)
* Chassis optimization as a cornerstone for the application of synthetic biology based strategies in microbial secondary metabolism ([[Oprimizacija šasij kot osnovni korak pri uporabi sintezno biološkega pristopa pri karakterizaciji mikrobnega sekundarnega metabolizma]]) (Jure Zabret)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4571725/ Recent advances and opportunities in synthetic logic gates engineering in living cells] ([[Napredki v načrtovanju bioloških logičnih vrat v živih celicah]]) (Monika Biasizzo)
* Programmable genetic circuits for pathway engineering (Urban Javoršek)
* Better together: engineering and application of microbial symbioses (Nejc Petrišič)
* Synthetic biology for microbial production of lipid-based biofuels (Urška Pevec)
* Engineering Biosynthesis Mechanisms for Diversifying Polyhydroxyalkanoates (Mojca Banič)
* Synthetic biology of fungal natural products (Estera Merljak)
* Synthetic biology and biomimetic chemistry as converging technologies fostering a new generation of smart biosensors (Benjamin Bajželj)
* How Synthetic Biology Would Reconsider Natural Bioluminescence and its Application (Ana Grom & Ana Unkovič)
* Synthetic Biology-Toward Therapeutic Solutions (Tanja Korpar)
* Synthetically modified mRNA for efficient and fast human iPS cell generation and direct transdifferentiation to myoblasts (Mirjana Malnar)
* Mammalian synthetic biology: emerging medical applications (Maša Mirkovič)
* Synthetic biology devices and circuits for RNA-based ‘smart vaccines’: a propositional review (Monika Škrjanc)