Wiki FKKT - User contributions [en]

Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov

2023-05-16T07:17:54Z

Nezaribnikar: /* Zasnova sistema za uporabo v običajnih laboratorijskih sevih */

Povzeto po članku [https://www.nature.com/articles/s41467-022-34647-1 ''C. Barajas, HH. Huang,J. Gibson, L. Sansoval, D. Del Vecchio.: Feedforward growth rate control mitigates gene activation burden. Nat Commun, 2022, 13, 7054.'']

==Uvod==
Prekomerno izražanje heterolognih genov (angl. Gene of interest, GOI) izčrpa celične vire, še posebej ribosome. To breme zmanjša hitrost rasti celic in povzroči spremembe s slabo predvidljivimi posledicami, ki običajno ovirajo predvideno delovanje celice. Za ublažitev posledic izražanja GOI, so avtorji članka razvili sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki omogoča aktiviranje GOI do poljubne ravni, pri čemer rast celic ostane konstantna. To pa so dosegli s povečanjem hidrolize ppGpp [1].

Alarmona gvanozin tetrafosfat (ppGpp) in gvanozin pentafosfat (pppGpp) (imenujemo kar ppGpp) v celici koordinirata odziv na stres z obsežnim preklopom profila transkripcije. Pri tem pride do zaustavitve sinteze DNA, stabilnih RNA in ribosomov, začne pa se proizvodnja dejavnikov, ki so ključni za odpornost na stres, glikolizo in sintezo aminokislin. ppGpp se neposredno veže na RNA polimerazo in s tem uravnava izbiro promotorja. Preko raznih mehanizmov pa vpliva tudi na stabilnost, oligomerizacijo in aktivnost mnogih proteinov in regulatornih RNA [1,2].

Celični bazen ppGpp nadzirata dva razreda encimov. RelA so monofunkcionalne sintaze, ki katalizirajo sintezo pppGpp iz GTP in ATP. Proteini SpoT pa so odgovorni za sintezo ppGpp in pppGpp in njuno hidrolizo do GDP in pirofosfata (PPi) oziroma GTP in PPi [2].
==Rezultati==
Avtorji članka so za povečanje stopnje rasti celic eksogeno izrazili različico SpoT proteina, ki vsebuje prvih 203 aminokislinskih ostankov le-tega in ima zgolj hidrolazno aktivnost (SpoTH). Ta encim torej povzroči zmanjšanje koncentracije ppGpp, zaradi česar so pričakovali, da bo prišlo do povečanja hitrosti rasti bakterij. Izražanje SpoTH pa obremeni celico s sekvestacijo celičnih virov, npr. ribosomov. Ko torej SpoTH odstrani zadostne količine ppGpp, samo breme izražanja SpoTH začne prevladovati nad povečanjem hitrosti rasti, kar se kaže kot nemonoton odziv med ekspresijo SpoTH in hitrostjo rasti [1].
===Izbira seva z želenim profilom delovanja sistema===
Konstrukt, ki je vseboval zapis za ''tetR'' pod konstitutivnim promotorjem in zapis za SpoTH pod kontrolo inducibilnega promotorja PtetR so testirali v različnih sevih ''E.coli'' in sicer v sevu CF944 (spoT202 alel), CF945 (spoT203 alel) in CF946 (spoT204 alel). Bazalni nivoji ppGpp so najnižji pri sevu CF944 in najvišji pri sevu CF946. Poleg teh sevov pa so konstrukt uporabili tudi v kontrolnem sevu divjega tipa MG1655. Genetsko vezje, ki so ga uporabili, jim je omogočilo povečano izražanje SpoTH s povečanjem koncentracije induktorja anhidrotetraciklina (aTc) [1].

Pri sevih CF945 in CF946 je aktivacija gena SpoTH povečala stopnjo rasti za 80% oziroma 60%, pri MG1655 in CF944, ki pa imata v osnovi nižjo bazalno raven ppGpp, pa se hitrost rasti ni spremenila. Za sev CF945 so določili relativno največje povečanje hitrosti rasti, zato so raziskave nadaljevali na tem sevu [1].

===Uporaba različnih virov ogljika===
Osnovno raven ppGpp lahko uravnavamo tudi prek sestave rastnega medija, natančneje prek vira ogljika. Zato so preizkusili tudi štiri najpogosteje uporabljene vire ogljika: glukozo, glicerol, fruktozo in laktozo. Opazili so, da se pri vseh virih ogljika hitrost rasti povečuje z izražanjem SpoTH. Nominalna hitrost rasti celic je najnižja pri laktozi, nato glicerolu, fruktozi in glukozi, in se lahko poveča za 75%, 85%, 50% in 45%. Ti podatki kažejo, da obstaja kompromis med nominalno stopnjo rasti in relativnim povečanjem hitrosti, ki ga je mogoče doseči z izražanjem SpoTH. Stopnja, do katere je mogoče povečati hitrost rasti, je namreč neposredno povezana s količino ppGpp, ki je na voljo za hidrolizo [1].
===Zasnova sistema za uporabo v sevu ''E.coli'' CF945===
Nato so zasnovali sistem za kontrolo rasti, ki je vseboval zapis za SpoTH in rdeči fluorescenčni protein (RFP) – GOI. Poimenovali so ga zaprta zanka (CL, plazmid P_IFFL_x), ker v nasprotju z odprto zanko (OL, plazmid P_OL) vsebuje zapis za SpoTH. Za zasnovo obeh sistemov so uporabili zaporedje ''luxR'', ki se konstitutivno izraža, in inducibilni promotor Plux, ki se aktivira ob dodatku N-acetilhomoserinlaktona (AHL) pri čemer pride do transkripcije RFP. Izražanje RFP sekvestira celične vire, vključno z ribosomi, kar ima negativen vpliv na rast celic. V sistemu CL pa dodatek AHL poveča tudi izražanje SpoTH, kar pa poveča raven ribosomov v celici in s tem kompenzira zmanjšanje hitrosti rasti. Da bi zagotovili ustrezne ravni SpoTH, in s tem zmanjšali občutljivost količine prostih ribosomov na izražanje heterolognih genov, so zasnovali štiri CL sisteme z različno močnimi RBS za SpoTH – RBS1, RBS2, RBS3 in RBS4, ki si v tem zaporedju sledijo tudi po moči. Moč RBS je odvisna od zaporedij pred in za njim, zato so okarakterizirali RBS knjižnico za SpoTH, ki je vsebovala tudi zapis za RFP. Pri tem pa so zmanjšali moč RBS za RFP tako, da je količina ribosomov, ki jih le-ta sekvestira, zanemarljiva [1].

Pri uporabi fruktoze kot primarnega vira ogljika, se je hitrost rasti OL sistema po aktivaciji ekspresije RFP zmanjšala za 25%, medtem ko je za sistem CL z uporabo RBS2 le-ta ostala konstantna. Pri uporabi glicerola se je hitrost rasti za sistem OL zmanjša za 45% ob aktivaciji ekspresije RFP, medtem ko se je za sistem CL z uporabo RBS1 le-ta zmanjšala za 10%. Pri laktozi pa se je hitrost rasti zmanjšala za 55% pri uporabi OL, medtem ko je za sistem CL z RBS2 ostala skoraj enaka [1].

Za kontrolo pa so uporabili konstrukt, ki je namesto zapisa za SpoTH vseboval zapis za nefunckionalni heterologni protein CJB (cjBlue H197S). S tem so želeli potrditi, da je sistem CL boljši od sistema OL zaradi izražanja SpoTH in ne zaradi konfiguracije mRNA RFP. To predpostavko so tudi potrdili, saj je izražanje RFP s kontrolnim konstruktom povzročilo še večje zmanjšanje rasti celic, kot z OL sistemom [1].
===Zasnova sistema za uporabo v običajnih laboratorijskih sevih===
Z namenom razširitve uporabe sistema za nadzor hitrosti rasti na običajne bakterijske seve, so v osnovni konstrukt vključili inducibilno ekspresijsko kaseto RelA+ gena (plazmid P_IFFL_RelA_2). RelA+ različica vsebuje le 455 N-končnih aminokislinskih ostankov RelA divjega tipa, in ima konstitutivno ppGpp sintezno aktivnost. Zapis za RelA+ so postavili pod inducibilni promotor Psal, pri čemer se transkripcija gena aktivira v prisotnosti salicilata in produkta regulatornega gena ''nahR'', ki se konstitutivno izraža. Gen za SpoTH pa so postavili pod inducibilni promotor Ptet [1].

Po pričakovanjih so povečane ravni RelA+ proteina povzročile nižjo hitrost rasti sevov ''E.coli'' MG1655, TOP10 in NEB. Pri nivoju ekspresije RelA+, ki zniža hitrost rasti za polovico, pa aktivacija transkripcije gena za SpoTH povzroči povečanje hitrosti rasti na isti nivo, kot če se RelA+ ne bi izražal. Iz tega so sklepali, da aktivacija transkripcije gena SpoTH omogoča povečanje hitrosti rasti tudi v običajnih laboratorijskih sevih [1].

Za ocenitev zmožnosti CL sistema, da ohrani konstantno rast celic po aktivaciji ekspresije GOI v sevu TOP10, so okarakterizirali tri sisteme OL z različnimi nominalnimi hitrostmi rasti, ki so jih pripravili s transformacijo sevov ''E.coli'' CF944, CF945 in CF946 s plazmidom P_OL. Za primerjavo pa so uporabili še tri CL sisteme, ki so jih pripravili s transformacijo seva TOP10 s plazmidom P_IFFL_RelA_x (zapis za SpoTH pod inducibilnim promotorjem Plux). Nominalno stopnjo rasti pa so prilagodili ustreznemu OL sistemu z indukcijo ekspresije RelA+. Ob aktivaciji transkripcije RFP se je hitrost rasti pri OL sistemih znižala za 20%, 55% in 40%, pri CL sistemih pa le za 5%, 7% oziroma 15%. Nadaljnja optimizacija RBS pa bi lahko omogočila, da do padca v stopnji rasti sploh ne bi prišlo. Ekspresija RelA+ torej določa nominalno stopnjo rasti, indukcija ekspresije SpoTH skupaj z GOI pa omogoča, da se le-ta ohrani [1].

===Trajno izražanje GOI v kokulturi===
Gensko spremenjene bakterije običajno uporabljamo v okoljih, kjer so že prisotni drugi mikrobi. Če aktivacija transkripcije GOI povzroči defekte v hitrosti rasti, potem lahko hitreje rastoči organizmi prevladajo nad to populacijo, zaradi česar pride do izgube ekspresije GOI [1].

V ta namen so testirali uporabnost sistema za kontrolo rasti celic v kokulturi. Primerjali so uspešnost OL sistema (sev CF945, plazmid P_OL) in CL sistema (sev CF945, plazmid P_IFFL_x), ki sta inducibilno izražala RFP, ko so ju gojili v kokulturi s konkurenčnim sevom (sev TOP10), ki je konstitutivno izražal BFP (plazmid P_BFP). V izolaciji so bile posamezne hitrosti rasti identične, sčasoma pa je prišlo do padca hitrosti rasti seva transformiranega z P_OL za 50%, medtem ko je sev transformiran s plazmidom P_IFFL_x ohranil začetno stopnjo rasti. Da bi potrdili, da dinamična sprememba na ravni populacije ni posledica dinamične spremembe v stopnji izražanja BFP in RFP, so spremljali intenziteto fluorescence BFP in RFP, in ugotovili, da je le-ta konstantna. Intenziteto fluorescence so normirali na OD600. Iz tega so torej sklepali, da sistem CL prepreči enakomerno zmanjševanje hitrosti rasti celic po aktivaciji ekspresije GOI ter da omogoča trajno izražanje GOI na ravni populacije [1].

==Zaključek==
Sistem za kontrolo hitrosti rasti ima potencial za uporabo pri ekspresiji kateregakoli GOI z uporabo ustreznega RBS za SpoTH na podlagi bremena, ki ga predstavlja GOI. Zasnova je prilagodljiva in modularna. Ekspresija SpoTH lahko povzroči zmanjšanje sinteze drugih proteinov, zato avtorji predlagajo, da se njihov sistem uporablja v kombinaciji s sistemom, ki zagotavlja konstantno stopnjo sinteze proteinov [1].

Kot so uspeli dokazati, bo to orodje ključno za gojenje bakterij v kokulturi. Dobro lastnost sistema pa predstavlja tudi dejstvo, da so ppGpp in homologi RelA/SpoT univerzalno ohranjeni v bakterijah in se pojavljajo tudi pri evkariontih, vključno s človekom, zato se lahko ta sistem uporablja tudi v drugih organizmih [1].
==Literatura==
[1] C. Barajas, HH. Huang,J. Gibson, L. Sansoval, D. Del Vecchio.: Feedforward growth rate control mitigates gene activation burden. Nat Commun, 2022, 13, 7054.

[2] Z. Dalebroux, M. Swanson: ppGpp: magic beyond RNA polymerase. Nat Rev Microbiol 2012, 10, 203–212.

Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov

2023-05-15T19:38:27Z

Nezaribnikar: /* Zasnova sistema za uporabo v običajnih laboratorijskih sevih */

Povzeto po članku [https://www.nature.com/articles/s41467-022-34647-1 ''C. Barajas, HH. Huang,J. Gibson, L. Sansoval, D. Del Vecchio.: Feedforward growth rate control mitigates gene activation burden. Nat Commun, 2022, 13, 7054.'']

==Uvod==
Prekomerno izražanje heterolognih genov (angl. Gene of interest, GOI) izčrpa celične vire, še posebej ribosome. To breme zmanjša hitrost rasti celic in povzroči spremembe s slabo predvidljivimi posledicami, ki običajno ovirajo predvideno delovanje celice. Za ublažitev posledic izražanja GOI, so avtorji članka razvili sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki omogoča aktiviranje GOI do poljubne ravni, pri čemer rast celic ostane konstantna. To pa so dosegli s povečanjem hidrolize ppGpp [1].

Alarmona gvanozin tetrafosfat (ppGpp) in gvanozin pentafosfat (pppGpp) (imenujemo kar ppGpp) v celici koordinirata odziv na stres z obsežnim preklopom profila transkripcije. Pri tem pride do zaustavitve sinteze DNA, stabilnih RNA in ribosomov, začne pa se proizvodnja dejavnikov, ki so ključni za odpornost na stres, glikolizo in sintezo aminokislin. ppGpp se neposredno veže na RNA polimerazo in s tem uravnava izbiro promotorja. Preko raznih mehanizmov pa vpliva tudi na stabilnost, oligomerizacijo in aktivnost mnogih proteinov in regulatornih RNA [1,2].

Celični bazen ppGpp nadzirata dva razreda encimov. RelA so monofunkcionalne sintaze, ki katalizirajo sintezo pppGpp iz GTP in ATP. Proteini SpoT pa so odgovorni za sintezo ppGpp in pppGpp in njuno hidrolizo do GDP in pirofosfata (PPi) oziroma GTP in PPi [2].
==Rezultati==
Avtorji članka so za povečanje stopnje rasti celic eksogeno izrazili različico SpoT proteina, ki vsebuje prvih 203 aminokislinskih ostankov le-tega in ima zgolj hidrolazno aktivnost (SpoTH). Ta encim torej povzroči zmanjšanje koncentracije ppGpp, zaradi česar so pričakovali, da bo prišlo do povečanja hitrosti rasti bakterij. Izražanje SpoTH pa obremeni celico s sekvestacijo celičnih virov, npr. ribosomov. Ko torej SpoTH odstrani zadostne količine ppGpp, samo breme izražanja SpoTH začne prevladovati nad povečanjem hitrosti rasti, kar se kaže kot nemonoton odziv med ekspresijo SpoTH in hitrostjo rasti [1].
===Izbira seva z želenim profilom delovanja sistema===
Konstrukt, ki je vseboval zapis za ''tetR'' pod konstitutivnim promotorjem in zapis za SpoTH pod kontrolo inducibilnega promotorja PtetR so testirali v različnih sevih ''E.coli'' in sicer v sevu CF944 (spoT202 alel), CF945 (spoT203 alel) in CF946 (spoT204 alel). Bazalni nivoji ppGpp so najnižji pri sevu CF944 in najvišji pri sevu CF946. Poleg teh sevov pa so konstrukt uporabili tudi v kontrolnem sevu divjega tipa MG1655. Genetsko vezje, ki so ga uporabili, jim je omogočilo povečano izražanje SpoTH s povečanjem koncentracije induktorja anhidrotetraciklina (aTc) [1].

Pri sevih CF945 in CF946 je aktivacija gena SpoTH povečala stopnjo rasti za 80% oziroma 60%, pri MG1655 in CF944, ki pa imata v osnovi nižjo bazalno raven ppGpp, pa se hitrost rasti ni spremenila. Za sev CF945 so določili relativno največje povečanje hitrosti rasti, zato so raziskave nadaljevali na tem sevu [1].

===Uporaba različnih virov ogljika===
Osnovno raven ppGpp lahko uravnavamo tudi prek sestave rastnega medija, natančneje prek vira ogljika. Zato so preizkusili tudi štiri najpogosteje uporabljene vire ogljika: glukozo, glicerol, fruktozo in laktozo. Opazili so, da se pri vseh virih ogljika hitrost rasti povečuje z izražanjem SpoTH. Nominalna hitrost rasti celic je najnižja pri laktozi, nato glicerolu, fruktozi in glukozi, in se lahko poveča za 75%, 85%, 50% in 45%. Ti podatki kažejo, da obstaja kompromis med nominalno stopnjo rasti in relativnim povečanjem hitrosti, ki ga je mogoče doseči z izražanjem SpoTH. Stopnja, do katere je mogoče povečati hitrost rasti, je namreč neposredno povezana s količino ppGpp, ki je na voljo za hidrolizo [1].
===Zasnova sistema za uporabo v sevu ''E.coli'' CF945===
Nato so zasnovali sistem za kontrolo rasti, ki je vseboval zapis za SpoTH in rdeči fluorescenčni protein (RFP) – GOI. Poimenovali so ga zaprta zanka (CL, plazmid P_IFFL_x), ker v nasprotju z odprto zanko (OL, plazmid P_OL) vsebuje zapis za SpoTH. Za zasnovo obeh sistemov so uporabili zaporedje ''luxR'', ki se konstitutivno izraža, in inducibilni promotor Plux, ki se aktivira ob dodatku N-acetilhomoserinlaktona (AHL) pri čemer pride do transkripcije RFP. Izražanje RFP sekvestira celične vire, vključno z ribosomi, kar ima negativen vpliv na rast celic. V sistemu CL pa dodatek AHL poveča tudi izražanje SpoTH, kar pa poveča raven ribosomov v celici in s tem kompenzira zmanjšanje hitrosti rasti. Da bi zagotovili ustrezne ravni SpoTH, in s tem zmanjšali občutljivost količine prostih ribosomov na izražanje heterolognih genov, so zasnovali štiri CL sisteme z različno močnimi RBS za SpoTH – RBS1, RBS2, RBS3 in RBS4, ki si v tem zaporedju sledijo tudi po moči. Moč RBS je odvisna od zaporedij pred in za njim, zato so okarakterizirali RBS knjižnico za SpoTH, ki je vsebovala tudi zapis za RFP. Pri tem pa so zmanjšali moč RBS za RFP tako, da je količina ribosomov, ki jih le-ta sekvestira, zanemarljiva [1].

Pri uporabi fruktoze kot primarnega vira ogljika, se je hitrost rasti OL sistema po aktivaciji ekspresije RFP zmanjšala za 25%, medtem ko je za sistem CL z uporabo RBS2 le-ta ostala konstantna. Pri uporabi glicerola se je hitrost rasti za sistem OL zmanjša za 45% ob aktivaciji ekspresije RFP, medtem ko se je za sistem CL z uporabo RBS1 le-ta zmanjšala za 10%. Pri laktozi pa se je hitrost rasti zmanjšala za 55% pri uporabi OL, medtem ko je za sistem CL z RBS2 ostala skoraj enaka [1].

Za kontrolo pa so uporabili konstrukt, ki je namesto zapisa za SpoTH vseboval zapis za nefunckionalni heterologni protein CJB (cjBlue H197S). S tem so želeli potrditi, da je sistem CL boljši od sistema OL zaradi izražanja SpoTH in ne zaradi konfiguracije mRNA RFP. To predpostavko so tudi potrdili, saj je izražanje RFP s kontrolnim konstruktom povzročilo še večje zmanjšanje rasti celic, kot z OL sistemom [1].
===Zasnova sistema za uporabo v običajnih laboratorijskih sevih===
Z namenom razširitve uporabe sistema za nadzor kontrole hitrosti rasti na običajne bakterijske seve, so v osnovni konstrukt vključili inducibilno ekspresijsko kaseto RelA+ gena (plazmid P_IFFL_RelA_2). RelA+ različica vsebuje le 455 N-končnih aminokislinskih ostankov RelA divjega tipa, in ima konstitutivno ppGpp sintezno aktivnost. Zapis za RelA+ so postavili pod inducibilni promotor Psal, pri čemer se transkripcija gena aktivira v prisotnosti salicilata in produkta regulatornega gena ''nahR'', ki se konstitutivno izraža. Gen za SpoTH pa so postavili pod inducibilni promotor Ptet [1].

Po pričakovanjih so povečane ravni RelA+ proteina povzročile nižjo hitrost rasti sevov ''E.coli'' MG1655, TOP10 in NEB. Pri nivoju ekspresije RelA+, ki zniža hitrost rasti za polovico, pa aktivacija transkripcije gena za SpoTH povzroči povečanje hitrosti rasti na isti nivo, kot če se RelA+ ne bi izražal. Iz tega so sklepali, da aktivacija transkripcije gena SpoTH omogoča povečanje hitrosti rasti tudi v običajnih laboratorijskih sevih [1].

Za ocenitev zmožnosti CL sistema, da ohrani konstantno rast celic po aktivaciji ekspresije GOI v sevu TOP10, so okarakterizirali tri sisteme OL z različnimi nominalnimi hitrostmi rasti, ki so jih pripravili s transformacijo sevov ''E.coli'' CF944, CF945 in CF946 s plazmidom P_OL. Za primerjavo pa so uporabili še tri CL sisteme, ki so jih pripravili s transformacijo seva TOP10 s plazmidom P_IFFL_RelA_x (zapis za SpoTH pod inducibilnim promotorjem Plux). Nominalno stopnjo rasti pa so prilagodili ustreznemu OL sistemu z indukcijo ekspresije RelA+. Ob aktivaciji transkripcije RFP se je hitrost rasti pri OL sistemih znižala za 20%, 55% in 40%, pri CL sistemih pa le za 5%, 7% oziroma 15%. Nadaljnja optimizacija RBS pa bi lahko omogočila, da do padca v stopnji rasti sploh ne bi prišlo. Ekspresija RelA+ torej določa nominalno stopnjo rasti, indukcija ekspresije SpoTH skupaj z GOI pa omogoča, da se le-ta ohrani [1].

===Trajno izražanje GOI v kokulturi===
Gensko spremenjene bakterije običajno uporabljamo v okoljih, kjer so že prisotni drugi mikrobi. Če aktivacija transkripcije GOI povzroči defekte v hitrosti rasti, potem lahko hitreje rastoči organizmi prevladajo nad to populacijo, zaradi česar pride do izgube ekspresije GOI [1].

V ta namen so testirali uporabnost sistema za kontrolo rasti celic v kokulturi. Primerjali so uspešnost OL sistema (sev CF945, plazmid P_OL) in CL sistema (sev CF945, plazmid P_IFFL_x), ki sta inducibilno izražala RFP, ko so ju gojili v kokulturi s konkurenčnim sevom (sev TOP10), ki je konstitutivno izražal BFP (plazmid P_BFP). V izolaciji so bile posamezne hitrosti rasti identične, sčasoma pa je prišlo do padca hitrosti rasti seva transformiranega z P_OL za 50%, medtem ko je sev transformiran s plazmidom P_IFFL_x ohranil začetno stopnjo rasti. Da bi potrdili, da dinamična sprememba na ravni populacije ni posledica dinamične spremembe v stopnji izražanja BFP in RFP, so spremljali intenziteto fluorescence BFP in RFP, in ugotovili, da je le-ta konstantna. Intenziteto fluorescence so normirali na OD600. Iz tega so torej sklepali, da sistem CL prepreči enakomerno zmanjševanje hitrosti rasti celic po aktivaciji ekspresije GOI ter da omogoča trajno izražanje GOI na ravni populacije [1].

==Zaključek==
Sistem za kontrolo hitrosti rasti ima potencial za uporabo pri ekspresiji kateregakoli GOI z uporabo ustreznega RBS za SpoTH na podlagi bremena, ki ga predstavlja GOI. Zasnova je prilagodljiva in modularna. Ekspresija SpoTH lahko povzroči zmanjšanje sinteze drugih proteinov, zato avtorji predlagajo, da se njihov sistem uporablja v kombinaciji s sistemom, ki zagotavlja konstantno stopnjo sinteze proteinov [1].

Kot so uspeli dokazati, bo to orodje ključno za gojenje bakterij v kokulturi. Dobro lastnost sistema pa predstavlja tudi dejstvo, da so ppGpp in homologi RelA/SpoT univerzalno ohranjeni v bakterijah in se pojavljajo tudi pri evkariontih, vključno s človekom, zato se lahko ta sistem uporablja tudi v drugih organizmih [1].
==Literatura==
[1] C. Barajas, HH. Huang,J. Gibson, L. Sansoval, D. Del Vecchio.: Feedforward growth rate control mitigates gene activation burden. Nat Commun, 2022, 13, 7054.

[2] Z. Dalebroux, M. Swanson: ppGpp: magic beyond RNA polymerase. Nat Rev Microbiol 2012, 10, 203–212.

Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov

2023-05-15T19:37:50Z

Nezaribnikar: /* Zasnova sistema za uporabo v običajnih laboratorijskih sevih */

Povzeto po članku [https://www.nature.com/articles/s41467-022-34647-1 ''C. Barajas, HH. Huang,J. Gibson, L. Sansoval, D. Del Vecchio.: Feedforward growth rate control mitigates gene activation burden. Nat Commun, 2022, 13, 7054.'']

==Uvod==
Prekomerno izražanje heterolognih genov (angl. Gene of interest, GOI) izčrpa celične vire, še posebej ribosome. To breme zmanjša hitrost rasti celic in povzroči spremembe s slabo predvidljivimi posledicami, ki običajno ovirajo predvideno delovanje celice. Za ublažitev posledic izražanja GOI, so avtorji članka razvili sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki omogoča aktiviranje GOI do poljubne ravni, pri čemer rast celic ostane konstantna. To pa so dosegli s povečanjem hidrolize ppGpp [1].

Alarmona gvanozin tetrafosfat (ppGpp) in gvanozin pentafosfat (pppGpp) (imenujemo kar ppGpp) v celici koordinirata odziv na stres z obsežnim preklopom profila transkripcije. Pri tem pride do zaustavitve sinteze DNA, stabilnih RNA in ribosomov, začne pa se proizvodnja dejavnikov, ki so ključni za odpornost na stres, glikolizo in sintezo aminokislin. ppGpp se neposredno veže na RNA polimerazo in s tem uravnava izbiro promotorja. Preko raznih mehanizmov pa vpliva tudi na stabilnost, oligomerizacijo in aktivnost mnogih proteinov in regulatornih RNA [1,2].

Celični bazen ppGpp nadzirata dva razreda encimov. RelA so monofunkcionalne sintaze, ki katalizirajo sintezo pppGpp iz GTP in ATP. Proteini SpoT pa so odgovorni za sintezo ppGpp in pppGpp in njuno hidrolizo do GDP in pirofosfata (PPi) oziroma GTP in PPi [2].
==Rezultati==
Avtorji članka so za povečanje stopnje rasti celic eksogeno izrazili različico SpoT proteina, ki vsebuje prvih 203 aminokislinskih ostankov le-tega in ima zgolj hidrolazno aktivnost (SpoTH). Ta encim torej povzroči zmanjšanje koncentracije ppGpp, zaradi česar so pričakovali, da bo prišlo do povečanja hitrosti rasti bakterij. Izražanje SpoTH pa obremeni celico s sekvestacijo celičnih virov, npr. ribosomov. Ko torej SpoTH odstrani zadostne količine ppGpp, samo breme izražanja SpoTH začne prevladovati nad povečanjem hitrosti rasti, kar se kaže kot nemonoton odziv med ekspresijo SpoTH in hitrostjo rasti [1].
===Izbira seva z želenim profilom delovanja sistema===
Konstrukt, ki je vseboval zapis za ''tetR'' pod konstitutivnim promotorjem in zapis za SpoTH pod kontrolo inducibilnega promotorja PtetR so testirali v različnih sevih ''E.coli'' in sicer v sevu CF944 (spoT202 alel), CF945 (spoT203 alel) in CF946 (spoT204 alel). Bazalni nivoji ppGpp so najnižji pri sevu CF944 in najvišji pri sevu CF946. Poleg teh sevov pa so konstrukt uporabili tudi v kontrolnem sevu divjega tipa MG1655. Genetsko vezje, ki so ga uporabili, jim je omogočilo povečano izražanje SpoTH s povečanjem koncentracije induktorja anhidrotetraciklina (aTc) [1].

Pri sevih CF945 in CF946 je aktivacija gena SpoTH povečala stopnjo rasti za 80% oziroma 60%, pri MG1655 in CF944, ki pa imata v osnovi nižjo bazalno raven ppGpp, pa se hitrost rasti ni spremenila. Za sev CF945 so določili relativno največje povečanje hitrosti rasti, zato so raziskave nadaljevali na tem sevu [1].

===Uporaba različnih virov ogljika===
Osnovno raven ppGpp lahko uravnavamo tudi prek sestave rastnega medija, natančneje prek vira ogljika. Zato so preizkusili tudi štiri najpogosteje uporabljene vire ogljika: glukozo, glicerol, fruktozo in laktozo. Opazili so, da se pri vseh virih ogljika hitrost rasti povečuje z izražanjem SpoTH. Nominalna hitrost rasti celic je najnižja pri laktozi, nato glicerolu, fruktozi in glukozi, in se lahko poveča za 75%, 85%, 50% in 45%. Ti podatki kažejo, da obstaja kompromis med nominalno stopnjo rasti in relativnim povečanjem hitrosti, ki ga je mogoče doseči z izražanjem SpoTH. Stopnja, do katere je mogoče povečati hitrost rasti, je namreč neposredno povezana s količino ppGpp, ki je na voljo za hidrolizo [1].
===Zasnova sistema za uporabo v sevu ''E.coli'' CF945===
Nato so zasnovali sistem za kontrolo rasti, ki je vseboval zapis za SpoTH in rdeči fluorescenčni protein (RFP) – GOI. Poimenovali so ga zaprta zanka (CL, plazmid P_IFFL_x), ker v nasprotju z odprto zanko (OL, plazmid P_OL) vsebuje zapis za SpoTH. Za zasnovo obeh sistemov so uporabili zaporedje ''luxR'', ki se konstitutivno izraža, in inducibilni promotor Plux, ki se aktivira ob dodatku N-acetilhomoserinlaktona (AHL) pri čemer pride do transkripcije RFP. Izražanje RFP sekvestira celične vire, vključno z ribosomi, kar ima negativen vpliv na rast celic. V sistemu CL pa dodatek AHL poveča tudi izražanje SpoTH, kar pa poveča raven ribosomov v celici in s tem kompenzira zmanjšanje hitrosti rasti. Da bi zagotovili ustrezne ravni SpoTH, in s tem zmanjšali občutljivost količine prostih ribosomov na izražanje heterolognih genov, so zasnovali štiri CL sisteme z različno močnimi RBS za SpoTH – RBS1, RBS2, RBS3 in RBS4, ki si v tem zaporedju sledijo tudi po moči. Moč RBS je odvisna od zaporedij pred in za njim, zato so okarakterizirali RBS knjižnico za SpoTH, ki je vsebovala tudi zapis za RFP. Pri tem pa so zmanjšali moč RBS za RFP tako, da je količina ribosomov, ki jih le-ta sekvestira, zanemarljiva [1].

Pri uporabi fruktoze kot primarnega vira ogljika, se je hitrost rasti OL sistema po aktivaciji ekspresije RFP zmanjšala za 25%, medtem ko je za sistem CL z uporabo RBS2 le-ta ostala konstantna. Pri uporabi glicerola se je hitrost rasti za sistem OL zmanjša za 45% ob aktivaciji ekspresije RFP, medtem ko se je za sistem CL z uporabo RBS1 le-ta zmanjšala za 10%. Pri laktozi pa se je hitrost rasti zmanjšala za 55% pri uporabi OL, medtem ko je za sistem CL z RBS2 ostala skoraj enaka [1].

Za kontrolo pa so uporabili konstrukt, ki je namesto zapisa za SpoTH vseboval zapis za nefunckionalni heterologni protein CJB (cjBlue H197S). S tem so želeli potrditi, da je sistem CL boljši od sistema OL zaradi izražanja SpoTH in ne zaradi konfiguracije mRNA RFP. To predpostavko so tudi potrdili, saj je izražanje RFP s kontrolnim konstruktom povzročilo še večje zmanjšanje rasti celic, kot z OL sistemom [1].
===Zasnova sistema za uporabo v običajnih laboratorijskih sevih===
Z namenom razširitve uporabe sistema za nadzor kontrole hitrosti rasti na običajne bakterijske seve, so v osnovni konstrukt vključili inducibilno ekspresijsko kaseto RelA+ gena (plazmid P_IFFL_RelA_2). RelA+ različica vsebuje le 455 N-končnih aminokislinskih ostankov RelA divjega tipa, in ima konstitutivno ppGpp sintezno aktivnost. Zapis za RelA+ so postavili pod inducibilni promotor Psal, pri čemer se transkripcija gena aktivira v prisotnosti salicilata in produkta regulatornega gena ''nahR'', ki se konstitutivno izraža. Gen za SpoTH pa so postavili pod inducibilni promotor Ptet [1].

Po pričakovanjih so povečane ravni RelA+ proteina povzročile nižjo hitrost rasti sevov ''E.coli'' MG1655, TOP10 in NEB. Pri nivoju ekspresije RelA+, ki zniža hitrost rasti za polovico, pa aktivacija transkripcije gena za SpoTH povzroči povečanje hitrosti rasti na isti nivo, kot če se RelA+ ne bi izražal. Iz tega so sklepali, da aktivacija transkripcije gena SpoTH omogoča povečanje hitrosti rasti tudi v običajnih laboratorijskih sevih [1].

Za ocenitev zmožnosti CL sistema, da ohrani konstantno rast celic po aktivaciji ekspresije GOI v sevu TOP10, so okarakterizirali tri sisteme OL z različnimi nominalnimi hitrostmi rasti, ki so jih pripravili s transformacijo sevov ''E.coli'' CF944, CF945 in CF946 s plazmidom P_OL. Za primerjavo pa so uporabili še tri CL sisteme, ki so jih pripravili s transformacijo seva TOP10 s plazmidom P_IFFL_RelA_x (zapis za SopTH pod inducibilnim promotorjem Plux). Nominalno stopnjo rasti pa so prilagodili ustreznemu OL sistemu z indukcijo ekspresije RelA+. Ob aktivaciji transkripcije RFP se je hitrost rasti pri OL sistemih znižala za 20%, 55% in 40%, pri CL sistemih pa le za 5%, 7% oziroma 15%. Nadaljnja optimizacija RBS pa bi lahko omogočila, da do padca v stopnji rasti sploh ne bi prišlo. Ekspresija RelA+ torej določa nominalno stopnjo rasti, indukcija ekspresije SpoTH skupaj z GOI pa omogoča, da se le-ta ohrani [1].

===Trajno izražanje GOI v kokulturi===
Gensko spremenjene bakterije običajno uporabljamo v okoljih, kjer so že prisotni drugi mikrobi. Če aktivacija transkripcije GOI povzroči defekte v hitrosti rasti, potem lahko hitreje rastoči organizmi prevladajo nad to populacijo, zaradi česar pride do izgube ekspresije GOI [1].

V ta namen so testirali uporabnost sistema za kontrolo rasti celic v kokulturi. Primerjali so uspešnost OL sistema (sev CF945, plazmid P_OL) in CL sistema (sev CF945, plazmid P_IFFL_x), ki sta inducibilno izražala RFP, ko so ju gojili v kokulturi s konkurenčnim sevom (sev TOP10), ki je konstitutivno izražal BFP (plazmid P_BFP). V izolaciji so bile posamezne hitrosti rasti identične, sčasoma pa je prišlo do padca hitrosti rasti seva transformiranega z P_OL za 50%, medtem ko je sev transformiran s plazmidom P_IFFL_x ohranil začetno stopnjo rasti. Da bi potrdili, da dinamična sprememba na ravni populacije ni posledica dinamične spremembe v stopnji izražanja BFP in RFP, so spremljali intenziteto fluorescence BFP in RFP, in ugotovili, da je le-ta konstantna. Intenziteto fluorescence so normirali na OD600. Iz tega so torej sklepali, da sistem CL prepreči enakomerno zmanjševanje hitrosti rasti celic po aktivaciji ekspresije GOI ter da omogoča trajno izražanje GOI na ravni populacije [1].

==Zaključek==
Sistem za kontrolo hitrosti rasti ima potencial za uporabo pri ekspresiji kateregakoli GOI z uporabo ustreznega RBS za SpoTH na podlagi bremena, ki ga predstavlja GOI. Zasnova je prilagodljiva in modularna. Ekspresija SpoTH lahko povzroči zmanjšanje sinteze drugih proteinov, zato avtorji predlagajo, da se njihov sistem uporablja v kombinaciji s sistemom, ki zagotavlja konstantno stopnjo sinteze proteinov [1].

Kot so uspeli dokazati, bo to orodje ključno za gojenje bakterij v kokulturi. Dobro lastnost sistema pa predstavlja tudi dejstvo, da so ppGpp in homologi RelA/SpoT univerzalno ohranjeni v bakterijah in se pojavljajo tudi pri evkariontih, vključno s človekom, zato se lahko ta sistem uporablja tudi v drugih organizmih [1].
==Literatura==
[1] C. Barajas, HH. Huang,J. Gibson, L. Sansoval, D. Del Vecchio.: Feedforward growth rate control mitigates gene activation burden. Nat Commun, 2022, 13, 7054.

[2] Z. Dalebroux, M. Swanson: ppGpp: magic beyond RNA polymerase. Nat Rev Microbiol 2012, 10, 203–212.

Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov

2023-05-15T17:25:47Z

Nezaribnikar: /* Zasnova sistema za uporabo v običajnih laboratorijskih sevih */

Povzeto po članku [https://www.nature.com/articles/s41467-022-34647-1 ''C. Barajas, HH. Huang,J. Gibson, L. Sansoval, D. Del Vecchio.: Feedforward growth rate control mitigates gene activation burden. Nat Commun, 2022, 13, 7054.'']

==Uvod==
Prekomerno izražanje heterolognih genov (angl. Gene of interest, GOI) izčrpa celične vire, še posebej ribosome. To breme zmanjša hitrost rasti celic in povzroči spremembe s slabo predvidljivimi posledicami, ki običajno ovirajo predvideno delovanje celice. Za ublažitev posledic izražanja GOI, so avtorji članka razvili sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki omogoča aktiviranje GOI do poljubne ravni, pri čemer rast celic ostane konstantna. To pa so dosegli s povečanjem hidrolize ppGpp [1].

Alarmona gvanozin tetrafosfat (ppGpp) in gvanozin pentafosfat (pppGpp) (imenujemo kar ppGpp) v celici koordinirata odziv na stres z obsežnim preklopom profila transkripcije. Pri tem pride do zaustavitve sinteze DNA, stabilnih RNA in ribosomov, začne pa se proizvodnja dejavnikov, ki so ključni za odpornost na stres, glikolizo in sintezo aminokislin. ppGpp se neposredno veže na RNA polimerazo in s tem uravnava izbiro promotorja. Preko raznih mehanizmov pa vpliva tudi na stabilnost, oligomerizacijo in aktivnost mnogih proteinov in regulatornih RNA [1,2].

Celični bazen ppGpp nadzirata dva razreda encimov. RelA so monofunkcionalne sintaze, ki katalizirajo sintezo pppGpp iz GTP in ATP. Proteini SpoT pa so odgovorni za sintezo ppGpp in pppGpp in njuno hidrolizo do GDP in pirofosfata (PPi) oziroma GTP in PPi [2].
==Rezultati==
Avtorji članka so za povečanje stopnje rasti celic eksogeno izrazili različico SpoT proteina, ki vsebuje prvih 203 aminokislinskih ostankov le-tega in ima zgolj hidrolazno aktivnost (SpoTH). Ta encim torej povzroči zmanjšanje koncentracije ppGpp, zaradi česar so pričakovali, da bo prišlo do povečanja hitrosti rasti bakterij. Izražanje SpoTH pa obremeni celico s sekvestacijo celičnih virov, npr. ribosomov. Ko torej SpoTH odstrani zadostne količine ppGpp, samo breme izražanja SpoTH začne prevladovati nad povečanjem hitrosti rasti, kar se kaže kot nemonoton odziv med ekspresijo SpoTH in hitrostjo rasti [1].
===Izbira seva z želenim profilom delovanja sistema===
Konstrukt, ki je vseboval zapis za ''tetR'' pod konstitutivnim promotorjem in zapis za SpoTH pod kontrolo inducibilnega promotorja PtetR so testirali v različnih sevih ''E.coli'' in sicer v sevu CF944 (spoT202 alel), CF945 (spoT203 alel) in CF946 (spoT204 alel). Bazalni nivoji ppGpp so najnižji pri sevu CF944 in najvišji pri sevu CF946. Poleg teh sevov pa so konstrukt uporabili tudi v kontrolnem sevu divjega tipa MG1655. Genetsko vezje, ki so ga uporabili, jim je omogočilo povečano izražanje SpoTH s povečanjem koncentracije induktorja anhidrotetraciklina (aTc) [1].

Pri sevih CF945 in CF946 je aktivacija gena SpoTH povečala stopnjo rasti za 80% oziroma 60%, pri MG1655 in CF944, ki pa imata v osnovi nižjo bazalno raven ppGpp, pa se hitrost rasti ni spremenila. Za sev CF945 so določili relativno največje povečanje hitrosti rasti, zato so raziskave nadaljevali na tem sevu [1].

===Uporaba različnih virov ogljika===
Osnovno raven ppGpp lahko uravnavamo tudi prek sestave rastnega medija, natančneje prek vira ogljika. Zato so preizkusili tudi štiri najpogosteje uporabljene vire ogljika: glukozo, glicerol, fruktozo in laktozo. Opazili so, da se pri vseh virih ogljika hitrost rasti povečuje z izražanjem SpoTH. Nominalna hitrost rasti celic je najnižja pri laktozi, nato glicerolu, fruktozi in glukozi, in se lahko poveča za 75%, 85%, 50% in 45%. Ti podatki kažejo, da obstaja kompromis med nominalno stopnjo rasti in relativnim povečanjem hitrosti, ki ga je mogoče doseči z izražanjem SpoTH. Stopnja, do katere je mogoče povečati hitrost rasti, je namreč neposredno povezana s količino ppGpp, ki je na voljo za hidrolizo [1].
===Zasnova sistema za uporabo v sevu ''E.coli'' CF945===
Nato so zasnovali sistem za kontrolo rasti, ki je vseboval zapis za SpoTH in rdeči fluorescenčni protein (RFP) – GOI. Poimenovali so ga zaprta zanka (CL, plazmid P_IFFL_x), ker v nasprotju z odprto zanko (OL, plazmid P_OL) vsebuje zapis za SpoTH. Za zasnovo obeh sistemov so uporabili zaporedje ''luxR'', ki se konstitutivno izraža, in inducibilni promotor Plux, ki se aktivira ob dodatku N-acetilhomoserinlaktona (AHL) pri čemer pride do transkripcije RFP. Izražanje RFP sekvestira celične vire, vključno z ribosomi, kar ima negativen vpliv na rast celic. V sistemu CL pa dodatek AHL poveča tudi izražanje SpoTH, kar pa poveča raven ribosomov v celici in s tem kompenzira zmanjšanje hitrosti rasti. Da bi zagotovili ustrezne ravni SpoTH, in s tem zmanjšali občutljivost količine prostih ribosomov na izražanje heterolognih genov, so zasnovali štiri CL sisteme z različno močnimi RBS za SpoTH – RBS1, RBS2, RBS3 in RBS4, ki si v tem zaporedju sledijo tudi po moči. Moč RBS je odvisna od zaporedij pred in za njim, zato so okarakterizirali RBS knjižnico za SpoTH, ki je vsebovala tudi zapis za RFP. Pri tem pa so zmanjšali moč RBS za RFP tako, da je količina ribosomov, ki jih le-ta sekvestira, zanemarljiva [1].

Pri uporabi fruktoze kot primarnega vira ogljika, se je hitrost rasti OL sistema po aktivaciji ekspresije RFP zmanjšala za 25%, medtem ko je za sistem CL z uporabo RBS2 le-ta ostala konstantna. Pri uporabi glicerola se je hitrost rasti za sistem OL zmanjša za 45% ob aktivaciji ekspresije RFP, medtem ko se je za sistem CL z uporabo RBS1 le-ta zmanjšala za 10%. Pri laktozi pa se je hitrost rasti zmanjšala za 55% pri uporabi OL, medtem ko je za sistem CL z RBS2 ostala skoraj enaka [1].

Za kontrolo pa so uporabili konstrukt, ki je namesto zapisa za SpoTH vseboval zapis za nefunckionalni heterologni protein CJB (cjBlue H197S). S tem so želeli potrditi, da je sistem CL boljši od sistema OL zaradi izražanja SpoTH in ne zaradi konfiguracije mRNA RFP. To predpostavko so tudi potrdili, saj je izražanje RFP s kontrolnim konstruktom povzročilo še večje zmanjšanje rasti celic, kot z OL sistemom [1].
===Zasnova sistema za uporabo v običajnih laboratorijskih sevih===
Z namenom razširitve uporabe sistema za nadzor kontrole hitrosti rasti na običajne bakterijske seve, so v osnovni konstrukt vključili inducibilno ekspresijsko kaseto RelA+ gena (plazmid P_IFFL_RelA_2). RelA+ različica vsebuje le 455 N-končnih aminokislinskih ostankov RelA divjega tipa, in ima konstitutivno ppGpp sintezno aktivnost. Zapis za RelA+ so postavili pod inducibilni promotor Psal, pri čemer se transkripcija gena aktivira v prisotnosti salicilata in produkta regulatornega gena ''nahR'', ki se konstitutivno izraža. Gen za SpoTH pa so postavili pod inducibilni promotor Ptet [1].

Po pričakovanjih so povečane ravni RelA+ proteina povzročile nižjo hitrost rasti sevov ''E.coli'' MG1655, TOP10 in NEB. Pri nivoju ekspresije RelA+, ki zniža hitrost rasti za polovico, pa aktivacija transkripcije gena za SpoTH povzroči povečanje hitrosti rasti na isti nivo, kot če se RelA+ ne bi izražal. Iz tega so sklepali, da aktivacija transkripcije gena SpoTH omogoča povečanje hitrosti rasti tudi v običajnih laboratorijskih sevih [1].

Za ocenitev zmožnosti CL sistema, da ohrani konstantno rast celic po aktivaciji ekspresije GOI v sevu TOP10, so okarakterizirali tri sisteme OL z različnimi nominalnimi hitrostmi rasti, ki so jih pripravili s transformacijo sevov ''E.coli'' CF944, CF945 in CF946 s plazmidom P_OL. Za primerjavo pa so uporabili še tri CL sisteme, ki so jih pripravili s transformacijo seva TOP10 s plazmidom P_IFFL_RelA_2. Nominalno stopnjo rasti pa so prilagodili ustreznemu OL sistemu z indukcijo ekspresije RelA+. Ob aktivaciji transkripcije RFP se je hitrost rasti pri OL sistemih znižala za 20%, 55% in 40%, pri CL sistemih pa le za 5%, 7% oziroma 15%. Nadaljnja optimizacija RBS pa bi lahko omogočila, da do padca v stopnji rasti sploh ne bi prišlo. Ekspresija RelA+ torej določa nominalno stopnjo rasti, indukcija ekspresije SpoTH skupaj z GOI pa omogoča, da se le-ta ohrani [1].

===Trajno izražanje GOI v kokulturi===
Gensko spremenjene bakterije običajno uporabljamo v okoljih, kjer so že prisotni drugi mikrobi. Če aktivacija transkripcije GOI povzroči defekte v hitrosti rasti, potem lahko hitreje rastoči organizmi prevladajo nad to populacijo, zaradi česar pride do izgube ekspresije GOI [1].

V ta namen so testirali uporabnost sistema za kontrolo rasti celic v kokulturi. Primerjali so uspešnost OL sistema (sev CF945, plazmid P_OL) in CL sistema (sev CF945, plazmid P_IFFL_x), ki sta inducibilno izražala RFP, ko so ju gojili v kokulturi s konkurenčnim sevom (sev TOP10), ki je konstitutivno izražal BFP (plazmid P_BFP). V izolaciji so bile posamezne hitrosti rasti identične, sčasoma pa je prišlo do padca hitrosti rasti seva transformiranega z P_OL za 50%, medtem ko je sev transformiran s plazmidom P_IFFL_x ohranil začetno stopnjo rasti. Da bi potrdili, da dinamična sprememba na ravni populacije ni posledica dinamične spremembe v stopnji izražanja BFP in RFP, so spremljali intenziteto fluorescence BFP in RFP, in ugotovili, da je le-ta konstantna. Intenziteto fluorescence so normirali na OD600. Iz tega so torej sklepali, da sistem CL prepreči enakomerno zmanjševanje hitrosti rasti celic po aktivaciji ekspresije GOI ter da omogoča trajno izražanje GOI na ravni populacije [1].

==Zaključek==
Sistem za kontrolo hitrosti rasti ima potencial za uporabo pri ekspresiji kateregakoli GOI z uporabo ustreznega RBS za SpoTH na podlagi bremena, ki ga predstavlja GOI. Zasnova je prilagodljiva in modularna. Ekspresija SpoTH lahko povzroči zmanjšanje sinteze drugih proteinov, zato avtorji predlagajo, da se njihov sistem uporablja v kombinaciji s sistemom, ki zagotavlja konstantno stopnjo sinteze proteinov [1].

Kot so uspeli dokazati, bo to orodje ključno za gojenje bakterij v kokulturi. Dobro lastnost sistema pa predstavlja tudi dejstvo, da so ppGpp in homologi RelA/SpoT univerzalno ohranjeni v bakterijah in se pojavljajo tudi pri evkariontih, vključno s človekom, zato se lahko ta sistem uporablja tudi v drugih organizmih [1].
==Literatura==
[1] C. Barajas, HH. Huang,J. Gibson, L. Sansoval, D. Del Vecchio.: Feedforward growth rate control mitigates gene activation burden. Nat Commun, 2022, 13, 7054.

[2] Z. Dalebroux, M. Swanson: ppGpp: magic beyond RNA polymerase. Nat Rev Microbiol 2012, 10, 203–212.

Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov

2023-05-15T17:22:02Z

Nezaribnikar: /* Zasnova sistema za uporabo v običajnih laboratorijskih sevih */

Povzeto po članku [https://www.nature.com/articles/s41467-022-34647-1 ''C. Barajas, HH. Huang,J. Gibson, L. Sansoval, D. Del Vecchio.: Feedforward growth rate control mitigates gene activation burden. Nat Commun, 2022, 13, 7054.'']

==Uvod==
Prekomerno izražanje heterolognih genov (angl. Gene of interest, GOI) izčrpa celične vire, še posebej ribosome. To breme zmanjša hitrost rasti celic in povzroči spremembe s slabo predvidljivimi posledicami, ki običajno ovirajo predvideno delovanje celice. Za ublažitev posledic izražanja GOI, so avtorji članka razvili sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki omogoča aktiviranje GOI do poljubne ravni, pri čemer rast celic ostane konstantna. To pa so dosegli s povečanjem hidrolize ppGpp [1].

Alarmona gvanozin tetrafosfat (ppGpp) in gvanozin pentafosfat (pppGpp) (imenujemo kar ppGpp) v celici koordinirata odziv na stres z obsežnim preklopom profila transkripcije. Pri tem pride do zaustavitve sinteze DNA, stabilnih RNA in ribosomov, začne pa se proizvodnja dejavnikov, ki so ključni za odpornost na stres, glikolizo in sintezo aminokislin. ppGpp se neposredno veže na RNA polimerazo in s tem uravnava izbiro promotorja. Preko raznih mehanizmov pa vpliva tudi na stabilnost, oligomerizacijo in aktivnost mnogih proteinov in regulatornih RNA [1,2].

Celični bazen ppGpp nadzirata dva razreda encimov. RelA so monofunkcionalne sintaze, ki katalizirajo sintezo pppGpp iz GTP in ATP. Proteini SpoT pa so odgovorni za sintezo ppGpp in pppGpp in njuno hidrolizo do GDP in pirofosfata (PPi) oziroma GTP in PPi [2].
==Rezultati==
Avtorji članka so za povečanje stopnje rasti celic eksogeno izrazili različico SpoT proteina, ki vsebuje prvih 203 aminokislinskih ostankov le-tega in ima zgolj hidrolazno aktivnost (SpoTH). Ta encim torej povzroči zmanjšanje koncentracije ppGpp, zaradi česar so pričakovali, da bo prišlo do povečanja hitrosti rasti bakterij. Izražanje SpoTH pa obremeni celico s sekvestacijo celičnih virov, npr. ribosomov. Ko torej SpoTH odstrani zadostne količine ppGpp, samo breme izražanja SpoTH začne prevladovati nad povečanjem hitrosti rasti, kar se kaže kot nemonoton odziv med ekspresijo SpoTH in hitrostjo rasti [1].
===Izbira seva z želenim profilom delovanja sistema===
Konstrukt, ki je vseboval zapis za ''tetR'' pod konstitutivnim promotorjem in zapis za SpoTH pod kontrolo inducibilnega promotorja PtetR so testirali v različnih sevih ''E.coli'' in sicer v sevu CF944 (spoT202 alel), CF945 (spoT203 alel) in CF946 (spoT204 alel). Bazalni nivoji ppGpp so najnižji pri sevu CF944 in najvišji pri sevu CF946. Poleg teh sevov pa so konstrukt uporabili tudi v kontrolnem sevu divjega tipa MG1655. Genetsko vezje, ki so ga uporabili, jim je omogočilo povečano izražanje SpoTH s povečanjem koncentracije induktorja anhidrotetraciklina (aTc) [1].

Pri sevih CF945 in CF946 je aktivacija gena SpoTH povečala stopnjo rasti za 80% oziroma 60%, pri MG1655 in CF944, ki pa imata v osnovi nižjo bazalno raven ppGpp, pa se hitrost rasti ni spremenila. Za sev CF945 so določili relativno največje povečanje hitrosti rasti, zato so raziskave nadaljevali na tem sevu [1].

===Uporaba različnih virov ogljika===
Osnovno raven ppGpp lahko uravnavamo tudi prek sestave rastnega medija, natančneje prek vira ogljika. Zato so preizkusili tudi štiri najpogosteje uporabljene vire ogljika: glukozo, glicerol, fruktozo in laktozo. Opazili so, da se pri vseh virih ogljika hitrost rasti povečuje z izražanjem SpoTH. Nominalna hitrost rasti celic je najnižja pri laktozi, nato glicerolu, fruktozi in glukozi, in se lahko poveča za 75%, 85%, 50% in 45%. Ti podatki kažejo, da obstaja kompromis med nominalno stopnjo rasti in relativnim povečanjem hitrosti, ki ga je mogoče doseči z izražanjem SpoTH. Stopnja, do katere je mogoče povečati hitrost rasti, je namreč neposredno povezana s količino ppGpp, ki je na voljo za hidrolizo [1].
===Zasnova sistema za uporabo v sevu ''E.coli'' CF945===
Nato so zasnovali sistem za kontrolo rasti, ki je vseboval zapis za SpoTH in rdeči fluorescenčni protein (RFP) – GOI. Poimenovali so ga zaprta zanka (CL, plazmid P_IFFL_x), ker v nasprotju z odprto zanko (OL, plazmid P_OL) vsebuje zapis za SpoTH. Za zasnovo obeh sistemov so uporabili zaporedje ''luxR'', ki se konstitutivno izraža, in inducibilni promotor Plux, ki se aktivira ob dodatku N-acetilhomoserinlaktona (AHL) pri čemer pride do transkripcije RFP. Izražanje RFP sekvestira celične vire, vključno z ribosomi, kar ima negativen vpliv na rast celic. V sistemu CL pa dodatek AHL poveča tudi izražanje SpoTH, kar pa poveča raven ribosomov v celici in s tem kompenzira zmanjšanje hitrosti rasti. Da bi zagotovili ustrezne ravni SpoTH, in s tem zmanjšali občutljivost količine prostih ribosomov na izražanje heterolognih genov, so zasnovali štiri CL sisteme z različno močnimi RBS za SpoTH – RBS1, RBS2, RBS3 in RBS4, ki si v tem zaporedju sledijo tudi po moči. Moč RBS je odvisna od zaporedij pred in za njim, zato so okarakterizirali RBS knjižnico za SpoTH, ki je vsebovala tudi zapis za RFP. Pri tem pa so zmanjšali moč RBS za RFP tako, da je količina ribosomov, ki jih le-ta sekvestira, zanemarljiva [1].

Pri uporabi fruktoze kot primarnega vira ogljika, se je hitrost rasti OL sistema po aktivaciji ekspresije RFP zmanjšala za 25%, medtem ko je za sistem CL z uporabo RBS2 le-ta ostala konstantna. Pri uporabi glicerola se je hitrost rasti za sistem OL zmanjša za 45% ob aktivaciji ekspresije RFP, medtem ko se je za sistem CL z uporabo RBS1 le-ta zmanjšala za 10%. Pri laktozi pa se je hitrost rasti zmanjšala za 55% pri uporabi OL, medtem ko je za sistem CL z RBS2 ostala skoraj enaka [1].

Za kontrolo pa so uporabili konstrukt, ki je namesto zapisa za SpoTH vseboval zapis za nefunckionalni heterologni protein CJB (cjBlue H197S). S tem so želeli potrditi, da je sistem CL boljši od sistema OL zaradi izražanja SpoTH in ne zaradi konfiguracije mRNA RFP. To predpostavko so tudi potrdili, saj je izražanje RFP s kontrolnim konstruktom povzročilo še večje zmanjšanje rasti celic, kot z OL sistemom [1].
===Zasnova sistema za uporabo v običajnih laboratorijskih sevih===
Z namenom razširitve uporabe sistema za nadzor kontrole hitrosti rasti na običajne bakterijske seve, so v osnovni konstrukt vključili inducibilno ekspresijsko kaseto RelA+ gena (plazmid P_IFFL_RelA_2). RelA+ različica vsebuje le 455 N-končnih aminokislinskih ostankov RelA divjega tipa, in ima konstitutivno ppGpp sintezno aktivnost. Zapis za RelA+ so postavili pod inducibilni promotor Psal, pri čemer se transkripcija gena aktivira v prisotnosti salicilata in produkta regulatornega gena ''nahR'', ki se konstitutivno izraža. Gen za SpoTH pa so postavili pod inducibilni promotor Ptet [1].

Po pričakovanjih so povečane ravni RelA+ proteina povzročile nižjo hitrost rasti sevov ''E.coli'' MG1655, TOP10 in NEB. Pri nivoju ekspresije RelA+, ki zniža hitrost rasti za polovico, pa aktivacija transkripcije gena za SpoTH povzroči povečanje hitrosti rasti na isti nivo, kot če se RelA+ ne bi izražal. Iz tega so sklepali, da aktivacija transkripcije gena SpoTH omogoča povečanje hitrosti rasti tudi v običajnih laboratorijskih sevih [1].

Za ocenitev zmožnosti CL sistema, da ohrani konstantno rast celic po aktivaciji ekspresije GOI, so okarakterizirali tri sisteme OL z različnimi nominalnimi hitrostmi rasti, ki so jih pripravili s transformacijo sevov ''E.coli'' CF944, CF945 in CF946 s plazmidom P_OL. Za primerjavo pa so uporabili še tri CL sisteme, ki so jih pripravili s transformacijo seva TOP10 s plazmidom P_IFFL_RelA_2. Nominalno stopnjo rasti pa so prilagodili ustreznemu OL sistemu z indukcijo ekspresije RelA+. Ob aktivaciji transkripcije RFP se je hitrost rasti pri OL sistemih znižala za 20%, 55% in 40%, pri CL sistemih pa le za 5%, 7% oziroma 15%. Nadaljnja optimizacija RBS pa bi lahko omogočila, da do padca v stopnji rasti sploh ne bi prišlo. Ekspresija RelA+ torej določa nominalno stopnjo rasti, indukcija ekspresije SpoTH skupaj z GOI pa omogoča, da se le-ta ohrani [1].

===Trajno izražanje GOI v kokulturi===
Gensko spremenjene bakterije običajno uporabljamo v okoljih, kjer so že prisotni drugi mikrobi. Če aktivacija transkripcije GOI povzroči defekte v hitrosti rasti, potem lahko hitreje rastoči organizmi prevladajo nad to populacijo, zaradi česar pride do izgube ekspresije GOI [1].

V ta namen so testirali uporabnost sistema za kontrolo rasti celic v kokulturi. Primerjali so uspešnost OL sistema (sev CF945, plazmid P_OL) in CL sistema (sev CF945, plazmid P_IFFL_x), ki sta inducibilno izražala RFP, ko so ju gojili v kokulturi s konkurenčnim sevom (sev TOP10), ki je konstitutivno izražal BFP (plazmid P_BFP). V izolaciji so bile posamezne hitrosti rasti identične, sčasoma pa je prišlo do padca hitrosti rasti seva transformiranega z P_OL za 50%, medtem ko je sev transformiran s plazmidom P_IFFL_x ohranil začetno stopnjo rasti. Da bi potrdili, da dinamična sprememba na ravni populacije ni posledica dinamične spremembe v stopnji izražanja BFP in RFP, so spremljali intenziteto fluorescence BFP in RFP, in ugotovili, da je le-ta konstantna. Intenziteto fluorescence so normirali na OD600. Iz tega so torej sklepali, da sistem CL prepreči enakomerno zmanjševanje hitrosti rasti celic po aktivaciji ekspresije GOI ter da omogoča trajno izražanje GOI na ravni populacije [1].

==Zaključek==
Sistem za kontrolo hitrosti rasti ima potencial za uporabo pri ekspresiji kateregakoli GOI z uporabo ustreznega RBS za SpoTH na podlagi bremena, ki ga predstavlja GOI. Zasnova je prilagodljiva in modularna. Ekspresija SpoTH lahko povzroči zmanjšanje sinteze drugih proteinov, zato avtorji predlagajo, da se njihov sistem uporablja v kombinaciji s sistemom, ki zagotavlja konstantno stopnjo sinteze proteinov [1].

Kot so uspeli dokazati, bo to orodje ključno za gojenje bakterij v kokulturi. Dobro lastnost sistema pa predstavlja tudi dejstvo, da so ppGpp in homologi RelA/SpoT univerzalno ohranjeni v bakterijah in se pojavljajo tudi pri evkariontih, vključno s človekom, zato se lahko ta sistem uporablja tudi v drugih organizmih [1].
==Literatura==
[1] C. Barajas, HH. Huang,J. Gibson, L. Sansoval, D. Del Vecchio.: Feedforward growth rate control mitigates gene activation burden. Nat Commun, 2022, 13, 7054.

[2] Z. Dalebroux, M. Swanson: ppGpp: magic beyond RNA polymerase. Nat Rev Microbiol 2012, 10, 203–212.

Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov

2023-05-14T18:04:00Z

Nezaribnikar: /* Zasnova sistema za uporabo v običajnih laboratorijskih sevih */

Povzeto po članku [https://www.nature.com/articles/s41467-022-34647-1 ''C. Barajas, HH. Huang,J. Gibson, L. Sansoval, D. Del Vecchio.: Feedforward growth rate control mitigates gene activation burden. Nat Commun, 2022, 13, 7054.'']

==Uvod==
Prekomerno izražanje heterolognih genov (angl. Gene of interest, GOI) izčrpa celične vire, še posebej ribosome. To breme zmanjša hitrost rasti celic in povzroči spremembe s slabo predvidljivimi posledicami, ki običajno ovirajo predvideno delovanje celice. Za ublažitev posledic izražanja GOI, so avtorji članka razvili sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki omogoča aktiviranje GOI do poljubne ravni, pri čemer rast celic ostane konstantna. To pa so dosegli s povečanjem hidrolize ppGpp [1].

Alarmona gvanozin tetrafosfat (ppGpp) in gvanozin pentafosfat (pppGpp) (imenujemo kar ppGpp) v celici koordinirata odziv na stres z obsežnim preklopom profila transkripcije. Pri tem pride do zaustavitve sinteze DNA, stabilnih RNA in ribosomov, začne pa se proizvodnja dejavnikov, ki so ključni za odpornost na stres, glikolizo in sintezo aminokislin. ppGpp se neposredno veže na RNA polimerazo in s tem uravnava izbiro promotorja. Preko raznih mehanizmov pa vpliva tudi na stabilnost, oligomerizacijo in aktivnost mnogih proteinov in regulatornih RNA [1,2].

Celični bazen ppGpp nadzirata dva razreda encimov. RelA so monofunkcionalne sintaze, ki katalizirajo sintezo pppGpp iz GTP in ATP. Proteini SpoT pa so odgovorni za sintezo ppGpp in pppGpp in njuno hidrolizo do GDP in pirofosfata (PPi) oziroma GTP in PPi [2].
==Rezultati==
Avtorji članka so za povečanje stopnje rasti celic eksogeno izrazili različico SpoT proteina, ki vsebuje prvih 203 aminokislinskih ostankov le-tega in ima zgolj hidrolazno aktivnost (SpoTH). Ta encim torej povzroči zmanjšanje koncentracije ppGpp, zaradi česar so pričakovali, da bo prišlo do povečanja hitrosti rasti bakterij. Izražanje SpoTH pa obremeni celico s sekvestacijo celičnih virov, npr. ribosomov. Ko torej SpoTH odstrani zadostne količine ppGpp, samo breme izražanja SpoTH začne prevladovati nad povečanjem hitrosti rasti, kar se kaže kot nemonoton odziv med ekspresijo SpoTH in hitrostjo rasti [1].
===Izbira seva z želenim profilom delovanja sistema===
Konstrukt, ki je vseboval zapis za ''tetR'' pod konstitutivnim promotorjem in zapis za SpoTH pod kontrolo inducibilnega promotorja PtetR so testirali v različnih sevih ''E.coli'' in sicer v sevu CF944 (spoT202 alel), CF945 (spoT203 alel) in CF946 (spoT204 alel). Bazalni nivoji ppGpp so najnižji pri sevu CF944 in najvišji pri sevu CF946. Poleg teh sevov pa so konstrukt uporabili tudi v kontrolnem sevu divjega tipa MG1655. Genetsko vezje, ki so ga uporabili, jim je omogočilo povečano izražanje SpoTH s povečanjem koncentracije induktorja anhidrotetraciklina (aTc) [1].

Pri sevih CF945 in CF946 je aktivacija gena SpoTH povečala stopnjo rasti za 80% oziroma 60%, pri MG1655 in CF944, ki pa imata v osnovi nižjo bazalno raven ppGpp, pa se hitrost rasti ni spremenila. Za sev CF945 so določili relativno največje povečanje hitrosti rasti, zato so raziskave nadaljevali na tem sevu [1].

===Uporaba različnih virov ogljika===
Osnovno raven ppGpp lahko uravnavamo tudi prek sestave rastnega medija, natančneje prek vira ogljika. Zato so preizkusili tudi štiri najpogosteje uporabljene vire ogljika: glukozo, glicerol, fruktozo in laktozo. Opazili so, da se pri vseh virih ogljika hitrost rasti povečuje z izražanjem SpoTH. Nominalna hitrost rasti celic je najnižja pri laktozi, nato glicerolu, fruktozi in glukozi, in se lahko poveča za 75%, 85%, 50% in 45%. Ti podatki kažejo, da obstaja kompromis med nominalno stopnjo rasti in relativnim povečanjem hitrosti, ki ga je mogoče doseči z izražanjem SpoTH. Stopnja, do katere je mogoče povečati hitrost rasti, je namreč neposredno povezana s količino ppGpp, ki je na voljo za hidrolizo [1].
===Zasnova sistema za uporabo v sevu ''E.coli'' CF945===
Nato so zasnovali sistem za kontrolo rasti, ki je vseboval zapis za SpoTH in rdeči fluorescenčni protein (RFP) – GOI. Poimenovali so ga zaprta zanka (CL, plazmid P_IFFL_x), ker v nasprotju z odprto zanko (OL, plazmid P_OL) vsebuje zapis za SpoTH. Za zasnovo obeh sistemov so uporabili zaporedje ''luxR'', ki se konstitutivno izraža, in inducibilni promotor Plux, ki se aktivira ob dodatku N-acetilhomoserinlaktona (AHL) pri čemer pride do transkripcije RFP. Izražanje RFP sekvestira celične vire, vključno z ribosomi, kar ima negativen vpliv na rast celic. V sistemu CL pa dodatek AHL poveča tudi izražanje SpoTH, kar pa poveča raven ribosomov v celici in s tem kompenzira zmanjšanje hitrosti rasti. Da bi zagotovili ustrezne ravni SpoTH, in s tem zmanjšali občutljivost količine prostih ribosomov na izražanje heterolognih genov, so zasnovali štiri CL sisteme z različno močnimi RBS za SpoTH – RBS1, RBS2, RBS3 in RBS4, ki si v tem zaporedju sledijo tudi po moči. Moč RBS je odvisna od zaporedij pred in za njim, zato so okarakterizirali RBS knjižnico za SpoTH, ki je vsebovala tudi zapis za RFP. Pri tem pa so zmanjšali moč RBS za RFP tako, da je količina ribosomov, ki jih le-ta sekvestira, zanemarljiva [1].

Pri uporabi fruktoze kot primarnega vira ogljika, se je hitrost rasti OL sistema po aktivaciji ekspresije RFP zmanjšala za 25%, medtem ko je za sistem CL z uporabo RBS2 le-ta ostala konstantna. Pri uporabi glicerola se je hitrost rasti za sistem OL zmanjša za 45% ob aktivaciji ekspresije RFP, medtem ko se je za sistem CL z uporabo RBS1 le-ta zmanjšala za 10%. Pri laktozi pa se je hitrost rasti zmanjšala za 55% pri uporabi OL, medtem ko je za sistem CL z RBS2 ostala skoraj enaka [1].

Za kontrolo pa so uporabili konstrukt, ki je namesto zapisa za SpoTH vseboval zapis za nefunckionalni heterologni protein CJB (cjBlue H197S). S tem so želeli potrditi, da je sistem CL boljši od sistema OL zaradi izražanja SpoTH in ne zaradi konfiguracije mRNA RFP. To predpostavko so tudi potrdili, saj je izražanje RFP s kontrolnim konstruktom povzročilo še večje zmanjšanje rasti celic, kot z OL sistemom [1].
===Zasnova sistema za uporabo v običajnih laboratorijskih sevih===
Z namenom razširitve uporabe sistema za nadzor kontrole hitrosti rasti na običajne bakterijske seve, so v osnovni konstrukt vključili inducibilno ekspresijsko kaseto RelA+ gena (plazmid P_IFFL_RelA_2). RelA+ različica vsebuje le 455 N-končnih aminokislinskih ostankov RelA divjega tipa, in ima konstitutivno ppGpp sintezno aktivnost. Zapis za RelA+ so postavili pod inducibilni promotor Psal, pri čemer se transkripcija gena aktivira v prisotnosti salicilata in produkta regulatornega gena ''nahR'', ki se konstitutivno izraža. Gen za SpoTH pa so postavili pod inducibilni promotor Ptet [1].

Po pričakovanjih so povečane ravni RelA+ proteina povzročile nižjo hitrost rasti sevov ''E.coli'' MG1655, TOP10 in NEB. Pri nivoju ekspresije RelA+, ki zniža hitrost rasti za polovico, pa aktivacija transkripcije gena za SpoTH povzroči povečanje hitrosti rasti na isti nivo, kot če se RelA+ ne bi izražal. Iz tega so sklepali, da aktivacija transkripcije gena SpoTH omogoča povečanje hitrosti rasti tudi v običajnih laboratorijskih sevih [1].

Za ocenitev zmožnosti CL sistema, da ohrani konstantno rast celic po aktivaciji ekspresije GOI, so okarakterizirali tri sisteme OL z različnimi nominalnimi hitrostmi rasti, ki so jih pripravili s transformacijo sevov ''E.coli'' CF944, CF945 in CF946 s plazmidom P_OL. Za primerjavo pa so uporabili še tri CL sisteme, ki so jih pripravili s transformacijo identičnih sevov s plazmidom P_IFFL_RelA_2. Nominalno stopnjo rasti pa so prilagodili ustreznemu OL sistemu z indukcijo ekspresije RelA+. Ob aktivaciji transkripcije RFP se je hitrost rasti pri OL sistemih znižala za 20%, 55% in 40%, pri CL sistemih pa le za 5%, 7% oziroma 15%. Nadaljnja optimizacija RBS pa bi lahko omogočila, da do padca v stopnji rasti sploh ne bi prišlo. Ekspresija RelA+ torej določa nominalno stopnjo rasti, indukcija ekspresije SpoTH skupaj z GOI pa omogoča, da se le-ta ohrani [1].

===Trajno izražanje GOI v kokulturi===
Gensko spremenjene bakterije običajno uporabljamo v okoljih, kjer so že prisotni drugi mikrobi. Če aktivacija transkripcije GOI povzroči defekte v hitrosti rasti, potem lahko hitreje rastoči organizmi prevladajo nad to populacijo, zaradi česar pride do izgube ekspresije GOI [1].

V ta namen so testirali uporabnost sistema za kontrolo rasti celic v kokulturi. Primerjali so uspešnost OL sistema (sev CF945, plazmid P_OL) in CL sistema (sev CF945, plazmid P_IFFL_x), ki sta inducibilno izražala RFP, ko so ju gojili v kokulturi s konkurenčnim sevom (sev TOP10), ki je konstitutivno izražal BFP (plazmid P_BFP). V izolaciji so bile posamezne hitrosti rasti identične, sčasoma pa je prišlo do padca hitrosti rasti seva transformiranega z P_OL za 50%, medtem ko je sev transformiran s plazmidom P_IFFL_x ohranil začetno stopnjo rasti. Da bi potrdili, da dinamična sprememba na ravni populacije ni posledica dinamične spremembe v stopnji izražanja BFP in RFP, so spremljali intenziteto fluorescence BFP in RFP, in ugotovili, da je le-ta konstantna. Intenziteto fluorescence so normirali na OD600. Iz tega so torej sklepali, da sistem CL prepreči enakomerno zmanjševanje hitrosti rasti celic po aktivaciji ekspresije GOI ter da omogoča trajno izražanje GOI na ravni populacije [1].

==Zaključek==
Sistem za kontrolo hitrosti rasti ima potencial za uporabo pri ekspresiji kateregakoli GOI z uporabo ustreznega RBS za SpoTH na podlagi bremena, ki ga predstavlja GOI. Zasnova je prilagodljiva in modularna. Ekspresija SpoTH lahko povzroči zmanjšanje sinteze drugih proteinov, zato avtorji predlagajo, da se njihov sistem uporablja v kombinaciji s sistemom, ki zagotavlja konstantno stopnjo sinteze proteinov [1].

Kot so uspeli dokazati, bo to orodje ključno za gojenje bakterij v kokulturi. Dobro lastnost sistema pa predstavlja tudi dejstvo, da so ppGpp in homologi RelA/SpoT univerzalno ohranjeni v bakterijah in se pojavljajo tudi pri evkariontih, vključno s človekom, zato se lahko ta sistem uporablja tudi v drugih organizmih [1].
==Literatura==
[1] C. Barajas, HH. Huang,J. Gibson, L. Sansoval, D. Del Vecchio.: Feedforward growth rate control mitigates gene activation burden. Nat Commun, 2022, 13, 7054.

[2] Z. Dalebroux, M. Swanson: ppGpp: magic beyond RNA polymerase. Nat Rev Microbiol 2012, 10, 203–212.

Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov

2023-05-14T18:02:44Z

Nezaribnikar: /* Zasnova sistema za uporabo v običajnih bakterijskih sevih */

Povzeto po članku [https://www.nature.com/articles/s41467-022-34647-1 ''C. Barajas, HH. Huang,J. Gibson, L. Sansoval, D. Del Vecchio.: Feedforward growth rate control mitigates gene activation burden. Nat Commun, 2022, 13, 7054.'']

==Uvod==
Prekomerno izražanje heterolognih genov (angl. Gene of interest, GOI) izčrpa celične vire, še posebej ribosome. To breme zmanjša hitrost rasti celic in povzroči spremembe s slabo predvidljivimi posledicami, ki običajno ovirajo predvideno delovanje celice. Za ublažitev posledic izražanja GOI, so avtorji članka razvili sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki omogoča aktiviranje GOI do poljubne ravni, pri čemer rast celic ostane konstantna. To pa so dosegli s povečanjem hidrolize ppGpp [1].

Alarmona gvanozin tetrafosfat (ppGpp) in gvanozin pentafosfat (pppGpp) (imenujemo kar ppGpp) v celici koordinirata odziv na stres z obsežnim preklopom profila transkripcije. Pri tem pride do zaustavitve sinteze DNA, stabilnih RNA in ribosomov, začne pa se proizvodnja dejavnikov, ki so ključni za odpornost na stres, glikolizo in sintezo aminokislin. ppGpp se neposredno veže na RNA polimerazo in s tem uravnava izbiro promotorja. Preko raznih mehanizmov pa vpliva tudi na stabilnost, oligomerizacijo in aktivnost mnogih proteinov in regulatornih RNA [1,2].

Celični bazen ppGpp nadzirata dva razreda encimov. RelA so monofunkcionalne sintaze, ki katalizirajo sintezo pppGpp iz GTP in ATP. Proteini SpoT pa so odgovorni za sintezo ppGpp in pppGpp in njuno hidrolizo do GDP in pirofosfata (PPi) oziroma GTP in PPi [2].
==Rezultati==
Avtorji članka so za povečanje stopnje rasti celic eksogeno izrazili različico SpoT proteina, ki vsebuje prvih 203 aminokislinskih ostankov le-tega in ima zgolj hidrolazno aktivnost (SpoTH). Ta encim torej povzroči zmanjšanje koncentracije ppGpp, zaradi česar so pričakovali, da bo prišlo do povečanja hitrosti rasti bakterij. Izražanje SpoTH pa obremeni celico s sekvestacijo celičnih virov, npr. ribosomov. Ko torej SpoTH odstrani zadostne količine ppGpp, samo breme izražanja SpoTH začne prevladovati nad povečanjem hitrosti rasti, kar se kaže kot nemonoton odziv med ekspresijo SpoTH in hitrostjo rasti [1].
===Izbira seva z želenim profilom delovanja sistema===
Konstrukt, ki je vseboval zapis za ''tetR'' pod konstitutivnim promotorjem in zapis za SpoTH pod kontrolo inducibilnega promotorja PtetR so testirali v različnih sevih ''E.coli'' in sicer v sevu CF944 (spoT202 alel), CF945 (spoT203 alel) in CF946 (spoT204 alel). Bazalni nivoji ppGpp so najnižji pri sevu CF944 in najvišji pri sevu CF946. Poleg teh sevov pa so konstrukt uporabili tudi v kontrolnem sevu divjega tipa MG1655. Genetsko vezje, ki so ga uporabili, jim je omogočilo povečano izražanje SpoTH s povečanjem koncentracije induktorja anhidrotetraciklina (aTc) [1].

Pri sevih CF945 in CF946 je aktivacija gena SpoTH povečala stopnjo rasti za 80% oziroma 60%, pri MG1655 in CF944, ki pa imata v osnovi nižjo bazalno raven ppGpp, pa se hitrost rasti ni spremenila. Za sev CF945 so določili relativno največje povečanje hitrosti rasti, zato so raziskave nadaljevali na tem sevu [1].

===Uporaba različnih virov ogljika===
Osnovno raven ppGpp lahko uravnavamo tudi prek sestave rastnega medija, natančneje prek vira ogljika. Zato so preizkusili tudi štiri najpogosteje uporabljene vire ogljika: glukozo, glicerol, fruktozo in laktozo. Opazili so, da se pri vseh virih ogljika hitrost rasti povečuje z izražanjem SpoTH. Nominalna hitrost rasti celic je najnižja pri laktozi, nato glicerolu, fruktozi in glukozi, in se lahko poveča za 75%, 85%, 50% in 45%. Ti podatki kažejo, da obstaja kompromis med nominalno stopnjo rasti in relativnim povečanjem hitrosti, ki ga je mogoče doseči z izražanjem SpoTH. Stopnja, do katere je mogoče povečati hitrost rasti, je namreč neposredno povezana s količino ppGpp, ki je na voljo za hidrolizo [1].
===Zasnova sistema za uporabo v sevu ''E.coli'' CF945===
Nato so zasnovali sistem za kontrolo rasti, ki je vseboval zapis za SpoTH in rdeči fluorescenčni protein (RFP) – GOI. Poimenovali so ga zaprta zanka (CL, plazmid P_IFFL_x), ker v nasprotju z odprto zanko (OL, plazmid P_OL) vsebuje zapis za SpoTH. Za zasnovo obeh sistemov so uporabili zaporedje ''luxR'', ki se konstitutivno izraža, in inducibilni promotor Plux, ki se aktivira ob dodatku N-acetilhomoserinlaktona (AHL) pri čemer pride do transkripcije RFP. Izražanje RFP sekvestira celične vire, vključno z ribosomi, kar ima negativen vpliv na rast celic. V sistemu CL pa dodatek AHL poveča tudi izražanje SpoTH, kar pa poveča raven ribosomov v celici in s tem kompenzira zmanjšanje hitrosti rasti. Da bi zagotovili ustrezne ravni SpoTH, in s tem zmanjšali občutljivost količine prostih ribosomov na izražanje heterolognih genov, so zasnovali štiri CL sisteme z različno močnimi RBS za SpoTH – RBS1, RBS2, RBS3 in RBS4, ki si v tem zaporedju sledijo tudi po moči. Moč RBS je odvisna od zaporedij pred in za njim, zato so okarakterizirali RBS knjižnico za SpoTH, ki je vsebovala tudi zapis za RFP. Pri tem pa so zmanjšali moč RBS za RFP tako, da je količina ribosomov, ki jih le-ta sekvestira, zanemarljiva [1].

Pri uporabi fruktoze kot primarnega vira ogljika, se je hitrost rasti OL sistema po aktivaciji ekspresije RFP zmanjšala za 25%, medtem ko je za sistem CL z uporabo RBS2 le-ta ostala konstantna. Pri uporabi glicerola se je hitrost rasti za sistem OL zmanjša za 45% ob aktivaciji ekspresije RFP, medtem ko se je za sistem CL z uporabo RBS1 le-ta zmanjšala za 10%. Pri laktozi pa se je hitrost rasti zmanjšala za 55% pri uporabi OL, medtem ko je za sistem CL z RBS2 ostala skoraj enaka [1].

Za kontrolo pa so uporabili konstrukt, ki je namesto zapisa za SpoTH vseboval zapis za nefunckionalni heterologni protein CJB (cjBlue H197S). S tem so želeli potrditi, da je sistem CL boljši od sistema OL zaradi izražanja SpoTH in ne zaradi konfiguracije mRNA RFP. To predpostavko so tudi potrdili, saj je izražanje RFP s kontrolnim konstruktom povzročilo še večje zmanjšanje rasti celic, kot z OL sistemom [1].
===Zasnova sistema za uporabo v običajnih laboratorijskih sevih===
Z namenom razširitve uporabe sistema za nadzor kontrole hitrosti rasti na običajne bakterijske seve, so v osnovni konstrukt vključili inducibilno ekspresijsko kaseto RelA+ gena (plazmid P_IFFL_RelA_2). RelA+ različica vsebuje le 455 N-končnih aminokislinskih ostankov RelA divjega tipa, in ima konstitutivno ppGpp sintezno aktivnost. Zapis za RelA+ so postavili pod inducibilni promotor Psal, pri čemer se transkripcija gena aktivira v prisotnosti salicilata in produkta regulatornega gena ''nahR'', ki se konstitutivno izraža. Gen za SpoTH pa so postavili pod inducibilni promotor Ptet [1].

Po pričakovanjih so povečane ravni RelA+ proteina povzročile nižjo hitrost rasti sevov ''E.coli'' MG1655, TOP10 in NEB. Pri nivoju ekspresije RelA+, ki zniža hitrost rasti za polovico, pa aktivacija transkripcije gena za SpoTH povzroči povečanje hitrosti rasti na isti nivo, kot če se RelA+ ne bi izražal. Iz tega so sklepali, da aktivacija transkripcije gena SpoTH omogoča povečanje hitrosti rasti tudi v običajnih laboratorijskih sevih [1].

Za ocenitev zmožnosti CL sistema, da ohrani konstantno rast celic po aktivaciji ekspresije GOI, so okarakterizirali tri sisteme OL z različnimi nominalnimi hitrostmi rasti, ki so jih pripravili s transformacijo sevov ''E.coli'' CF944, CF945 in CF946 s plazmidom P_OL. Za primerjavo pa so uporabili še tri CL sisteme, ki so jih pripravili s transformacijo identičnih sevov s plazmidom P_IFFL_RelA_2. Nominalno stopnjo rasti pa so prilagodili ustreznemu OL sistemu z indukcijo ekspresije RelA+. Ob aktivaciji transkripcije RFP se je hitrost rasti pri OL sistemih znižala za 20%, 55% in 40%, pri CL sistemih pa le za 5%, 7% oziroma 15%. Nadaljnja optimizacija RBS pa bi lahko omogočila, da do padca v stopnji rasti sploh ne bi prišlo. Ekspresija RelA+ torej določa nominalno stopnjo rasti, aktivacija ekspresije SpoTH skupaj z GOI pa omogoča, da se le-ta ohrani [1].

===Trajno izražanje GOI v kokulturi===
Gensko spremenjene bakterije običajno uporabljamo v okoljih, kjer so že prisotni drugi mikrobi. Če aktivacija transkripcije GOI povzroči defekte v hitrosti rasti, potem lahko hitreje rastoči organizmi prevladajo nad to populacijo, zaradi česar pride do izgube ekspresije GOI [1].

V ta namen so testirali uporabnost sistema za kontrolo rasti celic v kokulturi. Primerjali so uspešnost OL sistema (sev CF945, plazmid P_OL) in CL sistema (sev CF945, plazmid P_IFFL_x), ki sta inducibilno izražala RFP, ko so ju gojili v kokulturi s konkurenčnim sevom (sev TOP10), ki je konstitutivno izražal BFP (plazmid P_BFP). V izolaciji so bile posamezne hitrosti rasti identične, sčasoma pa je prišlo do padca hitrosti rasti seva transformiranega z P_OL za 50%, medtem ko je sev transformiran s plazmidom P_IFFL_x ohranil začetno stopnjo rasti. Da bi potrdili, da dinamična sprememba na ravni populacije ni posledica dinamične spremembe v stopnji izražanja BFP in RFP, so spremljali intenziteto fluorescence BFP in RFP, in ugotovili, da je le-ta konstantna. Intenziteto fluorescence so normirali na OD600. Iz tega so torej sklepali, da sistem CL prepreči enakomerno zmanjševanje hitrosti rasti celic po aktivaciji ekspresije GOI ter da omogoča trajno izražanje GOI na ravni populacije [1].

==Zaključek==
Sistem za kontrolo hitrosti rasti ima potencial za uporabo pri ekspresiji kateregakoli GOI z uporabo ustreznega RBS za SpoTH na podlagi bremena, ki ga predstavlja GOI. Zasnova je prilagodljiva in modularna. Ekspresija SpoTH lahko povzroči zmanjšanje sinteze drugih proteinov, zato avtorji predlagajo, da se njihov sistem uporablja v kombinaciji s sistemom, ki zagotavlja konstantno stopnjo sinteze proteinov [1].

Kot so uspeli dokazati, bo to orodje ključno za gojenje bakterij v kokulturi. Dobro lastnost sistema pa predstavlja tudi dejstvo, da so ppGpp in homologi RelA/SpoT univerzalno ohranjeni v bakterijah in se pojavljajo tudi pri evkariontih, vključno s človekom, zato se lahko ta sistem uporablja tudi v drugih organizmih [1].
==Literatura==
[1] C. Barajas, HH. Huang,J. Gibson, L. Sansoval, D. Del Vecchio.: Feedforward growth rate control mitigates gene activation burden. Nat Commun, 2022, 13, 7054.

[2] Z. Dalebroux, M. Swanson: ppGpp: magic beyond RNA polymerase. Nat Rev Microbiol 2012, 10, 203–212.

Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov

2023-05-14T18:01:20Z

Nezaribnikar: /* Izbira seva z željenim profilom aktuatorja */

Povzeto po članku [https://www.nature.com/articles/s41467-022-34647-1 ''C. Barajas, HH. Huang,J. Gibson, L. Sansoval, D. Del Vecchio.: Feedforward growth rate control mitigates gene activation burden. Nat Commun, 2022, 13, 7054.'']

==Uvod==
Prekomerno izražanje heterolognih genov (angl. Gene of interest, GOI) izčrpa celične vire, še posebej ribosome. To breme zmanjša hitrost rasti celic in povzroči spremembe s slabo predvidljivimi posledicami, ki običajno ovirajo predvideno delovanje celice. Za ublažitev posledic izražanja GOI, so avtorji članka razvili sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki omogoča aktiviranje GOI do poljubne ravni, pri čemer rast celic ostane konstantna. To pa so dosegli s povečanjem hidrolize ppGpp [1].

Alarmona gvanozin tetrafosfat (ppGpp) in gvanozin pentafosfat (pppGpp) (imenujemo kar ppGpp) v celici koordinirata odziv na stres z obsežnim preklopom profila transkripcije. Pri tem pride do zaustavitve sinteze DNA, stabilnih RNA in ribosomov, začne pa se proizvodnja dejavnikov, ki so ključni za odpornost na stres, glikolizo in sintezo aminokislin. ppGpp se neposredno veže na RNA polimerazo in s tem uravnava izbiro promotorja. Preko raznih mehanizmov pa vpliva tudi na stabilnost, oligomerizacijo in aktivnost mnogih proteinov in regulatornih RNA [1,2].

Celični bazen ppGpp nadzirata dva razreda encimov. RelA so monofunkcionalne sintaze, ki katalizirajo sintezo pppGpp iz GTP in ATP. Proteini SpoT pa so odgovorni za sintezo ppGpp in pppGpp in njuno hidrolizo do GDP in pirofosfata (PPi) oziroma GTP in PPi [2].
==Rezultati==
Avtorji članka so za povečanje stopnje rasti celic eksogeno izrazili različico SpoT proteina, ki vsebuje prvih 203 aminokislinskih ostankov le-tega in ima zgolj hidrolazno aktivnost (SpoTH). Ta encim torej povzroči zmanjšanje koncentracije ppGpp, zaradi česar so pričakovali, da bo prišlo do povečanja hitrosti rasti bakterij. Izražanje SpoTH pa obremeni celico s sekvestacijo celičnih virov, npr. ribosomov. Ko torej SpoTH odstrani zadostne količine ppGpp, samo breme izražanja SpoTH začne prevladovati nad povečanjem hitrosti rasti, kar se kaže kot nemonoton odziv med ekspresijo SpoTH in hitrostjo rasti [1].
===Izbira seva z želenim profilom delovanja sistema===
Konstrukt, ki je vseboval zapis za ''tetR'' pod konstitutivnim promotorjem in zapis za SpoTH pod kontrolo inducibilnega promotorja PtetR so testirali v različnih sevih ''E.coli'' in sicer v sevu CF944 (spoT202 alel), CF945 (spoT203 alel) in CF946 (spoT204 alel). Bazalni nivoji ppGpp so najnižji pri sevu CF944 in najvišji pri sevu CF946. Poleg teh sevov pa so konstrukt uporabili tudi v kontrolnem sevu divjega tipa MG1655. Genetsko vezje, ki so ga uporabili, jim je omogočilo povečano izražanje SpoTH s povečanjem koncentracije induktorja anhidrotetraciklina (aTc) [1].

Pri sevih CF945 in CF946 je aktivacija gena SpoTH povečala stopnjo rasti za 80% oziroma 60%, pri MG1655 in CF944, ki pa imata v osnovi nižjo bazalno raven ppGpp, pa se hitrost rasti ni spremenila. Za sev CF945 so določili relativno največje povečanje hitrosti rasti, zato so raziskave nadaljevali na tem sevu [1].

===Uporaba različnih virov ogljika===
Osnovno raven ppGpp lahko uravnavamo tudi prek sestave rastnega medija, natančneje prek vira ogljika. Zato so preizkusili tudi štiri najpogosteje uporabljene vire ogljika: glukozo, glicerol, fruktozo in laktozo. Opazili so, da se pri vseh virih ogljika hitrost rasti povečuje z izražanjem SpoTH. Nominalna hitrost rasti celic je najnižja pri laktozi, nato glicerolu, fruktozi in glukozi, in se lahko poveča za 75%, 85%, 50% in 45%. Ti podatki kažejo, da obstaja kompromis med nominalno stopnjo rasti in relativnim povečanjem hitrosti, ki ga je mogoče doseči z izražanjem SpoTH. Stopnja, do katere je mogoče povečati hitrost rasti, je namreč neposredno povezana s količino ppGpp, ki je na voljo za hidrolizo [1].
===Zasnova sistema za uporabo v sevu ''E.coli'' CF945===
Nato so zasnovali sistem za kontrolo rasti, ki je vseboval zapis za SpoTH in rdeči fluorescenčni protein (RFP) – GOI. Poimenovali so ga zaprta zanka (CL, plazmid P_IFFL_x), ker v nasprotju z odprto zanko (OL, plazmid P_OL) vsebuje zapis za SpoTH. Za zasnovo obeh sistemov so uporabili zaporedje ''luxR'', ki se konstitutivno izraža, in inducibilni promotor Plux, ki se aktivira ob dodatku N-acetilhomoserinlaktona (AHL) pri čemer pride do transkripcije RFP. Izražanje RFP sekvestira celične vire, vključno z ribosomi, kar ima negativen vpliv na rast celic. V sistemu CL pa dodatek AHL poveča tudi izražanje SpoTH, kar pa poveča raven ribosomov v celici in s tem kompenzira zmanjšanje hitrosti rasti. Da bi zagotovili ustrezne ravni SpoTH, in s tem zmanjšali občutljivost količine prostih ribosomov na izražanje heterolognih genov, so zasnovali štiri CL sisteme z različno močnimi RBS za SpoTH – RBS1, RBS2, RBS3 in RBS4, ki si v tem zaporedju sledijo tudi po moči. Moč RBS je odvisna od zaporedij pred in za njim, zato so okarakterizirali RBS knjižnico za SpoTH, ki je vsebovala tudi zapis za RFP. Pri tem pa so zmanjšali moč RBS za RFP tako, da je količina ribosomov, ki jih le-ta sekvestira, zanemarljiva [1].

Pri uporabi fruktoze kot primarnega vira ogljika, se je hitrost rasti OL sistema po aktivaciji ekspresije RFP zmanjšala za 25%, medtem ko je za sistem CL z uporabo RBS2 le-ta ostala konstantna. Pri uporabi glicerola se je hitrost rasti za sistem OL zmanjša za 45% ob aktivaciji ekspresije RFP, medtem ko se je za sistem CL z uporabo RBS1 le-ta zmanjšala za 10%. Pri laktozi pa se je hitrost rasti zmanjšala za 55% pri uporabi OL, medtem ko je za sistem CL z RBS2 ostala skoraj enaka [1].

Za kontrolo pa so uporabili konstrukt, ki je namesto zapisa za SpoTH vseboval zapis za nefunckionalni heterologni protein CJB (cjBlue H197S). S tem so želeli potrditi, da je sistem CL boljši od sistema OL zaradi izražanja SpoTH in ne zaradi konfiguracije mRNA RFP. To predpostavko so tudi potrdili, saj je izražanje RFP s kontrolnim konstruktom povzročilo še večje zmanjšanje rasti celic, kot z OL sistemom [1].
===Zasnova sistema za uporabo v običajnih bakterijskih sevih===
Z namenom razširitve uporabe sistema za nadzor kontrole hitrosti rasti na običajne bakterijske seve, so v osnovni konstrukt vključili inducibilno ekspresijsko kaseto RelA+ gena (plazmid P_IFFL_RelA_2). RelA+ različica vsebuje le 455 N-končnih aminokislinskih ostankov RelA divjega tipa, in ima konstitutivno ppGpp sintezno aktivnost. Zapis za RelA+ so postavili pod inducibilni promotor Psal, pri čemer se transkripcija gena aktivira v prisotnosti salicilata in produkta regulatornega gena ''nahR'', ki se konstitutivno izraža. Gen za SpoTH pa so postavili pod inducibilni promotor Ptet [1].

Po pričakovanjih so povečane ravni RelA+ proteina povzročile nižjo hitrost rasti sevov ''E.coli'' MG1655, TOP10 in NEB. Pri nivoju ekspresije RelA+, ki zniža hitrost rasti za polovico, pa aktivacija transkripcije gena za SpoTH povzroči povečanje hitrosti rasti na isti nivo, kot če se RelA+ ne bi izražal. Iz tega so sklepali, da aktivacija transkripcije gena SpoTH omogoča povečanje hitrosti rasti tudi v običajnih laboratorijskih sevih [1].

Za ocenitev zmožnosti CL sistema, da ohrani konstantno rast celic po aktivaciji ekspresije GOI, so okarakterizirali tri sisteme OL z različnimi nominalnimi hitrostmi rasti, ki so jih pripravili s transformacijo sevov ''E.coli'' CF944, CF945 in CF946 s plazmidom P_OL. Za primerjavo pa so uporabili še tri CL sisteme, ki so jih pripravili s transformacijo identičnih sevov s plazmidom P_IFFL_RelA_2. Nominalno stopnjo rasti pa so prilagodili ustreznemu OL sistemu z indukcijo ekspresije RelA+. Ob aktivaciji transkripcije RFP se je hitrost rasti pri OL sistemih znižala za 20%, 55% in 40%, pri CL sistemih pa le za 5%, 7% oziroma 15%. Nadaljnja optimizacija RBS pa bi lahko omogočila, da do padca v stopnji rasti sploh ne bi prišlo. Ekspresija RelA+ torej določa nominalno stopnjo rasti, aktivacija ekspresije SpoTH skupaj z GOI pa omogoča, da se le-ta ohrani [1].
===Trajno izražanje GOI v kokulturi===
Gensko spremenjene bakterije običajno uporabljamo v okoljih, kjer so že prisotni drugi mikrobi. Če aktivacija transkripcije GOI povzroči defekte v hitrosti rasti, potem lahko hitreje rastoči organizmi prevladajo nad to populacijo, zaradi česar pride do izgube ekspresije GOI [1].

V ta namen so testirali uporabnost sistema za kontrolo rasti celic v kokulturi. Primerjali so uspešnost OL sistema (sev CF945, plazmid P_OL) in CL sistema (sev CF945, plazmid P_IFFL_x), ki sta inducibilno izražala RFP, ko so ju gojili v kokulturi s konkurenčnim sevom (sev TOP10), ki je konstitutivno izražal BFP (plazmid P_BFP). V izolaciji so bile posamezne hitrosti rasti identične, sčasoma pa je prišlo do padca hitrosti rasti seva transformiranega z P_OL za 50%, medtem ko je sev transformiran s plazmidom P_IFFL_x ohranil začetno stopnjo rasti. Da bi potrdili, da dinamična sprememba na ravni populacije ni posledica dinamične spremembe v stopnji izražanja BFP in RFP, so spremljali intenziteto fluorescence BFP in RFP, in ugotovili, da je le-ta konstantna. Intenziteto fluorescence so normirali na OD600. Iz tega so torej sklepali, da sistem CL prepreči enakomerno zmanjševanje hitrosti rasti celic po aktivaciji ekspresije GOI ter da omogoča trajno izražanje GOI na ravni populacije [1].

==Zaključek==
Sistem za kontrolo hitrosti rasti ima potencial za uporabo pri ekspresiji kateregakoli GOI z uporabo ustreznega RBS za SpoTH na podlagi bremena, ki ga predstavlja GOI. Zasnova je prilagodljiva in modularna. Ekspresija SpoTH lahko povzroči zmanjšanje sinteze drugih proteinov, zato avtorji predlagajo, da se njihov sistem uporablja v kombinaciji s sistemom, ki zagotavlja konstantno stopnjo sinteze proteinov [1].

Kot so uspeli dokazati, bo to orodje ključno za gojenje bakterij v kokulturi. Dobro lastnost sistema pa predstavlja tudi dejstvo, da so ppGpp in homologi RelA/SpoT univerzalno ohranjeni v bakterijah in se pojavljajo tudi pri evkariontih, vključno s človekom, zato se lahko ta sistem uporablja tudi v drugih organizmih [1].
==Literatura==
[1] C. Barajas, HH. Huang,J. Gibson, L. Sansoval, D. Del Vecchio.: Feedforward growth rate control mitigates gene activation burden. Nat Commun, 2022, 13, 7054.

[2] Z. Dalebroux, M. Swanson: ppGpp: magic beyond RNA polymerase. Nat Rev Microbiol 2012, 10, 203–212.

Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov

2023-05-14T17:42:10Z

Nezaribnikar: /* Rezultati */

Povzeto po članku [https://www.nature.com/articles/s41467-022-34647-1 ''C. Barajas, HH. Huang,J. Gibson, L. Sansoval, D. Del Vecchio.: Feedforward growth rate control mitigates gene activation burden. Nat Commun, 2022, 13, 7054.'']

==Uvod==
Prekomerno izražanje heterolognih genov (angl. Gene of interest, GOI) izčrpa celične vire, še posebej ribosome. To breme zmanjša hitrost rasti celic in povzroči spremembe s slabo predvidljivimi posledicami, ki običajno ovirajo predvideno delovanje celice. Za ublažitev posledic izražanja GOI, so avtorji članka razvili sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki omogoča aktiviranje GOI do poljubne ravni, pri čemer rast celic ostane konstantna. To pa so dosegli s povečanjem hidrolize ppGpp [1].

Alarmona gvanozin tetrafosfat (ppGpp) in gvanozin pentafosfat (pppGpp) (imenujemo kar ppGpp) v celici koordinirata odziv na stres z obsežnim preklopom profila transkripcije. Pri tem pride do zaustavitve sinteze DNA, stabilnih RNA in ribosomov, začne pa se proizvodnja dejavnikov, ki so ključni za odpornost na stres, glikolizo in sintezo aminokislin. ppGpp se neposredno veže na RNA polimerazo in s tem uravnava izbiro promotorja. Preko raznih mehanizmov pa vpliva tudi na stabilnost, oligomerizacijo in aktivnost mnogih proteinov in regulatornih RNA [1,2].

Celični bazen ppGpp nadzirata dva razreda encimov. RelA so monofunkcionalne sintaze, ki katalizirajo sintezo pppGpp iz GTP in ATP. Proteini SpoT pa so odgovorni za sintezo ppGpp in pppGpp in njuno hidrolizo do GDP in pirofosfata (PPi) oziroma GTP in PPi [2].
==Rezultati==
Avtorji članka so za povečanje stopnje rasti celic eksogeno izrazili različico SpoT proteina, ki vsebuje prvih 203 aminokislinskih ostankov le-tega in ima zgolj hidrolazno aktivnost (SpoTH). Ta encim torej povzroči zmanjšanje koncentracije ppGpp, zaradi česar so pričakovali, da bo prišlo do povečanja hitrosti rasti bakterij. Izražanje SpoTH pa obremeni celico s sekvestacijo celičnih virov, npr. ribosomov. Ko torej SpoTH odstrani zadostne količine ppGpp, samo breme izražanja SpoTH začne prevladovati nad povečanjem hitrosti rasti, kar se kaže kot nemonoton odziv med ekspresijo SpoTH in hitrostjo rasti [1].
===Izbira seva z željenim profilom aktuatorja===
Konstrukt, ki je vseboval zapis za ''tetR'' pod konstitutivnim promotorjem in zapis za SpoTH pod kontrolo inducibilnega promotorja PtetR so testirali v različnih sevih ''E.coli'' in sicer v sevu CF944 (spoT202 alel), CF945 (spoT203 alel) in CF946 (spoT204 alel). Bazalni nivoji ppGpp so najnižji pri sevu CF944 in najvišji pri sevu CF946. Poleg teh sevov pa so konstrukt uporabili tudi v kontrolnem sevu divjega tipa MG1655. Genetsko vezje, ki so ga uporabili, jim je omogočilo povečano izražanje SpoTH s povečanjem koncentracije induktorja anhidrotetraciklina (aTc) [1].

Pri sevih CF945 in CF946 je aktivacija gena SpoTH povečala stopnjo rasti za 80% oziroma 60%, pri MG1655 in CF944, ki pa imata v osnovi nižjo bazalno raven ppGpp, pa se hitrost rasti ni spremenila. Za sev CF945 so določili relativno največje povečanje hitrosti rasti, zato so raziskave nadaljevali na tem sevu [1].
===Uporaba različnih virov ogljika===
Osnovno raven ppGpp lahko uravnavamo tudi prek sestave rastnega medija, natančneje prek vira ogljika. Zato so preizkusili tudi štiri najpogosteje uporabljene vire ogljika: glukozo, glicerol, fruktozo in laktozo. Opazili so, da se pri vseh virih ogljika hitrost rasti povečuje z izražanjem SpoTH. Nominalna hitrost rasti celic je najnižja pri laktozi, nato glicerolu, fruktozi in glukozi, in se lahko poveča za 75%, 85%, 50% in 45%. Ti podatki kažejo, da obstaja kompromis med nominalno stopnjo rasti in relativnim povečanjem hitrosti, ki ga je mogoče doseči z izražanjem SpoTH. Stopnja, do katere je mogoče povečati hitrost rasti, je namreč neposredno povezana s količino ppGpp, ki je na voljo za hidrolizo [1].
===Zasnova sistema za uporabo v sevu ''E.coli'' CF945===
Nato so zasnovali sistem za kontrolo rasti, ki je vseboval zapis za SpoTH in rdeči fluorescenčni protein (RFP) – GOI. Poimenovali so ga zaprta zanka (CL, plazmid P_IFFL_x), ker v nasprotju z odprto zanko (OL, plazmid P_OL) vsebuje zapis za SpoTH. Za zasnovo obeh sistemov so uporabili zaporedje ''luxR'', ki se konstitutivno izraža, in inducibilni promotor Plux, ki se aktivira ob dodatku N-acetilhomoserinlaktona (AHL) pri čemer pride do transkripcije RFP. Izražanje RFP sekvestira celične vire, vključno z ribosomi, kar ima negativen vpliv na rast celic. V sistemu CL pa dodatek AHL poveča tudi izražanje SpoTH, kar pa poveča raven ribosomov v celici in s tem kompenzira zmanjšanje hitrosti rasti. Da bi zagotovili ustrezne ravni SpoTH, in s tem zmanjšali občutljivost količine prostih ribosomov na izražanje heterolognih genov, so zasnovali štiri CL sisteme z različno močnimi RBS za SpoTH – RBS1, RBS2, RBS3 in RBS4, ki si v tem zaporedju sledijo tudi po moči. Moč RBS je odvisna od zaporedij pred in za njim, zato so okarakterizirali RBS knjižnico za SpoTH, ki je vsebovala tudi zapis za RFP. Pri tem pa so zmanjšali moč RBS za RFP tako, da je količina ribosomov, ki jih le-ta sekvestira, zanemarljiva [1].

Pri uporabi fruktoze kot primarnega vira ogljika, se je hitrost rasti OL sistema po aktivaciji ekspresije RFP zmanjšala za 25%, medtem ko je za sistem CL z uporabo RBS2 le-ta ostala konstantna. Pri uporabi glicerola se je hitrost rasti za sistem OL zmanjša za 45% ob aktivaciji ekspresije RFP, medtem ko se je za sistem CL z uporabo RBS1 le-ta zmanjšala za 10%. Pri laktozi pa se je hitrost rasti zmanjšala za 55% pri uporabi OL, medtem ko je za sistem CL z RBS2 ostala skoraj enaka [1].

Za kontrolo pa so uporabili konstrukt, ki je namesto zapisa za SpoTH vseboval zapis za nefunckionalni heterologni protein CJB (cjBlue H197S). S tem so želeli potrditi, da je sistem CL boljši od sistema OL zaradi izražanja SpoTH in ne zaradi konfiguracije mRNA RFP. To predpostavko so tudi potrdili, saj je izražanje RFP s kontrolnim konstruktom povzročilo še večje zmanjšanje rasti celic, kot z OL sistemom [1].
===Zasnova sistema za uporabo v običajnih bakterijskih sevih===
Z namenom razširitve uporabe sistema za nadzor kontrole hitrosti rasti na običajne bakterijske seve, so v osnovni konstrukt vključili inducibilno ekspresijsko kaseto RelA+ gena (plazmid P_IFFL_RelA_2). RelA+ različica vsebuje le 455 N-končnih aminokislinskih ostankov RelA divjega tipa, in ima konstitutivno ppGpp sintezno aktivnost. Zapis za RelA+ so postavili pod inducibilni promotor Psal, pri čemer se transkripcija gena aktivira v prisotnosti salicilata in produkta regulatornega gena ''nahR'', ki se konstitutivno izraža. Gen za SpoTH pa so postavili pod inducibilni promotor Ptet [1].

Po pričakovanjih so povečane ravni RelA+ proteina povzročile nižjo hitrost rasti sevov ''E.coli'' MG1655, TOP10 in NEB. Pri nivoju ekspresije RelA+, ki zniža hitrost rasti za polovico, pa aktivacija transkripcije gena za SpoTH povzroči povečanje hitrosti rasti na isti nivo, kot če se RelA+ ne bi izražal. Iz tega so sklepali, da aktivacija transkripcije gena SpoTH omogoča povečanje hitrosti rasti tudi v običajnih laboratorijskih sevih [1].

Za ocenitev zmožnosti CL sistema, da ohrani konstantno rast celic po aktivaciji ekspresije GOI, so okarakterizirali tri sisteme OL z različnimi nominalnimi hitrostmi rasti, ki so jih pripravili s transformacijo sevov ''E.coli'' CF944, CF945 in CF946 s plazmidom P_OL. Za primerjavo pa so uporabili še tri CL sisteme, ki so jih pripravili s transformacijo identičnih sevov s plazmidom P_IFFL_RelA_2. Nominalno stopnjo rasti pa so prilagodili ustreznemu OL sistemu z indukcijo ekspresije RelA+. Ob aktivaciji transkripcije RFP se je hitrost rasti pri OL sistemih znižala za 20%, 55% in 40%, pri CL sistemih pa le za 5%, 7% oziroma 15%. Nadaljnja optimizacija RBS pa bi lahko omogočila, da do padca v stopnji rasti sploh ne bi prišlo. Ekspresija RelA+ torej določa nominalno stopnjo rasti, aktivacija ekspresije SpoTH skupaj z GOI pa omogoča, da se le-ta ohrani [1].
===Trajno izražanje GOI v kokulturi===
Gensko spremenjene bakterije običajno uporabljamo v okoljih, kjer so že prisotni drugi mikrobi. Če aktivacija transkripcije GOI povzroči defekte v hitrosti rasti, potem lahko hitreje rastoči organizmi prevladajo nad to populacijo, zaradi česar pride do izgube ekspresije GOI [1].

V ta namen so testirali uporabnost sistema za kontrolo rasti celic v kokulturi. Primerjali so uspešnost OL sistema (sev CF945, plazmid P_OL) in CL sistema (sev CF945, plazmid P_IFFL_x), ki sta inducibilno izražala RFP, ko so ju gojili v kokulturi s konkurenčnim sevom (sev TOP10), ki je konstitutivno izražal BFP (plazmid P_BFP). V izolaciji so bile posamezne hitrosti rasti identične, sčasoma pa je prišlo do padca hitrosti rasti seva transformiranega z P_OL za 50%, medtem ko je sev transformiran s plazmidom P_IFFL_x ohranil začetno stopnjo rasti. Da bi potrdili, da dinamična sprememba na ravni populacije ni posledica dinamične spremembe v stopnji izražanja BFP in RFP, so spremljali intenziteto fluorescence BFP in RFP, in ugotovili, da je le-ta konstantna. Intenziteto fluorescence so normirali na OD600. Iz tega so torej sklepali, da sistem CL prepreči enakomerno zmanjševanje hitrosti rasti celic po aktivaciji ekspresije GOI ter da omogoča trajno izražanje GOI na ravni populacije [1].

==Zaključek==
Sistem za kontrolo hitrosti rasti ima potencial za uporabo pri ekspresiji kateregakoli GOI z uporabo ustreznega RBS za SpoTH na podlagi bremena, ki ga predstavlja GOI. Zasnova je prilagodljiva in modularna. Ekspresija SpoTH lahko povzroči zmanjšanje sinteze drugih proteinov, zato avtorji predlagajo, da se njihov sistem uporablja v kombinaciji s sistemom, ki zagotavlja konstantno stopnjo sinteze proteinov [1].

Kot so uspeli dokazati, bo to orodje ključno za gojenje bakterij v kokulturi. Dobro lastnost sistema pa predstavlja tudi dejstvo, da so ppGpp in homologi RelA/SpoT univerzalno ohranjeni v bakterijah in se pojavljajo tudi pri evkariontih, vključno s človekom, zato se lahko ta sistem uporablja tudi v drugih organizmih [1].
==Literatura==
[1] C. Barajas, HH. Huang,J. Gibson, L. Sansoval, D. Del Vecchio.: Feedforward growth rate control mitigates gene activation burden. Nat Commun, 2022, 13, 7054.

[2] Z. Dalebroux, M. Swanson: ppGpp: magic beyond RNA polymerase. Nat Rev Microbiol 2012, 10, 203–212.

Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov

2023-05-14T16:21:36Z

Nezaribnikar:

Povzeto po članku [https://www.nature.com/articles/s41467-022-34647-1 ''C. Barajas, HH. Huang,J. Gibson, L. Sansoval, D. Del Vecchio.: Feedforward growth rate control mitigates gene activation burden. Nat Commun, 2022, 13, 7054.'']

==Uvod==
Prekomerno izražanje heterolognih genov (angl. Gene of interest, GOI) izčrpa celične vire, še posebej ribosome. To breme zmanjša hitrost rasti celic in povzroči spremembe s slabo predvidljivimi posledicami, ki običajno ovirajo predvideno delovanje celice. Za ublažitev posledic izražanja GOI, so avtorji članka razvili sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki omogoča aktiviranje GOI do poljubne ravni, pri čemer rast celic ostane konstantna. To pa so dosegli s povečanjem hidrolize ppGpp [1].

Alarmona gvanozin tetrafosfat (ppGpp) in gvanozin pentafosfat (pppGpp) (imenujemo kar ppGpp) v celici koordinirata odziv na stres z obsežnim preklopom profila transkripcije. Pri tem pride do zaustavitve sinteze DNA, stabilnih RNA in ribosomov, začne pa se proizvodnja dejavnikov, ki so ključni za odpornost na stres, glikolizo in sintezo aminokislin. ppGpp se neposredno veže na RNA polimerazo in s tem uravnava izbiro promotorja. Preko raznih mehanizmov pa vpliva tudi na stabilnost, oligomerizacijo in aktivnost mnogih proteinov in regulatornih RNA [1,2].

Celični bazen ppGpp nadzirata dva razreda encimov. RelA so monofunkcionalne sintaze, ki katalizirajo sintezo pppGpp iz GTP in ATP. Proteini SpoT pa so odgovorni za sintezo ppGpp in pppGpp in njuno hidrolizo do GDP in pirofosfata (PPi) oziroma GTP in PPi [2].
==Rezultati==
Avtorji članka so za povečanje stopnje rasti eksogeno izrazili različico SpoT proteina, ki vsebuje prvih 203 aminokislinskih ostankov le-tega in ima zgolj hidrolazno aktivnost (SpoTH). Ta encim torej povzroči zmanjšanje koncentracije ppGpp, zaradi česar so pričakovali, da bo prišlo do povečanja hitrosti rasti bakterij. Izražanje SpoTH pa obremeni celico s sekvestacijo celičnih virov, npr. ribosomov. Ko torej SpoTH odstrani zadostne količine ppGpp, samo breme izražanja SpoTH začne prevladovati nad povečanjem hitrosti rasti, kar se kaže kot nemonoton odziv med ekspresijo SpoTH in hitrostjo rasti [1].
===Izbira seva z željenim profilom aktuatorja===
Konstrukt, ki je vseboval zapis za ''tetR'' pod konstitutivnim promotorjem in zapis za SpoTH pod kontrolo inducibilnega promotorja PtetR so testirali v različnih sevih ''E.coli'' in sicer v sevu CF944 (spoT202 alel), CF945 (spoT203 alel) in CF946 (spoT204 alel). Bazalni nivoji ppGpp so najnižji pri sevu CF944 in najvišji pri sevu CF946. Poleg teh sevov pa so konstrukt uporabili tudi v kontrolnem sevu divjega tipa MG1655. Genetsko vezje, ki so ga uporabili, jim je omogočilo povečano izražanje SpoTH s povečanjem koncentracije induktorja anhidrotetraciklina (aTc) [1].

Pri sevih CF945 in CF946 je aktivacija gena SpoTH povečala stopnjo rasti za 80% oziroma 60%, pri MG1655 in CF944, ki pa imata v osnovi nižjo bazalno raven ppGpp, pa se hitrost rasti ni spremenila. Za sev CF945 so določili relativno največje povečanje hitrosti rasti, zato so raziskave nadaljevali na tem sevu [1].
===Uporaba različnih virov ogljika===
Osnovno raven ppGpp lahko uravnavamo tudi prek sestave rastnega medija, natančneje prek vira ogljika. Zato so preizkusili tudi štiri najpogosteje uporabljene vire ogljika: glukozo, glicerol, fruktozo in laktozo. Opazili so, da se pri vseh virih ogljika hitrost rasti povečuje z izražanjem SpoTH. Nominalna hitrost rasti celic je najnižja pri laktozi, nato glicerolu, fruktozi in glukozi, in se lahko poveča za 75%, 85%, 50% in 45%. Ti podatki kažejo, da obstaja kompromis med nominalno stopnjo rasti in relativnim povečanjem hitrosti, ki ga je mogoče doseči z izražanjem SpoTH. Stopnja, do katere je mogoče povečati hitrost rasti, je namreč neposredno povezana s količino ppGpp, ki je na voljo za hidrolizo [1].
===Zasnova sistema za uporabo v sevu ''E.coli'' CF945===
Nato so zasnovali sistem za kontrolo rasti, ki je vseboval zapis za SpoTH in rdeči fluorescenčni protein (RFP) – GOI. Poimenovali so ga zaprta zanka (CL, plazmid P_IFFL_x), ker v nasprotju z odprto zanko (OL, plazmid P_OL) vsebuje zapis za SpoTH. Za zasnovo obeh sistemov so uporabili zaporedje ''luxR'', ki se konstitutivno izraža, in inducibilni promotor Plux, ki se aktivira ob dodatku N-acetilhomoserinlaktona (AHL) pri čemer pride do transkripcije RFP. Izražanje RFP sekvestira celične vire, vključno z ribosomi, kar ima negativen vpliv na rast celic. V sistemu CL pa dodatek AHL poveča tudi izražanje SpoTH, kar pa poveča raven ribosomov v celici in s tem kompenzira zmanjšanje hitrosti rasti. Da bi zagotovili ustrezne ravni SpoTH, in s tem zmanjšali občutljivost količine prostih ribosomov na izražanje heterolognih genov, so zasnovali štiri CL sisteme z različno močnimi RBS za SpoTH – RBS1, RBS2, RBS3 in RBS4, ki si v tem zaporedju sledijo tudi po moči. Moč RBS je odvisna od zaporedij pred in za njim, zato so okarakterizirali RBS knjižnico za SpoTH, ki je vsebovala tudi zapis za RFP. Pri tem pa so zmanjšali moč RBS za RFP tako, da je količina ribosomov, ki jih le-ta sekvestira, zanemarljiva [1].

Pri uporabi fruktoze kot primarnega vira ogljika, se je hitrost rasti OL sistema po aktivaciji ekspresije RFP zmanjšala za 25%, medtem ko je za sistem CL z uporabo RBS2 le-ta ostala konstantna. Pri uporabi glicerola se je hitrost rasti za sistem OL zmanjša za 45% ob aktivaciji ekspresije RFP, medtem ko se je za sistem CL z uporabo RBS1 le-ta zmanjšala za 10%. Pri laktozi pa se je hitrost rasti zmanjšala za 55% pri uporabi OL, medtem ko je za sistem CL z RBS2 ostala skoraj enaka [1].

Za kontrolo pa so uporabili konstrukt, ki je namesto zapisa za SpoTH vseboval zapis za nefunckionalni heterologni protein CJB (cjBlue H197S). S tem so želeli potrditi, da je sistem CL boljši od sistema OL zaradi izražanja SpoTH in ne zaradi konfiguracije mRNA RFP. To predpostavko so tudi potrdili, saj je izražanje RFP s kontrolnim konstruktom povzročilo še večje zmanjšanje rasti celic, kot z OL sistemom [1].
===Zasnova sistema za uporabo v običajnih bakterijskih sevih===
Z namenom razširitve uporabe sistema za nadzor kontrole hitrosti rasti na običajne bakterijske seve, so v osnovni konstrukt vključili inducibilno ekspresijsko kaseto RelA+ gena (plazmid P_IFFL_RelA_2). RelA+ različica vsebuje le 455 N-končnih aminokislinskih ostankov RelA divjega tipa, in ima konstitutivno ppGpp sintezno aktivnost. Zapis za RelA+ so postavili pod inducibilni promotor Psal, pri čemer se transkripcija gena aktivira v prisotnosti salicilata in produkta regulatornega gena ''nahR'', ki se konstitutivno izraža. Gen za SpoTH pa so postavili pod inducibilni promotor Ptet [1].

Po pričakovanjih so povečane ravni RelA+ proteina povzročile nižjo hitrost rasti sevov ''E.coli'' MG1655, TOP10 in NEB. Pri nivoju ekspresije RelA+, ki zniža hitrost rasti za polovico, pa aktivacija transkripcije gena za SpoTH povzroči povečanje hitrosti rasti na isti nivo, kot če se RelA+ ne bi izražal. Iz tega so sklepali, da aktivacija transkripcije gena SpoTH omogoča povečanje hitrosti rasti tudi v običajnih laboratorijskih sevih [1].

Za ocenitev zmožnosti CL sistema, da ohrani konstantno rast celic po aktivaciji ekspresije GOI, so okarakterizirali tri sisteme OL z različnimi nominalnimi hitrostmi rasti, ki so jih pripravili s transformacijo sevov ''E.coli'' CF944, CF945 in CF946 s plazmidom P_OL. Za primerjavo pa so uporabili še tri CL sisteme, ki so jih pripravili s transformacijo identičnih sevov s plazmidom P_IFFL_RelA_2. Nominalno stopnjo rasti pa so prilagodili ustreznemu OL sistemu z indukcijo ekspresije RelA+. Ob aktivaciji transkripcije RFP se je hitrost rasti pri OL sistemih znižala za 20%, 55% in 40%, pri CL sistemih pa le za 5%, 7% oziroma 15%. Nadaljnja optimizacija RBS pa bi lahko omogočila, da do padca v stopnji rasti sploh ne bi prišlo. Ekspresija RelA+ torej določa nominalno stopnjo rasti, aktivacija ekspresije SpoTH skupaj z GOI pa omogoča, da se le-ta ohrani [1].
===Trajno izražanje GOI v kokulturi===
Gensko spremenjene bakterije običajno uporabljamo v okoljih, kjer so že prisotni drugi mikrobi. Če aktivacija transkripcije GOI povzroči defekte v hitrosti rasti, potem lahko hitreje rastoči organizmi prevladajo nad to populacijo, zaradi česar pride do izgube ekspresije GOI [1].

V ta namen so testirali uporabnost sistema za kontrolo rasti celic v kokulturi. Primerjali so uspešnost OL sistema (sev CF945, plazmid P_OL) in CL sistema (sev CF945, plazmid P_IFFL_x), ki sta inducibilno izražala RFP, ko so ju gojili v kokulturi s konkurenčnim sevom (sev TOP10), ki je konstitutivno izražal BFP (plazmid P_BFP). V izolaciji so bile posamezne hitrosti rasti identične, sčasoma pa je prišlo do padca hitrosti rasti seva transformiranega z P_OL za 50%, medtem ko je sev transformiran s plazmidom P_IFFL_x ohranil začetno stopnjo rasti. Da bi potrdili, da dinamična sprememba na ravni populacije ni posledica dinamične spremembe v stopnji izražanja BFP in RFP, so spremljali intenziteto fluorescence BFP in RFP, in ugotovili, da je le-ta konstantna. Intenziteto fluorescence so normirali na OD600. Iz tega so torej sklepali, da sistem CL prepreči enakomerno zmanjševanje hitrosti rasti celic po aktivaciji ekspresije GOI ter da omogoča trajno izražanje GOI na ravni populacije [1].

==Zaključek==
Sistem za kontrolo hitrosti rasti ima potencial za uporabo pri ekspresiji kateregakoli GOI z uporabo ustreznega RBS za SpoTH na podlagi bremena, ki ga predstavlja GOI. Zasnova je prilagodljiva in modularna. Ekspresija SpoTH lahko povzroči zmanjšanje sinteze drugih proteinov, zato avtorji predlagajo, da se njihov sistem uporablja v kombinaciji s sistemom, ki zagotavlja konstantno stopnjo sinteze proteinov [1].

Kot so uspeli dokazati, bo to orodje ključno za gojenje bakterij v kokulturi. Dobro lastnost sistema pa predstavlja tudi dejstvo, da so ppGpp in homologi RelA/SpoT univerzalno ohranjeni v bakterijah in se pojavljajo tudi pri evkariontih, vključno s človekom, zato se lahko ta sistem uporablja tudi v drugih organizmih [1].
==Literatura==
[1] C. Barajas, HH. Huang,J. Gibson, L. Sansoval, D. Del Vecchio.: Feedforward growth rate control mitigates gene activation burden. Nat Commun, 2022, 13, 7054.

[2] Z. Dalebroux, M. Swanson: ppGpp: magic beyond RNA polymerase. Nat Rev Microbiol 2012, 10, 203–212.

Seminarji SB 2022/23

2023-05-14T16:07:42Z

Nezaribnikar:

V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br>
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_tumor_ciljajočih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_dušikov(II)_oksid Priprava tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljeni_ribocim%2C_ki_signale_nativnih_RNA_pove%C5%BEe_z_ortogonalnimi_proteinskimi_izhodnimi_signali Razcepljeni ribocim, ki signale nativnih RNA poveže z ortogonalnimi proteinskimi izhodnimi signali] (Ajda Beltram)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_nadzor_%C5%A1tevila_plazmidov_v_celici_%28Tulip%29 Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)] (Gregor Strniša)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Skupnostna_znanost_je_na%C4%8Drtovala_ribosome_s_koristnimi_fenotipi Skupnostna znanost je načrtovala ribosome s koristnimi fenotipi] (Tanja Gošnjak)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pristop_sintezne_biologije_za_načrtovanje_kandidata_za_cepivo_proti_delta_različici_SARSCoV2_je_razkril_prekinitev_favoriziranega_para_kodonov_kot_boljšo_strategijo_pred_uporabo_redkih_kodonov Pristop sintezne biologije za načrtovanje kandidata za cepivo proti delta različici SARS-CoV-2 je razkril prekinitev favoriziranega para kodonov kot boljšo strategijo pred uporabo redkih kodonov] (Stefanija Ivanova)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Dvosmerni_hibridni_eritritol_–_inducibilni_promotor_za_sintezno_biologijo_v_Yarrowia_lipolytica Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v ''Yarrowia lipolytica''] (Maša Andoljšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Utišanje_izražanja_genov_s_strukturo_definirano_zankasto_strukturo_male_nekodirajoče_RNA_s_programiranimi_regulatornimi_aktivnostmi Utišanje izražanja genov s strukturno definirano zankasto strukturo male nekodirajoče RNA s programiranimi regulatornimi aktivnostmi] (Nika Bedrač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izbolj%C5%A1anje_evolucijske_stabilnosti_obremenjujo%C4%8Dih_in_toksi%C4%8Dnih_funkcij_v_E.coli_z_diferenciacijskim_genetskim_vezjem_posredovanim_z_integrazo Izboljšanje evolucijske stabilnosti obremenjujočih in toksičnih funkcij v E.coli z diferenciacijskim genetskim vezjem posredovanim z integrazo] (Nika Banovšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_sintetična_mala_RNA%2C_ki_promovira_prekomerno_izražanje_proteinov_v_brezceličnem_sistemu Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brez-celičnem sistemu] (Ana Godeša)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_kontrolo_hitrosti_rasti_celic%2C_ki_zmanj%C5%A1uje_breme_aktivacije_genov Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov] (Neža Ribnikar)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NETLANTIS NETLANTIS] (Maša Gabrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BINANOX BINANOX] (Vivian Nemanič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CoBiota CoBiota] (Petra Sintič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sporadicate Sporadicate] (Gašper Možina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FISHERLY FISHERLY] (Lucija Pišek)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].

Seminarji SB 2022/23

2023-05-14T16:05:27Z

Nezaribnikar:

V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) <br>
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/IN_VIVO_SAMOSESTAVLJENA_siRNA_KOT_NA%C4%8CIN_KOMBINIRANEGA_ZDRAVLJENJA_ULCEROZNEGA_KOLITISA#ZAKLJU.C4.8CEK In vivo samosestavljena siRNA kot način kombiniranega zdravljenja ulceroznega kolitisa] (Tjaša Kos)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_kompleta_orodij_za_zaznavanje_kvoruma_pri_cianobakterijah:_Razvoj_medceli%C4%8Dne_koordinacije_v_me%C5%A1anih_avtotrofno-heterotrofnih_skupnostih Priprava kompleta orodij za zaznavanje kvoruma pri cianobakterijah: Razvoj medcelične koordinacije v mešanih avtotrofno-heterotrofnih skupnostih] (Nuša Tkalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razvoj_temperaturno_inducibilnega_transkripcijskega_reostata_pri_Neurospori_crassi Razvoj temperaturno inducibilnega transkripcijskega reostata pri ''Neurospori crassi''] (Luka Šegota)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_tumor_ciljajočih_bakterij_s_stikalnim_sistemom,_ki_se_odziva_na_dušikov(II)_oksid Priprava tumor ciljajočih bakterij s stikalnim sistemom, ki se odziva na dušikov(II) oksid] (Ana Kodra)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Razcepljeni_ribocim%2C_ki_signale_nativnih_RNA_pove%C5%BEe_z_ortogonalnimi_proteinskimi_izhodnimi_signali Razcepljeni ribocim, ki signale nativnih RNA poveže z ortogonalnimi proteinskimi izhodnimi signali] (Ajda Beltram)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_nadzor_%C5%A1tevila_plazmidov_v_celici_%28Tulip%29 Sistem za nadzor števila plazmidov v celici (Tulip)] (Gregor Strniša)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Skupnostna_znanost_je_na%C4%8Drtovala_ribosome_s_koristnimi_fenotipi Skupnostna znanost je načrtovala ribosome s koristnimi fenotipi] (Tanja Gošnjak)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Pristop_sintezne_biologije_za_načrtovanje_kandidata_za_cepivo_proti_delta_različici_SARSCoV2_je_razkril_prekinitev_favoriziranega_para_kodonov_kot_boljšo_strategijo_pred_uporabo_redkih_kodonov Pristop sintezne biologije za načrtovanje kandidata za cepivo proti delta različici SARS-CoV-2 je razkril prekinitev favoriziranega para kodonov kot boljšo strategijo pred uporabo redkih kodonov] (Stefanija Ivanova)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Dvosmerni_hibridni_eritritol_–_inducibilni_promotor_za_sintezno_biologijo_v_Yarrowia_lipolytica Dvosmerni hibridni eritritol – inducibilni promotor za sintezno biologijo v ''Yarrowia lipolytica''] (Maša Andoljšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Utišanje_izražanja_genov_s_strukturo_definirano_zankasto_strukturo_male_nekodirajoče_RNA_s_programiranimi_regulatornimi_aktivnostmi Utišanje izražanja genov s strukturno definirano zankasto strukturo male nekodirajoče RNA s programiranimi regulatornimi aktivnostmi] (Nika Bedrač)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Izbolj%C5%A1anje_evolucijske_stabilnosti_obremenjujo%C4%8Dih_in_toksi%C4%8Dnih_funkcij_v_E.coli_z_diferenciacijskim_genetskim_vezjem_posredovanim_z_integrazo Izboljšanje evolucijske stabilnosti obremenjujočih in toksičnih funkcij v E.coli z diferenciacijskim genetskim vezjem posredovanim z integrazo] (Nika Banovšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nova_sintetična_mala_RNA%2C_ki_promovira_prekomerno_izražanje_proteinov_v_brezceličnem_sistemu Nova sintetična mala RNA, ki promovira prekomerno izražanje proteinov v brez-celičnem sistemu] (Ana Godeša)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_za_kontrolo_hitrosti_rasti_celic%2C_ki_zmanj%C5%A1uje_breme_aktivacije_genov] (Neža Ribnikar)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FIAT_LUX FIAT LUX] (Neža Lanišek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/NETLANTIS NETLANTIS] (Maša Gabrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BINANOX BINANOX] (Vivian Nemanič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CoBiota CoBiota] (Petra Sintič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sporadicate Sporadicate] (Gašper Možina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/FISHERLY FISHERLY] (Lucija Pišek)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.

Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.

Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].

User:Nezaribnikar

2023-05-14T16:03:02Z

Nezaribnikar: User:Nezaribnikar moved to Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov

#REDIRECT [[Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov]]

Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov

2023-05-14T16:03:02Z

Nezaribnikar: User:Nezaribnikar moved to Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov

Povzeto po članku [https://www.nature.com/articles/s41467-022-34647-1 ''C. Barajas, HH. Huang,J. Gibson, et al.: Feedforward growth rate control mitigates gene activation burden. Nat Commun, 2022, 13, 7054.'']

==Uvod==
Prekomerno izražanje heterolognih genov (angl. Gene of interest, GOI) izčrpa celične vire, še posebej ribosome. To breme zmanjša hitrost rasti celic in povzroči spremembe s slabo predvidljivimi posledicami, ki običajno ovirajo predvideno delovanje celice. Za ublažitev posledic izražanja GOI, so avtorji članka razvili sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki omogoča aktiviranje GOI do poljubne ravni, pri čemer rast celic ostane konstantna. To pa so dosegli s povečanjem hidrolize ppGpp [1].

Alarmona gvanozin tetrafosfat (ppGpp) in gvanozin pentafosfat (pppGpp) (imenujemo kar ppGpp) v celici koordinirata odziv na stres z obsežnim preklopom profila transkripcije. Pri tem pride do zaustavitve sinteze DNA, stabilnih RNA in ribosomov, začne pa se proizvodnja dejavnikov, ki so ključni za odpornost na stres, glikolizo in sintezo aminokislin. ppGpp se neposredno veže na RNA polimerazo in s tem uravnava izbiro promotorja. Preko raznih mehanizmov pa vpliva tudi na stabilnost, oligomerizacijo in aktivnost mnogih proteinov in regulatornih RNA [1,2].

Celični bazen ppGpp nadzirata dva razreda encimov. RelA so monofunkcionalne sintaze, ki katalizirajo sintezo pppGpp iz GTP in ATP. Proteini SpoT pa so odgovorni za sintezo ppGpp in pppGpp in njuno hidrolizo do GDP in pirofosfata (PPi) oziroma GTP in PPi [2].
==Rezultati==
Avtorji članka so za povečanje stopnje rasti eksogeno izrazili različico SpoT proteina, ki vsebuje prvih 203 aminokislinskih ostankov le-tega in ima zgolj hidrolazno aktivnost (SpoTH). Ta encim torej povzroči zmanjšanje koncentracije ppGpp, zaradi česar so pričakovali, da bo prišlo do povečanja hitrosti rasti bakterij. Izražanje SpoTH pa obremeni celico s sekvestacijo celičnih virov, npr. ribosomov. Ko torej SpoTH odstrani zadostne količine ppGpp, samo breme izražanja SpoTH začne prevladovati nad povečanjem hitrosti rasti, kar se kaže kot nemonoton odziv med ekspresijo SpoTH in hitrostjo rasti [1].
===Izbira seva z željenim profilom aktuatorja===
Konstrukt, ki je vseboval zapis za ''tetR'' pod konstitutivnim promotorjem in zapis za SpoTH pod kontrolo inducibilnega promotorja PtetR so testirali v različnih sevih ''E.coli'' in sicer v sevu CF944 (spoT202 alel), CF945 (spoT203 alel) in CF946 (spoT204 alel). Bazalni nivoji ppGpp so najnižji pri sevu CF944 in najvišji pri sevu CF946. Poleg teh sevov pa so konstrukt uporabili tudi v kontrolnem sevu divjega tipa MG1655. Genetsko vezje, ki so ga uporabili, jim je omogočilo povečano izražanje SpoTH s povečanjem koncentracije induktorja anhidrotetraciklina (aTc) [1].

Pri sevih CF945 in CF946 je aktivacija gena SpoTH povečala stopnjo rasti za 80% oziroma 60%, pri MG1655 in CF944, ki pa imata v osnovi nižjo bazalno raven ppGpp, pa se hitrost rasti ni spremenila. Za sev CF945 so določili relativno največje povečanje hitrosti rasti, zato so raziskave nadaljevali na tem sevu [1].
===Uporaba različnih virov ogljika===
Osnovno raven ppGpp lahko uravnavamo tudi prek sestave rastnega medija, natančneje prek vira ogljika. Zato so preizkusili tudi štiri najpogosteje uporabljene vire ogljika: glukozo, glicerol, fruktozo in laktozo. Opazili so, da se pri vseh virih ogljika hitrost rasti povečuje z izražanjem SpoTH. Nominalna hitrost rasti celic je najnižja pri laktozi, nato glicerolu, fruktozi in glukozi, in se lahko poveča za 75%, 85%, 50% in 45%. Ti podatki kažejo, da obstaja kompromis med nominalno stopnjo rasti in relativnim povečanjem hitrosti, ki ga je mogoče doseči z izražanjem SpoTH. Stopnja, do katere je mogoče povečati hitrost rasti, je namreč neposredno povezana s količino ppGpp, ki je na voljo za hidrolizo [1].
===Zasnova sistema za uporabo v sevu ''E.coli'' CF945===
Nato so zasnovali sistem za kontrolo rasti, ki je vseboval zapis za SpoTH in rdeči fluorescenčni protein (RFP) – GOI. Poimenovali so ga zaprta zanka (CL, plazmid P_IFFL_x), ker v nasprotju z odprto zanko (OL, plazmid P_OL) vsebuje zapis za SpoTH. Za zasnovo obeh sistemov so uporabili zaporedje ''luxR'', ki se konstitutivno izraža, in inducibilni promotor Plux, ki se aktivira ob dodatku N-acetilhomoserinlaktona (AHL) pri čemer pride do transkripcije RFP. Izražanje RFP sekvestira celične vire, vključno z ribosomi, kar ima negativen vpliv na rast celic. V sistemu CL pa dodatek AHL poveča tudi izražanje SpoTH, kar pa poveča raven ribosomov v celici in s tem kompenzira zmanjšanje hitrosti rasti. Da bi zagotovili ustrezne ravni SpoTH, in s tem zmanjšali občutljivost količine prostih ribosomov na izražanje heterolognih genov, so zasnovali štiri CL sisteme z različno močnimi RBS za SpoTH – RBS1, RBS2, RBS3 in RBS4, ki si v tem zaporedju sledijo tudi po moči. Moč RBS je odvisna od zaporedij pred in za njim, zato so okarakterizirali RBS knjižnico za SpoTH, ki je vsebovala tudi zapis za RFP. Pri tem pa so zmanjšali moč RBS za RFP tako, da je količina ribosomov, ki jih le-ta sekvestira, zanemarljiva [1].

Pri uporabi fruktoze kot primarnega vira ogljika, se je hitrost rasti OL sistema po aktivaciji ekspresije RFP zmanjšala za 25%, medtem ko je za sistem CL z uporabo RBS2 le-ta ostala konstantna. Pri uporabi glicerola se je hitrost rasti za sistem OL zmanjša za 45% ob aktivaciji ekspresije RFP, medtem ko se je za sistem CL z uporabo RBS1 le-ta zmanjšala za 10%. Pri laktozi pa se je hitrost rasti zmanjšala za 55% pri uporabi OL, medtem ko je za sistem CL z RBS2 ostala skoraj enaka [1].

Za kontrolo pa so uporabili konstrukt, ki je namesto zapisa za SpoTH vseboval zapis za nefunckionalni heterologni protein CJB (cjBlue H197S). S tem so želeli potrditi, da je sistem CL boljši od sistema OL zaradi izražanja SpoTH in ne zaradi konfiguracije mRNA RFP. To predpostavko so tudi potrdili, saj je izražanje RFP s kontrolnim konstruktom povzročilo še večje zmanjšanje rasti celic, kot z OL sistemom [1].
===Zasnova sistema za uporabo v običajnih bakterijskih sevih===
Z namenom razširitve uporabe sistema za nadzor kontrole hitrosti rasti na običajne bakterijske seve, so v osnovni konstrukt vključili inducibilno ekspresijsko kaseto RelA+ gena (plazmid P_IFFL_RelA_2). RelA+ različica vsebuje le 455 N-končnih aminokislinskih ostankov RelA divjega tipa, in ima konstitutivno ppGpp sintezno aktivnost. Zapis za RelA+ so postavili pod inducibilni promotor Psal, pri čemer se transkripcija gena aktivira v prisotnosti salicilata in produkta regulatornega gena ''nahR'', ki se konstitutivno izraža. Gen za SpoTH pa so postavili pod inducibilni promotor Ptet [1].

Po pričakovanjih so povečane ravni RelA+ proteina povzročile nižjo hitrost rasti sevov ''E.coli'' MG1655, TOP10 in NEB. Pri nivoju ekspresije RelA+, ki zniža hitrost rasti za polovico, pa aktivacija transkripcije gena za SpoTH povzroči povečanje hitrosti rasti na isti nivo, kot če se RelA+ ne bi izražal. Iz tega so sklepali, da aktivacija transkripcije gena SpoTH omogoča povečanje hitrosti rasti tudi v običajnih laboratorijskih sevih [1].

Za ocenitev zmožnosti CL sistema, da ohrani konstantno rast celic po aktivaciji ekspresije GOI, so okarakterizirali tri sisteme OL z različnimi nominalnimi hitrostmi rasti, ki so jih pripravili s transformacijo sevov ''E.coli'' CF944, CF945 in CF946 s plazmidom P_OL. Za primerjavo pa so uporabili še tri CL sisteme, ki so jih pripravili s transformacijo identičnih sevov s plazmidom P_IFFL_RelA_2. Nominalno stopnjo rasti pa so prilagodili ustreznemu OL sistemu z indukcijo ekspresije RelA+. Ob aktivaciji transkripcije RFP se je hitrost rasti pri OL sistemih znižala za 20%, 55% in 40%, pri CL sistemih pa le za 5%, 7% oziroma 15%. Nadaljnja optimizacija RBS pa bi lahko omogočila, da do padca v stopnji rasti sploh ne bi prišlo. Ekspresija RelA+ torej določa nominalno stopnjo rasti, aktivacija ekspresije SpoTH skupaj z GOI pa omogoča, da se le-ta ohrani [1].
===Trajno izražanje GOI v kokulturi===
Gensko spremenjene bakterije običajno uporabljamo v okoljih, kjer so že prisotni drugi mikrobi. Če aktivacija transkripcije GOI povzroči defekte v hitrosti rasti, potem lahko hitreje rastoči organizmi prevladajo nad to populacijo, zaradi česar pride do izgube ekspresije GOI [1].

V ta namen so testirali uporabnost sistema za kontrolo rasti celic v kokulturi. Primerjali so uspešnost OL sistema (sev CF945, plazmid P_OL) in CL sistema (sev CF945, plazmid P_IFFL_x), ki sta inducibilno izražala RFP, ko so ju gojili v kokulturi s konkurenčnim sevom (sev TOP10), ki je konstitutivno izražal BFP (plazmid P_BFP). V izolaciji so bile posamezne hitrosti rasti identične, sčasoma pa je prišlo do padca hitrosti rasti seva transformiranega z P_OL za 50%, medtem ko je sev transformiran s plazmidom P_IFFL_x ohranil začetno stopnjo rasti. Da bi potrdili, da dinamična sprememba na ravni populacije ni posledica dinamične spremembe v stopnji izražanja BFP in RFP, so spremljali intenziteto fluorescence BFP in RFP, in ugotovili, da je le-ta konstantna. Intenziteto fluorescence so normirali na OD600. Iz tega so torej sklepali, da sistem CL prepreči enakomerno zmanjševanje hitrosti rasti celic po aktivaciji ekspresije GOI ter da omogoča trajno izražanje GOI na ravni populacije [1].

==Zaključek==
Sistem za kontrolo hitrosti rasti ima potencial za uporabo pri ekspresiji kateregakoli GOI z uporabo ustreznega RBS za SpoTH na podlagi bremena, ki ga predstavlja GOI. Zasnova je prilagodljiva in modularna. Ekspresija SpoTH lahko povzroči zmanjšanje sinteze drugih proteinov, zato avtorji predlagajo, da se njihov sistem uporablja v kombinaciji s sistemom, ki zagotavlja konstantno stopnjo sinteze proteinov [1].

Kot so uspeli dokazati, bo to orodje ključno za gojenje bakterij v kokulturi. Dobro lastnost sistema pa predstavlja tudi dejstvo, da so ppGpp in homologi RelA/SpoT univerzalno ohranjeni v bakterijah in se pojavljajo tudi pri evkariontih, vključno s človekom, zato se lahko ta sistem uporablja tudi v drugih organizmih [1].
==Literatura==
[1] C. Barajas, HH. Huang,J. Gibson, et al.: Feedforward growth rate control mitigates gene activation burden. Nat Commun, 2022, 13, 7054.

[2] Z. Dalebroux, M. Swanson: ppGpp: magic beyond RNA polymerase. Nat Rev Microbiol 2012, 10, 203–212.

Sistem za kontrolo hitrosti rasti celic, ki zmanjšuje breme aktivacije genov

2023-05-14T16:02:29Z

Nezaribnikar: New page: Povzeto po članku [https://www.nature.com/articles/s41467-022-34647-1 ''C. Barajas, HH. Huang,J. Gibson, et al.: Feedforward growth rate control mitigates gene activation burden. Nat Comm...