Wiki FKKT - User contributions [en]

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-10T09:54:40Z

Natalijapucihar: /* Rezultati in ugotovitve */

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Celice so kotransficirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) OPN4 uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazemski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim OPN4. Qui (2005) je predlagal, da bi OPN4 in TRPC kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje OPN4 v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalskih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1,5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih raziskavah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransficiranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo motnje glikemije zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov, kot sta lantanov klorid in etilen-tetraocetna kislina. [5].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov pri človeku, bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-10T09:53:10Z

Natalijapucihar: /* Signalna fototransdukcijska kaskada */

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Celice so kotransficirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) OPN4 uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazemski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim OPN4. Qui (2005) je predlagal, da bi OPN4 in TRPC kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje OPN4 v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalskih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransficiranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo motnje glikemije zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov, kot sta lantanov klorid in etilen-tetraocetna kislina. [5].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov pri človeku, bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-10T09:51:19Z

Natalijapucihar: /* Rezultati in ugotovitve */

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Celice so kotransficirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) OPN4 uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim OPN4. Qui (2005) je predlagal, da bi OPN4 in TRPC kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje OPN4 v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalskih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransficiranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo motnje glikemije zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov, kot sta lantanov klorid in etilen-tetraocetna kislina. [5].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov pri človeku, bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-10T09:50:27Z

Natalijapucihar: /* Uvod */

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Celice so kotransficirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) OPN4 uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim OPN4. Qui (2005) je predlagal, da bi OPN4 in TRPC kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje OPN4 v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransfeciranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo motnje glikemije zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov, kot sta lantanov klorid in etilen-tetraocetna kislina. [5].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov pri človeku, bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-09T17:10:57Z

Natalijapucihar: /* Uvod */

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) OPN4 uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim OPN4. Qui (2005) je predlagal, da bi OPN4 in TRPC kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje OPN4 v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransfeciranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo motnje glikemije zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov, kot sta lantanov klorid in etilen-tetraocetna kislina. [5].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov pri človeku, bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-09T08:46:54Z

Natalijapucihar: /* Rezultati in ugotovitve */

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za OPN4 in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) OPN4 uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim OPN4. Qui (2005) je predlagal, da bi OPN4 in TRPC kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje OPN4 v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransfeciranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo motnje glikemije zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov, kot sta lantanov klorid in etilen-tetraocetna kislina. [5].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov pri človeku, bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-08T23:50:04Z

Natalijapucihar: /* Signalna fototransdukcijska kaskada */

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za OPN4 in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) OPN4 uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim OPN4. Qui (2005) je predlagal, da bi OPN4 in TRPC kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje OPN4 v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransfeciranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo motnje glikemije zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov pri človeku, bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-08T23:24:10Z

Natalijapucihar:

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za OPN4 in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) OPN4 uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi OPN4 in TRPC kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje OPN4 v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransfeciranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo motnje glikemije zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov pri človeku, bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-08T23:21:03Z

Natalijapucihar: /* Zaključek */

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA PRI MIŠIH'''

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za OPN4 in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) OPN4 uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi OPN4 in TRPC kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje OPN4 v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransfeciranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo motnje glikemije zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov pri človeku, bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-08T23:19:33Z

Natalijapucihar: /* Zaključek */

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA PRI MIŠIH'''

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za OPN4 in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) OPN4 uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi OPN4 in TRPC kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje OPN4 v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransfeciranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo motnje glikemije zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov pri človeku, bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-08T23:18:58Z

Natalijapucihar: /* Primer možne klinične uporabe */

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA PRI MIŠIH'''

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za OPN4 in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) OPN4 uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi OPN4 in TRPC kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje OPN4 v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransfeciranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo motnje glikemije zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-08T23:16:27Z

Natalijapucihar: /* Rezultati in ugotovitve */

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA PRI MIŠIH'''

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za OPN4 in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) OPN4 uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi OPN4 in TRPC kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje OPN4 v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransfeciranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo motnje glikemije zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

== Primer možne klinične uporabe ==

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP-1 nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-08T23:10:41Z

Natalijapucihar: /* Rezultati in ugotovitve */

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA PRI MIŠIH'''

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za OPN4 in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) OPN4 uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi OPN4 in TRPC kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje OPN4 v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransfeciranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

== Primer možne klinične uporabe ==

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP-1 nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-08T23:09:41Z

Natalijapucihar: /* Melanopsin - molekularno stikalo */

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA PRI MIŠIH'''

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za OPN4 in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) OPN4 uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi OPN4 in TRPC kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje OPN4 v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem, za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransfeciranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

== Primer možne klinične uporabe ==

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP-1 nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-08T23:08:10Z

Natalijapucihar: /* Uvod */

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA PRI MIŠIH'''

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za OPN4 in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) ''OPN4'' uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi OPN4 in TRPC kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje OPN4 v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem, za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransfeciranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

== Primer možne klinične uporabe ==

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP-1 nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-08T23:05:52Z

Natalijapucihar: /* Rezultati in ugotovitve */

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA PRI MIŠIH'''

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) ''OPN4'' uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi OPN4 in TRPC kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje OPN4 v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem, za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransfeciranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

== Primer možne klinične uporabe ==

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP-1 nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-08T23:02:38Z

Natalijapucihar: /* Signalna fototransdukcijska kaskada */

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA PRI MIŠIH'''

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) ''OPN4'' uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi OPN4 in TRPC kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje OPN4 v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem, za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransficiranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

== Primer možne klinične uporabe ==

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP-1 nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-08T23:01:53Z

Natalijapucihar: /* Signalna fototransdukcijska kaskada */

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA PRI MIŠIH'''

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) ''OPN4'' uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi OPN4 in TRPC kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje ''OPN4'' v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem, za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransficiranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

== Primer možne klinične uporabe ==

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP-1 nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-08T23:00:44Z

Natalijapucihar: /* Signalna fototransdukcijska kaskada */

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA PRI MIŠIH'''

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) ''OPN4'' uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi ''OPN4'' in ''TRPC'' kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje ''OPN4'' v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem, za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransficiranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

== Primer možne klinične uporabe ==

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP-1 nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-08T23:00:14Z

Natalijapucihar: /* Rezultati in ugotovitve */

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA PRI MIŠIH'''

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) ''OPN4'' uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi ''OPN4'' in ''TRPC'' kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje ''OPN4'' v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem, za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransficiranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

== Primer možne klinične uporabe ==

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP-1 nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-08T22:58:54Z

Natalijapucihar: /* Melanopsin - molekularno stikalo */

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA PRI MIŠIH'''

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) ''OPN4'' uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi ''OPN4'' in ''TRPC'' kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje ''OPN4'' v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem, za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransficiranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

== Primer možne klinične uporabe ==

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP-1 nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-08T22:58:06Z

Natalijapucihar: /* Uvod */

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA PRI MIŠIH'''

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) ''OPN4'' uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti OPN4 se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi ''OPN4'' in ''TRPC'' kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje ''OPN4'' v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem, za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransficiranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

== Primer možne klinične uporabe ==

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP-1 nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-08T22:57:32Z

Natalijapucihar: /* Signalna fototransdukcijska kaskada */

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA PRI MIŠIH'''

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) ''OPN4'' uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti OPN4 se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi ''OPN4'' in ''TRPC'' kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje ''OPN4'' v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem, za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransficiranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

== Primer možne klinične uporabe ==

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP-1 nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-08T22:28:44Z

Natalijapucihar:

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA PRI MIŠIH'''

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) ''OPN4'' uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti OPN4 se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi ''OPN4'' in ''TRPC'' kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje ''OPN4'' v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem, za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransficiranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

== Primer možne klinične uporabe ==

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP-1 nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-08T22:28:30Z

Natalijapucihar:

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568, [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA PRI MIŠIH'''

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) ''OPN4'' uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti OPN4 se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi ''OPN4'' in ''TRPC'' kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje ''OPN4'' v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem, za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransficiranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

== Primer možne klinične uporabe ==

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP-1 nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših

2019-01-08T22:27:42Z

Natalijapucihar: New page: Izvorni članek: [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565] '''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA PRI MIŠIH''' == Uvo...

Izvorni članek: [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA PRI MIŠIH'''

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) ''OPN4'' uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti OPN4 se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi ''OPN4'' in ''TRPC'' kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje ''OPN4'' v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem, za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransficiranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

== Primer možne klinične uporabe ==

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP-1 nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Seminarji SB 2018/19

2019-01-08T22:18:35Z

Natalijapucihar:

V študijskem letu 2018/19 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RNA-stikala_tipa_%C2%BBToehold%C2%AB:_de_novo_oblikovani_regulatorji_izra%C5%BEanja_genov RNA-stikala tipa Toehold: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov] (Špela Malenšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Raznoliko_in_modelno_zasnovana_priprava_sinteti%C4%8Dnih_genskih_vezij_s_predvidenimi_lastnostmi Raznoliko in modelno zasnovana priprava sintetičnih genskih vezij s predvidenimi lastnostmi] (Matej Kolarič)

[[Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage]] (Fran Krstanović)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nekaj_pogledov_na_sistemsko_biologijo_kvasovke Nekaj pogledov na sistemsko biologijo kvasovke] (Gašper Žun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organizacija_znotrajceli%C4%8Dnih_reakcij_z_razumsko_na%C4%8Drtovanimi_RNA_sestavi#Na.C4.8Drtovanje_in_sestavljanje_RNA_sestavov Organizacija znotrajceličnih reakcij z razumsko načrtovanimi RNA sestavi] (Urška Jelenovec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biolo%C5%A1ko_vezje_na_osnovi_RNA-interference_za_identifikacijo_specifi%C4%8Dnih_rakavih_celic Biološko vezje na osnovi RNA-interference za identifikacijo specifičnih rakavih celic] (Gašper Marinšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kontrola_hitrosti_translacije_preko_pomožnega_mesta_5’-UTR:_energijski_kompromis_med_dostopnostjo%2C_selektivnim_razvijanjem_RNA-struktur_in_drsenjem_30S_ribosomske_podenote_po_RNA-strukturah Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah] (Neža Koritnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_genskega_skupka_za_fiksacijo_dušika_bakterije_Klebsiella_oxytoca Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije ''Klebsiella oxytoca''] (Gašper Virant)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Negativna_samoregulacija_linearizira_odziv_na_odmerek_in_zavira_heterogenost_genskega_izražanja Negativna samoregulacija linearizira odziv na odmerek in zavira heterogenost genskega izražanja] (Primož Tič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Design_and_analysis_of_synthetic_carbon_fixation_pathways Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways] (Marija Atanasova)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pol-sinteti%C4%8Den_organizem_z_raz%C5%A1irjeno_gensko_abecedo Pol-sintetičen organizem z razširjeno gensko abecedo] (Peter Pečan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programirano_uti%C5%A1anje_in_aktivacija_izra%C5%BEanja_bakterijskega_gena_z_uporabo_konstruiranega_CRISPR-Cas_sistema Programirano utišanje in aktivacija izražanja bakterijskega gena z uporabo konstruiranega CRISPR-Cas sistema] (Tjaša Sorčan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_optogenetska_transkripcijska_naprava_za_izboljšanje_homeostaze_krvnega_sladkorja_pri_miših Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja pri miših] (Natalija Pucihar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ Inženiring bakterij Escherichia coli, da se odzivajo na svetlobo: Te pametne bakterije „fotografirajo“ svetlobni vzorec kot kemično sliko visoke ločljivosti] (Karmen Žbogar)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Canditect:_hitra_detekcija_vaginalne_infekcije_s_Candido_albicans_z_uporabo_sistema_CRISPR/dCas9 Canditect – hitra detekcija vaginalne infekcije s Candido albicans z uporabo sistema CRISPR/dCas9] (Jerneja Ovčar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAPOEIRA_-_razvoj_personaliziranega_cepiva_proti_raku_in_sistema_za_spremljanje_odziva_na_zdravljenje CAPOEIRA – razvoj personaliziranega cepiva proti raku in sistema za spremljanje odziva na zdravljenje] (Anamarija Habič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biotic_Blue_-_encimska_razgradnja_zdravilnih_u%C4%8Dinkovin_v_odpadnih_vodah#BIOTIC_BLUE BIOTIC BLUE - encimska razgradnja zdravilnih učinkovin v odpadnih vodah] (Tina Požun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Of_CO2urse_-_sistem_za_zmanj%C5%A1evanje_izpustov_ogljikovega_dioksida_v_industriji Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji] (Kity Požek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cockroach_terminator Cockroach terminator]] (Roberta Mulac)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MiBiome_-_probioti%C4%8Dna_bakterija_za_zdravljenje_kroni%C4%8Dne_vnetne_%C4%8Drevesne_bolezni MiBiome - probiotična bakterija za zdravljenje kronične vnetne črevesne bolezni] (Ernest Šprager)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BioWatcher_pametna_ura_za_sledenje_ravni_biomarkerjev_za_bolezni BioWatcher: Pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni] (Nina Mavec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAT-Seq:_Visokoprepustna_metoda_za_analizo_katalitske_aktivnosti_biomolekul CAT-Seq: Visokoprepustna metoda za analizo katalitske aktivnosti biomolekul] (Bine Tršavec)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

22.11. 
1 
2 Valentina Levak 

27.11. 
1 
2 
3 
4 

29.11. 
1 Matej Kolarič 
2 Špela Malenšek 
3 
4 

4.12. 
1 Gašper Žun 
2 Fran Krstanovic 
3 
4 

6.12. 
1 Urška Jelenovec 
2 Rok Miklavčič 
3 
4 

11.12. 
1 Jerneja Ovčar 
2 Neža Koritnik 
3 Gašper Virant 
4 Gašper Marinšek 

18.12. 
1 Tina Požun 
2 Anamarija Habič 
3 Roberta Mulac 
4 Kity Požek 

3.1. 
1 Nina Mavec 
2 Primož Tič 
3 Ernest Šprager 
4 

8.1. 
1 Marija Atanasova 
2 Bine Tršavec 
3 Peter Pečan 
4 Tjaša Sorčan 

10.1. 
1 Urška Kašnik 
2 Natalija Pucihar 
3 Karmen Žbogar 
4 Uroš Zavrtanik 

15.1. 
1 Jerneja Kocutar 
2 Blaž Lebar 
3 Tadej Satler 
4 Miha Koprivnikar Krajnc 

17.1. 
1 Milena Stojkovska 
2 Špela Koren

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja v miših

2019-01-08T22:17:19Z

Natalijapucihar:

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA PRI MIŠIH'''

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) ''OPN4'' uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti OPN4 se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi ''OPN4'' in ''TRPC'' kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje ''OPN4'' v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem, za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransficiranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

== Primer možne klinične uporabe ==

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP-1 nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja v miših

2019-01-08T22:15:51Z

Natalijapucihar:

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA V MIŠIH'''

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) ''OPN4'' uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti OPN4 se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi ''OPN4'' in ''TRPC'' kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje ''OPN4'' v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem, za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransficiranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

== Primer možne klinične uporabe ==

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP-1 nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==
[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.

[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.

[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.

[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.

[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.

[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja v miših

2019-01-08T22:14:37Z

Natalijapucihar:

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA V MIŠIH'''

== Uvod ==

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

== Melanopsin - molekularno stikalo ==

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) ''OPN4'' uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti OPN4 se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava ==

=== Signalna fototransdukcijska kaskada ===

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi ''OPN4'' in ''TRPC'' kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje ''OPN4'' v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

=== Rezultati in ugotovitve ===

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem, za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransficiranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

== Primer možne klinične uporabe ==

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP-1 nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

== Zaključek ==

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

== Viri ==

[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.
[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.
[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.
[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.
[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.
[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja v miših

2019-01-08T22:13:11Z

Natalijapucihar:

Izvorni članek: H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568. [http://science.sciencemag.org/content/332/6037/1565]

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA V MIŠIH'''

'''== Uvod =='''

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

'''== Melanopsin - molekularno stikalo =='''

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) ''OPN4'' uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti OPN4 se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

'''== Sintezna optogenetska transkripcijska naprava =='''

'''=== Signalna fototransdukcijska kaskada ==='''

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi ''OPN4'' in ''TRPC'' kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje ''OPN4'' v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

'''=== Rezultati in ugotovitve ==='''

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem, za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransficiranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

'''== Primer možne klinične uporabe =='''

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP-1 nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

'''== Zaključek =='''

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

'''== Viri =='''

[1] K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.
[2] https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.
[3] M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.
[4] A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.
[5] H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.
[6] A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja v miših

2019-01-08T22:01:23Z

Natalijapucihar:

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA V MIŠIH'''

'''1. UVOD'''

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

'''2. MELANOPSIN-MOLEKULARNO STIKALO'''

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) ''OPN4'' uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti OPN4 se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

'''3. SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA'''

'''3.1. SIGNALNA FOTOTRANSDUKCIJSKA KASKADA'''

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi ''OPN4'' in ''TRPC'' kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje ''OPN4'' v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

'''3.2. REZULTATI IN UGOTOVITVE'''

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem, za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pAsv40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransficiranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

'''4.PRIMER MOŽNE KLINIČNE UPORABE'''

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP-1 nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

'''5.ZAKLJUČEK'''

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

'''6.VIRI'''

1) K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.
2) https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.
3) M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.
4) A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.
5) H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.
6) A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja v miših

2019-01-08T21:57:13Z

Natalijapucihar:

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja v miših

2019-01-08T21:56:31Z

Natalijapucihar:

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja v miših

2019-01-08T21:55:59Z

Natalijapucihar:

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja v miših

2019-01-08T21:53:08Z

Natalijapucihar:

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja v miših

2019-01-08T21:49:53Z

Natalijapucihar:

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA V MIŠIH'''

'''1. UVOD'''

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

'''2. MELANOPSIN-MOLEKULARNO STIKALO'''

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) ''OPN4'' uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti OPN4 se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

'''3. SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA'''

'''3.1. SIGNALNA FOTOTRANSDUKCIJSKA KASKADA'''

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi ''OPN4'' in ''TRPC'' kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje ''OPN4'' v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4].

'''3.2. REZULTATI IN UGOTOVITVE'''

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem, za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransficiranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

'''4.PRIMER MOŽNE KLINIČNE UPORABE'''

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP-1 nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

'''5.ZAKLJUČEK'''

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje [3].

'''6.VIRI'''

1) K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.
2) https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.
3) M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.
4) A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.
5) H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.
6) A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja v miših

2019-01-08T21:46:06Z

Natalijapucihar:

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA V MIŠIH'''

'''1. UVOD'''

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

'''2. MELANOPSIN-MOLEKULARNO STIKALO'''

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) ''OPN4'' uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti OPN4 se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

'''3. SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA'''

'''3.1. SIGNALNA FOTOTRANSDUKCIJSKA KASKADA'''

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi ''OPN4'' in ''TRPC'' kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje ''OPN4'' v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4]

'''3.2. REZULTATI IN UGOTOVITVE'''

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši [5]. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem, za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransficiranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

'''4.PRIMER MOŽNE KLINIČNE UPORABE'''

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

'''5.ZAKLJUČEK'''

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje. [3]

'''6.VIRI'''

1) K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.
2) https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.
3) M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.
4) A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.
5) H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.
6) A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja v miših

2019-01-08T21:41:18Z

Natalijapucihar:

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA V MIŠIH'''

'''1. UVOD'''

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

'''2. MELANOPSIN-MOLEKULARNO STIKALO'''

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) ''OPN4'' uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti OPN4 se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

'''3. SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA'''

'''3.1. SIGNALNA FOTOTRANSDUKCIJSKA KASKADA'''

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi ''OPN4'' in ''TRPC'' kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje ''OPN4'' v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4]

'''3.2. REZULTATI IN UGOTOVITVE'''

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši [5]. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem, za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASV40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (Phcmv-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransficiranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

'''4.PRIMER MOŽNE KLINIČNE UPORABE'''

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

'''5.ZAKLJUČEK'''

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje. [3]

'''6.VIRI'''

1) K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.
2) https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.
3) M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.
4) A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.
5) H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.
6) A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja v miših

2019-01-08T21:31:01Z

Natalijapucihar:

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA V MIŠIH'''

'''1. UVOD'''

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v, trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

'''2. MELANOPSIN-MOLEKULARNO STIKALO'''

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) ''OPN4'' uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti OPN4 se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

'''3. SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA'''

'''3.1. SIGNALNA FOTOTRANSDUKCIJSKA KASKADA'''

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi ''OPN4'' in ''TRPC'' kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje ''OPN4'' v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4]

'''3.2. REZULTATI IN UGOTOVITVE'''

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši [5]. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem, za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASv40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (Phcmv-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransficiranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

'''4.PRIMER MOŽNE KLINIČNE UPORABE'''

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

'''5.ZAKLJUČEK'''

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje. [3]

'''6.VIRI'''

1) K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.
2) https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.
3) M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.
4) A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.
5) H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.
6) A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja v miših

2019-01-08T21:08:40Z

Natalijapucihar: New page: '''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA V MIŠIH''' '''1. UVOD''' Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje ...

'''SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA ZA IZBOLJŠANJE HOMEOSTAZE KRVNEGA SLADKORJA V MIŠIH'''

'''1. UVOD'''

Optogenetika je hitro razvijajoča panoga tehnologije. Vključuje uporabo svetlobe za nadzor celic v bioloških sistemih, z visoko časovno in prostorsko ločljivostjo. Gre za nevromodulacijsko metodo, ki uporablja kombinacijo tehnik optike, genetike in bioinženiringa za nadzor in spremljanje dejavnosti posameznih nevronov v ''in vivo'' študijah organizmov in natančno merjenje učinkov manipulacije v realnem času [1]. Ključni reagenti, ki se uporabljajo pri optogenetiki, so svetlobno občutljivi proteini. Optogenetika se je v nevroznanosti pojavila leta 2010. Študije možganov in psiholoških bolezni so sprva večinoma vključevale uporabo elektrod in zdravil za stimulacijo določenih predelov možganov. Takšni načini študija možganov običajno niso bili dovolj natančni, saj elektrode stimulirajo tudi druga področja možganov, zdravila pa delujejo zelo počasi. Optogenetika deluje na bolj specifičen način, kjer gene z zapisom za opsin vstavimo v želene celice z molekularnim inženiringom [2]. Razvoj optogenetike se je sprva osredotočal na nevroznanost, vse bolj pa postaja zanimiv za terapevtsko uporabo.

V članku, ki so ga objavili Ye in sodelavci leta 2011, je bil melanopsin uporabljen za optogenetsko sintezno transkripcijsko napravo. Napravo so testirali za namen proizvodnje terapevtskega, glukagonu podobnega peptida 1 (GLP-1). Celice so kotransfecirali z vektorjema, ki imata vključen zapis za ''OPN4'' in željeni transgen ter jih vstavili v, trebušno votlino (intraperitonealno) ali pod kožo (subkutano), miši. GLP-1 je nevropeptid, ki stimulira izločanje inzulina in zavira izločanje glukagona, ko je v krvi glukoza. Znanstveniki so prikazali uporabo optogenetike za nadzor krvnega sladkorja v miših. Proizveden GLP-1 je uspešno zmanjšal motnje glikemije pri diabetičnih miših tipa II ''in vivo''.

'''2. MELANOPSIN-MOLEKULARNO STIKALO'''

Melanopsin je vrsta fotopigmenta, ki pripada večji skupini svetlobno občutljivih proteinov mrežnice, opsinom in ga kodira ''OPN4''. Pri ljudeh se melanopsin nahaja v intrinzičnih, svetlobno občutljivih ganglijskih celicah mrežnice (ipRGC). Protein melanopsin ima sedem alfa heliksov vgrajenih v plazemsko membrano, N- in C- terminalno domeno in spada med receptorje, sklopljene z G proteini (GPCR) [3]. Najbolj odziven je na modro svetlobo valovne dolžine 480 nm. Pokazali so, da bi lahko ektopično izražanje (izražanje na neobičajnem mestu) ''OPN4'' uporabili kot optogenetsko orodje za nadzor celičnih aktivnosti v različnih tkivih. V primerjavi z drugimi optogenetskimi pigmenti je receptor OPN4 bolj občutljiv na svetlobo, je dalj časa aktiven in lahko nadzoruje znotrajcelično dinamiko Ca2+. Te edinstvene lastnosti OPN4 se kažejo kot prednosti za njegovo uporabo kot optogenetsko orodje [4].

'''3. SINTEZNA OPTOGENETSKA TRANSKRIPCIJSKA NAPRAVA'''

'''3.1. SIGNALNA FOTOTRANSDUKCIJSKA KASKADA'''

OPN4 služi kot molekularno stikalo. Uporabili so ga za nadziranje znotrajcelične dinamike Ca2+ in uravnavanje transkripcijskega faktorja NFAT. Modra svetloba valovne dolžine 480 nm je povzročila fotoizomerizacijo kromofora, 11-cis-retinala, ki spremeni konformacijo melanopsina. Sprememba konformacije kaskadno aktivira Gαq tip G proteina, fosfolipazo C (PLC) in fosfokinazo C (PKC). Slednja sproži pritok Ca2+ iz zunajceličnega okolja v celico z aktivacijo TRPC – napetostno odvisnih ionskih kanalov in verjetno tudi iz znotrajceličnih organelov za shranjevanje Ca2+, kot je ER (endoplazmatski retikulum). Z modro svetlobo sprožen dvig znotrajceličnih kalcijevih ionov je povezan s signalno potjo NFAT preko kalmodulina, ki služi kot nekakšen senzor za kalcijeve ione. Kalmodulin nato aktivira kalcinevrin, ki je serin/treonin fosfataza in defosforilira s serini bogate regije in serin-prolin ponovitve na aminskem koncu NFAT. Defosforilacija NFAT povzroči konformacijsko spremembo, izpostavi se jedrni lokalizacijski signal (NLS) in NFAT se lahko translocira v jedro. V jedru se veže na specifične promotorje PNFAT ter sproži izražanje transgena [5].
OPN4 sam po sebi ne tvori ionskih kanalov. Kationski kanal, kot je TRPC, mora biti za regulacijo celic funkcionalno sklopljen z transfeciranim ''OPN4''. Qui (2005) je predlagal, da bi ''OPN4'' in ''TRPC'' kanale izražali sočasno. Ektopično izražanje ''OPN4'' v celicah z endogenimi TRPC3 kanali še ne pomeni, da je OPN4 funkcionalno sklopljen z TRPC3 kanali. Negativni rezultati eksperimentov so pokazali, da je za uspešno funkcionalno sklopitev ektopično izraženega receptorja melanopsina in endogenih kationskih kanalčkov potrebna posebna »mašinerija« [4]

'''3.2. REZULTATI IN UGOTOVITVE'''

Svetlobno sproženo izražanje transgena lahko izvedemo v različnih celičnih linijah, ki so gojene v kulturi, bioreaktorjih ali pa so implantirane v miši [5]. Izražanje lahko uravnavamo z nastavitvijo periode osvetljevanja [5].
Z enostavno kotransfekcijo glodalčjih in človeških celičnih linij z ekspresijskim vektorjem, za konstitutivno izražanje melanopsina, pHY42 (PhCMV-melanopsin-pASV40) in luciferaznim reporterskim konstruktom pod promotorjem PNFAT, pGL4.30 (PNFAT -luc2P-pASv40 ) so pokazali, da je bila luciferaza inducirana izključno takrat, ko so bile celice izpostavljene pulzom modre svetlobe za 24 ur. Posamezen pulz je sestavljen iz 5 sekund vklopljenega in 10 sekund izklopljenega stanja, svetlobne intenzitete 1.5x1018 fotonov s-1 m-2. Celice HEK-293 so pokazale najboljši profil svetlobno sproženega izražanja transgena in so bile zato uporabljene v vseh nadaljnjih študijah [5].

Ko so izvedli kotransfekcijo celic HEK-293 s pHY42 (Phcmv-melanopsin-pASV40) in pHY30 (PNFAT -SEAP-pASV40), ki omogoča izražanje SEAP pod promotorjem PNFAT in jih za 48 ur izpostavili pulzom modre svetlobe, je nivo SEAP že po 24 urah dosegel skoraj maksimalni nivo. Najvišje vrednosti SEAP so bile primerljive s tistimi, ki jih dosežemo s sproženjem odziva NFAT z ionomicinom. To nakazuje na to, da je kaskada, sprožena s svetlobno induciranim melanopsinom, optimalno izkoristila endogene komponente poti NFAT in delovala z maksimalnim izkoristkom. Nivoji SEAP kotransficiranih celic HEK-293 so lahko natančno določeni s spreminjanjem časa osvetljevanja med 0 in 72 ur, kar potrjuje, da je sintezna kontrolna naprava zmožna skozi čas integrirati intenziteto pulzirajočega vira svetlobe in zagotoviti vzdrževano, s svetlobo sproženo transkripcijo. Z izpostavitvijo omenjenih celic pulzom določene intenzitete in časa osvetljevanja, bi lahko natančno predprogramirali kinetiko izražanja SEAP in vnaprej določili maksimalne nivoje SEAP, ki jih dosežemo po več dneh [5].

Sprožilna naprava za nadzor izražanja transgena ''in vivo'' bi lahko bila uporabna v terapiji sladkorne bolezni. Intraperitonealne vsadke so naredili tako, da so 1x105 pHY30/pHY42 transgenskih celic HEK-293 vstavili v 2 cm CellMax membrane iz votlih vlaken. Na eno stran membrane so pripeli votla optična vlakna in toplotno zatesnili oba konca. Vsadek so vstavili v trebušno votlino miši. Optična vlakna so bila povezana z LED in kontrolno enoto. Vsadek je bil osvetljevan z pulzi modre svetlobe 3 ali 48 ur. Kontrolnih miši niso osvetljevali. 48 ur po implantaciji so zbrali vzorce krvi in določili vrednosti SEAP v serumu. S tem so pokazali, da lahko ustrezno nadzorujejo ravni plazemskega SEAP [5].

Za subkutane vsadke so pripravili celice HEK-293, ki konstitutivno izražajo melanopsin (pHY42) in različico človeškega glukagonu podobnega peptida 1 s PNFAT (shGLP1 ; pHY57), katerega izražanje je sproženo s svetlobo. Celice so mikroenkapsulirali v alginat-poli-(L)-lizinske kapsule (200 celic/kapsula) in jih injicirali v podkožje miši divjega tipa (WT) ter diabetične miši (db/db). Miši so osvetlili za 48 ur s standardnimi pulzi modre svetlobe. Trideset ur po implantiranju, so miši stradali 16 ur preden so jim intraperitonealno injicirali glukozo. Nivo glukoze v plazmi so spremljali z vzorci krvi iz repne vene 120 minut. 48 ur po implantaciji so določili vrednosti shGLP-1 in inzulina z metodo ELISA [5].

Koncentracija shGLP-1 in inzulina, se je po izpostavitvi modri svetlobi bistveno povečala tako pri WT kot tudi pri diabetičnih miših. Kontrolni poskusi so potrdili s svetlobo sproženo izražanje shGLP-1 in njegovo sposobnost induciranja izločanja inzulina iz celic b-TC-6. Delovanje obeh proteinov je pomembno zmanjšalo nivo glukoze v krvi zdravljenih živali po intraperitonealnem vnosu glukoze. Učinkovitost znotrajcelične signalne poti NFAT je bila visoka, brez škodljivih učinkov na celično preživetje, kot bi lahko pričakovali zaradi dolgotrajne izpostavljenosti celic modri svetlobi. Izražanje transgena v HEK-293, se lahko učinkovito ustavi z inhibitorji kalcijevih kanalčkov [5].

'''4.PRIMER MOŽNE KLINIČNE UPORABE'''

Alternativa obstoječi terapiji z inzulinom bi lahko bila, da bi pacientu s sladkorno boleznijo subkutano vstavili celični implantant enkapsuliran v polprepustni napravi. S polprepustnostjo bi zagotovili zaščito pred imunskim sistemom gostitelja. Na implantant, zaščiten pred zunanjo svetlobo, bi bila pritrjena LED. Po potrebi (po obroku), bi pacient prižgal LED s pritiskom na gumb, s čimer bi implantant za določeno časovno obdobje izpostavil modri svetlobi. Z melanopsinom sproženo izločanje GLP-1 iz implantiranih celic v pacientov krvni obtok, bi učinkovito regulirali homeostazo glukoze po obroku s sprožanjem izločanja insulina iz beta celic trebušne slinavke pacienta. Ko bi bil GLP nivo dovolj visok bi lučko ugasnili [6].

'''5.ZAKLJUČEK'''

Pred klinično uporabo teh vsadkov bi bilo potrebno dobro premisliti o etičnih, znanstvenih in varnostnih vprašanjih. Katere celične linije bi bile dovolj varne za vsaditev v človeka? Kako dolgo lahko tak vsadek ostane funkcionalen? Ali lahko implantirane transgenske celice komunicirajo z normalnim tkivom gostitelja? Če da, kakšne bi bile posledice? [6]
Za klinično terapevtsko uporabo imajo OPN4 in druga optogenetska orodja tako prednosti kot slabosti. Za druge aplikacije bi bilo, odvisno od cilja, potrebno izbrati ustrezno optogenetsko orodje. [3]

'''6.VIRI'''

1) K. Deisseroth, Optogenetics. Nature Methods 2011, 26-29.
2) https://sciencecalling.com/2011/08/12/light-science-optogenetics/, pridobljeno dne 25.12.2018.
3) M.W. Hankins, S.N.Peirson, R.G. Foster, Melanopsin: an exciting photopigment. Trends Neurosci. 2008, 27-36.
4) A. Koizumi, K.F.Tanaka, A.Yamanaka. The manipulation of neural and cellular activities by ectopic expression of melanopsin. Neuroscience Research 2013, 3-5.
5) H. Ye, M.D. E. Baba, R.W.Peng, M. Fussenegger. A Synthetic Optogenetic Transcription Device Enhances Blood-Glucose Homeostasis in Mice. Science 2011, 1565-1568.
6) A. Sengupta, Melanopsin: A Photopigment Regulating Circadian Photoentrainment May Lead to a Blue Light-Induced Treatment of Diabetes. Ross University School of Medicine, 2013.

Seminarji SB 2018/19

2019-01-08T20:44:37Z

Natalijapucihar:

V študijskem letu 2018/19 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RNA-stikala_tipa_%C2%BBToehold%C2%AB:_de_novo_oblikovani_regulatorji_izra%C5%BEanja_genov RNA-stikala tipa Toehold: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov] (Špela Malenšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Raznoliko_in_modelno_zasnovana_priprava_sinteti%C4%8Dnih_genskih_vezij_s_predvidenimi_lastnostmi Raznoliko in modelno zasnovana priprava sintetičnih genskih vezij s predvidenimi lastnostmi] (Matej Kolarič)

[[Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage]] (Fran Krstanović)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nekaj_pogledov_na_sistemsko_biologijo_kvasovke Nekaj pogledov na sistemsko biologijo kvasovke] (Gašper Žun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organizacija_znotrajceli%C4%8Dnih_reakcij_z_razumsko_na%C4%8Drtovanimi_RNA_sestavi#Na.C4.8Drtovanje_in_sestavljanje_RNA_sestavov Organizacija znotrajceličnih reakcij z razumsko načrtovanimi RNA sestavi] (Urška Jelenovec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biolo%C5%A1ko_vezje_na_osnovi_RNA-interference_za_identifikacijo_specifi%C4%8Dnih_rakavih_celic Biološko vezje na osnovi RNA-interference za identifikacijo specifičnih rakavih celic] (Gašper Marinšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kontrola_hitrosti_translacije_preko_pomožnega_mesta_5’-UTR:_energijski_kompromis_med_dostopnostjo%2C_selektivnim_razvijanjem_RNA-struktur_in_drsenjem_30S_ribosomske_podenote_po_RNA-strukturah Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah] (Neža Koritnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_genskega_skupka_za_fiksacijo_dušika_bakterije_Klebsiella_oxytoca Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije ''Klebsiella oxytoca''] (Gašper Virant)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Negativna_samoregulacija_linearizira_odziv_na_odmerek_in_zavira_heterogenost_genskega_izražanja Negativna samoregulacija linearizira odziv na odmerek in zavira heterogenost genskega izražanja] (Primož Tič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Design_and_analysis_of_synthetic_carbon_fixation_pathways Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways] (Marija Atanasova)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pol-sinteti%C4%8Den_organizem_z_raz%C5%A1irjeno_gensko_abecedo Pol-sintetičen organizem z razširjeno gensko abecedo] (Peter Pečan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programirano_uti%C5%A1anje_in_aktivacija_izra%C5%BEanja_bakterijskega_gena_z_uporabo_konstruiranega_CRISPR-Cas_sistema Programirano utišanje in aktivacija izražanja bakterijskega gena z uporabo konstruiranega CRISPR-Cas sistema] (Tjaša Sorčan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_optogenetska_transkripcijska_naprava_za_izboljšanje_homeostaze_krvnega_sladkorja_v_miših Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja v miših] (Natalija Pucihar)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Canditect:_hitra_detekcija_vaginalne_infekcije_s_Candido_albicans_z_uporabo_sistema_CRISPR/dCas9 Canditect – hitra detekcija vaginalne infekcije s Candido albicans z uporabo sistema CRISPR/dCas9] (Jerneja Ovčar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAPOEIRA_-_razvoj_personaliziranega_cepiva_proti_raku_in_sistema_za_spremljanje_odziva_na_zdravljenje CAPOEIRA – razvoj personaliziranega cepiva proti raku in sistema za spremljanje odziva na zdravljenje] (Anamarija Habič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biotic_Blue_-_encimska_razgradnja_zdravilnih_u%C4%8Dinkovin_v_odpadnih_vodah#BIOTIC_BLUE BIOTIC BLUE - encimska razgradnja zdravilnih učinkovin v odpadnih vodah] (Tina Požun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Of_CO2urse_-_sistem_za_zmanj%C5%A1evanje_izpustov_ogljikovega_dioksida_v_industriji Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji] (Kity Požek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cockroach_terminator Cockroach terminator]] (Roberta Mulac)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MiBiome_-_probioti%C4%8Dna_bakterija_za_zdravljenje_kroni%C4%8Dne_vnetne_%C4%8Drevesne_bolezni MiBiome - probiotična bakterija za zdravljenje kronične vnetne črevesne bolezni] (Ernest Šprager)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BioWatcher_pametna_ura_za_sledenje_ravni_biomarkerjev_za_bolezni BioWatcher: Pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni] (Nina Mavec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAT-Seq:_Visokoprepustna_metoda_za_analizo_katalitske_aktivnosti_biomolekul CAT-Seq: Visokoprepustna metoda za analizo katalitske aktivnosti biomolekul] (Bine Tršavec)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

22.11. 
1 
2 Valentina Levak 

27.11. 
1 
2 
3 
4 

29.11. 
1 Matej Kolarič 
2 Špela Malenšek 
3 
4 

4.12. 
1 Gašper Žun 
2 Fran Krstanovic 
3 
4 

6.12. 
1 Urška Jelenovec 
2 Rok Miklavčič 
3 
4 

11.12. 
1 Jerneja Ovčar 
2 Neža Koritnik 
3 Gašper Virant 
4 Gašper Marinšek 

18.12. 
1 Tina Požun 
2 Anamarija Habič 
3 Roberta Mulac 
4 Kity Požek 

3.1. 
1 Nina Mavec 
2 Primož Tič 
3 Ernest Šprager 
4 

8.1. 
1 Marija Atanasova 
2 Bine Tršavec 
3 Peter Pečan 
4 Tjaša Sorčan 

10.1. 
1 Urška Kašnik 
2 Natalija Pucihar 
3 Karmen Žbogar 
4 Uroš Zavrtanik 

15.1. 
1 Jerneja Kocutar 
2 Blaž Lebar 
3 Tadej Satler 
4 Miha Koprivnikar Krajnc 

17.1. 
1 Milena Stojkovska 
2 Špela Koren

Seminarji SB 2018/19

2019-01-08T20:44:08Z

Natalijapucihar:

V študijskem letu 2018/19 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RNA-stikala_tipa_%C2%BBToehold%C2%AB:_de_novo_oblikovani_regulatorji_izra%C5%BEanja_genov RNA-stikala tipa Toehold: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov] (Špela Malenšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Raznoliko_in_modelno_zasnovana_priprava_sinteti%C4%8Dnih_genskih_vezij_s_predvidenimi_lastnostmi Raznoliko in modelno zasnovana priprava sintetičnih genskih vezij s predvidenimi lastnostmi] (Matej Kolarič)

[[Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage]] (Fran Krstanović)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nekaj_pogledov_na_sistemsko_biologijo_kvasovke Nekaj pogledov na sistemsko biologijo kvasovke] (Gašper Žun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organizacija_znotrajceli%C4%8Dnih_reakcij_z_razumsko_na%C4%8Drtovanimi_RNA_sestavi#Na.C4.8Drtovanje_in_sestavljanje_RNA_sestavov Organizacija znotrajceličnih reakcij z razumsko načrtovanimi RNA sestavi] (Urška Jelenovec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biolo%C5%A1ko_vezje_na_osnovi_RNA-interference_za_identifikacijo_specifi%C4%8Dnih_rakavih_celic Biološko vezje na osnovi RNA-interference za identifikacijo specifičnih rakavih celic] (Gašper Marinšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kontrola_hitrosti_translacije_preko_pomožnega_mesta_5’-UTR:_energijski_kompromis_med_dostopnostjo%2C_selektivnim_razvijanjem_RNA-struktur_in_drsenjem_30S_ribosomske_podenote_po_RNA-strukturah Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah] (Neža Koritnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_genskega_skupka_za_fiksacijo_dušika_bakterije_Klebsiella_oxytoca Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije ''Klebsiella oxytoca''] (Gašper Virant)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Negativna_samoregulacija_linearizira_odziv_na_odmerek_in_zavira_heterogenost_genskega_izražanja Negativna samoregulacija linearizira odziv na odmerek in zavira heterogenost genskega izražanja] (Primož Tič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Design_and_analysis_of_synthetic_carbon_fixation_pathways Design and analysis of synthetic carbon fixation pathways] (Marija Atanasova)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pol-sinteti%C4%8Den_organizem_z_raz%C5%A1irjeno_gensko_abecedo Pol-sintetičen organizem z razširjeno gensko abecedo] (Peter Pečan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programirano_uti%C5%A1anje_in_aktivacija_izra%C5%BEanja_bakterijskega_gena_z_uporabo_konstruiranega_CRISPR-Cas_sistema Programirano utišanje in aktivacija izražanja bakterijskega gena z uporabo konstruiranega CRISPR-Cas sistema] (Tjaša Sorčan)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sintezna_optogenetska_transkripcijska_naprava_za_izboljšanje_homeostaze_krvnega_sladkorja_v_miših Sintezna optogenetska transkripcijska naprava za izboljšanje homeostaze krvnega sladkorja v miših] (Natalija Pucihar)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Canditect:_hitra_detekcija_vaginalne_infekcije_s_Candido_albicans_z_uporabo_sistema_CRISPR/dCas9 Canditect – hitra detekcija vaginalne infekcije s Candido albicans z uporabo sistema CRISPR/dCas9] (Jerneja Ovčar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAPOEIRA_-_razvoj_personaliziranega_cepiva_proti_raku_in_sistema_za_spremljanje_odziva_na_zdravljenje CAPOEIRA – razvoj personaliziranega cepiva proti raku in sistema za spremljanje odziva na zdravljenje] (Anamarija Habič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biotic_Blue_-_encimska_razgradnja_zdravilnih_u%C4%8Dinkovin_v_odpadnih_vodah#BIOTIC_BLUE BIOTIC BLUE - encimska razgradnja zdravilnih učinkovin v odpadnih vodah] (Tina Požun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Of_CO2urse_-_sistem_za_zmanj%C5%A1evanje_izpustov_ogljikovega_dioksida_v_industriji Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji] (Kity Požek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cockroach_terminator Cockroach terminator]] (Roberta Mulac)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MiBiome_-_probioti%C4%8Dna_bakterija_za_zdravljenje_kroni%C4%8Dne_vnetne_%C4%8Drevesne_bolezni MiBiome - probiotična bakterija za zdravljenje kronične vnetne črevesne bolezni] (Ernest Šprager)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BioWatcher_pametna_ura_za_sledenje_ravni_biomarkerjev_za_bolezni BioWatcher: Pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni] (Nina Mavec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAT-Seq:_Visokoprepustna_metoda_za_analizo_katalitske_aktivnosti_biomolekul CAT-Seq: Visokoprepustna metoda za analizo katalitske aktivnosti biomolekul] (Bine Tršavec)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

22.11. 
1 
2 Valentina Levak 

27.11. 
1 
2 
3 
4 

29.11. 
1 Matej Kolarič 
2 Špela Malenšek 
3 
4 

4.12. 
1 Gašper Žun 
2 Fran Krstanovic 
3 
4 

6.12. 
1 Urška Jelenovec 
2 Rok Miklavčič 
3 
4 

11.12. 
1 Jerneja Ovčar 
2 Neža Koritnik 
3 Gašper Virant 
4 Gašper Marinšek 

18.12. 
1 Tina Požun 
2 Anamarija Habič 
3 Roberta Mulac 
4 Kity Požek 

3.1. 
1 Nina Mavec 
2 Primož Tič 
3 Ernest Šprager 
4 

8.1. 
1 Marija Atanasova 
2 Bine Tršavec 
3 Peter Pečan 
4 Tjaša Sorčan 

10.1. 
1 Urška Kašnik 
2 Natalija Pucihar 
3 Karmen Žbogar 
4 Uroš Zavrtanik 

15.1. 
1 Jerneja Kocutar 
2 Blaž Lebar 
3 Tadej Satler 
4 Miha Koprivnikar Krajnc 

17.1. 
1 Milena Stojkovska 
2 Špela Koren

Seminarji SB 2018/19

2018-11-14T20:53:34Z

Natalijapucihar:

Seminarji SB 2018/19

2018-11-14T20:48:12Z

Natalijapucihar:

Seminarji SB 2018/19

2018-11-14T20:36:16Z

Natalijapucihar:

Seminarji SB 2018/19

2018-11-14T20:00:51Z

Natalijapucihar:

Seminarji SB 2018/19

2018-11-14T18:47:38Z

Natalijapucihar:

Seminarji SB 2018/19

2018-11-14T18:45:08Z

Natalijapucihar:

Talk:Mehanizem celične smrti po delovanju antibiotikov

2017-05-16T21:41:17Z

Natalijapucihar:

Uvod, toksin-antitoksin sistemi - Karmen Žbogar

Antibiotični zaviralci transkripcije in/ali translacije, ROS odvisna/neodvisna celična smrt - Natalija Pucihar