Wiki FKKT - User contributions [en]

B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka

2021-04-18T22:39:21Z

Neza.pavko:

Projekt B.O.T. je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje podiplomskega študija iz Lozane v Švici. Namen projekta je bil vnos oscilirajočega sistema v probiotske bakterije. Le-te bi nato v intervalih sintetizirale azurin, ki bi služil kot terapevtik za zdravljenje kolorektalnega raka.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:UNILausanne

Avtorica povzetka: Neža Pavko

== '''Uvod''' ==
'''Kolorektalni rak'''

Kolorektalni rak je tretja najpogostejša oblika raka in po vrsti četrti vzrok za smrt povezano z rakom. Za zdravljenje kolorektalnega raka se najpogosteje uporablja kombinacija tehnik, in sicer kemoterapije, radioterapije in opreativne odstranitve. Kemoterapija in operativni poseg sta predvsem pri napredovali bolezni učinkovita le v omejenem obsegu [1].

'''Kronoterapija'''

Pri zdravljenju kolorektalnega raka se je za učinkovito izkazala kronoterapija, ki temelji na administraciji protirakavih učinkovin v določeni točki cirkadianega ritma. Cirkadiani ritem je lastnost procesov v živih organizmih, ki se ciklično spreminjajo v odvisnosti od dnevno-nočnega cikla pogojev v njihovem okolju, torej s periodo 24 ur. Na ta način se lahko izboljša učinkovitost zdravljenja, hkrati pa zmanjša neželene učinke terapije. S projektom so želeli raziskati možnost kombiniranja kronoterapije in terapije z bakterijami, kot nove metode za boj proti kolorektalnemu raku [2], [3].

'''Azurin'''

Kot protirakavo učinkovino so izbrali azurin, ki ga v osnovi proizvaja Pseudomonas aeruginosa. Azurin preferenčno vstopa v človeške rakaste celice, kjer inducira apoptozo ali zavira njihovo rast. Najbolj proučen način delovanja azurina je tvorba kompleksov s tumor supresorskim proteinom p53 in stabilizacija le-tega. Kompleksi p53/azurin potujejo v jedro, kjer p53 aktivira transkripcijo proapoptotskih genov, kot sta Bax in Noxa. p53 aktivira tudi ekspresijo inhibitorjev celičnega cikla [4].

== '''Ideja''' ==
Skupina je idejo o kronoterapiji za zdravljenje kolorektalnega raka uporabila kot osnovo za svoj projekt, pri katerem so v probiotski sev ''Escherichia coli'' Nissle 1917 ''Δclb'' uvedli represilatorski sistem. S tem so želeli doseči oscilirajoče izražanje protirakave učinkovine azurin. Sev ''E. coli'' Nissle 1917 ''Δclb'' so izbrali na podlagi dokazov, da lahko penetrirajo v tumorje bolje kot ostali sevi zaradi svoje anaerobne karakteristike. Omenjeni sev so uporabili že v mnogih raziskavah in nekaterih kliničnih študijah (1. faza) za dostavo protirakavih učinkovin [5]. Represilatorski sistem so želeli prilagoditi za produkcijo azurina in celotni sistem preizkusiti na Caco-2 celicah, ki so jih izbrali kot in vitro model. V razvoj projekta so vključili tudi vidik biološke varnosti. Vnos genetsko spremenjenega organizma v telo oz. okolje bi lahko imelo svoje negativne posledice, zato so se odločili za uporabo samomorilskega stikala, ki bi služil kot varnostni mehanizem [6].

== '''Zasnova projekta in laboratorijsko delo''' ==
'''Represilator'''

Pri oblikovanju represilatorskega sistema so izhajali iz plazmida, ki vsebuje tri gene – ''tetR'' iz Tn10 transpozona, ''cI'' iz bakteriofaga λ ter ''lacI'' iz laktoznega operona [7],[8]. Celotni represilatorski sistem pa je sestavljen iz dveh plazmidov – represilatorskega plazmida in sponge plazmida. Slednji služi za zmanjšanje šuma oscilacije. Sprva so preizkusili represilatorski sisem v bakterijskem sevu ''E. coli'' Nissle 1917 ''Δclb'' in merili fluorescenco različnih reporterskih genov v različnih časovnih točkah. Pokazali so, da se fluorescenčni proteini izražajo oscilirajoče, kot v osnovnem članku [8]. Temu je sledila modifikacija sponge plazmida, kamor so vstavili gen za reporterski protein oziroma gen za protirakavo učinkovino azurin, ki je pod regulacijo PLtetO1 promotorja. Azurin bi se tako izražal in izločal ob normalnem delovanju PLtetO1. Z vzpostavitvijo računskih modelov so lahko predvideli amplitudo in periodo oscilacije za izbran bakterijski in represilatorski sistem. Na podlagi modelov so lahko prevideli tudi, koliko časa bakterije sinhrono oscilirajo s predhodno sinhronizacijo z IPTG. Represilator bi glede na predhodne študije lahko deloval do 16 dni v črevesju miši [9], kar bi bil tudi časovni interval, na katerega bi pacient zaužil B.O.T. zdravilo. V simulacijah, ki jih je izvedla iGEM skupina, pa so pokazali, da bi bakterije sinhrono delovale krajši čas, zato bi bilo potrebno zdravilo zaužiti pogosteje.

'''Sekrecija in učinek azurina'''

Karakterizacije sinteze in sekrecije azurina so se lotili v treh korakih: i) izolacija azurina, sintetiziranega z ekspresijskim sevom ''E. coli'', ii) dokazovanje, da je sintetiziran protein res azurin, iii) dokazovanje sekrecije azurina (zaradi dodatka pelB-5D sekrecijske oznake). Za dokaz ekspresije so pripravili konstrukt, pri katerem so v pET22 vektor pod inducibilni T7 promotor vstavili gen za azurin z dodano His oznako. Po prvem poskusu izolacije se je izkazalo, da le-ta ne bo tako enostavna. Uporabljen konstrukt so nekoliko optimizirali in namesto His oznake uvedli 3XFLAG oznako na N-konec azurina. S tem so na koncu lahko uspešno dokazali sintezo in sekrecijo azurina. Učinek azurina, sintetiziranega v ''E. coli'' Nissle 1917 ''Δclb'' celicah, so želeli preizkusiti na Caco-2 celični liniji, ki se jo pogosto uporablja za raziskave povezane s kolorektalnim rakom. Za primerjavo učinka azurina na Caco-2 celično linijo so oblikovali eksperimente, pri katerih so uporabili že obstoječa protirakava zdravila (Anisomycin, Cisplatin, Doxorubicin, Salirasib in TNFα). Na koncu so ugotovili, da azurin na Caco-2 celice nima vpliva, vzrok za to pa je po vsej verjetnosti lahko sprememba v p53 signalni poti, ki je glavna in najbolje okarakterizirana tarča protirakave učinkovine azurin [4]. Če bi imeli več časa, bi učinek azurina preverili še na celični liniji HPK116.

'''Samomorilsko stikalo'''

Da bi se izognili razširitvi bakterij na neželena mesta telesa (npr. krvni obtok) ali v okolje, so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na dveh toksin-antitoksin parih: ccdB-ccdA (BBa_K3482016) in miniColicin-E2/IM2 (BBa_K3482017). Cilj je, da bi na mestih, kjer so bakterije nezaželene, prevladoval le toksin, zato bakterije ne bi preživele. V črevesju, kjer so bakterije zaželene, pa bi antitoksin nevtraliziral učinek toksina. Samomorilsko stikalo bi se odzivalo na spremembo dveh pogojev: i) temperatura, ii) koncentracija fosfata. V črevesju, kjer je temperatura visoka in koncentracija fosfata nizka, so prisotni permisivni pogoji za samomorilsko stikalo. Izven telesa, kjer je temperatura nižja, ter v krvnem obtoku, kjer je koncentracija fosfata višja, kot v črevesju, pa pride do sprožitve samomorilskega stikala. Da bi dosegli odzivnost samomorilskega stikala na temperaturo, so uporabili toplotno-inducibilni RNA termosenzor, ki so ga združili z geni za antitoksine, ter toplotno-represivni RNA termosenzor, ki so ga združili z geni za toksine. Odzivnost na koncentracijo fosfata so dosegli z združitvijo genov za antitoksine s promotorjem PphoB, ki ga je možno regulirati s spremembo koncentracije fosfata. Sistem so želeli izboljšati na način, da bi gene za toksine inkorporirali v genom celic in na ta način uvedli kontrolo glede na prisotnost plazmida v celici. Če bi bakterija izgubila plazmid, bi zanjo to pomenilo smrt. Posledično bi lahko iz uporabljenih plazmidov odstranili gene za odpornost na antibiotike in tako pripomogli pri boju proti odpornosti bakterij na antibiotike.

== '''Glavni rezultati in zaključek''' ==

Skupina je uspešno oblikovala in sestavila represilatorski sistem za ''E. coli'' Nissle 1917 ''Δclb'' z namenom oscilirajoče produkcije in sekrecije protirakave učinkovine azurin za zdravljenje kolorektalnega raka. Dokazali so, da pripravljen represilatorski sistem deluje v izbrani šasiji in da se azurin sintetizira in izloča iz celic. Pri proučevanju učinka azurina na Caco-2 celično linijo so ugotovili, da le-ta na celice nima predvidenega učinka, zaradi spremenjene p53 signalne poti v celicah, ki pa je glavna tarča za azurin. Za biološko varnost produkta so sestavili samomorilsko stikalo, zaradi katerega B.O.T. bakterije ne bi preživele izven črevesja pacienta. Razvit bakterijski sistem, ki izloča azurin, bi v perspektivi lahko uporabili tudi za zdravljenje drugih oblik raka, saj lahko sev ''E. coli'' Nissle 1917 ''Δclb'' sorazmerno dobro kolonizira različne tipe tumorskega tkiva [10]. Azurin kot protirakava učinkovina pa se je izkazal kot učinkovit proti melanomu in raku dojke [4].

== '''Viri''' ==
1. I. Mármol, C. Sánchez-de-Diego, A. Pradilla Dieste, E. Cerrada, M. Rodriguez Yoldi: Colorectal Carcinoma: A General Overview and Future Perspectives in Colorectal Cancer. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18(1), str. 197.

2. M. Eriguchi, F. Levi, T. Hisa, H. Yanagie, Y. Nonaka, Y. Takeda: Chronotherapy for cancer. Biomed. Pharmacother. 2003, 57(SUPPL. 1), str. 92–95.

3. F. Lévi: Chronotherapeutics: The relevance of timing in cancer therapy. Cancer Causes Control 2006, 17(4), str. 611–621.

4. M. Gao, J. Zhou, Z. Su, Y. Huang: Bacterial cupredoxin azurin hijacks cellular signaling networks: Protein–protein interactions and cancer therapy. Protein Sci. 2017, 26(12), str. 2334–2341.

5. X. Yu, C. Lin, J. Yu, Q. Qi, Q. Wang: Bioengineered ''Escherichia coli'' Nissle 1917 for tumour-targeting therapy. Microb. Biotechnol. 2020, 13(3), str. 629–636.

6. B.O.T. Project Motivation https://2020.igem.org/Team:UNILausanne/Motivation (pridobljeno 17. 4. 2021).

7. M. B. Elowitz, S. Leibler: A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature 2000, 403(6767), str. 335–338.

8. L. Potvin-Trottier, N. D. Lord, G. Vinnicombe, J. Paulsson: Synchronous long-term oscillations in a synthetic gene circuit. Nature 2016, 538(7626), str. 514–517.

9. D. T. Riglar, D. L. Richmond, L. Potvin-Trottier, A. A. Verdegaal, A. D. Naydich, S. Bakshi, E. Leoncini, L. G. Lyon, J. Paulsson, P. A. Silver: Bacterial variability in the mammalian gut captured by a single-cell synthetic oscillator. Nat. Commun. 2019, 10(1), str. 4665.

10. J. STRITZKER, S. WEIBEL, P. HILL, T. OELSCHLAEGER, W. GOEBEL, A. SZALAY: Tumor-specific colonization, tissue distribution, and gene induction by probiotic ''Escherichia coli'' Nissle 1917 in live mice. Int. J. Med. Microbiol. 2007, 297(3), str. 151–162.

B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka

2021-04-18T22:32:27Z

Neza.pavko:

Projekt B.O.T. je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje podiplomskega študija iz Lozane v Švici. Namen projekta je bil vnos oscilirajočega sistema v probiotske bakterije. Le-te bi nato v intervalih sintetizirale azurin, ki bi služil kot terapevtik za zdravljenje kolorektalnega raka.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:UNILausanne

Avtorica povzetka: Neža Pavko

== '''Uvod''' ==
'''Kolorektalni rak'''

Kolorektalni rak je tretja najpogostejša oblika raka in po vrsti četrti vzrok za smrt povezano z rakom. Za zdravljenje kolorektalnega raka se najpogosteje uporablja kombinacija tehnik, in sicer kemoterapije, radioterapije in opreativne odstranitve. Kemoterapija in operativni poseg sta predvsem pri napredovali bolezni učinkovita le v omejenem obsegu [1].

'''Kronoterapija'''

Pri zdravljenju kolorektalnega raka se je za učinkovito izkazala kronoterapija, ki temelji na administraciji protirakavih učinkovin v določeni točki cirkadianega ritma. Cirkadiani ritem je lastnost procesov v živih organizmih, ki se ciklično spreminjajo v odvisnosti od dnevno-nočnega cikla pogojev v njihovem okolju, torej s periodo 24 ur. Na ta način se lahko izboljša učinkovitost zdravljenja, hkrati pa zmanjša neželene učinke terapije. S projektom so želeli raziskati možnost kombiniranja kronoterapije in terapije z bakterijami, kot nove metode za boj proti kolorektalnemu raku [2], [3].

'''Azurin'''

Kot protirakavo učinkovino so izbrali azurin, ki ga v osnovi proizvaja Pseudomonas aeruginosa. Azurin preferenčno vstopa v človeške rakaste celice, kjer inducira apoptozo ali zavira njihovo rast. Najbolj proučen način delovanja azurina je tvorba kompleksov s tumor supresorskim proteinom p53 in stabilizacija le-tega. Kompleksi p53/azurin potujejo v jedro, kjer p53 aktivira transkripcijo proapoptotskih genov, kot sta Bax in Noxa. p53 aktivira tudi ekspresijo inhibitorjev celičnega cikla [4].

== '''Ideja''' ==
Skupina je idejo o kronoterapiji za zdravljenje kolorektalnega raka uporabila kot osnovo za svoj projekt, pri katerem so v probiotski sev ''Escherichia coli'' Nissle 1917 ''Δclb'' uvedli represilatorski sistem. S tem so želeli doseči oscilirajoče izražanje protirakave učinkovine azurin. Sev ''E. coli'' Nissle 1917 ''Δclb'' so izbrali na podlagi dokazov, da lahko penetrirajo v tumorje bolje kot ostali sevi zaradi svoje anaerobne karakteristike. Omenjeni sev so uporabili že v mnogih raziskavah in nekaterih kliničnih študijah (1. faza) za dostavo protirakavih učinkovin [5]. Represilatorski sistem so želeli prilagoditi za produkcijo azurina in celotni sistem preizkusiti na Caco-2 celicah, ki so jih izbrali kot in vitro model. V razvoj projekta so vključili tudi vidik biološke varnosti. Vnos genetsko spremenjenega organizma v telo oz. okolje bi lahko imelo svoje negativne posledice, zato so se odločili za uporabo samomorilskega stikala, ki bi služil kot varnostni mehanizem [6].

== '''Zasnova projekta in laboratorijsko delo''' ==
'''Represilator'''

Pri oblikovanju represilatorskega sistema so izhajali iz plazmida, ki vsebuje tri gene – ''tetR'' iz Tn10 transpozona, ''cI'' iz bakteriofaga λ ter ''lacI'' iz laktoznega operona [7],[8]. Celotni represilatorski sistem pa je sestavljen iz dveh plazmidov – represilatorskega plazmida in sponge plazmida. Slednji služi za zmanjšanje šuma oscilacije. Sprva so preizkusili represilatorski sisem v bakterijskem sevu ''E. coli'' Nissle 1917 ''Δclb'' in merili fluorescenco različnih reporterskih genov v različnih časovnih točkah. Pokazali so, da se fluorescenčni proteini izražajo oscilirajoče, kot v osnovnem članku [8]. Temu je sledila modifikacija sponge plazmida, kamor so vstavili gen za reporterski protein oziroma gen za protirakavo učinkovino azurin, ki je pod regulacijo PLtetO1 promotorja. Azurin bi se tako izražal in izločal ob normalnem delovanju PLtetO1. Z vzpostavitvijo računskih modelov so lahko predvideli amplitudo in periodo oscilacije za izbran bakterijski in represilatorski sistem. Na podlagi modelov so lahko prevideli tudi, koliko časa bakterije sinhrono oscilirajo s predhodno sinhronizacijo z IPTG. Represilator bi glede na predhodne študije lahko deloval do 16 dni v črevesju miši [9], kar bi bil tudi časovni interval, na katerega bi pacient zaužil B.O.T. zdravilo. V simulacijah, ki jih je izvedla iGEM skupina, pa so pokazali, da bi bakterije sinhrono delovale krajši čas, zato bi bilo potrebno zdravilo zaužiti pogosteje.

'''Sekrecija in učinek azurina'''

Karakterizacije sinteze in sekrecije azurina so se lotili v treh korakih: i) izolacija azurina, sintetiziranega z ekspresijskim sevom E. coli, ii) dokazovanje, da je sintetiziran protein res azurin, iii) dokazovanje sekrecije azurina (zaradi dodatka pelB-5D sekrecijske oznake). Za dokaz ekspresije so pripravili konstrukt, pri katerem so v pET22 vektor pod inducibilni T7 promotor vstavili gen za azurin z dodano His oznako. Po prvem poskusu izolacije se je izkazalo, da le-ta ne bo tako enostavna. Uporabljen konstrukt so nekoliko optimizirali in namesto His oznake uvedli 3XFLAG oznako na N-konec azurina. S tem so na koncu lahko uspešno dokazali sintezo in sekrecijo azurina. Učinek azurina, sintetiziranega v ''E. coli'' Nissle 1917 ''Δclb'' celicah, so želeli preizkusiti na Caco-2 celični liniji, ki se jo pogosto uporablja za raziskave povezane s kolorektalnim rakom. Za primerjavo učinka azurina na Caco-2 celično linijo so oblikovali eksperimente, pri katerih so uporabili že obstoječa protirakava zdravila (Anisomycin, Cisplatin, Doxorubicin, Salirasib in TNFα). Na koncu so ugotovili, da azurin na Caco-2 celice nima vpliva. Če bi imeli več časa, bi učinek azurina preverili še na celični liniji HPK116.

'''Samomorilsko stikalo'''

Da bi se izognili razširitvi bakterij na neželena mesta telesa (npr. krvni obtok) ali v okolje, so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na dveh toksin-antitoksin parih: ccdB-ccdA (BBa_K3482016) in miniColicin-E2/IM2 (BBa_K3482017). Cilj je, da bi na mestih, kjer so bakterije nezaželene, prevladoval le toksin, zato bakterije ne bi preživele. V črevesju, kjer so bakterije zaželene, pa bi antitoksin nevtraliziral učinek toksina. Samomorilsko stikalo bi se odzivalo na spremembo dveh pogojev: i) temperatura, ii) koncentracija fosfata. V črevesju, kjer je temperatura visoka in koncentracija fosfata nizka, so prisotni permisivni pogoji za samomorilsko stikalo. Izven telesa, kjer je temperatura nižja, ter v krvnem obtoku, kjer je koncentracija fosfata višja, kot v črevesju, pa pride do sprožitve samomorilskega stikala. Da bi dosegli odzivnost samomorilskega stikala na temperaturo, so uporabili toplotno-inducibilni RNA termosenzor, ki so ga združili z geni za antitoksine, ter toplotno-represivni RNA termosenzor, ki so ga združili z geni za toksine. Odzivnost na koncentracijo fosfata so dosegli z združitvijo genov za antitoksine s promotorjem PphoB, ki ga je možno regulirati s spremembo koncentracije fosfata. Sistem so želeli izboljšati na način, da bi gene za toksine inkorporirali v genom celic in na ta način uvedli kontrolo glede na prisotnost plazmida v celici. Če bi bakterija izgubila plazmid, bi zanjo to pomenilo smrt. Posledično bi lahko iz uporabljenih plazmidov odstranili gene za odpornost na antibiotike in tako pripomogli pri boju proti odpornosti bakterij na antibiotike.

== '''Glavni rezultati in zaključek''' ==

Skupina je uspešno oblikovala in sestavila represilatorski sistem za ''E. coli'' Nissle 1917 ''Δclb'' z namenom oscilirajoče produkcije in sekrecije protirakave učinkovine azurin za zdravljenje kolorektalnega raka. Dokazali so, da pripravljen represilatorski sistem deluje v izbrani šasiji in da se azurin sintetizira in izloča iz celic. Pri proučevanju učinka azurina na Caco-2 celično linijo so ugotovili, da le-ta na celice nima predvidenega učinka, zaradi spremenjene p53 signalne poti v celicah, ki pa je glavna tarča za azurin. Za biološko varnost produkta so sestavili samomorilsko stikalo, zaradi katerega B.O.T. bakterije ne bi preživele izven črevesja pacienta. Razvit bakterijski sistem, ki izloča azurin, bi v perspektivi lahko uporabili tudi za zdravljenje drugih oblik raka, saj lahko sev ''E. coli'' Nissle 1917 ''Δclb'' sorazmerno dobro kolonizira različne tipe tumorskega tkiva [10]. Azurin kot protirakava učinkovina pa se je izkazal kot učinkovit proti melanomu in raku dojke [4].

== '''Viri''' ==
1. I. Mármol, C. Sánchez-de-Diego, A. Pradilla Dieste, E. Cerrada, M. Rodriguez Yoldi: Colorectal Carcinoma: A General Overview and Future Perspectives in Colorectal Cancer. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18(1), str. 197.

2. M. Eriguchi, F. Levi, T. Hisa, H. Yanagie, Y. Nonaka, Y. Takeda: Chronotherapy for cancer. Biomed. Pharmacother. 2003, 57(SUPPL. 1), str. 92–95.

3. F. Lévi: Chronotherapeutics: The relevance of timing in cancer therapy. Cancer Causes Control 2006, 17(4), str. 611–621.

4. M. Gao, J. Zhou, Z. Su, Y. Huang: Bacterial cupredoxin azurin hijacks cellular signaling networks: Protein–protein interactions and cancer therapy. Protein Sci. 2017, 26(12), str. 2334–2341.

5. X. Yu, C. Lin, J. Yu, Q. Qi, Q. Wang: Bioengineered ''Escherichia coli'' Nissle 1917 for tumour-targeting therapy. Microb. Biotechnol. 2020, 13(3), str. 629–636.

6. B.O.T. Project Motivation https://2020.igem.org/Team:UNILausanne/Motivation (pridobljeno 17. 4. 2021).

7. M. B. Elowitz, S. Leibler: A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature 2000, 403(6767), str. 335–338.

8. L. Potvin-Trottier, N. D. Lord, G. Vinnicombe, J. Paulsson: Synchronous long-term oscillations in a synthetic gene circuit. Nature 2016, 538(7626), str. 514–517.

9. D. T. Riglar, D. L. Richmond, L. Potvin-Trottier, A. A. Verdegaal, A. D. Naydich, S. Bakshi, E. Leoncini, L. G. Lyon, J. Paulsson, P. A. Silver: Bacterial variability in the mammalian gut captured by a single-cell synthetic oscillator. Nat. Commun. 2019, 10(1), str. 4665.

10. J. STRITZKER, S. WEIBEL, P. HILL, T. OELSCHLAEGER, W. GOEBEL, A. SZALAY: Tumor-specific colonization, tissue distribution, and gene induction by probiotic ''Escherichia coli'' Nissle 1917 in live mice. Int. J. Med. Microbiol. 2007, 297(3), str. 151–162.

B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka

2021-04-18T22:09:51Z

Neza.pavko:

Projekt B.O.T. je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje podiplomskega študija iz Lozane v Švici. Namen projekta je bil vnos oscilirajočega sistema v probiotske bakterije. Le-te bi nato v intervalih sintetizirale azurin, ki bi služil kot terapevtik za zdravljenje kolorektalnega raka.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:UNILausanne

Avtorica povzetka: Neža Pavko

== '''Uvod''' ==
'''Kolorektalni rak'''

Kolorektalni rak je tretja najpogostejša oblika raka in po vrsti četrti vzrok za smrt povezano z rakom. Za zdravljenje kolorektalnega raka se najpogosteje uporablja kombinacija tehnik, in sicer kemoterapije, radioterapije in opreativne odstranitve. Kemoterapija in operativni poseg sta predvsem pri napredovali bolezni učinkovita le v omejenem obsegu [1].

'''Kronoterapija'''

Pri zdravljenju kolorektalnega raka se je za učinkovito izkazala kronoterapija, ki temelji na administraciji protirakavih učinkovin v določeni točki cirkadianega ritma. Cirkadiani ritem je lastnost procesov v živih organizmih, ki se ciklično spreminjajo v odvisnosti od dnevno-nočnega cikla pogojev v njihovem okolju, torej s periodo 24 ur. Na ta način se lahko izboljša učinkovitost zdravljenja, hkrati pa zmanjša neželene učinke terapije. S projektom so želeli raziskati možnost kombiniranja kronoterapije in terapije z bakterijami, kot nove metode za boj proti kolorektalnemu raku [2], [3].

'''Azurin'''

Kot protirakavo učinkovino so izbrali azurin, ki ga v osnovi proizvaja Pseudomonas aeruginosa. Azurin preferenčno vstopa v človeške rakaste celice, kjer inducira apoptozo ali zavira njihovo rast. Najbolj proučen način delovanja azurina je tvorba kompleksov s tumor supresorskim proteinom p53 in stabilizacija le-tega. Kompleksi p53/azurin potujejo v jedro, kjer p53 aktivira transkripcijo proapoptotskih genov, kot sta Bax in Noxa. p53 aktivira tudi ekspresijo inhibitorjev celičnega cikla [4].

== '''Ideja''' ==
Skupina je idejo o kronoterapiji za zdravljenje kolorektalnega raka uporabila kot osnovo za svoj projekt, pri katerem so v probiotski sev ''Escherichia coli'' Nissle 1917 ''Δclb'' uvedli represilatorski sistem. S tem so želeli doseči oscilirajoče izražanje protirakave učinkovine azurin. Sev ''E. coli'' Nissle 1917 ''Δclb'' so izbrali na podlagi dokazov, da lahko penetrirajo v tumorje bolje kot ostali sevi zaradi svoje anaerobne karakteristike. Omenjeni sev so uporabili že v mnogih raziskavah in nekaterih kliničnih študijah (1. faza) za dostavo protirakavih učinkovin [5]. Represilatorski sistem so želeli prilagoditi za produkcijo azurina in celotni sistem preizkusiti na Caco-2 celicah, ki so jih izbrali kot in vitro model. V razvoj projekta so vključili tudi vidik biološke varnosti. Vnos genetsko spremenjenega organizma v telo oz. okolje bi lahko imelo svoje negativne posledice, zato so se odločili za uporabo samomorilskega stikala, ki bi služil kot varnostni mehanizem [6].

== '''Zasnova projekta in laboratorijsko delo''' ==
'''Represilator'''

Pri oblikovanju represilatorskega sistema so izhajali iz plazmida, ki vsebuje tri gene – ''tetR'' iz Tn10 transpozona, ''cI'' iz bakteriofaga λ ter ''lacI'' iz laktoznega operona [7],[8]. Celotni represilatorski sistem pa je sestavljen iz dveh plazmidov – represilatorskega plazmida in sponge plazmida. Slednji služi za zmanjšanje šuma oscilacije. Sprva so preizkusili represilatorski sisem v bakterijskem sevu ''E. coli'' Nissle 1917 ''Δclb'' in merili fluorescenco različnih reporterskih genov v različnih časovnih točkah. Pokazali so, da se fluorescenčni proteini izražajo oscilirajoče, kot v osnovnem članku [8]. Temu je sledila modifikacija sponge plazmida, kamor so vstavili gen za reporterski protein oziroma gen za protirakavo učinkovino azurin, ki je pod regulacijo PLtetO1 promotorja. Azurin bi se tako izražal in izločal ob normalnem delovanju PLtetO1. Z vzpostavitvijo računskih modelov so lahko predvideli amplitudo in periodo oscilacije za izbran bakterijski in represilatorski sistem. Na podlagi modelov so lahko prevideli tudi, koliko časa bakterije sinhrono oscilirajo s predhodno sinhronizacijo z IPTG. Represilator bi glede na predhodne študije lahko deloval do 16 dni v črevesju miši [9], kar bi bil tudi časovni interval, na katerega bi pacient zaužil B.O.T. zdravilo. V simulacijah, ki jih je izvedla iGEM skupina, pa so pokazali, da bi bakterije sinhrono delovale krajši čas, zato bi bilo potrebno zdravilo zaužiti pogosteje.

'''Sekrecija in učinek azurina'''

Karakterizacije sinteze in sekrecije azurina so se lotili v treh korakih: i) izolacija azurina, sintetiziranega z ekspresijskim sevom ''E. coli'', ii) dokazovanje, da je sintetiziran protein res azurin, iii) dokazovanje sekrecije azurina (zaradi dodatka pelB-5D sekrecijske oznake). Pri dokazovanju ekspresije azurina so naleteli na nekaj težav, zato so morali uporabljene plazmide nekoliko optimizirati. Za dokazovanje ekspresije in sekrecije so uvedli 3XFLAG oznako na N-konec azurina, s čimer so na koncu lahko uspešno dokazali sintezo in sekrecijo azurina. Učinek azurina, sintetiziranega v ''E. coli'' Nissle 1917 ''Δclb'' celicah, so želeli preizkusiti na Caco-2 celični liniji, ki se jo pogosto uporablja za raziskave povezane s kolorektalnim rakom. Za primerjavo učinka azurina na Caco-2 celično linijo so oblikovali eksperimente, pri katerih so uporabili že obstoječa protirakava zdravila (Anisomycin, Cisplatin, Doxorubicin, Salirasib in TNFα). Na koncu so ugotovili, da azurin na Caco-2 celice nima vpliva. Če bi imeli več časa, bi učinek azurina preverili še na celični liniji HPK116.

'''Samomorilsko stikalo'''

Da bi se izognili razširitvi bakterij na neželena mesta telesa (npr. krvni obtok) ali v okolje, so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na dveh toksin-antitoksin parih: ccdB-ccdA (BBa_K3482016) in miniColicin-E2/IM2 (BBa_K3482017). Cilj je, da bi na mestih, kjer so bakterije nezaželene, prevladoval le toksin, zato bakterije ne bi preživele. V črevesju, kjer so bakterije zaželene, pa bi antitoksin nevtraliziral učinek toksina. Samomorilsko stikalo bi se odzivalo na spremembo dveh pogojev: i) temperatura, ii) koncentracija fosfata. V črevesju, kjer je temperatura visoka in koncentracija fosfata nizka, so prisotni permisivni pogoji za samomorilsko stikalo. Izven telesa, kjer je temperatura nižja, ter v krvnem obtoku, kjer je koncentracija fosfata višja, kot v črevesju, pa pride do sprožitve samomorilskega stikala. Da bi dosegli odzivnost samomorilskega stikala na temperaturo, so uporabili toplotno-inducibilni RNA termosenzor, ki so ga združili z geni za antitoksine, ter toplotno-represivni RNA termosenzor, ki so ga združili z geni za toksine. Odzivnost na koncentracijo fosfata so dosegli z združitvijo genov za antitoksine s promotorjem PphoB, ki ga je možno regulirati s spremembo koncentracije fosfata. Sistem so želeli izboljšati na način, da bi gene za toksine inkorporirali v genom celic in na ta način uvedli kontrolo glede na prisotnost plazmida v celici. Če bi bakterija izgubila plazmid, bi zanjo to pomenilo smrt. Posledično bi lahko iz uporabljenih plazmidov odstranili gene za odpornost na antibiotike in tako pripomogli pri boju proti odpornosti bakterij na antibiotike.

== '''Glavni rezultati in zaključek''' ==

Skupina je uspešno oblikovala in sestavila represilatorski sistem za ''E. coli'' Nissle 1917 ''Δclb'' z namenom oscilirajoče produkcije in sekrecije protirakave učinkovine azurin za zdravljenje kolorektalnega raka. Dokazali so, da pripravljen represilatorski sistem deluje v izbrani šasiji in da se azurin sintetizira in izloča iz celic. Pri proučevanju učinka azurina na Caco-2 celično linijo so ugotovili, da le-ta na celice nima predvidenega učinka, zaradi spremenjene p53 signalne poti v celicah, ki pa je glavna tarča za azurin. Za biološko varnost produkta so sestavili samomorilsko stikalo, zaradi katerega B.O.T. bakterije ne bi preživele izven črevesja pacienta. Razvit bakterijski sistem, ki izloča azurin, bi v perspektivi lahko uporabili tudi za zdravljenje drugih oblik raka, saj lahko sev ''E. coli'' Nissle 1917 ''Δclb'' sorazmerno dobro kolonizira različne tipe tumorskega tkiva [10]. Azurin kot protirakava učinkovina pa se je izkazal kot učinkovit proti melanomu in raku dojke [4].

== '''Viri''' ==
1. I. Mármol, C. Sánchez-de-Diego, A. Pradilla Dieste, E. Cerrada, M. Rodriguez Yoldi: Colorectal Carcinoma: A General Overview and Future Perspectives in Colorectal Cancer. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18(1), str. 197.

2. M. Eriguchi, F. Levi, T. Hisa, H. Yanagie, Y. Nonaka, Y. Takeda: Chronotherapy for cancer. Biomed. Pharmacother. 2003, 57(SUPPL. 1), str. 92–95.

3. F. Lévi: Chronotherapeutics: The relevance of timing in cancer therapy. Cancer Causes Control 2006, 17(4), str. 611–621.

4. M. Gao, J. Zhou, Z. Su, Y. Huang: Bacterial cupredoxin azurin hijacks cellular signaling networks: Protein–protein interactions and cancer therapy. Protein Sci. 2017, 26(12), str. 2334–2341.

5. X. Yu, C. Lin, J. Yu, Q. Qi, Q. Wang: Bioengineered ''Escherichia coli'' Nissle 1917 for tumour-targeting therapy. Microb. Biotechnol. 2020, 13(3), str. 629–636.

6. B.O.T. Project Motivation https://2020.igem.org/Team:UNILausanne/Motivation (pridobljeno 17. 4. 2021).

7. M. B. Elowitz, S. Leibler: A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature 2000, 403(6767), str. 335–338.

8. L. Potvin-Trottier, N. D. Lord, G. Vinnicombe, J. Paulsson: Synchronous long-term oscillations in a synthetic gene circuit. Nature 2016, 538(7626), str. 514–517.

9. D. T. Riglar, D. L. Richmond, L. Potvin-Trottier, A. A. Verdegaal, A. D. Naydich, S. Bakshi, E. Leoncini, L. G. Lyon, J. Paulsson, P. A. Silver: Bacterial variability in the mammalian gut captured by a single-cell synthetic oscillator. Nat. Commun. 2019, 10(1), str. 4665.

10. J. STRITZKER, S. WEIBEL, P. HILL, T. OELSCHLAEGER, W. GOEBEL, A. SZALAY: Tumor-specific colonization, tissue distribution, and gene induction by probiotic ''Escherichia coli'' Nissle 1917 in live mice. Int. J. Med. Microbiol. 2007, 297(3), str. 151–162.

B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka

2021-04-18T22:04:33Z

Neza.pavko:

Projekt B.O.T. je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje podiplomskega študija iz Lozane v Švici. Namen projekta je bil vnos oscilirajočega sistema v probiotske bakterije. Le-te bi nato v intervalih sintetizirale azurin, ki bi služil kot terapevtik za zdravljenje kolorektalnega raka.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:UNILausanne

Avtorica povzetka: Neža Pavko

== '''Uvod''' ==
'''Kolorektalni rak'''

Kolorektalni rak je tretja najpogostejša oblika raka in po vrsti četrti vzrok za smrt povezano z rakom. Za zdravljenje kolorektalnega raka se najpogosteje uporablja kombinacija tehnik, in sicer kemoterapije, radioterapije in opreativne odstranitve. Kemoterapija in operativni poseg sta predvsem pri napredovali bolezni učinkovita le v omejenem obsegu [1].

'''Kronoterapija'''

Pri zdravljenju kolorektalnega raka se je za učinkovito izkazala kronoterapija, ki temelji na administraciji protirakavih učinkovin v določeni točki cirkadianega ritma. Cirkadiani ritem je lastnost procesov v živih organizmih, ki se ciklično spreminjajo v odvisnosti od dnevno-nočnega cikla pogojev v njihovem okolju, torej s periodo 24 ur. Na ta način se lahko izboljša učinkovitost zdravljenja, hkrati pa zmanjša neželene učinke terapije. S projektom so želeli raziskati možnost kombiniranja kronoterapije in terapije z bakterijami, kot nove metode za boj proti kolorektalnemu raku [2], [3].

'''Azurin'''

Kot protirakavo učinkovino so izbrali azurin, ki ga v osnovi proizvaja Pseudomonas aeruginosa. Azurin preferenčno vstopa v človeške rakaste celice, kjer inducira apoptozo ali zavira njihovo rast. Najbolj proučen način delovanja azurina je tvorba kompleksov s tumor supresorskim proteinom p53 in stabilizacija le-tega. Kompleksi p53/azurin potujejo v jedro, kjer p53 aktivira transkripcijo proapoptotskih genov, kot sta Bax in Noxa. p53 aktivira tudi ekspresijo inhibitorjev celičnega cikla [4].

== '''Ideja''' ==
Skupina je idejo o kronoterapiji za zdravljenje kolorektalnega raka uporabila kot osnovo za svoj projekt, pri katerem so v probiotski sev Escherichia coli Nissle 1917 Δclb uvedli represilatorski sistem. S tem so želeli doseči oscilirajoče izražanje protirakave učinkovine azurin. Sev E. coli Nissle 1917 Δclb so izbrali na podlagi dokazov, da lahko penetrirajo v tumorje bolje kot ostali sevi zaradi svoje anaerobne karakteristike. Omenjeni sev so uporabili že v mnogih raziskavah in nekaterih kliničnih študijah (1. faza) za dostavo protirakavih učinkovin [5]. Represilatorski sistem so želeli prilagoditi za produkcijo azurina in celotni sistem preizkusiti na Caco-2 celicah, ki so jih izbrali kot in vitro model. V razvoj projekta so vključili tudi vidik biološke varnosti. Vnos genetsko spremenjenega organizma v telo oz. okolje bi lahko imelo svoje negativne posledice, zato so se odločili za uporabo samomorilskega stikala, ki bi služil kot varnostni mehanizem [6].

== '''Zasnova projekta in laboratorijsko delo''' ==
'''Represilator'''

Pri oblikovanju represilatorskega sistema so izhajali iz plazmida, ki vsebuje tri gene – tetR iz Tn10 transpozona, cI iz bakteriofaga λ ter lacI iz laktoznega operona [7],[8]. Celotni represilatorski sistem pa je sestavljen iz dveh plazmidov – represilatorskega plazmida in sponge plazmida. Slednji služi za zmanjšanje šuma oscilacije. Sprva so preizkusili represilatorski sisem v bakterijskem sevu E. coli Nissle 1917 Δclb in merili fluorescenco različnih reporterskih genov v različnih časovnih točkah. Pokazali so, da se fluorescenčni proteini izražajo oscilirajoče, kot v osnovnem članku [8]. Temu je sledila modifikacija sponge plazmida, kamor so vstavili gen za reporterski protein oziroma gen za protirakavo učinkovino azurin, ki je pod regulacijo PLtetO1 promotorja. Azurin bi se tako izražal in izločal ob normalnem delovanju PLtetO1. Z vzpostavitvijo računskih modelov so lahko predvideli amplitudo in periodo oscilacije za izbran bakterijski in represilatorski sistem. Na podlagi modelov so lahko prevideli tudi, koliko časa bakterije sinhrono oscilirajo s predhodno sinhronizacijo z IPTG. Represilator bi glede na predhodne študije lahko deloval do 16 dni v črevesju miši [9], kar bi bil tudi časovni interval, na katerega bi pacient zaužil B.O.T. zdravilo. V simulacijah, ki jih je izvedla iGEM skupina, pa so pokazali, da bi bakterije sinhrono delovale krajši čas, zato bi bilo potrebno zdravilo zaužiti pogosteje.

'''Sekrecija in učinek azurina'''

Karakterizacije sinteze in sekrecije azurina so se lotili v treh korakih: i) izolacija azurina, sintetiziranega z ekspresijskim sevom E. coli, ii) dokazovanje, da je sintetiziran protein res azurin, iii) dokazovanje sekrecije azurina (zaradi dodatka pelB-5D sekrecijske oznake). Pri dokazovanju ekspresije azurina so naleteli na nekaj težav, zato so morali uporabljene plazmide nekoliko optimizirati. Za dokazovanje ekspresije in sekrecije so uvedli 3XFLAG oznako na N-konec azurina, s čimer so na koncu lahko uspešno dokazali sintezo in sekrecijo azurina. Učinek azurina, sintetiziranega v E. coli Nissle 1917 Δclb celicah, so želeli preizkusiti na Caco-2 celični liniji, ki se jo pogosto uporablja za raziskave povezane s kolorektalnim rakom. Za primerjavo učinka azurina na Caco-2 celično linijo so oblikovali eksperimente, pri katerih so uporabili že obstoječa protirakava zdravila (Anisomycin, Cisplatin, Doxorubicin, Salirasib in TNFα). Na koncu so ugotovili, da azurin na Caco-2 celice nima vpliva. Če bi imeli več časa, bi učinek azurina preverili še na celični liniji HPK116.

'''Samomorilsko stikalo'''

Da bi se izognili razširitvi bakterij na neželena mesta telesa (npr. krvni obtok) ali v okolje, so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na dveh toksin-antitoksin parih: ccdB-ccdA (BBa_K3482016) in miniColicin-E2/IM2 (BBa_K3482017). Cilj je, da bi na mestih, kjer so bakterije nezaželene, prevladoval le toksin, zato bakterije ne bi preživele. V črevesju, kjer so bakterije zaželene, pa bi antitoksin nevtraliziral učinek toksina. Samomorilsko stikalo bi se odzivalo na spremembo dveh pogojev: i) temperatura, ii) koncentracija fosfata. V črevesju, kjer je temperatura visoka in koncentracija fosfata nizka, so prisotni permisivni pogoji za samomorilsko stikalo. Izven telesa, kjer je temperatura nižja, ter v krvnem obtoku, kjer je koncentracija fosfata višja, kot v črevesju, pa pride do sprožitve samomorilskega stikala. Da bi dosegli odzivnost samomorilskega stikala na temperaturo, so uporabili toplotno-inducibilni RNA termosenzor, ki so ga združili z geni za antitoksine, ter toplotno-represivni RNA termosenzor, ki so ga združili z geni za toksine. Odzivnost na koncentracijo fosfata so dosegli z združitvijo genov za antitoksine s promotorjem PphoB, ki ga je možno regulirati s spremembo koncentracije fosfata. Sistem so želeli izboljšati na način, da bi gene za toksine inkorporirali v genom celic in na ta način uvedli kontrolo glede na prisotnost plazmida v celici. Če bi bakterija izgubila plazmid, bi zanjo to pomenilo smrt. Posledično bi lahko iz uporabljenih plazmidov odstranili gene za odpornost na antibiotike in tako pripomogli pri boju proti odpornosti bakterij na antibiotike.

== '''Glavni rezultati in zaključek''' ==

Skupina je uspešno oblikovala in sestavila represilatorski sistem za E. coli Nissle 1917 Δclb z namenom oscilirajoče produkcije in sekrecije protirakave učinkovine azurin za zdravljenje kolorektalnega raka. Dokazali so, da pripravljen represilatorski sistem deluje v izbrani šasiji in da se azurin sintetizira in izloča iz celic. Pri proučevanju učinka azurina na Caco-2 celično linijo so ugotovili, da le-ta na celice nima predvidenega učinka, zaradi spremenjene p53 signalne poti v celicah, ki pa je glavna tarča za azurin. Za biološko varnost produkta so sestavili samomorilsko stikalo, zaradi katerega B.O.T. bakterije ne bi preživele izven črevesja pacienta. Razvit bakterijski sistem, ki izloča azurin, bi v perspektivi lahko uporabili tudi za zdravljenje drugih oblik raka, saj lahko sev E. coli Nissle 1917 Δclb sorazmerno dobro kolonizira različne tipe tumorskega tkiva [10]. Azurin kot protirakava učinkovina pa se je izkazal kot učinkovit proti melanomu in raku dojke [4].

== '''Viri''' ==
1. I. Mármol, C. Sánchez-de-Diego, A. Pradilla Dieste, E. Cerrada, M. Rodriguez Yoldi: Colorectal Carcinoma: A General Overview and Future Perspectives in Colorectal Cancer. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18(1), str. 197.

2. M. Eriguchi, F. Levi, T. Hisa, H. Yanagie, Y. Nonaka, Y. Takeda: Chronotherapy for cancer. Biomed. Pharmacother. 2003, 57(SUPPL. 1), str. 92–95.

3. F. Lévi: Chronotherapeutics: The relevance of timing in cancer therapy. Cancer Causes Control 2006, 17(4), str. 611–621.

4. M. Gao, J. Zhou, Z. Su, Y. Huang: Bacterial cupredoxin azurin hijacks cellular signaling networks: Protein–protein interactions and cancer therapy. Protein Sci. 2017, 26(12), str. 2334–2341.

5. X. Yu, C. Lin, J. Yu, Q. Qi, Q. Wang: Bioengineered Escherichia coli Nissle 1917 for tumour-targeting therapy. Microb. Biotechnol. 2020, 13(3), str. 629–636.

6. B.O.T. Project Motivation https://2020.igem.org/Team:UNILausanne/Motivation (pridobljeno 17. 4. 2021).

7. M. B. Elowitz, S. Leibler: A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature 2000, 403(6767), str. 335–338.

8. L. Potvin-Trottier, N. D. Lord, G. Vinnicombe, J. Paulsson: Synchronous long-term oscillations in a synthetic gene circuit. Nature 2016, 538(7626), str. 514–517.

9. D. T. Riglar, D. L. Richmond, L. Potvin-Trottier, A. A. Verdegaal, A. D. Naydich, S. Bakshi, E. Leoncini, L. G. Lyon, J. Paulsson, P. A. Silver: Bacterial variability in the mammalian gut captured by a single-cell synthetic oscillator. Nat. Commun. 2019, 10(1), str. 4665.

10. J. STRITZKER, S. WEIBEL, P. HILL, T. OELSCHLAEGER, W. GOEBEL, A. SZALAY: Tumor-specific colonization, tissue distribution, and gene induction by probiotic Escherichia coli Nissle 1917 in live mice. Int. J. Med. Microbiol. 2007, 297(3), str. 151–162.

B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka

2021-04-18T22:02:52Z

Neza.pavko: New page: Projekt B.O.T. je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje podiplomskega študija iz Lozane v Švici. Namen projekta je bil vnos oscilirajočega sist...

Projekt B.O.T. je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje podiplomskega študija iz Lozane v Švici. Namen projekta je bil vnos oscilirajočega sistema v probiotske bakterije. Le-te bi nato v intervalih sintetizirale azurin, ki bi služil kot terapevtik za zdravljenje kolorektalnega raka.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:UNILausanne

Avtorica povzetka: Neža Pavko

== '''Uvod''' ==
'''Kolorektalni rak'''

Kolorektalni rak je tretja najpogostejša oblika raka in po vrsti četrti vzrok za smrt povezano z rakom. Za zdravljenje kolorektalnega raka se najpogosteje uporablja kombinacija tehnik, in sicer kemoterapije, radioterapije in opreativne odstranitve. Kemoterapija in operativni poseg sta predvsem pri napredovali bolezni učinkovita le v omejenem obsegu [1].

'''Kronoterapija'''

Pri zdravljenju kolorektalnega raka se je za učinkovito izkazala kronoterapija, ki temelji na administraciji protirakavih učinkovin v določeni točki cirkadianega ritma. Cirkadiani ritem je lastnost procesov v živih organizmih, ki se ciklično spreminjajo v odvisnosti od dnevno-nočnega cikla pogojev v njihovem okolju, torej s periodo 24 ur. Na ta način se lahko izboljša učinkovitost zdravljenja, hkrati pa zmanjša neželene učinke terapije. S projektom so želeli raziskati možnost kombiniranja kronoterapije in terapije z bakterijami, kot nove metode za boj proti kolorektalnemu raku [2], [3].

'''Azurin'''

Kot protirakavo učinkovino so izbrali azurin, ki ga v osnovi proizvaja Pseudomonas aeruginosa. Azurin preferenčno vstopa v človeške rakaste celice, kjer inducira apoptozo ali zavira njihovo rast. Najbolj proučen način delovanja azurina je tvorba kompleksov s tumor supresorskim proteinom p53 in stabilizacija le-tega. Kompleksi p53/azurin potujejo v jedro, kjer p53 aktivira transkripcijo proapoptotskih genov, kot sta Bax in Noxa. p53 aktivira tudi ekspresijo inhibitorjev celičnega cikla [4].

== '''Ideja''' ==
Skupina je idejo o kronoterapiji za zdravljenje kolorektalnega raka uporabila kot osnovo za svoj projekt, pri katerem so v probiotski sev Escherichia coli Nissle 1917 Δclb uvedli represilatorski sistem. S tem so želeli doseči oscilirajoče izražanje protirakave učinkovine azurin. Sev E. coli Nissle 1917 Δclb so izbrali na podlagi dokazov, da lahko penetrirajo v tumorje bolje kot ostali sevi zaradi svoje anaerobne karakteristike. Omenjeni sev so uporabili že v mnogih raziskavah in nekaterih kliničnih študijah (1. faza) za dostavo protirakavih učinkovin [5]. Represilatorski sistem so želeli prilagoditi za produkcijo azurina in celotni sistem preizkusiti na Caco-2 celicah, ki so jih izbrali kot in vitro model. V razvoj projekta so vključili tudi vidik biološke varnosti. Vnos genetsko spremenjenega organizma v telo oz. okolje bi lahko imelo svoje negativne posledice, zato so se odločili za uporabo samomorilskega stikala, ki bi služil kot varnostni mehanizem [6].

== ''Zasnova projekta in laboratorijsko delo'' ==
'''Represilator'''

Pri oblikovanju represilatorskega sistema so izhajali iz plazmida, ki vsebuje tri gene – tetR iz Tn10 transpozona, cI iz bakteriofaga λ ter lacI iz laktoznega operona [7],[8]. Celotni represilatorski sistem pa je sestavljen iz dveh plazmidov – represilatorskega plazmida in sponge plazmida. Slednji služi za zmanjšanje šuma oscilacije. Sprva so preizkusili represilatorski sisem v bakterijskem sevu E. coli Nissle 1917 Δclb in merili fluorescenco različnih reporterskih genov v različnih časovnih točkah. Pokazali so, da se fluorescenčni proteini izražajo oscilirajoče, kot v osnovnem članku [8]. Temu je sledila modifikacija sponge plazmida, kamor so vstavili gen za reporterski protein oziroma gen za protirakavo učinkovino azurin, ki je pod regulacijo PLtetO1 promotorja. Azurin bi se tako izražal in izločal ob normalnem delovanju PLtetO1. Z vzpostavitvijo računskih modelov so lahko predvideli amplitudo in periodo oscilacije za izbran bakterijski in represilatorski sistem. Na podlagi modelov so lahko prevideli tudi, koliko časa bakterije sinhrono oscilirajo s predhodno sinhronizacijo z IPTG. Represilator bi glede na predhodne študije lahko deloval do 16 dni v črevesju miši [9], kar bi bil tudi časovni interval, na katerega bi pacient zaužil B.O.T. zdravilo. V simulacijah, ki jih je izvedla iGEM skupina, pa so pokazali, da bi bakterije sinhrono delovale krajši čas, zato bi bilo potrebno zdravilo zaužiti pogosteje.

'''Sekrecija in učinek azurina'''

Karakterizacije sinteze in sekrecije azurina so se lotili v treh korakih: i) izolacija azurina, sintetiziranega z ekspresijskim sevom E. coli, ii) dokazovanje, da je sintetiziran protein res azurin, iii) dokazovanje sekrecije azurina (zaradi dodatka pelB-5D sekrecijske oznake). Pri dokazovanju ekspresije azurina so naleteli na nekaj težav, zato so morali uporabljene plazmide nekoliko optimizirati. Za dokazovanje ekspresije in sekrecije so uvedli 3XFLAG oznako na N-konec azurina, s čimer so na koncu lahko uspešno dokazali sintezo in sekrecijo azurina. Učinek azurina, sintetiziranega v E. coli Nissle 1917 Δclb celicah, so želeli preizkusiti na Caco-2 celični liniji, ki se jo pogosto uporablja za raziskave povezane s kolorektalnim rakom. Za primerjavo učinka azurina na Caco-2 celično linijo so oblikovali eksperimente, pri katerih so uporabili že obstoječa protirakava zdravila (Anisomycin, Cisplatin, Doxorubicin, Salirasib in TNFα). Na koncu so ugotovili, da azurin na Caco-2 celice nima vpliva. Če bi imeli več časa, bi učinek azurina preverili še na celični liniji HPK116.

'''Samomorilsko stikalo'''

Da bi se izognili razširitvi bakterij na neželena mesta telesa (npr. krvni obtok) ali v okolje, so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na dveh toksin-antitoksin parih: ccdB-ccdA (BBa_K3482016) in miniColicin-E2/IM2 (BBa_K3482017). Cilj je, da bi na mestih, kjer so bakterije nezaželene, prevladoval le toksin, zato bakterije ne bi preživele. V črevesju, kjer so bakterije zaželene, pa bi antitoksin nevtraliziral učinek toksina. Samomorilsko stikalo bi se odzivalo na spremembo dveh pogojev: i) temperatura, ii) koncentracija fosfata. V črevesju, kjer je temperatura visoka in koncentracija fosfata nizka, so prisotni permisivni pogoji za samomorilsko stikalo. Izven telesa, kjer je temperatura nižja, ter v krvnem obtoku, kjer je koncentracija fosfata višja, kot v črevesju, pa pride do sprožitve samomorilskega stikala. Da bi dosegli odzivnost samomorilskega stikala na temperaturo, so uporabili toplotno-inducibilni RNA termosenzor, ki so ga združili z geni za antitoksine, ter toplotno-represivni RNA termosenzor, ki so ga združili z geni za toksine. Odzivnost na koncentracijo fosfata so dosegli z združitvijo genov za antitoksine s promotorjem PphoB, ki ga je možno regulirati s spremembo koncentracije fosfata. Sistem so želeli izboljšati na način, da bi gene za toksine inkorporirali v genom celic in na ta način uvedli kontrolo glede na prisotnost plazmida v celici. Če bi bakterija izgubila plazmid, bi zanjo to pomenilo smrt. Posledično bi lahko iz uporabljenih plazmidov odstranili gene za odpornost na antibiotike in tako pripomogli pri boju proti odpornosti bakterij na antibiotike.

== '''Glavni rezultati in zaključek''' ==

Skupina je uspešno oblikovala in sestavila represilatorski sistem za E. coli Nissle 1917 Δclb z namenom oscilirajoče produkcije in sekrecije protirakave učinkovine azurin za zdravljenje kolorektalnega raka. Dokazali so, da pripravljen represilatorski sistem deluje v izbrani šasiji in da se azurin sintetizira in izloča iz celic. Pri proučevanju učinka azurina na Caco-2 celično linijo so ugotovili, da le-ta na celice nima predvidenega učinka, zaradi spremenjene p53 signalne poti v celicah, ki pa je glavna tarča za azurin. Za biološko varnost produkta so sestavili samomorilsko stikalo, zaradi katerega B.O.T. bakterije ne bi preživele izven črevesja pacienta. Razvit bakterijski sistem, ki izloča azurin, bi v perspektivi lahko uporabili tudi za zdravljenje drugih oblik raka, saj lahko sev E. coli Nissle 1917 Δclb sorazmerno dobro kolonizira različne tipe tumorskega tkiva [10]. Azurin kot protirakava učinkovina pa se je izkazal kot učinkovit proti melanomu in raku dojke [4].

== '''Viri''' ==
1. I. Mármol, C. Sánchez-de-Diego, A. Pradilla Dieste, E. Cerrada, M. Rodriguez Yoldi: Colorectal Carcinoma: A General Overview and Future Perspectives in Colorectal Cancer. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18(1), str. 197.

2. M. Eriguchi, F. Levi, T. Hisa, H. Yanagie, Y. Nonaka, Y. Takeda: Chronotherapy for cancer. Biomed. Pharmacother. 2003, 57(SUPPL. 1), str. 92–95.

3. F. Lévi: Chronotherapeutics: The relevance of timing in cancer therapy. Cancer Causes Control 2006, 17(4), str. 611–621.

4. M. Gao, J. Zhou, Z. Su, Y. Huang: Bacterial cupredoxin azurin hijacks cellular signaling networks: Protein–protein interactions and cancer therapy. Protein Sci. 2017, 26(12), str. 2334–2341.

5. X. Yu, C. Lin, J. Yu, Q. Qi, Q. Wang: Bioengineered Escherichia coli Nissle 1917 for tumour-targeting therapy. Microb. Biotechnol. 2020, 13(3), str. 629–636.

6. B.O.T. Project Motivation https://2020.igem.org/Team:UNILausanne/Motivation (pridobljeno 17. 4. 2021).

7. M. B. Elowitz, S. Leibler: A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature 2000, 403(6767), str. 335–338.

8. L. Potvin-Trottier, N. D. Lord, G. Vinnicombe, J. Paulsson: Synchronous long-term oscillations in a synthetic gene circuit. Nature 2016, 538(7626), str. 514–517.

9. D. T. Riglar, D. L. Richmond, L. Potvin-Trottier, A. A. Verdegaal, A. D. Naydich, S. Bakshi, E. Leoncini, L. G. Lyon, J. Paulsson, P. A. Silver: Bacterial variability in the mammalian gut captured by a single-cell synthetic oscillator. Nat. Commun. 2019, 10(1), str. 4665.

10. J. STRITZKER, S. WEIBEL, P. HILL, T. OELSCHLAEGER, W. GOEBEL, A. SZALAY: Tumor-specific colonization, tissue distribution, and gene induction by probiotic Escherichia coli Nissle 1917 in live mice. Int. J. Med. Microbiol. 2007, 297(3), str. 151–162.

Seminarji SB 2020/21

2021-04-18T19:31:40Z

Neza.pavko:

V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline]
(Liza Ulčakar) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 
6 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv]
(Špela Supej) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 
4 [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) 
6 [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) 

----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Opuščena cepiva: Merck (IAVI, Themix), Imperial College London, Univ. of Queensland

2021-04-11T22:21:37Z

Neza.pavko: New page: == V590 – Merck, IAVI == To cepivo temelji na rekombinantnih oslabljenih virusnih delcih vezikularnega stomatitisa (rVSV), ki so jim gen za plaščni glikoprotein zamenjali z genom za pr...

== V590 – Merck, IAVI ==
To cepivo temelji na rekombinantnih oslabljenih virusnih delcih vezikularnega stomatitisa (rVSV), ki so jim gen za plaščni glikoprotein zamenjali z genom za protein bodice virusa SARS-CoV-2. Zaradi te menjave imajo rekombinantni virusni delci podobne lastnosti vstopa v celice kot sam virus SARS-CoV-2 [1]. V 1. fazi kliničnih študij so po intramuskularni administraciji cepiva ugotovili, da se osebe na cepivo dobro odzivajo, vendar njihov imunski odziv ni tako močan kot pri osebah, ki so okužbo s Covid-19 že prebolele ali bile cepljene z enim izmed registriranih cepiv [2].

== V591 – Merck, Themis, Institut Pasteur ==
To cepivo temelji na že dobro uveljavljenem cepivu proti ošpicam. Oslabljenim virusnim delcem ošpic so v genom vstavili gen za protein bodice virusa SARS-CoV-2. Oslabljeni virusni delci ošpic okužujejo antigen predstavitvene celice. Ob replikaciji rekombinantnih virusnih delcev v antigen predstavitvenih celicah se sintetizira tudi protein bodice, ki v cepljeni osebi sproži imunski odziv proti proteinu bodic virusa SARS-CoV-2 [3], [4]. Cepivo so po 1. fazi kliničnih študij opustili zaradi enakih razlogov kot cepivo V590 [3].

== UQ-CSL V451- University of Queensland, CSL Limited ==
Cepivo so pripravili s tehnologijo molekularne objemke. Molekularna objemka je polipeptid, ki se uporablja za ohranjanje oblike proteinov. Univerza v Queenslandu je tehnologijo molekularne objemke zasnovala tako, da objemka stabilizira protein bodice v njegovi prefuzijski konformaciji. Kot objemko so uporabili fragmente glikoproteina 41, ki je protein virusne ovojnice virusa HIV [5]. Raziskovalci so poleg objemke cepivu dodali tudi adjuvans MF59. Junija 2020 so začeli s 1 fazo kliničnega testiranja, v kateri je sodelovalo 216 prostovoljcev [6]. Med poskusom prve faze kliničnega testiranja so ugotovili, da so udeleženci razvili protitelesa proti fragmentom glikoproteina 41, kar je povzročilo lažno pozitivne rezultate presejalnih testov za HIV. Zato so se odločili, da ne bodo nadaljevali z naslednjo fazo kliničnih testiranj [5].

== Cepivo Imperial College London ==
To cepivo temelji na samo-ojačevalni RNA, ki nosi navodila za sintezo proteina bodice (najdemo ga na površini SARS-CoV-2). Glede na število že odobrenih in distribuiranih cepiv so se odločili, da cepivo ne bo napredovalo v tretjo fazo kliničnih testiranj, ampak da bodo svoje raziskave osredotočili na prilagoditev tehnologije novim različicam SARS-CoV-2. Ta sposobnost bi lahko bila osrednja pri razvoju cepiv druge generacije proti Covid-19 [7].

== Viri in literatura ==
1. M. E. Dieterle, D. Haslwanter, R. H. Bortz, A. S. Wirchnianski, G. Lasso, O. Vergnolle, S. A. Abbasi, J. M. Fels, E. Laudermilch, … R. K. Jangra: A replication-competent vesicular stomatitis virus for studies of SARS-CoV-2 spike-mediated cell entry and its inhibition. bioRxiv Prepr. Serv. Biol. 2020.

2. IAVI Press release https://www.iavi.org/news-resources/press-releases/2021/merck-and-iavi-discontinue-development-of-covid-19-vaccine-candidate-v590 (pridobljeno 7. 4. 2021).

3. Institut Pasteur Press release https://www.pasteur.fr/en/research-journal/press-documents/covid-19-progress-update-institut-pasteur-s-scientific-response-and-vaccine-candidate-research (pridobljeno 7. 4. 2021).

4. F. Tangy, H. Y. Naim: Live attenuated measles vaccine as a potential multivalent pediatric vaccination vector. Viral Immunol. 2005, 18(2), str. 317–326.

5. Molecular clamp vaccines https://www.nature.com/articles/d42473-020-00504-2?source=globalbiodefense&fbclid=IwAR2akaPqMNeVnHbnkKEZIhg11d-bNQTI8xfM8KIT9dFNeLw6QNGXu5JGjEc (pridobljeno 6. 4. 2021).

6. Precision vaccinations https://www.precisionvaccinations.com/vaccines/uq-csl-v451-vaccine (pridobljeno 6. 4. 2021).

7. Independent - Imperial College London https://www.independent.co.uk/news/health/covid-vaccine-variant-imperial-college-uk-b1792766.html (pridobljeno 6. 4. 2021).

Protikovidna cepiva

2021-04-11T22:15:57Z

Neza.pavko:

Študentski seminar pri predmetu Molekularna biotehnologija 2020/21 
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo 
Magistrski študij Biokemija 

Seminar pripravljajo študentje 1. in 2. letnika magistrskega študija. Kratki povzetki morajo biti napisani na taki ravni zahtevnosti, da so razumljivi širši javnosti. Predstavitve seminarjev (6 oz. 12 minut) imajo splošen uvod in strokovno nadaljevanje. Vsebina temelji na javno dostopnih podatkih v času priprave seminarja. Po zadnji seminarski predstavitvi bomo predvidoma izdali zbornih povzetkov, ki bo vključeval tudi slikovne razlage. Poleg tega seminarja morajo študentje pripraviti tudi daljšo predstavitev teme iz znanstvene literature.

Razpored predstavitev:

# [[Molekularnobiološke značilnosti SARS-CoV-2 in aktualni mutanti (južnoafriški, britanski, nigerijski,...)]] - 11.3. (12 min) 
# [[Interakcija SARS-CoV-2 s tarčno celico]] - 11.3. (6 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca Moderna (mRNA)]] - 18.3. (12 min) 
# [[Rezultati kliničnih testiranj cepiva proizvajalca Moderna (mRNA) ]] - 18.3.(6 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)]] - 25.3. (12 min) 
# [[Rezultati kliničnih testiranj proizvajalca AstraZeneca / Oxford University (ChAdOx1)]] - 25.3. (6 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca Pfizer / BioNTech (mRNA)]] - 1.4. (12 min) 
# [[Rezultati kliničnih testiranj cepiva proizvajalca Pfizer / BioNTech (mRNA)]] - 1.4. (12 min) 
# [[Značilnosti cepiva proizvajalca Johnson&Johnson / Jennsen (Ad26)]] - 8.4. (6 min) 
# [[Opuščena cepiva: Merck (IAVI, Themix), Imperial College London, Univ. of Queensland]] - 8.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Sputnik V (Gamaleya) (Ad26, Ad5) - 15.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva CanSino (Ad5) - 15.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiv Sinopharm in Sinovac (inaktivirano) - 22.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Bharat Biotech (inaktivirano) - 22.4. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Novavax (proteinsko) - 6.5. (12 min) 
# Značilnosti cepiva Vector Institute (proteinsko) - 6.5. (6 min) 
# Značilnosti cepiva EpiVacCorona (peptidno) - 13.5. (6 min) 
nerazporejeno:
# Značilnosti cepiva Zyadus Cadilla (DNA) - 13.5. 
# Značilnosti cepiva COVAXX / UBI (peptidno) - 20.5. 
 
----
Povezava do [https://www.youtube.com/watch?v=K3odScka55A videa z razlago] o načinu določanja učinkovitosti cepiv in o (ne)smislu primerjanja teh vrednosti (Vox).

V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih

2021-03-24T15:45:23Z

Neza.pavko: /* Rezultati */

== Malarija ==

Malarijo prenašajo komarji rodu ''Anopheles'' spp. in je ena izmed resnejših nalezljivih bolezni, za katero po svetu letno zboli več kot 200 milijonov ljudi. Pri človeku okužbo povzročata patogena ''Plasmodium falciparum'' in ''Plasmodium vivax'' [1]. Za boj proti malariji je bilo identificiranih veliko kandidatov za cepiva, vendar pa razvoj le-tega predstavlja resen izziv, predvsem zaradi antigenske kompleksnosti, visoke stopnje polimorfizma med proteini patogena ter visoke cene proizvodnje. Ena izmed možnih in cenovno učinkovitih rešitev je proizvodnja cepiva proti malariji v rastlinah [2].

== Zasnova in izvedba eksperimenta ==

Namen eksperimenta je bil priprava rastlinskega cepiva proti malariji, sestavljenega iz epitopov AMA1 in MSP119 iz ''P. falciparium'' ter peptida GK1, ki služi kot adjuvant. Cepivo bi služilo kot dokaz koncepta za proizvodnjo varnih rekombinantnih cepiv v rastlinah. V ta namen so pripravili konstrukt z imenom Malchloroplast, za sočasno ekspresijo AMA1, MSP119 ter GK1. Bralne okvirje so optimizirali glede na rabo kodona v kloroplastih [3]. 766 bp dolg Malchloroplast konstrukt so vstavili v pBic plazmid, ki je bil oblikovan za integracijo tujih genov v ''Mun''I restrikcijsko mesto znotraj regije obrnjenih ponovitev kloroplastnega genoma [3], [4]. Plazmid je tako vseboval končni konstrukt, sestavljen iz regij za homologno rekombinacijo INSL ter INSR, ki obdajata Prrn promotor, Malchloroplast insert ter selekcijski marker ''aadA'' [3].

Plazmid so na delcih zlata z gensko pištolo vnesli v 3-5 tednov stare liste rastline ''Nicotiana tabacum''. S selekcijo so prišli do rastlin, ki vsebujejo transgen. To so potrdili s PCR reakcijo z ustreznimi začetnimi oligonukleotidi, ki se vežejo na zaporedje AMA1 in MSP119 znotraj regije Malchloroplast. Po cvetenju so uspešno transformiranim T0 rastlinam pobrali semena in jih prestavili na MS medij z dodanim spektinomicinom, da bi le-ta kalila, in tako dobili T1 rastline. Da bi dokazali homoplazmijo T1 rastlin, so izvedli PCR analizo z začetnimi oligonukleotidi, ki objemajo mesto insercije transgena v genomu kloroplasta [3].

Aktivno transkripcijo Malchloroplast transgena so dokazali s qRT-PCR. Ekspresijo ter velikost posameznih peptidov AMA1, MSK119 ter GK1 so dokazali z western prenosom, slednjega so tudi kvantificirali s HPLC. Z ELISA testom so nato analizirali še reaktivnost serumov pacientov okuženih s ''P. falciparium'' na Malchloroplast, imunogenost kandidatnega cepiva pa so proučili tudi z imunizacijo miši. Prisotnost ustreznih protiteles so nato dokazovali z ELISA testom [3].

== Rezultati ==

V eksperimentu so pripravili policistronski konstrukt za ekspresijo AMA1, MSP119 ter GK1, ki so ga z gensko pištolo prenesli v liste rastline ''Nicotiana tabacum''. Po selekciji uspešno transformiranih rastlin so pridobili 11 sadik izmed katerih so pri petih s PCR analizo potrdili prisotnost transgena. Iz semen ene transplastomske rastline so se razvile štiri T1 rastline, ki jim je bila s PCR analizo na podlagi velikosti inserta v kloroplastih dokazana homoplazmija [3].

Pri analizi transkripcijske aktivnosti so ugotovili, da so željeni transkripti prisotni le pri transplastomskih rastlinah, medtem ko pri divjem tipu niso bili prisotni. Proteine vseh štirih T1 rastlin so analizirali z western prenosom, pri čemer so s protitelesi anti-AMA1 in anti-GK1 v listih transgenih rastlin dokazali ekspresijo rekombinantnih proteinov. Pri ELISA testu s serumi okuženih pacientov so dobili pozitivne antigenske reakcije v primerih uporabe ekstrakta z Malchloroplast-om, medtem ko pri divjem tipu tobaka pozitivnih reakcij ni bilo, s čimer so dokazali, da so v ekstraktu z Malchloroplast-om prisotne antigenske determinante [3].

Temu je sledila imunizacija BALB/c miši z rastlinskim ekstraktom ene izmed T1 rastlin. Dokazali so prisotnost protiteles proti AMA1, MSP119 in GK1, po zadnji dozi ekstrakta pa so opazili tudi močnejši odziv na ekstrakt transplastomske linije v primerjavi z ekstraktom rastlin divjega tipa [3].

== Zaključki ==

Z eksperimentom so dokazali možen koncept priprave cepiv z različnimi antigeni v kloroplastih tobaka. Komponente kandidatnega cepiva so reagirale s protitelesi v serumu z malarijo okuženih pacientov, prav tako pa so dokazali protitelesa proti AMA1, MSP119 in GK1 v imuniziranih miših. Glede na pridobljene rezultate bi ta pristop priprave cepiv lahko še bolje raziskali in potencialno razvili učinkovito oralno cepivo [3].

== Viri ==

1. M. A. Phillips, J. N. Burrows, C. Manyando, R. H. van Huijsduijnen, W. C. Van Voorhis, T. N. C. Wells: Malaria. ''Nat. Rev. Dis. Prim''. ''2017'', ''3(1)'', str. 17050.

2. K.-C. Kwon, D. Verma, N. D. Singh, R. Herzog, H. Daniell: Oral delivery of human biopharmaceuticals, autoantigens and vaccine antigens bioencapsulated in plant cells. ''Adv. Drug Deliv. Rev''. ''2013'', ''65(6)'', str. 782–799.

3. E. M. Milán-Noris, E. Monreal-Escalante, S. Rosales-Mendoza, R. E. Soria-Guerra, O. Radwan, J. A. Juvik, S. S. Korban: An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant-Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals. ''Mol. Biotechnol''. ''2020'', ''62(10)'', str. 534–545.

4. Z. Zou, C. Eibl, H.-U. Koop: The stem-loop region of the tobacco psbA 5′UTR is an important determinant of mRNA stability and translation efficiency. ''Mol. Genet. Genomics 2003'', ''269(3)'', str. 340–349.

MBT seminarji 2021

2021-03-24T11:08:46Z

Neza.pavko:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah:

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.) 
# An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.) 

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# (1.4.) 
# (1.4.) 
# Andrej Race (7.4.)
# Peter Škrinjar (7.4.)

'''Gensko spremenjene živali in celične linije''' 
# Urša Lovše (8.4.)
# Matija Ruparčič (8.4.)

'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti''' 
# Saša Slabe (14.4.)
# Luka Gnidovec (15.4.)
# Liza Ulčakar (15.4.)

'''Biotehnološki polimeri''' 
# Anže Karlek (21.4.)
# Ana Maklin (22.4.)
# Urban Hribar(22.4.)

'''Biotehnološko pridobljeni encimi''' 
# Urška Fajdiga (5.5.)
# Mirsad Mešić (6.5.)
# Martina Lokar (6.5.)

'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji''' 
# Jerneja Nimac (12.5.)
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)
# Klementina Polanec (13.5.)
# Ernestina Lavrih (13.5.)

'''Biomasa in biogoriva''' 
# Željka Erić (19.5.)
# Karin Dobravc Škof (20.5.)
# Katja Doberšek(20.5.)

'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija''' 
# Almina Tahirović (26.5.)
# Eva Keber (27.5.)
# Nina Lukančič (27.5.)

V rastlinah proizvedeno transplastomsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih

2021-03-24T11:07:21Z

Neza.pavko: V rastlinah proizvedeno transplastomsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih moved to [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski

#REDIRECT [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]

V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih

2021-03-24T11:07:21Z

== Malarija ==

Malarijo prenašajo komarji rodu ''Anopheles'' spp. in je ena izmed resnejših nalezljivih bolezni, za katero po svetu letno zboli več kot 200 milijonov ljudi. Pri človeku okužbo povzročata patogena ''Plasmodium falciparum'' in ''Plasmodium vivax'' [1]. Za boj proti malariji je bilo identificiranih veliko kandidatov za cepiva, vendar pa razvoj le-tega predstavlja resen izziv, predvsem zaradi antigenske kompleksnosti, visoke stopnje polimorfizma med proteini patogena ter visoke cene proizvodnje. Ena izmed možnih in cenovno učinkovitih rešitev je proizvodnja cepiva proti malariji v rastlinah [2].

== Zasnova in izvedba eksperimenta ==

Namen eksperimenta je bil priprava rastlinskega cepiva proti malariji, sestavljenega iz epitopov AMA1 in MSP119 iz ''P. falciparium'' ter peptida GK1, ki služi kot adjuvant. Cepivo bi služilo kot dokaz koncepta za proizvodnjo varnih rekombinantnih cepiv v rastlinah. V ta namen so pripravili konstrukt z imenom Malchloroplast, za sočasno ekspresijo AMA1, MSP119 ter GK1. Bralne okvirje so optimizirali glede na rabo kodona v kloroplastih [3]. 766 bp dolg Malchloroplast konstrukt so vstavili v pBic plazmid, ki je bil oblikovan za integracijo tujih genov v ''Mun''I restrikcijsko mesto znotraj regije obrnjenih ponovitev kloroplastnega genoma [3], [4]. Plazmid je tako vseboval končni konstrukt, sestavljen iz regij za homologno rekombinacijo INSL ter INSR, ki obdajata Prrn promotor, Malchloroplast insert ter selekcijski marker ''aadA'' [3].

Plazmid so na delcih zlata z gensko pištolo vnesli v 3-5 tednov stare liste rastline ''Nicotiana tabacum''. S selekcijo so prišli do rastlin, ki vsebujejo transgen. To so potrdili s PCR reakcijo z ustreznimi začetnimi oligonukleotidi, ki se vežejo na zaporedje AMA1 in MSP119 znotraj regije Malchloroplast. Po cvetenju so uspešno transformiranim T0 rastlinam pobrali semena in jih prestavili na MS medij z dodanim spektinomicinom, da bi le-ta kalila, in tako dobili T1 rastline. Da bi dokazali homoplazmijo T1 rastlin, so izvedli PCR analizo z začetnimi oligonukleotidi, ki objemajo mesto insercije transgena v genomu kloroplasta [3].

Aktivno transkripcijo Malchloroplast transgena so dokazali s qRT-PCR. Ekspresijo ter velikost posameznih peptidov AMA1, MSK119 ter GK1 so dokazali z western prenosom, slednjega so tudi kvantificirali s HPLC. Z ELISA testom so nato analizirali še reaktivnost serumov pacientov okuženih s ''P. falciparium'' na Malchloroplast, imunogenost kandidatnega cepiva pa so proučili tudi z imunizacijo miši. Prisotnost ustreznih protiteles so nato dokazovali z ELISA testom [3].

== Rezultati ==

V eksperimentu so pripravili policistronski konstrukt za ekspresijo AMA1, MSP119 ter GK1, ki so ga z gensko pištolo prenesli v liste rastline ''Nicotiana tabacum''. Po selekciji uspešno transformiranih rastlin so pridobili 11 sadik izmed katerih so pri šestih s PCR analizo potrdili prisotnost transgena. Iz semen ene transplastomske rastline so se razvile štiri T1 rastline, ki jim je bila s PCR analizo na podlagi velikosti inserta v kloroplastih dokazana homoplazmija [3].

Pri analizi transkripcijske aktivnosti so ugotovili, da so željeni transkripti prisotni le pri transplastomskih rastlinah, medtem ko pri divjem tipu niso bili prisotni. Proteine vseh štirih T1 rastlin so analizirali z western prenosom, pri čemer so s protitelesi anti-AMA1 in anti-GK1 v listih transgenih rastlin dokazali ekspresijo rekombinantnih proteinov. Pri ELISA testu s serumi okuženih pacientov so dobili pozitivne antigenske reakcije v primerih uporabe ekstrakta z Malchloroplast-om, medtem ko pri divjem tipu tobaka pozitivnih reakcij ni bilo, s čimer so dokazali, da so v ekstraktu z Malchloroplast-om prisotne antigenske determinante [3].

Temu je sledila imunizacija BALB/c miši z rastlinskim ekstraktom ene izmed T1 rastlin. Dokazali so prisotnost protiteles proti AMA1, MSP119 in GK1, po zadnji dozi ekstrakta pa so opazili tudi močnejši odziv na ekstrakt transplastomske linije v primerjavi z ekstraktom rastlin divjega tipa [3].

== Zaključki ==

Z eksperimentom so dokazali možen koncept priprave cepiv z različnimi antigeni v kloroplastih tobaka. Komponente kandidatnega cepiva so reagirale s protitelesi v serumu z malarijo okuženih pacientov, prav tako pa so dokazali protitelesa proti AMA1, MSP119 in GK1 v imuniziranih miših. Glede na pridobljene rezultate bi ta pristop priprave cepiv lahko še bolje raziskali in potencialno razvili učinkovito oralno cepivo [3].

== Viri ==

1. M. A. Phillips, J. N. Burrows, C. Manyando, R. H. van Huijsduijnen, W. C. Van Voorhis, T. N. C. Wells: Malaria. ''Nat. Rev. Dis. Prim''. ''2017'', ''3(1)'', str. 17050.

2. K.-C. Kwon, D. Verma, N. D. Singh, R. Herzog, H. Daniell: Oral delivery of human biopharmaceuticals, autoantigens and vaccine antigens bioencapsulated in plant cells. ''Adv. Drug Deliv. Rev''. ''2013'', ''65(6)'', str. 782–799.

3. E. M. Milán-Noris, E. Monreal-Escalante, S. Rosales-Mendoza, R. E. Soria-Guerra, O. Radwan, J. A. Juvik, S. S. Korban: An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant-Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals. ''Mol. Biotechnol''. ''2020'', ''62(10)'', str. 534–545.

4. Z. Zou, C. Eibl, H.-U. Koop: The stem-loop region of the tobacco psbA 5′UTR is an important determinant of mRNA stability and translation efficiency. ''Mol. Genet. Genomics 2003'', ''269(3)'', str. 340–349.

V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih

2021-03-24T08:39:27Z

Neza.pavko: /* Malarija */

== Malarija ==

Malarijo prenašajo komarji rodu ''Anopheles'' spp. in je ena izmed resnejših nalezljivih bolezni, za katero po svetu letno zboli več kot 200 milijonov ljudi. Pri človeku okužbo povzročata patogena ''Plasmodium falciparum'' in ''Plasmodium vivax'' [1]. Za boj proti malariji je bilo identificiranih veliko kandidatov za cepiva, vendar pa razvoj le-tega predstavlja resen izziv, predvsem zaradi antigenske kompleksnosti, visoke stopnje polimorfizma med proteini patogena ter visoke cene proizvodnje. Ena izmed možnih in cenovno učinkovitih rešitev je proizvodnja cepiva proti malariji v rastlinah [2].

== Zasnova in izvedba eksperimenta ==

Namen eksperimenta je bil priprava rastlinskega cepiva proti malariji, sestavljenega iz epitopov AMA1 in MSP119 iz ''P. falciparium'' ter peptida GK1, ki služi kot adjuvant. Cepivo bi služilo kot dokaz koncepta za proizvodnjo varnih rekombinantnih cepiv v rastlinah. V ta namen so pripravili konstrukt z imenom Malchloroplast, za sočasno ekspresijo AMA1, MSP119 ter GK1. Bralne okvirje so optimizirali glede na rabo kodona v kloroplastih [3]. 766 bp dolg Malchloroplast konstrukt so vstavili v pBic plazmid, ki je bil oblikovan za integracijo tujih genov v ''Mun''I restrikcijsko mesto znotraj regije obrnjenih ponovitev kloroplastnega genoma [3], [4]. Plazmid je tako vseboval končni konstrukt, sestavljen iz regij za homologno rekombinacijo INSL ter INSR, ki obdajata Prrn promotor, Malchloroplast insert ter selekcijski marker ''aadA'' [3].

Plazmid so na delcih zlata z gensko pištolo vnesli v 3-5 tednov stare liste rastline ''Nicotiana tabacum''. S selekcijo so prišli do rastlin, ki vsebujejo transgen. To so potrdili s PCR reakcijo z ustreznimi začetnimi oligonukleotidi, ki se vežejo na zaporedje AMA1 in MSP119 znotraj regije Malchloroplast. Po cvetenju so uspešno transformiranim T0 rastlinam pobrali semena in jih prestavili na MS medij z dodanim spektinomicinom, da bi le-ta kalila, in tako dobili T1 rastline. Da bi dokazali homoplazmijo T1 rastlin, so izvedli PCR analizo z začetnimi oligonukleotidi, ki objemajo mesto insercije transgena v genomu kloroplasta [3].

Aktivno transkripcijo Malchloroplast transgena so dokazali s qRT-PCR. Ekspresijo ter velikost posameznih peptidov AMA1, MSK119 ter GK1 so dokazali z western prenosom, slednjega so tudi kvantificirali s HPLC. Z ELISA testom so nato analizirali še reaktivnost serumov pacientov okuženih s ''P. falciparium'' na Malchloroplast, imunogenost kandidatnega cepiva pa so proučili tudi z imunizacijo miši. Prisotnost ustreznih protiteles so nato dokazovali z ELISA testom [3].

== Rezultati ==

V eksperimentu so pripravili policistronski konstrukt za ekspresijo AMA1, MSP119 ter GK1, ki so ga z gensko pištolo prenesli v liste rastline ''Nicotiana tabacum''. Po selekciji uspešno transformiranih rastlin so pridobili 11 sadik izmed katerih so pri šestih s PCR analizo potrdili prisotnost transgena. Iz semen ene transplastomske rastline so se razvile štiri T1 rastline, ki jim je bila s PCR analizo na podlagi velikosti inserta v kloroplastih dokazana homoplazmija [3].

Pri analizi transkripcijske aktivnosti so ugotovili, da so željeni transkripti prisotni le pri transplastomskih rastlinah, medtem ko pri divjem tipu niso bili prisotni. Proteine vseh štirih T1 rastlin so analizirali z western prenosom, pri čemer so s protitelesi anti-AMA1 in anti-GK1 v listih transgenih rastlin dokazali ekspresijo rekombinantnih proteinov. Pri ELISA testu s serumi okuženih pacientov so dobili pozitivne antigenske reakcije v primerih uporabe ekstrakta z Malchloroplast-om, medtem ko pri divjem tipu tobaka pozitivnih reakcij ni bilo, s čimer so dokazali, da so v ekstraktu z Malchloroplast-om prisotne antigenske determinante [3].

Temu je sledila imunizacija BALB/c miši z rastlinskim ekstraktom ene izmed T1 rastlin. Dokazali so prisotnost protiteles proti AMA1, MSP119 in GK1, po zadnji dozi ekstrakta pa so opazili tudi močnejši odziv na ekstrakt transplastomske linije v primerjavi z ekstraktom rastlin divjega tipa [3].

== Zaključki ==

Z eksperimentom so dokazali možen koncept priprave cepiv z različnimi antigeni v kloroplastih tobaka. Komponente kandidatnega cepiva so reagirale s protitelesi v serumu z malarijo okuženih pacientov, prav tako pa so dokazali protitelesa proti AMA1, MSP119 in GK1 v imuniziranih miših. Glede na pridobljene rezultate bi ta pristop priprave cepiv lahko še bolje raziskali in potencialno razvili učinkovito oralno cepivo [3].

== Viri ==

1. M. A. Phillips, J. N. Burrows, C. Manyando, R. H. van Huijsduijnen, W. C. Van Voorhis, T. N. C. Wells: Malaria. ''Nat. Rev. Dis. Prim''. ''2017'', ''3(1)'', str. 17050.

2. K.-C. Kwon, D. Verma, N. D. Singh, R. Herzog, H. Daniell: Oral delivery of human biopharmaceuticals, autoantigens and vaccine antigens bioencapsulated in plant cells. ''Adv. Drug Deliv. Rev''. ''2013'', ''65(6)'', str. 782–799.

3. E. M. Milán-Noris, E. Monreal-Escalante, S. Rosales-Mendoza, R. E. Soria-Guerra, O. Radwan, J. A. Juvik, S. S. Korban: An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant-Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals. ''Mol. Biotechnol''. ''2020'', ''62(10)'', str. 534–545.

4. Z. Zou, C. Eibl, H.-U. Koop: The stem-loop region of the tobacco psbA 5′UTR is an important determinant of mRNA stability and translation efficiency. ''Mol. Genet. Genomics 2003'', ''269(3)'', str. 340–349.

V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih

2021-03-24T08:38:43Z

Neza.pavko: /* Zaključki */

== Malarija ==

Malarijo prenašajo komarji rodu ''Anopheles'' spp. in je ena izmed resnejših nalezljivih bolezni, za katero po svetu letno zboli več kot 200 milijonov ljudi. Pri človeku okužbo povzročata patogena ''Plasmodium falciparum'' in ''Plasmodium vivax'' [1]. Za boj proti malariji je bilo identificiranih veliko kandidatov za cepiva, vendar pa razvoj le-tega predstavlja resen izziv, predvsem zaradi antigenske kompleksnosti, visoke stopnje polimorfizma med proteini patogena ter visoke cene proizvodnje. Ena izmed možnih in cenovno učinkovitih rešitev je proizvodnja cepiva proti malariji v rastlinah [2].

== Zasnova in izvedba eksperimenta ==

Namen eksperimenta je bil priprava rastlinskega cepiva proti malariji, sestavljenega iz epitopov AMA1 in MSP119 iz ''P. falciparium'' ter peptida GK1, ki služi kot adjuvant. Cepivo bi služilo kot dokaz koncepta za proizvodnjo varnih rekombinantnih cepiv v rastlinah. V ta namen so pripravili konstrukt z imenom Malchloroplast, za sočasno ekspresijo AMA1, MSP119 ter GK1. Bralne okvirje so optimizirali glede na rabo kodona v kloroplastih [3]. 766 bp dolg Malchloroplast konstrukt so vstavili v pBic plazmid, ki je bil oblikovan za integracijo tujih genov v ''Mun''I restrikcijsko mesto znotraj regije obrnjenih ponovitev kloroplastnega genoma [3], [4]. Plazmid je tako vseboval končni konstrukt, sestavljen iz regij za homologno rekombinacijo INSL ter INSR, ki obdajata Prrn promotor, Malchloroplast insert ter selekcijski marker ''aadA'' [3].

Plazmid so na delcih zlata z gensko pištolo vnesli v 3-5 tednov stare liste rastline ''Nicotiana tabacum''. S selekcijo so prišli do rastlin, ki vsebujejo transgen. To so potrdili s PCR reakcijo z ustreznimi začetnimi oligonukleotidi, ki se vežejo na zaporedje AMA1 in MSP119 znotraj regije Malchloroplast. Po cvetenju so uspešno transformiranim T0 rastlinam pobrali semena in jih prestavili na MS medij z dodanim spektinomicinom, da bi le-ta kalila, in tako dobili T1 rastline. Da bi dokazali homoplazmijo T1 rastlin, so izvedli PCR analizo z začetnimi oligonukleotidi, ki objemajo mesto insercije transgena v genomu kloroplasta [3].

Aktivno transkripcijo Malchloroplast transgena so dokazali s qRT-PCR. Ekspresijo ter velikost posameznih peptidov AMA1, MSK119 ter GK1 so dokazali z western prenosom, slednjega so tudi kvantificirali s HPLC. Z ELISA testom so nato analizirali še reaktivnost serumov pacientov okuženih s ''P. falciparium'' na Malchloroplast, imunogenost kandidatnega cepiva pa so proučili tudi z imunizacijo miši. Prisotnost ustreznih protiteles so nato dokazovali z ELISA testom [3].

== Rezultati ==

V eksperimentu so pripravili policistronski konstrukt za ekspresijo AMA1, MSP119 ter GK1, ki so ga z gensko pištolo prenesli v liste rastline ''Nicotiana tabacum''. Po selekciji uspešno transformiranih rastlin so pridobili 11 sadik izmed katerih so pri šestih s PCR analizo potrdili prisotnost transgena. Iz semen ene transplastomske rastline so se razvile štiri T1 rastline, ki jim je bila s PCR analizo na podlagi velikosti inserta v kloroplastih dokazana homoplazmija [3].

Pri analizi transkripcijske aktivnosti so ugotovili, da so željeni transkripti prisotni le pri transplastomskih rastlinah, medtem ko pri divjem tipu niso bili prisotni. Proteine vseh štirih T1 rastlin so analizirali z western prenosom, pri čemer so s protitelesi anti-AMA1 in anti-GK1 v listih transgenih rastlin dokazali ekspresijo rekombinantnih proteinov. Pri ELISA testu s serumi okuženih pacientov so dobili pozitivne antigenske reakcije v primerih uporabe ekstrakta z Malchloroplast-om, medtem ko pri divjem tipu tobaka pozitivnih reakcij ni bilo, s čimer so dokazali, da so v ekstraktu z Malchloroplast-om prisotne antigenske determinante [3].

Temu je sledila imunizacija BALB/c miši z rastlinskim ekstraktom ene izmed T1 rastlin. Dokazali so prisotnost protiteles proti AMA1, MSP119 in GK1, po zadnji dozi ekstrakta pa so opazili tudi močnejši odziv na ekstrakt transplastomske linije v primerjavi z ekstraktom rastlin divjega tipa [3].

== Zaključki ==

Z eksperimentom so dokazali možen koncept priprave cepiv z različnimi antigeni v kloroplastih tobaka. Komponente kandidatnega cepiva so reagirale s protitelesi v serumu z malarijo okuženih pacientov, prav tako pa so dokazali protitelesa proti AMA1, MSP119 in GK1 v imuniziranih miših. Glede na pridobljene rezultate bi ta pristop priprave cepiv lahko še bolje raziskali in potencialno razvili učinkovito oralno cepivo [3].

== Viri ==

1. M. A. Phillips, J. N. Burrows, C. Manyando, R. H. van Huijsduijnen, W. C. Van Voorhis, T. N. C. Wells: Malaria. ''Nat. Rev. Dis. Prim''. ''2017'', ''3(1)'', str. 17050.

2. K.-C. Kwon, D. Verma, N. D. Singh, R. Herzog, H. Daniell: Oral delivery of human biopharmaceuticals, autoantigens and vaccine antigens bioencapsulated in plant cells. ''Adv. Drug Deliv. Rev''. ''2013'', ''65(6)'', str. 782–799.

3. E. M. Milán-Noris, E. Monreal-Escalante, S. Rosales-Mendoza, R. E. Soria-Guerra, O. Radwan, J. A. Juvik, S. S. Korban: An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant-Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals. ''Mol. Biotechnol''. ''2020'', ''62(10)'', str. 534–545.

4. Z. Zou, C. Eibl, H.-U. Koop: The stem-loop region of the tobacco psbA 5′UTR is an important determinant of mRNA stability and translation efficiency. ''Mol. Genet. Genomics 2003'', ''269(3)'', str. 340–349.

V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih

2021-03-24T08:38:14Z

Neza.pavko: /* Rezultati */

== Malarija ==

Malarijo prenašajo komarji rodu ''Anopheles'' spp. in je ena izmed resnejših nalezljivih bolezni, za katero po svetu letno zboli več kot 200 milijonov ljudi. Pri človeku okužbo povzročata patogena ''Plasmodium falciparum'' in ''Plasmodium vivax'' [1]. Za boj proti malariji je bilo identificiranih veliko kandidatov za cepiva, vendar pa razvoj le-tega predstavlja resen izziv, predvsem zaradi antigenske kompleksnosti, visoke stopnje polimorfizma med proteini patogena ter visoke cene proizvodnje. Ena izmed možnih in cenovno učinkovitih rešitev je proizvodnja cepiva proti malariji v rastlinah [2].

== Zasnova in izvedba eksperimenta ==

Namen eksperimenta je bil priprava rastlinskega cepiva proti malariji, sestavljenega iz epitopov AMA1 in MSP119 iz ''P. falciparium'' ter peptida GK1, ki služi kot adjuvant. Cepivo bi služilo kot dokaz koncepta za proizvodnjo varnih rekombinantnih cepiv v rastlinah. V ta namen so pripravili konstrukt z imenom Malchloroplast, za sočasno ekspresijo AMA1, MSP119 ter GK1. Bralne okvirje so optimizirali glede na rabo kodona v kloroplastih [3]. 766 bp dolg Malchloroplast konstrukt so vstavili v pBic plazmid, ki je bil oblikovan za integracijo tujih genov v ''Mun''I restrikcijsko mesto znotraj regije obrnjenih ponovitev kloroplastnega genoma [3], [4]. Plazmid je tako vseboval končni konstrukt, sestavljen iz regij za homologno rekombinacijo INSL ter INSR, ki obdajata Prrn promotor, Malchloroplast insert ter selekcijski marker ''aadA'' [3].

Plazmid so na delcih zlata z gensko pištolo vnesli v 3-5 tednov stare liste rastline ''Nicotiana tabacum''. S selekcijo so prišli do rastlin, ki vsebujejo transgen. To so potrdili s PCR reakcijo z ustreznimi začetnimi oligonukleotidi, ki se vežejo na zaporedje AMA1 in MSP119 znotraj regije Malchloroplast. Po cvetenju so uspešno transformiranim T0 rastlinam pobrali semena in jih prestavili na MS medij z dodanim spektinomicinom, da bi le-ta kalila, in tako dobili T1 rastline. Da bi dokazali homoplazmijo T1 rastlin, so izvedli PCR analizo z začetnimi oligonukleotidi, ki objemajo mesto insercije transgena v genomu kloroplasta [3].

Aktivno transkripcijo Malchloroplast transgena so dokazali s qRT-PCR. Ekspresijo ter velikost posameznih peptidov AMA1, MSK119 ter GK1 so dokazali z western prenosom, slednjega so tudi kvantificirali s HPLC. Z ELISA testom so nato analizirali še reaktivnost serumov pacientov okuženih s ''P. falciparium'' na Malchloroplast, imunogenost kandidatnega cepiva pa so proučili tudi z imunizacijo miši. Prisotnost ustreznih protiteles so nato dokazovali z ELISA testom [3].

== Rezultati ==

V eksperimentu so pripravili policistronski konstrukt za ekspresijo AMA1, MSP119 ter GK1, ki so ga z gensko pištolo prenesli v liste rastline ''Nicotiana tabacum''. Po selekciji uspešno transformiranih rastlin so pridobili 11 sadik izmed katerih so pri šestih s PCR analizo potrdili prisotnost transgena. Iz semen ene transplastomske rastline so se razvile štiri T1 rastline, ki jim je bila s PCR analizo na podlagi velikosti inserta v kloroplastih dokazana homoplazmija [3].

Pri analizi transkripcijske aktivnosti so ugotovili, da so željeni transkripti prisotni le pri transplastomskih rastlinah, medtem ko pri divjem tipu niso bili prisotni. Proteine vseh štirih T1 rastlin so analizirali z western prenosom, pri čemer so s protitelesi anti-AMA1 in anti-GK1 v listih transgenih rastlin dokazali ekspresijo rekombinantnih proteinov. Pri ELISA testu s serumi okuženih pacientov so dobili pozitivne antigenske reakcije v primerih uporabe ekstrakta z Malchloroplast-om, medtem ko pri divjem tipu tobaka pozitivnih reakcij ni bilo, s čimer so dokazali, da so v ekstraktu z Malchloroplast-om prisotne antigenske determinante [3].

Temu je sledila imunizacija BALB/c miši z rastlinskim ekstraktom ene izmed T1 rastlin. Dokazali so prisotnost protiteles proti AMA1, MSP119 in GK1, po zadnji dozi ekstrakta pa so opazili tudi močnejši odziv na ekstrakt transplastomske linije v primerjavi z ekstraktom rastlin divjega tipa [3].

== Zaključki ==

Z eksperimentom so dokazali možen koncept priprave cepiv z različnimi antigeni v kloroplastih tobaka. Komponente kandidatnega cepiva so reagirale s protitelesi v serumu z malarijo okuženih pacientov, prav tako pa so dokazali protitelesa proti AMA1, MSP1 in GK1 v imuniziranih miših. Glede na pridobljene rezultate bi ta pristop priprave cepiv lahko še bolje raziskali in potencialno razvili učinkovito oralno cepivo [3].

== Viri ==

1. M. A. Phillips, J. N. Burrows, C. Manyando, R. H. van Huijsduijnen, W. C. Van Voorhis, T. N. C. Wells: Malaria. ''Nat. Rev. Dis. Prim''. ''2017'', ''3(1)'', str. 17050.

2. K.-C. Kwon, D. Verma, N. D. Singh, R. Herzog, H. Daniell: Oral delivery of human biopharmaceuticals, autoantigens and vaccine antigens bioencapsulated in plant cells. ''Adv. Drug Deliv. Rev''. ''2013'', ''65(6)'', str. 782–799.

3. E. M. Milán-Noris, E. Monreal-Escalante, S. Rosales-Mendoza, R. E. Soria-Guerra, O. Radwan, J. A. Juvik, S. S. Korban: An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant-Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals. ''Mol. Biotechnol''. ''2020'', ''62(10)'', str. 534–545.

4. Z. Zou, C. Eibl, H.-U. Koop: The stem-loop region of the tobacco psbA 5′UTR is an important determinant of mRNA stability and translation efficiency. ''Mol. Genet. Genomics 2003'', ''269(3)'', str. 340–349.

V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih

2021-03-24T08:36:39Z

Neza.pavko: /* Zasnova in izvedba eksperimenta */

== Malarija ==

Malarijo prenašajo komarji rodu ''Anopheles'' spp. in je ena izmed resnejših nalezljivih bolezni, za katero po svetu letno zboli več kot 200 milijonov ljudi. Pri človeku okužbo povzročata patogena ''Plasmodium falciparum'' in ''Plasmodium vivax'' [1]. Za boj proti malariji je bilo identificiranih veliko kandidatov za cepiva, vendar pa razvoj le-tega predstavlja resen izziv, predvsem zaradi antigenske kompleksnosti, visoke stopnje polimorfizma med proteini patogena ter visoke cene proizvodnje. Ena izmed možnih in cenovno učinkovitih rešitev je proizvodnja cepiva proti malariji v rastlinah [2].

== Zasnova in izvedba eksperimenta ==

Namen eksperimenta je bil priprava rastlinskega cepiva proti malariji, sestavljenega iz epitopov AMA1 in MSP119 iz ''P. falciparium'' ter peptida GK1, ki služi kot adjuvant. Cepivo bi služilo kot dokaz koncepta za proizvodnjo varnih rekombinantnih cepiv v rastlinah. V ta namen so pripravili konstrukt z imenom Malchloroplast, za sočasno ekspresijo AMA1, MSP119 ter GK1. Bralne okvirje so optimizirali glede na rabo kodona v kloroplastih [3]. 766 bp dolg Malchloroplast konstrukt so vstavili v pBic plazmid, ki je bil oblikovan za integracijo tujih genov v ''Mun''I restrikcijsko mesto znotraj regije obrnjenih ponovitev kloroplastnega genoma [3], [4]. Plazmid je tako vseboval končni konstrukt, sestavljen iz regij za homologno rekombinacijo INSL ter INSR, ki obdajata Prrn promotor, Malchloroplast insert ter selekcijski marker ''aadA'' [3].

Plazmid so na delcih zlata z gensko pištolo vnesli v 3-5 tednov stare liste rastline ''Nicotiana tabacum''. S selekcijo so prišli do rastlin, ki vsebujejo transgen. To so potrdili s PCR reakcijo z ustreznimi začetnimi oligonukleotidi, ki se vežejo na zaporedje AMA1 in MSP119 znotraj regije Malchloroplast. Po cvetenju so uspešno transformiranim T0 rastlinam pobrali semena in jih prestavili na MS medij z dodanim spektinomicinom, da bi le-ta kalila, in tako dobili T1 rastline. Da bi dokazali homoplazmijo T1 rastlin, so izvedli PCR analizo z začetnimi oligonukleotidi, ki objemajo mesto insercije transgena v genomu kloroplasta [3].

Aktivno transkripcijo Malchloroplast transgena so dokazali s qRT-PCR. Ekspresijo ter velikost posameznih peptidov AMA1, MSK119 ter GK1 so dokazali z western prenosom, slednjega so tudi kvantificirali s HPLC. Z ELISA testom so nato analizirali še reaktivnost serumov pacientov okuženih s ''P. falciparium'' na Malchloroplast, imunogenost kandidatnega cepiva pa so proučili tudi z imunizacijo miši. Prisotnost ustreznih protiteles so nato dokazovali z ELISA testom [3].

== Rezultati ==

V eksperimentu so pripravili policistronski konstrukt za ekspresijo AMA1, MSP119 ter GK1, ki so ga z gensko pištolo prenesli v liste rastline ''Nicotiana tabacum''. Po selekciji uspešno transformiranih rastlin so pridobili 11 sadik izmed katerih so pri šestih s PCR analizo potrdili prisotnost transgena. Iz semen ene transplastomske rastline so se razvile štiri T1 rastline, ki jim je bila s PCR analizo na podlagi velikosti inserta v kloroplastih dokazana homoplazmija [3].

Pri analizi transkripcijske aktivnosti so ugotovili, da so željeni transkripti prisotni le pri transplastomskih rastlinah, medtem ko pri divjem tipu niso bili prisotni. Proteine vseh štirih T1 rastlin so analizirali z western prenosom, pri čemer so s protitelesi anti-AMA1 in anti-GK1 v listih transgenih rastlin dokazali ekspresijo rekombinantnih proteinov. Pri ELISA testu s serumi okuženih pacientov so dobili pozitivne antigenske reakcije v primerih uporabe ekstrakta z Malchloroplast-om, medtem ko pri divjem tipu tobaka pozitivnih reakcij ni bilo, s čimer so dokazali, da so v ekstraktu z Malchloroplast-om prisotne antigenske determinante [3].

Temu je sledila imunizacija BALB/c miši z rastlinskim ekstraktom ene izmed T1 rastlin. Dokazali so prisotnost protiteles proti AMA1, MSP1 in GK1, po zadnji dozi ekstrakta pa so opazili tudi močnejši odziv na ekstrakt transplastomske linije v primerjavi z ekstraktom rastlin divjega tipa [3].

== Zaključki ==

Z eksperimentom so dokazali možen koncept priprave cepiv z različnimi antigeni v kloroplastih tobaka. Komponente kandidatnega cepiva so reagirale s protitelesi v serumu z malarijo okuženih pacientov, prav tako pa so dokazali protitelesa proti AMA1, MSP1 in GK1 v imuniziranih miših. Glede na pridobljene rezultate bi ta pristop priprave cepiv lahko še bolje raziskali in potencialno razvili učinkovito oralno cepivo [3].

== Viri ==

1. M. A. Phillips, J. N. Burrows, C. Manyando, R. H. van Huijsduijnen, W. C. Van Voorhis, T. N. C. Wells: Malaria. ''Nat. Rev. Dis. Prim''. ''2017'', ''3(1)'', str. 17050.

2. K.-C. Kwon, D. Verma, N. D. Singh, R. Herzog, H. Daniell: Oral delivery of human biopharmaceuticals, autoantigens and vaccine antigens bioencapsulated in plant cells. ''Adv. Drug Deliv. Rev''. ''2013'', ''65(6)'', str. 782–799.

3. E. M. Milán-Noris, E. Monreal-Escalante, S. Rosales-Mendoza, R. E. Soria-Guerra, O. Radwan, J. A. Juvik, S. S. Korban: An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant-Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals. ''Mol. Biotechnol''. ''2020'', ''62(10)'', str. 534–545.

4. Z. Zou, C. Eibl, H.-U. Koop: The stem-loop region of the tobacco psbA 5′UTR is an important determinant of mRNA stability and translation efficiency. ''Mol. Genet. Genomics 2003'', ''269(3)'', str. 340–349.

MBT seminarji 2021

2021-03-24T08:34:33Z

Neza.pavko:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah:

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.) 
# An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.) 

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# (1.4.) 
# (1.4.) 
# Andrej Race (7.4.)
# Peter Škrinjar (7.4.)

'''Gensko spremenjene živali in celične linije''' 
# Urša Lovše (8.4.)
# Matija Ruparčič (8.4.)

'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti''' 
# Saša Slabe (14.4.)
# Luka Gnidovec (15.4.)
# Liza Ulčakar (15.4.)

'''Biotehnološki polimeri''' 
# Anže Karlek (21.4.)
# Ana Maklin (22.4.)
# Urban Hribar(22.4.)

'''Biotehnološko pridobljeni encimi''' 
# Urška Fajdiga (5.5.)
# Mirsad Mešić (6.5.)
# Martina Lokar (6.5.)

'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji''' 
# Jerneja Nimac (12.5.)
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)
# Klementina Polanec (13.5.)
# Ernestina Lavrih (13.5.)

'''Biomasa in biogoriva''' 
# Željka Erić (19.5.)
# Karin Dobravc Škof (20.5.)
# Katja Doberšek(20.5.)

'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija''' 
# Almina Tahirović (26.5.)
# Eva Keber (27.5.)
# Nina Lukančič (27.5.)

MBT seminarji 2021

2021-03-24T08:33:03Z

Neza.pavko:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah:

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.) 
# An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.) 

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# (1.4.) 
# (1.4.) 
# Andrej Race (7.4.)
# Peter Škrinjar (7.4.)

'''Gensko spremenjene živali in celične linije''' 
# Urša Lovše (8.4.)
# Matija Ruparčič (8.4.)

'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti''' 
# Saša Slabe (14.4.)
# Luka Gnidovec (15.4.)
# Liza Ulčakar (15.4.)

'''Biotehnološki polimeri''' 
# Anže Karlek (21.4.)
# Ana Maklin (22.4.)
# Urban Hribar(22.4.)

'''Biotehnološko pridobljeni encimi''' 
# Urška Fajdiga (5.5.)
# Mirsad Mešić (6.5.)
# Martina Lokar (6.5.)

'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji''' 
# Jerneja Nimac (12.5.)
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)
# Klementina Polanec (13.5.)
# Ernestina Lavrih (13.5.)

'''Biomasa in biogoriva''' 
# Željka Erić (19.5.)
# Karin Dobravc Škof (20.5.)
# Katja Doberšek(20.5.)

'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija''' 
# Almina Tahirović (26.5.)
# Eva Keber (27.5.)
# Nina Lukančič (27.5.)

V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih

2021-03-24T08:23:47Z

Neza.pavko: /* Zasnova in izvedba eksperimenta */

== Malarija ==

Malarijo prenašajo komarji rodu ''Anopheles'' spp. in je ena izmed resnejših nalezljivih bolezni, za katero po svetu letno zboli več kot 200 milijonov ljudi. Pri človeku okužbo povzročata patogena ''Plasmodium falciparum'' in ''Plasmodium vivax'' [1]. Za boj proti malariji je bilo identificiranih veliko kandidatov za cepiva, vendar pa razvoj le-tega predstavlja resen izziv, predvsem zaradi antigenske kompleksnosti, visoke stopnje polimorfizma med proteini patogena ter visoke cene proizvodnje. Ena izmed možnih in cenovno učinkovitih rešitev je proizvodnja cepiva proti malariji v rastlinah [2].

== Zasnova in izvedba eksperimenta ==

Namen eksperimenta je bil priprava rastlinskega cepiva proti malariji, sestavljenega iz epitopov AMA1 in MSP119 iz ''P. falciparium'' ter peptida GK1, ki služi kot adjuvant. Cepivo bi služilo kot dokaz koncepta za proizvodnjo varnih rekombinantnih cepiv v rastlinah. V ta namen so pripravili konstrukt z imenom Malchloroplast, za sočasno ekspresijo AMA1, MSP119 ter GK1. Bralne okvirje so optimizirali glede na rabo kodona v kloroplastih [3]. 766 bp dolg Malchloroplast konstrukt so vstavili v pBic plazmid, ki je bil oblikovan za integracijo tujih genov v ''Mun''I restrikcijsko mesto znotraj regije obrnjenih ponovitev kloroplastnega genoma [3], [4]. Plazmid je tako vseboval končni konstrukt, sestavljen iz regij za homologno rekombinacijo INSL ter INSR, ki obdajata Prrn promotor, Malchloroplast insert ter selekcijski marker ''aadA'' [3].

Plazmid so na delcih zlata z gensko pištolo vnesli v 3-5 tednov stare liste rastline ''Nicotiana tabacum''. S selekcijo so prišli do rastlin, ki vsebujejo transgen. To so potrdili s PCR reakcijo z ustreznimi začetnimi oligonukleotidi, ki se vežejo na zaporedje AMA1 in MSP119 znotraj regije Malchloroplast. Po cvetenju so uspešno transformiranim T0 rastlinam pobrali semena in jih prestavili na MS medij z dodanim spektinomicinom, da bi le-ta kalila, in tako dobili T1 rastline. Da bi dokazali homoplazmijo T1 rastlin, so izvedli PCR analizo z začetnimi oligonukleotidi, ki objemajo mesto insercije transgena v genomu kloroplasta [3].

Aktivno transkripcijo Malchloroplast transgena so dokazali s qRT-PCR. Ekspresijo ter velikost posameznih peptidov AMA1, MSK1 ter GK1 so dokazali z western prenosom, slednjega so tudi kvantificirali s HPLC. Z ELISA testom so nato analizirali še reaktivnost serumov pacientov okuženih s ''P. falciparium'' na Malchloroplast, imunogenost kandidatnega cepiva pa so proučili tudi z imunizacijo miši. Prisotnost ustreznih protiteles so nato dokazovali z ELISA testom [3].

== Rezultati ==

V eksperimentu so pripravili policistronski konstrukt za ekspresijo AMA1, MSP119 ter GK1, ki so ga z gensko pištolo prenesli v liste rastline ''Nicotiana tabacum''. Po selekciji uspešno transformiranih rastlin so pridobili 11 sadik izmed katerih so pri šestih s PCR analizo potrdili prisotnost transgena. Iz semen ene transplastomske rastline so se razvile štiri T1 rastline, ki jim je bila s PCR analizo na podlagi velikosti inserta v kloroplastih dokazana homoplazmija [3].

Pri analizi transkripcijske aktivnosti so ugotovili, da so željeni transkripti prisotni le pri transplastomskih rastlinah, medtem ko pri divjem tipu niso bili prisotni. Proteine vseh štirih T1 rastlin so analizirali z western prenosom, pri čemer so s protitelesi anti-AMA1 in anti-GK1 v listih transgenih rastlin dokazali ekspresijo rekombinantnih proteinov. Pri ELISA testu s serumi okuženih pacientov so dobili pozitivne antigenske reakcije v primerih uporabe ekstrakta z Malchloroplast-om, medtem ko pri divjem tipu tobaka pozitivnih reakcij ni bilo, s čimer so dokazali, da so v ekstraktu z Malchloroplast-om prisotne antigenske determinante [3].

Temu je sledila imunizacija BALB/c miši z rastlinskim ekstraktom ene izmed T1 rastlin. Dokazali so prisotnost protiteles proti AMA1, MSP1 in GK1, po zadnji dozi ekstrakta pa so opazili tudi močnejši odziv na ekstrakt transplastomske linije v primerjavi z ekstraktom rastlin divjega tipa [3].

== Zaključki ==

Z eksperimentom so dokazali možen koncept priprave cepiv z različnimi antigeni v kloroplastih tobaka. Komponente kandidatnega cepiva so reagirale s protitelesi v serumu z malarijo okuženih pacientov, prav tako pa so dokazali protitelesa proti AMA1, MSP1 in GK1 v imuniziranih miših. Glede na pridobljene rezultate bi ta pristop priprave cepiv lahko še bolje raziskali in potencialno razvili učinkovito oralno cepivo [3].

== Viri ==

1. M. A. Phillips, J. N. Burrows, C. Manyando, R. H. van Huijsduijnen, W. C. Van Voorhis, T. N. C. Wells: Malaria. ''Nat. Rev. Dis. Prim''. ''2017'', ''3(1)'', str. 17050.

2. K.-C. Kwon, D. Verma, N. D. Singh, R. Herzog, H. Daniell: Oral delivery of human biopharmaceuticals, autoantigens and vaccine antigens bioencapsulated in plant cells. ''Adv. Drug Deliv. Rev''. ''2013'', ''65(6)'', str. 782–799.

3. E. M. Milán-Noris, E. Monreal-Escalante, S. Rosales-Mendoza, R. E. Soria-Guerra, O. Radwan, J. A. Juvik, S. S. Korban: An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant-Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals. ''Mol. Biotechnol''. ''2020'', ''62(10)'', str. 534–545.

4. Z. Zou, C. Eibl, H.-U. Koop: The stem-loop region of the tobacco psbA 5′UTR is an important determinant of mRNA stability and translation efficiency. ''Mol. Genet. Genomics 2003'', ''269(3)'', str. 340–349.

V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih

2021-03-23T18:52:10Z

Neza.pavko:

== Malarija ==

Malarijo prenašajo komarji rodu ''Anopheles'' spp. in je ena izmed resnejših nalezljivih bolezni, za katero po svetu letno zboli več kot 200 milijonov ljudi. Pri človeku okužbo povzročata patogena ''Plasmodium falciparum'' in ''Plasmodium vivax'' [1]. Za boj proti malariji je bilo identificiranih veliko kandidatov za cepiva, vendar pa razvoj le-tega predstavlja resen izziv, predvsem zaradi antigenske kompleksnosti, visoke stopnje polimorfizma med proteini patogena ter visoke cene proizvodnje. Ena izmed možnih in cenovno učinkovitih rešitev je proizvodnja cepiva proti malariji v rastlinah [2].

== Zasnova in izvedba eksperimenta ==

Namen eksperimenta je bil priprava rastlinskega cepiva proti malariji, sestavljenega iz epitopov AMA1 in MSP119 iz ''P. falciparium'' ter peptida GK1, ki služi kot adjuvant. Cepivo bi služilo kot dokaz koncepta za proizvodnjo varnih rekombinantnih cepiv v rastlinah. V ta namen so pripravili konstrukt z imenom Malchloroplast, za sočasno ekspresijo AMA1, MSP119 ter GK1. Bralne okvirje so optimizirali glede na rabo kodona v kloroplastih [3]. 766 bp dolg Malchloroplast konstrukt so vstavili v pBic plazmid, ki je bil oblikovan za integracijo tujih genov v ''Mun''I restrikcijsko mesto znotraj regije obrnjenih ponovitev kloroplastnega genoma [3], [4]. Plazmid je tako vseboval končni konstrukt, sestavljen iz regij za homologno rekombinacijo INSL ter INSR, ki obdajata Prrn promotor, Malchloroplast insert ter selekcijski marker aadA [3].

Plazmid so na delcih zlata z gensko pištolo vnesli v 3-5 tednov stare liste rastline ''Nicotiana tabacum''. S selekcijo so prišli do rastlin, ki vsebujejo transgen. To so potrdili s PCR reakcijo z ustreznimi začetnimi oligonukleotidi, ki se vežejo na zaporedje AMA1 in MSP119 znotraj regije Malchloroplast. Po cvetenju so uspešno transformiranim T0 rastlinam pobrali semena in jih prestavili na MS medij z dodanim spektinomicinom, da bi le-ta kalila, in tako dobili T1 rastline. Da bi dokazali homoplazmijo T1 rastlin, so izvedli PCR analizo z začetnimi oligonukleotidi, ki objemajo mesto insercije transgena v genomu kloroplasta [3].

Aktivno transkripcijo Malchloroplast transgena so dokazali s qRT-PCR. Ekspresijo ter velikost posameznih peptidov AMA1, MSK1 ter GK1 so dokazali z western prenosom, slednjega so tudi kvantificirali s HPLC. Z ELISA testom so nato analizirali še reaktivnost serumov pacientov okuženih s ''P. falciparium'' na Malchloroplast, imunogenost kandidatnega cepiva pa so proučili tudi z imunizacijo miši. Prisotnost ustreznih protiteles so nato dokazovali z ELISA testom [3].

== Rezultati ==

V eksperimentu so pripravili policistronski konstrukt za ekspresijo AMA1, MSP119 ter GK1, ki so ga z gensko pištolo prenesli v liste rastline ''Nicotiana tabacum''. Po selekciji uspešno transformiranih rastlin so pridobili 11 sadik izmed katerih so pri šestih s PCR analizo potrdili prisotnost transgena. Iz semen ene transplastomske rastline so se razvile štiri T1 rastline, ki jim je bila s PCR analizo na podlagi velikosti inserta v kloroplastih dokazana homoplazmija [3].

Pri analizi transkripcijske aktivnosti so ugotovili, da so željeni transkripti prisotni le pri transplastomskih rastlinah, medtem ko pri divjem tipu niso bili prisotni. Proteine vseh štirih T1 rastlin so analizirali z western prenosom, pri čemer so s protitelesi anti-AMA1 in anti-GK1 v listih transgenih rastlin dokazali ekspresijo rekombinantnih proteinov. Pri ELISA testu s serumi okuženih pacientov so dobili pozitivne antigenske reakcije v primerih uporabe ekstrakta z Malchloroplast-om, medtem ko pri divjem tipu tobaka pozitivnih reakcij ni bilo, s čimer so dokazali, da so v ekstraktu z Malchloroplast-om prisotne antigenske determinante [3].

Temu je sledila imunizacija BALB/c miši z rastlinskim ekstraktom ene izmed T1 rastlin. Dokazali so prisotnost protiteles proti AMA1, MSP1 in GK1, po zadnji dozi ekstrakta pa so opazili tudi močnejši odziv na ekstrakt transplastomske linije v primerjavi z ekstraktom rastlin divjega tipa [3].

== Zaključki ==

Z eksperimentom so dokazali možen koncept priprave cepiv z različnimi antigeni v kloroplastih tobaka. Komponente kandidatnega cepiva so reagirale s protitelesi v serumu z malarijo okuženih pacientov, prav tako pa so dokazali protitelesa proti AMA1, MSP1 in GK1 v imuniziranih miših. Glede na pridobljene rezultate bi ta pristop priprave cepiv lahko še bolje raziskali in potencialno razvili učinkovito oralno cepivo [3].

== Viri ==

1. M. A. Phillips, J. N. Burrows, C. Manyando, R. H. van Huijsduijnen, W. C. Van Voorhis, T. N. C. Wells: Malaria. ''Nat. Rev. Dis. Prim''. ''2017'', ''3(1)'', str. 17050.

2. K.-C. Kwon, D. Verma, N. D. Singh, R. Herzog, H. Daniell: Oral delivery of human biopharmaceuticals, autoantigens and vaccine antigens bioencapsulated in plant cells. ''Adv. Drug Deliv. Rev''. ''2013'', ''65(6)'', str. 782–799.

3. E. M. Milán-Noris, E. Monreal-Escalante, S. Rosales-Mendoza, R. E. Soria-Guerra, O. Radwan, J. A. Juvik, S. S. Korban: An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant-Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals. ''Mol. Biotechnol''. ''2020'', ''62(10)'', str. 534–545.

4. Z. Zou, C. Eibl, H.-U. Koop: The stem-loop region of the tobacco psbA 5′UTR is an important determinant of mRNA stability and translation efficiency. ''Mol. Genet. Genomics 2003'', ''269(3)'', str. 340–349.

V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih

2021-03-23T18:51:35Z

Neza.pavko: /* Zasnova in izvedba eksperimenta */

== Malarija ==

Malarijo prenašajo komarji rodu ''Anopheles'' spp. in je ena izmed resnejših nalezljivih bolezni, za katero po svetu letno zboli več kot 200 milijonov ljudi. Pri človeku okužbo povzročata patogena ''Plasmodium falciparum'' in ''Plasmodium vivax'' [1]. Za boj proti malariji je bilo identificiranih veliko kandidatov za cepiva, vendar pa razvoj le-tega predstavlja resen izziv, predvsem zaradi antigenske kompleksnosti, visoke stopnje polimorfizma med proteini patogena ter visoke cene proizvodnje. Ena izmed možnih in cenovno učinkovitih rešitev je proizvodnja cepiva proti malariji v rastlinah [2].

== Zasnova in izvedba eksperimenta ==

Namen eksperimenta je bil priprava rastlinskega cepiva proti malariji, sestavljenega iz epitopov AMA1 in MSP119 iz ''P. falciparium'' ter peptida GK1, ki služi kot adjuvant. Cepivo bi služilo kot dokaz koncepta za proizvodnjo varnih rekombinantnih cepiv v rastlinah. V ta namen so pripravili konstrukt z imenom Malchloroplast, za sočasno ekspresijo AMA1, MSP119 ter GK1. Bralne okvirje so optimizirali glede na rabo kodona v kloroplastih [3]. 766 bp dolg Malchloroplast konstrukt so vstavili v pBic plazmid, ki je bil oblikovan za integracijo tujih genov v ''Mun''I restrikcijsko mesto znotraj regije obrnjenih ponovitev kloroplastnega genoma [3], [4]. Plazmid je tako vseboval končni konstrukt, sestavljen iz regij za homologno rekombinacijo INSL ter INSR, ki obdajata Prrn promotor, Malchloroplast insert ter selekcijski marker aadA [3].

Plazmid so na delcih zlata z gensko pištolo vnesli v 3-5 tednov stare liste rastline ''Nicotiana tabacum''. S selekcijo so prišli do rastlin, ki vsebujejo transgen. To so potrdili s PCR reakcijo z ustreznimi začetnimi oligonukleotidi, ki se vežejo na zaporedje AMA1 in MSP119 znotraj regije Malchloroplast. Po cvetenju so uspešno transformiranim T0 rastlinam pobrali semena in jih prestavili na MS medij z dodanim spektinomicinom, da bi le-ta kalila, in tako dobili T1 rastline. Da bi dokazali homoplazmijo T1 rastlin, so izvedli PCR analizo z začetnimi oligonukleotidi, ki objemajo mesto insercije transgena v genomu kloroplasta [3].

Aktivno transkripcijo Malchloroplast transgena so dokazali s qRT-PCR. Ekspresijo ter velikost posameznih peptidov AMA1, MSK1 ter GK1 so dokazali z western prenosom, slednjega so tudi kvantificirali s HPLC. Z ELISA testom so nato analizirali še reaktivnost serumov pacientov okuženih s ''P. falciparium'' na Malchloroplast, imunogenost kandidatnega cepiva pa so proučili tudi z imunizacijo miši. Prisotnost ustreznih protiteles so nato dokazovali z ELISA testom [3].

== Rezultati ==

V eksperimentu so pripravili policistronski konstrukt za ekspresijo AMA1, MSP119 ter GK1, ki so ga z gensko pištolo prenesli v liste rastline ''Nicotiana tabacum''. Po selekciji uspešno transformiranih rastlin so pridobili 11 sadik izmed katerih so pri šestih s PCR analizo potrdili prisotnost transgena. Iz semen ene transplastomske rastline so se razvile štiri T1 rastline, ki jim je bila s PCR analizo na podlagi velikosti inserta v kloroplastih dokazana homoplazmija [3].

Pri analizi transkripcijske aktivnosti so ugotovili, da so željeni transkripti prisotni le pri transplastomskih rastlinah, medtem ko pri divjem tipu niso bili prisotni. Proteine vseh štirih T1 rastlin so analizirali z western prenosom, pri čemer so s protitelesi anti-AMA1 in anti-GK1 v listih transgenih rastlin dokazali ekspresijo rekombinantnih proteinov. Pri ELISA testu s serumi okuženih pacientov so dobili pozitivne antigenske reakcije v primerih uporabe ekstrakta z Malchloroplast-om, medtem ko pri divjem tipu tobaka pozitivnih reakcij ni bilo, s čimer so dokazali, da so v ekstraktu z Malchloroplast-om prisotne antigenske determinante [3].

Temu je sledila imunizacija BALB/c miši z rastlinskim ekstraktom ene izmed T1 rastlin. Dokazali so prisotnost protiteles proti AMA1, MSP1 in GK1, po zadnji dozi ekstrakta pa so opazili tudi močnejši odziv na ekstrakt transplastomske linije v primerjavi z ekstraktom rastlin divjega tipa [3].

== Zaključki ==

Z eksperimentom so dokazali možen koncept priprave cepiv z različnimi antigeni v kloroplastih tobaka. Komponente kandidatnega cepiva so reagirale s protitelesi v serumu z malarijo okuženih pacientov, prav tako pa so dokazali protitelesa proti AMA1, MSP1 in GK1 v imuniziranih miših. Glede na pridobljene rezultate bi ta pristop priprave cepiv lahko še bolje raziskali in potencialno razvili učinkovito oralno cepivo [3].

== Viri ==

1. M. A. Phillips, J. N. Burrows, C. Manyando, R. H. van Huijsduijnen, W. C. Van Voorhis, T. N. C. Wells: Malaria. ''Nat. Rev. Dis. Prim''. ''2017'', ''3(1)'', str. 17050.

2. K.-C. Kwon, D. Verma, N. D. Singh, R. Herzog, H. Daniell: Oral delivery of human biopharmaceuticals, autoantigens and vaccine antigens bioencapsulated in plant cells. ''Adv. Drug Deliv. Rev''. ''2013'', ''65(6)'', str. 782–799.

3. E. M. Milán-Noris, E. Monreal-Escalante, S. Rosales-Mendoza, R. E. Soria-Guerra, O. Radwan, J. A. Juvik, S. S. Korban: An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant-Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals. ''Mol. Biotechnol''. ''2020'', ''62(10)'', str. 534–545.

4. Z. Zou, C. Eibl, H.-U. Koop: The stem-loop region of the tobacco psbA 5′UTR is an important determinant of mRNA stability and translation efficiency. ''Mol. Genet. Genomics 2003'', ''269(3)'', str. 340–349.

V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih

2021-03-23T17:39:15Z

Neza.pavko: New page: == Malarija == Malarijo prenašajo komarji rodu ''Anopheles'' spp. in je ena izmed resnejših nalezljivih bolezni, za katero po svetu letno zboli več kot 200 milijonov ljudi. Pri človek...

== Malarija ==

Malarijo prenašajo komarji rodu ''Anopheles'' spp. in je ena izmed resnejših nalezljivih bolezni, za katero po svetu letno zboli več kot 200 milijonov ljudi. Pri človeku okužbo povzročata patogena ''Plasmodium falciparum'' in ''Plasmodium vivax'' [1]. Za boj proti malariji je bilo identificiranih veliko kandidatov za cepiva, vendar pa razvoj le-tega predstavlja resen izziv, predvsem zaradi antigenske kompleksnosti, visoke stopnje polimorfizma med proteini patogena ter visoke cene proizvodnje. Ena izmed možnih in cenovno učinkovitih rešitev je proizvodnja cepiva proti malariji v rastlinah [2].

== Zasnova in izvedba eksperimenta ==

Namen eksperimenta je bil priprava rastlinskega cepiva proti malariji, sestavljenega iz epitopov AMA1 in MSP119 iz ''P. falciparium'' ter peptida GK1, ki služi kot adjuvant. Cepivo bi služilo kot dokaz koncepta za proizvodnjo varnih rekombinantnih cepiv v rastlinah. V ta namen so pripravili konstrukt z imenom Malchloroplast, za sočasno ekspresijo AMA1, MSP119 ter GK1. Bralne okvirje so optimizirali glede na rabo kodona v kloroplastih [3]. 766 bp dolg Malchloroplast konstrukt so vstavili v pBic plazmid, ki je bil oblikovan za integracijo tujih genov v MunI restrikcijsko mesto znotraj regije obrnjenih ponovitev kloroplastnega genoma [3], [4]. Plazmid je tako vseboval končni konstrukt, sestavljen iz regij za homologno rekombinacijo INSL ter INSR, ki obdajata Prrn promotor, Malchloroplast insert ter selekcijski marker aadA [3].

Plazmid so na delcih zlata z gensko pištolo vnesli v 3-5 tednov stare liste rastline ''Nicotiana tabacum''. S selekcijo so prišli do rastlin, ki vsebujejo transgen. To so potrdili s PCR reakcijo z ustreznimi začetnimi oligonukleotidi, ki se vežejo na zaporedje AMA1 in MSP119 znotraj regije Malchloroplast. Po cvetenju so uspešno transformiranim T0 rastlinam pobrali semena in jih prestavili na MS medij z dodanim spektinomicinom, da bi le-ta kalila, in tako dobili T1 rastline. Da bi dokazali homoplazmijo T1 rastlin, so izvedli PCR analizo z začetnimi oligonukleotidi, ki objemajo mesto insercije transgena v genomu kloroplasta [3].

Aktivno transkripcijo Malchloroplast transgena so dokazali s qRT-PCR. Ekspresijo ter velikost posameznih peptidov AMA1, MSK1 ter GK1 so dokazali z western prenosom, slednjega so tudi kvantificirali s HPLC. Z ELISA testom so nato analizirali še reaktivnost serumov pacientov okuženih s ''P. falciparium'' na Malchloroplast, imunogenost kandidatnega cepiva pa so proučili tudi z imunizacijo miši. Prisotnost ustreznih protiteles so nato dokazovali z ELISA testom [3].

== Rezultati ==

V eksperimentu so pripravili policistronski konstrukt za ekspresijo AMA1, MSP119 ter GK1, ki so ga z gensko pištolo prenesli v liste rastline ''Nicotiana tabacum''. Po selekciji uspešno transformiranih rastlin so pridobili 11 sadik izmed katerih so pri šestih s PCR analizo potrdili prisotnost transgena. Iz semen ene transplastomske rastline so se razvile štiri T1 rastline, ki jim je bila s PCR analizo na podlagi velikosti inserta v kloroplastih dokazana homoplazmija [3].

Pri analizi transkripcijske aktivnosti so ugotovili, da so željeni transkripti prisotni le pri transplastomskih rastlinah, medtem ko pri divjem tipu niso bili prisotni. Proteine vseh štirih T1 rastlin so analizirali z western prenosom, pri čemer so s protitelesi anti-AMA1 in anti-GK1 v listih transgenih rastlin dokazali ekspresijo rekombinantnih proteinov. Pri ELISA testu s serumi okuženih pacientov so dobili pozitivne antigenske reakcije v primerih uporabe ekstrakta z Malchloroplast-om, medtem ko pri divjem tipu tobaka pozitivnih reakcij ni bilo, s čimer so dokazali, da so v ekstraktu z Malchloroplast-om prisotne antigenske determinante [3].

Temu je sledila imunizacija BALB/c miši z rastlinskim ekstraktom ene izmed T1 rastlin. Dokazali so prisotnost protiteles proti AMA1, MSP1 in GK1, po zadnji dozi ekstrakta pa so opazili tudi močnejši odziv na ekstrakt transplastomske linije v primerjavi z ekstraktom rastlin divjega tipa [3].

== Zaključki ==

Z eksperimentom so dokazali možen koncept priprave cepiv z različnimi antigeni v kloroplastih tobaka. Komponente kandidatnega cepiva so reagirale s protitelesi v serumu z malarijo okuženih pacientov, prav tako pa so dokazali protitelesa proti AMA1, MSP1 in GK1 v imuniziranih miših. Glede na pridobljene rezultate bi ta pristop priprave cepiv lahko še bolje raziskali in potencialno razvili učinkovito oralno cepivo [3].

== Viri ==

1. M. A. Phillips, J. N. Burrows, C. Manyando, R. H. van Huijsduijnen, W. C. Van Voorhis, T. N. C. Wells: Malaria. ''Nat. Rev. Dis. Prim''. ''2017'', ''3(1)'', str. 17050.

2. K.-C. Kwon, D. Verma, N. D. Singh, R. Herzog, H. Daniell: Oral delivery of human biopharmaceuticals, autoantigens and vaccine antigens bioencapsulated in plant cells. ''Adv. Drug Deliv. Rev''. ''2013'', ''65(6)'', str. 782–799.

3. E. M. Milán-Noris, E. Monreal-Escalante, S. Rosales-Mendoza, R. E. Soria-Guerra, O. Radwan, J. A. Juvik, S. S. Korban: An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant-Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals. ''Mol. Biotechnol''. ''2020'', ''62(10)'', str. 534–545.

4. Z. Zou, C. Eibl, H.-U. Koop: The stem-loop region of the tobacco psbA 5′UTR is an important determinant of mRNA stability and translation efficiency. ''Mol. Genet. Genomics 2003'', ''269(3)'', str. 340–349.

MBT seminarji 2021

2021-03-23T17:13:03Z

Neza.pavko:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah:

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.) 
# An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.) 

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# (1.4.) 
# (1.4.) 
# Andrej Race (7.4.)
# Peter Škrinjar (7.4.)

'''Gensko spremenjene živali in celične linije''' 
# Urša Lovše (8.4.)
# Matija Ruparčič (8.4.)

'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti''' 
# Saša Slabe (14.4.)
# Luka Gnidovec (15.4.)
# Liza Ulčakar (15.4.)

'''Biotehnološki polimeri''' 
# Anže Karlek (21.4.)
# Ana Maklin (22.4.)
# Urban Hribar(22.4.)

'''Biotehnološko pridobljeni encimi''' 
# Urška Fajdiga (5.5.)
# Mirsad Mešić (6.5.)
# Martina Lokar (6.5.)

'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji''' 
# Jerneja Nimac (12.5.)
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)
# Klementina Polanec (13.5.)
# Ernestina Lavrih (13.5.)

'''Biomasa in biogoriva''' 
# Željka Erić (19.5.)
# Karin Dobravc Škof (20.5.)
# Katja Doberšek(20.5.)

'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija''' 
# Almina Tahirović (26.5.)
# Eva Keber (27.5.)
# Nina Lukančič (27.5.)

MBT seminarji 2021

2021-03-23T17:12:15Z

Neza.pavko:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah:

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.) 
# An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih.]] Neža Pavko (25.3.) 

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# (1.4.) 
# (1.4.) 
# Andrej Race (7.4.)
# Peter Škrinjar (7.4.)

'''Gensko spremenjene živali in celične linije''' 
# Urša Lovše (8.4.)
# Matija Ruparčič (8.4.)

'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti''' 
# Saša Slabe (14.4.)
# Luka Gnidovec (15.4.)
# Liza Ulčakar (15.4.)

'''Biotehnološki polimeri''' 
# Anže Karlek (21.4.)
# Ana Maklin (22.4.)
# Urban Hribar(22.4.)

'''Biotehnološko pridobljeni encimi''' 
# Urška Fajdiga (5.5.)
# Mirsad Mešić (6.5.)
# Martina Lokar (6.5.)

'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji''' 
# Jerneja Nimac (12.5.)
# Urška Pečarič Strnad (12.5.)
# Klementina Polanec (13.5.)
# Ernestina Lavrih (13.5.)

'''Biomasa in biogoriva''' 
# Željka Erić (19.5.)
# Karin Dobravc Škof (20.5.)
# Katja Doberšek(20.5.)

'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija''' 
# Almina Tahirović (26.5.)
# Eva Keber (27.5.)
# Nina Lukančič (27.5.)

BNT-seminar

2021-03-09T12:00:50Z

Neza.pavko: /* Seznam seminarjev */

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019058 
30200303 
30019363 
30019057 
30170131 
30170078 
30170177 
30200324 
30019063 
30170103 
30170002 
30200319 
30200309 
30200320 
30019056 
30200311 
30200306 
30170243 
30019051 
30170141 
30170061 
30019035 
30200316 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
16.3.2021 
23.3.2021 
23.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
13.4.2021 
13.4.2021 
20.4.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
23.3.2021 
20.4.2020 
6.4.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
11.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Aljaž Bratina 
Urban Hribar 
Sabina Sladič Oblak 
Barbara Slapnik 
Tina Kolenc Milavec 
Klementina Polanec 
Martin Špendl 
Tjaša Mlakar 
Sara Laznik 
Martina Lokar 
Doroteja Armič 
Martin Špendl 
Saša Slabe 
Mateja Žvipelj 
Špela Supej 
Urška Fajdiga 
Ernestina Lavrih 
Nika Mikulič Vernik 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Tadej Medved 
Urška Zagorc 
Nina Lukančič 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Urška Zagorc 
Liza Ulčakar 
Urša Štrancar 
Sara Laznik 
Luka Gnidovec 
Irma Zeljković 
Jernej Imperl 
Barbara Slapnik 
Urša Lovše 
Mateja Žvipelj 
Neža Pavko 
Almina Tahirović 
Nika Mikulič Vernik 
Urška Fajdiga 
Saša Slabe 
Klementina Polanec 
Tjaša Mlakar 
Ajda Godec 
Jernej Imperl 
Špela Supej 
Aljaž Bratina 
Nina Lukančič 
Matija Ruparčič 
|-

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.