Wiki FKKT - User contributions [en]

FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib

2021-05-12T11:13:13Z

Mzvipelj:

Flawoflow je iGEM projekt iz leta 2020, ki ga je zasnovala študentska ekipa iz Vilne, Litva. Želeli so ustvariti hitri test za detekcijo okužb, ki se pogosto pojavijo v robogojnich.

Spletna stran projekta FlavoFlow, iGEM 2020 [1]: https://2020.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania

== Opis problematike ==
Ribogojnice s 'krožnim' delovanjem (angl. ''Recirculating Aquaculture System'' - RAS) so skoraj povsem zaprt sistem, kjer se voda iz bazenov z ribami prečisti (z mehanskimi in biološkimi filtri), obogati s kisikom (in dodatno vodo, ki je iz sistem izhlapela) in ponovno uporabi [2]. Takšni sistemi so dobra rešitev za pridobivanje rib, saj z rastočo populacijo ljudi narašča tudi potreba po morski hrani. Problem sistemov RAS pa so lahko okužbe (virusne, bakterijske, glivne). [1]
Pogoste patogene bakterije rib so ''Flavobacterium columnare'', ''Flavobacterium psychrophilum'' in ''Flavobacterium branchiophilum''. Povzročajo bakterijsko bolezen hladnih voda (angl. ''bacterial cold water disease'') ali sindrom mavrične postrvi (angl. ''rainbow trout fry syndrome''), bolezen ''columnaris'' in bakterijsko bolezen škrg (angl. ''bacterial gill disease'').
Tovrstne okužbe se odražajo v spremenjenem obnašanju in izgledu rib. Že 24-72 ur po pojavu teh sprememb smrtnost rib doseže 70%. Z obstojem sistema za detekcijo opisanih okužb, bi se ribogojniška podjetja izognila finančnim izgubam, ki so posledica propada velikih količin rib ob pojavu okužb.

== Cilji projekta ==
Ekipa si je zastavila tri cilje.
# Glavni cilj projekta Flavoflow je zasnova hitrega testa, s katerim bi lahko, ob sumu na okužbo, delavci v ribogojnicah hitro in enostavno identificirali bakterijsko vrsto, ki le-to povzroča, in pravočasno ukrepali. Želeli so zasnovati cenovno ugoden, robusten in prenosljiv senzor za detekcijo bakterij ''Flavobacterium columnare'' in ''Flavobacterium psychrophilum''. Odločili so se za senzor, ki bo temeljil na metodi HLA (angl. ''isothermal helicase-dependent amplification'') in LFA (angl. ''lateral flow assay'').
# Poleg detekcije bakterijske okužbe so želeli ustvariti tudi ustrezno rešitev za zdravljenje okuženih rib, pri čemer bi bila poraba antibiotikov čim manjša (zaradi globalnega problema prevelike uporabe antibiotikov in antibiotične rezistence). Razvili so dva sintezno biološka sistema z uporabo AI-2 inducibilnih promotorjev. Zgoraj omenjene bakterije namreč na škrgah rib tvorijo biofilme (kar oteži privzem kisika in posledično propad ribe), ob tem pa izločajo molekule AI-2 (angl. ''autoinducer-2''). Preko teh med seboj komunicirajo v t. i. procesu ''quorum sensing''. Za zajezitev okužbe bi torej uporabili gensko spremenjene bakterije (s samomorilskim stikalom), ki bi ob prisotnosti molekul AI-2 sintetizirale molekule za uničenje bakterije, ki v ribogojnici povzroča okužbo.
# Prav tako pa so želeli ustvariti tudi preventivno rešitev in tako preprečiti razvoj nadaljnjih okužb. Njihova ideja je bila pripraviti oralno cepivo, saj se večina cepiv ribam sicer dozira intraperitonealno, kar za ribe predstavlja dodaten stres. Odločili so se ustvariti cepivo proti ''F. columnare'', pri čemer bi ribe imunizirali s proteinom GldJ, ki se nahaja na zunanji membrani te bakterije. Ker pa tudi virusi povzročajo obolenja rib, proti nekaterim pa še ni razvitih cepiv, so se odločili ustvariti cepivo proti virusu VHSV (angl. ''viral hemorrhagic septicemia virus''), ki ima na svoji površini Glikoprptein G.

=== Podrobnejši opis ===
==== 1. Detekcija okužbe ====
Z bioinformatsko analizo so najprej poiskali markerski gen, specifičen za za določeno bakterijsko vrsto. Uporabili so gen za 16S rRNA ter gen rpoC (specifičen za ''F. psychrophilum'') in gen cslA (specifičen za ''F. columnare''). Sledilo je dizajniranje treh ssDNA prob (detekcijske, lovilne in kontrolne) za test LFA in priprava začetnih oligonukleotidov za metodo HDA.
'''Postopek hitrega testa''': odvzem vzorca, liza celic (mehansko ali drugače), pomnožitev tarčnega gena patogene bakterije z metodo HDA, detekcija okužbe s testom LFA
*: '''Metoda HDA''' je analogna metodi PCR, le da za samo izvedbo ni potrebna posebna laboratorijska oprema, saj reakcija poteka zgolj pri eni temperaturi, ki pa mora biti ves čas konstantna. V koliko je v vzorcu prisoten tarčni patogen, termostabilna DNA helikaza razvije dsDNA, nato proteini SSB (angl. ''single-stranded DNA-binding proteins'') prekrijejo ssDNA, sledi vezava specifičnih oligonukleotidov (eden od teh se porabi, drugi pa je v presežku – asimetrična metoda HDA), DNA polimeraza nato podaljša DNA verigo in cikel se ponovi. Ker je torej den izmed oligonukleotidov v presežku (oz. drugega primanjkuje), dobimo po končani reakciji veliko ssDNA matric, ki jih potrebujemo za test LFA. Za izboljšavo in pocenitev metode HDA so uporabili helimerazo, ki omogoči tvorbo daljših fragmentov DNA, za izvedbo pa niso potrebni nekateri proteni SSB.
*: '''Test LFA''' temelji na hibridizaciji nukleinskih kislin. Z njim so želeli vizualizirati pomnožke DAN, pridobljene z metodo HDA. Vzorec kanemo na testno ploščico in dodamo pufer. Tekočina se absorbira v membrano, ki vsebuje zlate nanodelce z dodanimi detekcijskimi sondami, kamor se vežejo ssDNA iz vzorca (prva hibridizacijska reakcija). Tako nastali kompleksi potujejo do nitorcelulozne membrane, kjer sta dve črti. Prva je t. i. testna črta, druga pa kontrolna. Na testni črti poteče druga hibridizacija, in sicer kompleks nanodelca z vezanimi ssDNA se veže na lovilno sondo. Ta je vezana na podlago, zato se nastali kompleksi kopičijo na testni črti, kar privede do rdeče črte, vidne s prostim očesom. Nanodelci brez vezanih ssDNA potujejo do kontrolne črte, kjer se hibridizirajo na kontrolno sondo, ki je prav tako pritrjena na podlagi. Ob pozitivnem testu torej zaznamo dve rdeči črti. Če je test negativen, je vidna zgolj kontrolna črta, v ostalih primerih (le testna črta ali nobena črta) pa je test neveljaven.

==== 2. Zdravljenje okužbe ====
Oba sintezno biološka sistema temeljita na sintezi eksoliznov, razlikujeta pa se v načinu, kako celica (gensko spremenjena bakterija ''E. coli'') lizira samo sebe. Uporabili so 3 različne inducibilne promotorje AI-2; nativnega (lsrACDBFG; K3416000) in dva mutirana (EP01r; K3416001 in EP14r; K3416014).
* Sistem endolizin/eksolizin: Celice ''E. coli'' (DH5alfa) zaznavajo eksogen AL-2 v okolju (ki jih izločajo npr. ''Flavobacterium''), zaradi mutacije v genu ''luxS'' pa molekul AL-2 ne morejo proizvajati in so tako primerna šasija za zaznavanje in privzem molekul AL-2. Te v celice ''E. coli'' vstopijo skozi transporter IsrABC, nato pa se v citoplazmi fosforilirajo z LsrK. Fosforilirana molekula AL-2 (AL-2-P) se veže na represor LsrR, kar povzroči konformacijsko spremembo represorja, kompleks AL-2-P in represor pa se zato odcepi s promotorja. To povzroči transkripcijo 2 genov; gena za eksolizin in gena za endolizin. Eksolizin (protein virusa) je specifičen za posamezen bakterijski sev (ali seve) in torej, ko se sprosti iz ''E. coli'', uniči bakterijo, ki povzroča okužbo. Do sprostitve eksolizina pa pride zaradi delovanja endolizina, ki lizira E. coli (in ima torej tudi vlogo samomorilnega stikala).
* Sistem toksin/antitoksin: Začetni del je enak; pri aktivaciji od AL-2 inducibilnega promotorja se prepiše gen za eksolizin. Hkrati pa pod šibkim konstitutivnim promotorjem poteka tudi transkripcija gena MazE, ki je antitoksin v sistemu MazEF. MazF je toksin (specifična endoribonukleaza; cepi mRNA za mestom ACA in prepreči sintezo proteina) in je tudi pod AL-2 inducibilnim promotorjem. Ko je količina MazF toksina nizka, ga MazE antitoksin inhibira (tvori heterokompleks), ko pa količina MazF naraste (preseže količino MazE), to pa s časoma povzroči lizo E. coli in sprostitev eksolizina iz ''E. coli''' na mesto okužbe.

==== 3. Preventiva ====
Ker bi cepivo vnašali oralno, bi imunogene proteine zapakirali v kroglice kalcijevega alginata (ki je biokompatibilen in odporen na nizek pH). Ta bi se v prebavnem traktu razgradil pod vplivom alginat liaze (algLs), ki jo izločajo nekateri mikroorganizmi v prebavilih rib. Imunogen protein bi se tako absorbiral v kri in prišlo bi do nastanka imunskega odgovora. Sintezo proteina gIdJ so načrtovali v bakterijskem ekspresijskem sistemu in gen klonirali v vektor pET28-a(+). Glikoprotein G pa so sintetizirali v kvasovki; gen so klonirali v vektor pfX-7.

== Doprinos ekipe ==
*Karakterizacija biokock
*#Zapis za protein mazE: BBa_K2142001 – mazE je antitoksin za toksin mazF
*#zapis za protein mazF: BBa_K2142003 – mazF pa je antitoksin za mazE. Ta sistem toksin/antitoksin uporabljajo bakterije ''E. coli'' in druge za sprožitev programirane celične smrti kot odgovor na pomanjkanje hranil. Ko sta oba proteina izražena (koekspresija), ne vplivata na celično rast in viabilnost. Oba dela sta bila uporabljena 2016 s strani iGEM ekipe iz Gradca.
*#Zapis za LuxS: BBa_K091109 - LuxS je sintaza, ki tvori 4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione (DPD), ta pa spontano tvori signalno molekulo AI-2. Slednja je vpletena v mehanizem izražanja genov; v sistem ''guorum sensing'' (izražanje genov v odvisnosti od celične gostote). To biokocko je uporabila ekipa iGEM Davidson-Missouri Western, 2008.
*3D model hitrega testa – pri razvoju senzorja jim je pomagalo podjetje Micromolds. Na voljo je 3D model, ki ga lahko natisne vsak imetnik 3D tiskalnika (npr. druge iGEM ekipe) in ga prilagodi svojim potrebam za LFA testiranje. Uporabi se lahko različne tipe plastike, tudi reciklirano plastiko. Zainteresirani pa lahko za model zaprosijo po e-pošti.

== Viri ==
[1] https://2020.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania
[2] https://www.aquacultureid.com/recirculating-aquaculture-system/

FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib

2021-05-10T21:16:01Z

Mzvipelj:

Flawoflow je iGEM projekt iz leta 2020, ki ga je zasnovala študentska ekipa iz Vilne, Litva. Želeli so ustvariti hitri test za detekcijo okužb, ki se pogosto pojavijo v robogojnich.

Spletna stran projekta FlavoFlow, iGEM 2020 [1]: https://2020.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania

== Opis problematike ==
Ribogojnice s 'krožnim' delovanjem (angl. ''Recirculating Aquaculture System'' - RAS) so skoraj povsem zaprt sistem, kjer se voda iz bazenov z ribami prečisti (z mehanskimi in biološkimi filtri), obogati s kisikom (in dodatno vodo, ki je iz sistem izhlapela) in ponovno uporabi [2]. Takšni sistemi so dobra rešitev za pridobivanje rib, saj z rastočo populacijo ljudi narašča tudi potreba po morski hrani. Problem sistemov RAS pa so lahko okužbe (virusne, bakterijske, glivne). [1]
Pogoste patogene bakterije rib so ''Flavobacterium columnare'', ''Flavobacterium psychrophilum'' in ''Flavobacterium branchiophilum''. Povzročajo bakterijsko bolezen hladnih voda (angl. ''bacterial cold water disease'') ali sindrom mavrične postrvi (angl. ''rainbow trout fry syndrome''), bolezen ''columnaris'' in bakterijsko bolezen škrg (angl. ''bacterial gill disease'').
Tovrstne okužbe se odražajo v spremenjenem obnašanju in izgledu rib. Že 24-72 ur po pojavu teh sprememb smrtnost rib doseže 70%. Z obstojem sistema za detekcijo opisanih okužb, bi se ribogojniška podjetja izognila finančnim izgubam, ki so posledica propada velikih količin rib ob pojavu okužb.

== Cilji projekta ==
Ekipa si je zastavila tri cilje.
# Glavni cilj projekta Flavoflow je zasnova hitrega testa, s katerim bi lahko, ob sumu na okužbo, delavci v ribogojnicah hitro in enostavno identificirali bakterijsko vrsto, ki le-to povzroča, in pravočasno ukrepali. Želeli so zasnovati cenovno ugoden, robusten in prenosljiv senzor za detekcijo bakterij ''Flavobacterium columnare'' in ''Flavobacterium psychrophilum''. Odločili so se za senzor, ki bo temeljil na metodi HLA (angl. ''isothermal helicase-dependent amplification'') in LFA (angl. ''lateral flow assay'').
# Poleg detekcije bakterijske okužbe so želeli ustvariti tudi ustrezno rešitev za zdravljenje okuženih rib, pri čemer bi bila poraba antibiotikov čim manjša (zaradi globalnega problema prevelike uporabe antibiotikov in antibiotične rezistence). Razvili so dva sintezno biološka sistema z uporabo AI-2 inducibilnih promotorjev. Zgoraj omenjene bakterije namreč na škrgah rib tvorijo biofilme (kar oteži privzem kisika in posledično propad ribe), ob tem pa izločajo molekule AI-2 (angl. ''autoinducer-2''). Preko teh med seboj komunicirajo v t. i. procesu ''guorum sensing''. Za zajezitev okužbe bi torej uporabili gensko spremenjene bakterije (s samomorilskim stikalom), ki bi ob prisotnosti molekul AI-2 sintetizirale molekule za uničenje bakterije, ki v ribogojnici povzroča okužbo.
# Prav tako pa so želeli ustvariti tudi preventivno rešitev in tako preprečiti razvoj nadaljnjih okužb. Njihova ideja je bila pripraviti oralno cepivo, saj se večina cepiv ribam sicer dozira intraperitonealno, kar za ribe predstavlja dodaten stres. Odločili so se ustvariti cepivo proti ''F. columnare'', pri čemer bi ribe imunizirali s proteinom GldJ, ki se nahaja na zunanji membrani te bakterije. Ker pa tudi virusi povzročajo obolenja rib, proti nekaterim pa še ni razvitih cepiv, so se odločili ustvariti cepivo proti virusu VHSV (angl. ''viral hemorrhagic septicemia virus''), ki ima na svoji površini Glikoprptein G.

=== Podrobnejši opis ===
==== 1. Detekcija okužbe ====
Z bioinformatsko analizo so najprej poiskali markerski gen, specifičen za za določeno bakterijsko vrsto. Uporabili so gen za 16S rRNA ter gen rpoC (specifičen za ''F. psychrophilum'') in gen cslA (specifičen za ''F. columnare''). Sledilo je dizajniranje treh ssDNA prob (detekcijske, lovilne in kontrolne) za test LFA in priprava začetnih oligonukleotidov za metodo HDA.
'''Postopek hitrega testa''': odvzem vzorca, liza celic (mehansko ali drugače), pomnožitev tarčnega gena patogene bakterije z metodo HDA, detekcija okužbe s testom LFA
*: '''Metoda HDA''' je analogna metodi PCR, le da za samo izvedbo ni potrebna posebna laboratorijska oprema, saj reakcija poteka zgolj pri eni temperaturi, ki pa mora biti ves čas konstantna. V koliko je v vzorcu prisoten tarčni patogen, termostabilna DNA helikaza razvije dsDNA, nato proteini SSB (angl. ''single-stranded DNA-binding proteins'') prekrijejo ssDNA, sledi vezava specifičnih oligonukleotidov (eden od teh se porabi, drugi pa je v presežku – asimetrična metoda HDA), DNA polimeraza nato podaljša DNA verigo in cikel se ponovi. Ker je torej den izmed oligonukleotidov v presežku (oz. drugega primanjkuje), dobimo po končani reakciji veliko ssDNA matric, ki jih potrebujemo za test LFA. Za izboljšavo in pocenitev metode HDA so uporabili helimerazo, ki omogoči tvorbo daljših fragmentov DNA, za izvedbo pa niso potrebni nekateri proteni SSB.
*: '''Test LFA''' temelji na hibridizaciji nukleinskih kislin. Z njim so želeli vizualizirati pomnožke DAN, pridobljene z metodo HDA. Vzorec kanemo na testno ploščico in dodamo pufer. Tekočina se absorbira v membrano, ki vsebuje zlate nanodelce z dodanimi detekcijskimi sondami, kamor se vežejo ssDNA iz vzorca (prva hibridizacijska reakcija). Tako nastali kompleksi potujejo do nitorcelulozne membrane, kjer sta dve črti. Prva je t. i. testna črta, druga pa kontrolna. Na testni črti poteče druga hibridizacija, in sicer kompleks nanodelca z vezanimi ssDNA se veže na lovilno sondo. Ta je vezana na podlago, zato se nastali kompleksi kopičijo na testni črti, kar privede do rdeče črte, vidne s prostim očesom. Nanodelci brez vezanih ssDNA potujejo do kontrolne črte, kjer se hibridizirajo na kontrolno sondo, ki je prav tako pritrjena na podlagi. Ob pozitivnem testu torej zaznamo dve rdeči črti. Če je test negativen, je vidna zgolj kontrolna črta, v ostalih primerih (le testna črta ali nobena črta) pa je test neveljaven.

==== 2. Zdravljenje okužbe ====
Oba sintezno biološka sistema temeljita na sintezi eksoliznov, razlikujeta pa se v načinu, kako celica (gensko spremenjena bakterija ''E. coli'') lizira samo sebe. Uporabili so 3 različne inducibilne promotorje AI-2; nativnega (lsrACDBFG; K3416000) in dva mutirana (EP01r; K3416001 in EP14r; K3416014).
* Sistem endolizin/eksolizin: Celice ''E. coli'' (DH5alfa) zaznavajo eksogen AL-2 v okolju (ki jih izločajo npr. ''Flavobacterium''), zaradi mutacije v genu ''luxS'' pa molekul AL-2 ne morejo proizvajati in so tako primerna šasija za zaznavanje in privzem molekul AL-2. Te v celice ''E. coli'' vstopijo skozi transporter IsrABC, nato pa se v citoplazmi fosforilirajo z LsrK. Fosforilirana molekula AL-2 (AL-2-P) se veže na represor LsrR, kar povzroči konformacijsko spremembo represorja, kompleks AL-2-P in represor pa se zato odcepi s promotorja. To povzroči transkripcijo 2 genov; gena za eksolizin in gena za endolizin. Eksolizin (protein virusa) je specifičen za posamezen bakterijski sev (ali seve) in torej, ko se sprosti iz ''E. coli'', uniči bakterijo, ki povzroča okužbo. Do sprostitve eksolizina pa pride zaradi delovanja endolizina, ki lizira E. coli (in ima torej tudi vlogo samomorilnega stikala).
* Sistem toksin/antitoksin: Začetni del je enak; pri aktivaciji od AL-2 inducibilnega promotorja se prepiše gen za eksolizin. Hkrati pa pod šibkim konstitutivnim promotorjem poteka tudi transkripcija gena MazE, ki je antitoksin v sistemu MazEF. MazF je toksin (specifična endoribonukleaza; cepi mRNA za mestom ACA in prepreči sintezo proteina) in je tudi pod AL-2 inducibilnim promotorjem. Ko je količina MazF toksina nizka, ga MazE antitoksin inhibira (tvori heterokompleks), ko pa količina MazF naraste (preseže količino MazE), to pa s časoma povzroči lizo E. coli in sprostitev eksolizina iz ''E. coli''' na mesto okužbe.

==== 3. Preventiva ====
Ker bi cepivo vnašali oralno, bi imunogene proteine zapakirali v kroglice kalcijevega alginata (ki je biokompatibilen in odporen na nizek pH). Ta bi se v prebavnem traktu razgradil pod vplivom alginat liaze (algLs), ki jo izločajo nekateri mikroorganizmi v prebavilih rib. Imunogen protein bi se tako absorbiral v kri in prišlo bi do nastanka imunskega odgovora. Sintezo proteina gIdJ so načrtovali v bakterijskem ekspresijskem sistemu in gen klonirali v vektor pET28-a(+). Glikoprotein G pa so sintetizirali v kvasovki; gen so klonirali v vektor pfX-7.

== Doprinos ekipe ==
*Karakterizacija biokock
*#Zapis za protein mazE: BBa_K2142001 – mazE je antitoksin za toksin mazF
*#zapis za protein mazF: BBa_K2142003 – mazF pa je antitoksin za mazE. Ta sistem toksin/antitoksin uporabljajo bakterije ''E. coli'' in druge za sprožitev programirane celične smrti kot odgovor na pomanjkanje hranil. Ko sta oba proteina izražena (koekspresija), ne vplivata na celično rast in viabilnost. Oba dela sta bila uporabljena 2016 s strani iGEM ekipe iz Gradca.
*#Zapis za LuxS: BBa_K091109 - LuxS je sintaza, ki tvori 4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione (DPD), ta pa spontano tvori signalno molekulo AI-2. Slednja je vpletena v mehanizem izražanja genov; v sistem ''guorum sensing'' (izražanje genov v odvisnosti od celične gostote). To biokocko je uporabila ekipa iGEM Davidson-Missouri Western, 2008.
*3D model hitrega testa – pri razvoju senzorja jim je pomagalo podjetje Micromolds. Na voljo je 3D model, ki ga lahko natisne vsak imetnik 3D tiskalnika (npr. druge iGEM ekipe) in ga prilagodi svojim potrebam za LFA testiranje. Uporabi se lahko različne tipe plastike, tudi reciklirano plastiko. Zainteresirani pa lahko za model zaprosijo po e-pošti.

== Viri ==
[1] https://2020.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania
[2] https://www.aquacultureid.com/recirculating-aquaculture-system/

FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib

2021-05-10T21:14:15Z

Mzvipelj:

Flawoflow je iGEM projekt iz leta 2020, ki ga je zasnovala študentska ekipa iz Vilne, Litva. Želeli so ustvariti hitri test za detekcijo okužb, ki se pogosto pojavijo v robogojnich.

Spletna stran projekta FlavoFlow, iGEM 2020 [1]: [https://2020.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania]

== Opis problematike ==
Ribogojnice s 'krožnim' delovanjem (angl. ''Recirculating Aquaculture System'' - RAS) so skoraj povsem zaprt sistem, kjer se voda iz bazenov z ribami prečisti (z mehanskimi in biološkimi filtri), obogati s kisikom (in dodatno vodo, ki je iz sistem izhlapela) in ponovno uporabi [2]. Takšni sistemi so dobra rešitev za pridobivanje rib, saj z rastočo populacijo ljudi narašča tudi potreba po morski hrani. Problem sistemov RAS pa so lahko okužbe (virusne, bakterijske, glivne). [1]
Pogoste patogene bakterije rib so ''Flavobacterium columnare'', ''Flavobacterium psychrophilum'' in ''Flavobacterium branchiophilum''. Povzročajo bakterijsko bolezen hladnih voda (angl. ''bacterial cold water disease'') ali sindrom mavrične postrvi (angl. ''rainbow trout fry syndrome''), bolezen ''columnaris'' in bakterijsko bolezen škrg (angl. ''bacterial gill disease'').
Tovrstne okužbe se odražajo v spremenjenem obnašanju in izgledu rib. Že 24-72 ur po pojavu teh sprememb smrtnost rib doseže 70%. Z obstojem sistema za detekcijo opisanih okužb, bi se ribogojniška podjetja izognila finančnim izgubam, ki so posledica propada velikih količin rib ob pojavu okužb.

== Cilji projekta ==
Ekipa si je zastavila tri cilje.
# Glavni cilj projekta Flavoflow je zasnova hitrega testa, s katerim bi lahko, ob sumu na okužbo, delavci v ribogojnicah hitro in enostavno identificirali bakterijsko vrsto, ki le-to povzroča, in pravočasno ukrepali. Želeli so zasnovati cenovno ugoden, robusten in prenosljiv senzor za detekcijo bakterij ''Flavobacterium columnare'' in ''Flavobacterium psychrophilum''. Odločili so se za senzor, ki bo temeljil na metodi HLA (angl. ''isothermal helicase-dependent amplification'') in LFA (angl. ''lateral flow assay'').
# Poleg detekcije bakterijske okužbe so želeli ustvariti tudi ustrezno rešitev za zdravljenje okuženih rib, pri čemer bi bila poraba antibiotikov čim manjša (zaradi globalnega problema prevelike uporabe antibiotikov in antibiotične rezistence). Razvili so dva sintezno biološka sistema z uporabo AI-2 inducibilnih promotorjev. Zgoraj omenjene bakterije namreč na škrgah rib tvorijo biofilme (kar oteži privzem kisika in posledično propad ribe), ob tem pa izločajo molekule AI-2 (angl. ''autoinducer-2''). Preko teh med seboj komunicirajo v t. i. procesu ''guorum sensing''. Za zajezitev okužbe bi torej uporabili gensko spremenjene bakterije (s samomorilskim stikalom), ki bi ob prisotnosti molekul AI-2 sintetizirale molekule za uničenje bakterije, ki v ribogojnici povzroča okužbo.
# Prav tako pa so želeli ustvariti tudi preventivno rešitev in tako preprečiti razvoj nadaljnjih okužb. Njihova ideja je bila pripraviti oralno cepivo, saj se večina cepiv ribam sicer dozira intraperitonealno, kar za ribe predstavlja dodaten stres. Odločili so se ustvariti cepivo proti ''F. columnare'', pri čemer bi ribe imunizirali s proteinom GldJ, ki se nahaja na zunanji membrani te bakterije. Ker pa tudi virusi povzročajo obolenja rib, proti nekaterim pa še ni razvitih cepiv, so se odločili ustvariti cepivo proti virusu VHSV (angl. ''viral hemorrhagic septicemia virus''), ki ima na svoji površini Glikoprptein G.

=== Podrobnejši opis ===
==== 1. Detekcija okužbe ====
Z bioinformatsko analizo so najprej poiskali markerski gen, specifičen za za določeno bakterijsko vrsto. Uporabili so gen za 16S rRNA ter gen rpoC (specifičen za ''F. psychrophilum'') in gen cslA (specifičen za ''F. columnare''). Sledilo je dizajniranje treh ssDNA prob (detekcijske, lovilne in kontrolne) za test LFA in priprava začetnih oligonukleotidov za metodo HDA.
'''Postopek hitrega testa''': odvzem vzorca, liza celic (mehansko ali drugače), pomnožitev tarčnega gena patogene bakterije z metodo HDA, detekcija okužbe s testom LFA
*: '''Metoda HDA''' je analogna metodi PCR, le da za samo izvedbo ni potrebna posebna laboratorijska oprema, saj reakcija poteka zgolj pri eni temperaturi, ki pa mora biti ves čas konstantna. V koliko je v vzorcu prisoten tarčni patogen, termostabilna DNA helikaza razvije dsDNA, nato proteini SSB (angl. ''single-stranded DNA-binding proteins'') prekrijejo ssDNA, sledi vezava specifičnih oligonukleotidov (eden od teh se porabi, drugi pa je v presežku – asimetrična metoda HDA), DNA polimeraza nato podaljša DNA verigo in cikel se ponovi. Ker je torej den izmed oligonukleotidov v presežku (oz. drugega primanjkuje), dobimo po končani reakciji veliko ssDNA matric, ki jih potrebujemo za test LFA. Za izboljšavo in pocenitev metode HDA so uporabili helimerazo, ki omogoči tvorbo daljših fragmentov DNA, za izvedbo pa niso potrebni nekateri proteni SSB.
*: '''Test LFA''' temelji na hibridizaciji nukleinskih kislin. Z njim so želeli vizualizirati pomnožke DAN, pridobljene z metodo HDA. Vzorec kanemo na testno ploščico in dodamo pufer. Tekočina se absorbira v membrano, ki vsebuje zlate nanodelce z dodanimi detekcijskimi sondami, kamor se vežejo ssDNA iz vzorca (prva hibridizacijska reakcija). Tako nastali kompleksi potujejo do nitorcelulozne membrane, kjer sta dve črti. Prva je t. i. testna črta, druga pa kontrolna. Na testni črti poteče druga hibridizacija, in sicer kompleks nanodelca z vezanimi ssDNA se veže na lovilno sondo. Ta je vezana na podlago, zato se nastali kompleksi kopičijo na testni črti, kar privede do rdeče črte, vidne s prostim očesom. Nanodelci brez vezanih ssDNA potujejo do kontrolne črte, kjer se hibridizirajo na kontrolno sondo, ki je prav tako pritrjena na podlagi. Ob pozitivnem testu torej zaznamo dve rdeči črti. Če je test negativen, je vidna zgolj kontrolna črta, v ostalih primerih (le testna črta ali nobena črta) pa je test neveljaven.

==== 2. Zdravljenje okužbe ====
Oba sintezno biološka sistema temeljita na sintezi eksoliznov, razlikujeta pa se v načinu, kako celica (gensko spremenjena bakterija ''E. coli'') lizira samo sebe. Uporabili so 3 različne inducibilne promotorje AI-2; nativnega (lsrACDBFG; K3416000) in dva mutirana (EP01r; K3416001 in EP14r; K3416014).
* Sistem endolizin/eksolizin: Celice ''E. coli'' (DH5alfa) zaznavajo eksogen AL-2 v okolju (ki jih izločajo npr. ''Flavobacterium''), zaradi mutacije v genu ''luxS'' pa molekul AL-2 ne morejo proizvajati in so tako primerna šasija za zaznavanje in privzem molekul AL-2. Te v celice ''E. coli'' vstopijo skozi transporter IsrABC, nato pa se v citoplazmi fosforilirajo z LsrK. Fosforilirana molekula AL-2 (AL-2-P) se veže na represor LsrR, kar povzroči konformacijsko spremembo represorja, kompleks AL-2-P in represor pa se zato odcepi s promotorja. To povzroči transkripcijo 2 genov; gena za eksolizin in gena za endolizin. Eksolizin (protein virusa) je specifičen za posamezen bakterijski sev (ali seve) in torej, ko se sprosti iz ''E. coli'', uniči bakterijo, ki povzroča okužbo. Do sprostitve eksolizina pa pride zaradi delovanja endolizina, ki lizira E. coli (in ima torej tudi vlogo samomorilnega stikala).
* Sistem toksin/antitoksin: Začetni del je enak; pri aktivaciji od AL-2 inducibilnega promotorja se prepiše gen za eksolizin. Hkrati pa pod šibkim konstitutivnim promotorjem poteka tudi transkripcija gena MazE, ki je antitoksin v sistemu MazEF. MazF je toksin (specifična endoribonukleaza; cepi mRNA za mestom ACA in prepreči sintezo proteina) in je tudi pod AL-2 inducibilnim promotorjem. Ko je količina MazF toksina nizka, ga MazE antitoksin inhibira (tvori heterokompleks), ko pa količina MazF naraste (preseže količino MazE), to pa s časoma povzroči lizo E. coli in sprostitev eksolizina iz ''E. coli''' na mesto okužbe.

==== 3. Preventiva ====
Ker bi cepivo vnašali oralno, bi imunogene proteine zapakirali v kroglice kalcijevega alginata (ki je biokompatibilen in odporen na nizek pH). Ta bi se v prebavnem traktu razgradil pod vplivom alginat liaze (algLs), ki jo izločajo nekateri mikroorganizmi v prebavilih rib. Imunogen protein bi se tako absorbiral v kri in prišlo bi do nastanka imunskega odgovora. Sintezo proteina gIdJ so načrtovali v bakterijskem ekspresijskem sistemu in gen klonirali v vektor pET28-a(+). Glikoprotein G pa so sintetizirali v kvasovki; gen so klonirali v vektor pfX-7.

== Doprinos ekipe ==
*Karakterizacija biokock
*#Zapis za protein mazE: BBa_K2142001 – mazE je antitoksin za toksin mazF
*#zapis za protein mazF: BBa_K2142003 – mazF pa je antitoksin za mazE. Ta sistem toksin/antitoksin uporabljajo bakterije ''E. coli'' in druge za sprožitev programirane celične smrti kot odgovor na pomanjkanje hranil. Ko sta oba proteina izražena (koekspresija), ne vplivata na celično rast in viabilnost. Oba dela sta bila uporabljena 2016 s strani iGEM ekipe iz Gradca.
*#Zapis za LuxS: BBa_K091109 - LuxS je sintaza, ki tvori 4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione (DPD), ta pa spontano tvori signalno molekulo AI-2. Slednja je vpletena v mehanizem izražanja genov; v sistem ''guorum sensing'' (izražanje genov v odvisnosti od celične gostote). To biokocko je uporabila ekipa iGEM Davidson-Missouri Western, 2008.
*3D model hitrega testa – pri razvoju senzorja jim je pomagalo podjetje Micromolds. Na voljo je 3D model, ki ga lahko natisne vsak imetnik 3D tiskalnika (npr. druge iGEM ekipe) in ga prilagodi svojim potrebam za LFA testiranje. Uporabi se lahko različne tipe plastike, tudi reciklirano plastiko. Zainteresirani pa lahko za model zaprosijo po e-pošti.

== Viri ==
[1] [https://2020.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania]
[2] [https://www.aquacultureid.com/recirculating-aquaculture-system/]

FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib

2021-05-10T21:12:46Z

Mzvipelj:

Flawoflow je iGEM projekt iz leta 2020, ki ga je zasnovala študentska ekipa iz Vilne, Litva. Želeli so ustvariti hitri test za detekcijo okužb, ki se pogosto pojavijo v robogojnich.

Spletna stran projekta FlavoFlow, iGEM 2020 [1]: [https://2020.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania]

== Opis problematike ==
Ribogojnice s 'krožnim' delovanjem (angl. ''Recirculating Aquaculture System'' - RAS) so skoraj povsem zaprt sistem, kjer se voda iz bazenov z ribami prečisti (z mehanskimi in biološkimi filtri), obogati s kisikom (in dodatno vodo, ki je iz sistem izhlapela) in ponovno uporabi [2]. Takšni sistemi so dobra rešitev za pridobivanje rib, saj z rastočo populacijo ljudi narašča tudi potreba po morski hrani. Problem sistemov RAS pa so lahko okužbe (virusne, bakterijske, glivne). [1]
Pogoste patogene bakterije rib so ''Flavobacterium columnare'', ''Flavobacterium psychrophilum'' in ''Flavobacterium branchiophilum''. Povzročajo bakterijsko bolezen hladnih voda (angl. ''bacterial cold water disease'') ali sindrom mavrične postrvi (angl. ''rainbow trout fry syndrome''), bolezen ''columnaris'' in bakterijsko bolezen škrg (angl. ''bacterial gill disease'').
Tovrstne okužbe se odražajo v spremenjenem obnašanju in izgledu rib. Že 24-72 ur po pojavu teh sprememb smrtnost rib doseže 70%. Z obstojem sistema za detekcijo opisanih okužb, bi se ribogojniška podjetja izognila finančnim izgubam, ki so posledica propada velikih količin rib ob pojavu okužb.

== Cilji projekta ==
Ekipa si je zastavila tri cilje.
# Glavni cilj projekta Flavoflow je zasnova hitrega testa, s katerim bi lahko, ob sumu na okužbo, delavci v ribogojnicah hitro in enostavno identificirali bakterijsko vrsto, ki le-to povzroča, in pravočasno ukrepali. Želeli so zasnovati cenovno ugoden, robusten in prenosljiv senzor za detekcijo bakterij ''Flavobacterium columnare'' in ''Flavobacterium psychrophilum''. Odločili so se za senzor, ki bo temeljil na metodi HLA (angl. ''isothermal helicase-dependent amplification'') in LFA (angl. ''lateral flow assay'').
# Poleg detekcije bakterijske okužbe so želeli ustvariti tudi ustrezno rešitev za zdravljenje okuženih rib, pri čemer bi bila poraba antibiotikov čim manjša (zaradi globalnega problema prevelike uporabe antibiotikov in antibiotične rezistence). Razvili so dva sintezno biološka sistema z uporabo AI-2 inducibilnih promotorjev. Zgoraj omenjene bakterije namreč na škrgah rib tvorijo biofilme (kar oteži privzem kisika in posledično propad ribe), ob tem pa izločajo molekule AI-2 (angl. ''autoinducer-2''). Preko teh med seboj komunicirajo v t. i. procesu ''guorum sensing''. Za zajezitev okužbe bi torej uporabili gensko spremenjene bakterije (s samomorilskim stikalom), ki bi ob prisotnosti molekul AI-2 sintetizirale molekule za uničenje bakterije, ki v ribogojnici povzroča okužbo.
# Prav tako pa so želeli ustvariti tudi preventivno rešitev in tako preprečiti razvoj nadaljnjih okužb. Njihova ideja je bila pripraviti oralno cepivo, saj se večina cepiv ribam sicer dozira intraperitonealno, kar za ribe predstavlja dodaten stres. Odločili so se ustvariti cepivo proti ''F. columnare'', pri čemer bi ribe imunizirali s proteinom GldJ, ki se nahaja na zunanji membrani te bakterije. Ker pa tudi virusi povzročajo obolenja rib, proti nekaterim pa še ni razvitih cepiv, so se odločili ustvariti cepivo proti virusu VHSV (angl. ''viral hemorrhagic septicemia virus''), ki ima na svoji površini Glikoprptein G.

=== Podrobnejši opis ===
==== 1. Detekcija okužbe ====
Z bioinformatsko analizo so najprej poiskali markerski gen, specifičen za za določeno bakterijsko vrsto. Uporabili so gen za 16S rRNA ter gen rpoC (specifičen za ''F. psychrophilum'') in gen cslA (specifičen za ''F. columnare''). Sledilo je dizajniranje treh ssDNA prob (detekcijske, lovilne in kontrolne) za test LFA in priprava začetnih oligonukleotidov za metodo HDA.
'''Postopek hitrega testa''': odvzem vzorca, liza celic (mehansko ali drugače), pomnožitev tarčnega gena patogene bakterije z metodo HDA, detekcija okužbe s testom LFA
*: '''Metoda HDA''' je analogna metodi PCR, le da za samo izvedbo ni potrebna posebna laboratorijska oprema, saj reakcija poteka zgolj pri eni temperaturi, ki pa mora biti ves čas konstantna. V koliko je v vzorcu prisoten tarčni patogen, termostabilna DNA helikaza razvije dsDNA, nato proteini SSB (angl. ''single-stranded DNA-binding proteins'') prekrijejo ssDNA, sledi vezava specifičnih oligonukleotidov (eden od teh se porabi, drugi pa je v presežku – asimetrična metoda HDA), DNA polimeraza nato podaljša DNA verigo in cikel se ponovi. Ker je torej den izmed oligonukleotidov v presežku (oz. drugega primanjkuje), dobimo po končani reakciji veliko ssDNA matric, ki jih potrebujemo za test LFA. Za izboljšavo in pocenitev metode HDA so uporabili helimerazo, ki omogoči tvorbo daljših fragmentov DNA, za izvedbo pa niso potrebni nekateri proteni SSB.
*: '''Test LFA''' temelji na hibridizaciji nukleinskih kislin. Z njim so želeli vizualizirati pomnožke DAN, pridobljene z metodo HDA. Vzorec kanemo na testno ploščico in dodamo pufer. Tekočina se absorbira v membrano, ki vsebuje zlate nanodelce z dodanimi detekcijskimi sondami, kamor se vežejo ssDNA iz vzorca (prva hibridizacijska reakcija). Tako nastali kompleksi potujejo do nitorcelulozne membrane, kjer sta dve črti. Prva je t. i. testna črta, druga pa kontrolna. Na testni črti poteče druga hibridizacija, in sicer kompleks nanodelca z vezanimi ssDNA se veže na lovilno sondo. Ta je vezana na podlago, zato se nastali kompleksi kopičijo na testni črti, kar privede do rdeče črte, vidne s prostim očesom. Nanodelci brez vezanih ssDNA potujejo do kontrolne črte, kjer se hibridizirajo na kontrolno sondo, ki je prav tako pritrjena na podlagi. Ob pozitivnem testu torej zaznamo dve rdeči črti. Če je test negativen, je vidna zgolj kontrolna črta, v ostalih primerih (le testna črta ali nobena črta) pa je test neveljaven.

==== 2. Zdravljenje okužbe ====
Oba sintezno biološka sistema temeljita na sintezi eksoliznov, razlikujeta pa se v načinu, kako celica (gensko spremenjena bakterija ''E. coli'') lizira samo sebe. Uporabili so 3 različne inducibilne promotorje AI-2; nativnega (lsrACDBFG; K3416000) in dva mutirana (EP01r; K3416001 in EP14r; K3416014).
* Sistem endolizin/eksolizin: Celice ''E. coli'' (DH5alfa) zaznavajo eksogen AL-2 v okolju (ki jih izločajo npr. ''Flavobacterium''), zaradi mutacije v genu ''luxS'' pa molekul AL-2 ne morejo proizvajati in so tako primerna šasija za zaznavanje in privzem molekul AL-2. Te v celice ''E. coli'' vstopijo skozi transporter IsrABC, nato pa se v citoplazmi fosforilirajo z LsrK. Fosforilirana molekula AL-2 (AL-2-P) se veže na represor LsrR, kar povzroči konformacijsko spremembo represorja, kompleks AL-2-P in represor pa se zato odcepi s promotorja. To povzroči transkripcijo 2 genov; gena za eksolizin in gena za endolizin. Eksolizin (protein virusa) je specifičen za posamezen bakterijski sev (ali seve) in torej, ko se sprosti iz ''E. coli'', uniči bakterijo, ki povzroča okužbo. Do sprostitve eksolizina pa pride zaradi delovanja endolizina, ki lizira E. coli (in ima torej tudi vlogo samomorilnega stikala).
* Sistem toksin/antitoksin: Začetni del je enak; pri aktivaciji od AL-2 inducibilnega promotorja se prepiše gen za eksolizin. Hkrati pa pod šibkim konstitutivnim promotorjem poteka tudi transkripcija gena MazE, ki je antitoksin v sistemu MazEF. MazF je toksin (specifična endoribonukleaza; cepi mRNA za mestom ACA in prepreči sintezo proteina) in je tudi pod AL-2 inducibilnim promotorjem. Ko je količina MazF toksina nizka, ga MazE antitoksin inhibira (tvori heterokompleks), ko pa količina MazF naraste (preseže količino MazE), to pa s časoma povzroči lizo E. coli in sprostitev eksolizina iz ''E. coli''' na mesto okužbe.

==== 3. Preventiva ====
Ker bi cepivo vnašali oralno, bi imunogene proteine zapakirali v kroglice kalcijevega alginata (ki je biokompatibilen in odporen na nizek pH). Ta bi se v prebavnem traktu razgradil pod vplivom alginat liaze (algLs), ki jo izločajo nekateri mikroorganizmi v prebavilih rib. Imunogen protein bi se tako absorbiral v kri in prišlo bi do nastanka imunskega odgovora. Sintezo proteina gIdJ so načrtovali v bakterijskem ekspresijskem sistemu in gen klonirali v vektor pET28-a(+). Glikoprotein G pa so sintetizirali v kvasovki; gen so klonirali v vektor pfX-7.

== Doprinos ekipe ==
*Karakterizacija biokock
*#Zapis za protein mazE: BBa_K2142001 – mazE je antitoksin za toksin mazF
*#zapis za protein mazF: BBa_K2142003 – mazF pa je antitoksin za mazE. Ta sistem toksin/antitoksin uporabljajo bakterije ''E. coli'' in druge za sprožitev programirane celične smrti kot odgovor na pomanjkanje hranil. Ko sta oba proteina izražena (koekspresija), ne vplivata na celično rast in viabilnost. Oba dela sta bila uporabljena 2016 s strani iGEM ekipe iz Gradca.
*#Zapis za LuxS: BBa_K091109 - LuxS je sintaza, ki tvori 4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione (DPD), ta pa spontano tvori signalno molekulo AI-2. Slednja je vpletena v mehanizem izražanja genov; v sistem ''guorum sensing'' (izražanje genov v odvisnosti od celične gostote). To biokocko je uporabila ekipa iGEM Davidson-Missouri Western, 2008.
*3D model hitrega testa – pri razvoju senzorja jim je pomagalo podjetje Micromolds. Na voljo je 3D model, ki ga lahko natisne vsak imetnik 3D tiskalnika (npr. druge iGEM ekipe) in ga prilagodi svojim potrebam za LFA testiranje. Uporabi se lahko različne tipe plastike, tudi reciklirano plastiko. Zainteresirani pa lahko za model zaprosijo po e-pošti.

FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib

2021-05-10T21:12:27Z

Mzvipelj:

Flawoflow je iGEM projekt iz leta 2020, ki ga je zasnovala študentska ekipa iz Vilne, Litva. Želeli so ustvariti hitri test za detekcijo okužb, ki se pogosto pojavijo v robogojnich.

Spletna stran projekta FlavoFlow, iGEM 2020 [1]: [https://2020.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania]

== Opis problematike ==
Ribogojnice s 'krožnim' delovanjem (angl. ''Recirculating Aquaculture System'' - RAS) so skoraj povsem zaprt sistem, kjer se voda iz bazenov z ribami prečisti (z mehanskimi in biološkimi filtri), obogati s kisikom (in dodatno vodo, ki je iz sistem izhlapela) in ponovno uporabi [2]. Takšni sistemi so dobra rešitev za pridobivanje rib, saj z rastočo populacijo ljudi narašča tudi potreba po morski hrani. Problem sistemov RAS pa so lahko okužbe (virusne, bakterijske, glivne). [1]
Pogoste patogene bakterije rib so ''Flavobacterium columnare'', ''Flavobacterium psychrophilum'' in ''Flavobacterium branchiophilum''. Povzročajo bakterijsko bolezen hladnih voda (angl. ''bacterial cold water disease'') ali sindrom mavrične postrvi (angl. ''rainbow trout fry syndrome''), bolezen ''columnaris'' in bakterijsko bolezen škrg (angl. ''bacterial gill disease'').
Tovrstne okužbe se odražajo v spremenjenem obnašanju in izgledu rib. Že 24-72 ur po pojavu teh sprememb smrtnost rib doseže 70%. Z obstojem sistema za detekcijo opisanih okužb, bi se ribogojniška podjetja izognila finančnim izgubam, ki so posledica propada velikih količin rib ob pojavu okužb.

== Cilji projekta ==
Ekipa si je zastavila tri cilje.
# Glavni cilj projekta Flavoflow je zasnova hitrega testa, s katerim bi lahko, ob sumu na okužbo, delavci v ribogojnicah hitro in enostavno identificirali bakterijsko vrsto, ki le-to povzroča, in pravočasno ukrepali. Želeli so zasnovati cenovno ugoden, robusten in prenosljiv senzor za detekcijo bakterij ''Flavobacterium columnare'' in ''Flavobacterium psychrophilum''. Odločili so se za senzor, ki bo temeljil na metodi HLA (angl. ''isothermal helicase-dependent amplification'') in LFA (angl. ''lateral flow assay'').
# Poleg detekcije bakterijske okužbe so želeli ustvariti tudi ustrezno rešitev za zdravljenje okuženih rib, pri čemer bi bila poraba antibiotikov čim manjša (zaradi globalnega problema prevelike uporabe antibiotikov in antibiotične rezistence). Razvili so dva sintezno biološka sistema z uporabo AI-2 inducibilnih promotorjev. Zgoraj omenjene bakterije namreč na škrgah rib tvorijo biofilme (kar oteži privzem kisika in posledično propad ribe), ob tem pa izločajo molekule AI-2 (angl. ''autoinducer-2''). Preko teh med seboj komunicirajo v t. i. procesu ''guorum sensing''. Za zajezitev okužbe bi torej uporabili gensko spremenjene bakterije (s samomorilskim stikalom), ki bi ob prisotnosti molekul AI-2 sintetizirale molekule za uničenje bakterije, ki v ribogojnici povzroča okužbo.
# Prav tako pa so želeli ustvariti tudi preventivno rešitev in tako preprečiti razvoj nadaljnjih okužb. Njihova ideja je bila pripraviti oralno cepivo, saj se večina cepiv ribam sicer dozira intraperitonealno, kar za ribe predstavlja dodaten stres. Odločili so se ustvariti cepivo proti ''F. columnare'', pri čemer bi ribe imunizirali s proteinom GldJ, ki se nahaja na zunanji membrani te bakterije. Ker pa tudi virusi povzročajo obolenja rib, proti nekaterim pa še ni razvitih cepiv, so se odločili ustvariti cepivo proti virusu VHSV (angl. ''viral hemorrhagic septicemia virus''), ki ima na svoji površini Glikoprptein G.

=== Podrobnejši opis ===
==== 1. Detekcija okužbe ====
Z bioinformatsko analizo so najprej poiskali markerski gen, specifičen za za določeno bakterijsko vrsto. Uporabili so gen za 16S rRNA ter gen rpoC (specifičen za ''F. psychrophilum'') in gen cslA (specifičen za ''F. columnare''). Sledilo je dizajniranje treh ssDNA prob (detekcijske, lovilne in kontrolne) za test LFA in priprava začetnih oligonukleotidov za metodo HDA.
'''Postopek hitrega testa''': odvzem vzorca, liza celic (mehansko ali drugače), pomnožitev tarčnega gena patogene bakterije z metodo HDA, detekcija okužbe s testom LFA
*: '''Metoda HDA''' je analogna metodi PCR, le da za samo izvedbo ni potrebna posebna laboratorijska oprema, saj reakcija poteka zgolj pri eni temperaturi, ki pa mora biti ves čas konstantna. V koliko je v vzorcu prisoten tarčni patogen, termostabilna DNA helikaza razvije dsDNA, nato proteini SSB (angl. ''single-stranded DNA-binding proteins'') prekrijejo ssDNA, sledi vezava specifičnih oligonukleotidov (eden od teh se porabi, drugi pa je v presežku – asimetrična metoda HDA), DNA polimeraza nato podaljša DNA verigo in cikel se ponovi. Ker je torej den izmed oligonukleotidov v presežku (oz. drugega primanjkuje), dobimo po končani reakciji veliko ssDNA matric, ki jih potrebujemo za test LFA. Za izboljšavo in pocenitev metode HDA so uporabili helimerazo, ki omogoči tvorbo daljših fragmentov DNA, za izvedbo pa niso potrebni nekateri proteni SSB.
*: '''Test LFA''' temelji na hibridizaciji nukleinskih kislin. Z njim so želeli vizualizirati pomnožke DAN, pridobljene z metodo HDA. Vzorec kanemo na testno ploščico in dodamo pufer. Tekočina se absorbira v membrano, ki vsebuje zlate nanodelce z dodanimi detekcijskimi sondami, kamor se vežejo ssDNA iz vzorca (prva hibridizacijska reakcija). Tako nastali kompleksi potujejo do nitorcelulozne membrane, kjer sta dve črti. Prva je t. i. testna črta, druga pa kontrolna. Na testni črti poteče druga hibridizacija, in sicer kompleks nanodelca z vezanimi ssDNA se veže na lovilno sondo. Ta je vezana na podlago, zato se nastali kompleksi kopičijo na testni črti, kar privede do rdeče črte, vidne s prostim očesom. Nanodelci brez vezanih ssDNA potujejo do kontrolne črte, kjer se hibridizirajo na kontrolno sondo, ki je prav tako pritrjena na podlagi. Ob pozitivnem testu torej zaznamo dve rdeči črti. Če je test negativen, je vidna zgolj kontrolna črta, v ostalih primerih (le testna črta ali nobena črta) pa je test neveljaven.

==== 2. Zdravljenje okužbe ====
Oba sintezno biološka sistema temeljita na sintezi eksoliznov, razlikujeta pa se v načinu, kako celica (gensko spremenjena bakterija ''E. coli'') lizira samo sebe. Uporabili so 3 različne inducibilne promotorje AI-2; nativnega (lsrACDBFG; K3416000) in dva mutirana (EP01r; K3416001 in EP14r; K3416014).
* Sistem endolizin/eksolizin: Celice ''E. coli'' (DH5alfa) zaznavajo eksogen AL-2 v okolju (ki jih izločajo npr. ''Flavobacterium''), zaradi mutacije v genu ''luxS'' pa molekul AL-2 ne morejo proizvajati in so tako primerna šasija za zaznavanje in privzem molekul AL-2. Te v celice ''E. coli'' vstopijo skozi transporter IsrABC, nato pa se v citoplazmi fosforilirajo z LsrK. Fosforilirana molekula AL-2 (AL-2-P) se veže na represor LsrR, kar povzroči konformacijsko spremembo represorja, kompleks AL-2-P in represor pa se zato odcepi s promotorja. To povzroči transkripcijo 2 genov; gena za eksolizin in gena za endolizin. Eksolizin (protein virusa) je specifičen za posamezen bakterijski sev (ali seve) in torej, ko se sprosti iz ''E. coli'', uniči bakterijo, ki povzroča okužbo. Do sprostitve eksolizina pa pride zaradi delovanja endolizina, ki lizira E. coli (in ima torej tudi vlogo samomorilnega stikala).
* Sistem toksin/antitoksin: Začetni del je enak; pri aktivaciji od AL-2 inducibilnega promotorja se prepiše gen za eksolizin. Hkrati pa pod šibkim konstitutivnim promotorjem poteka tudi transkripcija gena MazE, ki je antitoksin v sistemu MazEF. MazF je toksin (specifična endoribonukleaza; cepi mRNA za mestom ACA in prepreči sintezo proteina) in je tudi pod AL-2 inducibilnim promotorjem. Ko je količina MazF toksina nizka, ga MazE antitoksin inhibira (tvori heterokompleks), ko pa količina MazF naraste (preseže količino MazE), to pa s časoma povzroči lizo E. coli in sprostitev eksolizina iz ''E. coli''' na mesto okužbe.

==== Preventiva ====
Ker bi cepivo vnašali oralno, bi imunogene proteine zapakirali v kroglice kalcijevega alginata (ki je biokompatibilen in odporen na nizek pH). Ta bi se v prebavnem traktu razgradil pod vplivom alginat liaze (algLs), ki jo izločajo nekateri mikroorganizmi v prebavilih rib. Imunogen protein bi se tako absorbiral v kri in prišlo bi do nastanka imunskega odgovora. Sintezo proteina gIdJ so načrtovali v bakterijskem ekspresijskem sistemu in gen klonirali v vektor pET28-a(+). Glikoprotein G pa so sintetizirali v kvasovki; gen so klonirali v vektor pfX-7.

== Doprinos ekipe ==
*Karakterizacija biokock
*#Zapis za protein mazE: BBa_K2142001 – mazE je antitoksin za toksin mazF
*#zapis za protein mazF: BBa_K2142003 – mazF pa je antitoksin za mazE. Ta sistem toksin/antitoksin uporabljajo bakterije ''E. coli'' in druge za sprožitev programirane celične smrti kot odgovor na pomanjkanje hranil. Ko sta oba proteina izražena (koekspresija), ne vplivata na celično rast in viabilnost. Oba dela sta bila uporabljena 2016 s strani iGEM ekipe iz Gradca.
*#Zapis za LuxS: BBa_K091109 - LuxS je sintaza, ki tvori 4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione (DPD), ta pa spontano tvori signalno molekulo AI-2. Slednja je vpletena v mehanizem izražanja genov; v sistem ''guorum sensing'' (izražanje genov v odvisnosti od celične gostote). To biokocko je uporabila ekipa iGEM Davidson-Missouri Western, 2008.
*3D model hitrega testa – pri razvoju senzorja jim je pomagalo podjetje Micromolds. Na voljo je 3D model, ki ga lahko natisne vsak imetnik 3D tiskalnika (npr. druge iGEM ekipe) in ga prilagodi svojim potrebam za LFA testiranje. Uporabi se lahko različne tipe plastike, tudi reciklirano plastiko. Zainteresirani pa lahko za model zaprosijo po e-pošti.

FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib

2021-05-10T21:02:42Z

Mzvipelj:

Flawoflow je iGEM projekt iz leta 2020, ki ga je zasnovala študentska ekipa iz Vilne, Litva. Želeli so ustvariti hitri test za detekcijo okužb, ki se pogosto pojavijo v robogojnich.

Spletna stran projekta FlavoFlow, iGEM 2020 [1]: [https://2020.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania]

== Opis problematike ==
Ribogojnice s 'krožnim' delovanjem (angl. ''Recirculating Aquaculture System'' - RAS) so skoraj povsem zaprt sistem, kjer se voda iz bazenov z ribami prečisti (z mehanskimi in biološkimi filtri), obogati s kisikom (in dodatno vodo, ki je iz sistem izhlapela) in ponovno uporabi [2]. Takšni sistemi so dobra rešitev za pridobivanje rib, saj z rastočo populacijo ljudi narašča tudi potreba po morski hrani. Problem sistemov RAS pa so lahko okužbe (virusne, bakterijske, glivne). [1]
Pogoste patogene bakterije rib so ''Flavobacterium columnare'', ''Flavobacterium psychrophilum'' in ''Flavobacterium branchiophilum''. Povzročajo bakterijsko bolezen hladnih voda (angl. ''bacterial cold water disease'') ali sindrom mavrične postrvi (angl. ''rainbow trout fry syndrome''), bolezen ''columnaris'' in bakterijsko bolezen škrg (angl. ''bacterial gill disease'').
Tovrstne okužbe se odražajo v spremenjenem obnašanju in izgledu rib. Že 24-72 ur po pojavu teh sprememb smrtnost rib doseže 70%. Z obstojem sistema za detekcijo opisanih okužb, bi se ribogojniška podjetja izognila finančnim izgubam, ki so posledica propada velikih količin rib ob pojavu okužb.

== Cilji projekta ==
Ekipa si je zastavila tri cilje.
# Glavni cilj projekta Flavoflow je zasnova hitrega testa, s katerim bi lahko, ob sumu na okužbo, delavci v ribogojnicah hitro in enostavno identificirali bakterijsko vrsto, ki le-to povzroča, in pravočasno ukrepali. Želeli so zasnovati cenovno ugoden, robusten in prenosljiv senzor za detekcijo bakterij ''Flavobacterium columnare'' in ''Flavobacterium psychrophilum''. Odločili so se za senzor, ki bo temeljil na metodi HLA (angl. ''isothermal helicase-dependent amplification'') in LFA (angl. ''lateral flow assay'').
# Poleg detekcije bakterijske okužbe so želeli ustvariti tudi ustrezno rešitev za zdravljenje okuženih rib, pri čemer bi bila poraba antibiotikov čim manjša (zaradi globalnega problema prevelike uporabe antibiotikov in antibiotične rezistence). Razvili so dva sintezno biološka sistema z uporabo AI-2 inducibilnih promotorjev. Zgoraj omenjene bakterije namreč na škrgah rib tvorijo biofilme (kar oteži privzem kisika in posledično propad ribe), ob tem pa izločajo molekule AI-2 (angl. ''autoinducer-2''). Preko teh med seboj komunicirajo v t. i. procesu ''guorum sensing''. Za zajezitev okužbe bi torej uporabili gensko spremenjene bakterije (s samomorilskim stikalom), ki bi ob prisotnosti molekul AI-2 sintetizirale molekule za uničenje bakterije, ki v ribogojnici povzroča okužbo.
# Prav tako pa so želeli ustvariti tudi preventivno rešitev in tako preprečiti razvoj nadaljnjih okužb. Njihova ideja je bila pripraviti oralno cepivo, saj se večina cepiv ribam sicer dozira intraperitonealno, kar za ribe predstavlja dodaten stres. Odločili so se ustvariti cepivo proti ''F. columnare'', pri čemer bi ribe imunizirali s proteinom GldJ, ki se nahaja na zunanji membrani te bakterije. Ker pa tudi virusi povzročajo obolenja rib, proti nekaterim pa še ni razvitih cepiv, so se odločili ustvariti cepivo proti virusu VHSV (angl. ''viral hemorrhagic septicemia virus''), ki ima na svoji površini Glikoprptein G.

=== Podrobnejši opis ===
==== 1. Detekcija okužbe ====
Z bioinformatsko analizo so najprej poiskali markerski gen, specifičen za za določeno bakterijsko vrsto. Uporabili so gen za 16S rRNA ter gen rpoC (specifičen za ''F. psychrophilum'') in gen cslA (specifičen za ''F. columnare''). Sledilo je dizajniranje treh ssDNA prob (detekcijske, lovilne in kontrolne) za test LFA in priprava začetnih oligonukleotidov za metodo HDA.
'''Postopek hitrega testa''': odvzem vzorca, liza celic (mehansko ali drugače), pomnožitev tarčnega gena patogene bakterije z metodo HDA, detekcija okužbe s testom LFA
*: '''Metoda HDA''' je analogna metodi PCR, le da za samo izvedbo ni potrebna posebna laboratorijska oprema, saj reakcija poteka zgolj pri eni temperaturi, ki pa mora biti ves čas konstantna. V koliko je v vzorcu prisoten tarčni patogen, termostabilna DNA helikaza razvije dsDNA, nato proteini SSB (angl. ''single-stranded DNA-binding proteins'') prekrijejo ssDNA, sledi vezava specifičnih oligonukleotidov (eden od teh se porabi, drugi pa je v presežku – asimetrična metoda HDA), DNA polimeraza nato podaljša DNA verigo in cikel se ponovi. Ker je torej den izmed oligonukleotidov v presežku (oz. drugega primanjkuje), dobimo po končani reakciji veliko ssDNA matric, ki jih potrebujemo za test LFA. Za izboljšavo in pocenitev metode HDA so uporabili helimerazo, ki omogoči tvorbo daljših fragmentov DNA, za izvedbo pa niso potrebni nekateri proteni SSB.
*: '''Test LFA''' temelji na hibridizaciji nukleinskih kislin. Z njim so želeli vizualizirati pomnožke DAN, pridobljene z metodo HDA. Vzorec kanemo na testno ploščico in dodamo pufer. Tekočina se absorbira v membrano, ki vsebuje zlate nanodelce z dodanimi detekcijskimi sondami, kamor se vežejo ssDNA iz vzorca (prva hibridizacijska reakcija). Tako nastali kompleksi potujejo do nitorcelulozne membrane, kjer sta dve črti. Prva je t. i. testna črta, druga pa kontrolna. Na testni črti poteče druga hibridizacija, in sicer kompleks nanodelca z vezanimi ssDNA se veže na lovilno sondo. Ta je vezana na podlago, zato se nastali kompleksi kopičijo na testni črti, kar privede do rdeče črte, vidne s prostim očesom. Nanodelci brez vezanih ssDNA potujejo do kontrolne črte, kjer se hibridizirajo na kontrolno sondo, ki je prav tako pritrjena na podlagi. Ob pozitivnem testu torej zaznamo dve rdeči črti. Če je test negativen, je vidna zgolj kontrolna črta, v ostalih primerih (le testna črta ali nobena črta) pa je test neveljaven.

==== 2. Zdravljenje okužbe ====
Oba sintezno biološka sistema temeljita na sintezi eksoliznov, razlikujeta pa se v načinu, kako celica (gensko spremenjena bakterija ''E. coli'') lizira samo sebe. Uporabili so 3 različne inducibilne promotorje AI-2; nativnega (lsrACDBFG; K3416000) in dva mutirana (EP01r; K3416001 in EP14r; K3416014).
* Sistem endolizin/eksolizin: Celice ''E. coli'' (DH5alfa) zaznavajo eksogen AL-2 v okolju (ki jih izločajo npr. ''Flavobacterium''), zaradi mutacije v genu ''luxS'' pa molekul AL-2 ne morejo proizvajati in so tako primerna šasija za zaznavanje in privzem molekul AL-2. Te v celice ''E. coli'' vstopijo skozi transporter IsrABC, nato pa se v citoplazmi fosforilirajo z LsrK. Fosforilirana molekula AL-2 (AL-2-P) se veže na represor LsrR, kar povzroči konformacijsko spremembo represorja, kompleks AL-2-P in represor pa se zato odcepi s promotorja. To povzroči transkripcijo 2 genov; gena za eksolizin in gena za endolizin. Eksolizin (protein virusa) je specifičen za posamezen bakterijski sev (ali seve) in torej, ko se sprosti iz ''E. coli'', uniči bakterijo, ki povzroča okužbo. Do sprostitve eksolizina pa pride zaradi delovanja endolizina, ki lizira E. coli (in ima torej tudi vlogo samomorilnega stikala).
* Sistem toksin/antitoksin: Začetni del je enak; pri aktivaciji od AL-2 inducibilnega promotorja se prepiše gen za eksolizin. Hkrati pa pod šibkim konstitutivnim promotorjem poteka tudi transkripcija gena MazE, ki je antitoksin v sistemu MazEF. MazF je toksin (specifična endoribonukleaza; cepi mRNA za mestom ACA in prepreči sintezo proteina) in je tudi pod AL-2 inducibilnim promotorjem. Ko je količina MazF toksina nizka, ga MazE antitoksin inhibira (tvori heterokompleks), ko pa količina MazF naraste (preseže količino MazE), to pa s časoma povzroči lizo E. coli in sprostitev eksolizina iz ''E. coli''' na mesto okužbe.

== Doprinos ekipe ==
*Karakterizacija biokock
*#Zapis za protein mazE: BBa_K2142001 – mazE je antitoksin za toksin mazF
*#zapis za protein mazF: BBa_K2142003 – mazF pa je antitoksin za mazE. Ta sistem toksin/antitoksin uporabljajo bakterije ''E. coli'' in druge za sprožitev programirane celične smrti kot odgovor na pomanjkanje hranil. Ko sta oba proteina izražena (koekspresija), ne vplivata na celično rast in viabilnost. Oba dela sta bila uporabljena 2016 s strani iGEM ekipe iz Gradca.
*#Zapis za LuxS: BBa_K091109 - LuxS je sintaza, ki tvori 4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione (DPD), ta pa spontano tvori signalno molekulo AI-2. Slednja je vpletena v mehanizem izražanja genov; v sistem ''guorum sensing'' (izražanje genov v odvisnosti od celične gostote). To biokocko je uporabila ekipa iGEM Davidson-Missouri Western, 2008.
*3D model hitrega testa – pri razvoju senzorja jim je pomagalo podjetje Micromolds. Na voljo je 3D model, ki ga lahko natisne vsak imetnik 3D tiskalnika (npr. druge iGEM ekipe) in ga prilagodi svojim potrebam za LFA testiranje. Uporabi se lahko različne tipe plastike, tudi reciklirano plastiko. Zainteresirani pa lahko za model zaprosijo po e-pošti.

FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib

2021-05-10T20:47:23Z

Mzvipelj:

Flawoflow je iGEM projekt iz leta 2020, ki ga je zasnovala študentska ekipa iz Vilne, Litva. Želeli so ustvariti hitri test za detekcijo okužb, ki se pogosto pojavijo v robogojnich.

Spletna stran projekta FlavoFlow, iGEM 2020 [1]: [https://2020.igem.org/Team:Vilnius-Lithuania]

== Opis problematike ==
Ribogojnice s 'krožnim' delovanjem (angl. ''Recirculating Aquaculture System'' - RAS) so skoraj povsem zaprt sistem, kjer se voda iz bazenov z ribami prečisti (z mehanskimi in biološkimi filtri), obogati s kisikom (in dodatno vodo, ki je iz sistem izhlapela) in ponovno uporabi [2]. Takšni sistemi so dobra rešitev za pridobivanje rib, saj z rastočo populacijo ljudi narašča tudi potreba po morski hrani. Problem sistemov RAS pa so lahko okužbe (virusne, bakterijske, glivne). [1]
Pogoste patogene bakterije rib so ''Flavobacterium columnare'', ''Flavobacterium psychrophilum'' in ''Flavobacterium branchiophilum''. Povzročajo bakterijsko bolezen hladnih voda (angl. ''bacterial cold water disease'') ali sindrom mavrične postrvi (angl. ''rainbow trout fry syndrome''), bolezen ''columnaris'' in bakterijsko bolezen škrg (angl. ''bacterial gill disease'').
Tovrstne okužbe se odražajo v spremenjenem obnašanju in izgledu rib. Že 24-72 ur po pojavu teh sprememb smrtnost rib doseže 70%. Z obstojem sistema za detekcijo opisanih okužb, bi se ribogojniška podjetja izognila finančnim izgubam, ki so posledica propada velikih količin rib ob pojavu okužb.

== Cilji projekta ==
Ekipa si je zastavila tri cilje.
# Glavni cilj projekta Flavoflow je zasnova hitrega testa, s katerim bi lahko, ob sumu na okužbo, delavci v ribogojnicah hitro in enostavno identificirali bakterijsko vrsto, ki le-to povzroča, in pravočasno ukrepali. Želeli so zasnovati cenovno ugoden, robusten in prenosljiv senzor za detekcijo bakterij ''Flavobacterium columnare'' in ''Flavobacterium psychrophilum''. Odločili so se za senzor, ki bo temeljil na metodi HLA (angl. ''isothermal helicase-dependent amplification'') in LFA (angl. ''lateral flow assay'').
# Poleg detekcije bakterijske okužbe so želeli ustvariti tudi ustrezno rešitev za zdravljenje okuženih rib, pri čemer bi bila poraba antibiotikov čim manjša (zaradi globalnega problema prevelike uporabe antibiotikov in antibiotične rezistence). Razvili so dva sintezno biološka sistema z uporabo AI-2 inducibilnih promotorjev. Zgoraj omenjene bakterije namreč na škrgah rib tvorijo biofilme (kar oteži privzem kisika in posledično propad ribe), ob tem pa izločajo molekule AI-2 (angl. ''autoinducer-2''). Preko teh med seboj komunicirajo v t. i. procesu ''guorum sensing''. Za zajezitev okužbe bi torej uporabili gensko spremenjene bakterije (s samomorilskim stikalom), ki bi ob prisotnosti molekul AI-2 sintetizirale molekule za uničenje bakterije, ki v ribogojnici povzroča okužbo.
# Prav tako pa so želeli ustvariti tudi preventivno rešitev in tako preprečiti razvoj nadaljnjih okužb. Njihova ideja je bila pripraviti oralno cepivo, saj se večina cepiv ribam sicer dozira intraperitonealno, kar za ribe predstavlja dodaten stres. Odločili so se ustvariti cepivo proti ''F. columnare'', pri čemer bi ribe imunizirali s proteinom GldJ, ki se nahaja na zunanji membrani te bakterije. Ker pa tudi virusi povzročajo obolenja rib, proti nekaterim pa še ni razvitih cepiv, so se odločili ustvariti cepivo proti virusu VHSV (angl. ''viral hemorrhagic septicemia virus''), ki ima na svoji površini Glikoprptein G.

=== Podrobnejši opis ===
==== 1. Detekcija okužbe ====
Z bioinformatsko analizo so najprej poiskali markerski gen, specifičen za za določeno bakterijsko vrsto. Uporabili so gen za 16S rRNA ter gen rpoC (specifičen za ''F. psychrophilum'') in gen cslA (specifičen za ''F. columnare''). Sledilo je dizajniranje treh ssDNA prob (detekcijske, lovilne in kontrolne) za test LFA in priprava začetnih oligonukleotidov za metodo HDA.
'''Postopek hitrega testa''': odvzem vzorca, liza celic (mehansko ali drugače), pomnožitev tarčnega gena patogene bakterije z metodo HDA, detekcija okužbe s testom LFA
*: '''Metoda HDA''' je analogna metodi PCR, le da za samo izvedbo ni potrebna posebna laboratorijska oprema, saj reakcija poteka zgolj pri eni temperaturi, ki pa mora biti ves čas konstantna. V koliko je v vzorcu prisoten tarčni patogen, termostabilna DNA helikaza razvije dsDNA, nato proteini SSB (angl. ''single-stranded DNA-binding proteins'') prekrijejo ssDNA, sledi vezava specifičnih oligonukleotidov (eden od teh se porabi, drugi pa je v presežku – asimetrična metoda HDA), DNA polimeraza nato podaljša DNA verigo in cikel se ponovi. Ker je torej den izmed oligonukleotidov v presežku (oz. drugega primanjkuje), dobimo po končani reakciji veliko ssDNA matric, ki jih potrebujemo za test LFA. Za izboljšavo in pocenitev metode HDA so uporabili helimerazo, ki omogoči tvorbo daljših fragmentov DNA, za izvedbo pa niso potrebni nekateri proteni SSB.
*: '''Test LFA''' temelji na hibridizaciji nukleinskih kislin. Z njim so želeli vizualizirati pomnožke DAN, pridobljene z metodo HDA. Vzorec kanemo na testno ploščico in dodamo pufer. Tekočina se absorbira v membrano, ki vsebuje zlate nanodelce z dodanimi detekcijskimi sondami, kamor se vežejo ssDNA iz vzorca (prva hibridizacijska reakcija). Tako nastali kompleksi potujejo do nitorcelulozne membrane, kjer sta dve črti. Prva je t. i. testna črta, druga pa kontrolna. Na testni črti poteče druga hibridizacija, in sicer kompleks nanodelca z vezanimi ssDNA se veže na lovilno sondo. Ta je vezana na podlago, zato se nastali kompleksi kopičijo na testni črti, kar privede do rdeče črte, vidne s prostim očesom. Nanodelci brez vezanih ssDNA potujejo do kontrolne črte, kjer se hibridizirajo na kontrolno sondo, ki je prav tako pritrjena na podlagi. Ob pozitivnem testu torej zaznamo dve rdeči črti. Če je test negativen, je vidna zgolj kontrolna črta, v ostalih primerih (le testna črta ali nobena črta) pa je test neveljaven.

== Doprinos ekipe ==
*Karakterizacija biokock
*#Zapis za protein mazE: BBa_K2142001 – mazE je antitoksin za toksin mazF
*#zapis za protein mazF: BBa_K2142003 – mazF pa je antitoksin za mazE. Ta sistem toksin/antitoksin uporabljajo bakterije ''E. coli'' in druge za sprožitev programirane celične smrti kot odgovor na pomanjkanje hranil. Ko sta oba proteina izražena (koekspresija), ne vplivata na celično rast in viabilnost. Oba dela sta bila uporabljena 2016 s strani iGEM ekipe iz Gradca.
*#Zapis za LuxS: BBa_K091109 - LuxS je sintaza, ki tvori 4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione (DPD), ta pa spontano tvori signalno molekulo AI-2. Slednja je vpletena v mehanizem izražanja genov; v sistem ''guorum sensing'' (izražanje genov v odvisnosti od celične gostote). To biokocko je uporabila ekipa iGEM Davidson-Missouri Western, 2008.
*3D model hitrega testa – pri razvoju senzorja jim je pomagalo podjetje Micromolds. Na voljo je 3D model, ki ga lahko natisne vsak imetnik 3D tiskalnika (npr. druge iGEM ekipe) in ga prilagodi svojim potrebam za LFA testiranje. Uporabi se lahko različne tipe plastike, tudi reciklirano plastiko. Zainteresirani pa lahko za model zaprosijo po e-pošti.

FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib

2021-05-10T20:05:21Z

Mzvipelj:

FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib

2021-05-10T18:54:14Z

Mzvipelj: New page: Flawoflow je iGEM projekt iz leta 2020, ki ga je zasnovala študentska ekipa iz Vilne, Litva. Želeli so ustvariti hitri test za detekcijo okužb, ki se pogosto pojavijo v robogojnich. Sp...

Seminarji SB 2020/21

2021-05-10T18:42:50Z

Mzvipelj:

V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline]
(Liza Ulčakar) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 
6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) 
7 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) 
8 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reverzibilna_toplotna_regulacija_za_bifunkcionalno_dinamično_uravnavanje_izražanja_genov_v_E._coli Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli] (Urška Fajdiga) 
9 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dna_optogenetska_naprava_na_osnovi_BRET_za_pulzirajo%C4%8Do_ekspresijo_transgena%2C_ki_omogo%C4%8Da_glukozno_homeostazo_pri_mi%C5%A1ih Sintetična optogenetska naprava na osnovi BRET za pulzirajočo ekspresijo transgena, ki omogoča glukozno homeostazo pri miših] (Paula Horvat) 
10 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hkratna_karakterizacija_več_različnih_racionalno_načrtovanih_promotorskih_arhitektur Vpogled v kombinatorno logiko z IPTG induciranih sistemov] (Urška Zagorc) 
11 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ponovno_določanje_specifičnosti_izven_citoplazme_aktivnih_sigma_faktorjev Ponovno določanje specifičnosti izven citoplazme aktivnih sigma faktorjev] (Eva Keber) 
12 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hierarhi%C4%8Dno_sestavljanje_asimetri%C4%8Dnih_ikozaedri%C4%8Dnih_virusnih_kapsid Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid] (Urška Pečarič Strnad)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv]
(Špela Supej) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 
4 [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) 
6 [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) 
7 [[Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe]] (Mirsad Mešić) 
8 [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) 
9 [[Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata]] (Jernej Imperl) 
10 [[NANOFLEX: Standardiziran, prilagodljiv in priročen celični biosenzor]] (Martin Špendl) 
11 [[FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib]] (Mateja Žvipelj) 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Značilnosti cepiva proizvajalca Moderna (mRNA)

2021-03-15T21:21:39Z

Mzvipelj:

COVID-19 cepivo Moderne je namenjeno preprečevanju bolezni COVID-19, ki jo povzroča virus SARS-CoV-2. Primerno je za ljudi med 18 in 65 letom starosti. Osnovano je na molekuli mRNA, ki nosi informacijo za sintezo proteina Spike, ki je v naravi prisoten na površini virusnega delca. Za učinkovito dostavo molekule mRNA do tarčnih celic, jo v procesu proizvodnje zapakirajo v ovoj, zgrajen iz štirih različnih lipidov. Lipidni ovoj nima samo transportne vloge, ampak hkrati tudi zagotovi zaščito molekule mRNA pred razgradnjo in ji tako omogoči, da v celicah opravi svojo funkcijo. Po vnosu molekule mRNA v celico, pride do sinteze proteina Spike, ki sam po sebi ni nevaren, je pa za telo tuj in zato sproži imunski odziv. Pri tem se tvorijo protiteles, ki so sposobna prepoznati sintetiziran Spike protein, posledično pa tudi virus SARS-Cov-2. Protitelesa, ki jih človek po cepljenju razvije, omogočijo hitrejše in bolj učinkovito uničenje virusnih delcev, ki bi lahko zašli v telo. Tako osebo zaščitijo pred okužbo oziroma razvojem bolezni COVID-19.

Priprava cepiva poteka v dveh glavnih korakih. Sprva je potrebno sintetizirati molekule mRNA, kar poteka brez uporabe celic, in sicer s procesom ''in vitro'' translacije. Pri tem procesu v reakcijsko mešanico vnesemo potrebne gradnike, encime in matrico, ki predstavlja navodilo za sintezo molekul mRNA. V drugem delu pa tako nastale mRNA, ki so v vodnem okolju, pomešamo z lipidno fazo. Zaradi neugodnih interakcij med vodo in lipidi, se slednji uredijo v kroglaste strukture (lipidne nanodelce), ki v svojo notranjost zaobjamejo molekule mRNA. Take lipidne nanodelce lahko pripravimo relativno enostavno in hitro. Z dodatkom pomožnih snovi za uravnavanje pH, povečanje stabilnosti in lažje injiciranje, se tako ustvari končna oblika cepiva, primerna za uporabo.

Cepivo je potrebno injicirati v mišico (intramuskularno), en odmerek po 0,5 ml vsebuje 100 μg mRNA. Za dosego polne zaščitenosti, ki jo to cepivo nudi (splošno velja, da zaščita ni 100 %), je potrebno prejeti 2 odmerka v priporočenem razmiku 28 dni. Cepljena oseba pa je v polni meri zaščitena po 14 dneh od prejema drugega odmerka.

Cepivo torej ne vsebuje virusa, ampak samo informacijo za sintezo ene izmed njegovih komponent, kar pomeni, da se po cepljenju bolezen COVID-19 ne more razviti. Poleg tega je molekula mRNA zelo nestabilna in se čez čas v telesu razgradi. Dodatno varnost pri uporabi zagotavljajo njene lastnosti, saj kot taka ne more spremeniti dednega materiala človeka ali kako drugače toksično vplivati na telo. Pomembne prednosti mRNA cepiv so med drugim tudi hiter razvoj in izdelava, cena proizvodnje je majhna, hkrati pa lahko enostavno proizvedemo velike količine cepiva.

----

Pridobljeno po virih:

#I. Staffans: Annex I. Evid. Eur. Asylum Proced., 2012, 269–269. 
#C. for M. P. for H. U. (CHMP): Assessment report COVID-19 Vaccine Moderna. Ema, 2021, 31, [Online]. Available: https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/covid-19-vaccine-moderna-epar-public-assessment-report_en.pdf. 
#A. M. Reichmuth, M. A. Oberli, A. Jeklenec, R. Langer, and D. Blankschtein: mRNA vaccine delivery using lipid nanoparticles. Ther. Deliv., 2016, 7, 319–334. 
#Y. Huang, C. Yang, X. feng Xu, W. Xu, and S. wen Liu: Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacol. Sin., 2020, 41, 1141–1149. 
#N. A. C. Jackson, K. E. Kester, D. Casimiro, S. Gurunathan, and F. DeRosa: The promise of mRNA vaccines: a biotech and industrial perspective. npj Vaccines, 2020, 5, 3–8. 
#N. Pardi, M. J. Hogan, F. W. Porter, and D. Weissman: mRNA vaccines-a new era in vaccinology. Nat. Rev. Drug Discov., 2018, 17, 261–279. 
#Y. Wang, Z. Zhang, J. Luo, X. Han, Y. Wei, and X. Wei: mRNA vaccine: a potential therapeutic strategy. Mol. Cancer, 2021, 20, 33.
#Buschmann, M. D. et al. Nanomaterial delivery systems for mrna vaccines. Vaccines 9, 1–30 (2021).
#D., T., G., Y. & R., V. COVID-19: An update on vaccine development. Indian J. Rheumatol. 15, 70–72 (2020).
#Chung, Y. H., Beiss, V., Fiering, S. N. & Steinmetz, N. F. Covid-19 vaccine frontrunners and their nanotechnology design. ACS Nano 14, 12522–12537 (2020).

Protikovidna cepiva

2021-03-15T20:34:26Z

Mzvipelj:

študentski seminar pri predmetu Molekularna biotehnologija 2020/21 
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo 
Magistrski študij Biokemija 

Seminar pripravljajo študentje 1. in 2. letnika magistrskega študija. Kratki povzetki morajo biti napisani na taki ravni zahtevnosti, da so razumljivi širši javnosti. Predstavitve seminarjev (6 oz. 12 minut) imajo splošen uvod in strokovno nadaljevanje. Vsebina temelji na javno dostopnih podatkih v času priprave seminarja. Po zadnji seminarski predstavitvi bomo predvidoma izdali zbornih povzetkov, ki bo vključeval tudi slikovne razlage. Poleg tega seminarja morajo študentje pripraviti tudi daljšo predstavitev teme iz znanstvene literature.

Razpored predstavitev:

# [[Molekularnobiološke značilnosti SARS-CoV-2 in aktualni mutanti (južnoafriški, britanski, nigerijski,...)]] - 11.3. (12 min) 
# [[Interakcija SARS-CoV-2 s tarčno celico]] - 11.3. (6 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca Moderna (mRNA)]] - 18.3. (12 min) 
# Rezultati kliničnih testiranj cepiva proizvajalca Moderna (mRNA) - 18.3.(6 min) 
# Značilnosti cepiva proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1) - 25.3. (12 min) 
# Rezultati kliničnih testiranj proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1) - 25.3. 
# Značilnosti cepiva proizvajalca Pfizer / BioNTech (mRNA) - 1.4. 
# Rezultati kliničnih testiranj cepiva proizvajalca Pfizer / BioNTech (mRNA) - 1.4. 
# Značilnosti cepiva proizvajalca Johnson&Johnson / Jennsen (Ad26) - 8.4. 
# Opuščena cepiva: Merck (IAVI, Themix), Imperial College London, Univ. of Queensland - 8.4. 
# Značilnosti cepiva Sputnik V (Gamaleya) (Ad26, Ad5) - 15.4. 
# Značilnosti cepiva CanSino (Ad5) - 15.4. 
# Značilnosti cepiv Sinopharm in Sinovac (inaktivirano) - 22.4. 
# Značilnosti cepiva Bharat Biotech (inaktivirano) - 22.4. 
# Značilnosti cepiva Novavax (proteinsko) - 6.5. 
# Značilnosti cepiva Vector Institute (proteinsko) - 6.5. 
# Značilnosti cepiva EpiVacCorona (peptidno) - 13.5. 
# Značilnosti cepiva Zyadus Cadilla (DNA) - 13.5. 
# Značilnosti cepiva COVAXX / UBI (peptidno) - 20.5.

Značilnosti cepiva proizvajalca Moderna (mRNA)

2021-03-15T20:31:31Z

Mzvipelj: New page: COVID-19 cepivo Moderne je namenjeno preprečevanju bolezni COVID-19, ki jo povzroča virus SARS-CoV-2. Primerno je za ljudi med 18 in 65 letom starosti. Osnovano je na molekuli mRNA, ki n...

COVID-19 cepivo Moderne je namenjeno preprečevanju bolezni COVID-19, ki jo povzroča virus SARS-CoV-2. Primerno je za ljudi med 18 in 65 letom starosti. Osnovano je na molekuli mRNA, ki nosi informacijo za sintezo proteina Spike, ki je v naravi prisoten na površini virusnega delca. Za učinkovito dostavo molekule mRNA do tarčnih celic, jo v procesu proizvodnje zapakirajo v ovoj, zgrajen iz štirih različnih lipidov. Lipidni ovoj nima samo transportne vloge, ampak hkrati tudi zagotovi zaščito molekule mRNA pred razgradnjo in ji tako omogoči, da v celicah opravi svojo funkcijo. Po vnosu molekule mRNA v celico, pride do sinteze proteina Spike, ki sam po sebi ni nevaren, je pa za telo tuj in zato sproži imunski odziv. Pri tem se tvorijo protiteles, ki so sposobna prepoznati sintetiziran Spike protein, posledično pa tudi virus SARS-Cov-2. Protitelesa, ki jih človek po cepljenju razvije, omogočijo učinkovitejše uničenje virusnih delcev, ki bi lahko zašli v telo. Tako osebo zaščitijo pred okužbo oziroma razvojem bolezni COVID-19.

Priprava cepiva poteka v dveh glavnih korakih. Sprva je potrebno sintetizirati molekule mRNA, kar poteka brez uporabe celic, in sicer s procesom in vitro translacije. Pri tem procesu v reakcijsko mešanico vnesemo potrebne gradnike, encime in matrico, ki predstavlja navodilo za sintezo molekul mRNA. V drugem delu pa tako nastale mRNA, ki so v vodnem okolju, pomešamo z lipidno fazo. Zaradi neugodnih interakcij med vodo in lipidi, se slednji uredijo v kroglaste strukture (lipidne nanodelce), ki v svojo notranjost zaobjamejo molekule mRNA. Take lipidne nanodelce lahko pripravimo relativno enostavno in hitro. Z dodatkom pomožnih snovi za uravnavanje pH, povečanje stabilnosti in lažje injiciranje, se tako ustvari končna oblika cepiva, primerna za uporabo.

Cepivo je potrebno injicirati v mišico (intramuskularno), en odmerek po 0,5 ml vsebuje 100 μg mRNA. Za dosego polne zaščitenosti, ki jo to cepivo nudi (splošno velja, da zaščita ni 100 %), je potrebno prejeti 2 odmerka v priporočenem razmiku 28 dni. Cepljena oseba pa je v polni meri zaščitena po 14 dneh od prejema drugega odmerka.
Cepivo torej ne vsebuje virusa, ampak samo informacijo za sintezo ene izmed njegovih komponent, kar pomeni, da se po cepljenju bolezen COVID-19 ne more razviti. Poleg tega je molekula mRNA zelo nestabilna in se čez čas v telesu razgradi. Dodatno varnost pri uporabi zagotavljajo njene lastnosti, saj kot taka ne more spremeniti dednega materiala človeka ali kako drugače toksično vplivati na telo. Pomembne prednosti mRNA cepiv so med drugim tudi hiter razvoj in izdelava, cena proizvodnje je majhna, hkrati pa lahko enostavno proizvedemo velike količine cepiva.

Cepivo torej ne vsebuje virusa, ampak samo informacijo za sintezo ene izmed njegovih komponent, kar pomeni, da se po cepljenju bolezen COVID-19 ne more razviti. Poleg tega je molekula mRNA zelo nestabilna in se čez čas v telesu razgradi. Dodatno varnost pri uporabi zagotavljajo njene lastnosti, saj kot taka ne more spremeniti dednega materiala človeka ali kako drugače toksično vplivati na telo. Pomembne prednosti mRNA cepiv so med drugim tudi hiter razvoj in izdelava, cena proizvodnje je majhna, hkrati pa lahko enostavno proizvedemo velike količine cepiva.

Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.

2021-03-09T12:13:11Z

Mzvipelj:

Norovirus je enoverižni RNA virus brez virusne ovojnice. Okuži lahko različne sesalske organizme in povzroča akutni gastroenteritis (okužbo prebavil). V pogovornem jeziku se za to bolezen pogosto uporablja izraz trebušna gripa, čeprav povzročitelj le-te ni virus gripe. Humani norovirus lahko prizadene ljudi vseh starostnih skupin, ranljive skupine pa so predvsem otroci, starejši in ljudje z oslabljenim imunskim sistemom [1]. Kljub temu, da posledice okužbe po večini niso nevarne (driska, bruhanje, bolečine v trebuhu), po ocenah zaradi te bolezni letno umre med 70.000 in 200.000 ljudi. Človek je dovzeten za okužbo z norovirusi iz skupine GI, GII in GIV, znotraj katerih obstaja veliko genotipov [2]. Prenaša se z okuženim materialom (hrano, pijačo, izločki). Na tržišču trenutno še ni zdravila za zdravljenje in nadzor nad boleznijo [1].

===MucoRice===
Raziskovalci so v rižu vrste japonica (Nipponbare) proizvedli protitelesa proti humanemu norovitusu GII.4 (seva 2006b in Sydney_2012) oziroma GII.17 (sev Kawasaki_2015). To so t. i. VHH protitelesa, kjer gre za variabilno domeno fragmentov težke verige laminih protiteles (VHH - ''a variable domain of a llama heavy-chain antibody fragment''). Z virusom podobnimi delci (VLP – ''virus-like particle'') norovirusa GII.4 oziroma GII.17 so imunizirali lame in tako pridobili več klonov VHH. S predstavitvijo na bakteriofagih pa so izbrali dva klona; 7C6 proti GII.4 in 1E4 proti GII.17 [1].

===Snovanje in izvedba eksperimenta===
Zasnovana sta bila dva tipa transgenega riža. Prvi je izražal monomerni VHH 7C6 proti GII.4, drugi pa heterodimerni VHH 7C6-1E4 proti GII.4 in GII.17. V obeh primerih so uporabili binarni T-DNA vektor (pZH2Bik45G1B), v katerega so poleg enega oz. drugega zapisa vstavili tudi konstrukt za RNA interferenco. S tem so v riževih zrnih zmanjšali izražanje prolamina in glutelina, ki sta poglavitna založna proteina, in tako vplivali na visoko vsebnost rekombinantnega proteina v zrnih. Transformacijo riževih rastlin s pripravljenima vektorjema so izvedli z ''Agrobacterium tumefaciens''. Tako vzgojene transgene rastline so rasle pri pogojih: 12 urna fotoperioda, med osvetljenim delom cikla pri 27°C oz. 22°C v nočnem delu cikla. Iz zrn so pripravili riževo moko in s pufrom ekstrahirali vse proteine, nato pa v raztopino PBS ekstrahirali protein VHH. Po centrifugiranju so za nadaljnje eksperimente uporabili riževo vodo (supernatant), kjer se nahaja topen VHH.
* Vsebnost akumuliranih VHH so določili z analizo SDS-PAGE (barvanje s Coomassie Brilliant Blue - CBB) in prenosom po Westernu. Intenziteto linij (na gelu oz. membrani) VHH iz riža (monomerni VHH 7C6 oz. heterodimerni VHH 7C6-1E4) so primerjali z intenziteto linij standarda (rekombinantni homodimerni VHH 7C6 in heterodimerni VHH 7C6-1E4). Vzporedno so namreč v celicah ''Escherichia coli'' pripravili tudi dva rekombinantna proteina*, ki so ju izolirali, očistili z uporabo Ni kolone ter uporabili kot standard (njuna koncentracija je bila določena na podlagi teoretične absorbance pri valovni dolžini 280 nm).
:: *V celicah ''Escherichia coli'' (Rosetta 2 (DE3) pLysS) proizvedena rekombinantna proteina sta: homidimerni VHH, ki ga tvorita dve VHH 7C6 zaporedji povezani z zaporedjem (GGGGS)3, ter rekombinantni heterodimerni VHH, katerega C konec predstavlja zaporedje 1E4, N konec zaporedje 7C6, povezuje pa ju vmesnik (GGGGS)4.
* Učinkovitost tako proizvedenih protiteles (tistih iz riža kot tudi tistih iz ''Escherichia coli'') so preizkusili na epitelnih črevesnih celicah (pridobljenih iz humanih induciranih pluripotentnih celic) - IEC (''human induced pluripotent stem-cellderived intestinal epithelial cells'').
* S primarnimi in konjugiranimi sekundarnimi protitelesi so na rezinah riževih zrn označili prolamin, glutelin in 7C6 ter z imunofluorescenčno mikroskopijo določili intenziteto fluorescence prolamina in glutelina. Podobno so tudi z imunotranskmisijsko elektronsko mikroskopijo opazovali porazdelitev VHH ter obeh založnih proteinov v riževih zrnih [1].

===Rezultati===
Z analizo intenzitet linij VHH (iz riža) na gelu so ugotovili, da je v povprečju nivo izražanja 7C6 enak 7,17 mg/g riževih zrn, za 7CH-1E4 pa 4,63 mg/g zrn. Povprečen izkoristek topnega 7C6 je znašal 5,39 mg/g riževe vode oz. 2,78 mg/g riževe vode. Učinkovitost ekstrakcije 7C6 oz. 7CH-1E4 s PBS iz riževe moke je bila torej 75,1% oz. 59,9%.
Z imunofluorescenčno mikroskopijo so pokazali, da je prisotnost prolamina in glutelina v riževih zrnih, ki izražajo 7C6 oz. 7C6-1E4, občutno manjša, kar potrjuje učinkovitost RNA interference za zaviranje izražanja teh dve založnih protinov. Slednje so potrdili tudi z imunotranskmisijsko elektronsko mikroskopijo.
Nevtralizacijska sposobnost v rižu proizvedenih heterodimernih VHH 7C6-1E4 se je izkazala za bolj učinkovito (tako proti norovirusu GII.4 kot pri GII.17) v primerjavi z monomernim VHH 7C6. Vpliv dimerizacije VHH na povečano sposobnost nevtralizacije je potrdil tudi rezultat obeh rekombinantnih proteinov (homodimer 7C6 in heterodimer 7C6-1E4), proizvedenih v ''Escherichia coli''. Učinkovitost obeh je bila namreč večja od monomernega 7C6, proizvedenega v rižu, in primerljiva s heterodiemernim 7C6-1E4, prav tako proizvedenim v rižu. Za slednjega so pokazali, da nevtralizacijsko sposobnost obdrži tudi ob predhodni toplotni obdelavi (90°C, 20 min) [1].

===Zaključek===
Kljub manjši ekspresiji heterodimera VHH 7C6-1E4 v riževih zrnih napram monomeru VHH 7C6, je heteordimerni VHH v primerjavi z monomernim izkazoval večjo učinkovitost nevtralizacije norovirusa GII.4_2006b in GII.4 Sydney_2012. Ob enem pa VHH 7C6-1E4 nevtralizira tudi norovirus GII.17 [1].
V razvoju so sicer cepiva na podlagi virusom podobnih delcev (VLP) proti GII.4 in GI.1, ne pa tudi proti novim oblikam virusa (GII.17). Prav tako za omenjena cepiva še ni podatka o primernosti njihove uporabe za ranljivejše skupine, za protitelesa VHH pa poročajo o učinkoviti in varni uporabi tudi pri slednjih [3], [4]. V rižu proizveden heterodimerni VHH 7C6-1E4 proti GII.4 in GII.17 tako predstavlja učinkovino, ki je tudi temperaturno in pH stabilna ter zato potencialno primerna za oralno inumoterapijo [1].

===Viri===
[1] Sasou, A. et al. Development of Antibody-Fragment – Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus. Front. Plant Sci. 12, (2021).

[2] Chhabra, P. et al. Updated classification of norovirus genogroups and genotypes. J. Gen. Virol. 100, 1393–1406 (2019).

[3] Moonens, K. et al. Structural insight in the inhibition of adherence of F4 fimbriae producing Enterotoxigenic Escherichia coli by llama single domain antibodies. Vet. Res. 46, 1–7 (2015).

[4] Tremblay, J. M. et al. A single VHH-based toxin-neutralizing agent and an effector antibody protect mice against challenge with Shiga toxins 1 and 2. Infect. Immun. 81, 4592–4603 (2013).

BNT-seminar

2021-03-09T11:01:51Z

Mzvipelj:

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019058 
30200303 
30019057 
30170131 
30170078 
30170177 
30200324 
30019063 
30170103 
30170002 
30200319 
30200309 
30200320 
30019056 
30200311 
30200306 
30170243 
30019051 
30170141 
30170061 
30019035 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
16.3.2021 
23.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
13.4.2021 
13.4.2021 
20.4.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
23.3.2021 
20.4.2020 
6.4.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
11.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Aljaž Bratina 
Urban Hribar 
Barbara Slapnik 
Tina Kolenc Milavec 
Klementina Polanec 
Martin Špendl 
Tjaša Mlakar 
Sara Laznik 
Martina Lokar 
Doroteja Armič 
Martin Špendl 
Saša Slabe 
Mateja Žvipelj 
Špela Supej 
Urška Fajdiga 
Ernestina Lavrih 
Nika Mikulič Vernik 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Tadej Medved 
Urška Zagorc 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Urška Zagorc 
Liza Ulčakar 
Sara Laznik 
Luka Gnidovec 
Irma Zeljković 
Jernej Imperl 
Barbara Slapnik 
Urša Lovše 
Mateja Žvipelj 
Neža Pavko 
Almina Tahirović 
Nika Mikulič Vernik 
Urška Fajdiga 
Saša Slabe 
Klementina Polanec 
Tjaša Mlakar 
Ajda Godec 
Jernej Imperl 
Špela Supej 
Aljaž Bratina 
Nina Lukančič 
|-

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.

2021-03-08T21:32:30Z

Mzvipelj:

Norovirus je enoverižni RNA virus brez virusne ovojnice. Okuži lahko različne sesalske organizme in povzroča akutni gastroenteritis (okužbo prebavil). V pogovornem jeziku se za to bolezen pogosto uporablja izraz trebušna gripa, čeprav povzročitelj le-te ni virus gripe. Humani norovirus lahko prizadene ljudi vseh starostnih skupin, ranljive skupine pa so predvsem otroci, starejši in ljudje z oslabljenim imunskim sistemom [1]. Kljub temu, da posledice okužbe po večini niso nevarne (driska, bruhanje, bolečine v trebuhu), po ocenah zaradi te bolezni letno umre med 70.000 in 200.000 ljudi. Človek je dovzeten za okužbo z norovirusi iz skupine GI, GII in GIV, znotraj katerih obstaja veliko genotipov [2]. Prenaša se z okuženim materialom (hrano, pijačo, izločki). Na tržišču trenutno še ni zdravila za zdravljenje in nadzor nad boleznijo [1].

===MucoRice===
Raziskovalci so v rižu vrste japonica (Nipponbare) proizvedli protitelesa proti humanemu norovitusu GII.4 (seva 2006b in Sydney_2012) oziroma GII.17 (sev Kawasaki_2015). To so t. i. VHH protitelesa, kjer gre za variabilno domeno fragmentov težke verige laminih protiteles (VHH - ''a variable domain of a llama heavy-chain antibody fragment''). Z virusom podobnimi delci (VLP – ''virus-like particle'') norovirusa GII.4 oziroma GII.17 so imunizirali lame in tako pridobili več klonov VHH. S predstavitvijo na bakteriofagih pa so izbrali dva klona; 7C6 proti GII.4 in 1E4 proti GII.17 [1].

===Snovanje in izvedba eksperimenta===
Zasnovana sta bila dva tipa transgenega riža. Prvi je izražal monomerni VHH 7C6 proti GII.4, drugi pa heterodimerni VHH 7C6-1E4 proti GII.4 in GII.17. V obeh primerih so uporabili binarni T-DNA vektor (pZH2Bik45G1B), v katerega so poleg enega oziroma drugega zapisa vstavili tudi konstrukt za RNA interferenco. S tem so v riževih zrnih zmanjšali izražanje prolamina in glutelina, ki sta poglavitna založna proteina, in tako vplivali na visoko vsebnost rekombinantnega proteina v zrnih. Transformacijo riževih rastlin s pripravljenima vektorjema so izvedli z ''Agrobacterium tumefaciens''. Tako vzgojene transgene rastline so rasle pri pogojih: 12 urna fotoperioda, med osvetljenim delom cikla pri 27°C oz. 22°C v nočnem delu cikla. Iz zrn so pripravili riževo moko in s pufrom ekstrahirali vse proteine, nato pa v raztopino PBS ekstrahirali protein VHH. Po centrifugiranju so za nadaljnje eksperimente uporabili riževo vodo (supernatant), kjer se nahaja topen VHH.
* Vsebnost akumuliranih VHH so določili z analizo SDS-PAGE (barvanje s Coomassie Brilliant Blue - CBB) in prenosom po Westernu. Intenziteto linij (na gelu oz. membrani) VHH iz riža (monomerni VHH 7C6 oz. heterodimerni VHH 7C6-1E4) so primerjali z intenziteto linij standarda (rekombinantni homodimerni VHH 7C6 in heterodimerni VHH 7C6-1E4). Vzporedno so namreč v celicah ''Escherichia coli'' pripravili tudi dva rekombinantna proteina*, ki so ju izolirali, očistili z uporabo Ni kolone ter uporabili kot standard (njuna koncentracija je bila določena na podlagi teoretične absorbance pri valovni dolžini 280 nm).
:: *V celicah ''Escherichia coli'' (Rosetta 2 (DE3) pLysS) proizvedena rekombinantna proteina sta: homidimerni VHH, ki ga tvorita dve VHH 7C6 zaporedji povezani z zaporedjem (GGGGS)3, ter rekombinantni heterodimerni VHH, katerega C konec predstavlja zaporedje 1E4, N konec zaporedje 7C6, povezuje pa ju vmesnik (GGGGS)4.
* Učinkovitost tako proizvedenih protiteles (tistih iz riža kot tudi tistih iz ''Escherichia coli'') so preizkusili na epitelnih črevesnih celicah (pridobljenih iz humanih induciranih pluripotentnih celic) - IEC (''human induced pluripotent stem-cellderived intestinal epithelial cells'').
* S primarnimi in konjugiranimi sekundarnimi protitelesi so na rezinah riževih zrn označili prolamin, glutelin in 7C6 ter z imunofluorescenčno mikroskopijo določili intenziteto fluorescence prolamina in glutelina. Podobno so tudi z imunotranskmisijsko elektronsko mikroskopijo opazovali porazdelitev VHH ter obeh založnih proteinov v riževih zrnih [1].

===Rezultati===
Z analizo intenzitet linij VHH (iz riža) na gelu so ugotovili, da je v povprečju nivo izražanja 7C6 enak 7,17 mg/g riževih zrn, za 7CH-1E4 pa 4,63 mg/g zrn. Povprečen izkoristek topnega 7C6 je znašal 5,39 mg/g riževe vode oz. 2,78 mg/g riževe vode. Učinkovitost ekstrakcije 7C6 oz. 7CH-1E4 s PBS iz riževe moke je bila torej 75,1% oz. 59,9%.
Z imunofluorescenčno mikroskopijo so pokazali, da je prisotnost prolamina in glutelina v riževih zrnih, ki izražajo 7C6 oz. 7C6-1E4, občutno manjša, kar potrjuje učinkovitost RNA interference za zaviranje izražanja teh dve založnih protinov. Slednje so potrdili tudi z imunotranskmisijsko elektronsko mikroskopijo.
Nevtralizacijska sposobnost v rižu proizvedenih heterodimernih VHH 7C6-1E4 se je izkazala za bolj učinkovito (tako proti norovirusu GII.4 kot pri GII.17) v primerjavi z monomernim VHH 7C6. Vpliv dimerizacije VHH na povečano sposobnost nevtralizacije je potrdil tudi rezultat obeh rekombinantnih proteinov (homodimer 7C6 in heterodimer 7C6-1E4), proizvedenih v ''Escherichia coli''. Učinkovitost obeh je bila namreč večja od monomernega 7C6, proizvedenega v rižu, in primerljiva s heterodiemernim 7C6-1E4, prav tako proizvedenim v rižu. Za slednjega so pokazali, da nevtralizacijsko sposobnost obdrži tudi ob predhodni toplotni obdelavi (90°C, 20 min) [1].

===Zaključek===
Kljub manjši ekspresiji heterodimera VHH 7C6-1E4 v riževih zrnih napram monomeru VHH 7C6, je heteordimerni VHH v primerjavi z monomernim izkazoval večjo učinkovitost nevtralizacije norovirusa GII.4_2006b in GII.4 Sydney_2012. Ob enem pa VHH 7C6-1E4 nevtralizira tudi norovirus GII.17 [1].
V razvoju so sicer cepiva na podlagi virusom podobnih delcev (VLP) proti GII.4 in GI.1, ne pa tudi proti novim oblikam virusa (GII.17). Prav tako za omenjena cepiva še ni podatka o primernosti njihove uporabe za ranljivejše skupine, za protitelesa VHH pa poročajo o učinkoviti in varni uporabi tudi pri slednjih [3], [4]. V rižu proizveden heterodimerni VHH 7C6-1E4 proti GII.4 in GII.17 tako predstavlja učinkovino, ki je tudi temperaturno in pH stabilna ter zato potencialno primerna za oralno inumoterapijo [1].

===Viri===
[1] Sasou, A. et al. Development of Antibody-Fragment – Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus. Front. Plant Sci. 12, (2021).

[2] Chhabra, P. et al. Updated classification of norovirus genogroups and genotypes. J. Gen. Virol. 100, 1393–1406 (2019).

[3] Moonens, K. et al. Structural insight in the inhibition of adherence of F4 fimbriae producing Enterotoxigenic Escherichia coli by llama single domain antibodies. Vet. Res. 46, 1–7 (2015).

[4] Tremblay, J. M. et al. A single VHH-based toxin-neutralizing agent and an effector antibody protect mice against challenge with Shiga toxins 1 and 2. Infect. Immun. 81, 4592–4603 (2013).

Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.

2021-03-08T21:30:38Z

Mzvipelj: New page: Norovirus je enoverižni RNA virus brez virusne ovojnice. Okuži lahko različne sesalske organizme in povzroča akutni gastroenteritis (okužbo prebavil). V pogovornem jeziku se za to bol...

Norovirus je enoverižni RNA virus brez virusne ovojnice. Okuži lahko različne sesalske organizme in povzroča akutni gastroenteritis (okužbo prebavil). V pogovornem jeziku se za to bolezen pogosto uporablja izraz trebušna gripa, čeprav povzročitelj le-te ni virus gripe. Humani norovirus lahko prizadene ljudi vseh starostnih skupin, ranljive skupine pa so predvsem otroci, starejši in ljudje z oslabljenim imunskim sistemom [1]. Kljub temu, da posledice okužbe po večini niso nevarne (driska, bruhanje, bolečine v trebuhu), po ocenah zaradi te bolezni letno umre med 70.000 in 200.000 ljudi. Človek je dovzeten za okužbo z norovirusi iz skupine GI, GII in GIV, znotraj katerih obstaja veliko genotipov [2]. Prenaša se z okuženim materialom (hrano, pijačo, izločki). Na tržišču trenutno še ni zdravila za zdravljenje in nadzor nad boleznijo [1].

===MucoRice===
Raziskovalci so v rižu vrste japonica (Nipponbare) proizvedli protitelesa proti humanemu norovitusu GII.4 (seva 2006b in Sydney_2012) oziroma GII.17 (sev Kawasaki_2015). To so t. i. VHH protitelesa, kjer gre za variabilno domeno fragmentov težke verige laminih protiteles (VHH - ''a variable domain of a llama heavy-chain antibody fragment''). Z virusom podobnimi delci (VLP – ''virus-like particle'') norovirusa GII.4 oziroma GII.17 so imunizirali lame in tako pridobili več klonov VHH. S predstavitvijo na bakteriofagih pa so izbrali dva klona; 7C6 proti GII.4 in 1E4 proti GII.17 [1].

===Snovanje in izvedba eksperimenta===
Zasnovana sta bila dva tipa transgenega riža. Prvi je izražal monomerni VHH 7C6 proti GII.4, drugi pa heterodimerni VHH 7C6-1E4 proti GII.4 in GII.17. V obeh primerih so uporabili binarni T-DNA vektor (pZH2Bik45G1B), v katerega so poleg enega oziroma drugega zapisa vstavili tudi konstrukt za RNA interferenco. S tem so v riževih zrnih zmanjšali izražanje prolamina in glutelina, ki sta poglavitna založna proteina, in tako vplivali na visoko vsebnost rekombinantnega proteina v zrnih. Transformacijo riževih rastlin s pripravljenima vektorjema so izvedli z ''Agrobacterium tumefaciens''. Tako vzgojene transgene rastline so rasle pri pogojih: 12 urna fotoperioda, med osvetljenim delom cikla pri 27°C oz. 22°C v nočnem delu cikla. Iz zrn so pripravili riževo moko in s pufrom ekstrahirali vse proteine, nato pa v raztopino PBS ekstrahirali protein VHH. Po centrifugiranju so za nadaljnje eksperimente uporabili riževo vodo (supernatant), kjer se nahaja topen VHH.
* Vsebnost akumuliranih VHH so določili z analizo SDS-PAGE (barvanje s Coomassie Brilliant Blue - CBB) in prenosom po Westernu. Intenziteto linij (na gelu oz. membrani) VHH iz riža (monomerni VHH 7C6 oz. heterodimerni VHH 7C6-1E4) so primerjali z intenziteto linij standarda (rekombinantni homodimerni VHH 7C6 in heterodimerni VHH 7C6-1E4). Vzporedno so namreč v celicah ''Escherichia coli'' pripravili tudi dva rekombinantna proteina*, ki so ju izolirali, očistili z uporabo Ni kolone ter uporabili kot standard (njuna koncentracija je bila določena na podlagi teoretične absorbance pri valovni dolžini 280 nm).
:: *V celicah ''Escherichia coli'' (Rosetta 2 (DE3) pLysS) proizvedena rekombinantna proteina sta: homidimerni VHH, ki ga tvorita dve VHH 7C6 zaporedji povezani z zaporedjem (GGGGS)3, ter rekombinantni heterodimerni VHH, katerega C konec predstavlja zaporedje 1E4, N konec zaporedje 7C6, povezuje pa ju vmesnik (GGGGS)4.
* Učinkovitost tako proizvedenih protiteles (tistih iz riža kot tudi tistih iz ''Escherichia coli'') so preizkusili na epitelnih črevesnih celicah (pridobljenih iz humanih induciranih pluripotentnih celic) - IEC (''human induced pluripotent stem-cellderived intestinal epithelial cells'').
* S primarnimi in konjugiranimi sekundarnimi protitelesi so na rezinah riževih zrn označili prolamin, glutelin in 7C6 ter z imunofluorescenčno mikroskopijo določili intenziteto fluorescence prolamina in glutelina. Podobno so tudi z imunotranskmisijsko elektronsko mikroskopijo opazovali porazdelitev VHH ter obeh založnih proteinov v riževih zrnih [1].

===Rezultati===
Z analizo intenzitet linij VHH (iz riža) na gelu so ugotovili, da je v povprečju nivo izražanja 7C6 enak 7,17 mg/g riževih zrn, za 7CH-1E4 pa 4,63 mg/g zrn. Povprečen izkoristek topnega 7C6 je znašal 5,39 mg/g riževe vode oz. 2,78 mg/g riževe vode. Učinkovitost ekstrakcije 7C6 oz. 7CH-1E4 s PBS iz riževe moke je bila torej 75,1% oz. 59,9%.
Z imunofluorescenčno mikroskopijo so pokazali, da je prisotnost prolamina in glutelina v riževih zrnih, ki izražajo 7C6 oz. 7C6-1E4, občutno manjša, kar potrjuje učinkovitost RNA interference za zaviranje izražanja teh dve založnih protinov. Slednje so potrdili tudi z imunotranskmisijsko elektronsko mikroskopijo.
Nevtralizacijska sposobnost v rižu proizvedenih heterodimernih VHH 7C6-1E4 se je izkazala za bolj učinkovito (tako proti norovirusu GII.4 kot pri GII.17) v primerjavi z monomernim VHH 7C6. Vpliv dimerizacije VHH na povečano sposobnost nevtralizacije je potrdil tudi rezultat obeh rekombinantnih proteinov (homodimer 7C6 in heterodimer 7C6-1E4), proizvedenih v ''Escherichia coli''. Učinkovitost obeh je bila namreč večja od monomernega 7C6, proizvedenega v rižu, in primerljiva s heterodiemernim 7C6-1E4, prav tako proizvedenim v rižu. Za slednjega so pokazali, da nevtralizacijsko sposobnost obdrži tudi ob predhodni toplotni obdelavi (90°C, 20 min) [1].

===Zaključek===
Kljub manjši ekspresiji heterodimera VHH 7C6-1E4 v riževih zrnih napram monomeru VHH 7C6, je heteordimerni VHH v primerjavi z monomernim izkazoval večjo učinkovitost nevtralizacije norovirusa GII.4_2006b in GII.4 Sydney_2012. Ob enem pa VHH 7C6-1E4 nevtralizira tudi norovirus GII.17 [1].
V razvoju so sicer cepiva na podlagi virusom podobnih delcev (VLP) proti GII.4 in GI.1, ne pa tudi proti novim oblikam virusa (GII.17). Prav tako za omenjena cepiva še ni podatka o primernosti njihove uporabe za ranljivejše skupine, za protitelesa VHH pa poročajo o učinkoviti in varni uporabi tudi pri slednjih [3], [4]. V rižu proizveden heterodimerni VHH 7C6-1E4 proti GII.4 in GII.17 tako predstavlja učinkovino, ki je tudi temperaturno in pH stabilna ter zato potencialno primerna za oralno inumoterapijo [1].

===Viri===
[1] Sasou, A. et al. Development of Antibody-Fragment – Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus. Front. Plant Sci. 12, (2021).

[2] Chhabra, P. et al. Updated classification of norovirus genogroups and genotypes. J. Gen. Virol. 100, 1393–1406 (2019).

[3] Moonens, K. et al. Structural insight in the inhibition of adherence of F4 fimbriae producing Enterotoxigenic Escherichia coli by llama single domain antibodies. Vet. Res. 46, 1–7 (2015).

[4] Tremblay, J. M. et al. A single VHH-based toxin-neutralizing agent and an effector antibody protect mice against challenge with Shiga toxins 1 and 2. Infect. Immun. 81, 4592–4603 (2013).

MBT seminarji 2021

2021-03-08T21:16:48Z

Mzvipelj:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah: <--- seznam je v pripravi in bo objavljen do 12.3.

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.) 
# Jernej Imperl (18.3.) 
# Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Paula Horvat 
# Neža Pavko

Razvoj riža za proizvodnjo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.

2021-03-08T21:11:41Z

Norovirus je enoverižni RNA virus brez virusne ovojnice. Okuži lahko različne sesalske organizme in povzroča akutni gastroenteritis (okužbo prebavil). V pogovornem jeziku se za to bolezen pogosto uporablja izraz trebušna gripa, čeprav povzročitelj le-te ni virus gripe. Humani norovirus lahko prizadene ljudi vseh starostnih skupin, ranljive skupine pa so predvsem otroci, starejši in ljudje z oslabljenim imunskim sistemom [1]. Kljub temu, da posledice okužbe po večini niso nevarne (driska, bruhanje, bolečine v trebuhu), po ocenah zaradi te bolezni letno umre med 70.000 in 200.000 ljudi. Človek je dovzeten za okužbo z norovirusi iz skupine GI, GII in GIV, znotraj katerih obstaja veliko genotipov [2]. Prenaša se z okuženim materialom (hrano, pijačo, izločki). Na tržišču trenutno še ni zdravila za zdravljenje in nadzor nad boleznijo [1].

===MucoRice===
Raziskovalci so v rižu vrste japonica (Nipponbare) proizvedli protitelesa proti humanemu norovitusu GII.4 (seva 2006b in Sydney_2012) oziroma GII.17 (sev Kawasaki_2015). To so t. i. VHH protitelesa, kjer gre za variabilno domeno fragmentov težke verige laminih protiteles (VHH - ''a variable domain of a llama heavy-chain antibody fragment''). Z virusom podobnimi delci (VLP – ''virus-like particle'') norovirusa GII.4 oziroma GII.17 so imunizirali lame in tako pridobili več klonov VHH. S predstavitvijo na bakteriofagih pa so izbrali dva klona; 7C6 proti GII.4 in 1E4 proti GII.17 [1].

===Snovanje in izvedba eksperimenta===
Zasnovana sta bila dva tipa transgenega riža. Prvi je izražal monomerni VHH 7C6 proti GII.4, drugi pa heterodimerni VHH 7C6-1E4 proti GII.4 in GII.17. V obeh primerih so uporabili binarni T-DNA vektor (pZH2Bik45G1B), v katerega so poleg enega oziroma drugega zapisa vstavili tudi konstrukt za RNA interferenco. S tem so v riževih zrnih zmanjšali izražanje prolamina in glutelina, ki sta poglavitna založna proteina, in tako vplivali na visoko vsebnost rekombinantnega proteina v zrnih. Transformacijo riževih rastlin s pripravljenima vektorjema so izvedli z ''Agrobacterium tumefaciens''. Tako vzgojene transgene rastline so rasle pri pogojih: 12 urna fotoperioda, med osvetljenim delom cikla pri 27°C oz. 22°C v nočnem delu cikla. Iz zrn so pripravili riževo moko in s pufrom ekstrahirali vse proteine, nato pa v raztopino PBS ekstrahirali protein VHH. Po centrifugiranju so za nadaljnje eksperimente uporabili riževo vodo (supernatant), kjer se nahaja topen VHH.
* Vsebnost akumuliranih VHH so določili z analizo SDS-PAGE (barvanje s Coomassie Brilliant Blue - CBB) in prenosom po Westernu. Intenziteto linij (na gelu oz. membrani) VHH iz riža (monomerni VHH 7C6 oz. heterodimerni VHH 7C6-1E4) so primerjali z intenziteto linij standarda (rekombinantni homodimerni VHH 7C6 in heterodimerni VHH 7C6-1E4). Vzporedno so namreč v celicah ''Escherichia coli'' pripravili tudi dva rekombinantna proteina*, ki so ju izolirali, očistili z uporabo Ni kolone ter uporabili kot standard (njuna koncentracija je bila določena na podlagi teoretične absorbance pri valovni dolžini 280 nm).
:: *V celicah Escherichia coli (Rosetta 2 (DE3) pLysS) proizvedena rekombinantna proteina sta: homidimerni VHH, ki ga tvorita dve VHH 7C6 zaporedji povezani z zaporedjem (GGGGS)3, ter rekombinantni heterodimerni VHH, katerega C konec predstavlja zaporedje 1E4, N konec zaporedje 7C6, povezuje pa ju vmesnik (GGGGS)4.
* Učinkovitost tako proizvedenih protiteles (tistih iz riža kot tudi tistih iz ''Escherichia coli'') so preizkusili na epitelnih črevesnih celicah (pridobljenih iz humanih induciranih pluripotentnih celic) - IEC (''human induced pluripotent stem-cellderived intestinal epithelial cells'').
* S primarnimi in konjugiranimi sekundarnimi protitelesi so na rezinah riževih zrn označili prolamin, glutelin in 7C6 ter z imunofluorescenčno mikroskopijo določili intenziteto fluorescence prolamina in glutelina. Podobno so tudi z imunotranskmisijsko elektronsko mikroskopijo opazovali porazdelitev VHH ter obeh založnih proteinov v riževih zrnih [1].

===Rezultati===
Z analizo intenzitet linij VHH (iz riža) na gelu so ugotovili, da je v povprečju nivo izražanja 7C6 enak 7,17 mg/g riževih zrn, za 7CH-1E4 pa 4,63 mg/g zrn. Povprečen izkoristek topnega 7C6 je znašal 5,39 mg/g riževe vode oz. 2,78 mg/g riževe vode. Učinkovitost ekstrakcije 7C6 oz. 7CH-1E4 s PBS iz riževe moke je bila torej 75,1% oz. 59,9%.
Z imunofluorescenčno mikroskopijo so pokazali, da je prisotnost prolamina in glutelina v riževih zrnih, ki izražajo 7C6 oz. 7C6-1E4, občutno manjša, kar potrjuje učinkovitost RNA interference za zaviranje izražanja teh dve založnih protinov. Slednje so potrdili tudi z imunotranskmisijsko elektronsko mikroskopijo.
Nevtralizacijska sposobnost v rižu proizvedenih heterodimernih VHH 7C6-1E4 se je izkazala za bolj učinkovito (tako proti norovirusu GII.4 kot proti GII.17) v primerjavi z monomernim VHH 7C6. Vpliv dimerizacije VHH na povečano sposobnost nevtralizacije je potrdil tudi rezultat obeh rekombinantnih proteinov (homodimer 7C6 in heterodimer 7C6-1E4), proizvedenih v ''Escherichia coli''. Učinkovitost obeh je bila namreč večja od monomernega 7C6, proizvedenega v rižu, in primerljiva s heterodiemernim 7C6-1E4, prav tako proizvedenim v rižu. Za slednjega so pokazali, da nevtralizacijsko sposobnost obdrži tudi ob predhodni toplotni obdelavi (90°C, 20 min) [1].

===Zaključek===
Kljub manjši ekspresiji heterodimera VHH 7C6-1E4 v riževih zrnih napram monomeru VHH 7C6, je heteordimerni VHH v primerjavi z monomernim izkazoval večjo učinkovitost nevtralizacije norovirusa GII.4_2006b in GII.4 Sydney_2012. Ob enem pa VHH 7C6-1E4 nevtralizira tudi norovirus GII.17 [1].
V razvoju so sicer cepiva na podlagi virusom podobnih delcev (VLP) proti GII.4 in GI.1, ne pa tudi proti novim oblikam virusa (GII.17). Prav tako za omenjena cepiva še ni podatka o primernosti njihove uporabe za ranljivejše skupine, za protitelesa VHH pa poročajo o učinkoviti in varni uporabi tudi pri slednjih [3], [4]. V rižu proizveden heterodimerni VHH 7C6-1E4 proti GII.4 in GII.17 tako predstavlja učinkovino, ki je tudi temperaturno in pH stabilna ter zato potencialno primerna za oralno inumoterapijo [1].

===Viri===
[1] Sasou, A. et al. Development of Antibody-Fragment – Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus. Front. Plant Sci. 12, (2021).

[2] Chhabra, P. et al. Updated classification of norovirus genogroups and genotypes. J. Gen. Virol. 100, 1393–1406 (2019).

[3] Moonens, K. et al. Structural insight in the inhibition of adherence of F4 fimbriae producing Enterotoxigenic Escherichia coli by llama single domain antibodies. Vet. Res. 46, 1–7 (2015).

[4] Tremblay, J. M. et al. A single VHH-based toxin-neutralizing agent and an effector antibody protect mice against challenge with Shiga toxins 1 and 2. Infect. Immun. 81, 4592–4603 (2013).

MBT seminarji 2021

2021-03-08T20:33:09Z

Mzvipelj:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah: <--- seznam je v pripravi in bo objavljen do 12.3.

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Razvoj riža za proizvodnjo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.) 
# Jernej Imperl (18.3.) 
# Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Paula Horvat 
# Neža Pavko

MBT seminarji 2021

2021-03-08T20:28:21Z

Mzvipelj:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah: <--- seznam je v pripravi in bo objavljen do 12.3.

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Razvoj riža za proizvodnjo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu. Mateja Žvipelj]] (11.3.) 
# Jernej Imperl (18.3.) 
# Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Paula Horvat 
# Neža Pavko

MBT seminarji 2021

2021-03-08T20:27:24Z

Mzvipelj:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah: <--- seznam je v pripravi in bo objavljen do 12.3.

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [Razvoj riža za proizvodnjo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu. Mateja Žvipelj] [[stran]](11.3.) 
# Jernej Imperl (18.3.) 
# Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Paula Horvat 
# Neža Pavko

MBT seminarji 2021

2021-03-08T19:57:18Z

Mzvipelj:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah: <--- seznam je v pripravi in bo objavljen do 12.3.

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [Razvoj riža za proizvodnjo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu. Mateja Žvipelj] (11.3.) 
# Jernej Imperl (18.3.) 
# Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Paula Horvat 
# Neža Pavko