Wiki FKKT - User contributions [en]

Označevanje bioloških celic za zanesljivo celično inženirstvo

2022-05-02T19:17:34Z

Nezablaznik: New page: Izhodni članek: [https://www.nature.com/articles/s41467-022-28350-4 J. Tellechea-luzardo, L. Hobbs, E. Velázquez, S. Woods, V. De Lorenzo, N. Krasnogor: Versioning biological cells for t...

Izhodni članek: [https://www.nature.com/articles/s41467-022-28350-4 J. Tellechea-luzardo, L. Hobbs, E. Velázquez, S. Woods, V. De Lorenzo, N. Krasnogor: Versioning biological cells for trustworthy cell engineering. str. 1–12]

==Uvod==

V današnjem svetu v znanosti prihaja do znatnih napredkov na področju urejanja genoma ter na področju integracije informatike v samo raziskovalno delo. Področje biološkega inženirstva tako na podlagi novih in cenejših tehnik odpira vrata mnogim novim produktom na področju ved o življenju. Razvoj pa je trenutno nekoliko omejen z obdelavo podatkov, ki nastajajo med samimi inženirskimi procesi. Tekom enega samega projekta nove podatke predstavljajo laboratorijski dnevniki, protokoli, preglednice, uporabljeni sevi in njihove modifikacije, uporabljeni oligonukleotidi itd., kar vodi v nastanek terabajtov novih podatkov. Ob zaključku nekega projekta ali raziskave je javnosti predstavljen le končni produkt z omejenim naborom podatkov, ki so predstavljeni v člankih. Zaradi omejene dostopnosti podatkov lahko v prihodnosti prihaja do težav s ponovljivostjo rezultatov, večkrat pa se je tudi že zgodilo, da so bile naknadno morda odkrite kakšne napake, ki so potem vodile do umika znanstvenih člankov. Taki incidenti so neželeni s strani znanstvenih revij in znanstvenikov, hkrati pa se ob takih dogodkih zamaje tudi zaupanje javnosti v znanstvene raziskave.

Tellecha-Luzardo in sodelavci so k temu problemu pristopili z razvojem sistema za nadzor različic (ang. ''version control system''). Novo razviti sistem so poimenovali CellRepo. Sistem obstaja v oblaku in združuje nadzor različic za sledenje podatkov o uporabljenih organizmih ter protokole za uvedbo črtnih kod v bioloških podatkih. Na ta način so biološki vzorci povezani z digitalnimi podatki, ki so shranjeni v oblaku, njihova dostopnost pa je določena s strani uporabnika [1].

===Sistemi za nadzor različic===

Ustaljena praksa na področju razvoja nove programske opreme. Gre za programsko opremo za sledenje vsake novo ustvarjene spremembe kode (ang. ''commit''), ki jo posamezni programerji napravijo na svojem računalniku. Vsaka sprememba predstavlja stanje datotek ob določenem času, skupaj z avtorjem, opisom in podatkih o predhodnih spremembah. Predstavlja osnovno enoto nadzora različic. Vse zabeležene spremembe se hranijo v repozitoriju. Poleg tega sistem za nadzor različic lahko omogoča tudi sodelovanje programerjev iz različnih koncev sveta. Celotna skupina lahko dostopa in ureja izvorno kodo. Skupna koda se tako posodablja, brez da bi posamezniki ločeno shranjevali in urejali svoje verzije kode, kar bi lahko vodilo do ponavljanja kode ali do izbrisa določenih segmentov. Sistem omogoča tudi sledljivost, saj beleži kdo in kdaj je napravil kakšno spremembo [2, 3].

===Črtne kode DNA===

Črtna koda DNA je krajše nukleotidno zaporedje v genomu, ki je unikatno za določeno vrsto ali sev organizma. Črtne kode se uporabljajo predvsem v taksonomiji kot pomoč pri identifikaciji in klasifikaciji organizmov. Iz organizma najprej izolirajo DNA, s PCR pomnožijo regijo črtne kode, vstavijo v vektor ter ji nato določijo nukleotidno zaporedje. Dobljeno zaporedje nato vnesejo v bazo podatkov in določijo vrsto organizma, kateri pripada izolirana koda [4, 5].

Uporaba črtnih kod DNA v sintezni biologiji omogoča označevanje šasij, kar pripomore k sledljivosti. Hkrati svoje mesto najdejo tudi pri identifikaciji gensko spremenjenih organizmov, ki se znajdejo izven laboratorijev. V primeru, da pride do neželene kontaminacije okolja s sevom, ki je označen s črtno kodo, lahko sev hitro identificirajo ter dostopajo do z njim povezane dokumentacije o stopnji tveganja [1].

==Rezultati==

===CellRepo===

Novo postavljen sistem za nadzor različic, ki je zgrajen na osnovi moderne programske opreme za spletne aplikacije. Namenjen je sledenju in organizaciji digitalnih podatkov, ki nastajajo med biološkim inženiringom ter povezovanju teh podatkov z biološkimi vzorci. V osnovi ima CellRepo dve ključni funkciji:

1. '''Zbiranje podatkov o sevih tekom eksperimentov oziroma projektov:''' Med inženirskim procesom lahko sodelujoči vpisujejo podatke o genotipu, fenotipu, avtorjih, protokolih, rezultatih kot spremembe. Ob trenutku pomembnejših sprememb se lahko generira črtna koda DNA, s katero se označi izbrani sev

2. '''Povezovanje vzorcev s spremembami prek črtnih kod DNA:''' Z identifikacijo črtne kode DNA v sevu lahko s CellRepo dobijo vpogled v trenutek, ko je črtna koda DNA nastala. S tem dobijo tudi vse pripadajoče informacije o identificiranem sevu.

CellRepo je namenjen tako individualni rabi kot uporabi znotraj neke večje skupine raziskovalcev. Uporabnik se mora najprej registrirati in navesti nekaj osebnih podatkov. Ob registraciji se uporabniku odpre domača stran, ki vsebuje vse kar uporabnik potrebuje za gradnjo repozitorija sevov, na katerih poteka njegovo eksperimentalno delo. Svoj repozitorij lahko deli s svojo raziskovalno skupino ali s splošno javnostjo. To torej pomeni, da uporabnik lahko dostopa tudi do določenih drugih repozitorijev v katerih ni vključen, vendar so javno dostopni. S tem želijo znanost narediti bolj transparentno in dostopno tudi za javnost [1].

Ko uporabnik želi ustvariti nov repozitorij, mora najprej izbrati vrsto uporabljenega organizma. Tako lahko začne z vnosom sprememb v osnovni veji repozitorija. V primeru različnih dodatnih eksperimentov znotraj izvornega projekta lahko uporabnik repozitorij razveja v več vej ali podskupin. Uporabniki z dostopom do repozitorija lahko vanj vnašajo spremembe s katerimi označijo sev ob določenem času. Obsežnost vnešene spremembe je prepuščena uporabnikom – lahko vnašajo nukleotidna zaporedja, slike gelov po elektroforezi, rezultate bioinformatskih analiz ali protokole, ki so jih uporabili pri delu. CellRepo uporabnikom omogoča tudi, da določene spremembe zabeležijo kot prelomne. V takih primerih sam sistem lahko generira črtno kodo DNA, katera se potem lahko sintetizira in vstavi v genom seva. S tem je sev nedvoumno označen, črtna koda DNA pa omogoča povezavo do spremembe, pri kateri je koda nastala [1].

Za demonstracijo uporabe CellRepo so Tellecha-Luzardo in sodelavci pokazali kako platforma deluje pri uporabi šestih različnih sevov bakterij in gliv. Uporabili so organizme ''Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces albidoflavus, Pseudomonas putida, Saccharomyces cerevisiae'' in ''Komagataella phaffi'' [1].

===Vnos črtnih kod DNA===

Vnos črtnih kod DNA so testirali na vseh šestih izbranih organizmih. Pri vsakem sevu so uporabili do tri različne metode za vnos črtne kode DNA. Po vnosu so preverili še morebiten vpliv vnosa črtnih kod na posamezne organizme. Spremljali so rast in pojavnost mutacij v izbranih organizmih po vnosu črtne kode DNA ob različnih rastnih pogojih. V splošnem so ugotovili, da ima vnos črtne kode DNA zelo malo ali nič vpliva na rast izbranih vrst organizmov. Za določitev stopnje pojavnosti mutacij so sekvencirali celotne genome organizmov po vnosu črtne kode in primerjali z organizmi divjega tipa. Ugotovili so, da je pri vseh organizmih stopnja mutacij po vnosu črtne kode DNA zelo nizka. Identificirali so sicer posamezne točkovne mutacije, ki pa se v več replikah niso ponavljale na istih mestih. Iz teh rezultatov so sklepali, da so bile točkovne mutacije verjetno posledica več rastnih ciklov v različnih gojiščih in ne direktna posledica vnosa črtne kode DNA. Zaradi razlik pojavnosti mutacij med posameznimi metodami vnosa črtne kode DNA, uporabnik lahko ob generaciji črtne kode DNA v CellRepo izbere metodo vnosa črtne kode DNA glede na ocenjeno uspešnost metod pri vsakem sevu [1].

Preverili so tudi stabilnost črtne kode DNA v daljšem časovnem obdobju stacionarne faze rasti. S tem so želeli preveriti stabilnost v pogojih, ki se pojavljajo v laboratorijih ali večjih industrijskih procesih. Po pomnoževanju izbranih regij s PCR in sekvenciranju po Sangerjevi metodi so potrdili prisotnost črtnih kod tudi po daljši inkubaciji pri različnih eksperimentalnih pogojih [1].

==Zaključek==

Z razvojem programa CellRepo so želeli v znanost o vedah o življenju implementirati načine dela iz sveta programiranja. Z uporabo takih sistemov za nadzor različic bi se lahko povečale sledljivost, ponovljivost, sodelovanje, transparentnost in ekonomičnost v znanosti. Sledljivost bi bila zagotovljena z uporabo črtnih kod DNA. Prek črtnih kod DNA bi lahko dostopali do sprememb zabeleženih v repozitorijih. Ti repozitoriji bi hranili vse podatke v zvezi s posameznimi projekti, kar olajša tudi ponovljivost eksperimentov in sodelovanje znotraj raziskovalnih skupin. Podatki v repozitorijih bi posamezne projekte ali raziskave naredili tudi bolj transparentne, kar bi olajšalo identifikacijo in popravljanje napak ter hkrati pripomoglo k povečanju zaupanja javnosti v znanstveno delo [1].

==Literatura==

[1] J. Tellechea-luzardo, L. Hobbs, E. Velázquez, S. Woods, V. De Lorenzo, N. Krasnogor: Versioning biological cells for trustworthy cell engineering. str. 1–12.

[2] N. N. Zolkifli, A. Ngah, A. Deraman: ScienceDirect ScienceDirect Version Control System : A Review Version Control System : A Review. Procedia Comput. Sci. 2018, 135, str. 408–415.

[3] Nadzor različic — Uvod v programiranje http://matija.pretnar.info/uvod-v-programiranje/10-nadzor-razlicic.html (pridobljeno 29. 4. 2022).

[4] R. S. Purty, S. Chatterjee: DNA Barcoding : An Effective Technique in Molecular Taxonomy. 2016.

[5] Z. Kowalska, F. Pniewski, A. Latała: Ecohydrology & Hydrobiology DNA barcoding – A new device in phycologist ’ s toolbox. Integr. Med. Res. 2019, 19(3), str. 417–427.

Seminarji SB 2021/22

2022-05-02T19:07:41Z

Nezablaznik:

V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_E._coli Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inžiniring_in_izkoriščanje_sintetične_alosterije_luciferaze_NanoLuc Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc] (Rebeka Dajčman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularen_RNA_interferenčni_sistem_za_regulacijo_multipleksnih_genov Modularen RNA interferenčni sistem za regulacijo multipleksnih genov] (Marko Pavleković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Označevanje_bioloških_celic_za_zanesljivo_celično_inženirstvo Označevanje bioloških celic za zanesljivo celično inženirstvo] (Neža Blaznik)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Openplast OpenPlast - kloroplastni brezcelični sistemi za hitrejšo karakterizacijo genetskih delov] (Kim Glavič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana PHEAST - ''P. pastoris'' za odstranjevanje metana] (Ana Potočnik) 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Seminarji SB 2021/22

2022-05-02T19:06:28Z

Nezablaznik:

V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_E._coli Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inžiniring_in_izkoriščanje_sintetične_alosterije_luciferaze_NanoLuc Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc] (Rebeka Dajčman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularen_RNA_interferenčni_sistem_za_regulacijo_multipleksnih_genov Modularen RNA interferenčni sistem za regulacijo multipleksnih genov] (Marko Pavleković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Označevanje_biolođkih_celic_za_zanesljivo_celično_inženirstvo Označevanje bioloških celic za zanesljivo celično inženirstvo] (Neža Blaznik)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Openplast OpenPlast - kloroplastni brezcelični sistemi za hitrejšo karakterizacijo genetskih delov] (Kim Glavič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana PHEAST - ''P. pastoris'' za odstranjevanje metana] (Ana Potočnik) 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-04-22T13:14:59Z

Nezablaznik: /* Zaključek */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem nezadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog, da kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto ter slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Problem prenosa imunogenih molekul do rastlin so rešili z uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in N-končni del elongacijskega faktorja Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo ''E. coli tolB'', za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev ''E.coli'' BL21 ''omp8'', pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da ne bodo v celoti sintetizirali plazmida, ampak bodo sintetizirali posamezne fragmente, ki jih bodo kasneje ligirali z uporabo sistema Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Vse skupaj so ligirali po sistemu Golden Gate. Prednost takega načina izgradnje je, da bi lahko enostavno zamenjali zapis za PAMP-e ali membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:

• inducibilni promotor pBAD (BBa_I0500)

• srednje močan RBS

• zapis za ClyA (BBa_K811000)

• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)

• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)

• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)

• zapis za flg22 (BBa_K3286138)

• zapis za elf18 (BBa_K3989023)

• dvojni terminator (BBa_B0010)

Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji ''E. coli tolB'' je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:

a) če vezikli, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in

b) če vezikli z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).

Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E''. coli'' BL21 ''omp8'', ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline ''Arabidopsis thaliana'', za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA. Ta imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1,7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi ''Arabidopsis thaliana''. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. nekih signalnih molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano. Zaradi večje stabilnosti taka bakterija proizvaja manj veziklov zunanje membrane. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena bi se tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi izbitega gena. V prisotnosti AHL bi molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati bi z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bi sprožilo izražanje proteaze, ki bi cepila že prisoten tolB. Koncentracija proteina tolB bi se posledično znižala in začela bi se hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, kar pomeni uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razvoj neke alternative, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Najprej so uspešno induciranje imunskega odgovora potrdili s preprostimi testi v laboratoriju, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. Za lažje delo skupin, ki bi raziskovale to področje, so naredili tudi obsežno statistično analizo rezultatov. V anketah so dobili pozitivno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-04-22T13:14:04Z

Nezablaznik: /* Gensko modificirane bakterije */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem nezadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog, da kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto ter slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Problem prenosa imunogenih molekul do rastlin so rešili z uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in N-končni del elongacijskega faktorja Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo ''E. coli tolB'', za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev ''E.coli'' BL21 ''omp8'', pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da ne bodo v celoti sintetizirali plazmida, ampak bodo sintetizirali posamezne fragmente, ki jih bodo kasneje ligirali z uporabo sistema Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Vse skupaj so ligirali po sistemu Golden Gate. Prednost takega načina izgradnje je, da bi lahko enostavno zamenjali zapis za PAMP-e ali membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:

• inducibilni promotor pBAD (BBa_I0500)

• srednje močan RBS

• zapis za ClyA (BBa_K811000)

• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)

• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)

• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)

• zapis za flg22 (BBa_K3286138)

• zapis za elf18 (BBa_K3989023)

• dvojni terminator (BBa_B0010)

Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji ''E. coli tolB'' je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:

a) če vezikli, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in

b) če vezikli z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).

Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E''. coli'' BL21 ''omp8'', ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline ''Arabidopsis thaliana'', za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA. Ta imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1,7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi ''Arabidopsis thaliana''. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. nekih signalnih molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano. Zaradi večje stabilnosti taka bakterija proizvaja manj veziklov zunanje membrane. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena bi se tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi izbitega gena. V prisotnosti AHL bi molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati bi z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bi sprožilo izražanje proteaze, ki bi cepila že prisoten tolB. Koncentracija proteina tolB bi se posledično znižala in začela bi se hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, kar pomeni uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razvoj neke alternative, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Najprej so uspešno induciranje imunskega odgovora potrdili s preprostimi testi v laboratoriju, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. Za lažje delo skupin, ki bi raziskovale to področje so naredili tudi obsežno statistično analizo rezultatov. V anketah so dobili tudi pozitivno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-04-22T12:47:33Z

Nezablaznik: /* Gensko modificirane bakterije */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem nezadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog, da kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto ter slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Problem prenosa imunogenih molekul do rastlin so rešili z uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in N-končni del elongacijskega faktorja Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo ''E. coli tolB'', za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev ''E.coli'' BL21 ''omp8'', pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da ne bodo v celoti sintetizirali plazmida, ampak bodo sintetizirali posamezne fragmente, ki jih bodo kasneje ligirali z uporabo sistema Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Vse skupaj so ligirali po sistemu Golden Gate. Prednost takega načina izgradnje je, da bi lahko enostavno zamenjali zapis za PAMP-e ali membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:

• inducibilni promotor pBAD (BBa_I0500)

• srednje močan RBS

• zapis za ClyA (BBa_K811000)

• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)

• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)

• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)

• zapis za flg22 (BBa_K3286138)

• zapis za elf18 (BBa_K3989023)

• dvojni terminator (BBa_B0010)

Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji ''E. coli tolB'' je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:

a) če vezikli, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in

b) če vezikli z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).

Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E''. coli'' BL21 ''omp8'', ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline ''Arabidopsis thaliana'', za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA. Ta imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1,7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi ''Arabidopsis thaliana''. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. nekih signalnih molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano. Zaradi večje stabilnosti taka bakterija proizvaja manj veziklov zunanje membrane. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena bi se tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, kar pomeni uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razvoj neke alternative, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Najprej so uspešno induciranje imunskega odgovora potrdili s preprostimi testi v laboratoriju, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. Za lažje delo skupin, ki bi raziskovale to področje so naredili tudi obsežno statistično analizo rezultatov. V anketah so dobili tudi pozitivno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-04-22T12:43:51Z

Nezablaznik: /* Test inhibicije rasti semen (SGI) */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem nezadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog, da kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto ter slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Problem prenosa imunogenih molekul do rastlin so rešili z uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in N-končni del elongacijskega faktorja Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo ''E. coli tolB'', za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev ''E.coli'' BL21 ''omp8'', pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da ne bodo v celoti sintetizirali plazmida, ampak bodo sintetizirali posamezne fragmente, ki jih bodo kasneje ligirali z uporabo sistema Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Vse skupaj so ligirali po sistemu Golden Gate. Prednost takega načina izgradnje je, da bi lahko enostavno zamenjali zapis za PAMP-e ali membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:

• inducibilni promotor pBAD (BBa_I0500)

• srednje močan RBS

• zapis za ClyA (BBa_K811000)

• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)

• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)

• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)

• zapis za flg22 (BBa_K3286138)

• zapis za elf18 (BBa_K3989023)

• dvojni terminator (BBa_B0010)

Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji ''E. coli tolB'' je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:

a) če vezikli, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in

b) če vezikli z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).

Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E''. coli'' BL21 ''omp8'', ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline ''Arabidopsis thaliana'', za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA. Ta imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1,7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi ''Arabidopsis thaliana''. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. nekih signalnih molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano. Zaradi večje stabilnosti taka bakterija proizvaja manj veziklov zunanje membrane. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, kar pomeni uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razvoj neke alternative, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Najprej so uspešno induciranje imunskega odgovora potrdili s preprostimi testi v laboratoriju, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. Za lažje delo skupin, ki bi raziskovale to področje so naredili tudi obsežno statistično analizo rezultatov. V anketah so dobili tudi pozitivno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-04-22T12:42:59Z

Nezablaznik: /* Test inhibicije rasti semen (SGI) */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem nezadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog, da kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto ter slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Problem prenosa imunogenih molekul do rastlin so rešili z uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in N-končni del elongacijskega faktorja Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo ''E. coli tolB'', za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev ''E.coli'' BL21 ''omp8'', pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da ne bodo v celoti sintetizirali plazmida, ampak bodo sintetizirali posamezne fragmente, ki jih bodo kasneje ligirali z uporabo sistema Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Vse skupaj so ligirali po sistemu Golden Gate. Prednost takega načina izgradnje je, da bi lahko enostavno zamenjali zapis za PAMP-e ali membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:

• inducibilni promotor pBAD (BBa_I0500)

• srednje močan RBS

• zapis za ClyA (BBa_K811000)

• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)

• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)

• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)

• zapis za flg22 (BBa_K3286138)

• zapis za elf18 (BBa_K3989023)

• dvojni terminator (BBa_B0010)

Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji ''E. coli tolB'' je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:

a) če vezikli, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in

b) če vezikli z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).

Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E''. coli'' BL21 ''omp8'', ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline ''Arabidopsis thaliana'', za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1,7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi ''Arabidopsis thaliana''. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. nekih signalnih molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano. Zaradi večje stabilnosti taka bakterija proizvaja manj veziklov zunanje membrane. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, kar pomeni uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razvoj neke alternative, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Najprej so uspešno induciranje imunskega odgovora potrdili s preprostimi testi v laboratoriju, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. Za lažje delo skupin, ki bi raziskovale to področje so naredili tudi obsežno statistično analizo rezultatov. V anketah so dobili tudi pozitivno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-04-22T12:41:38Z

Nezablaznik: /* Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem nezadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog, da kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto ter slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Problem prenosa imunogenih molekul do rastlin so rešili z uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in N-končni del elongacijskega faktorja Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo ''E. coli tolB'', za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev ''E.coli'' BL21 ''omp8'', pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da ne bodo v celoti sintetizirali plazmida, ampak bodo sintetizirali posamezne fragmente, ki jih bodo kasneje ligirali z uporabo sistema Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Vse skupaj so ligirali po sistemu Golden Gate. Prednost takega načina izgradnje je, da bi lahko enostavno zamenjali zapis za PAMP-e ali membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:

• inducibilni promotor pBAD (BBa_I0500)

• srednje močan RBS

• zapis za ClyA (BBa_K811000)

• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)

• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)

• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)

• zapis za flg22 (BBa_K3286138)

• zapis za elf18 (BBa_K3989023)

• dvojni terminator (BBa_B0010)

Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji ''E. coli tolB'' je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:

a) če vezikli, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in

b) če vezikli z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).

Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E''. coli'' BL21 ''omp8'', ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline ''Arabidopsis thaliana'', za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi ''Arabidopsis thaliana''. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. nekih signalnih molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano. Zaradi večje stabilnosti taka bakterija proizvaja manj veziklov zunanje membrane. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, kar pomeni uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razvoj neke alternative, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Najprej so uspešno induciranje imunskega odgovora potrdili s preprostimi testi v laboratoriju, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. Za lažje delo skupin, ki bi raziskovale to področje so naredili tudi obsežno statistično analizo rezultatov. V anketah so dobili tudi pozitivno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-04-22T12:41:26Z

Nezablaznik: /* Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem nezadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog, da kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto ter slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Problem prenosa imunogenih molekul do rastlin so rešili z uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in N-končni del elongacijskega faktorja Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo ''E. coli tolB'', za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev ''E.coli'' BL21 ''omp8'', pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da ne bodo v celoti sintetizirali plazmida, ampak bodo sintetizirali posamezne fragmente, ki jih bodo kasneje ligirali z uporabo sistema Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Vse skupaj so ligirali po sistemu Golden Gate. Prednost takega načina izgradnje je, da bi lahko enostavno zamenjali zapis za PAMP-e ali membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:

• inducibilni promotor pBAD (BBa_I0500)

• srednje močan RBS

• zapis za ClyA (BBa_K811000)

• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)

• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)

• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)

• zapis za flg22 (BBa_K3286138)

• zapis za elf18 (BBa_K3989023)

• dvojni terminator (BBa_B0010)

Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji ''E. coli tolB'' je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:

a) če vezikli, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in

b) če vezikli z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E''. coli'' BL21 ''omp8'', ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline ''Arabidopsis thaliana'', za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi ''Arabidopsis thaliana''. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. nekih signalnih molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano. Zaradi večje stabilnosti taka bakterija proizvaja manj veziklov zunanje membrane. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, kar pomeni uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razvoj neke alternative, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Najprej so uspešno induciranje imunskega odgovora potrdili s preprostimi testi v laboratoriju, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. Za lažje delo skupin, ki bi raziskovale to področje so naredili tudi obsežno statistično analizo rezultatov. V anketah so dobili tudi pozitivno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid

2022-04-01T15:27:02Z

Nezablaznik: /* Načrtovanje konstrukta */

Let.it.bee je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je zasnovala skupina podiplomskih študentov iz Univerze São Paulo v Braziliji. Z njim so se uvrstili med prvih deset ekip v kategoriji podiplomskih študentov. Njihov cilj je bil pripraviti rastlino, ki bi reševala problematiko manjšanja populacij čebel zaradi splošne uporabe pesticidov.

Spletna stran projekta Let.it.bee, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:USP-Brazil https://2021.igem.org/Team:USP-Brazil]

Avtorica povzetka: Barbara Jaklič

=='''Čebele in njihov pomen'''==

Kljub svoji majhnosti so čebele kot opraševalke ključnega pomena za ohranjanje številnih kopenskih življenjskih združb. Obstaja preko 20.000 vrst razdeljenih v sedem družin, med katerimi je najbolj znana družina pravih čebel (''Apidae''), kamor spadata rod čmrljev in medonosnih čebel. V Braziliji, od koder prihaja ekipa, je prisotnih okrog 3000 vrst [1], medtem ko jih imamo v Sloveniji okrog 550, predvsem iz rodu peščinskih čebel (''Andrena''). Za človeka je zagotovo najpomembnejša vrsta domača čebela (''Apis mellifera''), katere podvrsta kranjska čebela (''Apis mellifera carnica'') je v Sloveniji avtohtona [2].

Z opraševanjem čebele skrbijo za razmnoževanje številnih rastlinskih vrst in njihovo genetsko variabilnost. Oprašujejo kar 80 % vseh cvetočih rastlin, od tega več kot 130 vrst sadja in zelenjave [3]. Zato imajo poleg okoljskega vidika čebele tudi velik ekonomski pomen. Nekatere vrste sadja kot so kivi, melone, buče in lubenice so popolnoma odvisne od čebeljega opraševanja, brez čebel ne bi imeli niti kakava, brazilskih oreščkov, vanilije in klinčkov. Poleg tega obstajajo številne druge vrste sadja, oreščkov in drugih poljščin, katerih donos v odsotnosti čebel bi se zmanjšal za 40 do 90 %. V to skupino spadajo jabolka, marelice, borovnice, mango, breskve, slive, hruške, maline, mandlji, indijski oreščki, kumare, avokado in celo pšenica [4]. Na splošno se pomembnost čebel odraža v kar eni tretjini vse hrane, ki jo zaužijemo, pridelavi vlaken za oblačila in surovin za biogoriva ter seveda pridobivanju medu in voska. Zaradi navedenih razlogov čebele doprinesejo k 10 % BDP v kmetijskem sektorju [1].

=='''Problem'''==

Na žalost po celem svetu prihaja do upadanja števila čebeljih kolonij. Od konca 20. stoletja pa do danes naj bi izumrla skoraj četrtina nekdaj prisotnih vrst. Posebej za zmanjšanje populacij medonosnih vrst kot je ''Apis mellifera'' se je uveljavil izraz ''sindrom propadanja čebeljih družin'' [5]. Razlogov za to je več, najpomembnejši so zagotovo urbanizacija in z njo kulturno gojenje rastlin ter posledična izguba čebeljega habitata, upadanje dejavnosti čebelarjev, podnebne spremembe, pojav čebelje pršice in varoje ter sistematična uporaba pesticidov [6].

Posebej problematična je nepravilna uporaba pesticidov za zaščito zrnja, predvsem neonikotinoidov kot so klotianidin, imidakloprid in tiametoksam, ki povzročajo akutno zastrupitev čebel. Nevarne so že subletalne koncentracije, saj se lahko okužijo le posamezne čebele, kar pa zaradi posebne organizacije čebeljega panja lahko vpliva na celotno kolonijo [6].

===Uporaba neonikotinoidov===

Neonikotinoidi so najpogosteje uporabljena skupina pesticidov, čeprav je bila leta 2013 njihova uporaba v Evropski Uniji močno omejena [7]. Spadajo med nevrotoksine, saj delujejo agonistično na nikotinske acetilholinske receptorje (nAChR) v nevronih insektov, ne pa tudi vretenčarjev [8]. Kmetje se največ poslužujejo imidakloprida, saj je zelo učinkovit in v rastlinah deluje sistemsko [9].

'''Imidakloprid''' se običajno vnese v rastlino s talnim nanosom v obliki granul ali tekočine, lahko pa tudi z obdelavo semen, od koder se med rastjo razširi po celotni rastlini [8]. Čebele pridejo v stik z imidaklopridom bodisi pri hranjenju z nektarjem, ki predstavlja vir ogljikovih hidratov, ali pri prenosu cvetnega prahu, ki predstavlja vir beljakovin in maščob. V čebelah se ta pesticid pretvori v še nevarnejše metabolite, kar vpliva na njihove motorične in kognitivne sposobnosti (letenje, prehranjevanje in navigacija) [10]. Največja težava pa je, da tako nektar kot cvetni prah čebele nosijo v panj in zato ob stiku s strupeno substanco ne pride do zastrupitve ene same čebele, ampak celega panja [8].

=='''Ideja'''==

Kljub negativnim učinkom imidakloprida je njegova uporaba v kmetijstvu neizogibna, saj predstavlja enega izmed bolj učinkovitih načinov obrambe pred škodljivci, ki bi sicer močno zmanjšali donos ekonomsko pomembnih rastlin. Zato se je ekipa USP-Brazil lotila projekta Let.it.bee, katerega glavni cilj je bil zasnovati tehnologijo, s katero bi zmanjšali toksične učinke neonikotinoidnih pesticidov na čebele [1].

Njihova ideja temelji na dejstvu, da so določene vrste insektov odporne na imidakloprid zaradi povečanega izražanja nekaterih encimov iz naddružine citokromov P450 (CYP), ki sodelujejo pri pretvorbi strupenega imidakloprida v manj nevarne metabolite. Primer takšnih organizmov so vinske mušice (''Drosophila melanogaster''), ki izražajo kar 10- do 100-krat več encima CYP6G1 kakor ostali neodporni insekti [11]. Zato so zasnovali biološki sistem, ki omogoča rastlinam, da izražajo encim CYP6G1 samo v tkivih, s katerimi so v stiku čebele med opraševanjem, torej nektar in cvetni prah. Ostali deli rastline kot so listi in steblo pa ostanejo zaščiteni pred škodljivci, saj v njih ne pride do izgube funkcije pesticida [1]. Encim CYP6G1 metabolizira imidakloprid do intermediatov 4- in 5-hidroksiimidakloprida, ki sta v primerjavi z izhodno spojino manj toksična, poleg tega ju lahko CYP6G1 dodatno razgradi do olefina 4,5 hidroksiimidakloprida. Nastali produkti so tudi bolj hidrofilni od imidakloprida, zato jih žuželka lažje izloči iz telesa [12].

===Razvoj ideje===

Za šasijo so sprva izbrali pogosto uporabljen navadni repnjakovec (''Arabidopsis thaliana''), kasneje pa so za testno rastlino raje izbrali paradižnik, ki je četrta najpomembnejša kulturna rastlina na svetu in celo najpomembnejša, če izvzamemo žitarice. Poleg tega je transformacija paradižnika z uporabo ''Agrobacterium tumefaciens'' zanesljiva in učinkovita, rastline pa se po transformaciji dobro regenerirajo [13]. Natančneje so za šasijo uporabili rastline pritlikavega mikroparadižnika '''Micro-Tom (biokocka BBa_K3890000)''', ki je bil razvit za domače vrtove, in ima dobre eksperimentalne lastnosti, kot sta kratek življenjski krog in majhen genom (samo 950 Mb). Poleg tega rastline ne proizvajajo nektarja, zato je bilo dovolj, da izbran encim za aktivacijo pesticide izrazijo v pelodu [14].

===Načrtovanje konstrukta===

Načrtovali so biološki sistem, vstavljen v binarni vektor, ki temelji na plazmidu Ti ''Agrobacterium tumefaciens''. Poleg bakterijskega ori in selekcijskega markerja za bakterije (zapis za odpornost proti streptamicinu) vsebuje tudi elemente za transformacijo rastlin. Med levim in desnim robom T-DNA regije, ki se integrira v rastlinski genom, se nahaja rastlinski selekcijski marker (zapis za odpornost proti kanamicinu) pod kontrolo rastlinskega promotorja CaMV 35S in vsi elementi sistema, ki omogočajo izražanje CYP6G1 v cvetnem prahu [1]:

* '''Promotor pLAT52 (biokocka BBa_K3890001)''', ki je močan promotor specifičen za pelod. Pri predhodnih raziskavah so dokazali visok nivo izražanja po kontrolo tega promotorja v prašnikih, v preostalih rastlinskih organih praktično nič. Promotor so poleg paradižnika testirali tudi v navadnem repnjakovcu (''Arabidopsis thaliana'') in tobaku (''Nicotiana tabacum''), kjer so prav tako dokazali visoko specifičnost za pelod. To predstavlja prednost pred promotorjem pLAT59, pri katerem so dokazali nizek nivo izražanja tudi v semenih in koreninah.
* '''Zapis za encim CYP6G1 (biokocka BBa_K3890006)''' z optimizirano rabo kodonov za izražanje v paradižniku. V predhodnih raziskavah izražanja v tobaku je bilo ugotovljeno, da lahko v 48 urah encim metabolizira 83 % od 400 μg dodanega imidakloprida [Joussen, 2018].
* '''Fuzija dveh samoizrezujočih se peptidov LP4/2A (biokocka BBa_K3890002)''', kar omogoča izražanje dveh proteinov pod kontrolo istega promotorja. 2A peptidi so kratka aminokislinska zaporedja, ki so pogosto prisotna v virusni DNA, cepitev poteče po metodi preskakovanja ribosoma med translacijo. Ribosom pri tem pogosto popolnoma pade dol ali pa sploh ne prekine prevajanja, kar so izboljšali s fuzijo z rastlinskim peptidom LP4 iz semen ''Impatiens balsamina''.
* '''Reporterski gen GUS (biokocka BBa_K330002)''', navzdol od zapisa za encim.

=='''Eksperimenti'''==

Rastline transfromiranega mikroparadižnika so gojili v kontroliranem okolju pri 30 °C, ustrezni vlažnosti in naravnem dnevno-nočnem ciklu. Izolacijo listov in cvetnega prahu so vedno izvajali ob istem času in shranjevali material pri -80 °C. Glavni trije eksperimenti, s katerimi so potrdili delovanje biološkega sistema so bili:
* histokemijsko GUS barvanje peloda, pri katerem so aktivnost β-glukuronidaze detektirali z dodatkom substrata 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl β-D-Glucuronide (X-Gluc), ki ga encim β-glukuronidaza pretvarja v indigo modro,
* ekstrakcija genomske DNA iz listov in peloda ter validacija prisotnosti vstavljene kasete LAT52 CYP6G1 GUS,
* kvantifikacijska analiza transkriptoma, za kar so najprej izolirali RNA, sintetizirali cDNA in jo analizirali z RT-qPCR [1].

=='''Model in rezultati'''==
Pripravili so dva mikromodela, ki sta simulirala delovanje detoksifikacijskega encima CYP6G1. Pri prvem so želeli z mutagenezo izboljšati encim, tako da bi razgrajeval tudi druge pesticide, kar so preverjali z molekulsko umestitvijo. Za modelno molekulo so s pomočjo orodja PSI-BLAST izbrali encim CYP3A4. Pri drugem modelu so simulirali stopnjo izražanja encima pod kontrolo promotorja pLAT52 in z dobljenim teoretičnim modelom napovedali stopnjo razgradnje imidakloprida in nastanka razgradnih metabolitov.
Tretji makromodel je simuliral obnašanje čebel v prisotnosti genetsko spremenjene rastline in predvideval, koliko čebel bi se okužilo s pesticidom, če upoštevamo, da pesticid v panj prinesejo le čebele delavke, in kako razsežen bi bil vpliv zastrupitve.
Iz modelov so predvideli, da popolna razgradnja imidakloprida traja 12 sekund in da so rastline transformirane z Let.it.bee in tretirane z imdaklopridom za čebele 5- do 10-krat manj strupene od divjih rastlin [1].

=='''Model in rezultati'''==

LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid

2022-03-31T18:59:14Z

Nezablaznik:

Let.it.bee je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je zasnovala skupina podiplomskih študentov iz Univerze São Paulo v Braziliji. Z njim so se uvrstili med prvih deset ekip v kategoriji podiplomskih študentov. Njihov cilj je bil pripraviti rastlino, ki bi reševala problematiko manjšanja populacij čebel zaradi splošne uporabe pesticidov.

Spletna stran projekta Let.it.bee, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:USP-Brazil https://2021.igem.org/Team:USP-Brazil]

Avtorica povzetka: Barbara Jaklič

=='''Čebele in njihov pomen'''==

Kljub svoji majhnosti so čebele kot opraševalke ključnega pomena za ohranjanje številnih kopenskih življenjskih združb. Obstaja preko 20.000 vrst razdeljenih v sedem družin, med katerimi je najbolj znana družina pravih čebel (''Apidae''), kamor spadata rod čmrljev in medonosnih čebel. V Braziliji, od koder prihaja ekipa, je prisotnih okrog 3000 vrst [1], medtem ko jih imamo v Sloveniji okrog 550, predvsem iz rodu peščinskih čebel (''Andrena''). Za človeka je zagotovo najpomembnejša vrsta domača čebela (''Apis mellifera''), katere podvrsta kranjska čebela (''Apis mellifera carnica'') je v Sloveniji avtohtona [2].

Z opraševanjem čebele skrbijo za razmnoževanje številnih rastlinskih vrst in njihovo genetsko variabilnost. Oprašujejo kar 80 % vseh cvetočih rastlin, od tega več kot 130 vrst sadja in zelenjave [3]. Zato imajo poleg okoljskega vidika čebele tudi velik ekonomski pomen. Nekatere vrste sadja kot so kivi, melone, buče in lubenice so popolnoma odvisne od čebeljega opraševanja, brez čebel ne bi imeli niti kakava, brazilskih oreščkov, vanilije in klinčkov. Poleg tega obstajajo številne druge vrste sadja, oreščkov in drugih poljščin, katerih donos v odsotnosti čebel bi se zmanjšal za 40 do 90 %. V to skupino spadajo jabolka, marelice, borovnice, mango, breskve, slive, hruške, maline, mandlji, indijski oreščki, kumare, avokado in celo pšenica [4]. Na splošno se pomembnost čebel odraža v kar eni tretjini vse hrane, ki jo zaužijemo, pridelavi vlaken za oblačila in surovin za biogoriva ter seveda pridobivanju medu in voska. Zaradi navedenih razlogov čebele doprinesejo k 10 % BDP v kmetijskem sektorju [1].

=='''Problem'''==

Na žalost po celem svetu prihaja do upadanja števila čebeljih kolonij. Od konca 20. stoletja pa do danes naj bi izumrla skoraj četrtina nekdaj prisotnih vrst. Posebej za zmanjšanje populacij medonosnih vrst kot je ''Apis mellifera'' se je uveljavil izraz ''sindrom propadanja čebeljih družin'' [5]. Razlogov za to je več, najpomembnejši so zagotovo urbanizacija in z njo kulturno gojenje rastlin ter posledična izguba čebeljega habitata, upadanje dejavnosti čebelarjev, podnebne spremembe, pojav čebelje pršice in varoje ter sistematična uporaba pesticidov [6].

Posebej problematična je nepravilna uporaba pesticidov za zaščito zrnja, predvsem neonikotinoidov kot so klotianidin, imidakloprid in tiametoksam, ki povzročajo akutno zastrupitev čebel. Nevarne so že subletalne koncentracije, saj se lahko okužijo le posamezne čebele, kar pa zaradi posebne organizacije čebeljega panja lahko vpliva na celotno kolonijo [6].

===Uporaba neonikotinoidov===

Neonikotinoidi so najpogosteje uporabljena skupina pesticidov, čeprav je bila leta 2013 njihova uporaba v Evropski Uniji močno omejena [7]. Spadajo med nevrotoksine, saj delujejo agonistično na nikotinske acetilholinske receptorje (nAChR) v nevronih insektov, ne pa tudi vretenčarjev [8]. Kmetje se največ poslužujejo imidakloprida, saj je zelo učinkovit in v rastlinah deluje sistemsko [9].

'''Imidakloprid''' se običajno vnese v rastlino s talnim nanosom v obliki granul ali tekočine, lahko pa tudi z obdelavo semen, od koder se med rastjo razširi po celotni rastlini [8]. Čebele pridejo v stik z imidaklopridom bodisi pri hranjenju z nektarjem, ki predstavlja vir ogljikovih hidratov, ali pri prenosu cvetnega prahu, ki predstavlja vir beljakovin in maščob. V čebelah se ta pesticid pretvori v še nevarnejše metabolite, kar vpliva na njihove motorične in kognitivne sposobnosti (letenje, prehranjevanje in navigacija) [10]. Največja težava pa je, da tako nektar kot cvetni prah čebele nosijo v panj in zato ob stiku s strupeno substanco ne pride do zastrupitve ene same čebele, ampak celega panja [8].

=='''Ideja'''==

Kljub negativnim učinkom imidakloprida je njegova uporaba v kmetijstvu neizogibna, saj predstavlja enega izmed bolj učinkovitih načinov obrambe pred škodljivci, ki bi sicer močno zmanjšali donos ekonomsko pomembnih rastlin. Zato se je ekipa USP-Brazil lotila projekta Let.it.bee, katerega glavni cilj je bil zasnovati tehnologijo, s katero bi zmanjšali toksične učinke neonikotinoidnih pesticidov na čebele [1].

Njihova ideja temelji na dejstvu, da so določene vrste insektov odporne na imidakloprid zaradi povečanega izražanja nekaterih encimov iz naddružine citokromov P450 (CYP), ki sodelujejo pri pretvorbi strupenega imidakloprida v manj nevarne metabolite. Primer takšnih organizmov so vinske mušice (''Drosophila melanogaster''), ki izražajo kar 10- do 100-krat več encima CYP6G1 kakor ostali neodporni insekti [11]. Zato so zasnovali biološki sistem, ki omogoča rastlinam, da izražajo encim CYP6G1 samo v tkivih, s katerimi so v stiku čebele med opraševanjem, torej nektar in cvetni prah. Ostali deli rastline kot so listi in steblo pa ostanejo zaščiteni pred škodljivci, saj v njih ne pride do izgube funkcije pesticida [1]. Encim CYP6G1 metabolizira imidakloprid do intermediatov 4- in 5-hidroksiimidakloprida, ki sta v primerjavi z izhodno spojino manj toksična, poleg tega ju lahko CYP6G1 dodatno razgradi do olefina 4,5 hidroksiimidakloprida. Nastali produkti so tudi bolj hidrofilni od imidakloprida, zato jih žuželka lažje izloči iz telesa [12].

===Razvoj ideje===

Za šasijo so sprva izbrali pogosto uporabljen navadni repnjakovec (''Arabidopsis thaliana''), kasneje pa so za testno rastlino raje izbrali paradižnik, ki je četrta najpomembnejša kulturna rastlina na svetu in celo najpomembnejša, če izvzamemo žitarice. Poleg tega je transformacija paradižnika z uporabo ''Agrobacterium tumefaciens'' zanesljiva in učinkovita, rastline pa se po transformaciji dobro regenerirajo [13]. Natančneje so za šasijo uporabili rastline pritlikavega mikroparadižnika '''Micro-Tom (biokocka BBa_K3890000)''', ki je bil razvit za domače vrtove, in ima dobre eksperimentalne lastnosti, kot sta kratek življenjski krog in majhen genom (samo 950 Mb). Poleg tega rastline ne proizvajajo nektarja, zato je bilo dovolj, da izbran encim za aktivacijo pesticide izrazijo v pelodu [14].

===Načrtovanje konstrukta===

Načrtovali so biološki sistem, vstavljen v binarni vektor za ''Agrobacterium tumefaciens'', ki poleg bakterijskega ori in selekcijskega markerja za bakterije (zapis za odpornost proti streptamicinu) vsebuje tudi vse potrebne elemente za transformacijo rastlin. Med levim in desnim robom T-DNA regije, ki se integrira v rastlinski genom, se nahaja rastlinski selekcijski marker (zapis za odpornost proti kanamicinu) pod kontrolo rastlinskega promotorja CaMV 35S in vsi sestavni deli testnega sistema, ki omogočajo izražanje CYP6G1 v cvetnem prahu [1]:

* '''Promotor pLAT52 (biokocka BBa_K3890001)''', ki je močan promotor specifičen za pelod. Pri predhodnih raziskavah so dokazali visok nivo izražanja po kontrolo tega promotorja v prašnikih, v preostalih rastlinskih organih praktično nič. Promotor so poleg paradižnika testirali tudi v navadnem repnjakovcu (''Arabidopsis thaliana'') in tobaku (''Nicotiana tabacum''), kjer so prav tako dokazali visoko specifičnost za pelod. To predstavlja prednost pred promotorjem pLAT59, pri katerem so dokazali nizek nivo izražanja tudi v semenih in koreninah.
* '''Zapis za encim CYP6G1 (biokocka BBa_K3890006)''' z optimizirano rabo kodonov za izražanje v paradižniku. V predhodnih raziskavah izražanja v tobaku je bilo ugotovljeno, da lahko v 48 urah encim metabolizira 83 % od 400 μg dodanega imidakloprida [Joussen, 2018].
* '''Fuzija dveh samoizrezujočih se peptidov LP4/2A (biokocka BBa_K3890002)''', kar omogoča izražanje dveh proteinov pod kontrolo istega promotorja. 2A peptidi so kratka aminokislinska zaporedja, ki so pogosto prisotna v virusni DNA, cepitev poteče po metodi preskakovanja ribosoma med translacijo. Ribosom pri tem pogosto popolnoma pade dol ali pa sploh ne prekine prevajanja, kar so izboljšali s fuzijo z rastlinskim peptidom LP4 iz semen ''Impatiens balsamina''.
* '''Reporterski gen GUS (biokocka BBa_K330002)''', navzdol od zapisa za encim.

=='''Eksperimenti'''==

Rastline transfromiranega mikroparadižnika so gojili v kontroliranem okolju pri 30 °C, ustrezni vlažnosti in naravnem dnevno-nočnem ciklu. Izolacijo listov in cvetnega prahu so vedno izvajali ob istem času in shranjevali material pri -80 °C. Glavni trije eksperimenti, s katerimi so potrdili delovanje biološkega sistema so bili:
* histokemijsko GUS barvanje peloda, pri katerem so aktivnost β-glukuronidaze detektirali z dodatkom substrata 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl β-D-Glucuronide (X-Gluc), ki ga encim β-glukuronidaza pretvarja v indigo modro,
* ekstrakcija genomske DNA iz listov in peloda ter validacija prisotnosti vstavljene kasete LAT52 CYP6G1 GUS,
* kvantifikacijska analiza transkriptoma, za kar so najprej izolirali RNA, sintetizirali cDNA in jo analizirali z RT-qPCR [1].

=='''Model in rezultati'''==
Pripravili so dva mikromodela, ki sta simulirala delovanje detoksifikacijskega encima CYP6G1. Pri prvem so želeli z mutagenezo izboljšati encim, tako da bi razgrajeval tudi druge pesticide, kar so preverjali z molekulsko umestitvijo. Za modelno molekulo so s pomočjo orodja PSI-BLAST izbrali encim CYP3A4. Pri drugem modelu so simulirali stopnjo izražanja encima pod kontrolo promotorja pLAT52 in z dobljenim teoretičnim modelom napovedali stopnjo razgradnje imidakloprida in nastanka razgradnih metabolitov.
Tretji makromodel je simuliral obnašanje čebel v prisotnosti genetsko spremenjene rastline in predvideval, koliko čebel bi se okužilo s pesticidom, če upoštevamo, da pesticid v panj prinesejo le čebele delavke, in kako razsežen bi bil vpliv zastrupitve.
Iz modelov so predvideli, da popolna razgradnja imidakloprida traja 12 sekund in da so rastline transformirane z Let.it.bee in tretirane z imdaklopridom za čebele 5- do 10-krat manj strupene od divjih rastlin [1].

LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid

2022-03-30T17:09:55Z

Nezablaznik: /* Načrtovanje konstrukta */

Let.it.bee je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je zasnovala skupina podiplomskih študentov iz Univerze São Paulo v Braziliji. Z njim so se uvrstili med prvih deset ekip v kategoriji podiplomskih študentov. Njihov cilj je bil pripraviti rastlino, ki bi reševala problematiko manjšanja populacij čebel zaradi splošne uporabe pesticidov.

Spletna stran projekta Let.it.bee, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:USP-Brazil https://2021.igem.org/Team:USP-Brazil]

Avtorica povzetka: Barbara Jaklič

=='''Čebele in njihov pomen'''==

Kljub svoji majhnosti so čebele kot opraševalke ključnega pomena za ohranjanje številnih kopenskih življenjskih združb. Obstaja preko 20.000 vrst razdeljenih v sedem družin, med katerimi je najbolj znana družina pravih čebel (''Apidae''), kamor spadata rod čmrljev in medonosnih čebel. V Braziliji, od koder prihaja ekipa, je prisotnih okrog 3000 vrst [1], medtem ko jih imamo v Sloveniji okrog 550, predvsem iz rodu peščinskih čebel (''Andrena''). Za človeka je zagotovo najpomembnejša vrsta domača čebela (''Apis mellifera''), katere podvrsta kranjska čebela (''Apis mellifera carnica'') je avtohtona za Slovenijo [2].

Z opraševanjem čebele skrbijo za razmnoževanje številnih rastlinskih vrst in njihovo genetsko variabilnost. Oprašujejo kar 80 % vseh cvetočih rastlin, od tega več kot 130 vrst sadja in zelenjave [3]. Zato imajo poleg okoljskega vidika čebele tudi velik ekonomski pomen. Nekatere vrste sadja kot so kivi, melone, buče in lubenice so popolnoma odvisne od čebeljega opraševanja, brez čebel ne bi imeli niti kakava, brazilskih oreščkov, vanilije in klinčkov. Poleg tega obstajajo številne druge vrste sadja, oreščkov in drugih poljščin, katerih donos v odsotnosti čebel bi se zmanjšal za 40 do 90 %. V to skupino spadajo jabolka, marelice, borovnice, mango, breskve, slive, hruške, maline, mandlji, indijski oreščki, kumare, avokado in celo pšenica [4]. Na splošno se pomembnost čebel odraža v kar eni tretjini vse hrane, ki jo zaužijemo, pridelavi vlaken za oblačila in surovin za biogoriva ter seveda pridobivanju medu in voska. Zaradi navedenih razlogov čebele doprinesejo k 10 % BDP v kmetijskem sektorju [1].

=='''Problem'''==

Na žalost po celem svetu prihaja do upadanja števila čebeljih kolonij. Od konca 20. stoletja pa do danes naj bi izumrla skoraj četrtina nekdaj prisotnih vrst. Posebej za zmanjšanje populacij medonosnih vrst kot je ''Apis mellifera'' se je uveljavil izraz ''sindrom propadanja čebeljih družin'' [5]. Razlogov za to je več, najpomembnejši so zagotovo urbanizacija in z njo kulturno gojenje rastlin ter posledična izguba čebeljega habitata, upadanje dejavnosti čebelarjev, podnebne spremembe, pojav čebelje pršice in varoje ter sistematična uporaba pesticidov [6].

Posebej problematična je nepravilna uporaba pesticidov za zaščito zrnja, predvsem neonikotinoidov kot so klotianidin, imidakloprid in tiametoksam, ki povzročajo akutno zastrupitev čebel. Nevarne so že subletalne koncentracije, saj se lahko okužijo le posamezne čebele, kar pa zaradi posebne organizacije čebeljega panja lahko vpliva na celotno kolonijo [6].

===Uporaba neonikotinoidov===

Neonikotinoidi so najpogosteje uporabljena skupina pesticidov, čeprav je bila leta 2013 njihova uporaba v Evropski Uniji močno omejena [7]. Spadajo med nevrotoksine, saj delujejo agonistično na nikotinske acetilholinske receptorje (nAChR) v nevronih insektov, ne pa tudi vretenčarjev [8]. Kmetje se največ poslužujejo imidakloprida, saj je zelo učinkovit in v rastlinah deluje sistemsko [9].

'''Imidakloprid''' se običajno vnese v rastlino s talnim nanosom v obliki granul ali tekočine, lahko pa tudi z obdelavo semen, od koder se med rastjo razširi po celotni rastlini [8]. Čebele pridejo v stik z imidaklopridom bodisi pri hranjenju z nektarjem, ki predstavlja vir ogljikovih hidratov, ali pri prenosu cvetnega prahu, ki predstavlja vir beljakovin in maščob. V čebelah se ta pesticid pretvori v še nevarnejše metabolite, kar vpliva na njihove motorične in kognitivne sposobnosti (letenje, prehranjevanje in navigacija) [10]. Največja težava pa je, da tako nektar kot cvetni prah čebele nosijo v panj in zato ob stiku s strupeno substanco ne pride do zastrupitve ene same čebele, ampak celega panja [8].

=='''Ideja'''==

Kljub negativnim učinkom imidakloprida je njegova uporaba v kmetijstvu neizogibna, saj predstavlja enega izmed bolj učinkovitih načinov obrambe pred škodljivci, ki bi sicer močno zmanjšali donos ekonomsko pomembnih rastlin. Zato se je ekipa USP-Brazil lotila projekta Let.it.bee, katerega glavni cilj je bil zasnovati tehnologijo, s katero bi zmanjšali toksične učinke neonikotinoidnih pesticidov na čebele [1].

Njihova ideja temelji na dejstvu, da so določene vrste insektov odporne na imidakloprid zaradi povečanega izražanja nekaterih encimov iz naddružine citokromov P450 (CYP), ki sodelujejo pri pretvorbi strupenega imidakloprida v manj nevarne metabolite. Primer takšnih organizmov so vinske mušice (''Drosophila melanogaster''), ki izražajo kar 10- do 100-krat več encima CYP6G1 kakor ostali neodporni insekti [11]. Zato so zasnovali biološki sistem, ki omogoča rastlinam, da izražajo encim CYP6G1 samo v tkivih, s katerimi so v stiku čebele med opraševanjem, torej nektar in cvetni prah. Ostali deli rastline kot so listi in steblo pa ostanejo zaščiteni pred škodljivci, saj v njih ne pride do izgube funkcije pesticida [1]. Encim CYP6G1 metabolizira imidakloprid do intermediatov 4- in 5-hidroksiimidakloprida, ki sta v primerjavi z izhodno spojino manj toksična, poleg tega ju lahko CYP6G1 dodatno razgradi do olefina 4,5 hidroksiimidakloprida. Nastali produkti so tudi bolj hidrofilni od imidakloprida, zato jih žuželka lažje izloči iz telesa [12].

===Razvoj ideje===

Za šasijo so sprva izbrali pogosto uporabljen navadni repnjakovec (''Arabidopsis thaliana''), kasneje pa so za testno rastlino raje izbrali paradižnik, ki je četrta najpomembnejša kulturna rastlina na svetu in celo najpomembnejša, če izvzamemo žitarice. Poleg tega je transformacija paradižnika z uporabo ''Agrobacterium tumefaciens'' zanesljiva in učinkovita, rastline pa se po transformaciji dobro regenerirajo [13]. Natančneje so za šasijo uporabili rastline pritlikavega mikroparadižnika '''Micro-Tom (biokocka BBa_K3890000)''', ki je bil razvit za domače vrtove, in ima dobre eksperimentalne lastnosti, kot sta kratek življenjski krog in majhen genom (samo 950 Mb). Poleg tega rastline ne proizvajajo nektarja, zato je bilo dovolj, da izbran encim za aktivacijo pesticide izrazijo v pelodu [14].

===Načrtovanje konstrukta===

Načrtovali so biološki sistem, vstavljen v binarni vektor za ''Agrobacterium tumefaciens'', ki poleg bakterijskega ori in selekcijskega markerja za bakterije (zapis za odpornost proti streptamicinu) vsebuje tudi vse potrebne elemente za transformacijo rastlin. Med levim in desnim robom T-DNA regije, ki se integrira v rastlinski genom, se nahaja rastlinski selekcijski marker (zapis za odpornost proti kanamicinu) pod kontrolo rastlinskega promotorja CaMV 35S in vsi sestavni deli testnega sistema, ki omogočajo izražanje CYP6G1 v cvetnem prahu [1]:

* '''Promotor pLAT52 (biokocka BBa_K3890001)''', ki je močan promotor specifičen za pelod. Pri predhodnih raziskavah so dokazali visok nivo izražanja po kontrolo tega promotorja v prašnikih, v preostalih rastlinskih organih praktično nič. Promotor so poleg paradižnika testirali tudi v navadnem repnjakovcu (''Arabidopsis thaliana'') in tobaku (''Nicotiana tabacum''), kjer so prav tako dokazali visoko specifičnost za pelod. To predstavlja prednost pred promotorjem pLAT59, pri katerem so dokazali nizek nivo izražanja tudi v semenih in koreninah.
* '''Zapis za encim CYP6G1 (biokocka BBa_K3890006)''' z optimizirano rabo kodonov za izražanje v paradižniku. V predhodnih raziskavah izražanja v tobaku je bilo ugotovljeno, da lahko v 48 urah encim metabolizira 83 % od 400 μg dodanega imidakloprida [Joussen, 2018].
* '''Fuzija dveh samoizrezujočih se peptidov LP4/2A (biokocka BBa_K3890002)''', kar omogoča izražanje dveh proteinov pod kontrolo istega promotorja. 2A peptidi so kratka aminokislinska zaporedja, ki so pogosto prisotna v virusni DNA, cepitev poteče po metodi preskakovanja ribosoma med translacijo. Ribosom pri tem pogosto popolnoma pade dol ali pa sploh ne prekine prevajanja, kar so izboljšali s fuzijo z rastlinskim peptidom LP4 iz semen ''Impatiens balsamina''.
* '''Reporterski gen GUS (biokocka BBa_K330002)''', navzdol od zapisa za encim.

=='''Eksperimenti'''==

Rastline transfromiranega mikroparadižnika so gojili v kontroliranem okolju pri 30 °C, ustrezni vlažnosti in naravnem dnevno-nočnem ciklu. Izolacijo listov in cvetnega prahu so vedno izvajali ob istem času in shranjevali material pri -80 °C. Glavni trije eksperimenti, s katerimi so potrdili delovanje biološkega sistema so bili:
* histokemijsko GUS barvanje peloda, pri katerem so aktivnost β-glukuronidaze detektirali z dodatkom substrata 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl β-D-Glucuronide (X-Gluc), ki ga encim β-glukuronidaza pretvarja v indigo modro,
* ekstrakcija genomske DNA iz listov in peloda ter validacija prisotnosti vstavljene kasete LAT52 CYP6G1 GUS,
* kvantifikacijska analiza transkriptoma, za kar so najprej izolirali RNA, sintetizirali cDNA in jo analizirali z RT-qPCR [1].

=='''Model in rezultati'''==
Pripravili so dva mikromodela, ki sta simulirala delovanje detoksifikacijskega encima CYP6G1. Pri prvem so želeli z mutagenezo izboljšati encim, tako da bi razgrajeval tudi druge pesticide, kar so preverjali z molekulsko umestitvijo. Za modelno molekulo so s pomočjo orodja PSI-BLAST izbrali encim CYP3A4. Pri drugem modelu so simulirali stopnjo izražanja encima pod kontrolo promotorja pLAT52 in z dobljenim teoretičnim modelom napovedali stopnjo razgradnje imidakloprida in nastanka razgradnih metabolitov.
Tretji makromodel je simuliral obnašanje čebel v prisotnosti genetsko spremenjene rastline in predvideval, koliko čebel bi se okužilo s pesticidom, če upoštevamo, da pesticid v panj prinesejo le čebele delavke, in kako razsežen bi bil vpliv zastrupitve.
Iz modelov so predvideli, da popolna razgradnja imidakloprida traja 12 sekund in da so rastline transformirane z Let.it.bee in tretirane z imdaklopridom za čebele 5- do 10-krat manj strupene od divjih rastlin [1].

LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid

2022-03-30T17:09:19Z

Nezablaznik:

Let.it.bee je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je zasnovala skupina podiplomskih študentov iz Univerze São Paulo v Braziliji. Z njim so se uvrstili med prvih deset ekip v kategoriji podiplomskih študentov. Njihov cilj je bil pripraviti rastlino, ki bi reševala problematiko manjšanja populacij čebel zaradi splošne uporabe pesticidov.

Spletna stran projekta Let.it.bee, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:USP-Brazil https://2021.igem.org/Team:USP-Brazil]

Avtorica povzetka: Barbara Jaklič

=='''Čebele in njihov pomen'''==

Kljub svoji majhnosti so čebele kot opraševalke ključnega pomena za ohranjanje številnih kopenskih življenjskih združb. Obstaja preko 20.000 vrst razdeljenih v sedem družin, med katerimi je najbolj znana družina pravih čebel (''Apidae''), kamor spadata rod čmrljev in medonosnih čebel. V Braziliji, od koder prihaja ekipa, je prisotnih okrog 3000 vrst [1], medtem ko jih imamo v Sloveniji okrog 550, predvsem iz rodu peščinskih čebel (''Andrena''). Za človeka je zagotovo najpomembnejša vrsta domača čebela (''Apis mellifera''), katere podvrsta kranjska čebela (''Apis mellifera carnica'') je avtohtona za Slovenijo [2].

Z opraševanjem čebele skrbijo za razmnoževanje številnih rastlinskih vrst in njihovo genetsko variabilnost. Oprašujejo kar 80 % vseh cvetočih rastlin, od tega več kot 130 vrst sadja in zelenjave [3]. Zato imajo poleg okoljskega vidika čebele tudi velik ekonomski pomen. Nekatere vrste sadja kot so kivi, melone, buče in lubenice so popolnoma odvisne od čebeljega opraševanja, brez čebel ne bi imeli niti kakava, brazilskih oreščkov, vanilije in klinčkov. Poleg tega obstajajo številne druge vrste sadja, oreščkov in drugih poljščin, katerih donos v odsotnosti čebel bi se zmanjšal za 40 do 90 %. V to skupino spadajo jabolka, marelice, borovnice, mango, breskve, slive, hruške, maline, mandlji, indijski oreščki, kumare, avokado in celo pšenica [4]. Na splošno se pomembnost čebel odraža v kar eni tretjini vse hrane, ki jo zaužijemo, pridelavi vlaken za oblačila in surovin za biogoriva ter seveda pridobivanju medu in voska. Zaradi navedenih razlogov čebele doprinesejo k 10 % BDP v kmetijskem sektorju [1].

=='''Problem'''==

Na žalost po celem svetu prihaja do upadanja števila čebeljih kolonij. Od konca 20. stoletja pa do danes naj bi izumrla skoraj četrtina nekdaj prisotnih vrst. Posebej za zmanjšanje populacij medonosnih vrst kot je ''Apis mellifera'' se je uveljavil izraz ''sindrom propadanja čebeljih družin'' [5]. Razlogov za to je več, najpomembnejši so zagotovo urbanizacija in z njo kulturno gojenje rastlin ter posledična izguba čebeljega habitata, upadanje dejavnosti čebelarjev, podnebne spremembe, pojav čebelje pršice in varoje ter sistematična uporaba pesticidov [6].

Posebej problematična je nepravilna uporaba pesticidov za zaščito zrnja, predvsem neonikotinoidov kot so klotianidin, imidakloprid in tiametoksam, ki povzročajo akutno zastrupitev čebel. Nevarne so že subletalne koncentracije, saj se lahko okužijo le posamezne čebele, kar pa zaradi posebne organizacije čebeljega panja lahko vpliva na celotno kolonijo [6].

===Uporaba neonikotinoidov===

Neonikotinoidi so najpogosteje uporabljena skupina pesticidov, čeprav je bila leta 2013 njihova uporaba v Evropski Uniji močno omejena [7]. Spadajo med nevrotoksine, saj delujejo agonistično na nikotinske acetilholinske receptorje (nAChR) v nevronih insektov, ne pa tudi vretenčarjev [8]. Kmetje se največ poslužujejo imidakloprida, saj je zelo učinkovit in v rastlinah deluje sistemsko [9].

'''Imidakloprid''' se običajno vnese v rastlino s talnim nanosom v obliki granul ali tekočine, lahko pa tudi z obdelavo semen, od koder se med rastjo razširi po celotni rastlini [8]. Čebele pridejo v stik z imidaklopridom bodisi pri hranjenju z nektarjem, ki predstavlja vir ogljikovih hidratov, ali pri prenosu cvetnega prahu, ki predstavlja vir beljakovin in maščob. V čebelah se ta pesticid pretvori v še nevarnejše metabolite, kar vpliva na njihove motorične in kognitivne sposobnosti (letenje, prehranjevanje in navigacija) [10]. Največja težava pa je, da tako nektar kot cvetni prah čebele nosijo v panj in zato ob stiku s strupeno substanco ne pride do zastrupitve ene same čebele, ampak celega panja [8].

=='''Ideja'''==

Kljub negativnim učinkom imidakloprida je njegova uporaba v kmetijstvu neizogibna, saj predstavlja enega izmed bolj učinkovitih načinov obrambe pred škodljivci, ki bi sicer močno zmanjšali donos ekonomsko pomembnih rastlin. Zato se je ekipa USP-Brazil lotila projekta Let.it.bee, katerega glavni cilj je bil zasnovati tehnologijo, s katero bi zmanjšali toksične učinke neonikotinoidnih pesticidov na čebele [1].

Njihova ideja temelji na dejstvu, da so določene vrste insektov odporne na imidakloprid zaradi povečanega izražanja nekaterih encimov iz naddružine citokromov P450 (CYP), ki sodelujejo pri pretvorbi strupenega imidakloprida v manj nevarne metabolite. Primer takšnih organizmov so vinske mušice (''Drosophila melanogaster''), ki izražajo kar 10- do 100-krat več encima CYP6G1 kakor ostali neodporni insekti [11]. Zato so zasnovali biološki sistem, ki omogoča rastlinam, da izražajo encim CYP6G1 samo v tkivih, s katerimi so v stiku čebele med opraševanjem, torej nektar in cvetni prah. Ostali deli rastline kot so listi in steblo pa ostanejo zaščiteni pred škodljivci, saj v njih ne pride do izgube funkcije pesticida [1]. Encim CYP6G1 metabolizira imidakloprid do intermediatov 4- in 5-hidroksiimidakloprida, ki sta v primerjavi z izhodno spojino manj toksična, poleg tega ju lahko CYP6G1 dodatno razgradi do olefina 4,5 hidroksiimidakloprida. Nastali produkti so tudi bolj hidrofilni od imidakloprida, zato jih žuželka lažje izloči iz telesa [12].

===Razvoj ideje===

Za šasijo so sprva izbrali pogosto uporabljen navadni repnjakovec (''Arabidopsis thaliana''), kasneje pa so za testno rastlino raje izbrali paradižnik, ki je četrta najpomembnejša kulturna rastlina na svetu in celo najpomembnejša, če izvzamemo žitarice. Poleg tega je transformacija paradižnika z uporabo ''Agrobacterium tumefaciens'' zanesljiva in učinkovita, rastline pa se po transformaciji dobro regenerirajo [13]. Natančneje so za šasijo uporabili rastline pritlikavega mikroparadižnika '''Micro-Tom (biokocka BBa_K3890000)''', ki je bil razvit za domače vrtove, in ima dobre eksperimentalne lastnosti, kot sta kratek življenjski krog in majhen genom (samo 950 Mb). Poleg tega rastline ne proizvajajo nektarja, zato je bilo dovolj, da izbran encim za aktivacijo pesticide izrazijo v pelodu [14].

===Načrtovanje konstrukta===

Načrtovali so biološki sistem, vstavljen v binarni vektor za ''Agrobacterium tumefaciens'', ki poleg bakterijskega ori in selekcijskega markerja za bakterije (zapis za odpornost proti streptamicinu) vsebuje tudi vse potrebne elemente za transformacijo rastlin. Med levim in desnim robom T-DNA regije, ki se integrira v rastlinski genom, se nahaja rastlinski selekcijski marker (zapis za odpornost proti kanamicinu) pod kontrolo rastlinskega promotorja CaMV 35S in vsi sestavni deli testnega sistema, ki omogočajo izražanje CYP6G1 v cvetnem prahu [1]:

* '''Promotor pLAT52 (biokocka BBa_K3890001)''', ki je močan promotor specifičen za pelod. Pri predhodnih raziskavah so dokazali visok nivo izražanja po kontrolo tega promotorja v prašnikih, v preostalih rastlinskih organih praktično nič. Promotor so poleg paradižnika testirali tudi v navadnem repnjakovcu (''Arabidopsis thaliana'') in tobaku (''Nicotiana tabacum''), kjer so prav tako dokazali visoko specifičnost za pelod. To predstavlja prednost pred promotorjem pLAT59, pri katerem so dokazali nizek nivo izražanja tudi v semenih in koreninah.
* '''Zapis za encim CYP6G1 (biokocka BBa_K3890006)''' z optimizirano rabo kodonov za izražanje v paradižniku. V predhodnih raziskavah izražanja v tobaku je bilo ugotovljeno, da lahko v 48 urah encim metabolizira 83 % od 400 μg dodanega imidakloprida [Joussen, 2018].
* '''Fuzija dveh samoizrezujočih se peptidov LP4/2A (biokocka BBa_K3890002)''', kar omogoča izražanje dveh proteinov pod kontrolo istega promotorja. 2A peptidi so kratka aminokislinska zaporedja, ki so pogosto prisotna v virusni DNA, cepitev poteče po metodi preskakovanja ribosoma med translacijo. Ribosom pri tem pogosto popolnoma pade dol ali pa sploh ne prekine prevajanja, kar so izboljšali s fuzijo z rastlinskim peptidom LP4 iz semen ''
Impatiens balsamina''.
* '''Reporterski gen GUS (biokocka BBa_K330002)''', navzdol od zapisa za encim.

=='''Eksperimenti'''==

Rastline transfromiranega mikroparadižnika so gojili v kontroliranem okolju pri 30 °C, ustrezni vlažnosti in naravnem dnevno-nočnem ciklu. Izolacijo listov in cvetnega prahu so vedno izvajali ob istem času in shranjevali material pri -80 °C. Glavni trije eksperimenti, s katerimi so potrdili delovanje biološkega sistema so bili:
* histokemijsko GUS barvanje peloda, pri katerem so aktivnost β-glukuronidaze detektirali z dodatkom substrata 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl β-D-Glucuronide (X-Gluc), ki ga encim β-glukuronidaza pretvarja v indigo modro,
* ekstrakcija genomske DNA iz listov in peloda ter validacija prisotnosti vstavljene kasete LAT52 CYP6G1 GUS,
* kvantifikacijska analiza transkriptoma, za kar so najprej izolirali RNA, sintetizirali cDNA in jo analizirali z RT-qPCR [1].

=='''Model in rezultati'''==
Pripravili so dva mikromodela, ki sta simulirala delovanje detoksifikacijskega encima CYP6G1. Pri prvem so želeli z mutagenezo izboljšati encim, tako da bi razgrajeval tudi druge pesticide, kar so preverjali z molekulsko umestitvijo. Za modelno molekulo so s pomočjo orodja PSI-BLAST izbrali encim CYP3A4. Pri drugem modelu so simulirali stopnjo izražanja encima pod kontrolo promotorja pLAT52 in z dobljenim teoretičnim modelom napovedali stopnjo razgradnje imidakloprida in nastanka razgradnih metabolitov.
Tretji makromodel je simuliral obnašanje čebel v prisotnosti genetsko spremenjene rastline in predvideval, koliko čebel bi se okužilo s pesticidom, če upoštevamo, da pesticid v panj prinesejo le čebele delavke, in kako razsežen bi bil vpliv zastrupitve.
Iz modelov so predvideli, da popolna razgradnja imidakloprida traja 12 sekund in da so rastline transformirane z Let.it.bee in tretirane z imdaklopridom za čebele 5- do 10-krat manj strupene od divjih rastlin [1].

LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid

2022-03-30T16:47:08Z

Nezablaznik: New page: Let.it.bee je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je zasnovala skupina podiplomskih študentov iz Univerze São Paulo v Braziliji. Z njim so se uvrstili med prvih deset ekip v kategoriji podi...

Seminarji SB 2021/22

2022-03-30T16:29:16Z

Nezablaznik:

Seminarji SB 2021/22

2022-03-30T16:28:26Z

Nezablaznik:

Seminarji SB 2021/22

2022-03-30T16:26:53Z

Nezablaznik:

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-30T09:52:06Z

Nezablaznik: /* Razvoj ideje */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem nezadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog, da kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto ter slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Problem prenosa imunogenih molekul do rastlin so rešili z uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in N-končni del elongacijskega faktorja Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo ''E. coli tolB'', za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev ''E.coli'' BL21 ''omp8'', pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da ne bodo v celoti sintetizirali plazmida, ampak bodo sintetizirali posamezne fragmente, ki jih bodo kasneje ligirali z uporabo sistema Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Vse skupaj so ligirali po sistemu Golden Gate. Prednost takega načina izgradnje je, da bi lahko enostavno zamenjali zapis za PAMP-e ali membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:

• inducibilni promotor pBAD (BBa_I0500)

• srednje močan RBS

• zapis za ClyA (BBa_K811000)

• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)

• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)

• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)

• zapis za flg22 (BBa_K3286138)

• zapis za elf18 (BBa_K3989023)

• dvojni terminator (BBa_B0010)

Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji ''E. coli tolB'' je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če vezikli, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če vezikli z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E''. coli'' BL21 ''omp8'', ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline ''Arabidopsis thaliana'', za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi ''Arabidopsis thaliana''. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. nekih signalnih molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano. Zaradi večje stabilnosti taka bakterija proizvaja manj veziklov zunanje membrane. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, kar pomeni uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razvoj neke alternative, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Najprej so uspešno induciranje imunskega odgovora potrdili s preprostimi testi v laboratoriju, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. Za lažje delo skupin, ki bi raziskovale to področje so naredili tudi obsežno statistično analizo rezultatov. V anketah so dobili tudi pozitivno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-29T19:00:56Z

Nezablaznik: /* Gensko modificirane bakterije */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem nezadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog, da kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto ter slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Problem prenosa imunogenih molekul do rastlin so rešili z uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo ''E. coli tolB'', za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev ''E.coli'' BL21 ''omp8'', pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da ne bodo v celoti sintetizirali plazmida, ampak bodo sintetizirali posamezne fragmente, ki jih bodo kasneje ligirali z uporabo sistema Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Vse skupaj so ligirali po sistemu Golden Gate. Prednost takega načina izgradnje je, da bi lahko enostavno zamenjali zapis za PAMP-e ali membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:

• inducibilni promotor pBAD (BBa_I0500)

• srednje močan RBS

• zapis za ClyA (BBa_K811000)

• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)

• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)

• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)

• zapis za flg22 (BBa_K3286138)

• zapis za elf18 (BBa_K3989023)

• dvojni terminator (BBa_B0010)

Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji ''E. coli tolB'' je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če vezikli, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če vezikli z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E''. coli'' BL21 ''omp8'', ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline ''Arabidopsis thaliana'', za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi ''Arabidopsis thaliana''. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. nekih signalnih molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano. Zaradi večje stabilnosti taka bakterija proizvaja manj veziklov zunanje membrane. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, kar pomeni uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razvoj neke alternative, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Najprej so uspešno induciranje imunskega odgovora potrdili s preprostimi testi v laboratoriju, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. Za lažje delo skupin, ki bi raziskovale to področje so naredili tudi obsežno statistično analizo rezultatov. V anketah so dobili tudi pozitivno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-29T18:54:31Z

Nezablaznik: /* Gensko modificirane bakterije */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem nezadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog, da kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto ter slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Problem prenosa imunogenih molekul do rastlin so rešili z uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo ''E. coli tolB'', za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev ''E.coli'' BL21 ''omp8'', pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da ne bodo v celoti sintetizirali plazmida, ampak bodo sintetizirali posamezne fragmente, ki jih bodo kasneje ligirali z uporabo sistema Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Vse skupaj so ligirali po sistemu Golden Gate. Prednost takega načina izgradnje je, da bi lahko enostavno zamenjali zapis za PAMP-e ali membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:

• inducibilni promotor pBAD (BBa_I0500)

• srednje močan RBS

• zapis za ClyA (BBa_K811000)

• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)

• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)

• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)

• zapis za flg22 (BBa_K3286138)

• zapis za elf18 (BBa_K3989023)

• dvojni terminator (BBa_B0010)

Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji ''E. coli tolB'' je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če vezikli, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če vezikli z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E''. coli'' BL21 ''omp8'', ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline ''Arabidopsis thaliana'', za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi ''Arabidopsis thaliana''. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. nekih signalnih molekul, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano. Zaradi čje stabilnosti taka bakterija proizvaja manj veziklov zunanje membrane. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, kar pomeni uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razvoj neke alternative, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Najprej so uspešno induciranje imunskega odgovora potrdili s preprostimi testi v laboratoriju, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. Za lažje delo skupin, ki bi raziskovale to področje so naredili tudi obsežno statistično analizo rezultatov. V anketah so dobili tudi pozitivno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-29T18:50:50Z

Nezablaznik: /* Golden Gate */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem nezadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog, da kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto ter slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Problem prenosa imunogenih molekul do rastlin so rešili z uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo ''E. coli tolB'', za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev ''E.coli'' BL21 ''omp8'', pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da ne bodo v celoti sintetizirali plazmida, ampak bodo sintetizirali posamezne fragmente, ki jih bodo kasneje ligirali z uporabo sistema Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Vse skupaj so ligirali po sistemu Golden Gate. Prednost takega načina izgradnje je, da bi lahko enostavno zamenjali zapis za PAMP-e ali membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:

• inducibilni promotor pBAD (BBa_I0500)

• srednje močan RBS

• zapis za ClyA (BBa_K811000)

• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)

• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)

• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)

• zapis za flg22 (BBa_K3286138)

• zapis za elf18 (BBa_K3989023)

• dvojni terminator (BBa_B0010)

Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji ''E. coli tolB'' je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če vezikli, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če vezikli z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E''. coli'' BL21 ''omp8'', ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline ''Arabidopsis thaliana'', za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi ''Arabidopsis thaliana''. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano. Zaradi čje stabilnosti taka bakterija proizvaja manj veziklov zunanje membrane. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, kar pomeni uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razvoj neke alternative, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Najprej so uspešno induciranje imunskega odgovora potrdili s preprostimi testi v laboratoriju, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. Za lažje delo skupin, ki bi raziskovale to področje so naredili tudi obsežno statistično analizo rezultatov. V anketah so dobili tudi pozitivno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-29T18:47:00Z

Nezablaznik: /* Konstrukt */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem nezadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog, da kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto ter slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Problem prenosa imunogenih molekul do rastlin so rešili z uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo ''E. coli tolB'', za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev ''E.coli'' BL21 ''omp8'', pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da ne bodo v celoti sintetizirali plazmida, ampak bodo sintetizirali posamezne fragmente, ki jih bodo kasneje ligirali z uporabo sistema Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da bi lahko enostavno zamenjali zapis za PAMP-e ali membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:

• inducibilni promotor pBAD (BBa_I0500)

• srednje močan RBS

• zapis za ClyA (BBa_K811000)

• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)

• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)

• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)

• zapis za flg22 (BBa_K3286138)

• zapis za elf18 (BBa_K3989023)

• dvojni terminator (BBa_B0010)

Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji ''E. coli tolB'' je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če vezikli, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če vezikli z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E''. coli'' BL21 ''omp8'', ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline ''Arabidopsis thaliana'', za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi ''Arabidopsis thaliana''. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano. Zaradi čje stabilnosti taka bakterija proizvaja manj veziklov zunanje membrane. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, kar pomeni uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razvoj neke alternative, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Najprej so uspešno induciranje imunskega odgovora potrdili s preprostimi testi v laboratoriju, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. Za lažje delo skupin, ki bi raziskovale to področje so naredili tudi obsežno statistično analizo rezultatov. V anketah so dobili tudi pozitivno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-29T17:53:58Z

Nezablaznik: /* Načrtovanje konstrukta */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem nezadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog, da kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto ter slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Problem prenosa imunogenih molekul do rastlin so rešili z uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo ''E. coli tolB'', za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev ''E.coli'' BL21 ''omp8'', pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da ne bodo v celoti sintetizirali plazmida, ampak bodo sintetizirali posamezne fragmente, ki jih bodo kasneje ligirali z uporabo sistema Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da bi lahko enostavno zamenjali zapis za PAMP-e ali membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:

• inducibilni promotor araBAD (BBa_I0500)

• srednje močan RBS

• zapis za ClyA (BBa_K811000)

• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)

• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)

• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)

• zapis za flg22 (BBa_K3286138)

• zapis za elf18 (BBa_K3989023)

• dvojni terminator (BBa_B0010)

Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji ''E. coli tolB'' je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če vezikli, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če vezikli z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E''. coli'' BL21 ''omp8'', ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline ''Arabidopsis thaliana'', za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi ''Arabidopsis thaliana''. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano. Zaradi čje stabilnosti taka bakterija proizvaja manj veziklov zunanje membrane. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, kar pomeni uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razvoj neke alternative, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Najprej so uspešno induciranje imunskega odgovora potrdili s preprostimi testi v laboratoriju, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. Za lažje delo skupin, ki bi raziskovale to področje so naredili tudi obsežno statistično analizo rezultatov. V anketah so dobili tudi pozitivno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-28T14:25:34Z

Nezablaznik: /* Zaključek */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem nezadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog, da kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto ter slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Problem prenosa imunogenih molekul do rastlin so rešili z uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo ''E. coli tolB'', za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev ''E.coli'' BL21 ''omp8'', pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da bodo plazmid pripravili po sistemu Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da lahko enostavno zamenjaš zapis za PAMP-e in membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:

• inducibilni promotor araBAD (BBa_I0500)

• srednje močan RBS

• zapis za ClyA (BBa_K811000)

• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)

• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)

• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)

• zapis za flg22 (BBa_K3286138)

• zapis za elf18 (BBa_K3989023)

• dvojni terminator (BBa_B0010)

Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji ''E. coli tolB'' je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če vezikli, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če vezikli z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E''. coli'' BL21 ''omp8'', ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline ''Arabidopsis thaliana'', za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi ''Arabidopsis thaliana''. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano. Zaradi čje stabilnosti taka bakterija proizvaja manj veziklov zunanje membrane. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, kar pomeni uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razvoj neke alternative, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Najprej so uspešno induciranje imunskega odgovora potrdili s preprostimi testi v laboratoriju, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. Za lažje delo skupin, ki bi raziskovale to področje so naredili tudi obsežno statistično analizo rezultatov. V anketah so dobili tudi pozitivno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-28T14:24:02Z

Nezablaznik: /* Gensko modificirane bakterije */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem nezadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog, da kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto ter slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Problem prenosa imunogenih molekul do rastlin so rešili z uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo ''E. coli tolB'', za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev ''E.coli'' BL21 ''omp8'', pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da bodo plazmid pripravili po sistemu Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da lahko enostavno zamenjaš zapis za PAMP-e in membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:

• inducibilni promotor araBAD (BBa_I0500)

• srednje močan RBS

• zapis za ClyA (BBa_K811000)

• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)

• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)

• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)

• zapis za flg22 (BBa_K3286138)

• zapis za elf18 (BBa_K3989023)

• dvojni terminator (BBa_B0010)

Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji ''E. coli tolB'' je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če vezikli, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če vezikli z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E''. coli'' BL21 ''omp8'', ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline ''Arabidopsis thaliana'', za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi ''Arabidopsis thaliana''. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano. Zaradi čje stabilnosti taka bakterija proizvaja manj veziklov zunanje membrane. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, ki je pomenila uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razviti neko alternativo, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Najprej so uspešno induciranje imunskega odgovora potrdili s preprostimi testi v laboratoriju, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. Za lažje delo skupin, ki bi raziskovale to področje so naredili tudi obsežno statistično analizo rezultatov. V anketah so dobili tudi pozitivno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-28T14:21:10Z

Nezablaznik: /* Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem nezadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog, da kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto ter slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Problem prenosa imunogenih molekul do rastlin so rešili z uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo ''E. coli tolB'', za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev ''E.coli'' BL21 ''omp8'', pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da bodo plazmid pripravili po sistemu Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da lahko enostavno zamenjaš zapis za PAMP-e in membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:

• inducibilni promotor araBAD (BBa_I0500)

• srednje močan RBS

• zapis za ClyA (BBa_K811000)

• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)

• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)

• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)

• zapis za flg22 (BBa_K3286138)

• zapis za elf18 (BBa_K3989023)

• dvojni terminator (BBa_B0010)

Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji ''E. coli tolB'' je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če vezikli, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če vezikli z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E''. coli'' BL21 ''omp8'', ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline ''Arabidopsis thaliana'', za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi ''Arabidopsis thaliana''. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano, kar onemogoča hipervaskulacijo. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, ki je pomenila uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razviti neko alternativo, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Najprej so uspešno induciranje imunskega odgovora potrdili s preprostimi testi v laboratoriju, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. Za lažje delo skupin, ki bi raziskovale to področje so naredili tudi obsežno statistično analizo rezultatov. V anketah so dobili tudi pozitivno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-28T14:19:03Z

Nezablaznik: /* Konstrukt */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem nezadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog, da kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto ter slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Problem prenosa imunogenih molekul do rastlin so rešili z uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo ''E. coli tolB'', za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev ''E.coli'' BL21 ''omp8'', pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da bodo plazmid pripravili po sistemu Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da lahko enostavno zamenjaš zapis za PAMP-e in membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:

• inducibilni promotor araBAD (BBa_I0500)

• srednje močan RBS

• zapis za ClyA (BBa_K811000)

• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)

• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)

• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)

• zapis za flg22 (BBa_K3286138)

• zapis za elf18 (BBa_K3989023)

• dvojni terminator (BBa_B0010)

Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji E. coli tolB je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če OMV, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če OMV z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E. coli BL21 omp8, ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline Arabidopsis thaliana, za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi Arabidopsis thaliana. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano, kar onemogoča hipervaskulacijo. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, ki je pomenila uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razviti neko alternativo, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Najprej so uspešno induciranje imunskega odgovora potrdili s preprostimi testi v laboratoriju, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. Za lažje delo skupin, ki bi raziskovale to področje so naredili tudi obsežno statistično analizo rezultatov. V anketah so dobili tudi pozitivno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-28T14:18:50Z

Nezablaznik: /* Konstrukt */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem nezadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog, da kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto ter slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Problem prenosa imunogenih molekul do rastlin so rešili z uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo ''E. coli tolB'', za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev ''E.coli'' BL21 ''omp8'', pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da bodo plazmid pripravili po sistemu Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da lahko enostavno zamenjaš zapis za PAMP-e in membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:
• inducibilni promotor araBAD (BBa_I0500)

• srednje močan RBS

• zapis za ClyA (BBa_K811000)

• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)

• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)

• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)

• zapis za flg22 (BBa_K3286138)

• zapis za elf18 (BBa_K3989023)

• dvojni terminator (BBa_B0010)

Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji E. coli tolB je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če OMV, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če OMV z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E. coli BL21 omp8, ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline Arabidopsis thaliana, za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi Arabidopsis thaliana. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano, kar onemogoča hipervaskulacijo. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, ki je pomenila uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razviti neko alternativo, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Najprej so uspešno induciranje imunskega odgovora potrdili s preprostimi testi v laboratoriju, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. Za lažje delo skupin, ki bi raziskovale to področje so naredili tudi obsežno statistično analizo rezultatov. V anketah so dobili tudi pozitivno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-28T14:16:25Z

Nezablaznik: /* Razvoj ideje */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem nezadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog, da kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto ter slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Problem prenosa imunogenih molekul do rastlin so rešili z uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo ''E. coli tolB'', za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev ''E.coli'' BL21 ''omp8'', pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da bodo plazmid pripravili po sistemu Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da lahko enostavno zamenjaš zapis za PAMP-e in membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:
• inducibilni promotor araBAD (BBa_I0500)
• srednje močan RBS
• zapis za ClyA (BBa_K811000)
• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)
• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)
• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)
• zapis za flg22 (BBa_K3286138)
• zapis za elf18 (BBa_K3989023)
• dvojni terminator (BBa_B0010)
Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji E. coli tolB je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če OMV, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če OMV z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E. coli BL21 omp8, ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline Arabidopsis thaliana, za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi Arabidopsis thaliana. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano, kar onemogoča hipervaskulacijo. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, ki je pomenila uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razviti neko alternativo, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Najprej so uspešno induciranje imunskega odgovora potrdili s preprostimi testi v laboratoriju, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. Za lažje delo skupin, ki bi raziskovale to področje so naredili tudi obsežno statistično analizo rezultatov. V anketah so dobili tudi pozitivno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-28T14:15:34Z

Nezablaznik: /* Ideja - BOOM V */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem nezadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog, da kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto ter slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Problem prenosa imunogenih molekul do rastlin so rešili z uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo E. coli tolB, za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev E.coli BL21 omp8, pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da bodo plazmid pripravili po sistemu Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da lahko enostavno zamenjaš zapis za PAMP-e in membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:
• inducibilni promotor araBAD (BBa_I0500)
• srednje močan RBS
• zapis za ClyA (BBa_K811000)
• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)
• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)
• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)
• zapis za flg22 (BBa_K3286138)
• zapis za elf18 (BBa_K3989023)
• dvojni terminator (BBa_B0010)
Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji E. coli tolB je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če OMV, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če OMV z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E. coli BL21 omp8, ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline Arabidopsis thaliana, za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi Arabidopsis thaliana. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano, kar onemogoča hipervaskulacijo. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, ki je pomenila uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razviti neko alternativo, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Najprej so uspešno induciranje imunskega odgovora potrdili s preprostimi testi v laboratoriju, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. Za lažje delo skupin, ki bi raziskovale to področje so naredili tudi obsežno statistično analizo rezultatov. V anketah so dobili tudi pozitivno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-28T14:10:44Z

Nezablaznik: /* Uvod */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem nezadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog, da kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto ter slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Potrebovali so le še način kako bi te imunogene molekule prenesli do rastlin. Odločili so se za uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo E. coli tolB, za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev E.coli BL21 omp8, pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da bodo plazmid pripravili po sistemu Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da lahko enostavno zamenjaš zapis za PAMP-e in membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:
• inducibilni promotor araBAD (BBa_I0500)
• srednje močan RBS
• zapis za ClyA (BBa_K811000)
• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)
• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)
• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)
• zapis za flg22 (BBa_K3286138)
• zapis za elf18 (BBa_K3989023)
• dvojni terminator (BBa_B0010)
Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji E. coli tolB je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če OMV, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če OMV z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E. coli BL21 omp8, ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline Arabidopsis thaliana, za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi Arabidopsis thaliana. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano, kar onemogoča hipervaskulacijo. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, ki je pomenila uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razviti neko alternativo, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Najprej so uspešno induciranje imunskega odgovora potrdili s preprostimi testi v laboratoriju, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. Za lažje delo skupin, ki bi raziskovale to področje so naredili tudi obsežno statistično analizo rezultatov. V anketah so dobili tudi pozitivno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-28T14:05:04Z

Nezablaznik: /* Rezultati testiranja delovanja produkta */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem zadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog zaradi katerega kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto in slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Potrebovali so le še način kako bi te imunogene molekule prenesli do rastlin. Odločili so se za uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo E. coli tolB, za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev E.coli BL21 omp8, pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da bodo plazmid pripravili po sistemu Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da lahko enostavno zamenjaš zapis za PAMP-e in membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:
• inducibilni promotor araBAD (BBa_I0500)
• srednje močan RBS
• zapis za ClyA (BBa_K811000)
• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)
• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)
• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)
• zapis za flg22 (BBa_K3286138)
• zapis za elf18 (BBa_K3989023)
• dvojni terminator (BBa_B0010)
Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja odziva rastlin na BOOM V'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji E. coli tolB je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če OMV, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če OMV z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E. coli BL21 omp8, ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline Arabidopsis thaliana, za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi Arabidopsis thaliana. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano, kar onemogoča hipervaskulacijo. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, ki je pomenila uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razviti neko alternativo, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Najprej so uspešno induciranje imunskega odgovora potrdili s preprostimi testi v laboratoriju, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. Za lažje delo skupin, ki bi raziskovale to področje so naredili tudi obsežno statistično analizo rezultatov. V anketah so dobili tudi pozitivno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-28T14:01:37Z

Nezablaznik:

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem zadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog zaradi katerega kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto in slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Potrebovali so le še način kako bi te imunogene molekule prenesli do rastlin. Odločili so se za uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo E. coli tolB, za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev E.coli BL21 omp8, pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da bodo plazmid pripravili po sistemu Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da lahko enostavno zamenjaš zapis za PAMP-e in membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:
• inducibilni promotor araBAD (BBa_I0500)
• srednje močan RBS
• zapis za ClyA (BBa_K811000)
• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)
• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)
• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)
• zapis za flg22 (BBa_K3286138)
• zapis za elf18 (BBa_K3989023)
• dvojni terminator (BBa_B0010)
Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja delovanja produkta'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji E. coli tolB je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če OMV, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če OMV z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E. coli BL21 omp8, ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline Arabidopsis thaliana, za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi Arabidopsis thaliana. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano, kar onemogoča hipervaskulacijo. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, ki je pomenila uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razviti neko alternativo, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Najprej so uspešno induciranje imunskega odgovora potrdili s preprostimi testi v laboratoriju, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. Za lažje delo skupin, ki bi raziskovale to področje so naredili tudi obsežno statistično analizo rezultatov. V anketah so dobili tudi pozitivno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-28T13:33:06Z

Nezablaznik: /* Viri */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem zadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog zaradi katerega kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto in slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Potrebovali so le še način kako bi te imunogene molekule prenesli do rastlin. Odločili so se za uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo E. coli tolB, za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev E.coli BL21 omp8, pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da bodo plazmid pripravili po sistemu Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da lahko enostavno zamenjaš zapis za PAMP-e in membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:
• inducibilni promotor araBAD (BBa_I0500)
• srednje močan RBS
• zapis za ClyA (BBa_K811000)
• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)
• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)
• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)
• zapis za flg22 (BBa_K3286138)
• zapis za elf18 (BBa_K3989023)
• dvojni terminator (BBa_B0010)
Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja delovanja produkta'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji E. coli tolB je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če OMV, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če OMV z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E. coli BL21 omp8, ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline Arabidopsis thaliana, za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi Arabidopsis thaliana. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano, kar onemogoča hipervaskulacijo. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, ki je pomenila uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razviti neko alternativo, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Delovanje produkta so potrdili preprostimi testi v laboratorijo, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. V anketah so dobili tudi pozitiveno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646

[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.

[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202

[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R

[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12

[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-28T13:32:43Z

Nezablaznik: /* Viri */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem zadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog zaradi katerega kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto in slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Potrebovali so le še način kako bi te imunogene molekule prenesli do rastlin. Odločili so se za uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo E. coli tolB, za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev E.coli BL21 omp8, pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da bodo plazmid pripravili po sistemu Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da lahko enostavno zamenjaš zapis za PAMP-e in membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:
• inducibilni promotor araBAD (BBa_I0500)
• srednje močan RBS
• zapis za ClyA (BBa_K811000)
• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)
• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)
• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)
• zapis za flg22 (BBa_K3286138)
• zapis za elf18 (BBa_K3989023)
• dvojni terminator (BBa_B0010)
Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja delovanja produkta'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji E. coli tolB je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če OMV, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če OMV z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E. coli BL21 omp8, ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline Arabidopsis thaliana, za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi Arabidopsis thaliana. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano, kar onemogoča hipervaskulacijo. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, ki je pomenila uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razviti neko alternativo, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Delovanje produkta so potrdili preprostimi testi v laboratorijo, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. V anketah so dobili tudi pozitiveno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)

[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646
[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.
[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202
[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R
[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12
[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-28T13:31:58Z

Nezablaznik: /* Gensko modificirane bakterije */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem zadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog zaradi katerega kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto in slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Potrebovali so le še način kako bi te imunogene molekule prenesli do rastlin. Odločili so se za uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo E. coli tolB, za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev E.coli BL21 omp8, pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da bodo plazmid pripravili po sistemu Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da lahko enostavno zamenjaš zapis za PAMP-e in membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:
• inducibilni promotor araBAD (BBa_I0500)
• srednje močan RBS
• zapis za ClyA (BBa_K811000)
• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)
• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)
• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)
• zapis za flg22 (BBa_K3286138)
• zapis za elf18 (BBa_K3989023)
• dvojni terminator (BBa_B0010)
Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja delovanja produkta'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji E. coli tolB je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če OMV, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če OMV z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E. coli BL21 omp8, ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline Arabidopsis thaliana, za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi Arabidopsis thaliana. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

===Gensko modificirane bakterije===

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano, kar onemogoča hipervaskulacijo. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, ki je pomenila uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razviti neko alternativo, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Delovanje produkta so potrdili preprostimi testi v laboratorijo, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. V anketah so dobili tudi pozitiveno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)
[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646
[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.
[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202
[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R
[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12
[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-28T13:31:45Z

Nezablaznik: /* Sprej */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem zadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog zaradi katerega kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto in slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Potrebovali so le še način kako bi te imunogene molekule prenesli do rastlin. Odločili so se za uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo E. coli tolB, za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev E.coli BL21 omp8, pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da bodo plazmid pripravili po sistemu Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da lahko enostavno zamenjaš zapis za PAMP-e in membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:
• inducibilni promotor araBAD (BBa_I0500)
• srednje močan RBS
• zapis za ClyA (BBa_K811000)
• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)
• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)
• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)
• zapis za flg22 (BBa_K3286138)
• zapis za elf18 (BBa_K3989023)
• dvojni terminator (BBa_B0010)
Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja delovanja produkta'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji E. coli tolB je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če OMV, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če OMV z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E. coli BL21 omp8, ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline Arabidopsis thaliana, za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi Arabidopsis thaliana. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

===Sprej===

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

==Gensko modificirane bakterije==

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano, kar onemogoča hipervaskulacijo. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, ki je pomenila uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razviti neko alternativo, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Delovanje produkta so potrdili preprostimi testi v laboratorijo, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. V anketah so dobili tudi pozitiveno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)
[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646
[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.
[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202
[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R
[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12
[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-28T13:31:31Z

Nezablaznik: /* Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem zadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog zaradi katerega kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto in slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Potrebovali so le še način kako bi te imunogene molekule prenesli do rastlin. Odločili so se za uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo E. coli tolB, za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev E.coli BL21 omp8, pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da bodo plazmid pripravili po sistemu Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da lahko enostavno zamenjaš zapis za PAMP-e in membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:
• inducibilni promotor araBAD (BBa_I0500)
• srednje močan RBS
• zapis za ClyA (BBa_K811000)
• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)
• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)
• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)
• zapis za flg22 (BBa_K3286138)
• zapis za elf18 (BBa_K3989023)
• dvojni terminator (BBa_B0010)
Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja delovanja produkta'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji E. coli tolB je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če OMV, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če OMV z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E. coli BL21 omp8, ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline Arabidopsis thaliana, za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

===Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)===

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi Arabidopsis thaliana. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

==Sprej==

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

==Gensko modificirane bakterije==

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano, kar onemogoča hipervaskulacijo. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, ki je pomenila uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razviti neko alternativo, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Delovanje produkta so potrdili preprostimi testi v laboratorijo, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. V anketah so dobili tudi pozitiveno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)
[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646
[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.
[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202
[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R
[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12
[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-28T13:31:18Z

Nezablaznik: /* Test inhibicije rasti semen (SGI) */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem zadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog zaradi katerega kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto in slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Potrebovali so le še način kako bi te imunogene molekule prenesli do rastlin. Odločili so se za uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo E. coli tolB, za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev E.coli BL21 omp8, pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da bodo plazmid pripravili po sistemu Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da lahko enostavno zamenjaš zapis za PAMP-e in membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:
• inducibilni promotor araBAD (BBa_I0500)
• srednje močan RBS
• zapis za ClyA (BBa_K811000)
• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)
• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)
• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)
• zapis za flg22 (BBa_K3286138)
• zapis za elf18 (BBa_K3989023)
• dvojni terminator (BBa_B0010)
Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja delovanja produkta'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji E. coli tolB je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če OMV, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če OMV z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E. coli BL21 omp8, ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

===Test inhibicije rasti semen (SGI)===

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline Arabidopsis thaliana, za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

==Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)==

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi Arabidopsis thaliana. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

==Sprej==

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

==Gensko modificirane bakterije==

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano, kar onemogoča hipervaskulacijo. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, ki je pomenila uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razviti neko alternativo, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Delovanje produkta so potrdili preprostimi testi v laboratorijo, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. V anketah so dobili tudi pozitiveno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)
[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646
[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.
[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202
[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R
[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12
[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-28T13:31:04Z

Nezablaznik: /* Western blot */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem zadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog zaradi katerega kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto in slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Potrebovali so le še način kako bi te imunogene molekule prenesli do rastlin. Odločili so se za uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo E. coli tolB, za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev E.coli BL21 omp8, pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da bodo plazmid pripravili po sistemu Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da lahko enostavno zamenjaš zapis za PAMP-e in membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:
• inducibilni promotor araBAD (BBa_I0500)
• srednje močan RBS
• zapis za ClyA (BBa_K811000)
• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)
• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)
• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)
• zapis za flg22 (BBa_K3286138)
• zapis za elf18 (BBa_K3989023)
• dvojni terminator (BBa_B0010)
Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja delovanja produkta'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji E. coli tolB je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če OMV, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če OMV z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

===Western blot===

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E. coli BL21 omp8, ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

== Test inhibicije rasti semen (SGI)==

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline Arabidopsis thaliana, za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

==Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)==

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi Arabidopsis thaliana. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

==Sprej==

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

==Gensko modificirane bakterije==

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano, kar onemogoča hipervaskulacijo. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, ki je pomenila uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razviti neko alternativo, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Delovanje produkta so potrdili preprostimi testi v laboratorijo, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. V anketah so dobili tudi pozitiveno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)
[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646
[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.
[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202
[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R
[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12
[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-28T13:30:53Z

Nezablaznik: /* Konstrukt */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem zadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog zaradi katerega kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto in slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Potrebovali so le še način kako bi te imunogene molekule prenesli do rastlin. Odločili so se za uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo E. coli tolB, za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev E.coli BL21 omp8, pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da bodo plazmid pripravili po sistemu Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da lahko enostavno zamenjaš zapis za PAMP-e in membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

===Konstrukt===

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:
• inducibilni promotor araBAD (BBa_I0500)
• srednje močan RBS
• zapis za ClyA (BBa_K811000)
• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)
• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)
• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)
• zapis za flg22 (BBa_K3286138)
• zapis za elf18 (BBa_K3989023)
• dvojni terminator (BBa_B0010)
Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja delovanja produkta'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji E. coli tolB je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če OMV, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če OMV z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

==Western blot==

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E. coli BL21 omp8, ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

== Test inhibicije rasti semen (SGI)==

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline Arabidopsis thaliana, za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

==Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)==

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi Arabidopsis thaliana. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

==Sprej==

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

==Gensko modificirane bakterije==

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano, kar onemogoča hipervaskulacijo. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, ki je pomenila uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razviti neko alternativo, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Delovanje produkta so potrdili preprostimi testi v laboratorijo, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. V anketah so dobili tudi pozitiveno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)
[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646
[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.
[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202
[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R
[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12
[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-28T13:30:40Z

Nezablaznik: /* Golden Gate */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem zadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog zaradi katerega kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto in slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Potrebovali so le še način kako bi te imunogene molekule prenesli do rastlin. Odločili so se za uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo E. coli tolB, za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev E.coli BL21 omp8, pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da bodo plazmid pripravili po sistemu Golden Gate.

===Golden Gate===

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da lahko enostavno zamenjaš zapis za PAMP-e in membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

==Konstrukt==

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:
• inducibilni promotor araBAD (BBa_I0500)
• srednje močan RBS
• zapis za ClyA (BBa_K811000)
• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)
• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)
• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)
• zapis za flg22 (BBa_K3286138)
• zapis za elf18 (BBa_K3989023)
• dvojni terminator (BBa_B0010)
Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja delovanja produkta'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji E. coli tolB je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če OMV, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če OMV z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

==Western blot==

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E. coli BL21 omp8, ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

== Test inhibicije rasti semen (SGI)==

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline Arabidopsis thaliana, za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

==Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)==

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi Arabidopsis thaliana. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

==Sprej==

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

==Gensko modificirane bakterije==

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano, kar onemogoča hipervaskulacijo. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, ki je pomenila uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razviti neko alternativo, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Delovanje produkta so potrdili preprostimi testi v laboratorijo, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. V anketah so dobili tudi pozitiveno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)
[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646
[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.
[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202
[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R
[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12
[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-28T13:30:21Z

Nezablaznik: /* ==Razvoj ideje */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem zadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog zaradi katerega kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto in slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Potrebovali so le še način kako bi te imunogene molekule prenesli do rastlin. Odločili so se za uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

===Razvoj ideje===

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo E. coli tolB, za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev E.coli BL21 omp8, pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da bodo plazmid pripravili po sistemu Golden Gate.

==Golden Gate==

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da lahko enostavno zamenjaš zapis za PAMP-e in membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

==Konstrukt==

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:
• inducibilni promotor araBAD (BBa_I0500)
• srednje močan RBS
• zapis za ClyA (BBa_K811000)
• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)
• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)
• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)
• zapis za flg22 (BBa_K3286138)
• zapis za elf18 (BBa_K3989023)
• dvojni terminator (BBa_B0010)
Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja delovanja produkta'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji E. coli tolB je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če OMV, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če OMV z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

==Western blot==

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E. coli BL21 omp8, ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

== Test inhibicije rasti semen (SGI)==

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline Arabidopsis thaliana, za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

==Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)==

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi Arabidopsis thaliana. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

==Sprej==

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

==Gensko modificirane bakterije==

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano, kar onemogoča hipervaskulacijo. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, ki je pomenila uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razviti neko alternativo, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Delovanje produkta so potrdili preprostimi testi v laboratorijo, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. V anketah so dobili tudi pozitiveno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)
[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646
[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.
[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202
[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R
[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12
[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-28T13:30:03Z

Nezablaznik: /* Razvoj ideje */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem zadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog zaradi katerega kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto in slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Potrebovali so le še način kako bi te imunogene molekule prenesli do rastlin. Odločili so se za uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

====Razvoj ideje==

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo E. coli tolB, za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev E.coli BL21 omp8, pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da bodo plazmid pripravili po sistemu Golden Gate.

==Golden Gate==

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da lahko enostavno zamenjaš zapis za PAMP-e in membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

==Konstrukt==

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:
• inducibilni promotor araBAD (BBa_I0500)
• srednje močan RBS
• zapis za ClyA (BBa_K811000)
• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)
• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)
• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)
• zapis za flg22 (BBa_K3286138)
• zapis za elf18 (BBa_K3989023)
• dvojni terminator (BBa_B0010)
Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja delovanja produkta'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji E. coli tolB je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če OMV, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če OMV z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

==Western blot==

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E. coli BL21 omp8, ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

== Test inhibicije rasti semen (SGI)==

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline Arabidopsis thaliana, za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

==Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)==

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi Arabidopsis thaliana. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

==Sprej==

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

==Gensko modificirane bakterije==

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano, kar onemogoča hipervaskulacijo. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, ki je pomenila uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razviti neko alternativo, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Delovanje produkta so potrdili preprostimi testi v laboratorijo, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. V anketah so dobili tudi pozitiveno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)
[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646
[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.
[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202
[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R
[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12
[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-28T13:28:30Z

Nezablaznik:

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

Avtorica povzetka: Eva Gartner

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem zadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog zaradi katerega kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto in slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Potrebovali so le še način kako bi te imunogene molekule prenesli do rastlin. Odločili so se za uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

==Razvoj ideje==

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo E. coli tolB, za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev E.coli BL21 omp8, pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da bodo plazmid pripravili po sistemu Golden Gate.

==Golden Gate==

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da lahko enostavno zamenjaš zapis za PAMP-e in membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

==Konstrukt==

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:
• inducibilni promotor araBAD (BBa_I0500)
• srednje močan RBS
• zapis za ClyA (BBa_K811000)
• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)
• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)
• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)
• zapis za flg22 (BBa_K3286138)
• zapis za elf18 (BBa_K3989023)
• dvojni terminator (BBa_B0010)
Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja delovanja produkta'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji E. coli tolB je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če OMV, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če OMV z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

==Western blot==

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E. coli BL21 omp8, ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

== Test inhibicije rasti semen (SGI)==

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline Arabidopsis thaliana, za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

==Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)==

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi Arabidopsis thaliana. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

==Sprej==

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

==Gensko modificirane bakterije==

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano, kar onemogoča hipervaskulacijo. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, ki je pomenila uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razviti neko alternativo, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Delovanje produkta so potrdili preprostimi testi v laboratorijo, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. V anketah so dobili tudi pozitiveno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)
[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646
[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.
[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202
[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R
[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12
[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-28T13:27:31Z

Nezablaznik: /* Uvod */

BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti okolju in zdravju bolj prijazno alternativo sintetičnim pesticidom, pri čemer so izkoristili naravni imunski sistem rastlin.

Spletna stran projekta BOOM V, iGEM 2021: [https://2021.igem.org/Team:UZurich https://2021.igem.org/Team:UZurich]

=='''Uvod'''==

Število svetovnega prebivalstva vsako leto narašča, s čimer se povečuje problem zadostne preskrbe s hrano. Vsako leto namreč narašča odstotek ljudi, ki je nimajo dovolj. Soočamo se tudi s pomanjkanjem kmetijskih površin, zato moramo najti način kako pridelati čim več hrane na čim manjši površini. To je glavni razlog zaradi katerega kmetje uporabljajo vedno večje količine sintetičnih pesticidov za obrambo rastlin pred patogenimi organizmi in posledično uničujejo biodiverziteto in slabijo zemljo. Skupina študentov iz Švice je pri svojem projektu iskala nov, alternativen pristop, ki bi vplival le na tarčne organizme in ne bi imel negativnih učinkov na okolje in zdravje ljudi [1].

=='''Ideja - BOOM V'''==

Težave s patogenimi organizmi so se lotili na nekoliko drugačen način. Namesto, da bi ciljali direktno na ubijanje patogenov so se odločili, da bodo izkoristili naravni obrambni mehanizem rastlin. Spodbudili bi delovanje rastlinskega imunskega sistema in njenih obrambnih mehanizmov, še preden rastlina pride v stik s patogenom in jo na tak način okrepili in naredili bolj odporno [1].
Njihova ideja je bila, da stimulirajo delovanje PTI (angl. »pattern triggered immunity«). To je prva obrambna linija rastline ob stiku s patogenom, ki se sproži ob prepoznavanju ti. PAMP-ov (angl. »pathogen-associated molecular patterns«), dobro ohranjenih molekul, ki so karakteristične za posamezne skupine patogenov. Prepoznajo jih posebni receptorji na celični membrani, PRR (angl. »patteren recognition receptor«), ki potem aktivirajo PTI. Ta obrambni odziv ni specifičen, ampak se rastlina odzove prek več različnih mehanizmov kot so povečanje koncentracije kalcija, povečana proizvodnjo kisikovih reaktivnih snovi, fitohormonov, spremembo transkriptoma itd. [1, 2, 3]. Potrebovali so le še način kako bi te imunogene molekule prenesli do rastlin. Odločili so se za uporabo veziklov zunanje membrane (OMV), ki jih naravno proizvajajo gramnegativne bakterije. Prednost, ki jo predstavljajo, je enostaven nastanek in dejstvo, da je njihova sestava enaka sestavi zunanje membrane bakterij, ki jih proizvajajo. Njihov načrt je bil, da imunogene molekule (PAMP-e) izrazijo na zunanji membrani bakterij in jih preko veziklov dostavijo do rastlin [1, 4, 5].

==Razvoj ideje==

Na podlagi predhodnih raziskav so se odločili, da bodo izrazili dve imunogeni molekuli: flagelin-22 (flg22) in elongacijski faktor Tu (elf18). ). Zanju so se odločili na podlagi literature, saj ti dve molekuli inducirata močan imunski odziv pri več vrstah rastlin. Prenos na zunanjo membrano so dosegli tako, da so ju prek linkerja vezali na membranski protein ClyA, značilen za bakterijo E.coli. Tudi to so izbrali na podlagi predhodnih raziskav. Zaradi nezadostne naravne proizvodnje OMV so za šasijo izbrali bakterijo E. coli tolB, za katero je značilna hipervaskulacija, za večjo imunogenost pa so uporabili sev E.coli BL21 omp8, pri katerem naj bi se na membrani izrazilo več imunogenih molekul [1].

=='''Načrtovanje konstrukta'''==

Po osnovanju ideje so se lotili načrtovanja konstrukta, s katerim bi transformirali celice. Po premisleku so se odločili, da bodo plazmid pripravili po sistemu Golden Gate.

==Golden Gate==

Kloniranje po sistemu Golden Gate omogoča sintezo več fragmentov DNA in njihovo združitev skupaj z uporabo restriktaz tipa IIS. Te so posebne v tem, da ne režejo v sredini prepoznavnih zaporedij, ampak izven njih in ustvarijo lepljive konce, dolge 4 bp, prek katerih lahko fragmente ligiraš v vektor [6]. Delali so z restriktazama Bsal in Bpil. Za osnovo so vzeli plazmid LII in sintetizirali fragment, ki je vseboval zapis za ClyA ter oznako 3x FLAG ter fragmenta, ki sta zapisovala za imunogeni molekuli. Fragmentom so dodali restrikcijsko mesto za BsaI ali Bpil in jih ligirali v vektor. Prednost takega načina izgradnje je, da lahko enostavno zamenjaš zapis za PAMP-e in membranski protein, saj imajo različne rastline različno močne odzive na posamezne molekule [1].

==Konstrukt==

Za izgradnjo konstrukta so uporabili že obstoječe biokocke. Pripravljen konstrukt je vseboval:
• inducibilni promotor araBAD (BBa_I0500)
• srednje močan RBS
• zapis za ClyA (BBa_K811000)
• oznaka 3 x FLAG (BBa_K823034)
• fleksibilni linker 2 x (GGGGS) (BBa_K1486004)
• daljši linker 3 x (GGSG) (BBa_K243006)
• zapis za flg22 (BBa_K3286138)
• zapis za elf18 (BBa_K3989023)
• dvojni terminator (BBa_B0010)
Končni vektor je poleg tega konstrukta vseboval še zapis za araC (regulator promotorja, represor v odsotnosti arabinoze in aktivator v prisotnosti arabinoze), mesto začetka replikacije za E. coli (Col E1) in selekcijski marker za odpornost proti antibiotiku ampicilinu [1].

=='''Rezultati testiranja delovanja produkta'''==

Po načrtovanju konstrukta in transformaciji E. coli tolB je sledilo testiranje produkta. V prvi fazi so želeli preveriti dve stvari:
a) če OMV, ki jih proizvajajo bakterije, po indukciji z arabinozo res izražajo fuzijski protein na membrani (preverili z Western Blot) in
b) če OMV z izraženimi imunogenimi molekulami res inducirajo imunski odgovor (preverili z dvema testoma: SGI in ROS).
Vse tri teste so izvedli s tremi različnimi izraženimi konstrukti in sicer samo ClyA, ClyA z vezanim elf18 ter ClyA z vezanim flg22.

==Western blot==

Za analizo so s plazmidi transformirali celice E. coli BL21 omp8, ki imajo na membrani izraženih več konstruktov. Izolirane vezikle so nanesli na gel in prenesli na membrano, ki so jo inkubirali s protitelesi proti oznaki FLAG. V vseh treh primerih so dobili liso pri približno 40 kDa, kar so tudi pričakovali [1].

== Test inhibicije rasti semen (SGI)==

Pri tem testu je merilo za moč imunskega odgovora rast semen. Bolj kot je ta zaustavljena, močnejši je imunski odziv. Pri eksperimentu so uporabili semena modelne rastline Arabidopsis thaliana, za katero je znano, da naj bi elf18 in flg22 močno stimulirala imunski odgovor. Rezultati so pokazali, da vezikli z izraženima fuzijskim proteinoma elf18 in flg22 inducirajo imunski odgovor, ki je močnejši kot pri samem ClyA, ki imunski odgovor inducira šele pri višjih koncentracijah [1, 7].

==Test prisotnosti reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS)==

Po prvem pozitivnem rezultatu so naredili še test prisotnosti kisikovih reaktivnih snovi, pri čemer višja koncentracija pomeni močnejši imunski odgovor. Tudi tu so rezultati potrdili, da konstrukti dejansko inducirajo imunski odgovor in pokazali, da elf18 v obeh primerih inducira precej večji odziv. Slednje so pričakovali, saj je ta bolj imunogen za rastline iz družine kamor sodi Arabidopsis thaliana. Vseeno pa odgovor še zdaleč ni bil tako močan kot pri pozitivni kontroli, kar bi lahko poskušali izboljšati z drugim fuzijskim proteinom z več ekstracelularnimi domenami, boljšimi šasijami [1, 7].

=='''Implementacija'''==

Razmišljali so o dveh možnih načinih uporabe: v obliki spreja ali s sprostitvijo gensko modificiranih bakterij (GMO) v okolje.

==Sprej==

Uporaba spreja je za enkrat bolj priljubljen način, saj ne vključuje sprostitve GMO v okolje, vendar ima tudi svoje pomanjkljivosti kot je npr. spiranje z dežjem. Omogoča pa uporabo produkta v državah s strogo regulativo glede uporabe gensko modificiranih organizmov.

==Gensko modificirane bakterije==

Druga ideja je bila, da bi v bakterije implementirali nek inducibilni sistem, ki bi se odzval na prisotnost patogenov oz. molekul iz razreda AHL, ki so zanje značilne. To bi bile lahko neke bakterije, ki so pogoste pri rastlinah in imajo nefunkcionalen oz. izbit gen za protein tolB, ki povezuje notranjo in zunanjo celično membrano, kar onemogoča hipervaskulacijo. Te bakterije bi transformirali s tremi vektorji: prvi bi vseboval naš konstrukt, drugi zapis za proteazo TEV pod kontrolo lux promotorja (regulator luxR) in tretji zapis za protein tolB pod kontrolo promotorja PesaR (regulator EsaR). Zapis za protein tolB bi vseboval tri mesta, kjer lahko reže proteaza TEV in v kolikor bi bila ta prisotna, izražen protein ne bi bil funkcionalen. V odsotnosti patogena se bi tolB konstitutivno izražal in bi kompenziral pomanjkanje proteina tolB zaradi seva z izbitim genom. V prisotnosti AHL bo molekula EsaR raje interagirala s tem kot s promotorjem PesaR, zato se bo tolB nehal izražati. Hkrati pa bo z AHL interagirala tudi molekula luxR, kar bo sprožilo izražanje proteaze, ki bo cepila tolB. Koncentracija proteina tolB se bo posledično znižala in začela se bo hipervaskulacija [1].

=='''Zaključek'''==

Študentje so pri opisanem projektu izhajali iz mnenja kmetov, da za uspešno pridelavo hrane nujno potrebujejo zaščito pred patogenimi organizmi, ki je pomenila uporabo sintetičnih pesticidov. Kot izziv so si postavili razviti neko alternativo, ki bi rastline prav tako obvarovala pred napadom patogenov, a bi imela manj škodljivih učinkov na okolje in zdravje. Delovanje produkta so potrdili preprostimi testi v laboratorijo, nadaljevali pa bi s testi na dejanskih poljščinah in optimizacijo celotnega procesa. V anketah so dobili tudi pozitiveno povratno informacijo kmetov, kar jim je dalo zagon za nadaljnje delo.

=='''Viri'''==

[1] Team: UZurich – 2021.igem.org https://2021.igem.org/Team:UZurich (pridobljeno dne 20. 3. 2022)
[2] Hou, Shuguo et al. “Damage-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Plants.” Frontiers in plant science vol. 10 646. 22 May. 2019, doi:10.3389/fpls.2019.00646
[3] Bigeard, J., Colcombet, J. and Hirt, H., 2015. Signaling mechanisms in pattern-triggered immunity (PTI). Molecular Plant, 8(4), pp.521-539.
[4] Li, Ruizhen, and Liu Qiong. "Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Multifunctional Delivery Platforms." Frontiers in Materials vol. 7 202. 10. July. 2020, doi:10.3389/fmats.2020.00202
[5] Bahar, Ofir et al. “Bacterial Outer Membrane Vesicles Induce Plant Immune Responses.” Molecular plant-microbe interactions: MPMI vol. 29,5 (2016): 374-84. doi:10.1094/MPMI-12-15-0270-R
[6] Chiasson, D., Giménez-Oya, V., Bircheneder, M., Bachmaier, S., Studtrucker, T., Ryan, J., ... & Parniske, M. (2019). A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific reports, 9(1), 1-12
[7] Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., & Monaghan, J. (2019). Pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in Arabidopsis thaliana. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (147), e59437.

BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni

2022-03-28T13:08:18Z

Nezablaznik: New page: BOOM V je projekt iGEM iz leta 2021, ki ga je naredila skupina študentov iz Univerze v Zürichu. Z njim so se uvrstili na prvo mesto v kategoriji novih pristopov. Želeli so pripraviti ok...

Seminarji SB 2021/22

2022-03-28T11:11:57Z

Nezablaznik:

Seminarji SB 2021/22

2022-03-28T11:11:35Z

Nezablaznik: