Wiki FKKT - User contributions [en]

Samoinducibilno molekulsko stikalo za biosintezo hialuronske kisline z nizko molekulsko maso

2026-04-12T19:42:33Z

Nejc Horvat:

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acssynbio.5c00570 Programming Low-Molecular-Weight Hyaluronic Acid Biosynthesis in Bacillus amyloliquefaciens Via an Autoinducible Molecular Switch]

== Uvod ==

Bakterije imajo za regulacijo izražanja genov razvite zelo natančne regulatorne mehanizme, ki se odzivajo na okoljske dejavnike, s čimer vplivajo na metabolizem glede na njihove potrebe in stadij rasti. Sintezni biologi so razvili mnogo strategij regulacije izražanja genov, predvsem na nivoju transkripcije (inducibilni promotorji, odvisni od IPTG, ksiloze, saharoze, arabinoze ipd.), vendar pa so ti odvisni od eksogenega signala, ki direktno inducira izražanje pod nekim promotorjem. Možno alternativo predstavlja uporaba sistemov za zaznavanje celične gostote (ang. ''quorum sensing'', QS), ki predstavljajo izražanje genov na podlagi gostote celic, brez potrebe po eksogenem induktorju. V raziskavi so se osredotočili na optimizacijo regulacije biosinteze hialuronske kisline [1].

Hialuronska kislina (HA) je glikozaminoglikan, sestavljen iz ponavljajočih disaharidnih enot N-acetil-D-glukozamina in D-glukoronske kisline. Njena glavna naloga v bakterijah je kot virulenčni faktor, v vretenčarjih pa predstavlja pomemben del zunajceličnega matriksa, hrustanca, hkrati pa opravlja vloge kot signalna ali vezavna molekula pri embriogenezi, angiogenezi, celjenju ran ipd. Tradicionalno pridobivanje za aplikacije v zdravstvu, industriji in kozmetiki je vključevalo ekstrakcijo iz živalskih tkiv, dandanes pa je v uporabi predvsem mikrobna fermentacija. V tem procesu encim hialuronan sintaza katalizira polimerizacijo osnovnih gradnikov HA. Ker je HA polimer, ga najdemo v zelo različnih dolžinah, pri čemer se je izhodiščni članek fokusiral na HA z nizko molekulsko maso. Pri njih je postopek sinteze še nekoliko bolj poseben, saj potrebujemo še encim hialuronidazo, ki dolg polimer cepi do primernih dolžin [2, 3]. Primer je hialuronidaza SthHL, ki omogoča nastanek molekul HA primernih dolžin, vendar je ta regulacija v prejšnjih študijah potrebovala indukcijo s ksilozo, kar so v tej raziskavi skušali odpraviti [1].

== Oris izdelave sinteznobiološkega vezja ==

Raziskovalci so izdelali avtoinducibilno molekulsko stikalo v šasiji ''Bacillus amyloliquefaciens'', ki je predstavljalo regulatorni mehanizem pri biosintezi HA z nizko molekulsko maso. Sistem vključuje dve glavni komponenti – proteolitski sistem PaSspB-ssrA (odgovoren za razgradnjo encimov, ki omejujejo hitrost rasti) in sistem za zaznavanje celične gostote DegU-RapG-PhrG (omogoča regulacijo molekulske mase HA glede na gostoto celic). Cilj raziskave je bil povečati količino nastale HA ter producirati sistem, ki bi omogočal »programirano« modulacijo molekulske mase HA [1].

Glavni koraki pri izdelavi molekulskega stikala so:

1. konstrukcija in optimizacija proteolitskega sistema, ki bi deloval kot OFF stikalo za metabolizem in bil preusmeril metabolizem proti sintezi prekurzorjev HA

2. Uporaba QS sistema in ustreznega promotorja kot ON stikala za od celične gostote odvisno transkripcijo

3. Priprava šasije, ki bi producirala čim večjo količino produkta (»knockout« mutante)

4. Priprava z rastjo povezanih genov z dodanimi oznakami ssrA, ki bi skupaj s QS sistemom avtoinducirali ekspresijo hialuronidaze SthHL in proteina PaSspB (slednji prepozna ssrA oznake in jih dostavi do proteaz za razgradnjo)

== Delovanje in optimizacija vezja ==

=== SspB-ssrA proteolitski sistem ===

SspB-ssrA sistem v prokariotih omogoča proteolizo tarčnih proteinov preko prepoznave ssrA oznake s strani SspB proteina. Slednji dostavi prepoznan protein na kompleks ClpXP proteaze, kjer potečeta razvitje proteina in razgradnja s pomočjo ATP [4].
Znanstveniki so preverjali fluorescenco RFP (Red Fluorescent Protein) brez in z dodano ssrA oznako, pri čemer je prišlo do popolne atenuacije signala. Zato so delno modificirali nativno ssrA oznako, da bi omogočala, da se fluorescenca hkrati večja s časom fermentacije, hkrati pa da pride do hitrejše razgradnje proteina zaradi dodane oznake. V ta namen so testirali štiri različne SspB proteine različnih bakterij (''E. coli'', ''B. amyloliquefaciens'', ''B. subtilis'' in ''Pantoea alhagi'') in preverili do kakšne mere razgrajujejo z ssrA označen RFP. Najprimernejši je bil PaSspB iz bakterije ''P. alhagi'', pri kateri je prišlo do 37 % zmanjšanja fluorescence [1].

=== DegU-RapG-PhrG sistem za zaznavanje celične gostote ===

QS sistemi omogočajo regulacijo ekspresije genov brez eksogenih induktorjev, in sicer preko aktivacije promotorja glede na celično gostoto. Za po Gramu negativne bakterije se običajno uporablja sistem na osnovi acil homoserin laktona (AHL), ki pa ni kompatibilen z po Gramu pozitivnim rodom ''Bacillus''. V tej raziskavi so uporabili sistem DegU-RapG-PhrG iz ''B. subtilis'', ki deluje na principih fosforilacijske kaskade in antagonizma med peptidi, ki so v sistem udeleženi.

Pri nizki celični gostoti RapG inhibira fosforiliran DegU in prepreči, da bi ta aktiviral promotor PD4. Z višanjem celične gostote pa se akumulira zunajcelični peptid PhrG, ki se veže na RapG in prepreči inhibicijo. S tem se sproži transkripcija genov za PD4 promotorjem.

V raziskavi so znanstveniki konstruirali štiri seve ''B. amyloliquefaciens'', da bi potrdili mehanizem pod PD4 promotorjem. V sev, kjer so izražali RFP pod PD4 promotorjem (odvisinim od DegU), so zaznali visoko fluorescenco. V sevu, kjer so poleg tega še konstitutivno izražali DegU, pa so zaznali padec v fluorescenci in s tem dognali, da v njihovi šasiji fosforiliran DegU deluje kot represor PD4 promotorja.

Ker DegU ni uspešno aktiviral tega promotorja, so poiskali kompatibilen promotor, ki bi se primerno odzival na prisotnost DegU. Našli so nativen promotor v ''B. amyloliguefaciens'' s transkriptomsko primerjavo med sevom, ki DegU izraža in sevom iz katerega so ustrezen gen izbili. Izbrali so šest možnih kandidatov in pod temi promotorji izražali RFP. Do največje razlike med ekspresijo pri sevu z in brez DegU je prišlo pri promotorju PispA. Zanj so potrdili tudi njegovo odvisnost od celične gostote, saj je prišlo do njegove indukcije pri optični gostoti nad 4. Ta promotor predstavlja ON stikalo za izražanje proteina, ki se aktivira pri visoki celični gostoti [1].

=== Metabolno inženirstvo za izboljšanje sinteze HA v ''B. amyloliquefaciens'' ===

Preden so sistema, opisana v prejšnjih podpoglavjih, lahko uporabili za molekulsko stikalo pri sintezi hialuronske kisline, so morali raziskovalci najprej optimizirati biosintezo HA v izbrani šasiji ''B. amyloliquefaciens''. Temelji na ekspresiji hialuronan sintaze SthasA in hialuronidaze SthHL, ki skupaj omogočata de novo sintezo HA z določeno velikostjo iz osnovnih gradnikov UDP-N-acetil-D-glukozamina in UDP-D-glukoronske kisline [1,5]. Med fermentacijo stranski produkti, kot sta laktat in acetat, porabijo okoli 80 % vseh možnih virov ogljika, s čimer se močno zmanjša zmožnost sinteze drugih produktov, npr. hialuronske kisline. Raziskovalci so zato z metodo CRISPR-Cas9n ustvarili »knockout« seve ''B. amyloliquefaciens'', kjer so skušali zmotiti transkripcijo genov, udeleženih v sintezo laktata, acetata in nekaterih direktnih stranskih produktov v sintezi monosaharidnih prekurzorjev HA (genov, ki sodelujejo pri katabolizmu UDP-GlcNAc in UDP-GlcUA). Uporabili so metodo z dvema plazmidoma – enega z zapisom za nikazo Cas9n, drugega s sgRNA. Pri izbitju gena ldh so v mutiranem sevu opazili kar 68-% zmanjšanje v količini laktata. Poleg sevov z enim izbitim genom, so ustvarili tudi seve s kombiniranima dvema ali tremi izbitji genov. Kot najprimernejšo šasijo so izbrali sev z največjim titrom hialuronske kisline, ki so ga določili s HPLC preko primerjave s kalibracijsko krivuljo HA standarda. Izbrani sev je povečal sintezo N-acetilglukozamina za 3,5-krat, kar je omogočilo za 14 % višjo produkcijo HA [1].

=== Molekulsko stikalo za regulacijo biosinteze HA z nizko molekulsko maso ===

Za določanje učinkovitosti PaSsspB-ssrA sistema v ''B. amyloliquefaciens'' sta bila izbrana encima pfkA in fruA, saj so v predhodnih raziskavah določili, da oba indirektno vplivata na biosintezo hialuronske kisline. 6-Fosfofruktokinaza predstavlja glavni encim, ki omejuje hitrost glikolize. Atenuacija tega encima poveča količino znotrajcelične fruktoze-6-fosfata in s tem njeno dostopnost v sintezi HA. Izbijanje gena za fruA pa je vodilo v približno 25 % zvišanje produkcije HA.

V raziskavi so najprej konstruirali vezje regulirano z eksogenim induktorjem. Represor XylR se veže na promotorsko regijo PxylA in s tem preprečuje transkripcijo genov za SthHL in PaSspB, ob dodatku zunanjega signala (ksiloze), se ta veže na represor in preprečuje represijo obeh genov.
V tem vezju je vloga hialuronidaze SthHL cepitev HA, PaSspB pa sproži degradacijo s ssrA označenih PfkA in FruA, s čimer se fluks ogljika v glikolizi preusmeri v sintezo HA gradnikov. V nadgrajenem vezju so indukcijo s ksilozo zamenjali z avtoindukcijo s promotorjem PispA, ki regulira ekspresijo genov SthHL in PaSspB glede na celično gostoto. V eksponentni fazi rasti celic je bil titer hialuronske kisline nizek, z večanjem celične gostote pa je prišlo do aktivacije SthHL in PaSspB, kar je vodilo do stabilizacije rasti celic (manjši del fluksa ogljika gre za glikolizo) in povečanje biosinteze HA. Končni sev s QS regulacijo je produciral 13,5 g/L HA z nizko molekulsko maso, kar predstavlja 28-% povišanje glede na kontrolo [1].

== Zaključek ==

Raziskovalcem je uspelo konstruirati molekulsko stikalo, ki omogoča povečano sintezo hialuronske kisline znotraj enega seva brez potrebe po zunanjih induktorjih ali dodatnih encimih. Zunanje induktorje je nadomestil sistem za zaznavanje celične gostote, ki omogoča preusmeritev metabolizma od glikolize in celične rasti k sintezi hialuronske kisline v fazi, ko energija za rast ni več tako nujna. Ta sistem tako ponuja rešitev nad dolgotrajnih problemom hkratne uspešne rasti celic in produkcije zadostne količine hialuronske kisline. Sistem prav tako ni baziran na dodatku eksogenih encimov (hialuronidaz), ki bi dodatno povečalo kompleksnost sistema, prav tako pa tudi stroške sinteze. Zaradi neodvisnosti od zunanjih induktorjev, sistem omogoča tudi lažje čiščenje HA in odstranitev kontaminant, kar dodatno zniža stroške pri industrijski sintezi (v kozmetični in farmacevtski industriji).

== Literatura ==

[1] Zhong, Q., Li, Z., Duan, W., Lei, P., Xu, X., Xu, H., Li, S. and Qiu, Y. Programming Low-Molecular-Weight Hyaluronic Acid Biosynthesis in Bacillus amyloliquefaciens Via an Autoinducible Molecular Switch. ACS Synthetic Biology, 2026, 15(3), str. 1008–1020. doi:https://doi.org/10.1021/acssynbio.5c00570.

[2] Palenčárová, K., Köszagová, R. in Nahálka, J. Hyaluronic Acid and Its Synthases—Current Knowledge. International Journal of Molecular Sciences, 2025, 26(15), str. 7028–7028. doi:https://doi.org/10.3390/ijms26157028.

[3] Ucm, R., Aem, M., Lhb, Z., Kumar, V., Taherzadeh, M.J., Garlapati, V.K. in Chandel, A.K. Comprehensive review on biotechnological production of hyaluronic acid: status, innovation, market and applications. Bioengineered, 2022, 13(4), str. 9645–9661. doi:https://doi.org/10.1080/21655979.2022.2057760.

[4] Alireza Ghanbarpour, Fei, X., Baker, T.A., Davis, J.H. in Sauer, R.T. The SspB adaptor drives structural changes in the AAA+ ClpXP protease during ssrA-tagged substrate delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2023, 120(6). doi:https://doi.org/10.1073/pnas.2219044120.

[5] Imen Zalila-Kolsi, Afif Ben‐Mahmoud in Al-Barazie, R. Bacillus amyloliquefaciens: Harnessing Its Potential for Industrial, Medical, and Agricultural Applications—A Comprehensive Review. Microorganisms, 2023, 11(9), str. 2215–2215. doi:https://doi.org/10.3390/microorganisms11092215.

Seminarji SB 2025/26

2026-04-12T19:40:38Z

Nejc Horvat:

V študijskem letu 2025/26 študenti in študentke pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OrthologTransformer OrthologTransformer] (Tim David Agrež)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Genetsko_kodirani_biosenzor_za_spremljanje_depolimerizacije_morskih_polisarahidov Genetsko kodirani biosenzor za spremljanje depolimerizacije morskih polisarahidov] (Vanja Vogrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Komunikacije_na_podlagi_RNA_v_heterogenih_populacijah_mimetičnih_celic Komunikacije na podlagi RNA v heterogenih populacijah mimetičnih celic] (Marcel Tušek)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovanje_oscilatorjev_izra%C5%BEanja_proteinov_vodenih_s_%C5%A1umom_v_%C5%BEivih_celicah Načrtovanje oscilatorjev izražanja proteinov vodenih s šumom v živih celicah] (Varvara Titova)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Samoinducibilno_molekulsko_stikalo_za_biosintezo_hialuronske_kisline_z_nizko_molekulsko_maso Samoinducibilno molekulsko stikalo za biosintezo hialuronske kisline z nizko molekulsko maso] (Nejc Horvat)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NomNomNylon NomNomNylon] (Rebeka Ribič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TasAnchor TasAnchor] (Jasna Čarman)

(zgornji primer nadomestite s prvim letošnjim seminarjem iz študentskih projektov)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej najkasneje v ponedeljek do 23:59). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive (dostopno samo študentom tekočega letnika).

Kako je videti končni seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2024/25]].

Samoinducibilno molekulsko stikalo za biosintezo hialuronske kisline z nizko molekulsko maso

2026-04-12T19:37:23Z

Nejc Horvat:

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acssynbio.5c00570 Programming Low-Molecular-Weight Hyaluronic Acid Biosynthesis in Bacillus amyloliquefaciens Via an Autoinducible Molecular Switch]

== Uvod ==

Bakterije imajo za regulacijo izražanja genov razvite zelo natančne regulatorne mehanizme, ki se odzivajo na okoljske dejavnike, s čimer vplivajo na metabolizem glede na njihove potrebe in stadij rasti. Sintezni biologi so razvili mnogo strategij regulacije izražanja genov, predvsem na nivoju transkripcije (inducibilni promotorji, odvisni od IPTG, ksiloze, saharoze, arabinoze ipd.), vendar pa so ti odvisni od eksogenega signala, ki direktno inducira izražanje pod nekim promotorjem. Možno alternativo predstavlja uporaba sistemov za zaznavanje celične gostote (ang. ''quorum sensing'', QS), ki predstavljajo izražanje genov na podlagi gostote celic, brez potrebe po eksogenem induktorju. V raziskavi so se osredotočili na optimizacijo regulacije biosinteze hialuronske kisline.

Hialuronska kislina (HA) je glikozaminoglikan, sestavljen iz ponavljajočih disaharidnih enot N-acetil-D-glukozamina in D-glukoronske kisline. Njena glavna naloga v bakterijah je kot virulenčni faktor, v vretenčarjih pa predstavlja pomemben del zunajceličnega matriksa, hrustanca, hkrati pa opravlja vloge kot signalna ali vezavna molekula pri embriogenezi, angiogenezi, celjenju ran ipd. Tradicionalno pridobivanje za aplikacije v zdravstvu, industriji in kozmetiki je vključevalo ekstrakcijo iz živalskih tkiv, dandanes pa je v uporabi predvsem mikrobna fermentacija. V tem procesu encim hialuronan sintaza katalizira polimerizacijo osnovnih gradnikov HA. Ker je HA polimer, ga najdemo v zelo različnih dolžinah, pri čemer se je izhodiščni članek fokusiral na HA z nizko molekulsko maso. Pri njih je postopek sinteze še nekoliko bolj poseben, saj potrebujemo še encim hialuronidazo, ki dolg polimer cepi do primernih dolžin [2,3]. Primer je hialuronidaza SthHL, ki omogoča nastanek molekul HA primernih dolžin, vendar je ta regulacija v prejšnjih študijah potrebovala indukcijo s ksilozo, kar so v tej raziskavi skušali odpraviti.

== Oris izdelave sinteznobiološkega vezja ==

Raziskovalci so izdelali avtoinducibilno molekulsko stikalo v šasiji ''Bacillus amyloliquefaciens'', ki je predstavljalo regulatorni mehanizem pri biosintezi HA z nizko molekulsko maso. Sistem vključuje dve glavni komponenti – proteolitski sistem PaSspB-ssrA (odgovoren za razgradnjo encimov, ki omejujejo hitrost rasti) in sistem za zaznavanje celične gostote DegU-RapG-PhrG (omogoča regulacijo molekulske mase HA glede na gostoto celic). Cilj raziskave je bil povečati količino nastale HA ter producirati sistem, ki bi omogočal »programirano« modulacijo molekulske mase HA.

Glavni koraki pri izdelavi molekulskega stikala so:

1. konstrukcija in optimizacija proteolitskega sistema, ki bi deloval kot OFF stikalo za metabolizem in bil preusmeril metabolizem proti sintezi prekurzorjev HA

2. Uporaba QS sistema in ustreznega promotorja kot ON stikala za od celične gostote odvisno transkripcijo

3. Priprava šasije, ki bi producirala čim večjo količino produkta (»knockout« mutante)

4. Priprava z rastjo povezanih genov z dodanimi oznakami ssrA, ki bi skupaj s QS sistemom avtoinducirali ekspresijo hialuronidaze SthHL in proteina PaSspB (slednji prepozna ssrA oznake in jih dostavi do proteaz za razgradnjo)

== Delovanje in optimizacija vezja ==

=== SspB-ssrA proteolitski sistem ===

SspB-ssrA sistem v prokariotih omogoča proteolizo tarčnih proteinov preko prepoznave ssrA oznake s strani SspB proteina. Slednji dostavi prepoznan protein na kompleks ClpXP proteaze, kjer potečeta razvitje proteina in razgradnja s pomočjo ATP [4].
Znanstveniki so preverjali fluorescenco RFP (Red Fluorescent Protein) brez in z dodano ssrA oznako, pri čemer je prišlo do popolne atenuacije signala. Zato so delno modificirali nativno ssrA oznako, da bi omogočala, da se fluorescenca hkrati večja s časom fermentacije, hkrati pa da pride do hitrejše razgradnje proteina zaradi dodane oznake. V ta namen so testirali štiri različne SspB proteine različnih bakterij (''E. coli'', ''B. amyloliquefaciens'', ''B. subtilis'' in ''Pantoea alhagi'') in preverili do kakšne mere razgrajujejo z ssrA označen RFP. Najprimernejši je bil PaSspB iz bakterije ''P. alhagi'', pri kateri je prišlo do 37 % zmanjšanja fluorescence.

=== DegU-RapG-PhrG sistem za zaznavanje celične gostote ===

QS sistemi omogočajo regulacijo ekspresije genov brez eksogenih induktorjev, in sicer preko aktivacije promotorja glede na celično gostoto. Za po Gramu negativne bakterije se običajno uporablja sistem na osnovi acil homoserin laktona (AHL), ki pa ni kompatibilen z po Gramu pozitivnim rodom ''Bacillus''. V tej raziskavi so uporabili sistem DegU-RapG-PhrG iz ''B. subtilis'', ki deluje na principih fosforilacijske kaskade in antagonizma med peptidi, ki so v sistem udeleženi.

Pri nizki celični gostoti RapG inhibira fosforiliran DegU in prepreči, da bi ta aktiviral promotor PD4. Z višanjem celične gostote pa se akumulira zunajcelični peptid PhrG, ki se veže na RapG in prepreči inhibicijo. S tem se sproži transkripcija genov za PD4 promotorjem.

V raziskavi so znanstveniki konstruirali štiri seve ''B. amyloliquefaciens'', da bi potrdili mehanizem pod PD4 promotorjem. V sev, kjer so izražali RFP pod PD4 promotorjem (odvisinim od DegU), so zaznali visoko fluorescenco. V sevu, kjer so poleg tega še konstitutivno izražali DegU, pa so zaznali padec v fluorescenci in s tem dognali, da v njihovi šasiji fosforiliran DegU deluje kot represor PD4 promotorja.

Ker DegU ni uspešno aktiviral tega promotorja, so poiskali kompatibilen promotor, ki bi se primerno odzival na prisotnost DegU. Našli so nativen promotor v ''B. amyloliguefaciens'' s transkriptomsko primerjavo med sevom, ki DegU izraža in sevom iz katerega so ustrezen gen izbili. Izbrali so šest možnih kandidatov in pod temi promotorji izražali RFP. Do največje razlike med ekspresijo pri sevu z in brez DegU je prišlo pri promotorju PispA. Zanj so potrdili tudi njegovo odvisnost od celične gostote, saj je prišlo do njegove indukcije pri optični gostoti nad 4. Ta promotor predstavlja ON stikalo za izražanje proteina, ki se aktivira pri visoki celični gostoti.

=== Metabolno inženirstvo za izboljšanje sinteze HA v ''B. amyloliquefaciens'' ===

Preden so sistema, opisana v prejšnjih podpoglavjih, lahko uporabili za molekulsko stikalo pri sintezi hialuronske kisline, so morali raziskovalci najprej optimizirati biosintezo HA v izbrani šasiji ''B. amyloliquefaciens''. Temelji na ekspresiji hialuronan sintaze SthasA in hialuronidaze SthHL, ki skupaj omogočata de novo sintezo HA z določeno velikostjo iz osnovnih gradnikov UDP-N-acetil-D-glukozamina in UDP-D-glukoronske kisline [1,5]. Med fermentacijo stranski produkti, kot sta laktat in acetat, porabijo okoli 80 % vseh možnih virov ogljika, s čimer se močno zmanjša zmožnost sinteze drugih produktov, npr. hialuronske kisline. Raziskovalci so zato z metodo CRISPR-Cas9n ustvarili »knockout« seve ''B. amyloliquefaciens'', kjer so skušali zmotiti transkripcijo genov, udeleženih v sintezo laktata, acetata in nekaterih direktnih stranskih produktov v sintezi monosaharidnih prekurzorjev HA (genov, ki sodelujejo pri katabolizmu UDP-GlcNAc in UDP-GlcUA). Uporabili so metodo z dvema plazmidoma – enega z zapisom za nikazo Cas9n, drugega s sgRNA. Pri izbitju gena ldh so v mutiranem sevu opazili kar 68-% zmanjšanje v količini laktata. Poleg sevov z enim izbitim genom, so ustvarili tudi seve s kombiniranima dvema ali tremi izbitji genov. Kot najprimernejšo šasijo so izbrali sev z največjim titrom hialuronske kisline, ki so ga določili s HPLC preko primerjave s kalibracijsko krivuljo HA standarda. Izbrani sev je povečal sintezo N-acetilglukozamina za 3,5-krat, kar je omogočilo za 14 % višjo produkcijo HA.

=== Molekulsko stikalo za regulacijo biosinteze HA z nizko molekulsko maso ===

Za določanje učinkovitosti PaSsspB-ssrA sistema v ''B. amyloliquefaciens'' sta bila izbrana encima pfkA in fruA, saj so v predhodnih raziskavah določili, da oba indirektno vplivata na biosintezo hialuronske kisline. 6-Fosfofruktokinaza predstavlja glavni encim, ki omejuje hitrost glikolize. Atenuacija tega encima poveča količino znotrajcelične fruktoze-6-fosfata in s tem njeno dostopnost v sintezi HA. Izbijanje gena za fruA pa je vodilo v približno 25 % zvišanje produkcije HA.

V raziskavi so najprej konstruirali vezje regulirano z eksogenim induktorjem. Represor XylR se veže na promotorsko regijo PxylA in s tem preprečuje transkripcijo genov za SthHL in PaSspB, ob dodatku zunanjega signala (ksiloze), se ta veže na represor in preprečuje represijo obeh genov.
V tem vezju je vloga hialuronidaze SthHL cepitev HA, PaSspB pa sproži degradacijo s ssrA označenih PfkA in FruA, s čimer se fluks ogljika v glikolizi preusmeri v sintezo HA gradnikov. V nadgrajenem vezju so indukcijo s ksilozo zamenjali z avtoindukcijo s promotorjem PispA, ki regulira ekspresijo genov SthHL in PaSspB glede na celično gostoto. V eksponentni fazi rasti celic je bil titer hialuronske kisline nizek, z večanjem celične gostote pa je prišlo do aktivacije SthHL in PaSspB, kar je vodilo do stabilizacije rasti celic (manjši del fluksa ogljika gre za glikolizo) in povečanje biosinteze HA. Končni sev s QS regulacijo je produciral 13,5 g/L HA z nizko molekulsko maso, kar predstavlja 28-% povišanje glede na kontrolo.

== Zaključek ==

Raziskovalcem je uspelo konstruirati molekulsko stikalo, ki omogoča povečano sintezo hialuronske kisline znotraj enega seva brez potrebe po zunanjih induktorjih ali dodatnih encimih. Zunanje induktorje je nadomestil sistem za zaznavanje celične gostote, ki omogoča preusmeritev metabolizma od glikolize in celične rasti k sintezi hialuronske kisline v fazi, ko energija za rast ni več tako nujna. Ta sistem tako ponuja rešitev nad dolgotrajnih problemom hkratne uspešne rasti celic in produkcije zadostne količine hialuronske kisline. Sistem prav tako ni baziran na dodatku eksogenih encimov (hialuronidaz), ki bi dodatno povečalo kompleksnost sistema, prav tako pa tudi stroške sinteze. Zaradi neodvisnosti od zunanjih induktorjev, sistem omogoča tudi lažje čiščenje HA in odstranitev kontaminant, kar dodatno zniža stroške pri industrijski sintezi (v kozmetični in farmacevtski industriji).

== Literatura ==

[1] Zhong, Q., Li, Z., Duan, W., Lei, P., Xu, X., Xu, H., Li, S. and Qiu, Y. Programming Low-Molecular-Weight Hyaluronic Acid Biosynthesis in Bacillus amyloliquefaciens Via an Autoinducible Molecular Switch. ACS Synthetic Biology, 2026, 15(3), str. 1008–1020. doi:https://doi.org/10.1021/acssynbio.5c00570.

[2] Palenčárová, K., Köszagová, R. in Nahálka, J. Hyaluronic Acid and Its Synthases—Current Knowledge. International Journal of Molecular Sciences, 2025, 26(15), str. 7028–7028. doi:https://doi.org/10.3390/ijms26157028.

[3] Ucm, R., Aem, M., Lhb, Z., Kumar, V., Taherzadeh, M.J., Garlapati, V.K. in Chandel, A.K. Comprehensive review on biotechnological production of hyaluronic acid: status, innovation, market and applications. Bioengineered, 2022, 13(4), str. 9645–9661. doi:https://doi.org/10.1080/21655979.2022.2057760.

[4] Alireza Ghanbarpour, Fei, X., Baker, T.A., Davis, J.H. in Sauer, R.T. The SspB adaptor drives structural changes in the AAA+ ClpXP protease during ssrA-tagged substrate delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2023, 120(6). doi:https://doi.org/10.1073/pnas.2219044120.

[5] Imen Zalila-Kolsi, Afif Ben‐Mahmoud in Al-Barazie, R. Bacillus amyloliquefaciens: Harnessing Its Potential for Industrial, Medical, and Agricultural Applications—A Comprehensive Review. Microorganisms, 2023, 11(9), str. 2215–2215. doi:https://doi.org/10.3390/microorganisms11092215.

Samoinducibilno molekulsko stikalo za biosintezo hialuronske kisline z nizko molekulsko maso

2026-04-12T19:31:12Z

Nejc Horvat:

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acssynbio.5c00570 Programming Low-Molecular-Weight Hyaluronic Acid Biosynthesis in Bacillus amyloliquefaciens Via an Autoinducible Molecular Switch]

== Uvod ==

Bakterije imajo za regulacijo izražanja genov razvite zelo natančne regulatorne mehanizme, ki se odzivajo na okoljske dejavnike, s čimer vplivajo na metabolizem glede na njihove potrebe in stadij rasti. Sintezni biologi so razvili mnogo strategij regulacije izražanja genov, predvsem na nivoju transkripcije (inducibilni promotorji, odvisni od IPTG, ksiloze, saharoze, arabinoze ipd.), vendar pa so ti odvisni od eksogenega signala, ki direktno inducira izražanje pod nekim promotorjem. Možno alternativo predstavlja uporaba sistemov za zaznavanje celične gostote (ang. quorum sensing, QS), ki predstavljajo izražanje genov na podlagi gostote celic, brez potrebe po eksogenem induktorju. V raziskavi so se osredotočili na optimizacijo regulacije biosinteze hialuronske kisline.

Hialuronska kislina (HA) je glikozaminoglikan, sestavljen iz ponavljajočih disaharidnih enot N-acetil-D-glukozamina in D-glukoronske kisline. Njena glavna naloga v bakterijah je kot virulenčni faktor, v vretenčarjih pa predstavlja pomemben del zunajceličnega matriksa, hrustanca, hkrati pa opravlja vloge kot signalna ali vezavna molekula pri embriogenezi, angiogenezi, celjenju ran ipd. Tradicionalno pridobivanje za aplikacije v zdravstvu, industriji in kozmetiki je vključevalo ekstrakcijo iz živalskih tkiv, dandanes pa je v uporabi predvsem mikrobna fermentacija. V tem procesu encim hialuronan sintaza katalizira polimerizacijo osnovnih gradnikov HA. Ker je HA polimer, ga najdemo v zelo različnih dolžinah, pri čemer se je izhodiščni članek fokusiral na HA z nizko molekulsko maso. Pri njih je postopek sinteze še nekoliko bolj poseben, saj potrebujemo še encim hialuronidazo, ki dolg polimer cepi do primernih dolžin [2,3]. Primer je hialuronidaza SthHL, ki omogoča nastanek molekul HA primernih dolžin, vendar je ta regulacija v prejšnjih študijah potrebovala indukcijo s ksilozo, kar so v tej raziskavi skušali odpraviti.

== Oris izdelave sinteznobiološkega vezja ==

Raziskovalci so izdelali avtoinducibilno molekulsko stikalo v šasiji Bacillus amyloliquefaciens, ki je predstavljalo regulatorni mehanizem pri biosintezi HA z nizko molekulsko maso. Sistem vključuje dve glavni komponenti – proteolitski sistem PaSspB-ssrA (odgovoren za razgradnjo encimov, ki omejujejo hitrost rasti) in sistem za zaznavanje celične gostote DegU-RapG-PhrG (omogoča regulacijo molekulske mase HA glede na gostoto celic). Cilj raziskave je bil povečati količino nastale HA ter producirati sistem, ki bi omogočal »programirano« modulacijo molekulske mase HA.

Glavni koraki pri izdelavi molekulskega stikala so:

1. konstrukcija in optimizacija proteolitskega sistema, ki bi deloval kot OFF stikalo za metabolizem in bil preusmeril metabolizem proti sintezi prekurzorjev HA

2. Uporaba QS sistema in ustreznega promotorja kot ON stikala za od celične gostote odvisno transkripcijo

3. Priprava šasije, ki bi producirala čim večjo količino produkta (»knockout« mutante)

4. Priprava z rastjo povezanih genov z dodanimi oznakami ssrA, ki bi skupaj s QS sistemom avtoinducirali ekspresijo hialuronidaze SthHL in proteina PaSspB (slednji prepozna ssrA oznake in jih dostavi do proteaz za razgradnjo)

== Delovanje in optimizacija vezja ==

=== SspB-ssrA proteolitski sistem ===

SspB-ssrA sistem v prokariotih omogoča proteolizo tarčnih proteinov preko prepoznave ssrA oznake s strani SspB proteina. Slednji dostavi prepoznan protein na kompleks ClpXP proteaze, kjer potečeta razvitje proteina in razgradnja s pomočjo ATP [4].
Znanstveniki so preverjali fluorescenco RFP (Red Fluorescent Protein) brez in z dodano ssrA oznako, pri čemer je prišlo do popolne atenuacije signala. Zato so delno modificirali nativno ssrA oznako, da bi omogočala, da se fluorescenca hkrati večja s časom fermentacije, hkrati pa da pride do hitrejše razgradnje proteina zaradi dodane oznake. V ta namen so testirali štiri različne SspB proteine različnih bakterij (E. coli, B. amyloliguefaciens, B. subtilis in Pantoea alhagi) in preverili do kakšne mere razgrajujejo z ssrA označen RFP. Najprimernejši je bil PaSspB iz bakterije P. algahi, pri kateri je prišlo do 37 % zmanjšanja fluorescence.

=== DegU-RapG-PhrG sistem za zaznavanje celične gostote ===

QS sistemi omogočajo regulacijo ekspresije genov brez eksogenih induktorjev, in sicer preko aktivacije promotorja glede na celično gostoto. Za po Gramu negativne bakterije se običajno uporablja sistem na osnovi acil homoserin laktona (AHL), ki pa ni kompatibilen z po Gramu pozitivnim rodom Bacillus. V tej raziskavi so uporabili sistem DegU-RapG-PhrG iz B. subtilis, ki deluje na principih fosforilacijske kaskade in antagonizma med peptidi, ki so v sistem udeleženi.

Pri nizki celični gostoti RapG inhibira fosforiliran DegU in prepreči, da bi ta aktiviral promotor PD4. Z višanjem celične gostote pa se akumulira zunajcelični peptid PhrG, ki se veže na RapG in prepreči inhibicijo. S tem se sproži transkripcija genov za PD4 promotorjem.

V raziskavi so znanstveniki konstruirali štiri seve B. amyloliquefaciens, da bi potrdili mehanizem pod PD4 promotorjem. V sev, kjer so izražali RFP pod PD4 promotorjem (odvisinim od DegU), so zaznali visoko fluorescenco. V sevu, kjer so poleg tega še konstitutivno izražali DegU, pa so zaznali padec v fluorescenci in s tem dognali, da v njihovi šasiji fosforiliran DegU deluje kot represor PD4 promotorja.

Ker DegU ni uspešno aktiviral tega promotorja, so poiskali kompatibilen promotor, ki bi se primerno odzival na prisotnost DegU. Našli so nativen promotor v B. amyloliguefaciens s transkriptomsko primerjavo med sevom, ki DegU izraža in sevom iz katerega so ustrezen gen izbili. Izbrali so šest možnih kandidatov in pod temi promotorji izražali RFP. Do največje razlike med ekspresijo pri sevu z in brez DegU je prišlo pri promotorju PispA. Zanj so potrdili tudi njegovo odvisnost od celične gostote, saj je prišlo do njegove indukcije pri optični gostoti nad 4. Ta promotor predstavlja ON stikalo za izražanje proteina, ki se aktivira pri visoki celični gostoti.

=== Metabolno inženirstvo za izboljšanje sinteze HA v B. amyloliquefaciens ===

Preden so sistema, opisana v prejšnjih podpoglavjih, lahko uporabili za molekulsko stikalo pri sintezi hialuronske kisline, so morali raziskovalci najprej optimizirati biosintezo HA v izbrani šasiji B. amyloliquefaciens. Temelji na ekspresiji hialuronan sintaze SthasA in hialuronidaze SthHL, ki skupaj omogočata de novo sintezo HA z določeno velikostjo iz osnovnih gradnikov UDP-N-acetil-D-glukozamina in UDP-D-glukoronske kisline [1,5].
Med fermentacijo stranski produkti, kot sta laktat in acetat, porabijo okoli 80 % vseh možnih virov ogljika, s čimer se močno zmanjša zmožnost sinteze drugih produktov, npr. hialuronske kisline. Raziskovalci so zato z metodo CRISPR-Cas9n ustvarili »knockout« seve B. amyloliquefaciens, kjer so skušali zmotiti transkripcijo genov, udeleženih v sintezo laktata, acetata in nekaterih direktnih stranskih produktov v sintezi monosaharidnih prekurzorjev HA (genov, ki sodelujejo pri katabolizmu UDP-GlcNAc in UDP-GlcUA). Uporabili so metodo z dvema plazmidoma – enega z zapisom za nikazo Cas9n, drugega s sgRNA. Pri izbitju gena ldh so v mutiranem sevu opazili kar 68-% zmanjšanje v količini laktata. Poleg sevov z enim izbitim genom, so ustvarili tudi seve s kombiniranima dvema ali tremi izbitji genov. Kot najprimernejšo šasijo so izbrali sev z največjim titrom hialuronske kisline, ki so ga določili s HPLC preko primerjave s kalibracijsko krivuljo HA standarda. Izbrani sev je povečal sintezo N-acetilglukozamina za 3,5-krat, kar je omogočilo za 14 % višjo produkcijo HA.

=== Molekulsko stikalo za regulacijo biosinteze HA z nizko molekulsko maso ===

Za določanje učinkovitosti PaSsspB-ssrA sistema v B. amyloliquefaciens sta bila izbrana encima pfkA in fruA, saj so v predhodnih raziskavah določili, da oba indirektno vplivata na biosintezo hialuronske kisline. 6-Fosfofruktokinaza predstavlja glavni encim, ki omejuje hitrost glikolize. Atenuacija tega encima poveča količino znotrajcelične fruktoze-6-fosfata in s tem njeno dostopnost v sintezi HA. Izbijanje gena za fruA pa je vodilo v približno 25 % zvišanje produkcije HA.

V raziskavi so najprej konstruirali vezje regulirano z eksogenim induktorjem. Represor XylR se veže na promotorsko regijo PxylA in s tem preprečuje transkripcijo genov za SthHL in PaSspB, ob dodatku zunanjega signala (ksiloze), se ta veže na represor in preprečuje represijo obeh genov.
V tem vezju je vloga hialuronidaze SthHL cepitev HA, PaSspB pa sproži degradacijo s ssrA označenih PfkA in FruA, s čimer se fluks ogljika v glikolizi preusmeri v sintezo HA gradnikov. V nadgrajenem vezju so indukcijo s ksilozo zamenjali z avtoindukcijo s promotorjem PispA, ki regulira ekspresijo genov SthHL in PaSspB glede na celično gostoto. V eksponentni fazi rasti celic je bil titer hialuronske kisline nizek, z večanjem celične gostote pa je prišlo do aktivacije SthHL in PaSspB, kar je vodilo do stabilizacije rasti celic (manjši del fluksa ogljika gre za glikolizo) in povečanje biosinteze HA. Končni sev s QS regulacijo je produciral 13,5 g/L HA z nizko molekulsko maso, kar predstavlja 28-% povišanje glede na kontrolo.

== Zaključek ==

Raziskovalcem je uspelo konstruirati molekulsko stikalo, ki omogoča povečano sintezo hialuronske kisline znotraj enega seva brez potrebe po zunanjih induktorjih ali dodatnih encimih. Zunanje induktorje je nadomestil sistem za zaznavanje celične gostote, ki omogoča preusmeritev metabolizma od glikolize in celične rasti k sintezi hialuronske kisline v fazi, ko energija za rast ni več tako nujna. Ta sistem tako ponuja rešitev nad dolgotrajnih problemom hkratne uspešne rasti celic in produkcije zadostne količine hialuronske kisline. Sistem prav tako ni baziran na dodatku eksogenih encimov (hialuronidaz), ki bi dodatno povečalo kompleksnost sistema, prav tako pa tudi stroške sinteze. Zaradi neodvisnosti od zunanjih induktorjev, sistem omogoča tudi lažje čiščenje HA in odstranitev kontaminant, kar dodatno zniža stroške pri industrijski sintezi (v kozmetični in farmacevtski industriji).

== Literatura ==

[1] Zhong, Q., Li, Z., Duan, W., Lei, P., Xu, X., Xu, H., Li, S. and Qiu, Y. Programming Low-Molecular-Weight Hyaluronic Acid Biosynthesis in Bacillus amyloliquefaciens Via an Autoinducible Molecular Switch. ACS Synthetic Biology, 2026, 15(3), pp.1008–1020. doi:https://doi.org/10.1021/acssynbio.5c00570.
[2] Palenčárová, K., Köszagová, R. in Nahálka, J. Hyaluronic Acid and Its Synthases—Current Knowledge. International Journal of Molecular Sciences, 2025, 26(15), str. 7028–7028. doi:https://doi.org/10.3390/ijms26157028.
[3] Ucm, R., Aem, M., Lhb, Z., Kumar, V., Taherzadeh, M.J., Garlapati, V.K. in Chandel, A.K. Comprehensive review on biotechnological production of hyaluronic acid: status, innovation, market and applications. Bioengineered, 2022, 13(4), str. 9645–9661. doi:https://doi.org/10.1080/21655979.2022.2057760.
[4] Alireza Ghanbarpour, Fei, X., Baker, T.A., Davis, J.H. in Sauer, R.T. The SspB adaptor drives structural changes in the AAA+ ClpXP protease during ssrA-tagged substrate delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2023, 120(6). doi:https://doi.org/10.1073/pnas.2219044120.
[5] Imen Zalila-Kolsi, Afif Ben‐Mahmoud in Al-Barazie, R. Bacillus amyloliquefaciens: Harnessing Its Potential for Industrial, Medical, and Agricultural Applications—A Comprehensive Review. Microorganisms, 2023, 11(9), str. 2215–2215. doi:https://doi.org/10.3390/microorganisms11092215.

Samoinducibilno molekulsko stikalo za biosintezo hialuronske kisline z nizko molekulsko maso

2026-04-12T19:30:03Z

Nejc Horvat: Created page with "Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acssynbio.5c00570 Programming Low-Molecular-Weight Hyaluronic Acid Biosynthesis in Bacillus amyloliquefaciens Via an Autoinducible Molecular Switch] == Uvod == Bakterije imajo za regulacijo izražanja genov razvite zelo natančne regulatorne mehanizme, ki se odzivajo na okoljske dejavnike, s čimer vplivajo na metabolizem glede na njihove potrebe in stadij rasti. Sintezni biologi so razvili mnogo strategij reg..."

Izhodiščni članek: [https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acssynbio.5c00570 Programming Low-Molecular-Weight Hyaluronic Acid Biosynthesis in Bacillus amyloliquefaciens Via an Autoinducible Molecular Switch]

== Uvod ==

Bakterije imajo za regulacijo izražanja genov razvite zelo natančne regulatorne mehanizme, ki se odzivajo na okoljske dejavnike, s čimer vplivajo na metabolizem glede na njihove potrebe in stadij rasti. Sintezni biologi so razvili mnogo strategij regulacije izražanja genov, predvsem na nivoju transkripcije (inducibilni promotorji, odvisni od IPTG, ksiloze, saharoze, arabinoze ipd.), vendar pa so ti odvisni od eksogenega signala, ki direktno inducira izražanje pod nekim promotorjem. Možno alternativo predstavlja uporaba sistemov za zaznavanje celične gostote (ang. quorum sensing, QS), ki predstavljajo izražanje genov na podlagi gostote celic, brez potrebe po eksogenem induktorju. V raziskavi so se osredotočili na optimizacijo regulacije biosinteze hialuronske kisline.

Hialuronska kislina (HA) je glikozaminoglikan, sestavljen iz ponavljajočih disaharidnih enot N-acetil-D-glukozamina in D-glukoronske kisline. Njena glavna naloga v bakterijah je kot virulenčni faktor, v vretenčarjih pa predstavlja pomemben del zunajceličnega matriksa, hrustanca, hkrati pa opravlja vloge kot signalna ali vezavna molekula pri embriogenezi, angiogenezi, celjenju ran ipd. Tradicionalno pridobivanje za aplikacije v zdravstvu, industriji in kozmetiki je vključevalo ekstrakcijo iz živalskih tkiv, dandanes pa je v uporabi predvsem mikrobna fermentacija. V tem procesu encim hialuronan sintaza katalizira polimerizacijo osnovnih gradnikov HA. Ker je HA polimer, ga najdemo v zelo različnih dolžinah, pri čemer se je izhodiščni članek fokusiral na HA z nizko molekulsko maso. Pri njih je postopek sinteze še nekoliko bolj poseben, saj potrebujemo še encim hialuronidazo, ki dolg polimer cepi do primernih dolžin [2,3]. Primer je hialuronidaza SthHL, ki omogoča nastanek molekul HA primernih dolžin, vendar je ta regulacija v prejšnjih študijah potrebovala indukcijo s ksilozo, kar so v tej raziskavi skušali odpraviti.

== Oris izdelave sinteznobiološkega vezja ==

Raziskovalci so izdelali avtoinducibilno molekulsko stikalo v šasiji Bacillus amyloliquefaciens, ki je predstavljalo regulatorni mehanizem pri biosintezi HA z nizko molekulsko maso. Sistem vključuje dve glavni komponenti – proteolitski sistem PaSspB-ssrA (odgovoren za razgradnjo encimov, ki omejujejo hitrost rasti) in sistem za zaznavanje celične gostote DegU-RapG-PhrG (omogoča regulacijo molekulske mase HA glede na gostoto celic). Cilj raziskave je bil povečati količino nastale HA ter producirati sistem, ki bi omogočal »programirano« modulacijo molekulske mase HA.
Glavni koraki pri izdelavi molekulskega stikala so:
1. konstrukcija in optimizacija proteolitskega sistema, ki bi deloval kot OFF stikalo za metabolizem in bil preusmeril metabolizem proti sintezi prekurzorjev HA
2. Uporaba QS sistema in ustreznega promotorja kot ON stikala za od celične gostote odvisno transkripcijo
3. Priprava šasije, ki bi producirala čim večjo količino produkta (»knockout« mutante)
4. Priprava z rastjo povezanih genov z dodanimi oznakami ssrA, ki bi skupaj s QS sistemom avtoinducirali ekspresijo hialuronidaze SthHL in proteina PaSspB (slednji prepozna ssrA oznake in jih dostavi do proteaz za razgradnjo)

== Delovanje in optimizacija vezja ==

=== SspB-ssrA proteolitski sistem ===

SspB-ssrA sistem v prokariotih omogoča proteolizo tarčnih proteinov preko prepoznave ssrA oznake s strani SspB proteina. Slednji dostavi prepoznan protein na kompleks ClpXP proteaze, kjer potečeta razvitje proteina in razgradnja s pomočjo ATP [4].
Znanstveniki so preverjali fluorescenco RFP (Red Fluorescent Protein) brez in z dodano ssrA oznako, pri čemer je prišlo do popolne atenuacije signala. Zato so delno modificirali nativno ssrA oznako, da bi omogočala, da se fluorescenca hkrati večja s časom fermentacije, hkrati pa da pride do hitrejše razgradnje proteina zaradi dodane oznake. V ta namen so testirali štiri različne SspB proteine različnih bakterij (E. coli, B. amyloliguefaciens, B. subtilis in Pantoea alhagi) in preverili do kakšne mere razgrajujejo z ssrA označen RFP. Najprimernejši je bil PaSspB iz bakterije P. algahi, pri kateri je prišlo do 37 % zmanjšanja fluorescence.

=== DegU-RapG-PhrG sistem za zaznavanje celične gostote ===

QS sistemi omogočajo regulacijo ekspresije genov brez eksogenih induktorjev, in sicer preko aktivacije promotorja glede na celično gostoto. Za po Gramu negativne bakterije se običajno uporablja sistem na osnovi acil homoserin laktona (AHL), ki pa ni kompatibilen z po Gramu pozitivnim rodom Bacillus. V tej raziskavi so uporabili sistem DegU-RapG-PhrG iz B. subtilis, ki deluje na principih fosforilacijske kaskade in antagonizma med peptidi, ki so v sistem udeleženi.

Pri nizki celični gostoti RapG inhibira fosforiliran DegU in prepreči, da bi ta aktiviral promotor PD4. Z višanjem celične gostote pa se akumulira zunajcelični peptid PhrG, ki se veže na RapG in prepreči inhibicijo. S tem se sproži transkripcija genov za PD4 promotorjem.

V raziskavi so znanstveniki konstruirali štiri seve B. amyloliquefaciens, da bi potrdili mehanizem pod PD4 promotorjem. V sev, kjer so izražali RFP pod PD4 promotorjem (odvisinim od DegU), so zaznali visoko fluorescenco. V sevu, kjer so poleg tega še konstitutivno izražali DegU, pa so zaznali padec v fluorescenci in s tem dognali, da v njihovi šasiji fosforiliran DegU deluje kot represor PD4 promotorja.

Ker DegU ni uspešno aktiviral tega promotorja, so poiskali kompatibilen promotor, ki bi se primerno odzival na prisotnost DegU. Našli so nativen promotor v B. amyloliguefaciens s transkriptomsko primerjavo med sevom, ki DegU izraža in sevom iz katerega so ustrezen gen izbili. Izbrali so šest možnih kandidatov in pod temi promotorji izražali RFP. Do največje razlike med ekspresijo pri sevu z in brez DegU je prišlo pri promotorju PispA. Zanj so potrdili tudi njegovo odvisnost od celične gostote, saj je prišlo do njegove indukcije pri optični gostoti nad 4. Ta promotor predstavlja ON stikalo za izražanje proteina, ki se aktivira pri visoki celični gostoti.

=== Metabolno inženirstvo za izboljšanje sinteze HA v B. amyloliquefaciens ===

Preden so sistema, opisana v prejšnjih podpoglavjih, lahko uporabili za molekulsko stikalo pri sintezi hialuronske kisline, so morali raziskovalci najprej optimizirati biosintezo HA v izbrani šasiji B. amyloliquefaciens. Temelji na ekspresiji hialuronan sintaze SthasA in hialuronidaze SthHL, ki skupaj omogočata de novo sintezo HA z določeno velikostjo iz osnovnih gradnikov UDP-N-acetil-D-glukozamina in UDP-D-glukoronske kisline [1,5].
Med fermentacijo stranski produkti, kot sta laktat in acetat, porabijo okoli 80 % vseh možnih virov ogljika, s čimer se močno zmanjša zmožnost sinteze drugih produktov, npr. hialuronske kisline. Raziskovalci so zato z metodo CRISPR-Cas9n ustvarili »knockout« seve B. amyloliquefaciens, kjer so skušali zmotiti transkripcijo genov, udeleženih v sintezo laktata, acetata in nekaterih direktnih stranskih produktov v sintezi monosaharidnih prekurzorjev HA (genov, ki sodelujejo pri katabolizmu UDP-GlcNAc in UDP-GlcUA). Uporabili so metodo z dvema plazmidoma – enega z zapisom za nikazo Cas9n, drugega s sgRNA. Pri izbitju gena ldh so v mutiranem sevu opazili kar 68-% zmanjšanje v količini laktata. Poleg sevov z enim izbitim genom, so ustvarili tudi seve s kombiniranima dvema ali tremi izbitji genov. Kot najprimernejšo šasijo so izbrali sev z največjim titrom hialuronske kisline, ki so ga določili s HPLC preko primerjave s kalibracijsko krivuljo HA standarda. Izbrani sev je povečal sintezo N-acetilglukozamina za 3,5-krat, kar je omogočilo za 14 % višjo produkcijo HA.

=== Molekulsko stikalo za regulacijo biosinteze HA z nizko molekulsko maso ===

Za določanje učinkovitosti PaSsspB-ssrA sistema v B. amyloliquefaciens sta bila izbrana encima pfkA in fruA, saj so v predhodnih raziskavah določili, da oba indirektno vplivata na biosintezo hialuronske kisline. 6-Fosfofruktokinaza predstavlja glavni encim, ki omejuje hitrost glikolize. Atenuacija tega encima poveča količino znotrajcelične fruktoze-6-fosfata in s tem njeno dostopnost v sintezi HA. Izbijanje gena za fruA pa je vodilo v približno 25 % zvišanje produkcije HA.

V raziskavi so najprej konstruirali vezje regulirano z eksogenim induktorjem. Represor XylR se veže na promotorsko regijo PxylA in s tem preprečuje transkripcijo genov za SthHL in PaSspB, ob dodatku zunanjega signala (ksiloze), se ta veže na represor in preprečuje represijo obeh genov.
V tem vezju je vloga hialuronidaze SthHL cepitev HA, PaSspB pa sproži degradacijo s ssrA označenih PfkA in FruA, s čimer se fluks ogljika v glikolizi preusmeri v sintezo HA gradnikov. V nadgrajenem vezju so indukcijo s ksilozo zamenjali z avtoindukcijo s promotorjem PispA, ki regulira ekspresijo genov SthHL in PaSspB glede na celično gostoto. V eksponentni fazi rasti celic je bil titer hialuronske kisline nizek, z večanjem celične gostote pa je prišlo do aktivacije SthHL in PaSspB, kar je vodilo do stabilizacije rasti celic (manjši del fluksa ogljika gre za glikolizo) in povečanje biosinteze HA. Končni sev s QS regulacijo je produciral 13,5 g/L HA z nizko molekulsko maso, kar predstavlja 28-% povišanje glede na kontrolo.

== Zaključek ==

Raziskovalcem je uspelo konstruirati molekulsko stikalo, ki omogoča povečano sintezo hialuronske kisline znotraj enega seva brez potrebe po zunanjih induktorjih ali dodatnih encimih. Zunanje induktorje je nadomestil sistem za zaznavanje celične gostote, ki omogoča preusmeritev metabolizma od glikolize in celične rasti k sintezi hialuronske kisline v fazi, ko energija za rast ni več tako nujna. Ta sistem tako ponuja rešitev nad dolgotrajnih problemom hkratne uspešne rasti celic in produkcije zadostne količine hialuronske kisline. Sistem prav tako ni baziran na dodatku eksogenih encimov (hialuronidaz), ki bi dodatno povečalo kompleksnost sistema, prav tako pa tudi stroške sinteze. Zaradi neodvisnosti od zunanjih induktorjev, sistem omogoča tudi lažje čiščenje HA in odstranitev kontaminant, kar dodatno zniža stroške pri industrijski sintezi (v kozmetični in farmacevtski industriji).

== Literatura ==

[1] Zhong, Q., Li, Z., Duan, W., Lei, P., Xu, X., Xu, H., Li, S. and Qiu, Y. Programming Low-Molecular-Weight Hyaluronic Acid Biosynthesis in Bacillus amyloliquefaciens Via an Autoinducible Molecular Switch. ACS Synthetic Biology, 2026, 15(3), pp.1008–1020. doi:https://doi.org/10.1021/acssynbio.5c00570.
[2] Palenčárová, K., Köszagová, R. in Nahálka, J. Hyaluronic Acid and Its Synthases—Current Knowledge. International Journal of Molecular Sciences, 2025, 26(15), str. 7028–7028. doi:https://doi.org/10.3390/ijms26157028.
[3] Ucm, R., Aem, M., Lhb, Z., Kumar, V., Taherzadeh, M.J., Garlapati, V.K. in Chandel, A.K. Comprehensive review on biotechnological production of hyaluronic acid: status, innovation, market and applications. Bioengineered, 2022, 13(4), str. 9645–9661. doi:https://doi.org/10.1080/21655979.2022.2057760.
[4] Alireza Ghanbarpour, Fei, X., Baker, T.A., Davis, J.H. in Sauer, R.T. The SspB adaptor drives structural changes in the AAA+ ClpXP protease during ssrA-tagged substrate delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2023, 120(6). doi:https://doi.org/10.1073/pnas.2219044120.
[5] Imen Zalila-Kolsi, Afif Ben‐Mahmoud in Al-Barazie, R. Bacillus amyloliquefaciens: Harnessing Its Potential for Industrial, Medical, and Agricultural Applications—A Comprehensive Review. Microorganisms, 2023, 11(9), str. 2215–2215. doi:https://doi.org/10.3390/microorganisms11092215.

2026-BNT-seminar

2026-03-13T19:58:03Z

Nejc Horvat: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija 2026- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
V tabelo] prosim vpišite temo vašega projekta in kratko oznako.

{| class="wikitable"
! datum predstavitve !! naslov !! kratka koda projekta !! predstavlja !! recenzent 1 !! recenzent 2
|-
| 18/03/2025 || Bionanotehnološki pristop k dolgoročnemu arhiviranju digitalnih podatkov z DNA zaporedjem ||DNArchive || Kozel, Vid || ||
|-
| 18/03/2025 || Sistem za adsorpcijo in razgradnjo gliadina (uporaba v medicini in prehranski industriji) || GlutenBlock || Horvat, Nejc || ||
|-
| 18/03/2025 || || || Perc, Anže || ||
|-
| 18/03/2025 || Nanosenzorski sistem za personalizirano uravnavanje cirkadianega ritma z melatoninom || CircAlign || Kovaček, Lucija || ||
|-
| 25/03/2025 || || || Pezo Zupančič, Neža || ||
|-
| 25/03/2025 || || || Bogataj, Lenart || ||
|-
| 25/03/2025 || || || Ferjančič, Lara || ||
|-
| 25/03/2025 || || || Briševac, Tea || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Pšeničnik, Tiara || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Jukić, Lea || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Petrovič, Filip || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Novak, Anja || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Kristan, Maruša || ||
|-
| 08/04/2025 || Pristop k zdravljenju neonatalne zlatenice || ZlatoHome || Auer, Špela || ||
|-
| 08/04/2025 || || || Dimovska, Andreja || ||
|-
| 08/04/2025 || || || Gomiršek, Katarina || ||
|-
| 08/04/2025 || || || Titova, Varvara || ||
|-
| 08/04/2025 || Atmos: Sistem za dostavo kisika pri pljučnih boleznih in potencialna uporaba v vojski|| || Oman Sušnik, Tonja || ||
|-
| 15/04/2025 || || || Škorjanc, Meri || ||
|-
| 15/04/2025 || || || Bregar, Jana || ||
|-
| 15/04/2025 || || || Smrečnik, Meta || ||
|-
| 15/04/2025 || || || Tušek, Marcel || ||
|-
| 15/04/2025 || || || Zupan, Zala || ||
|-
| 22/04/2025 || LitterLab: Mikrofluidni nanosenzorski sistem za zgodnje zaznavanje bolezni mačk preko analize urina || || Lešnik, Tjaša || ||
|-
| 22/04/2025 || || || Čarman, Jasna || ||
|-
| 22/04/2025 || || || Ribič, Rebeka || ||
|-
| 06/05/2025 || || || Hvalec, Jan || ||
|-
| 06/05/2025 || || || Klopčič, Klemen || ||
|-
| 06/05/2025 || || || Mohar, Teja || ||
|-
| 06/05/2025 || || || Vogrič, Vanja || ||
|-
| 13/05/2025 || || || Bajramovikj, Denis || ||
|-
| 13/05/2025 || || || Šenica Pavletič, Primož || ||
|-
| 13/05/2025 || || || Agrež, Tim-David || ||
|-
| 13/05/2025 || || || Bervar, Amber || ||
|-
| 20/05/2025 || || || Habot, Hanna || ||
|-
| 20/05/2025 || || || Jarm, Lea || ||
|-
| 20/05/2025 || || || Todorovska, Milena || ||
|-
| 20/05/2025 || || || Klinar, Brina || ||
|-
| 27/05/2025 || || || kratke predstavitve || ||
|}

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte '''dva dni pred predstavitvijo,''' kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Predstavitev naj bo dolga 15 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 25_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 25_nano_Craik_Venter.doc
* 25_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 25_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

2026-BNT-seminar

2026-03-12T17:40:16Z

Nejc Horvat: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija 2026- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
V tabelo] prosim vpišite temo vašega projekta in kratko oznako.

{| class="wikitable"
! datum predstavitve !! naslov !! kratka koda projekta !! predstavlja !! recenzent 1 !! recenzent 2
|-
| 18/03/2025 ||DNArchive: Bionanotehnološki pristop k dolgoročnemu arhiviranju digitalnih podatkov || || Kozel, Vid || ||
|-
| 18/03/2025 || GlutenBlock: Sistem za adsorpcijo in razgradnjo gliadina (uporaba v medicini in prehranski industriji) || || Horvat, Nejc || ||
|-
| 18/03/2025 || || || Perc, Anže || ||
|-
| 18/03/2025 || || || Kovaček, Lucija || ||
|-
| 25/03/2025 || || || Pezo Zupančič, Neža || ||
|-
| 25/03/2025 || || || Bogataj, Lenart || ||
|-
| 25/03/2025 || || || Ferjančič, Lara || ||
|-
| 25/03/2025 || || || Briševac, Tea || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Pšeničnik, Tiara || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Jukić, Lea || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Petrovič, Filip || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Novak, Anja || ||
|-
| 01/04/2025 || || || Kristan, Maruša || ||
|-
| 08/04/2025 || || || Auer, Špela || ||
|-
| 08/04/2025 || || || Dimovska, Andreja || ||
|-
| 08/04/2025 || || || Gomiršek, Katarina || ||
|-
| 08/04/2025 || || || Titova, Varvara || ||
|-
| 08/04/2025 || Atmos: Sistem za dostavo kisika pri pljučnih boleznih in potencialna uporaba v vojski|| || Oman Sušnik, Tonja || ||
|-
| 15/04/2025 || || || Škorjanc, Meri || ||
|-
| 15/04/2025 || || || Bregar, Jana || ||
|-
| 15/04/2025 || || || Smrečnik, Meta || ||
|-
| 15/04/2025 || || || Tušek, Marcel || ||
|-
| 15/04/2025 || || || Zupan, Zala || ||
|-
| 22/04/2025 || LitterLab: Mikrofluidni nanosenzorski sistem za zgodnje zaznavanje bolezni mačk preko analize urina || || Lešnik, Tjaša || ||
|-
| 22/04/2025 || || || Čarman, Jasna || ||
|-
| 22/04/2025 || || || Ribič, Rebeka || ||
|-
| 06/05/2025 || || || Hvalec, Jan || ||
|-
| 06/05/2025 || || || Klopčič, Klemen || ||
|-
| 06/05/2025 || || || Mohar, Teja || ||
|-
| 06/05/2025 || || || Vogrič, Vanja || ||
|-
| 13/05/2025 || || || Bajramovikj, Denis || ||
|-
| 13/05/2025 || || || Šenica Pavletič, Primož || ||
|-
| 13/05/2025 || || || Agrež, Tim-David || ||
|-
| 13/05/2025 || || || Bervar, Amber || ||
|-
| 20/05/2025 || || || Habot, Hanna || ||
|-
| 20/05/2025 || || || Jarm, Lea || ||
|-
| 20/05/2025 || || || Todorovska, Milena || ||
|-
| 20/05/2025 || || || Klinar, Brina || ||
|-
| 27/05/2025 || || || kratke predstavitve || ||
|}

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte '''dva dni pred predstavitvijo,''' kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Predstavitev naj bo dolga 15 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 25_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 25_nano_Craik_Venter.doc
* 25_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 25_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.