https://wiki.fkkt.uni-lj.si/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=Ne%C5%BEa+Levi%C4%8Dnik 2026-04-15T12:15:15Z User contributions MediaWiki 1.39.3 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni&diff=13638 2017-12-18T23:40:35Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>(Neža Gaube)<br /> ==Uvod==<br /> Rezistenca na antibiotike postaja zelo velik problem. Zaradi prevelike, napačne in nepotrebne uporabe antibiotikov, se je razvilo že kar nekaj odpornih sevov patogenov (npr. MRSA). Veliko statističnih analiz kaže, da se približno polovica antibiotikov predpiše nepotrebno, saj gre pogosto tudi za virusne okužbe.<br /> Razvoj različnih zelo specifičnih metod (npr. PCR, FISH in ELISA) daje nove možnosti tudi za uporabo sintezne biologije pri ustvarjanju novih in bolj točnih diagnostičnih testov. Trenutne diagnostične metode uporabljajo drago opremo in izobraženo osebje, kar omeji uporabo teh metod. V zadnjem času so na področju detekcije šli v t.i. »&quot;point of care testing&quot;« (POCT), kjer gre za testiranje ob pacientu. Uporablja se različne cenovno ugodne platforme (npr. papirnati trakovi). Tudi pri tem projektu so želeli razviti metodo detekcije na ta način.<br /> Ekipa Munich iz iGEM 2017 si je zamislila, da bi uporabila torej POC test z napravo za in vitro diagnostiko, ker naj bi po njihovi hipotezi bila zmožna ločiti med patogeni (tako virusnimi kot tudi bakterijskimi). Z uporabo take metode bi preprečili oz. zmanjšali neustrezno rabo antibiotikov ter s tem tudi zmanjšali možnost nadaljnje rezistence.<br /> Njihov sistem naj bi vseboval »vse v enem«: priprava vzorca, pomnožitev nukleinskih kislin in detekcija tarče.<br /> <br /> ==Cas13a==<br /> Uporabili so lastnosti nedavno odkritega efektorjega sistema CRISPR/Cas – Cas13a. Ta se razlikuje od ostalih Cas proteinov s tem, da cepi specifično RNA tarče in ne DNA. ). Njegova struktura ni podobna ostalim »običajnim« Cas encimom (npr. Cas9), ampak ima dve HEPN domeni (Cas9 ima HNH in RuvC domeni za cepitev DNA). Cas13a lahko prepozna katero koli zaporedje RNA in se nanj veže. Nima pa sposobnosti, da bi cepil tarčno RNA, ampak ob vezavi pride do konformacijskih sprememb in se odpre HEPN aktivacijsko mesto s katerim potem nespecifično cepi druge RNA.<br /> <br /> Lahko se jo prilagodi na katerokoli zaporedje, kar omogoča, da se napravo naredi specifično za kateri koli patogen. Je tudi zelo specifična in občutljiva, saj zazna tarčno zaporedje tudi če je prisotno le v sledeh. Za delovanje pa Cas13a potrebuje crRNA. iGEM ekipa je pripravila programsko opremo (software) s pomočjo katere lahko lažje pripravimo ustrezno crRNA. Lahko si pa tudi pomagamo s podatkovno bazo z že uporabljenimi crRNA, ki so jo prav tako pripravili v okviru projekta.<br /> <br /> <br /> ==Projekt==<br /> Projekt je bil sestavljen iz treh modulov. &lt;br&gt;<br /> 1) Modul priprave vzorca (liza izbranih patogenov in pomnožitev tarčnih sekvenc dokler ne dosežemo količine RNA, ki jo lahko zaznamo s Cas13a) &lt;br&gt;<br /> 2) Modul čiščenja in karakterizacije Cas13a (priprava Cas13a za diagnostiko)&lt;br&gt;<br /> 3) Modul detekcije (naredi signal viden uporabniku)&lt;br&gt;<br /> Vse tri module so sestavili v prenosno obliko (primeren hardware). Posamezne module so razvijali neodvisno drug od drugega.<br /> <br /> ===1.Modul: Priprava vzorca:===<br /> Cilj je bil torej pridobiti količino tarčne RNA, ki jo lahko zaznamo iz vzorca celic &quot;E. coli&quot;, ki so si jo izbrali za izvedbo poskusa. Najprej so primerjali različne tehnike lize celic. Učinkovitost so preverili z agarozno gelsko elektroforezo.&lt;br&gt;<br /> Uporabili so:&lt;br&gt;<br /> - Liza s kaotropnimi snovmi (na koncu lize je potrebno čiščenje lizata, ki vsebuje toksične kemikalije)&lt;br&gt;<br /> - Inkubacija pri visoki temperaturi z detergenti npr. NaDS (dobili so dobre rezultate, ampak je vseeno potrebna ločitev NaDS od tarčne RNA)&lt;br&gt;<br /> - Liza s toploto (dodatno čiščenje ni potrebno)&lt;br&gt;<br /> Vzorec so čistili z različnimi postopki s silikagelom, a so na koncu vseeno izbrali metodo, kjer dodatno čiščenje ni potrebno. Uporabili so lizo s toploto, ki ji sledi pomnožitev z rekombinazo in polimerazo (RPA). To je izotermna alternativa PCR. Izvaja se pri 37 °C brez potrebe, da bi menjavali temperature, zaradi česar je cenejša metoda. &lt;br&gt;<br /> ====Potek RPA====<br /> Kompleks rekombinaze in začetnega oligonukleotida najprej »najde« mesto na DNA, ki je homologno začetnemu oligonukleotidu. Potem rekombinaza razpre vijačnico pri čemer pride do hibridizacije med začetnim oligonukleotidom in homolognim mestom na DNA. Na tem mestu se vežejo na drugo verigo dna enoverižni vezavni proteini (SSB). Začetni oligonukleotid se podaljša s pomočjo polimeraze pri čemer se ena veriga odstrani. Na novo sintentiziran dvoverižni kompleks pa se uporabi naprej za nadaljnjo pomnoževanje (postopek se ponavlja). RPA je hitra in občutljiva metoda, ampak pogosto problem predstavlja ozadje.&lt;br&gt;<br /> Tarča proteina Cas13a je RNA in ne DNA, zato so sklopili to RPA še z in vitro transkripcijo, ki poteka prav tako pri 37 °C, zato so lahko dodali reagente za transkripcijo kar v to mešanico brez vmesnega čiščenja.<br /> <br /> <br /> ===2. Modul: Čiščenje in karakterizacija Cas13a===<br /> ====Čiščenje====<br /> Pripravili so nove biokocke za ekspresijo in čiščenje proteina Cas13a.&lt;br&gt;<br /> Priprava:&lt;br&gt;<br /> Analizirali so proteine iz družine Cas13a iz družin različnih organizmov. &quot;Leptotrichia buccalis&quot; (Lbu), &quot;Leptotrichia shahii&quot; (Lsh) in &quot;Leptotrichia wadei&quot; (Lwa). Naročili so plazmida za Lbu in Lsh ter protein izrazili v &quot;E.coli Rosetta2&quot;. Za Lwa pa so sami pripravili plazmid in ga izrazili v &quot;E.coli BL21&quot;. Njihov konstrukt je bil sestavljen iz T7 promotorja, His oznake, SUMO oznake, zaporedja proteina in terminatorja. Naredili so fuzijo z majhnim ubikvintinu podobnim proteinom (SUMO), da so povečali topnost Cas13a proteina.<br /> Izolirani protein so očistili z Ni-NTA agarozo. His-SUMO oznaki so cepili s proteazo ter nato še enkrat uporabili Ni-NTA, da so odstranili tiste proteine pri katerih se His oznaka ni odcepila. Na koncu so uporabili še kromatografijo z ločevanjem po velikosti. Čistost dobljenega proteina so preverili še z NaDS-PAGE.<br /> Kljub temu, da so sledili protokolom čiščenja iz literature, le-to ni najbolje uspelo. Ugotovili so, da je čiščenje s His oznako delovalo v redu, kar pomeni, da je bil problem kationsko izmenjevalna kromatografija. Tam so izgubili veliko proteinov. Delo so nadaljevali z nepopolnoma očiščenimi proteini (na sliki poliakrilamidnega gela je poleg lise proteina prisotnih še veliko drugih, kar kaže na precej nečistot). <br /> Vzporedno so delali s proteini Cas13a iz treh različnih organizmov. Zgoraj je opisan le postopek za Lwa, kjer so sami pripravljali tudi konstrukt.<br /> ====Karakterizacija====<br /> Dobljeni Cas13a so karakterizirali z RNaseAlert testom. <br /> <br /> CascAID uporablja torej nespecifično RNazno aktivnost Cas13a, da dobi ojačan signal. V tem modulu so poskrbeli, da pri cepitvi RNA dobijo signal, ki ga je lahko in zanesljivo meriti ter ga uporabnik lahko tudi sam interpretira. Menijo, da je to ključna stopnja projekta, zato so poskusili več možnosti. Test RNaseAlert, test s špinačnim aptamerom, sistem intein-ekstein in druge. Najboljše se je obnesel test RNase Alert, ki je spodaj tudi opisan.<br /> Test RNaseAlert je komercialno dostopni test, ki daje fluorescentni signal s katerim lahko spremljamo aktivnost RNAze. Mešanici tarčne RNA, Cas13a in crRNA so dodali še RNA na katero sta s pomočjo linkerja vezana fluorofor in dušilec (eden na N-konec in drugi na C-konec). Ko pride do cepitve z RNazo, se fluorofor oddalji od dušilca in zato lahko fluorescira. Ker pride do nespecifične RNAzne aktivnosti, je sam signal precej ojačan.<br /> =====Funkcionalnost:=====<br /> Funkcionalnost Cas13 so preverili z uporabo zaporedja 16S rRNA iz E.coli kot tarčno zaporedje. In vitro so prepisali 130 nukleotidov (od 1500). Na podlagi DNA matrice so zasnovali crRNA. Ugotovili so, da sta funkcionalni tako Lbu kot Lwa. Lbu je bil bolj aktiven kot Lwa, kar je v nasprotju s podatki iz literature (Gootenberg in sodelavci, 2017). Pri Lsh pa niso dobili nobenih rezultatov. Nadaljnje poskuse so na podlagi teh podatkov izvajali z Lbu.<br /> =====Specifičnost aktivnosti:=====<br /> Specifičnost aktivnosti Cas13a so preverjali z uporabo različnih tarčnih zaporedij (za &quot;Noro virus&quot;, &quot;Hepatitis C&quot; (HCV) in &quot;Bacillus subtilis&quot;).<br /> Določili so fluorescenco pri vzorcih posameznih bakterij/virusov, kjer je bila dodana ustrezna crRNA. Te vrednosti so primerjali samo z določitvijo fluorescenve v vzorcu, kjer ni bilo prisotne ustrezne crRNA.<br /> Ker se zavedajo, da je možnost kontaminacije velika, so naredili še en poskus. Izbrali so crRNA Norovirusa in dodali posebej 30 nM koncentracije treh različnih organizmov (&quot;Norovirus&quot;, &quot;E. coli&quot; in &quot;HCV&quot;). Ugotovili so, da je prišlo do velikega povečanja fluorescence le v primeru, ko je bil v vzorcu Norovirus. Pri ostalih organizmih do pretiranega povečanja fluorescence ni prišlo. Na podlagi teh podatkov lahko sklepamo, da je ta mehanizem zelo specifičen.<br /> ===3. Modul: Detektor===<br /> Za zaznavanje signala so pa potrebovali cenovno ugoden, prenosljiv in dovolj zanesljiv fluorescentni detektor. S pomočjo modeliranja so si ga zamislili ter nato tudi sestavili. Detektor he narejen na osnovi papirja in lahko zazna fluorescin že v koncentracijah do 10 nM. Njegova cena je manj kot 15 dolarjev.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> CascAID+ predstavlja prenosen, cenovno dostopen in uporaben POC test z dobro občutljivostjo. Prednost CascAID je to, da se ga lahko hitro prilagodi na zelo različne tarče (bakterijske infekcije, hitro razvijujoče se virusne epidemije, z rakom povezane okužbe …). CascAID bi lahko uporabljal zdravnik ali pacient brez dodatnega »potovanja« vzorca do laboratorija. Sama analiza traja približno 30 minut in da dovolj točne informacije, da bi lahko (med drugim) tudi pripomogel k zmanjšanju rezistence bakterij na antibiotike, kar je bil povod za samo izdelavo CascAID sistema.<br /> ==Literatura==<br /> 1. [http://2017.igem.org/Team:Munich Projekt iGEM 2017, ekipa Munich]&lt;br&gt;<br /> 2. Liu L, Li X, Ma J, Li Z, You L, Wang J, Wang M, Zhang X, Wang Y. The molecular architecture for RNA-guided RNA cleavage by Cas13a. Cell. 2017 Aug 10;170(4):714-26. &lt;br&gt;<br /> 3. Piepenburg O, Williams CH, Stemple DL, Armes NA. DNA detection using recombination proteins. PLoS biology. 2006 Jun 13;4(7):e204.&lt;br&gt;<br /> 4. Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Konermann S, Joung J, Slaymaker IM, Cox DB, Shmakov S, Makarova KS, Semenova E, Minakhin L, Severinov K. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 2016 Aug 5;353(6299):aaf5573.&lt;br&gt;</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2017/18&diff=13637 2017-12-18T23:32:12Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2017/18 študentje predstavljajo naslednje teme:<br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola]&lt;br&gt;<br /> #[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah]&lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] &lt;br&gt;<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezceli%C4%8Dna_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni CascAID - test s Cas13a za diagnostiko nalezljivih bolezni]<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.<br /> <br /> ---------------------------<br /> Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):<br /> <br /> 27.11. &lt;br&gt;<br /> 1 Marija Srnko -[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]&lt;br&gt;<br /> 2 Neža Brezovar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SLOVO_RAKU Slovo raku]&lt;br&gt;<br /> <br /> 28.11.&lt;br&gt;<br /> 1 Tjaša Grum - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola]&lt;br&gt;<br /> 2 Urška Černe [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] &lt;br&gt;<br /> 3 Petra Vivod - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense] &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 4.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Sara Kimm Fuhrmann - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ] &lt;br&gt;<br /> 2 Anja Tanšek - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DNA_assembler - DNA assembler] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 5.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Urška Furar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah] &lt;br&gt;<br /> 2 Tina Lekan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] &lt;br&gt;<br /> 3 Katja Malovrh [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin] &lt;br&gt; <br /> 4 Jernej Vidmar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 12.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Helena Jakše - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka] &lt;br&gt;<br /> 2 Tjaša Bensa - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezcelična_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni] &lt;br&gt;<br /> 3 Sabina Štukelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MagicBlock:_interaktivna_platforma_za_sintezno_biologijo MagicBlock: interaktivna platforma za sintezno biologijo] &lt;br&gt;<br /> 4 Amadeja Lapornik [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 19.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Krišelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED] &lt;br&gt; <br /> 2 Vanna Imširović [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Beton-samoporavljaju%C4%87i_sistem Beton-samopopravljajući sistem] &lt;br&gt;<br /> 3 Dominik Dekleva - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] &lt;br&gt;<br /> 4 Neža Gaube [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni CascAID - test s Cas13a za diagnostiko nalezljivih bolezni] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 9.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Nastja Marondini &lt;br&gt;<br /> 2 Elizabeta Jevnikar &lt;br&gt;<br /> 3 Nina Roštan &lt;br&gt;<br /> 4 Barbara Lipovšek&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 15.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Matic Kovačič - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/%C5%A0irjenje_genetskega_koda Širjenje genetskega koda]&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 16.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Inge Sotlar &lt;br&gt;<br /> 2 Marija Kisilak&lt;br&gt;<br /> 3 Nataša Traven&lt;br&gt;<br /> 4 Tina Šimunović&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 22.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Mojca Hunski &lt;br&gt;<br /> 2 Tomaž Žagar &lt;br&gt;<br /> 3 Tadej Ulčnik &lt;br&gt;<br /> 4 Jakob Rupert&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 23.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Cirnski &lt;br&gt;<br /> 2 Rok Ferenc &lt;br&gt;<br /> 3&lt;br&gt;<br /> 4&lt;br&gt;</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni&diff=13636 2017-12-18T23:28:50Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>(Neža Gaube)<br /> ==Uvod==<br /> Rezistenca na antibiotike postaja zelo velik problem. Zaradi prevelike, napačne in nepotrebne uporabe antibiotikov, se je razvilo že kar nekaj odpornih sevov patogenov (npr. MRSA). Veliko statističnih analiz kaže, da se približno polovica antibiotikov predpiše nepotrebno, saj gre pogosto tudi za virusne okužbe.<br /> Razvoj različnih zelo specifičnih metod (npr. PCR, FISH in ELISA) daje nove možnosti tudi za uporabo sintezne biologije pri ustvarjanju novih in bolj točnih diagnostičnih testov. Trenutne diagnostične metode uporabljajo drago opremo in izobraženo osebje, kar omeji uporabo teh metod. V zadnjem času so na področju detekcije šli v t.i. »&quot;point of care testing&quot;« (POCT), kjer gre za testiranje ob pacientu. Uporablja se različne cenovno ugodne platforme (npr. papirnati trakovi). Tudi pri tem projektu so želeli razviti metodo detekcije na ta način.<br /> Ekipa Munich iz iGEM 2017 si je zamislila, da bi uporabila torej POC test z napravo za in vitro diagnostiko, ker naj bi po njihovi hipotezi bila zmožna ločiti med patogeni (tako virusnimi kot tudi bakterijskimi). Z uporabo take metode bi preprečili oz. zmanjšali neustrezno rabo antibiotikov ter s tem tudi zmanjšali možnost nadaljnje rezistence.<br /> Njihov sistem naj bi vseboval »vse v enem«: priprava vzorca, pomnožitev nukleinskih kislin in detekcija tarče.<br /> <br /> ==Cas13a==<br /> Uporabili so lastnosti nedavno odkritega efektorjega sistema CRISPR/Cas – Cas13a. Ta se razlikuje od ostalih Cas proteinov s tem, da cepi specifično RNA tarče in ne DNA. ). Njegova struktura ni podobna ostalim »običajnim« Cas encimom (npr. Cas9), ampak ima dve HEPN domeni (Cas9 ima HNH in RuvC domeni za cepitev DNA). Cas13a lahko prepozna katero koli zaporedje RNA in se nanj veže. Nima pa sposobnosti, da bi cepil tarčno RNA, ampak ob vezavi pride do konformacijskih sprememb in se odpre HEPN aktivacijsko mesto s katerim potem nespecifično cepi druge RNA.<br /> <br /> Lahko se jo prilagodi na katerokoli zaporedje, kar omogoča, da se napravo naredi specifično za kateri koli patogen. Je tudi zelo specifična in občutljiva, saj zazna tarčno zaporedje tudi če je prisotno le v sledeh. Za delovanje pa Cas13a potrebuje crRNA. iGEM ekipa je pripravila programsko opremo (software) s pomočjo katere lahko lažje pripravimo ustrezno crRNA. Lahko si pa tudi pomagamo s podatkovno bazo z že uporabljenimi crRNA, ki so jo prav tako pripravili v okviru projekta.<br /> <br /> <br /> ==Projekt==<br /> Projekt je bil sestavljen iz treh modulov. &lt;br&gt;<br /> 1) Modul priprave vzorca (liza izbranih patogenov in pomnožitev tarčnih sekvenc dokler ne dosežemo količine RNA, ki jo lahko zaznamo s Cas13a) &lt;br&gt;<br /> 2) Modul čiščenja in karakterizacije Cas13a (priprava Cas13a za diagnostiko)&lt;br&gt;<br /> 3) Modul detekcije (naredi signal viden uporabniku)&lt;br&gt;<br /> Vse tri module so sestavili v prenosno obliko (primeren hardware). Posamezne module so razvijali neodvisno drug od drugega.<br /> <br /> ===1.Modul: Priprava vzorca:===<br /> Cilj je bil torej pridobiti količino tarčne RNA, ki jo lahko zaznamo iz vzorca celic &quot;E. coli&quot;, ki so si jo izbrali za izvedbo poskusa. Najprej so primerjali različne tehnike lize celic. Učinkovitost so preverili z agarozno gelsko elektroforezo.&lt;br&gt;<br /> Uporabili so:&lt;br&gt;<br /> - Liza s kaotropnimi snovmi (na koncu lize je potrebno čiščenje lizata, ki vsebuje toksične kemikalije)&lt;br&gt;<br /> - Inkubacija pri visoki temperaturi z detergenti npr. NaDS (dobili so dobre rezultate, ampak je vseeno potrebna ločitev NaDS od tarčne RNA)&lt;br&gt;<br /> - Liza s toploto (dodatno čiščenje ni potrebno)&lt;br&gt;<br /> Vzorec so čistili z različnimi postopki s silikagelom, a so na koncu vseeno izbrali metodo, kjer dodatno čiščenje ni potrebno. Uporabili so lizo s toploto, ki ji sledi pomnožitev z rekombinazo in polimerazo (RPA). To je izotermna alternativa PCR. Izvaja se pri 37 °C brez potrebe, da bi menjavali temperature, zaradi česar je cenejša metoda. &lt;br&gt;<br /> ====Potek RPA====<br /> Kompleks rekombinaze in začetnega oligonukleotida najprej »najde« mesto na DNA, ki je homologno začetnemu oligonukleotidu. Potem rekombinaza razpre vijačnico pri čemer pride do hibridizacije med začetnim oligonukleotidom in homolognim mestom na DNA. Na tem mestu se vežejo na drugo verigo dna enoverižni vezavni proteini (SSB). Začetni oligonukleotid se podaljša s pomočjo polimeraze pri čemer se ena veriga odstrani. Na novo sintentiziran dvoverižni kompleks pa se uporabi naprej za nadaljnjo pomnoževanje (postopek se ponavlja). RPA je hitra in občutljiva metoda, ampak pogosto problem predstavlja ozadje.&lt;br&gt;<br /> Tarča proteina Cas13a je RNA in ne DNA, zato so sklopili to RPA še z in vitro transkripcijo, ki poteka prav tako pri 37 °C, zato so lahko dodali reagente za transkripcijo kar v to mešanico brez vmesnega čiščenja.<br /> <br /> <br /> ===2. Modul: Čiščenje in karakterizacija Cas13a===<br /> ====Čiščenje====<br /> Pripravili so nove biokocke za ekspresijo in čiščenje proteina Cas13a.<br /> Priprava:<br /> Analizirali so proteine iz družine Cas13a iz družin različnih organizmov. &quot;Leptotrichia buccalis&quot; (Lbu), &quot;Leptotrichia shahii&quot; (Lsh) in &quot;Leptotrichia wadei&quot; (Lwa). Naročili so plazmida za Lbu in Lsh ter protein izrazili v &quot;E.coli Rosetta2&quot;. Za Lwa pa so sami pripravili plazmid in ga izrazili v &quot;E.coli BL21&quot;. Njihov konstrukt je bil sestavljen iz T7 promotorja, His oznake, SUMO oznake, zaporedja proteina in terminatorja. Naredili so fuzijo z majhnim ubikvintinu podobnim proteinom (SUMO), da so povečali topnost Cas13a proteina.<br /> Izolirani protein so očistili z Ni-NTA agarozo. His-SUMO oznaki so cepili s proteazo ter nato še enkrat uporabili Ni-NTA, da so odstranili tiste proteine pri katerih se His oznaka ni odcepila. Na koncu so uporabili še kromatografijo z ločevanjem po velikosti. Čistost dobljenega proteina so preverili še z NaDS-PAGE.<br /> Kljub temu, da so sledili protokolom čiščenja iz literature, le-to ni najbolje uspelo. Ugotovili so, da je čiščenje s His oznako delovalo v redu, kar pomeni, da je bil problem kationsko izmenjevalna kromatografija. Tam so izgubili veliko proteinov. Delo so nadaljevali z nepopolnoma očiščenimi proteini (na sliki poliakrilamidnega gela je poleg lise proteina prisotnih še veliko drugih, kar kaže na precej nečistot). <br /> Vzporedno so delali s proteini Cas13a iz treh različnih organizmov. Zgoraj je opisan le postopek za Lwa, kjer so sami pripravljali tudi konstrukt.<br /> ====Karakterizacija====<br /> Dobljeni Cas13a so karakterizirali z RNaseAlert testom. <br /> <br /> CascAID uporablja torej nespecifično RNazno aktivnost Cas13a, da dobi ojačan signal. V tem modulu so poskrbeli, da pri cepitvi RNA dobijo signal, ki ga je lahko in zanesljivo meriti ter ga uporabnik lahko tudi sam interpretira. Menijo, da je to ključna stopnja projekta, zato so poskusili več možnosti. Test RNaseAlert, test s špinačnim aptamerom, sistem intein-ekstein in druge. Najboljše se je obnesel test RNase Alert, ki je spodaj tudi opisan.<br /> Test RNaseAlert je komercialno dostopni test, ki daje fluorescentni signal s katerim lahko spremljamo aktivnost RNAze. Mešanici tarčne RNA, Cas13a in crRNA so dodali še RNA na katero sta s pomočjo linkerja vezana fluorofor in dušilec (eden na N-konec in drugi na C-konec). Ko pride do cepitve z RNazo, se fluorofor oddalji od dušilca in zato lahko fluorescira. Ker pride do nespecifične RNAzne aktivnosti, je sam signal precej ojačan.<br /> =====Funkcionalnost:=====<br /> Funkcionalnost Cas13 so preverili z uporabo zaporedja 16S rRNA iz E.coli kot tarčno zaporedje. In vitro so prepisali 130 nukleotidov (od 1500). Na podlagi DNA matrice so zasnovali crRNA. Ugotovili so, da sta funkcionalni tako Lbu kot Lwa. Lbu je bil bolj aktiven kot Lwa, kar je v nasprotju s podatki iz literature (Gootenberg in sodelavci, 2017). Pri Lsh pa niso dobili nobenih rezultatov. Nadaljnje poskuse so na podlagi teh podatkov izvajali z Lbu.<br /> =====Specifičnost aktivnosti:=====<br /> Specifičnost aktivnosti Cas13a so preverjali z uporabo različnih tarčnih zaporedij (za &quot;Noro virus&quot;, &quot;Hepatitis C&quot; (HCV) in &quot;Bacillus subtilis&quot;).<br /> Določili so fluorescenco pri vzorcih posameznih bakterij/virusov, kjer je bila dodana ustrezna crRNA. Te vrednosti so primerjali samo z določitvijo fluorescenve v vzorcu, kjer ni bilo prisotne ustrezne crRNA.<br /> Ker se zavedajo, da je možnost kontaminacije velika, so naredili še en poskus. Izbrali so crRNA Norovirusa in dodali posebej 30 nM koncentracije treh različnih organizmov (&quot;Norovirus&quot;, &quot;E. coli&quot; in &quot;HCV&quot;). Ugotovili so, da je prišlo do velikega povečanja fluorescence le v primeru, ko je bil v vzorcu Norovirus. Pri ostalih organizmih do pretiranega povečanja fluorescence ni prišlo. Na podlagi teh podatkov lahko sklepamo, da je ta mehanizem zelo specifičen.<br /> ===3. Modul: Detektor===<br /> Za zaznavanje signala so pa potrebovali cenovno ugoden, prenosljiv in dovolj zanesljiv fluorescentni detektor. S pomočjo modeliranja so si ga zamislili ter nato tudi sestavili. Detektor he narejen na osnovi papirja in lahko zazna fluorescin že v koncentracijah do 10 nM. Njegova cena je manj kot 15 dolarjev.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> CascAID+ predstavlja prenosen, cenovno dostopen in uporaben POC test z dobro občutljivostjo. Prednost CascAID je to, da se ga lahko hitro prilagodi na zelo različne tarče (bakterijske infekcije, hitro razvijujoče se virusne epidemije, z rakom povezane okužbe …). CascAID bi lahko uporabljal zdravnik ali pacient brez dodatnega »potovanja« vzorca do laboratorija. Sama analiza traja približno 30 minut in da dovolj točne informacije, da bi lahko (med drugim) tudi pripomogel k zmanjšanju rezistence bakterij na antibiotike, kar je bil povod za samo izdelavo CascAID sistema.<br /> ==Literatura==<br /> 1. [http://2017.igem.org/Team:Munich Projekt iGEM 2017, ekipa Munich]&lt;br&gt;<br /> 2. Liu L, Li X, Ma J, Li Z, You L, Wang J, Wang M, Zhang X, Wang Y. The molecular architecture for RNA-guided RNA cleavage by Cas13a. Cell. 2017 Aug 10;170(4):714-26. &lt;br&gt;<br /> 3. Piepenburg O, Williams CH, Stemple DL, Armes NA. DNA detection using recombination proteins. PLoS biology. 2006 Jun 13;4(7):e204.&lt;br&gt;<br /> 4. Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Konermann S, Joung J, Slaymaker IM, Cox DB, Shmakov S, Makarova KS, Semenova E, Minakhin L, Severinov K. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 2016 Aug 5;353(6299):aaf5573.&lt;br&gt;</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni&diff=13635 2017-12-18T23:25:47Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>(Neža Gaube)<br /> ==Uvod==<br /> Rezistenca na antibiotike postaja zelo velik problem. Zaradi prevelike, napačne in nepotrebne uporabe antibiotikov, se je razvilo že kar nekaj odpornih sevov patogenov (npr. MRSA). Veliko statističnih analiz kaže, da se približno polovica antibiotikov predpiše nepotrebno, saj gre pogosto tudi za virusne okužbe.<br /> Razvoj različnih zelo specifičnih metod (npr. PCR, FISH in ELISA) daje nove možnosti tudi za uporabo sintezne biologije pri ustvarjanju novih in bolj točnih diagnostičnih testov. Trenutne diagnostične metode uporabljajo drago opremo in izobraženo osebje, kar omeji uporabo teh metod. V zadnjem času so na področju detekcije šli v t.i. »&quot;point of care testing&quot;« (POCT), kjer gre za testiranje ob pacientu. Uporablja se različne cenovno ugodne platforme (npr. papirnati trakovi). Tudi pri tem projektu so želeli razviti metodo detekcije na ta način.<br /> Ekipa Munich iz iGEM 2017 si je zamislila, da bi uporabila torej POC test z napravo za in vitro diagnostiko, ker naj bi po njihovi hipotezi bila zmožna ločiti med patogeni (tako virusnimi kot tudi bakterijskimi). Z uporabo take metode bi preprečili oz. zmanjšali neustrezno rabo antibiotikov ter s tem tudi zmanjšali možnost nadaljnje rezistence.<br /> Njihov sistem naj bi vseboval »vse v enem«: priprava vzorca, pomnožitev nukleinskih kislin in detekcija tarče.<br /> <br /> ==Cas13a==<br /> Uporabili so lastnosti nedavno odkritega efektorjega sistema CRISPR/Cas – Cas13a. Ta se razlikuje od ostalih Cas proteinov s tem, da cepi specifično RNA tarče in ne DNA. ). Njegova struktura ni podobna ostalim »običajnim« Cas encimom (npr. Cas9), ampak ima dve HEPN domeni (Cas9 ima HNH in RuvC domeni za cepitev DNA). Cas13a lahko prepozna katero koli zaporedje RNA in se nanj veže. Nima pa sposobnosti, da bi cepil tarčno RNA, ampak ob vezavi pride do konformacijskih sprememb in se odpre HEPN aktivacijsko mesto s katerim potem nespecifično cepi druge RNA.<br /> <br /> Lahko se jo prilagodi na katerokoli zaporedje, kar omogoča, da se napravo naredi specifično za kateri koli patogen. Je tudi zelo specifična in občutljiva, saj zazna tarčno zaporedje tudi če je prisotno le v sledeh. Za delovanje pa Cas13a potrebuje crRNA. iGEM ekipa je pripravila programsko opremo (software) s pomočjo katere lahko lažje pripravimo ustrezno crRNA. Lahko si pa tudi pomagamo s podatkovno bazo z že uporabljenimi crRNA, ki so jo prav tako pripravili v okviru projekta.<br /> <br /> <br /> ==Projekt==<br /> Projekt je bil sestavljen iz treh modulov. &lt;br&gt;<br /> 1) Modul priprave vzorca (liza izbranih patogenov in pomnožitev tarčnih sekvenc dokler ne dosežemo količine RNA, ki jo lahko zaznamo s Cas13a) &lt;br&gt;<br /> 2) Modul čiščenja in karakterizacije Cas13a (priprava Cas13a za diagnostiko)&lt;br&gt;<br /> 3) Modul detekcije (naredi signal viden uporabniku)&lt;br&gt;<br /> Vse tri module so sestavili v prenosno obliko (primeren hardware). Posamezne module so razvijali neodvisno drug od drugega.<br /> <br /> ===1.Modul: Priprava vzorca:===<br /> Cilj je bil torej pridobiti količino tarčne RNA, ki jo lahko zaznamo iz vzorca celic &quot;E. coli&quot;, ki so si jo izbrali za izvedbo poskusa. Najprej so primerjali različne tehnike lize celic. Učinkovitost so preverili z agarozno gelsko elektroforezo.<br /> Uporabili so:<br /> - Liza s kaotropnimi snovmi (na koncu lize je potrebno čiščenje lizata, ki vsebuje toksične kemikalije)<br /> - Inkubacija pri visoki temperaturi z detergenti npr. NaDS (dobili so dobre rezultate, ampak je vseeno potrebna ločitev NaDS od tarčne RNA)<br /> - Liza s toploto (dodatno čiščenje ni potrebno)<br /> Vzorec so čistili z različnimi postopki s silikagelom, a so na koncu vseeno izbrali metodo, kjer dodatno čiščenje ni potrebno. Uporabili so lizo s toploto, ki ji sledi pomnožitev z rekombinazo in polimerazo (RPA). To je izotermna alternativa PCR. Izvaja se pri 37 °C brez potrebe, da bi menjavali temperature, zaradi česar je cenejša metoda. <br /> Potek: Kompleks rekombinaze in začetnega oligonukleotida najprej »najde« mesto na DNA, ki je homologno začetnemu oligonukleotidu. Potem rekombinaza razpre vijačnico pri čemer pride do hibridizacije med začetnim oligonukleotidom in homolognim mestom na DNA. Na tem mestu se vežejo na drugo verigo dna enoverižni vezavni proteini (SSB). Začetni oligonukleotid se podaljša s pomočjo polimeraze pri čemer se ena veriga odstrani. Na novo sintentiziran dvoverižni kompleks pa se uporabi naprej za nadaljnjo pomnoževanje (postopek se ponavlja). RPA je hitra in občutljiva metoda, ampak pogosto problem predstavlja ozadje.<br /> Tarča proteina Cas13a je RNA in ne DNA, zato so sklopili to RPA še z in vitro transkripcijo, ki poteka prav tako pri 37 °C, zato so lahko dodali reagente za transkripcijo kar v to mešanico brez vmesnega čiščenja.<br /> <br /> <br /> ===2. Modul: Čiščenje in karakterizacija Cas13a===<br /> ====Čiščenje====<br /> Pripravili so nove biokocke za ekspresijo in čiščenje proteina Cas13a.<br /> Priprava:<br /> Analizirali so proteine iz družine Cas13a iz družin različnih organizmov. &quot;Leptotrichia buccalis&quot; (Lbu), &quot;Leptotrichia shahii&quot; (Lsh) in &quot;Leptotrichia wadei&quot; (Lwa). Naročili so plazmida za Lbu in Lsh ter protein izrazili v &quot;E.coli Rosetta2&quot;. Za Lwa pa so sami pripravili plazmid in ga izrazili v &quot;E.coli BL21&quot;. Njihov konstrukt je bil sestavljen iz T7 promotorja, His oznake, SUMO oznake, zaporedja proteina in terminatorja. Naredili so fuzijo z majhnim ubikvintinu podobnim proteinom (SUMO), da so povečali topnost Cas13a proteina.<br /> Izolirani protein so očistili z Ni-NTA agarozo. His-SUMO oznaki so cepili s proteazo ter nato še enkrat uporabili Ni-NTA, da so odstranili tiste proteine pri katerih se His oznaka ni odcepila. Na koncu so uporabili še kromatografijo z ločevanjem po velikosti. Čistost dobljenega proteina so preverili še z NaDS-PAGE.<br /> Kljub temu, da so sledili protokolom čiščenja iz literature, le-to ni najbolje uspelo. Ugotovili so, da je čiščenje s His oznako delovalo v redu, kar pomeni, da je bil problem kationsko izmenjevalna kromatografija. Tam so izgubili veliko proteinov. Delo so nadaljevali z nepopolnoma očiščenimi proteini (na sliki poliakrilamidnega gela je poleg lise proteina prisotnih še veliko drugih, kar kaže na precej nečistot). <br /> Vzporedno so delali s proteini Cas13a iz treh različnih organizmov. Zgoraj je opisan le postopek za Lwa, kjer so sami pripravljali tudi konstrukt.<br /> ====Karakterizacija====<br /> Dobljeni Cas13a so karakterizirali z RNaseAlert testom. <br /> <br /> CascAID uporablja torej nespecifično RNazno aktivnost Cas13a, da dobi ojačan signal. V tem modulu so poskrbeli, da pri cepitvi RNA dobijo signal, ki ga je lahko in zanesljivo meriti ter ga uporabnik lahko tudi sam interpretira. Menijo, da je to ključna stopnja projekta, zato so poskusili več možnosti. Test RNaseAlert, test s špinačnim aptamerom, sistem intein-ekstein in druge. Najboljše se je obnesel test RNase Alert, ki je spodaj tudi opisan.<br /> Test RNaseAlert je komercialno dostopni test, ki daje fluorescentni signal s katerim lahko spremljamo aktivnost RNAze. Mešanici tarčne RNA, Cas13a in crRNA so dodali še RNA na katero sta s pomočjo linkerja vezana fluorofor in dušilec (eden na N-konec in drugi na C-konec). Ko pride do cepitve z RNazo, se fluorofor oddalji od dušilca in zato lahko fluorescira. Ker pride do nespecifične RNAzne aktivnosti, je sam signal precej ojačan.<br /> =====Funkcionalnost:=====<br /> Funkcionalnost Cas13 so preverili z uporabo zaporedja 16S rRNA iz E.coli kot tarčno zaporedje. In vitro so prepisali 130 nukleotidov (od 1500). Na podlagi DNA matrice so zasnovali crRNA. Ugotovili so, da sta funkcionalni tako Lbu kot Lwa. Lbu je bil bolj aktiven kot Lwa, kar je v nasprotju s podatki iz literature (Gootenberg in sodelavci, 2017). Pri Lsh pa niso dobili nobenih rezultatov. Nadaljnje poskuse so na podlagi teh podatkov izvajali z Lbu.<br /> =====Specifičnost aktivnosti:=====<br /> Specifičnost aktivnosti Cas13a so preverjali z uporabo različnih tarčnih zaporedij (za &quot;Noro virus&quot;, &quot;Hepatitis C&quot; (HCV) in &quot;Bacillus subtilis&quot;).<br /> Določili so fluorescenco pri vzorcih posameznih bakterij/virusov, kjer je bila dodana ustrezna crRNA. Te vrednosti so primerjali samo z določitvijo fluorescenve v vzorcu, kjer ni bilo prisotne ustrezne crRNA.<br /> Ker se zavedajo, da je možnost kontaminacije velika, so naredili še en poskus. Izbrali so crRNA Norovirusa in dodali posebej 30 nM koncentracije treh različnih organizmov (&quot;Norovirus&quot;, &quot;E. coli&quot; in &quot;HCV&quot;). Ugotovili so, da je prišlo do velikega povečanja fluorescence le v primeru, ko je bil v vzorcu Norovirus. Pri ostalih organizmih do pretiranega povečanja fluorescence ni prišlo. Na podlagi teh podatkov lahko sklepamo, da je ta mehanizem zelo specifičen.<br /> ===3. Modul: Detektor===<br /> Za zaznavanje signala so pa potrebovali cenovno ugoden, prenosljiv in dovolj zanesljiv fluorescentni detektor. S pomočjo modeliranja so si ga zamislili ter nato tudi sestavili. Detektor he narejen na osnovi papirja in lahko zazna fluorescin že v koncentracijah do 10 nM. Njegova cena je manj kot 15 dolarjev.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> CascAID+ predstavlja prenosen, cenovno dostopen in uporaben POC test z dobro občutljivostjo. Prednost CascAID je to, da se ga lahko hitro prilagodi na zelo različne tarče (bakterijske infekcije, hitro razvijujoče se virusne epidemije, z rakom povezane okužbe …). CascAID bi lahko uporabljal zdravnik ali pacient brez dodatnega »potovanja« vzorca do laboratorija. Sama analiza traja približno 30 minut in da dovolj točne informacije, da bi lahko (med drugim) tudi pripomogel k zmanjšanju rezistence bakterij na antibiotike, kar je bil povod za samo izdelavo CascAID sistema.<br /> ==Literatura==<br /> 1. [http://2017.igem.org/Team:Munich Projekt iGEM 2017, ekipa Munich]&lt;br&gt;<br /> 2. Liu L, Li X, Ma J, Li Z, You L, Wang J, Wang M, Zhang X, Wang Y. The molecular architecture for RNA-guided RNA cleavage by Cas13a. Cell. 2017 Aug 10;170(4):714-26. &lt;br&gt;<br /> 3. Piepenburg O, Williams CH, Stemple DL, Armes NA. DNA detection using recombination proteins. PLoS biology. 2006 Jun 13;4(7):e204.&lt;br&gt;<br /> 4. Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Konermann S, Joung J, Slaymaker IM, Cox DB, Shmakov S, Makarova KS, Semenova E, Minakhin L, Severinov K. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 2016 Aug 5;353(6299):aaf5573.&lt;br&gt;</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni&diff=13634 2017-12-18T23:25:21Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>(Neža Gaube)<br /> ==Uvod==<br /> Rezistenca na antibiotike postaja zelo velik problem. Zaradi prevelike, napačne in nepotrebne uporabe antibiotikov, se je razvilo že kar nekaj odpornih sevov patogenov (npr. MRSA). Veliko statističnih analiz kaže, da se približno polovica antibiotikov predpiše nepotrebno, saj gre pogosto tudi za virusne okužbe.<br /> Razvoj različnih zelo specifičnih metod (npr. PCR, FISH in ELISA) daje nove možnosti tudi za uporabo sintezne biologije pri ustvarjanju novih in bolj točnih diagnostičnih testov. Trenutne diagnostične metode uporabljajo drago opremo in izobraženo osebje, kar omeji uporabo teh metod. V zadnjem času so na področju detekcije šli v t.i. »&quot;point of care testing&quot;« (POCT), kjer gre za testiranje ob pacientu. Uporablja se različne cenovno ugodne platforme (npr. papirnati trakovi). Tudi pri tem projektu so želeli razviti metodo detekcije na ta način.<br /> Ekipa Munich iz iGEM 2017 si je zamislila, da bi uporabila torej POC test z napravo za in vitro diagnostiko, ker naj bi po njihovi hipotezi bila zmožna ločiti med patogeni (tako virusnimi kot tudi bakterijskimi). Z uporabo take metode bi preprečili oz. zmanjšali neustrezno rabo antibiotikov ter s tem tudi zmanjšali možnost nadaljnje rezistence.<br /> Njihov sistem naj bi vseboval »vse v enem«: priprava vzorca, pomnožitev nukleinskih kislin in detekcija tarče.<br /> <br /> ==Cas13a==<br /> Uporabili so lastnosti nedavno odkritega efektorjega sistema CRISPR/Cas – Cas13a. Ta se razlikuje od ostalih Cas proteinov s tem, da cepi specifično RNA tarče in ne DNA. ). Njegova struktura ni podobna ostalim »običajnim« Cas encimom (npr. Cas9), ampak ima dve HEPN domeni (Cas9 ima HNH in RuvC domeni za cepitev DNA). Cas13a lahko prepozna katero koli zaporedje RNA in se nanj veže. Nima pa sposobnosti, da bi cepil tarčno RNA, ampak ob vezavi pride do konformacijskih sprememb in se odpre HEPN aktivacijsko mesto s katerim potem nespecifično cepi druge RNA.<br /> <br /> Lahko se jo prilagodi na katerokoli zaporedje, kar omogoča, da se napravo naredi specifično za kateri koli patogen. Je tudi zelo specifična in občutljiva, saj zazna tarčno zaporedje tudi če je prisotno le v sledeh. Za delovanje pa Cas13a potrebuje crRNA. iGEM ekipa je pripravila programsko opremo (software) s pomočjo katere lahko lažje pripravimo ustrezno crRNA. Lahko si pa tudi pomagamo s podatkovno bazo z že uporabljenimi crRNA, ki so jo prav tako pripravili v okviru projekta.<br /> <br /> <br /> ==Projekt==<br /> Projekt je bil sestavljen iz treh modulov. &lt;br&gt;<br /> 1) Modul priprave vzorca (liza izbranih patogenov in pomnožitev tarčnih sekvenc dokler ne dosežemo količine RNA, ki jo lahko zaznamo s Cas13a) &lt;br&gt;<br /> 2) Modul čiščenja in karakterizacije Cas13a (priprava Cas13a za diagnostiko)&lt;br&gt;<br /> 3) Modul detekcije (naredi signal viden uporabniku)&lt;br&gt;<br /> Vse tri module so sestavili v prenosno obliko (primeren hardware). Posamezne module so razvijali neodvisno drug od drugega.<br /> <br /> ===1.Modul: Priprava vzorca:===<br /> Cilj je bil torej pridobiti količino tarčne RNA, ki jo lahko zaznamo iz vzorca celic &quot;E. coli&quot;, ki so si jo izbrali za izvedbo poskusa. Najprej so primerjali različne tehnike lize celic. Učinkovitost so preverili z agarozno gelsko elektroforezo.<br /> Uporabili so:<br /> - Liza s kaotropnimi snovmi (na koncu lize je potrebno čiščenje lizata, ki vsebuje toksične kemikalije)<br /> - Inkubacija pri visoki temperaturi z detergenti npr. NaDS (dobili so dobre rezultate, ampak je vseeno potrebna ločitev NaDS od tarčne RNA)<br /> - Liza s toploto (dodatno čiščenje ni potrebno)<br /> Vzorec so čistili z različnimi postopki s silikagelom, a so na koncu vseeno izbrali metodo, kjer dodatno čiščenje ni potrebno. Uporabili so lizo s toploto, ki ji sledi pomnožitev z rekombinazo in polimerazo (RPA). To je izotermna alternativa PCR. Izvaja se pri 37 °C brez potrebe, da bi menjavali temperature, zaradi česar je cenejša metoda. <br /> Potek: Kompleks rekombinaze in začetnega oligonukleotida najprej »najde« mesto na DNA, ki je homologno začetnemu oligonukleotidu. Potem rekombinaza razpre vijačnico pri čemer pride do hibridizacije med začetnim oligonukleotidom in homolognim mestom na DNA. Na tem mestu se vežejo na drugo verigo dna enoverižni vezavni proteini (SSB). Začetni oligonukleotid se podaljša s pomočjo polimeraze pri čemer se ena veriga odstrani. Na novo sintentiziran dvoverižni kompleks pa se uporabi naprej za nadaljnjo pomnoževanje (postopek se ponavlja). RPA je hitra in občutljiva metoda, ampak pogosto problem predstavlja ozadje.<br /> Tarča proteina Cas13a je RNA in ne DNA, zato so sklopili to RPA še z in vitro transkripcijo, ki poteka prav tako pri 37 °C, zato so lahko dodali reagente za transkripcijo kar v to mešanico brez vmesnega čiščenja.<br /> <br /> <br /> ===2. Modul: Čiščenje in karakterizacija Cas13a===<br /> ====Čiščenje====<br /> Pripravili so nove biokocke za ekspresijo in čiščenje proteina Cas13a.<br /> Priprava:<br /> Analizirali so proteine iz družine Cas13a iz družin različnih organizmov. &quot;Leptotrichia buccalis&quot; (Lbu), &quot;Leptotrichia shahii&quot; (Lsh) in &quot;Leptotrichia wadei&quot; (Lwa). Naročili so plazmida za Lbu in Lsh ter protein izrazili v &quot;E.coli Rosetta2&quot;. Za Lwa pa so sami pripravili plazmid in ga izrazili v &quot;E.coli BL21&quot;. Njihov konstrukt je bil sestavljen iz T7 promotorja, His oznake, SUMO oznake, zaporedja proteina in terminatorja. Naredili so fuzijo z majhnim ubikvintinu podobnim proteinom (SUMO), da so povečali topnost Cas13a proteina.<br /> Izolirani protein so očistili z Ni-NTA agarozo. His-SUMO oznaki so cepili s proteazo ter nato še enkrat uporabili Ni-NTA, da so odstranili tiste proteine pri katerih se His oznaka ni odcepila. Na koncu so uporabili še kromatografijo z ločevanjem po velikosti. Čistost dobljenega proteina so preverili še z NaDS-PAGE.<br /> Kljub temu, da so sledili protokolom čiščenja iz literature, le-to ni najbolje uspelo. Ugotovili so, da je čiščenje s His oznako delovalo v redu, kar pomeni, da je bil problem kationsko izmenjevalna kromatografija. Tam so izgubili veliko proteinov. Delo so nadaljevali z nepopolnoma očiščenimi proteini (na sliki poliakrilamidnega gela je poleg lise proteina prisotnih še veliko drugih, kar kaže na precej nečistot). <br /> Vzporedno so delali s proteini Cas13a iz treh različnih organizmov. Zgoraj je opisan le postopek za Lwa, kjer so sami pripravljali tudi konstrukt.<br /> ====Karakterizacija====<br /> Dobljeni Cas13a so karakterizirali z RNaseAlert testom. <br /> <br /> CascAID uporablja torej nespecifično RNazno aktivnost Cas13a, da dobi ojačan signal. V tem modulu so poskrbeli, da pri cepitvi RNA dobijo signal, ki ga je lahko in zanesljivo meriti ter ga uporabnik lahko tudi sam interpretira. Menijo, da je to ključna stopnja projekta, zato so poskusili več možnosti. Test RNaseAlert, test s špinačnim aptamerom, sistem intein-ekstein in druge. Najboljše se je obnesel test RNase Alert, ki je spodaj tudi opisan.<br /> Test RNaseAlert je komercialno dostopni test, ki daje fluorescentni signal s katerim lahko spremljamo aktivnost RNAze. Mešanici tarčne RNA, Cas13a in crRNA so dodali še RNA na katero sta s pomočjo linkerja vezana fluorofor in dušilec (eden na N-konec in drugi na C-konec). Ko pride do cepitve z RNazo, se fluorofor oddalji od dušilca in zato lahko fluorescira. Ker pride do nespecifične RNAzne aktivnosti, je sam signal precej ojačan.<br /> =====Funkcionalnost:=====<br /> Funkcionalnost Cas13 so preverili z uporabo zaporedja 16S rRNA iz E.coli kot tarčno zaporedje. In vitro so prepisali 130 nukleotidov (od 1500). Na podlagi DNA matrice so zasnovali crRNA. Ugotovili so, da sta funkcionalni tako Lbu kot Lwa. Lbu je bil bolj aktiven kot Lwa, kar je v nasprotju s podatki iz literature (Gootenberg in sodelavci, 2017). Pri Lsh pa niso dobili nobenih rezultatov. Nadaljnje poskuse so na podlagi teh podatkov izvajali z Lbu.<br /> =====Specifičnost aktivnosti:=====<br /> Specifičnost aktivnosti Cas13a so preverjali z uporabo različnih tarčnih zaporedij (za &quot;Noro virus&quot;, &quot;Hepatitis C&quot; (HCV) in &quot;Bacillus subtilis&quot;).<br /> Določili so fluorescenco pri vzorcih posameznih bakterij/virusov, kjer je bila dodana ustrezna crRNA. Te vrednosti so primerjali samo z določitvijo fluorescenve v vzorcu, kjer ni bilo prisotne ustrezne crRNA.<br /> Ker se zavedajo, da je možnost kontaminacije velika, so naredili še en poskus. Izbrali so crRNA Norovirusa in dodali posebej 30 nM koncentracije treh različnih organizmov (&quot;Norovirus&quot;, &quot;E. coli&quot; in &quot;HCV&quot;). Ugotovili so, da je prišlo do velikega povečanja fluorescence le v primeru, ko je bil v vzorcu Norovirus. Pri ostalih organizmih do pretiranega povečanja fluorescence ni prišlo. Na podlagi teh podatkov lahko sklepamo, da je ta mehanizem zelo specifičen.<br /> ===3. Modul: Detektor===<br /> Za zaznavanje signala so pa potrebovali cenovno ugoden, prenosljiv in dovolj zanesljiv fluorescentni detektor. S pomočjo modeliranja so si ga zamislili ter nato tudi sestavili. Detektor he narejen na osnovi papirja in lahko zazna fluorescin že v koncentracijah do 10 nM. Njegova cena je manj kot 15 dolarjev.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> CascAID+ predstavlja prenosen, cenovno dostopen in uporaben POC test z dobro občutljivostjo. Prednost CascAID je to, da se ga lahko hitro prilagodi na zelo različne tarče (bakterijske infekcije, hitro razvijujoče se virusne epidemije, z rakom povezane okužbe …). CascAID bi lahko uporabljal zdravnik ali pacient brez dodatnega »potovanja« vzorca do laboratorija. Sama analiza traja približno 30 minut in da dovolj točne informacije, da bi lahko (med drugim) tudi pripomogel k zmanjšanju rezistence bakterij na antibiotike, kar je bil povod za samo izdelavo CascAID sistema.<br /> ==Literatura==<br /> 1. [http://2017.igem.org/Team:Munich Članek iGEM 2017, ekipa Munich]&lt;br&gt;<br /> 2. Liu L, Li X, Ma J, Li Z, You L, Wang J, Wang M, Zhang X, Wang Y. The molecular architecture for RNA-guided RNA cleavage by Cas13a. Cell. 2017 Aug 10;170(4):714-26. &lt;br&gt;<br /> 3. Piepenburg O, Williams CH, Stemple DL, Armes NA. DNA detection using recombination proteins. PLoS biology. 2006 Jun 13;4(7):e204.&lt;br&gt;<br /> 4. Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Konermann S, Joung J, Slaymaker IM, Cox DB, Shmakov S, Makarova KS, Semenova E, Minakhin L, Severinov K. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 2016 Aug 5;353(6299):aaf5573.&lt;br&gt;</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni&diff=13633 2017-12-18T23:24:10Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>(Neža Gaube)<br /> ==Uvod==<br /> Rezistenca na antibiotike postaja zelo velik problem. Zaradi prevelike, napačne in nepotrebne uporabe antibiotikov, se je razvilo že kar nekaj odpornih sevov patogenov (npr. MRSA). Veliko statističnih analiz kaže, da se približno polovica antibiotikov predpiše nepotrebno, saj gre pogosto tudi za virusne okužbe.<br /> Razvoj različnih zelo specifičnih metod (npr. PCR, FISH in ELISA) daje nove možnosti tudi za uporabo sintezne biologije pri ustvarjanju novih in bolj točnih diagnostičnih testov. Trenutne diagnostične metode uporabljajo drago opremo in izobraženo osebje, kar omeji uporabo teh metod. V zadnjem času so na področju detekcije šli v t.i. »&quot;point of care testing&quot;« (POCT), kjer gre za testiranje ob pacientu. Uporablja se različne cenovno ugodne platforme (npr. papirnati trakovi). Tudi pri tem projektu so želeli razviti metodo detekcije na ta način.<br /> Ekipa Munich iz iGEM 2017 si je zamislila, da bi uporabila torej POC test z napravo za in vitro diagnostiko, ker naj bi po njihovi hipotezi bila zmožna ločiti med patogeni (tako virusnimi kot tudi bakterijskimi). Z uporabo take metode bi preprečili oz. zmanjšali neustrezno rabo antibiotikov ter s tem tudi zmanjšali možnost nadaljnje rezistence.<br /> Njihov sistem naj bi vseboval »vse v enem«: priprava vzorca, pomnožitev nukleinskih kislin in detekcija tarče.<br /> <br /> ==Cas13a==<br /> Uporabili so lastnosti nedavno odkritega efektorjega sistema CRISPR/Cas – Cas13a. Ta se razlikuje od ostalih Cas proteinov s tem, da cepi specifično RNA tarče in ne DNA. ). Njegova struktura ni podobna ostalim »običajnim« Cas encimom (npr. Cas9), ampak ima dve HEPN domeni (Cas9 ima HNH in RuvC domeni za cepitev DNA). Cas13a lahko prepozna katero koli zaporedje RNA in se nanj veže. Nima pa sposobnosti, da bi cepil tarčno RNA, ampak ob vezavi pride do konformacijskih sprememb in se odpre HEPN aktivacijsko mesto s katerim potem nespecifično cepi druge RNA.<br /> <br /> Lahko se jo prilagodi na katerokoli zaporedje, kar omogoča, da se napravo naredi specifično za kateri koli patogen. Je tudi zelo specifična in občutljiva, saj zazna tarčno zaporedje tudi če je prisotno le v sledeh. Za delovanje pa Cas13a potrebuje crRNA. iGEM ekipa je pripravila programsko opremo (software) s pomočjo katere lahko lažje pripravimo ustrezno crRNA. Lahko si pa tudi pomagamo s podatkovno bazo z že uporabljenimi crRNA, ki so jo prav tako pripravili v okviru projekta.<br /> <br /> <br /> ==Projekt==<br /> Projekt je bil sestavljen iz treh modulov. &lt;br&gt;<br /> 1) Modul priprave vzorca (liza izbranih patogenov in pomnožitev tarčnih sekvenc dokler ne dosežemo količine RNA, ki jo lahko zaznamo s Cas13a) &lt;br&gt;<br /> 2) Modul čiščenja in karakterizacije Cas13a (priprava Cas13a za diagnostiko)&lt;br&gt;<br /> 3) Modul detekcije (naredi signal viden uporabniku)&lt;br&gt;<br /> Vse tri module so sestavili v prenosno obliko (primeren hardware). Posamezne module so razvijali neodvisno drug od drugega.<br /> <br /> ===1.Modul: Priprava vzorca:===<br /> Cilj je bil torej pridobiti količino tarčne RNA, ki jo lahko zaznamo iz vzorca celic &quot;E. coli&quot;, ki so si jo izbrali za izvedbo poskusa. Najprej so primerjali različne tehnike lize celic. Učinkovitost so preverili z agarozno gelsko elektroforezo.<br /> Uporabili so:<br /> - Liza s kaotropnimi snovmi (na koncu lize je potrebno čiščenje lizata, ki vsebuje toksične kemikalije)<br /> - Inkubacija pri visoki temperaturi z detergenti npr. NaDS (dobili so dobre rezultate, ampak je vseeno potrebna ločitev NaDS od tarčne RNA)<br /> - Liza s toploto (dodatno čiščenje ni potrebno)<br /> Vzorec so čistili z različnimi postopki s silikagelom, a so na koncu vseeno izbrali metodo, kjer dodatno čiščenje ni potrebno. Uporabili so lizo s toploto, ki ji sledi pomnožitev z rekombinazo in polimerazo (RPA). To je izotermna alternativa PCR. Izvaja se pri 37 °C brez potrebe, da bi menjavali temperature, zaradi česar je cenejša metoda. <br /> Potek: Kompleks rekombinaze in začetnega oligonukleotida najprej »najde« mesto na DNA, ki je homologno začetnemu oligonukleotidu. Potem rekombinaza razpre vijačnico pri čemer pride do hibridizacije med začetnim oligonukleotidom in homolognim mestom na DNA. Na tem mestu se vežejo na drugo verigo dna enoverižni vezavni proteini (SSB). Začetni oligonukleotid se podaljša s pomočjo polimeraze pri čemer se ena veriga odstrani. Na novo sintentiziran dvoverižni kompleks pa se uporabi naprej za nadaljnjo pomnoževanje (postopek se ponavlja). RPA je hitra in občutljiva metoda, ampak pogosto problem predstavlja ozadje.<br /> Tarča proteina Cas13a je RNA in ne DNA, zato so sklopili to RPA še z in vitro transkripcijo, ki poteka prav tako pri 37 °C, zato so lahko dodali reagente za transkripcijo kar v to mešanico brez vmesnega čiščenja.<br /> <br /> <br /> ===2. Modul: Čiščenje in karakterizacija Cas13a===<br /> ====Čiščenje====<br /> Pripravili so nove biokocke za ekspresijo in čiščenje proteina Cas13a.<br /> Priprava:<br /> Analizirali so proteine iz družine Cas13a iz družin različnih organizmov. &quot;Leptotrichia buccalis&quot; (Lbu), &quot;Leptotrichia shahii&quot; (Lsh) in &quot;Leptotrichia wadei&quot; (Lwa). Naročili so plazmida za Lbu in Lsh ter protein izrazili v &quot;E.coli Rosetta2&quot;. Za Lwa pa so sami pripravili plazmid in ga izrazili v &quot;E.coli BL21&quot;. Njihov konstrukt je bil sestavljen iz T7 promotorja, His oznake, SUMO oznake, zaporedja proteina in terminatorja. Naredili so fuzijo z majhnim ubikvintinu podobnim proteinom (SUMO), da so povečali topnost Cas13a proteina.<br /> Izolirani protein so očistili z Ni-NTA agarozo. His-SUMO oznaki so cepili s proteazo ter nato še enkrat uporabili Ni-NTA, da so odstranili tiste proteine pri katerih se His oznaka ni odcepila. Na koncu so uporabili še kromatografijo z ločevanjem po velikosti. Čistost dobljenega proteina so preverili še z NaDS-PAGE.<br /> Kljub temu, da so sledili protokolom čiščenja iz literature, le-to ni najbolje uspelo. Ugotovili so, da je čiščenje s His oznako delovalo v redu, kar pomeni, da je bil problem kationsko izmenjevalna kromatografija. Tam so izgubili veliko proteinov. Delo so nadaljevali z nepopolnoma očiščenimi proteini (na sliki poliakrilamidnega gela je poleg lise proteina prisotnih še veliko drugih, kar kaže na precej nečistot). <br /> Vzporedno so delali s proteini Cas13a iz treh različnih organizmov. Zgoraj je opisan le postopek za Lwa, kjer so sami pripravljali tudi konstrukt.<br /> ====Karakterizacija====<br /> Dobljeni Cas13a so karakterizirali z RNaseAlert testom. <br /> <br /> CascAID uporablja torej nespecifično RNazno aktivnost Cas13a, da dobi ojačan signal. V tem modulu so poskrbeli, da pri cepitvi RNA dobijo signal, ki ga je lahko in zanesljivo meriti ter ga uporabnik lahko tudi sam interpretira. Menijo, da je to ključna stopnja projekta, zato so poskusili več možnosti. Test RNaseAlert, test s špinačnim aptamerom, sistem intein-ekstein in druge. Najboljše se je obnesel test RNase Alert, ki je spodaj tudi opisan.<br /> Test RNaseAlert je komercialno dostopni test, ki daje fluorescentni signal s katerim lahko spremljamo aktivnost RNAze. Mešanici tarčne RNA, Cas13a in crRNA so dodali še RNA na katero sta s pomočjo linkerja vezana fluorofor in dušilec (eden na N-konec in drugi na C-konec). Ko pride do cepitve z RNazo, se fluorofor oddalji od dušilca in zato lahko fluorescira. Ker pride do nespecifične RNAzne aktivnosti, je sam signal precej ojačan.<br /> =====Funkcionalnost:=====<br /> Funkcionalnost Cas13 so preverili z uporabo zaporedja 16S rRNA iz E.coli kot tarčno zaporedje. In vitro so prepisali 130 nukleotidov (od 1500). Na podlagi DNA matrice so zasnovali crRNA. Ugotovili so, da sta funkcionalni tako Lbu kot Lwa. Lbu je bil bolj aktiven kot Lwa, kar je v nasprotju s podatki iz literature (Gootenberg in sodelavci, 2017). Pri Lsh pa niso dobili nobenih rezultatov. Nadaljnje poskuse so na podlagi teh podatkov izvajali z Lbu.<br /> =====Specifičnost aktivnosti:=====<br /> Specifičnost aktivnosti Cas13a so preverjali z uporabo različnih tarčnih zaporedij (za &quot;Noro virus&quot;, &quot;Hepatitis C&quot; (HCV) in &quot;Bacillus subtilis&quot;).<br /> Določili so fluorescenco pri vzorcih posameznih bakterij/virusov, kjer je bila dodana ustrezna crRNA. Te vrednosti so primerjali samo z določitvijo fluorescenve v vzorcu, kjer ni bilo prisotne ustrezne crRNA.<br /> Ker se zavedajo, da je možnost kontaminacije velika, so naredili še en poskus. Izbrali so crRNA Norovirusa in dodali posebej 30 nM koncentracije treh različnih organizmov (&quot;Norovirus&quot;, &quot;E. coli&quot; in &quot;HCV&quot;). Ugotovili so, da je prišlo do velikega povečanja fluorescence le v primeru, ko je bil v vzorcu Norovirus. Pri ostalih organizmih do pretiranega povečanja fluorescence ni prišlo. Na podlagi teh podatkov lahko sklepamo, da je ta mehanizem zelo specifičen.<br /> ===3. Modul: Detektor===<br /> Za zaznavanje signala so pa potrebovali cenovno ugoden, prenosljiv in dovolj zanesljiv fluorescentni detektor. S pomočjo modeliranja so si ga zamislili ter nato tudi sestavili. Detektor he narejen na osnovi papirja in lahko zazna fluorescin že v koncentracijah do 10 nM. Njegova cena je manj kot 15 dolarjev.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> CascAID+ predstavlja prenosen, cenovno dostopen in uporaben POC test z dobro občutljivostjo. Prednost CascAID je to, da se ga lahko hitro prilagodi na zelo različne tarče (bakterijske infekcije, hitro razvijujoče se virusne epidemije, z rakom povezane okužbe …). CascAID bi lahko uporabljal zdravnik ali pacient brez dodatnega »potovanja« vzorca do laboratorija. Sama analiza traja približno 30 minut in da dovolj točne informacije, da bi lahko (med drugim) tudi pripomogel k zmanjšanju rezistence bakterij na antibiotike, kar je bil povod za samo izdelavo CascAID sistema.<br /> ==Literatura==<br /> 1. Članek iGEM &lt;br&gt;<br /> 2. Liu L, Li X, Ma J, Li Z, You L, Wang J, Wang M, Zhang X, Wang Y. The molecular architecture for RNA-guided RNA cleavage by Cas13a. Cell. 2017 Aug 10;170(4):714-26. &lt;br&gt;<br /> 3. Piepenburg O, Williams CH, Stemple DL, Armes NA. DNA detection using recombination proteins. PLoS biology. 2006 Jun 13;4(7):e204.&lt;br&gt;<br /> 4. Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Konermann S, Joung J, Slaymaker IM, Cox DB, Shmakov S, Makarova KS, Semenova E, Minakhin L, Severinov K. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 2016 Aug 5;353(6299):aaf5573.&lt;br&gt;</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni&diff=13632 2017-12-18T23:22:28Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>(Neža Gaube)<br /> ==Uvod==<br /> Rezistenca na antibiotike postaja zelo velik problem. Zaradi prevelike, napačne in nepotrebne uporabe antibiotikov, se je razvilo že kar nekaj odpornih sevov patogenov (npr. MRSA). Veliko statističnih analiz kaže, da se približno polovica antibiotikov predpiše nepotrebno, saj gre pogosto tudi za virusne okužbe.<br /> Razvoj različnih zelo specifičnih metod (npr. PCR, FISH in ELISA) daje nove možnosti tudi za uporabo sintezne biologije pri ustvarjanju novih in bolj točnih diagnostičnih testov. Trenutne diagnostične metode uporabljajo drago opremo in izobraženo osebje, kar omeji uporabo teh metod. V zadnjem času so na področju detekcije šli v t.i. »&quot;point of care testing&quot;« (POCT), kjer gre za testiranje ob pacientu. Uporablja se različne cenovno ugodne platforme (npr. papirnati trakovi). Tudi pri tem projektu so želeli razviti metodo detekcije na ta način.<br /> Ekipa Munich iz iGEM 2017 si je zamislila, da bi uporabila torej POC test z napravo za in vitro diagnostiko, ker naj bi po njihovi hipotezi bila zmožna ločiti med patogeni (tako virusnimi kot tudi bakterijskimi). Z uporabo take metode bi preprečili oz. zmanjšali neustrezno rabo antibiotikov ter s tem tudi zmanjšali možnost nadaljnje rezistence.<br /> Njihov sistem naj bi vseboval »vse v enem«: priprava vzorca, pomnožitev nukleinskih kislin in detekcija tarče.<br /> <br /> ==Cas13a==<br /> Uporabili so lastnosti nedavno odkritega efektorjega sistema CRISPR/Cas – Cas13a. Ta se razlikuje od ostalih Cas proteinov s tem, da cepi specifično RNA tarče in ne DNA. ). Njegova struktura ni podobna ostalim »običajnim« Cas encimom (npr. Cas9), ampak ima dve HEPN domeni (Cas9 ima HNH in RuvC domeni za cepitev DNA). Cas13a lahko prepozna katero koli zaporedje RNA in se nanj veže. Nima pa sposobnosti, da bi cepil tarčno RNA, ampak ob vezavi pride do konformacijskih sprememb in se odpre HEPN aktivacijsko mesto s katerim potem nespecifično cepi druge RNA.<br /> <br /> Lahko se jo prilagodi na katerokoli zaporedje, kar omogoča, da se napravo naredi specifično za kateri koli patogen. Je tudi zelo specifična in občutljiva, saj zazna tarčno zaporedje tudi če je prisotno le v sledeh. Za delovanje pa Cas13a potrebuje crRNA. iGEM ekipa je pripravila programsko opremo (software) s pomočjo katere lahko lažje pripravimo ustrezno crRNA. Lahko si pa tudi pomagamo s podatkovno bazo z že uporabljenimi crRNA, ki so jo prav tako pripravili v okviru projekta.<br /> <br /> <br /> ==Projekt==<br /> Projekt je bil sestavljen iz treh modulov. &lt;br&gt;<br /> 1) Modul priprave vzorca (liza izbranih patogenov in pomnožitev tarčnih sekvenc dokler ne dosežemo količine RNA, ki jo lahko zaznamo s Cas13a) &lt;br&gt;<br /> 2) Modul čiščenja in karakterizacije Cas13a (priprava Cas13a za diagnostiko)&lt;br&gt;<br /> 3) Modul detekcije (naredi signal viden uporabniku)&lt;br&gt;<br /> Vse tri module so sestavili v prenosno obliko (primeren hardware). Posamezne module so razvijali neodvisno drug od drugega.<br /> <br /> ===1.Modul: Priprava vzorca:===<br /> Cilj je bil torej pridobiti količino tarčne RNA, ki jo lahko zaznamo iz vzorca celic &quot;E. coli&quot;, ki so si jo izbrali za izvedbo poskusa. Najprej so primerjali različne tehnike lize celic. Učinkovitost so preverili z agarozno gelsko elektroforezo.<br /> Uporabili so:<br /> - Liza s kaotropnimi snovmi (na koncu lize je potrebno čiščenje lizata, ki vsebuje toksične kemikalije)<br /> - Inkubacija pri visoki temperaturi z detergenti npr. NaDS (dobili so dobre rezultate, ampak je vseeno potrebna ločitev NaDS od tarčne RNA)<br /> - Liza s toploto (dodatno čiščenje ni potrebno)<br /> Vzorec so čistili z različnimi postopki s silikagelom, a so na koncu vseeno izbrali metodo, kjer dodatno čiščenje ni potrebno. Uporabili so lizo s toploto, ki ji sledi pomnožitev z rekombinazo in polimerazo (RPA). To je izotermna alternativa PCR. Izvaja se pri 37 °C brez potrebe, da bi menjavali temperature, zaradi česar je cenejša metoda. <br /> Potek: Kompleks rekombinaze in začetnega oligonukleotida najprej »najde« mesto na DNA, ki je homologno začetnemu oligonukleotidu. Potem rekombinaza razpre vijačnico pri čemer pride do hibridizacije med začetnim oligonukleotidom in homolognim mestom na DNA. Na tem mestu se vežejo na drugo verigo dna enoverižni vezavni proteini (SSB). Začetni oligonukleotid se podaljša s pomočjo polimeraze pri čemer se ena veriga odstrani. Na novo sintentiziran dvoverižni kompleks pa se uporabi naprej za nadaljnjo pomnoževanje (postopek se ponavlja). RPA je hitra in občutljiva metoda, ampak pogosto problem predstavlja ozadje.<br /> Tarča proteina Cas13a je RNA in ne DNA, zato so sklopili to RPA še z in vitro transkripcijo, ki poteka prav tako pri 37 °C, zato so lahko dodali reagente za transkripcijo kar v to mešanico brez vmesnega čiščenja.<br /> <br /> <br /> ===2. Modul: Čiščenje in karakterizacija Cas13a===<br /> ====Čiščenje====<br /> Pripravili so nove biokocke za ekspresijo in čiščenje proteina Cas13a.<br /> Priprava:<br /> Analizirali so proteine iz družine Cas13a iz družin različnih organizmov. &quot;Leptotrichia buccalis&quot; (Lbu), &quot;Leptotrichia shahii&quot; (Lsh) in &quot;Leptotrichia wadei&quot; (Lwa). Naročili so plazmida za Lbu in Lsh ter protein izrazili v &quot;E.coli Rosetta2&quot;. Za Lwa pa so sami pripravili plazmid in ga izrazili v &quot;E.coli BL21&quot;. Njihov konstrukt je bil sestavljen iz T7 promotorja, His oznake, SUMO oznake, zaporedja proteina in terminatorja. Naredili so fuzijo z majhnim ubikvintinu podobnim proteinom (SUMO), da so povečali topnost Cas13a proteina.<br /> Izolirani protein so očistili z Ni-NTA agarozo. His-SUMO oznaki so cepili s proteazo ter nato še enkrat uporabili Ni-NTA, da so odstranili tiste proteine pri katerih se His oznaka ni odcepila. Na koncu so uporabili še kromatografijo z ločevanjem po velikosti. Čistost dobljenega proteina so preverili še z NaDS-PAGE.<br /> Kljub temu, da so sledili protokolom čiščenja iz literature, le-to ni najbolje uspelo. Ugotovili so, da je čiščenje s His oznako delovalo v redu, kar pomeni, da je bil problem kationsko izmenjevalna kromatografija. Tam so izgubili veliko proteinov. Delo so nadaljevali z nepopolnoma očiščenimi proteini (na sliki poliakrilamidnega gela je poleg lise proteina prisotnih še veliko drugih, kar kaže na precej nečistot). <br /> Vzporedno so delali s proteini Cas13a iz treh različnih organizmov. Zgoraj je opisan le postopek za Lwa, kjer so sami pripravljali tudi konstrukt.<br /> ====Karakterizacija====<br /> Dobljeni Cas13a so karakterizirali z RNaseAlert testom. <br /> <br /> CascAID uporablja torej nespecifično RNazno aktivnost Cas13a, da dobi ojačan signal. V tem modulu so poskrbeli, da pri cepitvi RNA dobijo signal, ki ga je lahko in zanesljivo meriti ter ga uporabnik lahko tudi sam interpretira. Menijo, da je to ključna stopnja projekta, zato so poskusili več možnosti. Test RNaseAlert, test s špinačnim aptamerom, sistem intein-ekstein in druge. Najboljše se je obnesel test RNase Alert, ki je spodaj tudi opisan.<br /> Test RNaseAlert je komercialno dostopni test, ki daje fluorescentni signal s katerim lahko spremljamo aktivnost RNAze. Mešanici tarčne RNA, Cas13a in crRNA so dodali še RNA na katero sta s pomočjo linkerja vezana fluorofor in dušilec (eden na N-konec in drugi na C-konec). Ko pride do cepitve z RNazo, se fluorofor oddalji od dušilca in zato lahko fluorescira. Ker pride do nespecifične RNAzne aktivnosti, je sam signal precej ojačan.<br /> =====Funkcionalnost:=====<br /> Funkcionalnost Cas13 so preverili z uporabo zaporedja 16S rRNA iz E.coli kot tarčno zaporedje. In vitro so prepisali 130 nukleotidov (od 1500). Na podlagi DNA matrice so zasnovali crRNA. Ugotovili so, da sta funkcionalni tako Lbu kot Lwa. Lbu je bil bolj aktiven kot Lwa, kar je v nasprotju s podatki iz literature (Gootenberg in sodelavci, 2017). Pri Lsh pa niso dobili nobenih rezultatov. Nadaljnje poskuse so na podlagi teh podatkov izvajali z Lbu.<br /> =====Specifičnost aktivnosti:=====<br /> Specifičnost aktivnosti Cas13a so preverjali z uporabo različnih tarčnih zaporedij (za &quot;Noro virus&quot;, &quot;Hepatitis C&quot; (HCV) in &quot;Bacillus subtilis&quot;).<br /> Določili so fluorescenco pri vzorcih posameznih bakterij/virusov, kjer je bila dodana ustrezna crRNA. Te vrednosti so primerjali samo z določitvijo fluorescenve v vzorcu, kjer ni bilo prisotne ustrezne crRNA.<br /> Ker se zavedajo, da je možnost kontaminacije velika, so naredili še en poskus. Izbrali so crRNA Norovirusa in dodali posebej 30 nM koncentracije treh različnih organizmov (&quot;Norovirus&quot;, &quot;E. coli&quot; in &quot;HCV&quot;). Ugotovili so, da je prišlo do velikega povečanja fluorescence le v primeru, ko je bil v vzorcu Norovirus. Pri ostalih organizmih do pretiranega povečanja fluorescence ni prišlo. Na podlagi teh podatkov lahko sklepamo, da je ta mehanizem zelo specifičen.<br /> ===3. Modul: Detektor===<br /> Za zaznavanje signala so pa potrebovali cenovno ugoden, prenosljiv in dovolj zanesljiv fluorescentni detektor. S pomočjo modeliranja so si ga zamislili ter nato tudi sestavili. Detektor he narejen na osnovi papirja in lahko zazna fluorescin že v koncentracijah do 10 nM. Njegova cena je manj kot 15 dolarjev.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> CascAID+ predstavlja prenosen, cenovno dostopen in uporaben POC test z dobro občutljivostjo. Prednost CascAID je to, da se ga lahko hitro prilagodi na zelo različne tarče (bakterijske infekcije, hitro razvijujoče se virusne epidemije, z rakom povezane okužbe …). CascAID bi lahko uporabljal zdravnik ali pacient brez dodatnega »potovanja« vzorca do laboratorija. Sama analiza traja približno 30 minut in da dovolj točne informacije, da bi lahko (med drugim) tudi pripomogel k zmanjšanju rezistence bakterij na antibiotike, kar je bil povod za samo izdelavo CascAID sistema.</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni&diff=13631 2017-12-18T23:20:32Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>(Neža Gaube)<br /> ==Uvod==<br /> Rezistenca na antibiotike postaja zelo velik problem. Zaradi prevelike, napačne in nepotrebne uporabe antibiotikov, se je razvilo že kar nekaj odpornih sevov patogenov (npr. MRSA). Veliko statističnih analiz kaže, da se približno polovica antibiotikov predpiše nepotrebno, saj gre pogosto tudi za virusne okužbe.<br /> Razvoj različnih zelo specifičnih metod (npr. PCR, FISH in ELISA) daje nove možnosti tudi za uporabo sintezne biologije pri ustvarjanju novih in bolj točnih diagnostičnih testov. Trenutne diagnostične metode uporabljajo drago opremo in izobraženo osebje, kar omeji uporabo teh metod. V zadnjem času so na področju detekcije šli v t.i. »&quot;point of care testing&quot;« (POCT), kjer gre za testiranje ob pacientu. Uporablja se različne cenovno ugodne platforme (npr. papirnati trakovi). Tudi pri tem projektu so želeli razviti metodo detekcije na ta način.<br /> Ekipa Munich iz iGEM 2017 si je zamislila, da bi uporabila torej POC test z napravo za in vitro diagnostiko, ker naj bi po njihovi hipotezi bila zmožna ločiti med patogeni (tako virusnimi kot tudi bakterijskimi). Z uporabo take metode bi preprečili oz. zmanjšali neustrezno rabo antibiotikov ter s tem tudi zmanjšali možnost nadaljnje rezistence.<br /> Njihov sistem naj bi vseboval »vse v enem«: priprava vzorca, pomnožitev nukleinskih kislin in detekcija tarče.<br /> <br /> ==Cas13a==<br /> Uporabili so lastnosti nedavno odkritega efektorjega sistema CRISPR/Cas – Cas13a. Ta se razlikuje od ostalih Cas proteinov s tem, da cepi specifično RNA tarče in ne DNA. ). Njegova struktura ni podobna ostalim »običajnim« Cas encimom (npr. Cas9), ampak ima dve HEPN domeni (Cas9 ima HNH in RuvC domeni za cepitev DNA). Cas13a lahko prepozna katero koli zaporedje RNA in se nanj veže. Nima pa sposobnosti, da bi cepil tarčno RNA, ampak ob vezavi pride do konformacijskih sprememb in se odpre HEPN aktivacijsko mesto s katerim potem nespecifično cepi druge RNA.<br /> <br /> Lahko se jo prilagodi na katerokoli zaporedje, kar omogoča, da se napravo naredi specifično za kateri koli patogen. Je tudi zelo specifična in občutljiva, saj zazna tarčno zaporedje tudi če je prisotno le v sledeh. Za delovanje pa Cas13a potrebuje crRNA. iGEM ekipa je pripravila programsko opremo (software) s pomočjo katere lahko lažje pripravimo ustrezno crRNA. Lahko si pa tudi pomagamo s podatkovno bazo z že uporabljenimi crRNA, ki so jo prav tako pripravili v okviru projekta.<br /> <br /> <br /> ==Projekt==<br /> Projekt je bil sestavljen iz treh modulov. <br /> 1) Modul priprave vzorca (liza izbranih patogenov in pomnožitev tarčnih sekvenc dokler ne dosežemo količine RNA, ki jo lahko zaznamo s Cas13a)<br /> 2) Modul čiščenja in karakterizacije Cas13a (priprava Cas13a za diagnostiko)<br /> 3) Modul detekcije (naredi signal viden uporabniku)<br /> Vse tri module so sestavili v prenosno obliko (primeren hardware). Posamezne module so razvijali neodvisno drug od drugega.<br /> <br /> ===1.Modul: Priprava vzorca:===<br /> Cilj je bil torej pridobiti količino tarčne RNA, ki jo lahko zaznamo iz vzorca celic &quot;E. coli&quot;, ki so si jo izbrali za izvedbo poskusa. Najprej so primerjali različne tehnike lize celic. Učinkovitost so preverili z agarozno gelsko elektroforezo.<br /> Uporabili so:<br /> - Liza s kaotropnimi snovmi (na koncu lize je potrebno čiščenje lizata, ki vsebuje toksične kemikalije)<br /> - Inkubacija pri visoki temperaturi z detergenti npr. NaDS (dobili so dobre rezultate, ampak je vseeno potrebna ločitev NaDS od tarčne RNA)<br /> - Liza s toploto (dodatno čiščenje ni potrebno)<br /> Vzorec so čistili z različnimi postopki s silikagelom, a so na koncu vseeno izbrali metodo, kjer dodatno čiščenje ni potrebno. Uporabili so lizo s toploto, ki ji sledi pomnožitev z rekombinazo in polimerazo (RPA). To je izotermna alternativa PCR. Izvaja se pri 37 °C brez potrebe, da bi menjavali temperature, zaradi česar je cenejša metoda. <br /> Potek: Kompleks rekombinaze in začetnega oligonukleotida najprej »najde« mesto na DNA, ki je homologno začetnemu oligonukleotidu. Potem rekombinaza razpre vijačnico pri čemer pride do hibridizacije med začetnim oligonukleotidom in homolognim mestom na DNA. Na tem mestu se vežejo na drugo verigo dna enoverižni vezavni proteini (SSB). Začetni oligonukleotid se podaljša s pomočjo polimeraze pri čemer se ena veriga odstrani. Na novo sintentiziran dvoverižni kompleks pa se uporabi naprej za nadaljnjo pomnoževanje (postopek se ponavlja). RPA je hitra in občutljiva metoda, ampak pogosto problem predstavlja ozadje.<br /> Tarča proteina Cas13a je RNA in ne DNA, zato so sklopili to RPA še z in vitro transkripcijo, ki poteka prav tako pri 37 °C, zato so lahko dodali reagente za transkripcijo kar v to mešanico brez vmesnega čiščenja.<br /> <br /> <br /> ===2. Modul: Čiščenje in karakterizacija Cas13a===<br /> ====Čiščenje====<br /> Pripravili so nove biokocke za ekspresijo in čiščenje proteina Cas13a.<br /> Priprava:<br /> Analizirali so proteine iz družine Cas13a iz družin različnih organizmov. &quot;Leptotrichia buccalis&quot; (Lbu), &quot;Leptotrichia shahii&quot; (Lsh) in &quot;Leptotrichia wadei&quot; (Lwa). Naročili so plazmida za Lbu in Lsh ter protein izrazili v &quot;E.coli Rosetta2&quot;. Za Lwa pa so sami pripravili plazmid in ga izrazili v &quot;E.coli BL21&quot;. Njihov konstrukt je bil sestavljen iz T7 promotorja, His oznake, SUMO oznake, zaporedja proteina in terminatorja. Naredili so fuzijo z majhnim ubikvintinu podobnim proteinom (SUMO), da so povečali topnost Cas13a proteina.<br /> Izolirani protein so očistili z Ni-NTA agarozo. His-SUMO oznaki so cepili s proteazo ter nato še enkrat uporabili Ni-NTA, da so odstranili tiste proteine pri katerih se His oznaka ni odcepila. Na koncu so uporabili še kromatografijo z ločevanjem po velikosti. Čistost dobljenega proteina so preverili še z NaDS-PAGE.<br /> Kljub temu, da so sledili protokolom čiščenja iz literature, le-to ni najbolje uspelo. Ugotovili so, da je čiščenje s His oznako delovalo v redu, kar pomeni, da je bil problem kationsko izmenjevalna kromatografija. Tam so izgubili veliko proteinov. Delo so nadaljevali z nepopolnoma očiščenimi proteini (na sliki poliakrilamidnega gela je poleg lise proteina prisotnih še veliko drugih, kar kaže na precej nečistot). <br /> Vzporedno so delali s proteini Cas13a iz treh različnih organizmov. Zgoraj je opisan le postopek za Lwa, kjer so sami pripravljali tudi konstrukt.<br /> ====Karakterizacija====<br /> Dobljeni Cas13a so karakterizirali z RNaseAlert testom. <br /> <br /> CascAID uporablja torej nespecifično RNazno aktivnost Cas13a, da dobi ojačan signal. V tem modulu so poskrbeli, da pri cepitvi RNA dobijo signal, ki ga je lahko in zanesljivo meriti ter ga uporabnik lahko tudi sam interpretira. Menijo, da je to ključna stopnja projekta, zato so poskusili več možnosti. Test RNaseAlert, test s špinačnim aptamerom, sistem intein-ekstein in druge. Najboljše se je obnesel test RNase Alert, ki je spodaj tudi opisan.<br /> Test RNaseAlert je komercialno dostopni test, ki daje fluorescentni signal s katerim lahko spremljamo aktivnost RNAze. Mešanici tarčne RNA, Cas13a in crRNA so dodali še RNA na katero sta s pomočjo linkerja vezana fluorofor in dušilec (eden na N-konec in drugi na C-konec). Ko pride do cepitve z RNazo, se fluorofor oddalji od dušilca in zato lahko fluorescira. Ker pride do nespecifične RNAzne aktivnosti, je sam signal precej ojačan.<br /> =====Funkcionalnost:=====<br /> Funkcionalnost Cas13 so preverili z uporabo zaporedja 16S rRNA iz E.coli kot tarčno zaporedje. In vitro so prepisali 130 nukleotidov (od 1500). Na podlagi DNA matrice so zasnovali crRNA. Ugotovili so, da sta funkcionalni tako Lbu kot Lwa. Lbu je bil bolj aktiven kot Lwa, kar je v nasprotju s podatki iz literature (Gootenberg in sodelavci, 2017). Pri Lsh pa niso dobili nobenih rezultatov. Nadaljnje poskuse so na podlagi teh podatkov izvajali z Lbu.<br /> =====Specifičnost aktivnosti:=====<br /> Specifičnost aktivnosti Cas13a so preverjali z uporabo različnih tarčnih zaporedij (za &quot;Noro virus&quot;, &quot;Hepatitis C&quot; (HCV) in &quot;Bacillus subtilis&quot;).<br /> Določili so fluorescenco pri vzorcih posameznih bakterij/virusov, kjer je bila dodana ustrezna crRNA. Te vrednosti so primerjali samo z določitvijo fluorescenve v vzorcu, kjer ni bilo prisotne ustrezne crRNA.<br /> Ker se zavedajo, da je možnost kontaminacije velika, so naredili še en poskus. Izbrali so crRNA Norovirusa in dodali posebej 30 nM koncentracije treh različnih organizmov (&quot;Norovirus&quot;, &quot;E. coli&quot; in &quot;HCV&quot;). Ugotovili so, da je prišlo do velikega povečanja fluorescence le v primeru, ko je bil v vzorcu Norovirus. Pri ostalih organizmih do pretiranega povečanja fluorescence ni prišlo. Na podlagi teh podatkov lahko sklepamo, da je ta mehanizem zelo specifičen.<br /> ===3. Modul: Detektor===<br /> Za zaznavanje signala so pa potrebovali cenovno ugoden, prenosljiv in dovolj zanesljiv fluorescentni detektor. S pomočjo modeliranja so si ga zamislili ter nato tudi sestavili. Detektor he narejen na osnovi papirja in lahko zazna fluorescin že v koncentracijah do 10 nM. Njegova cena je manj kot 15 dolarjev.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> CascAID+ predstavlja prenosen, cenovno dostopen in uporaben POC test z dobro občutljivostjo. Prednost CascAID je to, da se ga lahko hitro prilagodi na zelo različne tarče (bakterijske infekcije, hitro razvijujoče se virusne epidemije, z rakom povezane okužbe …). CascAID bi lahko uporabljal zdravnik ali pacient brez dodatnega »potovanja« vzorca do laboratorija. Sama analiza traja približno 30 minut in da dovolj točne informacije, da bi lahko (med drugim) tudi pripomogel k zmanjšanju rezistence bakterij na antibiotike, kar je bil povod za samo izdelavo CascAID sistema.</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2017/18&diff=13630 2017-12-18T23:19:48Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2017/18 študentje predstavljajo naslednje teme:<br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola]&lt;br&gt;<br /> #[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah]&lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] &lt;br&gt;<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezceli%C4%8Dna_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni CascAID - Cas13a test za diagnostiko nalezljivih bolezni]<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.<br /> <br /> ---------------------------<br /> Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):<br /> <br /> 27.11. &lt;br&gt;<br /> 1 Marija Srnko -[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]&lt;br&gt;<br /> 2 Neža Brezovar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SLOVO_RAKU Slovo raku]&lt;br&gt;<br /> <br /> 28.11.&lt;br&gt;<br /> 1 Tjaša Grum - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola]&lt;br&gt;<br /> 2 Urška Černe [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] &lt;br&gt;<br /> 3 Petra Vivod - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense] &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 4.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Sara Kimm Fuhrmann - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ] &lt;br&gt;<br /> 2 Anja Tanšek - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DNA_assembler - DNA assembler] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 5.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Urška Furar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah] &lt;br&gt;<br /> 2 Tina Lekan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] &lt;br&gt;<br /> 3 Katja Malovrh [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin] &lt;br&gt; <br /> 4 Jernej Vidmar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 12.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Helena Jakše - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka] &lt;br&gt;<br /> 2 Tjaša Bensa - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezcelična_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni] &lt;br&gt;<br /> 3 Sabina Štukelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MagicBlock:_interaktivna_platforma_za_sintezno_biologijo MagicBlock: interaktivna platforma za sintezno biologijo] &lt;br&gt;<br /> 4 Amadeja Lapornik [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 19.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Krišelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED] &lt;br&gt; <br /> 2 Vanna Imširović [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Beton-samoporavljaju%C4%87i_sistem Beton-samopopravljajući sistem] &lt;br&gt;<br /> 3 Dominik Dekleva - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] &lt;br&gt;<br /> 4 Neža Gaube [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni CascAID - Cas13a test za diagnostiko nalezljivih bolezni] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 9.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Nastja Marondini &lt;br&gt;<br /> 2 Elizabeta Jevnikar &lt;br&gt;<br /> 3 Nina Roštan &lt;br&gt;<br /> 4 Barbara Lipovšek&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 15.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Matic Kovačič - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/%C5%A0irjenje_genetskega_koda Širjenje genetskega koda]&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 16.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Inge Sotlar &lt;br&gt;<br /> 2 Marija Kisilak&lt;br&gt;<br /> 3 Nataša Traven&lt;br&gt;<br /> 4 Tina Šimunović&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 22.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Mojca Hunski &lt;br&gt;<br /> 2 Tomaž Žagar &lt;br&gt;<br /> 3 Tadej Ulčnik &lt;br&gt;<br /> 4 Jakob Rupert&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 23.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Cirnski &lt;br&gt;<br /> 2 Rok Ferenc &lt;br&gt;<br /> 3&lt;br&gt;<br /> 4&lt;br&gt;</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2017/18&diff=13629 2017-12-18T23:18:25Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2017/18 študentje predstavljajo naslednje teme:<br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola]&lt;br&gt;<br /> #[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah]&lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] &lt;br&gt;<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezceli%C4%8Dna_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED]<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.<br /> <br /> ---------------------------<br /> Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):<br /> <br /> 27.11. &lt;br&gt;<br /> 1 Marija Srnko -[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]&lt;br&gt;<br /> 2 Neža Brezovar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SLOVO_RAKU Slovo raku]&lt;br&gt;<br /> <br /> 28.11.&lt;br&gt;<br /> 1 Tjaša Grum - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola]&lt;br&gt;<br /> 2 Urška Černe [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] &lt;br&gt;<br /> 3 Petra Vivod - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense] &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 4.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Sara Kimm Fuhrmann - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ] &lt;br&gt;<br /> 2 Anja Tanšek - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DNA_assembler - DNA assembler] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 5.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Urška Furar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah] &lt;br&gt;<br /> 2 Tina Lekan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] &lt;br&gt;<br /> 3 Katja Malovrh [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin] &lt;br&gt; <br /> 4 Jernej Vidmar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 12.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Helena Jakše - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka] &lt;br&gt;<br /> 2 Tjaša Bensa - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezcelična_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni] &lt;br&gt;<br /> 3 Sabina Štukelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MagicBlock:_interaktivna_platforma_za_sintezno_biologijo MagicBlock: interaktivna platforma za sintezno biologijo] &lt;br&gt;<br /> 4 Amadeja Lapornik [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 19.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Krišelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED] &lt;br&gt; <br /> 2 Vanna Imširović [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Beton-samoporavljaju%C4%87i_sistem Beton-samopopravljajući sistem] &lt;br&gt;<br /> 3 Dominik Dekleva - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] &lt;br&gt;<br /> 4 Neža Gaube [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni CascAID - Cas13a test za diagnostiko nalezljivih bolezni] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 9.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Nastja Marondini &lt;br&gt;<br /> 2 Elizabeta Jevnikar &lt;br&gt;<br /> 3 Nina Roštan &lt;br&gt;<br /> 4 Barbara Lipovšek&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 15.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Matic Kovačič - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/%C5%A0irjenje_genetskega_koda Širjenje genetskega koda]&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 16.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Inge Sotlar &lt;br&gt;<br /> 2 Marija Kisilak&lt;br&gt;<br /> 3 Nataša Traven&lt;br&gt;<br /> 4 Tina Šimunović&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 22.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Mojca Hunski &lt;br&gt;<br /> 2 Tomaž Žagar &lt;br&gt;<br /> 3 Tadej Ulčnik &lt;br&gt;<br /> 4 Jakob Rupert&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 23.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Cirnski &lt;br&gt;<br /> 2 Rok Ferenc &lt;br&gt;<br /> 3&lt;br&gt;<br /> 4&lt;br&gt;</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni&diff=13628 2017-12-18T23:12:40Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Rezistenca na antibiotike postaja zelo velik problem. Zaradi prevelike, napačne in nepotrebne uporabe antibiotikov, se je razvilo že kar nekaj odpornih sevov patogenov (npr. MRSA). Veliko statističnih analiz kaže, da se približno polovica antibiotikov predpiše nepotrebno, saj gre pogosto tudi za virusne okužbe.<br /> Razvoj različnih zelo specifičnih metod (npr. PCR, FISH in ELISA) daje nove možnosti tudi za uporabo sintezne biologije pri ustvarjanju novih in bolj točnih diagnostičnih testov. Trenutne diagnostične metode uporabljajo drago opremo in izobraženo osebje, kar omeji uporabo teh metod. V zadnjem času so na področju detekcije šli v t.i. »&quot;point of care testing&quot;« (POCT), kjer gre za testiranje ob pacientu. Uporablja se različne cenovno ugodne platforme (npr. papirnati trakovi). Tudi pri tem projektu so želeli razviti metodo detekcije na ta način.<br /> Ekipa Munich iz iGEM 2017 si je zamislila, da bi uporabila torej POC test z napravo za in vitro diagnostiko, ker naj bi po njihovi hipotezi bila zmožna ločiti med patogeni (tako virusnimi kot tudi bakterijskimi). Z uporabo take metode bi preprečili oz. zmanjšali neustrezno rabo antibiotikov ter s tem tudi zmanjšali možnost nadaljnje rezistence.<br /> Njihov sistem naj bi vseboval »vse v enem«: priprava vzorca, pomnožitev nukleinskih kislin in detekcija tarče.<br /> <br /> ==Cas13a==<br /> Uporabili so lastnosti nedavno odkritega efektorjega sistema CRISPR/Cas – Cas13a. Ta se razlikuje od ostalih Cas proteinov s tem, da cepi specifično RNA tarče in ne DNA. ). Njegova struktura ni podobna ostalim »običajnim« Cas encimom (npr. Cas9), ampak ima dve HEPN domeni (Cas9 ima HNH in RuvC domeni za cepitev DNA). Cas13a lahko prepozna katero koli zaporedje RNA in se nanj veže. Nima pa sposobnosti, da bi cepil tarčno RNA, ampak ob vezavi pride do konformacijskih sprememb in se odpre HEPN aktivacijsko mesto s katerim potem nespecifično cepi druge RNA.<br /> <br /> Lahko se jo prilagodi na katerokoli zaporedje, kar omogoča, da se napravo naredi specifično za kateri koli patogen. Je tudi zelo specifična in občutljiva, saj zazna tarčno zaporedje tudi če je prisotno le v sledeh. Za delovanje pa Cas13a potrebuje crRNA. iGEM ekipa je pripravila programsko opremo (software) s pomočjo katere lahko lažje pripravimo ustrezno crRNA. Lahko si pa tudi pomagamo s podatkovno bazo z že uporabljenimi crRNA, ki so jo prav tako pripravili v okviru projekta.<br /> <br /> <br /> ==Projekt==<br /> Projekt je bil sestavljen iz treh modulov. <br /> 1) Modul priprave vzorca (liza izbranih patogenov in pomnožitev tarčnih sekvenc dokler ne dosežemo količine RNA, ki jo lahko zaznamo s Cas13a)<br /> 2) Modul čiščenja in karakterizacije Cas13a (priprava Cas13a za diagnostiko)<br /> 3) Modul detekcije (naredi signal viden uporabniku)<br /> Vse tri module so sestavili v prenosno obliko (primeren hardware). Posamezne module so razvijali neodvisno drug od drugega.<br /> <br /> ===1.Modul: Priprava vzorca:===<br /> Cilj je bil torej pridobiti količino tarčne RNA, ki jo lahko zaznamo iz vzorca celic &quot;E. coli&quot;, ki so si jo izbrali za izvedbo poskusa. Najprej so primerjali različne tehnike lize celic. Učinkovitost so preverili z agarozno gelsko elektroforezo.<br /> Uporabili so:<br /> - Liza s kaotropnimi snovmi (na koncu lize je potrebno čiščenje lizata, ki vsebuje toksične kemikalije)<br /> - Inkubacija pri visoki temperaturi z detergenti npr. NaDS (dobili so dobre rezultate, ampak je vseeno potrebna ločitev NaDS od tarčne RNA)<br /> - Liza s toploto (dodatno čiščenje ni potrebno)<br /> Vzorec so čistili z različnimi postopki s silikagelom, a so na koncu vseeno izbrali metodo, kjer dodatno čiščenje ni potrebno. Uporabili so lizo s toploto, ki ji sledi pomnožitev z rekombinazo in polimerazo (RPA). To je izotermna alternativa PCR. Izvaja se pri 37 °C brez potrebe, da bi menjavali temperature, zaradi česar je cenejša metoda. <br /> Potek: Kompleks rekombinaze in začetnega oligonukleotida najprej »najde« mesto na DNA, ki je homologno začetnemu oligonukleotidu. Potem rekombinaza razpre vijačnico pri čemer pride do hibridizacije med začetnim oligonukleotidom in homolognim mestom na DNA. Na tem mestu se vežejo na drugo verigo dna enoverižni vezavni proteini (SSB). Začetni oligonukleotid se podaljša s pomočjo polimeraze pri čemer se ena veriga odstrani. Na novo sintentiziran dvoverižni kompleks pa se uporabi naprej za nadaljnjo pomnoževanje (postopek se ponavlja). RPA je hitra in občutljiva metoda, ampak pogosto problem predstavlja ozadje.<br /> Tarča proteina Cas13a je RNA in ne DNA, zato so sklopili to RPA še z in vitro transkripcijo, ki poteka prav tako pri 37 °C, zato so lahko dodali reagente za transkripcijo kar v to mešanico brez vmesnega čiščenja.<br /> <br /> <br /> ===2. Modul: Čiščenje in karakterizacija Cas13a===<br /> ====Čiščenje====<br /> Pripravili so nove biokocke za ekspresijo in čiščenje proteina Cas13a.<br /> Priprava:<br /> Analizirali so proteine iz družine Cas13a iz družin različnih organizmov. &quot;Leptotrichia buccalis&quot; (Lbu), &quot;Leptotrichia shahii&quot; (Lsh) in &quot;Leptotrichia wadei&quot; (Lwa). Naročili so plazmida za Lbu in Lsh ter protein izrazili v &quot;E.coli Rosetta2&quot;. Za Lwa pa so sami pripravili plazmid in ga izrazili v &quot;E.coli BL21&quot;. Njihov konstrukt je bil sestavljen iz T7 promotorja, His oznake, SUMO oznake, zaporedja proteina in terminatorja. Naredili so fuzijo z majhnim ubikvintinu podobnim proteinom (SUMO), da so povečali topnost Cas13a proteina.<br /> Izolirani protein so očistili z Ni-NTA agarozo. His-SUMO oznaki so cepili s proteazo ter nato še enkrat uporabili Ni-NTA, da so odstranili tiste proteine pri katerih se His oznaka ni odcepila. Na koncu so uporabili še kromatografijo z ločevanjem po velikosti. Čistost dobljenega proteina so preverili še z NaDS-PAGE.<br /> Kljub temu, da so sledili protokolom čiščenja iz literature, le-to ni najbolje uspelo. Ugotovili so, da je čiščenje s His oznako delovalo v redu, kar pomeni, da je bil problem kationsko izmenjevalna kromatografija. Tam so izgubili veliko proteinov. Delo so nadaljevali z nepopolnoma očiščenimi proteini (na sliki poliakrilamidnega gela je poleg lise proteina prisotnih še veliko drugih, kar kaže na precej nečistot). <br /> Vzporedno so delali s proteini Cas13a iz treh različnih organizmov. Zgoraj je opisan le postopek za Lwa, kjer so sami pripravljali tudi konstrukt.<br /> ====Karakterizacija====<br /> Dobljeni Cas13a so karakterizirali z RNaseAlert testom. <br /> <br /> CascAID uporablja torej nespecifično RNazno aktivnost Cas13a, da dobi ojačan signal. V tem modulu so poskrbeli, da pri cepitvi RNA dobijo signal, ki ga je lahko in zanesljivo meriti ter ga uporabnik lahko tudi sam interpretira. Menijo, da je to ključna stopnja projekta, zato so poskusili več možnosti. Test RNaseAlert, test s špinačnim aptamerom, sistem intein-ekstein in druge. Najboljše se je obnesel test RNase Alert, ki je spodaj tudi opisan.<br /> Test RNaseAlert je komercialno dostopni test, ki daje fluorescentni signal s katerim lahko spremljamo aktivnost RNAze. Mešanici tarčne RNA, Cas13a in crRNA so dodali še RNA na katero sta s pomočjo linkerja vezana fluorofor in dušilec (eden na N-konec in drugi na C-konec). Ko pride do cepitve z RNazo, se fluorofor oddalji od dušilca in zato lahko fluorescira. Ker pride do nespecifične RNAzne aktivnosti, je sam signal precej ojačan.<br /> =====Funkcionalnost:=====<br /> Funkcionalnost Cas13 so preverili z uporabo zaporedja 16S rRNA iz E.coli kot tarčno zaporedje. In vitro so prepisali 130 nukleotidov (od 1500). Na podlagi DNA matrice so zasnovali crRNA. Ugotovili so, da sta funkcionalni tako Lbu kot Lwa. Lbu je bil bolj aktiven kot Lwa, kar je v nasprotju s podatki iz literature (Gootenberg in sodelavci, 2017). Pri Lsh pa niso dobili nobenih rezultatov. Nadaljnje poskuse so na podlagi teh podatkov izvajali z Lbu.<br /> =====Specifičnost aktivnosti:=====<br /> Specifičnost aktivnosti Cas13a so preverjali z uporabo različnih tarčnih zaporedij (za &quot;Noro virus&quot;, &quot;Hepatitis C&quot; (HCV) in &quot;Bacillus subtilis&quot;).<br /> Določili so fluorescenco pri vzorcih posameznih bakterij/virusov, kjer je bila dodana ustrezna crRNA. Te vrednosti so primerjali samo z določitvijo fluorescenve v vzorcu, kjer ni bilo prisotne ustrezne crRNA.<br /> Ker se zavedajo, da je možnost kontaminacije velika, so naredili še en poskus. Izbrali so crRNA Norovirusa in dodali posebej 30 nM koncentracije treh različnih organizmov (&quot;Norovirus&quot;, &quot;E. coli&quot; in &quot;HCV&quot;). Ugotovili so, da je prišlo do velikega povečanja fluorescence le v primeru, ko je bil v vzorcu Norovirus. Pri ostalih organizmih do pretiranega povečanja fluorescence ni prišlo. Na podlagi teh podatkov lahko sklepamo, da je ta mehanizem zelo specifičen.<br /> ===3. Modul: Detektor===<br /> Za zaznavanje signala so pa potrebovali cenovno ugoden, prenosljiv in dovolj zanesljiv fluorescentni detektor. S pomočjo modeliranja so si ga zamislili ter nato tudi sestavili. Detektor he narejen na osnovi papirja in lahko zazna fluorescin že v koncentracijah do 10 nM. Njegova cena je manj kot 15 dolarjev.<br /> <br /> ==Zaključek==<br /> CascAID+ predstavlja prenosen, cenovno dostopen in uporaben POC test z dobro občutljivostjo. Prednost CascAID je to, da se ga lahko hitro prilagodi na zelo različne tarče (bakterijske infekcije, hitro razvijujoče se virusne epidemije, z rakom povezane okužbe …). CascAID bi lahko uporabljal zdravnik ali pacient brez dodatnega »potovanja« vzorca do laboratorija. Sama analiza traja približno 30 minut in da dovolj točne informacije, da bi lahko (med drugim) tudi pripomogel k zmanjšanju rezistence bakterij na antibiotike, kar je bil povod za samo izdelavo CascAID sistema.</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2017/18&diff=13627 2017-12-18T23:07:52Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2017/18 študentje predstavljajo naslednje teme:<br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola]&lt;br&gt;<br /> #[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah]&lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] &lt;br&gt;<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezceli%C4%8Dna_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED]<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.<br /> <br /> ---------------------------<br /> Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):<br /> <br /> 27.11. &lt;br&gt;<br /> 1 Marija Srnko -[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]&lt;br&gt;<br /> 2 Neža Brezovar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SLOVO_RAKU Slovo raku]&lt;br&gt;<br /> <br /> 28.11.&lt;br&gt;<br /> 1 Tjaša Grum - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola]&lt;br&gt;<br /> 2 Urška Černe [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] &lt;br&gt;<br /> 3 Petra Vivod - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense] &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 4.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Sara Kimm Fuhrmann - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ] &lt;br&gt;<br /> 2 Anja Tanšek - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DNA_assembler - DNA assembler] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 5.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Urška Furar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah] &lt;br&gt;<br /> 2 Tina Lekan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] &lt;br&gt;<br /> 3 Katja Malovrh [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin] &lt;br&gt; <br /> 4 Jernej Vidmar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 12.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Helena Jakše - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka] &lt;br&gt;<br /> 2 Tjaša Bensa - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezcelična_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni] &lt;br&gt;<br /> 3 Sabina Štukelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MagicBlock:_interaktivna_platforma_za_sintezno_biologijo MagicBlock: interaktivna platforma za sintezno biologijo] &lt;br&gt;<br /> 4 Amadeja Lapornik [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 19.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Krišelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED] &lt;br&gt; <br /> 2 Vanna Imširović [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Beton-samoporavljaju%C4%87i_sistem Beton-samopopravljajući sistem] &lt;br&gt;<br /> 3 Dominik Dekleva - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] &lt;br&gt;<br /> 4 Neža Gaube [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 9.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Nastja Marondini &lt;br&gt;<br /> 2 Elizabeta Jevnikar &lt;br&gt;<br /> 3 Nina Roštan &lt;br&gt;<br /> 4 Barbara Lipovšek&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 15.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Matic Kovačič - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/%C5%A0irjenje_genetskega_koda Širjenje genetskega koda]&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 16.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Inge Sotlar &lt;br&gt;<br /> 2 Marija Kisilak&lt;br&gt;<br /> 3 Nataša Traven&lt;br&gt;<br /> 4 Tina Šimunović&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 22.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Mojca Hunski &lt;br&gt;<br /> 2 Tomaž Žagar &lt;br&gt;<br /> 3 Tadej Ulčnik &lt;br&gt;<br /> 4 Jakob Rupert&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 23.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Cirnski &lt;br&gt;<br /> 2 Rok Ferenc &lt;br&gt;<br /> 3&lt;br&gt;<br /> 4&lt;br&gt;</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2017/18&diff=13626 2017-12-18T23:05:37Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2017/18 študentje predstavljajo naslednje teme:<br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola]&lt;br&gt;<br /> #[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah]&lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] &lt;br&gt;<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezceli%C4%8Dna_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED]<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.<br /> <br /> ---------------------------<br /> Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):<br /> <br /> 27.11. &lt;br&gt;<br /> 1 Marija Srnko -[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]&lt;br&gt;<br /> 2 Neža Brezovar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SLOVO_RAKU Slovo raku]&lt;br&gt;<br /> <br /> 28.11.&lt;br&gt;<br /> 1 Tjaša Grum - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola]&lt;br&gt;<br /> 2 Urška Černe [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] &lt;br&gt;<br /> 3 Petra Vivod - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense] &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 4.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Sara Kimm Fuhrmann - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ] &lt;br&gt;<br /> 2 Anja Tanšek - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DNA_assembler - DNA assembler] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 5.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Urška Furar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah] &lt;br&gt;<br /> 2 Tina Lekan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] &lt;br&gt;<br /> 3 Katja Malovrh [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin] &lt;br&gt; <br /> 4 Jernej Vidmar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 12.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Helena Jakše - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka] &lt;br&gt;<br /> 2 Tjaša Bensa - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezcelična_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni] &lt;br&gt;<br /> 3 Sabina Štukelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MagicBlock:_interaktivna_platforma_za_sintezno_biologijo MagicBlock: interaktivna platforma za sintezno biologijo] &lt;br&gt;<br /> 4 Amadeja Lapornik [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 19.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Krišelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED] &lt;br&gt; <br /> 2 Vanna Imširović [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Beton-samoporavljaju%C4%87i_sistem Beton-samopopravljajući sistem] &lt;br&gt;<br /> 3 Dominik Dekleva - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] &lt;br&gt;<br /> 4 Neža Gaube [CascAID - Cas13a test za diagnostiko nalezljivih bolezni] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 9.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Nastja Marondini &lt;br&gt;<br /> 2 Elizabeta Jevnikar &lt;br&gt;<br /> 3 Nina Roštan &lt;br&gt;<br /> 4 Barbara Lipovšek&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 15.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Matic Kovačič - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/%C5%A0irjenje_genetskega_koda Širjenje genetskega koda]&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 16.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Inge Sotlar &lt;br&gt;<br /> 2 Marija Kisilak&lt;br&gt;<br /> 3 Nataša Traven&lt;br&gt;<br /> 4 Tina Šimunović&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 22.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Mojca Hunski &lt;br&gt;<br /> 2 Tomaž Žagar &lt;br&gt;<br /> 3 Tadej Ulčnik &lt;br&gt;<br /> 4 Jakob Rupert&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 23.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Cirnski &lt;br&gt;<br /> 2 Rok Ferenc &lt;br&gt;<br /> 3&lt;br&gt;<br /> 4&lt;br&gt;</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2017/18&diff=13625 2017-12-18T23:03:54Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2017/18 študentje predstavljajo naslednje teme:<br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola]&lt;br&gt;<br /> #[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah]&lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] &lt;br&gt;<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezceli%C4%8Dna_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano] <br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin]<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED]<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.<br /> <br /> ---------------------------<br /> Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):<br /> <br /> 27.11. &lt;br&gt;<br /> 1 Marija Srnko -[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]&lt;br&gt;<br /> 2 Neža Brezovar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SLOVO_RAKU Slovo raku]&lt;br&gt;<br /> <br /> 28.11.&lt;br&gt;<br /> 1 Tjaša Grum - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola]&lt;br&gt;<br /> 2 Urška Černe [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] &lt;br&gt;<br /> 3 Petra Vivod - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense] &lt;br&gt;<br /> 4 &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 4.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Sara Kimm Fuhrmann - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ] &lt;br&gt;<br /> 2 Anja Tanšek - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DNA_assembler - DNA assembler] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 5.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Urška Furar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah] &lt;br&gt;<br /> 2 Tina Lekan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] &lt;br&gt;<br /> 3 Katja Malovrh [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin] &lt;br&gt; <br /> 4 Jernej Vidmar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 12.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Helena Jakše - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka] &lt;br&gt;<br /> 2 Tjaša Bensa - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezcelična_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni] &lt;br&gt;<br /> 3 Sabina Štukelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MagicBlock:_interaktivna_platforma_za_sintezno_biologijo MagicBlock: interaktivna platforma za sintezno biologijo] &lt;br&gt;<br /> 4 Amadeja Lapornik [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 19.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Krišelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED] &lt;br&gt; <br /> 2 Vanna Imširović [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Beton-samoporavljaju%C4%87i_sistem Beton-samopopravljajući sistem] &lt;br&gt;<br /> 3 Dominik Dekleva - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] &lt;br&gt;<br /> 4 Neža Gaube [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni] &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 9.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Nastja Marondini &lt;br&gt;<br /> 2 Elizabeta Jevnikar &lt;br&gt;<br /> 3 Nina Roštan &lt;br&gt;<br /> 4 Barbara Lipovšek&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 15.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Matic Kovačič - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/%C5%A0irjenje_genetskega_koda Širjenje genetskega koda]&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 16.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Inge Sotlar &lt;br&gt;<br /> 2 Marija Kisilak&lt;br&gt;<br /> 3 Nataša Traven&lt;br&gt;<br /> 4 Tina Šimunović&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 22.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Mojca Hunski &lt;br&gt;<br /> 2 Tomaž Žagar &lt;br&gt;<br /> 3 Tadej Ulčnik &lt;br&gt;<br /> 4 Jakob Rupert&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 23.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Cirnski &lt;br&gt;<br /> 2 Rok Ferenc &lt;br&gt;<br /> 3&lt;br&gt;<br /> 4&lt;br&gt;</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni&diff=13624 2017-12-18T23:02:00Z

<p>Neža Levičnik: New page: ==Uvod== Rezistenca na antibiotike postaja zelo velik problem. Zaradi prevelike, napačne in nepotrebne uporabe antibiotikov, se je razvilo že kar nekaj odpornih sevov patogenov (npr. MRS...</p> <hr /> <div>==Uvod==<br /> Rezistenca na antibiotike postaja zelo velik problem. Zaradi prevelike, napačne in nepotrebne uporabe antibiotikov, se je razvilo že kar nekaj odpornih sevov patogenov (npr. MRSA). Veliko statističnih analiz kaže, da se približno polovica antibiotikov predpiše nepotrebno, saj gre pogosto tudi za virusne okužbe.<br /> Razvoj različnih zelo specifičnih metod (npr. PCR, FISH in ELISA) daje nove možnosti tudi za uporabo sintezne biologije pri ustvarjanju novih in bolj točnih diagnostičnih testov. Trenutne diagnostične metode uporabljajo drago opremo in izobraženo osebje, kar omeji uporabo teh metod. V zadnjem času so na področju detekcije šli v t.i. »point of care testing« (POCT), kjer gre za testiranje ob pacientu. Uporablja se različne cenovno ugodne platforme (npr. papirnati trakovi). Tudi pri tem projektu so želeli razviti metodo detekcije na ta način.<br /> Ekipa Munich iz iGEM 2017 si je zamislila, da bi uporabila torej POC test z napravo za in vitro diagnostiko, ker naj bi po njihovi hipotezi bila zmožna ločiti med patogeni (tako virusnimi kot tudi bakterijskimi). Z uporabo take metode bi preprečili oz. zmanjšali neustrezno rabo antibiotikov ter s tem tudi zmanjšali možnost nadaljnje rezistence.<br /> Njihov sistem naj bi vseboval »vse v enem«: priprava vzorca, pomnožitev nukleinskih kislin in detekcija tarče.<br /> <br /> ==Cas13a==<br /> Uporabili so lastnosti nedavno odkritega efektorjega sistema CRISPR/Cas – Cas13a. Ta se razlikuje od ostalih Cas proteinov s tem, da cepi specifično RNA tarče in ne DNA. ). Njegova struktura ni podobna ostalim »običajnim« Cas encimom (npr. Cas9), ampak ima dve HEPN domeni (Cas9 ima HNH in RuvC domeni za cepitev DNA). Cas13a lahko prepozna katero koli zaporedje RNA in se nanj veže. Nima pa sposobnosti, da bi cepil tarčno RNA, ampak ob vezavi pride do konformacijskih sprememb in se odpre HEPN aktivacijsko mesto s katerim potem nespecifično cepi druge RNA.<br /> <br /> Lahko se jo prilagodi na katerokoli zaporedje, kar omogoča, da se napravo naredi specifično za kateri koli patogen. Je tudi zelo specifična in občutljiva, saj zazna tarčno zaporedje tudi če je prisotno le v sledeh. Za delovanje pa Cas13a potrebuje crRNA. iGEM ekipa je pripravila programsko opremo (software) s pomočjo katere lahko lažje pripravimo ustrezno crRNA. Lahko si pa tudi pomagamo s podatkovno bazo z že uporabljenimi crRNA, ki so jo prav tako pripravili v okviru projekta.<br /> <br /> <br /> ==Projekt==<br /> Projekt je bil sestavljen iz treh modulov. <br /> 1) Modul priprave vzorca (liza izbranih patogenov in pomnožitev tarčnih sekvenc dokler ne dosežemo količine RNA, ki jo lahko zaznamo s Cas13a)<br /> 2) Modul čiščenja in karakterizacije Cas13a (priprava Cas13a za diagnostiko)<br /> 3) Modul detekcije (naredi signal viden uporabniku)<br /> Vse tri module so sestavili v prenosno obliko (primeren hardware). Posamezne module so razvijali neodvisno drug od drugega.<br /> <br /> ===1.Modul: Priprava vzorca:===<br /> Cilj je bil torej pridobiti količino tarčne RNA, ki jo lahko zaznamo iz vzorca celic E. coli, ki so si jo izbrali za izvedbo poskusa. Najprej so primerjali različne tehnike lize celic. Učinkovitost so preverili z agarozno gelsko elektroforezo.<br /> Uporabili so:<br /> - Liza s kaotropnimi snovmi (na koncu lize je potrebno čiščenje lizata, ki vsebuje toksične kemikalije)<br /> - Inkubacija pri visoki temperaturi z detergenti npr. NaDS (dobili so dobre rezultate, ampak je vseeno potrebna ločitev NaDS od tarčne RNA)<br /> - Liza s toploto (dodatno čiščenje ni potrebno)<br /> Vzorec so čistili z različnimi postopki s silikagelom, a so na koncu vseeno izbrali metodo, kjer dodatno čiščenje ni potrebno. Uporabili so lizo s toploto, ki ji sledi pomnožitev z rekombinazo in polimerazo (RPA). To je izotermna alternativa PCR. Izvaja se pri 37 °C brez potrebe, da bi menjavali temperature, zaradi česar je cenejša metoda. <br /> Potek: Kompleks rekombinaze in začetnega oligonukleotida najprej »najde« mesto na DNA, ki je homologno začetnemu oligonukleotidu. Potem rekombinaza razpre vijačnico pri čemer pride do hibridizacije med začetnim oligonukleotidom in homolognim mestom na DNA. Na tem mestu se vežejo na drugo verigo dna enoverižni vezavni proteini (SSB). Začetni oligonukleotid se podaljša s pomočjo polimeraze pri čemer se ena veriga odstrani. Na novo sintentiziran dvoverižni kompleks pa se uporabi naprej za nadaljnjo pomnoževanje (postopek se ponavlja). RPA je hitra in občutljiva metoda, ampak pogosto problem predstavlja ozadje.<br /> Tarča proteina Cas13a je RNA in ne DNA, zato so sklopili to RPA še z in vitro transkripcijo, ki poteka prav tako pri 37 °C, zato so lahko dodali reagente za transkripcijo kar v to mešanico brez vmesnega čiščenja.<br /> <br /> <br /> ===2. Modul: Čiščenje in karakterizacija Cas13a===<br /> ====2.1 Čiščenje====<br /> Pripravili so nove biokocke za ekspresijo in čiščenje proteina Cas13a.<br /> Priprava:<br /> Analizirali so proteine iz družine Cas13a iz družin različnih organizmov. Leptotrichia buccalis (Lbu), Leptotrichia shahii (Lsh) in Leptotrichia wadei (Lwa). Naročili so plazmida za Lbu in Lsh ter protein izrazili v E.coli Rosetta2. Za Lwa pa so sami pripravili plazmid in ga izrazili v E.coli BL21. Njihov konstrukt je bil sestavljen iz T7 promotorja, His oznake, SUMO oznake, zaporedja proteina in terminatorja. Naredili so fuzijo z majhnim ubikvintinu podobnim proteinom (SUMO), da so povečali topnost Cas13a proteina.<br /> Izolirani protein so očistili z Ni-NTA agarozo. His-SUMO oznaki so cepili s proteazo ter nato še enkrat uporabili Ni-NTA, da so odstranili tiste proteine pri katerih se His oznaka ni odcepila. Na koncu so uporabili še kromatografijo z ločevanjem po velikosti. Čistost dobljenega proteina so preverili še z NaDS-PAGE.<br /> Kljub temu, da so sledili protokolom čiščenja iz literature, le-to ni najbolje uspelo. Ugotovili so, da je čiščenje s His oznako delovalo v redu, kar pomeni, da je bil problem kationsko izmenjevalna kromatografija. Tam so izgubili veliko proteinov. Delo so nadaljevali z nepopolnoma očiščenimi proteini (na sliki poliakrilamidnega gela je poleg lise proteina prisotnih še veliko drugih, kar kaže na precej nečistot). <br /> Vzporedno so delali s proteini Cas13a iz treh različnih organizmov. Zgoraj je opisan le postopek za Lwa, kjer so sami pripravljali tudi konstrukt.<br /> ====2.2 Karakterizacija====<br /> Dobljeni Cas13a so karakterizirali z RNaseAlert testom. <br /> <br /> CascAID uporablja torej nespecifično RNazno aktivnost Cas13a, da dobi ojačan signal. V tem modulu so poskrbeli, da pri cepitvi RNA dobijo signal, ki ga je lahko in zanesljivo meriti ter ga uporabnik lahko tudi sam interpretira. Menijo, da je to ključna stopnja projekta, zato so poskusili več možnosti. Test RNaseAlert, test s špinačnim aptamerom, sistem intein-ekstein in druge. Najboljše se je obnesel test RNase Alert, ki je spodaj tudi opisan.<br /> Test RNaseAlert je komercialno dostopni test, ki daje fluorescentni signal s katerim lahko spremljamo aktivnost RNAze. Mešanici tarčne RNA, Cas13a in crRNA so dodali še RNA na katero sta s pomočjo linkerja vezana fluorofor in dušilec (eden na N-konec in drugi na C-konec). Ko pride do cepitve z RNazo, se fluorofor oddalji od dušilca in zato lahko fluorescira. Ker pride do nespecifične RNAzne aktivnosti, je sam signal precej ojačan.<br /> Funkcionalnost:<br /> Funkcionalnost Cas13 so preverili z uporabo zaporedja 16S rRNA iz E.coli kot tarčno zaporedje. In vitro so prepisali 130 nukleotidov (od 1500). Na podlagi DNA matrice so zasnovali crRNA. Ugotovili so, da sta funkcionalni tako Lbu kot Lwa. Lbu je bil bolj aktiven kot Lwa, kar je v nasprotju s podatki iz literature (Gootenberg in sodelavci, 2017). Pri Lsh pa niso dobili nobenih rezultatov. Nadaljnje poskuse so na podlagi teh podatkov izvajali z Lbu.<br /> Specifičnost aktivnosti:<br /> Specifičnost aktivnosti Cas13a so preverjali z uporabo različnih tarčnih zaporedij (za Noro virus, Hepatitis C (HCV) in Bacillus subtilis).<br /> Določili so fluorescenco pri vzorcih posameznih bakterij/virusov, kjer je bila dodana ustrezna crRNA. Te vrednosti so primerjali samo z določitvijo fluorescenve v vzorcu, kjer ni bilo prisotne ustrezne crRNA.<br /> Ker se zavedajo, da je možnost kontaminacije velika, so naredili še en poskus. Izbrali so crRNA Norovirusa in dodali posebej 30 nM koncentracije treh različnih organizmov (Norovirus, E. coli in HCV). Ugotovili so, da je prišlo do velikega povečanja fluorescence le v primeru, ko je bil v vzorcu Norovirus. Pri ostalih organizmih do pretiranega povečanja fluorescence ni prišlo. Na podlagi teh podatkov lahko sklepamo, da je ta mehanizem zelo specifičen.<br /> ===3. Modul: Detektor===<br /> Za zaznavanje signala so pa potrebovali cenovno ugoden, prenosljiv in dovolj zanesljiv fluorescentni detektor. S pomočjo modeliranja so si ga zamislili ter nato tudi sestavili. Detektor he narejen na osnovi papirja in lahko zazna fluorescin že v koncentracijah do 100 nM. Njegova cena je manj kot 15 dolarjev.<br /> <br /> ===Zaključek===<br /> CascAID+ predstavlja prenosen, cenovno dostopen in uporaben POC test z dobro občutljivostjo. Prednost CascAID je to, da se ga lahko hitro prilagodi na zelo različne tarče (bakterijske infekcije, hitro razvijujoče se virusne epidemije, z rakom povezane okužbe …). CascAID bi lahko uporabljal zdravnik ali pacient brez dodatnega »potovanja« vzorca do laboratorija. Sama analiza traja približno 30 minut in da dovolj točne informacije, da bi lahko (med drugim) tudi pripomogel k zmanjšanju rezistence bakterij na antibiotike, kar je bil povod za samo izdelavo CascAID sistema.</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=SBTS&diff=13607 2017-12-18T07:47:02Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>= Sinteznobiološki terminološki slovar =<br /> Tu bo postopno rasel sinteznobiološki angleško slovenski slovar. Morebitne nove izraze vpisujte sami in če imate predlog za prevod, vpišite tudi tega. Da bomo vedeli, kateri izrazi so novi, jih vpišite ''poševno''.<br /> <br /> ==A==<br /> abstraction - abstrakcija, abstrahiranje&lt;br&gt;<br /> actuator - prožilo, aktuator&lt;br&gt;<br /> amplification - pomnožitev (DNA)&lt;br&gt;<br /> amplitude - amplituda&lt;br&gt;<br /> annotation - anotacija&lt;br&gt;<br /> aptazyme - aptacim&lt;br&gt;<br /> assembly - sestav?, sestavljanje&lt;br&gt;<br /> autopoiesis - avtopoeza; samoohranjanje, samoproizvajanje? (soc.), samozadostnost?, samorazmnoževanje?, npr. autopoiesis system - samoohranjevalni sistem&lt;br&gt;<br /> <br /> ==B==<br /> back insert (BI) - zadnji vključek (BI); prim. front insert&lt;br&gt;<br /> back vector (BV) - zadnji vektor (BV); prim. front vector&lt;br&gt;<br /> band detector - pasovni detektor&lt;br&gt;<br /> band pass filter - pasovnoprepustni filter&lt;br&gt;<br /> biobrick - biokocka&lt;br&gt;<br /> BioBrick(R) - BioBrick(R) (zaščiteno ime - ne prevajamo)&lt;br&gt;<br /> bioprinting - biotisk, biotiskanje&lt;br&gt;<br /> biosafety - biološka varnost&lt;br&gt;<br /> biosecurity - biološka varnost ?&lt;br&gt;<br /> bistable switch - dvopolno stikalo&lt;br&gt;<br /> bottom-up - od spodaj navzgor<br /> <br /> ==C==<br /> CAR --&gt; gl. chimeric antigen receptor&lt;br&gt;<br /> Cas --&gt; gl. CRISPR-associated&lt;br&gt;<br /> chimeric antigen receptor - himerni receptor za antigen&lt;br&gt;<br /> circuit - vezje&lt;br&gt;<br /> clustered regularly interspersed short palindromic repeats (CRISPR) - gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev (CRISPR)&lt;br&gt;<br /> comparator - primerjalnik&lt;br&gt;<br /> composable - sestavljiv; npr. composable inverter - sestavljivi inverter&lt;br&gt;<br /> CRISPR-associated (Cas) - s CRISPR povezan (Cas); v povezavi s CRISPR (Cas)&lt;br&gt;<br /> <br /> ==D==<br /> DArT --&gt; gl. diversity arrays technology&lt;br&gt;<br /> decoupling - razklop&lt;br&gt;<br /> degradation tag - oznaka za razgradnjo&lt;br&gt;<br /> designer receptors exclusively activated by designer drugs - dizajnerski receptorji, izključno aktivirani z dizajnerskimi zdravili&lt;br&gt;<br /> destination vector - ciljni vektor (toda: target vector!); destinacijski vektor (J. Turnšek, diploma BF 2012)&lt;br&gt;<br /> digital sequence information - digitalni podatki o zaporedjih (v kontekstu Nagojskega protokola); za razumevanje bi zadoščalo 'zaporedja'&lt;br&gt;<br /> diversity arrays technology (DArT) - tehnologija razlikovalnih mrež (DArT)&lt;br&gt;<br /> DREADD --&gt; gl. designer receptors exclusively activated by designer drugs&lt;br&gt;<br /> <br /> ==E==<br /> enabling technologies - zmogljive napredne tehnologije, prebojne tehnologije<br /> <br /> ==F==<br /> front insert (FI) - sprednji vključek (FI); prim. back insert&lt;br&gt;<br /> front vector (FV) - sprednji vektor (FV); prim. back vector<br /> <br /> ==G==<br /> gate - vrata&lt;br&gt;<br /> guide RNA - vodeča RNA (pri tehniki CRISPR-Cas)<br /> <br /> ==H==<br /> high-pass filter - visokoprepustni filter<br /> <br /> ==I==<br /> <br /> ==J==<br /> <br /> ==K==<br /> kill-switch - stikalo za uničenje, ubijalsko stikalo (inducibilni sistem za samouničenje celice); izklopno stikalo (v tehniški varnosti 'stikalo za izklop v sili')&lt;br&gt;<br /> killer gene - ubijalski gen [pri mehanizmih biološke varnosti; povzročijo samomor celice, ko se aktivirajo]<br /> <br /> ==L==<br /> LID --&gt; gl. ligand-induced degradation&lt;br&gt;<br /> ligand-induced degradation - z ligandom inducirana razgradnja&lt;br&gt;<br /> logic circuit - logično vezje&lt;br&gt;<br /> logic gate - logična vrata&lt;br&gt;<br /> low-pass filter - nizkoprepustni filter&lt;br&gt;<br /> <br /> ==M==<br /> <br /> ==N==<br /> <br /> ==O==<br /> <br /> ==P==<br /> PAM --&gt; glej protospacer adjacent motif&lt;br&gt;<br /> PCA --&gt; glej polymerase cycling assembly&lt;br&gt;<br /> persistent genes - persistentni geni (tisti, ki so ohranjeni v večini genomov in se močno izražajo)&lt;br&gt;<br /> polymerase cycling assembly (PCA) - verižno sestavljanje s polimerazo&lt;br&gt;<br /> prefix - predpona; zgornji rob (?); prim. suffix&lt;br&gt;<br /> protospacer adjacent motif (PAM) - motiv ob protovmesniku<br /> <br /> ==Q==<br /> <br /> ==R==<br /> RASSL --&gt; gl. receptors activated solely by synthetic ligands&lt;br&gt;<br /> receptors activated solely by synthetic ligands - receptorji, aktivirani izključno s sintetičnimi ligandi&lt;br&gt;<br /> recombineering - rekombinacijsko inženirstvo (angl. recombination-mediated genetic engineering), ?rekombinirstvo &lt;br&gt;<br /> reconstruction - rekonstrukcija (genome reconstruction - rekonstrukcija genoma, rekonstruiranje genoma)&lt;br&gt;<br /> refactoring - preoblikovanje kode (v sintezni genomiki)&lt;br&gt;<br /> registry - register&lt;br&gt;<br /> rewire - prevezati&lt;br&gt;<br /> rewiring - prevezava [prevod ni optimalen, npr. v kontekstu 'rewiring nature', kar pomeni bolj 'preureditev z uvedbo drugačnih povezav']&lt;br&gt;<br /> RISC (RNA-induced silencing complex) - z RNA induciran utiševalni kompleks&lt;br&gt;<br /> ring oscilator - obročasti oscilator &lt;br&gt;<br /> Recombinase Polymerase Amplification (RPA) - Pomnoževanje z rekombinazo in polimerazo (?)<br /> <br /> ==S==<br /> scaffold - ogrodje &lt;br&gt;<br /> scar - spoj, brazgotina (?)&lt;br&gt;<br /> sensor - senzor&lt;br&gt;<br /> standardisation - standardizacija&lt;br&gt;<br /> suffix - obrazilo; spodnji rob (?)&lt;br&gt;<br /> suicide switch - samomorilsko stikalo&lt;br&gt;<br /> switch - stikalo<br /> <br /> ==T==<br /> TAL (transcription activator-like) - podoben transkripcijskemu aktivatorju&lt;br&gt;<br /> TALE (transcription activator-like effector) - efektor, podoben transkripcijskemu aktivatorju&lt;br&gt;<br /> TALEN (TALE nuclease) - TALE-nukleaza, nukleaza TAL-efektorja&lt;br&gt;<br /> transducer - pretvornik &lt;br&gt;<br /> tunable oscillator - nastavljivi oscilator &lt;br&gt;<br /> <br /> ==U==<br /> <br /> ==V==<br /> <br /> ==X==<br /> xeno nucleic acid (XNA) - ksenonukleinska kislina (XNA)&lt;br&gt;<br /> xeno-nucleotide - ksenonukleotid&lt;br&gt;<br /> xeno-organism - ksenoorganizem&lt;br&gt;<br /> xenosome - ksenosom [analog ribosoma, ki je kompatibilen s XNA]&lt;br&gt;<br /> XNA --&gt; gl. xeno nucleic acid<br /> <br /> ==Y==<br /> <br /> ==Z==</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=SBTS&diff=13606 2017-12-18T07:46:15Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>= Sinteznobiološki terminološki slovar =<br /> Tu bo postopno rasel sinteznobiološki angleško slovenski slovar. Morebitne nove izraze vpisujte sami in če imate predlog za prevod, vpišite tudi tega. Da bomo vedeli, kateri izrazi so novi, jih vpišite ''poševno''.<br /> <br /> ==A==<br /> abstraction - abstrakcija, abstrahiranje&lt;br&gt;<br /> actuator - prožilo, aktuator&lt;br&gt;<br /> amplification - pomnožitev (DNA)&lt;br&gt;<br /> amplitude - amplituda&lt;br&gt;<br /> annotation - anotacija&lt;br&gt;<br /> aptazyme - aptacim&lt;br&gt;<br /> assembly - sestav?, sestavljanje&lt;br&gt;<br /> autopoiesis - avtopoeza; samoohranjanje, samoproizvajanje? (soc.), samozadostnost?, samorazmnoževanje?, npr. autopoiesis system - samoohranjevalni sistem&lt;br&gt;<br /> <br /> ==B==<br /> back insert (BI) - zadnji vključek (BI); prim. front insert&lt;br&gt;<br /> back vector (BV) - zadnji vektor (BV); prim. front vector&lt;br&gt;<br /> band detector - pasovni detektor&lt;br&gt;<br /> band pass filter - pasovnoprepustni filter&lt;br&gt;<br /> biobrick - biokocka&lt;br&gt;<br /> BioBrick(R) - BioBrick(R) (zaščiteno ime - ne prevajamo)&lt;br&gt;<br /> bioprinting - biotisk, biotiskanje&lt;br&gt;<br /> biosafety - biološka varnost&lt;br&gt;<br /> biosecurity - biološka varnost ?&lt;br&gt;<br /> bistable switch - dvopolno stikalo&lt;br&gt;<br /> bottom-up - od spodaj navzgor<br /> <br /> ==C==<br /> CAR --&gt; gl. chimeric antigen receptor&lt;br&gt;<br /> Cas --&gt; gl. CRISPR-associated&lt;br&gt;<br /> chimeric antigen receptor - himerni receptor za antigen&lt;br&gt;<br /> circuit - vezje&lt;br&gt;<br /> clustered regularly interspersed short palindromic repeats (CRISPR) - gruče enakomerno prekinjenih kratkih palindromnih ponovitev (CRISPR)&lt;br&gt;<br /> comparator - primerjalnik&lt;br&gt;<br /> composable - sestavljiv; npr. composable inverter - sestavljivi inverter&lt;br&gt;<br /> CRISPR-associated (Cas) - s CRISPR povezan (Cas); v povezavi s CRISPR (Cas)&lt;br&gt;<br /> <br /> ==D==<br /> DArT --&gt; gl. diversity arrays technology&lt;br&gt;<br /> decoupling - razklop&lt;br&gt;<br /> degradation tag - oznaka za razgradnjo&lt;br&gt;<br /> designer receptors exclusively activated by designer drugs - dizajnerski receptorji, izključno aktivirani z dizajnerskimi zdravili&lt;br&gt;<br /> destination vector - ciljni vektor (toda: target vector!); destinacijski vektor (J. Turnšek, diploma BF 2012)&lt;br&gt;<br /> digital sequence information - digitalni podatki o zaporedjih (v kontekstu Nagojskega protokola); za razumevanje bi zadoščalo 'zaporedja'&lt;br&gt;<br /> diversity arrays technology (DArT) - tehnologija razlikovalnih mrež (DArT)&lt;br&gt;<br /> DREADD --&gt; gl. designer receptors exclusively activated by designer drugs&lt;br&gt;<br /> <br /> ==E==<br /> enabling technologies - zmogljive napredne tehnologije, prebojne tehnologije<br /> <br /> ==F==<br /> front insert (FI) - sprednji vključek (FI); prim. back insert&lt;br&gt;<br /> front vector (FV) - sprednji vektor (FV); prim. back vector<br /> <br /> ==G==<br /> gate - vrata&lt;br&gt;<br /> guide RNA - vodeča RNA (pri tehniki CRISPR-Cas)<br /> <br /> ==H==<br /> high-pass filter - visokoprepustni filter<br /> <br /> ==I==<br /> <br /> ==J==<br /> <br /> ==K==<br /> kill-switch - stikalo za uničenje, ubijalsko stikalo (inducibilni sistem za samouničenje celice); izklopno stikalo (v tehniški varnosti 'stikalo za izklop v sili')&lt;br&gt;<br /> killer gene - ubijalski gen [pri mehanizmih biološke varnosti; povzročijo samomor celice, ko se aktivirajo]<br /> <br /> ==L==<br /> LID --&gt; gl. ligand-induced degradation&lt;br&gt;<br /> ligand-induced degradation - z ligandom inducirana razgradnja&lt;br&gt;<br /> logic circuit - logično vezje&lt;br&gt;<br /> logic gate - logična vrata&lt;br&gt;<br /> low-pass filter - nizkoprepustni filter&lt;br&gt;<br /> <br /> ==M==<br /> <br /> ==N==<br /> <br /> ==O==<br /> <br /> ==P==<br /> PAM --&gt; glej protospacer adjacent motif&lt;br&gt;<br /> PCA --&gt; glej polymerase cycling assembly&lt;br&gt;<br /> persistent genes - persistentni geni (tisti, ki so ohranjeni v večini genomov in se močno izražajo)&lt;br&gt;<br /> polymerase cycling assembly (PCA) - verižno sestavljanje s polimerazo&lt;br&gt;<br /> prefix - predpona; zgornji rob (?); prim. suffix&lt;br&gt;<br /> protospacer adjacent motif (PAM) - motiv ob protovmesniku<br /> <br /> ==Q==<br /> <br /> ==R==<br /> RASSL --&gt; gl. receptors activated solely by synthetic ligands&lt;br&gt;<br /> receptors activated solely by synthetic ligands - receptorji, aktivirani izključno s sintetičnimi ligandi&lt;br&gt;<br /> recombineering - rekombinacijsko inženirstvo (angl. recombination-mediated genetic engineering), ?rekombinirstvo &lt;br&gt;<br /> reconstruction - rekonstrukcija (genome reconstruction - rekonstrukcija genoma, rekonstruiranje genoma)&lt;br&gt;<br /> refactoring - preoblikovanje kode (v sintezni genomiki)&lt;br&gt;<br /> registry - register&lt;br&gt;<br /> rewire - prevezati&lt;br&gt;<br /> rewiring - prevezava [prevod ni optimalen, npr. v kontekstu 'rewiring nature', kar pomeni bolj 'preureditev z uvedbo drugačnih povezav']&lt;br&gt;<br /> RISC (RNA-induced silencing complex) - z RNA induciran utiševalni kompleks&lt;br&gt;<br /> ring oscilator - obročasti oscilator<br /> Recombinase Polymerase Amplification (RPA) - Pomnoževanje z rekombinazo in polimerazo ?<br /> <br /> ==S==<br /> scaffold - ogrodje &lt;br&gt;<br /> scar - spoj, brazgotina (?)&lt;br&gt;<br /> sensor - senzor&lt;br&gt;<br /> standardisation - standardizacija&lt;br&gt;<br /> suffix - obrazilo; spodnji rob (?)&lt;br&gt;<br /> suicide switch - samomorilsko stikalo&lt;br&gt;<br /> switch - stikalo<br /> <br /> ==T==<br /> TAL (transcription activator-like) - podoben transkripcijskemu aktivatorju&lt;br&gt;<br /> TALE (transcription activator-like effector) - efektor, podoben transkripcijskemu aktivatorju&lt;br&gt;<br /> TALEN (TALE nuclease) - TALE-nukleaza, nukleaza TAL-efektorja&lt;br&gt;<br /> transducer - pretvornik &lt;br&gt;<br /> tunable oscillator - nastavljivi oscilator &lt;br&gt;<br /> <br /> ==U==<br /> <br /> ==V==<br /> <br /> ==X==<br /> xeno nucleic acid (XNA) - ksenonukleinska kislina (XNA)&lt;br&gt;<br /> xeno-nucleotide - ksenonukleotid&lt;br&gt;<br /> xeno-organism - ksenoorganizem&lt;br&gt;<br /> xenosome - ksenosom [analog ribosoma, ki je kompatibilen s XNA]&lt;br&gt;<br /> XNA --&gt; gl. xeno nucleic acid<br /> <br /> ==Y==<br /> <br /> ==Z==</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2017/18&diff=13391 2017-11-16T16:57:55Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2017/18 študentje predstavljajo naslednje teme:<br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br /> #<br /> #<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) <br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.<br /> <br /> ---------------------------<br /> Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):<br /> <br /> 27.11. &lt;br&gt;<br /> 1&lt;br&gt;<br /> 2&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 28.11.&lt;br&gt;<br /> 1 Tjaša Grum &lt;br&gt;<br /> 2&lt;br&gt;<br /> 3&lt;br&gt;<br /> 4&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 4.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Sara Kimm Fuhrmann &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 5.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Urška Furar&lt;br&gt;<br /> 2 Tina Lekan &lt;br&gt;<br /> 3 Katja Malovrh &lt;br&gt; <br /> 4 Jernej Vidmar &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 12.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Helena Jakše &lt;br&gt;<br /> 2 Tjaša Bensa &lt;br&gt;<br /> 3 Sabina Štukelj &lt;br&gt;<br /> 4 Amadeja Lapornik&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 19.12.&lt;br&gt;<br /> 1 Ana Krišelj &lt;br&gt;<br /> 2 Vanna Imširović &lt;br&gt;<br /> 3 Dominik Dekleva &lt;br&gt;<br /> 4 Neža Gaube &lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 9.1.&lt;br&gt;<br /> 1 Nastja Marondini &lt;br&gt;<br /> 2 Elizabeta Jevnikar &lt;br&gt;<br /> 3 Nina Roštan &lt;br&gt;<br /> 4 Barbara Lipovšek&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 15.1.&lt;br&gt;<br /> 1&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 16.1.&lt;br&gt;<br /> 1&lt;br&gt;<br /> 2&lt;br&gt;<br /> 3&lt;br&gt;<br /> 4&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 22.1.&lt;br&gt;<br /> 1&lt;br&gt;<br /> 2&lt;br&gt;<br /> 3&lt;br&gt;<br /> 4&lt;br&gt;<br /> <br /> <br /> 23.1.&lt;br&gt;<br /> 1&lt;br&gt;<br /> 2&lt;br&gt;<br /> 3&lt;br&gt;<br /> 4&lt;br&gt;</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Proizvodnja_humanega_%C5%BEiv%C4%8Dnega_rastnega_faktorja_v_slini_transgenskih_mi%C5%A1i_z_uporabo_%C5%BElez_slinavk_kot_bioreaktorjev&diff=12577 2017-03-27T20:08:40Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>Transgenske živali se uporabljajo za proizvodnjo različnih terapevtsko pomembnih humanih proteinov. Najpogosteje za pridobivanje le teh uporabljajo izražanje v mlečnih žlezah, saj se mleko lahko dobi na relativno preprost način. Problem predstavlja dejstvo, da se za tovrstno pridobivanje terapevtskih proteinov lahko uporabljajo le samice in še to le v laktacijski dobi. Ta je pri nekaterih živalskih vrstah kratka, kar pomeni manj želenega proteina. Poleg tega pa je v mleku prisotnih še veliko endogenih proteinov, ki otežijo čiščenje proteina.<br /> Zaradi vseh naštetih slabosti izražanja tujih proteinov v mleku, so poskusili drugačen pristop in sicer z uporabo žlez slinavk. Te so eksokrini organ in izločajo biološko aktivne proteine v slini, ki neprenehoma nastaja tako pri samicah kot tudi pri samcih skozi celotno življenjsko dobo. Poleg tega pa veliko živali izloča velike volumne sline, ki so pogosto tudi večji od količine nastalega mleka. V slini je tudi manj endogenih proteinov, kar je prednost pri čiščenju tujih proteinov.<br /> V tej študiji so poskusili s pomočjo transgenskih miši pridobiti humani živčni rastni faktor (iz ang. ''human nerve growth factor'' (NGF)). Ta je klinično pomemben za zdravljenje določenih nevroloških bolezni, ima pa tudi potencial pri nekaterih drugih motnjah, ki niso nevrološke. Komercialni mišji NGF (mNGF) se na Kitajskem že uporablja pri zdravljenju določenih bolezni (npr. za Alzheimerjevo in Parkinsonovo bolezen). Ta je tudi bolj občutljiv na proteolitično cepitev in toplotno denaturacijo, ima pa tudi nižjo aktivnost kot hNGH v človeških celicah. <br /> Zgoraj našteti razlogi so bili motivacija za uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo hNGF.<br /> <br /> == Priprava plazmida ==<br /> Najprej so pripravili donorski plazmid pmPSP-hNGR, na katerem je bil t.i. piggyBac transpozon, ki je poleg zapisa za transgen ''hNGF'' vseboval tudi promotor mišjega parotidnega sekretornega proteina (specifičen za žleze slinavke), gen za poliadenilacijski signal govejega rastnega hormona (''bGH-pA''), CMV promotor genov za rezistenco na neomicin in ''EGFP'', ki sta povezana preko 2A peptida (''Neo-2A-EGFP''). <br /> <br /> == Transgenske živali ==<br /> V projedra 96 mišjih zigot so poleg donorskega plazmida pmPSP-hNGR injicirali tudi pomožni plazmid s PB transpozazo. Vseh 90 embrijev so prenesli v samice. Skotilo se je samo 35 miši, od katerih so le v 18 z analizo PCR zaznali selekcijski marker EGFP. Pri transgenih miših niso zaznali nobenega posebnega fenotipa, so pa izražale različne koncentracije EGFP. S prenosom po Southernu so ugotovili, da je prišlo do integracije transpozona pri vseh miših na istem mestu, število ponovitev pa je bilo različno (1-6).<br /> <br /> == Izbira mišje linije z največjo koncentracijo hNGF v slini ==<br /> Plazmid so vnesli v miši različnih linij in s pomočjo testa ELISA določili koncentracijo terapevtskega proteina v slini. Če je bilo prisotnih več kopij transgena, je bila raven proteina bolj variabilna kot pri prisotnosti le ene kopije. Določili so tudi koncentracijo mNGF, ki je bila nižja in primerljiva s koncentracijo mNGF pri WT miši. <br /> <br /> == Linija 553 transgenskih miši ==<br /> Delo so nadaljevali z linijo 553 transgenskih miši. Identificirali so mesto integracije v genomu s pomočjo inverznega PCR. Gen za hNGF se je integriral v nekodirajoče zaporedje in sicer med dve TTAA mesti (prepoznavno zaporedje za PB transpozazo). Z uporabo RT-PCR iz DNA različnih tkiv so potrdili, da se je hNGF izločal predvsem v treh žlezah slinavkah, ne pa iz mišičnega tkiva, jetrnega tkiva … S pomočjo prenosa western so potrdili prisotnost hNGF v slini, kar nakazuje, da je sekrecija proteina iz žlez slinavk potekla uspešno. Sledilo je čiščenje s pomočjo kromatografije z ločevanjem po velikosti (izkoristek je bil 51,47 %). Identifikacijo očiščenega hNGF so potrdili s pomočjo prenosa western in LC-MS/MS. Izolirani protein so dodali celicam PC12 in ugotovili, da je prišlo do induciranja nevronske diferenciacije, kar kaže na visoko funkcionalnost proteina. <br /> <br /> == Zaključek ==<br /> S pomočjo študije so potrdili uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo proteinov, saj je nastala zadostna količina funkcionalnega proteina. Z optimizacijo postopkov (npr. za zbiranje sline) bi lahko ta sistem uporabili za proizvodnjo terapevtskih proteinov.</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Proizvodnja_humanega_%C5%BEiv%C4%8Dnega_rastnega_faktorja_v_slini_transgenskih_mi%C5%A1i_z_uporabo_%C5%BElez_slinavk_kot_bioreaktorjev&diff=12576 2017-03-27T20:04:27Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>Transgenske živali se uporabljajo za proizvodnjo različnih terapevtsko pomembnih humanih proteinov. Najpogosteje za pridobivanje le teh uporabljajo izražanje v mleko, ki se ga lahko dobi na relativno preprost način. Problem predstavlja dejstvo, da se za tovrstno pridobivanje terapevtskih proteinov lahko uporabljajo le samice in še to le v laktacijski dobi. Ta je pri nekaterih živalskih vrstah kratka, kar pomeni manj želenega proteina. Poleg tega pa je v mleku prisotnih še veliko endogenih proteinov, ki otežijo čiščenje proteina.<br /> Zaradi vseh naštetih slabosti izražanja tujih proteinov v mleku, so poskusili drugačen pristop in sicer z uporabo žlez slinavk. Te so eksokrini organ in izločajo biološko aktivne proteine v slini, ki neprenehoma nastaja tako pri samicah kot tudi pri samcih skozi celotno življenjsko dobo. Poleg tega pa veliko živali izloča velike volumne sline, ki so pogosto tudi večji od količine nastalega mleka. V slini je tudi manj endogenih proteinov, kar je prednost pri čiščenju tujih proteinov.<br /> V tej študiji so poskusili s pomočjo transgenskih miši pridobiti humani živčni rastni faktor (iz ang. ''human nerve growth factor'' (NGF)). Ta je klinično pomemben za zdravljenje določenih nevroloških bolezni, ima pa tudi potencial pri nekaterih drugih motnjah, ki niso nevrološke. Komercialni mišji NGF (mNGF) se na Kitajskem že uporablja pri zdravljenju določenih bolezni (npr. za Alzheimerjevo in Parkinsonovo bolezen). Ta je tudi bolj občutljiv na proteolitično cepitev in toplotno denaturacijo, ima pa tudi nižjo aktivnost kot hNGH v človeških celicah. <br /> Zgoraj našteti razlogi so bili motivacija za uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo hNGF.<br /> <br /> == Priprava plazmida ==<br /> Najprej so pripravili donorski plazmid pmPSP-hNGR, na katerem je bil t.i. piggyBac transpozon, ki je poleg zapisa za transgen ''hNGF'' vseboval tudi promotor mišjega parotidnega sekretornega proteina (specifičen za žleze slinavke), gen za poliadenilacijski signal govejega rastnega hormona (''bGH-pA''), CMV promotor genov za rezistenco na neomicin in ''EGFP'', ki sta povezana preko 2A peptida (''Neo-2A-EGFP''). <br /> <br /> == Transgenske živali ==<br /> V projedra 96 mišjih zigot so poleg donorskega plazmida pmPSP-hNGR injicirali tudi pomožni plazmid s PB transpozazo. Vseh 90 embrijev so prenesli v samice. Skotilo se je samo 35 miši, od katerih so le v 18 z analizo PCR zaznali selekcijski marker EGFP. Pri transgenih miših niso zaznali nobenega posebnega fenotipa, so pa izražale različne koncentracije EGFP. S prenosom po Southernu so ugotovili, da je prišlo do integracije transpozona pri vseh miših na istem mestu, število ponovitev pa je bilo različno (1-6).<br /> <br /> == Izbira mišje linije z največjo koncentracijo hNGF v slini ==<br /> Plazmid so vnesli v miši različnih linij in s pomočjo testa ELISA določili koncentracijo terapevtskega proteina v slini. Če je bilo prisotnih več kopij transgena, je bila raven proteina bolj variabilna kot pri prisotnosti le ene kopije. Določili so tudi koncentracijo mNGF, ki je bila nižja in primerljiva s koncentracijo mNGF pri WT miši. <br /> <br /> == Linija 553 transgenskih miši ==<br /> Delo so nadaljevali z linijo 553 transgenskih miši. Identificirali so mesto integracije v genomu s pomočjo inverznega PCR. Gen za hNGF se je integriral v nekodirajoče zaporedje in sicer med dve TTAA mesti (prepoznavno zaporedje za PB transpozazo). Z uporabo RT-PCR iz DNA različnih tkiv so potrdili, da se je hNGF izločal predvsem v treh žlezah slinavkah, ne pa iz mišičnega tkiva, jetrnega tkiva … S pomočjo prenosa western so potrdili prisotnost hNGF v slini, kar nakazuje, da je sekrecija proteina iz žlez slinavk potekla uspešno. Sledilo je čiščenje s pomočjo kromatografije z ločevanjem po velikosti (izkoristek je bil 51,47 %). Identifikacijo očiščenega hNGF so potrdili s pomočjo prenosa western in LC-MS/MS. Izolirani protein so dodali celicam PC12 in ugotovili, da je prišlo do induciranja nevronske diferenciacije, kar kaže na visoko funkcionalnost proteina. <br /> <br /> == Zaključek ==<br /> S pomočjo študije so potrdili uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo proteinov, saj je nastala zadostna količina funkcionalnega proteina. Z optimizacijo postopkov (npr. za zbiranje sline) bi lahko ta sistem uporabili za proizvodnjo terapevtskih proteinov.</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Proizvodnja_humanega_%C5%BEiv%C4%8Dnega_rastnega_faktorja_v_slini_transgenskih_mi%C5%A1i_z_uporabo_%C5%BElez_slinavk_kot_bioreaktorjev&diff=12575 2017-03-27T19:52:10Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>Transgenske živali se uporabljajo za proizvodnjo različnih terapevtsko pomembnih humanih proteinov. Najpogosteje za pridobivanje le teh uporabljajo izražanje proteinov v mleku, ki se ga lahko dobi na relativno preprost način. Problem predstavlja dejstvo, da se za tovrstno pridobivanje terapevtskih proteinov lahko uporabljajo le samice in še to le v laktacijski dobi. Ta je pri nekaterih živalskih vrstah kratka, kar pomeni manj želenega proteina. Poleg tega pa je v mleku prisotnih še veliko endogenih proteinov, ki otežijo čiščenje proteina.<br /> Zaradi vseh naštetih slabosti izražanja tujih proteinov v mleku, so poskusili drugačen pristop in sicer z uporabo žlez slinavk. Te so eksokrini organ in izločajo biološko aktivne proteine v slini, ki neprenehoma nastaja tako pri samicah kot tudi pri samcih skozi celotno življenjsko dobo. Poleg tega pa veliko živali izloča velike volumne sline, ki so pogosto tudi večji od količine nastalega mleka. V slini je tudi manj endogenih proteinov, kar je prednost pri čiščenju tujih proteinov.<br /> V tej študiji so poskusili s pomočjo transgenskih miši pridobiti humani živčni rastni faktor (iz ang. ''human nerve growth factor'' (NGF)). Ta je klinično pomemben za zdravljenje določenih nevronskih bolezni, ima pa tudi potencial pri nekaterih drugih motnjah, ki niso nevronske. Komercialni mišji NGF (mNGF) se na Kitajskem že uporablja pri zdravljenju določenih bolezni (npr. za Alzheimerjevo in Parkinsonovo bolezen). Ta je tudi bolj občutljiv na proteolitično cepitev in toplotno denaturacijo, ima pa tudi nižjo aktivnost kot hNGH v človeških celicah. <br /> Zgoraj našteti razlogi so bili motivacija za uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo hNGF.<br /> <br /> == Priprava plazmida ==<br /> Najprej so pripravili donorski plazmid pmPSP-hNGR na katerem je bil t.i. piggyBac transpozon, ki je poleg zapisa za transgen ''hNGF'', vseboval tudi promotor mišjega parotidnega sekretornega proteina (specifičen za žleze slinavke), gen za poliadenilacijski signal govejega rastnega hormona (''bGH-pA''), CMV promotor genov za rezistenco na neomicin in ''EGFP'', ki sta povezana preko 2A peptida (''Neo-2A-EGFP''). <br /> <br /> == Transgenske živali ==<br /> V projedra 96 mišjih zigot so poleg donorskega plazmida pmPSP-hNGR injicirali tudi pomožni plazmid s PB transpozazo. Vseh 90 embrijev so prenesli v samice. Skotilo se je samo 35 miši, od katerih so le v 18 s PCR analizo zaznali selekcijski marker EGFP. Pri transgenih miših niso zaznali nobenega posebnega fenotipa, so pa izražale različne koncentracije EGFP. S prenosom po Southernu so ugotovili, da je prišlo do integracije transpozona pri vseh miših na istem mestu, število ponovitev pa je bilo različno (1-6).<br /> <br /> == Izbira mišje linije z največjo koncentracijo hNGF v slini ==<br /> Plazmid so vnesli v miši različnih linij in s pomočjo testa ELISA določili koncentracijo terapevtskega proteina v slini. Če je bilo prisotnih več kopij transgena, je bila raven proteina bolj variabilna kot pri prisotnosti le ene kopije. Določili so tudi koncentracijo mNGF, ki je bila nižja in primerljiva s koncentracijo mNGF pri WT miši. <br /> <br /> == Linija 553 transgenskih miši ==<br /> Delo so nadaljevali z linijo 553 transgenskih miši. Identificirali so mesto integracije v genomu s pomočjo inverznega PCR. Gen za hNGF se je integriral v nekodirajoče zaporedje in sicer med dve TTAA mesti (prepoznavno zaporedje za PB transpozazo). Z uporabo RT-PCR različnih tkiv so potrdili, da se je hNGF izločal predvsem v treh žlezah slinavkah, ne pa iz mišičnega tkiva, jetrnega tkiva … S pomočjo prenosa western so potrdili prisotnost hNGF v slini, kar nakazuje, da je sekrecija proteina iz žlez slinavk potekla uspešno. Sledilo je čiščenje s pomočjo kromatografije z ločevanjem po velikosti (izkoristek je bil 51,47 %). Identifikacijo očiščenega hNGF so potrdili s pomočjo prenosa western in LC-MS/MS. Izolirani protein so dodali celicam PC12 in ugotovili, da je prišlo do induciranja nevronske diferenciacije, kar kaže na visoko funkcionalnost proteina. <br /> <br /> == Zaključek ==<br /> S pomočjo študije so potrdili uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo proteinov, saj je nastala zadostna količina funkcionalnega proteina. Z optimizacijo postopkov (npr. za zbiranje sline) bi lahko ta sistem uporabili za proizvodnjo terapevtskih proteinov.</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Proizvodnja_humanega_%C5%BEiv%C4%8Dnega_rastnega_faktorja_v_slini_transgenskih_mi%C5%A1i_z_uporabo_%C5%BElez_slinavk_kot_bioreaktorjev&diff=12574 2017-03-27T19:23:41Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>Transgenske živali se uporabljajo za proizvodnjo različnih terapevtsko pomembnih humanih proteinov. Običajno se uporablja izražanje proteinov v mleku, ki se ga lahko dobi na relativno preprost način. Problem predstavlja dejstvo, da se za tovrstno pridobivanje terapevtskih proteinov lahko uporabljajo le samice in še to le v laktacijski dobi. Ta je pri nekaterih živalskih vrstah kratka, kar pomeni manj želenega proteina. Poleg tega pa je v mleku prisotnih še veliko endogenih proteinov, ki otežijo čiščenje proteina.<br /> Zaradi vseh naštetih slabosti izražanja tujih proteinov v mleku, so poskusili drugačen pristop in sicer z uporabo žlez slinavk. Te so eksokrini organ in izločajo biološko aktivne proteine v slini, ki neprenehoma nastaja tako pri samicah kot tudi pri samcih skozi celotno življenjsko dobo. Poleg tega pa veliko živali izloča velike volumne sline, ki so pogosto tudi večji od količine nastalega mleka. V slini je tudi manj endogenih proteinov, kar je prednost pri čiščenju tujih proteinov.<br /> V tej študiji so poskusili s pomočjo transgenskih miši pridobiti humani živčni rastni faktor (iz ang. ''human nerve growth factor'' (NGF)). Ta je klinično pomemben za zdravljenje določenih nevronskih bolezni, ima pa tudi potencial pri nekaterih drugih motnjah, ki niso nevronske. Komercialni mišji NGF (mNGF) se na Kitajskem že uporablja pri zdravljenju določenih bolezni (npr. za Alzheimerjevo in Parkinsonovo bolezen). Ta je tudi bolj občutljiv na proteolitično cepitev in toplotno denaturacijo, ima pa tudi nižjo aktivnost kot hNGH v človeških celicah. <br /> Zgoraj našteti razlogi so bili motivacija za uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo hNGF.<br /> <br /> == Priprava plazmida ==<br /> Najprej so pripravili donorski plazmid pmPSP-hNGR na katerem je bil t.i. piggyBac transpozon, ki je poleg zapisa za transgen ''hNGF'', vseboval tudi promotor mišjega parotidnega sekretornega proteina (specifičen za žleze slinavke), gen za poliadenilacijski signal govejega rastnega hormona (''bGH-pA''), CMV promotor genov za rezistenco na neomicin in ''EGFP'', ki sta povezana preko 2A peptida (''Neo-2A-EGFP''). <br /> <br /> == Transgenske živali ==<br /> V projedra 96 mišjih zigot so poleg donorskega plazmida pmPSP-hNGR injicirali tudi pomožni plazmid s PB transpozazo. Vseh 90 embrijev so prenesli v samice. Skotilo se je samo 35 miši, od katerih so le v 18 s PCR analizo zaznali selekcijski marker EGFP. Pri transgenih miših niso zaznali nobenega posebnega fenotipa, so pa izražale različne koncentracije EGFP. S prenosom po Southernu so ugotovili, da je prišlo do integracije transpozona pri vseh miših na istem mestu, število ponovitev pa je bilo različno (1-6).<br /> <br /> == Izbira mišje linije z največjo koncentracijo hNGF v slini ==<br /> Plazmid so vnesli v miši različnih linij in s pomočjo testa ELISA določili koncentracijo terapevtskega proteina v slini. Če je bilo prisotnih več kopij transgena, je bila raven proteina bolj variabilna kot pri prisotnosti le ene kopije. Določili so tudi koncentracijo mNGF, ki je bila nižja in primerljiva s koncentracijo mNGF pri WT miši. <br /> <br /> == Linija 553 transgenskih miši ==<br /> Delo so nadaljevali z linijo 553 transgenskih miši. Identificirali so mesto integracije v genomu s pomočjo inverznega PCR. Gen za hNGF se je integriral v nekodirajoče zaporedje in sicer med dve TTAA mesti (prepoznavno zaporedje za PB transpozazo). Z uporabo RT-PCR različnih tkiv so potrdili, da se je hNGF izločal predvsem v treh žlezah slinavkah, ne pa iz mišičnega tkiva, jetrnega tkiva … S pomočjo prenosa western so potrdili prisotnost hNGF v slini, kar nakazuje, da je sekrecija proteina iz žlez slinavk potekla uspešno. Sledilo je čiščenje s pomočjo kromatografije z ločevanjem po velikosti (izkoristek je bil 51,47 %). Identifikacijo očiščenega hNGF so potrdili s pomočjo prenosa western in LC-MS/MS. Izolirani protein so dodali celicam PC12 in ugotovili, da je prišlo do induciranja nevronske diferenciacije, kar kaže na visoko funkcionalnost proteina. <br /> <br /> == Zaključek ==<br /> S pomočjo študije so potrdili uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo proteinov, saj je nastala zadostna količina funkcionalnega proteina. Z optimizacijo postopkov (npr. za zbiranje sline) bi lahko ta sistem uporabili za proizvodnjo terapevtskih proteinov.</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Proizvodnja_humanega_%C5%BEiv%C4%8Dnega_rastnega_faktorja_v_slini_transgenskih_mi%C5%A1i_z_uporabo_%C5%BElez_slinavk_kot_bioreaktorjev&diff=12573 2017-03-27T19:18:21Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>Transgenske živali se uporabljajo za proizvodnjo različnih terapevtsko pomembnih humanih proteinov. Običajno se uporablja izražanje proteinov v mleku, ki se ga lahko dobi na relativno preprost način. Problem predstavlja dejstvo, da se za tovrstno pridobivanje terapevtskih proteinov lahko uporabljajo le samice in še to le v laktacijski dobi. Ta je pri nekaterih živalskih vrstah kratka, kar pomeni manj želenega proteina. Poleg tega pa je v mleku prisotnih še veliko endogenih proteinov, ki otežijo čiščenje proteina.<br /> Zaradi vseh naštetih slabosti izražanja tujih proteinov v mleku, so poskusili drugačen pristop in sicer z uporabo žlez slinavk. Te so eksokrini organ in izločajo biološko aktivne proteine v slini, ki neprenehoma nastaja tako pri samicah kot tudi pri samcih skozi celotno življenjsko dobo. Poleg tega pa veliko živali izloča velike volumne sline, ki so pogosto tudi večji od količine nastalega mleka. V slini je tudi manj endogenih proteinov, kar je prednost pri čiščenju tujih proteinov.<br /> V tej študiji so poskusili s pomočjo transgenskih miši pridobiti humani živčni rastni faktor (iz ang. ''human nerve growth factor'' (NGF)). Ta je klinično pomemben za zdravljenje določenih nevronskih bolezni, ima pa tudi potencial pri nekaterih drugih motnjah, ki niso nevronske. Komercialni mišji NGF (mNGF) se na Kitajskem že uporablja pri zdravljenju določenih bolezni (npr. za Alzheimerjevo in Parkinsonovo bolezen). Ta je tudi bolj občutljiv na proteolitično cepitev in toplotno denaturacijo, ima pa tudi nižjo aktivnost kot hNGH v človeških celicah. <br /> Zgoraj našteti razlogi so bili motivacija za uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo hNGF.<br /> <br /> == Priprava plazmida ==<br /> Najprej so pripravili donorski plazmid pmPSP-hNGR na katerem je bil t.i. piggyBac transpozon, ki je poleg zapisa za transgen ''hNGF'', vseboval tudi promotor mišjega parotidnega sekretornega proteina (specifičen za žleze slinavke), gen za poliadenilacijski signal govejega rastnega hormona (''bGH-pA''), CMV promotor genov za rezistenco na neomicin in ''EGFP'', ki sta povezana preko 2A peptida (''Neo-2A-EGFP''). <br /> <br /> == Transgenske živali ==<br /> V projedra 96 mišjih zigot so poleg donorskega plazmida pmPSP-hNGR injicirali tudi pomožni plazmid s PB transpozazo. Vseh 90 embrijev so prenesli v samice. Skotilo se je samo 35 miši od katerih so le v 18 s PCR analizo zaznali selekcijski marker EGFP. Pri transgenih miših niso zaznali nobenega posebnega fenotipa, so pa izražale različne koncentracije EGFP. S prenosom po Southernu so ugotovili, da je prišlo do integracije transpozona pri vseh miših na istem mestu, število ponovitev pa je bilo različno (1-6).<br /> <br /> == Izbira mišje linije z največjo koncentracijo hNGF v slini ==<br /> Plazmid so vnesli v miši različnih linij in s pomočjo testa ELISA določili koncentracijo terapevtskega proteina v slini. Če je bilo prisotnih več kopij transgena, je bila raven proteina bolj variabilna kot pri prisotnosti le ene kopije. Določili so tudi koncentracijo mNGF, ki je bila nižja in primerljiva s koncentracijo mNGF pri WT miši. <br /> <br /> == Linija 553 transgenskih miši ==<br /> Delo so nadaljevali z linijo 553 transgenskih miši. Identificirali so mesto integracije v genomu s pomočjo inverznega PCR. Gen za hNGF se je integriral v nekodirajoče zaporedje in sicer med dve TTAA mesti (prepoznavno zaporedje za PB transpozazo). Z uporabo RT-PCR različnih tkiv so potrdili, da se je hNGF izločal predvsem v treh žlezah slinavkah, ne pa iz jeter, mišic … S pomočjo prenosa western so potrdili prisotnost hNGF v slini, kar nakazuje, da je sekrecija proteina iz žlez slinavk potekla uspešno. Sledilo je čiščenje s pomočjo kromatografije z ločevanjem po velikosti (izkoristek je bil 51,47 %). Identifikacijo očiščenega hNGF so potrdili s pomočjo prenosa western in LC-MS/MS. Izolirani protein so dodali celicam PC12 in ugotovili, da je prišlo do induciranja nevronske diferenciacije, kar kaže na visoko funkcionalnost proteina. <br /> <br /> == Zaključek ==<br /> S pomočjo študije so potrdili uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo proteinov, saj je nastala zadostna količina funkcionalnega proteina. Z optimizacijo postopkov (npr. za zbiranje sline) bi lahko ta sistem uporabili za proizvodnjo terapevtskih proteinov.</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Proizvodnja_humanega_%C5%BEiv%C4%8Dnega_rastnega_faktorja_v_slini_transgenskih_mi%C5%A1i_z_uporabo_%C5%BElez_slinavk_kot_bioreaktorjev&diff=12572 2017-03-27T19:12:17Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>Transgenske živali se uporabljajo za proizvodnjo različnih terapevtsko pomembnih humanih proteinov. Običajno se uporablja izražanje proteinov v mleku, ki se ga lahko dobi na relativno preprost način. Problem predstavlja dejstvo, da se za tovrstno pridobivanje terapevtskih proteinov lahko uporabljajo le samice in še to le v laktacijski dobi. Ta je pri nekaterih živalskih vrstah kratka, kar pomeni manj želenega proteina. Poleg tega pa je v mleku prisotnih še veliko endogenih proteinov, ki otežijo čiščenje proteina.<br /> Zaradi vseh naštetih slabosti izražanja tujih proteinov v mleku, so poskusili drugačen pristop in sicer z uporabo žlez slinavk. Te so eksokrini organ in izločajo biološko aktivne proteine v slini, ki neprenehoma nastaja tako pri samicah kot tudi pri samcih skozi celotno življenjsko dobo. Poleg tega pa veliko živali izloča velike volumne sline, ki so pogosto tudi večji od količine nastalega mleka. V slini je tudi manj endogenih proteinov, kar je prednost pri čiščenju tujih proteinov.<br /> V tej študiji so poskusili s pomočjo transgenskih miši pridobiti humani živčni rastni faktor (iz ang. ''human nerve growth factor'' (NGF)). Ta je klinično pomemben za zdravljenje določenih nevronskih bolezni, ima pa tudi potencial pri nekaterih drugih motnjah, ki niso nevronske. Komercialni mišji NGF (mNGF) se na Kitajskem že uporablja pri zdravljenju določenih bolezni (npr. za Alzheimerjevo in Parkinsonovo bolezen). Ta je tudi bolj občutljiv na proteolitično cepitev in toplotno denaturacijo, ima pa tudi nižjo aktivnost kot hNGH v človeških celicah. <br /> Zgoraj našteti razlogi so bili motivacija za uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo hNGF.<br /> <br /> == Priprava plazmida ==<br /> Najprej so pripravili donorski plazmid pmPSP-hNGR na katerem je bil t.i. piggyBac transpozon, ki je poleg zapisa za transgen ''hNGF'', vseboval tudi promotor mišjega parotidnega sekretornega proteina (specifičen za žleze slinavke), gen za poliadenilacijski signal govejega rastnega hormona (''bGH-pA''), CMV promotor genov za rezistenco na neomicin in ''EGFP'', ki sta povezana preko 2A peptida (''Neo-2A-EGFP''). <br /> <br /> == Transgenske živali ==<br /> V projedra 96 mišjih zigot so poleg donorskega plazmida pmPSP-hNGR injicirali tudi pomožni plazmid s PB transpozazo. Vseh 90 embrijev so prenesli v samice. Skotilo se je samo 35 miši od katerih so le v 18 s PCR analizo zaznali selekcijski marker EGFP. Pri transgenih miših niso zaznali nobenega posebnega fenotipa, so pa izražale različne koncentracije EGFP. S prenosom po Southernu so ugotovili, da je prišlo do integracije transpozona pri vseh miših na istem mestu, število ponovitev pa je bilo različno (1-6).<br /> <br /> == Izbira mišje linije z največjo koncentracijo hNGF v slini ==<br /> Plazmid so vnesli v miši različnih linij in s pomočjo testa ELISA določili koncentracijo terapevtskega proteina v slini. Če je bilo prisotnih več kopij transgena, je bila raven proteina bolj variabilna kot pri prisotnosti le ene kopije. Določili so tudi koncentracijo mNGF, ki je bila nižja in primerljiva s koncentracijo mNGF pri WT miši. <br /> <br /> == Linija 553 transgenskih miši ==<br /> Delo so nadaljevali z linijo 553 transgenskih miši. Identificirali so mesto integracije v genomu s pomočjo inverznega PCR. Gen za hNGF se je integriral na v nekodirajoče zaporedje in sicer med dve TTAA mesti (prepoznavno zaporedje za PB transpozazo). Z uporabo RT-PCR različnih tkiv so potrdili, da se je hNGF izločal predvsem v treh žlezah slinavkah, ne pa iz jeter, mišic … S pomočjo prenosa western so potrdili prisotnost hNGF v slini, kar nakazuje, da je sekrecija proteina iz žlez slinavk potekla uspešno. Sledilo je čiščenje s pomočjo kromatografije z ločevanjem po velikosti (izkoristek je bil 51,47 %). Identifikacijo očiščenega hNGF so potrdili s pomočjo prenosa western in LC-MS/MS. Izolirani protein so dodali celicam PC12 in ugotovili, da je prišlo do induciranja nevronske diferenciacije, kar kaže na visoko funkcionalnost proteina. <br /> <br /> == Zaključek ==<br /> S pomočjo študije so potrdili uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo proteinov, saj nastala zadostna količina funkcionalnega proteina. Z optimizacijo postopkov (npr. za zbiranje sline) bi lahko ta sistem uporabili za proizvodnjo terapevtskih proteinov.</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Proizvodnja_humanega_%C5%BEiv%C4%8Dnega_rastnega_faktorja_v_slini_transgenskih_mi%C5%A1i_z_uporabo_%C5%BElez_slinavk_kot_bioreaktorjev&diff=12571 2017-03-27T19:05:21Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>Transgenske živali se uporabljajo za proizvodnjo različnih terapevtsko pomembnih humanih proteinov. Običajno se uporablja izražanje proteinov v mleku, ki se ga lahko dobi na relativno preprost način. Problem predstavlja dejstvo, da se za tovrstno pridobivanje terapevtskih proteinov lahko uporabljajo le samice in še to le v laktacijski dobi. Ta je pri nekaterih živalskih vrstah kratka, kar pomeni manj želenega proteina. Poleg tega pa je v mleku prisotnih še veliko endogenih proteinov, ki otežijo čiščenje proteina.<br /> Zaradi vseh naštetih slabosti izražanja tujih proteinov v mleku, so poskusili drugačen pristop in sicer z uporabo žlez slinavk. Te so eksokrini organ in izločajo biološko aktivne proteine v slini, ki neprenehoma nastaja tako pri samicah kot tudi pri samcih skozi celotno življenjsko dobo. Poleg tega pa veliko živali izloča velike volumne sline, ki so pogosto tudi večji od količine nastalega mleka. V slini je tudi manj endogenih proteinov, kar je prednost pri čiščenju tujih proteinov.<br /> V tej študiji so poskusili s pomočjo transgenskih miši pridobiti humani živčni rastni faktor (iz ang. ''human nerve growth factor'' (NGF)). Ta je klinično pomemben za zdravljenje določenih nevronskih bolezni, ima pa tudi potencial pri nekaterih drugih motnjah, ki niso nevronske. Komercialni mišji NGF (mNGF) se na Kitajskem že uporablja pri zdravljenju določenih bolezni (npr. za Alzheimerjevo in Parkinsonovo bolezen). Ta je tudi bolj občutljiv na proteolitično cepitev in toplotno denaturacijo, ima pa tudi nižjo aktivnost kot hNGH v človeških celicah. <br /> Zgoraj našteti razlogi so bili motivacija za uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo hNGF.<br /> <br /> == Priprava plazmida ==<br /> Najprej so pripravili donorski plazmid pmPSP-hNGR na katerem je bil t.i. piggyBac transpozon, ki je poleg zapisa za transgen hNGF, vseboval tudi promotor mišjega parotidnega sekretornega proteina (specifičen za žleze slinavke), gen za poliadenilacijski signal govejega rastnega hormona (bGH-pA), CMV promotor genov za rezistenco na neomicin in EGFP, ki sta povezana preko 2A peptida (Neo-2A-EGFP). <br /> <br /> == Transgenske živali ==<br /> V projedra 96 mišjih zigot so poleg donorskega plazmida pmPSP-hNGR injicirali tudi pomožni plazmid s PB transpozazo. Vseh 90 embrijev so prenesli v samice. Skotilo se je samo 35 miši od katerih so le v 18 s PCR analizo zaznali selekcijski marker EGFP. Pri transgenih miših niso zaznali nobenega posebnega fenotipa, so pa izražale različne koncentracije EGFP. S prenosom po Southernu so ugotovili, da je prišlo do integracije transpozona pri vseh miših na istem mestu, število ponovitev pa je bilo različno (1-6).<br /> <br /> == Izbira mišje linije z največjo koncentracijo hNGF v slini ==<br /> Plazmid so vnesli v miši različnih linij in s pomočjo testa ELISA določili koncentracijo terapevtskega proteina v slini. Če je bilo prisotnih več kopij transgena, je bila raven proteina bolj variabilna kot pri prisotnosti le ene kopije. Določili so tudi koncentracijo mNGF, ki je bila nižja in primerljiva s koncentracijo mNGF pri WT miši. <br /> <br /> == Linija 553 transgenskih miši ==<br /> Delo so nadaljevali z linijo 553 transgenskih miši. Identificirali so mesto integracije v genomu s pomočjo inverznega PCR. Gen za hNGF se je integriral na v nekodirajoče zaporedje in sicer med dve TTAA mesti (prepoznavno zaporedje za PB transpozazo). Z uporabo RT-PCR različnih tkiv so potrdili, da se je hNGF izločal predvsem v treh žlezah slinavkah, ne pa iz jeter, mišic … S pomočjo prenosa western so potrdili prisotnost hNGF v slini, kar nakazuje, da je sekrecija proteina iz žlez slinavk potekla uspešno. Sledilo je čiščenje s pomočjo kromatografije z ločevanjem po velikosti (izkoristek je bil 51,47 %). Identifikacijo očiščenega hNGF so potrdili s pomočjo prenosa western in LC-MS/MS. Izolirani protein so dodali celicam PC12 in ugotovili, da je prišlo do induciranja nevronske diferenciacije, kar kaže na visoko funkcionalnost proteina. <br /> <br /> == Zaključek ==<br /> S pomočjo študije so potrdili uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo proteinov, saj nastala zadostna količina funkcionalnega proteina. Z optimizacijo postopkov (npr. za zbiranje sline) bi lahko ta sistem uporabili za proizvodnjo terapevtskih proteinov.</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Proizvodnja_humanega_%C5%BEiv%C4%8Dnega_rastnega_faktorja_v_slini_transgenskih_mi%C5%A1i_z_uporabo_%C5%BElez_slinavk_kot_bioreaktorjev&diff=12570 2017-03-27T19:01:06Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>Transgenske živali se uporabljajo za proizvodnjo različnih terapevtsko pomembnih humanih proteinov. Običajno se uporablja izražanje proteinov v mleku, ki se ga lahko dobi na relativno preprost način. Problem predstavlja dejstvo, da se za tovrstno pridobivanje terapevtskih proteinov lahko uporabljajo le samice in še to le v laktacijski dobi. Ta je pri nekaterih živalskih vrstah kratka, kar pomeni manj želenega proteina. Poleg tega pa je v mleku prisotnih še veliko endogenih proteinov, ki otežijo čiščenje proteina.<br /> Zaradi vseh naštetih slabosti izražanja tujih proteinov v mleku, so poskusili drugačen pristop in sicer z uporabo žlez slinavk. Te so eksokrini organ in izločajo biološko aktivne proteine v slini, ki neprenehoma nastaja tako pri samicah kot tudi pri samcih skozi celotno življenjsko dobo. Poleg tega pa veliko živali izloča velike volumne sline, ki so pogosto tudi večji od količine nastalega mleka. V slini je tudi manj endogenih proteinov, kar je prednost pri čiščenju tujih proteinov.<br /> V tej študiji so poskusili s pomočjo transgenskih miši pridobiti humani živčni rastni faktor (iz ang. ''human nerve growth factor'' (NGF)). Ta je klinično pomemben za zdravljenje določenih nevronskih bolezni, ima pa tudi potencial pri nekaterih drugih motnjah, ki niso nevronske. Komercialni mišji NGF (mNGF) se na Kitajskem že uporablja pri zdravljenju določenih bolezni (npr. za Alzheimerjevo in Parkinsonovo bolezen). Ta je tudi bolj občutljiv na proteolitično cepitev in toplotno denaturacijo, ima pa tudi nižjo aktivnost kot hNGH v človeških celicah. <br /> Zgoraj našteti razlogi so bili motivacija za uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo hNGF.<br /> <br /> == Priprava plazmida ==<br /> Najprej so pripravili donorski plazmid pmPSP-hNGR na katerem je bil t.i. piggyBac transpozon, ki je poleg zapisa za transgen hNGF, vseboval tudi promotor mišjega parotidnega sekretornega proteina (specifičen za žleze slinavke), gen za poliadenilacijski signal govejega rastnega hormona (bGH-pA), CMV promotor genov za rezistenco na neomicin in EGFP, ki sta povezana preko 2A peptida (Neo-2A-EGFP). <br /> <br /> == Transgenske živali ==<br /> V projedra 96 mišjih zigot so poleg donorskega plazmida pmPSP-hNGR injicirali tudi pomožni plazmid s PB transpozazo. Vseh 90 embrijev so prenesli v samice. Skotilo se je samo 35 miši od katerih so le v 18 s PCR analizo zaznali selekcijski marker EGFP. Pri transgenih miših niso zaznali nobenega posebnega fenotipa, so pa izražale različne koncentracije EGFP. S prenosom po Southernu so ugotovili, da je prišlo do integracije transpozona pri vseh miših na istem mestu, število ponovitev pa je bilo različno (1-6).<br /> <br /> == Izbira mišje linije z največjo koncentracijo hNGF v slini ==<br /> Plazmid so vnesli v miši različnih linij in s pomočjo testa ELISA določili koncentracijo terapevtskega proteina v slini. Če je bilo prisotnih več kopij transgena, je raven proteina bila bolj variabilna kot ko je bila prisotna le ena kopija. Določili so tudi prisotnost mišjega NGF (mNGF), ki je bila nižja in primerljiva s koncentracijo mNGF pri WT miši. <br /> <br /> == Linija 553 transgenskih miši ==<br /> Delo so nadaljevali z linijo 553 transgenskih miši. Identificirali so mesto integracije v genomu s pomočjo inverznega PCR. Gen za hNGF se je integriral na v nekodirajoče zaporedje in sicer med dve TTAA mesti (prepoznavno zaporedje za PB transpozazo). Z uporabo RT-PCR različnih tkiv so potrdili, da se je hNGF izločal predvsem v treh žlezah slinavkah, ne pa iz jeter, mišic … S pomočjo prenosa western so potrdili prisotnost hNGF v slini, kar nakazuje, da je sekrecija proteina iz žlez slinavk potekla uspešno. Sledilo je čiščenje s pomočjo kromatografije z ločevanjem po velikosti (izkoristek je bil 51,47 %). Identifikacijo očiščenega hNGF so potrdili s pomočjo prenosa western in LC-MS/MS. Izolirani protein so dodali celicam PC12 in ugotovili, da je prišlo do induciranja nevronske diferenciacije, kar kaže na visoko funkcionalnost proteina. <br /> <br /> == Zaključek ==<br /> S pomočjo študije so potrdili uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo proteinov, saj nastala zadostna količina funkcionalnega proteina. Z optimizacijo postopkov (npr. za zbiranje sline) bi lahko ta sistem uporabili za proizvodnjo terapevtskih proteinov.</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Proizvodnja_humanega_%C5%BEiv%C4%8Dnega_rastnega_faktorja_v_slini_transgenskih_mi%C5%A1i_z_uporabo_%C5%BElez_slinavk_kot_bioreaktorjev&diff=12569 2017-03-27T18:55:04Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>Transgenske živali se uporabljajo za proizvodnjo različnih terapevtsko pomembnih humanih proteinov. Običajno se uporablja izražanje proteinov v mleku, ki se ga lahko dobi na relativno preprost način. Problem predstavlja dejstvo, da se za tovrstno pridobivanje terapevtskih proteinov lahko uporabljajo le samice in še to le v laktacijski dobi. Ta je pri nekaterih živalskih vrstah kratka, kar pomeni manj želenega proteina. Poleg tega pa je v mleku prisotnih še veliko endogenih proteinov, ki otežijo čiščenje proteina.<br /> Zaradi vseh naštetih slabosti izražanja tujih proteinov v mleku, so poskusili drugačen pristop in sicer z uporabo žlez slinavk. Te so eksokrini organ in izločajo biološko aktivne proteine v slini, ki neprenehoma nastaja tako pri samicah kot tudi pri samcih skozi celotno življenjsko dobo. Poleg tega pa veliko živali izloča velike volumne sline, ki so pogosto tudi večji od količine nastalega mleka. V slini je tudi manj endogenih proteinov, kar je prednost pri čiščenju tujih proteinov.<br /> V tej študiji so poskusili s pomočjo transgenskih miši pridobiti humani živčni rastni faktor (iz ang. ''human nerve growth factor'' (NGF)). Ta je klinično pomemben za zdravljenje določenih nevronskih bolezni, ima pa tudi potencial pri nekaterih drugih motnjah, ki niso nevronske. Komercialni mišji NGF (mNGF) se na Kitajskem že uporablja pri zdravljenju določenih bolezni (npr. za Alzheimerjevo in Parkinsonovo bolezen). Mišji NGF je bolj občutljiv na proteolitično cepitev in toplotno denaturacijo, ima pa tudi nižjo aktivnost kot hNGH v človeških celicah. <br /> Zgoraj našteti razlogi so bili motivacija za uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo hNGF.<br /> <br /> == Priprava plazmida ==<br /> Najprej so pripravili donorski plazmid pmPSP-hNGR na katerem je bil t.i. piggyBac transpozon, ki je poleg zapisa za transgen hNGF, vseboval tudi promotor mišjega parotidnega sekretornega proteina (specifičen za žleze slinavke), gen za poliadenilacijski signal govejega rastnega hormona (bGH-pA), CMV promotor genov za rezistenco na neomicin in EGFP, ki sta povezana preko 2A peptida (Neo-2A-EGFP). <br /> <br /> == Transgenske živali ==<br /> V projedra 96 mišjih zigot so poleg donorskega plazmida pmPSP-hNGR injicirali tudi pomožni plazmid s PB transpozazo. Vseh 90 embrijev so prenesli v samice. Skotilo se je samo 35 miši od katerih so le v 18 s PCR analizo zaznali selekcijski marker EGFP. Pri transgenih miših niso zaznali nobenega posebnega fenotipa, so pa izražale različne koncentracije EGFP. S prenosom po Southernu so ugotovili, da je prišlo do integracije transpozona pri vseh miših na istem mestu, število ponovitev pa je bilo različno (1-6).<br /> <br /> == Izbira mišje linije z največjo koncentracijo hNGF v slini ==<br /> Plazmid so vnesli v miši različnih linij in s pomočjo testa ELISA določili koncentracijo terapevtskega proteina v slini. Če je bilo prisotnih več kopij transgena, je raven proteina bila bolj variabilna kot ko je bila prisotna le ena kopija. Določili so tudi prisotnost mišjega NGF (mNGF), ki je bila nižja in primerljiva s koncentracijo mNGF pri WT miši. <br /> <br /> == Linija 553 transgenskih miši ==<br /> Delo so nadaljevali z linijo 553 transgenskih miši. Identificirali so mesto integracije v genomu s pomočjo inverznega PCR. Gen za hNGF se je integriral na v nekodirajoče zaporedje in sicer med dve TTAA mesti (prepoznavno zaporedje za PB transpozazo). Z uporabo RT-PCR različnih tkiv so potrdili, da se je hNGF izločal predvsem v treh žlezah slinavkah, ne pa iz jeter, mišic … S pomočjo prenosa western so potrdili prisotnost hNGF v slini, kar nakazuje, da je sekrecija proteina iz žlez slinavk potekla uspešno. Sledilo je čiščenje s pomočjo kromatografije z ločevanjem po velikosti (izkoristek je bil 51,47 %). Identifikacijo očiščenega hNGF so potrdili s pomočjo prenosa western in LC-MS/MS. Izolirani protein so dodali celicam PC12 in ugotovili, da je prišlo do induciranja nevronske diferenciacije, kar kaže na visoko funkcionalnost proteina. <br /> <br /> == Zaključek ==<br /> S pomočjo študije so potrdili uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo proteinov, saj nastala zadostna količina funkcionalnega proteina. Z optimizacijo postopkov (npr. za zbiranje sline) bi lahko ta sistem uporabili za proizvodnjo terapevtskih proteinov.</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Proizvodnja_humanega_%C5%BEiv%C4%8Dnega_rastnega_faktorja_v_slini_transgenskih_mi%C5%A1i_z_uporabo_%C5%BElez_slinavk_kot_bioreaktorjev&diff=12568 2017-03-27T18:52:44Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>Transgenske živali se uporabljajo za proizvodnjo različnih terapevtsko pomembnih humanih proteinov. Običajno se uporablja izražanje proteinov v mleku, ki se ga lahko dobi na relativno preprost način. Problem predstavlja dejstvo, da se za tovrstno pridobivanje terapevtskih proteinov lahko uporabljajo le samice in še to le v laktacijski dobi. Ta je pri nekaterih živalskih vrstah kratka, kar pomeni manj želenega proteina. Poleg tega pa je v mleku prisotnih še veliko endogenih proteinov, ki otežijo čiščenje proteina.<br /> Zaradi vseh naštetih slabosti izražanja tujih proteinov v mleku, so poskusili drugačen pristop in sicer z uporabo žlez slinavk. Te so eksokrini organ in izločajo biološko aktivne proteine v slini, ki neprenehoma nastaja tako pri samicah kot tudi pri samcih skozi celotno življenjsko dobo. Poleg tega pa veliko živali izloča velike volumne sline, ki so pogosto tudi večji od količine nastalega mleka. V slini je tudi manj endogenih proteinov, kar je prednost pri čiščenju tujih proteinov.<br /> V tej študiji so poskusili s pomočjo transgenskih miši pridobiti humani živčni rastni faktor (iz ang. ''human nerve growth factor'' (NGF)). Ta je klinično pomemben za zdravljenje določenih nevronskih bolezni, ima pa tudi potencial pri nekaterih drugih motnjah, ki niso nevronske. Komercialni mišji NGF (mNGF) se na Kitajskem že uporablja pri zdravljenju določenih bolezni (npr. za Alzheimerjevo in Parkinsonovo bolezen). Mišji NGF je bolj občutljiv na proteolitično cepitev in toplotno denaturacijo, ima pa tudi nižjo aktivnost kot hNGH v človeških celicah. <br /> Zgoraj našteti razlogi so bili motivacija za uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo hNGF.<br /> <br /> == Priprava plazmida ==<br /> Najprej so pripravili donorski plazmid pmPSP-hNGR na katerem je bil t.i. piggyBac transpozon, ki je poleg zapisa za transgen hNGF, vseboval tudi promotor mišjega parotidnega sekretornega proteina (specifičen za žleze slinavke), gen za poliadenilacijski signal govejega rastnega hormona (bGH-pA), CMV promotor genov za rezistenco na neomicin in EGFP, ki sta povezana preko 2A peptida (Neo-2A-EGFP). <br /> <br /> == Transgenske živali ==<br /> V projedra 96 mišjih zigot so poleg donorskega plazmida pmPSP-hNGR injicirali tudi pomožni plazmid s PB transpozazo. Vseh 90 embrijev so prenesli v samice. Skotilo se je samo 35 miši od katerih so le v 18 s PCR analizo zaznali selekcijski marker EGFP. Pri transgenih miših niso zaznali nobenega posebnega fenotipa, so pa izražale različne koncentracije EGFP. S prenosom po Southernu so ugotovili, da je prišlo do integracije transpozona pri vseh miših na istem mestu, število ponovitev pa je bilo različno (1-6).<br /> <br /> == Izbira mišje linije, kjer je največja koncentracija hNGF v slini ==<br /> Plazmid so vnesli v miši različnih linij in s pomočjo testa ELISA določili koncentracijo terapevtskega proteina v slini. Če je bilo prisotnih več kopij transgena, je raven proteina bila bolj variabilna kot ko je bila prisotna le ena kopija. Določili so tudi prisotnost mišjega NGF (mNGF), ki je bila nižja in primerljiva s koncentracijo mNGF pri WT miši. <br /> <br /> == Linija 553 transgenskih miši ==<br /> Delo so nadaljevali z linijo 553 transgenskih miši. Identificirali so mesto integracije v genomu s pomočjo inverznega PCR. Gen za hNGF se je integriral na v nekodirajoče zaporedje in sicer med dve TTAA mesti (prepoznavno zaporedje za PB transpozazo). Z uporabo RT-PCR različnih tkiv so potrdili, da se je hNGF izločal predvsem v treh žlezah slinavkah, ne pa iz jeter, mišic … S pomočjo prenosa western so potrdili prisotnost hNGF v slini, kar nakazuje, da je sekrecija proteina iz žlez slinavk potekla uspešno. Sledilo je čiščenje s pomočjo kromatografije z ločevanjem po velikosti (izkoristek je bil 51,47 %). Identifikacijo očiščenega hNGF so potrdili s pomočjo prenosa western in LC-MS/MS. Izolirani protein so dodali celicam PC12 in ugotovili, da je prišlo do induciranja nevronske diferenciacije, kar kaže na visoko funkcionalnost proteina. <br /> <br /> == Zaključek ==<br /> S pomočjo študije so potrdili uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo proteinov, saj nastala zadostna količina funkcionalnega proteina. Z optimizacijo postopkov (npr. za zbiranje sline) bi lahko ta sistem uporabili za proizvodnjo terapevtskih proteinov.</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Proizvodnja_humanega_%C5%BEiv%C4%8Dnega_rastnega_faktorja_v_slini_transgenskih_mi%C5%A1i_z_uporabo_%C5%BElez_slinavk_kot_bioreaktorjev&diff=12567 2017-03-27T18:51:02Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>Transgenske živali se uporabljajo za proizvodnjo različnih terapevtsko pomembnih humanih proteinov. Običajno se uporablja izražanje proteinov v mleku, ki se ga lahko dobi na relativno preprost način. Problem predstavlja dejstvo, da se za tovrstno pridobivanje terapevtskih proteinov lahko uporabljajo le samice in še to le v laktacijski dobi. Ta je pri nekaterih živalskih vrstah kratka, kar pomeni manj želenega proteina. Poleg tega pa je v mleku prisotnih še veliko endogenih proteinov, ki otežijo čiščenje proteina.<br /> Zaradi vseh naštetih slabosti izražanja tujih proteinov v mleku, so poskusili drugačen pristop in sicer z uporabo žlez slinavk. Te so eksokrini organ in izločajo biološko aktivne proteine v slini, ki neprenehoma nastaja tako pri samicah kot tudi pri samcih skozi celotno življenjsko dobo. Poleg tega pa veliko živali izloča velike volumne sline, ki so pogosto tudi večji od količine nastalega mleka. V slini je tudi manj endogenih proteinov, kar je prednost pri čiščenju tujih proteinov.<br /> V tej študiji so poskusili s pomočjo transgenskih miši pridobiti humani živčni rastni faktor (iz ang. human nerve growth factor (NGF)). Ta je klinično pomemben za zdravljenje določenih nevronskih bolezni, ima pa tudi potencial pri nekaterih drugih motnjah, ki niso nevronske. Komercialni mišji NGF (mNGF) se na Kitajskem že uporablja pri zdravljenju določenih bolezni (npr. za Alzheimerjevo in Parkinsonovo bolezen). Mišji NGF je bolj občutljiv na proteolitično cepitev in toplotno denaturacijo, ima pa tudi nižjo aktivnost kot hNGH v človeških celicah. <br /> Zgoraj našteti razlogi so bili motivacija za uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo hNGF.<br /> <br /> == Priprava plazmida ==<br /> Najprej so pripravili donorski plazmid pmPSP-hNGR na katerem je bil t.i. piggyBac transpozon, ki je poleg zapisa za transgen hNGF, vseboval tudi promotor mišjega parotidnega sekretornega proteina (specifičen za žleze slinavke), gen za poliadenilacijski signal govejega rastnega hormona (bGH-pA), CMV promotor genov za rezistenco na neomicin in EGFP, ki sta povezana preko 2A peptida (Neo-2A-EGFP). <br /> <br /> == Transgenske živali ==<br /> V projedra 96 mišjih zigot so poleg donorskega plazmida pmPSP-hNGR injicirali tudi pomožni plazmid s PB transpozazo. Vseh 90 embrijev so prenesli v samice. Skotilo se je samo 35 miši od katerih so le v 18 s PCR analizo zaznali selekcijski marker EGFP. Pri transgenih miših niso zaznali nobenega posebnega fenotipa, so pa izražale različne koncentracije EGFP. S prenosom po Southernu so ugotovili, da je prišlo do integracije transpozona pri vseh miših na istem mestu, število ponovitev pa je bilo različno (1-6).<br /> <br /> == Izbira mišje linije, kjer je največja koncentracija hNGF v slini ==<br /> Plazmid so vnesli v miši različnih linij in s pomočjo testa ELISA določili koncentracijo terapevtskega proteina v slini. Če je bilo prisotnih več kopij transgena, je raven proteina bila bolj variabilna kot ko je bila prisotna le ena kopija. Določili so tudi prisotnost mišjega NGF (mNGF), ki je bila nižja in primerljiva s koncentracijo mNGF pri WT miši. <br /> <br /> == Linija 553 transgenskih miši ==<br /> Delo so nadaljevali z linijo 553 transgenskih miši. Identificirali so mesto integracije v genomu s pomočjo inverznega PCR. Gen za hNGF se je integriral na v nekodirajoče zaporedje in sicer med dve TTAA mesti (prepoznavno zaporedje za PB transpozazo). Z uporabo RT-PCR različnih tkiv so potrdili, da se je hNGF izločal predvsem v treh žlezah slinavkah, ne pa iz jeter, mišic … S pomočjo prenosa western so potrdili prisotnost hNGF v slini, kar nakazuje, da je sekrecija proteina iz žlez slinavk potekla uspešno. Sledilo je čiščenje s pomočjo kromatografije z ločevanjem po velikosti (izkoristek je bil 51,47 %). Identifikacijo očiščenega hNGF so potrdili s pomočjo prenosa western in LC-MS/MS. Izolirani protein so dodali celicam PC12 in ugotovili, da je prišlo do induciranja nevronske diferenciacije, kar kaže na visoko funkcionalnost proteina. <br /> <br /> == Zaključek ==<br /> S pomočjo študije so potrdili uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo proteinov, saj nastala zadostna količina funkcionalnega proteina. Z optimizacijo postopkov (npr. za zbiranje sline) bi lahko ta sistem uporabili za proizvodnjo terapevtskih proteinov.</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Proizvodnja_humanega_%C5%BEiv%C4%8Dnega_rastnega_faktorja_v_slini_transgenskih_mi%C5%A1i_z_uporabo_%C5%BElez_slinavk_kot_bioreaktorjev&diff=12566 2017-03-27T18:50:47Z

<p>Neža Levičnik: New page: Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev Transgenske živali se uporabljajo za proizvodnjo različnih terapev...</p> <hr /> <div>Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev<br /> <br /> Transgenske živali se uporabljajo za proizvodnjo različnih terapevtsko pomembnih humanih proteinov. Običajno se uporablja izražanje proteinov v mleku, ki se ga lahko dobi na relativno preprost način. Problem predstavlja dejstvo, da se za tovrstno pridobivanje terapevtskih proteinov lahko uporabljajo le samice in še to le v laktacijski dobi. Ta je pri nekaterih živalskih vrstah kratka, kar pomeni manj želenega proteina. Poleg tega pa je v mleku prisotnih še veliko endogenih proteinov, ki otežijo čiščenje proteina.<br /> Zaradi vseh naštetih slabosti izražanja tujih proteinov v mleku, so poskusili drugačen pristop in sicer z uporabo žlez slinavk. Te so eksokrini organ in izločajo biološko aktivne proteine v slini, ki neprenehoma nastaja tako pri samicah kot tudi pri samcih skozi celotno življenjsko dobo. Poleg tega pa veliko živali izloča velike volumne sline, ki so pogosto tudi večji od količine nastalega mleka. V slini je tudi manj endogenih proteinov, kar je prednost pri čiščenju tujih proteinov.<br /> V tej študiji so poskusili s pomočjo transgenskih miši pridobiti humani živčni rastni faktor (iz ang. human nerve growth factor (NGF)). Ta je klinično pomemben za zdravljenje določenih nevronskih bolezni, ima pa tudi potencial pri nekaterih drugih motnjah, ki niso nevronske. Komercialni mišji NGF (mNGF) se na Kitajskem že uporablja pri zdravljenju določenih bolezni (npr. za Alzheimerjevo in Parkinsonovo bolezen). Mišji NGF je bolj občutljiv na proteolitično cepitev in toplotno denaturacijo, ima pa tudi nižjo aktivnost kot hNGH v človeških celicah. <br /> Zgoraj našteti razlogi so bili motivacija za uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo hNGF.<br /> <br /> == Priprava plazmida ==<br /> Najprej so pripravili donorski plazmid pmPSP-hNGR na katerem je bil t.i. piggyBac transpozon, ki je poleg zapisa za transgen hNGF, vseboval tudi promotor mišjega parotidnega sekretornega proteina (specifičen za žleze slinavke), gen za poliadenilacijski signal govejega rastnega hormona (bGH-pA), CMV promotor genov za rezistenco na neomicin in EGFP, ki sta povezana preko 2A peptida (Neo-2A-EGFP). <br /> <br /> == Transgenske živali ==<br /> V projedra 96 mišjih zigot so poleg donorskega plazmida pmPSP-hNGR injicirali tudi pomožni plazmid s PB transpozazo. Vseh 90 embrijev so prenesli v samice. Skotilo se je samo 35 miši od katerih so le v 18 s PCR analizo zaznali selekcijski marker EGFP. Pri transgenih miših niso zaznali nobenega posebnega fenotipa, so pa izražale različne koncentracije EGFP. S prenosom po Southernu so ugotovili, da je prišlo do integracije transpozona pri vseh miših na istem mestu, število ponovitev pa je bilo različno (1-6).<br /> <br /> == Izbira mišje linije, kjer je največja koncentracija hNGF v slini ==<br /> Plazmid so vnesli v miši različnih linij in s pomočjo testa ELISA določili koncentracijo terapevtskega proteina v slini. Če je bilo prisotnih več kopij transgena, je raven proteina bila bolj variabilna kot ko je bila prisotna le ena kopija. Določili so tudi prisotnost mišjega NGF (mNGF), ki je bila nižja in primerljiva s koncentracijo mNGF pri WT miši. <br /> <br /> == Linija 553 transgenskih miši ==<br /> Delo so nadaljevali z linijo 553 transgenskih miši. Identificirali so mesto integracije v genomu s pomočjo inverznega PCR. Gen za hNGF se je integriral na v nekodirajoče zaporedje in sicer med dve TTAA mesti (prepoznavno zaporedje za PB transpozazo). Z uporabo RT-PCR različnih tkiv so potrdili, da se je hNGF izločal predvsem v treh žlezah slinavkah, ne pa iz jeter, mišic … S pomočjo prenosa western so potrdili prisotnost hNGF v slini, kar nakazuje, da je sekrecija proteina iz žlez slinavk potekla uspešno. Sledilo je čiščenje s pomočjo kromatografije z ločevanjem po velikosti (izkoristek je bil 51,47 %). Identifikacijo očiščenega hNGF so potrdili s pomočjo prenosa western in LC-MS/MS. Izolirani protein so dodali celicam PC12 in ugotovili, da je prišlo do induciranja nevronske diferenciacije, kar kaže na visoko funkcionalnost proteina. <br /> <br /> == Zaključek ==<br /> S pomočjo študije so potrdili uporabo žlez slinavk transgenskih živali kot bioreaktorjev za sintezo proteinov, saj nastala zadostna količina funkcionalnega proteina. Z optimizacijo postopkov (npr. za zbiranje sline) bi lahko ta sistem uporabili za proizvodnjo terapevtskih proteinov.</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2017&diff=12551 2017-03-26T20:00:59Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''<br /> <br /> Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).<br /> <br /> Način vnosa:<br /> <br /> # The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops &amp; Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017<br /> (slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br /> <br /> <br /> '''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''<br /> <br /> <br /> '''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec)&lt;br&gt;<br /> # Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017<br /> # Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017<br /> # The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017<br /> <br /> <br /> '''Gensko spremenjene živali''' (15. marec)&lt;br&gt;<br /> # Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017<br /> # High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017<br /> # Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017<br /> <br /> <br /> '''Okolje''' (22. marec)&lt;br&gt;<br /> # Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017<br /> # Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017<br /> # Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017<br /> <br /> <br /> '''Terapevtski proteini''' (29. marec)&lt;br&gt;<br /> # Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) [[Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev]]. Neža Levičnik, 29. marca 2017<br /> # Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) Mechano rastni faktor-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za inženirstvo tkiva ligamentov. Peter Prezelj, 29. marca 2017<br /> # Secretion of biologically active pancreatitis-associated protein I (PAP) by genetically modified dairy ''Lactococcus lactis'' NZ9000 in the prevention of intestinal mucositis (R. D. Carvalho ''et al''; Microbial cell factories, 2017; http://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-017-0624-x) [[Preprečevanje vnetja sluznice prebavnega trakta z gensko spremenjenimi bakterijami Lactococcus lactis NZ9000, ki izločajo biološko aktivni s pankreatitisom povezani protein I (PAP)]]. Domen Klofutar, 29. marec 2017<br /> <br /> <br /> '''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april)&lt;br&gt;<br /> # Ema Guštin &lt;3<br /> # Jan Rozman<br /> # A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice. Alja Zgonc, 5. april 2017<br /> <br /> <br /> '''Diagnostiki''' (12. april)&lt;br&gt; <br /> # Tjaša Košir<br /> # Petra Vivod<br /> # Marija Kisilak<br /> <br /> <br /> '''Cepiva''' (19. april)&lt;br&gt;<br /> #Tomaž Rozmarič<br /> #Amadeja Lapornik<br /> #Mojca Hunski<br /> <br /> <br /> '''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april)&lt;br&gt;<br /> #Vid Jazbec &lt;3 &lt;3<br /> #Zala Gluhić<br /> #Katja Malovrh<br /> <br /> <br /> '''Male molekule in polimeri''' (3. maj)&lt;br&gt;<br /> # Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola. Petra Tavčar,3. marec 2017<br /> # Tim Božič<br /> # Tajda Buh<br /> <br /> <br /> '''Encimi''' (10. maj)&lt;br&gt;<br /> # Nataša Traven<br /> # Bine Tršavec<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Pretvorba biomase''' (17. maj)&lt;br&gt;<br /> # Inge Sotlar<br /> # Anja Herceg<br /> # The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5). Anja Tanšek, 17. maj 2017<br /> <br /> <br /> '''Metabolno inženirstvo''' (24. maj)&lt;br&gt;<br /> # Barbara Dušak<br /> # Tjaša Grum<br /> # Sara Kimm Fuhrmann<br /> <br /> <br /> '''Biološki viri energije''' (31. maj)&lt;br&gt;<br /> # Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017<br /> # A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij)&lt;br&gt;<br /> # Matjaž Ivanuša<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2017&diff=12543 2017-03-25T19:30:05Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''<br /> <br /> Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).<br /> <br /> Način vnosa:<br /> <br /> # The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops &amp; Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017<br /> (slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br /> <br /> <br /> '''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''<br /> <br /> <br /> '''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec)&lt;br&gt;<br /> # Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017<br /> # Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017<br /> # The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017<br /> <br /> <br /> '''Gensko spremenjene živali''' (15. marec)&lt;br&gt;<br /> # Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017<br /> # High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017<br /> # Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017<br /> <br /> <br /> '''Okolje''' (22. marec)&lt;br&gt;<br /> # Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017<br /> # Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017<br /> # Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017<br /> <br /> <br /> '''Terapevtski proteini''' (29. marec)&lt;br&gt;<br /> # Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja v slini transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev. Neža Levičnik, 29. marca 2017<br /> # Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) Mechano rastni faktor-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za inženirstvo tkiva ligamentov. Peter Prezelj, 29. marca 2017<br /> #Domen Klofutar<br /> <br /> <br /> '''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april)&lt;br&gt;<br /> # Ema Guštin &lt;3<br /> # Jan Rozman<br /> # A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice. Alja Zgonc, 5. april 2017<br /> <br /> <br /> '''Diagnostiki''' (12. april)&lt;br&gt; <br /> # Tjaša Košir<br /> # Petra Vivod<br /> # Marija Kisilak<br /> <br /> <br /> '''Cepiva''' (19. april)&lt;br&gt;<br /> #Tomaž Rozmarič<br /> #Amadeja Lapornik<br /> #Mojca Hunski<br /> <br /> <br /> '''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april)&lt;br&gt;<br /> #Vid Jazbec &lt;3 &lt;3<br /> #Zala Gluhić<br /> #Katja Malovrh<br /> <br /> <br /> '''Male molekule in polimeri''' (3. maj)&lt;br&gt;<br /> # Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola. Petra Tavčar,3. marec 2017<br /> # Tim Božič<br /> # Tajda Buh<br /> <br /> <br /> '''Encimi''' (10. maj)&lt;br&gt;<br /> # Nataša Traven<br /> # Bine Tršavec<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Pretvorba biomase''' (17. maj)&lt;br&gt;<br /> # Inge Sotlar<br /> # Anja Herceg<br /> # The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5). Anja Tanšek, 17. maj 2017<br /> <br /> <br /> '''Metabolno inženirstvo''' (24. maj)&lt;br&gt;<br /> # Barbara Dušak<br /> # Tjaša Grum<br /> # Sara Kimm Fuhrmann<br /> <br /> <br /> '''Biološki viri energije''' (31. maj)&lt;br&gt;<br /> # Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017<br /> # A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij)&lt;br&gt;<br /> # Matjaž Ivanuša<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].</div>

Neža Levičnik https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MBT_seminarji_2017&diff=12281 2017-02-28T17:15:20Z

<p>Neža Levičnik: </p> <hr /> <div>'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''<br /> <br /> Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).<br /> <br /> Način vnosa:<br /> <br /> # The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops &amp; Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017<br /> (slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)<br /> <br /> <br /> '''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''<br /> <br /> <br /> '''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec)&lt;br&gt;<br /> # Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti ''Streptococcus pneumoniae'' v kloroplastih alge ''Chlamydomonas reinhardtii''. Eva Vidak, 8. marec 2017<br /> # Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) Bioinženiring rastlinske kulture ''Capsium frutescens'' z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina. Mojca Juteršek, 8. marec 2017<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Gensko spremenjene živali''' (15. marec)&lt;br&gt;<br /> # <br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Okolje''' (22. marec)&lt;br&gt;<br /> # Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) Okrasitev veziklov zunanje membrane z organofosforno hidrolazo in celuloza vezavno domeno za razgradnjo organofosfatnih pesticidov. Nina Roštan, 22. marec 2017<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Terapevtski proteini''' (29. marec)&lt;br&gt;<br /> # Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja iz sline transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev. Neža Levičnik, 29. marca 2017<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april)&lt;br&gt;<br /> # HIV antibodies for treatment of HIV infection (D. M. Margolis; Immunological reviews, 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/imr.12506/full). Protitelesa HIV za zdravljenje okužbe s HIV. Ema Guštin, 5. april 2017<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Diagnostiki''' (12. april)&lt;br&gt; <br /> # <br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Cepiva''' (19. april)&lt;br&gt;<br /> # <br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april)&lt;br&gt;<br /> #<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Male molekule in polimeri''' (3. maj)&lt;br&gt;<br /> # <br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Encimi''' (10. maj)&lt;br&gt;<br /> # <br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Pretvorba biomase''' (17. maj)&lt;br&gt;<br /> #<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Metabolno inženirstvo''' (24. maj)&lt;br&gt;<br /> # <br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Biološki viri energije''' (31. maj)&lt;br&gt;<br /> # Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> '''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij)&lt;br&gt;<br /> #<br /> #<br /> #<br /> <br /> <br /> Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].</div>

Neža Levičnik