Wiki FKKT - User contributions [en]

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T19:48:21Z

Nataša Vujović: /* BioRNA/BCL2-siRNA */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka BioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so vstavili v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za izolacijo in testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za čiščenje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC in vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne BioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo zeleni fluorescenčni protein (GFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549-GFP-Luc, Huh7-GFP-Luc ter 143B-GFP-Luc celice).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali konstrukt BioRNA/BCL2-siRNA in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z oligonukleotidom steblo-zanka (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfeciranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolo. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in odpira nove možnosti za zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti in biološka aktivnost odražavajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T19:46:59Z

Nataša Vujović:

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka BioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so vstavili v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za izolacijo in testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za čiščenje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC in vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne BioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo zeleni fluorescenčni protein (GFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549-GFP-Luc, Huh7-GFP-Luc ter 143B-GFP-Luc celice).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali konstrukt BioRNA/BCL2-siRNA in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR s oligonukleotidom steblo-zanka (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfeciranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolo. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in odpira nove možnosti za zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti in biološka aktivnost odražavajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T19:22:26Z

Nataša Vujović: /* Zaključek */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka BioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so vstavili v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za izolacijo in testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za čiščenje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC in vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne BioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo zeleni fluorescenčni protein (GFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549-GFP-Luc, Huh7-GFP-Luc ter 143B-GFP-Luc celice).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali konstrukt BioRNA/BCL2-siRNA in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfeciranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolo. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in odpira nove možnosti za zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti in biološka aktivnost odražavajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T19:21:30Z

Nataša Vujović: /* Zaključek */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka BioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so vstavili v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za izolacijo in testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za čiščenje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC in vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne BioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo zeleni fluorescenčni protein (GFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549-GFP-Luc, Huh7-GFP-Luc ter 143B-GFP-Luc celice).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali konstrukt BioRNA/BCL2-siRNA in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfeciranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolo. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in odpira nove možnosti za zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti in biološka aktivnost odražavata naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T19:21:11Z

Nataša Vujović: /* Zaključek */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka BioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so vstavili v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za izolacijo in testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za čiščenje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC in vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne BioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo zeleni fluorescenčni protein (GFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549-GFP-Luc, Huh7-GFP-Luc ter 143B-GFP-Luc celice).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali konstrukt BioRNA/BCL2-siRNA in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfeciranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolo. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in odpira nove možnosti za zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti in biološka aktivnost odražata naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T19:19:47Z

Nataša Vujović: /* Zaključek */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka BioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so vstavili v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za izolacijo in testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za čiščenje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC in vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne BioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo zeleni fluorescenčni protein (GFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549-GFP-Luc, Huh7-GFP-Luc ter 143B-GFP-Luc celice).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali konstrukt BioRNA/BCL2-siRNA in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfeciranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolo. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in odpira nove možnosti za zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti in biološka aktivnost odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T19:15:21Z

Nataša Vujović: /* Zaključek */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka BioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so vstavili v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za izolacijo in testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za čiščenje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC in vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne BioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo zeleni fluorescenčni protein (GFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549-GFP-Luc, Huh7-GFP-Luc ter 143B-GFP-Luc celice).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali konstrukt BioRNA/BCL2-siRNA in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfeciranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolo. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in odpira nove možnosti za zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T19:11:11Z

Nataša Vujović: /* Zaključek */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka BioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so vstavili v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za izolacijo in testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za čiščenje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC in vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne BioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo zeleni fluorescenčni protein (GFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549-GFP-Luc, Huh7-GFP-Luc ter 143B-GFP-Luc celice).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali konstrukt BioRNA/BCL2-siRNA in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfeciranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolo. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in odpira nove možnosti za zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T19:03:26Z

Nataša Vujović: /* BioRNA/PD-L1-siRNA */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka BioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so vstavili v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za izolacijo in testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za čiščenje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC in vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne BioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo zeleni fluorescenčni protein (GFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549-GFP-Luc, Huh7-GFP-Luc ter 143B-GFP-Luc celice).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali konstrukt BioRNA/BCL2-siRNA in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfeciranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolo. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in se spogleduje z zdravljenjem prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T19:01:48Z

Nataša Vujović: /* BioRNA/PD-L1-siRNA */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka BioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so vstavili v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za izolacijo in testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za čiščenje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC in vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne BioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo zeleni fluorescenčni protein (GFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549-GFP-Luc, Huh7-GFP-Luc ter 143B-GFP-Luc celice).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali konstrukt BioRNA/BCL2-siRNA in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfeciranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolo. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci.BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in se spogleduje z zdravljenjem prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T18:52:46Z

Nataša Vujović: /* BioRNA/BCL2-siRNA */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka BioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so vstavili v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za izolacijo in testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za čiščenje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC in vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne BioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo zeleni fluorescenčni protein (GFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549-GFP-Luc, Huh7-GFP-Luc ter 143B-GFP-Luc celice).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali konstrukt BioRNA/BCL2-siRNA in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfeciranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci.BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in se spogleduje z zdravljenjem prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T18:40:58Z

Nataša Vujović: /* BioRNA/BCL2-siRNA */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka BioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so vstavili v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za izolacijo in testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za čiščenje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC in vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne BioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo zeleni fluorescenčni protein (GFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549-GFP-Luc, Huh7-GFP-Luc ter 143B-GFP-Luc celice).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali konstrukt BioRNA/BCL2-siRNA in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci.BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in se spogleduje z zdravljenjem prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T18:31:53Z

Nataša Vujović: /* Utišanje genov s siRNA */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka BioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so vstavili v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za izolacijo in testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za čiščenje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC in vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne BioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo zeleni fluorescenčni protein (GFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549-GFP-Luc, Huh7-GFP-Luc ter 143B-GFP-Luc celice).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali BioRNA konstrukt s siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA) in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci.BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in se spogleduje z zdravljenjem prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T18:30:59Z

Nataša Vujović: /* BioRNA/GFP-siRNA */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka BioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so vstavili v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za izolacijo in testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za čiščenje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC in vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne BioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo zeleni fluorescenčni protein (GFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549-GFP-Luc, Huh7-GFP-Luc ter 143B-GFP-Luc celice).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas,kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali BioRNA konstrukt s siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA) in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci.BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in se spogleduje z zdravljenjem prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T18:27:42Z

Nataša Vujović: /* BioRNA/GFP-siRNA */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka BioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so vstavili v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za izolacijo in testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za čiščenje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC in vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne BioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo zeleni fluorescenčni protein (GFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549, Huh7 ter 143B).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas,kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali BioRNA konstrukt s siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA) in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci.BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in se spogleduje z zdravljenjem prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T18:03:03Z

Nataša Vujović: /* Utišanje genov s siRNA */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka BioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so vstavili v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za izolacijo in testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za čiščenje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC in vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne BioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo izboljšani zeleni fluorescenčni protein (EGFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549, Huh7 ter 143B).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas,kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali BioRNA konstrukt s siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA) in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci.BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in se spogleduje z zdravljenjem prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T18:01:44Z

Nataša Vujović: /* Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka BioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so vstavili v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za izolacijo in testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za čiščenje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC in vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne bioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo izboljšani zeleni fluorescenčni protein (EGFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549, Huh7 ter 143B).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas,kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali BioRNA konstrukt s siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA) in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci.BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in se spogleduje z zdravljenjem prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T17:56:29Z

Nataša Vujović: /* Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka BioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so vstavili v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za izolacijo in testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za prečiščevanje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC in vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne bioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo izboljšani zeleni fluorescenčni protein (EGFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549, Huh7 ter 143B).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas,kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali BioRNA konstrukt s siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA) in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci.BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in se spogleduje z zdravljenjem prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T17:54:01Z

Nataša Vujović: /* Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka BioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so vstavili v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za prečiščevanje in funkcionalno testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za prečiščevanje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC in vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne bioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo izboljšani zeleni fluorescenčni protein (EGFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549, Huh7 ter 143B).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas,kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali BioRNA konstrukt s siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA) in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci.BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in se spogleduje z zdravljenjem prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T17:52:03Z

Nataša Vujović: /* Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka BioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so vstavili v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za prečiščevanje in funkcionalno testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za prečiščevanje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC; vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne bioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo izboljšani zeleni fluorescenčni protein (EGFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549, Huh7 ter 143B).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas,kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali BioRNA konstrukt s siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA) in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci.BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in se spogleduje z zdravljenjem prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T17:51:32Z

Nataša Vujović: /* Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka bioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so vstavili v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za prečiščevanje in funkcionalno testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za prečiščevanje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC; vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne bioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo izboljšani zeleni fluorescenčni protein (EGFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549, Huh7 ter 143B).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas,kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali BioRNA konstrukt s siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA) in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci.BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in se spogleduje z zdravljenjem prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T17:42:04Z

Nataša Vujović: /* Uvod */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma sintetizirane kemijsko in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka bioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so klonirali v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08 za fermentacijo.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za prečiščevanje in funkcionalno testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za prečiščevanje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC; vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne bioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo izboljšani zeleni fluorescenčni protein (EGFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549, Huh7 ter 143B).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas,kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali BioRNA konstrukt s siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA) in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci.BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in se spogleduje z zdravljenjem prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T15:44:32Z

Nataša Vujović:

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma izdelane s kemično sintezo in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka bioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so klonirali v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08 za fermentacijo.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za prečiščevanje in funkcionalno testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za prečiščevanje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC; vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne bioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo izboljšani zeleni fluorescenčni protein (EGFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549, Huh7 ter 143B).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po transfekciji z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po transfekciji z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas,kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali BioRNA konstrukt s siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA) in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, transfecirane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, transfecirane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci.BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in se spogleduje z zdravljenjem prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T14:37:58Z

Nataša Vujović: /* Zaključek */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma izdelane s kemično sintezo in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka bioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so klonirali v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08 za fermentacijo.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za prečiščevanje in funkcionalno testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za prečiščevanje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC; vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne bioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo izboljšani zeleni fluorescenčni protein (EGFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549, Huh7 ter 143B).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po obdelavi z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po obdelavi z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas,kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali BioRNA konstrukt s siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA) in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, tretiranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, obdelane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, obdelane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci.BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Prihodnost terapija z RNAi je obetavna in se spogleduje z zdravljenjem prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve s strani FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. Batra in sod. so so v raziskavi uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Slednje se razlikujejo od kemično sintetiziranih siRNA, ker so v živih celicah podvržene naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in cenovno ugodno strategijo za proizvodnjo siRNA.
Metoda naredi velik korak naprej za terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni [2].

== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T14:32:05Z

Nataša Vujović: /* BioRNA/PD-L1-siRNA */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma izdelane s kemično sintezo in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka bioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so klonirali v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08 za fermentacijo.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za prečiščevanje in funkcionalno testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za prečiščevanje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC; vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne bioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo izboljšani zeleni fluorescenčni protein (EGFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549, Huh7 ter 143B).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po obdelavi z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po obdelavi z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas,kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali BioRNA konstrukt s siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA) in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, tretiranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, obdelane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, obdelane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, ki ga izražajo tumorske celice in se veže na PD-1 na T celicah in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem po katerem delujejo mnoga biološka zdravila za raka, odobrena s strani FDA. Naredili so transfekcijo BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila močno prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je le potrdila predhodne ugotovitve, saj je pokazala zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1. Test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA uspešno zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci.BioRNA/PD-L1-siRNA torej ne zgolj utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z mogočim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Terapija z RNAi predstavlja obetavno zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. V študiji so Batra in sod. uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Ta se razlikuje od kemično sintetiziranih siRNA, saj so v živih celicah podvržena naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in stroškovno učinkovito strategijo za proizvodnjo siRNA. Ta napredek bistveno izboljšuje terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni in pospešuje uporabo sintezne biologije [2].
== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T14:24:13Z

Nataša Vujović: /* BioRNA/BCL2-siRNA */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma izdelane s kemično sintezo in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka bioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so klonirali v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08 za fermentacijo.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za prečiščevanje in funkcionalno testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za prečiščevanje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC; vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne bioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo izboljšani zeleni fluorescenčni protein (EGFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549, Huh7 ter 143B).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po obdelavi z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po obdelavi z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas,kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Nato so testirali BioRNA konstrukt s siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA) in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki rakavim celicam omogoča izogibanje apoptozi. Ker lahko utišanje gena BCL2 sproži apoptozo v tumorskih celicah, je le-ta pomembna terapevtska tarča pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, tretiranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Zanimivo je dejstvo, da so celice, obdelane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, obdelane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda učinkoviteje sprejeta in stabilnejša od sintetične oblike. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve nakazujejo na to, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč je sposobna celo preseči delovanje standardne sintetične siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko ležal v ohranjenosti strukture pre-miRNA, kar bi encimu Dicer olajšalo prepoznavanje. Lahko pa gre tudi za odsotnost kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, izražen v tumorskih celicah, ki se veže na PD-1 na celicah T in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem za več bioloških zdravil za raka, ki jih je odobrila FDA. Naredili so transfekcija BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila izrazito prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je dodatno potrdila te ugotovitve, saj so pokazale zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1.Ta test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA učinkovito zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. Torej BioRNA/PD-L1-siRNA ne le utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z možnim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Terapija z RNAi predstavlja obetavno zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. V študiji so Batra in sod. uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Ta se razlikuje od kemično sintetiziranih siRNA, saj so v živih celicah podvržena naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in stroškovno učinkovito strategijo za proizvodnjo siRNA. Ta napredek bistveno izboljšuje terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni in pospešuje uporabo sintezne biologije [2].
== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T14:09:45Z

Nataša Vujović: /* BioRNA/GFP-siRNA */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma izdelane s kemično sintezo in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka bioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so klonirali v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08 za fermentacijo.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za prečiščevanje in funkcionalno testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za prečiščevanje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC; vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne bioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo izboljšani zeleni fluorescenčni protein (EGFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549, Huh7 ter 143B).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 ur po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po obdelavi z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po obdelavi z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas,kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Potem so testirali BioRNA konstrukt s siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA) in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki omogoča rakavim celicam izogniti se apoptozi. Ker utišanje gena BCL2 lahko sproži apoptozo v tumorskih celicah, ta predstavlja pomembno terapevtsko tarčo pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, tretiranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Vendar je zanimivo, da so celice, obdelane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, obdelane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda bolj učinkovito sprejeta ali morda bolj stabilna kot sintetična oblika. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve so izjemno pomembne, saj kažejo, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč jo lahko celo preseže v primerjavi s standardno sintetično siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko izhajal iz ohranjene strukture pre-miRNA, kar bi olajšalo prepoznavo encimu Dicer, ali pa iz odsotnosti kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, izražen v tumorskih celicah, ki se veže na PD-1 na celicah T in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem za več bioloških zdravil za raka, ki jih je odobrila FDA. Naredili so transfekcija BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila izrazito prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je dodatno potrdila te ugotovitve, saj so pokazale zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1.Ta test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA učinkovito zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. Torej BioRNA/PD-L1-siRNA ne le utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z možnim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Terapija z RNAi predstavlja obetavno zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. V študiji so Batra in sod. uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Ta se razlikuje od kemično sintetiziranih siRNA, saj so v živih celicah podvržena naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in stroškovno učinkovito strategijo za proizvodnjo siRNA. Ta napredek bistveno izboljšuje terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni in pospešuje uporabo sintezne biologije [2].
== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T13:55:41Z

Nataša Vujović: /* BioRNA/GFP-siRNA */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma izdelane s kemično sintezo in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka bioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so klonirali v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08 za fermentacijo.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za prečiščevanje in funkcionalno testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za prečiščevanje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC; vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne bioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo izboljšani zeleni fluorescenčni protein (EGFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549, Huh7, 143B).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 urah po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po obdelavi z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.
Po 48 in 72 urah po obdelavi z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas,kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Potem so testirali BioRNA konstrukt s siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA) in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki omogoča rakavim celicam izogniti se apoptozi. Ker utišanje gena BCL2 lahko sproži apoptozo v tumorskih celicah, ta predstavlja pomembno terapevtsko tarčo pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, tretiranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Vendar je zanimivo, da so celice, obdelane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, obdelane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda bolj učinkovito sprejeta ali morda bolj stabilna kot sintetična oblika. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve so izjemno pomembne, saj kažejo, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč jo lahko celo preseže v primerjavi s standardno sintetično siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko izhajal iz ohranjene strukture pre-miRNA, kar bi olajšalo prepoznavo encimu Dicer, ali pa iz odsotnosti kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, izražen v tumorskih celicah, ki se veže na PD-1 na celicah T in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem za več bioloških zdravil za raka, ki jih je odobrila FDA. Naredili so transfekcija BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila izrazito prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je dodatno potrdila te ugotovitve, saj so pokazale zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1.Ta test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA učinkovito zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. Torej BioRNA/PD-L1-siRNA ne le utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z možnim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Terapija z RNAi predstavlja obetavno zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. V študiji so Batra in sod. uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Ta se razlikuje od kemično sintetiziranih siRNA, saj so v živih celicah podvržena naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in stroškovno učinkovito strategijo za proizvodnjo siRNA. Ta napredek bistveno izboljšuje terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni in pospešuje uporabo sintezne biologije [2].
== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T13:55:21Z

Nataša Vujović: /* BioRNA/GFP-siRNA */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma izdelane s kemično sintezo in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka bioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so klonirali v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08 za fermentacijo.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za prečiščevanje in funkcionalno testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za prečiščevanje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC; vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne bioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo izboljšani zeleni fluorescenčni protein (EGFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549, Huh7, 143B).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 urah po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po obdelavi z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo.

Po 48 in 72 urah po obdelavi z BioRNA so v celicah opazili dodatno redukcijo GFP signala, kar nakazuje na postopno utišanje izražanja reporterja.

V vseh testiranih celičnih linijah so opazili postopno zmanjševanje fluorescence skozi čas,kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna, funkcionalna in ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Potem so testirali BioRNA konstrukt s siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA) in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki omogoča rakavim celicam izogniti se apoptozi. Ker utišanje gena BCL2 lahko sproži apoptozo v tumorskih celicah, ta predstavlja pomembno terapevtsko tarčo pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, tretiranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Vendar je zanimivo, da so celice, obdelane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, obdelane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda bolj učinkovito sprejeta ali morda bolj stabilna kot sintetična oblika. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve so izjemno pomembne, saj kažejo, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč jo lahko celo preseže v primerjavi s standardno sintetično siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko izhajal iz ohranjene strukture pre-miRNA, kar bi olajšalo prepoznavo encimu Dicer, ali pa iz odsotnosti kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, izražen v tumorskih celicah, ki se veže na PD-1 na celicah T in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem za več bioloških zdravil za raka, ki jih je odobrila FDA. Naredili so transfekcija BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila izrazito prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je dodatno potrdila te ugotovitve, saj so pokazale zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1.Ta test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA učinkovito zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. Torej BioRNA/PD-L1-siRNA ne le utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z možnim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Terapija z RNAi predstavlja obetavno zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. V študiji so Batra in sod. uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Ta se razlikuje od kemično sintetiziranih siRNA, saj so v živih celicah podvržena naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in stroškovno učinkovito strategijo za proizvodnjo siRNA. Ta napredek bistveno izboljšuje terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni in pospešuje uporabo sintezne biologije [2].
== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T13:48:34Z

Nataša Vujović: /* BioRNA/GFP-siRNA */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma izdelane s kemično sintezo in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka bioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so klonirali v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08 za fermentacijo.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za prečiščevanje in funkcionalno testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za prečiščevanje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC; vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne bioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA so naredili transfekcijo bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo izboljšani zeleni fluorescenčni protein (EGFP). Uporabili so tri modele celic, ki izražajo GFP in sicer iz različnih vrst raka (A549, Huh7, 143B).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 urah po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po obdelavi z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo. Po 48 in 72 urah po obdelavi z BioRNA je bila pri celicah opazna dodatna redukcija GFP signala, kar nakazuje postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah je zaznan časovni potek zmanjševanja fluorescence, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna in funkcionalna ter ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Potem so testirali BioRNA konstrukt s siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA) in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki omogoča rakavim celicam izogniti se apoptozi. Ker utišanje gena BCL2 lahko sproži apoptozo v tumorskih celicah, ta predstavlja pomembno terapevtsko tarčo pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, tretiranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Vendar je zanimivo, da so celice, obdelane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, obdelane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda bolj učinkovito sprejeta ali morda bolj stabilna kot sintetična oblika. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve so izjemno pomembne, saj kažejo, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč jo lahko celo preseže v primerjavi s standardno sintetično siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko izhajal iz ohranjene strukture pre-miRNA, kar bi olajšalo prepoznavo encimu Dicer, ali pa iz odsotnosti kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, izražen v tumorskih celicah, ki se veže na PD-1 na celicah T in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem za več bioloških zdravil za raka, ki jih je odobrila FDA. Naredili so transfekcija BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila izrazito prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je dodatno potrdila te ugotovitve, saj so pokazale zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1.Ta test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA učinkovito zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. Torej BioRNA/PD-L1-siRNA ne le utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z možnim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Terapija z RNAi predstavlja obetavno zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. V študiji so Batra in sod. uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Ta se razlikuje od kemično sintetiziranih siRNA, saj so v živih celicah podvržena naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in stroškovno učinkovito strategijo za proizvodnjo siRNA. Ta napredek bistveno izboljšuje terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni in pospešuje uporabo sintezne biologije [2].
== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T13:45:51Z

Nataša Vujović: /* BioRNA/BCL2-siRNA */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma izdelane s kemično sintezo in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka bioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so klonirali v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08 za fermentacijo.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za prečiščevanje in funkcionalno testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za prečiščevanje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC; vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne bioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA, je bila eksperimentalna strategija transfekcija bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo izboljšani zeleni fluorescenčni protein (EGFP). Uporabljeni so bili trije različni modeli celic, ki izražajo GFP, iz različnih vrst raka (A549, Huh7, 143B).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 urah po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po obdelavi z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo. Po 48 in 72 urah po obdelavi z BioRNA je bila pri celicah opazna dodatna redukcija GFP signala, kar nakazuje postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah je zaznan časovni potek zmanjševanja fluorescence, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna in funkcionalna ter ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Potem so testirali BioRNA konstrukt s siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA) in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki omogoča rakavim celicam izogniti se apoptozi. Ker utišanje gena BCL2 lahko sproži apoptozo v tumorskih celicah, ta predstavlja pomembno terapevtsko tarčo pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, tretiranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Vendar je zanimivo, da so celice, obdelane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, obdelane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda bolj učinkovito sprejeta ali morda bolj stabilna kot sintetična oblika. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve so izjemno pomembne, saj kažejo, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč jo lahko celo preseže v primerjavi s standardno sintetično siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko izhajal iz ohranjene strukture pre-miRNA, kar bi olajšalo prepoznavo encimu Dicer, ali pa iz odsotnosti kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, izražen v tumorskih celicah, ki se veže na PD-1 na celicah T in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem za več bioloških zdravil za raka, ki jih je odobrila FDA. Naredili so transfekcija BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila izrazito prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je dodatno potrdila te ugotovitve, saj so pokazale zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1.Ta test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA učinkovito zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. Torej BioRNA/PD-L1-siRNA ne le utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z možnim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Terapija z RNAi predstavlja obetavno zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. V študiji so Batra in sod. uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Ta se razlikuje od kemično sintetiziranih siRNA, saj so v živih celicah podvržena naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in stroškovno učinkovito strategijo za proizvodnjo siRNA. Ta napredek bistveno izboljšuje terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni in pospešuje uporabo sintezne biologije [2].
== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T13:44:56Z

Nataša Vujović:

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma izdelane s kemično sintezo in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka bioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so klonirali v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08 za fermentacijo.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z Urea-PAGE analizo in z uporabo majhneg volumna kultur so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za prečiščevanje in funkcionalno testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za prečiščevanje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC; vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne bioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA, je bila eksperimentalna strategija transfekcija bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo izboljšani zeleni fluorescenčni protein (EGFP). Uporabljeni so bili trije različni modeli celic, ki izražajo GFP, iz različnih vrst raka (A549, Huh7, 143B).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 urah po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po obdelavi z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo. Po 48 in 72 urah po obdelavi z BioRNA je bila pri celicah opazna dodatna redukcija GFP signala, kar nakazuje postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah je zaznan časovni potek zmanjševanja fluorescence, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna in funkcionalna ter ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Potem so testirali BioRNA konstrukt z siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA), in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki omogoča rakavim celicam izogniti se apoptozi. Ker utišanje gena BCL2 lahko sproži apoptozo v tumorskih celicah, ta predstavlja pomembno terapevtsko tarčo pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, tretiranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Vendar je zanimivo, da so celice, obdelane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, obdelane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda bolj učinkovito sprejeta ali morda bolj stabilna kot sintetična oblika. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve so izjemno pomembne, saj kažejo, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč jo lahko celo preseže v primerjavi s standardno sintetično siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko izhajal iz ohranjene strukture pre-miRNA, kar bi olajšalo prepoznavo encimu Dicer, ali pa iz odsotnosti kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, izražen v tumorskih celicah, ki se veže na PD-1 na celicah T in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem za več bioloških zdravil za raka, ki jih je odobrila FDA. Naredili so transfekcija BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila izrazito prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je dodatno potrdila te ugotovitve, saj so pokazale zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1.Ta test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA učinkovito zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. Torej BioRNA/PD-L1-siRNA ne le utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z možnim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Terapija z RNAi predstavlja obetavno zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. V študiji so Batra in sod. uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Ta se razlikuje od kemično sintetiziranih siRNA, saj so v živih celicah podvržena naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in stroškovno učinkovito strategijo za proizvodnjo siRNA. Ta napredek bistveno izboljšuje terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni in pospešuje uporabo sintezne biologije [2].
== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T13:40:02Z

Nataša Vujović: /* Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma izdelane s kemično sintezo in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka bioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukte so klonirali v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08 za fermentacijo.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z uporabo majhneg volumna kultur, z Urea-PAGE analizom so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za prečiščevanje in funkcionalno testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za prečiščevanje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC; vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Funkcionalno utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA funkcionalno sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne bioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA, je bila eksperimentalna strategija transfekcija bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo izboljšani zeleni fluorescenčni protein (EGFP). Uporabljeni so bili trije različni modeli celic, ki izražajo GFP, iz različnih vrst raka (A549, Huh7, 143B).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 urah po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po obdelavi z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo. Po 48 in 72 urah po obdelavi z BioRNA je bila pri celicah opazna dodatna redukcija GFP signala, kar nakazuje postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah je zaznan časovni potek zmanjševanja fluorescence, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna in funkcionalna ter ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Potem so testirali BioRNA konstrukt z siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA), in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki omogoča rakavim celicam izogniti se apoptozi. Ker utišanje gena BCL2 lahko sproži apoptozo v tumorskih celicah, ta predstavlja pomembno terapevtsko tarčo pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, tretiranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Vendar je zanimivo, da so celice, obdelane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, obdelane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda bolj učinkovito sprejeta ali morda bolj stabilna kot sintetična oblika. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve so izjemno pomembne, saj kažejo, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč jo lahko celo preseže v primerjavi s standardno sintetično siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko izhajal iz ohranjene strukture pre-miRNA, kar bi olajšalo prepoznavo encimu Dicer, ali pa iz odsotnosti kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, izražen v tumorskih celicah, ki se veže na PD-1 na celicah T in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem za več bioloških zdravil za raka, ki jih je odobrila FDA. Naredili so transfekcija BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila izrazito prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je dodatno potrdila te ugotovitve, saj so pokazale zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1.Ta test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA učinkovito zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. Torej BioRNA/PD-L1-siRNA ne le utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z možnim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Terapija z RNAi predstavlja obetavno zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. V študiji so Batra in sod. uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Ta se razlikuje od kemično sintetiziranih siRNA, saj so v živih celicah podvržena naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in stroškovno učinkovito strategijo za proizvodnjo siRNA. Ta napredek bistveno izboljšuje terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni in pospešuje uporabo sintezne biologije [2].
== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T13:38:54Z

Nataša Vujović: /* Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma izdelane s kemično sintezo in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka bioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukti so klonirali v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08 za fermentacijo.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z uporabo majhneg volumna kultur, z Urea-PAGE analizom so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za prečiščevanje in funkcionalno testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za prečiščevanje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC; vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Funkcionalno utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA funkcionalno sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne bioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA, je bila eksperimentalna strategija transfekcija bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo izboljšani zeleni fluorescenčni protein (EGFP). Uporabljeni so bili trije različni modeli celic, ki izražajo GFP, iz različnih vrst raka (A549, Huh7, 143B).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 urah po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po obdelavi z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo. Po 48 in 72 urah po obdelavi z BioRNA je bila pri celicah opazna dodatna redukcija GFP signala, kar nakazuje postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah je zaznan časovni potek zmanjševanja fluorescence, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna in funkcionalna ter ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Potem so testirali BioRNA konstrukt z siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA), in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki omogoča rakavim celicam izogniti se apoptozi. Ker utišanje gena BCL2 lahko sproži apoptozo v tumorskih celicah, ta predstavlja pomembno terapevtsko tarčo pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, tretiranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Vendar je zanimivo, da so celice, obdelane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, obdelane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda bolj učinkovito sprejeta ali morda bolj stabilna kot sintetična oblika. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve so izjemno pomembne, saj kažejo, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč jo lahko celo preseže v primerjavi s standardno sintetično siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko izhajal iz ohranjene strukture pre-miRNA, kar bi olajšalo prepoznavo encimu Dicer, ali pa iz odsotnosti kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, izražen v tumorskih celicah, ki se veže na PD-1 na celicah T in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem za več bioloških zdravil za raka, ki jih je odobrila FDA. Naredili so transfekcija BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila izrazito prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je dodatno potrdila te ugotovitve, saj so pokazale zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1.Ta test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA učinkovito zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. Torej BioRNA/PD-L1-siRNA ne le utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z možnim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Terapija z RNAi predstavlja obetavno zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. V študiji so Batra in sod. uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Ta se razlikuje od kemično sintetiziranih siRNA, saj so v živih celicah podvržena naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in stroškovno učinkovito strategijo za proizvodnjo siRNA. Ta napredek bistveno izboljšuje terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni in pospešuje uporabo sintezne biologije [2].
== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T13:38:08Z

Nataša Vujović:

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za namen terapije so večinoma izdelane s kemično sintezo in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Obstaja tudi tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili metodo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Metoda temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, in omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Novo razvito človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka bioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukti so klonirali v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08 za fermentacijo.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z uporabo majhneg volumna kultur, z Urea-PAGE analizom so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za prečiščevanje in funkcionalno testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za prečiščevanje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC; vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Funkcionalno utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA funkcionalno sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne bioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA, je bila eksperimentalna strategija transfekcija bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo izboljšani zeleni fluorescenčni protein (EGFP). Uporabljeni so bili trije različni modeli celic, ki izražajo GFP, iz različnih vrst raka (A549, Huh7, 143B).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 urah po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po obdelavi z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo. Po 48 in 72 urah po obdelavi z BioRNA je bila pri celicah opazna dodatna redukcija GFP signala, kar nakazuje postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah je zaznan časovni potek zmanjševanja fluorescence, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna in funkcionalna ter ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Potem so testirali BioRNA konstrukt z siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA), in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki omogoča rakavim celicam izogniti se apoptozi. Ker utišanje gena BCL2 lahko sproži apoptozo v tumorskih celicah, ta predstavlja pomembno terapevtsko tarčo pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, tretiranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Vendar je zanimivo, da so celice, obdelane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, obdelane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda bolj učinkovito sprejeta ali morda bolj stabilna kot sintetična oblika. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve so izjemno pomembne, saj kažejo, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč jo lahko celo preseže v primerjavi s standardno sintetično siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko izhajal iz ohranjene strukture pre-miRNA, kar bi olajšalo prepoznavo encimu Dicer, ali pa iz odsotnosti kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, izražen v tumorskih celicah, ki se veže na PD-1 na celicah T in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem za več bioloških zdravil za raka, ki jih je odobrila FDA. Naredili so transfekcija BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila izrazito prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je dodatno potrdila te ugotovitve, saj so pokazale zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1.Ta test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA učinkovito zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. Torej BioRNA/PD-L1-siRNA ne le utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z možnim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Terapija z RNAi predstavlja obetavno zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. V študiji so Batra in sod. uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Ta se razlikuje od kemično sintetiziranih siRNA, saj so v živih celicah podvržena naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in stroškovno učinkovito strategijo za proizvodnjo siRNA. Ta napredek bistveno izboljšuje terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni in pospešuje uporabo sintezne biologije [2].
== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T13:26:02Z

Nataša Vujović: /* BioRNA/BCL2-siRNA */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za terapije so večinoma izdelane s kemično sintezo in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Tudi obstaja tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili novo platformo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Ta platforma temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, ki omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Novo razvito človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka bioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukti so klonirali v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08 za fermentacijo.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z uporabo majhneg volumna kultur, z Urea-PAGE analizom so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za prečiščevanje in funkcionalno testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za prečiščevanje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC; vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Funkcionalno utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA funkcionalno sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne bioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA, je bila eksperimentalna strategija transfekcija bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo izboljšani zeleni fluorescenčni protein (EGFP). Uporabljeni so bili trije različni modeli celic, ki izražajo GFP, iz različnih vrst raka (A549, Huh7, 143B).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 urah po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po obdelavi z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo. Po 48 in 72 urah po obdelavi z BioRNA je bila pri celicah opazna dodatna redukcija GFP signala, kar nakazuje postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah je zaznan časovni potek zmanjševanja fluorescence, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna in funkcionalna ter ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Potem so testirali BioRNA konstrukt z siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA), in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki omogoča rakavim celicam izogniti se apoptozi. Ker utišanje gena BCL2 lahko sproži apoptozo v tumorskih celicah, ta predstavlja pomembno terapevtsko tarčo pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, tretiranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Vendar je zanimivo, da so celice, obdelane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, obdelane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda bolj učinkovito sprejeta ali morda bolj stabilna kot sintetična oblika. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve so izjemno pomembne, saj kažejo, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč jo lahko celo preseže v primerjavi s standardno sintetično siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko izhajal iz ohranjene strukture pre-miRNA, kar bi olajšalo prepoznavo encimu Dicer, ali pa iz odsotnosti kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

=== BioRNA/PD-L1-siRNA ===
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, izražen v tumorskih celicah, ki se veže na PD-1 na celicah T in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem za več bioloških zdravil za raka, ki jih je odobrila FDA. Naredili so transfekcija BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila izrazito prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je dodatno potrdila te ugotovitve, saj so pokazale zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1.Ta test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA učinkovito zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. Torej BioRNA/PD-L1-siRNA ne le utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z možnim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Terapija z RNAi predstavlja obetavno zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. V študiji so Batra in sod. uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Ta se razlikuje od kemično sintetiziranih siRNA, saj so v živih celicah podvržena naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in stroškovno učinkovito strategijo za proizvodnjo siRNA. Ta napredek bistveno izboljšuje terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni in pospešuje uporabo sintezne biologije [2].
== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA

2025-05-19T12:39:21Z

Nataša Vujović:

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38733599/ Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents]

== Uvod ==

RNAi je celični obrambni mehanizem, ki uravnava izražanje genov. Zavira izražanje genov z razgradnjo določenih mRNA, s čimer preprečuje sintezo ciljnih proteinov.
Mehanizem so terapevtsko izkoristili z uporabo majhnih interferenčnih RNA (siRNA), ki omogočajo ciljno utišanje genov, povezanih z boleznimi. Visoka specifičnost in učinkovitost RNA interference pri utišanju genov je omogočila razvoj terapij na osnovi siRNA, namenjenih zdravljenju različnih bolezni, vključno z redkimi dednimi motnjami, določenimi vrstami raka ter virusnimi okužbami [1].
Molekule siRNA za terapije so večinoma izdelane s kemično sintezo in pogosto vsebujejo umetne modifikacije za povečanje stabilnosti in zmanjšanje imunogenosti, kar pa lahko povzroči nepredvidene stranske učinke. Tudi obstaja tveganje za kontaminacijo z endotoksini. Zato se povečuje zanimanje za proizvodnjo bolj naravnih molekul siRNA, ki ohranjajo endogene lastnosti.
Raziskovalci so pa razvili novo platformo za bioinženiring molekul siRNA z uporabo bakterijske fermentacije. Ta platforma temelji na nosilcih pre-miRNA, združenih s tRNA, ki omogoča proizvodnjo številnih bioinženirskih molekul siRNA v živih gostiteljskih celicah [2].

== Načrtovanje, izražanje in izolacija rekombinantnih molekul siRNA ==
Novo razvito človeško tRNA za glicin z zaporedjem GCC (BioRNAGly) so povezali z optimiziranim zaporedjem pre-miR-34a, da bi ustvarili stabilen nosilec za majhne RNA molekule.
tRNA/pre-miRNA nosilec zagotavlja strukturno stabilnost in omogoča učinkovito proizvodnjo ter procesiranje funkcionalnih molekul siRNA.
Na tej osnovi so uspešno razvili devet različnih konstruktov BioRNA/siRNA, usmerjenih proti različnim genom. Kompleks tRNA/pre-miRNA služi kot nosilec za siRNA duplekse. Vsaka bioRNA/siRNA je bila izdelana z vstavitvijo specifičnega dupleksnega zaporedja siRNA namesto nativnega dupleksa miR-34a v skelet tRNA/pre-miRNA.
Konstrukti so klonirali v vektor pBSTNAV in transformirali v celice ''E. coli'' HST08 za fermentacijo.
S platformo so ustvarili panel devetih konstruktov BioRNA/siRNA, vključno z FDA odobrenimi terapevtiki (TTR-siRNA in ALAS1-siRNA), tudi kandidati v kliničnih ali prekliničnih študijah (VEGFR-siRNA, PD-1-siRNA, PD-L1-siRNA, BCL2-siRNA) in tri pogosto uporabljene siRNA v raziskavah (GFP-siRNA, Luciferase-siRNA, CDK6-siRNA).
Izvedli so fermentacije v majhnem (15 mL) in velikem (0,25 L) volumnu kultur. Z uporabo majhneg volumna kultur, z Urea-PAGE analizom so opazili prekomerno izražanje vsakega konstrukta BioRNA, ki so predstavljale več kot 50 % vseh RNA v vzorcu in 100% uspešnost pri vseh konstruktih.
Po potrditvi izražanja so povečali volumen kultur za proizvodnjo večjih količin vsake BioRNA/siRNA za prečiščevanje in funkcionalno testiranje. Za vsak konstrukt so gojili kulture ''E. coli ''(250 ml) in iz odvzetih celic izolirali skupno RNA.
Za prečiščevanje siRNA so uporabili kromatografijo FPLC.
Čistost so ocenili z urea-PAGE in HPLC; vsi BioRNA/siRNA so dosegli >98 % čistost. Tudi so izmerili endotoksine z LAL testom in so vsi vzorci imeli nizko aktivnost endotoksinov (<5 EU/μg RNA).
Zagotavljanje nizke vsebnosti endotoksinov je bistvenega pomena za uporabo RNA v terapevtske namene, saj lahko bakterijski endotoksini sprožijo močne vnetne odzive.
Izkoristek iz 0,25 l kulture je bil od približno 3 mg do 10 mg prečiščene RNA na konstrukt [2].

== Funkcionalno utišanje genov s siRNA ==

Preverili so, če biološko ustvarjene siRNA funkcionalno sposobne utišati gene v celicah. Testirali so tri reprezentativne bioRNA/siRNA v celičnih testih: BioRNA/GFP-siRNA, BioRNA/BCL2-siRNA in BioRNA/PD-L1-siRNA. GFP-siRNA je izbran zaradi svoje pogoste uporabe v raziskovalne namene, BCL2-siRNA kot terapevtski kandidat pri raku in PD-L1-siRNA kot imunoterapevtski pristop v onkologiji. Ocenili so uspešnost glede na njeno sposobnost zorenja v aktivno obliko siRNA v človeških celicah in zmanjšanja izražanja ciljnega gena [2].

=== BioRNA/GFP-siRNA ===

Za preverjanje aktivnosti BioRNA/GFP-siRNA, je bila eksperimentalna strategija transfekcija bioinženirske RNA v linije rakavih celic, ki izražajo izboljšani zeleni fluorescenčni protein (EGFP). Uporabljeni so bili trije različni modeli celic, ki izražajo GFP, iz različnih vrst raka (A549, Huh7, 143B).
Spremljali so raven izražanja GFP s fluorescenčno mikroskopijo in kvantitativno analizo slik ob 24, 48 in 72 urah po transfekciji. Rezultati so pokazali izrazito zmanjšanje fluorescence GFP že 24 ur po obdelavi z BioRNA/GFP-siRNA v primerjavi s kontrolo. Po 48 in 72 urah po obdelavi z BioRNA je bila pri celicah opazna dodatna redukcija GFP signala, kar nakazuje postopno utišanje izražanja reporterja. V vseh testiranih celičnih linijah je zaznan časovni potek zmanjševanja fluorescence, kar potrjuje, da je vnesena BioRNA stabilna in funkcionalna ter ohranja funkcijo vsaj več dni po transfekciji. Pri celicah, tretiranih s kontrolo, ter pri netretiranih celicah ni prišlo do opaznih sprememb v izražanju GFP. To potrjuje, da je utišanje rezultat delovanja siRNA specifične za GFP in da lahko sredstva BioRNA/siRNA vstopijo v človeške celice in sproščajo funkcionalne siRNA [2].

=== BioRNA/BCL2-siRNA ===

Potem so testirali BioRNA konstrukt z siRNA zaporedjem, usmerjenim proti BCL2 (BioRNA/BCL2-siRNA), in ga primerjali s kemično sintetizirano siRNA enakega zaporedja. BCL2 (''angl.'' B-cell lymphoma 2) je onkogen, ki omogoča rakavim celicam izogniti se apoptozi. Ker utišanje gena BCL2 lahko sproži apoptozo v tumorskih celicah, ta predstavlja pomembno terapevtsko tarčo pri zdravljenju raka.
Izvedli so transfekcijo človeških celic nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) z BioRNA/BCL2-siRNA, s kemično sintetizirano siRNA BCL2 ter z ustreznimi kontrolami. Uporabili so RT-qPCR z lasnično zanko (''angl.'' stem-loop RT-qPCR), ki omogoča natančno pomnoževanje zrele oblike zaporedja siRNA proti BCL2. Po 48 urah po transfekciji so zaznali prisotnost zrele oblike siRNA proti BCL2 tako v celicah, tretiranih z BioRNA/BCL2-siRNA kot s sintetično siRNA. Vendar je zanimivo, da so celice, obdelane z BioRNA/BCL2-siRNA, pokazale bistveno višje ravni zrele siRNA kot celice, obdelane s sintetično siRNA (pri enaki koncentraciji 15 nM). Ta rezultat nakazuje, da je biološko zasnovana RNA morda bolj učinkovito sprejeta ali morda bolj stabilna kot sintetična oblika. Po meritvi izražanja gena BCL2 po 48-72 urah, je BioRNA/siRNA pokazala enako ali večjo učinkovitost utišanja genov v primerjavi z običajnimi siRNA.
Obe siRNA sta učinkovito znižali raven BCL2 mRNA. Natančneje, BioRNA/BCL2-siRNA je v dveh celičnih linijah NSCLC zmanjšala raven BCL2 mRNA za približno 70-80 %, raven proteinov pa za 60-75 %, kar je bilo enako ali boljše od utišanja, doseženega s sintetično siRNA. Te ugotovitve so izjemno pomembne, saj kažejo, da biološko sintetizirana siRNA ne le učinkovito opravlja svojo funkcijo, temveč jo lahko celo preseže v primerjavi s standardno sintetično siRNA. Razlog za povečano učinkovitost BioRNA v celici bi lahko izhajal iz ohranjene strukture pre-miRNA, kar bi olajšalo prepoznavo encimu Dicer, ali pa iz odsotnosti kemičnih modifikacij, ki lahko pri sintetičnih oblikah ovirajo nadaljnjo obdelavo [2].

BioRNA/PD-L1-siRNA
Preverili so tudi delovanje BioRNA/PD-L1-siRNA v okviru imunoterapije raka. PD-L1 (''angl.'' programmed death-ligand 1) je protein, izražen v tumorskih celicah, ki se veže na PD-1 na celicah T in zavira imunski odziv. Blokiranje PD-L1 je mehanizem za več bioloških zdravil za raka, ki jih je odobrila FDA. Naredili so transfekcija BioRNA/PD-L1-siRNA v celice NSCLC in ovarijske celice kitajskega hrčka (CHO). Selektivna analiza z RT-qPCR metodo je po 48 urah potrdila izrazito prisotnost zrele oblike siRNA, usmerjene proti PD-L1.
Tudi kasnejše analize RT-qPCR in Western blot so pokazale znatno znižanje ravni mRNA PD-L1 (30-60 %) in proteina (70-80 %) v primerjavi s kontrolnim zdravljenjem. Imunofluorescenčna analiza je dodatno potrdila te ugotovitve, saj so pokazale zmanjšano izražanje PD-L1 na celični membrani [2].

Za oceno posledic zmanjšanja izražanja PD-L1 so uporabili reporterski test, ki meri prekinitev signalizacije PD-1/PD-L1. V eksperimentu so uporabili gensko spremenjene T-celice Jurkat, ki izražajo PD-1 in celice CHO, ki prekomerno izražajo PD-L1.Ta test, ki posnema interakcije med T-celicami in tumorskimi celicami, je pokazal, da je BioRNA/PD-L1-siRNA učinkovito zmanjšala izražanje PD-L1, obnovila signalizacijo T-celičnih receptorjev in aktivirala nadaljnje imunske odzive, kar se kaže v povečani luminiscenci. Torej BioRNA/PD-L1-siRNA ne le utiša ciljni gen, temveč tudi sproži imunsko aktivacijo z možnim antitumorskim učinkom [2].

== Zaključek ==
Terapija z RNAi predstavlja obetavno zdravljenje prej neozdravljivih bolezni, vključno z genetskimi motnjami, boleznimi srca in ožilja, rakom, sladkorno boleznijo in virusnimi okužbami. Nedavne odobritve FDA in številne klinične študije poudarjajo njen naraščajoči terapevtski potencial. V študiji so Batra in sod. uspešno uporabili inovativen bioinženirski pristop z uporabo nosilca pre-miRNA s človeško tRNA, izraženega z bakterijsko fermentacijo, za proizvodnjo funkcionalnih BioRNA/siRNA. Ta se razlikuje od kemično sintetiziranih siRNA, saj so v živih celicah podvržena naravnim posttranskripcijskim modifikacijam, pri čemer fizikalno-kemijske lastnosti, biološka aktivnost in varnostni profili odražajo naravne značilnosti RNA. Pokazali so, da proizvedena BioRNA/siRNA učinkovito uravnavava izražanje ciljnih genov, kar ponuja trajnostno in stroškovno učinkovito strategijo za proizvodnjo siRNA. Ta napredek bistveno izboljšuje terapevtske možnosti, kar ima pomembne posledice za širok spekter bolezni in pospešuje uporabo sintezne biologije [2].
== Literatura ==
[1] S. Malakondaiah, A. Julius, D. Ponnambalam, S. S. Gunthoti, J. Ashok, P. S. Krishana, J. Rebecca: Gene silencing by RNA interference: a review. Genome Instability & Disease 2024 5:5 '''2024''', 5, 225–241.

[2] N. Batra, M. J. Tu, A. M. Yu: Molecular Engineering of Functional SiRNA Agents. ACS Synth Biol '''2024''', 13, 1906–1915.

Seminarji SB 2024/25

2025-05-18T22:23:29Z

Nataša Vujović:

V študijskem letu 2024/25 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br>
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_umetnih_medvrstnih_promotorjev_z_različnimi_transkripcijskimi_močmi Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi] (Miljan Trajković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preprečevanje_nastanka_multimerov_pogosto_uporabljenih_plazmidov_v_sintezni_biologiji Preprečevanje nastanka multimerov pogosto uporabljenih plazmidov v sintezni biologiji] (Lev Jošt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_Nicotiane_benthamiane_za_proizvodnjo_krisoeriola_z_uporabo_tehnik_sintezne_biologije Priprava ''Nicotiane benthamiane'' za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije] (Nika Frelih)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gensko_spremenjeni_receptorji_za_komunikacijo_med_celicami_preko_topnih_signalov_in_zaznavanje_bolezni Gensko spremenjeni receptorji za komunikacijo med celicami preko topnih signalov in zaznavanje bolezni] (Zara Bunc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nadzor_nad_izražanjem_heterolognih_genov_pri_Bdellovibrio_bacteriovorus_z_uporabo_sintezne_biologije Nadzor nad izražanjem heterolognih genov pri Bdellovibrio bacteriovorus z uporabo sintezne biologije] (Živa Flego)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_konzorcija_kvasovk_za_de_novo_biosintezo_rastlinskih_lignanov Uporaba konzorcija kvasovk za de novo biosintezo rastlinskih lignanov] (Urša Lah)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sonogenetsko_nadzorovane_gensko_spremenjene_celice_za_zdravljenje_raka_v_mišjih_tumorskih_modelih Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih] (Pia Mencin)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Združitev_difuzijskega_modela_in_transformerja_za_sintezo_izboljšanih_promotorjev_ter_napoved_moči_sintetičnih_promotorjev_z_uporabo_globokega_učenja Združitev difuzijskega modela in transformerja za sintezo izboljšanih promotorjev ter napoved moči sintetičnih promotorjev z uporabo globokega učenja] (Tinkara Korošec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_dvojno_svetlobo_nadzirani_kokulturni_sistem_omogoča_uravnavanje_sestave_populacije Z dvojno svetlobo nadzirani sistem omogoča uravnavanje sestave populacije] (Ula Mikoš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Načrtovanje_močnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah Načrtovanje močnih inducibilnih sinteznih promotorjev v kvasovkah] (Bor Kunstelj)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolni_inženiring_E._coli_za_izboljšano_produkcijo_diolov_iz_acetata Metabolni inženiring ''E. coli'' za izboljšano produkcijo diolov iz acetata] (Teo Trost)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inkorporacija_fotosintetsko_aktivnih_kloroplastov_iz_alg_v_kultivirane_celice_sesalcev_kot_pot_k_fotosintezi_pri_Živalih Inkorporacija fotosintetsko aktivnih kloroplastov iz alg v kultivirane celice sesalcev kot pot k fotosintezi pri živalih] (Peter Gričar Vintar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izgradnja_metabolične_poti_za_biosintezo_treonina_iz_etilen_glikola Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola] (Tinkara Butara)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezava_sintezne_in_sistemske_biologije_za_in_vivo_encimatiko Povezava sintezne in sistemske biologije za ''in vivo'' encimatiko] (Gaja Starc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nanotelo_proti_Pdc1p_kot_gensko_kodiran_inhibitor_proizvodnje_etanola_omogoča_dvojni_transkripcijski_in_posttranslacijski_nadzor_fermentacije_v_kvasovkah Nanotelo proti Pdc1p kot gensko kodiran inhibitor proizvodnje etanola omogoča dvojni transkripcijski in posttranslacijski nadzor fermentacije v kvasovkah] (Lara Zupanc)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/S_fazno_separacijo_posredovano_sestavljanje_ve%C4%8Dencimskih_kompleksov_in_vivo S fazno separacijo posredovano sestavljanje večencimskih kompleksov ''in vivo''] (Lana Kores)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Umetna_nevronska_mreža_na_proteinski_ravni_v_sesalskih_celicah Umetna nevronska mreža na proteinski ravni v sesalskih celicah] (Gal Kastelic)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_sintezne_virologije_za_hitro_inženirstvo_virusa_vezikularnega_stomatitisa_VSV Uporaba sintezne virologije za hitro inženirstvo virusa vezikularnega stomatitisa (VSV)] (Bine Brunec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_inženiring_funkcionalnih_siRNA Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA] (Nataša Vujović)
NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynPlode SynPlode] (Leila Bohorč)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETal:_izdelovanje_eteričnega_olja_sandalovine_iz_PET_plastike PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike] (Lara Krampač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET_TWINS:_Praktična_uporaba_PETaze_za_učinkovitejše_recikliranje_plastike PET TWINS: Praktična uporaba PETaze za učinkovitejše recikliranje plastike] (Tina Urh)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAU-China:_Nodulska_tovarna_DHA_in_EPA CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA] (Luka Fink)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/nuCloud:_Nov_oblak_za_shranjevanje_podatkov_na_osnovi_nukleotidov nuCloud: Nov oblak za shranjevanje podatkov na osnovi nukleotidov] (Aleš Poljanšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_metoda_diagnosticiranja_multiple_skleroze_-_miRADAR Nova metoda diagnosticiranja multiple skleroze - miRADAR] (Petja Premrl)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biostimulant_za_rast_rastlin_na_Luni_–_BioMoon Biostimulant za rast rastlin na Luni – BioMoon] (Žan Žnidar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CAPTURE:_Boj_proti_oku%C5%BEbam_s_Pseudomonas_aeruginosa_z_nosilci_protimikrobnih_peptidov&action=edit&redlink=1 Boj proti okužbam s Pseudomonas aeruginosa z nosilci protimikrobnih peptidov - CAPTURE] (Metka Rus)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/REPARO REPARO] (Lina Kopač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Tarakate Tarakate] (Pia Špehar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Heartecho:_presejalni_test_za_raka_pri_pacientih_po_miokardnem_infarktu Heartecho: presejalni test za raka pri pacientih po miokardnem infarktu] (Zarja Doberšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Synhesion Synhesion] (Janja Bohte)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rebolutionaries Rebolutionaries] (Mia Kobal)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v torek torej najkasneje v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored bo razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2023/24]].

Seminarji SB 2024/25

2025-05-18T19:40:44Z

Nataša Vujović:

V študijskem letu 2024/25 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br>
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inženiring_umetnih_medvrstnih_promotorjev_z_različnimi_transkripcijskimi_močmi Inženiring umetnih medvrstnih promotorjev z različnimi transkripcijskimi močmi] (Miljan Trajković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preprečevanje_nastanka_multimerov_pogosto_uporabljenih_plazmidov_v_sintezni_biologiji Preprečevanje nastanka multimerov pogosto uporabljenih plazmidov v sintezni biologiji] (Lev Jošt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_Nicotiane_benthamiane_za_proizvodnjo_krisoeriola_z_uporabo_tehnik_sintezne_biologije Priprava ''Nicotiane benthamiane'' za proizvodnjo krisoeriola z uporabo tehnik sintezne biologije] (Nika Frelih)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gensko_spremenjeni_receptorji_za_komunikacijo_med_celicami_preko_topnih_signalov_in_zaznavanje_bolezni Gensko spremenjeni receptorji za komunikacijo med celicami preko topnih signalov in zaznavanje bolezni] (Zara Bunc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nadzor_nad_izražanjem_heterolognih_genov_pri_Bdellovibrio_bacteriovorus_z_uporabo_sintezne_biologije Nadzor nad izražanjem heterolognih genov pri Bdellovibrio bacteriovorus z uporabo sintezne biologije] (Živa Flego)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_konzorcija_kvasovk_za_de_novo_biosintezo_rastlinskih_lignanov Uporaba konzorcija kvasovk za de novo biosintezo rastlinskih lignanov] (Urša Lah)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sonogenetsko_nadzorovane_gensko_spremenjene_celice_za_zdravljenje_raka_v_mišjih_tumorskih_modelih Sonogenetsko nadzorovane gensko spremenjene celice za zdravljenje raka v mišjih tumorskih modelih] (Pia Mencin)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Združitev_difuzijskega_modela_in_transformerja_za_sintezo_izboljšanih_promotorjev_ter_napoved_moči_sintetičnih_promotorjev_z_uporabo_globokega_učenja Združitev difuzijskega modela in transformerja za sintezo izboljšanih promotorjev ter napoved moči sintetičnih promotorjev z uporabo globokega učenja] (Tinkara Korošec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_dvojno_svetlobo_nadzirani_kokulturni_sistem_omogoča_uravnavanje_sestave_populacije Z dvojno svetlobo nadzirani sistem omogoča uravnavanje sestave populacije] (Ula Mikoš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Načrtovanje_močnih_inducibilnih_sinteznih_promotorjev_v_kvasovkah Načrtovanje močnih inducibilnih sinteznih promotorjev v kvasovkah] (Bor Kunstelj)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolni_inženiring_E._coli_za_izboljšano_produkcijo_diolov_iz_acetata Metabolni inženiring ''E. coli'' za izboljšano produkcijo diolov iz acetata] (Teo Trost)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inkorporacija_fotosintetsko_aktivnih_kloroplastov_iz_alg_v_kultivirane_celice_sesalcev_kot_pot_k_fotosintezi_pri_Živalih Inkorporacija fotosintetsko aktivnih kloroplastov iz alg v kultivirane celice sesalcev kot pot k fotosintezi pri živalih] (Peter Gričar Vintar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izgradnja_metabolične_poti_za_biosintezo_treonina_iz_etilen_glikola Izgradnja metabolične poti za biosintezo treonina iz etilen glikola] (Tinkara Butara)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povezava_sintezne_in_sistemske_biologije_za_in_vivo_encimatiko Povezava sintezne in sistemske biologije za ''in vivo'' encimatiko] (Gaja Starc)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nanotelo_proti_Pdc1p_kot_gensko_kodiran_inhibitor_proizvodnje_etanola_omogoča_dvojni_transkripcijski_in_posttranslacijski_nadzor_fermentacije_v_kvasovkah Nanotelo proti Pdc1p kot gensko kodiran inhibitor proizvodnje etanola omogoča dvojni transkripcijski in posttranslacijski nadzor fermentacije v kvasovkah] (Lara Zupanc)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/S_fazno_separacijo_posredovano_sestavljanje_ve%C4%8Dencimskih_kompleksov_in_vivo S fazno separacijo posredovano sestavljanje večencimskih kompleksov ''in vivo''] (Lana Kores)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Umetna_nevronska_mreža_na_proteinski_ravni_v_sesalskih_celicah Umetna nevronska mreža na proteinski ravni v sesalskih celicah] (Gal Kastelic)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Molekularni_inženiring_funkcionalnih_siRNA Molekularni inženiring funkcionalnih siRNA] (Nataša Vujović)
NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SynPlode SynPlode] (Leila Bohorč)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETal:_izdelovanje_eteričnega_olja_sandalovine_iz_PET_plastike PETal: izdelovanje eteričnega olja sandalovine iz PET plastike] (Lara Krampač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PET_TWINS:_Praktična_uporaba_PETaze_za_učinkovitejše_recikliranje_plastike PET TWINS: Praktična uporaba PETaze za učinkovitejše recikliranje plastike] (Tina Urh)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAU-China:_Nodulska_tovarna_DHA_in_EPA CAU-China: Nodulska tovarna DHA in EPA] (Luka Fink)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/nuCloud:_Nov_oblak_za_shranjevanje_podatkov_na_osnovi_nukleotidov nuCloud: Nov oblak za shranjevanje podatkov na osnovi nukleotidov] (Aleš Poljanšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_metoda_diagnosticiranja_multiple_skleroze_-_miRADAR Nova metoda diagnosticiranja multiple skleroze - miRADAR] (Petja Premrl)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biostimulant_za_rast_rastlin_na_Luni_–_BioMoon Biostimulant za rast rastlin na Luni – BioMoon] (Žan Žnidar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CAPTURE:_Boj_proti_oku%C5%BEbam_s_Pseudomonas_aeruginosa_z_nosilci_protimikrobnih_peptidov&action=edit&redlink=1 Boj proti okužbam s Pseudomonas aeruginosa z nosilci protimikrobnih peptidov - CAPTURE] (Metka Rus)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/REPARO REPARO] (Lina Kopač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Tarakate Tarakate] (Pia Špehar)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Heartecho:_presejalni_test_za_raka_pri_pacientih_po_miokardnem_infarktu Heartecho: presejalni test za raka pri pacientih po miokardnem infarktu] (Zarja Doberšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Synhesion Synhesion] (Janja Bohte)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rebolutionaries Rebolutionaries] (Mia Kobal)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v torek torej najkasneje v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored bo razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2023/24]].

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T13:56:58Z

Nataša Vujović: /* MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI */

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki so ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohranijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env. Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNA in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNA in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

=== HETEROGENOST INSERCIJSKIH PREFERENC IN PORAZDELITEV RETROTRANSPOZONOV MED RAZLIČNIMI POPULACIJAMI ===

Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNA gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.

Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.

LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza (ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.

Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.

Pri pojavi Parkinsonove bolezni je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskem odzivu. Ko imamo prisotno DNA v citoplazmi, na primer virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so multiple skleroza in Aicardi-Goutières sindromom, kot glavni vnetni efektorji.

Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.

Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.

Motnje avtističnega spektra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma. Pokazalo se da posamezniki z motnjo avtističnega spektra pogosto kažejo razširjeno vnetje in povečano izražanje citokinov v možganih.

Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.

Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več LINE-1Hs.

== VIRI IN LITERATURA ==

[1] Saleh, Aurian, et al. “Transposable Elements, Inflammation, and Neurological Disease.” Frontiers in Neurology, vol. 10, 2019. Frontiers, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fneur.2019.00894.

[2] Volkman HE, Stetson DB. The enemy within: endogenous retroelements and autoimmune disease. Nat Immunol. (2014) 15:415–22. doi: 10.1038/ni.2872

[3] Richardson SR, Morell S, Faulkner GJ. L1 retrotransposons and somatic mosaicism in the brain. Annu Rev Genet. (2014) 48:1–27. doi: 10.1146/annurev-genet-120213-092412

[4] Nelson PN, Carnegie PR, Martin J, Davari Ejtehadi H, Hooley P, Roden D, et al. Demystified. Human endogenous retroviruses. Mol Pathol. (2003) 56:11–8. doi: 10.1136/mp.56.1.11

[5] Levin HL, Moran JV. Dynamic interactions between transposable elements and their hosts. Nat Rev Genet. (2011) 12:615–27. doi: 10.1038/nrg3030

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T13:54:45Z

Nataša Vujović: /* TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA */

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki so ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohranijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env. Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNA in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNA in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

=== HETEROGENOST INSERCIJSKIH PREFERENC IN PORAZDELITEV RETROTRANSPOZONOV MED RAZLIČNIMI POPULACIJAMI ===

Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNA gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.

Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.

LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza (ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.

Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.

Pri pojavi Parkinsonove bolezni (PD) je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskem odzivu. Ko imamo prisotno DNA v citoplazmi, na primer virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so multiple skleroza in Aicardi-Goutières sindromom, kot glavni vnetni efektorji.

Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.

Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.

Motnje avtističnega spektra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma. Pokazalo se da posamezniki z motnjo avtističnega spektra pogosto kažejo razširjeno vnetje in povečano izražanje citokinov v možganih.

Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.

Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več LINE-1Hs.

== VIRI IN LITERATURA ==

[1] Saleh, Aurian, et al. “Transposable Elements, Inflammation, and Neurological Disease.” Frontiers in Neurology, vol. 10, 2019. Frontiers, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fneur.2019.00894.

[2] Volkman HE, Stetson DB. The enemy within: endogenous retroelements and autoimmune disease. Nat Immunol. (2014) 15:415–22. doi: 10.1038/ni.2872

[3] Richardson SR, Morell S, Faulkner GJ. L1 retrotransposons and somatic mosaicism in the brain. Annu Rev Genet. (2014) 48:1–27. doi: 10.1146/annurev-genet-120213-092412

[4] Nelson PN, Carnegie PR, Martin J, Davari Ejtehadi H, Hooley P, Roden D, et al. Demystified. Human endogenous retroviruses. Mol Pathol. (2003) 56:11–8. doi: 10.1136/mp.56.1.11

[5] Levin HL, Moran JV. Dynamic interactions between transposable elements and their hosts. Nat Rev Genet. (2011) 12:615–27. doi: 10.1038/nrg3030

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T13:53:24Z

Nataša Vujović: /* TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA */

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki so ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohranijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env. Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNA in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNA in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

=== HETEROGENOST INSERCIJSKIH PREFERENC IN PORAZDELITEV RETROTRANSPOZONOV MED RAZLIČNIMI POPULACIJAMI ===

Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNA gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.

Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.

LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza (ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.

Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.

Pri pojavi Parkinsonove bolezni (PD) je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskem odzivu. Ko imamo prisotno DNA v citoplazmi, na primer virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so multiple skleroza in Aicardi-Goutières sindromom, kot glavni vnetni efektorji.

Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.

Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.

Motnje avtističnega spektra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma. Pokazalo se da posamezniki pogosto kažejo razširjeno vnetje in povečano izražanje citokinov v možganih.

Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.

Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več LINE-1Hs.

== VIRI IN LITERATURA ==

[1] Saleh, Aurian, et al. “Transposable Elements, Inflammation, and Neurological Disease.” Frontiers in Neurology, vol. 10, 2019. Frontiers, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fneur.2019.00894.

[2] Volkman HE, Stetson DB. The enemy within: endogenous retroelements and autoimmune disease. Nat Immunol. (2014) 15:415–22. doi: 10.1038/ni.2872

[3] Richardson SR, Morell S, Faulkner GJ. L1 retrotransposons and somatic mosaicism in the brain. Annu Rev Genet. (2014) 48:1–27. doi: 10.1146/annurev-genet-120213-092412

[4] Nelson PN, Carnegie PR, Martin J, Davari Ejtehadi H, Hooley P, Roden D, et al. Demystified. Human endogenous retroviruses. Mol Pathol. (2003) 56:11–8. doi: 10.1136/mp.56.1.11

[5] Levin HL, Moran JV. Dynamic interactions between transposable elements and their hosts. Nat Rev Genet. (2011) 12:615–27. doi: 10.1038/nrg3030

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T13:42:34Z

Nataša Vujović: /* TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA */

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki so ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohranijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env. Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNA in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNA in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

=== HETEROGENOST INSERCIJSKIH PREFERENC IN PORAZDELITEV RETROTRANSPOZONOV MED RAZLIČNIMI POPULACIJAMI ===

Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNA gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.

Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.

LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza (ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.

Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.

Pri pojavi Parkinsonove bolezni (PD) je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskem odzivu. Ko imamo prisotno DNA v citoplazmi, na primer virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so multiple skleroza in Aicardi-Goutières sindromom, kot glavni vnetni efektorji.

Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.

Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.

Motnje avtističnega spektra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma. Pokazalo se da posamezniki z ASD pogosto kažejo razširjeno vnetje in povečano izražanje citokinov v možganih.

Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.

Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več LINE-1Hs.

== VIRI IN LITERATURA ==

[1] Saleh, Aurian, et al. “Transposable Elements, Inflammation, and Neurological Disease.” Frontiers in Neurology, vol. 10, 2019. Frontiers, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fneur.2019.00894.

[2] Volkman HE, Stetson DB. The enemy within: endogenous retroelements and autoimmune disease. Nat Immunol. (2014) 15:415–22. doi: 10.1038/ni.2872

[3] Richardson SR, Morell S, Faulkner GJ. L1 retrotransposons and somatic mosaicism in the brain. Annu Rev Genet. (2014) 48:1–27. doi: 10.1146/annurev-genet-120213-092412

[4] Nelson PN, Carnegie PR, Martin J, Davari Ejtehadi H, Hooley P, Roden D, et al. Demystified. Human endogenous retroviruses. Mol Pathol. (2003) 56:11–8. doi: 10.1136/mp.56.1.11

[5] Levin HL, Moran JV. Dynamic interactions between transposable elements and their hosts. Nat Rev Genet. (2011) 12:615–27. doi: 10.1038/nrg3030

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T13:40:32Z

Nataša Vujović: /* TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA */

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki so ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohranijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env. Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNA in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNA in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

=== HETEROGENOST INSERCIJSKIH PREFERENC IN PORAZDELITEV RETROTRANSPOZONOV MED RAZLIČNIMI POPULACIJAMI ===

Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNA gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.

Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.

LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza (ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.

Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.

Pri pojavi Parkinsonove bolezni (PD) je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskem odzivu. Ko imamo prisotno DNA v citoplazmi, na primer virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so multiple skleroza in Aicardi-Goutières sindromom, kot glavni vnetni efektorji.

Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.

Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.

Motnje avtističnega spectra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma. Pokazalo se da posamezniki z ASD pogosto kažejo razširjeno vnetje in povečano izražanje citokinov v možganih.

Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.

Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več LINE-1Hs.

== VIRI IN LITERATURA ==

[1] Saleh, Aurian, et al. “Transposable Elements, Inflammation, and Neurological Disease.” Frontiers in Neurology, vol. 10, 2019. Frontiers, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fneur.2019.00894.

[2] Volkman HE, Stetson DB. The enemy within: endogenous retroelements and autoimmune disease. Nat Immunol. (2014) 15:415–22. doi: 10.1038/ni.2872

[3] Richardson SR, Morell S, Faulkner GJ. L1 retrotransposons and somatic mosaicism in the brain. Annu Rev Genet. (2014) 48:1–27. doi: 10.1146/annurev-genet-120213-092412

[4] Nelson PN, Carnegie PR, Martin J, Davari Ejtehadi H, Hooley P, Roden D, et al. Demystified. Human endogenous retroviruses. Mol Pathol. (2003) 56:11–8. doi: 10.1136/mp.56.1.11

[5] Levin HL, Moran JV. Dynamic interactions between transposable elements and their hosts. Nat Rev Genet. (2011) 12:615–27. doi: 10.1038/nrg3030

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T13:10:25Z

Nataša Vujović: /* TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA */

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki so ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohranijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env. Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNA in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNA in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

=== HETEROGENOST INSERCIJSKIH PREFERENC IN PORAZDELITEV RETROTRANSPOZONOV MED RAZLIČNIMI POPULACIJAMI ===

Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNA gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.

Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.

LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza (ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.

Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.

Pri pojavi Parkinsonove bolezni (PD) je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskem odzivu. Ko imamo prisotno DNA v citoplazmi npr. virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so multiple skleroza in Aicardi-Goutières sindromom, kot glavni vnetni efektorji.

Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.

Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.

Motnje avtističnega spectra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma. Pokazalo se da posamezniki z ASD pogosto kažejo razširjeno vnetje in povečano izražanje citokinov v možganih.

Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.

Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več LINE-1Hs.

== VIRI IN LITERATURA ==

[1] Saleh, Aurian, et al. “Transposable Elements, Inflammation, and Neurological Disease.” Frontiers in Neurology, vol. 10, 2019. Frontiers, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fneur.2019.00894.

[2] Volkman HE, Stetson DB. The enemy within: endogenous retroelements and autoimmune disease. Nat Immunol. (2014) 15:415–22. doi: 10.1038/ni.2872

[3] Richardson SR, Morell S, Faulkner GJ. L1 retrotransposons and somatic mosaicism in the brain. Annu Rev Genet. (2014) 48:1–27. doi: 10.1146/annurev-genet-120213-092412

[4] Nelson PN, Carnegie PR, Martin J, Davari Ejtehadi H, Hooley P, Roden D, et al. Demystified. Human endogenous retroviruses. Mol Pathol. (2003) 56:11–8. doi: 10.1136/mp.56.1.11

[5] Levin HL, Moran JV. Dynamic interactions between transposable elements and their hosts. Nat Rev Genet. (2011) 12:615–27. doi: 10.1038/nrg3030

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T13:07:15Z

Nataša Vujović: /* TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA */

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki so ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohranijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env. Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNA in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNA in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

=== HETEROGENOST INSERCIJSKIH PREFERENC IN PORAZDELITEV RETROTRANSPOZONOV MED RAZLIČNIMI POPULACIJAMI ===

Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNA gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.

Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.

LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza (ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.

Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.

Pri pojavi Parkinsonove bolezni (PD) je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskem odzivu. Ko imamo prisotno DNA v citoplazmi npr. virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so multiple skleroza in Aicardi-Goutières sindromom, kot glavni vnetni efektorji.

Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.

Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.

Motnje avtističnega spectra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma. Pokazalo se da posamezniki z ASD pogosto kažejo razširjeno vnetje in povečano izražanje citokinov v možganih.

Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.

Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več elementov LINE-1Hs.

== VIRI IN LITERATURA ==

[1] Saleh, Aurian, et al. “Transposable Elements, Inflammation, and Neurological Disease.” Frontiers in Neurology, vol. 10, 2019. Frontiers, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fneur.2019.00894.

[2] Volkman HE, Stetson DB. The enemy within: endogenous retroelements and autoimmune disease. Nat Immunol. (2014) 15:415–22. doi: 10.1038/ni.2872

[3] Richardson SR, Morell S, Faulkner GJ. L1 retrotransposons and somatic mosaicism in the brain. Annu Rev Genet. (2014) 48:1–27. doi: 10.1146/annurev-genet-120213-092412

[4] Nelson PN, Carnegie PR, Martin J, Davari Ejtehadi H, Hooley P, Roden D, et al. Demystified. Human endogenous retroviruses. Mol Pathol. (2003) 56:11–8. doi: 10.1136/mp.56.1.11

[5] Levin HL, Moran JV. Dynamic interactions between transposable elements and their hosts. Nat Rev Genet. (2011) 12:615–27. doi: 10.1038/nrg3030

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T12:54:37Z

Nataša Vujović: /* MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI */

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki so ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohranijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env. Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNA in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNA in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

=== HETEROGENOST INSERCIJSKIH PREFERENC IN PORAZDELITEV RETROTRANSPOZONOV MED RAZLIČNIMI POPULACIJAMI ===

Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNA gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.

Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.

LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza (ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.

Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.

Pri pojavi Parkinsonove bolezni (PD) je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskem odzivu. Ko imamo prisotno DNA v citoplazmi npr. virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so multiple skleroza in Aicardi-Goutières sindromom, kot glavni vnetni efektorji.

Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.

Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.

Motnje avtističnega spectra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma.

Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.

Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več elementov LINE-1Hs.

== VIRI IN LITERATURA ==

[1] Saleh, Aurian, et al. “Transposable Elements, Inflammation, and Neurological Disease.” Frontiers in Neurology, vol. 10, 2019. Frontiers, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fneur.2019.00894.

[2] Volkman HE, Stetson DB. The enemy within: endogenous retroelements and autoimmune disease. Nat Immunol. (2014) 15:415–22. doi: 10.1038/ni.2872

[3] Richardson SR, Morell S, Faulkner GJ. L1 retrotransposons and somatic mosaicism in the brain. Annu Rev Genet. (2014) 48:1–27. doi: 10.1146/annurev-genet-120213-092412

[4] Nelson PN, Carnegie PR, Martin J, Davari Ejtehadi H, Hooley P, Roden D, et al. Demystified. Human endogenous retroviruses. Mol Pathol. (2003) 56:11–8. doi: 10.1136/mp.56.1.11

[5] Levin HL, Moran JV. Dynamic interactions between transposable elements and their hosts. Nat Rev Genet. (2011) 12:615–27. doi: 10.1038/nrg3030

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T11:47:28Z

Nataša Vujović: /* TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA */

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki so ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohranijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env. Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNA in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNA in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

=== HETEROGENOST INSERCIJSKIH PREFERENC IN PORAZDELITEV RETROTRANSPOZONOV MED RAZLIČNIMI POPULACIJAMI ===

Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNA gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.

Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.

LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza(ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. . Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.

Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.

Pri pojavi Parkinsonove bolezni (PD) je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskem odzivu. Ko imamo prisotno DNA v citoplazmi npr. virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so multiple skleroza in Aicardi-Goutières sindromom, kot glavni vnetni efektorji.

Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.

Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.

Motnje avtističnega spectra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma.

Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.

Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več elementov LINE-1Hs.

== VIRI IN LITERATURA ==

[1] Saleh, Aurian, et al. “Transposable Elements, Inflammation, and Neurological Disease.” Frontiers in Neurology, vol. 10, 2019. Frontiers, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fneur.2019.00894.

[2] Volkman HE, Stetson DB. The enemy within: endogenous retroelements and autoimmune disease. Nat Immunol. (2014) 15:415–22. doi: 10.1038/ni.2872

[3] Richardson SR, Morell S, Faulkner GJ. L1 retrotransposons and somatic mosaicism in the brain. Annu Rev Genet. (2014) 48:1–27. doi: 10.1146/annurev-genet-120213-092412

[4] Nelson PN, Carnegie PR, Martin J, Davari Ejtehadi H, Hooley P, Roden D, et al. Demystified. Human endogenous retroviruses. Mol Pathol. (2003) 56:11–8. doi: 10.1136/mp.56.1.11

[5] Levin HL, Moran JV. Dynamic interactions between transposable elements and their hosts. Nat Rev Genet. (2011) 12:615–27. doi: 10.1038/nrg3030

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T10:23:50Z

Nataša Vujović: /* TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA */

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki so ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohranijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env. Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNK in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNK in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

Heterogenost insercijskih preferenc in porazdelitev retrotranspozonov med različnimi populacijami:
Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNK gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.

Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.

LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza(ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. . Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.

Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.

Pri pojavi Parkinsonove bolezni (PD) je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskim odzivom. Ko imamo prisotno DNA v citoplazmi npr. virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so Multiple skleroza in Aicardi-Goutièresovim sindromom, kot glavni vnetni efektorji.

Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.

Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.

Motnje avtističnega spectra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma.

Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.

Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več elementov LINE-1Hs.

== VIRI IN LITERATURA ==

[1] Saleh, Aurian, et al. “Transposable Elements, Inflammation, and Neurological Disease.” Frontiers in Neurology, vol. 10, 2019. Frontiers, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fneur.2019.00894.

[2] Volkman HE, Stetson DB. The enemy within: endogenous retroelements and autoimmune disease. Nat Immunol. (2014) 15:415–22. doi: 10.1038/ni.2872

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

TE pri vnetnih boleznih

2022-05-08T10:20:38Z

Nataša Vujović: /* VIRI IN LITERATURA */

== UVOD ==

Transpozicijski elementi (TE) so mobilni elementi DNA, ki se lahko replicirajo in vstavijo na različne lokacije znotraj gostiteljskega genoma. Retrotranspozoni so transpozicijski elementi, ki se mobilizirajo preko RNA intermediatov s pomočjo reverzne transkriptaze. HERV in LINE-1 sta dve glavni vrsti retrotranspozonov. Njuni inserciji sta se kopičili skozi evolucijo, dokler so se gostiteljski genomi razvijali in z uporabo različnih dejavnikov so zavirali njuni aktivnosti. Znanstveniki so odkrili, da transpozicijski elementi bolj prispevajo k patogenezi človeških bolezni, kot so do takrat mislili.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI ==

Transpozicijski elemnti obsegajo vsaj 45% človeškega genoma, medtem ko kodirajoče zaporedje zasede manj kot 3% genoma. Razvrščamo jih kot transpozoni, ki so ves čas v obliki DNA (II razred) in retrotranspozoni, ki za izvedbo traspozicije potrebujejo RNA-intermediat (I razred). Transpozoni II razreda delujejo po mehanizmu „izreži in prilepi“, pri čemer se zaporedje s pomočjo encima transpozaze izreže iz ene regije in integrira v drugo določeno regijo v genomu. Retrotranspozoni pa delujejo po mehanizmu „kopiraj in prilepi“ kar omogoča aktivnim retrotranspozonim, da ohranijo svojo prvotno lokacijo v genomu, medtem ko kopičijo število kopij drugje. Te retrotranspozone pa lahko razdelimo v dve skupini LTR in ne-LTR. V LTR skupino pa uvrščamo človeške endogene retroviruse (HERV) in retrotranspozone pri sesalcih (MaLR). Ne-LTR pa razvrčamo v dva podtipa: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) in SINE (Short Interspersed Nuclear Elements).

=== HERV ===

HERV retrotranspozoni imajo podobno genomsko strukturo kot eksogeni retrovirusi, kot je HIV. Ti retrotranspozoni poleg LTR zaporedja vključujejo regije gag, pol in env. Gen gag kodira proteine za ovojnico retrotranspozonskega delca. Pol pa prestavlja gen za reverzno transkriptazo, integrazo in proteazo. HERV vsebuje tudi gen, ki kodira protein env oziroma ostanek njihovega eksogenega retrovirusnega izvora pred vstavitvijo in endogenizacijo v zarodne celice. Pokazalo se je, da transkripcijsko aktivne poddružine HERV prispevajo k različnim patofiziološkim motnjam. Leta 1993 so prišli do ugotovitve, da dodatek virusa herpes simpleksa tipa 1 (HSV-1) celicam izoliranim od bolnika z multiplo sklerozo, povzroči močno stimulacijo aktivnosti specifične reverzne transkriptaze. Iz tega so sklepali da je prvotno zaporedje retrovirusa, povezaneg z multiplo sklerozo (MSRV), zelo zastopano v človeški DNK in tako odkrili poddružine skupine HERV, ki prispevajo k patologiji različnih nevroloških motnjah.

=== LINE-1 RETROTRANSPOZONI ===

Transpozoni LINE-1 so avtonomni retrotranspozoni, ki jih vsebuje človeški genom. Večina kopij LINE-1 je nepremičnih i njih ni mogoče retrotransponirati, bodisi zaradi 5' skrajšanja ali inverzij, uvedenih v zaporedje. Retrotranspozicijsko kompetentna LINE-1 ( RC LINE-1) je dolga 6kb in vsebuje 5' neprevedeno regijo (5' UTR), dva odprta bralna okvirja ( ORF1/2) in 3' UTR, prekinjeno s poli-A repom. ORF 1 predstavlja gen za protein, ki ima aktivnost spremenljevalca nukleinske kisline in RNA vezavno domeno. ORF2 kodira protein z encimsko aktivnostjo, ki je potreben za retrotranspozicijo LINE-1. ORF2p ima tako aktivnosti endonukleaze (EN) kot reverzne transkriptaze (RT). Transkripcija LINE-1 se začne na promotorju RNA olimeraze II ali natačneje znotraj prvih 100 baznih parov 5' UTR. Potem ko je prepisana, poliadenilirana LINE-1 mRNA se izvozi v citoplazmo, kjer se združi z proteini ORF1 in ORF2 in tvorijo komleks z ribonukleotidi (RNP). Potem se uvozi v jedro, da se začne obratna transkripcija in integracija. EN zareže spodnjo verigo DNK in izpostavi 3' OH, ki služi kot primer za RT za nastanek cDNA iz LINE-1 mRNA.

Heterogenost insercijskih preferenc in porazdelitev retrotranspozonov med različnimi populacijami:
Po različnih študijah so ugotovili, da pri integracji LINE1 ne ciljajo na izražene gene, odprt kromatin, ampak se namesto tega povezujejo z replikacijo DNK gostitelja. Te ugotovitve zagotavljajo prve namige, da sta integracija LINE-1 in replikacija DNK lahko mehansko povezani. Obstaja heterogenost v porazdelitvi endogenih retrotranspozonov po različnih človeških populacijah: od prisotnosti/odsotnosti transpozona do polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP). Polimorfizmi pri vstavitvah retroelementov nastanejo bodisi v zarodni liniji bodisi zgodaj v embrionalnem razvoju. To omogoča genomski mozaizem znotraj določeneg posameznika ko kar med različnimi človeškimi populacijami.

== CELIČNI VPLIVI RETROTRANSPOZICIJE LINE-1 ==

Retrotranspozoni LINE-1 ustvarjajo strukturno nestabilnost znotraj genoma in posledično motijo izražanje gostiteljskega gena. Vstavitve LINE-1 lahko generirajo napačno spojene ali prezgodaj okrnjene transkripte, spodbujajo prekinitev transkripcije ali celo spodbujajo spremembe našega epigenoma. Retrotranspozoni, ki prispevajo k genomski variaciji, spreminjajo ekspresijo gostiteljskega gena na epigenetski, transkripcijski in translacijski ravni.

== CELIČNI ODZIVI NA RETROTRANSPOZICIJE ==
Glede na to, da lahko retroelementi vplivajo na celico na veliko načinov, se je gostiteljski genom razvil tako, da uporablja različne odzive za zaviranje njihove aktivnosti. Transkripcijsko represijo dosežemo z represivnimi epigenetskimi modifikacijami, kot je npr. metilacija DNA. Znatna hipometilacija med embriogenezo je povezana z višjimi stopnjami retrotranspozicije. V mišjih zarodkih, ki so bili izjemno hipometilirani, se genomska integriteta vzdržuje s pomočjo faktorja CAF-1, ki zamenja histon 3.3 s histonom 3.1/3.2, ki deluje kot represivni modifikator in ščiti zarodek od retrotranspozicijske aktivnosti. Ker transpozicijski elementi vsebujejo tudi vezavna mesta za transkripcijske faktorje, to omogoča specifično transkripcijsko regulacijo, kot način transkripcijske represije. Kruppel-associated box (KRAB), ki vsebuje proteine cinkovih prstov (KZFP), so ključni regulatorji transpozicijske aktivnosti, ki se vežejo na regulatorna zaporedja TE in zavirajo izražanje TE v zgodnjih zarodkih.

Post-transkripcijska regulacija LINE-1 elementov z majhnimi RNA kot so miRNA ali piRNA, je še en celični odziv na retrotranspozicijo. Majhne RNA molekule lahko delujejo preko tarčne razgradnje RNA. Od RNA induciran kompleks za utišanje (RISC) z uporabo endonukleolitične cepitve razgrajuje TE transkriptov in, če je Dicer protein, ki je sestaven del RISC kompleksa, mutiran, povzroča povečano transkripcijo LINE-1 elementov. Odkrili so da miRNA-128 omejuje aktivnost LINE-1 preko dveh mehanizmov: lahko direktno cilja na ORF2 RNA za razgradnjo ali cilja na 3’-UTR zaporedje kofaktorja TNPO1, ki olajša transport kompleksa LINE-1 RNP v jedro. piRNA so pomembni zaviralci aktivnosti TE v zarodni liniji. Vzajemno delujejo s poddružino PIWI nukleaz Argonaute in cepijo TE transkripte v citoplazmi.

LINE-1 RNP kompleks, ki je retrotranspozicijski intermediat, je tudi tarča za razgradnjo. Protein cinkovega prsta (ZAP) se veže z LINE-1 mRNA v citoplazemskih stresnih granulah, povzroči zgubljanje integritete RNP kompleksa in zavira retrotranspozicijo LINE-1. TUT7, ki je uridil transferaza, prenaša ostanke uridina na LINE-1 mRNA v citoplazmi, nato MOV10, ki je helikaza, premakne ORF1p, da omogoči uridilacijo in posledično zavirajo reverzne transkripcije ORF2p v jedru. Družina encimov APOBEC zavirajo retrotranspozijo, najverjetneje z destabilizacijo kompleksa RNP. Kljub številnim gostiteljskim mehanizmom za zaviranje retrotranspozicije, de novo insercije so še vedno prisotne v somatskih tkivih z znatno retrotranspozicijo v nevronskih linijah.

== LINE-1 V RAZVOJU PRI MOŽGANIH ==

Najzgodnejši dokumentirani primer somatske retrotranspozicije in vivo je bil v mišjih možganih. Nekaj let pozneje so odkrili endogeno LINE-1 mRNA v nevronskih matičnih celicah izoliranih iz možganov človeških plodov. S pomočjo RC-seq, visoko zmogljivo metodo sekvenciranja, ki cilja na 3’ in 5’ konca LINE-1, ki so jo uporabili na DNA ekstrahirane iz različnih tkiv, identificirali so bistveno več kopij ORF2 in LINE-1 CNV v hipokampusu v primerjavi s srcem in jetri istega posameznika. Zanimivo je, da so v nedavni analizi 24 hipokampalnih nevronov odkrili, da se somatske insercije, ki se pojavijo med nevrodiferenciacijo v matične celice človeškega zarodka, lahko pojavijo zaradi mutacije v Ying Yang 1 (YY1) vezavnem mestu za transkripcijski faktor. YY1 vezavno mesto v promotorski regiji LINE-1 posreduje pri metilaciji CpG otočkov in epigenetski represiji. Retrotranspozicija med nevronskim razvojem lahko prispeva k nevronski raznolikosti, saj omogoča varijacijo genomske DNA od celice do celice.

== MOBILNI ELEMENTI IN NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI ==

Amiotrofična lateralna skleroza(ALS) je nevrodegenerativna bolezen, za katero je značilna izguba zgornjih in spodnjih motoričnih nevronov. . Številne študije so ugotovile prisotnost retrovirusne aktivnosti reverzne transkriptaze v serumu bolnikov z ALS. V kortikalnih piramidnih in hrbteničnih nevronih v posmrtnem možganskem tkivu bolnikov z ALS opazimo večjo ekspresijo HERV K-Env ki je močni imunopatogeni protein ovojnice . Aktivacija gena za HERV-K posledično zmanjšuje dolžino dendrita in tudi razvejanost in kompleksnost motoričnih nevronov transgenih miši. Še ni znano, kaj sproži izražanje HERV-K pri odraslih nevronih.

Aktivacija retrotranspozona je bila povezana tudi s sporadično obliko Alzheimerjeve bolezni, vendar so raziskave pokazale nedosledne rezultate o tem, ali so LINE-1 povišane pri bolnikih. V nevronih bolnikov so odkrili mozaične genomske rekombinacije znotraj gena, povezanega z Alzheimerjevo boleznijo, amiloidnega prekurzorskega proteina (APP). Te različice niso imele introničnih zaporedij in so bile imenovane "genomske cDNA" (gencDNA). Predpostavili so da izvirajo iz RNA in da zahtevajo endogeno aktivnost reverzne transkriptaze da se vstavijo v prelome dvojnih verig.

Pri pojavi Parkinsonove bolezni (PD) je odkrito pet različnih strukturnih variacij v genu PRKN (parkin RBR E3 ubiquitin protein ligase). Predvideva se, da se strukturne variacije pojavijo z nealelno homologno rekombinacijo. LTR in ne-LTR retrotranspozonske sekvence so bile identificirane znotraj dveh kilobaz od točke prekinitve delecije. To lahko pomeni da so delecije morda nastale zaradi retrotranspozicije. Povezava med aktivacijo retrotranspozona pri nevrodegenerativnih boleznih ni v celoti ugotovljena.

== TRANSPOZICIJSKI ELEMENTI IN VNETJA ==

Malo je znanega o prispevku transpozonih elementov k imunskim odzivom, ki so izvzeti za virusne okužbe. Ko iamo prisotno DNA v citoplazmi npr. virusno DNA, sproži se aktivacija poti cGAS-STING. cGAS-STING posledično proizvaja interferone, ki sprožijo vnetni odziv. Interferonski odzivi so lahko mehansko povezani z deregulacijo proizvodnje retrotranspozona.
Vse je več dokazov, da imajo transpozoni vlogo pri sprožitvi nevroinflamacije. Detekcija endogene nukleinske kisline s strani imunskega sistema je v osnovah številnih avtoimunskih bolezni. Retrotranspozoni so povezani z boleznimi kot so Multiple skleroza in Aicardi-Goutièresovim sindromom, kot glavni vnetni efektorji.

Multipla skleroza je kronična avtoimunska bolezen, ki prizadene osrednje živčevje in za katero ni znanega zdravila. Za bolezen so značilne lezije v beli snovi, ki vodijo do razgradnje krvno-možganske pregrade in aksonskih motenj po hrbtenjači. Izražanje HERV proteina se šteje za dejavnik za napredovanje bolezni. Iz supernatantov celične kulture vzorcev bolnikov so izolirani retrovirusima podobni delci, in je bilo dokazano da izvirajo iz elementov HERV.

Pri sistemskom eritematoznem lupusu je ugotovljena povišana transkripcija HERV. V študijah so pokazali da so ravni ekspresije mRNA HERV-E v celicah CD4+ T lupusa višje kot v zdravih celicah. Še ni znan popoln prispevek aktivnosti HERV.

Motnje avtističnega spectra so razvojne motnje, ki ovirajo komunikacijo in vedenje. Ugotovljeno je da je pri bolnikih bila zmanjšanja metilacija in povečano izražanje LINE-1 v možganih. Vse je več dokazov da lahko kronično vnetje prispeva k simptomatologiji avtizma.

Rettov sindrom je X-povezana progresivna nevrorazvojna motnja z avtističnimi značilnostmi. Pri Rettovom sindromu imamo prisotne različne mutacije v metil CpG vezavnem proteinu-2 (MeCP2). Analizirani vzorci možganskega tkiva ob smrti so pokazali višje genomske sekvence LINE-1 ORF2 pri bolnikih.

Aicardi-Goutièresov sindrom je progresivna vnetna motnja, ki prizadene novorojenčke in ima za posledico hudo duševno in telesno prizadetost ter močno skrajšano življenjsko dobo. Lahko nastane zaradi mutacij v TREX1(three-prime repair exonuclease 1). TREX1 deluje tako, da razgradi dvoverižno DNA(dsDNA)/enoverižno DNA(ssDNA). Mutacije v genu povzročijo znatno kopičenje vrst DNA v citoplazmi, ki sprožijo prirojen imunski odziv, kot je indukcija interferona. Večina teh vrst DNA je sestavljena iz citoplazemske ssDNA LINE-1. V nevronskih celicah mišjih s pomanjkanjem TREX-1 se izrazilo 70 % več elementov LINE-1Hs.

== VIRI IN LITERATURA ==

[1] Saleh, Aurian, et al. “Transposable Elements, Inflammation, and Neurological Disease.” Frontiers in Neurology, vol. 10, 2019. Frontiers, https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fneur.2019.00894.

[2] Volkman HE, Stetson DB. The enemy within: endogenous retroelements and autoimmune disease. Nat Immunol. (2014) 15:415–22. doi: 10.1038/ni.2872

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]