Wiki FKKT - User contributions [en]

Seminarji SB 2015/16

2015-12-14T09:37:43Z

Nastja Štemberger:

Seminarji iz Sintezne biologije v študijskem letu 2015/16 so:

Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/2866/synthetic-biology-engineering-complexity-and-refactoring-cell-capabilities SYNTHETIC BIOLOGY: ENGINEERING COMPLEXITY AND REFACTORING CELL CAPABILITIES]

* Production of fatty acid-derived valuable chemicals in synthetic microbes ([[Proizvodnja kemikalij iz derivatov maščobnih kislin s pomočjo sintetičnih mikroorganizmov]]) (Maja Grdadolnik) 
* Optimization of the IPP precursor supply for the production of lycopene, decaprenoxanthin and astaxanthin by Corynebacterium glutamicum ([[Optimizacija sinteze IPP kot prekursorja za produkcijo likopena, dekaprenoksantina in astaksantina v Corynebacterium glutamicum]]) (Griša Prinčič) 
* Engineering sugar utilization and microbial tolerance toward lignocellulose conversion [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Konverzija_lignoceluloze_s_pomočjo_izkoriščanja_mikrobne_tolerance_in_inženiringa_sladkorjev] (Kim Potočnik) 
* Cofactor engineering for enhancing the flux of metabolic pathways [[INŽENIRING KOFAKTORJEV ZA IZBOLJŠANJE METABOLIČNIH POTI]] (Nastja Štemberger) 
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4354409/ Can the natural diversity of quorum-sensing advance synthetic biology?] ([[Ali lahko naravna diverziteta quorum sensinga pripomore k napredku v sintezni biologiji?]]) (Tina Snoj) 
* [http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fbioe.2015.00093/full Signal-to-noise ratio measures efficacy of biological computing devices and circuits] ([[Določanje učinkovitosti bioloških naprav in vezij z razmerjem signal-šum]]) (Jakob G. Lavrenčič) 
* A sense of balance: experimental investigation and modeling of a malonyl-CoA sensor in Escherichia coli (Ajda Rojc) 
* New transposon tools tailored for metabolic engineering of Gram-negative microbial cell factories (Rok Razpotnik) 

Vir: knjiga [http://journal.frontiersin.org/researchtopic/455/synthetic-biology-applications-in-industrial-microbiology SYNTHETIC BIOLOGY APPLICATIONS IN INDUSTRIAL MICROBIOLOGY]

* Recent Progress in Synthetic Biology for Microbial Production of C3–C10 Alcohols (Urška Rauter) ([[Napredki v sintezni biologiji pri proizvodnji C3-C10 alkoholov v mikroorganizmih]])
* Visualizing Evolution in Real-Time Method for Strain Engineering (Samo Zakotnik)
* Engineering Microbial Consortia to Enhance Biomining and Bioremediation (Maja Kostanjevec)
* Engineering Microbial Chemical Factories to Produce Renewable “Biomonomers” (Nastja Pirman)
* Application of Synthetic Biology in Cyanobacteria and Algae (Špela Tomaž)
* Synthetic Feedback Loop Model for Increasing Microbial Biofuel Production Using a Biosensor (Jernej Pušnik)
* Balance of XYL1 and XYL2 Expression in Different Yeast Chassis for Improved xylose Fermentation (Monika Praznik)
* Design and Development of Synthetic Microbial Platform Cells for Bioenergy (Erik Mršnik)
* [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3616241/ Microbial Production of Isoprenoids Enabled by Synthetic Biology] ([[Mikrobna produkcija izoprenoidov s sintezno biologijo]]) (Dominik Kert)
* Chemical synthetic biology: a mini-review (Anka Hotko)

Seminarji iz preglednih člankov:

* Towards engineering biological systems in a broader context (Aleksander Benčič)
* Synthetic biology: Novel approaches for microbiology (Daša Janeš)
* Tools and principles for microbial gene circuit engineering (Marko Radojković)
* Sensitive cells: enabling tools for static and dynamic control of microbial metabolic pathways (Katja Leben)
* Chassis optimization as a cornerstone for the application of synthetic biology based strategies in microbial secondary metabolism (Jure Zabret)
* Recent advances and opportunities in synthetic logic gates engineering in living cells (Monika Biasizzo)
* Programmable genetic circuits for pathway engineering (Urban Javoršek)
* Better together: engineering and application of microbial symbioses (Nejc Petrišič)
* Synthetic biology for microbial production of lipid-based biofuels (Urška Pevec)
* Engineering Biosynthesis Mechanisms for Diversifying Polyhydroxyalkanoates (Mojca Banič)
* Synthetic biology of fungal natural products (Estera Merljak)
* Synthetic biology and biomimetic chemistry as converging technologies fostering a new generation of smart biosensors (Benjamin Bajželj)
* How Synthetic Biology Would Reconsider Natural Bioluminescence and its Application (Ana Grom & Ana Unkovič)
* Synthetic Biology-Toward Therapeutic Solutions (Tanja Korpar)
* Synthetically modified mRNA for efficient and fast human iPS cell generation and direct transdifferentiation to myoblasts (Mirjana Malnar)
* Mammalian synthetic biology: emerging medical applications (Maša Mirkovič)
* Synthetic biology devices and circuits for RNA-based ‘smart vaccines’: a propositional review (Monika Škrjanc)

INŽENIRING KOFAKTORJEV ZA IZBOLJŠANJE METABOLIČNIH POTI

2015-12-14T09:34:52Z

Nastja Štemberger:

=='''Uvod'''==
Sintezna biologija omogoča inženiring bioloških naprav oz. sistemov z novimi ali izboljšanimi funkcijami. Tak pristop ima številne aplikacije, od proizvodnje številnih molekul, biogoriv do npr. zdravil. To se v principu doseže z inženiringom biokatalitičnih poti kjer so aktivnosti encimov skrbno koordinirane in vodijo v sintezo produkta, ki ga želimo. Delovanje velikega števila encimov je pogojeno s prisotnostjo kofaktorjev.
Pri tem seminarju bom govorila o pomembnosti kofaktorjev za biokatalitične procese in s primeri skušala pojasniti zakaj je sinteza in integracija kofaktorjev pri tvorbi holoencimov pomembna pri inženiringu metaboličnih poti ter o izboljšavah, ki jih je omogočila sintezna biologija.

=='''Pomen kofaktorjev v biologiji'''==
Za kofaktorje v širšem pomenu besede velja, da so povezani z več kot polovico znanih proteinov. V tem članku se izraz "kofaktor" nanaša le na tiste dele, bodisi organske ali anorganske, ki z encimom ostanejo fizično povezani skozi celoten katalitičen proces. To izključuje disocibilne kosubstrate, kot so NADPH in glutation. Poleg tega, saj je glavni poudarek članka na inženiringu biološke poti, velja omeniti le tiste kofaktorje, ki nastanejo po de novo poti. Tako so izključeni tudi kovinski subjekti, kot so kalcij in selen.
Razvrščeni so v dve vrsti, na organske in anorganske. Organski kofaktorji so običajno derivati vitaminov in opravljajo številne vrste reakcij, medtem ko anorganski običajno temeljijo na različnih železo-žveplovih kombinacijah.

=='''Holoencimi'''==
Veliko encimov je zgrajenih iz dveh delov: en del je beljakovinski (apoencim), drugi del pa nebeljakovinski (kofaktor). Celoten aktiven encim se imenuje holoencim. Če je kofaktor odstranjen, encim preneha delovati.
Za sintezo holoencimov sta potrebna dva strukturna dela: polipeptidna veriga, ki se tvori v procesu translacije in kofaktorski del, katerega sintetiziramo po določeni metabolni poti. Ko je kofaktor sintetiziran, se poveže z apoencimom, bodisi v co-translacijskih ali post-translacijskih procesih, tvori se holoencim.
Povezava koencim-apoencim je lahko kovalentna in v takih primerih se povezave običajno tvorijo preko serina, treonina histidina, tirozina in ostankov lizina in katalizirane preko določenega/različnih sistemov zorenja. Drugi način povezave koencim-apoencim je nekovalenten vendar močan.

=='''Težave'''==
Ključno za funkcionalen produkt holoencimov je, da je apoencim pravilno zvit s svojim kofaktorjem. Brez kofaktorjev, bi bili takšni encimi nefunkcionalni in s tem povezane poti bi postale neuporabne. To nezaželeno stanje je verjetno da nastopi pri pristopu pri mikrobnem inženiringu, kjer so lahko genetsko dobro okaraktizirane bakterije kot Escherichia coli popolnoma brez kofaktorjev, ki so potrebni za delovanje holencima. Druga možnost je, da so gostitelji sposobni sinteze zahtevanega kofaktorja, vendar pa je ta sinteza nezadostna, kar se kaže kot nabor encimov z visokim razmerjem Apo oblike v primerjavi s Holo obliko.
Najbolj očitna strategija za rešitev teh problemov bi bil gensko spreminjanje gostitelja tako, da je sposoben tvorbe kofaktorja oz. da je stopnja sinteze nativno prisotnega kofaktorja zadostna. (1)
==='''Primeri:'''===
Poglejmo ekspresijo Fe hidrogenaze (HydA1) iz Chlamydomonas reinhardtii (zelena alga) v E.coli. Ta encim je odvisen od H-cluster, ki je v osnovi sestavljen iz 2 želez in treh ogljikovih monoksidov, dveh cianidnih ligandov in enega ditiolatnega mostička. Nastanek tega clustra katalizirajo trije encimi zorenja, HydE, HydF in HydG. Ker E. Coli ni zmožna sinteze encimov Hyd, vedno daje nefunkcionalno Fe-Fe hidrogenazo. To se lahko preprosto prepreči z dopolnitvijo izražanja Fe-Fe hidrogenaze HydA1 s potjo zorenja za H clouster in se tako tvori aktivno Fe-Fe hidrogenazo. V ekspresijski vektor so vnesli gene za hidrogenazo (HydA1) in za HydE, HydF, HydG v različnih kombinacijah (A1,;A1+EF, A1+ G; A1+EF+G). Le koekspresija HydA1 skupaj z vsemi tremi encimi, HydE, HydF in HydG, je dala aktivno hidrogenazo v E.coli. (2)

Pirolokinolin(PQQ) je še en primer kofaktorja, ki se naravno ne sintetizira v E. coli. Ta kofaktor iz družine kinoproteinov je potencialno uporaben za biogorivne celice, bioremodelacijo in biosensing. Z vključitvijo pqqABCDE cluster gena iz Gluconobacter oxydansa, so uspešno dokazali aktivnost dehidrogenazo D-glukoze v E. Coli, ki za svoje delovanje potrebuje PQQ. Cluster gen je bil najverjetneje dopolnjen z nativnim tldD genom. (3)

Tetrahidrobiopterin (BH4) je bistven kofaktor različnih encimov v sesalcih. In vivo se sintetizira iz GTP po tristopenjski poti s pomočjo GTP ciklohidrolaze I (GCHI), 6-piruvoil-tetrahidropterin sintaze (PTP) in sepiapterin reduktaze (SPR). Za razliko od višjih organizmov, večina mikroorganizmov vključno z E. coli nimajo BH4 biosintezne poti. E. coli, sicer ima GCHI gen folE, ki sodeluje v biosintezi folne kisline.
Trenutno ga sintetiziramo s kemičnimi sredstvi, ki zahtevajo drage materiale in zapletene postopke in se raziskuje alternativne pristope. Za proizvodnjo BH4 so uporabili tehnologijo rekombinantne DNK v E.coli. Uporabili so različni ekspresijske plazmide z lac promotorjem ki so vsebovali folE gen iz E. coli, in cDNA gene jeter podgan ki izražajo PTP in SPR encime. Te sevi uspešno proizvajajo BH4, ki je bil odkrit kot dihidrobiopterin in biopterin, oksidacijski produkti BH4. Še dodatno so povečali aktivnost GTP ciklohidrolazo I da so gen folE iz E. coli nadomestili z mtrA gen iz Bacillus subtilis. S temi spremembami so pridobili 1,5x povečanje, do 4,0 g biopterina / L kulture. Rezultati kažejo, na možnost komercialne proizvodnjo BH4 s to metodo. (4)
=='''
Vgraditev kofaktorja je ključnega pomena holoencimsko aktivnost'''==
Da bi bila specifična aktivnost holoencima maksimalna je treba dopolniti sintezo kofaktorja in/ali kofaktor vgraditi. Za encime, ki se s kofaktorjem vežejo na nekovalenten način, je postopek vezave kofaktorja še vedno uganka. Za tiste encime, ki se s kofaktorjem kovalentno vežejo, so se razvili specializirani sistemi zorenja, ki katalizirajo vstavljanje in kovalentno povezavo s kofaktorjem.

'''Indukcija sistema zorenja lahko poveča holoencimsko aktivnost''', kot na primer karboksilne kislinske reduktaze (CAR), ki je bila pred kratkim uporabljena za proizvodnjo širokega spektra kemičnih proizvodov. CAR za svoje delovanje potrebuje kofaktor fosfopantetein. Ta kofaktor se med sintezo z encimom poveže preko fosfodiesterske vezi, kar omogoči encim zorenja, fosfopanteteinil transferaza. Ekspresija CAR v E. coli vodi k merljivim vendar izredno šibki aktivnosti. S soizražanjem fosfopanteteinil transferaze sfp iz Bacillus subtilis, se specifična aktivnost CAR za večkrat poveča v primerjavi z očiščenem encimom iz izvornega organizma. (5)

'''Poleg stimulacije specifične encimske aktivnosti lahko izboljšamo produkcijo holenmcimov tudi s povečanjem znotrajceličnega nivoja kofaktorjev''', na kar sklepamo iz razmerja med Holo / apo-oblike ter stopnje degradacije. Ta pojav je bil pogosto opažen pri hemoproteinih. Z dodatkom δ-aminolevulinske kisline k mediju, se poveča tvorba hema zato se tudi stopnja izražanja hemoglobina ter citokroma b5 znatno izboljša. (6)
Spodbujanje sinteze kofaktorja lahko poveča hitrost sinteznih poti

V zvezi z dejanskim vplivom, ki ga ima lahko inženiring kofaktorjev na metabolno uspešnost sinteznih poti je omenjena naslednja študija.
Za proizvodnjo prekurzorja vitamina C, to je 2-keto-L-gulonske kisline, so uporabili dve dehidrogenazi, ki sta odvisni od PQQ in D-sorbitol kot izhodni substrat. Ugotovili so, da inducirana ekspresija dehidrogenaz ni izboljšala titra nad določenim pragom, in postavili hipotezo da je PQQ omejujoč dejavnik. Hipoteza se je izkazala za pravilno, saj je indukcija poti za sintezo PQQ povzročila za 20% povečanje celotnega titra. (7)

=='''Zaključki'''==
• Zaradi pomembnosti sinteze in integracije kofaktorjev za aktivnost holoencimov je potrebno upoštevati nekaj ključnih točk pri sestavljanju bioloških poti, ki vključujejo holoencime:
1. Aktivnost holoencima je mogoča le znotraj gostitelja, ki je metabolično sposoben sintetizirat potreben kofaktor, drugače je potrebno izvesti komplementarno pot za proizvodnjo kofaktorja.
2. Da zagotovimo maksimalno aktivnost holoencima mora biti apoencim sklopljen s sintezo in insercijo potrebnega kofaktorja. Neuravnoteženost med tema dvema vodi v slabo aktivnost encima, ki je nezadostna za katalitične procese.
3. Ker je znano da kofaktor izboljša stabilnost in aktivnost holoencimov, je verjetno da bo inženiring kofaktorjev uporabna metoda za izboljšanje celokupne aktivnosti vseh holoencimov znotraj inženirane poti in s tem k tvorbi produkta ki ga želimo. (1)

=='''Viri:'''==
1. Cofactor engineering for enhancing the flux of metabolic pathways; Akhtar, Jones; 2014
2. Discovery of Two Novel Radical S-Adenosylmethionine Proteins Required for the Assembly of an Active [Fe] Hydrogenase; Posewitz; 2004
3. Pyrroloquinoline quinone biosynthesis in Escherichia coli through expression of the Gluconobacter oxydans pqqABCDE gene cluster; Yang; 2010
4. Genetic engineering of Escherichia coli for production of Tetrahydrobiopterin; Yamamoto; 2003
5. Reduction of Carboxylic Acids by Nocardia Aldehyde Oxidoreductase Requires a Phosphopantetheinylated Enzyme; Venkitasubramanian; 2006
6. Balanced globin protein expression and heme biosynthesis improve production of human hemoglobin in Saccharomyces cerevisiae; Liu; 2014
7. Stepwise metabolic engineering of Gluconobacter oxydans WSH-003 for the direct production of 2-keto-L-gulonic acid from D-sorbitol; Gao; 2014

INŽENIRING KOFAKTORJEV ZA IZBOLJŠANJE METABOLIČNIH POTI

2015-12-14T09:26:42Z

Nastja Štemberger:

Sintezna biologija omogoča inženiring bioloških naprav oz. sistemov z novimi ali izboljšanimi funkcijami. Tak pristop ima številne aplikacije, od proizvodnje številnih molekul, biogoriv do npr. zdravil. To se v principu doseže z inženiringom biokatalitičnih poti kjer so aktivnosti encimov skrbno koordinirane in vodijo v sintezo produkta, ki ga želimo. Delovanje velikega števila encimov je pogojeno s prisotnostjo kofaktorjev.
Pri tem seminarju bom govorila o pomembnosti kofaktorjev za biokatalitične procese in s primeri skušala pojasniti zakaj je sinteza in integracija kofaktorjev pri tvorbi holoencimov pomembna pri inženiringu metaboličnih poti ter o izboljšavah, ki jih je omogočila sintezna biologija.

'''Pomen kofaktorjev v biologiji'''
Za kofaktorje v širšem pomenu besede velja, da so povezani z več kot polovico znanih proteinov. V tem članku se izraz "kofaktor" nanaša le na tiste dele, bodisi organske ali anorganske, ki z encimom ostanejo fizično povezani skozi celoten katalitičen proces. To izključuje disocibilne kosubstrate, kot so NADPH in glutation. Poleg tega, saj je glavni poudarek članka na inženiringu biološke poti, velja omeniti le tiste kofaktorje, ki nastanejo po de novo poti. Tako so izključeni tudi kovinski subjekti, kot so kalcij in selen.
Razvrščeni so v dve vrsti, na organske in anorganske. Organski kofaktorji so običajno derivati vitaminov in opravljajo številne vrste reakcij, medtem ko anorganski običajno temeljijo na različnih železo-žveplovih kombinacijah.

'''Holoencimi'''
Veliko encimov je zgrajenih iz dveh delov: en del je beljakovinski (apoencim), drugi del pa nebeljakovinski (kofaktor). Celoten aktiven encim se imenuje holoencim. Če je kofaktor odstranjen, encim preneha delovati.
Za sintezo holoencimov sta potrebna dva strukturna dela: polipeptidna veriga, ki se tvori v procesu translacije in kofaktorski del, katerega sintetiziramo po določeni metabolni poti. Ko je kofaktor sintetiziran, se poveže z apoencimom, bodisi v co-translacijskih ali post-translacijskih procesih, tvori se holoencim.
Povezava koencim-apoencim je lahko kovalentna in v takih primerih se povezave običajno tvorijo preko serina, treonina histidina, tirozina in ostankov lizina in katalizirane preko določenega/različnih sistemov zorenja. Drugi način povezave koencim-apoencim je nekovalenten vendar močan.
'''
Težave'''
Ključno za funkcionalen produkt holoencimov je, da je apoencim pravilno zvit s svojim kofaktorjem. Brez kofaktorjev, bi bili takšni encimi nefunkcionalni in s tem povezane poti bi postale neuporabne. To nezaželeno stanje je verjetno da nastopi pri pristopu pri mikrobnem inženiringu, kjer so lahko genetsko dobro okaraktizirane bakterije kot Escherichia coli popolnoma brez kofaktorjev, ki so potrebni za delovanje holencima. Druga možnost je, da so gostitelji sposobni sinteze zahtevanega kofaktorja, vendar pa je ta sinteza nezadostna, kar se kaže kot nabor encimov z visokim razmerjem Apo oblike v primerjavi s Holo obliko.
Najbolj očitna strategija za rešitev teh problemov bi bil gensko spreminjanje gostitelja tako, da je sposoben tvorbe kofaktorja oz. da je stopnja sinteze nativno prisotnega kofaktorja zadostna. (1)
'''Primeri:'''
Poglejmo ekspresijo Fe hidrogenaze (HydA1) iz Chlamydomonas reinhardtii (zelena alga) v E.coli. Ta encim je odvisen od H-cluster, ki je v osnovi sestavljen iz 2 želez in treh ogljikovih monoksidov, dveh cianidnih ligandov in enega ditiolatnega mostička. Nastanek tega clustra katalizirajo trije encimi zorenja, HydE, HydF in HydG. Ker E. Coli ni zmožna sinteze encimov Hyd, vedno daje nefunkcionalno Fe-Fe hidrogenazo. To se lahko preprosto prepreči z dopolnitvijo izražanja Fe-Fe hidrogenaze HydA1 s potjo zorenja za H clouster in se tako tvori aktivno Fe-Fe hidrogenazo. V ekspresijski vektor so vnesli gene za hidrogenazo (HydA1) in za HydE, HydF, HydG v različnih kombinacijah (A1,;A1+EF, A1+ G; A1+EF+G). Le koekspresija HydA1 skupaj z vsemi tremi encimi, HydE, HydF in HydG, je dala aktivno hidrogenazo v E.coli. (2)

Pirolokinolin(PQQ) je še en primer kofaktorja, ki se naravno ne sintetizira v E. coli. Ta kofaktor iz družine kinoproteinov je potencialno uporaben za biogorivne celice, bioremodelacijo in biosensing. Z vključitvijo pqqABCDE cluster gena iz Gluconobacter oxydansa, so uspešno dokazali aktivnost dehidrogenazo D-glukoze v E. Coli, ki za svoje delovanje potrebuje PQQ. Cluster gen je bil najverjetneje dopolnjen z nativnim tldD genom. (3)

Tetrahidrobiopterin (BH4) je bistven kofaktor različnih encimov v sesalcih. In vivo se sintetizira iz GTP po tristopenjski poti s pomočjo GTP ciklohidrolaze I (GCHI), 6-piruvoil-tetrahidropterin sintaze (PTP) in sepiapterin reduktaze (SPR). Za razliko od višjih organizmov, večina mikroorganizmov vključno z E. coli nimajo BH4 biosintezne poti. E. coli, sicer ima GCHI gen folE, ki sodeluje v biosintezi folne kisline.
Trenutno ga sintetiziramo s kemičnimi sredstvi, ki zahtevajo drage materiale in zapletene postopke in se raziskuje alternativne pristope. Za proizvodnjo BH4 so uporabili tehnologijo rekombinantne DNK v E.coli. Uporabili so različni ekspresijske plazmide z lac promotorjem ki so vsebovali folE gen iz E. coli, in cDNA gene jeter podgan ki izražajo PTP in SPR encime. Te sevi uspešno proizvajajo BH4, ki je bil odkrit kot dihidrobiopterin in biopterin, oksidacijski produkti BH4. Še dodatno so povečali aktivnost GTP ciklohidrolazo I da so gen folE iz E. coli nadomestili z mtrA gen iz Bacillus subtilis. S temi spremembami so pridobili 1,5x povečanje, do 4,0 g biopterina / L kulture. Rezultati kažejo, na možnost komercialne proizvodnjo BH4 s to metodo. (4)
'''
Vgraditev kofaktorja je ključnega pomena holoencimsko aktivnost'''
Da bi bila specifična aktivnost holoencima maksimalna je treba dopolniti sintezo kofaktorja in/ali kofaktor vgraditi. Za encime, ki se s kofaktorjem vežejo na nekovalenten način, je postopek vezave kofaktorja še vedno uganka. Za tiste encime, ki se s kofaktorjem kovalentno vežejo, so se razvili specializirani sistemi zorenja, ki katalizirajo vstavljanje in kovalentno povezavo s kofaktorjem.

Indukcija sistema zorenja lahko poveča holoencimsko aktivnost, kot na primer karboksilne kislinske reduktaze (CAR), ki je bila pred kratkim uporabljena za proizvodnjo širokega spektra kemičnih proizvodov. CAR za svoje delovanje potrebuje kofaktor fosfopantetein. Ta kofaktor se med sintezo z encimom poveže preko fosfodiesterske vezi, kar omogoči encim zorenja, fosfopanteteinil transferaza. Ekspresija CAR v E. coli vodi k merljivim vendar izredno šibki aktivnosti. S soizražanjem fosfopanteteinil transferaze sfp iz Bacillus subtilis, se specifična aktivnost CAR za večkrat poveča v primerjavi z očiščenem encimom iz izvornega organizma. (5)
'''
Poleg stimulacije specifične encimske aktivnosti lahko izboljšamo produkcijo holenmcimov tudi s povečanjem znotrajceličnega nivoja kofaktorjev''', na kar sklepamo iz razmerja med Holo / apo-oblike ter stopnje degradacije. Ta pojav je bil pogosto opažen pri hemoproteinih. Z dodatkom δ-aminolevulinske kisline k mediju, se poveča tvorba hema zato se tudi stopnja izražanja hemoglobina ter citokroma b5 znatno izboljša. (6)
Spodbujanje sinteze kofaktorja lahko poveča hitrost sinteznih poti

V zvezi z dejanskim vplivom, ki ga ima lahko inženiring kofaktorjev na metabolno uspešnost sinteznih poti je omenjena naslednja študija.
Za proizvodnjo prekurzorja vitamina C, to je 2-keto-L-gulonske kisline, so uporabili dve dehidrogenazi, ki sta odvisni od PQQ in D-sorbitol kot izhodni substrat. Ugotovili so, da inducirana ekspresija dehidrogenaz ni izboljšala titra nad določenim pragom, in postavili hipotezo da je PQQ omejujoč dejavnik. Hipoteza se je izkazala za pravilno, saj je indukcija poti za sintezo PQQ povzročila za 20% povečanje celotnega titra. (7)
'''
Zaključki'''
• Zaradi pomembnosti sinteze in integracije kofaktorjev za aktivnost holoencimov je potrebno upoštevati nekaj ključnih točk pri sestavljanju bioloških poti, ki vključujejo holoencime:
1. Aktivnost holoencima je mogoča le znotraj gostitelja, ki je metabolično sposoben sintetizirat potreben kofaktor, drugače je potrebno izvesti komplementarno pot za proizvodnjo kofaktorja.
2. Da zagotovimo maksimalno aktivnost holoencima mora biti apoencim sklopljen s sintezo in insercijo potrebnega kofaktorja. Neuravnoteženost med tema dvema vodi v slabo aktivnost encima, ki je nezadostna za katalitične procese.
3. Ker je znano da kofaktor izboljša stabilnost in aktivnost holoencimov, je verjetno da bo inženiring kofaktorjev uporabna metoda za izboljšanje celokupne aktivnosti vseh holoencimov znotraj inženirane poti in s tem k tvorbi produkta ki ga želimo. (1)

Viri:
1. Cofactor engineering for enhancing the flux of metabolic pathways; Akhtar, Jones; 2014
2. Discovery of Two Novel Radical S-Adenosylmethionine Proteins Required for the Assembly of an Active [Fe] Hydrogenase; Posewitz; 2004
3. Pyrroloquinoline quinone biosynthesis in Escherichia coli through expression of the Gluconobacter oxydans pqqABCDE gene cluster; Yang; 2010
4. Genetic engineering of Escherichia coli for production of Tetrahydrobiopterin; Yamamoto; 2003
5. Reduction of Carboxylic Acids by Nocardia Aldehyde Oxidoreductase Requires a Phosphopantetheinylated Enzyme; Venkitasubramanian; 2006
6. Balanced globin protein expression and heme biosynthesis improve production of human hemoglobin in Saccharomyces cerevisiae; Liu; 2014
7. Stepwise metabolic engineering of Gluconobacter oxydans WSH-003 for the direct production of 2-keto-L-gulonic acid from D-sorbitol; Gao; 2014

INŽENIRING KOFAKTORJEV ZA IZBOLJŠANJE METABOLIČNIH POTI

2015-12-14T09:25:15Z

Nastja Štemberger: New page: Sintezna biologija omogoča inženiring bioloških naprav oz. sistemov z novimi ali izboljšanimi funkcijami. Tak pristop ima številne aplikacije, od proizvodnje številnih molekul, biogo...

Sintezna biologija omogoča inženiring bioloških naprav oz. sistemov z novimi ali izboljšanimi funkcijami. Tak pristop ima številne aplikacije, od proizvodnje številnih molekul, biogoriv do npr. zdravil. To se v principu doseže z inženiringom biokatalitičnih poti kjer so aktivnosti encimov skrbno koordinirane in vodijo v sintezo produkta, ki ga želimo. Delovanje velikega števila encimov je pogojeno s prisotnostjo kofaktorjev.
Pri tem seminarju bom govorila o pomembnosti kofaktorjev za biokatalitične procese in s primeri skušala pojasniti zakaj je sinteza in integracija kofaktorjev pri tvorbi holoencimov pomembna pri inženiringu metaboličnih poti ter o izboljšavah, ki jih je omogočila sintezna biologija.

Pomen kofaktorjev v biologiji
Za kofaktorje v širšem pomenu besede velja, da so povezani z več kot polovico znanih proteinov. V tem članku se izraz "kofaktor" nanaša le na tiste dele, bodisi organske ali anorganske, ki z encimom ostanejo fizično povezani skozi celoten katalitičen proces. To izključuje disocibilne kosubstrate, kot so NADPH in glutation. Poleg tega, saj je glavni poudarek članka na inženiringu biološke poti, velja omeniti le tiste kofaktorje, ki nastanejo po de novo poti. Tako so izključeni tudi kovinski subjekti, kot so kalcij in selen.
Razvrščeni so v dve vrsti, na organske in anorganske. Organski kofaktorji so običajno derivati vitaminov in opravljajo številne vrste reakcij, medtem ko anorganski običajno temeljijo na različnih železo-žveplovih kombinacijah.

Holoencimi
Veliko encimov je zgrajenih iz dveh delov: en del je beljakovinski (apoencim), drugi del pa nebeljakovinski (kofaktor). Celoten aktiven encim se imenuje holoencim. Če je kofaktor odstranjen, encim preneha delovati.
Za sintezo holoencimov sta potrebna dva strukturna dela: polipeptidna veriga, ki se tvori v procesu translacije in kofaktorski del, katerega sintetiziramo po določeni metabolni poti. Ko je kofaktor sintetiziran, se poveže z apoencimom, bodisi v co-translacijskih ali post-translacijskih procesih, tvori se holoencim.
Povezava koencim-apoencim je lahko kovalentna in v takih primerih se povezave običajno tvorijo preko serina, treonina histidina, tirozina in ostankov lizina in katalizirane preko določenega/različnih sistemov zorenja. Drugi način povezave koencim-apoencim je nekovalenten vendar močan.

Težave
Ključno za funkcionalen produkt holoencimov je, da je apoencim pravilno zvit s svojim kofaktorjem. Brez kofaktorjev, bi bili takšni encimi nefunkcionalni in s tem povezane poti bi postale neuporabne. To nezaželeno stanje je verjetno da nastopi pri pristopu pri mikrobnem inženiringu, kjer so lahko genetsko dobro okaraktizirane bakterije kot Escherichia coli popolnoma brez kofaktorjev, ki so potrebni za delovanje holencima. Druga možnost je, da so gostitelji sposobni sinteze zahtevanega kofaktorja, vendar pa je ta sinteza nezadostna, kar se kaže kot nabor encimov z visokim razmerjem Apo oblike v primerjavi s Holo obliko.
Najbolj očitna strategija za rešitev teh problemov bi bil gensko spreminjanje gostitelja tako, da je sposoben tvorbe kofaktorja oz. da je stopnja sinteze nativno prisotnega kofaktorja zadostna. (1)
Primeri:
Poglejmo ekspresijo Fe hidrogenaze (HydA1) iz Chlamydomonas reinhardtii (zelena alga) v E.coli. Ta encim je odvisen od H-cluster, ki je v osnovi sestavljen iz 2 želez in treh ogljikovih monoksidov, dveh cianidnih ligandov in enega ditiolatnega mostička. Nastanek tega clustra katalizirajo trije encimi zorenja, HydE, HydF in HydG. Ker E. Coli ni zmožna sinteze encimov Hyd, vedno daje nefunkcionalno Fe-Fe hidrogenazo. To se lahko preprosto prepreči z dopolnitvijo izražanja Fe-Fe hidrogenaze HydA1 s potjo zorenja za H clouster in se tako tvori aktivno Fe-Fe hidrogenazo. V ekspresijski vektor so vnesli gene za hidrogenazo (HydA1) in za HydE, HydF, HydG v različnih kombinacijah (A1,;A1+EF, A1+ G; A1+EF+G). Le koekspresija HydA1 skupaj z vsemi tremi encimi, HydE, HydF in HydG, je dala aktivno hidrogenazo v E.coli. (2)

Pirolokinolin(PQQ) je še en primer kofaktorja, ki se naravno ne sintetizira v E. coli. Ta kofaktor iz družine kinoproteinov je potencialno uporaben za biogorivne celice, bioremodelacijo in biosensing. Z vključitvijo pqqABCDE cluster gena iz Gluconobacter oxydansa, so uspešno dokazali aktivnost dehidrogenazo D-glukoze v E. Coli, ki za svoje delovanje potrebuje PQQ. Cluster gen je bil najverjetneje dopolnjen z nativnim tldD genom. (3)

Tetrahidrobiopterin (BH4) je bistven kofaktor različnih encimov v sesalcih. In vivo se sintetizira iz GTP po tristopenjski poti s pomočjo GTP ciklohidrolaze I (GCHI), 6-piruvoil-tetrahidropterin sintaze (PTP) in sepiapterin reduktaze (SPR). Za razliko od višjih organizmov, večina mikroorganizmov vključno z E. coli nimajo BH4 biosintezne poti. E. coli, sicer ima GCHI gen folE, ki sodeluje v biosintezi folne kisline.
Trenutno ga sintetiziramo s kemičnimi sredstvi, ki zahtevajo drage materiale in zapletene postopke in se raziskuje alternativne pristope. Za proizvodnjo BH4 so uporabili tehnologijo rekombinantne DNK v E.coli. Uporabili so različni ekspresijske plazmide z lac promotorjem ki so vsebovali folE gen iz E. coli, in cDNA gene jeter podgan ki izražajo PTP in SPR encime. Te sevi uspešno proizvajajo BH4, ki je bil odkrit kot dihidrobiopterin in biopterin, oksidacijski produkti BH4. Še dodatno so povečali aktivnost GTP ciklohidrolazo I da so gen folE iz E. coli nadomestili z mtrA gen iz Bacillus subtilis. S temi spremembami so pridobili 1,5x povečanje, do 4,0 g biopterina / L kulture. Rezultati kažejo, na možnost komercialne proizvodnjo BH4 s to metodo. (4)

Vgraditev kofaktorja je ključnega pomena holoencimsko aktivnost
Da bi bila specifična aktivnost holoencima maksimalna je treba dopolniti sintezo kofaktorja in/ali kofaktor vgraditi. Za encime, ki se s kofaktorjem vežejo na nekovalenten način, je postopek vezave kofaktorja še vedno uganka. Za tiste encime, ki se s kofaktorjem kovalentno vežejo, so se razvili specializirani sistemi zorenja, ki katalizirajo vstavljanje in kovalentno povezavo s kofaktorjem.

Indukcija sistema zorenja lahko poveča holoencimsko aktivnost, kot na primer karboksilne kislinske reduktaze (CAR), ki je bila pred kratkim uporabljena za proizvodnjo širokega spektra kemičnih proizvodov. CAR za svoje delovanje potrebuje kofaktor fosfopantetein. Ta kofaktor se med sintezo z encimom poveže preko fosfodiesterske vezi, kar omogoči encim zorenja, fosfopanteteinil transferaza. Ekspresija CAR v E. coli vodi k merljivim vendar izredno šibki aktivnosti. S soizražanjem fosfopanteteinil transferaze sfp iz Bacillus subtilis, se specifična aktivnost CAR za večkrat poveča v primerjavi z očiščenem encimom iz izvornega organizma. (5)

Poleg stimulacije specifične encimske aktivnosti lahko izboljšamo produkcijo holenmcimov tudi s povečanjem znotrajceličnega nivoja kofaktorjev, na kar sklepamo iz razmerja med Holo / apo-oblike ter stopnje degradacije. Ta pojav je bil pogosto opažen pri hemoproteinih. Z dodatkom δ-aminolevulinske kisline k mediju, se poveča tvorba hema zato se tudi stopnja izražanja hemoglobina ter citokroma b5 znatno izboljša. (6)
Spodbujanje sinteze kofaktorja lahko poveča hitrost sinteznih poti
V zvezi z dejanskim vplivom, ki ga ima lahko inženiring kofaktorjev na metabolno uspešnost sinteznih poti je omenjena naslednja študija.
Za proizvodnjo prekurzorja vitamina C, to je 2-keto-L-gulonske kisline, so uporabili dve dehidrogenazi, ki sta odvisni od PQQ in D-sorbitol kot izhodni substrat. Ugotovili so, da inducirana ekspresija dehidrogenaz ni izboljšala titra nad določenim pragom, in postavili hipotezo da je PQQ omejujoč dejavnik. Hipoteza se je izkazala za pravilno, saj je indukcija poti za sintezo PQQ povzročila za 20% povečanje celotnega titra. (7)
Zaključki
• Zaradi pomembnosti sinteze in integracije kofaktorjev za aktivnost holoencimov je potrebno upoštevati nekaj ključnih točk pri sestavljanju bioloških poti, ki vključujejo holoencime:
1. Aktivnost holoencima je mogoča le znotraj gostitelja, ki je metabolično sposoben sintetizirat potreben kofaktor, drugače je potrebno izvesti komplementarno pot za proizvodnjo kofaktorja.
2. Da zagotovimo maksimalno aktivnost holoencima mora biti apoencim sklopljen s sintezo in insercijo potrebnega kofaktorja. Neuravnoteženost med tema dvema vodi v slabo aktivnost encima, ki je nezadostna za katalitične procese.
3. Ker je znano da kofaktor izboljša stabilnost in aktivnost holoencimov, je verjetno da bo inženiring kofaktorjev uporabna metoda za izboljšanje celokupne aktivnosti vseh holoencimov znotraj inženirane poti in s tem k tvorbi produkta ki ga želimo. (1)

Viri:
1. Cofactor engineering for enhancing the flux of metabolic pathways; Akhtar, Jones; 2014
2. Discovery of Two Novel Radical S-Adenosylmethionine Proteins Required for the Assembly of an Active [Fe] Hydrogenase; Posewitz; 2004
3. Pyrroloquinoline quinone biosynthesis in Escherichia coli through expression of the Gluconobacter oxydans pqqABCDE gene cluster; Yang; 2010
4. Genetic engineering of Escherichia coli for production of Tetrahydrobiopterin; Yamamoto; 2003
5. Reduction of Carboxylic Acids by Nocardia Aldehyde Oxidoreductase Requires a Phosphopantetheinylated Enzyme; Venkitasubramanian; 2006
6. Balanced globin protein expression and heme biosynthesis improve production of human hemoglobin in Saccharomyces cerevisiae; Liu; 2014
7. Stepwise metabolic engineering of Gluconobacter oxydans WSH-003 for the direct production of 2-keto-L-gulonic acid from D-sorbitol; Gao; 2014

Metabolomics

2014-01-05T09:34:22Z

Nastja Štemberger:

ČLANEK: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3663530/

Članek: Metabolite Profiling to Characterize Disease-related Bacteria

Uvod.
Pseudomonas aeruginoso uvrščamo med Gram negativno oportunistično bakterijo. Pogosto povzroča vseživljenjske kronične infekcije v pljučih bolnikov s cistično fibrozo (CF).
Zaradi tega je za razumevanje okužb s P. aeruginoso ključno razumeti kako se ta oportunistična bakterija prilagaja na spremembe okolja v pljučih bolnikov s CF.

V članku so se posluževali analiz, ki so jim omogočile identifikacijo in kvantifikacijo skupin metabolitov, ki so si sorodni glede kemijskih lastnosti ali sodelujejo v isti presnovni poti, pravimo da so metabolitom določili profil (metabolite profiling). Osnovni koncept je ta, da se fenotipske profile, oz. metabolomske profile, lahko uporabi za razvrščanje ˝single-gene knockout˝ sevov na podlagi predpostavke, da se bodo funkcionalno sorodni geni združili skupaj (gene cluster). Za ˝single-gene knockouts˝ spremembe je večja verjetnost, da se bodo večje spremembe kazale pri metabolitih kot na transkripcijskem nivoju, zato je bolj smiselna analiza na nivoju metaboloma. To potrjujejo tudi dosedanji eksperimenti na tem področju - metabolne spremembe so veliko pomembnejše od npr. sprememb v rasti mikroorganizmov.

Za študij P. aeruginosa imamo na voljo celotno genomsko knockout knjižnico (PA14NR). Knjižnica zajema PA14 single-gene knockout mutante pridobljene s transpozoni, identificirana so tudi mesta kjer je transpozon vključen znotraj vsakega mutanta. V članku so preučevali možnosti uporabe presnovnega footprinting (analiza celotnega zunajceličnega metaboloma) pristopa za karakterizacijo širokega spektra vzorcev kot je celotna knockout genomska knjižnica.

Izbranih je bilo 86 mutantov iz PA14NR knjižnice. Vsi sevi so rasli v sintetičnem CF mediju (1mL SCFM) v mikrotitrski plošči s 96 vdolbinami. Eksperiment se je izvajal v petih replikacijah (5 plošč).

Analize, rezultati, diskusija.
NMR je zelo uporabna metoda pri metabolomskih študijah. Kvantificirali so 25 metabolitov iz spektra, 8 od teh je izločala večina sevov, 17 pa jih je bilo prisotnih v prvotnem mediju in so bili različno porabljeni. 5 od 8 metabolitov, ki so jih izločali sevi so bili tudi identificirani (etanol, format, acetat, piruvat in glukonat).

Biološko ovrednotenje glede na funkcionalno združevanje
Glavni cilj študije je bil ugotoviti ali bo na podlagi NMR rezultatov analiz eksometaboloma možno določiti tiste knockout mutante, ki imajo podobno funkcijo.
Analiza je pokazala, da se kopije mutantov analizirane pri različnih ponovitvah (analizirali so 5 plošč) združujejo tesno skupaj kar kaže na dobro ponovljivost rezultatov.
Večina mutantov je zrasla do podobne končne A600 kot wt, nekateri so imeli pa očitne napake v rasti.
V nadaljevanju so se posvetili dvo-komponentnem regulatornemem sistemu, ki zajema membransko histidinsko kinazo in citoplazemski regulator odgovora na določen stimulus. Kinaza/regulator mutirani pari so tvorili ločene skupke pri očitni razliki od wt.

Posledice mutacij na metabolizem
Laktat je bil glavni vir ogljika v SCFM - pri večini sevov je bila poraba laktata močno povezana z rastjo. Pri sevih z mutacijo genov, ki so odgovorni za sintezo molekul pri ˝quorum sensing˝ je bila opazna neučinkovita uporaba laktata. Porabili so skoraj vso zalogo laktata, zrasli pa niso do pričakovane velikosti.
2 od izločenih metabolitov sta bila prisotna v visokih količinah pri nekaterih sevih: glukonat in piruvat. Piruvat so preveč izločali aceE in aceF mutanti, glukonat pa cbrA, cbrB, največ pa rpoN mutanti.

Karakterizacija rpoN mutacije
Potrdili so ključno vlogo rpoN pri presnovi dušika, saj je bil mutant sposoben uporabiti le 23 virov dušika, medtem ko jih je wt 52. Presenetljivo je rpoN mutant pokazal višjo aktivnost kot wt na številnih ogljihovih virih.
Zakaj rpoN okvarjeni sevi izločajo glukanat?
Dokazali so da je pri rpoN mutantu za več kot 5x povišana tudi aktivnost glukonat dehidrogenaze v primerjavi z wt kar nakazuje, da je povečana koncentracija glukanata posledica nepravilnega delovanja presnovnih encimov in ne zmanjšanega prevzema glukanata v celice.
Glukonat je bil povišan tudi pri cbrA in cbrB mutantih. Skupaj z rpoN predstavljajo pozitivne regulatorje kratke nekodirajoče regulatorne RNA crcZ. Ta se veže na protein crc, ki regulira številne presnovne gene tako da zavira translacijo. Po analizi z glukonatnim testom so potrdili hipotezo, da crcZ knockout mutant proizvaja veliko več glukonata kot wt, pri crc knockout pa je količina glukonata enako kot pri wt.

Klinična uporabnost
25 od 156 izolatov pacientov je imelo povišano produkcijo glukonata. Izmed vseh izolatov so jih nato izbrali 96 in merili minimalno inhibitorno koncentracijo pri petih različnih antibiotikih (tobramicin, imipenem, ciprofloksacin, colistin, aztreonam). Izkazalo se je, da imajo izolati s povišano produkcijo glukonata nekoliko zmanjšano občutljivost na antibiotike.

ZVIŠEVANJE OCENE

2013-12-18T19:37:38Z

Nastja Štemberger: New page: 30017949

30017949