https://wiki.fkkt.uni-lj.si/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=Ne%C5%BEa+Lani%C5%A1ekWiki FKKT - User contributions [en]2026-05-23T13:04:47ZUser contributionsMediaWiki 1.45.3https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=FIAT_LUX&diff=21750FIAT LUX2023-04-07T14:21:42Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>FIAT LUX je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2022 pripravila ekipa francoskih dodiplomskih študentov z imenom INSA_LYON1. Na tekmovanju je projekt med projekti dodiplomskih študentov zasedel drugo mesto. Dostopen je na spletnem naslovu https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/.<br />
<br />
==Problem==<br />
Enega glavnih globalnih izzivov 21. stoletja predstavlja oskrba naraščajočega števila svetovnega prebivalstva s hrano. Dodatno breme za kmetijstvo na tem področju predstavlja globalno segrevanje, ki povzroča konstantno zmanjševanje obdelovalnih površin. Posledica globalnega segrevanja je tudi pojav doslej neznanih mikroorganizmov, ki se lahko razmnožujejo v novih, toplejših pogojih in poškodujejo ter tako zmanjšajo pridelek. Za preprečevanje tega problema se trenutno uporabljajo predvsem pesticidi, ki pa imajo negativen učinek na okolje in zdravje ljudi [1].<br /><br />
<br />
Skupina INSA_LYON1 je želela ustvariti orodje, s katerim bi lahko na podlagi razumevanja lastnosti posameznega patogena kmetom predlagali način, ki bi širjenje patogena omejil brez uporabe pesticidov, ob tem pa se tudi njihov pridelek ne bi pretirano zmanjšal [1].<br />
<br />
==Cilj projekta==<br />
Ideja je privedla do stvaritve FIAT LUX, biotehnološkega orodja, ki v bakterijah povzroči luminiscenco in tako na neinvaziven način omogoči spremljanje njihovega namnoževanja v rastlini v realnem času. Osredotočili so se predvsem na spremljanje namnoževanja fitopatogene bakterije ''Dickeya solani'', vendar pa je bil njihov cilj ustvariti biosenzor, prilagojen na katerokoli bakterijo. Tako bi lahko novoodkrito fitopatogeno bakterijo transformirali s tem orodjem, z njo v laboratoriju okužili ciljno rastlino in preko konstitutivne luminiscence opazovali njeno namnoževanje v rastlini. S pomočjo matematičnega modela bi lahko predvideli tudi nadaljnje namnoževanje bakterije in tako bolje razumeli ter hitreje odreagirali pri reševanju pridelka [1].<br />
<br />
==Načrt projekta==<br />
Orodje FIAT LUX temelji na ''ilux'' operonu, modificiranem ''lux'' operonu, ki emitira luminiscenco. ''ilux'' operon so si izbrali, saj v primeru izražanja v ''E.coli'' emitira 7-krat intenzivnejšo luminiscenco kot ''lux'' operon. Sestavljen je iz šestih genov (''iluxC'', ''iluxD'', ''iluxA'', ''iluxB'', ''iluxE'' in ''ilux-frp''), od katerih ima vsak specifično vlogo. ''iluxA'' in ''iluxB'' kodirata za luciferazni encimski kompleks, ki katalizira oksidacijo FMNH<sub>2</sub> do FMN in maščobnih aldehidov do maščobnih kislin, kar rezultira v luminiscenci. ''iluxC'', ''iluxD'' in ''iluxE'' tvorijo kompleks, ki reciklira maščobne kisline nazaj do maščobnih aldehidov. ''ilux-frp'' pa je FMN reduktaza, ki reciklira FMN nazaj do FMNH<sub>2</sub>. Emisija luminiscence z ''ilux'' operonom tako lahko poteka neodvisno, če sta le v okolju prisotna molekularni kisik in FMN, kar velja za vse aerobne celice [1, 2].<br /><br />
<br />
Svojo nalogo so razdelili na sledeče štiri korake:<br /><br />
1. Izdelava biokock.<br /><br />
2. Karakterizacija FIAT LUX v ''E.coli''.<br /><br />
3. Dokaz koncepta v ''D.solani''.<br /><br />
4. ''In situ'' opazovanje v rastlinah.<br />
<br />
==Izvedba projekta==<br />
<br />
===Izdelava biokock===<br />
Ker so želeli ''ilux'' operon vstaviti v plazmidno ogrodje, so ga najprej morali prilagoditi iGEM standardom. Le-ti zahtevajo, da sta v plazmidnem ogrodju restrikcijski mesti EcoRI in XbaI pozicionirani navzgor ter restrikcijski mesti SpeI in PstI navzdol od operona. Na ''ilux'' operonu so zato odstranili pet restrikcijskih mest (3-krat PstI, 1-krat EcoRI in 1-krat XbaI) in dobili šest ''ilux'' fragmentov. Ker poskus rekonstrukcije celotnega operona naenkrat ni uspel, so se odločili, da ga sestavijo v dveh delih. Geni ''iluxA'', ''iluxB'' in ''iluxE'' ne vsebujejo restrikcijskih mest, zato so s klasičnim PCR rekonstruirali ''fiatluxABE'' in zaporedje vstavili na ustrezno mesto v plazmidni ogrodji pSB1C3 in pBAD18. ''fiatluxABE'' je bil v pBAD18 pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja pBAD. V vektorju pACYDuet-1 so posebej konstruirali še ''fiatluxCD'' pod kontrolo šibkega konstitutivnega promotorja J23117 [1].<br /><br />
<br />
Preden so v plazmidu združili ''fiatluxABE'' in ''fiatluxCD'', so preverili vpliv uvedenih mutacij na emisijo luminiscence. ''E.coli'' DH5α so transformirali z ustvarjenima vektorjema pBAD18-''fiatluxABE'' in pACYDuet-1-''fiatluxCD''. Izkazalo se je, da je emisija luminiscence še vedno prisotna, torej je operon funkcionalen [1].<br /><br />
<br />
Želeli so, da je orodje uporabno za čim širši spekter bakterij, zato so ''fiatluxABE'' in J23117-''fiatluxCD'' združili v konjugativnem plazmidu. Uporabili so konjugativna vektorja pSEVA521 in pSEVA531, združevanje je potekalo s HiFi združevanjem. Plazmida so nato ločeno transformirali v ''E.coli'' DH5α [1].<br />
<br />
===Karakterizacija FIAT LUX v ''E.coli''===<br />
V naslednjem koraku so določevali optimalno koncentracijo antibiotika tetraciklina v gojišču in optimalno temperaturo, potrebno za shranjevanje transformiranih ''E.coli''. Tako so želeli zagotoviti dolgoročno stabilnost plazmidov. Preverili so vpliv koncentracije tetraciklina in temperature za shranjevanje ''E.coli'', transformirane s pSEVA521-''fiatluxCDABE'', pSEVA531-''fiatluxCDABE'', pSEVA521 oz. pSEVA531 (prazna vektorja). Na LB agar ploščah so pri 37 °C primerjali rast transformirane ''E.coli'', predhodno shranjene pri –80 °C, 4 °C in sobni temperaturi, ter pri koncentracijah tetraciklina 2, 5 in 10 μg/mL [1].<br /><br />
<br />
Bakterija, transformirana s pSEVA521-''fiatluxCDABE'' oz. pSEVA531-''fiatluxCDABE'', shranjena pri temperaturi –80 °C in 4 °C, pri koncentraciji tetraciklina 10 μg/mL ni rastla, medtem ko je pri istih pogojih bakterija, transformirana s praznima vektorjema, rastla. Pri shranjevanju na sobni temperaturi rast bakterije ni bila ovirana s koncentracijo tetraciklina. Opazili so, da bakterija, transformirana s pSEVA521-''fiatluxCDABE'', bolje raste pri koncentracijah tetraciklina 2 in 5 μg/mL, zato so v nadaljevanju koncentracijo tetraciklina v gojišču ohranjali med 2 in 5 μg/mL [1].<br /><br />
<br />
Ugotovili so, da izražanje ''fiatlux'' pri pSEVA531 zmanjšuje odpornost ''E.coli'' na tetraciklin. Vektorja pSEVA521 in pSEVA531 imata različni mesti začetka podvojevanja. pSEVA521-''fiatluxCDABE'' nosi RK2 ORI, medtem ko pSEVA531-''fiatluxCDABE'' nosi pBBR1 ORI, ki ima višjo stopnjo podvojevanja kot RK2. Možno je torej, da ima pri zmanjšani odpornosti ''E.coli'', transformirane s pSEVA531-''fiatluxCDABE'', na tetraciklin vlogo višja poraba energije pri emisiji luminiscence, posredovani z luciferaznim encimskim kompleksom [1].<br />
<br />
===Dokaz koncepta v ''D.solani''===<br />
Koncept delovanja orodja FIAT LUX so pokazali s prenosom plazmidov v fitopatogeno bakterijo ''D.solani'' in sicer v sev divjega tipa ''D.solani'' D s0432-1. ''D.solani'' je bakterija, odgovorna za bolezni številnih kmetijskih in okrasnih rastlin po vsem svetu. Bakterija proizvaja različne encime (pektinaze, celulaze in proteaze), ki razgrajujejo celično steno rastlinskih celic. Iz mrtvih rastlinskih celic nato bakterija pridobiva hranila ter se namnožuje po rastlinskem tkivu. Njena večja agresivnost v zadnjem obdobju je najverjetneje povezana s temperaturnimi spremembami zaradi globalnega segrevanja ozračja [1, 3].<br /><br />
<br />
Prenos v bakterijo so pokazali za plazmide pSEVA521-''fiatlux'', pSEVA531-''fiatlux'', pSEVA521 in pSEVA531. Prazna vektorja sta služila kot kontrola. Prenos so izvedli z metodo konjugacije. Najprej so s transformacijo vstavili plazmid v sev ''E.coli'' MFDpir. Po 48-urni inkubaciji pri 37 °C v prisotnosti 5 μg/mL tetraciklina so s kamero z visoko občutljivostjo zaznali luminiscenco. Po uspešni transformaciji je sledila konjugacija med ''E.coli'' MFDpir in ''D.solani''. Po 48-urni inkubaciji pri 30 °C v prisotnosti 5 μg/mL tetraciklina so s kamero z visoko občutljivostjo zaznali luminiscenco. Potrdili so, da so vsi štirje plazmidi uspešno vstavljeni v ''D.solani'', emisijo luminiscence pa so zaznali le v kolonijah, ki so vsebovale pSEVA521-''fiatlux'' oz. pSEVA531-''fiatlux''. S pektinaznim testom so potrdili, da so kolonije, zaznane po konjugaciji, res ''D.solani'' [1].<br /><br />
<br />
Karakterizacija ''fiatlux'' v ''D.solani'' je potekala podobno kot predhodno v ''E.coli''. Kot pri ''E.coli'', so tudi pri ''D.solani'' opazili, da bakterija s pSEVA531-''fiatlux'' emitira prej in več luminiscence kot bakterija s pSEVA521-''fiatlux''. Stabilnost plazmida v ''D.solani'' so preverili tako, da so z merjenjem OD pri 600 nm šteli bakterijske celice, ki so zrasle na gojišču LB in gojišču s 5 μg/mL tetraciklinom. Eksperiment so nastavili tako, da je poteklo devet celičnih celitev ''D.solani'' na dan, izvajali pa so ga tri dni. Po 27 generacijah (celičnih delitvah) je bakterija ohranila plazmid, kar zadostuje, če upoštevamo, da bakterija ''in situ'' niti ne doseže toliko generacij [1].<br />
<br />
===''In situ'' opazovanje v rastlinah===<br />
Na koncu so preverili, če njihovo orodje deluje ''in situ'' v rastlinah. Poskus so izvedli na listih cikorije in na gomoljih krompirja [1].<br /><br />
<br />
Za infekcijo listov cikorije so uporabili ''D.solani'', transformirano s pSEVA521-''fiatlux'', pSEVA531-''fiatlux'', pSEVA521 oz. pSEVA531. Po 30 in 48 urah so izmerili okuženo površino in opazovali luminiscenco listov. Največ znakov infekcije je kazala ''D.solani'' s pSEVA531 in pSEVA531-''fiatlux''. Poleg tega so zaznali tudi večjo emisijo luminiscence pri infekciji z ''D.solani'' s pSEVA531-''fiatlux'' kot pri pSEVA521-''fiatlux''. Na ta način so potrdili, da je plazmid pSEVA531-''fiatlux'' bolj učinkovit od pSEVA521-''fiatlux'' [1].<br /><br />
<br />
Poskus infekcije so izvedli tudi na gomoljih krompirja, vendar so tokrat za infekcijo uporabili le ''D.solani'', transformirano s pSEVA531-''fiatlux'' oz. pSEVA531. Po 24 in 48 urah so gomolje prerezali in ocenili nagnito površino. Infekcija je bila tudi tokrat učinkovita [1].<br />
<br />
==Uporaba orodja==<br />
Rezultati so pokazali, da je orodje FIAT LUX uporabno na primeru bakterije ''D.solani''. Uspešno so transformirali tudi dva druga seva, ''Citrobacter'' ''rodentium'' in ''Pseudomonas'' ''putida'', ki sta prav tako po konjugaciji emitirala luminiscenco. Z dokazom koncepta delovanja bi se orodje torej lahko izkazalo za zelo učinkovito. Po prejemu vzorca okužene rastline bi raziskovalci identificirali fitopatogen in nato spremljali njegovo namnoževanje pod različnimi pogoji z orodjem FIAT LUX. V doglednem času bi lahko predlagali način, ki bi preprečil širjenje patogena ter ga uničil [1].<br />
<br />
==Viri==<br />
[1] FIAT LUX https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/index.html.<br /><br />
[2] C. Gregor, K. C. Gwosch, S. J. Sahl, S. W. Hell: Strongly Enhanced Bacterial Bioluminescence with the Ilux Operon for Single-Cell Imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2018, 115, 962–967.<br /><br />
[3] M. A. Matilla, R. E. Monson, G. P. C. Salmond: Dickeya Solani. Trends Microbiol. 2023, xx, 1–2.</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=FIAT_LUX&diff=21749FIAT LUX2023-04-07T14:16:16Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>FIAT LUX je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2022 pripravila ekipa francoskih dodiplomskih študentov z imenom INSA_LYON1. Na tekmovanju je projekt med projekti dodiplomskih študentov zasedel drugo mesto. Dostopen je na spletnem naslovu https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/.<br />
<br />
==Problem==<br />
Enega glavnih globalnih izzivov 21. stoletja predstavlja oskrba naraščajočega števila svetovnega prebivalstva s hrano. Dodatno breme za kmetijstvo na tem področju predstavlja globalno segrevanje, ki povzroča konstantno zmanjševanje obdelovalnih površin. Posledica globalnega segrevanja je tudi pojav doslej neznanih mikroorganizmov, ki se lahko razmnožujejo v novih, toplejših pogojih in poškodujejo ter tako zmanjšajo pridelek. Za preprečevanje tega problema se trenutno uporabljajo predvsem pesticidi, ki pa imajo negativen učinek na okolje in zdravje ljudi [1].<br /><br />
<br />
Skupina INSA_LYON1 je želela ustvariti orodje, s katerim bi lahko na podlagi razumevanja lastnosti posameznega patogena kmetom predlagali način, ki bi širjenje patogena omejil brez uporabe pesticidov, ob tem pa se tudi njihov pridelek ne bi pretirano zmanjšal [1].<br />
<br />
==Cilj projekta==<br />
Ideja je privedla do stvaritve FIAT LUX, biotehnološkega orodja, ki v bakterijah povzroči luminiscenco in tako na neinvaziven način omogoči spremljanje njihovega namnoževanja v rastlini v realnem času. Osredotočili so se predvsem na spremljanje namnoževanja fitopatogene bakterije ''Dickeya solani'', vendar pa je bil njihov cilj ustvariti biosenzor, prilagojen na katerokoli bakterijo. Tako bi lahko novoodkrito fitopatogeno bakterijo transformirali s tem orodjem, z njo v laboratoriju okužili ciljno rastlino in preko konstitutivne luminiscence opazovali njeno namnoževanje v rastlini. S pomočjo matematičnega modela bi lahko predvideli tudi nadaljnje namnoževanje bakterije in tako bolje razumeli ter hitreje odreagirali pri reševanju pridelka [1].<br />
<br />
==Načrt projekta==<br />
Orodje FIAT LUX temelji na ''ilux'' operonu, modificiranem ''lux'' operonu, ki emitira luminiscenco. ''ilux'' operon so si izbrali, saj v primeru izražanja v ''E.coli'' emitira 7-krat intenzivnejšo luminiscenco kot ''lux'' operon. Sestavljen je iz šestih genov (''iluxC'', ''iluxD'', ''iluxA'', ''iluxB'', ''iluxE'' in ''ilux-frp''), od katerih ima vsak specifično vlogo. ''iluxA'' in ''iluxB'' kodirata za luciferazni encimski kompleks, ki katalizira oksidacijo FMNH<sub>2</sub> do FMN in maščobnih aldehidov do maščobnih kislin, kar rezultira v luminiscenci. ''iluxC'', ''iluxD'' in ''iluxE'' tvorijo kompleks, ki reciklira maščobne kisline nazaj do maščobnih aldehidov. ''ilux-frp'' pa je FMN reduktaza, ki reciklira FMN nazaj do FMNH<sub>2</sub>. Emisija luminiscence z ''ilux'' operonom tako lahko poteka neodvisno, če sta le v okolju prisotna molekularni kisik in FMN, kar velja za vse aerobne celice [1, 2].<br /><br />
<br />
Svojo nalogo so razdelili na sledeče štiri korake:<br /><br />
1. Izdelava biokock.<br /><br />
2. Karakterizacija FIAT LUX v ''E.coli''.<br /><br />
3. Dokaz koncepta v ''D.solani''.<br /><br />
4. ''In situ'' opazovanje v rastlinah.<br />
<br />
==Izvedba projekta==<br />
<br />
===Izdelava biokock===<br />
Ker so želeli ''ilux'' operon vstaviti v plazmidno ogrodje, so ga najprej morali prilagoditi iGEM standardom. Le-ti zahtevajo, da sta v plazmidnem ogrodju restrikcijski mesti EcoRI in XbaI pozicionirani navzgor ter restrikcijski mesti SpeI in PstI navzdol od operona. Na ''ilux'' operonu so zato odstranili pet restrikcijskih mest (3-krat PstI, 1-krat EcoRI in 1-krat XbaI) in dobili šest ''ilux'' fragmentov. Ker poskus rekonstrukcije celotnega operona naenkrat ni uspel, so se odločili, da ga sestavijo v dveh delih. Geni ''iluxA'', ''iluxB'' in ''iluxE'' ne vsebujejo restrikcijskih mest, zato so s klasičnim PCR rekonstruirali ''fiatluxABE'' in zaporedje vstavili na ustrezno mesto v plazmidni ogrodji pSB1C3 in pBAD18. ''fiatluxABE'' je bil v pBAD18 pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja pBAD. V vektorju pACYDuet-1 so posebej konstruirali še ''fiatluxCD'' pod kontrolo šibkega konstitutivnega promotorja J23117 [1].<br /><br />
<br />
Preden so v plazmidu združili ''fiatluxABE'' in ''fiatluxCD'', so preverili vpliv uvedenih mutacij na emisijo luminiscence. ''E.coli'' DH5α so transformirali z ustvarjenima vektorjema pBAD18-''fiatluxABE'' in pACYDuet-1-''fiatluxCD''. Izkazalo se je, da je emisija luminiscence še vedno prisotna, torej je operon funkcionalen [1].<br /><br />
<br />
Želeli so, da je orodje uporabno za čim širši spekter bakterij, zato so ''fiatluxABE'' in J23117-''fiatluxCD'' združili v konjugativnem plazmidu. Uporabili so konjugativna vektorja pSEVA521 in pSEVA531, združevanje je potekalo s HiFi združevanjem. Plazmida so nato ločeno transformirali v ''E.coli'' DH5α [1].<br />
<br />
===Karakterizacija FIAT LUX v ''E.coli''===<br />
V naslednjem koraku so določevali optimalno koncentracijo antibiotika tetraciklina v gojišču in optimalno temperaturo, potrebno za shranjevanje transformiranih ''E.coli''. Tako so želeli zagotoviti dolgoročno stabilnost plazmidov. Preverili so vpliv koncentracije tetraciklina in temperature za shranjevanje ''E.coli'', transformirane s pSEVA521-''fiatluxCDABE'', pSEVA531-''fiatluxCDABE'', pSEVA521 oz. pSEVA531 (prazna vektorja). Na LB agar ploščah so pri 37 °C primerjali rast transformirane ''E.coli'', predhodno shranjene pri –80 °C, 4 °C in sobni temperaturi, ter pri koncentracijah tetraciklina 2, 5 in 10 μg/mL [1].<br /><br />
<br />
Bakterija, transformirana s pSEVA521-''fiatluxCDABE'' oz. pSEVA531-''fiatluxCDABE'', shranjena pri temperaturi –80 °C in 4 °C, pri koncentraciji tetraciklina 10 μg/mL ni rastla, medtem ko je pri istih pogojih bakterija, transformirana s praznima vektorjema, rastla. Pri shranjevanju na sobni temperaturi rast bakterije ni bila ovirana s koncentracijo tetraciklina. Opazili so, da bakterija, transformirana s pSEVA521-''fiatluxCDABE'', bolje raste pri koncentracijah tetraciklina 2 in 5 μg/mL, zato so v nadaljevanju koncentracijo tetraciklina v gojišču ohranjali med 2 in 5 μg/mL [1].<br /><br />
<br />
Ugotovili so, da izražanje ''fiatlux'' pri pSEVA531 zmanjšuje odpornost ''E.coli'' na tetraciklin. Vektorja pSEVA521 in pSEVA531 imata različni mesti začetka podvojevanja. pSEVA521-''fiatluxCDABE'' nosi RK2 ORI, medtem ko pSEVA531-''fiatluxCDABE'' nosi pBBR1 ORI, ki ima višjo stopnjo podvojevanja kot RK2. Možno je torej, da ima pri zmanjšani odpornosti ''E.coli'', transformirane s pSEVA531-''fiatluxCDABE'', na tetraciklin vlogo višja poraba energije pri emisiji luminiscence, posredovani z luciferaznim encimskim kompleksom [1].<br />
<br />
===Dokaz koncepta v ''D.solani''===<br />
Koncept delovanja orodja FIAT LUX so pokazali s prenosom plazmidov v fitopatogeno bakterijo ''D.solani'' in sicer v sev divjega tipa ''D.solani'' D s0432-1. ''D.solani'' je bakterija, odgovorna za bolezni številnih kmetijskih in okrasnih rastlin po vsem svetu. Bakterija proizvaja različne encime (pektinaze, celulaze in proteaze), ki razgrajujejo celično steno rastlinskih celic. Iz mrtvih rastlinskih celic nato bakterija pridobiva hranila ter se namnožuje po rastlinskem tkivu. Njena večja agresivnost v zadnjem obdobju je najverjetneje povezana s temperaturnimi spremembami zaradi globalnega segrevanja ozračja [1, 3].<br /><br />
<br />
Prenos v bakterijo so pokazali za plazmide pSEVA521-''fiatlux'', pSEVA531-''fiatlux'', pSEVA521 in pSEVA531. Prazna vektorja sta služila kot kontrola. Prenos so izvedli z metodo konjugacije. Najprej so s transformacijo vstavili plazmid v sev ''E.coli'' MFDpir. Po 48-urni inkubaciji pri 37 °C v prisotnosti 5 μg/mL tetraciklina so s kamero z visoko občutljivostjo zaznali luminiscenco. Po uspešni transformaciji je sledila konjugacija med ''E.coli'' MFDpir in ''D.solani''. Po 48-urni inkubaciji pri 30 °C v prisotnosti 5 μg/mL tetraciklina so s kamero z visoko občutljivostjo zaznali luminiscenco. Potrdili so, da so vsi štirje plazmidi uspešno vstavljeni v ''D.solani'', emisijo luminiscence pa so zaznali le v kolonijah, ki so vsebovale pSEVA521-''fiatlux'' oz. pSEVA531-''fiatlux''. S pektinaznim testom so potrdili, da so kolonije, zaznane po konjugaciji, res ''D.solani'' [1].<br /><br />
<br />
Karakterizacija ''fiatlux'' v ''D.solani'' je potekala podobno kot predhodno v ''E.coli''. Kot pri ''E.coli'', so tudi pri ''D.solani'' opazili, da bakterija s pSEVA531-''fiatlux'' emitira prej in več luminiscence kot bakterija s pSEVA521-''fiatlux''. Stabilnost plazmida v ''D.solani'' so preverili tako, da so z merjenjem OD pri 600 nm šteli bakterijske celice, ki so zrasle na gojišču LB in gojišču s 5 μg/mL tetraciklinom. Eksperiment so nastavili tako, da je poteklo devet celičnih celitev ''D.solani'' na dan, izvajali pa so ga tri dni. Po 27 generacijah (celičnih delitvah) je bakterija ohranila plazmid, kar zadostuje, če upoštevamo, da bakterija in situ niti ne doseže toliko generacij [1].<br />
<br />
===''In situ'' opazovanje v rastlinah===<br />
Na koncu so preverili, če njihovo orodje deluje ''in situ'' v rastlinah. Poskus so izvedli na listih cikorije in na gomoljih krompirja [1].<br /><br />
<br />
Za infekcijo listov cikorije so uporabili ''D.solani'', transformirano s pSEVA521-''fiatlux'', pSEVA531-''fiatlux'', pSEVA521 oz. pSEVA531. Po 30 in 48 urah so izmerili okuženo površino in opazovali luminiscenco listov. Največ znakov infekcije je kazala ''D.solani'' s pSEVA531 in pSEVA531-''fiatlux''. Poleg tega so zaznali tudi večjo emisijo luminiscence pri infekciji z ''D.solani'' s pSEVA531-''fiatlux'' kot pri pSEVA521-''fiatlux''. Na ta način so potrdili, da je plazmid pSEVA531-''fiatlux'' bolj učinkovit od pSEVA521-''fiatlux'' [1].<br /><br />
<br />
Poskus infekcije so izvedli tudi na gomoljih krompirja, vendar so tokrat za infekcijo uporabili le ''D.solani'', transformirano s pSEVA531-''fiatlux'' oz. pSEVA531. Po 24 in 48 urah so gomolje prerezali in ocenili nagnito površino. Infekcija je bila tudi tokrat učinkovita [1].<br />
<br />
==Uporaba orodja==<br />
Rezultati so pokazali, da je orodje FIAT LUX uporabno na primeru bakterije ''D.solani''. Uspešno so transformirali tudi dva druga seva, ''Citrobacter'' ''rodentium'' in ''Pseudomonas'' ''putida'', ki sta prav tako po konjugaciji emitirala luminiscenco. Z dokazom koncepta delovanja bi se orodje torej lahko izkazalo za zelo učinkovito. Po prejemu vzorca okužene rastline bi raziskovalci identificirali fitopatogen in nato spremljali njegovo namnoževanje pod različnimi pogoji z orodjem FIAT LUX. V doglednem času bi lahko predlagali način, ki bi preprečil širjenje patogena ter ga uničil [1].<br />
<br />
==Viri==<br />
[1] FIAT LUX https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/index.html.<br /><br />
[2] C. Gregor, K. C. Gwosch, S. J. Sahl, S. W. Hell: Strongly Enhanced Bacterial Bioluminescence with the Ilux Operon for Single-Cell Imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2018, 115, 962–967.<br /><br />
[3] M. A. Matilla, R. E. Monson, G. P. C. Salmond: Dickeya Solani. Trends Microbiol. 2023, xx, 1–2.</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=FIAT_LUX&diff=21748FIAT LUX2023-04-07T14:13:36Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>FIAT LUX je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2022 pripravila ekipa francoskih dodiplomskih študentov z imenom INSA_LYON1. Na tekmovanju je projekt med projekti dodiplomskih študentov zasedel drugo mesto. Dostopen je na spletnem naslovu https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/.<br />
<br />
==Problem==<br />
Enega glavnih globalnih izzivov 21. stoletja predstavlja oskrba naraščajočega števila svetovnega prebivalstva s hrano. Dodatno breme za kmetijstvo na tem področju predstavlja globalno segrevanje, ki povzroča konstantno zmanjševanje obdelovalnih površin. Posledica globalnega segrevanja je tudi pojav doslej neznanih mikroorganizmov, ki se lahko razmnožujejo v novih, toplejših pogojih in poškodujejo ter tako zmanjšajo pridelek. Za preprečevanje tega problema se trenutno uporabljajo predvsem pesticidi, ki pa imajo negativen učinek na okolje in zdravje ljudi [1].<br /><br />
<br />
Skupina INSA_LYON1 je želela ustvariti orodje, s katerim bi lahko na podlagi razumevanja lastnosti posameznega patogena kmetom predlagali način, ki bi širjenje patogena omejil brez uporabe pesticidov, ob tem pa se tudi njihov pridelek ne bi pretirano zmanjšal [1].<br />
<br />
==Cilj projekta==<br />
Ideja je privedla do stvaritve FIAT LUX, biotehnološkega orodja, ki v bakterijah povzroči luminiscenco in tako na neinvaziven način omogoči spremljanje njihovega namnoževanja v rastlini v realnem času. Osredotočili so se predvsem na spremljanje namnoževanja fitopatogene bakterije ''Dickeya solani'', vendar pa je bil njihov cilj ustvariti biosenzor, prilagojen na katerokoli bakterijo. Tako bi lahko novoodkrito fitopatogeno bakterijo transformirali s tem orodjem, z njo v laboratoriju okužili ciljno rastlino in preko konstitutivne luminiscence opazovali njeno namnoževanje v rastlini. S pomočjo matematičnega modela bi lahko predvideli tudi nadaljnje namnoževanje bakterije in tako bolje razumeli ter hitreje odreagirali pri reševanju pridelka [1].<br />
<br />
==Načrt projekta==<br />
Orodje FIAT LUX temelji na ''ilux'' operonu, modificiranem ''lux'' operonu, ki emitira luminiscenco. ''ilux'' operon so si izbrali, saj v primeru izražanja v ''E.coli'' emitira 7-krat intenzivnejšo luminiscenco kot ''lux'' operon. Sestavljen je iz šestih genov (''iluxC'', ''iluxD'', ''iluxA'', ''iluxB'', ''iluxE'' in ''ilux-frp''), od katerih ima vsak specifično vlogo. ''iluxA'' in ''iluxB'' kodirata za luciferazni encimski kompleks, ki katalizira oksidacijo FMNH<sub>2</sub> do FMN in maščobnih aldehidov do maščobnih kislin, kar rezultira v luminiscenci. ''iluxC'', ''iluxD'' in ''iluxE'' tvorijo kompleks, ki reciklira maščobne kisline nazaj do maščobnih aldehidov. ''ilux-frp'' pa je FMN reduktaza, ki reciklira FMN nazaj do FMNH<sub>2</sub>. Emisija luminiscence z ''ilux'' operonom tako lahko poteka neodvisno, če sta le v okolju prisotna molekularni kisik in FMN, kar velja za vse aerobne celice [1, 2].<br /><br />
<br />
Svojo nalogo so razdelili na sledeče štiri korake:<br /><br />
1. Izdelava biokock.<br /><br />
2. Karakterizacija FIAT LUX v ''E.coli''.<br /><br />
3. Dokaz koncepta v ''D.solani''.<br /><br />
4. ''In situ'' opazovanje v rastlinah.<br />
<br />
==Izvedba projekta==<br />
<br />
===Izdelava biokock===<br />
Ker so želeli ''ilux'' operon vstaviti v plazmidno ogrodje, so ga najprej morali prilagoditi iGEM standardom. Le-ti zahtevajo, da sta v plazmidnem ogrodju restrikcijski mesti EcoRI in XbaI pozicionirani navzgor ter restrikcijski mesti SpeI in PstI navzdol od operona. Na ''ilux'' operonu so zato odstranili pet restrikcijskih mest (3-krat PstI, 1-krat EcoRI in 1-krat XbaI) in dobili šest ''ilux'' fragmentov. Ker poskus rekonstrukcije celotnega operona naenkrat ni uspel, so se odločili, da ga sestavijo v dveh delih. Geni ''iluxA'', ''iluxB'' in ''iluxE'' ne vsebujejo restrikcijskih mest, zato so s klasičnim PCR rekonstruirali ''fiatluxABE'' in zaporedje vstavili na ustrezno mesto v plazmidni ogrodji pSB1C3 in pBAD18. ''fiatluxABE'' je bil v pBAD18 pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja pBAD. V vektorju pACYDuet-1 so posebej konstruirali še ''fiatluxCD'' pod kontrolo šibkega konstitutivnega promotorja J23117 [1].<br /><br />
<br />
Preden so v plazmidu združili ''fiatluxABE'' in ''fiatluxCD'', so preverili vpliv uvedenih mutacij na emisijo luminiscence. ''E.coli'' DH5α so transformirali z ustvarjenima vektorjema pBAD18-''fiatluxABE'' in pACYDuet-1-''fiatluxCD''. Izkazalo se je, da je emisija luminiscence še vedno prisotna, torej je operon funkcionalen [1].<br /><br />
<br />
Želeli so, da je orodje uporabno za čim širši spekter bakterij, zato so ''fiatluxABE'' in J23117-''fiatluxCD'' združili v konjugativnem plazmidu. Uporabili so konjugativna vektorja pSEVA521 in pSEVA531, združevanje je potekalo s HiFi združevanjem. Plazmida so nato ločeno transformirali v ''E.coli'' DH5α [1].<br />
<br />
===Karakterizacija FIAT LUX v ''E.coli''===<br />
V naslednjem koraku so določevali optimalno koncentracijo antibiotika tetraciklina v gojišču in optimalno temperaturo, potrebno za shranjevanje transformiranih ''E.coli''. Tako so želeli zagotoviti dolgoročno stabilnost plazmidov. Preverili so vpliv koncentracije tetraciklina in temperature za shranjevanje ''E.coli'', transformirane s pSEVA521-''fiatluxCDABE'', pSEVA531-''fiatluxCDABE'', pSEVA521 oz. pSEVA531 (prazna vektorja). Na LB agar ploščah so pri 37 °C primerjali rast transformirane ''E.coli'', predhodno shranjene pri –80 °C, 4 °C in sobni temperaturi, ter pri koncentracijah tetraciklina 2, 5 in 10 μg/mL [1].<br /><br />
<br />
Bakterija, transformirana s pSEVA521-''fiatluxCDABE'' oz. pSEVA531-''fiatluxCDABE'', shranjena pri temperaturi –80 °C in 4 °C, pri koncentraciji tetraciklina 10 μg/mL ni rastla, medtem ko je pri istih pogojih bakterija, transformirana s praznima vektorjema, rastla. Pri shranjevanju na sobni temperaturi rast bakterije ni bila ovirana s koncentracijo tetraciklina. Opazili so, da bakterija, transformirana s pSEVA521-''fiatluxCDABE'', bolje raste pri koncentracijah tetraciklina 2 in 5 μg/mL, zato so v nadaljevanju v gojišču koncentracijo tetraciklina ohranjali med 2 in 5 μg/mL [1].<br /><br />
<br />
Ugotovili so, da izražanje fiatlux pri pSEVA531 zmanjšuje odpornost ''E.coli'' na tetraciklin. Vektorja pSEVA521 in pSEVA531 imata različni mesti začetka podvojevanja. pSEVA521-''fiatluxCDABE'' nosi RK2 ORI, medtem ko pSEVA531-''fiatluxCDABE'' nosi pBBR1 ORI, ki ima višjo stopnjo podvojevanja kot RK2. Možno je torej, da ima pri zmanjšani odpornosti ''E.coli'', transformirane s pSEVA531-''fiatluxCDABE'', na tetraciklin vlogo višja poraba energije pri emisiji luminiscence, posredovani z luciferaznim encimskim kompleksom [1].<br />
<br />
===Dokaz koncepta v ''D.solani''===<br />
Koncept delovanja orodja FIAT LUX so pokazali s prenosom plazmidov v fitopatogeno bakterijo ''D.solani'' in sicer v sev divjega tipa ''D.solani'' D s0432-1. ''D.solani'' je bakterija, odgovorna za bolezni številnih kmetijskih in okrasnih rastlin po vsem svetu. Bakterija proizvaja različne encime (pektinaze, celulaze in proteaze), ki razgrajujejo celično steno rastlinskih celic. Iz mrtvih rastlinskih celic nato bakterija pridobiva hranila ter se namnožuje po rastlinskem tkivu. Njena večja agresivnost v zadnjem obdobju je najverjetneje povezana s temperaturnimi spremembami zaradi globalnega segrevanja ozračja [1, 3].<br /><br />
<br />
Prenos v bakterijo so pokazali za plazmide pSEVA521-''fiatlux'', pSEVA531-''fiatlux'', pSEVA521 in pSEVA531. Prazna vektorja sta služila kot kontrola. Prenos so izvedli z metodo konjugacije. Najprej so s transformacijo vstavili plazmid v sev ''E.coli'' MFDpir. Po 48-urni inkubaciji pri 37 °C v prisotnosti 5 μg/mL tetraciklina so s kamero z visoko občutljivostjo zaznali luminiscenco. Po uspešni transformaciji je sledila konjugacija med ''E.coli'' MFDpir in ''D.solani''. Po 48-urni inkubaciji pri 30 °C v prisotnosti 5 μg/mL tetraciklina so s kamero z visoko občutljivostjo zaznali luminiscenco. Potrdili so, da so vsi štirje plazmidi uspešno vstavljeni v ''D.solani'', emisijo luminiscence pa so zaznali le v kolonijah, ki so vsebovale pSEVA521-''fiatlux'' oz. pSEVA531-''fiatlux''. S pektinaznim testom so potrdili, da so kolonije, zaznane po konjugaciji, res ''D.solani'' [1].<br /><br />
<br />
Karakterizacija ''fiatlux'' v ''D.solani'' je potekala podobno kot predhodno v ''E.coli''. Kot pri ''E.coli'', so tudi pri ''D.solani'' opazili, da bakterija s pSEVA531-''fiatlux'' emitira prej in več luminiscence kot bakterija s pSEVA521-''fiatlux''. Stabilnost plazmida v ''D.solani'' so preverili tako, da so z merjenjem OD pri 600 nm šteli bakterijske celice, ki so zrasle na gojišču LB in gojišču s 5 μg/mL tetraciklinom. Eksperiment so nastavili tako, da je poteklo devet celičnih celitev ''D.solani'' na dan, izvajali pa so ga tri dni. Po 27 generacijah (celičnih delitvah) je bakterija ohranila plazmid, kar zadostuje, če upoštevamo, da bakterija in situ niti ne doseže toliko generacij [1].<br />
<br />
===''In situ'' opazovanje v rastlinah===<br />
Na koncu so preverili, če njihovo orodje deluje ''in situ'' v rastlinah. Poskus so izvedli na listih cikorije in na gomoljih krompirja [1].<br /><br />
<br />
Za infekcijo listov cikorije so uporabili ''D.solani'', transformirano s pSEVA521-''fiatlux'', pSEVA531-''fiatlux'', pSEVA521 oz. pSEVA531. Po 30 in 48 urah so izmerili okuženo površino in opazovali luminiscenco listov. Največ znakov infekcije je kazala ''D.solani'' s pSEVA531 in pSEVA531-''fiatlux''. Poleg tega so zaznali tudi večjo emisijo luminiscence pri infekciji z ''D.solani'' s pSEVA531-''fiatlux'' kot pri pSEVA521-''fiatlux''. Na ta način so potrdili, da je plazmid pSEVA531-''fiatlux'' bolj učinkovit od pSEVA521-''fiatlux'' [1].<br /><br />
<br />
Poskus infekcije so izvedli tudi na gomoljih krompirja, vendar so tokrat za infekcijo uporabili le ''D.solani'', transformirano s pSEVA531-''fiatlux'' oz. pSEVA531. Po 24 in 48 urah so gomolje prerezali in ocenili nagnito površino. Infekcija je bila tudi tokrat učinkovita [1].<br />
<br />
==Uporaba orodja==<br />
Rezultati so pokazali, da je orodje FIAT LUX uporabno na primeru bakterije ''D.solani''. Uspešno so transformirali tudi dva druga seva, ''Citrobacter'' ''rodentium'' in ''Pseudomonas'' ''putida'', ki sta prav tako po konjugaciji emitirala luminiscenco. Z dokazom koncepta delovanja bi se orodje torej lahko izkazalo za zelo učinkovito. Po prejemu vzorca okužene rastline bi raziskovalci identificirali fitopatogen in nato spremljali njegovo namnoževanje pod različnimi pogoji z orodjem FIAT LUX. V doglednem času bi lahko predlagali način, ki bi preprečil širjenje patogena ter ga uničil [1].<br />
<br />
==Viri==<br />
[1] FIAT LUX https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/index.html.<br /><br />
[2] C. Gregor, K. C. Gwosch, S. J. Sahl, S. W. Hell: Strongly Enhanced Bacterial Bioluminescence with the Ilux Operon for Single-Cell Imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2018, 115, 962–967.<br /><br />
[3] M. A. Matilla, R. E. Monson, G. P. C. Salmond: Dickeya Solani. Trends Microbiol. 2023, xx, 1–2.</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=FIAT_LUX&diff=21747FIAT LUX2023-04-07T14:09:43Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>FIAT LUX je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2022 pripravila ekipa francoskih dodiplomskih študentov z imenom INSA_LYON1. Na tekmovanju je projekt med projekti dodiplomskih študentov zasedel drugo mesto. Dostopen je na spletnem naslovu https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/.<br />
<br />
==Problem==<br />
Enega glavnih globalnih izzivov 21. stoletja predstavlja oskrba naraščajočega števila svetovnega prebivalstva s hrano. Dodatno breme za kmetijstvo na tem področju predstavlja globalno segrevanje, ki povzroča konstantno zmanjševanje obdelovalnih površin. Posledica globalnega segrevanja je tudi pojav doslej neznanih mikroorganizmov, ki se lahko razmnožujejo v novih, toplejših pogojih in poškodujejo ter tako zmanjšajo pridelek. Za preprečevanje tega problema se trenutno uporabljajo predvsem pesticidi, ki pa imajo negativen učinek na okolje in zdravje ljudi [1].<br /><br />
<br />
Skupina INSA_LYON1 je želela ustvariti orodje, s katerim bi lahko na podlagi razumevanja lastnosti posameznega patogena kmetom predlagali način, ki bi širjenje patogena omejil brez uporabe pesticidov, ob tem pa se tudi njihov pridelek ne bi pretirano zmanjšal [1].<br />
<br />
==Cilj projekta==<br />
Ideja je privedla do stvaritve FIAT LUX, biotehnološkega orodja, ki v bakterijah povzroči luminiscenco in tako na neinvaziven način omogoči spremljanje njihovega namnoževanja v rastlini v realnem času. Osredotočili so se predvsem na spremljanje namnoževanja fitopatogene bakterije ''Dickeya solani'', vendar pa je bil njihov cilj ustvariti biosenzor, prilagojen na katerokoli bakterijo. Tako bi lahko novoodkrito fitopatogeno bakterijo transformirali s tem orodjem, z njo v laboratoriju okužili ciljno rastlino in preko konstitutivne luminiscence opazovali njeno namnoževanje v rastlini. S pomočjo matematičnega modela bi lahko predvideli tudi nadaljnje namnoževanje bakterije in tako bolje razumeli ter hitreje odreagirali pri reševanju pridelka [1].<br />
<br />
==Načrt projekta==<br />
Orodje FIAT LUX temelji na ''ilux'' operonu, modificiranem ''lux'' operonu, ki emitira luminiscenco. ''ilux'' operon so si izbrali, saj v primeru izražanja v ''E.coli'' emitira 7-krat intenzivnejšo luminiscenco kot ''lux'' operon. Sestavljen je iz šestih genov (''iluxC'', ''iluxD'', ''iluxA'', ''iluxB'', ''iluxE'' in ''ilux-frp''), od katerih ima vsak specifično vlogo. ''iluxA'' in ''iluxB'' kodirata za luciferazni encimski kompleks, ki katalizira oksidacijo FMNH<sub>2</sub> do FMN in maščobnih aldehidov do maščobnih kislin, kar rezultira v luminiscenci. ''iluxC'', ''iluxD'' in ''iluxE'' tvorijo kompleks, ki reciklira maščobne kisline nazaj do maščobnih aldehidov. ''ilux-frp'' pa je FMN reduktaza, ki reciklira FMN nazaj do FMNH<sub>2</sub>. Emisija luminiscence z ''ilux'' operonom tako lahko poteka neodvisno, če sta le v okolju prisotna molekularni kisik in FMN, kar velja za vse aerobne celice [1, 2].<br /><br />
<br />
Svojo nalogo so razdelili na sledeče štiri korake:<br /><br />
1. Izdelava biokock.<br /><br />
2. Karakterizacija FIAT LUX v ''E.coli''.<br /><br />
3. Dokaz koncepta v ''D.solani''.<br /><br />
4. ''In situ'' opazovanje v rastlinah.<br />
<br />
==Izvedba projekta==<br />
<br />
===Izdelava biokock===<br />
Ker so želeli ''ilux'' operon vstaviti v plazmidno ogrodje, so ga najprej morali prilagoditi iGEM standardom. Le-ti zahtevajo, da sta v plazmidnem ogrodju restrikcijski mesti EcoRI in XbaI pozicionirani navzgor ter restrikcijski mesti SpeI in PstI navzdol od operona. Na ''ilux'' operonu so zato odstranili pet restrikcijskih mest (3-krat PstI, 1-krat EcoRI in 1-krat XbaI) in dobili šest ''ilux'' fragmentov. Ker poskus rekonstrukcije celotnega operona naenkrat ni uspel, so se odločili, da ga sestavijo v dveh delih. Geni ''iluxA'', ''iluxB'' in ''iluxE'' ne vsebujejo restrikcijskih mest, zato so s klasičnim PCR rekonstruirali ''fiatluxABE'' in zaporedje vstavili na ustrezno mesto v plazmidni ogrodji pSB1C3 in pBAD18. ''fiatluxABE'' je bil v pBAD18 pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja pBAD. V vektorju pACYDuet-1 so posebej konstruirali še ''fiatluxCD'' pod kontrolo šibkega konstitutivnega promotorja J23117 [1].<br /><br />
<br />
Preden so v plazmidu združili ''fiatluxABE'' in ''fiatluxCD'', so preverili vpliv uvedenih mutacij na emisijo luminiscence. ''E.coli'' DH5α so transformirali z ustvarjenima vektorjema pBAD18-''fiatluxABE'' in pACYDuet-1-''fiatluxCD''. Izkazalo se je, da je emisija luminiscence še vedno prisotna, torej je operon funkcionalen [1].<br /><br />
<br />
Želeli so, da je orodje uporabno za čim širši spekter bakterij, zato so ''fiatluxABE'' in J23117-''fiatluxCD'' združili v konjugativnem plazmidu. Uporabili so konjugativna vektorja pSEVA521 in pSEVA531, združevanje je potekalo s HiFi združevanjem. Plazmida so nato ločeno transformirali v ''E.coli'' DH5α [1].<br />
<br />
===Karakterizacija FIAT LUX v ''E.coli''===<br />
V naslednjem koraku so določevali optimalno koncentracijo antibiotika tetraciklina v gojišču in optimalno temperaturo, potrebno za shranjevanje transformiranih ''E.coli''. Tako so želeli zagotoviti dolgoročno stabilnost plazmidov. Preverili so vpliv koncentracije tetraciklina in temperature za shranjevanje ''E.coli'', transformirane s pSEVA521-''fiatluxCDABE'', pSEVA531-''fiatluxCDABE'', pSEVA521 oz. pSEVA531 (prazna vektorja). Na LB agar ploščah so primerjali rast transformirane ''E.coli'' pri 37 °C, predhodno shranjene pri –80 °C, 4 °C in sobni temperaturi, ter pri koncentracijah tetraciklina 2, 5 in 10 μg/mL [1].<br /><br />
<br />
Bakterija, transformirana s pSEVA521-''fiatluxCDABE'' oz. pSEVA531-''fiatluxCDABE'', shranjena pri temperaturi –80 °C in 4 °C, pri koncentraciji tetraciklina 10 μg/mL ni rastla, medtem ko je pri istih pogojih bakterija, transformirana s praznima vektorjema, rastla. Pri shranjevanju na sobni temperaturi rast bakterije ni bila ovirana s koncentracijo tetraciklina. Opazili so, da bakterija, transformirana s pSEVA521-''fiatluxCDABE'', bolje raste pri koncentracijah tetraciklina 2 in 5 μg/mL, zato so v nadaljevanju v gojišču koncentracijo tetraciklina ohranjali med 2 in 5 μg/mL [1].<br /><br />
<br />
Ugotovili so, da izražanje fiatlux pri pSEVA531 zmanjšuje odpornost ''E.coli'' na tetraciklin. Vektorja pSEVA521 in pSEVA531 imata različni mesti začetka podvojevanja. pSEVA521-''fiatluxCDABE'' nosi RK2 ORI, medtem ko pSEVA531-''fiatluxCDABE'' nosi pBBR1 ORI, ki ima višjo stopnjo podvojevanja kot RK2. Možno je torej, da ima pri zmanjšani odpornosti ''E.coli'', transformirane s pSEVA531-''fiatluxCDABE'', na tetraciklin vlogo višja poraba energije pri emisiji luminiscence, posredovani z luciferaznim encimskim kompleksom [1].<br />
<br />
===Dokaz koncepta v ''D.solani''===<br />
Koncept delovanja orodja FIAT LUX so pokazali s prenosom plazmidov v fitopatogeno bakterijo ''D.solani'' in sicer v sev divjega tipa ''D.solani'' D s0432-1. ''D.solani'' je bakterija, odgovorna za bolezni številnih kmetijskih in okrasnih rastlin po vsem svetu. Bakterija proizvaja različne encime (pektinaze, celulaze in proteaze), ki razgrajujejo celično steno rastlinskih celic. Iz mrtvih rastlinskih celic nato bakterija pridobiva hranila ter se namnožuje po rastlinskem tkivu. Njena večja agresivnost v zadnjem obdobju je najverjetneje povezana s temperaturnimi spremembami zaradi globalnega segrevanja ozračja [1, 3].<br /><br />
<br />
Prenos v bakterijo so pokazali za plazmide pSEVA521-''fiatlux'', pSEVA531-''fiatlux'', pSEVA521 in pSEVA531. Prazna vektorja sta služila kot kontrola. Prenos so izvedli z metodo konjugacije. Najprej so s transformacijo vstavili plazmid v sev ''E.coli'' MFDpir. Po 48-urni inkubaciji pri 37 °C v prisotnosti 5 μg/mL tetraciklina so s kamero z visoko občutljivostjo zaznali luminiscenco. Po uspešni transformaciji je sledila konjugacija med ''E.coli'' MFDpir in ''D.solani''. Po 48-urni inkubaciji pri 30 °C v prisotnosti 5 μg/mL tetraciklina so s kamero z visoko občutljivostjo zaznali luminiscenco. Potrdili so, da so vsi štirje plazmidi uspešno vstavljeni v ''D.solani'', emisijo luminiscence pa so zaznali le v kolonijah, ki so vsebovale pSEVA521-''fiatlux'' oz. pSEVA531-''fiatlux''. S pektinaznim testom so potrdili, da so kolonije, zaznane po konjugaciji, res ''D.solani'' [1].<br /><br />
<br />
Karakterizacija ''fiatlux'' v ''D.solani'' je potekala podobno kot predhodno v ''E.coli''. Kot pri ''E.coli'', so tudi pri ''D.solani'' opazili, da bakterija s pSEVA531-''fiatlux'' emitira prej in več luminiscence kot bakterija s pSEVA521-''fiatlux''. Stabilnost plazmida v ''D.solani'' so preverili tako, da so z merjenjem OD pri 600 nm šteli bakterijske celice, ki so zrasle na gojišču LB in gojišču s 5 μg/mL tetraciklinom. Eksperiment so nastavili tako, da je poteklo devet celičnih celitev ''D.solani'' na dan, izvajali pa so ga tri dni. Po 27 generacijah (celičnih delitvah) je bakterija ohranila plazmid, kar zadostuje, če upoštevamo, da bakterija in situ niti ne doseže toliko generacij [1].<br />
<br />
===''In situ'' opazovanje v rastlinah===<br />
Na koncu so preverili, če njihovo orodje deluje ''in situ'' v rastlinah. Poskus so izvedli na listih cikorije in na gomoljih krompirja [1].<br /><br />
<br />
Za infekcijo listov cikorije so uporabili ''D.solani'', transformirano s pSEVA521-''fiatlux'', pSEVA531-''fiatlux'', pSEVA521 oz. pSEVA531. Po 30 in 48 urah so izmerili okuženo površino in opazovali luminiscenco listov. Največ znakov infekcije je kazala ''D.solani'' s pSEVA531 in pSEVA531-''fiatlux''. Poleg tega so zaznali tudi večjo emisijo luminiscence pri infekciji z ''D.solani'' s pSEVA531-''fiatlux'' kot pri pSEVA521-''fiatlux''. Na ta način so potrdili, da je plazmid pSEVA531-''fiatlux'' bolj učinkovit od pSEVA521-''fiatlux'' [1].<br /><br />
<br />
Poskus infekcije so izvedli tudi na gomoljih krompirja, vendar so tokrat za infekcijo uporabili le ''D.solani'', transformirano s pSEVA531-''fiatlux'' oz. pSEVA531. Po 24 in 48 urah so gomolje prerezali in ocenili nagnito površino. Infekcija je bila tudi tokrat učinkovita [1].<br />
<br />
==Uporaba orodja==<br />
Rezultati so pokazali, da je orodje FIAT LUX uporabno na primeru bakterije ''D.solani''. Uspešno so transformirali tudi dva druga seva, ''Citrobacter'' ''rodentium'' in ''Pseudomonas'' ''putida'', ki sta prav tako po konjugaciji emitirala luminiscenco. Z dokazom koncepta delovanja bi se orodje torej lahko izkazalo za zelo učinkovito. Po prejemu vzorca okužene rastline bi raziskovalci identificirali fitopatogen in nato spremljali njegovo namnoževanje pod različnimi pogoji z orodjem FIAT LUX. V doglednem času bi lahko predlagali način, ki bi preprečil širjenje patogena ter ga uničil [1].<br />
<br />
==Viri==<br />
[1] FIAT LUX https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/index.html.<br /><br />
[2] C. Gregor, K. C. Gwosch, S. J. Sahl, S. W. Hell: Strongly Enhanced Bacterial Bioluminescence with the Ilux Operon for Single-Cell Imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2018, 115, 962–967.<br /><br />
[3] M. A. Matilla, R. E. Monson, G. P. C. Salmond: Dickeya Solani. Trends Microbiol. 2023, xx, 1–2.</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=FIAT_LUX&diff=21746FIAT LUX2023-04-07T14:04:25Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>FIAT LUX je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2022 pripravila ekipa francoskih dodiplomskih študentov z imenom INSA_LYON1. Na tekmovanju je projekt med projekti dodiplomskih študentov zasedel drugo mesto. Dostopen je na spletnem naslovu https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/.<br />
<br />
==Problem==<br />
Enega glavnih globalnih izzivov 21. stoletja predstavlja oskrba naraščajočega števila svetovnega prebivalstva s hrano. Dodatno breme za kmetijstvo na tem področju predstavlja globalno segrevanje, ki povzroča konstantno zmanjševanje obdelovalnih površin. Posledica globalnega segrevanja je tudi pojav doslej neznanih mikroorganizmov, ki se lahko razmnožujejo v novih, toplejših pogojih in poškodujejo ter tako zmanjšajo pridelek. Za preprečevanje tega problema se trenutno uporabljajo predvsem pesticidi, ki pa imajo negativen učinek na okolje in zdravje ljudi [1].<br /><br />
<br />
Skupina INSA_LYON1 je želela ustvariti orodje, s katerim bi lahko na podlagi razumevanja lastnosti posameznega patogena kmetom predlagali način, ki bi širjenje patogena omejil brez uporabe pesticidov, ob tem pa se tudi njihov pridelek ne bi pretirano zmanjšal [1].<br />
<br />
==Cilj projekta==<br />
Ideja je privedla do stvaritve FIAT LUX, biotehnološkega orodja, ki v bakterijah povzroči luminiscenco in tako na neinvaziven način omogoči spremljanje njihovega namnoževanja v rastlini v realnem času. Osredotočili so se predvsem na spremljanje namnoževanja fitopatogene bakterije ''Dickeya solani'', vendar pa je bil njihov cilj ustvariti biosenzor, prilagojen na katerokoli bakterijo. Tako bi lahko novoodkrito fitopatogeno bakterijo transformirali s tem orodjem, z njo v laboratoriju okužili ciljno rastlino in preko konstitutivne luminiscence opazovali njeno namnoževanje v rastlini. S pomočjo matematičnega modela bi lahko predvideli tudi nadaljnje namnoževanje bakterije in tako bolje razumeli ter hitreje odreagirali pri reševanju pridelka [1].<br />
<br />
==Načrt projekta==<br />
Orodje FIAT LUX temelji na ''ilux'' operonu, modificiranem ''lux'' operonu, ki emitira luminiscenco. ''ilux'' operon so si izbrali, saj v primeru izražanja v ''E.coli'' emitira 7-krat intenzivnejšo luminiscenco kot ''lux'' operon. Sestavljen je iz šestih genov (''iluxC'', ''iluxD'', ''iluxA'', ''iluxB'', ''iluxE'' in ''ilux-frp''), od katerih ima vsak specifično vlogo. ''iluxA'' in ''iluxB'' kodirata za luciferazni encimski kompleks, ki katalizira oksidacijo FMNH<sub>2</sub> do FMN in maščobnih aldehidov do maščobnih kislin, kar rezultira v luminiscenci. ''iluxC'', ''iluxD'' in ''iluxE'' tvorijo kompleks, ki reciklira maščobne kisline nazaj do maščobnih aldehidov. ''ilux-frp'' pa je FMN reduktaza, ki reciklira FMN nazaj do FMNH<sub>2</sub>. Emisija luminiscence z ''ilux'' operonom tako lahko poteka neodvisno, če sta le v okolju prisotna molekularni kisik in FMN, kar velja za vse aerobne celice [1, 2].<br /><br />
<br />
Svojo nalogo so razdelili na sledeče štiri korake:<br /><br />
1. Izdelava biokock.<br /><br />
2. Karakterizacija FIAT LUX v ''E.coli''.<br /><br />
3. Dokaz koncepta v ''D.solani''.<br /><br />
4. In situ opazovanje v rastlinah.<br />
<br />
==Izvedba projekta==<br />
<br />
===Izdelava biokock===<br />
Ker so želeli ''ilux'' operon vstaviti v plazmidno ogrodje, so ga najprej morali prilagoditi iGEM standardom. Le-ti zahtevajo, da sta v plazmidnem ogrodju restrikcijski mesti EcoRI in XbaI pozicionirani navzgor ter restrikcijski mesti SpeI in PstI navzdol od operona. Na ''ilux'' operonu so zato odstranili pet restrikcijskih mest (3-krat PstI, 1-krat EcoRI in 1-krat XbaI) in dobili šest ''ilux'' fragmentov. Ker poskus rekonstrukcije celotnega operona naenkrat ni uspel, so se odločili, da ga sestavijo v dveh delih. Geni ''iluxA'', ''iluxB'' in ''iluxE'' ne vsebujejo restrikcijskih mest, zato so s klasičnim PCR rekonstruirali ''fiatluxABE'' in zaporedje vstavili na ustrezno mesto v plazmidni ogrodji pSB1C3 in pBAD18. ''fiatluxABE'' je bil v pBAD18 pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja pBAD. V vektorju pACYDuet-1 so posebej konstruirali še ''fiatluxCD'' pod kontrolo šibkega konstitutivnega promotorja J23117 [1].<br /><br />
<br />
Preden so v plazmidu združili ''fiatluxABE'' in ''fiatluxCD'', so preverili vpliv uvedenih mutacij na emisijo luminiscence. ''E.coli'' DH5α so transformirali z ustvarjenima vektorjema pBAD18-''fiatluxABE'' in pACYDuet-1-''fiatluxCD''. Izkazalo se je, da je emisija luminiscence še vedno prisotna, torej je operon funkcionalen [1].<br /><br />
<br />
Želeli so, da je orodje uporabno za čim širši spekter bakterij, zato so ''fiatluxABE'' in J23117-''fiatluxCD'' združili v konjugativnem plazmidu. Uporabili so konjugativna vektorja pSEVA521 in pSEVA531, združevanje je potekalo s HiFi združevanjem. Plazmida so nato ločeno transformirali v ''E.coli'' DH5α [1].<br />
<br />
===Karakterizacija FIAT LUX v ''E.coli''===<br />
V naslednjem koraku so določevali optimalno koncentracijo antibiotika tetraciklina v gojišču in optimalno temperaturo, potrebno za shranjevanje transformiranih ''E.coli''. Tako so želeli zagotoviti dolgoročno stabilnost plazmidov. Preverili so vpliv koncentracije tetraciklina in temperature za shranjevanje ''E.coli'', transformirane s pSEVA521-''fiatluxCDABE'', pSEVA531-''fiatluxCDABE'', pSEVA521 oz. pSEVA531 (prazna vektorja). Na LB agar ploščah so primerjali rast transformirane ''E.coli'' pri 37 °C, predhodno shranjene pri –80 °C, 4 °C in sobni temperaturi, ter pri koncentracijah tetraciklina 2, 5 in 10 μg/mL [1].<br /><br />
<br />
Bakterija, transformirana s pSEVA521-''fiatluxCDABE'' oz. pSEVA531-''fiatluxCDABE'', shranjena pri temperaturi –80 °C in 4 °C, pri koncentraciji tetraciklina 10 μg/mL ni rastla, medtem ko je pri istih pogojih bakterija, transformirana s praznima vektorjema, rastla. Pri shranjevanju na sobni temperaturi rast bakterije ni bila ovirana s koncentracijo tetraciklina. Opazili so, da bakterija, transformirana s pSEVA521-''fiatluxCDABE'', bolje raste pri koncentracijah tetraciklina 2 in 5 μg/mL, zato so v nadaljevanju v gojišču koncentracijo tetraciklina ohranjali med 2 in 5 μg/mL [1].<br /><br />
<br />
Ugotovili so, da izražanje fiatlux pri pSEVA531 zmanjšuje odpornost ''E.coli'' na tetraciklin. Vektorja pSEVA521 in pSEVA531 imata različni mesti začetka podvojevanja. pSEVA521-''fiatluxCDABE'' nosi RK2 ORI, medtem ko pSEVA531-''fiatluxCDABE'' nosi pBBR1 ORI, ki ima višjo stopnjo podvojevanja kot RK2. Možno je torej, da ima pri zmanjšani odpornosti ''E.coli'', transformirane s pSEVA531-''fiatluxCDABE'', na tetraciklin vlogo višja poraba energije pri emisiji luminiscence, posredovani z luciferaznim encimskim kompleksom [1].<br />
<br />
===Dokaz koncepta v ''D.solani''===<br />
Koncept delovanja orodja FIAT LUX so pokazali s prenosom plazmidov v fitopatogeno bakterijo ''D.solani'' in sicer v sev divjega tipa ''D.solani'' D s0432-1. ''D.solani'' je bakterija, odgovorna za bolezni številnih kmetijskih in okrasnih rastlin po vsem svetu. Bakterija proizvaja različne encime (pektinaze, celulaze in proteaze), ki razgrajujejo celično steno rastlinskih celic. Iz mrtvih rastlinskih celic nato bakterija pridobiva hranila ter se namnožuje po rastlinskem tkivu. Njena večja agresivnost v zadnjem obdobju je najverjetneje povezana s temperaturnimi spremembami zaradi globalnega segrevanja ozračja [1, 3].<br /><br />
<br />
Prenos v bakterijo so pokazali za plazmide pSEVA521-''fiatlux'', pSEVA531-''fiatlux'', pSEVA521 in pSEVA531. Prazna vektorja sta služila kot kontrola. Prenos so izvedli z metodo konjugacije. Najprej so s transformacijo vstavili plazmid v sev ''E.coli'' MFDpir. Po 48-urni inkubaciji pri 37 °C v prisotnosti 5 μg/mL tetraciklina so s kamero z visoko občutljivostjo zaznali luminiscenco. Po uspešni transformaciji je sledila konjugacija med ''E.coli'' MFDpir in ''D.solani''. Po 48-urni inkubaciji pri 30 °C v prisotnosti 5 μg/mL tetraciklina so s kamero z visoko občutljivostjo zaznali luminiscenco. Potrdili so, da so vsi štirje plazmidi uspešno vstavljeni v ''D.solani'', emisijo luminiscence pa so zaznali le v kolonijah, ki so vsebovale pSEVA521-''fiatlux'' oz. pSEVA531-''fiatlux''. S pektinaznim testom so potrdili, da so kolonije, zaznane po konjugaciji, res ''D.solani'' [1].<br /><br />
<br />
Karakterizacija ''fiatlux'' v ''D.solani'' je potekala podobno kot predhodno v ''E.coli''. Kot pri ''E.coli'', so tudi pri ''D.solani'' opazili, da bakterija s pSEVA531-''fiatlux'' emitira prej in več luminiscence kot bakterija s pSEVA521-''fiatlux''. Stabilnost plazmida v ''D.solani'' so preverili tako, da so z merjenjem OD pri 600 nm šteli bakterijske celice, ki so zrasle na gojišču LB in gojišču s 5 μg/mL tetraciklinom. Eksperiment so nastavili tako, da je poteklo devet celičnih celitev ''D.solani'' na dan, izvajali pa so ga tri dni. Po 27 generacijah (celičnih delitvah) je bakterija ohranila plazmid, kar zadostuje, če upoštevamo, da bakterija in situ niti ne doseže toliko generacij [1].<br />
<br />
===''In situ'' opazovanje v rastlinah===<br />
Na koncu so preverili, če njihovo orodje deluje ''in situ'' v rastlinah. Poskus so izvedli na listih cikorije in na gomoljih krompirja [1].<br /><br />
<br />
Za infekcijo listov cikorije so uporabili ''D.solani'', transformirano s pSEVA521-''fiatlux'', pSEVA531-''fiatlux'', pSEVA521 oz. pSEVA531. Po 30 in 48 urah so izmerili okuženo površino in opazovali luminiscenco listov. Največ znakov infekcije je kazala ''D.solani'' s pSEVA531 in pSEVA531-''fiatlux''. Poleg tega so zaznali tudi večjo emisijo luminiscence pri infekciji z ''D.solani'' s pSEVA531-''fiatlux'' kot pri pSEVA521-''fiatlux''. Na ta način so potrdili, da je plazmid pSEVA531-''fiatlux'' bolj učinkovit od pSEVA521-''fiatlux'' [1].<br /><br />
<br />
Poskus infekcije so izvedli tudi na gomoljih krompirja, vendar so tokrat za infekcijo uporabili le ''D.solani'', transformirano s pSEVA531-''fiatlux'' oz. pSEVA531. Po 24 in 48 urah so gomolje prerezali in ocenili nagnito površino. Infekcija je bila tudi tokrat učinkovita [1].<br />
<br />
==Uporaba orodja==<br />
Rezultati so pokazali, da je orodje FIAT LUX uporabno na primeru bakterije ''D.solani''. Uspešno so transformirali tudi dva druga seva, ''Citrobacter'' ''rodentium'' in ''Pseudomonas'' ''putida'', ki sta prav tako po konjugaciji emitirala luminiscenco. Z dokazom koncepta delovanja bi se orodje torej lahko izkazalo za zelo učinkovito. Po prejemu vzorca okužene rastline bi raziskovalci identificirali fitopatogen in nato spremljali njegovo namnoževanje pod različnimi pogoji z orodjem FIAT LUX. V doglednem času bi lahko predlagali način, ki bi preprečil širjenje patogena ter ga uničil [1].<br />
<br />
==Viri==<br />
[1] FIAT LUX https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/index.html.<br /><br />
[2] C. Gregor, K. C. Gwosch, S. J. Sahl, S. W. Hell: Strongly Enhanced Bacterial Bioluminescence with the Ilux Operon for Single-Cell Imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2018, 115, 962–967.<br /><br />
[3] M. A. Matilla, R. E. Monson, G. P. C. Salmond: Dickeya Solani. Trends Microbiol. 2023, xx, 1–2.</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=FIAT_LUX&diff=21745FIAT LUX2023-04-07T13:53:56Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>FIAT LUX je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2022 pripravila ekipa francoskih dodiplomskih študentov z imenom INSA_LYON1. Na tekmovanju je projekt med projekti dodiplomskih študentov zasedel drugo mesto. Dostopen je na spletnem naslovu https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/.<br />
<br />
==Problem==<br />
Enega glavnih globalnih izzivov 21. stoletja predstavlja oskrba naraščajočega števila svetovnega prebivalstva s hrano. Dodatno breme za kmetijstvo na tem področju predstavlja globalno segrevanje, ki povzroča konstantno zmanjševanje obdelovalnih površin. Posledica globalnega segrevanja je tudi pojav doslej neznanih mikroorganizmov, ki se lahko razmnožujejo v novih, toplejših pogojih in poškodujejo ter tako zmanjšajo pridelek. Za preprečevanje tega problema se trenutno uporabljajo predvsem pesticidi, ki pa imajo negativen učinek na okolje in zdravje ljudi [1].<br /><br />
<br />
Skupina INSA_LYON1 je želela ustvariti orodje, s katerim bi lahko na podlagi razumevanja lastnosti posameznega patogena kmetom predlagali način, ki bi širjenje patogena omejil brez uporabe pesticidov, ob tem pa se tudi njihov pridelek ne bi pretirano zmanjšal [1].<br />
<br />
==Cilj projekta==<br />
Ideja je privedla do stvaritve FIAT LUX, biotehnološkega orodja, ki v bakterijah povzroči luminiscenco in tako na neinvaziven način omogoči spremljanje njihovega namnoževanja v rastlini v realnem času. Osredotočili so se predvsem na spremljanje namnoževanja fitopatogene bakterije Dickeya solani, vendar pa je bil njihov cilj ustvariti biosenzor, prilagojen na katerokoli bakterijo. Tako bi lahko novoodkrito fitopatogeno bakterijo transformirali s tem orodjem, z njo v laboratoriju okužili ciljno rastlino in preko konstitutivne luminiscence opazovali njeno namnoževanje v rastlini. S pomočjo matematičnega modela bi lahko predvideli tudi nadaljnje namnoževanje bakterije in tako bolje razumeli ter hitreje odreagirali pri reševanju pridelka [1].<br />
<br />
==Načrt projekta==<br />
Orodje FIAT LUX temelji na ''ilux'' operonu, modificiranem ''lux'' operonu, ki emitira luminiscenco. ''ilux'' operon so si izbrali, saj v primeru izražanja v ''E.coli'' emitira 7-krat intenzivnejšo luminiscenco kot ''lux'' operon. Sestavljen je iz šestih genov (''iluxC'', ''iluxD'', ''iluxA'', ''iluxB'', ''iluxE'' in ''ilux-frp''), od katerih ima vsak specifično vlogo. ''iluxA'' in ''iluxB'' kodirata za luciferazni encimski kompleks, ki katalizira oksidacijo FMNH<sub>2</sub> do FMN in maščobnih aldehidov do maščobnih kislin, kar rezultira v luminiscenci. ''iluxC'', ''iluxD'' in ''iluxE'' tvorijo kompleks, ki reciklira maščobne kisline nazaj do maščobnih aldehidov. ''ilux-frp'' pa je FMN reduktaza, ki reciklira FMN nazaj do FMNH<sub>2</sub>. Emisija luminiscence z ''ilux'' operonom tako lahko poteka neodvisno, če sta le v okolju prisotna molekularni kisik in FMN, kar velja za vse aerobne celice [1, 2].<br /><br />
<br />
Svojo nalogo so razdelili na sledeče štiri korake:<br /><br />
1. Izdelava biokock.<br /><br />
2. Karakterizacija FIAT LUX v ''E.coli''.<br /><br />
3. Dokaz koncepta v ''D.solani''.<br /><br />
4. In situ opazovanje v rastlinah.<br />
<br />
==Izvedba projekta==<br />
<br />
===Izdelava biokock===<br />
Ker so želeli ''ilux'' operon vstaviti v plazmidno ogrodje, so ga najprej morali prilagoditi iGEM standardom. Le-ti zahtevajo, da sta v plazmidnem ogrodju restrikcijski mesti EcoRI in XbaI pozicionirani navzgor ter restrikcijski mesti SpeI in PstI navzdol od operona. Na ''ilux'' operonu so zato odstranili pet restrikcijskih mest (3-krat PstI, 1-krat EcoRI in 1-krat XbaI) in dobili šest ''ilux'' fragmentov. Ker poskus rekonstrukcije celotnega operona naenkrat ni uspel, so se odločili, da ga sestavijo v dveh delih. Geni ''iluxA'', ''iluxB'' in ''iluxE'' ne vsebujejo restrikcijskih mest, zato so s klasičnim PCR rekonstruirali ''fiatluxABE'' in zaporedje vstavili na ustrezno mesto v plazmidni ogrodji pSB1C3 in pBAD18. ''fiatluxABE'' je bil v pBAD18 pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja pBAD. V vektorju pACYDuet-1 so posebej konstruirali še ''fiatluxCD'' pod kontrolo šibkega konstitutivnega promotorja J23117 [1].<br /><br />
<br />
Preden so v plazmidu združili ''fiatluxABE'' in ''fiatluxCD'', so preverili vpliv uvedenih mutacij na emisijo luminiscence. ''E.coli'' DH5α so transformirali z ustvarjenima vektorjema pBAD18-''fiatluxABE'' in pACYDuet-1-''fiatluxCD''. Izkazalo se je, da je emisija luminiscence še vedno prisotna, torej je operon funkcionalen [1].<br /><br />
<br />
Želeli so, da je orodje uporabno za čim širši spekter bakterij, zato so ''fiatluxABE'' in J23117-''fiatluxCD'' združili v konjugativnem plazmidu. Uporabili so konjugativna vektorja pSEVA521 in pSEVA531, združevanje je potekalo s HiFi združevanjem. Plazmida so nato ločeno transformirali v ''E.coli'' DH5α [1].<br />
<br />
===Karakterizacija FIAT LUX v ''E.coli''===<br />
V naslednjem koraku so določevali optimalno koncentracijo antibiotika tetraciklina v gojišču in optimalno temperaturo, potrebno za shranjevanje transformiranih ''E.coli''. Tako so želeli zagotoviti dolgoročno stabilnost plazmidov. Preverili so vpliv koncentracije tetraciklina in temperature za shranjevanje ''E.coli'', transformirane s pSEVA521-''fiatluxCDABE'', pSEVA531-''fiatluxCDABE'', pSEVA521 oz. pSEVA531 (prazna vektorja). Na LB agar ploščah so primerjali rast transformirane ''E.coli'' pri 37 °C, predhodno shranjene pri –80 °C, 4 °C in sobni temperaturi, ter pri koncentracijah tetraciklina 2, 5 in 10 μg/mL [1].<br /><br />
<br />
Bakterija, transformirana s pSEVA521-''fiatluxCDABE'' oz. pSEVA531-''fiatluxCDABE'', shranjena pri temperaturi –80 °C in 4 °C, pri koncentraciji tetraciklina 10 μg/mL ni rastla, medtem ko je pri istih pogojih bakterija, transformirana s praznima vektorjema, rastla. Pri shranjevanju na sobni temperaturi rast bakterije ni bila ovirana s koncentracijo tetraciklina. Opazili so, da bakterija, transformirana s pSEVA521-''fiatluxCDABE'', bolje raste pri koncentracijah tetraciklina 2 in 5 μg/mL, zato so v nadaljevanju v gojišču koncentracijo tetraciklina ohranjali med 2 in 5 μg/mL [1].<br /><br />
<br />
Ugotovili so, da izražanje fiatlux pri pSEVA531 zmanjšuje odpornost ''E.coli'' na tetraciklin. Vektorja pSEVA521 in pSEVA531 imata različni mesti začetka podvojevanja. pSEVA521-''fiatluxCDABE'' nosi RK2 ORI, medtem ko pSEVA531-''fiatluxCDABE'' nosi pBBR1 ORI, ki ima višjo stopnjo podvojevanja kot RK2. Možno je torej, da ima pri zmanjšani odpornosti ''E.coli'', transformirane s pSEVA531-''fiatluxCDABE'', na tetraciklin vlogo višja poraba energije pri emisiji luminiscence, posredovani z luciferaznim encimskim kompleksom [1].<br />
<br />
===Dokaz koncepta v ''D.solani''===<br />
Koncept delovanja orodja FIAT LUX so pokazali s prenosom plazmidov v fitopatogeno bakterijo ''D.solani'' in sicer v sev divjega tipa ''D.solani'' D s0432-1. ''D.solani'' je bakterija, odgovorna za bolezni številnih kmetijskih in okrasnih rastlin po vsem svetu. Bakterija proizvaja različne encime (pektinaze, celulaze in proteaze), ki razgrajujejo celično steno rastlinskih celic. Iz mrtvih rastlinskih celic nato bakterija pridobiva hranila ter se namnožuje po rastlinskem tkivu. Njena večja agresivnost v zadnjem obdobju je najverjetneje povezana s temperaturnimi spremembami zaradi globalnega segrevanja ozračja [1, 3].<br /><br />
<br />
Prenos v bakterijo so pokazali za plazmide pSEVA521-''fiatlux'', pSEVA531-''fiatlux'', pSEVA521 in pSEVA531. Prazna vektorja sta služila kot kontrola. Prenos so izvedli z metodo konjugacije. Najprej so s transformacijo vstavili plazmid v sev ''E.coli'' MFDpir. Po 48-urni inkubaciji pri 37 °C v prisotnosti 5 μg/mL tetraciklina so s kamero z visoko občutljivostjo zaznali luminiscenco. Po uspešni transformaciji je sledila konjugacija med ''E.coli'' MFDpir in ''D.solani''. Po 48-urni inkubaciji pri 30 °C v prisotnosti 5 μg/mL tetraciklina so s kamero z visoko občutljivostjo zaznali luminiscenco. Potrdili so, da so vsi štirje plazmidi uspešno vstavljeni v ''D.solani'', emisijo luminiscence pa so zaznali le v kolonijah, ki so vsebovale pSEVA521-''fiatlux'' oz. pSEVA531-''fiatlux''. S pektinaznim testom so potrdili, da so kolonije, zaznane po konjugaciji, res ''D.solani'' [1].<br /><br />
<br />
Karakterizacija ''fiatlux'' v ''D.solani'' je potekala podobno kot predhodno v ''E.coli''. Kot pri ''E.coli'', so tudi pri ''D.solani'' opazili, da bakterija s pSEVA531-''fiatlux'' emitira prej in več luminiscence kot bakterija s pSEVA521-''fiatlux''. Stabilnost plazmida v ''D.solani'' so preverili tako, da so z merjenjem OD pri 600 nm šteli bakterijske celice, ki so zrasle na gojišču LB in gojišču s 5 μg/mL tetraciklinom. Eksperiment so nastavili tako, da je poteklo devet celičnih celitev ''D.solani'' na dan, izvajali pa so ga tri dni. Po 27 generacijah (celičnih delitvah) je bakterija ohranila plazmid, kar zadostuje, če upoštevamo, da bakterija in situ niti ne doseže toliko generacij [1].<br />
<br />
===''In situ'' opazovanje v rastlinah===<br />
Na koncu so preverili, če njihovo orodje deluje ''in situ'' v rastlinah. Poskus so izvedli na listih cikorije in na gomoljih krompirja [1].<br /><br />
<br />
Za infekcijo listov cikorije so uporabili ''D.solani'', transformirano s pSEVA521-''fiatlux'', pSEVA531-''fiatlux'', pSEVA521 oz. pSEVA531. Po 30 in 48 urah so izmerili okuženo površino in opazovali luminiscenco listov. Največ znakov infekcije je kazala ''D.solani'' s pSEVA531 in pSEVA531-''fiatlux''. Poleg tega so zaznali tudi večjo emisijo luminiscence pri infekciji z ''D.solani'' s pSEVA531-''fiatlux'' kot pri pSEVA521-''fiatlux''. Na ta način so potrdili, da je plazmid pSEVA531-''fiatlux'' bolj učinkovit od pSEVA521-''fiatlux'' [1].<br /><br />
<br />
Poskus infekcije so izvedli tudi na gomoljih krompirja, vendar so tokrat za infekcijo uporabili le ''D.solani'', transformirano s pSEVA531-''fiatlux'' oz. pSEVA531. Po 24 in 48 urah so gomolje prerezali in ocenili nagnito površino. Infekcija je bila tudi tokrat učinkovita [1].<br />
<br />
==Uporaba orodja==<br />
Rezultati so pokazali, da je orodje FIAT LUX uporabno na primeru bakterije ''D.solani''. Uspešno so transformirali tudi dva druga seva, ''Citrobacter'' ''rodentium'' in ''Pseudomonas'' ''putida'', ki sta prav tako po konjugaciji emitirala luminiscenco. Z dokazom koncepta delovanja bi se orodje torej lahko izkazalo za zelo učinkovito. Po prejemu vzorca okužene rastline bi raziskovalci identificirali fitopatogen in nato spremljali njegovo namnoževanje pod različnimi pogoji z orodjem FIAT LUX. V doglednem času bi lahko predlagali način, ki bi preprečil širjenje patogena ter ga uničil [1].<br />
<br />
==Viri==<br />
[1] FIAT LUX https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/index.html.<br /><br />
[2] C. Gregor, K. C. Gwosch, S. J. Sahl, S. W. Hell: Strongly Enhanced Bacterial Bioluminescence with the Ilux Operon for Single-Cell Imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2018, 115, 962–967.<br /><br />
[3] M. A. Matilla, R. E. Monson, G. P. C. Salmond: Dickeya Solani. Trends Microbiol. 2023, xx, 1–2.</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=FIAT_LUX&diff=21744FIAT LUX2023-04-07T13:47:50Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>FIAT LUX je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2022 pripravila ekipa francoskih dodiplomskih študentov z imenom INSA_LYON1. Na tekmovanju je projekt med projekti dodiplomskih študentov zasedel drugo mesto. Dostopen je na spletnem naslovu https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/.<br />
<br />
==Problem==<br />
Enega glavnih globalnih izzivov 21. stoletja predstavlja oskrba naraščajočega števila svetovnega prebivalstva s hrano. Dodatno breme za kmetijstvo na tem področju predstavlja globalno segrevanje, ki povzroča konstantno zmanjševanje obdelovalnih površin. Posledica globalnega segrevanja je tudi pojav doslej neznanih mikroorganizmov, ki se lahko razmnožujejo v novih, toplejših pogojih in poškodujejo ter tako zmanjšajo pridelek. Za preprečevanje tega problema se trenutno uporabljajo predvsem pesticidi, ki pa imajo negativen učinek na okolje in zdravje ljudi [1].<br /><br />
Skupina INSA_LYON1 je želela ustvariti orodje, s katerim bi lahko na podlagi razumevanja lastnosti posameznega patogena kmetom predlagali način, ki bi širjenje patogena omejil brez uporabe pesticidov, ob tem pa se tudi njihov pridelek ne bi pretirano zmanjšal [1].<br />
<br />
==Cilj projekta==<br />
Ideja je privedla do stvaritve FIAT LUX, biotehnološkega orodja, ki v bakterijah povzroči luminiscenco in tako na neinvaziven način omogoči spremljanje njihovega namnoževanja v rastlini v realnem času. Osredotočili so se predvsem na spremljanje namnoževanja fitopatogene bakterije Dickeya solani, vendar pa je bil njihov cilj ustvariti biosenzor, prilagojen na katerokoli bakterijo. Tako bi lahko novoodkrito fitopatogeno bakterijo transformirali s tem orodjem, z njo v laboratoriju okužili ciljno rastlino in preko konstitutivne luminiscence opazovali njeno namnoževanje v rastlini. S pomočjo matematičnega modela bi lahko predvideli tudi nadaljnje namnoževanje bakterije in tako bolje razumeli ter hitreje odreagirali pri reševanju pridelka [1].<br />
<br />
==Načrt projekta==<br />
Orodje FIAT LUX temelji na ''ilux'' operonu, modificiranem ''lux'' operonu, ki emitira luminiscenco. ''ilux'' operon so si izbrali, saj v primeru izražanja v ''E.coli'' emitira 7-krat intenzivnejšo luminiscenco kot ''lux'' operon. Sestavljen je iz šestih genov (''iluxC'', ''iluxD'', ''iluxA'', ''iluxB'', ''iluxE'' in ''ilux-frp''), od katerih ima vsak specifično vlogo. ''iluxA'' in ''iluxB'' kodirata za luciferazni encimski kompleks, ki katalizira oksidacijo FMNH<sub>2</sub> do FMN in maščobnih aldehidov do maščobnih kislin, kar rezultira v luminiscenci. ''iluxC'', ''iluxD'' in ''iluxE'' tvorijo kompleks, ki reciklira maščobne kisline nazaj do maščobnih aldehidov. ''ilux-frp'' pa je FMN reduktaza, ki reciklira FMN nazaj do FMNH<sub>2</sub>. Emisija luminiscence z ''ilux'' operonom tako lahko poteka neodvisno, če sta le v okolju prisotna molekularni kisik in FMN, kar velja za vse aerobne celice [1, 2].<br /><br />
Svojo nalogo so razdelili na sledeče štiri korake:<br /><br />
1. Izdelava biokock.<br /><br />
2. Karakterizacija FIAT LUX v ''E.coli''.<br /><br />
3. Dokaz koncepta v ''D.solani''.<br /><br />
4. In situ opazovanje v rastlinah.<br />
<br />
==Izvedba projekta==<br />
<br />
===Izdelava biokock===<br />
Ker so želeli ''ilux'' operon vstaviti v plazmidno ogrodje, so ga najprej morali prilagoditi iGEM standardom. Le-ti zahtevajo, da sta v plazmidnem ogrodju restrikcijski mesti EcoRI in XbaI pozicionirani navzgor ter restrikcijski mesti SpeI in PstI navzdol od operona. Na ''ilux'' operonu so zato odstranili pet restrikcijskih mest (3-krat PstI, 1-krat EcoRI in 1-krat XbaI) in dobili šest ''ilux'' fragmentov. Ker poskus rekonstrukcije celotnega operona naenkrat ni uspel, so se odločili, da ga sestavijo v dveh delih. Geni ''iluxA'', ''iluxB'' in ''iluxE'' ne vsebujejo restrikcijskih mest, zato so s klasičnim PCR rekonstruirali ''fiatluxABE'' in zaporedje vstavili na ustrezno mesto v plazmidni ogrodji pSB1C3 in pBAD18. ''fiatluxABE'' je bil v pBAD18 pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja pBAD. V vektorju pACYDuet-1 so posebej konstruirali še ''fiatluxCD'' pod kontrolo šibkega konstitutivnega promotorja J23117 [1].<br /><br />
Preden so v plazmidu združili ''fiatluxABE'' in ''fiatluxCD'', so preverili vpliv uvedenih mutacij na emisijo luminiscence. ''E.coli'' DH5α so transformirali z ustvarjenima vektorjema pBAD18-''fiatluxABE'' in pACYDuet-1-''fiatluxCD''. Izkazalo se je, da je emisija luminiscence še vedno prisotna, torej je operon funkcionalen [1].<br /><br />
Želeli so, da je orodje uporabno za čim širši spekter bakterij, zato so ''fiatluxABE'' in J23117-''fiatluxCD'' združili v konjugativnem plazmidu. Uporabili so konjugativna vektorja pSEVA521 in pSEVA531, združevanje je potekalo s HiFi združevanjem. Plazmida so nato ločeno transformirali v ''E.coli'' DH5α [1].<br />
<br />
===Karakterizacija FIAT LUX v ''E.coli''===<br />
V naslednjem koraku so določevali optimalno koncentracijo antibiotika tetraciklina v gojišču in optimalno temperaturo, potrebno za shranjevanje transformiranih ''E.coli''. Tako so želeli zagotoviti dolgoročno stabilnost plazmidov. Preverili so vpliv koncentracije tetraciklina in temperature za shranjevanje ''E.coli'', transformirane s pSEVA521-''fiatluxCDABE'', pSEVA531-''fiatluxCDABE'', pSEVA521 oz. pSEVA531 (prazna vektorja). Na LB agar ploščah so primerjali rast transformirane ''E.coli'' pri 37 °C, predhodno shranjene pri –80 °C, 4 °C in sobni temperaturi, ter pri koncentracijah tetraciklina 2, 5 in 10 μg/mL [1].<br /><br />
Bakterija, transformirana s pSEVA521-''fiatluxCDABE'' oz. pSEVA531-''fiatluxCDABE'', shranjena pri temperaturi –80 °C in 4 °C, pri koncentraciji tetraciklina 10 μg/mL ni rastla, medtem ko je pri istih pogojih bakterija, transformirana s praznima vektorjema, rastla. Pri shranjevanju na sobni temperaturi rast bakterije ni bila ovirana s koncentracijo tetraciklina. Opazili so, da bakterija, transformirana s pSEVA521-''fiatluxCDABE'', bolje raste pri koncentracijah tetraciklina 2 in 5 μg/mL, zato so v nadaljevanju v gojišču koncentracijo tetraciklina ohranjali med 2 in 5 μg/mL [1].<br /><br />
Ugotovili so, da izražanje fiatlux pri pSEVA531 zmanjšuje odpornost ''E.coli'' na tetraciklin. Vektorja pSEVA521 in pSEVA531 imata različni mesti začetka podvojevanja. pSEVA521-''fiatluxCDABE'' nosi RK2 ORI, medtem ko pSEVA531-''fiatluxCDABE'' nosi pBBR1 ORI, ki ima višjo stopnjo podvojevanja kot RK2. Možno je torej, da ima pri zmanjšani odpornosti ''E.coli'', transformirane s pSEVA531-''fiatluxCDABE'', na tetraciklin vlogo višja poraba energije pri emisiji luminiscence, posredovani z luciferaznim encimskim kompleksom [1].<br />
<br />
===Dokaz koncepta v ''D.solani''===<br />
Koncept delovanja orodja FIAT LUX so pokazali s prenosom plazmidov v fitopatogeno bakterijo ''D.solani'' in sicer v sev divjega tipa ''D.solani'' D s0432-1. ''D.solani'' je bakterija, odgovorna za bolezni številnih kmetijskih in okrasnih rastlin po vsem svetu. Bakterija proizvaja različne encime (pektinaze, celulaze in proteaze), ki razgrajujejo celično steno rastlinskih celic. Iz mrtvih rastlinskih celic nato bakterija pridobiva hranila ter se namnožuje po rastlinskem tkivu. Njena večja agresivnost v zadnjem obdobju je najverjetneje povezana s temperaturnimi spremembami zaradi globalnega segrevanja ozračja [1, 3].<br /><br />
Prenos v bakterijo so pokazali za plazmide pSEVA521-''fiatlux'', pSEVA531-''fiatlux'', pSEVA521 in pSEVA531. Prazna vektorja sta služila kot kontrola. Prenos so izvedli z metodo konjugacije. Najprej so s transformacijo vstavili plazmid v sev ''E.coli'' MFDpir. Po 48-urni inkubaciji pri 37 °C v prisotnosti 5 μg/mL tetraciklina so s kamero z visoko občutljivostjo zaznali luminiscenco. Po uspešni transformaciji je sledila konjugacija med ''E.coli'' MFDpir in ''D.solani''. Po 48-urni inkubaciji pri 30 °C v prisotnosti 5 μg/mL tetraciklina so s kamero z visoko občutljivostjo zaznali luminiscenco. Potrdili so, da so vsi štirje plazmidi uspešno vstavljeni v ''D.solani'', emisijo luminiscence pa so zaznali le v kolonijah, ki so vsebovale pSEVA521-''fiatlux'' oz. pSEVA531-''fiatlux''. S pektinaznim testom so potrdili, da so kolonije, zaznane po konjugaciji, res ''D.solani'' [1].<br /><br />
Karakterizacija ''fiatlux'' v ''D.solani'' je potekala podobno kot predhodno v ''E.coli''. Kot pri ''E.coli'', so tudi pri ''D.solani'' opazili, da bakterija s pSEVA531-''fiatlux'' emitira prej in več luminiscence kot bakterija s pSEVA521-''fiatlux''. Stabilnost plazmida v ''D.solani'' so preverili tako, da so z merjenjem OD pri 600 nm šteli bakterijske celice, ki so zrasle na gojišču LB in gojišču s 5 μg/mL tetraciklinom. Eksperiment so nastavili tako, da je poteklo devet celičnih celitev ''D.solani'' na dan, izvajali pa so ga tri dni. Po 27 generacijah (celičnih delitvah) je bakterija ohranila plazmid, kar zadostuje, če upoštevamo, da bakterija in situ niti ne doseže toliko generacij [1].<br />
<br />
===''In situ'' opazovanje v rastlinah===<br />
Na koncu so preverili, če njihovo orodje deluje ''in situ'' v rastlinah. Poskus so izvedli na listih cikorije in na gomoljih krompirja [1].<br /><br />
Za infekcijo listov cikorije so uporabili ''D.solani'', transformirano s pSEVA521-''fiatlux'', pSEVA531-''fiatlux'', pSEVA521 oz. pSEVA531. Po 30 in 48 urah so izmerili okuženo površino in opazovali luminiscenco listov. Največ znakov infekcije je kazala ''D.solani'' s pSEVA531 in pSEVA531-''fiatlux''. Poleg tega so zaznali tudi večjo emisijo luminiscence pri infekciji z ''D.solani'' s pSEVA531-''fiatlux'' kot pri pSEVA521-''fiatlux''. Na ta način so potrdili, da je plazmid pSEVA531-''fiatlux'' bolj učinkovit od pSEVA521-''fiatlux'' [1].<br /><br />
Poskus infekcije so izvedli tudi na gomoljih krompirja, vendar so tokrat za infekcijo uporabili le ''D.solani'', transformirano s pSEVA531-''fiatlux'' oz. pSEVA531. Po 24 in 48 urah so gomolje prerezali in ocenili nagnito površino. Infekcija je bila tudi tokrat učinkovita [1].<br />
<br />
==Uporaba orodja==<br />
Rezultati so pokazali, da je orodje FIAT LUX uporabno na primeru bakterije ''D.solani''. Uspešno so transformirali tudi dva druga seva, ''Citrobacter'' ''rodentium'' in ''Pseudomonas'' ''putida'', ki sta prav tako po konjugaciji emitirala luminiscenco. Z dokazom koncepta delovanja bi se orodje torej lahko izkazalo za zelo učinkovito. Po prejemu vzorca okužene rastline bi raziskovalci identificirali fitopatogen in nato spremljali njegovo namnoževanje pod različnimi pogoji z orodjem FIAT LUX. V doglednem času bi lahko predlagali način, ki bi preprečil širjenje patogena ter ga uničil [1].<br />
<br />
==Viri==<br />
[1] FIAT LUX https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/index.html.<br /><br />
[2] C. Gregor, K. C. Gwosch, S. J. Sahl, S. W. Hell: Strongly Enhanced Bacterial Bioluminescence with the Ilux Operon for Single-Cell Imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2018, 115, 962–967.<br /><br />
[3] M. A. Matilla, R. E. Monson, G. P. C. Salmond: Dickeya Solani. Trends Microbiol. 2023, xx, 1–2.</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=FIAT_LUX&diff=21743FIAT LUX2023-04-07T13:41:07Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>FIAT LUX je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2022 pripravila ekipa francoskih dodiplomskih študentov z imenom INSA_LYON1. Na tekmovanju je projekt med projekti dodiplomskih študentov zasedel drugo mesto. Dostopen je na spletnem naslovu https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/.<br />
<br />
==Problem==<br />
Enega glavnih globalnih izzivov 21. stoletja predstavlja oskrba naraščajočega števila svetovnega prebivalstva s hrano. Dodatno breme za kmetijstvo na tem področju predstavlja globalno segrevanje, ki povzroča konstantno zmanjševanje obdelovalnih površin. Posledica globalnega segrevanja je tudi pojav doslej neznanih mikroorganizmov, ki se lahko razmnožujejo v novih, toplejših pogojih in poškodujejo ter tako zmanjšajo pridelek. Za preprečevanje tega problema se trenutno uporabljajo predvsem pesticidi, ki pa imajo negativen učinek na okolje in zdravje ljudi [1].<br /><br />
Skupina INSA_LYON1 je želela ustvariti orodje, s katerim bi lahko na podlagi razumevanja lastnosti posameznega patogena kmetom predlagali način, ki bi širjenje patogena omejil brez uporabe pesticidov, ob tem pa se tudi njihov pridelek ne bi pretirano zmanjšal [1].<br />
<br />
==Cilj projekta==<br />
Ideja je privedla do stvaritve FIAT LUX, biotehnološkega orodja, ki v bakterijah povzroči luminiscenco in tako na neinvaziven način omogoči spremljanje njihovega namnoževanja v rastlini v realnem času. Osredotočili so se predvsem na spremljanje namnoževanja fitopatogene bakterije Dickeya solani, vendar pa je bil njihov cilj ustvariti biosenzor, prilagojen na katerokoli bakterijo. Tako bi lahko novoodkrito fitopatogeno bakterijo transformirali s tem orodjem, z njo v laboratoriju okužili ciljno rastlino in preko konstitutivne luminiscence opazovali njeno namnoževanje v rastlini. S pomočjo matematičnega modela bi lahko predvideli tudi nadaljnje namnoževanje bakterije in tako bolje razumeli ter hitreje odreagirali pri reševanju pridelka [1].<br />
<br />
==Načrt projekta==<br />
Orodje FIAT LUX temelji na ''ilux'' operonu, modificiranem ''lux'' operonu, ki emitira luminiscenco. ''ilux'' operon so si izbrali, saj v primeru izražanja v ''E.coli'' emitira 7-krat intenzivnejšo luminiscenco kot ''lux'' operon. Sestavljen je iz šestih genov (''iluxC'', ''iluxD'', ''iluxA'', ''iluxB'', ''iluxE'' in ''ilux-frp''), od katerih ima vsak specifično vlogo. ''iluxA'' in ''iluxB'' kodirata za luciferazni encimski kompleks, ki katalizira oksidacijo FMNH<sub>2</sub> do FMN in maščobnih aldehidov do maščobnih kislin, kar rezultira v luminiscenci. ''iluxC'', ''iluxD'' in ''iluxE'' tvorijo kompleks, ki reciklira maščobne kisline nazaj do maščobnih aldehidov. ''ilux-frp'' pa je FMN reduktaza, ki reciklira FMN nazaj do FMNH<sub>2</sub>. Emisija luminiscence z ''ilux'' operonom tako lahko poteka neodvisno, če sta le v okolju prisotna molekularni kisik in FMN, kar velja za vse aerobne celice [1, 2].<br /><br />
Svojo nalogo so razdelili na sledeče štiri korake:<br /><br />
1. Izdelava biokock.<br /><br />
2. Karakterizacija FIAT LUX v ''E.coli''.<br /><br />
3. Dokaz koncepta v ''D.solani''.<br /><br />
4. In situ opazovanje v rastlinah.<br />
<br />
==Izvedba projekta==<br />
===Izdelava biokock===<br />
Ker so želeli ''ilux'' operon vstaviti v plazmidno ogrodje, so ga najprej morali prilagoditi iGEM standardom. Le-ti zahtevajo, da sta v plazmidnem ogrodju restrikcijski mesti EcoRI in XbaI pozicionirani navzgor ter restrikcijski mesti SpeI in PstI navzdol od operona. Na ''ilux'' operonu so zato odstranili pet restrikcijskih mest (3-krat PstI, 1-krat EcoRI in 1-krat XbaI) in dobili šest ''ilux'' fragmentov. Ker poskus rekonstrukcije celotnega operona naenkrat ni uspel, so se odločili, da ga sestavijo v dveh delih. Geni ''iluxA'', ''iluxB'' in ''iluxE'' ne vsebujejo restrikcijskih mest, zato so s klasičnim PCR rekonstruirali ''fiatluxABE'' in zaporedje vstavili na ustrezno mesto v plazmidni ogrodji pSB1C3 in pBAD18. ''fiatluxABE'' je bil v pBAD18 pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja pBAD. V vektorju pACYDuet-1 so posebej konstruirali še ''fiatluxCD'' pod kontrolo šibkega konstitutivnega promotorja J23117 [1].<br /><br />
Preden so v plazmidu združili ''fiatluxABE'' in ''fiatluxCD'', so preverili vpliv uvedenih mutacij na emisijo luminiscence. ''E.coli'' DH5α so transformirali z ustvarjenima vektorjema pBAD18-''fiatluxABE'' in pACYDuet-1-''fiatluxCD''. Izkazalo se je, da je emisija luminiscence še vedno prisotna, torej je operon funkcionalen [1].<br /><br />
Želeli so, da je orodje uporabno za čim širši spekter bakterij, zato so ''fiatluxABE'' in J23117-''fiatluxCD'' združili v konjugativnem plazmidu. Uporabili so konjugativna vektorja pSEVA521 in pSEVA531, združevanje je potekalo s HiFi združevanjem. Plazmida so nato ločeno transformirali v ''E.coli'' DH5α [1].<br />
===Karakterizacija FIAT LUX v ''E.coli''===<br />
V naslednjem koraku so določevali optimalno koncentracijo antibiotika tetraciklina v gojišču in optimalno temperaturo, potrebno za shranjevanje transformiranih ''E.coli''. Tako so želeli zagotoviti dolgoročno stabilnost plazmidov. Preverili so vpliv koncentracije tetraciklina in temperature za shranjevanje ''E.coli'', transformirane s pSEVA521-''fiatluxCDABE'', pSEVA531-''fiatluxCDABE'', pSEVA521 oz. pSEVA531 (prazna vektorja). Na LB agar ploščah so primerjali rast transformirane ''E.coli'' pri 37 °C, predhodno shranjene pri –80 °C, 4 °C in sobni temperaturi, ter pri koncentracijah tetraciklina 2, 5 in 10 μg/mL [1].<br /><br />
Bakterija, transformirana s pSEVA521-''fiatluxCDABE'' oz. pSEVA531-''fiatluxCDABE'', shranjena pri temperaturi –80 °C in 4 °C, pri koncentraciji tetraciklina 10 μg/mL ni rastla, medtem ko je pri istih pogojih bakterija, transformirana s praznima vektorjema, rastla. Pri shranjevanju na sobni temperaturi rast bakterije ni bila ovirana s koncentracijo tetraciklina. Opazili so, da bakterija, transformirana s pSEVA521-''fiatluxCDABE'', bolje raste pri koncentracijah tetraciklina 2 in 5 μg/mL, zato so v nadaljevanju v gojišču koncentracijo tetraciklina ohranjali med 2 in 5 μg/mL [1].<br /><br />
Ugotovili so, da izražanje fiatlux pri pSEVA531 zmanjšuje odpornost ''E.coli'' na tetraciklin. Vektorja pSEVA521 in pSEVA531 imata različni mesti začetka podvojevanja. pSEVA521-''fiatluxCDABE'' nosi RK2 ORI, medtem ko pSEVA531-''fiatluxCDABE'' nosi pBBR1 ORI, ki ima višjo stopnjo podvojevanja kot RK2. Možno je torej, da ima pri zmanjšani odpornosti ''E.coli'', transformirane s pSEVA531-''fiatluxCDABE'', na tetraciklin vlogo višja poraba energije pri emisiji luminiscence, posredovani z luciferaznim encimskim kompleksom [1].<br />
===Dokaz koncepta v ''D.solani''===<br />
Koncept delovanja orodja FIAT LUX so pokazali s prenosom plazmidov v fitopatogeno bakterijo ''D.solani'' in sicer v sev divjega tipa ''D.solani'' D s0432-1. ''D.solani'' je bakterija, odgovorna za bolezni številnih kmetijskih in okrasnih rastlin po vsem svetu. Bakterija proizvaja različne encime (pektinaze, celulaze in proteaze), ki razgrajujejo celično steno rastlinskih celic. Iz mrtvih rastlinskih celic nato bakterija pridobiva hranila ter se namnožuje po rastlinskem tkivu. Njena večja agresivnost v zadnjem obdobju je najverjetneje povezana s temperaturnimi spremembami zaradi globalnega segrevanja ozračja [1, 3].<br /><br />
Prenos v bakterijo so pokazali za plazmide pSEVA521-''fiatlux'', pSEVA531-''fiatlux'', pSEVA521 in pSEVA531. Prazna vektorja sta služila kot kontrola. Prenos so izvedli z metodo konjugacije. Najprej so s transformacijo vstavili plazmid v sev ''E.coli'' MFDpir. Po 48-urni inkubaciji pri 37 °C v prisotnosti 5 μg/mL tetraciklina so s kamero z visoko občutljivostjo zaznali luminiscenco. Po uspešni transformaciji je sledila konjugacija med ''E.coli'' MFDpir in ''D.solani''. Po 48-urni inkubaciji pri 30 °C v prisotnosti 5 μg/mL tetraciklina so s kamero z visoko občutljivostjo zaznali luminiscenco. Potrdili so, da so vsi štirje plazmidi uspešno vstavljeni v ''D.solani'', emisijo luminiscence pa so zaznali le v kolonijah, ki so vsebovale pSEVA521-''fiatlux'' oz. pSEVA531-''fiatlux''. S pektinaznim testom so potrdili, da so kolonije, zaznane po konjugaciji, res ''D.solani'' [1].<br /><br />
Karakterizacija ''fiatlux'' v ''D.solani'' je potekala podobno kot predhodno v ''E.coli''. Kot pri ''E.coli'', so tudi pri ''D.solani'' opazili, da bakterija s pSEVA531-''fiatlux'' emitira prej in več luminiscence kot bakterija s pSEVA521-''fiatlux''. Stabilnost plazmida v ''D.solani'' so preverili tako, da so z merjenjem OD pri 600 nm šteli bakterijske celice, ki so zrasle na gojišču LB in gojišču s 5 μg/mL tetraciklinom. Eksperiment so nastavili tako, da je poteklo devet celičnih celitev ''D.solani'' na dan, izvajali pa so ga tri dni. Po 27 generacijah (celičnih delitvah) je bakterija ohranila plazmid, kar zadostuje, če upoštevamo, da bakterija in situ niti ne doseže toliko generacij [1].<br />
===''In situ'' opazovanje v rastlinah===<br />
Na koncu so preverili, če njihovo orodje deluje ''in situ'' v rastlinah. Poskus so izvedli na listih cikorije in na gomoljih krompirja [1].<br /><br />
Za infekcijo listov cikorije so uporabili ''D.solani'', transformirano s pSEVA521-''fiatlux'', pSEVA531-''fiatlux'', pSEVA521 oz. pSEVA531. Po 30 in 48 urah so izmerili okuženo površino in opazovali luminiscenco listov. Največ znakov infekcije je kazala ''D.solani'' s pSEVA531 in pSEVA531-''fiatlux''. Poleg tega so zaznali tudi večjo emisijo luminiscence pri infekciji z ''D.solani'' s pSEVA531-''fiatlux'' kot pri pSEVA521-''fiatlux''. Na ta način so potrdili, da je plazmid pSEVA531-''fiatlux'' bolj učinkovit od pSEVA521-''fiatlux'' [1].<br /><br />
Poskus infekcije so izvedli tudi na gomoljih krompirja, vendar so tokrat za infekcijo uporabili le ''D.solani'', transformirano s pSEVA531-''fiatlux'' oz. pSEVA531. Po 24 in 48 urah so gomolje prerezali in ocenili nagnito površino. Infekcija je bila tudi tokrat učinkovita [1].<br />
==Uporaba orodja==<br />
Rezultati so pokazali, da je orodje FIAT LUX uporabno na primeru bakterije ''D.solani''. Uspešno so transformirali tudi dva druga seva, ''Citrobacter'' ''rodentium'' in ''Pseudomonas'' ''putida'', ki sta prav tako po konjugaciji emitirala luminiscenco. Z dokazom koncepta delovanja bi se orodje torej lahko izkazalo za zelo učinkovito. Po prejemu vzorca okužene rastline bi raziskovalci identificirali fitopatogen in nato spremljali njegovo namnoževanje pod različnimi pogoji z orodjem FIAT LUX. V doglednem času bi lahko predlagali način, ki bi preprečil širjenje patogena ter ga uničil [1].<br />
==Viri==<br />
[1] FIAT LUX https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/index.html.<br /><br />
[2] C. Gregor, K. C. Gwosch, S. J. Sahl, S. W. Hell: Strongly Enhanced Bacterial Bioluminescence with the Ilux Operon for Single-Cell Imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2018, 115, 962–967.<br /><br />
[3] M. A. Matilla, R. E. Monson, G. P. C. Salmond: Dickeya Solani. Trends Microbiol. 2023, xx, 1–2.</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=FIAT_LUX&diff=21742FIAT LUX2023-04-07T13:33:49Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>FIAT LUX je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2022 pripravila ekipa francoskih dodiplomskih študentov z imenom INSA_LYON1. Na tekmovanju je projekt med projekti dodiplomskih študentov zasedel drugo mesto. Dostopen je na spletnem naslovu https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/.<br />
<br />
==Problem==<br />
Enega glavnih globalnih izzivov 21. stoletja predstavlja oskrba naraščajočega števila svetovnega prebivalstva s hrano. Dodatno breme za kmetijstvo na tem področju predstavlja globalno segrevanje, ki povzroča konstantno zmanjševanje obdelovalnih površin. Posledica globalnega segrevanja je tudi pojav doslej neznanih mikroorganizmov, ki se lahko razmnožujejo v novih, toplejših pogojih in poškodujejo ter tako zmanjšajo pridelek. Za preprečevanje tega problema se trenutno uporabljajo predvsem pesticidi, ki pa imajo negativen učinek na okolje in zdravje ljudi [1].<br /><br />
Skupina INSA_LYON1 je želela ustvariti orodje, s katerim bi lahko na podlagi razumevanja lastnosti posameznega patogena kmetom predlagali način, ki bi širjenje patogena omejil brez uporabe pesticidov, ob tem pa se tudi njihov pridelek ne bi pretirano zmanjšal [1].<br />
<br />
==Cilj projekta==<br />
Ideja je privedla do stvaritve FIAT LUX, biotehnološkega orodja, ki v bakterijah povzroči luminiscenco in tako na neinvaziven način omogoči spremljanje njihovega namnoževanja v rastlini v realnem času. Osredotočili so se predvsem na spremljanje namnoževanja fitopatogene bakterije Dickeya solani, vendar pa je bil njihov cilj ustvariti biosenzor, prilagojen na katerokoli bakterijo. Tako bi lahko novoodkrito fitopatogeno bakterijo transformirali s tem orodjem, z njo v laboratoriju okužili ciljno rastlino in preko konstitutivne luminiscence opazovali njeno namnoževanje v rastlini. S pomočjo matematičnega modela bi lahko predvideli tudi nadaljnje namnoževanje bakterije in tako bolje razumeli ter hitreje odreagirali pri reševanju pridelka [1].<br />
<br />
==Načrt projekta==<br />
Orodje FIAT LUX temelji na ''ilux'' operonu, modificiranem ''lux'' operonu, ki emitira luminiscenco. ''ilux'' operon so si izbrali, saj v primeru izražanja v ''E.coli'' emitira 7-krat intenzivnejšo luminiscenco kot ''lux'' operon. Sestavljen je iz šestih genov (''iluxC'', ''iluxD'', ''iluxA'', ''iluxB'', ''iluxE'' in ''ilux-frp''), od katerih ima vsak specifično vlogo. ''iluxA'' in ''iluxB'' kodirata za luciferazni encimski kompleks, ki katalizira oksidacijo FMNH<sub>2</sub> do FMN in maščobnih aldehidov do maščobnih kislin, kar rezultira v luminiscenci. ''iluxC'', ''iluxD'' in ''iluxE'' tvorijo kompleks, ki reciklira maščobne kisline nazaj do maščobnih aldehidov. ''ilux-frp'' pa je FMN reduktaza, ki reciklira FMN nazaj do FMNH<sub>2</sub>. Emisija luminiscence z ''ilux'' operonom tako lahko poteka neodvisno, če sta le v okolju prisotna molekularni kisik in FMN, kar velja za vse aerobne celice [1, 2].<br /><br />
Svojo nalogo so razdelili na sledeče štiri korake:<br /><br />
1. Izdelava biokock.<br /><br />
2. Karakterizacija FIAT LUX v ''E.coli''.<br /><br />
3. Dokaz koncepta v ''D.solani''.<br /><br />
4. In situ opazovanje v rastlinah.<br />
<br />
==Izvedba projekta==<br />
===Izdelava biokock===<br />
Ker so želeli ''ilux'' operon vstaviti v plazmidno ogrodje, so ga najprej morali prilagoditi iGEM standardom. Le-ti zahtevajo, da sta v plazmidnem ogrodju restrikcijski mesti EcoRI in XbaI pozicionirani navzgor ter restrikcijski mesti SpeI in PstI navzdol od operona. Na ''ilux'' operonu so zato odstranili pet restrikcijskih mest (3-krat PstI, 1-krat EcoRI in 1-krat XbaI) in dobili šest ''ilux'' fragmentov. Ker poskus rekonstrukcije celotnega operona naenkrat ni uspel, so se odločili, da ga sestavijo v dveh delih. Geni ''iluxA'', ''iluxB'' in ''iluxE'' ne vsebujejo restrikcijskih mest, zato so s klasičnim PCR rekonstruirali ''fiatluxABE'' in zaporedje vstavili na ustrezno mesto v plazmidni ogrodji pSB1C3 in pBAD18. ''fiatluxABE'' je bil v pBAD18 pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja pBAD. V vektorju pACYDuet-1 so posebej konstruirali še ''fiatluxCD'' pod kontrolo šibkega konstitutivnega promotorja J23117 [1].<br /><br />
Preden so v plazmidu združili ''fiatluxABE'' in ''fiatluxCD'', so preverili vpliv uvedenih mutacij na emisijo luminiscence. ''E.coli'' DH5α so transformirali z ustvarjenima vektorjema pBAD18-''fiatluxABE'' in pACYDuet-1-''fiatluxCD''. Izkazalo se je, da je emisija luminiscence še vedno prisotna, torej je operon funkcionalen [1].<br /><br />
Želeli so, da je orodje uporabno za čim širši spekter bakterij, zato so ''fiatluxABE'' in J23117-''fiatluxCD'' združili v konjugativnem plazmidu. Uporabili so konjugativna vektorja pSEVA521 in pSEVA531, združevanje je potekalo s HiFi združevanjem. Plazmida so nato ločeno transformirali v ''E.coli'' DH5α [1].<br />
===Karakterizacija FIAT LUX v E.coli===<br />
V naslednjem koraku so določevali optimalno koncentracijo antibiotika tetraciklina v gojišču in optimalno temperaturo, potrebno za shranjevanje transformiranih E.coli. Tako so želeli zagotoviti dolgoročno stabilnost plazmidov. Preverili so vpliv koncentracije tetraciklina in temperature za shranjevanje E.coli, transformirane s pSEVA521-fiatluxCDABE, pSEVA531-fiatluxCDABE, pSEVA521 oz. pSEVA531 (prazna vektorja). Na LB agar ploščah so primerjali rast transformirane E.coli pri 37 °C, predhodno shranjene pri –80 °C, 4 °C in sobni temperaturi, ter pri koncentracijah tetraciklina 2, 5 in 10 μg/mL [1].<br /><br />
Bakterija, transformirana s pSEVA521-fiatluxCDABE oz. pSEVA531-fiatluxCDABE, shranjena pri temperaturi –80 °C in 4 °C, pri koncentraciji tetraciklina 10 μg/mL ni rastla, medtem ko je pri istih pogojih bakterija, transformirana s praznima vektorjema, rastla. Pri shranjevanju na sobni temperaturi rast bakterije ni bila ovirana s koncentracijo tetraciklina. Opazili so, da bakterija, transformirana s pSEVA521-fiatluxCDABE, bolje raste pri koncentracijah tetraciklina 2 in 5 μg/mL, zato so v nadaljevanju v gojišču koncentracijo tetraciklina ohranjali med 2 in 5 μg/mL [1].<br /><br />
Ugotovili so, da izražanje fiatlux pri pSEVA531 zmanjšuje odpornost E.coli na tetraciklin. Vektorja pSEVA521 in pSEVA531 imata različni mesti začetka podvojevanja. pSEVA521-fiatluxCDABE nosi RK2 ORI, medtem ko pSEVA531-fiatluxCDABE nosi pBBR1 ORI, ki ima višjo stopnjo podvojevanja kot RK2. Možno je torej, da ima pri zmanjšani odpornosti E.coli, transformirane s pSEVA531-fiatluxCDABE, na tetraciklin vlogo višja poraba energije pri emisiji luminiscence, posredovani z luciferaznim encimskim kompleksom [1].<br />
===Dokaz koncepta v D.solani===<br />
Koncept delovanja orodja FIAT LUX so pokazali s prenosom plazmidov v fitopatogeno bakterijo D.solani in sicer v sev divjega tipa D.solani D s0432-1. D.solani je bakterija, odgovorna za bolezni številnih kmetijskih in okrasnih rastlin po vsem svetu. Bakterija proizvaja različne encime (pektinaze, celulaze in proteaze), ki razgrajujejo celično steno rastlinskih celic. Iz mrtvih rastlinskih celic nato bakterija pridobiva hranila ter se namnožuje po rastlinskem tkivu. Njena večja agresivnost v zadnjem obdobju je najverjetneje povezana s temperaturnimi spremembami zaradi globalnega segrevanja ozračja [1, 3].<br /><br />
Prenos v bakterijo so pokazali za plazmide pSEVA521-fiatlux, pSEVA531-fiatlux, pSEVA521 in pSEVA531. Prazna vektorja sta služila kot kontrola. Prenos so izvedli z metodo konjugacije. Najprej so s transformacijo vstavili plazmid v sev E.coli MFDpir. Po 48-urni inkubaciji pri 37 °C v prisotnosti 5 μg/mL tetraciklina so s kamero z visoko občutljivostjo zaznali luminiscenco. Po uspešni transformaciji je sledila konjugacija med E.coli MFDpir in D.solani. Po 48-urni inkubaciji pri 30 °C v prisotnosti 5 μg/mL tetraciklina so s kamero z visoko občutljivostjo zaznali luminiscenco. Potrdili so, da so vsi štirje plazmidi uspešno vstavljeni v D.solani, emisijo luminiscence pa so zaznali le v kolonijah, ki so vsebovale pSEVA521-fiatlux oz. pSEVA531-fiatlux. S pektinaznim testom so potrdili, da so kolonije, zaznane po konjugaciji, res D.solani [1].<br /><br />
Karakterizacija fiatlux v D.solani je potekala podobno kot predhodno v E.coli. Kot pri E.coli, so tudi pri D.solani opazili, da bakterija s pSEVA531-fiatlux emitira prej in več luminiscence kot bakterija s pSEVA521-fiatlux. Stabilnost plazmida v D.solani so preverili tako, da so z merjenjem OD pri 600 nm šteli bakterijske celice, ki so zrasle na gojišču LB in gojišču s 5 μg/mL tetraciklinom. Eksperiment so nastavili tako, da je poteklo devet celičnih celitev D.solani na dan, izvajali pa so ga tri dni. Po 27 generacijah (celičnih delitvah) je bakterija ohranila plazmid, kar zadostuje, če upoštevamo, da bakterija in situ niti ne doseže toliko generacij [1].<br />
===In situ opazovanje v rastlinah===<br />
Na koncu so preverili, če njihovo orodje deluje in situ v rastlinah. Poskus so izvedli na listih cikorije in na gomoljih krompirja [1].<br /><br />
Za infekcijo listov cikorije so uporabili D.solani, transformirano s pSEVA521-fiatlux, pSEVA531-fiatlux, pSEVA521 oz. pSEVA531. Po 30 in 48 urah so izmerili okuženo površino in opazovali luminiscenco listov. Največ znakov infekcije je kazala D.solani s pSEVA531 in pSEVA531-fiatlux. Poleg tega so zaznali tudi večjo emisijo luminiscence pri infekciji z D.solani s pSEVA531-fiatlux kot pri pSEVA521-fiatlux. Na ta način so potrdili, da je plazmid pSEVA531-fiatlux bolj učinkovit od pSEVA521-fiatlux [1].<br /><br />
Poskus infekcije so izvedli tudi na gomoljih krompirja, vendar so tokrat za infekcijo uporabili le D.solani, transformirano s pSEVA531-fiatlux oz. pSEVA531. Po 24 in 48 urah so gomolje prerezali in ocenili nagnito površino. Infekcija je bila tudi tokrat učinkovita [1].<br />
==Uporaba orodja==<br />
Rezultati so pokazali, da je orodje FIAT LUX uporabno na primeru bakterije D.solani. Uspešno so transformirali tudi dva druga seva, Citrobacter rodentium in Pseudomonas putida, ki sta prav tako po konjugaciji emitirala luminiscenco. Z dokazom koncepta delovanja bi se orodje torej lahko izkazalo za zelo učinkovito. Po prejemu vzorca okužene rastline bi raziskovalci identificirali fitopatogen in nato spremljali njegovo namnoževanje pod različnimi pogoji z orodjem FIAT LUX. V doglednem času bi lahko predlagali način, ki bi preprečil širjenje patogena ter ga uničil [1].<br />
==Viri==<br />
[1] FIAT LUX https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/index.html.<br /><br />
[2] C. Gregor, K. C. Gwosch, S. J. Sahl, S. W. Hell: Strongly Enhanced Bacterial Bioluminescence with the Ilux Operon for Single-Cell Imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2018, 115, 962–967.<br /><br />
[3] M. A. Matilla, R. E. Monson, G. P. C. Salmond: Dickeya Solani. Trends Microbiol. 2023, xx, 1–2.</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=FIAT_LUX&diff=21741FIAT LUX2023-04-07T13:20:50Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>FIAT LUX je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2022 pripravila ekipa francoskih dodiplomskih študentov z imenom INSA_LYON1. Na tekmovanju je projekt med projekti dodiplomskih študentov zasedel drugo mesto. Dostopen je na spletnem naslovu https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/.<br />
<br />
Problem<br />
Enega glavnih globalnih izzivov 21. stoletja predstavlja oskrba naraščajočega števila svetovnega prebivalstva s hrano. Dodatno breme za kmetijstvo na tem področju predstavlja globalno segrevanje, ki povzroča konstantno zmanjševanje obdelovalnih površin. Posledica globalnega segrevanja je tudi pojav doslej neznanih mikroorganizmov, ki se lahko razmnožujejo v novih, toplejših pogojih in poškodujejo ter tako zmanjšajo pridelek. Za preprečevanje tega problema se trenutno uporabljajo predvsem pesticidi, ki pa imajo negativen učinek na okolje in zdravje ljudi [1].<br />
Skupina INSA_LYON1 je želela ustvariti orodje, s katerim bi lahko na podlagi razumevanja lastnosti posameznega patogena kmetom predlagali način, ki bi širjenje patogena omejil brez uporabe pesticidov, ob tem pa se tudi njihov pridelek ne bi pretirano zmanjšal [1].<br />
<br />
Cilj projekta<br />
Ideja je privedla do stvaritve FIAT LUX, biotehnološkega orodja, ki v bakterijah povzroči luminiscenco in tako na neinvaziven način omogoči spremljanje njihovega namnoževanja v rastlini v realnem času. Osredotočili so se predvsem na spremljanje namnoževanja fitopatogene bakterije Dickeya solani, vendar pa je bil njihov cilj ustvariti biosenzor, prilagojen na katerokoli bakterijo. Tako bi lahko novoodkrito fitopatogeno bakterijo transformirali s tem orodjem, z njo v laboratoriju okužili ciljno rastlino in preko konstitutivne luminiscence opazovali njeno namnoževanje v rastlini. S pomočjo matematičnega modela bi lahko predvideli tudi nadaljnje namnoževanje bakterije in tako bolje razumeli ter hitreje odreagirali pri reševanju pridelka [1].<br />
<br />
Načrt projekta<br />
Orodje FIAT LUX temelji na ilux operonu, modificiranem lux operonu, ki emitira luminiscenco. ilux operon so si izbrali, saj v primeru izražanja v E.coli emitira 7-krat intenzivnejšo luminiscenco kot lux operon. Sestavljen je iz šestih genov (iluxC, iluxD, iluxA, iluxB, iluxE in ilux-frp), od katerih ima vsak specifično vlogo. iluxA in iluxB kodirata za luciferazni encimski kompleks, ki katalizira oksidacijo FMNH2 do FMN in maščobnih aldehidov do maščobnih kislin, kar rezultira v luminiscenci. iluxC, iluxD in iluxE tvorijo kompleks, ki reciklira maščobne kisline nazaj do maščobnih aldehidov. ilux-frp pa je FMN reduktaza, ki reciklira FMN nazaj do FMNH2. Emisija luminiscence z ilux operonom tako lahko poteka neodvisno, če sta le v okolju prisotna molekularni kisik in FMN, kar velja za vse aerobne celice [1, 2].<br />
Svojo nalogo so razdelili na sledeče štiri korake:<br />
1. Izdelava biokock.<br />
2. Karakterizacija FIAT LUX v E.coli.<br />
3. Dokaz koncepta v D.solani.<br />
4. In situ opazovanje v rastlinah.<br />
<br />
Izvedba projekta<br />
Izdelava biokock<br />
Ker so želeli ilux operon vstaviti v plazmidno ogrodje, so ga najprej morali prilagoditi iGEM standardom. Le-ti zahtevajo, da sta v plazmidnem ogrodju restrikcijski mesti EcoRI in XbaI pozicionirani navzgor ter restrikcijski mesti SpeI in PstI navzdol od operona. Na ilux operonu so zato odstranili pet restrikcijskih mest (3-krat PstI, 1-krat EcoRI in 1-krat XbaI) in dobili šest ilux fragmenotv. Ker poskus rekonstrukcije celotnega operona naenkrat ni uspel, so se odločili, da ga sestavijo v dveh delih. Geni iluxA, iluxB in iluxE ne vsebujejo restrikcijskih mest, zato so s klasičnim PCR rekonstruirali fiatluxABE in zaporedje vstavili na ustrezno mesto v plazmidni ogrodji pSB1C3 in pBAD18. fiatluxABE je bil v pBAD18 pod kontrolo arabinoznega inducibilnega promotorja pBAD. V vektorju pACYDuet-1 so posebej konstruirali še fiatluxCD pod kontrolo šibkega konstitutivnega promotorja J23117 [1].<br />
Preden so v plazmidu združili fiatluxABE in fiatluxCD, so preverili vpliv uvedenih mutacij na emisijo luminiscence. E.coli DH5α so transformirali z ustvarjenima vektorjema pBAD18-fiatluxABE in pACYDuet-1-fiatluxCD. Izkazalo se je, da je emisija luminiscence še vedno prisotna, torej je operon funkcionalen [1].<br />
Želeli so, da je orodje uporabno za čim širši spekter bakterij, zato so fiatluxABE in J23117-fiatluxCD združili v konjugativnem plazmidu. Uporabili so konjugativna vektorja pSEVA521 in pSEVA531, združevanje je potekalo s HiFi združevanjem. Plazmida so nato ločeno transformirali v E.coli DH5α [1].<br />
Karakterizacija FIAT LUX v E.coli<br />
V naslednjem koraku so določevali optimalno koncentracijo antibiotika tetraciklina v gojišču in optimalno temperaturo, potrebno za shranjevanje transformiranih E.coli. Tako so želeli zagotoviti dolgoročno stabilnost plazmidov. Preverili so vpliv koncentracije tetraciklina in temperature za shranjevanje E.coli, transformirane s pSEVA521-fiatluxCDABE, pSEVA531-fiatluxCDABE, pSEVA521 oz. pSEVA531 (prazna vektorja). Na LB agar ploščah so primerjali rast transformirane E.coli pri 37 °C, predhodno shranjene pri –80 °C, 4 °C in sobni temperaturi, ter pri koncentracijah tetraciklina 2, 5 in 10 μg/mL [1].<br />
Bakterija, transformirana s pSEVA521-fiatluxCDABE oz. pSEVA531-fiatluxCDABE, shranjena pri temperaturi –80 °C in 4 °C, pri koncentraciji tetraciklina 10 μg/mL ni rastla, medtem ko je pri istih pogojih bakterija, transformirana s praznima vektorjema, rastla. Pri shranjevanju na sobni temperaturi rast bakterije ni bila ovirana s koncentracijo tetraciklina. Opazili so, da bakterija, transformirana s pSEVA521-fiatluxCDABE, bolje raste pri koncentracijah tetraciklina 2 in 5 μg/mL, zato so v nadaljevanju v gojišču koncentracijo tetraciklina ohranjali med 2 in 5 μg/mL [1].<br />
Ugotovili so, da izražanje fiatlux pri pSEVA531 zmanjšuje odpornost E.coli na tetraciklin. Vektorja pSEVA521 in pSEVA531 imata različni mesti začetka podvojevanja. pSEVA521-fiatluxCDABE nosi RK2 ORI, medtem ko pSEVA531-fiatluxCDABE nosi pBBR1 ORI, ki ima višjo stopnjo podvojevanja kot RK2. Možno je torej, da ima pri zmanjšani odpornosti E.coli, transformirane s pSEVA531-fiatluxCDABE, na tetraciklin vlogo višja poraba energije pri emisiji luminiscence, posredovani z luciferaznim encimskim kompleksom [1].<br />
Dokaz koncepta v D.solani<br />
Koncept delovanja orodja FIAT LUX so pokazali s prenosom plazmidov v fitopatogeno bakterijo D.solani in sicer v sev divjega tipa D.solani D s0432-1. D.solani je bakterija, odgovorna za bolezni številnih kmetijskih in okrasnih rastlin po vsem svetu. Bakterija proizvaja različne encime (pektinaze, celulaze in proteaze), ki razgrajujejo celično steno rastlinskih celic. Iz mrtvih rastlinskih celic nato bakterija pridobiva hranila ter se namnožuje po rastlinskem tkivu. Njena večja agresivnost v zadnjem obdobju je najverjetneje povezana s temperaturnimi spremembami zaradi globalnega segrevanja ozračja [1, 3].<br />
Prenos v bakterijo so pokazali za plazmide pSEVA521-fiatlux, pSEVA531-fiatlux, pSEVA521 in pSEVA531. Prazna vektorja sta služila kot kontrola. Prenos so izvedli z metodo konjugacije. Najprej so s transformacijo vstavili plazmid v sev E.coli MFDpir. Po 48-urni inkubaciji pri 37 °C v prisotnosti 5 μg/mL tetraciklina so s kamero z visoko občutljivostjo zaznali luminiscenco. Po uspešni transformaciji je sledila konjugacija med E.coli MFDpir in D.solani. Po 48-urni inkubaciji pri 30 °C v prisotnosti 5 μg/mL tetraciklina so s kamero z visoko občutljivostjo zaznali luminiscenco. Potrdili so, da so vsi štirje plazmidi uspešno vstavljeni v D.solani, emisijo luminiscence pa so zaznali le v kolonijah, ki so vsebovale pSEVA521-fiatlux oz. pSEVA531-fiatlux. S pektinaznim testom so potrdili, da so kolonije, zaznane po konjugaciji, res D.solani [1].<br />
Karakterizacija fiatlux v D.solani je potekala podobno kot predhodno v E.coli. Kot pri E.coli, so tudi pri D.solani opazili, da bakterija s pSEVA531-fiatlux emitira prej in več luminiscence kot bakterija s pSEVA521-fiatlux. Stabilnost plazmida v D.solani so preverili tako, da so z merjenjem OD pri 600 nm šteli bakterijske celice, ki so zrasle na gojišču LB in gojišču s 5 μg/mL tetraciklinom. Eksperiment so nastavili tako, da je poteklo devet celičnih celitev D.solani na dan, izvajali pa so ga tri dni. Po 27 generacijah (celičnih delitvah) je bakterija ohranila plazmid, kar zadostuje, če upoštevamo, da bakterija in situ niti ne doseže toliko generacij [1].<br />
In situ opazovanje v rastlinah<br />
Na koncu so preverili, če njihovo orodje deluje in situ v rastlinah. Poskus so izvedli na listih cikorije in na gomoljih krompirja [1].<br />
Za infekcijo listov cikorije so uporabili D.solani, transformirano s pSEVA521-fiatlux, pSEVA531-fiatlux, pSEVA521 oz. pSEVA531. Po 30 in 48 urah so izmerili okuženo površino in opazovali luminiscenco listov. Največ znakov infekcije je kazala D.solani s pSEVA531 in pSEVA531-fiatlux. Poleg tega so zaznali tudi večjo emisijo luminiscence pri infekciji z D.solani s pSEVA531-fiatlux kot pri pSEVA521-fiatlux. Na ta način so potrdili, da je plazmid pSEVA531-fiatlux bolj učinkovit od pSEVA521-fiatlux [1].<br />
Poskus infekcije so izvedli tudi na gomoljih krompirja, vendar so tokrat za infekcijo uporabili le D.solani, transformirano s pSEVA531-fiatlux oz. pSEVA531. Po 24 in 48 urah so gomolje prerezali in ocenili nagnito površino. Infekcija je bila tudi tokrat učinkovita [1].<br />
Uporaba orodja<br />
Rezultati so pokazali, da je orodje FIAT LUX uporabno na primeru bakterije D.solani. Uspešno so transformirali tudi dva druga seva, Citrobacter rodentium in Pseudomonas putida, ki sta prav tako po konjugaciji emitirala luminiscenco. Z dokazom koncepta delovanja bi se orodje torej lahko izkazalo za zelo učinkovito. Po prejemu vzorca okužene rastline bi raziskovalci identificirali fitopatogen in nato spremljali njegovo namnoževanje pod različnimi pogoji z orodjem FIAT LUX. V doglednem času bi lahko predlagali način, ki bi preprečil širjenje patogena ter ga uničil [1].<br />
Viri<br />
[1] FIAT LUX https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/index.html.<br />
[2] C. Gregor, K. C. Gwosch, S. J. Sahl, S. W. Hell: Strongly Enhanced Bacterial Bioluminescence with the Ilux Operon for Single-Cell Imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2018, 115, 962–967.<br />
[3] M. A. Matilla, R. E. Monson, G. P. C. Salmond: Dickeya Solani. Trends Microbiol. 2023, xx, 1–2.</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2022/23&diff=21740Seminarji SB 2022/232023-04-07T13:18:52Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br />
<br />
RAZISKOVALNI ČLANKI<br />
<br />
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br><br />
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)<br />
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)<br />
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)<br />
<br />
NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br />
<br />
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br />
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)<br />
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)<br />
<br />
<br />
----<br />
<br />
Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br />
<br />
Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br />
<br />
Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=FIATLUX&diff=21739FIATLUX2023-04-05T18:37:22Z<p>Neža Lanišek: FIATLUX moved to FIAT LUX over redirect</p>
<hr />
<div>#REDIRECT [[FIAT LUX]]</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=FIAT_LUX&diff=21738FIAT LUX2023-04-05T18:37:22Z<p>Neža Lanišek: FIATLUX moved to FIAT LUX over redirect</p>
<hr />
<div>FIAT LUX je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2022 pripravila francoska ekipa dodiplomskih študentov z imenom INSA_LYON1. Na tekmovanju je projekt med projekti dodiplomskih študentov zasedel drugo mesto. Dostopen je na spletnem naslovu https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/.</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=FIAT_LUX&diff=21736FIAT LUX2023-04-05T18:37:15Z<p>Neža Lanišek: FIAT LUX moved to FIATLUX over redirect</p>
<hr />
<div>FIAT LUX je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2022 pripravila francoska ekipa dodiplomskih študentov z imenom INSA_LYON1. Na tekmovanju je projekt med projekti dodiplomskih študentov zasedel drugo mesto. Dostopen je na spletnem naslovu https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/.</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2022/23&diff=21735Seminarji SB 2022/232023-04-05T18:36:17Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br />
<br />
RAZISKOVALNI ČLANKI<br />
<br />
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br><br />
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)<br />
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)<br />
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)<br />
<br />
NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br />
<br />
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br />
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)<br />
#<br />
<br />
<br />
----<br />
<br />
Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br />
<br />
Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br />
<br />
Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2022/23&diff=21734Seminarji SB 2022/232023-04-05T18:35:47Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br />
<br />
RAZISKOVALNI ČLANKI<br />
<br />
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br><br />
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)<br />
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)<br />
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)<br />
<br />
NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br />
<br />
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br />
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)<br />
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)<br />
<br />
<br />
----<br />
<br />
Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br />
<br />
Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br />
<br />
Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2022/23&diff=21733Seminarji SB 2022/232023-04-05T18:34:19Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br />
<br />
RAZISKOVALNI ČLANKI<br />
<br />
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br><br />
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)<br />
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)<br />
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)<br />
<br />
NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br />
<br />
(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br />
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)<br />
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX] (Neža Lanišek)<br />
<br />
<br />
----<br />
<br />
Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br />
<br />
Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br />
<br />
Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=FIAT_LUX&diff=21731FIAT LUX2023-04-05T18:33:52Z<p>Neža Lanišek: FIATLUX moved to FIAT LUX over redirect</p>
<hr />
<div>FIAT LUX je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2022 pripravila francoska ekipa dodiplomskih študentov z imenom INSA_LYON1. Na tekmovanju je projekt med projekti dodiplomskih študentov zasedel drugo mesto. Dostopen je na spletnem naslovu https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/.</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=FIAT_LUX&diff=21729FIAT LUX2023-04-05T18:33:40Z<p>Neža Lanišek: FIAT LUX moved to FIATLUX</p>
<hr />
<div>FIAT LUX je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2022 pripravila francoska ekipa dodiplomskih študentov z imenom INSA_LYON1. Na tekmovanju je projekt med projekti dodiplomskih študentov zasedel drugo mesto. Dostopen je na spletnem naslovu https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/.</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=FIAT_LUX&diff=21728FIAT LUX2023-04-05T18:25:52Z<p>Neža Lanišek: New page: FIAT LUX je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2022 pripravila francoska ekipa dodiplomskih študentov z imenom INSA_LYON1. Na tekmovanju je projekt med projekti dodiplomskih ...</p>
<hr />
<div>FIAT LUX je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2022 pripravila francoska ekipa dodiplomskih študentov z imenom INSA_LYON1. Na tekmovanju je projekt med projekti dodiplomskih študentov zasedel drugo mesto. Dostopen je na spletnem naslovu https://2022.igem.wiki/insa-lyon1/.</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Retrotranspozoni_LINE-1_in_dejavniki,_ki_uravnavajo_njihovo_delovanje&diff=20298Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje2022-04-24T10:54:35Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>==Uvod==<br />
LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.<br />
<br />
Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.<br />
<br />
'''Mehanizem retrotranspozicije LINE-1'''<br />
<br />
Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu "na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije" (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.<br />
<br />
'''Regulacija aktivnosti LINE-1'''<br />
<br />
Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.<br />
<br />
==Regulacija LINE-1 na predimplantacijski stopnji==<br />
Na predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 na tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.<br />
<br />
Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA na predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena na stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže na stopnji osemceličnega zarodka.<br />
<br />
Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je na predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.<br />
<br />
Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.<br />
<br />
N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.<br />
<br />
Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).<br />
<br />
==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah==<br />
Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo. <br />
<br />
Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi regulatorna pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh se izražajo štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), samo tri Piwi proteine pa so identificirali pri miših (Miwi, Mili in Miwi2) in pri ''Drosophila melanogaster'' (Piwi, Aub in Ago3). piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 RNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Poleg tega lahko kompleks piRNA-Piwi reprimira aktivnost L1 tudi preko posredovanja pri de novo metilaciji DNA ter pri modifikaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Ni pa še bolj podrobno raziskano, kakšna je točna vloga piRNA-Piwi pri teh dveh procesih.<br />
<br />
Mehanizem direktne interakcije piRNA-Piwi z L1 mRNA je bil študiran na vinskih mušicah. Ključni sta bili opažanji, da (i) Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 RNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil in (ii) Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Po prepisu zaporedij za piRNA vsebuje RNA transkript zapise za več različnih piRNA hkrati. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' mestu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki se veže na Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.<br />
<br />
Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na post-transkripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi regulatorna pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT. <br />
<br />
==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka==<br />
Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji. <br />
<br />
Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MeCP2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). Domneva se, da je dvojna vloga YY1 regulirana bodisi s posttranslacijskimi modifikacijami proteina (acetilacija) bodisi preko interakcij z različnimi kofaktorji. Ko YY1 deluje kot represor L1, se veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz.<br />
<br />
==Regulacija LINE-1 v somatskih celicah==<br />
V večini somatskih celicah organizma je L1 repremiran in njegova aktivacija je po navadi povezana z različnimi patologijami (rak, nevropsihiatrične in avtoimune bolezni) ali starostnimi spremembami. Izjema je možgansko tkivo, kjer je L1 aktiven v nevronih in glijah. <br />
<br />
L1 je v glavnem repremiran z metilacijo DNA in specifičnimi modifikacijami histona, kar zmanjša dostopnost kromatina v L1 regijah somatskega tkiva. Proteini iz družine sirtuinov so povezani z mnogimi celičnimi procesi (popravljanje DNA, uravnavanje dolžine telomer, anti-vnetni procesi ...) in ena izmed funkcij proteina SIRT6 je tudi zaviranje L1. To se dogaja preko dveh poti. V prvi pride do mono-ADP ribozilacije faktorja KAP1, kar stimulira tvorbo heterokromatina, v drugi pa prihaja do interakcije SIRT6 s transkripcijskim faktorjem MePC2, ki je vključen v proces metilacije L1 promotorske regije.<br />
<br />
Posttranskripcijsko se L1 v somatskih celicah specifično inhibira preko RNA interference z miR-128, ki skupaj z Ago proteinom tvori RISC kompleks. Možna mehanizma sta dva; miR-128 se lahko direktno veže na ORF2 regijo L1 mRNA, lahko pa inhibira celične faktorje, ki omogočijo transport L1 RNP iz citoplazme v jedro – transportin-1 (TNPO1) in hnRNPA1. Obstaja tudi alternativen mehanizem, v katerem RISC kompleks neposredno prepozna lasnično zanko pre-miRNA v 5'UTR regiji L1 transkripta in jo prereže, kar prepreči njegovo nadaljnje zorenje. V inhibicijo L1 so vključeni tudi drugi nuklearni ribonukleoproteini (R, Q, L), a njihov mehanizem inhibicije še ni raziskan. <br />
<br />
L1 inhibirajo protivirusni faktorji. Ti se aktivirajo ob prisotnosti virusnih nukleinskih kislin in ob prisotnosti retrotranspozonov. Študije so pokazale, da L1 mRNA sproži imunski odziv in poveča nivo interferona β. INFB inducira encim RNazo L, le-ta pa cepi RNA in posledično vodi v pomembno znižanje ORF1 in ORF2 L1 proteinov. Močan inhibitor L1 je tudi MOV10 helikaza RNA. Mehanizem te helikaze ni popolnoma znan, znano pa je, da MOV10 z drugimi protivirusnimi proteini tvori kompleks, ki v interakciji z L1 transkripti tvori stresne granule, ki se potem nadaljnje razgradijo. Protein SAMHD1 (''SAM domain and HD domain-containing protein 1'') inhibira reverzno transkripcijo L1 z vezavo na ORF2 in zmanjša izražanje ORF2 proteinov. Družina proteinov APOBEC3 je ena prvih odkritih celičnih obrambnih sistemov proti nekontroliranem širjenju L1 in je prisotna zgolj pri človeku. Dogaja se na posttranskripcijskem nivoju preko deaminacijsko odvisnega ali neodvisnega mehanizma. Za L1 najbolj aktiven encim hA3A z deaminazno aktivnostjo pretvarja citozin v uracil v prvi verigi L1 cDNA transkripta. hA3C ali hA3DE delujeta po neodvisnem mehanizmu in blokirata reverzno transkripcijo L1 z interakcijo z L1 kompleksom RNP in ORF1 v celični citoplazmi. <br />
<br />
V zadnji fazi retrotranspozicije oz. v integraciji v genom, inhibicija poteka preko proteinov, ki s svojim delovanjem popravljajo prekinitve enojne in dvojno zvite molekule DNA. K inhibiciji L1 veliko prispevajo faktorji, ki sodelujejo v postreplikativnih modifikacijah DNA (npr. encim ATM, ki ob poškodovanju DNA aktivira različne faktorje in komplekse, kateri popravljajo DNA – deficit ATM ali njemu podobnih proteinov vodi v povišano aktivnost L1).<br />
V regulacijo L1 so vključeni faktorji celičnega cikla. Na 5'UTR promoter L1 se lahko veže transkripcijski faktor p53. Ta povzroči inhibitorne posttranslacijske modifikacije na N-koncih aminokislinskih ostankov histona. Inhibicijsko delujeta tudi faktorja p21 in p27 (Vezava na ORF2, preprečitev integracije). <br />
<br />
Retrotranspozicijo L1 promovira histonska demetilaza KDM4B, ki promovira demetilacijo H3K9me3 histonov, njena aktivnost pa je povečana v različnih tipih raka. Pozitivno regulacijo L1 povzroča transkripcijski faktor RUNX3 (''runt-domain transcription factor''), ki se veže na regijo 5'UTR. Omeniti je potrebno tudi transkripcijski faktor FOXA1, ki je aktiven pri raku. Delovanje FOXA1 na L1 so opazili pri celičnem staranju – večje izražanje imunskih faktorjev, ki ga ne spremlja repremija L1 - in aktivacija L1 skupaj s prisotnim vnetjem je dober pokazatelj staranja. Spreminjanje regulacije L1 je torej potencialna tarča zdravljenja s starostjo povezanih bolezni.<br />
<br />
==Viri==<br />
[1] Protasova, Maria Sergeevna, Tatiana Vladimirovna Andreeva, and Evgeny Ivanovich Rogaev. “Factors Regulating the Activity of LINE1 Retrotransposons.” Genes 12, no. 10 (2021): 1562. https://doi.org/10.3390/genes12101562.<br />
<br />
[2] Wu, You, Wenqiang Liu, Jiayu Chen, Shuaitong Liu, Mingzhu Wang, Lei Yang, Chuan Chen, et al. “Nuclear Exosome Targeting Complex Core Factor ZCCHC8 Regulates the Degradation of line1 RNA in Early Embryos and Embryonic Stem Cells.” Cell Reports 29, no. 8 (2019). https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.10.055.<br />
<br />
[3] Brennecke, Julius, Alexei A. Aravin, Alexander Stark, Monica Dus, Manolis Kellis, Ravi Sachidanandam, and Gregory J. Hannon. “Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in Drosophila.” Cell 128, no. 6 (2007): 1089–1103. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.01.043.<br />
<br />
[4] Verheul, Thijs C., Levi van Hijfte, Elena Perenthaler, and Tahsin Stefan Barakat. “The Why of YY1: Mechanisms of Transcriptional Regulation by Yin Yang 1.” Frontiers in Cell and Developmental Biology 8 (2020). https://doi.org/10.3389/fcell.2020.592164.<br />
<br />
<br />
[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Retrotranspozoni_LINE-1_in_dejavniki,_ki_uravnavajo_njihovo_delovanje&diff=20297Talk:Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje2022-04-24T10:54:05Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>Neža Lanišek: Uvod in Regulacija LINE-1 na predimplantacijski stopnji<br />
<br />
Ana Marija Kodra: Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah in Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka<br />
<br />
Gašper Možina: Regulacija LINE-1 v somatskih celicah</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Retrotranspozoni_LINE-1_in_dejavniki,_ki_uravnavajo_njihovo_delovanje&diff=20296Talk:Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje2022-04-24T10:53:31Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>Neža Lanišek: Uvod, Regulacija LINE-1 na predimplantacijski stopnji<br />
<br />
Ana Marija Kodra: Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah, Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka<br />
<br />
Gašper Možina: Regulacija LINE-1 v somatskih celicah</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Retrotranspozoni_LINE-1_in_dejavniki,_ki_uravnavajo_njihovo_delovanje&diff=20286Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje2022-04-24T09:37:01Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>==Uvod==<br />
LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.<br />
<br />
Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.<br />
<br />
'''Mehanizem retrotranspozicije LINE-1'''<br />
<br />
Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu "na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije" (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.<br />
<br />
'''Regulacija aktivnosti LINE-1'''<br />
<br />
Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.<br />
<br />
==Regulacija LINE-1 na predimplantacijski stopnji==<br />
Na predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 na tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.<br />
<br />
Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA na predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena na stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže na stopnji osemceličnega zarodka.<br />
<br />
Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je na predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.<br />
<br />
Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.<br />
<br />
N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.<br />
<br />
Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).<br />
<br />
==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah==<br />
Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo. <br />
<br />
Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi regulatorna pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh se izražajo štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), samo tri Piwi proteine pa so identificirali pri miših (Miwi, Mili in Miwi2) in pri ''Drosophila melanogaster'' (Piwi, Aub in Ago3). piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 RNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Poleg tega lahko kompleks piRNA-Piwi reprimira aktivnost L1 tudi preko posredovanja pri de novo metilaciji DNA ter pri modifikaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Ni pa še bolj podrobno raziskano, kakšna je točna vloga piRNA-Piwi pri teh dveh procesih.<br />
<br />
Mehanizem direktne interakcije piRNA-Piwi z L1 mRNA je bil študiran na vinskih mušicah. Ključni sta bili opažanji, da (i) Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 RNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil in (ii) Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Po prepisu zaporedij za piRNA vsebuje RNA transkript zapise za več različnih piRNA hkrati. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' mestu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki se veže na Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.<br />
<br />
Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na post-transkripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi regulatorna pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT. <br />
<br />
==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka==<br />
Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji. <br />
<br />
Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MeCP2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). Domneva se, da je dvojna vloga YY1 regulirana bodisi s posttranslacijskimi modifikacijami proteina (acetilacija) bodisi preko interakcij z različnimi kofaktorji. Ko YY1 deluje kot represor L1, se veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz.<br />
<br />
==Viri==<br />
[1] Protasova, Maria Sergeevna, Tatiana Vladimirovna Andreeva, and Evgeny Ivanovich Rogaev. “Factors Regulating the Activity of LINE1 Retrotransposons.” Genes 12, no. 10 (2021): 1562. https://doi.org/10.3390/genes12101562.<br />
<br />
[2] Wu, You, Wenqiang Liu, Jiayu Chen, Shuaitong Liu, Mingzhu Wang, Lei Yang, Chuan Chen, et al. “Nuclear Exosome Targeting Complex Core Factor ZCCHC8 Regulates the Degradation of line1 RNA in Early Embryos and Embryonic Stem Cells.” Cell Reports 29, no. 8 (2019). https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.10.055.<br />
<br />
[3] Brennecke, Julius, Alexei A. Aravin, Alexander Stark, Monica Dus, Manolis Kellis, Ravi Sachidanandam, and Gregory J. Hannon. “Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in Drosophila.” Cell 128, no. 6 (2007): 1089–1103. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.01.043.<br />
<br />
[4] Verheul, Thijs C., Levi van Hijfte, Elena Perenthaler, and Tahsin Stefan Barakat. “The Why of YY1: Mechanisms of Transcriptional Regulation by Yin Yang 1.” Frontiers in Cell and Developmental Biology 8 (2020). https://doi.org/10.3389/fcell.2020.592164.<br />
<br />
<br />
[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Retrotranspozoni_LINE-1_in_dejavniki,_ki_uravnavajo_njihovo_delovanje&diff=20285Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje2022-04-24T09:26:01Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>==Uvod==<br />
LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.<br />
<br />
Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.<br />
<br />
'''Mehanizem retrotranspozicije LINE-1'''<br />
<br />
Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu "na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije" (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.<br />
<br />
'''Regulacija aktivnosti LINE-1'''<br />
<br />
Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.<br />
<br />
==Regulacija LINE-1 na predimplantacijski stopnji==<br />
Na predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 na tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.<br />
<br />
Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA na predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena na stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže na stopnji osemceličnega zarodka.<br />
<br />
Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je na predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.<br />
<br />
Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.<br />
<br />
N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.<br />
<br />
Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).<br />
<br />
==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah==<br />
Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo. <br />
<br />
Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi regulatorna pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh se izražajo štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), samo tri Piwi proteine pa so identificirali pri miših (Miwi, Mili in Miwi2) in pri ''Drosophila melanogaster'' (Piwi, Aub in Ago3). piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 RNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Poleg tega lahko kompleks piRNA-Piwi reprimira aktivnost L1 tudi preko posredovanja pri de novo metilaciji DNA ter pri modifikaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Ni pa še bolj podrobno raziskano, kakšna je točna vloga piRNA-Piwi pri teh dveh procesih.<br />
<br />
Mehanizem direktne interakcije piRNA-Piwi z L1 mRNA je bil študiran na vinskih mušicah. Ključni sta bili opažanji, da (i) Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 RNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil in (ii) Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Po prepisu zaporedij za piRNA vsebuje RNA transkript zapise za več različnih piRNA hkrati. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' mestu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki se veže na Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.<br />
<br />
Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na post-transkripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi regulatorna pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT. <br />
<br />
==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka==<br />
Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji. <br />
<br />
Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MeCP2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). Domneva se, da je dvojna vloga YY1 regulirana bodisi s posttranslacijskimi modifikacijami proteina (acetilacija) bodisi preko interakcij z različnimi kofaktorji. Ko YY1 deluje kot represor L1, se veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz.<br />
<br />
==Viri==<br />
[1] Protasova, Maria Sergeevna, Tatiana Vladimirovna Andreeva, and Evgeny Ivanovich Rogaev. “Factors Regulating the Activity of LINE1 Retrotransposons.” Genes 12, no. 10 (2021): 1562. https://doi.org/10.3390/genes12101562.<br />
<br />
[2] Brennecke, Julius, Alexei A. Aravin, Alexander Stark, Monica Dus, Manolis Kellis, Ravi Sachidanandam, and Gregory J. Hannon. “Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in Drosophila.” Cell 128, no. 6 (2007): 1089–1103. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.01.043.<br />
<br />
[3] Verheul, Thijs C., Levi van Hijfte, Elena Perenthaler, and Tahsin Stefan Barakat. “The Why of YY1: Mechanisms of Transcriptional Regulation by Yin Yang 1.” Frontiers in Cell and Developmental Biology 8 (2020). https://doi.org/10.3389/fcell.2020.592164.<br />
<br />
[4] Wu, You, Wenqiang Liu, Jiayu Chen, Shuaitong Liu, Mingzhu Wang, Lei Yang, Chuan Chen, et al. “Nuclear Exosome Targeting Complex Core Factor ZCCHC8 Regulates the Degradation of line1 RNA in Early Embryos and Embryonic Stem Cells.” Cell Reports 29, no. 8 (2019). https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.10.055.<br />
<br />
[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Retrotranspozoni_LINE-1_in_dejavniki,_ki_uravnavajo_njihovo_delovanje&diff=20284Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje2022-04-24T09:15:04Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>==Uvod==<br />
LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.<br />
<br />
Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.<br />
<br />
'''Mehanizem retrotranspozicije LINE-1'''<br />
<br />
Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu "na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije" (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.<br />
<br />
'''Regulacija aktivnosti LINE-1'''<br />
<br />
Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.<br />
<br />
==Regulacija LINE-1 na predimplantacijski stopnji==<br />
Na predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 na tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.<br />
<br />
Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA na predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena na stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže na stopnji osemceličnega zarodka.<br />
<br />
Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je na predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.<br />
<br />
Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.<br />
<br />
N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.<br />
<br />
Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).<br />
<br />
==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah==<br />
Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo. <br />
<br />
Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi regulatorna pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh se izražajo štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), samo tri Piwi proteine pa so identificirali pri miših (Miwi, Mili in Miwi2) in pri ''Drosophila melanogaster'' (Piwi, Aub in Ago3). piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 RNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Poleg tega lahko kompleks piRNA-Piwi reprimira aktivnost L1 tudi preko posredovanja pri de novo metilaciji DNA ter pri modifikaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Ni pa še bolj podrobno raziskano, kakšna je točna vloga piRNA-Piwi pri teh dveh procesih.<br />
<br />
Mehanizem direktne interakcije piRNA-Piwi z L1 mRNA je bil študiran na vinskih mušicah. Ključni sta bili opažanji, da (i) Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 RNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil in (ii) Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Po prepisu zaporedij za piRNA vsebuje RNA transkript zapise za več različnih piRNA hkrati. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' mestu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki se veže na Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.<br />
<br />
Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na post-transkripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi regulatorna pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT. <br />
<br />
==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka==<br />
Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji. <br />
<br />
Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MeCP2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). Domneva se, da je dvojna vloga YY1 regulirana bodisi s posttranslacijskimi modifikacijami proteina (acetilacija) bodisi preko interakcij z različnimi kofaktorji. Ko YY1 deluje kot represor L1, se veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz.<br />
<br />
==Viri==<br />
[1] Protasova, Maria Sergeevna, Tatiana Vladimirovna Andreeva, and Evgeny Ivanovich Rogaev. “Factors Regulating the Activity of LINE1 Retrotransposons.” Genes 12, no. 10 (2021): 1562. https://doi.org/10.3390/genes12101562.<br />
<br />
[2] Brennecke, Julius, Alexei A. Aravin, Alexander Stark, Monica Dus, Manolis Kellis, Ravi Sachidanandam, and Gregory J. Hannon. “Discrete Small RNA-Generating Loci as Master Regulators of Transposon Activity in Drosophila.” Cell 128, no. 6 (2007): 1089–1103. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.01.043.<br />
<br />
[3] Verheul, Thijs C., Levi van Hijfte, Elena Perenthaler, and Tahsin Stefan Barakat. “The Why of YY1: Mechanisms of Transcriptional Regulation by Yin Yang 1.” Frontiers in Cell and Developmental Biology 8 (2020). https://doi.org/10.3389/fcell.2020.592164. <br />
<br />
<br />
[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Retrotranspozoni_LINE-1_in_dejavniki,_ki_uravnavajo_njihovo_delovanje&diff=20260Talk:Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje2022-04-23T14:27:24Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>Neža Lanišek: Uvod, Regulacija LINE-1 v predimplantacijski stopnji<br />
<br />
Ana Marija Kodra: Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah, Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka<br />
<br />
Gašper Možina:</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Talk:Retrotranspozoni_LINE-1_in_dejavniki,_ki_uravnavajo_njihovo_delovanje&diff=20259Talk:Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje2022-04-23T14:27:14Z<p>Neža Lanišek: New page: Neža Lanišek: Uvod, Regulacija LINE-1 v predimplantacijski stopnji Ana Marija Kodra: Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah, Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka Gašper Možina:</p>
<hr />
<div>Neža Lanišek: Uvod, Regulacija LINE-1 v predimplantacijski stopnji<br />
Ana Marija Kodra: Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah, Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka<br />
Gašper Možina:</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Retrotranspozoni_LINE-1_in_dejavniki,_ki_uravnavajo_njihovo_delovanje&diff=20258Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje2022-04-23T14:22:45Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>==Uvod==<br />
LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.<br />
<br />
Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.<br />
<br />
'''Mehanizem retrotranspozicije LINE-1'''<br />
<br />
Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu "na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije" (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.<br />
<br />
'''Regulacija aktivnosti LINE-1'''<br />
<br />
Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.<br />
<br />
==Regulacija LINE-1 v predimplantacijski stopnji==<br />
V predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 v tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.<br />
<br />
Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA v predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena v stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže v stopnji osemceličnega zarodka.<br />
<br />
Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je v predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.<br />
<br />
Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.<br />
<br />
N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.<br />
<br />
Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).<br />
<br />
==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah==<br />
Za zarodne celice je značilna globalna demetilacija DNA. Aktivnost L1 je na nivoju transkripcije regulirana z de novo metilacijo. Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo. <br />
Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA, ki so dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh so prisotni štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), pri miših so bili identificirani zgolj trije (Miwi, Mili in Miwi2), pravtako ''Drosophila melanogaster'' izraža zgolj tri (Piwi, Aub in Ago3). <br />
piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 mRNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Mehanizem delovanja piRNA ter Piwi proteinov je bil študiran na vinskih mušicah. Znano je, da Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 mRNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil. Po drugi strani Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Skupki zapisov za piRNA se prepišejo v isti primarni transkript. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' koncu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki tvori kompleks z Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.<br />
Poleg direktne interakcije z L1 RNA je znano tudi, da kompleks piRNA-Piwi zniža aktivnost L1 preko posredovanja pri de novo DNA metilaciji ter pri metilaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Mehanizem, kako kompleks piRNA-Piwi sodeluje pri obeh procesih, še ni dodobra raziskan.<br />
<br />
Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na posttranskripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT.<br />
<br />
==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka==<br />
Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji.<br />
<br />
Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MePC2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). YY1 se namreč veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz. <br />
<br />
==Viri==<br />
<br />
<br />
[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Retrotranspozoni_LINE-1_in_dejavniki,_ki_uravnavajo_njihovo_delovanje&diff=20257Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje2022-04-23T14:15:22Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>==Uvod==<br />
LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.<br />
<br />
Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.<br />
<br />
'''Mehanizem retrotranspozicije LINE-1'''<br />
Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu "na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije" (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.<br />
<br />
'''Regulacija aktivnosti LINE-1'''<br />
Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.<br />
<br />
==Regulacija LINE-1 v predimplantacijski stopnji==<br />
V predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 v tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.<br />
<br />
Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA v predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena v stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže v stopnji osemceličnega zarodka.<br />
<br />
Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je v predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.<br />
<br />
Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.<br />
<br />
N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.<br />
<br />
Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).<br />
<br />
==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah ==<br />
Za zarodne celice je značilna globalna demetilacija DNA. Aktivnost L1 je na nivoju transkripcije regulirana z de novo metilacijo. Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo. <br />
Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA, ki so dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh so prisotni štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), pri miših so bili identificirani zgolj trije (Miwi, Mili in Miwi2), pravtako ''Drosophila melanogaster'' izraža zgolj tri (Piwi, Aub in Ago3). <br />
piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 mRNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Mehanizem delovanja piRNA ter Piwi proteinov je bil študiran na vinskih mušicah. Znano je, da Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 mRNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil. Po drugi strani Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Skupki zapisov za piRNA se prepišejo v isti primarni transkript. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' koncu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki tvori kompleks z Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.<br />
Poleg direktne interakcije z L1 RNA je znano tudi, da kompleks piRNA-Piwi zniža aktivnost L1 preko posredovanja pri de novo DNA metilaciji ter pri metilaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Mehanizem, kako kompleks piRNA-Piwi sodeluje pri obeh procesih, še ni dodobra raziskan.<br />
<br />
Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na posttranskripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT.<br />
<br />
==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka ==<br />
Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji.<br />
<br />
Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MePC2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). YY1 se namreč veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz. <br />
<br />
<br />
==Viri==<br />
<br />
[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Retrotranspozoni_LINE-1_in_dejavniki,_ki_uravnavajo_njihovo_delovanje&diff=20256Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje2022-04-23T14:13:43Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>==Uvod==<br />
<br />
LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.<br />
<br />
Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.<br />
<br />
<br />
== Mehanizem retrotranspozicije LINE-1 ==<br />
<br />
<br />
Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu "na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije" (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.<br />
<br />
<br />
== Regulacija aktivnosti LINE-1 ==<br />
<br />
<br />
Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.<br />
<br />
==Regulacija LINE-1 v predimplantacijski stopnji==<br />
<br />
V predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 v tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.<br />
<br />
Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA v predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena v stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže v stopnji osemceličnega zarodka.<br />
<br />
Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je v predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.<br />
<br />
Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.<br />
<br />
N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.<br />
<br />
Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).<br />
<br />
==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah ==<br />
Za zarodne celice je značilna globalna demetilacija DNA. Aktivnost L1 je na nivoju transkripcije regulirana z de novo metilacijo. Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo. <br />
Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA, ki so dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh so prisotni štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), pri miših so bili identificirani zgolj trije (Miwi, Mili in Miwi2), pravtako ''Drosophila melanogaster'' izraža zgolj tri (Piwi, Aub in Ago3). <br />
piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 mRNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Mehanizem delovanja piRNA ter Piwi proteinov je bil študiran na vinskih mušicah. Znano je, da Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 mRNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil. Po drugi strani Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Skupki zapisov za piRNA se prepišejo v isti primarni transkript. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' koncu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki tvori kompleks z Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.<br />
Poleg direktne interakcije z L1 RNA je znano tudi, da kompleks piRNA-Piwi zniža aktivnost L1 preko posredovanja pri de novo DNA metilaciji ter pri metilaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Mehanizem, kako kompleks piRNA-Piwi sodeluje pri obeh procesih, še ni dodobra raziskan.<br />
<br />
Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na posttranskripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT.<br />
<br />
==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka ==<br />
Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji.<br />
<br />
Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MePC2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). YY1 se namreč veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz. <br />
<br />
<br />
==Viri==<br />
<br />
[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Retrotranspozoni_LINE-1_in_dejavniki,_ki_uravnavajo_njihovo_delovanje&diff=20255Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje2022-04-23T14:12:32Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>==Uvod==<br />
<br />
LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.<br />
<br />
Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.<br />
<br />
"Mehanizem retrotranspozicije LINE-1"<br />
<br />
Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu "na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije" (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.<br />
<br />
"Regulacija aktivnosti LINE-1"<br />
<br />
Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.<br />
<br />
==Regulacija LINE-1 v predimplantacijski stopnji==<br />
<br />
V predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 v tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.<br />
<br />
Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA v predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena v stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže v stopnji osemceličnega zarodka.<br />
<br />
Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je v predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.<br />
<br />
Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.<br />
<br />
N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.<br />
<br />
Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).<br />
<br />
==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah ==<br />
Za zarodne celice je značilna globalna demetilacija DNA. Aktivnost L1 je na nivoju transkripcije regulirana z de novo metilacijo. Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo. <br />
Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA, ki so dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh so prisotni štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), pri miših so bili identificirani zgolj trije (Miwi, Mili in Miwi2), pravtako ''Drosophila melanogaster'' izraža zgolj tri (Piwi, Aub in Ago3). <br />
piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 mRNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Mehanizem delovanja piRNA ter Piwi proteinov je bil študiran na vinskih mušicah. Znano je, da Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 mRNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil. Po drugi strani Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Skupki zapisov za piRNA se prepišejo v isti primarni transkript. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' koncu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki tvori kompleks z Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.<br />
Poleg direktne interakcije z L1 RNA je znano tudi, da kompleks piRNA-Piwi zniža aktivnost L1 preko posredovanja pri de novo DNA metilaciji ter pri metilaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Mehanizem, kako kompleks piRNA-Piwi sodeluje pri obeh procesih, še ni dodobra raziskan.<br />
<br />
Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na posttranskripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT.<br />
<br />
==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka ==<br />
Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji.<br />
<br />
Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MePC2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). YY1 se namreč veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz. <br />
<br />
<br />
==Viri==<br />
<br />
[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>Neža Lanišekhttps://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Retrotranspozoni_LINE-1_in_dejavniki,_ki_uravnavajo_njihovo_delovanje&diff=20254Retrotranspozoni LINE-1 in dejavniki, ki uravnavajo njihovo delovanje2022-04-23T14:12:03Z<p>Neža Lanišek: </p>
<hr />
<div>==Uvod==<br />
<br />
LINE-1 (L1) so retrotranspozoni, ki spadajo v skupino dolgih razpršenih jedrnih elementov (LINE). Pri človeku predstavljajo okoli 17 % genoma, nahajajo pa se predvsem v nekodirajočih regijah.<br />
<br />
Celotna kopija L1 je pri človeku dolga okoli 6 kbp. Sestavlja jo dvosmerni promotor na 5' koncu neprevajajoče se regije (UTR), dva odprta bralna okvirja (ORF1 in ORF2) in poli-A rep na 3' koncu UTR. ORF1 kodira protein, ki je ključen za stabilizacijo nove kopije L1, ORF2 pa kodira proteine z endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnostjo, ki sta ključni za retrotranspozicijo.<br />
<br />
""Mehanizem retrotranspozicije LINE-1""<br />
<br />
Retrotranspozicija L1 poteka po mehanizmu "na tarčnem mestu začete reverzne transkripcije" (TPRT). V celičnem jedru RNA-polimeraza II katalizira transkripcijo L1 v novo kopijo L1 RNA, ki poliadenilirana zapusti jedro. V citoplazmi se s translacijo sintetizirajo ORF1 in ORF2 proteini. Na poli-A rep L1 RNA se veže protein, ki omogoči tvorbo L1 ribonukleoproteina (RNP). L1 RNP se transportira nazaj v jedro. Endonukleaza ustvari zarezo v spodnji verigi tarčne DNA, kamor se nadalje preko poli-A repa veže L1 transkript – reverzna transkriptaza L1 RNA uporabi kot matrico za podaljšanje 3' konca spodnje verige tarčne DNA. Po integraciji komplementarne verige nove kopije L1 endonukleaza ustvari zarezo v zgornji verigi tarčne DNA, reverzna transkriptaza pa podaljša 3' konec nove zareze. Sinteza DNA tako nadomesti RNA. Na koncu nastopijo encimi, ki sodelujejo v popravljalnih mehanizmih novonastale DNA.<br />
<br />
""Regulacija aktivnosti LINE-1""<br />
<br />
Aktivnost L1 retrotranspozonov nadzorujejo različni faktorji v somatskih in zarodnih celicah ter na vseh stopnjah razvoja organizma. Regulacija L1 poteka na transkripcijskem in posttranskripcijskem nivoju ter na stopnji integracije v genom.<br />
<br />
==Regulacija LINE-1 v predimplantacijski stopnji==<br />
<br />
V predimplantacijski stopnji razvoja organizma je aktivnost L1 regulirana na nivoju transkripcije z metilacijo DNA, modifikacijami histonov in N6-metiladenilacijo ter na posttranskripcijski ravni prav tako z N6-metiladenilacijo in pa s kompleksom, ki usmerja eksosome v jedru (kompleks NEXT). Regulacija aktivnosti L1 v tej stopnji je do sedaj najbolj podrobno preučena na mišjih modelih.<br />
<br />
Metilacija DNA je epigenetski mehanizem, pri katerem pride do prenosa metilne skupine na C5 pozicijo citozina, pri čemer nastane 5-metilcitozin. Prenos metilne skupine z donorja metilne skupine S-adenozil metionina (SAM) katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo CpG DNA v predimplantacijski stopnji katalizirata metiltransferazi DNMT1 in DNMT3B. Z eksperimenti so pokazali, da izbitje teh encimov privede do smrti mišjega zarodka. V miših je najvišja stopnja metilacije dosežena v stopnji oblikovanja zigote, potem se stopnja metilacije DNA zniža in minimum doseže v stopnji osemceličnega zarodka.<br />
<br />
Histoni regulirajo transkripcijo na podlagi modifikacij, ki na različne načine vplivajo na njihovo interakcijo z DNA. Za regulacijo aktivnosti L1 je v predimplantacijski stopnji ključna predvsem metilacija histonov, ki poteka na lizinskem ali argininskem aminokislinskem ostanku N-terminalnega repa histona. Metilacijo histonov katalizirajo metiltransferaze. Metilacijo arginina katalizira protein arginin N-metiltransferaza 5 (PRMT5). Pri metilaciji histona H3 na lizinu 9 (H3K9) sodelujejo tri metiltransferaze: SUV39H, G9a in SETDB1. Z metilacijo histonov nastanejo različni histonski markerji, ki so vključeni v represijo transkripcije L1 (H3K9me2, H3K9me3). Pri metilaciji histonov sodeluje tudi faktor za sestavljanje kromatina (CAF-1). K nastanku histonskega markerja H3K9me3 in nadalje oblikovanju heterokromatina pripomore tudi regulatorni človeški utiševalni kompleks (kompleks HUSH). Sestavljajo ga trije proteini: TASOR, MPP8 in Perifilin.<br />
<br />
Poleg metilacije DNA in modifikacij histonov k zmanjšanju izražanja L1 in tvorbi heterokromatina v sesalcih pripomore še N6-metiladenilacija. Z eksperimenti so pokazali, da prisotnost markerja N6-metiladenina v miših vodi do inaktivacije L1.<br />
<br />
N6-metiladenilirani pa so lahko tudi L1 RNA transkripti, kar vodi v njihovo utišanje. Pomanjkanje proteina, ki vsebuje YT521-B homologno domeno (YTHDC1), faktorja, ki vodi v utišanje s prepoznavo N6-metiladenozinske modifikacije, lahko vodi do ponovne aktivacije utišanih L1.<br />
<br />
Do posttranskripcijske razgradnje L1 vodi tudi kompleks NEXT. Kompleks NEXT deluje kot kofaktor RNA eksosomov v nukleoplazmi in tako pripomore k eksosomski razgradnji novonastale RNA. Sestavljajo ga trije proteini, med katerimi je najpomembnejši protein, ki vsebuje CCHC domeno cinkovega prsta (ZCCHC8).<br />
<br />
==Regulacija LINE-1 v zarodnih celicah ==<br />
Za zarodne celice je značilna globalna demetilacija DNA. Aktivnost L1 je na nivoju transkripcije regulirana z de novo metilacijo. Mehanizmi regulacije L1 se pri moških in ženskih zarodnih celicah razlikujejo. <br />
Za regulacijo aktivnosti L1 v moških zarodnih celicah je ključnega pomena t.i. piRNA/Piwi pot. piRNA (s Piwi proteini interagirajoče RNA) so majhne nekodirajoče RNA, ki so dolge med 26 in 30 nt. Kot že ime pove piRNA tvorijo komplekse s skupino proteinov imenovano Piwi. Pri ljudeh so prisotni štiri različni Piwi proteini (PIWIL1-PIWIL4), pri miših so bili identificirani zgolj trije (Miwi, Mili in Miwi2), pravtako ''Drosophila melanogaster'' izraža zgolj tri (Piwi, Aub in Ago3). <br />
piRNA lahko v kompleksu s proteinom Piwi direktno interagira z L1 mRNA in tvori dvoverižni hibrid, ki ga Piwi protein s svojo ribonukleazno aktivnostjo nato cepi. Mehanizem delovanja piRNA ter Piwi proteinov je bil študiran na vinskih mušicah. Znano je, da Piwi in Aub tvorita komplekse s protismerno piRNA glede na L1 mRNA, ki ima na 5' koncu preferenčno uracil. Po drugi strani Ago3 tvori komplekse s smerno piRNA, ki nima enake preference na 5' koncu. Skupki zapisov za piRNA se prepišejo v isti primarni transkript. Cepitev transkripta na posamezne piRNA še ni dodobra razložena. Znano je le-da imajo po cepitvi piRNA na 5' koncu preferenčno uracil. Take piRNA se vežejo na Piwi ali Aub. Ko piRNA v kompleksu po komplementarnosti prepozna L1 mRNA in se z njo poveže preko vodikovih vezi, Piwi/Aub cepi fosfodiestersko vez približno 10 nt stran od 5' konca piRNA. Rezana L1 RNA se v celici procesira s cepitvijo 3' konca in tvori smerno piRNA, ki tvori kompleks z Ago3. Mehanizem procesiranja 3' konca ni poznan. Smerna piRNA v kompleksu z Ago3 se veže na primarni piRNA transkript, ki ga Ago3 nato cepi in s tem tvori nove protismerne piRNA. S tem se cikel ponovno začne.<br />
Poleg direktne interakcije z L1 RNA je znano tudi, da kompleks piRNA-Piwi zniža aktivnost L1 preko posredovanja pri de novo DNA metilaciji ter pri metilaciji histonov, specifično pri modifikaciji H3K9me3. Mehanizem, kako kompleks piRNA-Piwi sodeluje pri obeh procesih, še ni dodobra raziskan.<br />
<br />
Regulacija L1 v ženskih zarodnih celicah se zgodi predvsem na posttranskripcijski ravni. Nekateri proteini Piwi se sicer izražajo, vendar piRNA/Piwi pot ne deluje. Namesto tega regulacija poteka predvsem na principu interferenčne RNA in pa razgradnje L1 RNA, pri kateri sodelujejo različne ribonukleaze in pa kompleks NEXT.<br />
<br />
==Regulacija LINE-1 med razvojem zarodka ==<br />
Med razvojem zarodka regulacija aktivnosti L1 po posameznih tkivih ni dodobra poznana. Aktivnost L1 je reprimirana preko metilacije DNA, ki jo vršijo metiltransferaze DNMT1, DNMT3A in DNMT3B. DNMT1 je odgovorna za ohranjevanje metilacijskega vzorca po celični delitvi, medtem ko DNMT3A in DNMT3B sodelujeta pri de novo metilaciji.<br />
<br />
Aktivnost L1 je med razvojem zarodka največja v možganih, kjer je bilo zaznanih tudi največ somatskih mutacij. Znano je, da je piRNA-Piwi pot delujoča med razvojem možganov, vendar domnevno v manjšem obsegu kot pri zarodnih celicah. Aktivnost L1 je selektivno reprimirana s pomočjo MePC2 (metil-CpG-vezavni protein). Pri regulaciji sodeluje tudi protein YY1 (Yin Yang 1), ki ima lahko vlogo aktivatorja ali represorja. YY1 je namreč nujen za začetek transkripcije L1 (aktivator), a hkrati sodeluje pri metilaciji L1 promotorja (represor). YY1 se namreč veže na 5' UTR in posreduje pri vezavi metiltransferaz. <br />
<br />
<br />
==Viri==<br />
<br />
[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</div>Neža Lanišek