Wiki FKKT - User contributions [en]

Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah

2018-12-10T16:47:04Z

Neža Koritnik:

Povzeto po raziskovalnem članku ''”Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility, selective RNA unfoldnig and sliding at upstream standby sites”'' (2014) [[1]][https://academic.oup.com/nar/article/42/4/2646/2435298].

===Uvod===

Iniciacija translacije mRNA je pomembna točka regulacije sinteze proteinov. Pri prokariontih je to ponavadi najpočasnejša stopnja sinteze proteinov (od nje zavisi celokupna hitrost translacije), zato je podvržena različnim post-transkripcijskim mehanizmom uravnavanja izražanja genov [2].

Bakterijska iniciacija translacije se začne z nastankom 30S pre-iniciacijskega kompleksa. Ob asistenci treh iniciacijskih faktorjev (IF1-3) se 30S podenota ribosoma veže na mRNA, na start-kodon pa se rekrutira aminoacil-tRNA, ki prinese prvo aminokislino (fMet). 30S pre-iniciacijskemu komplesu se nato pridruži še 50S podenota ribosoma in tako nastane 70S iniciacijki kompleks, ki omogoči pričetek translacije [2].

Kontrola iniciacije translacije pri prokariontih je pogosto pogojena z interakcijami med 30S ribosomsko podenoto in 5'-UTR mRNA. Na hitrost translacije mRNA tako lahko vplivajo spremembe v zaporedju in sekundarni strukturi 5'-UTR. Na 5'-UTR se nahaja Shine-Dalgarnovo (SD) zaporedje, ki je definirano kot vezavno mesto za ribosom pri prokariontih. Sledi nekaj baznih parov dolg vmesnik in start-kodon. Vsi ti elementi sodelujejo pri regulaciji iniciacije tranlacije, ki je odvisna tako od SD-zaporeja (ki je konsenzno zaporedje in se med različnimi mRNA lahko razlikuje), dolžine vmesnika in tipa start-kodona (poleg AUG so možni še alternativni start-kodoni, t.j. GUG, UUG, AUU, AUC in AUA [2]). Veliko 5'-UTR-jev vsebuje še zaporedja navzgor od SD-zaporedja. Ta zaporedja lahko vsebujejo različne sekundarne strukture in tvorijo nespecifične elektrostatske interakcije s pozititivno nabitim delom površine 30S ribosomske podenote. Govorimo o pomožnem mestu (ang. ''“standby site”'') 5'-UTR.

Pomožno mesto je sestavljeno iz enega ali več modulov. Modul pomožnega mesta je vsaka posamezna sekundarna struktura mRNA, ponavadi pa gre za različno strukturirane lasnice. Raziskave kažejo [3], da ob sestavljanju 30S pre-iniciacijskega kompleksa na začetku pride do vezave 30S podenote ribosoma na pomožno mesto, kateri najprej sledi insercija mRNA skozi vhodni kanal podenote in nato komplementarno parjenje baz SD-zaporedja na mRNA in anti-SD-zaporedja na 16S rRNA, kar omogoči orientacijo start-kodona na P-mesto, kamor se tedaj rekrutira fMet-tRNA.

Za proces sestavljanja 30S pre-iniciacijskega kompleksa lahko izračunamo spremembo Gibbsove proste energije (∆G30S-mRNA), ki je neposredno povezana s hitrostjo translacije: r ∝ ''exp''(-β∆G30S-mRNA). ∆G30S-mRNA upošteva vse zgoraj navedene procese, torej prispevek parjenja baz SD- in anti-SD-zaporedja (∆GmRNA-rRNA < 0), prispevek morebitne neugodne dolžine vmesnika (∆Gvmesnik > 0), prispevek hibridizacije start-kodona in anti-kodona na fMet-tRNA (∆Gstart < 0), prispevek vezave na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto > 0) ter energijo zvitja mRNA v začetno stanje (∆GmRNA < 0). Celokupna Gibbsova prosta energija je tako: ∆G30S-mRNA = ∆GmRNA-rRNA + ∆Gvmesnik + ∆Gstart + ∆Gpomožno mesto - ∆GmRNA.

Vsi prispevki, razen ∆Gpomožno mesto, so bili predhodno že dobro okarakterizirani. Obravnavana raziskava se na podlagi strukturnih lastnosti pomožnega mesta 5'-UTR osredotoča na določitev ∆Gpomožno mesto, katero poveže s hitrostjo translacije.

===Potek eksperimenta===

V eksperimentu so zasnovali 136 sintetičnih 5'-UTR-jev mRNA, ki so bili sestavljeni iz različnih pomožnih mest, zaporedja navzdol pa so bila enaka (SD-zaporedje, vmesnik in start-kodon - AUG). Načrtane 5'-UTR so z metodami tehnologije rekombinantne DNA uporabili pri sestavitvi DNA-konstrukta, ki je vseboval ustrezen 5'-UTR, za start-kodonom pa zapis za reporterski protein - monomerni rdeči fluorescenčni protein 1 (mRFP1). DNA-konstrukte so vstavili v ekspresijski vektor pFTV1, ki je imel zapis za konstitutivni promor σ70 in s katerim so transformirali kompetente celice ''E. coli'' DH10B. Količino nastalega reporterskega proteina so določili z meritvami pretočne citometrije, pogoji gojenja celic pa so bili zasnovani tako, da je bila fluorescenca mRFP1 sorazmerna hitrosti (iniciacije) translacije, ta pa je sorazmerna ∆G30S-mRNA in zato ∆Gpomožno mesto: ∆Gpomožno mesto = -1/β ln(F/Fref) - (∆∆Gostali prispevki).

===Površina modula pomožnega mesta v povezavi s hitrostjo translacije===

Pri vezavi ribosoma na 5'-UTR je strukturiranost modula pomožnega mesta eden ključnih dejavnikov, ki modulirajo sposobnost vezave ribosoma na mRNA. Modul pomožnega mesta opišemo s tremi strukturnimi parametri:

- H (višina lasnice oziroma število nukleotidov od vznožja lasnice do sredine vrhnje zanke),

- D (dolžina distalnega vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzgor od lasnice),

- P (dolžina proksimalnegla vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzdol od lasnice).

Parametri so povezani z eno-verižno površino modula (As), ki jo definira enačba: As = 15 + P + D - H. As je tista površina, ki je dostopna ribosomu. Tako velja: večja kot je As, lažja je vezava 30S ribosomske podenote na modul. ∆Gpomožno mesto je torej manjša, ko je As večja (ko sta parametra D in P večja ter parameter H manjši), in obratno. V primeru maksimalno dostopnega modula (t.j. modul brez sekundarnih struktur) velja ∆Gpomožno mesto = 0.

Navedeno so potrdile meritve pretočne citometrije, ki so jih so izvedli na celicah transformiranih s konstrukti, ki so na pomožnem mestu 5'-UTR vsebovale en sam modul. Intenzitete fluorescence mRFP1 so se v odvisnosti od strukturiranosti modula oziroma v odvisnosti od As razlikovale. Modul z večjo As je imel večjo fluorescenco kot modul z manjšo As, saj je bil ribosomu dostopnejši, zaradi česar je bila vezava njegove 30S podenote energijsko ugodnejša (manjša ∆Gpomožno mesto), translacija pa hitrejša.

===Energijski kompromis med dostopnostjo in razvijanjem struktur modulov pomožnega mesta===

Znano je, da se nekatere mRNA-strukture, ki omejujejo vezavo ribosoma na SD-mesto, pred iniciacijo translacije razvijejo, kar zahteva energijski vložek in posledično zmanjšanje hitrosti iniciacije [4]–[6]. Manj pa je znanega o tem, kaj se zgodi s strukturami pred SD-zaporedjem, torej s strukturami na pomožnem mestu. Na voljo sta dve mejni možnosti: strukture se popolnoma razvijejo in tako maksimalno povečajo dostopnost ribosomu ali pa ostanjo zvite in se jim ribosom preko konformacijskih sprememb popolnoma prilagodi. Izkaže se, da gre za kompromis med obema procesoma. Po predlaganem modelu ribosom selektivno in delno razvije modul pomožnega mesta tako, da je spremebna Gibbsove proste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto) minimalna.

Obema procesoma lahko pripišemo energijski parameter. Z ∆Gprilagoditev (> 0) okarakteriziramo tisto spremembo Gibbsove proste energije, ki je potrebna za konformacijsko prilagoditev ribosomske podenote manj dostopnemu modulu na pomožnem mestu. Količina je neposredno povezana z A<dub>s in jo opisuje enačba ∆Gprilagoditev = C1(As)2 + C2(As) + C3. Velja, da večja kot je As (dostopnejši modul), manjša je ∆Gprilagoditev. Z ∆Grazvijanje (> 0) pa opišemo spremembo Gibbsove proste energije, ki se zgodi ob razvitju sekundarnih struktur modula. Za maksimalno dostopen modul velja: ∆Gprilagoditev = 0 in ∆Grazvijanje = 0. Energijska parametra obravnavamo kot prispevka k spremembi Gibbsove proste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje) in sta medsebojno odvisna. Pri manj dostopnih modulih bo tako razvitje sekundarnih struktur, za katerega je potreben vložek energije, ∆Grazvijanje, povečalo eno-verižno dostopno površino modula (As), kar bo povzorčilo večjo dostopnost, zaradi česar bo ∆Gprilagoditev manjši. Z drugimi besedami, obsežnejše razvijanje sekundarnih struktur (večja ∆Grazvijanje) bo imelo za rezultat manjše konformacijsko prilagajanje ribosoma (manjša ∆Gprilagoditev) in obratno. Procesa razvijanja struktur in konformacijskega prilagajanja ribosoma se med seboj uravnata tako, da je vsota njunih energijskih prispevkov minimalna oziroma da je ∆Gpomožno mesto minimalna. To se v realnosti odraža tako, da ribosom sekundarno strukturo modula razvije le do določene mere in se ji nato konformacijsko prilagodi.

Teorijo so preverili tudi eksperimentalno, in sicer na sintetičnih 5'-UTR, ki so jim z upoštevanjem energijske minimizacije izračunali ∆Gpomožno mesto. Eksperimentalne vrednosti ∆Gpomožno mesto, izpeljane iz fluorescenc celic pri meritvah pretočne citometrije, so za določen 5'-UTR sovpadale s predvidenimi vrednostmi ∆Gpomožno mesto. To potrjuje mehanizem delnega in selektivnega razvijanja mRNA struktur ob vezavi ribosoma na pomožno mesto. V vseh testiranih primerih je model predvidel razvitje le 1-3 bp strukture modula, medtem ko se je ribosom preostalim velikim RNA-strukturam prilagodil.

===Več modulov na pomožnem mestu===

V primeru večih modulov na pomožnem mestu sta ob vezavi 30S ribosomske podenote dve možnosti: kooperativna in nekooperativna vezava. Če bi šlo za kooperativno vezavo, bi z naraščanjem števila modulov naraščala tudi As, kar bi pospešilo hitrost translacije. Glede na eksperimentalne podatke pa se izkaže, da se ob dodajanju števila modulov hitrost translacije ne spremeni. To priča o tem, da se 30S podenota ribosoma vedno veže le na izbrani modul - na tisti z najmanjšo ∆Gpomožno mesto. Meritve kažejo, da tudi, ko je izbrani modul zelo daleč navzgor od start-kodona, to ne vpliva na hitrost translacije. Tako mora obstajati mehanizem, ki omogoča premik podenote do oddaljenega start-kodona, kjer se sestavi 30S pre-iniciacijski kompleks. Podenota lahko čez vmesne sturkture difuzivno poskakuje (takrat bi bila hitrost iniciacije močno odvisna od razdalje med modulom in start-kodonom, manj pa od vmesnih sekundarnih struktur) ali pa drsi (takrat pa bi, zaradi stalnega kontakta, hitrost iniciacije zavisela predvsem od narave vmesnih mRNA struktur). Ker položaj modula in zato tudi razdalja od start-kodona ne vplivata na hitrost translacije, gre za mehanizem drsenja. Ob tem definiramo spremembo Gibbsove proste energije za drsenje 30S ribosomske podenote čez vmesne sekundarne strukture mRNA (∆Gdrsenje > 0), ki je posledica oviranja ribosoma na njegovi poti. ∆Gdrsenje tudi dobro sovpada z razliko med eksperimentalno določeno in predvideno vrednostjo ∆Gpomožno mesto, ki je do sedaj upoštevala le prispevke razvijanja mRNA in konformacijskega prilagajanja ribosoma. ∆Gdrsenje dobimo tako, da seštevek višin (H) vseh vmesnih mRNA-lasnic pomnožimo s koeficientom 0,2 kcal/mol/nt.

===Zaključek===

Ob upoštevanju vseh obravnavanih energijskih prispevkov za vezanje ribosoma na pomožno mesto 5'-UTR dobimo biofizikalni model, ki ga opisuje enačba: ∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje + ∆Gdrsenje in ki zelo dobro napove hitrost translacije.

Model so aplicirali na celoten genom (3430 5'-UTR-jev iz ''E. coli'' MG1655), kjer so za vsak modul izračunali ∆Gpomožno mesto. Odkrili so, da celotna dolžina 5'-UTR ne vpliva na hitrost translacije. Daljši 5'-UTR so, v primerjavi s krajšimi, bolj strukturirani, kar naredi mRNA slabše dostopno ribosomu, vendar to vseeno ne povzroči večje represije iniciacije translacije.

Sekundarne strukture daljših 5'-UTR so pogosto tarče tako translacijskih represorjev kot translacijskih aktivatorjev. Gre za ''trans''- (RNA-vezavni proteini in male RNA), ki se vežejo na 5'-UTR, in ''cis''-elemente (RNA-stikala), ki povzročajo spremembe v aktivnosti preko vezave malih ligandov.

Dodaten nivo regulacije hitrosti translacije na celotnem genomu so operoni z večimi promotorji. Pri teh nastane več izooblik 5'-UTR, ki se razlikujejo po hitrosti translacije. Izbira promotorja je regulacija na transkripcijski ravni, za karakterizacijo česar so potrebne še dodatne raziskave.

===Literatura===

[1] A. E. Borujeni, A. S. Channarasappa, in H. M. Salis, „Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility , selective RNA unfolding and sliding at upstream standby sites“, Nucleic Acids Res., let. 42, št. 4, str. 2646–2659, 2014.

[2] C. O. Gualerzi in C. L. Pon, „Initiation of mRNA translation in bacteria: structural and dynamic aspects“, Cell. Mol. Life Sci., let. 72, št. 22, str. 4341–4367, 2015.

[3] G. Z. Yusupova, M. M. Yusupov, J. H. D. Cate, in H. F. Noller, „The path of messenger RNA through the ribosome“, Cell, let. 106, str. 233–241, 2001.

[4] M. de Smit in J. van Duin, „Control of translation by mRNA secondary structure in Escherichia coli. A quantitative analysis of literature data“, J. Mol. Biol., let. 244, št. 2, str. 144–150, 1994.

[5] H. Salis, E. Mirsky, in C. Voight, „Automated design of synthetic ribosome binding sires to control protein expression“, Nat Biotechnol, let. 27, št. 10, str. 946–950, 2010.

[6] S. M. Studer in S. Joseph, „Unfolding of mRNA secondary structure by the bacterial translation initiation complex“, Mol. Cell, let. 22, št. 1, str. 105–115, 2006.

===Dodatek - legenda===

- ∆G30S-mRNA ...celokupna sprememba Gibbsove proste energije za vezavo 30S podenote ribosoma na 5'-UTR mRNA,

- ∆GmRNA ...sprememba Gibbsove proste energije za zvitje mRNA v začetno stanje (pred vezavo 30S ribosomske podenote),

- ∆GmRNA-rRNA ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med SD-zaporedjem na mRNA in anti-SD-zaporedjem na 16S rRNA,

- ∆Gvmesnik ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S ribosomske podenote na 5'-UTR z neugodno dolžino vmesnika (zaporedje med SD-zaporedjem in start-kodonom),

- ∆Gstart ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med start-kodonom na mRNA in anti-kodonom na fMet-tRNA,

- ∆Gpomožno mesto ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S podenote ribosoma na pomožno mesto,

- ∆Gprilagoditev ...sprememba Gibbsove proste energije ob konformacijskem prilagajanju 30S podenote ribosoma sekundarnim strukturam modula na pomožnem mestu 5'-UTR,

- ∆Grazvijanje ...sprememba Gibbsove proste energije ob razvijanju modula pomožnega mesta 5'-UTR,

- ∆Gdrsenje ...sprememba Gibbsove proste energije ob drsenju 30S ribosomske podenote čez sekundarne strukture mRNA med izbranim modulom in start-kodonom,

- r ...hitrost translacije,

- β ...navidezna Boltzmannova konstanta (0,45 mol/kcal),

- F ...intenziteta fluorescence,

- Fref ...referenčna intenziteta fluorescence,

- H ...višina lasnice,

- D ...dolžina distalnega vezavnega mesta,

- P ...dolžina proksimalnegla vezavnega mesta,

- As ...eno-verižna površina modula pomožnega mesta,

- C1, C2 in C3 ...računalniško prilegani parametri vrednosti 0,038 kcal/mol/nt2, - 1,629 kcal/mol/nt in 17,359 kcal/mol.

Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah

2018-12-10T15:57:35Z

Neža Koritnik:

Povzeto po raziskovalnem članku ''”Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility, selective RNA unfoldnig and sliding at upstream standby sites”'' (2014) [[1]][https://academic.oup.com/nar/article/42/4/2646/2435298].

===Uvod===

Iniciacija translacije mRNA je pomembna točka regulacije sinteze proteinov. Pri prokariontih je to ponavadi najpočasnejša stopnja sinteze proteinov (od nje zavisi celokupna hitrost translacije), zato je podvržena različnim post-transkripcijskim mehanizmom uravnavanja izražanja genov [2].

Bakterijska iniciacija translacije se začne z nastankom 30S pre-iniciacijskega kompleksa. Ob asistenci treh iniciacijskih faktorjev (IF1-3) se 30S podenota ribosoma veže na mRNA, na start-kodon pa se rekrutira aminoacil-tRNA, ki prinese prvo aminokislino (fMet). 30S pre-iniciacijskemu komplesu se nato pridruži še 50S podenota ribosoma in tako nastane 70S iniciacijki kompleks, ki omogoči pričetek translacije [2].

Kontrola iniciacije translacije pri prokariontih je pogosto pogojena z interakcijami med 30S ribosomsko podenoto in 5'-UTR mRNA. Na hitrost translacije mRNA tako lahko vplivajo spremembe v zaporedju in sekundarni strukturi 5'-UTR. Na 5'-UTR se nahaja Shine-Dalgarnovo (SD) zaporedje, ki je definirano kot vezavno mesto za ribosom pri prokariontih. Sledi nekaj baznih parov dolg vmesnik in start-kodon. Vsi ti elementi sodelujejo pri regulaciji iniciacije tranlacije, ki je odvisna tako od SD-zaporeja (ki je konsenzno zaporedje in se med različnimi mRNA lahko razlikuje), dolžine vmesnika in tipa start-kodona (poleg AUG so možni še alternativni start-kodoni, t.j. GUG, UUG, AUU, AUC in AUA [2]). Veliko 5'-UTR-jev vsebuje še zaporedja navzgor od SD-zaporedja. Ta zaporedja lahko vsebujejo različne sekundarne strukture in tvorijo nespecifične elektrostatske interakcije s pozititivno nabitim delom površine 30S ribosomske podenote. Govorimo o pomožnem mestu (ang. ''“standby site”'') 5'-UTR.

Pomožno mesto je sestavljeno iz enega ali več modulov. Modul pomožnega mesta je vsaka posamezna sekundarna struktura mRNA, ponavadi pa gre za različno strukturirane lasnice. Raziskave kažejo [3], da ob sestavljanju 30S pre-iniciacijskega kompleksa na začetku pride do vezave 30S podenote ribosoma na pomožno mesto, kateri najprej sledi insercija mRNA skozi vhodni kanal podenote in nato komplementarno parjenje baz SD-zaporedja na mRNA in anti-SD-zaporedja na 16S rRNA, kar omogoči orientacijo start-kodona na P-mesto, kamor se tedaj rekrutira fMet-tRNA.

Za proces sestavljanja 30S pre-iniciacijskega kompleksa lahko izračunamo spremembo Gibbsove proste energije (∆G30S-mRNA), ki je neposredno povezana s hitrostjo translacije: r ∝ ''exp''(-β∆G30S-mRNA). ∆G30S-mRNA upošteva vse zgoraj navedene procese, torej prispevek parjenja baz SD- in anti-SD-zaporedja (∆GmRNA-rRNA < 0), prispevek morebitne neugodne dolžine vmesnika (∆Gvmesnik > 0), prispevek hibridizacije start-kodona in anti-kodona na fMet-tRNA (∆Gstart < 0), prispevek vezave na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto > 0) ter energijo zvitja mRNA v začetno stanje (∆GmRNA < 0). Celokupna Gibbsova prosta energija je tako: ∆G30S-mRNA = ∆GmRNA-rRNA + ∆Gvmesnik + ∆Gstart + ∆Gpomožno mesto - ∆GmRNA.

Vsi prispevki, razen ∆Gpomožno mesto, so bili predhodno že dobro okarakterizirani. Obravnavana raziskava se na podlagi strukturnih lastnosti pomožnega mesta 5'-UTR osredotoča na določitev ∆Gpomožno mesto, katero poveže s hitrostjo translacije.

===Potek eksperimenta===

V eksperimentu so zasnovali 136 sintetičnih 5'-UTR-jev mRNA, ki so bili sestavljeni iz različnih pomožnih mest, zaporedja navzdol pa so bila enaka (SD-zaporedje, vmesnik in start-kodon - AUG). Načrtane 5'-UTR so z metodami tehnologije rekombinantne DNA uporabili pri sestavitvi DNA-konstrukta, ki je vseboval ustrezen 5'-UTR, za start-kodonom pa zapis za reporterski protein - monomerni rdeči fluorescenčni protein 1 (mRFP1). DNA-konstrukte so vstavili v ekspresijski vektor pFTV1, ki je imel zapis za konstitutivni promor σ70 in s katerim so transformirali kompetente celice ''E. coli'' DH10B. Količino nastalega reporterskega proteina so določili z meritvami pretočne citometrije, pogoji gojenja celic pa so bili zasnovani tako, da je bila fluorescenca mRFP1 sorazmerna hitrosti (iniciacije) translacije, ta pa je sorazmerna ∆G30S-mRNA in zato ∆Gpomožno mesto: ∆Gpomožno mesto = -1/β ln(F/Fref) - (∆∆Gostali prispevki).

===Površina modula pomožnega mesta v povezavi s hitrostjo translacije===

Pri vezavi ribosoma na 5'-UTR je strukturiranost modula pomožnega mesta eden ključnih dejavnikov, ki modulirajo sposobnost vezave ribosoma na mRNA. Modul pomožnega mesta opišemo s tremi strukturnimi parametri:

- H (višina lasnice oziroma število nukleotidov od vznožja lasnice do sredine vrhnje zanke),

- D (dolžina distalnega vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzgor od lasnice),

- P (dolžina proksimalnegla vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzdol od lasnice).

Parametri so povezani z eno-verižno površino modula (As), ki jo definira enačba: As = 15 + P + D - H. As je tista površina, ki je dostopna ribosomu. Tako velja: večja kot je As, lažja je vezava 30S ribosomske podenote na modul. ∆Gpomožno mesto je torej manjša, ko je As večja (ko sta parametra D in P večja ter parameter H manjši), in obratno. V primeru maksimalno dostopnega modula (t.j. modul brez sekundarnih struktur) velja ∆Gpomožno mesto = 0.

Navedeno so potrdile meritve pretočne citometrije, ki so jih so izvedli na celicah transformiranih s konstrukti, ki so na pomožnem mestu 5'-UTR vsebovale en sam modul. Intenzitete fluorescence mRFP1 so se v odvisnosti od strukturiranosti modula oziroma v odvisnosti od As razlikovale. Modul z večjo As je imel večjo fluorescenco kot modul z manjšo As, saj je bil ribosomu dostopnejši, zaradi česar je bila vezava njegove 30S podenote energijsko ugodnejša (manjša ∆Gpomožno mesto), translacija pa hitrejša.

===Energijski kompromis med dostopnostjo in razvijanjem struktur modulov pomožnega mesta===

Znano je, da se nekatere mRNA-strukture, ki omejujejo vezavo ribosoma na SD-mesto, pred iniciacijo translacije razvijejo, kar zahteva energijski vložek in posledično zmanjšanje hitrosti iniciacije [4]–[6]. Manj pa je znanega o tem, kaj se zgodi s strukturami pred SD-zaporedjem, torej s strukturami na pomožnem mestu. Na voljo sta dve mejni možnosti: strukture se popolnoma razvijejo in tako maksimalno povečajo dostopnost ribosomu ali pa ostanjo zvite in se jim ribosom preko konformacijskih sprememb popolnoma prilagodi. Izkaže se, da gre za kompromis med obema procesoma. Po predlaganem modelu ribosom selektivno in delno razvije modul pomožnega mesta tako, da je spremebna Gibbsove proste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto) minimalna.

Obema procesoma lahko pripišemo energijski parameter. Z ∆Gprilagoditev (> 0) okarakteriziramo tisto spremembo Gibbsove proste energije, ki je potrebna za konformacijsko prilagoditev ribosomske podenote manj dostopnemu modulu na pomožnem mestu. Količina je neposredno povezana z A<dub>s in jo opisuje enačba ∆Gprilagoditev = C1(As)2 + C2(As) + C3. Velja, da večja kot je As (dostopnejši modul), manjša je ∆Gprilagoditev. Z ∆Grazvijanje (> 0) pa opišemo spremembo Gibbsove proste energije, ki se zgodi ob razvitju sekundarnih struktur modula. Za maksimalno dostopen modul velja: ∆Gprilagoditev = 0 in ∆Grazvijanje = 0. Energijska parametra obravnavamo kot prispevka k spremembi Gibbsove proste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje) in sta medsebojno odvisna. Pri manj dostopnih modulih bo tako razvitje sekundarnih struktur, za katerega je potreben vložek energije, ∆Grazvijanje, povečalo eno-verižno dostopno površino modula (As), kar bo povzorčilo večjo dostopnost, zaradi česar bo ∆Gprilagoditev manjši. Z drugimi besedami, obsežnejše razvijanje sekundarnih struktur (večja ∆Grazvijanje) bo imelo za rezultat manjše konformacijsko prilagajanje ribosoma (manjša ∆Gprilagoditev) in obratno. Procesa razvijanja struktur in konformacijskega prilagajanja ribosoma se med seboj uravnata tako, da je vsota njunih energijskih prispevkov minimalna oziroma da je ∆Gpomožno mesto minimalna. To se v realnosti odraža tako, da ribosom sekundarno strukturo modula razvije le do določene mere in se ji nato konformacijsko prilagodi.

Teorijo so preverili tudi eksperimentalno, in sicer na sintetičnih 5'-UTR, ki so jim z upoštevanjem energijske minimizacije izračunali ∆Gpomožno mesto. Eksperimentalne vrednosti ∆Gpomožno mesto, izpeljane iz fluorescenc celic pri meritvah pretočne citometrije, so za določen 5'-UTR sovpadale s predvidenimi vrednostmi ∆Gpomožno mesto. To potrjuje mehanizem delnega in selektivnega razvijanja mRNA struktur ob vezavi ribosoma na pomožno mesto. V vseh testiranih primerih je model predvidel razvitje le 1-3 bp strukture modula, medtem ko se je ribosom preostalim velikim RNA-strukturam prilagodil.

===Več modulov na pomožnem mestu===

V primeru večih modulov na pomožnem mestu sta ob vezavi 30S ribosomske podenote dve možnosti: kooperativna in nekooperativna vezava. Če bi šlo za kooperativno vezavo, bi z naraščanjem števila modulov naraščala tudi As, kar bi pospešilo hitrost translacije. Glede na eksperimentalne podatke pa se izkaže, da se ob dodajanju števila modulov hitrost translacije ne spremeni. To priča o tem, da se 30S podenota ribosoma vedno veže le na izbrani modul - na tisti z najmanjšo ∆Gpomožno mesto. Meritve kažejo, da tudi, ko je izbrani modul zelo daleč navzgor od start-kodona, to ne vpliva na hitrost translacije. Tako mora obstajati mehanizem, ki omogoča premik podenote do oddaljenega start-kodona, kjer se sestavi 30S pre-iniciacijski kompleks. Podenota lahko čez vmesne sturkture difuzivno poskakuje (takrat bi bila hitrost iniciacije močno odvisna od razdalje med modulom in start-kodonom, manj pa od vmesnih sekundarnih struktur) ali pa drsi (takrat pa bi, zaradi stalnega kontakta, hitrost iniciacije zavisela predvsem od narave vmesnih mRNA struktur). Ker položaj modula in zato tudi razdalja od start-kodona ne vplivata na hitrost translacije, gre za mehanizem drsenja. Ob tem definiramo spremembo Gibbsove proste energije za drsenje 30S ribosomske podenote čez vmesne sekundarne strukture mRNA (∆Gdrsenje > 0), ki je posledica oviranja ribosoma na njegovi poti. ∆Gdrsenje tudi dobro sovpada z razliko med eksperimentalno določeno in predvideno vrednostjo ∆Gpomožno mesto, ki je do sedaj upoštevala le prispevke razvijanja mRNA in konformacijskega prilagajanja ribosoma. ∆Gdrsenje dobimo tako, da seštevek višin (H) vseh vmesnih mRNA-lasnic pomnožimo s koeficientom 0,2 kcal/mol/nt.

===Zaključek===

Ob upoštevanju vseh obravnavanih energijskih prispevkov za vezanje ribosoma na pomožno mesto 5'-UTR dobimo biofizikalni model, ki ga opisuje enačba: ∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje + ∆Gdrsenje in ki zelo dobro napove hitrost translacije.

Model so aplicirali na celoten genom (3430 5'-UTR-jev iz ''E. coli'' MG1655), kjer so za vsak modul izračunali ∆Gpomožno mesto. Odkrili so, da celotna dolžina 5'-UTR ne vpliva na hitrost translacije. Daljši 5'-UTR so, v primerjavi s krajšimi, bolj strukturirani, kar naredi mRNA slabše dostopno ribosomu, vendar to vseeno ne povzroči večje represije iniciacije translacije.

Sekundarne strukture daljših 5'-UTR so pogosto tarče tako transkripcijskih represorjev kot transkripcijsih aktivatorjev. Gre za ''trans''- (RNA-vezavni proteini in male RNA), ki se vežejo na 5'-UTR, in ''cis''-elemente (RNA-stikala), ki povzročajo spremembe v aktivnosti preko vezave malih ligandov.

Dodaten nivo regulacije hitrosti translacije na celotnem genomu so operoni z večimi promotorji. Pri teh nastane več izooblik 5'-UTR, ki se razlikujejo po hitrosti translacije. Izbira promotorja je regulacija na transkripcijski ravni, za karakterizacijo česar so potrebne še dodatne raziskave.

===Literatura===

[1] A. E. Borujeni, A. S. Channarasappa, in H. M. Salis, „Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility , selective RNA unfolding and sliding at upstream standby sites“, Nucleic Acids Res., let. 42, št. 4, str. 2646–2659, 2014.

[2] C. O. Gualerzi in C. L. Pon, „Initiation of mRNA translation in bacteria: structural and dynamic aspects“, Cell. Mol. Life Sci., let. 72, št. 22, str. 4341–4367, 2015.

[3] G. Z. Yusupova, M. M. Yusupov, J. H. D. Cate, in H. F. Noller, „The path of messenger RNA through the ribosome“, Cell, let. 106, str. 233–241, 2001.

[4] M. de Smit in J. van Duin, „Control of translation by mRNA secondary structure in Escherichia coli. A quantitative analysis of literature data“, J. Mol. Biol., let. 244, št. 2, str. 144–150, 1994.

[5] H. Salis, E. Mirsky, in C. Voight, „Automated design of synthetic ribosome binding sires to control protein expression“, Nat Biotechnol, let. 27, št. 10, str. 946–950, 2010.

[6] S. M. Studer in S. Joseph, „Unfolding of mRNA secondary structure by the bacterial translation initiation complex“, Mol. Cell, let. 22, št. 1, str. 105–115, 2006.

===Dodatek - legenda===

- ∆G30S-mRNA ...celokupna sprememba Gibbsove proste energije za vezavo 30S podenote ribosoma na 5'-UTR mRNA,

- ∆GmRNA ...sprememba Gibbsove proste energije za zvitje mRNA v začetno stanje (pred vezavo 30S ribosomske podenote),

- ∆GmRNA-rRNA ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med SD-zaporedjem na mRNA in anti-SD-zaporedjem na 16S rRNA,

- ∆Gvmesnik ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S ribosomske podenote na 5'-UTR z neugodno dolžino vmesnika (zaporedje med SD-zaporedjem in start-kodonom),

- ∆Gstart ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med start-kodonom na mRNA in anti-kodonom na fMet-tRNA,

- ∆Gpomožno mesto ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S podenote ribosoma na pomožno mesto,

- ∆Gprilagoditev ...sprememba Gibbsove proste energije ob konformacijskem prilagajanju 30S podenote ribosoma sekundarnim strukturam modula na pomožnem mestu 5'-UTR,

- ∆Grazvijanje ...sprememba Gibbsove proste energije ob razvijanju modula pomožnega mesta 5'-UTR,

- ∆Gdrsenje ...sprememba Gibbsove proste energije ob drsenju 30S ribosomske podenote čez sekundarne strukture mRNA med izbranim modulom in start-kodonom,

- r ...hitrost translacije,

- β ...navidezna Boltzmannova konstanta (0,45 mol/kcal),

- F ...intenziteta fluorescence,

- Fref ...referenčna intenziteta fluorescence,

- H ...višina lasnice,

- D ...dolžina distalnega vezavnega mesta,

- P ...dolžina proksimalnegla vezavnega mesta,

- As ...eno-verižna površina modula pomožnega mesta,

- C1, C2 in C3 ...računalniško prilegani parametri vrednosti 0,038 kcal/mol/nt2, - 1,629 kcal/mol/nt in 17,359 kcal/mol.

Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah

2018-12-10T15:23:16Z

Neža Koritnik:

Povzeto po raziskovalnem članku ''”Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility, selective RNA unfoldnig and sliding at upstream standby sites”'' (2014) [[1]][https://academic.oup.com/nar/article/42/4/2646/2435298].

===Uvod===

Iniciacija translacije mRNA je pomembna točka regulacije sinteze proteinov. Pri prokariontih je to ponavadi najpočasnejša stopnja sinteze proteinov (od nje zavisi celokupna hitrost translacije), zato je podvržena različnim post-transkripcijskim mehanizmom uravnavanja izražanja genov [2].

Bakterijska iniciacija translacije se začne z nastankom 30S pre-iniciacijskega kompleksa. Ob asistenci treh iniciacijskih faktorjev (IF1-3) se 30S podenota ribosoma veže na mRNA, na start-kodon pa se rekrutira aminoacil-tRNA, ki prinese prvo aminokislino (fMet). 30S pre-iniciacijskemu komplesu se nato pridruži še 50S podenota ribosoma in tako nastane 70S iniciacijki kompleks, ki omogoči pričetek translacije [2].

Kontrola iniciacije translacije pri prokariontih je pogosto pogojena z interakcijami med 30S ribosomsko podenoto in 5'-UTR mRNA. Na hitrost translacije mRNA tako lahko vplivajo spremembe v zaporedju in sekundarni strukturi 5'-UTR. Na 5'-UTR se nahaja Shine-Dalgarnovo (SD) zaporedje, ki je definirano kot vezavno mesto za ribosom pri prokariontih. Sledi nekaj baznih parov dolg vmesnik in start-kodon. Vsi ti elementi sodelujejo pri regulaciji iniciacije tranlacije, ki je odvisna tako od SD-zaporeja (ki je konsenzno zaporedje in se med različnimi mRNA lahko razlikuje), dolžine vmesnika in tipa start-kodona (poleg AUG so možni še alternativni start-kodoni, t.j. GUG, UUG, AUU, AUC in AUA [2]). Veliko 5'-UTR-jev vsebuje še zaporedja navzgor od SD-zaporedja. Ta zaporedja lahko vsebujejo različne sekundarne strukture in tvorijo nespecifične elektrostatske interakcije s pozititivno nabitim delom površine 30S ribosomske podenote. Govorimo o pomožnem mestu (ang. ''“standby site”'') 5'-UTR.

Pomožno mesto je sestavljeno iz enega ali več modulov. Modul pomožnega mesta je vsaka posamezna sekundarna struktura mRNA, ponavadi pa gre za različno strukturirane lasnice. Raziskave kažejo [3], da ob sestavljanju 30S pre-iniciacijskega kompleksa na začetku pride do vezave 30S podenote ribosoma na pomožno mesto, kateri najprej sledi insercija mRNA skozi vhodni kanal podenote in nato komplementarno parjenje baz SD-zaporedja na mRNA in anti-SD-zaporedja na 16S rRNA, kar omogoči orientacijo start-kodona na P-mesto, kamor se tedaj rekrutira fMet-tRNA.

Za proces sestavljanja 30S pre-iniciacijskega kompleksa lahko izračunamo spremembo Gibbsove proste energije (∆G30S-mRNA), ki je neposredno povezana s hitrostjo translacije: r ∝ ''exp''(-β∆G30S-mRNA). ∆G30S-mRNA upošteva vse zgoraj navedene procese, torej prispevek parjenja baz SD- in anti-SD-zaporedja (∆GmRNA-rRNA < 0), prispevek morebitne neugodne dolžine vmesnika (∆Gvmesnik > 0), prispevek hibridizacije start-kodona in anti-kodona na fMet-tRNA (∆Gstart < 0), prispevek vezave na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto > 0) ter energijo zvitja mRNA v začetno stanje (∆GmRNA < 0). Celokupna Gibbsova prosta energija je tako: ∆G30S-mRNA = ∆GmRNA-rRNA + ∆Gvmesnik + ∆Gstart + ∆Gpomožno mesto - ∆GmRNA.

Vsi prispevki, razen ∆Gpomožno mesto, so bili predhodno že dobro okarakterizirani. Obravnavana raziskava se na podlagi strukturnih lastnosti pomožnega mesta 5'-UTR osredotoča na določitev ∆Gpomožno mesto, katero poveže s hitrostjo translacije.

===Potek eksperimenta===

V eksperimentu so zasnovali 136 sintetičnih 5'-UTR-jev mRNA, ki so bili sestavljeni iz različnih pomožnih mest, zaporedja navzdol pa so bila enaka (SD-zaporedje, vmesnik in start-kodon - AUG). Načrtane 5'-UTR so z metodami tehnologije rekombinantne DNA uporabili pri sestavitvi DNA-konstrukta, ki je vseboval ustrezen 5'-UTR, za start-kodonom pa zapis za reporterski protein - monomerni rdeči fluorescenčni protein 1 (mRFP1). DNA-konstrukte so vstavili v ekspresijski vektor pFTV1, ki je imel zapis za konstitutivni promor σ70 in s katerim so transformirali kompetente celice ''E. coli'' DH10B. Količino nastalega reporterskega proteina so določili z meritvami pretočne citometrije, pogoji gojenja celic pa so bili zasnovani tako, da je bila fluorescenca mRFP1 sorazmerna hitrosti (iniciacije) translacije, ta pa je sorazmerna ∆G30S-mRNA in zato ∆Gpomožno mesto: ∆Gpomožno mesto = -1/β ln(F/Fref) - (∆∆Gostali prispevki).

===Površina modula pomožnega mesta v povezavi s hitrostjo translacije===

Pri vezavi ribosoma na 5'-UTR je strukturiranost modula pomožnega mesta eden ključnih dejavnikov, ki modulirajo sposobnost vezave ribosoma na mRNA. Modul pomožnega mesta opišemo s tremi strukturnimi parametri:

- H (višina lasnice oziroma število nukleotidov od vznožja lasnice do sredine vrhnje zanke),

- D (dolžina distalnega vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzgor od lasnice),

- P (dolžina proksimalnegla vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzdol od lasnice).

Parametri so povezani z eno-verižno površino modula (As), ki jo definira enačba: As = 15 + P + D - H. As je tista površina, ki je dostopna ribosomu. Tako velja: večja kot je As, lažja je vezava 30S ribosomske podenote na modul. ∆Gpomožno mesto je torej manjša, ko je As večja (ko sta parametra D in P večja ter parameter H manjši), in obratno. V primeru maksimalno dostopnega modula (t.j. modul brez sekundarnih struktur) velja ∆Gpomožno mesto = 0.

Navedeno so potrdile meritve pretočne citometrije, ki so jih so izvedli na celicah transformiranih s konstrukti, ki so na pomožnem mestu 5'-UTR vsebovale en sam modul. Intenzitete fluorescence mRFP1 so se v odvisnosti od strukturiranosti modula oziroma v odvisnosti od As razlikovale. Modul z večjo As je imel večjo fluorescenco kot modul z manjšo As, saj je bil ribosomu dostopnejši, zaradi česar je bila vezava njegove 30S podenote energijsko ugodnejša (manjša ∆Gpomožno mesto), translacija pa hitrejša.

===Energijski kompromis med dostopnostjo in razvijanjem struktur modulov pomožnega mesta===

Znano je, da se nekatere mRNA-strukture, ki omejujejo vezavo ribosoma na SD-mesto, pred iniciacijo translacije razvijejo, kar zahteva energijski vložek in posledično zmanjšanje hitrosti iniciacije [4]–[6]. Manj pa je znanega o tem, kaj se zgodi s strukturami pred SD-zaporedjem, torej s strukturami na pomožnem mestu. Na voljo sta dve mejni možnosti: strukture se popolnoma razvijejo in tako maksimalno povečajo dostopnost ribosomu ali pa ostanjo zvite in se jim ribosom preko konformacijskih sprememb popolnoma prilagodi. Izkaže se, da gre za kompromis med obema procesoma. Po predlaganem modelu ribosom selektivno in delno razvije modul pomožnega mesta tako, da je spremebna Gibbsove proste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto) minimalna.

Obema procesoma lahko pripišemo energijski parameter. Z ∆Gprilagoditev (> 0) okarakteriziramo tisto spremembo Gibbsove proste energije, ki je potrebna za konformacijsko prilagoditev ribosomske podenote manj dostopnemu modulu na pomožnem mestu. Količina je neposredno povezana z A<dub>s in jo opisuje enačba ∆Gprilagoditev = C1(As)2 + C2(As) + C3. Velja, da večja kot je As (dostopnejši modul), manjša je ∆Gprilagoditev. Z ∆Grazvijanje (> 0) pa opišemo spremembo Gibbsove proste energije, ki se zgodi ob razvitju sekundarnih struktur modula. Za maksimalno dostopen modul velja: ∆Gprilagoditev = 0 in ∆Grazvijanje = 0. Energijska parametra obravnavamo kot prispevka k spremembi Gibbsove proste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje) in sta medsebojno odvisna. Pri manj dostopnih modulih bo tako razvitje sekundarnih struktur, za katerega je potreben vložek energije, ∆Grazvijanje, povečalo eno-verižno dostopno površino modula (As), kar bo povzorčilo večjo dostopnost, zaradi česar bo ∆Gprilagoditev manjši. Z drugimi besedami, obsežnejše razvijanje sekundarnih struktur (večja ∆Grazvijanje) bo imelo za rezultat manjše konformacijsko prilagajanje ribosoma (manjša ∆Gprilagoditev) in obratno. Procesa razvijanja struktur in konformacijskega prilagajanja ribosoma se med seboj uravnata tako, da je vsota njunih energijskih prispevkov minimalna oziroma da je ∆Gpomožno mesto minimalna. To se v realnosti odraža tako, da ribosom sekundarno strukturo modula razvije le do določene mere in se ji nato konformacijsko prilagodi.

Teorijo so preverili tudi eksperimentalno, in sicer na sintetičnih 5'-UTR, ki so jim z upoštevanjem energijske minimizacije izračunali ∆Gpomožno mesto. Eksperimentalne vrednosti ∆Gpomožno mesto, izpeljane iz fluorescenc celic pri meritvah pretočne citometrije, so za določen 5'-UTR sovpadale s predvidenimi vrednostmi ∆Gpomožno mesto. To potrjuje mehanizem delnega in selektivnega razvijanja mRNA struktur ob vezavi ribosoma na pomožno mesto. V vseh testiranih primerih je model predvidel razvitje le 1-3 bp strukture modula, medtem ko se je ribosom preostalim velikim RNA-strukturam prilagodil.

===Več modulov na pomožnem mestu===

V primeru večih modulov na pomožnem mestu sta ob vezavi 30S ribosomske podenote dve možnosti: kooperativna in nekooperativna vezava. Če bi šlo za kooperativno vezavo, bi z naraščanjem modulov naraščala tudi As, kar bi pospešilo hitrost translacije. Glede na eksperimentalne podatke pa se izkaže, da se ob dodajanju števila modulov hitrost translacije ne spremeni. To priča o tem, da se 30S podenota ribosoma vedno veže le na izbrani modul - na tisti z najmanjšo ∆Gpomožno mesto. Meritve kažejo, da tudi, ko je izbrani modul zelo daleč navzgor od start-kodona, to ne vpliva na hitrost translacije. Tako mora obstajati mehanizem, ki omogoča premik podenote do oddaljenega start-kodona, kjer se sestavi 30S pre-iniciacijski kompleks. Podenota lahko difuzivno poskakuje čez vmesne sturkture (takrat bi bila hitrost iniciacije močno odvisna od razdalje med modulom in start-kodonom, manj pa od vmesnih sekundarnih struktur) ali pa drsi (takrat pa bi, zaradi stalnega kontakta, hitrost iniciacije zavisela predvsm od narave vmesnih mRNA struktur). Ker položaj modula in zato tudi razdalja od start-kodona ne vplivata na hitrost translacije, gre za mehanizem drsenja. Ob tem definiramo spremembo Gibbsove proste energije za drsenje 30S ribosomske podenote čez vmesne sekundarne strukture mRNA (∆Gdrsenje > 0), ki je posledica oviranja ribosoma na njegovi poti. ∆Gdrsenje tudi dobro sovpada z razliko med izmerjeno in izračunano vrednostjo ∆Gpomožno mesto, ki je do sedaj upoštevala le prispevke razvijanja mRNA in konformacijskega prilagajanja ribosoma. ∆Gdrsenje dobimo tako, da seštevek višin (H) vseh vmesnih mRNA-lasnic pomnožimo s koeficientom 0,2 kcal/mol/nt.

===Zaključek===

Ob upoštevanju vseh obravnavanih energijskih prispevkov za vezanje ribosoma na pomožno mesto 5'-UTR dobimo biofizikalni model, ki ga opisuje enačba: ∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje + ∆Gdrsenje in ki zelo dobro napove hitrost translacije.

Model so aplicirali na celoten genom (3430 5'-UTR-jev iz ''E. coli'' MG1655), kjer so za vsak modul izračunali ∆Gpomožno mesto. Odkrili so, da celotna dolžina 5'-UTR ne vpliva na hitrost translacije. Daljši 5'-UTR so, v primerjavi s krajšimi, lahko bolj strukturirani, kar zmanjšuje dostopnost mRNA ribosomu, vendar to vseeno ne povzroči večje represije iniciacije translacije.

Sekundarne strukture daljših 5'-UTR so pogosto tarče tako transkripcijskih represorjev kot transkripcijsih aktivatorjev. Gre za trans- (RNA-vezavni proteini ali pa male RNA), ki se vežejo na 5'-UTR, in cis-elemente (RNA-stikala), ki povzročajo spremembe v aktivnosti preko vezave malih ligandov.

Dodaten nivo regulacije hitrosti translacije na celotnem genomu so operoni z več promotorji. Pri teh nastane več izooblik 5'-UTR, ki se razlikujejo po hitrosti translacije. Izbira promotorja je regulacija na transkripcijski ravni, za karakterizacijo česar so potrebne še dodatne raziskave.

===Literatura===

[1] A. E. Borujeni, A. S. Channarasappa, in H. M. Salis, „Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility , selective RNA unfolding and sliding at upstream standby sites“, Nucleic Acids Res., let. 42, št. 4, str. 2646–2659, 2014.

[2] C. O. Gualerzi in C. L. Pon, „Initiation of mRNA translation in bacteria: structural and dynamic aspects“, Cell. Mol. Life Sci., let. 72, št. 22, str. 4341–4367, 2015.

[3] G. Z. Yusupova, M. M. Yusupov, J. H. D. Cate, in H. F. Noller, „The path of messenger RNA through the ribosome“, Cell, let. 106, str. 233–241, 2001.

[4] M. de Smit in J. van Duin, „Control of translation by mRNA secondary structure in Escherichia coli. A quantitative analysis of literature data“, J. Mol. Biol., let. 244, št. 2, str. 144–150, 1994.

[5] H. Salis, E. Mirsky, in C. Voight, „Automated design of synthetic ribosome binding sires to control protein expression“, Nat Biotechnol, let. 27, št. 10, str. 946–950, 2010.

[6] S. M. Studer in S. Joseph, „Unfolding of mRNA secondary structure by the bacterial translation initiation complex“, Mol. Cell, let. 22, št. 1, str. 105–115, 2006.

===Dodatek - legenda===

- ∆G30S-mRNA ...celokupna sprememba Gibbsove proste energije za vezavo 30S podenote ribosoma na 5'-UTR mRNA,

- ∆GmRNA ...sprememba Gibbsove proste energije za zvitje mRNA v začetno stanje (pred vezavo 30S ribosomske podenote,

- ∆GmRNA-rRNA ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med SD-zaporedjem na mRNA in anti-SD-zaporedjem na 16S rRNA,

- ∆Gvmesnik ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S ribosomske podenote na 5'-UTR z neugdno dolžino vmesnika (zaporedje med SD-zaporedjem in start-kodonom),

- ∆Gstart ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med start-kodonom na mRNA in anti-kodonom na fMet-tRNA,

- ∆Gpomožno mesto ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S podenote ribosoma na pomožno mesto,

- ∆Gprilagoditev ...sprememba Gibbsove proste energije ob konformacijskegem prilagajanju 30S podenote ribosoma sekundarnim strukturam modula na pomožnem mestu 5'-UTR,

- ∆Grazvijanje ...sprememba Gibbsove proste energije ob razvijanju modula pomožnega mesta 5'-UTR,

- ∆Gdrsenje ...sprememba Gibbsove proste energije ob drsenju 30S ribosomske podenote čez sekundarne strukture mRNA med izbranim modulom in start-kodonom,

- r ...hitrost translacije,

- β ...navidezna Boltzmannova konstanta (0,45 mol/kcal),

- F ...intenziteta fluorescence

- Fref ...referenčna intenziteta fluorescence

- H ...višina lasnice

- D ...dolžina distalnega vezavnega mesta

- P ...dolžina proksimalnegla vezavnega mesta

- As ...eno-verižna površina modula pomžnega mesta

- C1, C2 in C3 ...računalniško prilegani parametri vrednosti 0,038 kcal/mol/nt2, - 1.629 kcal/mol/nt in 17.359 kcal/mol.

Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah

2018-12-09T18:13:33Z

Neža Koritnik:

Povzeto po raziskovalnem članku ''”Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility, selective RNA unfoldnig and sliding at upstream standby sites”'' (2014) [[1]][https://academic.oup.com/nar/article/42/4/2646/2435298].

===Uvod===

Iniciacija translacije mRNA je pomembna točka regulacije sinteze proteinov. Pri prokariontih je to ponavadi najpočasnejša stopnja sinteze proteinov (od nje zavisi celokupna hitrost translacije), zato je podvržena različnim post-transkripcijskim mehanizmom uravnavanja izražanja genov [2].

Bakterijska iniciacija translacije se začne z nastankom 30S pre-iniciacijskega kompleksa. Ob asistenci treh iniciacijskih faktorjev (IF1-3) se 30S podenota ribosoma veže na mRNA, na start-kodon pa se rekrutira aminoacil-tRNA, ki prinese prvo aminokislino (fMet). 30S pre-iniciacijskemu komplesu se nato pridruži še 50S podenota ribosoma in tako nastane 70S iniciacijki kompleks, ki omogoči pričetek translacije [2].

Kontrola iniciacije translacije pri prokariontih je pogosto pogojena z interakcijami med 30S ribosomsko podenoto in 5'-UTR mRNA. Na hitrost translacije mRNA tako lahko vplivajo spremembe v zaporedju in sekundarni strukturi 5'-UTR. Na 5'-UTR se nahaja Shine-Dalgarnovo (SD) zaporedje, ki je definirano kot vezavno mesto za ribosom pri prokariontih. Sledi nekaj baznih parov dolg vmesnik in start-kodon. Vsi ti elementi sodelujejo pri regulaciji iniciacije tranlacije, ki je odvisna tako od SD-zaporeja (ki je konsenzno zaporedje in se med različnimi mRNA lahko razlikuje), dolžine vmesnika in tipa start-kodona (poleg AUG so možni še alternativni start-kodoni, t.j. GUG, UUG, AUU, AUC in AUA [2]). Veliko 5'-UTR-jev vsebuje še zaporedja navzgor od SD-zaporedja. Ta zaporedja lahko vsebujejo različne sekundarne strukture in tvorijo nespecifične elektrostatske interakcije s pozititivno nabitim delom površine 30S ribosomske podenote. Govorimo o pomožnem mestu (ang. ''“standby site”'') 5'-UTR.

Pomožno mesto je sestavljeno iz enega ali več modulov. Modul pomožnega mesta je vsaka posamezna sekundarna struktura mRNA, ponavadi pa gre za različno strukturirane lasnice. Raziskave kažejo [3], da ob sestavljanju 30S pre-iniciacijskega kompleksa na začetku pride do vezave 30S podenote ribosoma na pomožno mesto, kateri najprej sledi insercija mRNA skozi vhodni kanal podenote in nato komplementarno parjenje baz SD-zaporedja na mRNA in anti-SD-zaporedja na 16S rRNA, kar omogoči orientacijo start-kodona na P-mesto, kamor se tedaj rekrutira fMet-tRNA.

Za proces sestavljanja 30S pre-iniciacijskega kompleksa lahko izračunamo spremembo Gibbsove proste energije (∆G30S-mRNA), ki je neposredno povezana s hitrostjo translacije: r ∝ ''exp''(-β∆G30S-mRNA). ∆G30S-mRNA upošteva vse zgoraj navedene procese, torej prispevek parjenja baz SD- in anti-SD-zaporedja (∆GmRNA-rRNA < 0), prispevek morebitne neugodne dolžine vmesnika (∆Gvmesnik > 0), prispevek hibridizacije start-kodona in anti-kodona na fMet-tRNA (∆Gstart < 0), prispevek vezave na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto > 0) ter energijo zvitja mRNA v začetno stanje (∆GmRNA < 0). Celokupna Gibbsova prosta energija je tako: ∆G30S-mRNA = ∆GmRNA-rRNA + ∆Gvmesnik + ∆Gstart + ∆Gpomožno mesto - ∆GmRNA.

Vsi prispevki, razen ∆Gpomožno mesto, so bili predhodno že dobro okarakterizirani. Obravnavana raziskava se na podlagi strukturnih lastnosti pomožnega mesta 5'-UTR osredotoča na določitev ∆Gpomožno mesto, katero poveže s hitrostjo translacije.

===Potek eksperimenta===

V eksperimentu so zasnovali 136 sintetičnih 5'-UTR-jev mRNA, ki so bili sestavljeni iz različnih pomožnih mest, zaporedja navzdol pa so bila enaka (SD-zaporedje, vmesnik in start-kodon - AUG). Načrtane 5'-UTR so z metodami tehnologije rekombinantne DNA uporabili pri sestavitvi DNA-konstrukta, ki je vseboval ustrezen 5'-UTR, za start-kodonom pa zapis za reporterski protein - monomerni rdeči fluorescenčni protein 1 (mRFP1). DNA-konstrukte so vstavili v ekspresijski vektor pFTV1, ki je imel zapis za konstitutivni promor σ70 in s katerim so transformirali kompetente celice ''E. coli'' DH10B. Količino nastalega reporterskega proteina so določili z meritvami pretočne citometrije, pogoji gojenja celic pa so bili zasnovani tako, da je bila fluorescenca mRFP1 proporcionalna hitrosti (iniciacije) translacije, ta pa je proporcionalna ∆G∆G30S-mRNA in tako ∆Gpomožno mesto: ∆Gpomožno mesto = -1/β ln(F/Fref) - (∆∆Gostali prispevki).

===Površina modula pomožnega mesta v povezavi s hitrostjo translacije===

Pri vezavi ribosoma na 5'-UTR je strukturiranost modula pomožnega mesta eden ključnih dejavnikov, ki modulirajo sposobnost vezave ribosoma na mRNA. Modul pomožnega mesta opišemo s tremi strukturnimi parametri:

- H (višina lasnice oziroma število nukleotidov od vznožja do sredine vrhnje zanke),

- D (dolžina distalnega vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzgor od lasnice),

- P (dolžina proksimalnegla vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzdol od lasnice).

Parametri so povezani z eno-verižno površino modula (As), ki jo definira enačba: As = 15 + P + D - H. As je tista površina, ki je dostopna ribosomu. Tako velja: večja kot je As, lažja je vezava 30S ribosomske podenote na modul. ∆Gpomožno mesto je torej manjša, ko je As večja (ko sta parametra D in P večja ter parameter H manjši), in obratno. V primeru maksimalno dostopnega modula (t.j. modul brez sekundarnih struktur) velja ∆Gpomožno mesto = 0.

Navedeno so potrdile meritve pretočne citometrije, ki so jih so izvedli na celicah transofrmiranih s konstrukti, ki so na pomožnem mestu 5'-UTR vsebovale en sam modul. Intenzitete fluorescence mRFP1 so se v odvisnosti od strukturiranosti modula oziroma v odvisnoti od As razlikovale. Modul z večjo As je imel večjo fluorescenco kot modul z manjšo As, saj je bil ribosomu dostopnejši, zaradi česar je bila vezava njegove 30S podenote energijsko ugodnejša (manjša ∆Gpomožno mesto), translacija pa hitrejša.

===Energijski kompromis med dostopnostjo in razvijanjem struktur modulov pomožnega mesta===

Znano je, da se nekatere mRNA-strukture, ki omejujejo vezavo ribosoma na SD-mesto, pred iniciacijo translacije razvijejo, kar zahteva energijski vložek in posledično zmanjšanje hitrosti iniciacije [4]–[6]. Manj pa je znanega o tem, kaj se zgodi s strukturami pred SD-zaporedjem, torej s strukturami na pomožnem mestu. Na voljo sta dve mejni možnosti: strukture se popolnoma razvijejo in tako maksimalno povečajo dostopnost ribosomu ali pa ostanjo zvite in se jim ribosom preko konformacijskih sprememb popolnoma prilagodi. Izkaže se, da gre za kompromis med obema procesoma. Po predlaganem modelu ribosom selektivno in delno razvije modul pomožnega mesta tako, da je spremebna Gibbsove protste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto) minimalna.

Obema procesoma lahko pripišemo energijski parameter. Z ∆Gprilagoditev (> 0) okarakteriziramo tisto spremembo Gibbsove proste energije, ki je potrebna za konformacijsko prilagoditev ribosomske podenote manj dostopnemu modulu na pomožnem mestu. Količina je neposredno povezana z As in jo opisuje enačba ∆Gprilagoditev = C1(As)2 + C2(As) + C3. Velja, da večja kot je As (dostopnejši modul), manjša je ∆Gprilagoditev. Z ∆Grazvijanje (> 0) pa opišemo spremembo Gibbsove proste energije, ki se zgodi ob razvitju sekundarnih struktur modula. Za maksimalno dostopen modul velja: ∆Gprilagoditev = 0 in ∆Grazvijanje = 0. Energijska parametra obravnavamo kot prispevka k spremembi Gibbsove proste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje) in sta medsebojno odvisna. Pri manj dostopnih modulih bo tako razvitje sekundarnih struktur, za katerega je potreben vložek energije, ∆Grazvijanje, povečalo eno-verižno dostopno površino modula (As), kar bo povzorčilo večjo dostopnost, zaradi česar bo ∆Gprilagoditev manjši. Z drugimi besedami, obsežnejše razvijanje sekundarnih struktur (večja ∆Grazvijanje) bo imelo za rezultat manjše konformacijsko prilagajanje ribosoma (manjša ∆Gprilagoditev) in obratno. Procesa razvijanja struktur in konformacijskega prilagajanja ribosoma se med seboj uravnata tako, da je vsota njunih energijskijh prispevkov minimalna oziroma da je ∆Gpomožno mesto minimalen. To se v realnosti odraža tako, da ribosom sekundarno strukturo modula razvije le do določene mere in se ji nato konformacijsko prilagodi.

Teorijo so preverili tudi eksperimentalno, in sicer na sintetičnih 5'-UTR, ki so jim z upoštevanjem energijske minimizacije izračunali ∆Gpomožno mesto. Eksperimentalne vrednosti ∆Gpomožno mesto, izpeljane iz fluorescenc celic pri meritvah pretočne citometrije, so za določen 5'-UTR sovpadale s predvidenimi vrednostmi ∆Gpomožno mesto. To potrjuje mehanizem delnega in selektivnega razvijanja mRNA struktur ob vezavi ribosoma na pomožno mesto. V vseh testiranih primerih je model predvidel razvitje le 1-3 bp strukture modula, medtem ko se je ribosom preostalim velikim RNA-strukturam prilagodil.

===Več modulov na pomožnem mestu===

V primeru večih modulov na pomožnem mestu sta ob vezavi 30S ribosomske podenote dve možnosti: kooperativna in nekooperativna vezava. Če bi šlo za kooperativno vezavo, bi z naraščanjem modulov naraščala tudi As, kar bi pospešilo hitrost translacije. Glede na eksperimentalne podatke pa se izkaže, da se ob dodajanju števila modulov hitrost translacije ne spremeni. To priča o tem, da se 30S podenota ribosoma vedno veže le na izbrani modul - na tisti z najmanjšo ∆Gpomožno mesto. Meritve kažejo, da tudi, ko je izbrani modul zelo daleč navzgor od start-kodona, to ne vpliva na hitrost translacije. Tako mora obstajati mehanizem, ki omogoča premik podenote do oddaljenega start-kodona, kjer se sestavi 30S pre-iniciacijski kompleks. Podenota lahko difuzivno poskakuje čez vmesne sturkture (takrat bi bila hitrost iniciacije močno odvisna od razdalje med modulom in start-kodonom, manj pa od vmesnih sekundarnih struktur) ali pa drsi (takrat pa bi, zaradi stalnega kontakta, hitrost iniciacije zavisela predvsm od narave vmesnih mRNA struktur). Ker položaj modula in zato tudi razdalja od start-kodona ne vplivata na hitrost translacije, gre za mehanizem drsenja. Ob tem definiramo spremembo Gibbsove proste energije za drsenje 30S ribosomske podenote čez vmesne sekundarne strukture mRNA (∆Gdrsenje > 0), ki je posledica oviranja ribosoma na njegovi poti. ∆Gdrsenje tudi dobro sovpada z razliko med izmerjeno in izračunano vrednostjo ∆Gpomožno mesto, ki je do sedaj upoštevala le prispevke razvijanja mRNA in konformacijskega prilagajanja ribosoma. ∆Gdrsenje dobimo tako, da seštevek višin (H) vseh vmesnih mRNA-lasnic pomnožimo s koeficientom 0,2 kcal/mol/nt.

===Zaključek===

Ob upoštevanju vseh obravnavanih energijskih prispevkov za vezanje ribosoma na pomožno mesto 5'-UTR dobimo biofizikalni model, ki ga opisuje enačba: ∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje + ∆Gdrsenje in ki zelo dobro napove hitrost translacije.

Model so aplicirali na celoten genom (3430 5'-UTR-jev iz ''E. coli'' MG1655), kjer so za vsak modul izračunali ∆Gpomožno mesto. Odkrili so, da celotna dolžina 5'-UTR ne vpliva na hitrost translacije. Daljši 5'-UTR so, v primerjavi s krajšimi, lahko bolj strukturirani, kar zmanjšuje dostopnost mRNA ribosomu, vendar to vseeno ne povzroči večje represije iniciacije translacije.

Sekundarne strukture daljših 5'-UTR so pogosto tarče tako transkripcijskih represorjev kot transkripcijsih aktivatorjev. Gre za trans- (RNA-vezavni proteini ali pa male RNA), ki se vežejo na 5'-UTR, in cis-elemente (RNA-stikala), ki povzročajo spremembe v aktivnosti preko vezave malih ligandov.

Dodaten nivo regulacije hitrosti translacije na celotnem genomu so operoni z več promotorji. Pri teh nastane več izooblik 5'-UTR, ki se razlikujejo po hitrosti translacije. Izbira promotorja je regulacija na transkripcijski ravni, za karakterizacijo česar so potrebne še dodatne raziskave.

===Literatura===

[1] A. E. Borujeni, A. S. Channarasappa, in H. M. Salis, „Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility , selective RNA unfolding and sliding at upstream standby sites“, Nucleic Acids Res., let. 42, št. 4, str. 2646–2659, 2014.

[2] C. O. Gualerzi in C. L. Pon, „Initiation of mRNA translation in bacteria: structural and dynamic aspects“, Cell. Mol. Life Sci., let. 72, št. 22, str. 4341–4367, 2015.

[3] G. Z. Yusupova, M. M. Yusupov, J. H. D. Cate, in H. F. Noller, „The path of messenger RNA through the ribosome“, Cell, let. 106, str. 233–241, 2001.

[4] M. de Smit in J. van Duin, „Control of translation by mRNA secondary structure in Escherichia coli. A quantitative analysis of literature data“, J. Mol. Biol., let. 244, št. 2, str. 144–150, 1994.

[5] H. Salis, E. Mirsky, in C. Voight, „Automated design of synthetic ribosome binding sires to control protein expression“, Nat Biotechnol, let. 27, št. 10, str. 946–950, 2010.

[6] S. M. Studer in S. Joseph, „Unfolding of mRNA secondary structure by the bacterial translation initiation complex“, Mol. Cell, let. 22, št. 1, str. 105–115, 2006.

===Dodatek - legenda===

- ∆G30S-mRNA ...celokupna sprememba Gibbsove proste energije za vezavo 30S podenote ribosoma na 5'-UTR mRNA,

- ∆GmRNA ...sprememba Gibbsove proste energije za zvitje mRNA v začetno stanje (pred vezavo 30S ribosomske podenote,

- ∆GmRNA-rRNA ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med SD-zaporedjem na mRNA in anti-SD-zaporedjem na 16S rRNA,

- ∆Gvmesnik ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S ribosomske podenote na 5'-UTR z neugdno dolžino vmesnika (zaporedje med SD-zaporedjem in start-kodonom),

- ∆Gstart ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med start-kodonom na mRNA in anti-kodonom na fMet-tRNA,

- ∆Gpomožno mesto ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S podenote ribosoma na pomožno mesto,

- ∆Gprilagoditev ...sprememba Gibbsove proste energije ob konformacijskegem prilagajanju 30S podenote ribosoma sekundarnim strukturam modula na pomožnem mestu 5'-UTR,

- ∆Grazvijanje ...sprememba Gibbsove proste energije ob razvijanju modula pomožnega mesta 5'-UTR,

- ∆Gdrsenje ...sprememba Gibbsove proste energije ob drsenju 30S ribosomske podenote čez sekundarne strukture mRNA med izbranim modulom in start-kodonom,

- r ...hitrost translacije,

- β ...navidezna Boltzmannova konstanta (0,45 mol/kcal),

- F ...intenziteta fluorescence

- Fref ...referenčna intenziteta fluorescence

- H ...višina lasnice

- D ...dolžina distalnega vezavnega mesta

- P ...dolžina proksimalnegla vezavnega mesta

- As ...eno-verižna površina modula pomžnega mesta

- C1, C2 in C3 ...računalniško prilegani parametri vrednosti 0,038 kcal/mol/nt2, - 1.629 kcal/mol/nt in 17.359 kcal/mol.

Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah

2018-12-09T18:02:15Z

Neža Koritnik:

Povzeto po raziskovalnem članku ''”Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility, selective RNA unfoldnig and sliding at upstream standby sites”'' (2014) [[1]][https://academic.oup.com/nar/article/42/4/2646/2435298].

=== Uvod ===

Iniciacija translacije mRNA je pomembna točka regulacije sinteze proteinov. Pri prokariontih je to ponavadi najpočasnejša stopnja sinteze proteinov (od nje zavisi celokupna hitrost translacije), zato je podvržena različnim post-transkripcijskim mehanizmom uravnavanja izražanja genov [2].

Bakterijska iniciacija translacije se začne z nastankom 30S pre-iniciacijskega kompleksa. Ob asistenci treh iniciacijskih faktorjev (IF1-3) se 30S podenota ribosoma veže na mRNA, na start-kodon pa se rekrutira aminoacil-tRNA, ki prinese prvo aminokislino (fMet). 30S pre-iniciacijskemu komplesu se nato pridruži še 50S podenota ribosoma in tako nastane 70S iniciacijki kompleks, ki omogoči pričetek translacije [2].

Kontrola iniciacije translacije pri prokariontih je pogosto pogojena z interakcijami med 30S ribosomsko podenoto in 5'-UTR mRNA. Na hitrost translacije mRNA tako lahko vplivajo spremembe v zaporedju in sekundarni strukturi 5'-UTR. Na 5'-UTR se nahaja Shine-Dalgarnovo (SD) zaporedje, ki je definirano kot vezavno mesto za ribosom pri prokariontih. Sledi nekaj baznih parov dolg vmesnik in start-kodon. Vsi ti elementi sodelujejo pri regulaciji iniciacije tranlacije, ki je odvisna tako od SD-zaporeja (ki je konsenzno zaporedje in se med različnimi mRNA lahko razlikuje), dolžine vmesnika in tipa start-kodona (poleg AUG so možni še alternativni start-kodoni, t.j. GUG, UUG, AUU, AUC in AUA [2]). Veliko 5'-UTR-jev vsebuje še zaporedja navzgor od SD-zaporedja. Ta zaporedja lahko vsebujejo različne sekundarne strukture in tvorijo nespecifične elektrostatske interakcije s pozititivno nabitim delom površine 30S ribosomske podenote. Govorimo o pomožnem mestu (ang. ''“standby site”'') 5'-UTR.

Pomožno mesto je sestavljeno iz enega ali več modulov. Modul pomožnega mesta je vsaka posamezna sekundarna struktura mRNA, ponavadi pa gre za različno strukturirane lasnice. Raziskave kažejo [3], da ob sestavljanju 30S pre-iniciacijskega kompleksa na začetku pride do vezave 30S podenote ribosoma na pomožno mesto, kateri najprej sledi insercija mRNA skozi vhodni kanal podenote in nato komplementarno parjenje baz SD-zaporedja na mRNA in anti-SD-zaporedja na 16S rRNA, kar omogoči orientacijo start-kodona na P-mesto, kamor se tedaj rekrutira fMet-tRNA.

Za proces sestavljanja 30S pre-iniciacijskega kompleksa lahko izračunamo spremembo Gibbsove proste energije (∆G30S-mRNA), ki je neposredno povezana s hitrostjo translacije: r ∝ ''exp''(-β∆G30S-mRNA). ∆G30S-mRNA upošteva vse zgoraj navedene procese, torej prispevek parjenja baz SD- in anti-SD-zaporedja (∆GmRNA-rRNA < 0), prispevek morebitne neugodne dolžine vmesnika (∆Gvmesnik > 0), prispevek hibridizacije start-kodona in anti-kodona na fMet-tRNA (∆Gstart < 0), prispevek vezave na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto > 0) ter energijo zvitja mRNA v začetno stanje (∆GmRNA < 0). Celokupna Gibbsova prosta energija je tako: ∆G30S-mRNA = ∆GmRNA-rRNA + ∆Gvmesnik + ∆Gstart + ∆Gpomožno mesto - ∆GmRNA.

Vsi prispevki, razen ∆Gpomožno mesto, so bili predhodno že dobro okarakterizirani. Obravnavana raziskava se na podlagi strukturnih lastnosti pomožnega mesta 5'-UTR osredotoča na določitev ∆Gpomožno mesto, katero poveže s hitrostjo translacije.

=== Potek eksperimenta ===

V eksperimentu so zasnovali 136 sintetičnih 5'-UTR-jev mRNA, ki so bili sestavljeni iz različnih pomožnih mest, zaporedja navzdol pa so bila enaka (SD-zaporedje, vmesnik in start-kodon - AUG). Načrtane 5'-UTR so z metodami tehnologije rekombinantne DNA uporabili pri sestavitvi DNA-konstrukta, ki je vseboval ustrezen 5'-UTR, za start-kodonom pa zapis za reporterski protein - monomerni rdeči fluorescenčni protein 1 (mRFP1). DNA-konstrukte so vstavili v ekspresijski vektor pFTV1, ki je imel zapis za konstitutivni promor σ70 in s katerim so transformirali kompetente celice ''E. coli'' DH10B. Količino nastalega reporterskega proteina so določili z meritvami pretočne citometrije, pogoji gojenja celic pa so bili zasnovani tako, da je bila fluorescenca mRFP1 proporcionalna hitrosti (iniciacije) translacije, ta pa je proporcionalna ∆G∆G30S-mRNA in tako ∆Gpomožno mesto: ∆Gpomožno mesto = -1/β ln(F/Fref) - (∆∆Gostali prispevki).

=== Površina modula pomožnega mesta v povezavi s hitrostjo translacije ===

Pri vezavi ribosoma na 5'-UTR je strukturiranost modula pomožnega mesta eden ključnih dejavnikov, ki modulirajo sposobnost vezave ribosoma na mRNA. Modul pomožnega mesta opišemo s tremi strukturnimi parametri:

- H (višina lasnice oziroma število nukleotidov od vznožja do sredine vrhnje zanke),

- D (dolžina distalnega vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzgor od lasnice),

- P (dolžina proksimalnegla vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzdol od lasnice).

Parametri so povezani z eno-verižno površino modula (As), ki jo definira enačba: As = 15 + P + D - H. As je tista površina, ki je dostopna ribosomu. Tako velja: večja kot je As, lažja je vezava 30S ribosomske podenote na modul. ∆Gpomožno mesto je torej manjša, ko je As večja (ko sta parametra D in P večja ter parameter H manjši), in obratno. V primeru maksimalno dostopnega modula (t.j. modul brez sekundarnih struktur) velja ∆Gpomožno mesto = 0.

Navedeno so potrdile meritve pretočne citometrije, ki so jih so izvedli na celicah transofrmiranih s konstrukti, ki so na pomožnem mestu 5'-UTR vsebovale en sam modul. Intenzitete fluorescence mRFP1 so se v odvisnosti od strukturiranosti modula oziroma v odvisnoti od As razlikovale. Modul z večjo As je imel večjo fluorescenco kot modul z manjšo As, saj je bil ribosomu dostopnejši, zaradi česar je bila vezava njegove 30S podenote energijsko ugodnejša (manjša ∆Gpomožno mesto), translacija pa hitrejša.

=== Energijski kompromis med dostopnostjo in razvijanjem struktur modulov pomožnega mesta ===

Znano je, da se nekatere mRNA-strukture, ki omejujejo vezavo ribosoma na SD-mesto, pred iniciacijo translacije razvijejo, kar zahteva energijski vložek in posledično zmanjšanje hitrosti iniciacije [4]–[6]. Manj pa je znanega o tem, kaj se zgodi s strukturami pred SD-zaporedjem, torej s strukturami na pomožnem mestu. Na voljo sta dve mejni možnosti: strukture se popolnoma razvijejo in tako maksimalno povečajo dostopnost ribosomu ali pa ostanjo zvite in se jim ribosom preko konformacijskih sprememb popolnoma prilagodi. Izkaže se, da gre za kompromis med obema procesoma. Po predlaganem modelu ribosom selektivno in delno razvije modul pomožnega mesta tako, da je spremebna Gibbsove protste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto) minimalna.

Obema procesoma lahko pripišemo energijski parameter. Z ∆Gprilagoditev (> 0) okarakteriziramo tisto spremembo Gibbsove proste energije, ki je potrebna za konformacijsko prilagoditev ribosomske podenote manj dostopnemu modulu na pomožnem mestu. Količina je neposredno povezana z As in jo opisuje enačba ∆Gprilagoditev = C1(As)2 + C2(As) + C3. Velja, da večja kot je As (dostopnejši modul), manjša je ∆Gprilagoditev. Z ∆Grazvijanje (> 0) pa opišemo spremembo Gibbsove proste energije, ki se zgodi ob razvitju sekundarnih struktur modula. Za maksimalno dostopen modul velja: ∆Gprilagoditev = 0 in ∆Grazvijanje = 0. Energijska parametra obravnavamo kot prispevka k spremembi Gibbsove proste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje) in sta medsebojno odvisna. Pri manj dostopnih modulih bo tako razvitje sekundarnih struktur, za katerega je potreben vložek energije, ∆Grazvijanje, povečalo eno-verižno dostopno površino modula (As), kar bo povzorčilo večjo dostopnost, zaradi česar bo ∆Gprilagoditev manjši. Z drugimi besedami, obsežnejše razvijanje sekundarnih struktur (večja ∆Grazvijanje) bo imelo za rezultat manjše konformacijsko prilagajanje ribosoma (manjša ∆Gprilagoditev) in obratno. Procesa razvijanja struktur in konformacijskega prilagajanja ribosoma se med seboj uravnata tako, da je vsota njunih energijskijh prispevkov minimalna oziroma da je ∆Gpomožno mesto minimalen. To se v realnosti odraža tako, da ribosom sekundarno strukturo modula razvije le do določene mere in se ji nato konformacijsko prilagodi.

Teorijo so preverili tudi eksperimentalno, in sicer na sintetičnih 5'-UTR, ki so jim z upoštevanjem energijske minimizacije izračunali ∆Gpomožno mesto. Eksperimentalne vrednosti ∆Gpomožno mesto, izpeljane iz fluorescenc celic pri meritvah pretočne citometrije, so za določen 5'-UTR sovpadale s predvidenimi vrednostmi ∆Gpomožno mesto. To potrjuje mehanizem delnega in selektivnega razvijanja mRNA struktur ob vezavi ribosoma na pomožno mesto. V vseh testiranih primerih je model predvidel razvitje le 1-3 bp strukture modula, medtem ko se je ribosom preostalim velikim RNA-strukturam prilagodil.

=== Več modulov na pomožnem mestu ===

V primeru večih modulov na pomožnem mestu sta ob vezavi 30S ribosomske podenote dve možnosti: kooperativna in nekooperativna vezava. Če bi šlo za kooperativno vezavo, bi z naraščanjem modulov naraščala tudi As, kar bi pospešilo hitrost translacije. Glede na eksperimentalne podatke pa se izkaže, da se ob dodajanju števila modulov hitrost translacije ne spremeni. To priča o tem, da se 30S podenota ribosoma vedno veže le na izbrani modul - na tisti z najmanjšo ∆Gpomožno mesto. Meritve kažejo, da tudi, ko je izbrani modul zelo daleč navzgor od start-kodona, to ne vpliva na hitrost translacije. Tako mora obstajati mehanizem, ki omogoča premik podenote do oddaljenega start-kodona, kjer se sestavi 30S pre-iniciacijski kompleks. Podenota lahko difuzivno poskakuje čez vmesne sturkture (takrat bi bila hitrost iniciacije močno odvisna od razdalje med modulom in start-kodonom, manj pa od vmesnih sekundarnih struktur) ali pa drsi (takrat pa bi, zaradi stalnega kontakta, hitrost iniciacije zavisela predvsm od narave vmesnih mRNA struktur). Ker položaj modula in zato tudi razdalja od start-kodona ne vplivata na hitrost translacije, gre za mehanizem drsenja. Ob tem definiramo spremembo Gibbsove proste energije za drsenje 30S ribosomske podenote čez vmesne sekundarne strukture mRNA (∆Gdrsenje > 0), ki je posledica oviranja ribosoma na njegovi poti. ∆Gdrsenje tudi dobro sovpada z razliko med izmerjeno in izračunano vrednostjo ∆Gpomožno mesto, ki je do sedaj upoštevala le prispevke razvijanja mRNA in konformacijskega prilagajanja ribosoma. ∆Gdrsenje dobimo tako, da seštevek višin (H) vseh vmesnih mRNA-lasnic pomnožimo s koeficientom 0,2 kcal/mol/nt.

=== Zaključek ===

Ob upoštevanju vseh obravnavanih energijskih prispevkov za vezanje ribosoma na pomožno mesto 5'-UTR dobimo biofizikalni model, ki ga opisuje enačba: ∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje + ∆Gdrsenje in ki zelo dobro napove hitrost translacije.

Model so aplicirali na celoten genom (3430 5'-UTR-jev iz ''E. coli'' MG1655), kjer so za vsak modul izračunali ∆Gpomožno mesto. Odkrili so, da celotna dolžina 5'-UTR ne vpliva na hitrost translacije. Daljši 5'-UTR so, v primerjavi s krajšimi, lahko bolj strukturirani, kar zmanjšuje dostopnost mRNA ribosomu, vendar to vseeno ne povzroči večje represije iniciacije translacije.

Sekundarne strukture daljših 5'-UTR so pogosto tarče tako transkripcijskih represorjev kot transkripcijsih aktivatorjev. Gre za trans- (RNA-vezavni proteini ali pa male RNA), ki se vežejo na 5'-UTR, in cis-elemente (RNA-stikala), ki povzročajo spremembe v aktivnosti preko vezave malih ligandov.

Dodaten nivo regulacije hitrosti translacije na celotnem genomu so operoni z več promotorji. Pri teh nastane več izooblik 5'-UTR, ki se razlikujejo po hitrosti translacije. Izbira promotorja je regulacija na transkripcijski ravni, za karakterizacijo česar so potrebne še dodatne raziskave.

===Literatura ===

[1] A. E. Borujeni, A. S. Channarasappa, in H. M. Salis, „Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility , selective RNA unfolding and sliding at upstream standby sites“, Nucleic Acids Res., let. 42, št. 4, str. 2646–2659, 2014.

[2] C. O. Gualerzi in C. L. Pon, „Initiation of mRNA translation in bacteria: structural and dynamic aspects“, Cell. Mol. Life Sci., let. 72, št. 22, str. 4341–4367, 2015.

[3] G. Z. Yusupova, M. M. Yusupov, J. H. D. Cate, in H. F. Noller, „The path of messenger RNA through the ribosome“, Cell, let. 106, str. 233–241, 2001.

[4] M. de Smit in J. van Duin, „Control of translation by mRNA secondary structure in Escherichia coli. A quantitative analysis of literature data“, J. Mol. Biol., let. 244, št. 2, str. 144–150, 1994.

[5] H. Salis, E. Mirsky, in C. Voight, „Automated design of synthetic ribosome binding sires to control protein expression“, Nat Biotechnol, let. 27, št. 10, str. 946–950, 2010.

[6] S. M. Studer in S. Joseph, „Unfolding of mRNA secondary structure by the bacterial translation initiation complex“, Mol. Cell, let. 22, št. 1, str. 105–115, 2006.

===Dodatek - legenda ===

- ∆G30S-mRNA ...celokupna sprememba Gibbsove proste energije za vezavo 30S podenote ribosoma na 5'-UTR mRNA,

- ∆GmRNA ...sprememba Gibbsove proste energije za zvitje mRNA v začetno stanje (pred vezavo 30S ribosomske podenote,

- ∆GmRNA-rRNA ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med SD-zaporedjem na mRNA in anti-SD-zaporedjem na 16S rRNA,

- ∆Gvmesnik ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S ribosomske podenote na 5'-UTR z neugdno dolžino vmesnika (zaporedje med SD-zaporedjem in start-kodonom),

- ∆Gstart ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med start-kodonom na mRNA in anti-kodonom na fMet-tRNA,

- ∆Gpomožno mesto ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S podenote ribosoma na pomožno mesto,

- ∆Gprilagoditev ...sprememba Gibbsove proste energije ob konformacijskegem prilagajanju 30S podenote ribosoma sekundarnim strukturam modula na pomožnem mestu 5'-UTR,

- ∆Grazvijanje ...sprememba Gibbsove proste energije ob razvijanju modula pomožnega mesta 5'-UTR,

- ∆Gdrsenje ...sprememba Gibbsove proste energije ob drsenju 30S ribosomske podenote čez sekundarne strukture mRNA med izbranim modulom in start-kodonom,

- r ...hitrost translacije,

- β ...navidezna Boltzmannova konstanta (0,45 mol/kcal),

- F ...intenziteta fluorescence

- Fref ...referenčna intenziteta fluorescence

- H ...višina lasnice

- D ...dolžina distalnega vezavnega mesta

- P ...dolžina proksimalnegla vezavnega mesta

- As ...eno-verižna površina modula pomžnega mesta

- C1, C2 in C3 ...računalniško prilegani parametri vrednosti 0,038 kcal/mol/nt2, - 1.629 kcal/mol/nt in 17.359 kcal/mol.

Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah

2018-12-09T17:59:33Z

Neža Koritnik:

Povzeto po raziskovalnem članku ''”Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility, selective RNA unfoldnig and sliding at upstream standby sites”'' (2014) [[1]][https://academic.oup.com/nar/article/42/4/2646/2435298].

=== Uvod ===

Iniciacija translacije mRNA je pomembna točka regulacije sinteze proteinov. Pri prokariontih je to ponavadi najpočasnejša stopnja sinteze proteinov (od nje zavisi celokupna hitrost translacije), zato je podvržena različnim post-transkripcijskim mehanizmom uravnavanja izražanja genov [2].

Bakterijska iniciacija translacije se začne z nastankom 30S pre-iniciacijskega kompleksa. Ob asistenci treh iniciacijskih faktorjev (IF1-3) se 30S podenota ribosoma veže na mRNA, na start-kodon pa se rekrutira aminoacil-tRNA, ki prinese prvo aminokislino (fMet). 30S pre-iniciacijskemu komplesu se nato pridruži še 50S podenota ribosoma in tako nastane 70S iniciacijki kompleks, ki omogoči pričetek translacije [2].

Kontrola iniciacije translacije pri prokariontih je pogosto pogojena z interakcijami med 30S ribosomsko podenoto in 5'-UTR mRNA. Na hitrost translacije mRNA tako lahko vplivajo spremembe v zaporedju in sekundarni strukturi 5'-UTR. Na 5'-UTR se nahaja Shine-Dalgarnovo (SD) zaporedje, ki je definirano kot vezavno mesto za ribosom pri prokariontih. Sledi nekaj baznih parov dolg vmesnik in start-kodon. Vsi ti elementi sodelujejo pri regulaciji iniciacije tranlacije, ki je odvisna tako od SD-zaporeja (ki je konsenzno zaporedje in se med različnimi mRNA lahko razlikuje), dolžine vmesnika in tipa start-kodona (poleg AUG so možni še alternativni start-kodoni, t.j. GUG, UUG, AUU, AUC in AUA [2]). Veliko 5'-UTR-jev vsebuje še zaporedja navzgor od SD-zaporedja. Ta zaporedja lahko vsebujejo različne sekundarne strukture in tvorijo nespecifične elektrostatske interakcije s pozititivno nabitim delom površine 30S ribosomske podenote. Govorimo o pomožnem mestu (ang. ''“standby site”'') 5'-UTR.

Pomožno mesto je sestavljeno iz enega ali več modulov. Modul pomožnega mesta je vsaka posamezna sekundarna struktura mRNA, ponavadi pa gre za različno strukturirane lasnice. Raziskave kažejo [3], da ob sestavljanju 30S pre-iniciacijskega kompleksa na začetku pride do vezave 30S podenote ribosoma na pomožno mesto, kateri najprej sledi insercija mRNA skozi vhodni kanal podenote in nato komplementarno parjenje baz SD-zaporedja na mRNA in anti-SD-zaporedja na 16S rRNA, kar omogoči orientacijo start-kodona na P-mesto, kamor se tedaj rekrutira fMet-tRNA.

Za proces sestavljanja 30S pre-iniciacijskega kompleksa lahko izračunamo spremembo Gibbsove proste energije (∆G30S-mRNA), ki je neposredno povezana s hitrostjo translacije: r ∝ ''exp''(-β∆G30S-mRNA). ∆G30S-mRNA upošteva vse zgoraj navedene procese, torej prispevek parjenja baz SD- in anti-SD-zaporedja (∆GmRNA-rRNA < 0), prispevek morebitne neugodne dolžine vmesnika (∆Gvmesnik > 0), prispevek hibridizacije start-kodona in anti-kodona na fMet-tRNA (∆Gstart < 0), prispevek vezave na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto > 0) ter energijo zvitja mRNA v začetno stanje (∆GmRNA < 0). Celokupna Gibbsova prosta energija je tako: ∆G30S-mRNA = ∆GmRNA-rRNA + ∆Gvmesnik + ∆Gstart + ∆Gpomožno mesto - ∆GmRNA.

Vsi prispevki, razen ∆Gpomožno mesto, so bili predhodno že dobro okarakterizirani. Obravnavana raziskava se na podlagi strukturnih lastnosti pomožnega mesta 5'-UTR osredotoča na določitev ∆Gpomožno mesto, katero poveže s hitrostjo translacije.

=== Potek eksperimenta ===

V eksperimentu so zasnovali 136 sintetičnih 5'-UTR-jev mRNA, ki so bili sestavljeni iz različnih pomožnih mest, zaporedja navzdol pa so bila enaka (SD-zaporedje, vmesnik in start-kodon - AUG). Načrtane 5'-UTR so z metodami tehnologije rekombinantne DNA uporabili pri sestavitvi DNA-konstrukta, ki je vseboval ustrezen 5'-UTR, za start-kodonom pa zapis za reporterski protein - monomerni rdeči fluorescenčni protein 1 (mRFP1). DNA-konstrukte so vstavili v ekspresijski vektor pFTV1, ki je imel zapis za konstitutivni promor σ70 in s katerim so transformirali kompetente celice ''E. coli'' DH10B. Količino nastalega reporterskega proteina so določili z meritvami pretočne citometrije, pogoji gojenja celic pa so bili zasnovani tako, da je bila fluorescenca mRFP1 proporcionalna hitrosti (iniciacije) translacije, ta pa je proporcionalna ∆G∆G30S-mRNA in tako ∆Gpomožno mesto: ∆Gpomožno mesto = -1/β ln(F/Fref) - (∆∆Gostali prispevki).

=== Površina modula pomožnega mesta v povezavi s hitrostjo translacije ===

Pri vezavi ribosoma na 5'-UTR je strukturiranost modula pomožnega mesta eden ključnih dejavnikov, ki modulirajo sposobnost vezave ribosoma na mRNA. Modul pomožnega mesta opišemo s tremi strukturnimi parametri:

- H (višina lasnice oziroma število nukleotidov od vznožja do sredine vrhnje zanke),

- D (dolžina distalnega vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzgor od lasnice),

- P (dolžina proksimalnegla vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzdol od lasnice).

Parametri so povezani z eno-verižno površino modula (As), ki jo definira enačba: As = 15 + P + D - H. As je tista površina, ki je dostopna ribosomu. Tako velja: večja kot je As, lažja je vezava 30S ribosomske podenote na modul. ∆Gpomožno mesto je torej manjša, ko je As večja (ko sta parametra D in P večja ter parameter H manjši), in obratno. V primeru maksimalno dostopnega modula (t.j. modul brez sekundarnih struktur) velja ∆Gpomožno mesto = 0.

Navedeno so potrdile meritve pretočne citometrije, ki so jih so izvedli na celicah transofrmiranih s konstrukti, ki so na pomožnem mestu 5'-UTR vsebovale en sam modul. Intenzitete fluorescence mRFP1 so se v odvisnosti od strukturiranosti modula oziroma v odvisnoti od As razlikovale. Modul z večjo As je imel večjo fluorescenco kot modul z manjšo As, saj je bil ribosomu dostopnejši, zaradi česar je bila vezava njegove 30S podenote energijsko ugodnejša (manjša ∆Gpomožno mesto), translacija pa hitrejša.

=== Energijski kompromis med dostopnostjo in razvijanjem struktur modulov pomožnega mesta ===

Znano je, da se nekatere mRNA-strukture, ki omejujejo vezavo ribosoma na SD-mesto, pred iniciacijo translacije razvijejo, kar zahteva energijski vložek in posledično zmanjšanje hitrosti iniciacije [4]–[6]. Manj pa je znanega o tem, kaj se zgodi s strukturami pred SD-zaporedjem, torej s strukturami na pomožnem mestu. Na voljo sta dve mejni možnosti: strukture se popolnoma razvijejo in tako maksimalno povečajo dostopnost ribosomu ali pa ostanjo zvite in se jim ribosom preko konformacijskih sprememb popolnoma prilagodi. Izkaže se, da gre za kompromis med obema procesoma. Po predlaganem modelu ribosom selektivno in delno razvije modul pomožnega mesta tako, da je spremebna Gibbsove protste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto) minimalna.

Obema procesoma lahko pripišemo energijski parameter. Z ∆Gprilagoditev (> 0) okarakteriziramo tisto spremembo Gibbsove proste energije, ki je potrebna za konformacijsko prilagoditev ribosomske podenote manj dostopnemu modulu na pomožnem mestu. Količina je neposredno povezana z As in jo opisuje enačba ∆Gprilagoditev = C1(As)2 + C2(As) + C3. Velja, da večja kot je As (dostopnejši modul), manjša je ∆Gprilagoditev. Z ∆Grazvijanje (> 0) pa opišemo spremembo Gibbsove proste energije, ki se zgodi ob razvitju sekundarnih struktur modula. Za maksimalno dostopen modul velja: ∆Gprilagoditev = 0 in ∆Grazvijanje = 0. Energijska parametra obravnavamo kot prispevka k spremembi Gibbsove proste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje) in sta medsebojno odvisna. Pri manj dostopnih modulih bo tako razvitje sekundarnih struktur, za katerega je potreben vložek energije, ∆Grazvijanje, povečalo eno-verižno dostopno površino modula (As), kar bo povzorčilo večjo dostopnost, zaradi česar bo ∆Gprilagoditev manjši. Z drugimi besedami, obsežnejše razvijanje sekundarnih struktur (večja ∆Grazvijanje) bo imelo za rezultat manjše konformacijsko prilagajanje ribosoma (manjša ∆Gprilagoditev) in obratno. Procesa razvijanja struktur in konformacijskega prilagajanja ribosoma se med seboj uravnata tako, da je vsota njunih energijskijh prispevkov minimalna oziroma da je ∆Gpomožno mesto minimalen. To se v realnosti odraža tako, da ribosom sekundarno strukturo modula razvije le do določene mere in se ji nato konformacijsko prilagodi.

Teorijo so preverili tudi eksperimentalno, in sicer na sintetičnih 5'-UTR, ki so jim z upoštevanjem energijske minimizacije izračunali ∆Gpomožno mesto. Eksperimentalne vrednosti ∆Gpomožno mesto, izpeljane iz fluorescenc celic pri meritvah pretočne citometrije, so za določen 5'-UTR sovpadale s predvidenimi vrednostmi ∆Gpomožno mesto. To potrjuje mehanizem delnega in selektivnega razvijanja mRNA struktur ob vezavi ribosoma na pomožno mesto. V vseh testiranih primerih je model predvidel razvitje le 1-3 bp strukture modula, medtem ko se je ribosom preostalim velikim RNA-strukturam prilagodil.

=== Več modulov na pomožnem mestu ===

V primeru večih modulov na pomožnem mestu sta ob vezavi 30S ribosomske podenote dve možnosti: kooperativna in nekooperativna vezava. Če bi šlo za kooperativno vezavo, bi z naraščanjem modulov naraščala tudi As, kar bi pospešilo hitrost translacije. Glede na eksperimentalne podatke pa se izkaže, da se ob dodajanju števila modulov hitrost translacije ne spremeni. To priča o tem, da se 30S podenota ribosoma vedno veže le na izbrani modul - na tisti z najmanjšo ∆Gpomožno mesto. Meritve kažejo, da tudi, ko je izbrani modul zelo daleč navzgor od start-kodona, to ne vpliva na hitrost translacije. Tako mora obstajati mehanizem, ki omogoča premik podenote do oddaljenega start-kodona, kjer se sestavi 30S pre-iniciacijski kompleks. Podenota lahko difuzivno poskakuje čez vmesne sturkture (takrat bi bila hitrost iniciacije močno odvisna od razdalje med modulom in start-kodonom, manj pa od vmesnih sekundarnih struktur) ali pa drsi (takrat pa bi, zaradi stalnega kontakta, hitrost iniciacije zavisela predvsm od narave vmesnih mRNA struktur). Ker položaj modula in zato tudi razdalja od start-kodona ne vplivata na hitrost translacije, gre za mehanizem drsenja. Ob tem definiramo spremembo Gibbsove proste energije za drsenje 30S ribosomske podenote čez vmesne sekundarne strukture mRNA (∆Gdrsenje > 0), ki je posledica oviranja ribosoma na njegovi poti. ∆Gdrsenje tudi dobro sovpada z razliko med izmerjeno in izračunano vrednostjo ∆Gpomožno mesto, ki je do sedaj upoštevala le prispevke razvijanja mRNA in konformacijskega prilagajanja ribosoma. ∆Gdrsenje dobimo tako, da seštevek višin (H) vseh vmesnih mRNA-lasnic pomnožimo s koeficientom 0,2 kcal/mol/nt.

=== Zaključek ===

Ob upoštevanju vseh obravnavanih energijskih prispevkov za vezanje ribosoma na pomožno mesto 5'-UTR dobimo biofizikalni model, ki ga opisuje enačba: ∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje + ∆Gdrsenje in ki zelo dobro napove hitrost translacije.

Model so aplicirali na celoten genom (3430 5'-UTR-jev iz ''E. coli'' MG1655), kjer so za vsak modul izračunali ∆Gpomožno mesto. Odkrili so, da celotna dolžina 5'-UTR ne vpliva na hitrost translacije. Daljši 5'-UTR so, v primerjavi s krajšimi, lahko bolj strukturirani, kar zmanjšuje dostopnost mRNA ribosomu, vendar to vseeno ne povzroči večje represije iniciacije translacije.

Sekundarne strukture daljših 5'-UTR so pogosto tarče tako transkripcijskih represorjev kot transkripcijsih aktivatorjev. Gre za trans- (RNA-vezavni proteini ali pa male RNA), ki se vežejo na 5'-UTR, in cis-elemente (RNA-stikala), ki povzročajo spremembe v aktivnosti preko vezave malih ligandov.

Dodaten nivo regulacije hitrosti translacije na celotnem genomu so operoni z več promotorji. Pri teh nastane več izooblik 5'-UTR, ki se razlikujejo po hitrosti translacije. Izbira promotorja je regulacija na transkripcijski ravni, za karakterizacijo česar so potrebne še dodatne raziskave.

===Literatura ===

[1] A. E. Borujeni, A. S. Channarasappa, in H. M. Salis, „Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility , selective RNA unfolding and sliding at upstream standby sites“, Nucleic Acids Res., let. 42, št. 4, str. 2646–2659, 2014.

[2] C. O. Gualerzi in C. L. Pon, „Initiation of mRNA translation in bacteria: structural and dynamic aspects“, Cell. Mol. Life Sci., let. 72, št. 22, str. 4341–4367, 2015.

[3] G. Z. Yusupova, M. M. Yusupov, J. H. D. Cate, in H. F. Noller, „The path of messenger RNA through the ribosome“, Cell, let. 106, str. 233–241, 2001.

[4] M. de Smit in J. van Duin, „Control of translation by mRNA secondary structure in Escherichia coli. A quantitative analysis of literature data“, J. Mol. Biol., let. 244, št. 2, str. 144–150, 1994.

[5] H. Salis, E. Mirsky, in C. Voight, „Automated design of synthetic ribosome binding sires to control protein expression“, Nat Biotechnol, let. 27, št. 10, str. 946–950, 2010.

[6] S. M. Studer in S. Joseph, „Unfolding of mRNA secondary structure by the bacterial translation initiation complex“, Mol. Cell, let. 22, št. 1, str. 105–115, 2006.

===Dodatek - legenda ===

- ∆G30S-mRNA ...celokupna sprememba Gibbsove proste energije za vezavo 30S podenote ribosoma na 5'-UTR mRNA,

- ∆GmRNA ...sprememba Gibbsove proste energije za zvitje mRNA v začetno stanje (pred vezavo 30S ribosomske podenote,

- ∆GmRNA-rRNA ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med SD-zaporedjem na mRNA in anti-SD-zaporedjem na 16S rRNA,

- ∆Gvmesnik ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S ribosomske podenote na 5'-UTR z neugdno dolžino vmesnika (zaporedje med SD-zaporedjem in start-kodonom),

- ∆Gstart ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med start-kodonom na mRNA in anti-kodonom na fMet-tRNA,

- ∆Gpomožno mesto ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S podenote ribosoma na pomožno mesto,

- ∆Gprilagoditev ...sprememba Gibbsove proste energije ob konformacijskegem prilagajanju 30S podenote ribosoma sekundarnim strukturam modula na pomožnem mestu 5'-UTR,

- ∆Grazvijanje ...sprememba Gibbsove proste energije ob razvijanju modula pomožnega mesta 5'-UTR,

- ∆Gdrsenje ...sprememba Gibbsove proste energije ob drsenju 30S ribosomske podenote čez sekundarne strukture mRNA med izbranim modulom in start-kodonom,

- r ...hitrost translacije,

- β ...navidezna Boltzmannova konstanta (0,45 mol/kcal),

- F ...intenziteta fluorescence

- Fref ...referenčna intenziteta fluorescence

- H ...višina lasnice

- D ...dolžina distalnega vezavnega mesta

- P ...dolžina proksimalnegla vezavnega mesta

- As ...eno-verižna površina modula pomžnega mesta

- C1, C2 in C3 ...računalniško prilegani parametri vrednosti 0,038 kcal/mol/nt2, - 1.629 kcal/mol/nt in 17.359 kcal/mol.

Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah

2018-12-09T17:56:05Z

Neža Koritnik:

Povzeto po raziskovalnem članku ''”Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility, selective RNA unfoldnig and sliding at upstream standby sites”'' (2014) [[1]][https://academic.oup.com/nar/article/42/4/2646/2435298].

=== Uvod ===

Iniciacija translacije mRNA je pomembna točka regulacije sinteze proteinov. Pri prokariontih je to ponavadi najpočasnejša stopnja sinteze proteinov (od nje zavisi celokupna hitrost translacije), zato je podvržena različnim post-transkripcijskim mehanizmom uravnavanja izražanja genov [2].

Bakterijska iniciacija translacije se začne z nastankom 30S pre-iniciacijskega kompleksa. Ob asistenci treh iniciacijskih faktorjev (IF1-3) se 30S podenota ribosoma veže na mRNA, na start-kodon pa se rekrutira aminoacil-tRNA, ki prinese prvo aminokislino (fMet). 30S pre-iniciacijskemu komplesu se nato pridruži še 50S podenota ribosoma in tako nastane 70S iniciacijki kompleks, ki omogoči pričetek translacije [2].

Kontrola iniciacije translacije pri prokariontih je pogosto pogojena z interakcijami med 30S ribosomsko podenoto in 5'-UTR mRNA. Na hitrost translacije mRNA tako lahko vplivajo spremembe v zaporedju in sekundarni strukturi 5'-UTR. Na 5'-UTR se nahaja Shine-Dalgarnovo (SD) zaporedje, ki je definirano kot vezavno mesto za ribosom pri prokariontih. Sledi nekaj baznih parov dolg vmesnik in start-kodon. Vsi ti elementi sodelujejo pri regulaciji iniciacije tranlacije, ki je odvisna tako od SD-zaporeja (ki je konsenzno zaporedje in se med različnimi mRNA lahko razlikuje), dolžine vmesnika in tipa start-kodona (poleg AUG so možni še alternativni start-kodoni, t.j. GUG, UUG, AUU, AUC in AUA [2]). Veliko 5'-UTR-jev vsebuje še zaporedja navzgor od SD-zaporedja. Ta zaporedja lahko vsebujejo različne sekundarne strukture in tvorijo nespecifične elektrostatske interakcije s pozititivno nabitim delom površine 30S ribosomske podenote. Govorimo o pomožnem mestu (ang. ''“standby site”'') 5'-UTR.

Pomožno mesto je sestavljeno iz enega ali več modulov. Modul pomožnega mesta je vsaka posamezna sekundarna struktura mRNA, ponavadi pa gre za različno strukturirane lasnice. Raziskave kažejo [3], da ob sestavljanju 30S pre-iniciacijskega kompleksa na začetku pride do vezave 30S podenote ribosoma na pomožno mesto, kateri najprej sledi insercija mRNA skozi vhodni kanal podenote in nato komplementarno parjenje baz SD-zaporedja na mRNA in anti-SD-zaporedja na 16S rRNA, kar omogoči orientacijo start-kodona na P-mesto, kamor se tedaj rekrutira fMet-tRNA.

Za proces sestavljanja 30S pre-iniciacijskega kompleksa lahko izračunamo spremembo Gibbsove proste energije (∆G30S-mRNA), ki je neposredno povezana s hitrostjo translacije: r ∝ ''exp''(-β∆G30S-mRNA). ∆G30S-mRNA upošteva vse zgoraj navedene procese, torej prispevek parjenja baz SD- in anti-SD-zaporedja (∆GmRNA-rRNA < 0), prispevek morebitne neugodne dolžine vmesnika (∆Gvmesnik > 0), prispevek hibridizacije start-kodona in anti-kodona na fMet-tRNA (∆Gstart < 0), prispevek vezave na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto > 0) ter energijo zvitja mRNA v začetno stanje (∆GmRNA < 0). Celokupna Gibbsova prosta energija je tako: ∆G30S-mRNA = ∆GmRNA-rRNA + ∆Gvmesnik + ∆Gstart + ∆Gpomožno mesto - ∆GmRNA.

Vsi prispevki, razen ∆Gpomožno mesto, so bili predhodno že dobro okarakterizirani. Obravnavana raziskava se na podlagi strukturnih lastnosti pomožnega mesta 5'-UTR osredotoča na določitev ∆Gpomožno mesto, katero poveže s hitrostjo translacije.

=== Potek eksperimenta ===

V eksperimentu so zasnovali 136 sintetičnih 5'-UTR-jev mRNA, ki so bili sestavljeni iz različnih pomožnih mest, zaporedja navzdol pa so bila enaka (SD-zaporedje, vmesnik in start-kodon - AUG). Načrtane 5'-UTR so z metodami tehnologije rekombinantne DNA uporabili pri sestavitvi DNA-konstrukta, ki je vseboval ustrezen 5'-UTR, za start-kodonom pa zapis za reporterski protein - monomerni rdeči fluorescenčni protein 1 (mRFP1). DNA-konstrukte so vstavili v ekspresijski vektor pFTV1, ki je imel zapis za konstitutivni promor σ70 in s katerim so transformirali kompetente celice ''E. coli'' DH10B. Količino nastalega reporterskega proteina so določili z meritvami pretočne citometrije, pogoji gojenja celic pa so bili zasnovani tako, da je bila fluorescenca mRFP1 proporcionalna hitrosti (iniciacije) translacije, ta pa je proporcionalna ∆G∆G30S-mRNA in tako ∆Gpomožno mesto: ∆Gpomožno mesto = -1/β ln(F/Fref) - (∆∆Gostali prispevki).

=== Površina modula pomožnega mesta v povezavi s hitrostjo translacije ===

Pri vezavi ribosoma na 5'-UTR je strukturiranost modula pomožnega mesta eden ključnih dejavnikov, ki modulirajo sposobnost vezave ribosoma na mRNA. Modul pomožnega mesta opišemo s tremi strukturnimi parametri:

- H (višina lasnice oziroma število nukleotidov od vznožja do sredine vrhnje zanke),

- D (dolžina distalnega vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzgor od lasnice),

- P (dolžina proksimalnegla vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzdol od lasnice).

Parametri so povezani z eno-verižno površino modula (As), ki jo definira enačba: As = 15 + P + D - H. As je tista površina, ki je dostopna ribosomu. Tako velja: večja kot je As, lažja je vezava 30S ribosomske podenote na modul. ∆Gpomožno mesto je torej manjša, ko je As večja (ko sta parametra D in P večja ter parameter H manjši), in obratno. V primeru maksimalno dostopnega modula (t.j. modul brez sekundarnih struktur) velja ∆Gpomožno mesto = 0.

Navedeno so potrdile meritve pretočne citometrije, ki so jih so izvedli na celicah transofrmiranih s konstrukti, ki so na pomožnem mestu 5'-UTR vsebovale en sam modul. Intenzitete fluorescence mRFP1 so se v odvisnosti od strukturiranosti modula oziroma v odvisnoti od As razlikovale. Modul z večjo As je imel večjo fluorescenco kot modul z manjšo As, saj je bil ribosomu dostopnejši, zaradi česar je bila vezava njegove 30S podenote energijsko ugodnejša (manjša ∆Gpomožno mesto), translacija pa hitrejša.

=== Energijski kompromis med dostopnostjo in razvijanjem struktur modulov pomožnega mesta ===

Znano je, da se nekatere mRNA-strukture, ki omejujejo vezavo ribosoma na SD-mesto, pred iniciacijo translacije razvijejo, kar zahteva energijski vložek in posledično zmanjšanje hitrosti iniciacije [4]–[6]. Manj pa je znanega o tem, kaj se zgodi s strukturami pred SD-zaporedjem, torej s strukturami na pomožnem mestu. Na voljo sta dve mejni možnosti: strukture se popolnoma razvijejo in tako maksimalno povečajo dostopnost ribosomu ali pa ostanjo zvite in se jim ribosom preko konformacijskih sprememb popolnoma prilagodi. Izkaže se, da gre za kompromis med obema procesoma. Po predlaganem modelu ribosom selektivno in delno razvije modul pomožnega mesta tako, da je spremebna Gibbsove protste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto) minimalna.

Obema procesoma lahko pripišemo energijski parameter. Z ∆Gprilagoditev (> 0) okarakteriziramo tisto spremembo Gibbsove proste energije, ki je potrebna za konformacijsko prilagoditev ribosomske podenote manj dostopnemu modulu na pomožnem mestu. Količina je neposredno povezana z As in jo opisuje enačba ∆Gprilagoditev = C1(As)2 + C2(As) + C3. Velja, da večja kot je As (dostopnejši modul), manjša je ∆Gprilagoditev. Z ∆Grazvijanje (> 0) pa opišemo spremembo Gibbsove proste energije, ki se zgodi ob razvitju sekundarnih struktur modula. Za maksimalno dostopen modul velja: ∆Gprilagoditev = 0 in ∆Grazvijanje = 0. Energijska parametra obravnavamo kot prispevka k spremembi Gibbsove proste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje) in sta medsebojno odvisna. Pri manj dostopnih modulih bo tako razvitje sekundarnih struktur, za katerega je potreben vložek energije, ∆Grazvijanje, povečalo eno-verižno dostopno površino modula (As), kar bo povzorčilo večjo dostopnost, zaradi česar bo ∆Gprilagoditev manjši. Z drugimi besedami, obsežnejše razvijanje sekundarnih struktur (večja ∆Grazvijanje) bo imelo za rezultat manjše konformacijsko prilagajanje ribosoma (manjša ∆Gprilagoditev) in obratno. Procesa razvijanja struktur in konformacijskega prilagajanja ribosoma se med seboj uravnata tako, da je vsota njunih energijskijh prispevkov minimalna oziroma da je ∆Gpomožno mesto minimalen. To se v realnosti odraža tako, da ribosom sekundarno strukturo modula razvije le do določene mere in se ji nato konformacijsko prilagodi.

Teorijo so preverili tudi eksperimentalno, in sicer na sintetičnih 5'-UTR, ki so jim z upoštevanjem energijske minimizacije izračunali ∆Gpomožno mesto. Eksperimentalne vrednosti ∆Gpomožno mesto, izpeljane iz fluorescenc celic pri meritvah pretočne citometrije, so za določen 5'-UTR sovpadale s predvidenimi vrednostmi ∆Gpomožno mesto. To potrjuje mehanizem delnega in selektivnega razvijanja mRNA struktur ob vezavi ribosoma na pomožno mesto. V vseh testiranih primerih je model predvidel razvitje le 1-3 bp strukture modula, medtem ko se je ribosom preostalim velikim RNA-strukturam prilagodil.

=== Več modulov na pomožnem mestu ===

V primeru večih modulov na pomožnem mestu sta ob vezavi 30S ribosomske podenote dve možnosti: kooperativna in nekooperativna vezava. Če bi šlo za kooperativno vezavo, bi z naraščanjem modulov naraščala tudi As, kar bi pospešilo hitrost translacije. Glede na eksperimentalne podatke pa se izkaže, da se ob dodajanju števila modulov hitrost translacije ne spremeni. To priča o tem, da se 30S podenota ribosoma vedno veže le na izbrani modul - na tisti z najmanjšo ∆Gpomožno mesto. Meritve kažejo, da tudi, ko je izbrani modul zelo daleč navzgor od start-kodona, to ne vpliva na hitrost translacije. Tako mora obstajati mehanizem, ki omogoča premik podenote do oddaljenega start-kodona, kjer se sestavi 30S pre-iniciacijski kompleks. Podenota lahko difuzivno poskakuje čez vmesne sturkture (takrat bi bila hitrost iniciacije močno odvisna od razdalje med modulom in start-kodonom, manj pa od vmesnih sekundarnih struktur) ali pa drsi (takrat pa bi, zaradi stalnega kontakta, hitrost iniciacije zavisela predvsm od narave vmesnih mRNA struktur). Ker položaj modula in zato tudi razdalja od start-kodona ne vplivata na hitrost translacije, gre za mehanizem drsenja. Ob tem definiramo spremembo Gibbsove proste energije za drsenje 30S ribosomske podenote čez vmesne sekundarne strukture mRNA (∆Gdrsenje > 0), ki je posledica oviranja ribosoma na njegovi poti. ∆Gdrsenje tudi dobro sovpada z razliko med izmerjeno in izračunano vrednostjo ∆Gpomožno mesto, ki je do sedaj upoštevala le prispevke razvijanja mRNA in konformacijskega prilagajanja ribosoma. ∆Gdrsenje dobimo tako, da seštevek višin (H) vseh vmesnih mRNA-lasnic pomnožimo s koeficientom 0,2 kcal/mol/nt.

=== Zaključek ===

Ob upoštevanju vseh obravnavanih energijskih prispevkov za vezanje ribosoma na pomožno mesto 5'-UTR dobimo biofizikalni model, ki ga opisuje enačba: ∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje + ∆Gdrsenje in ki zelo dobro napove hitrost translacije.

Model so aplicirali na celoten genom (3430 5'-UTR-jev iz ''E. coli'' MG1655), kjer so za vsak modul izračunali ∆Gpomožno mesto. Odkrili so, da celotna dolžina 5'-UTR ne vpliva na hitrost translacije. Daljši 5'-UTR so, v primerjavi s krajšimi, lahko bolj strukturirani, kar zmanjšuje dostopnost mRNA ribosomu, vendar to vseeno ne povzroči večje represije iniciacije translacije.

Sekundarne strukture daljših 5'-UTR so pogosto tarče tako transkripcijskih represorjev kot transkripcijsih aktivatorjev. Gre za trans- (RNA-vezavni proteini ali pa male RNA), ki se vežejo na 5'-UTR, in cis-elemente (RNA-stikala), ki povzročajo spremembe v aktivnosti preko vezave malih ligandov.

Dodaten nivo regulacije hitrosti translacije na celotnem genomu so operoni z več promotorji. Pri teh nastane več izooblik 5'-UTR, ki se razlikujejo po hitrosti translacije. Izbira promotorja je regulacija na transkripcijski ravni, za karakterizacijo česar so potrebne še dodatne raziskave.

===Literatura ===

[1] A. E. Borujeni, A. S. Channarasappa, and H. M. Salis, “Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility , selective RNA unfolding and sliding at upstream standby sites,” Nucleic Acids Res., vol. 42, no. 4, pp. 2646–2659, 2014.

[2] C. O. Gualerzi and C. L. Pon, “Initiation of mRNA translation in bacteria: structural and dynamic aspects,” Cell. Mol. Life Sci., vol. 72, no. 22, pp. 4341–4367, 2015.

[3] G. Z. Yusupova, M. M. Yusupov, J. H. D. Cate, and H. F. Noller, “The path of messenger RNA through the ribosome,” Cell, vol. 106, pp. 233–241, 2001.

[4] M. de Smit and J. van Duin, “Control of translation by mRNA secondary structure in Escherichia coli. A quantitative analysis of literature data,” J. Mol. Biol., vol. 244, no. 2, pp. 144–150, 1994.

[5] H. Salis, E. Mirsky, and C. Voight, “Automated design of synthetic ribosome binding sires to control protein expression,” Nat Biotechnol, vol. 27, no. 10, pp. 946–950, 2010.

[6] S. M. Studer and S. Joseph, “Unfolding of mRNA secondary structure by the bacterial translation initiation complex,” Mol. Cell, vol. 22, no. 1, pp. 105–115, 2006.

===Dodatek - legenda ===

- ∆G30S-mRNA ...celokupna sprememba Gibbsove proste energije za vezavo 30S podenote ribosoma na 5'-UTR mRNA,

- ∆GmRNA ...sprememba Gibbsove proste energije za zvitje mRNA v začetno stanje (pred vezavo 30S ribosomske podenote,

- ∆GmRNA-rRNA ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med SD-zaporedjem na mRNA in anti-SD-zaporedjem na 16S rRNA,

- ∆Gvmesnik ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S ribosomske podenote na 5'-UTR z neugdno dolžino vmesnika (zaporedje med SD-zaporedjem in start-kodonom),

- ∆Gstart ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med start-kodonom na mRNA in anti-kodonom na fMet-tRNA,

- ∆Gpomožno mesto ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S podenote ribosoma na pomožno mesto,

- ∆Gprilagoditev ...sprememba Gibbsove proste energije ob konformacijskegem prilagajanju 30S podenote ribosoma sekundarnim strukturam modula na pomožnem mestu 5'-UTR,

- ∆Grazvijanje ...sprememba Gibbsove proste energije ob razvijanju modula pomožnega mesta 5'-UTR,

- ∆Gdrsenje ...sprememba Gibbsove proste energije ob drsenju 30S ribosomske podenote čez sekundarne strukture mRNA med izbranim modulom in start-kodonom,

- r ...hitrost translacije,

- β ...navidezna Boltzmannova konstanta (0,45 mol/kcal),

- F ...intenziteta fluorescence

- Fref ...referenčna intenziteta fluorescence

- H ...višina lasnice

- D ...dolžina distalnega vezavnega mesta

- P ...dolžina proksimalnegla vezavnega mesta

- As ...eno-verižna površina modula pomžnega mesta

- C1, C2 in C3 ...računalniško prilegani parametri vrednosti 0,038 kcal/mol/nt2, - 1.629 kcal/mol/nt in 17.359 kcal/mol.

Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah

2018-12-09T17:55:14Z

Neža Koritnik:

Povzeto po raziskovalnem članku ''”Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility, selective RNA unfoldnig and sliding at upstream standby sites”'' (2014) [[1]][https://academic.oup.com/nar/article/42/4/2646/2435298].

=== Uvod ===

Iniciacija translacije mRNA je pomembna točka regulacije sinteze proteinov. Pri prokariontih je to ponavadi najpočasnejša stopnja sinteze proteinov (od nje zavisi celokupna hitrost translacije), zato je podvržena različnim post-transkripcijskim mehanizmom uravnavanja izražanja genov [2].

Bakterijska iniciacija translacije se začne z nastankom 30S pre-iniciacijskega kompleksa. Ob asistenci treh iniciacijskih faktorjev (IF1-3) se 30S podenota ribosoma veže na mRNA, na start-kodon pa se rekrutira aminoacil-tRNA, ki prinese prvo aminokislino (fMet). 30S pre-iniciacijskemu komplesu se nato pridruži še 50S podenota ribosoma in tako nastane 70S iniciacijki kompleks, ki omogoči pričetek translacije [2].

Kontrola iniciacije translacije pri prokariontih je pogosto pogojena z interakcijami med 30S ribosomsko podenoto in 5'-UTR mRNA. Na hitrost translacije mRNA tako lahko vplivajo spremembe v zaporedju in sekundarni strukturi 5'-UTR. Na 5'-UTR se nahaja Shine-Dalgarnovo (SD) zaporedje, ki je definirano kot vezavno mesto za ribosom pri prokariontih. Sledi nekaj baznih parov dolg vmesnik in start-kodon. Vsi ti elementi sodelujejo pri regulaciji iniciacije tranlacije, ki je odvisna tako od SD-zaporeja (ki je konsenzno zaporedje in se med različnimi mRNA lahko razlikuje), dolžine vmesnika in tipa start-kodona (poleg AUG so možni še alternativni start-kodoni, t.j. GUG, UUG, AUU, AUC in AUA [2]). Veliko 5'-UTR-jev vsebuje še zaporedja navzgor od SD-zaporedja. Ta zaporedja lahko vsebujejo različne sekundarne strukture in tvorijo nespecifične elektrostatske interakcije s pozititivno nabitim delom površine 30S ribosomske podenote. Govorimo o pomožnem mestu (ang. ''“standby site”'') 5'-UTR.

Pomožno mesto je sestavljeno iz enega ali več modulov. Modul pomožnega mesta je vsaka posamezna sekundarna struktura mRNA, ponavadi pa gre za različno strukturirane lasnice. Raziskave kažejo [3], da ob sestavljanju 30S pre-iniciacijskega kompleksa na začetku pride do vezave 30S podenote ribosoma na pomožno mesto, kateri najprej sledi insercija mRNA skozi vhodni kanal podenote in nato komplementarno parjenje baz SD-zaporedja na mRNA in anti-SD-zaporedja na 16S rRNA, kar omogoči orientacijo start-kodona na P-mesto, kamor se tedaj rekrutira fMet-tRNA.

Za proces sestavljanja 30S pre-iniciacijskega kompleksa lahko izračunamo spremembo Gibbsove proste energije (∆G30S-mRNA), ki je neposredno povezana s hitrostjo translacije: r ∝ ''exp''(-β∆G30S-mRNA). ∆G30S-mRNA upošteva vse zgoraj navedene procese, torej prispevek parjenja baz SD- in anti-SD-zaporedja (∆GmRNA-rRNA < 0), prispevek morebitne neugodne dolžine vmesnika (∆Gvmesnik > 0), prispevek hibridizacije start-kodona in anti-kodona na fMet-tRNA (∆Gstart < 0), prispevek vezave na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto > 0) ter energijo zvitja mRNA v začetno stanje (∆GmRNA < 0). Celokupna Gibbsova prosta energija je tako: ∆G30S-mRNA = ∆GmRNA-rRNA + ∆Gvmesnik + ∆Gstart + ∆Gpomožno mesto - ∆GmRNA.

Vsi prispevki, razen ∆Gpomožno mesto, so bili predhodno že dobro okarakterizirani. Obravnavana raziskava se na podlagi strukturnih lastnosti pomožnega mesta 5'-UTR osredotoča na določitev ∆Gpomožno mesto, katero poveže s hitrostjo translacije.

=== Potek eksperimenta ===

V eksperimentu so zasnovali 136 sintetičnih 5'-UTR-jev mRNA, ki so bili sestavljeni iz različnih pomožnih mest, zaporedja navzdol pa so bila enaka (SD-zaporedje, vmesnik in start-kodon - AUG). Načrtane 5'-UTR so z metodami tehnologije rekombinantne DNA uporabili pri sestavitvi DNA-konstrukta, ki je vseboval ustrezen 5'-UTR, za start-kodonom pa zapis za reporterski protein - monomerni rdeči fluorescenčni protein 1 (mRFP1). DNA-konstrukte so vstavili v ekspresijski vektor pFTV1, ki je imel zapis za konstitutivni promor σ70 in s katerim so transformirali kompetente celice ''E. coli'' DH10B. Količino nastalega reporterskega proteina so določili z meritvami pretočne citometrije, pogoji gojenja celic pa so bili zasnovani tako, da je bila fluorescenca mRFP1 proporcionalna hitrosti (iniciacije) translacije, ta pa je proporcionalna ∆G∆G30S-mRNA in tako ∆Gpomožno mesto: ∆Gpomožno mesto = -1/β ln(F/Fref) - (∆∆Gostali prispevki).

=== Površina modula pomožnega mesta v povezavi s hitrostjo translacije ===

Pri vezavi ribosoma na 5'-UTR je strukturiranost modula pomožnega mesta eden ključnih dejavnikov, ki modulirajo sposobnost vezave ribosoma na mRNA. Modul pomožnega mesta opišemo s tremi strukturnimi parametri:

- H (višina lasnice oziroma število nukleotidov od vznožja do sredine vrhnje zanke),

- D (dolžina distalnega vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzgor od lasnice),

- P (dolžina proksimalnegla vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzdol od lasnice).

Parametri so povezani z eno-verižno površino modula (As), ki jo definira enačba: As = 15 + P + D - H. As je tista površina, ki je dostopna ribosomu. Tako velja: večja kot je As, lažja je vezava 30S ribosomske podenote na modul. ∆Gpomožno mesto je torej manjša, ko je As večja (ko sta parametra D in P večja ter parameter H manjši), in obratno. V primeru maksimalno dostopnega modula (t.j. modul brez sekundarnih struktur) velja ∆Gpomožno mesto = 0.

Navedeno so potrdile meritve pretočne citometrije, ki so jih so izvedli na celicah transofrmiranih s konstrukti, ki so na pomožnem mestu 5'-UTR vsebovale en sam modul. Intenzitete fluorescence mRFP1 so se v odvisnosti od strukturiranosti modula oziroma v odvisnoti od As razlikovale. Modul z večjo As je imel večjo fluorescenco kot modul z manjšo As, saj je bil ribosomu dostopnejši, zaradi česar je bila vezava njegove 30S podenote energijsko ugodnejša (manjša ∆Gpomožno mesto), translacija pa hitrejša.

=== Energijski kompromis med dostopnostjo in razvijanjem struktur modulov ===

Znano je, da se nekatere mRNA-strukture, ki omejujejo vezavo ribosoma na SD-mesto, pred iniciacijo translacije razvijejo, kar zahteva energijski vložek in posledično zmanjšanje hitrosti iniciacije [4]–[6]. Manj pa je znanega o tem, kaj se zgodi s strukturami pred SD-zaporedjem, torej s strukturami na pomožnem mestu. Na voljo sta dve mejni možnosti: strukture se popolnoma razvijejo in tako maksimalno povečajo dostopnost ribosomu ali pa ostanjo zvite in se jim ribosom preko konformacijskih sprememb popolnoma prilagodi. Izkaže se, da gre za kompromis med obema procesoma. Po predlaganem modelu ribosom selektivno in delno razvije modul pomožnega mesta tako, da je spremebna Gibbsove protste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto) minimalna.

Obema procesoma lahko pripišemo energijski parameter. Z ∆Gprilagoditev (> 0) okarakteriziramo tisto spremembo Gibbsove proste energije, ki je potrebna za konformacijsko prilagoditev ribosomske podenote manj dostopnemu modulu na pomožnem mestu. Količina je neposredno povezana z As in jo opisuje enačba ∆Gprilagoditev = C1(As)2 + C2(As) + C3. Velja, da večja kot je As (dostopnejši modul), manjša je ∆Gprilagoditev. Z ∆Grazvijanje (> 0) pa opišemo spremembo Gibbsove proste energije, ki se zgodi ob razvitju sekundarnih struktur modula. Za maksimalno dostopen modul velja: ∆Gprilagoditev = 0 in ∆Grazvijanje = 0. Energijska parametra obravnavamo kot prispevka k spremembi Gibbsove proste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje) in sta medsebojno odvisna. Pri manj dostopnih modulih bo tako razvitje sekundarnih struktur, za katerega je potreben vložek energije, ∆Grazvijanje, povečalo eno-verižno dostopno površino modula (As), kar bo povzorčilo večjo dostopnost, zaradi česar bo ∆Gprilagoditev manjši. Z drugimi besedami, obsežnejše razvijanje sekundarnih struktur (večja ∆Grazvijanje) bo imelo za rezultat manjše konformacijsko prilagajanje ribosoma (manjša ∆Gprilagoditev) in obratno. Procesa razvijanja struktur in konformacijskega prilagajanja ribosoma se med seboj uravnata tako, da je vsota njunih energijskijh prispevkov minimalna oziroma da je ∆Gpomožno mesto minimalen. To se v realnosti odraža tako, da ribosom sekundarno strukturo modula razvije le do določene mere in se ji nato konformacijsko prilagodi.

Teorijo so preverili tudi eksperimentalno, in sicer na sintetičnih 5'-UTR, ki so jim z upoštevanjem energijske minimizacije izračunali ∆Gpomožno mesto. Eksperimentalne vrednosti ∆Gpomožno mesto, izpeljane iz fluorescenc celic pri meritvah pretočne citometrije, so za določen 5'-UTR sovpadale s predvidenimi vrednostmi ∆Gpomožno mesto. To potrjuje mehanizem delnega in selektivnega razvijanja mRNA struktur ob vezavi ribosoma na pomožno mesto. V vseh testiranih primerih je model predvidel razvitje le 1-3 bp strukture modula, medtem ko se je ribosom preostalim velikim RNA-strukturam prilagodil.

=== Več modulov na pomožnem mestu ===

V primeru večih modulov na pomožnem mestu sta ob vezavi 30S ribosomske podenote dve možnosti: kooperativna in nekooperativna vezava. Če bi šlo za kooperativno vezavo, bi z naraščanjem modulov naraščala tudi As, kar bi pospešilo hitrost translacije. Glede na eksperimentalne podatke pa se izkaže, da se ob dodajanju števila modulov hitrost translacije ne spremeni. To priča o tem, da se 30S podenota ribosoma vedno veže le na izbrani modul - na tisti z najmanjšo ∆Gpomožno mesto. Meritve kažejo, da tudi, ko je izbrani modul zelo daleč navzgor od start-kodona, to ne vpliva na hitrost translacije. Tako mora obstajati mehanizem, ki omogoča premik podenote do oddaljenega start-kodona, kjer se sestavi 30S pre-iniciacijski kompleks. Podenota lahko difuzivno poskakuje čez vmesne sturkture (takrat bi bila hitrost iniciacije močno odvisna od razdalje med modulom in start-kodonom, manj pa od vmesnih sekundarnih struktur) ali pa drsi (takrat pa bi, zaradi stalnega kontakta, hitrost iniciacije zavisela predvsm od narave vmesnih mRNA struktur). Ker položaj modula in zato tudi razdalja od start-kodona ne vplivata na hitrost translacije, gre za mehanizem drsenja. Ob tem definiramo spremembo Gibbsove proste energije za drsenje 30S ribosomske podenote čez vmesne sekundarne strukture mRNA (∆Gdrsenje > 0), ki je posledica oviranja ribosoma na njegovi poti. ∆Gdrsenje tudi dobro sovpada z razliko med izmerjeno in izračunano vrednostjo ∆Gpomožno mesto, ki je do sedaj upoštevala le prispevke razvijanja mRNA in konformacijskega prilagajanja ribosoma. ∆Gdrsenje dobimo tako, da seštevek višin (H) vseh vmesnih mRNA-lasnic pomnožimo s koeficientom 0,2 kcal/mol/nt.

=== Zaključek ===

Ob upoštevanju vseh obravnavanih energijskih prispevkov za vezanje ribosoma na pomožno mesto 5'-UTR dobimo biofizikalni model, ki ga opisuje enačba: ∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje + ∆Gdrsenje in ki zelo dobro napove hitrost translacije.

Model so aplicirali na celoten genom (3430 5'-UTR-jev iz ''E. coli'' MG1655), kjer so za vsak modul izračunali ∆Gpomožno mesto. Odkrili so, da celotna dolžina 5'-UTR ne vpliva na hitrost translacije. Daljši 5'-UTR so, v primerjavi s krajšimi, lahko bolj strukturirani, kar zmanjšuje dostopnost mRNA ribosomu, vendar to vseeno ne povzroči večje represije iniciacije translacije.

Sekundarne strukture daljših 5'-UTR so pogosto tarče tako transkripcijskih represorjev kot transkripcijsih aktivatorjev. Gre za trans- (RNA-vezavni proteini ali pa male RNA), ki se vežejo na 5'-UTR, in cis-elemente (RNA-stikala), ki povzročajo spremembe v aktivnosti preko vezave malih ligandov.

Dodaten nivo regulacije hitrosti translacije na celotnem genomu so operoni z več promotorji. Pri teh nastane več izooblik 5'-UTR, ki se razlikujejo po hitrosti translacije. Izbira promotorja je regulacija na transkripcijski ravni, za karakterizacijo česar so potrebne še dodatne raziskave.

===Literatura ===

[1] A. E. Borujeni, A. S. Channarasappa, and H. M. Salis, “Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility , selective RNA unfolding and sliding at upstream standby sites,” Nucleic Acids Res., vol. 42, no. 4, pp. 2646–2659, 2014.

[2] C. O. Gualerzi and C. L. Pon, “Initiation of mRNA translation in bacteria: structural and dynamic aspects,” Cell. Mol. Life Sci., vol. 72, no. 22, pp. 4341–4367, 2015.

[3] G. Z. Yusupova, M. M. Yusupov, J. H. D. Cate, and H. F. Noller, “The path of messenger RNA through the ribosome,” Cell, vol. 106, pp. 233–241, 2001.

[4] M. de Smit and J. van Duin, “Control of translation by mRNA secondary structure in Escherichia coli. A quantitative analysis of literature data,” J. Mol. Biol., vol. 244, no. 2, pp. 144–150, 1994.

[5] H. Salis, E. Mirsky, and C. Voight, “Automated design of synthetic ribosome binding sires to control protein expression,” Nat Biotechnol, vol. 27, no. 10, pp. 946–950, 2010.

[6] S. M. Studer and S. Joseph, “Unfolding of mRNA secondary structure by the bacterial translation initiation complex,” Mol. Cell, vol. 22, no. 1, pp. 105–115, 2006.

===Dodatek - legenda ===

- ∆G30S-mRNA ...celokupna sprememba Gibbsove proste energije za vezavo 30S podenote ribosoma na 5'-UTR mRNA,

- ∆GmRNA ...sprememba Gibbsove proste energije za zvitje mRNA v začetno stanje (pred vezavo 30S ribosomske podenote,

- ∆GmRNA-rRNA ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med SD-zaporedjem na mRNA in anti-SD-zaporedjem na 16S rRNA,

- ∆Gvmesnik ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S ribosomske podenote na 5'-UTR z neugdno dolžino vmesnika (zaporedje med SD-zaporedjem in start-kodonom),

- ∆Gstart ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med start-kodonom na mRNA in anti-kodonom na fMet-tRNA,

- ∆Gpomožno mesto ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S podenote ribosoma na pomožno mesto,

- ∆Gprilagoditev ...sprememba Gibbsove proste energije ob konformacijskegem prilagajanju 30S podenote ribosoma sekundarnim strukturam modula na pomožnem mestu 5'-UTR,

- ∆Grazvijanje ...sprememba Gibbsove proste energije ob razvijanju modula pomožnega mesta 5'-UTR,

- ∆Gdrsenje ...sprememba Gibbsove proste energije ob drsenju 30S ribosomske podenote čez sekundarne strukture mRNA med izbranim modulom in start-kodonom,

- r ...hitrost translacije,

- β ...navidezna Boltzmannova konstanta (0,45 mol/kcal),

- F ...intenziteta fluorescence

- Fref ...referenčna intenziteta fluorescence

- H ...višina lasnice

- D ...dolžina distalnega vezavnega mesta

- P ...dolžina proksimalnegla vezavnega mesta

- As ...eno-verižna površina modula pomžnega mesta

- C1, C2 in C3 ...računalniško prilegani parametri vrednosti 0,038 kcal/mol/nt2, - 1.629 kcal/mol/nt in 17.359 kcal/mol.

Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah

2018-12-09T17:54:16Z

Neža Koritnik:

povzeto po raziskovalnem članku ''”Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility, selective RNA unfoldnig and sliding at upstream standby sites”'' (2014) [[1]][https://academic.oup.com/nar/article/42/4/2646/2435298]

=== Uvod ===

Iniciacija translacije mRNA je pomembna točka regulacije sinteze proteinov. Pri prokariontih je to ponavadi najpočasnejša stopnja sinteze proteinov (od nje zavisi celokupna hitrost translacije), zato je podvržena različnim post-transkripcijskim mehanizmom uravnavanja izražanja genov [2].

Bakterijska iniciacija translacije se začne z nastankom 30S pre-iniciacijskega kompleksa. Ob asistenci treh iniciacijskih faktorjev (IF1-3) se 30S podenota ribosoma veže na mRNA, na start-kodon pa se rekrutira aminoacil-tRNA, ki prinese prvo aminokislino (fMet). 30S pre-iniciacijskemu komplesu se nato pridruži še 50S podenota ribosoma in tako nastane 70S iniciacijki kompleks, ki omogoči pričetek translacije [2].

Kontrola iniciacije translacije pri prokariontih je pogosto pogojena z interakcijami med 30S ribosomsko podenoto in 5'-UTR mRNA. Na hitrost translacije mRNA tako lahko vplivajo spremembe v zaporedju in sekundarni strukturi 5'-UTR. Na 5'-UTR se nahaja Shine-Dalgarnovo (SD) zaporedje, ki je definirano kot vezavno mesto za ribosom pri prokariontih. Sledi nekaj baznih parov dolg vmesnik in start-kodon. Vsi ti elementi sodelujejo pri regulaciji iniciacije tranlacije, ki je odvisna tako od SD-zaporeja (ki je konsenzno zaporedje in se med različnimi mRNA lahko razlikuje), dolžine vmesnika in tipa start-kodona (poleg AUG so možni še alternativni start-kodoni, t.j. GUG, UUG, AUU, AUC in AUA [2]). Veliko 5'-UTR-jev vsebuje še zaporedja navzgor od SD-zaporedja. Ta zaporedja lahko vsebujejo različne sekundarne strukture in tvorijo nespecifične elektrostatske interakcije s pozititivno nabitim delom površine 30S ribosomske podenote. Govorimo o pomožnem mestu (ang. ''“standby site”'') 5'-UTR.

Pomožno mesto je sestavljeno iz enega ali več modulov. Modul pomožnega mesta je vsaka posamezna sekundarna struktura mRNA, ponavadi pa gre za različno strukturirane lasnice. Raziskave kažejo [3], da ob sestavljanju 30S pre-iniciacijskega kompleksa na začetku pride do vezave 30S podenote ribosoma na pomožno mesto, kateri najprej sledi insercija mRNA skozi vhodni kanal podenote in nato komplementarno parjenje baz SD-zaporedja na mRNA in anti-SD-zaporedja na 16S rRNA, kar omogoči orientacijo start-kodona na P-mesto, kamor se tedaj rekrutira fMet-tRNA.

Za proces sestavljanja 30S pre-iniciacijskega kompleksa lahko izračunamo spremembo Gibbsove proste energije (∆G30S-mRNA), ki je neposredno povezana s hitrostjo translacije: r ∝ ''exp''(-β∆G30S-mRNA). ∆G30S-mRNA upošteva vse zgoraj navedene procese, torej prispevek parjenja baz SD- in anti-SD-zaporedja (∆GmRNA-rRNA < 0), prispevek morebitne neugodne dolžine vmesnika (∆Gvmesnik > 0), prispevek hibridizacije start-kodona in anti-kodona na fMet-tRNA (∆Gstart < 0), prispevek vezave na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto > 0) ter energijo zvitja mRNA v začetno stanje (∆GmRNA < 0). Celokupna Gibbsova prosta energija je tako: ∆G30S-mRNA = ∆GmRNA-rRNA + ∆Gvmesnik + ∆Gstart + ∆Gpomožno mesto - ∆GmRNA.

Vsi prispevki, razen ∆Gpomožno mesto, so bili predhodno že dobro okarakterizirani. Obravnavana raziskava se na podlagi strukturnih lastnosti pomožnega mesta 5'-UTR osredotoča na določitev ∆Gpomožno mesto, katero poveže s hitrostjo translacije.

=== Potek eksperimenta ===

V eksperimentu so zasnovali 136 sintetičnih 5'-UTR-jev mRNA, ki so bili sestavljeni iz različnih pomožnih mest, zaporedja navzdol pa so bila enaka (SD-zaporedje, vmesnik in start-kodon - AUG). Načrtane 5'-UTR so z metodami tehnologije rekombinantne DNA uporabili pri sestavitvi DNA-konstrukta, ki je vseboval ustrezen 5'-UTR, za start-kodonom pa zapis za reporterski protein - monomerni rdeči fluorescenčni protein 1 (mRFP1). DNA-konstrukte so vstavili v ekspresijski vektor pFTV1, ki je imel zapis za konstitutivni promor σ70 in s katerim so transformirali kompetente celice ''E. coli'' DH10B. Količino nastalega reporterskega proteina so določili z meritvami pretočne citometrije, pogoji gojenja celic pa so bili zasnovani tako, da je bila fluorescenca mRFP1 proporcionalna hitrosti (iniciacije) translacije, ta pa je proporcionalna ∆G∆G30S-mRNA in tako ∆Gpomožno mesto: ∆Gpomožno mesto = -1/β ln(F/Fref) - (∆∆Gostali prispevki).

=== Površina modula pomožnega mesta v povezavi s hitrostjo translacije ===

Pri vezavi ribosoma na 5'-UTR je strukturiranost modula pomožnega mesta eden ključnih dejavnikov, ki modulirajo sposobnost vezave ribosoma na mRNA. Modul pomožnega mesta opišemo s tremi strukturnimi parametri:

- H (višina lasnice oziroma število nukleotidov od vznožja do sredine vrhnje zanke),

- D (dolžina distalnega vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzgor od lasnice),

- P (dolžina proksimalnegla vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzdol od lasnice).

Parametri so povezani z eno-verižno površino modula (As), ki jo definira enačba: As = 15 + P + D - H. As je tista površina, ki je dostopna ribosomu. Tako velja: večja kot je As, lažja je vezava 30S ribosomske podenote na modul. ∆Gpomožno mesto je torej manjša, ko je As večja (ko sta parametra D in P večja ter parameter H manjši), in obratno. V primeru maksimalno dostopnega modula (t.j. modul brez sekundarnih struktur) velja ∆Gpomožno mesto = 0.

Navedeno so potrdile meritve pretočne citometrije, ki so jih so izvedli na celicah transofrmiranih s konstrukti, ki so na pomožnem mestu 5'-UTR vsebovale en sam modul. Intenzitete fluorescence mRFP1 so se v odvisnosti od strukturiranosti modula oziroma v odvisnoti od As razlikovale. Modul z večjo As je imel večjo fluorescenco kot modul z manjšo As, saj je bil ribosomu dostopnejši, zaradi česar je bila vezava njegove 30S podenote energijsko ugodnejša (manjša ∆Gpomožno mesto), translacija pa hitrejša.

=== Energijski kompromis med dostopnostjo in razvijanjem struktur modulov ===

Znano je, da se nekatere mRNA-strukture, ki omejujejo vezavo ribosoma na SD-mesto, pred iniciacijo translacije razvijejo, kar zahteva energijski vložek in posledično zmanjšanje hitrosti iniciacije [4]–[6]. Manj pa je znanega o tem, kaj se zgodi s strukturami pred SD-zaporedjem, torej s strukturami na pomožnem mestu. Na voljo sta dve mejni možnosti: strukture se popolnoma razvijejo in tako maksimalno povečajo dostopnost ribosomu ali pa ostanjo zvite in se jim ribosom preko konformacijskih sprememb popolnoma prilagodi. Izkaže se, da gre za kompromis med obema procesoma. Po predlaganem modelu ribosom selektivno in delno razvije modul pomožnega mesta tako, da je spremebna Gibbsove protste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto) minimalna.

Obema procesoma lahko pripišemo energijski parameter. Z ∆Gprilagoditev (> 0) okarakteriziramo tisto spremembo Gibbsove proste energije, ki je potrebna za konformacijsko prilagoditev ribosomske podenote manj dostopnemu modulu na pomožnem mestu. Količina je neposredno povezana z As in jo opisuje enačba ∆Gprilagoditev = C1(As)2 + C2(As) + C3. Velja, da večja kot je As (dostopnejši modul), manjša je ∆Gprilagoditev. Z ∆Grazvijanje (> 0) pa opišemo spremembo Gibbsove proste energije, ki se zgodi ob razvitju sekundarnih struktur modula. Za maksimalno dostopen modul velja: ∆Gprilagoditev = 0 in ∆Grazvijanje = 0. Energijska parametra obravnavamo kot prispevka k spremembi Gibbsove proste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje) in sta medsebojno odvisna. Pri manj dostopnih modulih bo tako razvitje sekundarnih struktur, za katerega je potreben vložek energije, ∆Grazvijanje, povečalo eno-verižno dostopno površino modula (As), kar bo povzorčilo večjo dostopnost, zaradi česar bo ∆Gprilagoditev manjši. Z drugimi besedami, obsežnejše razvijanje sekundarnih struktur (večja ∆Grazvijanje) bo imelo za rezultat manjše konformacijsko prilagajanje ribosoma (manjša ∆Gprilagoditev) in obratno. Procesa razvijanja struktur in konformacijskega prilagajanja ribosoma se med seboj uravnata tako, da je vsota njunih energijskijh prispevkov minimalna oziroma da je ∆Gpomožno mesto minimalen. To se v realnosti odraža tako, da ribosom sekundarno strukturo modula razvije le do določene mere in se ji nato konformacijsko prilagodi.

Teorijo so preverili tudi eksperimentalno, in sicer na sintetičnih 5'-UTR, ki so jim z upoštevanjem energijske minimizacije izračunali ∆Gpomožno mesto. Eksperimentalne vrednosti ∆Gpomožno mesto, izpeljane iz fluorescenc celic pri meritvah pretočne citometrije, so za določen 5'-UTR sovpadale s predvidenimi vrednostmi ∆Gpomožno mesto. To potrjuje mehanizem delnega in selektivnega razvijanja mRNA struktur ob vezavi ribosoma na pomožno mesto. V vseh testiranih primerih je model predvidel razvitje le 1-3 bp strukture modula, medtem ko se je ribosom preostalim velikim RNA-strukturam prilagodil.

=== Več modulov na pomožnem mestu ===

V primeru večih modulov na pomožnem mestu sta ob vezavi 30S ribosomske podenote dve možnosti: kooperativna in nekooperativna vezava. Če bi šlo za kooperativno vezavo, bi z naraščanjem modulov naraščala tudi As, kar bi pospešilo hitrost translacije. Glede na eksperimentalne podatke pa se izkaže, da se ob dodajanju števila modulov hitrost translacije ne spremeni. To priča o tem, da se 30S podenota ribosoma vedno veže le na izbrani modul - na tisti z najmanjšo ∆Gpomožno mesto. Meritve kažejo, da tudi, ko je izbrani modul zelo daleč navzgor od start-kodona, to ne vpliva na hitrost translacije. Tako mora obstajati mehanizem, ki omogoča premik podenote do oddaljenega start-kodona, kjer se sestavi 30S pre-iniciacijski kompleks. Podenota lahko difuzivno poskakuje čez vmesne sturkture (takrat bi bila hitrost iniciacije močno odvisna od razdalje med modulom in start-kodonom, manj pa od vmesnih sekundarnih struktur) ali pa drsi (takrat pa bi, zaradi stalnega kontakta, hitrost iniciacije zavisela predvsm od narave vmesnih mRNA struktur). Ker položaj modula in zato tudi razdalja od start-kodona ne vplivata na hitrost translacije, gre za mehanizem drsenja. Ob tem definiramo spremembo Gibbsove proste energije za drsenje 30S ribosomske podenote čez vmesne sekundarne strukture mRNA (∆Gdrsenje > 0), ki je posledica oviranja ribosoma na njegovi poti. ∆Gdrsenje tudi dobro sovpada z razliko med izmerjeno in izračunano vrednostjo ∆Gpomožno mesto, ki je do sedaj upoštevala le prispevke razvijanja mRNA in konformacijskega prilagajanja ribosoma. ∆Gdrsenje dobimo tako, da seštevek višin (H) vseh vmesnih mRNA-lasnic pomnožimo s koeficientom 0,2 kcal/mol/nt.

=== Zaključek ===

Ob upoštevanju vseh obravnavanih energijskih prispevkov za vezanje ribosoma na pomožno mesto 5'-UTR dobimo biofizikalni model, ki ga opisuje enačba: ∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje + ∆Gdrsenje in ki zelo dobro napove hitrost translacije.

Model so aplicirali na celoten genom (3430 5'-UTR-jev iz ''E. coli'' MG1655), kjer so za vsak modul izračunali ∆Gpomožno mesto. Odkrili so, da celotna dolžina 5'-UTR ne vpliva na hitrost translacije. Daljši 5'-UTR so, v primerjavi s krajšimi, lahko bolj strukturirani, kar zmanjšuje dostopnost mRNA ribosomu, vendar to vseeno ne povzroči večje represije iniciacije translacije.

Sekundarne strukture daljših 5'-UTR so pogosto tarče tako transkripcijskih represorjev kot transkripcijsih aktivatorjev. Gre za trans- (RNA-vezavni proteini ali pa male RNA), ki se vežejo na 5'-UTR, in cis-elemente (RNA-stikala), ki povzročajo spremembe v aktivnosti preko vezave malih ligandov.

Dodaten nivo regulacije hitrosti translacije na celotnem genomu so operoni z več promotorji. Pri teh nastane več izooblik 5'-UTR, ki se razlikujejo po hitrosti translacije. Izbira promotorja je regulacija na transkripcijski ravni, za karakterizacijo česar so potrebne še dodatne raziskave.

===Literatura ===

[1] A. E. Borujeni, A. S. Channarasappa, and H. M. Salis, “Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility , selective RNA unfolding and sliding at upstream standby sites,” Nucleic Acids Res., vol. 42, no. 4, pp. 2646–2659, 2014.

[2] C. O. Gualerzi and C. L. Pon, “Initiation of mRNA translation in bacteria: structural and dynamic aspects,” Cell. Mol. Life Sci., vol. 72, no. 22, pp. 4341–4367, 2015.

[3] G. Z. Yusupova, M. M. Yusupov, J. H. D. Cate, and H. F. Noller, “The path of messenger RNA through the ribosome,” Cell, vol. 106, pp. 233–241, 2001.

[4] M. de Smit and J. van Duin, “Control of translation by mRNA secondary structure in Escherichia coli. A quantitative analysis of literature data,” J. Mol. Biol., vol. 244, no. 2, pp. 144–150, 1994.

[5] H. Salis, E. Mirsky, and C. Voight, “Automated design of synthetic ribosome binding sires to control protein expression,” Nat Biotechnol, vol. 27, no. 10, pp. 946–950, 2010.

[6] S. M. Studer and S. Joseph, “Unfolding of mRNA secondary structure by the bacterial translation initiation complex,” Mol. Cell, vol. 22, no. 1, pp. 105–115, 2006.

===Dodatek - legenda ===

- ∆G30S-mRNA ...celokupna sprememba Gibbsove proste energije za vezavo 30S podenote ribosoma na 5'-UTR mRNA,

- ∆GmRNA ...sprememba Gibbsove proste energije za zvitje mRNA v začetno stanje (pred vezavo 30S ribosomske podenote,

- ∆GmRNA-rRNA ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med SD-zaporedjem na mRNA in anti-SD-zaporedjem na 16S rRNA,

- ∆Gvmesnik ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S ribosomske podenote na 5'-UTR z neugdno dolžino vmesnika (zaporedje med SD-zaporedjem in start-kodonom),

- ∆Gstart ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med start-kodonom na mRNA in anti-kodonom na fMet-tRNA,

- ∆Gpomožno mesto ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S podenote ribosoma na pomožno mesto,

- ∆Gprilagoditev ...sprememba Gibbsove proste energije ob konformacijskegem prilagajanju 30S podenote ribosoma sekundarnim strukturam modula na pomožnem mestu 5'-UTR,

- ∆Grazvijanje ...sprememba Gibbsove proste energije ob razvijanju modula pomožnega mesta 5'-UTR,

- ∆Gdrsenje ...sprememba Gibbsove proste energije ob drsenju 30S ribosomske podenote čez sekundarne strukture mRNA med izbranim modulom in start-kodonom,

- r ...hitrost translacije,

- β ...navidezna Boltzmannova konstanta (0,45 mol/kcal),

- F ...intenziteta fluorescence

- Fref ...referenčna intenziteta fluorescence

- H ...višina lasnice

- D ...dolžina distalnega vezavnega mesta

- P ...dolžina proksimalnegla vezavnega mesta

- As ...eno-verižna površina modula pomžnega mesta

- C1, C2 in C3 ...računalniško prilegani parametri vrednosti 0,038 kcal/mol/nt2, - 1.629 kcal/mol/nt in 17.359 kcal/mol.

Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah

2018-12-09T17:54:00Z

Neža Koritnik:

Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah

2018-12-09T17:52:52Z

Neža Koritnik:

povzeto po raziskovalnem članku ''”Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility, selective RNA unfoldnig and sliding at upstream standby sites”'' (2014) [[1]][https://academic.oup.com/nar/article/42/4/2646/2435298]

=== Uvod ===

Iniciacija translacije mRNA je pomembna točka regulacije sinteze proteinov. Pri prokariontih je to ponavadi najpočasnejša stopnja sinteze proteinov (od nje zavisi celokupna hitrost translacije), zato je podvržena različnim post-transkripcijskim mehanizmom uravnavanja izražanja genov [2].

Bakterijska iniciacija translacije se začne z nastankom 30S pre-iniciacijskega kompleksa. Ob asistenci treh iniciacijskih faktorjev (IF1-3) se 30S podenota ribosoma veže na mRNA, na start-kodon pa se rekrutira aminoacil-tRNA, ki prinese prvo aminokislino (fMet). 30S pre-iniciacijskemu komplesu se nato pridruži še 50S podenota ribosoma in tako nastane 70S iniciacijki kompleks, ki omogoči pričetek translacije [2].

Kontrola iniciacije translacije pri prokariontih je pogosto pogojena z interakcijami med 30S ribosomsko podenoto in 5'-UTR mRNA. Na hitrost translacije mRNA tako lahko vplivajo spremembe v zaporedju in sekundarni strukturi 5'-UTR. Na 5'-UTR se nahaja Shine-Dalgarnovo (SD) zaporedje, ki je definirano kot vezavno mesto za ribosom pri prokariontih. Sledi nekaj baznih parov dolg vmesnik in start-kodon. Vsi ti elementi sodelujejo pri regulaciji iniciacije tranlacije, ki je odvisna tako od SD-zaporeja (ki je konsenzno zaporedje in se med različnimi mRNA lahko razlikuje), dolžine vmesnika in tipa start-kodona (poleg AUG so možni še alternativni start-kodoni, t.j. GUG, UUG, AUU, AUC in AUA [2]). Veliko 5'-UTR-jev vsebuje še zaporedja navzgor od SD-zaporedja. Ta zaporedja lahko vsebujejo različne sekundarne strukture in tvorijo nespecifične elektrostatske interakcije s pozititivno nabitim delom površine 30S ribosomske podenote. Govorimo o pomožnem mestu (ang. ''“standby site”'') 5'-UTR.

Pomožno mesto je sestavljeno iz enega ali več modulov. Modul pomožnega mesta je vsaka posamezna sekundarna struktura mRNA, ponavadi pa gre za različno strukturirane lasnice. Raziskave kažejo [3], da ob sestavljanju 30S pre-iniciacijskega kompleksa na začetku pride do vezave 30S podenote ribosoma na pomožno mesto, kateri najprej sledi insercija mRNA skozi vhodni kanal podenote in nato komplementarno parjenje baz SD-zaporedja na mRNA in anti-SD-zaporedja na 16S rRNA, kar omogoči orientacijo start-kodona na P-mesto, kamor se tedaj rekrutira fMet-tRNA.

Za proces sestavljanja 30S pre-iniciacijskega kompleksa lahko izračunamo spremembo Gibbsove proste energije (∆G30S-mRNA), ki je neposredno povezana s hitrostjo translacije: r ∝ ''exp''(-β∆G30S-mRNA). ∆G30S-mRNA upošteva vse zgoraj navedene procese, torej prispevek parjenja baz SD- in anti-SD-zaporedja (∆GmRNA-rRNA < 0), prispevek morebitne neugodne dolžine vmesnika (∆Gvmesnik > 0), prispevek hibridizacije start-kodona in anti-kodona na fMet-tRNA (∆Gstart < 0), prispevek vezave na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto > 0) ter energijo zvitja mRNA v začetno stanje (∆GmRNA < 0). Celokupna Gibbsova prosta energija je tako: ∆G30S-mRNA = ∆GmRNA-rRNA + ∆Gvmesnik + ∆Gstart + ∆Gpomožno mesto - ∆GmRNA.

Vsi prispevki, razen ∆Gpomožno mesto, so bili predhodno že dobro okarakterizirani. Obravnavana raziskava se na podlagi strukturnih lastnosti pomožnega mesta 5'-UTR osredotoča na določitev ∆Gpomožno mesto, katero poveže s hitrostjo translacije.

=== Potek eksperimenta ===

V eksperimentu so zasnovali 136 sintetičnih 5'-UTR-jev mRNA, ki so bili sestavljeni iz različnih pomožnih mest, zaporedja navzdol pa so bila enaka (SD-zaporedje, vmesnik in start-kodon - AUG). Načrtane 5'-UTR so z metodami tehnologije rekombinantne DNA uporabili pri sestavitvi DNA-konstrukta, ki je vseboval ustrezen 5'-UTR, za start-kodonom pa zapis za reporterski protein - monomerni rdeči fluorescenčni protein 1 (mRFP1). DNA-konstrukte so vstavili v ekspresijski vektor pFTV1, ki je imel zapis za konstitutivni promor σ70 in s katerim so transformirali kompetente celice ''E. coli'' DH10B. Količino nastalega reporterskega proteina so določili z meritvami pretočne citometrije, pogoji gojenja celic pa so bili zasnovani tako, da je bila fluorescenca mRFP1 proporcionalna hitrosti (iniciacije) translacije, ta pa je proporcionalna ∆G∆G30S-mRNA in tako ∆Gpomožno mesto: ∆Gpomožno mesto = -1/β ln(F/Fref) - (∆∆Gostali prispevki).

=== Površina modula pomožnega mesta v povezavi s hitrostjo translacije ===

Pri vezavi ribosoma na 5'-UTR je strukturiranost modula pomožnega mesta eden ključnih dejavnikov, ki modulirajo sposobnost vezave ribosoma na mRNA. Modul pomožnega mesta opišemo s tremi strukturnimi parametri:
- H (višina lasnice oziroma število nukleotidov od vznožja do sredine vrhnje zanke),
- D (dolžina distalnega vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzgor od lasnice),
- P (dolžina proksimalnegla vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzdol od lasnice).

Parametri so povezani z eno-verižno površino modula (As), ki jo definira enačba: As = 15 + P + D - H. As je tista površina, ki je dostopna ribosomu. Tako velja: večja kot je As, lažja je vezava 30S ribosomske podenote na modul. ∆Gpomožno mesto je torej manjša, ko je As večja (ko sta parametra D in P večja ter parameter H manjši), in obratno. V primeru maksimalno dostopnega modula (t.j. modul brez sekundarnih struktur) velja ∆Gpomožno mesto = 0.

Navedeno so potrdile meritve pretočne citometrije, ki so jih so izvedli na celicah transofrmiranih s konstrukti, ki so na pomožnem mestu 5'-UTR vsebovale en sam modul. Intenzitete fluorescence mRFP1 so se v odvisnosti od strukturiranosti modula oziroma v odvisnoti od As razlikovale. Modul z večjo As je imel večjo fluorescenco kot modul z manjšo As, saj je bil ribosomu dostopnejši, zaradi česar je bila vezava njegove 30S podenote energijsko ugodnejša (manjša ∆Gpomožno mesto), translacija pa hitrejša.

=== Energijski kompromis med dostopnostjo in razvijanjem struktur modulov ===

Znano je, da se nekatere mRNA-strukture, ki omejujejo vezavo ribosoma na SD-mesto, pred iniciacijo translacije razvijejo, kar zahteva energijski vložek in posledično zmanjšanje hitrosti iniciacije [4]–[6]. Manj pa je znanega o tem, kaj se zgodi s strukturami pred SD-zaporedjem, torej s strukturami na pomožnem mestu. Na voljo sta dve mejni možnosti: strukture se popolnoma razvijejo in tako maksimalno povečajo dostopnost ribosomu ali pa ostanjo zvite in se jim ribosom preko konformacijskih sprememb popolnoma prilagodi. Izkaže se, da gre za kompromis med obema procesoma. Po predlaganem modelu ribosom selektivno in delno razvije modul pomožnega mesta tako, da je spremebna Gibbsove protste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto) minimalna.

Obema procesoma lahko pripišemo energijski parameter. Z ∆Gprilagoditev (> 0) okarakteriziramo tisto spremembo Gibbsove proste energije, ki je potrebna za konformacijsko prilagoditev ribosomske podenote manj dostopnemu modulu na pomožnem mestu. Količina je neposredno povezana z As in jo opisuje enačba ∆Gprilagoditev = C1(As)2 + C2(As) + C3. Velja, da večja kot je As (dostopnejši modul), manjša je ∆Gprilagoditev. Z ∆Grazvijanje (> 0) pa opišemo spremembo Gibbsove proste energije, ki se zgodi ob razvitju sekundarnih struktur modula. Za maksimalno dostopen modul velja: ∆Gprilagoditev = 0 in ∆Grazvijanje = 0. Energijska parametra obravnavamo kot prispevka k spremembi Gibbsove proste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje) in sta medsebojno odvisna. Pri manj dostopnih modulih bo tako razvitje sekundarnih struktur, za katerega je potreben vložek energije, ∆Grazvijanje, povečalo eno-verižno dostopno površino modula (As), kar bo povzorčilo večjo dostopnost, zaradi česar bo ∆Gprilagoditev manjši. Z drugimi besedami, obsežnejše razvijanje sekundarnih struktur (večja ∆Grazvijanje) bo imelo za rezultat manjše konformacijsko prilagajanje ribosoma (manjša ∆Gprilagoditev) in obratno. Procesa razvijanja struktur in konformacijskega prilagajanja ribosoma se med seboj uravnata tako, da je vsota njunih energijskijh prispevkov minimalna oziroma da je ∆Gpomožno mesto minimalen. To se v realnosti odraža tako, da ribosom sekundarno strukturo modula razvije le do določene mere in se ji nato konformacijsko prilagodi.

Teorijo so preverili tudi eksperimentalno, in sicer na sintetičnih 5'-UTR, ki so jim z upoštevanjem energijske minimizacije izračunali ∆Gpomožno mesto. Eksperimentalne vrednosti ∆Gpomožno mesto, izpeljane iz fluorescenc celic pri meritvah pretočne citometrije, so za določen 5'-UTR sovpadale s predvidenimi vrednostmi ∆Gpomožno mesto. To potrjuje mehanizem delnega in selektivnega razvijanja mRNA struktur ob vezavi ribosoma na pomožno mesto. V vseh testiranih primerih je model predvidel razvitje le 1-3 bp strukture modula, medtem ko se je ribosom preostalim velikim RNA-strukturam prilagodil.

=== Več modulov na pomožnem mestu ===

V primeru večih modulov na pomožnem mestu sta ob vezavi 30S ribosomske podenote dve možnosti: kooperativna in nekooperativna vezava. Če bi šlo za kooperativno vezavo, bi z naraščanjem modulov naraščala tudi As, kar bi pospešilo hitrost translacije. Glede na eksperimentalne podatke pa se izkaže, da se ob dodajanju števila modulov hitrost translacije ne spremeni. To priča o tem, da se 30S podenota ribosoma vedno veže le na izbrani modul - na tisti z najmanjšo ∆Gpomožno mesto. Meritve kažejo, da tudi, ko je izbrani modul zelo daleč navzgor od start-kodona, to ne vpliva na hitrost translacije. Tako mora obstajati mehanizem, ki omogoča premik podenote do oddaljenega start-kodona, kjer se sestavi 30S pre-iniciacijski kompleks. Podenota lahko difuzivno poskakuje čez vmesne sturkture (takrat bi bila hitrost iniciacije močno odvisna od razdalje med modulom in start-kodonom, manj pa od vmesnih sekundarnih struktur) ali pa drsi (takrat pa bi, zaradi stalnega kontakta, hitrost iniciacije zavisela predvsm od narave vmesnih mRNA struktur). Ker položaj modula in zato tudi razdalja od start-kodona ne vplivata na hitrost translacije, gre za mehanizem drsenja. Ob tem definiramo spremembo Gibbsove proste energije za drsenje 30S ribosomske podenote čez vmesne sekundarne strukture mRNA (∆Gdrsenje > 0), ki je posledica oviranja ribosoma na njegovi poti. ∆Gdrsenje tudi dobro sovpada z razliko med izmerjeno in izračunano vrednostjo ∆Gpomožno mesto, ki je do sedaj upoštevala le prispevke razvijanja mRNA in konformacijskega prilagajanja ribosoma. ∆Gdrsenje dobimo tako, da seštevek višin (H) vseh vmesnih mRNA-lasnic pomnožimo s koeficientom 0,2 kcal/mol/nt.

=== Zaključek ===

Ob upoštevanju vseh obravnavanih energijskih prispevkov za vezanje ribosoma na pomožno mesto 5'-UTR dobimo biofizikalni model, ki ga opisuje enačba: ∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje + ∆Gdrsenje in ki zelo dobro napove hitrost translacije.

Model so aplicirali na celoten genom (3430 5'-UTR-jev iz ''E. coli'' MG1655), kjer so za vsak modul izračunali ∆Gpomožno mesto. Odkrili so, da celotna dolžina 5'-UTR ne vpliva na hitrost translacije. Daljši 5'-UTR so, v primerjavi s krajšimi, lahko bolj strukturirani, kar zmanjšuje dostopnost mRNA ribosomu, vendar to vseeno ne povzroči večje represije iniciacije translacije.

Sekundarne strukture daljših 5'-UTR so pogosto tarče tako transkripcijskih represorjev kot transkripcijsih aktivatorjev. Gre za trans- (RNA-vezavni proteini ali pa male RNA), ki se vežejo na 5'-UTR, in cis-elemente (RNA-stikala), ki povzročajo spremembe v aktivnosti preko vezave malih ligandov.

Dodaten nivo regulacije hitrosti translacije na celotnem genomu so operoni z več promotorji. Pri teh nastane več izooblik 5'-UTR, ki se razlikujejo po hitrosti translacije. Izbira promotorja je regulacija na transkripcijski ravni, za karakterizacijo česar so potrebne še dodatne raziskave.

===Literatura ===

[1] A. E. Borujeni, A. S. Channarasappa, and H. M. Salis, “Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility , selective RNA unfolding and sliding at upstream standby sites,” Nucleic Acids Res., vol. 42, no. 4, pp. 2646–2659, 2014.

[2] C. O. Gualerzi and C. L. Pon, “Initiation of mRNA translation in bacteria: structural and dynamic aspects,” Cell. Mol. Life Sci., vol. 72, no. 22, pp. 4341–4367, 2015.

[3] G. Z. Yusupova, M. M. Yusupov, J. H. D. Cate, and H. F. Noller, “The path of messenger RNA through the ribosome,” Cell, vol. 106, pp. 233–241, 2001.

[4] M. de Smit and J. van Duin, “Control of translation by mRNA secondary structure in Escherichia coli. A quantitative analysis of literature data,” J. Mol. Biol., vol. 244, no. 2, pp. 144–150, 1994.

[5] H. Salis, E. Mirsky, and C. Voight, “Automated design of synthetic ribosome binding sires to control protein expression,” Nat Biotechnol, vol. 27, no. 10, pp. 946–950, 2010.

[6] S. M. Studer and S. Joseph, “Unfolding of mRNA secondary structure by the bacterial translation initiation complex,” Mol. Cell, vol. 22, no. 1, pp. 105–115, 2006.

===Dodatek - legenda ===

- ∆G30S-mRNA ...celokupna sprememba Gibbsove proste energije za vezavo 30S podenote ribosoma na 5'-UTR mRNA,

- ∆GmRNA ...sprememba Gibbsove proste energije za zvitje mRNA v začetno stanje (pred vezavo 30S ribosomske podenote,

- ∆GmRNA-rRNA ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med SD-zaporedjem na mRNA in anti-SD-zaporedjem na 16S rRNA,

- ∆Gvmesnik ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S ribosomske podenote na 5'-UTR z neugdno dolžino vmesnika (zaporedje med SD-zaporedjem in start-kodonom),

- ∆Gstart ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med start-kodonom na mRNA in anti-kodonom na fMet-tRNA,

- ∆Gpomožno mesto ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S podenote ribosoma na pomožno mesto,

- ∆Gprilagoditev ...sprememba Gibbsove proste energije ob konformacijskegem prilagajanju 30S podenote ribosoma sekundarnim strukturam modula na pomožnem mestu 5'-UTR,

- ∆Grazvijanje ...sprememba Gibbsove proste energije ob razvijanju modula pomožnega mesta 5'-UTR,

- ∆Gdrsenje ...sprememba Gibbsove proste energije ob drsenju 30S ribosomske podenote čez sekundarne strukture mRNA med izbranim modulom in start-kodonom,

- r ...hitrost translacije,

- β ...navidezna Boltzmannova konstanta (0,45 mol/kcal),

- F ...intenziteta fluorescence

- Fref ...referenčna intenziteta fluorescence

- H ...višina lasnice

- D ...dolžina distalnega vezavnega mesta

- P ...dolžina proksimalnegla vezavnega mesta

- As ...eno-verižna površina modula pomžnega mesta

- C1, C2 in C3 ...računalniško prilegani parametri vrednosti 0,038 kcal/mol/nt2, - 1.629 kcal/mol/nt in 17.359 kcal/mol.

Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah

2018-12-09T17:51:31Z

Neža Koritnik:

povzeto po raziskovalnem članku ''”Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility, selective RNA unfoldnig and sliding at upstream standby sites”'' (2014) [[1]][https://academic.oup.com/nar/article/42/4/2646/2435298]

=== Uvod ===

Iniciacija translacije mRNA je pomembna točka regulacije sinteze proteinov. Pri prokariontih je to ponavadi najpočasnejša stopnja sinteze proteinov (od nje zavisi celokupna hitrost translacije), zato je podvržena različnim post-transkripcijskim mehanizmom uravnavanja izražanja genov [2].

Bakterijska iniciacija translacije se začne z nastankom 30S pre-iniciacijskega kompleksa. Ob asistenci treh iniciacijskih faktorjev (IF1-3) se 30S podenota ribosoma veže na mRNA, na start-kodon pa se rekrutira aminoacil-tRNA, ki prinese prvo aminokislino (fMet). 30S pre-iniciacijskemu komplesu se nato pridruži še 50S podenota ribosoma in tako nastane 70S iniciacijki kompleks, ki omogoči pričetek translacije [2].

Kontrola iniciacije translacije pri prokariontih je pogosto pogojena z interakcijami med 30S ribosomsko podenoto in 5'-UTR mRNA. Na hitrost translacije mRNA tako lahko vplivajo spremembe v zaporedju in sekundarni strukturi 5'-UTR. Na 5'-UTR se nahaja Shine-Dalgarnovo (SD) zaporedje, ki je definirano kot vezavno mesto za ribosom pri prokariontih. Sledi nekaj baznih parov dolg vmesnik in start-kodon. Vsi ti elementi sodelujejo pri regulaciji iniciacije tranlacije, ki je odvisna tako od SD-zaporeja (ki je konsenzno zaporedje in se med različnimi mRNA lahko razlikuje), dolžine vmesnika in tipa start-kodona (poleg AUG so možni še alternativni start-kodoni, t.j. GUG, UUG, AUU, AUC in AUA [2]). Veliko 5'-UTR-jev vsebuje še zaporedja navzgor od SD-zaporedja. Ta zaporedja lahko vsebujejo različne sekundarne strukture in tvorijo nespecifične elektrostatske interakcije s pozititivno nabitim delom površine 30S ribosomske podenote. Govorimo o pomožnem mestu (ang. ''“standby site”'') 5'-UTR.

Pomožno mesto je sestavljeno iz enega ali več modulov. Modul pomožnega mesta je vsaka posamezna sekundarna struktura mRNA, ponavadi pa gre za različno strukturirane lasnice. Raziskave kažejo [3], da ob sestavljanju 30S pre-iniciacijskega kompleksa na začetku pride do vezave 30S podenote ribosoma na pomožno mesto, kateri najprej sledi insercija mRNA skozi vhodni kanal podenote in nato komplementarno parjenje baz SD-zaporedja na mRNA in anti-SD-zaporedja na 16S rRNA, kar omogoči orientacijo start-kodona na P-mesto, kamor se tedaj rekrutira fMet-tRNA.

Za proces sestavljanja 30S pre-iniciacijskega kompleksa lahko izračunamo spremembo Gibbsove proste energije (∆G30S-mRNA), ki je neposredno povezana s hitrostjo translacije: r ∝ ''exp''(-β∆G30S-mRNA). ∆G30S-mRNA upošteva vse zgoraj navedene procese, torej prispevek parjenja baz SD- in anti-SD-zaporedja (∆GmRNA-rRNA < 0), prispevek morebitne neugodne dolžine vmesnika (∆Gvmesnik > 0), prispevek hibridizacije start-kodona in anti-kodona na fMet-tRNA (∆Gstart < 0), prispevek vezave na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto > 0) ter energijo zvitja mRNA v začetno stanje (∆GmRNA < 0). Celokupna Gibbsova prosta energija je tako: ∆G30S-mRNA = ∆GmRNA-rRNA + ∆Gvmesnik + ∆Gstart + ∆Gpomožno mesto - ∆GmRNA.

Vsi prispevki, razen ∆Gpomožno mesto, so bili predhodno že dobro okarakterizirani. Obravnavana raziskava se na podlagi strukturnih lastnosti pomožnega mesta 5'-UTR osredotoča na določitev ∆Gpomožno mesto, katero poveže s hitrostjo translacije.

=== Potek eksperimenta ===

V eksperimentu so zasnovali 136 sintetičnih 5'-UTR-jev mRNA, ki so bili sestavljeni iz različnih pomožnih mest, zaporedja navzdol pa so bila enaka (SD-zaporedje, vmesnik in start-kodon - AUG). Načrtane 5'-UTR so z metodami tehnologije rekombinantne DNA uporabili pri sestavitvi DNA-konstrukta, ki je vseboval ustrezen 5'-UTR, za start-kodonom pa zapis za reporterski protein - monomerni rdeči fluorescenčni protein 1 (mRFP1). DNA-konstrukte so vstavili v ekspresijski vektor pFTV1, ki je imel zapis za konstitutivni promor σ70 in s katerim so transformirali kompetente celice ''E. coli'' DH10B. Količino nastalega reporterskega proteina so določili z meritvami pretočne citometrije, pogoji gojenja celic pa so bili zasnovani tako, da je bila fluorescenca mRFP1 proporcionalna hitrosti (iniciacije) translacije, ta pa je proporcionalna ∆G∆G30S-mRNA in tako ∆Gpomožno mesto: ∆Gpomožno mesto = -1/β ln(F/(F(ref))) - (∆∆Gostali prispevki).

=== Površina modula pomožnega mesta v povezavi s hitrostjo translacije ===

Pri vezavi ribosoma na 5'-UTR je strukturiranost modula pomožnega mesta eden ključnih dejavnikov, ki modulirajo sposobnost vezave ribosoma na mRNA. Modul pomožnega mesta opišemo s tremi strukturnimi parametri:
- H (višina lasnice oziroma število nukleotidov od vznožja do sredine vrhnje zanke),
- D (dolžina distalnega vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzgor od lasnice),
- P (dolžina proksimalnegla vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzdol od lasnice).

Parametri so povezani z eno-verižno površino modula (As), ki jo definira enačba: As = 15 + P + D - H. As je tista površina, ki je dostopna ribosomu. Tako velja: večja kot je As, lažja je vezava 30S ribosomske podenote na modul. ∆Gpomožno mesto je torej manjša, ko je As večja (ko sta parametra D in P večja ter parameter H manjši), in obratno. V primeru maksimalno dostopnega modula (t.j. modul brez sekundarnih struktur) velja ∆Gpomožno mesto = 0.

Navedeno so potrdile meritve pretočne citometrije, ki so jih so izvedli na celicah transofrmiranih s konstrukti, ki so na pomožnem mestu 5'-UTR vsebovale en sam modul. Intenzitete fluorescence mRFP1 so se v odvisnosti od strukturiranosti modula oziroma v odvisnoti od As razlikovale. Modul z večjo As je imel večjo fluorescenco kot modul z manjšo As, saj je bil ribosomu dostopnejši, zaradi česar je bila vezava njegove 30S podenote energijsko ugodnejša (manjša ∆Gpomožno mesto), translacija pa hitrejša.

=== Energijski kompromis med dostopnostjo in razvijanjem struktur modulov ===

Znano je, da se nekatere mRNA-strukture, ki omejujejo vezavo ribosoma na SD-mesto, pred iniciacijo translacije razvijejo, kar zahteva energijski vložek in posledično zmanjšanje hitrosti iniciacije [4]–[6]. Manj pa je znanega o tem, kaj se zgodi s strukturami pred SD-zaporedjem, torej s strukturami na pomožnem mestu. Na voljo sta dve mejni možnosti: strukture se popolnoma razvijejo in tako maksimalno povečajo dostopnost ribosomu ali pa ostanjo zvite in se jim ribosom preko konformacijskih sprememb popolnoma prilagodi. Izkaže se, da gre za kompromis med obema procesoma. Po predlaganem modelu ribosom selektivno in delno razvije modul pomožnega mesta tako, da je spremebna Gibbsove protste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto) minimalna.

Obema procesoma lahko pripišemo energijski parameter. Z ∆Gprilagoditev (> 0) okarakteriziramo tisto spremembo Gibbsove proste energije, ki je potrebna za konformacijsko prilagoditev ribosomske podenote manj dostopnemu modulu na pomožnem mestu. Količina je neposredno povezana z As in jo opisuje enačba ∆Gprilagoditev = C1(As)2 + C2(As) + C3. Velja, da večja kot je As (dostopnejši modul), manjša je ∆Gprilagoditev. Z ∆Grazvijanje (> 0) pa opišemo spremembo Gibbsove proste energije, ki se zgodi ob razvitju sekundarnih struktur modula. Za maksimalno dostopen modul velja: ∆Gprilagoditev = 0 in ∆Grazvijanje = 0. Energijska parametra obravnavamo kot prispevka k spremembi Gibbsove proste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje) in sta medsebojno odvisna. Pri manj dostopnih modulih bo tako razvitje sekundarnih struktur, za katerega je potreben vložek energije, ∆Grazvijanje, povečalo eno-verižno dostopno površino modula (As), kar bo povzorčilo večjo dostopnost, zaradi česar bo ∆Gprilagoditev manjši. Z drugimi besedami, obsežnejše razvijanje sekundarnih struktur (večja ∆Grazvijanje) bo imelo za rezultat manjše konformacijsko prilagajanje ribosoma (manjša ∆Gprilagoditev) in obratno. Procesa razvijanja struktur in konformacijskega prilagajanja ribosoma se med seboj uravnata tako, da je vsota njunih energijskijh prispevkov minimalna oziroma da je ∆Gpomožno mesto minimalen. To se v realnosti odraža tako, da ribosom sekundarno strukturo modula razvije le do določene mere in se ji nato konformacijsko prilagodi.

Teorijo so preverili tudi eksperimentalno, in sicer na sintetičnih 5'-UTR, ki so jim z upoštevanjem energijske minimizacije izračunali ∆Gpomožno mesto. Eksperimentalne vrednosti ∆Gpomožno mesto, izpeljane iz fluorescenc celic pri meritvah pretočne citometrije, so za določen 5'-UTR sovpadale s predvidenimi vrednostmi ∆Gpomožno mesto. To potrjuje mehanizem delnega in selektivnega razvijanja mRNA struktur ob vezavi ribosoma na pomožno mesto. V vseh testiranih primerih je model predvidel razvitje le 1-3 bp strukture modula, medtem ko se je ribosom preostalim velikim RNA-strukturam prilagodil.

=== Več modulov na pomožnem mestu ===

V primeru večih modulov na pomožnem mestu sta ob vezavi 30S ribosomske podenote dve možnosti: kooperativna in nekooperativna vezava. Če bi šlo za kooperativno vezavo, bi z naraščanjem modulov naraščala tudi As, kar bi pospešilo hitrost translacije. Glede na eksperimentalne podatke pa se izkaže, da se ob dodajanju števila modulov hitrost translacije ne spremeni. To priča o tem, da se 30S podenota ribosoma vedno veže le na izbrani modul - na tisti z najmanjšo ∆Gpomožno mesto. Meritve kažejo, da tudi, ko je izbrani modul zelo daleč navzgor od start-kodona, to ne vpliva na hitrost translacije. Tako mora obstajati mehanizem, ki omogoča premik podenote do oddaljenega start-kodona, kjer se sestavi 30S pre-iniciacijski kompleks. Podenota lahko difuzivno poskakuje čez vmesne sturkture (takrat bi bila hitrost iniciacije močno odvisna od razdalje med modulom in start-kodonom, manj pa od vmesnih sekundarnih struktur) ali pa drsi (takrat pa bi, zaradi stalnega kontakta, hitrost iniciacije zavisela predvsm od narave vmesnih mRNA struktur). Ker položaj modula in zato tudi razdalja od start-kodona ne vplivata na hitrost translacije, gre za mehanizem drsenja. Ob tem definiramo spremembo Gibbsove proste energije za drsenje 30S ribosomske podenote čez vmesne sekundarne strukture mRNA (∆Gdrsenje > 0), ki je posledica oviranja ribosoma na njegovi poti. ∆Gdrsenje tudi dobro sovpada z razliko med izmerjeno in izračunano vrednostjo ∆Gpomožno mesto, ki je do sedaj upoštevala le prispevke razvijanja mRNA in konformacijskega prilagajanja ribosoma. ∆Gdrsenje dobimo tako, da seštevek višin (H) vseh vmesnih mRNA-lasnic pomnožimo s koeficientom 0,2 kcal/mol/nt.

=== Zaključek ===

Ob upoštevanju vseh obravnavanih energijskih prispevkov za vezanje ribosoma na pomožno mesto 5'-UTR dobimo biofizikalni model, ki ga opisuje enačba: ∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje + ∆Gdrsenje in ki zelo dobro napove hitrost translacije.

Model so aplicirali na celoten genom (3430 5'-UTR-jev iz ''E. coli'' MG1655), kjer so za vsak modul izračunali ∆Gpomožno mesto. Odkrili so, da celotna dolžina 5'-UTR ne vpliva na hitrost translacije. Daljši 5'-UTR so, v primerjavi s krajšimi, lahko bolj strukturirani, kar zmanjšuje dostopnost mRNA ribosomu, vendar to vseeno ne povzroči večje represije iniciacije translacije.

Sekundarne strukture daljših 5'-UTR so pogosto tarče tako transkripcijskih represorjev kot transkripcijsih aktivatorjev. Gre za trans- (RNA-vezavni proteini ali pa male RNA), ki se vežejo na 5'-UTR, in cis-elemente (RNA-stikala), ki povzročajo spremembe v aktivnosti preko vezave malih ligandov.

Dodaten nivo regulacije hitrosti translacije na celotnem genomu so operoni z več promotorji. Pri teh nastane več izooblik 5'-UTR, ki se razlikujejo po hitrosti translacije. Izbira promotorja je regulacija na transkripcijski ravni, za karakterizacijo česar so potrebne še dodatne raziskave.

===Literatura ===

[1] A. E. Borujeni, A. S. Channarasappa, and H. M. Salis, “Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility , selective RNA unfolding and sliding at upstream standby sites,” Nucleic Acids Res., vol. 42, no. 4, pp. 2646–2659, 2014.

[2] C. O. Gualerzi and C. L. Pon, “Initiation of mRNA translation in bacteria: structural and dynamic aspects,” Cell. Mol. Life Sci., vol. 72, no. 22, pp. 4341–4367, 2015.

[3] G. Z. Yusupova, M. M. Yusupov, J. H. D. Cate, and H. F. Noller, “The path of messenger RNA through the ribosome,” Cell, vol. 106, pp. 233–241, 2001.

[4] M. de Smit and J. van Duin, “Control of translation by mRNA secondary structure in Escherichia coli. A quantitative analysis of literature data,” J. Mol. Biol., vol. 244, no. 2, pp. 144–150, 1994.

[5] H. Salis, E. Mirsky, and C. Voight, “Automated design of synthetic ribosome binding sires to control protein expression,” Nat Biotechnol, vol. 27, no. 10, pp. 946–950, 2010.

[6] S. M. Studer and S. Joseph, “Unfolding of mRNA secondary structure by the bacterial translation initiation complex,” Mol. Cell, vol. 22, no. 1, pp. 105–115, 2006.

===Dodatek - legenda ===

- ∆G30S-mRNA ...celokupna sprememba Gibbsove proste energije za vezavo 30S podenote ribosoma na 5'-UTR mRNA,

- ∆GmRNA ...sprememba Gibbsove proste energije za zvitje mRNA v začetno stanje (pred vezavo 30S ribosomske podenote,

- ∆GmRNA-rRNA ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med SD-zaporedjem na mRNA in anti-SD-zaporedjem na 16S rRNA,

- ∆Gvmesnik ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S ribosomske podenote na 5'-UTR z neugdno dolžino vmesnika (zaporedje med SD-zaporedjem in start-kodonom),

- ∆Gstart ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med start-kodonom na mRNA in anti-kodonom na fMet-tRNA,

- ∆Gpomožno mesto ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S podenote ribosoma na pomožno mesto,

- ∆Gprilagoditev ...sprememba Gibbsove proste energije ob konformacijskegem prilagajanju 30S podenote ribosoma sekundarnim strukturam modula na pomožnem mestu 5'-UTR,

- ∆Grazvijanje ...sprememba Gibbsove proste energije ob razvijanju modula pomožnega mesta 5'-UTR,

- ∆Gdrsenje ...sprememba Gibbsove proste energije ob drsenju 30S ribosomske podenote čez sekundarne strukture mRNA med izbranim modulom in start-kodonom,

- r ...hitrost translacije,

- β ...navidezna Boltzmannova konstanta (0,45 mol/kcal),

- F ...intenziteta fluorescence

- Fref ...referenčna intenziteta fluorescence

- H ...višina lasnice

- D ...dolžina distalnega vezavnega mesta

- P ...dolžina proksimalnegla vezavnega mesta

- As ...eno-verižna površina modula pomžnega mesta

- C1, C2 in C3 ...računalniško prilegani parametri vrednosti 0,038 kcal/mol/nt2, - 1.629 kcal/mol/nt in 17.359 kcal/mol.

Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah

2018-12-09T17:50:31Z

Neža Koritnik:

povzeto po raziskovalnem članku ''”Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility, selective RNA unfoldnig and sliding at upstream standby sites”'' (2014) [[1]][https://academic.oup.com/nar/article/42/4/2646/2435298]

=== Uvod ===

Iniciacija translacije mRNA je pomembna točka regulacije sinteze proteinov. Pri prokariontih je to ponavadi najpočasnejša stopnja sinteze proteinov (od nje zavisi celokupna hitrost translacije), zato je podvržena različnim post-transkripcijskim mehanizmom uravnavanja izražanja genov [2].

Bakterijska iniciacija translacije se začne z nastankom 30S pre-iniciacijskega kompleksa. Ob asistenci treh iniciacijskih faktorjev (IF1-3) se 30S podenota ribosoma veže na mRNA, na start-kodon pa se rekrutira aminoacil-tRNA, ki prinese prvo aminokislino (fMet). 30S pre-iniciacijskemu komplesu se nato pridruži še 50S podenota ribosoma in tako nastane 70S iniciacijki kompleks, ki omogoči pričetek translacije [2].

Kontrola iniciacije translacije pri prokariontih je pogosto pogojena z interakcijami med 30S ribosomsko podenoto in 5'-UTR mRNA. Na hitrost translacije mRNA tako lahko vplivajo spremembe v zaporedju in sekundarni strukturi 5'-UTR. Na 5'-UTR se nahaja Shine-Dalgarnovo (SD) zaporedje, ki je definirano kot vezavno mesto za ribosom pri prokariontih. Sledi nekaj baznih parov dolg vmesnik in start-kodon. Vsi ti elementi sodelujejo pri regulaciji iniciacije tranlacije, ki je odvisna tako od SD-zaporeja (ki je konsenzno zaporedje in se med različnimi mRNA lahko razlikuje), dolžine vmesnika in tipa start-kodona (poleg AUG so možni še alternativni start-kodoni, t.j. GUG, UUG, AUU, AUC in AUA [2]). Veliko 5'-UTR-jev vsebuje še zaporedja navzgor od SD-zaporedja. Ta zaporedja lahko vsebujejo različne sekundarne strukture in tvorijo nespecifične elektrostatske interakcije s pozititivno nabitim delom površine 30S ribosomske podenote. Govorimo o pomožnem mestu (ang. “standby site”) 5'-UTR.

Pomožno mesto je sestavljeno iz enega ali več modulov. Modul pomožnega mesta je vsaka posamezna sekundarna struktura mRNA, ponavadi pa gre za različno strukturirane lasnice. Raziskave kažejo [3], da ob sestavljanju 30S pre-iniciacijskega kompleksa na začetku pride do vezave 30S podenote ribosoma na pomožno mesto, kateri najprej sledi insercija mRNA skozi vhodni kanal podenote in nato komplementarno parjenje baz SD-zaporedja na mRNA in anti-SD-zaporedja na 16S rRNA, kar omogoči orientacijo start-kodona na P-mesto, kamor se tedaj rekrutira fMet-tRNA.

Za proces sestavljanja 30S pre-iniciacijskega kompleksa lahko izračunamo spremembo Gibbsove proste energije (∆G30S-mRNA), ki je neposredno povezana s hitrostjo translacije: r ∝ ''exp''(-β∆G30S-mRNA). ∆G30S-mRNA upošteva vse zgoraj navedene procese, torej prispevek parjenja baz SD- in anti-SD-zaporedja (∆GmRNA-rRNA < 0), prispevek morebitne neugodne dolžine vmesnika (∆Gvmesnik > 0), prispevek hibridizacije start-kodona in anti-kodona na fMet-tRNA (∆Gstart < 0), prispevek vezave na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto > 0) ter energijo zvitja mRNA v začetno stanje (∆GmRNA < 0). Celokupna Gibbsova prosta energija je tako: ∆G30S-mRNA = ∆GmRNA-rRNA + ∆Gvmesnik + ∆Gstart + ∆Gpomožno mesto - ∆GmRNA.

Vsi prispevki, razen ∆Gpomožno mesto, so bili predhodno že dobro okarakterizirani. Obravnavana raziskava se na podlagi strukturnih lastnosti pomožnega mesta 5'-UTR osredotoča na določitev ∆Gpomožno mesto, katero poveže s hitrostjo translacije.

=== Potek eksperimenta ===

V eksperimentu so zasnovali 136 sintetičnih 5'-UTR-jev mRNA, ki so bili sestavljeni iz različnih pomožnih mest, zaporedja navzdol pa so bila enaka (SD-zaporedje, vmesnik in start-kodon - AUG). Načrtane 5'-UTR so z metodami tehnologije rekombinantne DNA uporabili pri sestavitvi DNA-konstrukta, ki je vseboval ustrezen 5'-UTR, za start-kodonom pa zapis za reporterski protein - monomerni rdeči fluorescenčni protein 1 (mRFP1). DNA-konstrukte so vstavili v ekspresijski vektor pFTV1, ki je imel zapis za konstitutivni promor σ∆G70 in s katerim so transformirali kompetente celice ''E. coli'' DH10B. Količino nastalega reporterskega proteina so določili z meritvami pretočne citometrije, pogoji gojenja celic pa so bili zasnovani tako, da je bila fluorescenca mRFP1 proporcionalna hitrosti (iniciacije) translacije, ta pa je proporcionalna ∆G∆G30S-mRNA in tako ∆Gpomožno mesto: ∆Gpomožno mesto = -1/β ln(F/(F(ref))) - (∆∆Gostali prispevki).

=== Površina modula pomožnega mesta v povezavi s hitrostjo translacije ===

Pri vezavi ribosoma na 5'-UTR je strukturiranost modula pomožnega mesta eden ključnih dejavnikov, ki modulirajo sposobnost vezave ribosoma na mRNA. Modul pomožnega mesta opišemo s tremi strukturnimi parametri:
- H (višina lasnice oziroma število nukleotidov od vznožja do sredine vrhnje zanke),
- D (dolžina distalnega vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzgor od lasnice),
- P (dolžina proksimalnegla vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzdol od lasnice).

Parametri so povezani z eno-verižno površino modula (As), ki jo definira enačba: As = 15 + P + D - H. As je tista površina, ki je dostopna ribosomu. Tako velja: večja kot je As, lažja je vezava 30S ribosomske podenote na modul. ∆Gpomožno mesto je torej manjša, ko je As večja (ko sta parametra D in P večja ter parameter H manjši), in obratno. V primeru maksimalno dostopnega modula (t.j. modul brez sekundarnih struktur) velja ∆Gpomožno mesto = 0.

Navedeno so potrdile meritve pretočne citometrije, ki so jih so izvedli na celicah transofrmiranih s konstrukti, ki so na pomožnem mestu 5'-UTR vsebovale en sam modul. Intenzitete fluorescence mRFP1 so se v odvisnosti od strukturiranosti modula oziroma v odvisnoti od As razlikovale. Modul z večjo As je imel večjo fluorescenco kot modul z manjšo As, saj je bil ribosomu dostopnejši, zaradi česar je bila vezava njegove 30S podenote energijsko ugodnejša (manjša ∆Gpomožno mesto), translacija pa hitrejša.

=== Energijski kompromis med dostopnostjo in razvijanjem struktur modulov ===

Znano je, da se nekatere mRNA-strukture, ki omejujejo vezavo ribosoma na SD-mesto, pred iniciacijo translacije razvijejo, kar zahteva energijski vložek in posledično zmanjšanje hitrosti iniciacije [4]–[6]. Manj pa je znanega o tem, kaj se zgodi s strukturami pred SD-zaporedjem, torej s strukturami na pomožnem mestu. Na voljo sta dve mejni možnosti: strukture se popolnoma razvijejo in tako maksimalno povečajo dostopnost ribosomu ali pa ostanjo zvite in se jim ribosom preko konformacijskih sprememb popolnoma prilagodi. Izkaže se, da gre za kompromis med obema procesoma. Po predlaganem modelu ribosom selektivno in delno razvije modul pomožnega mesta tako, da je spremebna Gibbsove protste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto) minimalna.

Obema procesoma lahko pripišemo energijski parameter. Z ∆Gprilagoditev (> 0) okarakteriziramo tisto spremembo Gibbsove proste energije, ki je potrebna za konformacijsko prilagoditev ribosomske podenote manj dostopnemu modulu na pomožnem mestu. Količina je neposredno povezana z As in jo opisuje enačba ∆Gprilagoditev = C1(As)2 + C2(As) + C3. Velja, da večja kot je As (dostopnejši modul), manjša je ∆Gprilagoditev. Z ∆Grazvijanje (> 0) pa opišemo spremembo Gibbsove proste energije, ki se zgodi ob razvitju sekundarnih struktur modula. Za maksimalno dostopen modul velja: ∆Gprilagoditev = 0 in ∆Grazvijanje = 0. Energijska parametra obravnavamo kot prispevka k spremembi Gibbsove proste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje) in sta medsebojno odvisna. Pri manj dostopnih modulih bo tako razvitje sekundarnih struktur, za katerega je potreben vložek energije, ∆Grazvijanje, povečalo eno-verižno dostopno površino modula (As), kar bo povzorčilo večjo dostopnost, zaradi česar bo ∆Gprilagoditev manjši. Z drugimi besedami, obsežnejše razvijanje sekundarnih struktur (večja ∆Grazvijanje) bo imelo za rezultat manjše konformacijsko prilagajanje ribosoma (manjša ∆Gprilagoditev) in obratno. Procesa razvijanja struktur in konformacijskega prilagajanja ribosoma se med seboj uravnata tako, da je vsota njunih energijskijh prispevkov minimalna oziroma da je ∆Gpomožno mesto minimalen. To se v realnosti odraža tako, da ribosom sekundarno strukturo modula razvije le do določene mere in se ji nato konformacijsko prilagodi.

Teorijo so preverili tudi eksperimentalno, in sicer na sintetičnih 5'-UTR, ki so jim z upoštevanjem energijske minimizacije izračunali ∆Gpomožno mesto. Eksperimentalne vrednosti ∆Gpomožno mesto, izpeljane iz fluorescenc celic pri meritvah pretočne citometrije, so za določen 5'-UTR sovpadale s predvidenimi vrednostmi ∆Gpomožno mesto. To potrjuje mehanizem delnega in selektivnega razvijanja mRNA struktur ob vezavi ribosoma na pomožno mesto. V vseh testiranih primerih je model predvidel razvitje le 1-3 bp strukture modula, medtem ko se je ribosom preostalim velikim RNA-strukturam prilagodil.

=== Več modulov na pomožnem mestu ===

V primeru večih modulov na pomožnem mestu sta ob vezavi 30S ribosomske podenote dve možnosti: kooperativna in nekooperativna vezava. Če bi šlo za kooperativno vezavo, bi z naraščanjem modulov naraščala tudi As, kar bi pospešilo hitrost translacije. Glede na eksperimentalne podatke pa se izkaže, da se ob dodajanju števila modulov hitrost translacije ne spremeni. To priča o tem, da se 30S podenota ribosoma vedno veže le na izbrani modul - na tisti z najmanjšo ∆Gpomožno mesto. Meritve kažejo, da tudi, ko je izbrani modul zelo daleč navzgor od start-kodona, to ne vpliva na hitrost translacije. Tako mora obstajati mehanizem, ki omogoča premik podenote do oddaljenega start-kodona, kjer se sestavi 30S pre-iniciacijski kompleks. Podenota lahko difuzivno poskakuje čez vmesne sturkture (takrat bi bila hitrost iniciacije močno odvisna od razdalje med modulom in start-kodonom, manj pa od vmesnih sekundarnih struktur) ali pa drsi (takrat pa bi, zaradi stalnega kontakta, hitrost iniciacije zavisela predvsm od narave vmesnih mRNA struktur). Ker položaj modula in zato tudi razdalja od start-kodona ne vplivata na hitrost translacije, gre za mehanizem drsenja. Ob tem definiramo spremembo Gibbsove proste energije za drsenje 30S ribosomske podenote čez vmesne sekundarne strukture mRNA (∆Gdrsenje > 0), ki je posledica oviranja ribosoma na njegovi poti. ∆Gdrsenje tudi dobro sovpada z razliko med izmerjeno in izračunano vrednostjo ∆Gpomožno mesto, ki je do sedaj upoštevala le prispevke razvijanja mRNA in konformacijskega prilagajanja ribosoma. ∆Gdrsenje dobimo tako, da seštevek višin (H) vseh vmesnih mRNA-lasnic pomnožimo s koeficientom 0,2 kcal/mol/nt.

=== Zaključek ===

Ob upoštevanju vseh obravnavanih energijskih prispevkov za vezanje ribosoma na pomožno mesto 5'-UTR dobimo biofizikalni model, ki ga opisuje enačba: ∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje + ∆Gdrsenje in ki zelo dobro napove hitrost translacije.

Model so aplicirali na celoten genom (3430 5'-UTR-jev iz ''E. coli'' MG1655), kjer so za vsak modul izračunali ∆Gpomožno mesto. Odkrili so, da celotna dolžina 5'-UTR ne vpliva na hitrost translacije. Daljši 5'-UTR so, v primerjavi s krajšimi, lahko bolj strukturirani, kar zmanjšuje dostopnost mRNA ribosomu, vendar to vseeno ne povzroči večje represije iniciacije translacije.

Sekundarne strukture daljših 5'-UTR so pogosto tarče tako transkripcijskih represorjev kot transkripcijsih aktivatorjev. Gre za trans- (RNA-vezavni proteini ali pa male RNA), ki se vežejo na 5'-UTR, in cis-elemente (RNA-stikala), ki povzročajo spremembe v aktivnosti preko vezave malih ligandov.

Dodaten nivo regulacije hitrosti translacije na celotnem genomu so operoni z več promotorji. Pri teh nastane več izooblik 5'-UTR, ki se razlikujejo po hitrosti translacije. Izbira promotorja je regulacija na transkripcijski ravni, za karakterizacijo česar so potrebne še dodatne raziskave.

===Literatura ===

[1] A. E. Borujeni, A. S. Channarasappa, and H. M. Salis, “Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility , selective RNA unfolding and sliding at upstream standby sites,” Nucleic Acids Res., vol. 42, no. 4, pp. 2646–2659, 2014.

[2] C. O. Gualerzi and C. L. Pon, “Initiation of mRNA translation in bacteria: structural and dynamic aspects,” Cell. Mol. Life Sci., vol. 72, no. 22, pp. 4341–4367, 2015.

[3] G. Z. Yusupova, M. M. Yusupov, J. H. D. Cate, and H. F. Noller, “The path of messenger RNA through the ribosome,” Cell, vol. 106, pp. 233–241, 2001.

[4] M. de Smit and J. van Duin, “Control of translation by mRNA secondary structure in Escherichia coli. A quantitative analysis of literature data,” J. Mol. Biol., vol. 244, no. 2, pp. 144–150, 1994.

[5] H. Salis, E. Mirsky, and C. Voight, “Automated design of synthetic ribosome binding sires to control protein expression,” Nat Biotechnol, vol. 27, no. 10, pp. 946–950, 2010.

[6] S. M. Studer and S. Joseph, “Unfolding of mRNA secondary structure by the bacterial translation initiation complex,” Mol. Cell, vol. 22, no. 1, pp. 105–115, 2006.

===Dodatek - legenda ===

- ∆G30S-mRNA ...celokupna sprememba Gibbsove proste energije za vezavo 30S podenote ribosoma na 5'-UTR mRNA,

- ∆GmRNA ...sprememba Gibbsove proste energije za zvitje mRNA v začetno stanje (pred vezavo 30S ribosomske podenote,

- ∆GmRNA-rRNA ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med SD-zaporedjem na mRNA in anti-SD-zaporedjem na 16S rRNA,

- ∆Gvmesnik ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S ribosomske podenote na 5'-UTR z neugdno dolžino vmesnika (zaporedje med SD-zaporedjem in start-kodonom),

- ∆Gstart ...sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med start-kodonom na mRNA in anti-kodonom na fMet-tRNA,

- ∆Gpomožno mesto ...sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S podenote ribosoma na pomožno mesto,

- ∆Gprilagoditev ...sprememba Gibbsove proste energije ob konformacijskegem prilagajanju 30S podenote ribosoma sekundarnim strukturam modula na pomožnem mestu 5'-UTR,

- ∆Grazvijanje ...sprememba Gibbsove proste energije ob razvijanju modula pomožnega mesta 5'-UTR,

- ∆Gdrsenje ...sprememba Gibbsove proste energije ob drsenju 30S ribosomske podenote čez sekundarne strukture mRNA med izbranim modulom in start-kodonom,

- r ...hitrost translacije,

- β ...navidezna Boltzmannova konstanta (0,45 mol/kcal),

- F ...intenziteta fluorescence

- Fref ...referenčna intenziteta fluorescence

- H ...višina lasnice

- D ...dolžina distalnega vezavnega mesta

- P ...dolžina proksimalnegla vezavnega mesta

- As ...eno-verižna površina modula pomžnega mesta

- C1, C2 in C3 ...računalniško prilegani parametri vrednosti 0,038 kcal/mol/nt2, - 1.629 kcal/mol/nt in 17.359 kcal/mol.

Seminarji SB 2018/19

2018-12-09T17:47:08Z

Neža Koritnik:

V študijskem letu 2018/19 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RNA-stikala_tipa_%C2%BBToehold%C2%AB:_de_novo_oblikovani_regulatorji_izra%C5%BEanja_genov RNA-stikala tipa Toehold: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov] (Špela Malenšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Raznoliko_in_modelno_zasnovana_priprava_sinteti%C4%8Dnih_genskih_vezij_s_predvidenimi_lastnostmi Raznoliko in modelno zasnovana priprava sintetičnih genskih vezij s predvidenimi lastnostmi] (Matej Kolarič)

[[Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage]] (Fran Krstanović)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nekaj_pogledov_na_sistemsko_biologijo_kvasovke Nekaj pogledov na sistemsko biologijo kvasovke] (Gašper Žun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organizacija_znotrajceli%C4%8Dnih_reakcij_z_razumsko_na%C4%8Drtovanimi_RNA_sestavi#Na.C4.8Drtovanje_in_sestavljanje_RNA_sestavov Organizacija znotrajceličnih reakcij z razumsko načrtovanimi RNA sestavi] (Urška Jelenovec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biolo%C5%A1ko_vezje_na_osnovi_RNA-interference_za_identifikacijo_specifi%C4%8Dnih_rakavih_celic Biološko vezje na osnovi RNA-interference za identifikacijo specifičnih rakavih celic] (Gašper Marinšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kontrola_hitrosti_translacije_preko_pomožnega_mesta_5’-UTR:_energijski_kompromis_med_dostopnostjo%2C_selektivnim_razvijanjem_RNA-struktur_in_drsenjem_30S_ribosomske_podenote_po_RNA-strukturah Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah] (Neža Koritnik)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

22.11. 
1 
2 Valentina Levak 

27.11. 
1 
2 
3 
4 

29.11. 
1 Matej Kolarič 
2 Špela Malenšek 
3 
4 

4.12. 
1 Gašper Žun 
2 Fran Krstanovic 
3 
4 

6.12. 
1 Urška Jelenovec 
2 Rok Miklavčič 
3 
4 

11.12. 
1 Jerneja Ovčar 
2 Neža Koritnik 
3 Gašper Virant 
4 Gašper Marinšek 

18.12. 
1 Tina Požun 
2 Anamarija Habič 
3 Roberta Mulac 
4 Kity Požek 

3.1. 
1 Urška Kašnik 
2 Nina Mavec 
3 Primož Tič 
4 Ernest Šprager 

8.1. 
1 Marija Atanasova 
2 Bine Tršavec 
3 Peter Pečan 
4 Tjaša Sorčan 

10.1. 
1 Špela Koren 
2 Natalija Pucihar 
3 Karmen Žbogar 
4 Uroš Zavrtanik 

15.1. 
1 Jerneja Kocutar 
2 Blaž Lebar 
3 Tadej Satler 
4 Miha Koprivnikar Krajnc 

17.1. 
1 Milena Stojkovska 
2

Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah

2018-12-09T17:42:25Z

Neža Koritnik: New page: povzeto po raziskovalnem članku ''”Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility, selective RNA unfoldnig and sliding at upstream standby sites”'' (2...

povzeto po raziskovalnem članku ''”Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility, selective RNA unfoldnig and sliding at upstream standby sites”'' (2014) [[1]][https://academic.oup.com/nar/article/42/4/2646/2435298]

=== Uvod ===

Iniciacija translacije mRNA je pomembna točka regulacije sinteze proteinov. Pri prokariontih je to ponavadi najpočasnejša stopnja sinteze proteinov (od nje zavisi celokupna hitrost translacije), zato je podvržena različnim post-transkripcijskim mehanizmom uravnavanja izražanja genov [2].

Bakterijska iniciacija translacije se začne z nastankom 30S pre-iniciacijskega kompleksa. Ob asistenci treh iniciacijskih faktorjev (IF1-3) se 30S podenota ribosoma veže na mRNA, na start-kodon pa se rekrutira aminoacil-tRNA, ki prinese prvo aminokislino (fMet). 30S pre-iniciacijskemu komplesu se nato pridruži še 50S podenota ribosoma in tako nastane 70S iniciacijki kompleks, ki omogoči pričetek translacije [2].

Kontrola iniciacije translacije pri prokariontih je pogosto pogojena z interakcijami med 30S ribosomsko podenoto in 5'-UTR mRNA. Na hitrost translacije mRNA tako lahko vplivajo spremembe v zaporedju in sekundarni strukturi 5'-UTR. Na 5'-UTR se nahaja Shine-Dalgarnovo (SD) zaporedje, ki je definirano kot vezavno mesto za ribosom pri prokariontih. Sledi nekaj baznih parov dolg vmesnik in start-kodon. Vsi ti elementi sodelujejo pri regulaciji iniciacije tranlacije, ki je odvisna tako od SD-zaporeja (ki je konsenzno zaporedje in se med različnimi mRNA lahko razlikuje), dolžine vmesnika in tipa start-kodona (poleg AUG so možni še alternativni start-kodoni, t.j. GUG, UUG, AUU, AUC in AUA [2]). Veliko 5'-UTR-jev vsebuje še zaporedja navzgor od SD-zaporedja. Ta zaporedja lahko vsebujejo različne sekundarne strukture in tvorijo nespecifične elektrostatske interakcije s pozititivno nabitim delom površine 30S ribosomske podenote. Govorimo o pomožnem mestu (ang. “standby site”) 5'-UTR.

Pomožno mesto je sestavljeno iz enega ali več modulov. Modul pomožnega mesta je vsaka posamezna sekundarna struktura mRNA, ponavadi pa gre za različno strukturirane lasnice. Raziskave kažejo [3], da ob sestavljanju 30S pre-iniciacijskega kompleksa na začetku pride do vezave 30S podenote ribosoma na pomožno mesto, kateri najprej sledi insercija mRNA skozi vhodni kanal podenote in nato komplementarno parjenje baz SD-zaporedja na mRNA in anti-SD-zaporedja na 16S rRNA, kar omogoči orientacijo start-kodona na P-mesto, kamor se tedaj rekrutira fMet-tRNA.

Za proces sestavljanja 30S pre-iniciacijskega kompleksa lahko izračunamo spremembo Gibbsove proste energije (∆G30S-mRNA), ki je neposredno povezana s hitrostjo translacije: r ∝ ''exp''(-β∆G30S-mRNA). ∆G30S-mRNA upošteva vse zgoraj navedene procese, torej prispevek parjenja baz SD- in anti-SD-zaporedja (∆GmRNA-rRNA < 0), prispevek morebitne neugodne dolžine vmesnika (∆Gvmesnik > 0), prispevek hibridizacije start-kodona in anti-kodona na fMet-tRNA (∆Gstart < 0), prispevek vezave na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto > 0) ter energijo zvitja mRNA v začetno stanje (∆GmRNA < 0). Celokupna Gibbsova prosta energija je tako: ∆G30S-mRNA = ∆GmRNA-rRNA + ∆Gvmesnik + ∆Gstart + ∆Gpomožno mesto - ∆GmRNA.

Vsi prispevki, razen ∆Gpomožno mesto, so bili predhodno že dobro okarakterizirani. Obravnavana raziskava se na podlagi strukturnih lastnosti pomožnega mesta 5'-UTR osredotoča na določitev ∆Gpomožno mesto, katero poveže s hitrostjo translacije.

=== Potek eksperimenta ===

V eksperimentu so zasnovali 136 sintetičnih 5'-UTR-jev mRNA, ki so bili sestavljeni iz različnih pomožnih mest, zaporedja navzdol pa so bila enaka (SD-zaporedje, vmesnik in start-kodon - AUG). Načrtane 5'-UTR so z metodami tehnologije rekombinantne DNA uporabili pri sestavitvi DNA-konstrukta, ki je vseboval ustrezen 5'-UTR, za start-kodonom pa zapis za reporterski protein - monomerni rdeči fluorescenčni protein 1 (mRFP1). DNA-konstrukte so vstavili v ekspresijski vektor pFTV1, ki je imel zapis za konstitutivni promor σ∆G70 in s katerim so transformirali kompetente celice ''E. coli'' DH10B. Količino nastalega reporterskega proteina so določili z meritvami pretočne citometrije, pogoji gojenja celic pa so bili zasnovani tako, da je bila fluorescenca mRFP1 proporcionalna hitrosti (iniciacije) translacije, ta pa je proporcionalna ∆G∆G30S-mRNA in tako ∆Gpomožno mesto: ∆Gpomožno mesto = -1/β ln(F/(F(ref))) - (∆∆Gostali prispevki).

=== Površina modula pomožnega mesta v povezavi s hitrostjo translacije ===

Pri vezavi ribosoma na 5'-UTR je strukturiranost modula pomožnega mesta eden ključnih dejavnikov, ki modulirajo sposobnost vezave ribosoma na mRNA. Modul pomožnega mesta opišemo s tremi strukturnimi parametri:
- H (višina lasnice oziroma število nukleotidov od vznožja do sredine vrhnje zanke),
- D (dolžina distalnega vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzgor od lasnice),
- P (dolžina proksimalnegla vezavnega mesta oziroma število nukleotidov navzdol od lasnice).

Parametri so povezani z eno-verižno površino modula (As), ki jo definira enačba: As = 15 + P + D - H. As je tista površina, ki je dostopna ribosomu. Tako velja: večja kot je As, lažja je vezava 30S ribosomske podenote na modul. ∆Gpomožno mesto je torej manjša, ko je As večja (ko sta parametra D in P večja ter parameter H manjši), in obratno. V primeru maksimalno dostopnega modula (t.j. modul brez sekundarnih struktur) velja ∆Gpomožno mesto = 0.

Navedeno so potrdile meritve pretočne citometrije, ki so jih so izvedli na celicah transofrmiranih s konstrukti, ki so na pomožnem mestu 5'-UTR vsebovale en sam modul. Intenzitete fluorescence mRFP1 so se v odvisnosti od strukturiranosti modula oziroma v odvisnoti od As razlikovale. Modul z večjo As je imel večjo fluorescenco kot modul z manjšo As, saj je bil ribosomu dostopnejši, zaradi česar je bila vezava njegove 30S podenote energijsko ugodnejša (manjša ∆Gpomožno mesto), translacija pa hitrejša.

=== Energijski kompromis med dostopnostjo in razvijanjem struktur modulov ===

Znano je, da se nekatere mRNA-strukture, ki omejujejo vezavo ribosoma na SD-mesto, pred iniciacijo translacije razvijejo, kar zahteva energijski vložek in posledično zmanjšanje hitrosti iniciacije [4]–[6]. Manj pa je znanega o tem, kaj se zgodi s strukturami pred SD-zaporedjem, torej s strukturami na pomožnem mestu. Na voljo sta dve mejni možnosti: strukture se popolnoma razvijejo in tako maksimalno povečajo dostopnost ribosomu ali pa ostanjo zvite in se jim ribosom preko konformacijskih sprememb popolnoma prilagodi. Izkaže se, da gre za kompromis med obema procesoma. Po predlaganem modelu ribosom selektivno in delno razvije modul pomožnega mesta tako, da je spremebna Gibbsove protste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto) minimalna.

Obema procesoma lahko pripišemo energijski parameter. Z ∆Gprilagoditev (> 0) okarakteriziramo tisto spremembo Gibbsove proste energije, ki je potrebna za konformacijsko prilagoditev ribosomske podenote manj dostopnemu modulu na pomožnem mestu. Količina je neposredno povezana z As in jo opisuje enačba ∆Gprilagoditev = C1(As)2 + C2(As) + C3. Velja, da večja kot je As (dostopnejši modul), manjša je ∆Gprilagoditev. Z ∆Grazvijanje (> 0) pa opišemo spremembo Gibbsove proste energije, ki se zgodi ob razvitju sekundarnih struktur modula. Za maksimalno dostopen modul velja: ∆Gprilagoditev = 0 in ∆Grazvijanje = 0. Energijska parametra obravnavamo kot prispevka k spremembi Gibbsove proste energije vezanja ribosoma na pomožno mesto (∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje) in sta medsebojno odvisna. Pri manj dostopnih modulih bo tako razvitje sekundarnih struktur, za katerega je potreben vložek energije, ∆Grazvijanje, povečalo eno-verižno dostopno površino modula (As), kar bo povzorčilo večjo dostopnost, zaradi česar bo ∆Gprilagoditev manjši. Z drugimi besedami, obsežnejše razvijanje sekundarnih struktur (večja ∆Grazvijanje) bo imelo za rezultat manjše konformacijsko prilagajanje ribosoma (manjša ∆Gprilagoditev) in obratno. Procesa razvijanja struktur in konformacijskega prilagajanja ribosoma se med seboj uravnata tako, da je vsota njunih energijskijh prispevkov minimalna oziroma da je ∆Gpomožno mesto minimalen. To se v realnosti odraža tako, da ribosom sekundarno strukturo modula razvije le do določene mere in se ji nato konformacijsko prilagodi.

Teorijo so preverili tudi eksperimentalno, in sicer na sintetičnih 5'-UTR, ki so jim z upoštevanjem energijske minimizacije izračunali ∆Gpomožno mesto. Eksperimentalne vrednosti ∆Gpomožno mesto, izpeljane iz fluorescenc celic pri meritvah pretočne citometrije, so za določen 5'-UTR sovpadale s predvidenimi vrednostmi ∆Gpomožno mesto. To potrjuje mehanizem delnega in selektivnega razvijanja mRNA struktur ob vezavi ribosoma na pomožno mesto. V vseh testiranih primerih je model predvidel razvitje le 1-3 bp strukture modula, medtem ko se je ribosom preostalim velikim RNA-strukturam prilagodil.

=== Več modulov na pomožnem mestu ===

V primeru večih modulov na pomožnem mestu sta ob vezavi 30S ribosomske podenote dve možnosti: kooperativna in nekooperativna vezava. Če bi šlo za kooperativno vezavo, bi z naraščanjem modulov naraščala tudi As, kar bi pospešilo hitrost translacije. Glede na eksperimentalne podatke pa se izkaže, da se ob dodajanju števila modulov hitrost translacije ne spremeni. To priča o tem, da se 30S podenota ribosoma vedno veže le na izbrani modul - na tisti z najmanjšo ∆Gpomožno mesto. Meritve kažejo, da tudi, ko je izbrani modul zelo daleč navzgor od start-kodona, to ne vpliva na hitrost translacije. Tako mora obstajati mehanizem, ki omogoča premik podenote do oddaljenega start-kodona, kjer se sestavi 30S pre-iniciacijski kompleks. Podenota lahko difuzivno poskakuje čez vmesne sturkture (takrat bi bila hitrost iniciacije močno odvisna od razdalje med modulom in start-kodonom, manj pa od vmesnih sekundarnih struktur) ali pa drsi (takrat pa bi, zaradi stalnega kontakta, hitrost iniciacije zavisela predvsm od narave vmesnih mRNA struktur). Ker položaj modula in zato tudi razdalja od start-kodona ne vplivata na hitrost translacije, gre za mehanizem drsenja. Ob tem definiramo spremembo Gibbsove proste energije za drsenje 30S ribosomske podenote čez vmesne sekundarne strukture mRNA (∆Gdrsenje > 0), ki je posledica oviranja ribosoma na njegovi poti. ∆Gdrsenje tudi dobro sovpada z razliko med izmerjeno in izračunano vrednostjo ∆Gpomožno mesto, ki je do sedaj upoštevala le prispevke razvijanja mRNA in konformacijskega prilagajanja ribosoma. ∆Gdrsenje dobimo tako, da seštevek višin (H) vseh vmesnih mRNA-lasnic pomnožimo s koeficientom 0,2 kcal/mol/nt.

=== Zaključek ===

Ob upoštevanju vseh obravnavanih energijskih prispevkov za vezanje ribosoma na pomožno mesto 5'-UTR dobimo biofizikalni model, ki ga opisuje enačba: ∆Gpomožno mesto = ∆Gprilagoditev + ∆Grazvijanje + ∆Gdrsenje in ki zelo dobro napove hitrost translacije.

Model so aplicirali na celoten genom (3430 5'-UTR-jev iz ''E. coli'' MG1655), kjer so za vsak modul izračunali ∆Gpomožno mesto. Odkrili so, da celotna dolžina 5'-UTR ne vpliva na hitrost translacije. Daljši 5'-UTR so, v primerjavi s krajšimi, lahko bolj strukturirani, kar zmanjšuje dostopnost mRNA ribosomu, vendar to vseeno ne povzroči večje represije iniciacije translacije.

Sekundarne strukture daljših 5'-UTR so pogosto tarče tako transkripcijskih represorjev kot transkripcijsih aktivatorjev. Gre za trans- (RNA-vezavni proteini ali pa male RNA), ki se vežejo na 5'-UTR, in cis-elemente (RNA-stikala), ki povzročajo spremembe v aktivnosti preko vezave malih ligandov.

Dodaten nivo regulacije hitrosti translacije na celotnem genomu so operoni z več promotorji. Pri teh nastane več izooblik 5'-UTR, ki se razlikujejo po hitrosti translacije. Izbira promotorja je regulacija na transkripcijski ravni, za karakterizacijo česar so potrebne še dodatne raziskave.

===Literatura ===

[1] A. E. Borujeni, A. S. Channarasappa, and H. M. Salis, “Translation rate is controlled by coupled trade-offs between site accessibility , selective RNA unfolding and sliding at upstream standby sites,” Nucleic Acids Res., vol. 42, no. 4, pp. 2646–2659, 2014.

[2] C. O. Gualerzi and C. L. Pon, “Initiation of mRNA translation in bacteria: structural and dynamic aspects,” Cell. Mol. Life Sci., vol. 72, no. 22, pp. 4341–4367, 2015.

[3] G. Z. Yusupova, M. M. Yusupov, J. H. D. Cate, and H. F. Noller, “The path of messenger RNA through the ribosome,” Cell, vol. 106, pp. 233–241, 2001.

[4] M. de Smit and J. van Duin, “Control of translation by mRNA secondary structure in Escherichia coli. A quantitative analysis of literature data,” J. Mol. Biol., vol. 244, no. 2, pp. 144–150, 1994.

[5] H. Salis, E. Mirsky, and C. Voight, “Automated design of synthetic ribosome binding sires to control protein expression,” Nat Biotechnol, vol. 27, no. 10, pp. 946–950, 2010.

[6] S. M. Studer and S. Joseph, “Unfolding of mRNA secondary structure by the bacterial translation initiation complex,” Mol. Cell, vol. 22, no. 1, pp. 105–115, 2006.

===Dodatek - legenda: ===

- ∆G30S-mRNA ...celokupna sprememba Gibbsove proste energije za vezavo 30S podenote ribosoma na 5'-UTR mRNA,

- ∆GmRNA ...sprememba Gibbsove proste energije za zvitje mRNA v začetno stanje (pred vezavo 30S ribosomske podenote,

- ∆GmRNA-rRNA ... sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med SD-zaporedjem na mRNA in anti-SD-zaporedjem na 16S rRNA,

- ∆Gvmesnik ... sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S ribosomske podenote na 5'-UTR z neugdno dolžino vmesnika (zaporedje med SD-zaporedjem in start-kodonom),

- ∆Gstart ... sprememba Gibbsove proste energije ob tvorbi baznih parov med start-kodonom na mRNA in anti-kodonom na fMet-tRNA,

- ∆Gpomožno mesto ... sprememba Gibbsove proste energije ob vezavi 30S podenote ribosoma na pomožno mesto,

- ∆Gprilagoditev ...sprememba Gibbsove proste energije ob konformacijskegem prilagajanju 30S podenote ribosoma sekundarnim strukturam modula na pomožnem mestu 5'-UTR,

- ∆Grazvijanje ...sprememba Gibbsove proste energije ob razvijanju modula pomožnega mesta 5'-UTR,

- ∆Gdrsenje ... sprememba Gibbsove proste energije ob drsenju 30S ribosomske podenote čez sekundarne strukture mRNA med izbranim modulom in start-kodonom,

- r ...hitrost translacije,

- β ...navidezna Boltzmannova konstanta (0,45 mol/kcal),

- F ...intenziteta fluorescence

- Fref ...referenčna intenziteta fluorescence

- H ...višina lasnice

- D ...dolžina distalnega vezavnega mesta

- P ...dolžina proksimalnegla vezavnega mesta

- As ... eno-verižna površina modula pomžnega mesta

- C1, C2 in C3 ...računalniško prilegani parametri vrednosti 0,038 kcal/mol/nt2, - 1.629 kcal/mol/nt in 17.359 kcal/mol.

Nehomologno povezovanje koncev

2016-05-28T22:36:49Z

Neža Koritnik:

== Dvojnovijačni zlomi DNA in njihovo popravljanje ==

Vsak dan se v človeškem genomu zgodi okoli 10 000 poškodb DNA, med katerimi so najbolj nevarni dvojnovijačni zlomi (DSB, "Double Strand Breaks"). Če se ti ne popravijo pravilno, lahko pride do celične senescence, apoptoze in različnih kromosomskih napak (kot so na primer translokacije in delecije).
DSB-ji se popravljajo na dva načina - preko mehanizma nehomolognega povezovanja koncev (NHEJ, "Nonhomologous End Joining") ali pa preko mehanizma homologne rekombinacije (HR, "Homologous Recombination").
Pri mehanizmu nehomolognega povezovanja koncev gre za direktno ligacijo zlomljene molekule DNA, proces pa je neodvisen od nukleotidnega zaporedja na zlomljenih koncih. Za razliko od popravljanja dvojnovijačnih zlomov DNA preko homologne rekombinacije, ta mehanizem ne potrebuje homologne molekule DNA kot matrice za popravilo poškodovane DNA in zato ni odvisen od faze celičnega cikla. Mehanizem preko homologne rekombinacije je namreč možen samo, ko je na voljo sestrska kromatida - to pa je med S in G2 fazo celičnega cikla.

== Protein Ku in njegova vloga pri NHEJ ==

Popravljanje preko nehomolognega povezovanja koncev se začne z vezavo proteina Ku na mesto zloma. Ku je heterodimerni protein, sestavljen iz podenot Ku70 in Ku80, ter se nahaja v jedru. Ima sposobnost zelo hitre lokalizacije in vezave na DSB. Razlogi za to so njegova zelo velika afiniteta za konce DNA, visoka koncentraciji v celici in nespecifičnost za zaporedja ob zlomih. Njegovi podenoti se razlikujeta v aminokislinski sestavi, vendar imata podobno sekundarno in nativno strukturo. Sestavljeni sta iz treh domen: N-končne (von Willebrandove) iz alfa-heliksa in beta-sodčka, centralne domene, ki je potrebna za dimerizacijo podenot in vezave na DNA, ter C-končne domene, ki jo sestavlja alfa-heliks. Dimer podenot tvori obroč, ki s centarlnima domenama obda molekulo DNA. Protein Ku se tako na mestu zloma naniza na DNA in se pritrdi na sladkorno ogrodje vijačnice (zato nespecifičnost za zaporedja pri zlomih) preko C-končne domene podenote Ku70. Ku nato rekrutira ostale popravljalne faktorje. S C-končno domeno na podenoti Ku80 interagira z DNA-PK (od DNA odvisna kinaza) in ji omogoči vezavo na DNA. Na vijačnico se naloži s pomočjo N-končne levcinske zadrge. DNA-PK se sicer lahko tudi sama veže na DNA, vendar Ku poveča hitrost vezave približno stokrat. C-končna domena DNA-PK glede na N-končno tvori klešče, skozi katere gre molekula DNA. Interakcija DNA-PK z DNA povzroči premik proteina Ku naprej po dvojni vijačnici in tudi samo aktivacijo DNA-PK. Ku nato rekrutira tudi ligazni kompleks, ki je sestavljen iz DNA ligaze IV, XRCC4 in XLF. DNA ligaza IV in XLF interagirata s celotnim heterodimerom Ku, medtem ko se XRCC4 specifično veže le na podenoto Ku70. XRCC4 nima encimske aktivnosti. Poveže se s XLF, pomen tega pa je stabilizacija zlomljenih koncev DNA. Pri procesu ima pomembno vlogo tudi protein APLF, ki zadržuje proteine XRCC4, XLF in DNA ligazo IV na mestu poškodbe.

== D-NHEJ in vloga DNA-PK ==

Obstajata dve različici popravljalnega mehanizme preko nehomolognega povezovanja koncev; D-NHEJ ("DNA-PK" NHEJ) in B-NHEJ ("''Backup''" NHEJ).
D-NHEJ je najpogostejši mehanizem, ki je odvisen od DNA-PK. Prej opisani protein Ku, ki se je vezal na konce DSB-ja, v kompleksu Ku-DNA privlači katalitično podenoto od DNA odvisne protein kinaze (DNA-PKcs) in s tem tvori DNA-PK holoencim.
DNA-PKcs je serin/treonin proteinska kinaza, ki spada v družino PIKK (»''Phosphatidylinositol-3 Kinase-like Kinase Family''«), katere članici sta še ATM in ATR. N-terminalna regija DNA-PKcs sestoji iz HEAT ponovitev (»''Huntington-elongation-A-subunit-TOR''«), ki služijo kot področja za medproteinsko povezavo in oblikujejo karakteristično obliko proteina v obliki klešč. C-terminalna regija pa vsebuje PI3-kinazno domeno, ki je odgovorna za fosforilacijo. Obadajata jo za PIKK značilni domeni: v N-terminalno smer domena FAT (»''FRAP-ATM-TRAPP''«), v C-terminalno smer pa FATC (»''FAT-C-terminal''«).

DNA-PKcs je sposobna fosforilacije različnih proteinov, ki so ključni za uspešno ligacijo DSB-ja: RPA2, WRN, Artemis, XLF, XRCC4, DNA ligaze IV, fosforilira pa tudi sama sebe - avtofosforilacija. Ta se zgodi na več mestih, a najpomembnejša naj bi bila 2056-serin in 2609-treonin (slednje lahko fosforilirata poleg DNA-PK tudi ostala prej omenjena predstavnika družine PIKK). Z avtofosforilacijo pride v DNA-PKcs do konformacijske spremembe v FAT in FATC domeni. Posledica tega naj bi bilo odprtje klešč in sprostitev DNA-PK z DNA. Taka sprememba dovoli procesiranje koncev, polimerizacijo in v končni fazi tudi ligacijo z DNA ligazo IV. Ligaza IV sicer ima samostojno aktivnost, vendar ji pri zlepljanju DSB-jev pomagata dva faktorja: XRCC4 (»''X-ray repair cross-complementing protein 4''«), ki jo stabilizira ter s tem poveča njeno aktivnost in XLF (tudi znan kot Cernunnos ali NHEJ faktor 1), ki interagira z XRCC4-LigIV. Kot že omenjeno, vse te tri faktorje na mesto poškodbe veže protein Ku. Ta direktno interagira z BRCT domeno DNA ligaze IV in omogoči, da se kompleks XRCC4-LigIV naloži na mesto poškodbe. Poleg XLF, s kompleksom XRCC4 interagira tudi APLF (»''Aprataxin-and-PNK-Like Factor''«). Ugotovili so, da odsotnost APLF močno upočasni proces popravljanja. Povezuje se namreč tako s proteinom Ku kot s kompleksom XRCC4-LigIV, s čimer zagotavlja stabilnost tega kompleksa na mestu poškodbe in zaradi tega tudi pospešuje ligacijo. Kompleks XRCC4-LigIV je pomembnen tudi za rekrutiranje DNA polimeraz, ki so potrebne pri procesiranju koncev.

Vloga DNA-PK je pomembna tudi po končani ligaciji - s fosforilacijo odstrani faktorje, ki niso več potrebni, ostane le še protein Ku, ki je kot nekakšna zaponka, ki se ne more več odpeti. Odstranitev z DNA mu omogoči poliubikvitinacija. Podenoto Ku80 poliubikvitinira Skp1-Cu11-Fbx112 preko K48-povezave. Skp1-Cu11-Fbx112 je t.i. SCF oz. E3 ubikvitinska ligaza.

== Procesiranje koncev ==

Ligaza IV je zmožna spojiti le fragmente DNA, ki imajo ohranjen 3' hidroksilni in 5' fosfatni konec. Ker pa pri zlomu dvojne vijačnice pogosto prihaja do poškodb na koncih, je pred ligacijo navadno potrebno procesiranje kocev. Procesiranje koncev je proces, v katerem vrsta encimov odstrani poškodovane ali napačne nukleotide ter razdre strukture, ki ovirajo ligacijo, tako da ustvarijo kompatibilne konce. Polimeraze nato zapolnijo presledke v DNA, nastale zaradi samega zloma ali delovanja nukleaz.

=== Vrste kompleksnih koncev ===

Kompleksni konci so vsi konci, ki niso povezljivi. Taki so na primer ohranjeni 3' fosfatni ali 5' hidroksilni konci, ter konci s poškodovanimi nukleotidi. Najpogosteje prihaja do oksidacije baz ter do nastanka abazičnih (AP) mest, t.j. mest na DNA, ki nimajo niti purinskih, niti pirimidinskih baz. Konci se lahko zvijejo tudi v sekundarne strukture, kakršne so lasnične zanke, ali pa po poravnavi para koncev pride do neujemanj v nukleotidnem zaporedju, presledkov in »flap« struktur.

=== Glavni encimi in njihovo delovanje ===

Nekateri encimi, ki sodelujejo pri procesiranju koncev v NHEJ poti, so Artemis, PNKP, APLF, Polimerazi μ in λ, Werner (WRN), aprataksin in Ku. Potrebne encime na nepovezljive konce usmeri Ku-XRCC4 kompleks.

3' fosfatne in 5' hidroksilne konce popravlja encim PNKP, ki ima hkrati kinazno in fosfatazno aktivnost. S svojo kinazno domeno doda fosfatno skupino na 5' OH in s fosfatazno domeno s 3' konca odstrani fosfat. Tako ustvari povezljiva konca, ki jih lahko združi DNA ligaza IV.

V NHEJ sodeluje več nukleaz. Najpomembnejša med njimi je Artemis, ki ima veliko različnih nukleolitskih aktivnosti. 5' proti 3' endonukleazna aktivnost, ji omogoča, da odreže 5' lepljivi konec in ustvari dvoverižni topi konec. Artemis lahko odstrani tudi 3' fosfoglikolatne skupine z DNA koncev in odpre 5' proti 3' lasnične zanke. Artemis postane endonukleazno aktivna šele po tvorbi kompleksa in fosforilaciji z DNA-PKcs. Endo- in eksonukleazno aktivnost imajo tudi MRN, SETMAR, APLF in WRN. WNR na primer deluje kot 3' proti 5' eksonukleaza in APLF kot 3' proti 5' endonukleaza.

Pomembne pri procesiranju so tudi hidrolaze in liaze. V NHEJ sodeluje aprataksin (nukleotidna hidrolaza), ki odstranjuje adenilatne skupine, kovalentno vezane na 5' fosfatni konec. Ku protein ima liazno aktivnost in je sposoben izrezati AP mesta, blizu mesta zloma.

Med samim zlomom in zaradi delovanja nukleaz med procesiranjem v DNA zaporedju nastanejo presledki. Te zapolnjujeta polimerazi μ in λ. Obe lahko izvajata matrično odvisno sintezo, polimeraza μ pa ima v fizioloških razmerah tudi pomembno matrično-neodvisno aktivnost. Tako naključno dodajanje nukleotidov na konce DNA povzroči mikrohomologije, ki so poseben mehanizem nehomolognega povezovanja koncev. Poleg polimerazne pa ima polimeraza λ še pomemno liazno aktivnost, ki ji omogoča odstranjevanje poškodovanih baz.

== B-NHEJ ==

Kadar zaradi različnih vzrokov DNA-PK ni prisotna, poteka t.i. »''backup''« NHEJ, ki je v primerjavi z D-NHEJ počasnejše, bolj nagnjeno k napakam (povezovanje napačnih koncev) in veliko manj pogosto v celici, poleg tega pa je B-NHEJ odvisen tudi od faze celičnega cikla. Procesiranje konca je obsežnejše, delecije in translokacije za uspešno NHEJ potekajo več nukleotidov stran od DSB-ja. Za razliko od D-NHEJ, se tukaj najprej na DNA veže PARP-1 (poli-(ADP-riboza) polimeraza), MRN proteinski kompleks pa poskrbi za procesiranje koncev. Histon H1 deluje kot stimulatorni faktor in je odgovoren za poravnavo (podobno kot Ku protein pri D-NJEH). V zadnjem koraku, ligaciji, pa bi naj bi WRN in XRCC1 pomagala ligazi III pri zlepljanju koncev (morda tudi ligaza I). Za zlepljanje je odgovoren kompleks LigIII/XRCC1/PARP1. Ku70/80 v D-NHEJ naj bi se vezal z veliko večjo afiniteto na DNA kot histon H1 in PARP1 v B-NHEJ, kar razloži pogostejše D-NHEJ popravljalne mehanizme kot B-NHEJ.

== Klinični pomen nehomolognega povezovanja koncev ==

Popravljanje DSB z NHEJ pogosto vodi do kratkih insertov ali delecij na mestu zloma. Ta lastnost je vodila k poskusom uporabe NHEJ v zdravljenju osebkov, okuženih z virusom HIV. V T-celicah so delovali z nukleazo, zasnovano, da reže v CCR5 regiji gena, ki kodira za koreceptor za virus HIV. Popravilo zloma z NHEJ je ustvarilo celice z mutacijo v CCR5 regiji, ki so bile odporne na infekcijo z virusom.
Pomembno je bilo tudi odkritje, da je NHEJ nadpovprečno aktiven v rakavih celicah, za katere je splošno značilna genomska nestabilnost. Genomska nestabilnost je vzrok za invazivnost in hiter razvoj tumorskih celic. Raziskava je pokazala, da inhibicija DNA ligaze IV resnično ovira širjenje tumorjev pri rakavih miših. Ti podatki kažejo na pomembnost NHEJ v celici in na možnost širše uporabe agentov, sodelujočih pri NHEJ, v medicinske namene.

== Viri ==

1. Davis, A. J. in Chen, D. J. DNA Double Strand Break Repair via Non-Homologous End-Joining. ''Translational Cancer Research''. 2013, letnik 2, št. 3, str. 130-143. 
2. Fell, V. L. in Schild-Poulter, C. The Ku Heterodimer: Function in DNA Repair and Beyond. ''Mutation Research''. 2015, letnik 763. str. 15-29. 
3. Davis A.J., Chen B.P.C. in Chen D.J. DNA-PK: a dynamic enzyme in a versatile DSB repair pathway. ''DNA Repair''. 2014, 17:21-29. 
4. Mladenov E., Iliakis G. Induction and repair of DNA double strand breaks: The increasing spectrum of non-homologous end joining pathways. ''Mutat Res''. 2011, 711:61-72. 
5. Strande N. T., Waters C. A. in Ramsden D. A. Resolution of complex ends by non-homologous end joining - better to be lucky than good? ''Genome Integrity''. 2012 3:10. 

[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]

Nehomologno povezovanje koncev

2016-05-26T19:00:44Z

Neža Koritnik:

BIO2 Povzetki seminarjev 2015

2015-12-02T14:25:31Z

Neža Koritnik: /* Neža Koritnik: Uravnavanje koncentracije ROS in glutationilcija v mitohondriju */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2015/2016 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2015 stran]

=== Kristjan Stibilj: PI3K kaskada in njihova vloga pri rakavih obolenjih ===
Dandanes je zdravljenje rakavih obolenj poglavitna točka v razvoju farmacevtskih zdravil. Velike multinacionalke vlagajo ogromno denarja v razvoj zdravila, ki bi ozdravil tumorje oz. omilil njihovo delovanje. Za nastanek rakavih obolenj so v veliki meri krivi receptorji tirozin kinaze (RTK) in njihova PI3K/AKT/mTOR signalna pot. Ta namreč nadzoruje celično proliferacijo, metabolizem, premikanje in preživetje. Mutacije ključnih proteinov v PI3K kaskadi vodijo do nenadzorovane rasti in delitve celic, kar privede do nastanka tumorjev. Glavni princip zdravljenja oz. iskanje zdravila za rakava obolenja je torej poiskati takšno molekulo, ki bi uspešno inhibirala mutiran protein in s tem ustavila njegovo hiperaktivacjo. Znanstveniki so v zadnjih letih odkrili precej inhibitorjev, ki so bolj ali majn specifični in so sedaj v preiskavah kot morebitno zdravilo. Za inhibiranje PI3K molekule sta se v predkličninih študijah pokazala kot uspešna pictilisib in buparlisib, ki se vežeta na ATP-vezavno mesto. Na enak način deluje tudi večina AKT inhibitorjev, kamor spada tudi dobro raziskan Inhibitor VIII. mTOR, zadnja molekula v PI3K kaskadi, pa ima prav tako kar nekaj sintetičnih inhibitorjev, ki so analogni naravni molekuli rapamcin. Vsi našteti inhibitorji pa žal še niso zdravila za raka, saj so interakcije z ostalimi encimi v celici še vedno nepoznane.

=== Klara Kuret: Vpliv bakterijskih efektorjev na celični ubikvitinacijski sistem in rastlinski imunski odziv ===
Patogene bakterije uporabljajo efektorje za zatiranje imunskega odziva gostitelja. Tarča mnogih efektorskih proteinov je celični ubikvitinacijski sistem (UBS), ki je pomemben regulator imunskega odgovora. Ubikvitinska signalizacija poteka preko treh encimskih kompleksov, ki na proteinske substrate vežejo molekule ubikvitina. Dolžina in oblika ubikvitinske verige narekujeta, kakšen bo biološki odgovor celice na ubikvitinacijo oz. kaj se bo s substratom zgodilo. Ker prokarionti nimajo lastnega ubikvitinacijskega sistema, so morali razviti drugačne mehanizme, ki jim omogočajo interakcijo z evkariontskimi proteini, kateri nastopajo pri ubikvitinaciji. Efektorji lahko gostiteljski UBS izkoriščajo tako, da strukturno ali funkcijsko posnemajo evkariontske komponente UBS, ali pa so homologi evkariontskih proteinov. Lahko tudi pospešujejo ali inhibirajo delovanje 26S proteasoma. Efektorski proteini torej izkoriščajo evkariontske strategije za nadzor in manipulacijo gostiteljevih celičnih procesov, v smeri, ki patogenu omogoča čim boljšo možnost razvoja in množitve. Efektorji AvrPtoB, HopM1 ter VirF so nastali z različnim evolucijskim razvojem, zato se tudi mehanizmi njihovega delovanja na UBS razlikujejo. Patogeni efektorji lahko preko ubikvitinacije pomembnih signalnih proteinov v imunskih kaskadah povzročijo nezmožnost celice, da aktivira PAMP ter ETI imunost. Razgradnja gostiteljevih proteinov vodi lahko do motenj v izražanju genov, motenj v vezikularnem transportu in številnih drugih nepravilnosti v celičnih procesih, ki pripeljejo do večje dovzetnosti celice za okužbo.

=== Tjaša Lukšič: Alternativno izrezovanje GPCR-jev s poudarkom na sekretinski družini ===
Alternativno izrezovanje GPCR-jev je pogost pojav, še posebej pri sekretinski in nekaterih sorodnih družinah. Receptorji sekretinske družine se pojavljajo v zanimivih izooblikah, ki odstirajo nove poglede na regulacijo celične signalizacije. V sedmi transmembranski vijačnici sekretinskih GPCR-jev je dobro ohranjen ekson 12 oz. zaporedje 14 aminokislin, ki je tarča izrezovalno-povezovalnega kompleksa pri nekaterih receptorjih. Delecija eksona 12 nima izrazitega vpliva na vezavo primarnih sporočevalcev, ima pa zato toliko večje posledice pri prenosu signalov. Povezovanje z G-proteini je onemogočeno, ker skrajšana TMD7 ne omogoča normalne konformacijske spremembe. Le-ta se v običajnih izooblikah zgodi zaradi premika TMD6 in TMD7 proti statični TMD3, kar razkrije intracelularno vezavno domeno za navzdolnje efektorje. Poleg omenjene funkcije lažnega receptorja, se oslabi tudi membranska ekspresija kratkih-TMD7 receptorjev, saj je izbrisan transportni motiv v eksonu 12 in zmanjšana hidrofobnost C konca. Najbolj fascinantna posledica je zagotovo dominantno negativna regulacija membranske ekspresije ostalih izooblik. Za transport GPCR-jev iz kontrolnega sistema endoplazmatskega retikuluma je potrebna oligomerizacija. Hetero-oligomeri določenih kombinacij s kratkim-TMD7 receptorjem ne uspejo zapustiti ER, število delujočih receptorjev v membrani se zmanjšuje in celica je slabše odzivna na njihove primarne sporočevalce. Med tem pa nekateri receptorji nimajo težav pri transportu skupaj s skrajšanimi izooblikami. Številna bolezenska stanja so povezana s patološkimi izooblikami ali z neuspešnim transportom proteinov iz ER, za kar obstaja potencialna rešitev v farmakoloških šaperonih.

=== Rok Miklavčič: Preusmeritve signalnih poti preko TNFR1 v boju s patogeni ===
Celice so se skozi čas prilagodile na življenje v okolju, polnem potencialno škodljivih patogenov. Razvilo se je mnogo mehanizmov celičnega odgovora, ki so prilagojeni tako, da lahko ustrezen odgovor na patogene pripravijo v različnih situacijah. En takih mehanizmov predstavlja tudi signalna kaskada preko TNFR1, receptorja za citokin TNFα. TNFα sprostijo celice imunskega sistema, ko zaznajo prisotnost patogena. Osnovni celični odgovor pri stimulaciji TNFR1 je kaskada, ki preko zaporedja ubikvitinacij sodelujočih proteinov, privede do translokacije transkripcijskega faktorja NF-κB v jedro. NF-κB tam sproži prepisovanje genov za vnetne citokine, ki ob kasnejšem sproščanju v okolico celice povzročijo vnetni odziv sosednjih celic ter s tem omejitev okužbe. Nekateri patogeni pa so na ta odziv prilagojeni tako, da inhibirajo ključne proteine v začetni kaskadi in s tem zmanjšajo vnetje, vendar pa imajo na to prilagoditev odgovor tudi gostiteljske celice. Pri taki inhibiciji pride do prenosa signala po drugi poti, ki privede do apoptoze napadene celice, kar ubije tudi patogene v njej, in tako omeji okužbo. Patogeni lahko inhibirajo tudi samo apoptozo, zaradi česar obstaja tudi zasilni celični mehanizem odgovora nanje. V primeru inhibicije apoptoze se kaskada konča z aktivacijo psevdokinaze MLKL, ki je glavni efektor za mehanizem programirane nekroze z imenom nekroptoza. Pri nekroptozi pride kot pri nekrozi do celične lize, pri čemer se v okolico sprostijo DAMP-i, ki sprožijo vnetni odziv okoliškega tkiva.

=== Ema Gašperšič: PKC in njihov vpliv na raka ter Alzheimerjevo bolezen ===
Protein kinaze C (PKC) so družina encimov, ki sodelujejo v številnih signalnih poteh v celici. S fosforilacijo serina ali treonina nekega drugega proteina regulira njegovo aktivnost. Vplivajo na proliferacijo in diferenciacijo celice, apoptozo, oblikovanje sinaps, učenje ter shranjevanje spominov, nevrološke motnje in mnogo drugih procesov v celici. Za aktivacijo PKC sta ključni povečani koncentraciji diacilglicerola (DAG) in kalcijevih ionov Ca2+, ki z vezavo na PKC povzročita prehod iz neaktivne v aktivno obliko. Aktivacija PKC vpliva na spodbujanje oziroma inhibiranje razvoja raznih bolezni, kot so rak, ishemična možganska kap ali Alzheimerjeva bolezen in druge nevrodegenerativne bolezni. Problem je v tem, da je pri zdravljenju raka potrebno rast celic čim prej zaustaviti, med tem ko morajo pri nevrodegenerativnih boleznih nevroni ostajati živi. Poleg tega je zanimivo, da naj bi nekateri aktivatorji protein kinaz C rast rakavih celic spodbujali, drugi pa zavirali. Običajen mehanizem delovanja PKC je težko opisati, saj obstaja več oblik PKC izoencimov, ki so po različnih tkivih različno razporejeni, v celici imajo različne funkcije, poleg tega pa obstaja več signalnih poti, ki vodijo do aktivacije PKC. Vse to so razlogi za oteženo delo raziskovalcev, ki želijo odkriti načine zdravljenja prej omenjenih boleznih, zato torej to področje zahteva še precej raziskav, ki bi posledično lahko olajšale njihovo zdravljenje.

=== Tadej Satler: PD-1 limfocitov in melanomskih celic ===
Melanom je najnevarnejša oblika kožnega raka in znanstveniki že desetletja borijo izboljšali rezultate zdravljenja. Vzpodbuditi želijo proti-tumorski odziv imunskega sistema, vendar so zaradi kontrolnih točk neuspešni. Kontrolne točke so ključne za ohranjanje imunske homeostaze, saj bi brez njih bili žrtev številnim avtoimunskim boleznim in poškodbam tkiva ob prevelikem odzivu sistema na patogene vnetje. Med imunske kontrolne točke spada tudi receptor PD-1. Je monomer sestavljen iz imunoglobulinske in citoplazemske domene. Zanj sta značilna tudi dva liganda (PD-L1 in PD-L2), ki sta potrebna za njegovo aktivacijo. Najdemo ga predvsem pri limfocitih T in nekaterih melanomskih celicah. Izražanje PD-1 je raziskano predvsem pri limfocitih T, kjer ob interakciji z ligandoma inhibira delovanje in funkcije limfocitov ter povzroča njihovo apoptozo. To doseže s pomočjo zaviranja številnih ključnih procesov znotraj celice, ki so potrebni za njeno normalno delovanje. Pri melanomskih celicah je pa delovanje PD-1 še dokaj neraziskano. Do zdaj njegova prisotnost ni bila znana, vendar so nedavne raziskave pokazale njegovo izražanje na nekaterih celicah limfocitov. Obnašanje PD-1 melanomskih celic je drugačno kot pa pri limfocitih, saj njegovo izražanje spodbuja rast tumorja. S pomočjo boljšega poznavanja delovanja PD-1 v limfocitih T in melanomskih celicah, bo lažje razviti učinkovitejše metode boja proti raku.

=== Tilen Tršelič: PKM2 in njegova vloga pri razvoju rakavih celic ===
Piruvat kinaza (PK) je pomemben glikolitski encim, ki se pojavlja v štirih različnih oblikah. Oblika M2 je posebno zanimiva, saj poleg svoje glikolitske funkcije opravlja še mnoge druge, nemetabolične funkcije. Poleg tega je PKM2 prevladujoča oblika encima v rakavih celicah. Razlog za povečano izražanje le-tega verjeno izhaja iz dejstva, da lahko PKM2 zavzema aktivno tetramerno obliko ali skoraj neaktivno dimerno obliko. Možnost menjavanja svojih oblik celicam, bodisi zdravim ali rakavim, omogoča prilagajanje delovanja njihovim potrebam. Če celici primanjkuje energije, lahko encim zavzema pretežno aktivno tetramerno obliko in tako spodbuja proizvodnjo ATP. Če celica potrebuje nove makromolekule za proliferacijo, tu encim lahko zavzame pretežno neaktivno dimerno obliko in spodbuja kopičenje intermediatov glikolize. Te so ključni za sintezo novih snovi, saj služijo kot njihovi prekurzorji.
Aktivnost encima PKM2 se regulira na več načinov. Vlogo regulatorjev po navadi opravljajo post-translacijske modifikacije encima, lahko pa tudi nekatere druge spremembe v celičnem okolju.
PKM2 v svoji manj aktivni dimerni obliki prav tako lahko regulira druge procese. Predvsem pospešuje celično rast in razvoj prek reakcij z pomembnimi transkripcijskimi faktorji v jedru. Izkazalo se je, da delovanje encima PKM2 močno koristi rakavim celicam.
Ker je encim PKM2 zelo pomemben za razvoj takšnih celic, predstavlja dobro potencialno tarčo za zdravljenje. Raziskave potrjujejo, da bi bilo slednje možno, ne ponujajo pa konkretnega odgovora na vprašanje, kako bi takšno zdravljenje potekalo.

=== Tina Šimunović: Pentoza-fosfatna pot, njena regulacija in povezava z rakom ===
Pod imenom rak razumemo bolezen, za katero je značilna nenadzorovana rast in celična delitev. Rakave celice imajo tako večjo potrebo po biosintezi pomembnih makromolekul, ki jo zadostijo s prilagoditvijo in spremembo svojih metaboličnih poti. Ena izmed prilagoditev je lahko sprememba pentoza-fosfatne poti (PPP). To je ena izmed metaboličnih poti glukoze, katere glavna produkta sta riboza-5-fosfat in NADPH. Prva se naprej uporablja pri sintezi nukleinskih kislin, NADPH pa je pomemben za sintezo makromolekul in za detoksikacijo. Regulacija PPP poteka preko njenih metabolnih encimov. V rakavih celicah je predvsem izražena povišana aktivnost glukoza-6-fosfat dehidrogenaze in s tem aktivnost PPP. Pri tem encimu sta, poleg mnogih drugih, najpomembnejša regulatorja NADPH in tumorski supresor p53. Aktivnost PPP lahko poveča tudi acetilacija 6-fosfoglukonat dehidrogenaze ali pa povečano izražanje transketolaze. Na pospešeno proliferacijo rakavih celic vplivajo tudi inaktivirani tumorski supresorji in aktivirani onkoproteini, npr. p53, TIGAR, ATM, Ras, mTORC1 in Nrf2. Največji pomen PPP pri rakavih celicah, je v zaščiti pred celično smrtjo, saj se s povečano aktivnostjo PPP pospeši tvorba njenih produktov, ki so ključni pri preživetju celice. Z inhibicijo te poti, bi lahko tudi inhibirali rast tumorjev. PPP je tako postala potenciala tarča za zdravljenje raka, vendar je za to potrebnih še veliko raziskav in boljše razumevanje metabolizma rakavih celic.

=== Maja Zupanc: Kako dolge nekodirajoče RNA vplivajo na regulacijo metabolizma ===
Ena najbolj fascinantnih lastnosti metabolizma je njegova regulacija. Za homeostazo metabolizma hranil in energije v telesu je nujna specializirana regulacija centralnega živčnega sistema, Langerhansovih otočkov trebušne slinavke in glavnih metabolnih tkiv (maščobno tkivo, skeletne mišice in jetra). Dolge nekodirajoče molekule RNA (lncRNA) so RNA molekule dolge več kot 200 nukleotidov, ki ne kodirajo proteinov. Njihov spekter delovanja je izredno širok, na metabolizem vplivajo prek regulacije procesov adipogeneze in hepatičnega metabolizma, nadzora funkcionalnosti Langerhansovih otočkastih celic, regulacije razvoja skeletnih mišic, in energijske homeostaze. Do sedaj je bilo odkritih že več kot 60000 dolgih nekodirajočih RNA molekul in repetuar njihovih funkcij se z vsako novo raziskavo širi. Vloga lncRNA je še pred desetimi leti bila neznanka, od takrat pa nam je že postalo jasno, da so pomembni regulatorji izražanja DNA, diferenciacije in razvoja celic, razvoja tkiva in tumorogeneze. V resnici pa vemo zelo malo, oziroma smo šele na začetku razumevanja lncRNA. Ker se zaradi tega z vsakim novim odkritjem pojavlja še več vprašanj (o podrobnih principih delovanja lncRNA in njihovega sodelovanja z drugimi molekulami, o še nepoznanih funkcijah, vpletenosti v bolezni in možnosti razvoja novih tehnik zdravljenja…), so raziskave na tem področju zelo aktualne.

=== Lara Jerman: Warburgov učinek: od raka do avtoimunosti ===
V dvajsetih letih prejšnjega stoletja je Otto Warburg s svojimi sodelavci meril porabo kisika in sintezo laktata v rakastem tkivu. Pri tem je prišel do zelo pomembnega opažanja, ki ostaja zelo aktualno – da celice rakastega tkiva tudi ob normoksičnih pogojih vztrajajo pri močno povečani glikolizi. Danes vemo, da se Warburgov učinek v rakastih tkivi pojavlja skoraj univerzalno. Večina Warburgovih opažanj in meritev je bila kvantitativno pravilna. Njegova razlaga vzroka pojava pa se je izkazala za napačno, saj povečano stopnjo glikolize zasledimo v mnogih rakastih tkivih brez določljivih mitohondrijskih mutacij ali motenj oksidativno-fosforilacijske metabolne poti. V takih tkivih sinteza ATP v mitohondrijih poteka nemoteno in enako učinkovito kot pri normalnih tkivih z enako koncentracijo kisika. Raziskave zadnjih let kažejo na to, da je povečana glikoliza strateška poteza rakastih celic, ki zadovoljuje predvsem njihove potrebe po sintezi biomase. V skoraj stoletju od Warburgovega prvotnega odkritja je postalo jasno, da metabolična stikala omogočajo celici, da se prilagaja svojim bioenergetskim in biosintetskim potrebam. Zmožnost hitrega prilagajanje potrebam je še posebej pomembna pri imunskih celicah, ki morajo ob imunskem odzivu hitro preiti iz mirujočega stanja. Zato ni presenetljivo, da so si rakaste in imunske celice glede zagotavljanja metabolnih tokov in bionenergetike za rast in širjenje v marsičem podobne.

=== Sara Tekavec: Mutacije encimov Krebsovega cikla in vpliv na razvoj ter rast tumorjev ===
Encimi izocitrat dehidrogenaza (IDH), sukcinat dehidrogenaza (SDH) in fumarat hidrataza (FH) sodelujejo v Krebsovem ciklu. Prvi omogoča pretvorbo izocitrata v α-ketoglutarat (α-KG), drugi pretvorbo sukcinata v fumarat, tretji pa pretvorbo fumarata v malat. Za gene, ki kodirajo te encime, so značilne mutacije, ki vodijo v nastanek in rast tumorjev. Mutacije so lahko onkogen-aktivirajoče (mutacija IDH) ali tumor-supresor deaktivirajoče (mutacije SDH in FH). Mutacija IDH tako v encimu vzpodbudi novo funkcijo, in sicer pretvorbo α-ketoglutarata ob prisotnosti NADPH v onkometabolit 2-hidroksiglutarat (2-HG). Pri drugih dveh mutacijah pa gre za to, da je aktivnost encima zmanjšana oz. je sploh ni, kar ima za posledico kopičenje sukcinata ali fumarata. To ugodno vpliva na rast tumorja, saj lahko te tri omenjene molekule na različne načine inducirajo izražanje genov, pomembnih za celično rast in preživetje. Vse tri na primer stabilizirajo hipoksični inducibilni faktor (HIF), ki nato sproži transkripcijo in angiogenezo (rast krvnih žil). Z zmanjšano koncentracijo dveh antioksidantov NADPH in α-ketoglutarata se poveča tudi tveganje za nove mutacije, povzročene s strani reaktivnih kisikovih zvrsti. Poleg tega lahko α-KG sam deluje kot mutagen ali pa tudi inhibira metilacijo DNA in histonov, zaradi česar je izražanje onkogenov povečano. Kljub temu, da je ta metabolična pot pri tumorjih precej kompleksna, nam bodo nove metode detekcije tumorjev kmalu omogočile tudi boljše razumevanje samih mutacij in mehanizma nastanka tumorjev, ki tiči v ozadju.

=== Fran Krstanović: L-Carnitine enhances exercise endurance capacity ===
Our energy metabolism is working constantly to cover energy need of our body. ATP represents the first line of action. With cellular ATP concentration low, our body needs other sources of energy as fuel. Fats carbs and proteins play that part. To get energy from fats they need to be oxidase. The process of fat oxidation is situated in the mitochondria. Fats need a special transporter to get into the cell, l-carnitine.
Apart from fat transportation l-carnitine has many other roles; enhancing exercise endurance capacity is believed to be one of them. Mice fed with L-carnitine showed great promise to confirm this theory. Glycogen concentrations were higher, all important parameters for fatty acid intake and mitochondria biogenesis were higher and do additional AMPK was activated. The most important parameter was higher endurance capacity was reached. The problem lies in implicating the theory on humans; consuming concentrations are unknown (high can lead to problems, low won’t have affect). Further experiments will surely be held as carnitine provides great attention from sports industries as a supplement for fat burning or maybe for greater athletes’ fatigue.

=== Janja Krapež: Vpliv metabolizma maščobnih kislin na povišan krvni tlak v plučnih arterijah ===
Povišan krvni tlak v pljučnih arterijah (PAH) je huda bolezen, ki posledično zelo vpliva tudi na srce, predvsem na desni prekat, ki se zaradi prevelike obremenjenosti poveča. To lahko privede tudi do odpovedi srca. Zakaj pride do nepravilnega delovanja desnega prekata, je še neznano, prav tako kako do tega pride. Zadnje raziskave sklepajo, da je z nedelovanje povezan tudi metabolizem maščobnih kislin in glukoze. Problem predstavlja kopičenje maščobnih kislin znotraj mišičnih celic srca. Za transport maščobnih kislin z dolgimi verigami poskrbi protein CD36 skupaj s FATP (v miocitih FATP6). Kopičenje maščobnih kislin v celici je povezano tudi s favoriziranjem oksidacije glukoze. Preklop med ß-oksidacijo maščobnih kislin in oksidacijo glukoze poteka v Randlovem ciklu, kjer intermediati ene oksidacije inhibirajo drugo. Ključni pri inhibiciji ß-oksidacije je malonil-CoA, ki inhibira CAP encim na mitohondrjski membrani in je ključni prenašalec maščobnih kislin v mitohondrij, kjer se nadalje oksidirajo. Trenutne raziskave želijo izboljšati delovanje desnega prekata prav preko oksidacije maščobnih kislin. Šele razumevanje zapletenih mehanizmov metabolizma bo omogočilo nadaljnji razvoj potencialnih zdravil za zdravljenje PAH in posledično tudi izboljšalo delovanje desnega prekata.

=== Elvira Boršić: Posledice spremenjenega metabolizma maščobnih kislin v kardiomiocitih ===
V fetusu kardiomiociti pridobivajo energijo z oksidacijo glukoze in laktata zaradi pomanjkanja kisika. Ko se rodimo pa postanejo maščobne kisline preferenčni substrat pridobivanja ATP-ja. Do sprememb glavnega substrata pride zaradi večjih telesnih obremenitev, bolezni in okoliščin zunaj celice. Pri tem imajo osrednjo vlogo razni transkripcijski faktorji, npr. receptor, aktiviran s peroksisomskim proliferatorjem α (PPARα), in transkripcijski koaktivatorji, npr. PPARγ koaktivator 1α (PGC1α). Dokazali so, da lahko nedelovanje vsaj 22 encimov in transporterjev udeleženih pri metabolizmu maščobnih kislin povzroči razne bolezni, ki zmanjšajo delovanje srca. Vsaka od teh pa lahko povzroči srčno popuščanje. Do tega pride, ko srce ni več zmožno črpati krvi iz pljuč po telesu. Najpogostejša vzroka sta zvišan krvni tlak in ishemija. Slednjo povzroči hipoksija, zaradi česar se ustavi tok elektronov v dihalni verigi. V anaerobnih pogojih je tako glikoliza edini vir energije in proizvede le 5 % celotnega ATP-ja, ki ga imajo kardiomiociti v normalnih pogojih. Produkti glikolize porušijo homeostazo in za ohranjanje le-te celice porabijo veliko energije, ki bi se sicer porabila pri kontrakciji. Raven kisika se obnovi pri reperfuziji, ki pa naredi še več škode kot ishemija. Zaradi srčnega popuščanja umre vsako leto več tisoč ljudi, saj še ne poznamo zdravila, ki bi to bolezen preprečilo. Ker še ne razumemo vseh mehanizmov, poteka na tem področju veliko raziskav.

=== Miha Koprivnikar Krajnc: Pomanjkanje karbamoil-fosfat sintetaze ===
Pomanjkanje karbamoil fosfat sintetaze (CPS1) je ena izmed motenj cikla sečnine, torej poslabša zmožnost proizvodnje sečnine, ki ima pomembno vlogo pri regulaciji pH. CPS1 katalizira nastanek vstopne spojine cikla sečnine, karbamoil fosfat, in jo regulirajo Mg2+, Ca2+, NAG, ter tudi druge snovi posredno, preko NAG sintetaze. Mutacij, ki povzročajo spremembo strukture CPS1 je kar nekaj in povzročajo spremembe v aktivnosti encima različnih jakosti (od milih sprememb do popolne inaktivacije). To je razlog, da nekateri oboleli velikokrat sploh ne dočakajo otroštva, medtem ko pri ostalih bolezen pride na dan kasneje v življenju ob nekem stresu za organizem. Simptomi pomanjkanja CPS1 so predvsem nevropatološke narave in vključujejo poslabšanje kognitivnih sposobnosti, epizode delirija, utrujenost in druge simptome. Pri pacientih s hujšimi motnjami lahko bolezen tudi po zdravljenju pusti trajne posledice, saj pride do poškodb možganov v procesu razvoja. Razlog za nevrotoksičnost je osmotska aktivnost glutamina, ki se v velikih količinah nabira v astrocitah možganov. To povzroča hipertonično okolje v celicah in otekanje možganov. Brez ukrepov to privede do kome in smrti. Zdravljenje akutnih primerov motnje se začne z uporabo lovilcev amonijaka in dializo krvi, nadaljnji ukrepi pa so za enkrat omejeni na dieto z malo proteinov in citrulin. Za prihodnost je obetavno zdravljenje s stimulacijo encima z aktivatorjem oziroma njegovim analogom ali pa kar s stimulacijo sintetaze aktivatorja.

=== Špela Malenšek: Leucinska in glutaminska regulacija mTORC1 ===
Kompleks mTORC1 je ohranjena Ser/Thr kinaza, ki z združevanjem signalov regulira celično ravnovesje med anabolizmom in katabolizmom. Nadzoruje celično rast, sintezo proteinov ter ribosomov in blokira avtofagijo. Nepravilno delovanje mTORC1 je vzrok različnim vrstam raka, diabetesu tipa 2 in nevrodegenerativnim boleznim. Verjetno najpomembnejši, a hkrati najmanj razumljeni regulatorji mTORC1 so aminokisline, med katerimi izstopata leucin in glutamin. Koncentraciji slednjih v citosolu sta odvisni druga od druge, saj je t.i. terciarni aktivni transport leucina v celico sklopljen s prenosom glutamina iz celice. Eden izmed modelov regulacije mTORC1 predpostavlja, da so pri prenosu aminokislinskega signala do mTORC1 glavni trije multiproteinski kompleksi, ki vključujejo majhne RagGTPaze, Ragulator in v-ATPazo. Združitev slednjih poteka na lizosomih, kjer je mTORC1 posledično tudi aktiviran s proteinom Rheb. Aminokislinska signalna kaskada mTORC1 predstavlja tudi tipalo, s katerim celica zaznava prisotnost in koncentracijo aminokislin v lizosomskem lumnu, citoplazmi in v zunaj-celičnem prostoru. Delovanje v-ATPaze je namreč močno odvisno od koncentracije leucina v notranjosti lizosomov in predstavlja t.i. »notranjo« regulacijo mTORC1. Hkrati naj bi leucin neposredno vplival na spremembno konformacije RagGTPaz z vezavo na protein Sestrin2, vendar so je popoln mehanizem posledice vezave leucina še nepojasnjen. Glutamin naj bi na mTORC1 deloval drugače kot leucin (brez posredovanja RagGTPaz in Ragulatorja), hkrati pa naj bi regulacijsko vlogo aktivacije mTORC1 imel tudi eden izmed produktov dvojne deaminacije glumatina, α-ketoglutarat.

=== Neža Koritnik: Uravnavanje koncentracije ROS in glutationilacija v mitohondriju ===
V mitohondriju zaradi razlik v redoks okolju nastajajo reaktivne kisikove spojine (ROS), ki lahko povzročajo oksidativno škodo, v manjših koncentracijah pa so pomembne signalne molekule. Njihov glavni vir so predvsem flavoproteini, jih najdemo tudi v kompleksih dihalne verige in nekaterih encimih Krebsovega cikla. Ti lahko v času oksidativnega stresa zaradi različnih razlogov prenesejo elektrone namesto na njihov naravni akceptor direktno na kisik, pri čemer se tvorijo reaktivni superoksidni radikali (in druge ROS). H2O2 ima sposobnost oksidacije tiolnih cisteinskih ostankov proteinov (-SH do -SOH), kar ponavadi povzroči reverzibilno deaktivacijo proteinov in s tem regulacijo različnih procesov v mitohondriju. V skrajnem primeru pa pride do hiperoksidacije (do -SO2H ali - SO3H), ki pa je ireverzibilna in lahko trajo poškoduje proteine in druge molekule. Za preprečevanje oksidativne škode in uravnavanjem redoks signalizacije so se razvili sistemi GSH/Gpx/GR in Prx/Trx/TrxR. Glutation (GSH) je pomembna molekula, ki v razmerju s svojo oksidirano obliko (dimerom GSSG) določa redoks stanje v mitohondriju. V oksidirani obliki ima sposobnost vezave na tiole cisteinskih ostankov proteinov. To je proces glutationilacije, pri kateri se tvori disulfidna povezava protein-SSG, kar pa ima regulatorno vlogo (začasna aktivacija/deaktivacija proteina) ali pa zaščitno vlogo pred hiperoksidacijo. Pomemben encim, ki regulira glutationilacijo je glutaredoksin (Grx). S temi mehanizmi se v mitohondriju uravnavajo številni metabolni procesi in redoks stanje matriksa.

BIO2 Seminar 2015

2015-12-02T14:25:18Z

Neža Koritnik: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Kristjan Stibilj||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Kristjan_Stibilj:_Inhibicija PI3k/AKT/mTOR signalne poti kot orožje proti raku||Lovro Kotnik||Blaž Lebar]||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Tjaša Lukšič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tjasa_Luksic: Alternativno izrezovanje GPCR-jev s poudarkom na sekretinski družini]||Karmen Žbogar||Aleksandra Uzar||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Klara Kuret||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Klara_Kuret: Vpliv bakterijskih efektorjev na celični ubikvitinacijski sistem in rastlinski imunski odziv]||Klara Lenart||Petra Hruševar||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Rok Miklavčič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Rok_Miklavčič: Preusmeritve signalnih poti preko TNFR1 v boju s patogeni]||Katja Čop||Lovro Kotnik||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Ema Gašperšič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Ema_Gaspersic: PKC in njihov vpliv na raka ter Alzheimerjevo bolezen]||Nejc Kejžar||Karmen Žbogar||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Tadej Satler||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tadej_Satler: PD-1 limfocitov in melanomskih celic]||Neža Brezovar||Klara Lenart||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Tina Šimunović||14-15||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tina_Simunovic: Pentoza-fosfatna pot, njena regulacija in povezava z rakom]||Kristjan Stibilj||Katja Čop||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Maja Zupanc||14-15||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Maja_Zupanc: Kako dolge nekodirajoče RNA vplivajo na metabolizem]||Tjaša Lukšič||Nejc Kejžar||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Tilen Tršelič||14-15||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tilen_Trselic: PKM2 in njegova vloga pri razvoju rakavih celic]||Klara Kuret||Dorotea Borković||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Lara Jerman||16||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Lara_Jerman: Warburgov učinek: od raka do avtoimunosti]||Rok Miklavčič||Neža Brezovar||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Eva Rajh||16||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Eva_Rajh: Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na modifikacije DNK in histonov ter vpliv na staranje]||Ema Gašperšič||Kristjan Stibilj||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Sara Tekavec||16||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Sara_Tekavec: Mutacije encimov Krebsovega cikla in vpliv na razvoj ter rast tumorjev]||Tadej Satler||Tjaša Lukšič||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Fran Krstanović||17||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Fran_Krstanovic: L-Carnitine enhances exercise endurance capacity]||Tina Šimunović||Klara Kuret||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Elvira Boršić||17||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Elvira_Boršić: Posledice spremenjenega metabolizma maščobnih kislin v kardiomiocitih]||Maja Zupanc||Rok Miklavčič||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Janja Krapež||17||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Janja_Krapež: Vpliv metabolizma maščobnih kisln na povišan krvni tlak v pljučnih arterijah]||Tilen Tršelič||Ema Gašperšič||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Janez Javornik||18||||Lara Jerman||Tadej Satler||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Miha Koprivnikar Krajnc||18||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Miha_Koprivnikar_Krajnc: Pomanjkanje karbamoil-fosfat sintetaze]||Eva Rajh||Tina Šimunović||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Špela Malenšek||18||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Špela_Malenšek: Leucinska in glutaminska regulacija mTORC1]||Sara Tekavec||Maja Zupanc||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Urša Kopač||19||Vpliv mutacij na delovanje ATP-sintaze s poudarkom na TMEM70||Fran Krstanović||Tilen Tršelič||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Neža Koritnik||19||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Ne.C5.BEa_Koritnik: Uravnavanje koncentracije ROS in glutationilacija v mitohondriju]||Dorotea Borković||Lara Jerman||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Gašper Virant||19||||Elvira Boršić||Eva Rajh||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Uroš Zavrtanik||20||||Janja Krapež||Sara Tekavec||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Simon Aleksič||20||||Janez Javornik||Fran Krstanović||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Matej Hvalec||20||||Miha Koprivnikar Krajnc||Elvira Boršić||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Urša Čerček||21||PCSK9: Nov način uravnavanja koncentracije LDL v krvi||Špela Malenšek||Janja Krapež||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Katja Brezovar||21||Vloga sfingolipidov pri fagocitozi ''Candide albicans''||Urša Kopač||Janez Javornik||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Gašper Žun||21||||Neža Koritnik||Miha Koprivnikar Krajnc||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Blaž Lebar||22||||Gašper Virant||Špela Malenšek||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Aleksandra Uzar||22||Nucleoside antibiotics||Uroš Zavrtanik||Urša Kopač||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Petra Hruševar||22||Vloga metabolizma serina in glicina pri raku||Simon Aleksič||Neža Koritnik||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Dorotea Borković||23||||Matej Hvalec||Gašper Virant||06/01/16||08/01/16||12/01/16
|-
| Karmen Žbogar||23||||Katja Brezovar||Simon Aleksič||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Klara Lenart||23||||Gašper Žun||Matej Hvalec||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Lovro Kotnik||23||||Urša Čerček||Uroš Zavrtanik||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Katja Čop||23||||Blaž Lebar||Urša Čerček||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|-
| Nejc Kejžar||23||Hormonska regulacija razvoja T-celic||Aleksandra Uzar||Katja Brezovar||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|-
| Neža Brezovar||23||||Petra Hruševar||Gašper Žun||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2015|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši
* 116_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, ki je napisan na novo in je bil prijavljen v shemo 50%

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Povzetki seminarjev 2015

2015-12-02T14:20:12Z

Neža Koritnik: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2015/2016 */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2015/2016 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2015 stran]

=== Kristjan Stibilj: PI3K kaskada in njihova vloga pri rakavih obolenjih ===
Dandanes je zdravljenje rakavih obolenj poglavitna točka v razvoju farmacevtskih zdravil. Velike multinacionalke vlagajo ogromno denarja v razvoj zdravila, ki bi ozdravil tumorje oz. omilil njihovo delovanje. Za nastanek rakavih obolenj so v veliki meri krivi receptorji tirozin kinaze (RTK) in njihova PI3K/AKT/mTOR signalna pot. Ta namreč nadzoruje celično proliferacijo, metabolizem, premikanje in preživetje. Mutacije ključnih proteinov v PI3K kaskadi vodijo do nenadzorovane rasti in delitve celic, kar privede do nastanka tumorjev. Glavni princip zdravljenja oz. iskanje zdravila za rakava obolenja je torej poiskati takšno molekulo, ki bi uspešno inhibirala mutiran protein in s tem ustavila njegovo hiperaktivacjo. Znanstveniki so v zadnjih letih odkrili precej inhibitorjev, ki so bolj ali majn specifični in so sedaj v preiskavah kot morebitno zdravilo. Za inhibiranje PI3K molekule sta se v predkličninih študijah pokazala kot uspešna pictilisib in buparlisib, ki se vežeta na ATP-vezavno mesto. Na enak način deluje tudi večina AKT inhibitorjev, kamor spada tudi dobro raziskan Inhibitor VIII. mTOR, zadnja molekula v PI3K kaskadi, pa ima prav tako kar nekaj sintetičnih inhibitorjev, ki so analogni naravni molekuli rapamcin. Vsi našteti inhibitorji pa žal še niso zdravila za raka, saj so interakcije z ostalimi encimi v celici še vedno nepoznane.

=== Klara Kuret: Vpliv bakterijskih efektorjev na celični ubikvitinacijski sistem in rastlinski imunski odziv ===
Patogene bakterije uporabljajo efektorje za zatiranje imunskega odziva gostitelja. Tarča mnogih efektorskih proteinov je celični ubikvitinacijski sistem (UBS), ki je pomemben regulator imunskega odgovora. Ubikvitinska signalizacija poteka preko treh encimskih kompleksov, ki na proteinske substrate vežejo molekule ubikvitina. Dolžina in oblika ubikvitinske verige narekujeta, kakšen bo biološki odgovor celice na ubikvitinacijo oz. kaj se bo s substratom zgodilo. Ker prokarionti nimajo lastnega ubikvitinacijskega sistema, so morali razviti drugačne mehanizme, ki jim omogočajo interakcijo z evkariontskimi proteini, kateri nastopajo pri ubikvitinaciji. Efektorji lahko gostiteljski UBS izkoriščajo tako, da strukturno ali funkcijsko posnemajo evkariontske komponente UBS, ali pa so homologi evkariontskih proteinov. Lahko tudi pospešujejo ali inhibirajo delovanje 26S proteasoma. Efektorski proteini torej izkoriščajo evkariontske strategije za nadzor in manipulacijo gostiteljevih celičnih procesov, v smeri, ki patogenu omogoča čim boljšo možnost razvoja in množitve. Efektorji AvrPtoB, HopM1 ter VirF so nastali z različnim evolucijskim razvojem, zato se tudi mehanizmi njihovega delovanja na UBS razlikujejo. Patogeni efektorji lahko preko ubikvitinacije pomembnih signalnih proteinov v imunskih kaskadah povzročijo nezmožnost celice, da aktivira PAMP ter ETI imunost. Razgradnja gostiteljevih proteinov vodi lahko do motenj v izražanju genov, motenj v vezikularnem transportu in številnih drugih nepravilnosti v celičnih procesih, ki pripeljejo do večje dovzetnosti celice za okužbo.

=== Tjaša Lukšič: Alternativno izrezovanje GPCR-jev s poudarkom na sekretinski družini ===
Alternativno izrezovanje GPCR-jev je pogost pojav, še posebej pri sekretinski in nekaterih sorodnih družinah. Receptorji sekretinske družine se pojavljajo v zanimivih izooblikah, ki odstirajo nove poglede na regulacijo celične signalizacije. V sedmi transmembranski vijačnici sekretinskih GPCR-jev je dobro ohranjen ekson 12 oz. zaporedje 14 aminokislin, ki je tarča izrezovalno-povezovalnega kompleksa pri nekaterih receptorjih. Delecija eksona 12 nima izrazitega vpliva na vezavo primarnih sporočevalcev, ima pa zato toliko večje posledice pri prenosu signalov. Povezovanje z G-proteini je onemogočeno, ker skrajšana TMD7 ne omogoča normalne konformacijske spremembe. Le-ta se v običajnih izooblikah zgodi zaradi premika TMD6 in TMD7 proti statični TMD3, kar razkrije intracelularno vezavno domeno za navzdolnje efektorje. Poleg omenjene funkcije lažnega receptorja, se oslabi tudi membranska ekspresija kratkih-TMD7 receptorjev, saj je izbrisan transportni motiv v eksonu 12 in zmanjšana hidrofobnost C konca. Najbolj fascinantna posledica je zagotovo dominantno negativna regulacija membranske ekspresije ostalih izooblik. Za transport GPCR-jev iz kontrolnega sistema endoplazmatskega retikuluma je potrebna oligomerizacija. Hetero-oligomeri določenih kombinacij s kratkim-TMD7 receptorjem ne uspejo zapustiti ER, število delujočih receptorjev v membrani se zmanjšuje in celica je slabše odzivna na njihove primarne sporočevalce. Med tem pa nekateri receptorji nimajo težav pri transportu skupaj s skrajšanimi izooblikami. Številna bolezenska stanja so povezana s patološkimi izooblikami ali z neuspešnim transportom proteinov iz ER, za kar obstaja potencialna rešitev v farmakoloških šaperonih.

=== Rok Miklavčič: Preusmeritve signalnih poti preko TNFR1 v boju s patogeni ===
Celice so se skozi čas prilagodile na življenje v okolju, polnem potencialno škodljivih patogenov. Razvilo se je mnogo mehanizmov celičnega odgovora, ki so prilagojeni tako, da lahko ustrezen odgovor na patogene pripravijo v različnih situacijah. En takih mehanizmov predstavlja tudi signalna kaskada preko TNFR1, receptorja za citokin TNFα. TNFα sprostijo celice imunskega sistema, ko zaznajo prisotnost patogena. Osnovni celični odgovor pri stimulaciji TNFR1 je kaskada, ki preko zaporedja ubikvitinacij sodelujočih proteinov, privede do translokacije transkripcijskega faktorja NF-κB v jedro. NF-κB tam sproži prepisovanje genov za vnetne citokine, ki ob kasnejšem sproščanju v okolico celice povzročijo vnetni odziv sosednjih celic ter s tem omejitev okužbe. Nekateri patogeni pa so na ta odziv prilagojeni tako, da inhibirajo ključne proteine v začetni kaskadi in s tem zmanjšajo vnetje, vendar pa imajo na to prilagoditev odgovor tudi gostiteljske celice. Pri taki inhibiciji pride do prenosa signala po drugi poti, ki privede do apoptoze napadene celice, kar ubije tudi patogene v njej, in tako omeji okužbo. Patogeni lahko inhibirajo tudi samo apoptozo, zaradi česar obstaja tudi zasilni celični mehanizem odgovora nanje. V primeru inhibicije apoptoze se kaskada konča z aktivacijo psevdokinaze MLKL, ki je glavni efektor za mehanizem programirane nekroze z imenom nekroptoza. Pri nekroptozi pride kot pri nekrozi do celične lize, pri čemer se v okolico sprostijo DAMP-i, ki sprožijo vnetni odziv okoliškega tkiva.

=== Ema Gašperšič: PKC in njihov vpliv na raka ter Alzheimerjevo bolezen ===
Protein kinaze C (PKC) so družina encimov, ki sodelujejo v številnih signalnih poteh v celici. S fosforilacijo serina ali treonina nekega drugega proteina regulira njegovo aktivnost. Vplivajo na proliferacijo in diferenciacijo celice, apoptozo, oblikovanje sinaps, učenje ter shranjevanje spominov, nevrološke motnje in mnogo drugih procesov v celici. Za aktivacijo PKC sta ključni povečani koncentraciji diacilglicerola (DAG) in kalcijevih ionov Ca2+, ki z vezavo na PKC povzročita prehod iz neaktivne v aktivno obliko. Aktivacija PKC vpliva na spodbujanje oziroma inhibiranje razvoja raznih bolezni, kot so rak, ishemična možganska kap ali Alzheimerjeva bolezen in druge nevrodegenerativne bolezni. Problem je v tem, da je pri zdravljenju raka potrebno rast celic čim prej zaustaviti, med tem ko morajo pri nevrodegenerativnih boleznih nevroni ostajati živi. Poleg tega je zanimivo, da naj bi nekateri aktivatorji protein kinaz C rast rakavih celic spodbujali, drugi pa zavirali. Običajen mehanizem delovanja PKC je težko opisati, saj obstaja več oblik PKC izoencimov, ki so po različnih tkivih različno razporejeni, v celici imajo različne funkcije, poleg tega pa obstaja več signalnih poti, ki vodijo do aktivacije PKC. Vse to so razlogi za oteženo delo raziskovalcev, ki želijo odkriti načine zdravljenja prej omenjenih boleznih, zato torej to področje zahteva še precej raziskav, ki bi posledično lahko olajšale njihovo zdravljenje.

=== Tadej Satler: PD-1 limfocitov in melanomskih celic ===
Melanom je najnevarnejša oblika kožnega raka in znanstveniki že desetletja borijo izboljšali rezultate zdravljenja. Vzpodbuditi želijo proti-tumorski odziv imunskega sistema, vendar so zaradi kontrolnih točk neuspešni. Kontrolne točke so ključne za ohranjanje imunske homeostaze, saj bi brez njih bili žrtev številnim avtoimunskim boleznim in poškodbam tkiva ob prevelikem odzivu sistema na patogene vnetje. Med imunske kontrolne točke spada tudi receptor PD-1. Je monomer sestavljen iz imunoglobulinske in citoplazemske domene. Zanj sta značilna tudi dva liganda (PD-L1 in PD-L2), ki sta potrebna za njegovo aktivacijo. Najdemo ga predvsem pri limfocitih T in nekaterih melanomskih celicah. Izražanje PD-1 je raziskano predvsem pri limfocitih T, kjer ob interakciji z ligandoma inhibira delovanje in funkcije limfocitov ter povzroča njihovo apoptozo. To doseže s pomočjo zaviranja številnih ključnih procesov znotraj celice, ki so potrebni za njeno normalno delovanje. Pri melanomskih celicah je pa delovanje PD-1 še dokaj neraziskano. Do zdaj njegova prisotnost ni bila znana, vendar so nedavne raziskave pokazale njegovo izražanje na nekaterih celicah limfocitov. Obnašanje PD-1 melanomskih celic je drugačno kot pa pri limfocitih, saj njegovo izražanje spodbuja rast tumorja. S pomočjo boljšega poznavanja delovanja PD-1 v limfocitih T in melanomskih celicah, bo lažje razviti učinkovitejše metode boja proti raku.

=== Tilen Tršelič: PKM2 in njegova vloga pri razvoju rakavih celic ===
Piruvat kinaza (PK) je pomemben glikolitski encim, ki se pojavlja v štirih različnih oblikah. Oblika M2 je posebno zanimiva, saj poleg svoje glikolitske funkcije opravlja še mnoge druge, nemetabolične funkcije. Poleg tega je PKM2 prevladujoča oblika encima v rakavih celicah. Razlog za povečano izražanje le-tega verjeno izhaja iz dejstva, da lahko PKM2 zavzema aktivno tetramerno obliko ali skoraj neaktivno dimerno obliko. Možnost menjavanja svojih oblik celicam, bodisi zdravim ali rakavim, omogoča prilagajanje delovanja njihovim potrebam. Če celici primanjkuje energije, lahko encim zavzema pretežno aktivno tetramerno obliko in tako spodbuja proizvodnjo ATP. Če celica potrebuje nove makromolekule za proliferacijo, tu encim lahko zavzame pretežno neaktivno dimerno obliko in spodbuja kopičenje intermediatov glikolize. Te so ključni za sintezo novih snovi, saj služijo kot njihovi prekurzorji.
Aktivnost encima PKM2 se regulira na več načinov. Vlogo regulatorjev po navadi opravljajo post-translacijske modifikacije encima, lahko pa tudi nekatere druge spremembe v celičnem okolju.
PKM2 v svoji manj aktivni dimerni obliki prav tako lahko regulira druge procese. Predvsem pospešuje celično rast in razvoj prek reakcij z pomembnimi transkripcijskimi faktorji v jedru. Izkazalo se je, da delovanje encima PKM2 močno koristi rakavim celicam.
Ker je encim PKM2 zelo pomemben za razvoj takšnih celic, predstavlja dobro potencialno tarčo za zdravljenje. Raziskave potrjujejo, da bi bilo slednje možno, ne ponujajo pa konkretnega odgovora na vprašanje, kako bi takšno zdravljenje potekalo.

=== Tina Šimunović: Pentoza-fosfatna pot, njena regulacija in povezava z rakom ===
Pod imenom rak razumemo bolezen, za katero je značilna nenadzorovana rast in celična delitev. Rakave celice imajo tako večjo potrebo po biosintezi pomembnih makromolekul, ki jo zadostijo s prilagoditvijo in spremembo svojih metaboličnih poti. Ena izmed prilagoditev je lahko sprememba pentoza-fosfatne poti (PPP). To je ena izmed metaboličnih poti glukoze, katere glavna produkta sta riboza-5-fosfat in NADPH. Prva se naprej uporablja pri sintezi nukleinskih kislin, NADPH pa je pomemben za sintezo makromolekul in za detoksikacijo. Regulacija PPP poteka preko njenih metabolnih encimov. V rakavih celicah je predvsem izražena povišana aktivnost glukoza-6-fosfat dehidrogenaze in s tem aktivnost PPP. Pri tem encimu sta, poleg mnogih drugih, najpomembnejša regulatorja NADPH in tumorski supresor p53. Aktivnost PPP lahko poveča tudi acetilacija 6-fosfoglukonat dehidrogenaze ali pa povečano izražanje transketolaze. Na pospešeno proliferacijo rakavih celic vplivajo tudi inaktivirani tumorski supresorji in aktivirani onkoproteini, npr. p53, TIGAR, ATM, Ras, mTORC1 in Nrf2. Največji pomen PPP pri rakavih celicah, je v zaščiti pred celično smrtjo, saj se s povečano aktivnostjo PPP pospeši tvorba njenih produktov, ki so ključni pri preživetju celice. Z inhibicijo te poti, bi lahko tudi inhibirali rast tumorjev. PPP je tako postala potenciala tarča za zdravljenje raka, vendar je za to potrebnih še veliko raziskav in boljše razumevanje metabolizma rakavih celic.

=== Maja Zupanc: Kako dolge nekodirajoče RNA vplivajo na regulacijo metabolizma ===
Ena najbolj fascinantnih lastnosti metabolizma je njegova regulacija. Za homeostazo metabolizma hranil in energije v telesu je nujna specializirana regulacija centralnega živčnega sistema, Langerhansovih otočkov trebušne slinavke in glavnih metabolnih tkiv (maščobno tkivo, skeletne mišice in jetra). Dolge nekodirajoče molekule RNA (lncRNA) so RNA molekule dolge več kot 200 nukleotidov, ki ne kodirajo proteinov. Njihov spekter delovanja je izredno širok, na metabolizem vplivajo prek regulacije procesov adipogeneze in hepatičnega metabolizma, nadzora funkcionalnosti Langerhansovih otočkastih celic, regulacije razvoja skeletnih mišic, in energijske homeostaze. Do sedaj je bilo odkritih že več kot 60000 dolgih nekodirajočih RNA molekul in repetuar njihovih funkcij se z vsako novo raziskavo širi. Vloga lncRNA je še pred desetimi leti bila neznanka, od takrat pa nam je že postalo jasno, da so pomembni regulatorji izražanja DNA, diferenciacije in razvoja celic, razvoja tkiva in tumorogeneze. V resnici pa vemo zelo malo, oziroma smo šele na začetku razumevanja lncRNA. Ker se zaradi tega z vsakim novim odkritjem pojavlja še več vprašanj (o podrobnih principih delovanja lncRNA in njihovega sodelovanja z drugimi molekulami, o še nepoznanih funkcijah, vpletenosti v bolezni in možnosti razvoja novih tehnik zdravljenja…), so raziskave na tem področju zelo aktualne.

=== Lara Jerman: Warburgov učinek: od raka do avtoimunosti ===
V dvajsetih letih prejšnjega stoletja je Otto Warburg s svojimi sodelavci meril porabo kisika in sintezo laktata v rakastem tkivu. Pri tem je prišel do zelo pomembnega opažanja, ki ostaja zelo aktualno – da celice rakastega tkiva tudi ob normoksičnih pogojih vztrajajo pri močno povečani glikolizi. Danes vemo, da se Warburgov učinek v rakastih tkivi pojavlja skoraj univerzalno. Večina Warburgovih opažanj in meritev je bila kvantitativno pravilna. Njegova razlaga vzroka pojava pa se je izkazala za napačno, saj povečano stopnjo glikolize zasledimo v mnogih rakastih tkivih brez določljivih mitohondrijskih mutacij ali motenj oksidativno-fosforilacijske metabolne poti. V takih tkivih sinteza ATP v mitohondrijih poteka nemoteno in enako učinkovito kot pri normalnih tkivih z enako koncentracijo kisika. Raziskave zadnjih let kažejo na to, da je povečana glikoliza strateška poteza rakastih celic, ki zadovoljuje predvsem njihove potrebe po sintezi biomase. V skoraj stoletju od Warburgovega prvotnega odkritja je postalo jasno, da metabolična stikala omogočajo celici, da se prilagaja svojim bioenergetskim in biosintetskim potrebam. Zmožnost hitrega prilagajanje potrebam je še posebej pomembna pri imunskih celicah, ki morajo ob imunskem odzivu hitro preiti iz mirujočega stanja. Zato ni presenetljivo, da so si rakaste in imunske celice glede zagotavljanja metabolnih tokov in bionenergetike za rast in širjenje v marsičem podobne.

=== Sara Tekavec: Mutacije encimov Krebsovega cikla in vpliv na razvoj ter rast tumorjev ===
Encimi izocitrat dehidrogenaza (IDH), sukcinat dehidrogenaza (SDH) in fumarat hidrataza (FH) sodelujejo v Krebsovem ciklu. Prvi omogoča pretvorbo izocitrata v α-ketoglutarat (α-KG), drugi pretvorbo sukcinata v fumarat, tretji pa pretvorbo fumarata v malat. Za gene, ki kodirajo te encime, so značilne mutacije, ki vodijo v nastanek in rast tumorjev. Mutacije so lahko onkogen-aktivirajoče (mutacija IDH) ali tumor-supresor deaktivirajoče (mutacije SDH in FH). Mutacija IDH tako v encimu vzpodbudi novo funkcijo, in sicer pretvorbo α-ketoglutarata ob prisotnosti NADPH v onkometabolit 2-hidroksiglutarat (2-HG). Pri drugih dveh mutacijah pa gre za to, da je aktivnost encima zmanjšana oz. je sploh ni, kar ima za posledico kopičenje sukcinata ali fumarata. To ugodno vpliva na rast tumorja, saj lahko te tri omenjene molekule na različne načine inducirajo izražanje genov, pomembnih za celično rast in preživetje. Vse tri na primer stabilizirajo hipoksični inducibilni faktor (HIF), ki nato sproži transkripcijo in angiogenezo (rast krvnih žil). Z zmanjšano koncentracijo dveh antioksidantov NADPH in α-ketoglutarata se poveča tudi tveganje za nove mutacije, povzročene s strani reaktivnih kisikovih zvrsti. Poleg tega lahko α-KG sam deluje kot mutagen ali pa tudi inhibira metilacijo DNA in histonov, zaradi česar je izražanje onkogenov povečano. Kljub temu, da je ta metabolična pot pri tumorjih precej kompleksna, nam bodo nove metode detekcije tumorjev kmalu omogočile tudi boljše razumevanje samih mutacij in mehanizma nastanka tumorjev, ki tiči v ozadju.

=== Fran Krstanović: L-Carnitine enhances exercise endurance capacity ===
Our energy metabolism is working constantly to cover energy need of our body. ATP represents the first line of action. With cellular ATP concentration low, our body needs other sources of energy as fuel. Fats carbs and proteins play that part. To get energy from fats they need to be oxidase. The process of fat oxidation is situated in the mitochondria. Fats need a special transporter to get into the cell, l-carnitine.
Apart from fat transportation l-carnitine has many other roles; enhancing exercise endurance capacity is believed to be one of them. Mice fed with L-carnitine showed great promise to confirm this theory. Glycogen concentrations were higher, all important parameters for fatty acid intake and mitochondria biogenesis were higher and do additional AMPK was activated. The most important parameter was higher endurance capacity was reached. The problem lies in implicating the theory on humans; consuming concentrations are unknown (high can lead to problems, low won’t have affect). Further experiments will surely be held as carnitine provides great attention from sports industries as a supplement for fat burning or maybe for greater athletes’ fatigue.

=== Janja Krapež: Vpliv metabolizma maščobnih kislin na povišan krvni tlak v plučnih arterijah ===
Povišan krvni tlak v pljučnih arterijah (PAH) je huda bolezen, ki posledično zelo vpliva tudi na srce, predvsem na desni prekat, ki se zaradi prevelike obremenjenosti poveča. To lahko privede tudi do odpovedi srca. Zakaj pride do nepravilnega delovanja desnega prekata, je še neznano, prav tako kako do tega pride. Zadnje raziskave sklepajo, da je z nedelovanje povezan tudi metabolizem maščobnih kislin in glukoze. Problem predstavlja kopičenje maščobnih kislin znotraj mišičnih celic srca. Za transport maščobnih kislin z dolgimi verigami poskrbi protein CD36 skupaj s FATP (v miocitih FATP6). Kopičenje maščobnih kislin v celici je povezano tudi s favoriziranjem oksidacije glukoze. Preklop med ß-oksidacijo maščobnih kislin in oksidacijo glukoze poteka v Randlovem ciklu, kjer intermediati ene oksidacije inhibirajo drugo. Ključni pri inhibiciji ß-oksidacije je malonil-CoA, ki inhibira CAP encim na mitohondrjski membrani in je ključni prenašalec maščobnih kislin v mitohondrij, kjer se nadalje oksidirajo. Trenutne raziskave želijo izboljšati delovanje desnega prekata prav preko oksidacije maščobnih kislin. Šele razumevanje zapletenih mehanizmov metabolizma bo omogočilo nadaljnji razvoj potencialnih zdravil za zdravljenje PAH in posledično tudi izboljšalo delovanje desnega prekata.

=== Elvira Boršić: Posledice spremenjenega metabolizma maščobnih kislin v kardiomiocitih ===
V fetusu kardiomiociti pridobivajo energijo z oksidacijo glukoze in laktata zaradi pomanjkanja kisika. Ko se rodimo pa postanejo maščobne kisline preferenčni substrat pridobivanja ATP-ja. Do sprememb glavnega substrata pride zaradi večjih telesnih obremenitev, bolezni in okoliščin zunaj celice. Pri tem imajo osrednjo vlogo razni transkripcijski faktorji, npr. receptor, aktiviran s peroksisomskim proliferatorjem α (PPARα), in transkripcijski koaktivatorji, npr. PPARγ koaktivator 1α (PGC1α). Dokazali so, da lahko nedelovanje vsaj 22 encimov in transporterjev udeleženih pri metabolizmu maščobnih kislin povzroči razne bolezni, ki zmanjšajo delovanje srca. Vsaka od teh pa lahko povzroči srčno popuščanje. Do tega pride, ko srce ni več zmožno črpati krvi iz pljuč po telesu. Najpogostejša vzroka sta zvišan krvni tlak in ishemija. Slednjo povzroči hipoksija, zaradi česar se ustavi tok elektronov v dihalni verigi. V anaerobnih pogojih je tako glikoliza edini vir energije in proizvede le 5 % celotnega ATP-ja, ki ga imajo kardiomiociti v normalnih pogojih. Produkti glikolize porušijo homeostazo in za ohranjanje le-te celice porabijo veliko energije, ki bi se sicer porabila pri kontrakciji. Raven kisika se obnovi pri reperfuziji, ki pa naredi še več škode kot ishemija. Zaradi srčnega popuščanja umre vsako leto več tisoč ljudi, saj še ne poznamo zdravila, ki bi to bolezen preprečilo. Ker še ne razumemo vseh mehanizmov, poteka na tem področju veliko raziskav.

=== Miha Koprivnikar Krajnc: Pomanjkanje karbamoil-fosfat sintetaze ===
Pomanjkanje karbamoil fosfat sintetaze (CPS1) je ena izmed motenj cikla sečnine, torej poslabša zmožnost proizvodnje sečnine, ki ima pomembno vlogo pri regulaciji pH. CPS1 katalizira nastanek vstopne spojine cikla sečnine, karbamoil fosfat, in jo regulirajo Mg2+, Ca2+, NAG, ter tudi druge snovi posredno, preko NAG sintetaze. Mutacij, ki povzročajo spremembo strukture CPS1 je kar nekaj in povzročajo spremembe v aktivnosti encima različnih jakosti (od milih sprememb do popolne inaktivacije). To je razlog, da nekateri oboleli velikokrat sploh ne dočakajo otroštva, medtem ko pri ostalih bolezen pride na dan kasneje v življenju ob nekem stresu za organizem. Simptomi pomanjkanja CPS1 so predvsem nevropatološke narave in vključujejo poslabšanje kognitivnih sposobnosti, epizode delirija, utrujenost in druge simptome. Pri pacientih s hujšimi motnjami lahko bolezen tudi po zdravljenju pusti trajne posledice, saj pride do poškodb možganov v procesu razvoja. Razlog za nevrotoksičnost je osmotska aktivnost glutamina, ki se v velikih količinah nabira v astrocitah možganov. To povzroča hipertonično okolje v celicah in otekanje možganov. Brez ukrepov to privede do kome in smrti. Zdravljenje akutnih primerov motnje se začne z uporabo lovilcev amonijaka in dializo krvi, nadaljnji ukrepi pa so za enkrat omejeni na dieto z malo proteinov in citrulin. Za prihodnost je obetavno zdravljenje s stimulacijo encima z aktivatorjem oziroma njegovim analogom ali pa kar s stimulacijo sintetaze aktivatorja.

=== Špela Malenšek: Leucinska in glutaminska regulacija mTORC1 ===
Kompleks mTORC1 je ohranjena Ser/Thr kinaza, ki z združevanjem signalov regulira celično ravnovesje med anabolizmom in katabolizmom. Nadzoruje celično rast, sintezo proteinov ter ribosomov in blokira avtofagijo. Nepravilno delovanje mTORC1 je vzrok različnim vrstam raka, diabetesu tipa 2 in nevrodegenerativnim boleznim. Verjetno najpomembnejši, a hkrati najmanj razumljeni regulatorji mTORC1 so aminokisline, med katerimi izstopata leucin in glutamin. Koncentraciji slednjih v citosolu sta odvisni druga od druge, saj je t.i. terciarni aktivni transport leucina v celico sklopljen s prenosom glutamina iz celice. Eden izmed modelov regulacije mTORC1 predpostavlja, da so pri prenosu aminokislinskega signala do mTORC1 glavni trije multiproteinski kompleksi, ki vključujejo majhne RagGTPaze, Ragulator in v-ATPazo. Združitev slednjih poteka na lizosomih, kjer je mTORC1 posledično tudi aktiviran s proteinom Rheb. Aminokislinska signalna kaskada mTORC1 predstavlja tudi tipalo, s katerim celica zaznava prisotnost in koncentracijo aminokislin v lizosomskem lumnu, citoplazmi in v zunaj-celičnem prostoru. Delovanje v-ATPaze je namreč močno odvisno od koncentracije leucina v notranjosti lizosomov in predstavlja t.i. »notranjo« regulacijo mTORC1. Hkrati naj bi leucin neposredno vplival na spremembno konformacije RagGTPaz z vezavo na protein Sestrin2, vendar so je popoln mehanizem posledice vezave leucina še nepojasnjen. Glutamin naj bi na mTORC1 deloval drugače kot leucin (brez posredovanja RagGTPaz in Ragulatorja), hkrati pa naj bi regulacijsko vlogo aktivacije mTORC1 imel tudi eden izmed produktov dvojne deaminacije glumatina, α-ketoglutarat.

=== Neža Koritnik: Uravnavanje koncentracije ROS in glutationilcija v mitohondriju ===
V mitohondriju zaradi razlik v redoks okolju nastajajo reaktivne kisikove spojine (ROS), ki lahko povzročajo oksidativno škodo, v manjših koncentracijah pa so pomembne signalne molekule. Njihov glavni vir so predvsem flavoproteini, jih najdemo tudi v kompleksih dihalne verige in nekaterih encimih Krebsovega cikla. Ti lahko v času oksidativnega stresa zaradi različnih razlogov prenesejo elektrone namesto na njihov naravni akceptor direktno na kisik, pri čemer se tvorijo reaktivni superoksidni radikali (in druge ROS). H2O2 ima sposobnost oksidacije tiolnih cisteinskih ostankov proteinov (-SH do -SOH), kar ponavadi povzroči reverzibilno deaktivacijo proteinov in s tem regulacijo različnih procesov v mitohondriju. V skrajnem primeru pa pride do hiperoksidacije (do -SO2H ali - SO3H), ki pa je ireverzibilna in lahko trajo poškoduje proteine in druge molekule. Za preprečevanje oksidativne škode in uravnavanjem redoks signalizacije so se razvili sistemi GSH/Gpx/GR in Prx/Trx/TrxR. Glutation (GSH) je pomembna molekula, ki v razmerju s svojo oksidirano obliko (dimerom GSSG) določa redoks stanje v mitohondriju. V oksidirani obliki ima sposobnost vezave na tiole cisteinskih ostankov proteinov. To je proces glutationilacije, pri kateri se tvori disulfidna povezava protein-SSG, kar pa ima regulatorno vlogo (začasna aktivacija/deaktivacija proteina) ali pa zaščitno vlogo pred hiperoksidacijo. Pomemben encim, ki regulira glutationilacijo je glutaredoksin (Grx). S temi mehanizmi se v mitohondriju uravnavajo številni metabolni procesi in redoks stanje matriksa.

BIO2 Seminar 2015

2015-11-06T11:37:47Z

Neža Koritnik: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Kristjan Stibilj||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Kristjan_Stibilj:_Inhibicija PI3k/AKT/mTOR signalne poti kot orožje proti raku||Lovro Kotnik||Blaž Lebar]||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Tjaša Lukšič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tjasa_Luksic: Alternativno izrezovanje GPCR-jev s poudarkom na sekretinski družini]||Karmen Žbogar||Aleksandra Uzar||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Klara Kuret||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Klara_Kuret: Vpliv bakterijskih efektorjev na celični ubikvitinacijski sistem in rastlinski imunski odziv]||Klara Lenart||Petra Hruševar||21/10/15||23/10/15||28/10/15
|-
| Rok Miklavčič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Rok_Miklavčič: Preusmeritve signalnih poti preko TNFR1 v boju s patogeni]||Katja Čop||Lovro Kotnik||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Ema Gašperšič||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Ema_Gaspersic: PKC in njihov vpliv na raka ter Alzheimerjevo bolezen]||Nejc Kejžar||Karmen Žbogar||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Tadej Satler||12||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tadej_Satler: PD-1 limfocitov in melanomskih celic]||Neža Brezovar||Klara Lenart||28/10/15||30/10/15||04/11/15
|-
| Tina Šimunović||14-15||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2015#Tina_Simunovic: Pentoza-fosfatna pot, njena regulacija in povezava z rakom]||Kristjan Stibilj||Katja Čop||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Maja Zupanc||14-15||Kako dolge nekodirajoče RNA regulirajo metabolizem||Tjaša Lukšič||Nejc Kejžar||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Tilen Tršelič||14-15||PKM2 in njegova vloga pri razvoju rakavih celic||Klara Kuret||Dorotea Borković||04/11/15||06/11/15||11/11/15
|-
| Lara Jerman||16||||Rok Miklavčič||Neža Brezovar||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Eva Rajh||16||Vpliv intermediatov Krebsovega cikla na posttranslacijske modifikacije in DNA metilacijo ||Ema Gašperšič||Kristjan Stibilj||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Sara Tekavec||16||Mutacije encimov Krebsovega cikla in nastanek tumorja||Tadej Satler||Tjaša Lukšič||11/11/15||13/11/15||18/11/15
|-
| Fran Krstanović||17||||Tina Šimunović||Klara Kuret||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Elvira Boršić||17||||Maja Zupanc||Rok Miklavčič||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Janja Krapež||17||||Tilen Tršelič||Ema Gašperšič||18/11/15||20/11/15||25/11/15
|-
| Janez Javornik||18||||Lara Jerman||Tadej Satler||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Miha Koprivnikar Krajnc||18||||Eva Rajh||Tina Šimunović||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Špela Malenšek||18|| Aminokislinska regulacija mTORC1||Sara Tekavec||Maja Zupanc||25/11/15||27/11/15||02/12/15
|-
| Urša Kopač||19||||Fran Krstanović||Tilen Tršelič||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Neža Koritnik||19||Uravnavanje koncentracije ROS v mitohondriju z glutationilacijo||Dorotea Borković||Lara Jerman||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Gašper Virant||19||||Elvira Boršić||Eva Rajh||02/12/15||04/12/15||09/12/15
|-
| Uroš Zavrtanik||20||||Janja Krapež||Sara Tekavec||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Simon Aleksič||20||||Janez Javornik||Fran Krstanović||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Matej Hvalec||20||||Miha Koprivnikar Krajnc||Elvira Boršić||09/12/15||11/12/15||16/12/15
|-
| Urša Čerček||21||||Špela Malenšek||Janja Krapež||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Katja Brezovar||21||Vloga sfingolipidov pri fagocitozi ''Candide albicans''||Urša Kopač||Janez Javornik||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Gašper Žun||21||||Neža Koritnik||Miha Koprivnikar Krajnc||16/12/15||18/12/15||23/12/15
|-
| Blaž Lebar||22||||Gašper Virant||Špela Malenšek||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Aleksandra Uzar||22||||Uroš Zavrtanik||Urša Kopač||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Petra Hruševar||22||||Simon Aleksič||Neža Koritnik||23/12/15||03/01/16||06/01/16
|-
| Lovro Kotnik||23||||Urša Čerček||Uroš Zavrtanik||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Karmen Žbogar||23||||Katja Brezovar||Simon Aleksič||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Klara Lenart||23||||Gašper Žun||Matej Hvalec||06/01/16||08/01/16||13/01/16
|-
| Dorotea Borković||23||||Matej Hvalec||Gašper Virant||06/01/16||08/01/16||14/01/16
|-
| Katja Čop||23||||Blaž Lebar||Urša Čerček||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|-
| Nejc Kejžar||23||Hormonska regulacija razvoja T-celic||Aleksandra Uzar||Katja Brezovar||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|-
| Neža Brezovar||23||||Petra Hruševar||Gašper Žun||13/01/16||15/01/16||20/01/16
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo!

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2015|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši
* 116_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, ki je napisan na novo in je bil prijavljen v shemo 50%

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/19bnx0Yh4RIuC2Kzkdaa8t8WqRTBgXYNTV_IWfjrO0W4/viewform?usp=send_form mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2015 Povzetki seminarjev

2015-05-04T22:09:49Z

Neža Koritnik:

[[TBK2015-seminar|Nazaj na osnovno stran]]

=== Uroš Zavrtanik: Mehanizem popravljanja DNA: NER (faktor XPC) ===

Od samega nastanka naprej se življenje spopada s fundamentalnim problemom kemijske nestabilnosti genetske informacije, shranjene v DNA. Molekula DNA je izpostavljena številnim fizikalnim ter kemijskim dejavnikom, ki lahko vplivajo na njeno strukturo in posredno ali neposredno tudi na samo informacijo. Ker pa predstavlja ohranjanje informacije eden izmed ključnih in pomembnejših aspektov življenja samega, so se tekom evolucije razvili številni mehanizmi popravljanja DNA. Eden izmed teh mehanizmov je popravljanje DNA z izrezom nukleotidov (ang. Nucleotide Excision Repair-NER). NER je popravljalni proces za odstranjevanje in popravo večjih strukturnih nepravilnosti v strukturi DNA, ki so v glavnem posledica radiacije (UV, gama) ter okolijskih dejavnikov (specifične molekule, ki lahko strukturno poškodujejo DNA). NER predstavlja pri človeku edini mehanizem za popravljanje poškodb povzročenih zaradi UV radiacije. Največji izziv NER je, kako najti vse poškodovane dele DNA v celotnem genomu. Na podlagi eksperimentalnih ugotovitev raziskovalci ugotavljajo, da bi lahko bil ''ključ do uspeha'' naključna vezava proteina XPC (začetni faktor NER) na nespecifično mesto v DNA ter nato vzdolžna difuzija XPC do poškodovanega (specifičnega) mesta, kjer XPC za trenutek obstane, kar je signal za sprožitev popravljalnega procesa. Odkritje bi lahko predstavljalo generalni koncept mehanizma še vedno malo raziskane interakcije protein-DNA.

=== Gašper Virant: Vezava agonista na adenozinske receptorje lajša kronično bolečino ===
Kronična bolečina je posledica okvare živčevja. Ločimo nociceptivno kronično bolečino, ki jo povzroča draženje bolečinskih receptorjev (nociceptorjev) v tkivih notranjih organov ter mišičnoskeletnega sistema, in nevropatsko kronično bolečino, ki nastane kot posledica okvare, poškodbe ali motenega delovanja perifernega ali osrednjega živčevja . Najbolj uspešni pristopi lajšanja tovrstne bolečine temeljijo na uporabi mehanizma kalcijevih kanalčkov, opioidov, in adrenergikov. Pogosto pa imajo ta zdravila stranske učinke, ki nastopijo ob neprestani uporabi. Prav tako telo razvije toleranco do njih, kar pomeni, da je za enak učinek potreben vedno večji odmerek, kar vodi v zmanjšano učinkovanje zdravila. Kot močno ne-narkotično in ne-opoidno sredstvo za lajšanje tovrstne bolečine se je izkazal adenozin. Adenozin oz. nekateri še bolj selektivni agonisti se vežejo na zunajcelične adenozinske receptorje in s tem zmanjšajo zaznavanje bolečine. Adenozin v zunajceličem prostoru ni obstojen, vendar lahko njegovo življensko dobo podaljšamo z inhibicijo andenozin kinaz in deaminaz ter tako posledično podaljšamo tudi protibolečinsko delovanje. Visoko selektiven agonist z veliko afiniteto do A3 podskupine adenozinskih receptorjev bi tudi pomembno odpravil neželene stranske učinke.

=== Klara Lenart: Permanentno označevanje nevronskih povezav ===

Preučevanje nevronskih povezav je precej neraziskano področje. Za raziskave teh povezav uporabljajo proteine, najpogosteje skupino proteinov imenovano GCaMP, ki oddajajo fluorescenčno svetlobo kratek čas po zaznavi spremembe v koncentraciji kalcijevih ionov v celici. Skupina znanstvenikov z medicinskega inštituta Howard Hughes je razvila nov protein, imenovan CaMPARI(podoben je skupini GCaMP-jev), ki označuje aktivne nevrone glede na spremembo koncentracije Ca2+ v njih. Proteini, podobni CaMPARI-ju obstajajo že zadnjih 20 let, a posebnost novega proteina je permanentna fluorescenca, ki jo oddaja ob povečanju koncentracije kalcija v celici ter sočasnem obsevanju z vijolično svetlobo. Glavni del CaMPARI-ja je fluorescenten protein EosFP, ki spremeni barvo iz zelene v rdečo ob obsvetljevanju z vijolično svetlobo. Ko so EosFP spojili z kalmodulinom in peptidom M13, katera sta potrebna za vezavo kalcijevih ionov, je nastal CaMPARI. Ponuja možnost raziskav nevronskih povezav med kompleksnejšim vedenjem, na primer med učenjem. Prav tako je uporaben, ker lahko z reguliranim obsvetljevanjem vplivamo, kdaj bo potekala pretvorba iz zelene v rdečo in kdaj ne. Preizkusili so ga v štirih poskusih; na ličinkah in odraslih osebkih vinske mušice, na ličinkah cebrice in na odraslih miših. Vsi poskusi so potrdili že znana dejstva, kar dokazuje njegovo zanesljivost, ter ponuja mnogo možnosti za nadaljnje raziskave.

=== Blaž Lebar: Preučitev imunskega odziva komarja po piku ===

Malarija je bolezen, ki jo prenaša komar mrzličar ali Anopheles. Na leto se okuži na stotine milijonov ljudi, nekaj milijonov jih tudi umre. Povzročitelj te bolezni so različne vrste plazmodijev, ki se uspešno množijo v komarju, ki nato po piku okuži svojo žrtev. Vendar kako uspe tako inferiorno bitje kot je komar okužiti tako kompleksno bitje kot je človek, morda celo smrtno, sam komar pa normalno funkcionira navkljub patogenom v lastnem v organizmu?
Za komarjev imunski sistem so odgovorni LRIMi, bilo naj bi jih nekaj več kot 24, vendar delovanja večine še ne poznajo. Najpomembnejša za imunski sistem komarja naj bi bila člena sistema komplementa: LRIM1 in APL1C v hemolimfi, ki se z LRRji povežeta z TEP1cut in tako izvedeta uspešno lizo in melanizacijo patogenov, vendar sta se izkazala kot popolnoma neučinkovita pri eliminaciji P. berghei. V tej študiji pa so se osredotočili na LRIM9, protein v imunskem sistemu, ki naj bi imel najpomembnejšo vlogo pri borbi z plazmodiji. Najpogostejša tehnika je bila qRT-PCR, preverjali pa so namnožitev, reprodukcijo in melanizacijo P. berghei pri komarjih vrste A. gambiae ob prehranjevanju s krvjo miši, ter različne vplive na izražanje LRIM9 (prehranjevanje, bakterije, imunost…). Ugotovili so tudi povezavo izražanja LRIM9 in hormona »ecdysone«, ki se izloča iz jajčnikov samic.
Danih je bilo veliko odgovorov, ki pa so odprli nova vprašanja, katera bodo zahtevala še veliko raziskav.

=== Ema Gašperšič: Dvojedrni bakrov kompleks naj bi preprečil širjenje raka ===
Čeprav je v zadnjem času opazen napredek na področju zdravljenja raka, še vedno obstajajo določene pomanjkljivosti. Eno izmed najbolj pogosto uporabljenih zdravil za različne vrste raka je cisplatin, ki se veže na dušikove baze DNA in s tem povzroči celično smrt oz. apoptozo. Cisplatin pa kljub vsemu ni vedno učinkovit in ima precej stranskih učinkov, zato so raziskovalci želeli razviti alternativno zdravilo. Razvili so citotoksični dvojedrni kompleks z bakrom, ki se s pomočjo molekularne prepoznave veže na dve sosednji fosfatni skupini na vijačnici DNA, kar prepreči celične delitve in uniči patološko celico. Z različnimi anorganskimi in biokemijskimi metodami, spektroskopijo in metodami na posameznih molekulah so dokazali, da dvojedrni Cu2 kompleks zavira sintezo DNA in je citotoksična za človeške rakave celice. V članku je predstavljena sinteza prvega kompleksa iz te družine molekul, bakrovega Cu2 kompleksa ter različne metode, s katerimi so dokazali sposobnost ustrezne koordinacije Cu2(2+), sposobnost močne vezave Cu2(2+) na DNA, sposobnost inhibicije sinteze DNA ter citotoksičnost kompleksa. Iz dobljenih rezultatov znanstveniki predpostavljajo učinkovito interakcijo med Cu2(2+) in DNA in vitro ter v živih celicah. Nadaljnje klinične in medicinske raziskave pa bodo še odločale o tem, kako, in če sploh, bo bakrov kompleks resnično preizkušen na pacientih z rakom.

=== Tjaša Lukšič: Ključne biološke funkcije skakajočih genov ===

Dobro polovico človeškega genoma sestavljajo ponavljajoči se genetski elementi, katerim v preteklosti niso pripisovali posebne vloge, danes pa vse bolj postaja jasno, da njihova prisotnost v genomu prinaša svojevrstne biološke funkcije. Alu sekvence so primer takšnih transpozicijskih elementov, katerih prepisovanje je običajno minimalizirano, vendar se ob virusnih infekcijah ali stresu močno poveča. Po klasifikaciji so podvrsta kratkih razpršenih jedrnih elementov (SINE), ki se lahko transponirajo po genomu prek RNA intermediata, vendar ne kodirajo proteinov. Alu sekvence prepisuje RNA polimeraza III, Alu RNA pa ima značilno sekundarno strukturo dveh rok, ki omogoča tvorbo kompleksov s proteinskimi dimeri SRP9/14. Nastanek takšnih Alu ribonukleoproteinov (RNP) v običajnih celičnih razmerah ni pogost, saj je kljub veliki količini monomerov SRP9 in SRP14 stopnja pojavljanja Alu RNA-jev veliko manjša. Tvorba Alu RNP-jev prepreči iniciacijo prevajanja mRNA v aminokislinsko zaporedje in tvorbo polisomov. Po vezavi Alu RNP-ja na ribosomsko podenoto 40S, Alu RNA lahko zapusti kompleks in sodeluje v nadaljnjih prenosih novih SRP9/14. Mehanizem delovanja takšnih kompleksov je relativno nepoznan in odpira nove poglede na smisel ohranitve transpozicijskih elementov skozi evolucijo. Alu sekvence je predstavljajo perspektivno področje za preučevanje ravno zaradi njihovega prispevka k zaščiti translacijskih procesov celice v neugodnih razmerah in zaradi drugih še neodkritih, potencialnih bioloških funkcij.

=== Špela Malenšek: Smo zaradi endogenih retrovirusov pametnejši? ===

Človeški endogeni retrovirusi (ERV), genetsko podedovani ostanki preteklih virusnih infekcij, so klasično obravnavani kot človeku oziroma gostitelju neuporabni del genoma, tako imenovani "junk DNA". Njihovo delovanje je v običajnih somatskih celicah (fibroblasti, hepatocite, bele krvne celice …) nadzorovano z epigenetskim mehanizmom metilacije DNA, kjer se metilna skupina doda citozinu ali adeninu in tako prepreči izražanje virusnih delov genoma. V nevronskih izvornih celicah naj bi med drugim izražanje endogenih retrovirusnih elementov nadzoroval tudi protein TRIM28. Deluje namreč kot korepresor, ki z modifikacijo histonov zatre prepisovanje genetskega materiala. Raziskave na univerzah Lund in EPLF so pokazale, da se ob izbrisu TRIM28 v celicah nakopičita dve večji skupini ERV, ki pri miših vplivata na izražanje gena BC048671 in služita kot startni točki za IncRNA (dolga nekodirajoča RNA). Hkrati izbris proteina TRIM28 povzroči tako kompleksne vedenjske spremembe kot tudi abnormalne vedenjske fenotipe modelnih organizmov (miši), ki se izkažejo podobne nekaterim človeškim psihološkim motnjam. Klasični hipotezi o nefunkcionalnosti ERV se tako zoperstavlja nova ideja, ki trdi, da aktivnost ERV vpliva na izražanje genov v nevronskih izvornih celicah in na kompleksnost nevronske mreže v možganih. S tem se odpira popolnoma nova molekularna perspektiva na analizo kompleksnih vedenjskih vzorcev, možganskih motenj in samega delovanja nevronske mreže.

=== Nejc Kejžar: Novi 'pametni' inzulin ===

Z odkritjem biotehnoloških metod za umetno sintezo inzulina s pomočjo bakterije E. coli ali kvasovk je življenje s sladkorno boleznijo postalo mogoče, še vedno pa so prisotni zapleti, ki jih povzročata hipoglikemija in hiperglikemija. Današnje inzulinske terapije se osredotočajo na konstanto merjenje koncentracij glukoze v krvi in intravenozni vnos inzulina glede na izmerjeno koncentracijo, kar pa je kljub nujnosti (še posebej za paciente diabetesa tipa 1) zelo nadležno. Do težav lahko pride zaradi neupoštevanja terapije ali slabe glikemične kontrole, kar lahko v resnih stanjih hipoglikemije privede do kome ali smrti, hiperglikemija pa lahko vodi do kardiovaskularnih obolenj, težav s celjenjem ran ali celo do raka. Za učinkovitejše nadziranje krvne koncentracije glukoze in olajšano življenje pacientov je skupina znanstvenikov iz MIT razvila ‘pametni’ inzulin, ki ima nase pritrjen konjugat sestavljen iz alifatske verige 11 ogljikovih atomov in fenilborove kisline. Alifatska veriga povzroča podaljšano delovanje inzulina, fenilborova kislina pa služi kot ‘stikalo’, ki aktivira delovanje inzulina samo ob povečani koncentracije glukoze v krvi. Ta sintetični derivat je zmožen hitrejšega obnavljanja normalnih koncentracij krvne glukoze kot naravni in klinični inzulin, večkratnega zaporednega odziva na porast glukoze, prav tako pa ima nižji hipoglikemični indeks ob administraciji v času normalnih koncentracij glukoze, kar pomeni, da je tveganje za hipoglikemijo manjše. V najbolj zgovornem testu je bilo pokazano, da je učinkovitost pametnega inzulina primerljiva z delovanjem zdravega pankreasa.

=== Simon Aleksič: Zorenje mRNA pri lignjih zaznamujejo A-I deaminacije ===

Informacijska RNA je po prepisu iz DNA podvržena dodatnim procesom, tako v jedru kot tudi v citoplazmi. Izrezovanje intronov je le en izmed procesov, ki zagotavlja strukturno variabilnost proteinov. Za variabilnost strukture poskrbijo tudi malo raziskane deaminacije nukleotidov . Deaminacije nukleotidov so katalitski kemijski procesi, ki omogočajo spreminjanje tripletov kodonov v zapisih mRNA s pomočjo proteinov ADAR. Za takšne procese so predvidevali, da so v organizmih redki in nimajo posebnega vpliva na delovanje proteinov v telesu. A študija univerze v Tel Avivu je pokazala, da so deaminacije adenozina v inozin v živčnih tkivih lignjev eden poglavitnih procesov, ki se zgodijo pred translacijo mRNA v proteine. Deaminacije s spremembami tripletov povzročijo zamenjave aminokislin v proteinih, raziskava pa dokaže, da se stabilnejše aminokisline zamenjajo z manj stabilnimi. Manj stabilne aminokisline v območju aktivnega mesta in hidrofobnega jedra povzročijo, da je protein sam manj občutljiv na nižje temperature okolja in lahko ostane delujoč pri spremenjenih razmerah okolja. Deaminacije so posebno pogoste v mRNA prepisih genov, ki zapisujejo proteine vključene v živčni sistem in citoskelet. Novejše raziskave mutacije genov za protein ADAR pri človeku povezujejo z različnimi imunskimi boleznimi, kot so ADA-SCID in sindrom Aicardi–Goutières.

=== Gašper Žun: Antibiotiki betalaktami uničujejo bakterije z okvaro mehanizma za izgradnjo celične stene ===
Antibiotiki β-laktami, med katere spada tudi penicilin, predstavljajo eno izmed najdlje in najsplošneje uporabnih terapij pri bakterijskih okužbah. Učinkujejo tako, da z vezavo na penicilin-vezavne proteine (PBP) okvarijo mehanizem za sintezo celične stene. S tem onemogočijo zamreženje nastajajočih verig peptidoglikanov (PG) v matriks, v manjši meri pa se nove verige še vedno lahko sintetizirajo. Celična stena takih bakterij je zato neobičajnih oblik, med delitvijo pa se lahko na določenih mestih pretrga in celica propade. Zaradi nastajanja enoverižnih PG se vključijo v proces encimi (Slt), ki take neobičajne verige razgrajujejo. Lastnosti celične stene na tak način ostajajo funkcionalne, vendar pa zaradi vključenega brezuspešnega cikla sinteze in razgradnje celične stene pride do prekomerne porabe za celico pomembnih snovi, kar le še prispeva k toksičnemu delovanja antibiotikov. Obrambni mehanizmi proti antibiotični aktivnosti vključujejo encime (β-laktamaze), ki razgrajujejo β-laktame. Vse večja odpornost bakterij na antibiotike je posledica povečane frekvence genskega zapisa za β-laktamaze, ki se med bakterijami prenaša s plazmidi. Ker je za uspešen boj proti bakterijam potreben nenehen razvoj novih zdravil in terapij, je potrebno dodobra spoznati tako način učinkovanja antibiotikov kot način delovanja bakterij. Članek prispeva nov vpogled v delovanje encima Slt za razgradnjo nezamreženega novo nastalega PG, saj mu pripisuje vlogo kontrole nad kvaliteto izgradnje celične stene, kar pa v resnici potencira uničujoče posledice antibiotikov.

=== Rok Miklavčič: Kontrola prenašalnih RNA na CCA-dodajajočem encimu ===
tRNA je ena od biološko najpomembnejših molekul v živih organizmih in ima ključno vlogo pri sintezi proteinov, zato je pomembno, da so vse tRNA, ki na ribosome prinašajo aminokisline, funkcionalne. Od prepisa dalje grejo zato tRNA prepisi skozi serijo procesov in modifikacij, ki na koncu privedejo do popolnoma funkcionalnih tRNA. V predzadnji fazi urejanja tRNA sodeluje CCA-dodajajoči encim, ki na 3'-konec prepisov tRNA pripne končno nukleotidno zaporedje CCA, v zadnji fazi pa se na zadnji adenin nukleotid veže še ustrezna aminokislina. CCA-dodajajoči encim pa ima v sintezi tRNA še eno nedavno odkrito funkcijo: nestabilnim prepisom tRNA pripne nukleotidno zaporedje CCACCA, ki je signal za razgradnjo. Na ta način encim kontrolira kvaliteto tRNA in pripomore k optimizaciji same sinteze proteinov. Na CCA-dodajajočem encimu se razlike med stabilnimi in nestabilnimi tRNA prepisi pokažejo po vezavi prvega zaporedja CCA, in sicer pri premiku encima. Stabilne tRNA se ob premiku odcepijo z encima, medtem ko pri nestabilnih tRNA premik povzroči transformacijo njihove sekundarne strukture, ob tem pa nastane na tRNA izboklina. Za transformirane nestabilne tRNA se cikel dodajanja zaporedja CCA nato izvede še enkrat, kar privede do končnega zaporedja CCACCA. Po končanem drugem ciklu se ob nadaljnjem premiku encima z njega odcepijo tudi nestabilne tRNA.

=== Tilen Tršelič: Transport proteinov v celico s pomočjo nanodelcev ===
Nanotehnologija v moderni znanosti že dolgo igra pomembno vlogo. Raziskovalci so ugotovili, da lahko s pomočjo nanodelcev v celice dostavljajo nukleotide in nekatere druge manjše molekule. Medicina je zato kmalu izrazila željo, da bi v celico lahko dostavljali tudi delujoče, zaključene proteine, ki bi pomagali pri zdravljenju različnih bolezni.
Na Univerzi v Kaliforniji so nedavno odkrili način, kako bi nanotehnologijo res lahko uporabljali za transport proteinov v celice. Ugotovili so, da obstajajo delci, ki so zmožni vezati protein, ga prenašati in ob laserskem obsevanju sprostiti v celico. Podobne metode so že bile testirane, a je njihova uporabna vrednost majhna, saj je lasersko obsevanje zaradi visoke energije pogosto poškodovalo tkiva in organizme.
Raziskava, predstavljena v seminarju, je z uporabo zlatih nanodelcev in posebnega fluorescentnega proteina GFP dokazala, da je neškodljiv, natančen transport proteinov v celice le mogoč. Izbrana metoda transporta prav tako omogoča velik nadzor nad lokacijo in časom sprostitve izbranega proteina v okolje. Znanstveniki so na zlat nanodelec vezali poseben prenašalec, ki je sposoben vezati histidinizirane proteine, jih dostaviti v celico in jih nato ob laserskem obsevanju z nizko energijo sprostiti v okolje.
Raziskava in njeni izsledki imajo velik pomen, saj bi predstavljena metoda lahko omogočila vodeno diferenciacijo matičnih celic ali vodeno celično smrt in s tem zdravljenje nekaterih težjih bolezni.

=== Lovro Kotnik: Acetilacija lizina in spremembe v proteomu astrocitov možganske skorje pri okužbi s Toxoplasma gondii ===
Toxoplasma gondii je znotrajcelični zajedavec, ki ga lahko najdemo pri večini vrst toplokrvnih živali. Tudi človek ni izjema, okužena pa naj bi bila kar tretjina svetovne populacije. V zdravih ljudeh to ne predstavlja nevarnosti, saj lahko zdrav organizem popolnoma ustavi razmnoževanje Toxoplasma gondii in prepreči s tem zajedavcem povezano bolezen toksoplazmozo. Bolezen je nevarna samo za ljudi z oslabljenim imunskim sistemom in za nosečnice (Toxoplazma gondii lahko okuži tudi otroka in povzroči hude deformacije).
Pri tem zajedavcu je znano , da lahko spremeni obnašanje miši in podgan, vendar do sedaj mehanizem teh sprememb v obnašanju še ni bil znan. Nedavna raziskava je pokazala, da ob infekciji s Toxoplasma gondii v celicah potečejo določene spremembe. Spreminjati se začne izražanje genske kode, koncentracije proteinov in oblika proteinov. Do danes točen mehanizem še ni znan, možna pa je povezava z eno od post-translacijskih sprememb na proteinih: acetilacijo lizina.
Študija, na osnovi katere sem napisal svoj seminar je izvedla raziskavo proteoma astrocitov možganske skorje v miših (Rattus norvegicus), poiskala število proteinov, ki so vsebovali lizin z acetilno skupino in dokumentirala natančne položaje teh lizinov na vsakem izmed proteinov, nato pa podobno raziskavo izvedla še na astrocitih okuženih s Toxoplasmo gondii in primerjala rezultate obeh raziskav.

=== Katja Brezovar: HIV nadzoruje svojo aktivnost neodvisno od gostiteljske celice ===
HIV je retrovirus, ki napada limfocite T, predvsem CD4+ T celice in spada pod skupino lentivirusov. Problematičnost zdravljenja HIV-a je posledica virusne latence, ki virusu omogoča dolgoročno prisotnost v gostiteljski celici, ne glede na dolgoletno izpostavljenost protiretrovirusnim zdravilom. Do nedavnega je veljalo prepričanje, da je latentnost virusa HIV odvisna od stanja celice – torej ali je celica v aktivnem ali mirujočem stanju. Sedaj je bilo, z računalniškim modeliranjem in sintetičnim kontroliranjem HIV Tat pozitivne povratne zanke, predstavljeno, da je latentnost virusa neodvisna od celičnega stanja. Avtonomnost virusnega delovanja nam pomaga pri razlagi zakaj agenti, ki naj bi prekinjali latentnost niso delovali – ti so to poskušali storiti z vplivom na celično stanje, ki pa po najnovejših raziskavah nima vpliva na virusno aktivnost. Razlaga, da je latenca posledica avtonomnega virusnega vezja, postavi tudi vprašanje kakšen je evolucijski izvor in pomen le te. Latenca naj bi bila evolucijska strategija, katere cilj je maksimalni virusni prenos in zmanjševanje virusnega izumrtja med mukoznimi okužbami. Razumevanje latence in tega, kaj jo nadzoruje predstavlja pomemben korak za iskanje novih pristopov k zdravljenju bolezni AIDS.

=== Urša Čerček: Odkrita struktura encima Dbr1 predstavlja nove možnosti za zdravljenje ALS in FTD ===
ALS in FTD sta neurodegenerativni bolezni, ki ju povzročata proteina TDP-43 in FUS. Do sedaj so odkrili le zdravilo, ki blaži njune učinke ne pozdravi pa bolezni v celoti. Že nekaj let nazaj so znanstveniki dokazali, da odsotnost encima Dbr1 zavira delovanje mutiranih proteinov TDP-43. Dbr1 hidrolizira 2',5'-fosfodiestersko vez v ciklični strukturi nekodirajoče mRNA imenovani lariat. Lariatna struktura deluje kot vaba, na katero se protein TDP-43 veže raje kot na prosto mRNA in tako prepreči škodljive interakcije, ki vodijo do pojava bolezni. Z uporabo inhibitorjev encima Dbr1, s katerimi bi preprečili razgradnjo lariatnih struktur in posledično zavrli delovanje toksičnih TDP-43, bi lahko zdravili ti dve do sedaj neozdravljivi bolezni. Da bi lahko našli primerne inhibitorje, so znanstveniki analizirali strukturo encima in tako poskušali dobiti boljši vpogled v njegovo funkcijo in najti povezave med funkcijo in strukturo. Ugotovili so, da se Dbr1 loči od ostalih, podobnih encimov v treh ključnih strukturnih lastnostih. Te so prisotnost LRL in posebne CTD skupine ter Cys14 ostanka v aktivnem mestu. Da bi do sedaj znana dejstva lahko uporabili za zdravljenje ALS in FTD so potrebne še nadaljnje raziskave, potrebno pa je tudi preveriti, kakšne posledice bi imela delna inhibicija encima Dbr1 in kako bi do nje prišli.

=== Niko Šetar: Preprečevanje širjenja raka z inhibicijo ERK1/2 kaskade ===
Rak je v splošnem definiran kot maligen tumor, ki nastane kot posledica pretirane rasti celic, ta pretirana rast pa je večinoma posledica okvare oz. mutacije v signalnih poteh celice. Iz tega razloga se večina do sedaj razvitih zdravil fokusira na inhibicijo teh signalnih poteh, praviloma v inhibicijo t.i. ERK1/2 kaskade, ki je odgovorna predvsem za proliferacijo in apoptozo svoje tarčne celice. Na primer, PLX4032, eno izmed najbolj razširjenih zdravil proti raku, inhibira ERK1/2 kaskado le specifično v primeru mutiranega proteina B-Raf, kar vključuje zelo ozek spekter rakov. Drugo zdravilo, U0126, pa inhibira ERK1/2 in MAPK kaskado že v zelo zgodnjih fazah kar vodi do nizke učinkovitosti in mnogih stranskih učinkov. Znanstveniki, ki so se ukvarjali z razvojem novega zdravila, so sintetizirali tri nove peptide, ki temeljijo na strukturi NTS (Nuclear Translocation Signal), peptid Scr (SPS), fosfomimetični peptid EPE in nefosforilabilni peptid APA, vsi izmed katerih naj bi preprečevali vezavo ERK2 na Importin 7 in s tem njegov vstop v jedro tarčne celice. Takšna pozna inhibicija naj bi bila bolj učinkovita kot zgodnejše, nudila zdravljenje širšega spektra rakov in imela manj stranskih učinkov. Izmed testiranih peptidov se je najbolje obnesel EPE, in do sedaj izvedeni eksperimenti tako v kulturi, kot na laboratorijskih miših s človeškimi tumorskimi ksenografti, so pokazali rezultate v prid tej hipotezi.

=== Aleksandra Uzar: Optogenetska aktivacija holinergičnih nevronov vzbuja REM fazo ===
Dober spanec je ključnega pomena, da lahko človeško telo pravilno deluje. Naraven spanec je sestavljen iz ciklov REM/non-REM faze, pri katerem je REM faza pomembna za učenje, sanjanje. Gre za intervale spanca za katerega je značilno hitro in naklučno premikanje oči. Cilj raziskave je bil ugotoviti, kakšni sta vloga in vpliv holinergičnih nevronov – nevroni, ki sproščajo nevrotransmiter acetilholin – na REM fazo. Osnova za raziskavo je bila optogenetika. To je metoda pri kateri aktivirajo določene nevrone s pomočjo svetlobo. Z izrazitvijo ionskega kanala rodopsina-2, ki se pod vplivom modre svetlobe aktivira (odpre), so s stimulacijami vplivali le na holinergične nevrone v PPT in LDT – strukturi v možganskem deblu. Raziskava je pokazala, da ti nevroni povzročajo REM fazo ter z daljšanjem stimulacij med non-REM fazo ugotovili, da se poveča število intervalov REM faze, vendar ne njihovo trajanje. S pomočjo sorodnih raziskav so ugotovitve pokazale, da naj bi bili holinergični nevroni v PPT in LDT pomembni sprožilci REM faze, ne pa glavni vzdrževalci. Raziskovalci poudarjajo, da je za potrditev potrebno več raziskav, saj so celotni mehanizmi faze se vedno dokaj nerazumljivi. S podrobnim znanjem o delovanju bi lahko ugotovitve aplicirali na ljudi s motnjami spanja.

=== Tadej Satler: Določanje zaporedja DNK s pomočjo grafena ===
V letih, odkar je bilo prvič znano celotno zaporedje človeškega genoma, je prišlo do hitrega razvoja tehnologije , ki omogočajo dobro analizo zaporedja DNK (imenovano "next-generation sequencing "). Ti novi pristopi k določanju zaporedja obljubljajo popolno genomsko analizo, ki bi bila izvajana s strani rutinske klinične diagnostike. Električni senzorji iz grafena lahko zaradi svoje izjemne občutljivosti zaznajo adsorbirane molekule na njegovi površini, na čemer temelji tudi zaznavanje zaporedja DNK, ki je odvisno od molekularno specifičnih interakcij s površino grafena. Tako lahko veliko hitreje, bolj zanesljivo, natančneje in ceneje določamo zaporedja DNK v primerjavi s trenutnimi metodami, kar vodi vposodobitev in razvoj raznih medicinskih raziskav in testov. Avstralski znanstveniki so to tudi dokazali, saj so s pomočjo grafena zaznali tri osnovne nukleotide, ki tvorijo DNK , ter jih prepoznali na podlagi specifičnih interakcij med grafitom in njimi. Na grafenu so posamezno izpostavili vse štiri osnovne dušikove baze, ki gradijo DNK (adenin, citozin, timin in gvanin) in opazovali učinke molekularne adsorpcije individualne baze na njem.

=== Samo Purič: Dešifrirana enigma virusne infekcije ===
Od rinovirusa, ki povzroča vsem znan prehlad, do virusa hepaptitisa C ali HIV-a, virusna obolenja v večini primerov povzročajo nelagodje, v nekaterih primerih pa huda bolezenjska stanja. Enoverižni RNA virusi (med katere spadajo zgoraj našteti) so se razvili med prvimi in še dandanes ostajajo med najnevarnejšimi za človekovo zdravje. Virusi so v osnovi zgrajeni iz nukleinske kilsine in proteinskega ovoja, ki ga imenujemo kapsida. Virus injecira svoj DNA/RNA v gostiteljsko celico in prevzame delovanje celotne celice za proizvodnjo novih virusov. Že desetletja razumemo, da mRNA nosi genetska navodila, ki omogočajo nastanek novih virusnih proteinov (tako kapsidnih kot tudi glikoproteinov ki tvorijo dodatno virusno ovojnico) potem ko virus vstopi v celico. Znastveniki iz univerz v Leedsu in Yorku pa so šele nedavno ugotovili, da se v zaporedju črk, ki jih uporabljamo za označevanje genetskih informacij, skriva šifra, ki narekuje kako se bo virus v gostiteljski celici ponovno sestavil. Do odkritja so prišli z opazovanjem enkapsidacije enoverižnega RNA virusa v zunanjo lupino/ovojnico nato pa so sestavili matematične algoritme s katerimi so razbili šifro in posledično razvili računalniški model, ki je sposoben dešifrirati zaporedja rastlinskih virusov. Ob tem so raziskovalci naredili še korak naprej in namignili na možnost razvijanja molekul, ki bi interfirale z kodo in efektivno ustavile delovanje virusa.

=== Lija Srnovršnik: Zaviranje rasti tumorjev z rušenjem strukture tumorskega stromalnega mikrookolja ===
Mednarodna ekipa znanstvenikov je dokazala, da protitelo za protein EphA3, ki ga najdemo v mikrookolju trdnih oblik raka, učinkuje proti tumorjem. EphA3 je v zdravih organih prisoten, ko se zarodek razvija, v odraslih tkivih pa je prisoten v krvnih rakavih obolenjih ter v trdnih tumorjih in je lahko pristop, ki temelji na učinku protiteles, primerna terapija za trdne oblike tumorjev. Celice tumorja pošiljajo okoliškim celicam signale, ko potrebujejo zalogo krvi in temeljno strukturo, na kateri se potem širijo. Raziskava je dokazala, da stromalne matične celice, v katerih je izražen EphA3 in nastajajo v kostnem mozgu, oblikujejo celice, ki podpirajo in ustvarijo krvne žile v tumorjih. V mišje modele so vstavili človeške celice raka prostate, da bi poustvarili potek bolezni v ljudeh. EphA3 so našli v stromalnih celicah in žilah v okolici tumorja. Opazovali so tudi zdravljenje s protitelesom proti EphA3 (chIIIA4), ki je vidno upočasnilo rast tumorjev. Protitelo je poškodovalo tumorjeve žile in porušilo stromalno mikrookolje, celice so odmrle, saj je bila poškodovana njihova življenjska funkcija. Napad EphA3 s protitelesi je tako možna terapija za zmanjšanje ter uničenje tumorjev in krvnih rakavih bolezni.

=== Sara Tekavec: Cistična fibroza: odkrita dodatna okvara imunskega sistema ===
Cistična fibroza je avtosomna recesivna genetska bolezen, kar pomeni, da se v potomcu bolezen izrazi le v primeru homozigotnega stanja, ko sta kopiji gena identični. Bolezen se pojavi kot posledica mutacije gena CFTR, ki kodira zapis za membranski protein CFTR. Slednji je odgovoren za prehajanje kloridnih ionov v zunajcelični prostor. Ker se na različne organe (predvsem pljuča, trebušno slinavko, črevesje) nalaga gosta, lepljiva sluz so le-ti podvrženi kroničnim okužbam, delovanje imunskega sistema pa kmalu postane neučinkovito. Delovanje imunskega sistema so preučevali tudi nemški raziskovalci. Odkrili so dodatno okvaro, in sicer zmanjšano izražanje molekul HLA-DQ. Te spadajo v skupino poglavitnega histokompatibilnostnega kompleksa (PHK) razreda II in imajo nalogo razločevanja med lastnimi in tujimi antigeni ter predstavljanja le-teh celicam pomagalkam. V poskusih uporabljena tehnika je bila pretočna citometrija, s katero so merili izražanje molekul HLA-DQ na monocitih, makrofagih, dendritičnih celicah ter raven prepisovanja mRNK za obe podenoti molekule HLA-DQ. Z raziskavo so odkrili tudi del molekularnega mehanizma, na katerem temelji imunski odziv. Vsi testi so pokazali, da je izražanje molekul HLA-DQ pri bolnikih s CF močno zmanjšano, v nekaterih primerih celo odsotno. To je v neki meri mogoče razložiti z zmanjšanim odzivom gena CIITA na signale kot je npr. IFNγ, ki so ga uporabili pri analizi. Glede na to, da je bolezen za zdaj še neozdravljiva in je z respiratorno fizioterapijo možno le lajšanje simptomov, bo potrebnih še veliko raziskav, ki bi pripomogle k razvoju tehnik zdravljenja.

=== Klara Kuret: Novo odkriti biosenzor omogoča vpogled v delovanje rastlinskega obrambnega sistema ===
Rastline na biotske in abiotske strese odgovarjajo z raznimi obrambnimi mehanizmi. Znanstveniki so sintetizirali nov biosenzor Jas9-VENUS, s katerim lahko v času in planta sledijo rastlinskemu odzivu na poškodbo. Biosenzor (BS) je molekula, ki je sposobna pretvoriti neko dogajanje v celici v signal, ki ga lahko zaznamo. BS mora odgovarjati specifično na svojo tarčo, dajati kvantitativne podatke o dogajanju v organizmu ter zagotavljati dinamično in prostorsko sledenje dogajanja in vivo. Jas9-VENUS je fluorescentni protein, ki deluje kot BS za fitohormon jasmonično kislino (JA) ter njene derivate jasmonate. Jas9-VENUS so uspeli sintetizirati s translacijsko fuzijo iz zapisa za protein JAZ9, kateri zavira transkripcijske faktorje, ki se odzivajo na JA. JAZ9 se zaradi specifičnega zaporedja aminokislin (imenovanega Jas domena) ob prisotnosti JA razgrajuje prek proteosoma, kar vodi v sprostitev transkripcijskih faktorjev, povečano ekspresijo JA-odzivnih genov ter posledično do aktivacije ustreznih obrambnih odgovorov rastline. Ker se zaradi analogije s proteinom JAZ9 ob prisotnosti JA razgrajuje tudi novo sintetizirani BS, lahko z njim merimo koncentracijo JA v rastlinskih organih, tkivih in celicah. Kjer je koncentracija JA največja, bo rumena fluorescenca Jas9-VENUS najmanjša. Biosenzorji so pomembno orodje za preučevanje signalizacije znotraj organizmov. Na podlagi poznavanja le te, bo mogoče v prihodnosti vzgajati poljščine, ki bodo bolj odporne proti biotskim ter abiotskim stresom.

=== Neža Koritnik: Vpliv nekodirajoče DNA na tvorbo raka: interakcije na dolge razdalje ===
V molekuli DNA je le 2% področja, ki vsebuje gensko informacijo. Preostalih 98% t.i. nekodirajoče DNA pa naj ne bi imelo nobenega vpliva na izražanje genov. Glede na zadnje raziskave pa to ne drži popolnoma. Odkrili so, da ima nekodirajoča DNA vseeno posreden vpliv na gensko ekspresijo - preko DNA zank. Mutacije, ki se pojavijo v nekodirajočem delu, lahko na dolge razdalje efektirajo transkripcijo RNA, če so locirane ob sekvencah, ki se vežejo z regulatornimi elementi transkripcije. Že prej je bilo ugotovljeno, da eno-nukleotidne mutacije (SNP-ji), ki kodirajo kompleksne bolezni velikokrat ležijo ob takšnih sekvencah. S tvorjenjem zank se zbližajo oddaljeni predeli molekule DNA. Če se zbližajo sekvence promotorjev in ojačevalcev (na te sekvence se vežejo proteini, transkripcijski faktorji, ki regulirajo delovanje RNA-polimeraze II), se to odraža v ekspresiji genov. Znanstveniki so s z metodo cHi-C opazovali interakcije na dolge razdalje v nekodirajočem delu genoma na 14 SNP-jih povezanih z nastankom raka na debelem črevesju. SNP-ji, locirani ob regulatornih elementih, lahko preko zank interagirajo z oddaljenimi transkripcijskimi faktorji. Zanke jim dovoljujejo, da vplivajo na transkripcijo v oddaljenih kodirajočih delih genoma, kar se na koncu odraža v rakavem obolenju črevesja.

TBK2015-seminar

2015-03-02T21:22:31Z

Neža Koritnik: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prištejeh končnipisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.

== Seznam seminarjev ==
{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Klara Lenart||Protein, ki permanentno označuje aktivne nevrone||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150212141453.htm||10.03.||13.03.||16.03.||Maja Zupanc||Matej Hvalec||Urša Kopač
|-
| Uroš Zavrtanik||Popravljalni mehanizem DNA (XPC)||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/01/150128141423.htm||10.03.||13.03.||16.03.||Eva Rajh||Lara Jerman||Neža Koritnik
|-
| Blaž Lebar||Preučitev imunskega odziva komarja po piku||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150206174850.htm||10.03.||13.03.||16.03.||Elvira Boršić||Kristjan Stibilj||Katja Čop
|-
| Gašper Žun||||||17.03.||20.03.||23.03.||Nejc Kejžar||Samo Smole||Klara Kuret
|-
| Rok Miklavčič||||||17.03.||20.03.||23.03.||Tilen Tršelič||Miha Koprivnikar Krajnc||Matej Hvalec
|-
| Simon Aleksič||Zorenje mRNA pri lignjih zaznamujejo A-I deaminacije ||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150212114327.htm||17.03.||20.03.||23.03.||Klara Lenart||Maja Zupanc||Lara Jerman
|-
| Tjaša Lukšič||||||17.03.||20.03.||23.03.||Uroš Zavrtanik||Eva Rajh||Kristjan Stibilj
|-
| Špela Malenšek||Smo zaradi endogenih retrovirusov pametnejši?||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/01/150112093129.htm||24.03.||27.03.||30.03.||Blaž Lebar||Elvira Boršić||Samo Smole
|-
| Ema Gašperšič||||||24.03.||27.03.||30.03.||Gašper Žun||Nejc Kejžar||Miha Koprivnikar Krajnc
|-
| Tilen Tršelič||||||24.03.||27.03.||30.03.||Miha Koprivnikar Krajnc||Klara Kuret||Samo Purič
|-
| Gašper Virant||||||24.03.||27.03.||30.03.||Simon Aleksič||Klara Lenart||Eva Rajh
|-
| Manca Zupan||||||07.04.||10.04.||13.04.||Tjaša Lukšič||Uroš Zavrtanik||Elvira Boršić
|-
| Urša Čerček||||||07.04.||10.04.||13.04.||Špela Malenšek||Blaž Lebar||Nejc Kejžar
|-
| Katja Brezovar||HIV nadzoruje svojo aktivnost neodvisno od gostiteljske celice||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150227112749.htm||07.04.||10.04.||13.04.||Ema Gašperšič||Gašper Žun||Tilen Tršelič
|-
| Lovro Kotnik||||||07.04.||10.04.||13.04.||Petra Hruševar||Rok Miklavčič||Klara Lenart
|-
| Maruša Grošelj||||||14.04.||17.04.||20.04.||Gašper Virant||Simon Aleksič||Uroš Zavrtanik
|-
| Tadej Satler||||||14.04.||17.04.||20.04.||Manca Zupan||Tjaša Lukšič||Blaž Lebar
|-
| Aleksandra Uzar||||||14.04.||17.04.||20.04.||Urša Čerček||Špela Malenšek||Gašper Žun
|-
| Niko Šetar||||||14.04.||17.04.||20.04.||Katja Brezovar||Ema Gašperšič||Rok Miklavčič
|-
| Lija Srnovršnik||||||24.04.||30.04.||04.05.||Lovro Kotnik||Petra Hruševar||Simon Aleksič
|-
| Sara Tekavec||||||24.04.||30.04.||04.05.||Maruša Grošelj||Gašper Virant||Tjaša Lukšič
|-
| Jaka Kos||||||24.04.||30.04.||04.05.||Tadej Satler||Manca Zupan||Špela Malenšek
|-
| Samo Purič||Desifrirana enigma: virusne infekcije||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150204075224.htm||24.04.||30.04.||04.05.||Aleksandra Uzar||Urša Čerček||Ema Gašperšič
|-
| Urša Kopač||||||05.05.||08.05.||11.05.||Niko Šetar||Katja Brezovar||Petra Hruševar
|-
| Neža Koritnik||Vpliv nekodirajoče DNA na tvorbo raka: interakcije na dolge razdalje||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150219090349.htm||05.05.||08.05.||11.05.||Lija Srnovršnik||Lovro Kotnik||Gašper Virant
|-
| Katja Čop||||||05.05.||08.05.||11.05.||Sara Tekavec||Maruša Grošelj||Manca Zupan
|-
| Klara Kuret||||||05.05.||08.05.||11.05.||Jaka Kos||Tadej Satler||Urša Čerček
|-
| Matej Hvalec||||||12.05.||15.05.||18.05.||Samo Purič||Aleksandra Uzar||Katja Brezovar
|-
| Lara Jerman||||||12.05.||15.05.||18.05.||Urša Kopač||Niko Šetar||Lovro Kotnik
|-
| Kristjan Stibilj||||||12.05.||15.05.||18.05.||Neža Koritnik||Lija Srnovršnik||Maruša Grošelj
|-
| Samo Smole||||||12.05.||15.05.||18.05.||Katja Čop||Sara Tekavec||Tadej Satler
|-
| Miha Koprivnikar Krajnc||||||19.05.||22.05.||25.05.||Klara Kuret||Jaka Kos||Aleksandra Uzar
|-
| Maja Zupanc||||||19.05.||22.05.||25.05.||Matej Hvalec||Samo Purič||Niko Šetar
|-
| Eva Rajh||||||19.05.||22.05.||25.05.||Lara Jerman||Urša Kopač||Lija Srnovršnik
|-
| Elvira Boršić||||||19.05.||22.05.||25.05.||Kristjan Stibilj||Neža Koritnik||Sara Tekavec
|-
| Nejc Kejžar||Novi 'pametni' inzulin||http://www.sciencedaily.com/releases/2015/02/150209161141.htm||26.05.||29.05.||01.06.||Samo Smole||Katja Čop||Jaka Kos
|-
| Petra Hruševar||||||26.05.||29.05.||01.06.||Rok Miklavčič||Tilen Tršelič||Maja Zupanc
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2014. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete v PubMed povezavi [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ tukaj]
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2015 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
* TBK_2015_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2015_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2015_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2015_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2015_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2015_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2015_Guncar_Gregor.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).'''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.