Wiki FKKT - User contributions [en]

Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih

2021-04-14T08:01:11Z

Nika Mikulič: /* SVETLOBNA AKTIVACIJA EKSPRESIJE GENOV S SISTEMOM PA-Dre IN VIVO */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33318209/ H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.]
==UVOD==
Precizno gensko inženirstvo, ki bi v organizmu delovalo specifično na posamezne celice, je v časovnem in prostorskem spektru težko dosegljivo. V te namene se pri sintezni biologiji uporabljajo različne mestno specifične rekombinaze, na primer tirozinske rekombinaze. Sposobne so uvajati delecije, integracije, inverzije in tudi translokacije genomske DNA in to brez pomožnih proteinov. Kljub temu, da so v preteklosti dokazali veliko uporabnost rekombinaznih sistemov v genskem inženirstvu, imajo sistemi s samo eno rekombinazo mnoge ovire, ki preprečujejo razvoj zapletenih genetskih modelov.1,2

V raziskavi, ki jo bom kratko opisala, so pripravili zelo učinkovito svetlobno inducibilno Dre rekombinazo (PA-Dre), dokazali, da uspešno regulira gene v specifičnih mišjih tkivih, razvili pa so tudi dvojni rekombinazni sistem CALID (ang. ''Cre-activated light-inducible Dre system'').1

==UPORABA SPECIFIČNIH REKOMBINAZ V SINTEZNI BIOLOGIJI==
Zaradi enostavne uporabe in velike specifičnosti se v sesalskih sistemih uporablja predvsem sistem Cre/loxP. Razvili so mnoge mutirane seve mišk, ki izražajo rekombinazo Cre pod določenimi tkivno specifičnimi promotorji. Taki sevi mišk so uporabni med drugim tudi kot modeli človeških bolezni.1,2

Novejši sistem je sistem Dre/rox, ki so ga odkrili v bakteriofagu D6. Rekombinaza Dre je homologna Cre, mesto rox pa se od mesta loxP razlikuje samo v trinajst nukleotidih od dvaintridesetih. Kljub podobnostim v veliki večini primerov ne prihaja do prečne rekombinacije med sistemoma, zato lahko z njima sestavljamo dvojne rekombinazne sisteme. Prednost Dre pred Cre je prav tako, da nima nobenih toksičnih učinkov na celice.2

V zadnjih nekaj desetletjih razvijajo inducibilne variante rekombinaznih sistemov Cre, poleg kemijsko inducibilnih tudi nekaj svetlobno inducibilnih sistemov, kot sta na primer CRY2-CIB1-PA-Cre in Magnets-PA-Cre. Sistem Magnets, ki se je v tej raziskavi izkazal kot bolj učinkovit, je od modre svetlobe odvisen dimerizacijski sistem, sestavljen iz dveh svetlobnih stikal, imenovanih pozitivni magnet (pMag) in negativni magnet (nMag). Gre za flavin vezavni fotoreceptor, izoliran iz glive. Svetlobno inducibilni sistemi imajo veliko prednosti, omogočajo večjo časovno in prostorsko specifičnost, višjo možnost nadzora in hitro penetracijo tkiva, prav tako pa svetloba za tkivo ni invazivna.1,3

==REZULTATI==
===IDENTIFIKACIJA CEPITVENEGA MESTA Dre===
Ker so vse dotedanje raziskave temeljile predvsem na cepljeni Cre rekombinazi, so na podlagi podatkov o njej sklepali na določena mesta cepitve, s katerimi bi Dre ločili na N- in C-končni del tako, da bi se jima ob ponovnem združenju povrnila rekombinazna aktivnost. Uporabili so računalniške metode in identificirali 6 takih mest. Najboljše rezultate so dobili pri treh načinih cepljenja, DreN60/DreC61, DreN150/DreC151 in DreN246/DreC247.1

===OPTIMIZACIJA PA-Dre===
Pri testiranju ''in vitro'' se je kot fuzijski partner, odgovoren za dimerizacijo, najbolje izkazal sistem Magnets in sicer v primeru, da so na N konec Dre vezali nMag in na C konec Dre pMag. Ugotovili so, da zmanjšajo ozadje z uporabo linkerja L4, ki hkrati tudi ni poslabšal možnosti rekombinacije. Da bi dodatno zmanjšali ozadje s subcelično lokalizacijo polovic Dre, so dodali jedrni lokalizacijski signal iz nukleoplazmina (NLSNLP) na C konec DreC247. Dosegli so dodatno zmanjšanje ozadja in kar 102,2-kratno povečanje luciferazne aktivnosti.1

Pri sestavljanju vektorja so želeli povezati tako optimizirana fuzijska partnerja Dre-N246-nMag (PA-DreN) in pMag-DreC247 -NLSNLP (PA-DreC). Povezali so ju na tak način, da so med oba zapisa dodali zapis za enega izmed samocepilnih peptidov 2A. Ugotovili so, da uporaba T2A, ki ima sicer manjšo avtokatalitično sposobnost od P2A, izboljša razmerje signal/šum, se je pa izkazalo, da je tako razmerje singal/šum, kot tudi učinkovitost rekombinacije boljša, če uporabimo dva ločena vektorja. Prav tako je učinkovitost rekombinacije višja kot pri celem divjem tipu rekombinaze Dre. Najbrž fuzija s sistemom Magnets povzroči nastanek konformacijske oblike z višjo aktivnostjo. Z molekulsko dinamiko so potem dokazali, da je vezava na DNA približno enako stabilna kot pri divjem tipu Dre.1

Prav tako so dokazali, da sistem razpolovljene Dre deluje tudi v fuziji z drugimi dimerizacijskimi sistemi. Preizkusili so dimerizacijski sistem, občutljiv na modro svetlobo Vivid (VVD) iz gliv, sistem za zaznavo rdeče svetlobe (PhyB-PIF3) in svetlobo valovne dolžine na meji z IR (Bphp1-Q-PAS1), pa tudi s kemičnim stikalom FKBP-FRB.1

===KARAKTERIZACIJA PA-Dre ''IN VITRO''===
Najprej so natančno določili čas osvetlitve z modro svetlobo in intenziteto odziva v celicah HEK-293T, transfeciranih s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-Rluc (luciferaza iz korale). Različno dolgo so jih izpostavili svetlobi ali jih pustili rasti v temi. Ugotovili so, da pri osvetlitvi med 4 in 32 ur luciferazna aktivnost opazno raste, nato pa doseže plato. Sistem je bil odziven na modro svetlobo intenzitete 0,25 do 4 mW/cm2, maksimum je dosegel pri 1 mW/cm2. Podobne rezultate so dobili tudi, če so uporabili drugi reporter, CMV-rox-stop-rox-zsGreen (zelen fluorescenčni protein). Sistem je dobro deloval tudi v drugih celičnih linijah iz drugih sesalskih tkiv. Da je sistem kompatibilen tudi z drugimi močnimi promotorji so sklepali, ker so pri uporabi različnih promotorjev dobili dobro razmerje singal/šum in močen odziv na obsevanje z modro svetlobo. Prav tako je Dre deloval na različnih mutiranih rox zaporedjih.1

Veliko prednost pred kemijsko inducibilnimi imajo svetlobno inducibilni sistemi v prostorskem smislu. To so dokazali tako, da so z uporabo maske osvetljevali petrijevke z rastočimi celicami, transfeciranimi s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-zsGreen. Fluorescenčni odziv so zaznali samo v osvetljenih celicah, meja med fluorescirajočimi in temnimi celicami pa je bila razmeroma ostra.1

===SVETLOBNA AKTIVACIJA EKSPRESIJE GENOV S SISTEMOM PA-Dre ''IN VIVO''===
Kot reporterski sistem so pri ''in vivo'' eksperimentih uporabili rox-stop-rox-Fluc (luciferaza iz kresničke). Skupaj s plazmidi z zapisom za PA-Dre so jih injicirali preko repne vene miši in jih tako dostavili v jetra. Miške so nato po 8 urah osvetljevali z modro svetlobo, kontrolno skupino pa so pustili v temi. Luciferazno aktivnost so merili 24 ur po injekciji. Dobili so podobne rezultate kot ''in vitro''; 30 min trajajoča osvetlitev je povzročila opazno luciferazno aktivnost, ki pa je tudi naraščala z daljšim časom obsevanja. Ugotovili so tudi, da lahko uspešno rekombinacijo dosežejo že s 30 sekundnim obsevanjem, če so v miške injicirali večje količine plazmidov.1

Primerjava rekombinacije, dosežene s PA-Dre in do tedaj uporabljanje PA-Cre, je pokazala, da ima PA-Dre bistveno izboljšano razmerje signal/šum, kar kaže na to, da je novi sistem dosti bolj strikten. Dokazali pa so tudi, da lahko sistem uspešno dostavljajo v tarčna tkiva (jetra, možgane) preko z adenovirusi povezanih virusov (AAV).1

===SISTEM CALID===
S svetlobo inducirani rekombinazi Cre in Dre sta potencialno zelo uporabni pri prostorsko in časovno kontroliranem genskem inženirstvu, a imata nekaj težav pri specifični aktivaciji glede na tip celice. Da bi naredili celično specifični sistem, so razvili dvojni rekombinazni sistem CALID. Pripravljeni konstrukti so vsebovali tkivno specifična promotorja, zapis za Cre in z mesti loxP obkrožen invertiran zapis za PA-Dre. Pri genskem inženirstvu bi tako lahko dodali samo še gen, ki nas zanima, zapisan navzdol od stop kodona, ustrezno obkroženega z dvema rox mestoma. V celicah, kjer je prisotna rekombinaza Cre, bi ta popravila orientacijo rekombinaze PA-Dre, ta pa bi šele po osvetljevanju s svetlobo izrezala stop kodon in povzročila izražanje gena. S tem bi dosežegli elegantnejšo trojno kontrolo rekombinacije.1

AVV9 z zapisom za sistem CALID so skupaj z rekombinazo Cre injicirali v hipokampus odrasle miške R26-RSR-tdTomato. Po enem tednu so jih osvetljevali z optičnimi vlakni in opazili rdečo fluorescenco samo v nevronih, ki so vsebovali Cre in so bili obsevani. Primerjali so intenziteto fluorescence v odvisnosti od časa osvetlitve med 1s in 5 min. Ugotovili so pozitivno korelacijo med trajanjem osvetlitve in obsegom fluorescence, se pravi številom označenih nevronov. Obstajajo pa številni sevi mišk s tkivno specifičnim izražanjem rekombinaze Cre, v katerih bi bil sistem CALID uporaben. Raziskave so ponovili tudi v takih miškah, rezultati so bili primerljivi.1

==ZAKLJUČEK==
V raziskavi so opisali pripravo in optimizacijo sistema svetlobno inducibilne rekombinaze Dre. Ob prisotnosti modre svetlobe fuziran sistem Magnets poskrbi za dimerizacijo rekombinaze Dre, ki šele pod temi pogoji dobi povrnjeno aktivnost. Dokazali so delovanje sistema ''in vitro'' in tudi ''in vivo'' v mišjih modelih. Za lažjo časovno in prostorsko kontrolo rekombinacije so sestavili tudi od Cre odvisen svetlobno inducibilni Dre sistem, imenovan CALID. Z njim so dosegli specifično označevanje nevronov v mišjih možganih v željenem obsegu. Predvidevajo, da bodo s takim sistemom omogočili bolj detajlne raziskave v širšem področju bioloških znanostih.1
==VIRI==
1. H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.

2. M. Karimova, O. Baker, A. Camgoz, R. Naumann, F. Buchholz, K. Anastassiadis: A single reporter mouse line for Vika, Flp, Dre, and Cre-recombination. Sci. Rep. 2018, 8(1), str. 1–12.

3. F. Kawano, R. Okazaki, M. Yazawa, M. Sato: A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat. Chem. Biol. 2016, 12(12), str. 1059–1064.

Seminarji SB 2020/21

2021-04-13T21:24:21Z

Nika Mikulič:

V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline]
(Liza Ulčakar) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv]
(Špela Supej) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 
4 [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) 

----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Seminarji SB 2020/21

2021-04-13T21:24:00Z

Nika Mikulič:

V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline]
(Liza Ulčakar) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič)
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv]
(Špela Supej) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 
4 [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) 
5 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) 

----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih

2021-04-11T20:24:42Z

Nika Mikulič: /* SVETLOBNA AKTIVACIJA EKSPRESIJE GENOV S SISTEMOM PA-Dre IN VIVO */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33318209/ H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.]
==UVOD==
Precizno gensko inženirstvo, ki bi v organizmu delovalo specifično na posamezne celice, je v časovnem in prostorskem spektru težko dosegljivo. V te namene se pri sintezni biologiji uporabljajo različne mestno specifične rekombinaze, na primer tirozinske rekombinaze. Sposobne so uvajati delecije, integracije, inverzije in tudi translokacije genomske DNA in to brez pomožnih proteinov. Kljub temu, da so v preteklosti dokazali veliko uporabnost rekombinaznih sistemov v genskem inženirstvu, imajo sistemi s samo eno rekombinazo mnoge ovire, ki preprečujejo razvoj zapletenih genetskih modelov.1,2

V raziskavi, ki jo bom kratko opisala, so pripravili zelo učinkovito svetlobno inducibilno Dre rekombinazo (PA-Dre), dokazali, da uspešno regulira gene v specifičnih mišjih tkivih, razvili pa so tudi dvojni rekombinazni sistem CALID (ang. ''Cre-activated light-inducible Dre system'').1

==UPORABA SPECIFIČNIH REKOMBINAZ V SINTEZNI BIOLOGIJI==
Zaradi enostavne uporabe in velike specifičnosti se v sesalskih sistemih uporablja predvsem sistem Cre/loxP. Razvili so mnoge mutirane seve mišk, ki izražajo rekombinazo Cre pod določenimi tkivno specifičnimi promotorji. Taki sevi mišk so uporabni med drugim tudi kot modeli človeških bolezni.1,2

Novejši sistem je sistem Dre/rox, ki so ga odkrili v bakteriofagu D6. Rekombinaza Dre je homologna Cre, mesto rox pa se od mesta loxP razlikuje samo v trinajst nukleotidih od dvaintridesetih. Kljub podobnostim v veliki večini primerov ne prihaja do prečne rekombinacije med sistemoma, zato lahko z njima sestavljamo dvojne rekombinazne sisteme. Prednost Dre pred Cre je prav tako, da nima nobenih toksičnih učinkov na celice.2

V zadnjih nekaj desetletjih razvijajo inducibilne variante rekombinaznih sistemov Cre, poleg kemijsko inducibilnih tudi nekaj svetlobno inducibilnih sistemov, kot sta na primer CRY2-CIB1-PA-Cre in Magnets-PA-Cre. Sistem Magnets, ki se je v tej raziskavi izkazal kot bolj učinkovit, je od modre svetlobe odvisen dimerizacijski sistem, sestavljen iz dveh svetlobnih stikal, imenovanih pozitivni magnet (pMag) in negativni magnet (nMag). Gre za flavin vezavni fotoreceptor, izoliran iz glive. Svetlobno inducibilni sistemi imajo veliko prednosti, omogočajo večjo časovno in prostorsko specifičnost, višjo možnost nadzora in hitro penetracijo tkiva, prav tako pa svetloba za tkivo ni invazivna.1,3

==REZULTATI==
===IDENTIFIKACIJA CEPITVENEGA MESTA Dre===
Ker so vse dotedanje raziskave temeljile predvsem na cepljeni Cre rekombinazi, so na podlagi podatkov o njej sklepali na določena mesta cepitve, s katerimi bi Dre ločili na N- in C-končni del tako, da bi se jima ob ponovnem združenju povrnila rekombinazna aktivnost. Uporabili so računalniške metode in identificirali 6 takih mest. Najboljše rezultate so dobili pri treh načinih cepljenja, DreN60/DreC61, DreN150/DreC151 in DreN246/DreC247.1

===OPTIMIZACIJA PA-Dre===
Pri testiranju ''in vitro'' se je kot fuzijski partner, odgovoren za dimerizacijo, najbolje izkazal sistem Magnets in sicer v primeru, da so na N konec Dre vezali nMag in na C konec Dre pMag. Ugotovili so, da zmanjšajo ozadje z uporabo linkerja L4, ki hkrati tudi ni poslabšal možnosti rekombinacije. Da bi dodatno zmanjšali ozadje s subcelično lokalizacijo polovic Dre, so dodali jedrni lokalizacijski signal iz nukleoplazmina (NLSNLP) na C konec DreC247. Dosegli so dodatno zmanjšanje ozadja in kar 102,2-kratno povečanje luciferazne aktivnosti.1

Pri sestavljanju vektorja so želeli povezati tako optimizirana fuzijska partnerja Dre-N246-nMag (PA-DreN) in pMag-DreC247 -NLSNLP (PA-DreC). Povezali so ju na tak način, da so med oba zapisa dodali zapis za enega izmed samocepilnih peptidov 2A. Ugotovili so, da uporaba T2A, ki ima sicer manjšo avtokatalitično sposobnost od P2A, izboljša razmerje signal/šum, se je pa izkazalo, da je tako razmerje singal/šum, kot tudi učinkovitost rekombinacije boljša, če uporabimo dva ločena vektorja. Prav tako je učinkovitost rekombinacije višja kot pri celem divjem tipu rekombinaze Dre. Najbrž fuzija s sistemom Magnets povzroči nastanek konformacijske oblike z višjo aktivnostjo. Z molekulsko dinamiko so potem dokazali, da je vezava na DNA približno enako stabilna kot pri divjem tipu Dre.1

Prav tako so dokazali, da sistem razpolovljene Dre deluje tudi v fuziji z drugimi dimerizacijskimi sistemi. Preizkusili so dimerizacijski sistem, občutljiv na modro svetlobo Vivid (VVD) iz gliv, sistem za zaznavo rdeče svetlobe (PhyB-PIF3) in svetlobo valovne dolžine na meji z IR (Bphp1-Q-PAS1), pa tudi s kemičnim stikalom FKBP-FRB.1

===KARAKTERIZACIJA PA-Dre ''IN VITRO''===
Najprej so natančno določili čas osvetlitve z modro svetlobo in intenziteto odziva v celicah HEK-293T, transfeciranih s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-Rluc (luciferaza iz korale). Različno dolgo so jih izpostavili svetlobi ali jih pustili rasti v temi. Ugotovili so, da pri osvetlitvi med 4 in 32 ur luciferazna aktivnost opazno raste, nato pa doseže plato. Sistem je bil odziven na modro svetlobo intenzitete 0,25 do 4 mW/cm2, maksimum je dosegel pri 1 mW/cm2. Podobne rezultate so dobili tudi, če so uporabili drugi reporter, CMV-rox-stop-rox-zsGreen (zelen fluorescenčni protein). Sistem je dobro deloval tudi v drugih celičnih linijah iz drugih sesalskih tkiv. Da je sistem kompatibilen tudi z drugimi močnimi promotorji so sklepali, ker so pri uporabi različnih promotorjev dobili dobro razmerje singal/šum in močen odziv na obsevanje z modro svetlobo. Prav tako je Dre deloval na različnih mutiranih rox zaporedjih.1

Veliko prednost pred kemijsko inducibilnimi imajo svetlobno inducibilni sistemi v prostorskem smislu. To so dokazali tako, da so z uporabo maske osvetljevali petrijevke z rastočimi celicami, transfeciranimi s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-zsGreen. Fluorescenčni odziv so zaznali samo v osvetljenih celicah, meja med fluorescirajočimi in temnimi celicami pa je bila razmeroma ostra.1

===SVETLOBNA AKTIVACIJA EKSPRESIJE GENOV S SISTEMOM PA-Dre ''IN VIVO''===
Kot reporterski sistem so pri ''in vivo'' eksperimentih uporabili rox-stop-rox-Fluc (luciferaza iz kresničke). Skupaj s plazmidi z zapisom za PA-Dre so jih injicirali preko repne vene miši in jih tako dostavili v jetra. Miške so nato po 8 urah osvetljevali z modro svetlobo, kontrolno skupino pa so pustili v temi. Luciferazno aktivnost so merili 24 ur po injekciji. Dobili so podobne rezultate kot ''in vitro''; 30 min trajajoča osvetlitev je povzročila opazno luciferazno aktivnost, ki pa je tudi naraščala z daljšim časom obsevanja. Ugotovili so tudi, da lahko uspešno rekombinacijo dosežejo že s 30 sekundnim obsevanjem, če so v miške injicirali večje količine plazmidov.1

Primerjava rekombinacije, dosežene s PA-Dre in do tedaj uporabljanje PA-Cre, je pokazala, da ima PA-Dre bistveno izboljšano razmerje signal/šum, kar kaže na to, da je novi sistem dosti bolj strikten. Dokazali pa so tudi, da lahko sistem uspešno dostavljajo v tarčna tkiva (jetra, možgane) preko z adenovirusi povezanih vektorjev (AAV).1

===SISTEM CALID===
S svetlobo inducirani rekombinazi Cre in Dre sta potencialno zelo uporabni pri prostorsko in časovno kontroliranem genskem inženirstvu, a imata nekaj težav pri specifični aktivaciji glede na tip celice. Da bi naredili celično specifični sistem, so razvili dvojni rekombinazni sistem CALID. Pripravljeni konstrukti so vsebovali tkivno specifična promotorja, zapis za Cre in z mesti loxP obkrožen invertiran zapis za PA-Dre. Pri genskem inženirstvu bi tako lahko dodali samo še gen, ki nas zanima, zapisan navzdol od stop kodona, ustrezno obkroženega z dvema rox mestoma. V celicah, kjer je prisotna rekombinaza Cre, bi ta popravila orientacijo rekombinaze PA-Dre, ta pa bi šele po osvetljevanju s svetlobo izrezala stop kodon in povzročila izražanje gena. S tem bi dosežegli elegantnejšo trojno kontrolo rekombinacije.1

AVV9 z zapisom za sistem CALID so skupaj z rekombinazo Cre injicirali v hipokampus odrasle miške R26-RSR-tdTomato. Po enem tednu so jih osvetljevali z optičnimi vlakni in opazili rdečo fluorescenco samo v nevronih, ki so vsebovali Cre in so bili obsevani. Primerjali so intenziteto fluorescence v odvisnosti od časa osvetlitve med 1s in 5 min. Ugotovili so pozitivno korelacijo med trajanjem osvetlitve in obsegom fluorescence, se pravi številom označenih nevronov. Obstajajo pa številni sevi mišk s tkivno specifičnim izražanjem rekombinaze Cre, v katerih bi bil sistem CALID uporaben. Raziskave so ponovili tudi v takih miškah, rezultati so bili primerljivi.1

==ZAKLJUČEK==
V raziskavi so opisali pripravo in optimizacijo sistema svetlobno inducibilne rekombinaze Dre. Ob prisotnosti modre svetlobe fuziran sistem Magnets poskrbi za dimerizacijo rekombinaze Dre, ki šele pod temi pogoji dobi povrnjeno aktivnost. Dokazali so delovanje sistema ''in vitro'' in tudi ''in vivo'' v mišjih modelih. Za lažjo časovno in prostorsko kontrolo rekombinacije so sestavili tudi od Cre odvisen svetlobno inducibilni Dre sistem, imenovan CALID. Z njim so dosegli specifično označevanje nevronov v mišjih možganih v željenem obsegu. Predvidevajo, da bodo s takim sistemom omogočili bolj detajlne raziskave v širšem področju bioloških znanostih.1
==VIRI==
1. H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.

2. M. Karimova, O. Baker, A. Camgoz, R. Naumann, F. Buchholz, K. Anastassiadis: A single reporter mouse line for Vika, Flp, Dre, and Cre-recombination. Sci. Rep. 2018, 8(1), str. 1–12.

3. F. Kawano, R. Okazaki, M. Yazawa, M. Sato: A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat. Chem. Biol. 2016, 12(12), str. 1059–1064.

Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih

2021-04-11T20:23:54Z

Nika Mikulič: /* SISTEM CALID */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33318209/ H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.]
==UVOD==
Precizno gensko inženirstvo, ki bi v organizmu delovalo specifično na posamezne celice, je v časovnem in prostorskem spektru težko dosegljivo. V te namene se pri sintezni biologiji uporabljajo različne mestno specifične rekombinaze, na primer tirozinske rekombinaze. Sposobne so uvajati delecije, integracije, inverzije in tudi translokacije genomske DNA in to brez pomožnih proteinov. Kljub temu, da so v preteklosti dokazali veliko uporabnost rekombinaznih sistemov v genskem inženirstvu, imajo sistemi s samo eno rekombinazo mnoge ovire, ki preprečujejo razvoj zapletenih genetskih modelov.1,2

V raziskavi, ki jo bom kratko opisala, so pripravili zelo učinkovito svetlobno inducibilno Dre rekombinazo (PA-Dre), dokazali, da uspešno regulira gene v specifičnih mišjih tkivih, razvili pa so tudi dvojni rekombinazni sistem CALID (ang. ''Cre-activated light-inducible Dre system'').1

==UPORABA SPECIFIČNIH REKOMBINAZ V SINTEZNI BIOLOGIJI==
Zaradi enostavne uporabe in velike specifičnosti se v sesalskih sistemih uporablja predvsem sistem Cre/loxP. Razvili so mnoge mutirane seve mišk, ki izražajo rekombinazo Cre pod določenimi tkivno specifičnimi promotorji. Taki sevi mišk so uporabni med drugim tudi kot modeli človeških bolezni.1,2

Novejši sistem je sistem Dre/rox, ki so ga odkrili v bakteriofagu D6. Rekombinaza Dre je homologna Cre, mesto rox pa se od mesta loxP razlikuje samo v trinajst nukleotidih od dvaintridesetih. Kljub podobnostim v veliki večini primerov ne prihaja do prečne rekombinacije med sistemoma, zato lahko z njima sestavljamo dvojne rekombinazne sisteme. Prednost Dre pred Cre je prav tako, da nima nobenih toksičnih učinkov na celice.2

V zadnjih nekaj desetletjih razvijajo inducibilne variante rekombinaznih sistemov Cre, poleg kemijsko inducibilnih tudi nekaj svetlobno inducibilnih sistemov, kot sta na primer CRY2-CIB1-PA-Cre in Magnets-PA-Cre. Sistem Magnets, ki se je v tej raziskavi izkazal kot bolj učinkovit, je od modre svetlobe odvisen dimerizacijski sistem, sestavljen iz dveh svetlobnih stikal, imenovanih pozitivni magnet (pMag) in negativni magnet (nMag). Gre za flavin vezavni fotoreceptor, izoliran iz glive. Svetlobno inducibilni sistemi imajo veliko prednosti, omogočajo večjo časovno in prostorsko specifičnost, višjo možnost nadzora in hitro penetracijo tkiva, prav tako pa svetloba za tkivo ni invazivna.1,3

==REZULTATI==
===IDENTIFIKACIJA CEPITVENEGA MESTA Dre===
Ker so vse dotedanje raziskave temeljile predvsem na cepljeni Cre rekombinazi, so na podlagi podatkov o njej sklepali na določena mesta cepitve, s katerimi bi Dre ločili na N- in C-končni del tako, da bi se jima ob ponovnem združenju povrnila rekombinazna aktivnost. Uporabili so računalniške metode in identificirali 6 takih mest. Najboljše rezultate so dobili pri treh načinih cepljenja, DreN60/DreC61, DreN150/DreC151 in DreN246/DreC247.1

===OPTIMIZACIJA PA-Dre===
Pri testiranju ''in vitro'' se je kot fuzijski partner, odgovoren za dimerizacijo, najbolje izkazal sistem Magnets in sicer v primeru, da so na N konec Dre vezali nMag in na C konec Dre pMag. Ugotovili so, da zmanjšajo ozadje z uporabo linkerja L4, ki hkrati tudi ni poslabšal možnosti rekombinacije. Da bi dodatno zmanjšali ozadje s subcelično lokalizacijo polovic Dre, so dodali jedrni lokalizacijski signal iz nukleoplazmina (NLSNLP) na C konec DreC247. Dosegli so dodatno zmanjšanje ozadja in kar 102,2-kratno povečanje luciferazne aktivnosti.1

Pri sestavljanju vektorja so želeli povezati tako optimizirana fuzijska partnerja Dre-N246-nMag (PA-DreN) in pMag-DreC247 -NLSNLP (PA-DreC). Povezali so ju na tak način, da so med oba zapisa dodali zapis za enega izmed samocepilnih peptidov 2A. Ugotovili so, da uporaba T2A, ki ima sicer manjšo avtokatalitično sposobnost od P2A, izboljša razmerje signal/šum, se je pa izkazalo, da je tako razmerje singal/šum, kot tudi učinkovitost rekombinacije boljša, če uporabimo dva ločena vektorja. Prav tako je učinkovitost rekombinacije višja kot pri celem divjem tipu rekombinaze Dre. Najbrž fuzija s sistemom Magnets povzroči nastanek konformacijske oblike z višjo aktivnostjo. Z molekulsko dinamiko so potem dokazali, da je vezava na DNA približno enako stabilna kot pri divjem tipu Dre.1

Prav tako so dokazali, da sistem razpolovljene Dre deluje tudi v fuziji z drugimi dimerizacijskimi sistemi. Preizkusili so dimerizacijski sistem, občutljiv na modro svetlobo Vivid (VVD) iz gliv, sistem za zaznavo rdeče svetlobe (PhyB-PIF3) in svetlobo valovne dolžine na meji z IR (Bphp1-Q-PAS1), pa tudi s kemičnim stikalom FKBP-FRB.1

===KARAKTERIZACIJA PA-Dre ''IN VITRO''===
Najprej so natančno določili čas osvetlitve z modro svetlobo in intenziteto odziva v celicah HEK-293T, transfeciranih s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-Rluc (luciferaza iz korale). Različno dolgo so jih izpostavili svetlobi ali jih pustili rasti v temi. Ugotovili so, da pri osvetlitvi med 4 in 32 ur luciferazna aktivnost opazno raste, nato pa doseže plato. Sistem je bil odziven na modro svetlobo intenzitete 0,25 do 4 mW/cm2, maksimum je dosegel pri 1 mW/cm2. Podobne rezultate so dobili tudi, če so uporabili drugi reporter, CMV-rox-stop-rox-zsGreen (zelen fluorescenčni protein). Sistem je dobro deloval tudi v drugih celičnih linijah iz drugih sesalskih tkiv. Da je sistem kompatibilen tudi z drugimi močnimi promotorji so sklepali, ker so pri uporabi različnih promotorjev dobili dobro razmerje singal/šum in močen odziv na obsevanje z modro svetlobo. Prav tako je Dre deloval na različnih mutiranih rox zaporedjih.1

Veliko prednost pred kemijsko inducibilnimi imajo svetlobno inducibilni sistemi v prostorskem smislu. To so dokazali tako, da so z uporabo maske osvetljevali petrijevke z rastočimi celicami, transfeciranimi s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-zsGreen. Fluorescenčni odziv so zaznali samo v osvetljenih celicah, meja med fluorescirajočimi in temnimi celicami pa je bila razmeroma ostra.1

===SVETLOBNA AKTIVACIJA EKSPRESIJE GENOV S SISTEMOM PA-Dre ''IN VIVO''===
Kot reporterski sistem so pri ''in vivo'' eksperimentih uporabili rox-stop-rox-Fluc (luciferaza iz kresničke). Skupaj s plazmidi z zapisom za PA-Dre so jih injicirali preko repne vene miši in jih tako dostavili v jetra. Miške so nato po 8 urah osvetljevali z modro svetlobo, kontrolno skupino pa so pustili v temi. Luciferazno aktivnost so merili 24 ur po injekciji. Dobili so podobne rezultate kot in vitro; 30 min trajajoča osvetlitev je povzročila opazno luciferazno aktivnost, ki pa je tudi naraščala z daljšim časom obsevanja. Ugotovili so tudi, da lahko uspešno rekombinacijo dosežejo že s 30 sekundnim obsevanjem, če so v miške injicirali večje količine plazmidov.1

Primerjava rekombinacije, dosežene s PA-Dre in do tedaj uporabljanje PA-Cre, je pokazala, da ima PA-Dre bistveno izboljšano razmerje signal/šum, kar kaže na to, da je novi sistem dosti bolj strikten. Dokazali pa so tudi, da lahko sistem uspešno dostavljajo v tarčna tkiva (jetra, možgane) preko z adenovirusi povezanih vektorjev (AAV).1

===SISTEM CALID===
S svetlobo inducirani rekombinazi Cre in Dre sta potencialno zelo uporabni pri prostorsko in časovno kontroliranem genskem inženirstvu, a imata nekaj težav pri specifični aktivaciji glede na tip celice. Da bi naredili celično specifični sistem, so razvili dvojni rekombinazni sistem CALID. Pripravljeni konstrukti so vsebovali tkivno specifična promotorja, zapis za Cre in z mesti loxP obkrožen invertiran zapis za PA-Dre. Pri genskem inženirstvu bi tako lahko dodali samo še gen, ki nas zanima, zapisan navzdol od stop kodona, ustrezno obkroženega z dvema rox mestoma. V celicah, kjer je prisotna rekombinaza Cre, bi ta popravila orientacijo rekombinaze PA-Dre, ta pa bi šele po osvetljevanju s svetlobo izrezala stop kodon in povzročila izražanje gena. S tem bi dosežegli elegantnejšo trojno kontrolo rekombinacije.1

AVV9 z zapisom za sistem CALID so skupaj z rekombinazo Cre injicirali v hipokampus odrasle miške R26-RSR-tdTomato. Po enem tednu so jih osvetljevali z optičnimi vlakni in opazili rdečo fluorescenco samo v nevronih, ki so vsebovali Cre in so bili obsevani. Primerjali so intenziteto fluorescence v odvisnosti od časa osvetlitve med 1s in 5 min. Ugotovili so pozitivno korelacijo med trajanjem osvetlitve in obsegom fluorescence, se pravi številom označenih nevronov. Obstajajo pa številni sevi mišk s tkivno specifičnim izražanjem rekombinaze Cre, v katerih bi bil sistem CALID uporaben. Raziskave so ponovili tudi v takih miškah, rezultati so bili primerljivi.1

==ZAKLJUČEK==
V raziskavi so opisali pripravo in optimizacijo sistema svetlobno inducibilne rekombinaze Dre. Ob prisotnosti modre svetlobe fuziran sistem Magnets poskrbi za dimerizacijo rekombinaze Dre, ki šele pod temi pogoji dobi povrnjeno aktivnost. Dokazali so delovanje sistema ''in vitro'' in tudi ''in vivo'' v mišjih modelih. Za lažjo časovno in prostorsko kontrolo rekombinacije so sestavili tudi od Cre odvisen svetlobno inducibilni Dre sistem, imenovan CALID. Z njim so dosegli specifično označevanje nevronov v mišjih možganih v željenem obsegu. Predvidevajo, da bodo s takim sistemom omogočili bolj detajlne raziskave v širšem področju bioloških znanostih.1
==VIRI==
1. H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.

2. M. Karimova, O. Baker, A. Camgoz, R. Naumann, F. Buchholz, K. Anastassiadis: A single reporter mouse line for Vika, Flp, Dre, and Cre-recombination. Sci. Rep. 2018, 8(1), str. 1–12.

3. F. Kawano, R. Okazaki, M. Yazawa, M. Sato: A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat. Chem. Biol. 2016, 12(12), str. 1059–1064.

Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih

2021-04-11T20:23:37Z

Nika Mikulič: /* IDENTIFIKACIJA CEPITVENEGA MESTA Dre */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33318209/ H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.]
==UVOD==
Precizno gensko inženirstvo, ki bi v organizmu delovalo specifično na posamezne celice, je v časovnem in prostorskem spektru težko dosegljivo. V te namene se pri sintezni biologiji uporabljajo različne mestno specifične rekombinaze, na primer tirozinske rekombinaze. Sposobne so uvajati delecije, integracije, inverzije in tudi translokacije genomske DNA in to brez pomožnih proteinov. Kljub temu, da so v preteklosti dokazali veliko uporabnost rekombinaznih sistemov v genskem inženirstvu, imajo sistemi s samo eno rekombinazo mnoge ovire, ki preprečujejo razvoj zapletenih genetskih modelov.1,2

V raziskavi, ki jo bom kratko opisala, so pripravili zelo učinkovito svetlobno inducibilno Dre rekombinazo (PA-Dre), dokazali, da uspešno regulira gene v specifičnih mišjih tkivih, razvili pa so tudi dvojni rekombinazni sistem CALID (ang. ''Cre-activated light-inducible Dre system'').1

==UPORABA SPECIFIČNIH REKOMBINAZ V SINTEZNI BIOLOGIJI==
Zaradi enostavne uporabe in velike specifičnosti se v sesalskih sistemih uporablja predvsem sistem Cre/loxP. Razvili so mnoge mutirane seve mišk, ki izražajo rekombinazo Cre pod določenimi tkivno specifičnimi promotorji. Taki sevi mišk so uporabni med drugim tudi kot modeli človeških bolezni.1,2

Novejši sistem je sistem Dre/rox, ki so ga odkrili v bakteriofagu D6. Rekombinaza Dre je homologna Cre, mesto rox pa se od mesta loxP razlikuje samo v trinajst nukleotidih od dvaintridesetih. Kljub podobnostim v veliki večini primerov ne prihaja do prečne rekombinacije med sistemoma, zato lahko z njima sestavljamo dvojne rekombinazne sisteme. Prednost Dre pred Cre je prav tako, da nima nobenih toksičnih učinkov na celice.2

V zadnjih nekaj desetletjih razvijajo inducibilne variante rekombinaznih sistemov Cre, poleg kemijsko inducibilnih tudi nekaj svetlobno inducibilnih sistemov, kot sta na primer CRY2-CIB1-PA-Cre in Magnets-PA-Cre. Sistem Magnets, ki se je v tej raziskavi izkazal kot bolj učinkovit, je od modre svetlobe odvisen dimerizacijski sistem, sestavljen iz dveh svetlobnih stikal, imenovanih pozitivni magnet (pMag) in negativni magnet (nMag). Gre za flavin vezavni fotoreceptor, izoliran iz glive. Svetlobno inducibilni sistemi imajo veliko prednosti, omogočajo večjo časovno in prostorsko specifičnost, višjo možnost nadzora in hitro penetracijo tkiva, prav tako pa svetloba za tkivo ni invazivna.1,3

==REZULTATI==
===IDENTIFIKACIJA CEPITVENEGA MESTA Dre===
Ker so vse dotedanje raziskave temeljile predvsem na cepljeni Cre rekombinazi, so na podlagi podatkov o njej sklepali na določena mesta cepitve, s katerimi bi Dre ločili na N- in C-končni del tako, da bi se jima ob ponovnem združenju povrnila rekombinazna aktivnost. Uporabili so računalniške metode in identificirali 6 takih mest. Najboljše rezultate so dobili pri treh načinih cepljenja, DreN60/DreC61, DreN150/DreC151 in DreN246/DreC247.1

===OPTIMIZACIJA PA-Dre===
Pri testiranju ''in vitro'' se je kot fuzijski partner, odgovoren za dimerizacijo, najbolje izkazal sistem Magnets in sicer v primeru, da so na N konec Dre vezali nMag in na C konec Dre pMag. Ugotovili so, da zmanjšajo ozadje z uporabo linkerja L4, ki hkrati tudi ni poslabšal možnosti rekombinacije. Da bi dodatno zmanjšali ozadje s subcelično lokalizacijo polovic Dre, so dodali jedrni lokalizacijski signal iz nukleoplazmina (NLSNLP) na C konec DreC247. Dosegli so dodatno zmanjšanje ozadja in kar 102,2-kratno povečanje luciferazne aktivnosti.1

Pri sestavljanju vektorja so želeli povezati tako optimizirana fuzijska partnerja Dre-N246-nMag (PA-DreN) in pMag-DreC247 -NLSNLP (PA-DreC). Povezali so ju na tak način, da so med oba zapisa dodali zapis za enega izmed samocepilnih peptidov 2A. Ugotovili so, da uporaba T2A, ki ima sicer manjšo avtokatalitično sposobnost od P2A, izboljša razmerje signal/šum, se je pa izkazalo, da je tako razmerje singal/šum, kot tudi učinkovitost rekombinacije boljša, če uporabimo dva ločena vektorja. Prav tako je učinkovitost rekombinacije višja kot pri celem divjem tipu rekombinaze Dre. Najbrž fuzija s sistemom Magnets povzroči nastanek konformacijske oblike z višjo aktivnostjo. Z molekulsko dinamiko so potem dokazali, da je vezava na DNA približno enako stabilna kot pri divjem tipu Dre.1

Prav tako so dokazali, da sistem razpolovljene Dre deluje tudi v fuziji z drugimi dimerizacijskimi sistemi. Preizkusili so dimerizacijski sistem, občutljiv na modro svetlobo Vivid (VVD) iz gliv, sistem za zaznavo rdeče svetlobe (PhyB-PIF3) in svetlobo valovne dolžine na meji z IR (Bphp1-Q-PAS1), pa tudi s kemičnim stikalom FKBP-FRB.1

===KARAKTERIZACIJA PA-Dre ''IN VITRO''===
Najprej so natančno določili čas osvetlitve z modro svetlobo in intenziteto odziva v celicah HEK-293T, transfeciranih s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-Rluc (luciferaza iz korale). Različno dolgo so jih izpostavili svetlobi ali jih pustili rasti v temi. Ugotovili so, da pri osvetlitvi med 4 in 32 ur luciferazna aktivnost opazno raste, nato pa doseže plato. Sistem je bil odziven na modro svetlobo intenzitete 0,25 do 4 mW/cm2, maksimum je dosegel pri 1 mW/cm2. Podobne rezultate so dobili tudi, če so uporabili drugi reporter, CMV-rox-stop-rox-zsGreen (zelen fluorescenčni protein). Sistem je dobro deloval tudi v drugih celičnih linijah iz drugih sesalskih tkiv. Da je sistem kompatibilen tudi z drugimi močnimi promotorji so sklepali, ker so pri uporabi različnih promotorjev dobili dobro razmerje singal/šum in močen odziv na obsevanje z modro svetlobo. Prav tako je Dre deloval na različnih mutiranih rox zaporedjih.1

Veliko prednost pred kemijsko inducibilnimi imajo svetlobno inducibilni sistemi v prostorskem smislu. To so dokazali tako, da so z uporabo maske osvetljevali petrijevke z rastočimi celicami, transfeciranimi s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-zsGreen. Fluorescenčni odziv so zaznali samo v osvetljenih celicah, meja med fluorescirajočimi in temnimi celicami pa je bila razmeroma ostra.1

===SVETLOBNA AKTIVACIJA EKSPRESIJE GENOV S SISTEMOM PA-Dre ''IN VIVO''===
Kot reporterski sistem so pri ''in vivo'' eksperimentih uporabili rox-stop-rox-Fluc (luciferaza iz kresničke). Skupaj s plazmidi z zapisom za PA-Dre so jih injicirali preko repne vene miši in jih tako dostavili v jetra. Miške so nato po 8 urah osvetljevali z modro svetlobo, kontrolno skupino pa so pustili v temi. Luciferazno aktivnost so merili 24 ur po injekciji. Dobili so podobne rezultate kot in vitro; 30 min trajajoča osvetlitev je povzročila opazno luciferazno aktivnost, ki pa je tudi naraščala z daljšim časom obsevanja. Ugotovili so tudi, da lahko uspešno rekombinacijo dosežejo že s 30 sekundnim obsevanjem, če so v miške injicirali večje količine plazmidov.1

Primerjava rekombinacije, dosežene s PA-Dre in do tedaj uporabljanje PA-Cre, je pokazala, da ima PA-Dre bistveno izboljšano razmerje signal/šum, kar kaže na to, da je novi sistem dosti bolj strikten. Dokazali pa so tudi, da lahko sistem uspešno dostavljajo v tarčna tkiva (jetra, možgane) preko z adenovirusi povezanih vektorjev (AAV).1

===SISTEM CALID===
S svetlobo inducirani rekombinazi Cre in Dre sta potencialno zelo uporabni pri prostorsko in časovno kontroliranem genskem inženirstvu, a imata nekaj težav pri specifični aktivaciji glede na tip celice. Da bi naredili celično specifični sistem, so razvili dvojni rekombinazni sistem CALID. Pripravljeni konstrukti so vsebovali tkivno specifična promotorja, zapis za Cre in z mesti loxP obkrožen invertiran zapis za PA-Dre. Pri genskem inženirstvu bi tako lahko dodali samo še gen, ki nas zanima, zapisan navzdol od stop kodona, ustrezno obkroženega z dvema rox mestoma. V celicah, kjer je prisotna rekombinaza Cre, bi ta popravila orientacijo rekombinaze PA-Dre, ta pa bi šele po osvetljevanju s svetlobo izrezala stop kodon in povzročila izražanje gena. S tem bi dosežegli elegantnejšo trojno kontrolo rekombinacije.1

AVV9 z zapisom za sistem CALID so skupaj z rekombinazo Cre injicirali v hipokampus odrasle miške R26-RSR-tdTomato. Po enem tednu so jih osvetljevali z optičnimi vlakni in opazili rdečo fluorescenco samo v nevronih, ki so vsebovali Cre in so bili obsevani. Primerjali so intenziteto fluorescence v odvisnosti od časa osvetlitve med 1s in 5 min. Ugotovili so pozitivno korelacijo med trajanjem osvetlitve in obsegom fluorescence, se pravi številom označenih nevronov. Obstajajo pa številni sevi mišk s tkivno specifičnim izražanjem rekombinaze Cre, v katerih bi bil sistem CALID uporaben. Raziskave so ponovili tudi v takih miškah, krezultati so bili primerljivi.1

==ZAKLJUČEK==
V raziskavi so opisali pripravo in optimizacijo sistema svetlobno inducibilne rekombinaze Dre. Ob prisotnosti modre svetlobe fuziran sistem Magnets poskrbi za dimerizacijo rekombinaze Dre, ki šele pod temi pogoji dobi povrnjeno aktivnost. Dokazali so delovanje sistema ''in vitro'' in tudi ''in vivo'' v mišjih modelih. Za lažjo časovno in prostorsko kontrolo rekombinacije so sestavili tudi od Cre odvisen svetlobno inducibilni Dre sistem, imenovan CALID. Z njim so dosegli specifično označevanje nevronov v mišjih možganih v željenem obsegu. Predvidevajo, da bodo s takim sistemom omogočili bolj detajlne raziskave v širšem področju bioloških znanostih.1
==VIRI==
1. H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.

2. M. Karimova, O. Baker, A. Camgoz, R. Naumann, F. Buchholz, K. Anastassiadis: A single reporter mouse line for Vika, Flp, Dre, and Cre-recombination. Sci. Rep. 2018, 8(1), str. 1–12.

3. F. Kawano, R. Okazaki, M. Yazawa, M. Sato: A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat. Chem. Biol. 2016, 12(12), str. 1059–1064.

Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih

2021-04-11T20:22:55Z

Nika Mikulič: /* OPTIMIZACIJA PA-Dre */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33318209/ H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.]
==UVOD==
Precizno gensko inženirstvo, ki bi v organizmu delovalo specifično na posamezne celice, je v časovnem in prostorskem spektru težko dosegljivo. V te namene se pri sintezni biologiji uporabljajo različne mestno specifične rekombinaze, na primer tirozinske rekombinaze. Sposobne so uvajati delecije, integracije, inverzije in tudi translokacije genomske DNA in to brez pomožnih proteinov. Kljub temu, da so v preteklosti dokazali veliko uporabnost rekombinaznih sistemov v genskem inženirstvu, imajo sistemi s samo eno rekombinazo mnoge ovire, ki preprečujejo razvoj zapletenih genetskih modelov.1,2

V raziskavi, ki jo bom kratko opisala, so pripravili zelo učinkovito svetlobno inducibilno Dre rekombinazo (PA-Dre), dokazali, da uspešno regulira gene v specifičnih mišjih tkivih, razvili pa so tudi dvojni rekombinazni sistem CALID (ang. ''Cre-activated light-inducible Dre system'').1

==UPORABA SPECIFIČNIH REKOMBINAZ V SINTEZNI BIOLOGIJI==
Zaradi enostavne uporabe in velike specifičnosti se v sesalskih sistemih uporablja predvsem sistem Cre/loxP. Razvili so mnoge mutirane seve mišk, ki izražajo rekombinazo Cre pod določenimi tkivno specifičnimi promotorji. Taki sevi mišk so uporabni med drugim tudi kot modeli človeških bolezni.1,2

Novejši sistem je sistem Dre/rox, ki so ga odkrili v bakteriofagu D6. Rekombinaza Dre je homologna Cre, mesto rox pa se od mesta loxP razlikuje samo v trinajst nukleotidih od dvaintridesetih. Kljub podobnostim v veliki večini primerov ne prihaja do prečne rekombinacije med sistemoma, zato lahko z njima sestavljamo dvojne rekombinazne sisteme. Prednost Dre pred Cre je prav tako, da nima nobenih toksičnih učinkov na celice.2

V zadnjih nekaj desetletjih razvijajo inducibilne variante rekombinaznih sistemov Cre, poleg kemijsko inducibilnih tudi nekaj svetlobno inducibilnih sistemov, kot sta na primer CRY2-CIB1-PA-Cre in Magnets-PA-Cre. Sistem Magnets, ki se je v tej raziskavi izkazal kot bolj učinkovit, je od modre svetlobe odvisen dimerizacijski sistem, sestavljen iz dveh svetlobnih stikal, imenovanih pozitivni magnet (pMag) in negativni magnet (nMag). Gre za flavin vezavni fotoreceptor, izoliran iz glive. Svetlobno inducibilni sistemi imajo veliko prednosti, omogočajo večjo časovno in prostorsko specifičnost, višjo možnost nadzora in hitro penetracijo tkiva, prav tako pa svetloba za tkivo ni invazivna.1,3

==REZULTATI==
===IDENTIFIKACIJA CEPITVENEGA MESTA Dre===
Ker so vse dotedanje raziskave temeljile predvsem na cepljeni Cre rekombinazi, so na podlagi podatkov o njej sklepali na določena mesta cepitve, s katerimi bi Dre ločili na N- in C-končni del tako, da bi se jima ob ponovnem združenju povrnila rekombinazna aktivnost. Uporabili so računalniške metode in identificirali 6 takih mest. Najboljše rezultate do dobili pri treh načinih cepljenja, DreN60/DreC61, DreN150/DreC151 in DreN246/DreC247.1
===OPTIMIZACIJA PA-Dre===
Pri testiranju ''in vitro'' se je kot fuzijski partner, odgovoren za dimerizacijo, najbolje izkazal sistem Magnets in sicer v primeru, da so na N konec Dre vezali nMag in na C konec Dre pMag. Ugotovili so, da zmanjšajo ozadje z uporabo linkerja L4, ki hkrati tudi ni poslabšal možnosti rekombinacije. Da bi dodatno zmanjšali ozadje s subcelično lokalizacijo polovic Dre, so dodali jedrni lokalizacijski signal iz nukleoplazmina (NLSNLP) na C konec DreC247. Dosegli so dodatno zmanjšanje ozadja in kar 102,2-kratno povečanje luciferazne aktivnosti.1

Pri sestavljanju vektorja so želeli povezati tako optimizirana fuzijska partnerja Dre-N246-nMag (PA-DreN) in pMag-DreC247 -NLSNLP (PA-DreC). Povezali so ju na tak način, da so med oba zapisa dodali zapis za enega izmed samocepilnih peptidov 2A. Ugotovili so, da uporaba T2A, ki ima sicer manjšo avtokatalitično sposobnost od P2A, izboljša razmerje signal/šum, se je pa izkazalo, da je tako razmerje singal/šum, kot tudi učinkovitost rekombinacije boljša, če uporabimo dva ločena vektorja. Prav tako je učinkovitost rekombinacije višja kot pri celem divjem tipu rekombinaze Dre. Najbrž fuzija s sistemom Magnets povzroči nastanek konformacijske oblike z višjo aktivnostjo. Z molekulsko dinamiko so potem dokazali, da je vezava na DNA približno enako stabilna kot pri divjem tipu Dre.1

Prav tako so dokazali, da sistem razpolovljene Dre deluje tudi v fuziji z drugimi dimerizacijskimi sistemi. Preizkusili so dimerizacijski sistem, občutljiv na modro svetlobo Vivid (VVD) iz gliv, sistem za zaznavo rdeče svetlobe (PhyB-PIF3) in svetlobo valovne dolžine na meji z IR (Bphp1-Q-PAS1), pa tudi s kemičnim stikalom FKBP-FRB.1

===KARAKTERIZACIJA PA-Dre ''IN VITRO''===
Najprej so natančno določili čas osvetlitve z modro svetlobo in intenziteto odziva v celicah HEK-293T, transfeciranih s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-Rluc (luciferaza iz korale). Različno dolgo so jih izpostavili svetlobi ali jih pustili rasti v temi. Ugotovili so, da pri osvetlitvi med 4 in 32 ur luciferazna aktivnost opazno raste, nato pa doseže plato. Sistem je bil odziven na modro svetlobo intenzitete 0,25 do 4 mW/cm2, maksimum je dosegel pri 1 mW/cm2. Podobne rezultate so dobili tudi, če so uporabili drugi reporter, CMV-rox-stop-rox-zsGreen (zelen fluorescenčni protein). Sistem je dobro deloval tudi v drugih celičnih linijah iz drugih sesalskih tkiv. Da je sistem kompatibilen tudi z drugimi močnimi promotorji so sklepali, ker so pri uporabi različnih promotorjev dobili dobro razmerje singal/šum in močen odziv na obsevanje z modro svetlobo. Prav tako je Dre deloval na različnih mutiranih rox zaporedjih.1

Veliko prednost pred kemijsko inducibilnimi imajo svetlobno inducibilni sistemi v prostorskem smislu. To so dokazali tako, da so z uporabo maske osvetljevali petrijevke z rastočimi celicami, transfeciranimi s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-zsGreen. Fluorescenčni odziv so zaznali samo v osvetljenih celicah, meja med fluorescirajočimi in temnimi celicami pa je bila razmeroma ostra.1

===SVETLOBNA AKTIVACIJA EKSPRESIJE GENOV S SISTEMOM PA-Dre ''IN VIVO''===
Kot reporterski sistem so pri ''in vivo'' eksperimentih uporabili rox-stop-rox-Fluc (luciferaza iz kresničke). Skupaj s plazmidi z zapisom za PA-Dre so jih injicirali preko repne vene miši in jih tako dostavili v jetra. Miške so nato po 8 urah osvetljevali z modro svetlobo, kontrolno skupino pa so pustili v temi. Luciferazno aktivnost so merili 24 ur po injekciji. Dobili so podobne rezultate kot in vitro; 30 min trajajoča osvetlitev je povzročila opazno luciferazno aktivnost, ki pa je tudi naraščala z daljšim časom obsevanja. Ugotovili so tudi, da lahko uspešno rekombinacijo dosežejo že s 30 sekundnim obsevanjem, če so v miške injicirali večje količine plazmidov.1

Primerjava rekombinacije, dosežene s PA-Dre in do tedaj uporabljanje PA-Cre, je pokazala, da ima PA-Dre bistveno izboljšano razmerje signal/šum, kar kaže na to, da je novi sistem dosti bolj strikten. Dokazali pa so tudi, da lahko sistem uspešno dostavljajo v tarčna tkiva (jetra, možgane) preko z adenovirusi povezanih vektorjev (AAV).1

===SISTEM CALID===
S svetlobo inducirani rekombinazi Cre in Dre sta potencialno zelo uporabni pri prostorsko in časovno kontroliranem genskem inženirstvu, a imata nekaj težav pri specifični aktivaciji glede na tip celice. Da bi naredili celično specifični sistem, so razvili dvojni rekombinazni sistem CALID. Pripravljeni konstrukti so vsebovali tkivno specifična promotorja, zapis za Cre in z mesti loxP obkrožen invertiran zapis za PA-Dre. Pri genskem inženirstvu bi tako lahko dodali samo še gen, ki nas zanima, zapisan navzdol od stop kodona, ustrezno obkroženega z dvema rox mestoma. V celicah, kjer je prisotna rekombinaza Cre, bi ta popravila orientacijo rekombinaze PA-Dre, ta pa bi šele po osvetljevanju s svetlobo izrezala stop kodon in povzročila izražanje gena. S tem bi dosežegli elegantnejšo trojno kontrolo rekombinacije.1

AVV9 z zapisom za sistem CALID so skupaj z rekombinazo Cre injicirali v hipokampus odrasle miške R26-RSR-tdTomato. Po enem tednu so jih osvetljevali z optičnimi vlakni in opazili rdečo fluorescenco samo v nevronih, ki so vsebovali Cre in so bili obsevani. Primerjali so intenziteto fluorescence v odvisnosti od časa osvetlitve med 1s in 5 min. Ugotovili so pozitivno korelacijo med trajanjem osvetlitve in obsegom fluorescence, se pravi številom označenih nevronov. Obstajajo pa številni sevi mišk s tkivno specifičnim izražanjem rekombinaze Cre, v katerih bi bil sistem CALID uporaben. Raziskave so ponovili tudi v takih miškah, krezultati so bili primerljivi.1

==ZAKLJUČEK==
V raziskavi so opisali pripravo in optimizacijo sistema svetlobno inducibilne rekombinaze Dre. Ob prisotnosti modre svetlobe fuziran sistem Magnets poskrbi za dimerizacijo rekombinaze Dre, ki šele pod temi pogoji dobi povrnjeno aktivnost. Dokazali so delovanje sistema ''in vitro'' in tudi ''in vivo'' v mišjih modelih. Za lažjo časovno in prostorsko kontrolo rekombinacije so sestavili tudi od Cre odvisen svetlobno inducibilni Dre sistem, imenovan CALID. Z njim so dosegli specifično označevanje nevronov v mišjih možganih v željenem obsegu. Predvidevajo, da bodo s takim sistemom omogočili bolj detajlne raziskave v širšem področju bioloških znanostih.1
==VIRI==
1. H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.

2. M. Karimova, O. Baker, A. Camgoz, R. Naumann, F. Buchholz, K. Anastassiadis: A single reporter mouse line for Vika, Flp, Dre, and Cre-recombination. Sci. Rep. 2018, 8(1), str. 1–12.

3. F. Kawano, R. Okazaki, M. Yazawa, M. Sato: A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat. Chem. Biol. 2016, 12(12), str. 1059–1064.

Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih

2021-04-11T20:06:06Z

Nika Mikulič: /* UPORABA REKOMBINAZ V SINTEZNI BIOLOGIJI */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33318209/ H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.]
==UVOD==
Precizno gensko inženirstvo, ki bi v organizmu delovalo specifično na posamezne celice, je v časovnem in prostorskem spektru težko dosegljivo. V te namene se pri sintezni biologiji uporabljajo različne mestno specifične rekombinaze, na primer tirozinske rekombinaze. Sposobne so uvajati delecije, integracije, inverzije in tudi translokacije genomske DNA in to brez pomožnih proteinov. Kljub temu, da so v preteklosti dokazali veliko uporabnost rekombinaznih sistemov v genskem inženirstvu, imajo sistemi s samo eno rekombinazo mnoge ovire, ki preprečujejo razvoj zapletenih genetskih modelov.1,2

V raziskavi, ki jo bom kratko opisala, so pripravili zelo učinkovito svetlobno inducibilno Dre rekombinazo (PA-Dre), dokazali, da uspešno regulira gene v specifičnih mišjih tkivih, razvili pa so tudi dvojni rekombinazni sistem CALID (ang. ''Cre-activated light-inducible Dre system'').1

==UPORABA SPECIFIČNIH REKOMBINAZ V SINTEZNI BIOLOGIJI==
Zaradi enostavne uporabe in velike specifičnosti se v sesalskih sistemih uporablja predvsem sistem Cre/loxP. Razvili so mnoge mutirane seve mišk, ki izražajo rekombinazo Cre pod določenimi tkivno specifičnimi promotorji. Taki sevi mišk so uporabni med drugim tudi kot modeli človeških bolezni.1,2

Novejši sistem je sistem Dre/rox, ki so ga odkrili v bakteriofagu D6. Rekombinaza Dre je homologna Cre, mesto rox pa se od mesta loxP razlikuje samo v trinajst nukleotidih od dvaintridesetih. Kljub podobnostim v veliki večini primerov ne prihaja do prečne rekombinacije med sistemoma, zato lahko z njima sestavljamo dvojne rekombinazne sisteme. Prednost Dre pred Cre je prav tako, da nima nobenih toksičnih učinkov na celice.2

V zadnjih nekaj desetletjih razvijajo inducibilne variante rekombinaznih sistemov Cre, poleg kemijsko inducibilnih tudi nekaj svetlobno inducibilnih sistemov, kot sta na primer CRY2-CIB1-PA-Cre in Magnets-PA-Cre. Sistem Magnets, ki se je v tej raziskavi izkazal kot bolj učinkovit, je od modre svetlobe odvisen dimerizacijski sistem, sestavljen iz dveh svetlobnih stikal, imenovanih pozitivni magnet (pMag) in negativni magnet (nMag). Gre za flavin vezavni fotoreceptor, izoliran iz glive. Svetlobno inducibilni sistemi imajo veliko prednosti, omogočajo večjo časovno in prostorsko specifičnost, višjo možnost nadzora in hitro penetracijo tkiva, prav tako pa svetloba za tkivo ni invazivna.1,3

==REZULTATI==
===IDENTIFIKACIJA CEPITVENEGA MESTA Dre===
Ker so vse dotedanje raziskave temeljile predvsem na cepljeni Cre rekombinazi, so na podlagi podatkov o njej sklepali na določena mesta cepitve, s katerimi bi Dre ločili na N- in C-končni del tako, da bi se jima ob ponovnem združenju povrnila rekombinazna aktivnost. Uporabili so računalniške metode in identificirali 6 takih mest. Najboljše rezultate do dobili pri treh načinih cepljenja, DreN60/DreC61, DreN150/DreC151 in DreN246/DreC247.1
===OPTIMIZACIJA PA-Dre===
Pri testiranju in vitro se je kot fuzijski partner, odgovoren za dimerizacijo, najbolje izkazal sistem Magnets in sicer v primeru, da so na N konec Dre vezali nMag in na C konec Dre pMag. Ugotovili so, da zmanjšajo ozadje z uporabo linkerja L4, ki hkrati tudi ni poslabšal možnosti rekombinacije. Da bi dodatno zmanjšali ozadje s subcelično lokalizacijo polovic Dre, so dodali jedrni lokalizacijski signal iz nukleoplazmina (NLSNLP) na C konec DreC247. Dosegli so dodatno zmanjšanje ozadja in kar 102,2-kratno povečanje luciferazne aktivnosti.1

Pri sestavljanju vektorja so želeli povezati tako optimizirana fuzijska partnerja Dre-N246-nMag (PA-DreN) in pMag-DreC247 -NLSNLP (PA-DreC). Povezali so ju na tak način, da so med oba zapisa dodali zapis za enega izmed samocepilnih peptidov 2A. Ugotovili so, da uporaba T2A, ki ima sicer manjšo avtokatalitično sposobnost od P2A, izboljša razmerje signal/šum, se je pa izkazalo, da je tako razmerje singal/šum, kot tudi učinkovitost rekombinacije boljša, če uporabimo dva ločena vektorja. Prav tako je učinkovitost rekombinacije višja kot pri celem divjem tipu rekombinaze Dre. Najbrž fuzija s sistemom Magnets povzroči nastanek konformacijske oblike z višjo aktivnostjo. Z molekulsko dinamiko so potem dokazali, da je vezava na DNA približno enako stabilna kot pri divjem tipu Dre.1

Prav tako so dokazali, da sistem razpolovljene Dre deluje tudi v fuziji z drugimi dimerizacijskimi sistemi. Preizkusili so dimerizacijski sistem, občutljiv na modro svetlobo Vivid (VVD) iz gliv, sistem za zaznavo rdeče svetlobe (PhyB-PIF3) in svetlobo valovne dolžine na meji z IR (Bphp1-Q-PAS1), pa tudi s kemičnim stikalom FKBP-FRB.1

===KARAKTERIZACIJA PA-Dre ''IN VITRO''===
Najprej so natančno določili čas osvetlitve z modro svetlobo in intenziteto odziva v celicah HEK-293T, transfeciranih s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-Rluc (luciferaza iz korale). Različno dolgo so jih izpostavili svetlobi ali jih pustili rasti v temi. Ugotovili so, da pri osvetlitvi med 4 in 32 ur luciferazna aktivnost opazno raste, nato pa doseže plato. Sistem je bil odziven na modro svetlobo intenzitete 0,25 do 4 mW/cm2, maksimum je dosegel pri 1 mW/cm2. Podobne rezultate so dobili tudi, če so uporabili drugi reporter, CMV-rox-stop-rox-zsGreen (zelen fluorescenčni protein). Sistem je dobro deloval tudi v drugih celičnih linijah iz drugih sesalskih tkiv. Da je sistem kompatibilen tudi z drugimi močnimi promotorji so sklepali, ker so pri uporabi različnih promotorjev dobili dobro razmerje singal/šum in močen odziv na obsevanje z modro svetlobo. Prav tako je Dre deloval na različnih mutiranih rox zaporedjih.1

Veliko prednost pred kemijsko inducibilnimi imajo svetlobno inducibilni sistemi v prostorskem smislu. To so dokazali tako, da so z uporabo maske osvetljevali petrijevke z rastočimi celicami, transfeciranimi s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-zsGreen. Fluorescenčni odziv so zaznali samo v osvetljenih celicah, meja med fluorescirajočimi in temnimi celicami pa je bila razmeroma ostra.1

===SVETLOBNA AKTIVACIJA EKSPRESIJE GENOV S SISTEMOM PA-Dre ''IN VIVO''===
Kot reporterski sistem so pri ''in vivo'' eksperimentih uporabili rox-stop-rox-Fluc (luciferaza iz kresničke). Skupaj s plazmidi z zapisom za PA-Dre so jih injicirali preko repne vene miši in jih tako dostavili v jetra. Miške so nato po 8 urah osvetljevali z modro svetlobo, kontrolno skupino pa so pustili v temi. Luciferazno aktivnost so merili 24 ur po injekciji. Dobili so podobne rezultate kot in vitro; 30 min trajajoča osvetlitev je povzročila opazno luciferazno aktivnost, ki pa je tudi naraščala z daljšim časom obsevanja. Ugotovili so tudi, da lahko uspešno rekombinacijo dosežejo že s 30 sekundnim obsevanjem, če so v miške injicirali večje količine plazmidov.1

Primerjava rekombinacije, dosežene s PA-Dre in do tedaj uporabljanje PA-Cre, je pokazala, da ima PA-Dre bistveno izboljšano razmerje signal/šum, kar kaže na to, da je novi sistem dosti bolj strikten. Dokazali pa so tudi, da lahko sistem uspešno dostavljajo v tarčna tkiva (jetra, možgane) preko z adenovirusi povezanih vektorjev (AAV).1

===SISTEM CALID===
S svetlobo inducirani rekombinazi Cre in Dre sta potencialno zelo uporabni pri prostorsko in časovno kontroliranem genskem inženirstvu, a imata nekaj težav pri specifični aktivaciji glede na tip celice. Da bi naredili celično specifični sistem, so razvili dvojni rekombinazni sistem CALID. Pripravljeni konstrukti so vsebovali tkivno specifična promotorja, zapis za Cre in z mesti loxP obkrožen invertiran zapis za PA-Dre. Pri genskem inženirstvu bi tako lahko dodali samo še gen, ki nas zanima, zapisan navzdol od stop kodona, ustrezno obkroženega z dvema rox mestoma. V celicah, kjer je prisotna rekombinaza Cre, bi ta popravila orientacijo rekombinaze PA-Dre, ta pa bi šele po osvetljevanju s svetlobo izrezala stop kodon in povzročila izražanje gena. S tem bi dosežegli elegantnejšo trojno kontrolo rekombinacije.1

AVV9 z zapisom za sistem CALID so skupaj z rekombinazo Cre injicirali v hipokampus odrasle miške R26-RSR-tdTomato. Po enem tednu so jih osvetljevali z optičnimi vlakni in opazili rdečo fluorescenco samo v nevronih, ki so vsebovali Cre in so bili obsevani. Primerjali so intenziteto fluorescence v odvisnosti od časa osvetlitve med 1s in 5 min. Ugotovili so pozitivno korelacijo med trajanjem osvetlitve in obsegom fluorescence, se pravi številom označenih nevronov. Obstajajo pa številni sevi mišk s tkivno specifičnim izražanjem rekombinaze Cre, v katerih bi bil sistem CALID uporaben. Raziskave so ponovili tudi v takih miškah, krezultati so bili primerljivi.1

==ZAKLJUČEK==
V raziskavi so opisali pripravo in optimizacijo sistema svetlobno inducibilne rekombinaze Dre. Ob prisotnosti modre svetlobe fuziran sistem Magnets poskrbi za dimerizacijo rekombinaze Dre, ki šele pod temi pogoji dobi povrnjeno aktivnost. Dokazali so delovanje sistema ''in vitro'' in tudi ''in vivo'' v mišjih modelih. Za lažjo časovno in prostorsko kontrolo rekombinacije so sestavili tudi od Cre odvisen svetlobno inducibilni Dre sistem, imenovan CALID. Z njim so dosegli specifično označevanje nevronov v mišjih možganih v željenem obsegu. Predvidevajo, da bodo s takim sistemom omogočili bolj detajlne raziskave v širšem področju bioloških znanostih.1
==VIRI==
1. H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.

2. M. Karimova, O. Baker, A. Camgoz, R. Naumann, F. Buchholz, K. Anastassiadis: A single reporter mouse line for Vika, Flp, Dre, and Cre-recombination. Sci. Rep. 2018, 8(1), str. 1–12.

3. F. Kawano, R. Okazaki, M. Yazawa, M. Sato: A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat. Chem. Biol. 2016, 12(12), str. 1059–1064.

Seminarji SB 2020/21

2021-04-11T20:05:02Z

Nika Mikulič:

V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline]
(Liza Ulčakar) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv]
(Špela Supej) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 

----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Seminarji SB 2020/21

2021-04-11T20:04:46Z

Nika Mikulič:

V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline]
(Liza Ulčakar) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv]
(Špela Supej) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 

----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih

2021-04-11T20:03:24Z

Nika Mikulič: /* VIRI */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33318209/ H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.]
==UVOD==
Precizno gensko inženirstvo, ki bi v organizmu delovalo specifično na posamezne celice, je v časovnem in prostorskem spektru težko dosegljivo. V te namene se pri sintezni biologiji uporabljajo različne mestno specifične rekombinaze, na primer tirozinske rekombinaze. Sposobne so uvajati delecije, integracije, inverzije in tudi translokacije genomske DNA in to brez pomožnih proteinov. Kljub temu, da so v preteklosti dokazali veliko uporabnost rekombinaznih sistemov v genskem inženirstvu, imajo sistemi s samo eno rekombinazo mnoge ovire, ki preprečujejo razvoj zapletenih genetskih modelov.1,2

V raziskavi, ki jo bom kratko opisala, so pripravili zelo učinkovito svetlobno inducibilno Dre rekombinazo (PA-Dre), dokazali, da uspešno regulira gene v specifičnih mišjih tkivih, razvili pa so tudi dvojni rekombinazni sistem CALID (ang. ''Cre-activated light-inducible Dre system'').1

==UPORABA REKOMBINAZ V SINTEZNI BIOLOGIJI==
Zaradi enostavne uporabe in velike specifičnosti se v sesalskih sistemih uporablja predvsem sistem Cre/loxP. Razvili so mnoge mutirane seve mišk, ki izražajo rekombinazo Cre pod določenimi tkivno specifičnimi promotorji. Taki sevi mišk so uporabni med drugim tudi kot modeli človeških bolezni.1,2

Novejši sistem je sistem Dre/rox, ki so ga odkrili v bakteriofagu D6. Rekombinaza Dre je homologna Cre, mesto rox pa se od mesta loxP razlikuje samo v trinajst nukleotidih od dvaintridesetih. Kljub podobnostim v veliki večini primerov ne prihaja do prečne rekombinacije med sistemoma, zato lahko z njima sestavljamo dvojne rekombinazne sisteme. Prednost Dre pred Cre je prav tako, da nima nobenih toksičnih učinkov na celice.2

V zadnjih nekaj desetletjih razvijajo inducibilne variante rekombinaznih sistemov Cre, poleg kemijsko inducibilnih tudi nekaj svetlobno inducibilnih sistemov, kot sta na primer CRY2-CIB1-PA-Cre in Magnets-PA-Cre. Sistem Magnets, ki se je v tej raziskavi izkazal kot bolj učinkovit, je od modre svetlobe odvisen dimerizacijski sistem, sestavljen iz dveh svetlobnih stikal, imenovanih pozitivni magnet (pMag) in negativni magnet (nMag). Gre za flavin vezavni fotoreceptor, izoliran iz glive. Svetlobno inducibilni sistemi imajo veliko prednosti, omogočajo večjo časovno in prostorsko specifičnost, višjo možnost nadzora in hitro penetracijo tkiva, prav tako pa svetloba za tkivo ni invazivna.1,3

==REZULTATI==
===IDENTIFIKACIJA CEPITVENEGA MESTA Dre===
Ker so vse dotedanje raziskave temeljile predvsem na cepljeni Cre rekombinazi, so na podlagi podatkov o njej sklepali na določena mesta cepitve, s katerimi bi Dre ločili na N- in C-končni del tako, da bi se jima ob ponovnem združenju povrnila rekombinazna aktivnost. Uporabili so računalniške metode in identificirali 6 takih mest. Najboljše rezultate do dobili pri treh načinih cepljenja, DreN60/DreC61, DreN150/DreC151 in DreN246/DreC247.1
===OPTIMIZACIJA PA-Dre===
Pri testiranju in vitro se je kot fuzijski partner, odgovoren za dimerizacijo, najbolje izkazal sistem Magnets in sicer v primeru, da so na N konec Dre vezali nMag in na C konec Dre pMag. Ugotovili so, da zmanjšajo ozadje z uporabo linkerja L4, ki hkrati tudi ni poslabšal možnosti rekombinacije. Da bi dodatno zmanjšali ozadje s subcelično lokalizacijo polovic Dre, so dodali jedrni lokalizacijski signal iz nukleoplazmina (NLSNLP) na C konec DreC247. Dosegli so dodatno zmanjšanje ozadja in kar 102,2-kratno povečanje luciferazne aktivnosti.1

Pri sestavljanju vektorja so želeli povezati tako optimizirana fuzijska partnerja Dre-N246-nMag (PA-DreN) in pMag-DreC247 -NLSNLP (PA-DreC). Povezali so ju na tak način, da so med oba zapisa dodali zapis za enega izmed samocepilnih peptidov 2A. Ugotovili so, da uporaba T2A, ki ima sicer manjšo avtokatalitično sposobnost od P2A, izboljša razmerje signal/šum, se je pa izkazalo, da je tako razmerje singal/šum, kot tudi učinkovitost rekombinacije boljša, če uporabimo dva ločena vektorja. Prav tako je učinkovitost rekombinacije višja kot pri celem divjem tipu rekombinaze Dre. Najbrž fuzija s sistemom Magnets povzroči nastanek konformacijske oblike z višjo aktivnostjo. Z molekulsko dinamiko so potem dokazali, da je vezava na DNA približno enako stabilna kot pri divjem tipu Dre.1

Prav tako so dokazali, da sistem razpolovljene Dre deluje tudi v fuziji z drugimi dimerizacijskimi sistemi. Preizkusili so dimerizacijski sistem, občutljiv na modro svetlobo Vivid (VVD) iz gliv, sistem za zaznavo rdeče svetlobe (PhyB-PIF3) in svetlobo valovne dolžine na meji z IR (Bphp1-Q-PAS1), pa tudi s kemičnim stikalom FKBP-FRB.1

===KARAKTERIZACIJA PA-Dre ''IN VITRO''===
Najprej so natančno določili čas osvetlitve z modro svetlobo in intenziteto odziva v celicah HEK-293T, transfeciranih s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-Rluc (luciferaza iz korale). Različno dolgo so jih izpostavili svetlobi ali jih pustili rasti v temi. Ugotovili so, da pri osvetlitvi med 4 in 32 ur luciferazna aktivnost opazno raste, nato pa doseže plato. Sistem je bil odziven na modro svetlobo intenzitete 0,25 do 4 mW/cm2, maksimum je dosegel pri 1 mW/cm2. Podobne rezultate so dobili tudi, če so uporabili drugi reporter, CMV-rox-stop-rox-zsGreen (zelen fluorescenčni protein). Sistem je dobro deloval tudi v drugih celičnih linijah iz drugih sesalskih tkiv. Da je sistem kompatibilen tudi z drugimi močnimi promotorji so sklepali, ker so pri uporabi različnih promotorjev dobili dobro razmerje singal/šum in močen odziv na obsevanje z modro svetlobo. Prav tako je Dre deloval na različnih mutiranih rox zaporedjih.1

Veliko prednost pred kemijsko inducibilnimi imajo svetlobno inducibilni sistemi v prostorskem smislu. To so dokazali tako, da so z uporabo maske osvetljevali petrijevke z rastočimi celicami, transfeciranimi s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-zsGreen. Fluorescenčni odziv so zaznali samo v osvetljenih celicah, meja med fluorescirajočimi in temnimi celicami pa je bila razmeroma ostra.1

===SVETLOBNA AKTIVACIJA EKSPRESIJE GENOV S SISTEMOM PA-Dre ''IN VIVO''===
Kot reporterski sistem so pri ''in vivo'' eksperimentih uporabili rox-stop-rox-Fluc (luciferaza iz kresničke). Skupaj s plazmidi z zapisom za PA-Dre so jih injicirali preko repne vene miši in jih tako dostavili v jetra. Miške so nato po 8 urah osvetljevali z modro svetlobo, kontrolno skupino pa so pustili v temi. Luciferazno aktivnost so merili 24 ur po injekciji. Dobili so podobne rezultate kot in vitro; 30 min trajajoča osvetlitev je povzročila opazno luciferazno aktivnost, ki pa je tudi naraščala z daljšim časom obsevanja. Ugotovili so tudi, da lahko uspešno rekombinacijo dosežejo že s 30 sekundnim obsevanjem, če so v miške injicirali večje količine plazmidov.1

Primerjava rekombinacije, dosežene s PA-Dre in do tedaj uporabljanje PA-Cre, je pokazala, da ima PA-Dre bistveno izboljšano razmerje signal/šum, kar kaže na to, da je novi sistem dosti bolj strikten. Dokazali pa so tudi, da lahko sistem uspešno dostavljajo v tarčna tkiva (jetra, možgane) preko z adenovirusi povezanih vektorjev (AAV).1

===SISTEM CALID===
S svetlobo inducirani rekombinazi Cre in Dre sta potencialno zelo uporabni pri prostorsko in časovno kontroliranem genskem inženirstvu, a imata nekaj težav pri specifični aktivaciji glede na tip celice. Da bi naredili celično specifični sistem, so razvili dvojni rekombinazni sistem CALID. Pripravljeni konstrukti so vsebovali tkivno specifična promotorja, zapis za Cre in z mesti loxP obkrožen invertiran zapis za PA-Dre. Pri genskem inženirstvu bi tako lahko dodali samo še gen, ki nas zanima, zapisan navzdol od stop kodona, ustrezno obkroženega z dvema rox mestoma. V celicah, kjer je prisotna rekombinaza Cre, bi ta popravila orientacijo rekombinaze PA-Dre, ta pa bi šele po osvetljevanju s svetlobo izrezala stop kodon in povzročila izražanje gena. S tem bi dosežegli elegantnejšo trojno kontrolo rekombinacije.1

AVV9 z zapisom za sistem CALID so skupaj z rekombinazo Cre injicirali v hipokampus odrasle miške R26-RSR-tdTomato. Po enem tednu so jih osvetljevali z optičnimi vlakni in opazili rdečo fluorescenco samo v nevronih, ki so vsebovali Cre in so bili obsevani. Primerjali so intenziteto fluorescence v odvisnosti od časa osvetlitve med 1s in 5 min. Ugotovili so pozitivno korelacijo med trajanjem osvetlitve in obsegom fluorescence, se pravi številom označenih nevronov. Obstajajo pa številni sevi mišk s tkivno specifičnim izražanjem rekombinaze Cre, v katerih bi bil sistem CALID uporaben. Raziskave so ponovili tudi v takih miškah, krezultati so bili primerljivi.1

==ZAKLJUČEK==
V raziskavi so opisali pripravo in optimizacijo sistema svetlobno inducibilne rekombinaze Dre. Ob prisotnosti modre svetlobe fuziran sistem Magnets poskrbi za dimerizacijo rekombinaze Dre, ki šele pod temi pogoji dobi povrnjeno aktivnost. Dokazali so delovanje sistema ''in vitro'' in tudi ''in vivo'' v mišjih modelih. Za lažjo časovno in prostorsko kontrolo rekombinacije so sestavili tudi od Cre odvisen svetlobno inducibilni Dre sistem, imenovan CALID. Z njim so dosegli specifično označevanje nevronov v mišjih možganih v željenem obsegu. Predvidevajo, da bodo s takim sistemom omogočili bolj detajlne raziskave v širšem področju bioloških znanostih.1
==VIRI==
1. H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.

2. M. Karimova, O. Baker, A. Camgoz, R. Naumann, F. Buchholz, K. Anastassiadis: A single reporter mouse line for Vika, Flp, Dre, and Cre-recombination. Sci. Rep. 2018, 8(1), str. 1–12.

3. F. Kawano, R. Okazaki, M. Yazawa, M. Sato: A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat. Chem. Biol. 2016, 12(12), str. 1059–1064.

Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih

2021-04-11T20:02:10Z

Nika Mikulič: /* SISTEM CALID */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33318209/ H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.]
==UVOD==
Precizno gensko inženirstvo, ki bi v organizmu delovalo specifično na posamezne celice, je v časovnem in prostorskem spektru težko dosegljivo. V te namene se pri sintezni biologiji uporabljajo različne mestno specifične rekombinaze, na primer tirozinske rekombinaze. Sposobne so uvajati delecije, integracije, inverzije in tudi translokacije genomske DNA in to brez pomožnih proteinov. Kljub temu, da so v preteklosti dokazali veliko uporabnost rekombinaznih sistemov v genskem inženirstvu, imajo sistemi s samo eno rekombinazo mnoge ovire, ki preprečujejo razvoj zapletenih genetskih modelov.1,2

V raziskavi, ki jo bom kratko opisala, so pripravili zelo učinkovito svetlobno inducibilno Dre rekombinazo (PA-Dre), dokazali, da uspešno regulira gene v specifičnih mišjih tkivih, razvili pa so tudi dvojni rekombinazni sistem CALID (ang. ''Cre-activated light-inducible Dre system'').1

==UPORABA REKOMBINAZ V SINTEZNI BIOLOGIJI==
Zaradi enostavne uporabe in velike specifičnosti se v sesalskih sistemih uporablja predvsem sistem Cre/loxP. Razvili so mnoge mutirane seve mišk, ki izražajo rekombinazo Cre pod določenimi tkivno specifičnimi promotorji. Taki sevi mišk so uporabni med drugim tudi kot modeli človeških bolezni.1,2

Novejši sistem je sistem Dre/rox, ki so ga odkrili v bakteriofagu D6. Rekombinaza Dre je homologna Cre, mesto rox pa se od mesta loxP razlikuje samo v trinajst nukleotidih od dvaintridesetih. Kljub podobnostim v veliki večini primerov ne prihaja do prečne rekombinacije med sistemoma, zato lahko z njima sestavljamo dvojne rekombinazne sisteme. Prednost Dre pred Cre je prav tako, da nima nobenih toksičnih učinkov na celice.2

V zadnjih nekaj desetletjih razvijajo inducibilne variante rekombinaznih sistemov Cre, poleg kemijsko inducibilnih tudi nekaj svetlobno inducibilnih sistemov, kot sta na primer CRY2-CIB1-PA-Cre in Magnets-PA-Cre. Sistem Magnets, ki se je v tej raziskavi izkazal kot bolj učinkovit, je od modre svetlobe odvisen dimerizacijski sistem, sestavljen iz dveh svetlobnih stikal, imenovanih pozitivni magnet (pMag) in negativni magnet (nMag). Gre za flavin vezavni fotoreceptor, izoliran iz glive. Svetlobno inducibilni sistemi imajo veliko prednosti, omogočajo večjo časovno in prostorsko specifičnost, višjo možnost nadzora in hitro penetracijo tkiva, prav tako pa svetloba za tkivo ni invazivna.1,3

==REZULTATI==
===IDENTIFIKACIJA CEPITVENEGA MESTA Dre===
Ker so vse dotedanje raziskave temeljile predvsem na cepljeni Cre rekombinazi, so na podlagi podatkov o njej sklepali na določena mesta cepitve, s katerimi bi Dre ločili na N- in C-končni del tako, da bi se jima ob ponovnem združenju povrnila rekombinazna aktivnost. Uporabili so računalniške metode in identificirali 6 takih mest. Najboljše rezultate do dobili pri treh načinih cepljenja, DreN60/DreC61, DreN150/DreC151 in DreN246/DreC247.1
===OPTIMIZACIJA PA-Dre===
Pri testiranju in vitro se je kot fuzijski partner, odgovoren za dimerizacijo, najbolje izkazal sistem Magnets in sicer v primeru, da so na N konec Dre vezali nMag in na C konec Dre pMag. Ugotovili so, da zmanjšajo ozadje z uporabo linkerja L4, ki hkrati tudi ni poslabšal možnosti rekombinacije. Da bi dodatno zmanjšali ozadje s subcelično lokalizacijo polovic Dre, so dodali jedrni lokalizacijski signal iz nukleoplazmina (NLSNLP) na C konec DreC247. Dosegli so dodatno zmanjšanje ozadja in kar 102,2-kratno povečanje luciferazne aktivnosti.1

Pri sestavljanju vektorja so želeli povezati tako optimizirana fuzijska partnerja Dre-N246-nMag (PA-DreN) in pMag-DreC247 -NLSNLP (PA-DreC). Povezali so ju na tak način, da so med oba zapisa dodali zapis za enega izmed samocepilnih peptidov 2A. Ugotovili so, da uporaba T2A, ki ima sicer manjšo avtokatalitično sposobnost od P2A, izboljša razmerje signal/šum, se je pa izkazalo, da je tako razmerje singal/šum, kot tudi učinkovitost rekombinacije boljša, če uporabimo dva ločena vektorja. Prav tako je učinkovitost rekombinacije višja kot pri celem divjem tipu rekombinaze Dre. Najbrž fuzija s sistemom Magnets povzroči nastanek konformacijske oblike z višjo aktivnostjo. Z molekulsko dinamiko so potem dokazali, da je vezava na DNA približno enako stabilna kot pri divjem tipu Dre.1

Prav tako so dokazali, da sistem razpolovljene Dre deluje tudi v fuziji z drugimi dimerizacijskimi sistemi. Preizkusili so dimerizacijski sistem, občutljiv na modro svetlobo Vivid (VVD) iz gliv, sistem za zaznavo rdeče svetlobe (PhyB-PIF3) in svetlobo valovne dolžine na meji z IR (Bphp1-Q-PAS1), pa tudi s kemičnim stikalom FKBP-FRB.1

===KARAKTERIZACIJA PA-Dre ''IN VITRO''===
Najprej so natančno določili čas osvetlitve z modro svetlobo in intenziteto odziva v celicah HEK-293T, transfeciranih s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-Rluc (luciferaza iz korale). Različno dolgo so jih izpostavili svetlobi ali jih pustili rasti v temi. Ugotovili so, da pri osvetlitvi med 4 in 32 ur luciferazna aktivnost opazno raste, nato pa doseže plato. Sistem je bil odziven na modro svetlobo intenzitete 0,25 do 4 mW/cm2, maksimum je dosegel pri 1 mW/cm2. Podobne rezultate so dobili tudi, če so uporabili drugi reporter, CMV-rox-stop-rox-zsGreen (zelen fluorescenčni protein). Sistem je dobro deloval tudi v drugih celičnih linijah iz drugih sesalskih tkiv. Da je sistem kompatibilen tudi z drugimi močnimi promotorji so sklepali, ker so pri uporabi različnih promotorjev dobili dobro razmerje singal/šum in močen odziv na obsevanje z modro svetlobo. Prav tako je Dre deloval na različnih mutiranih rox zaporedjih.1

Veliko prednost pred kemijsko inducibilnimi imajo svetlobno inducibilni sistemi v prostorskem smislu. To so dokazali tako, da so z uporabo maske osvetljevali petrijevke z rastočimi celicami, transfeciranimi s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-zsGreen. Fluorescenčni odziv so zaznali samo v osvetljenih celicah, meja med fluorescirajočimi in temnimi celicami pa je bila razmeroma ostra.1

===SVETLOBNA AKTIVACIJA EKSPRESIJE GENOV S SISTEMOM PA-Dre ''IN VIVO''===
Kot reporterski sistem so pri ''in vivo'' eksperimentih uporabili rox-stop-rox-Fluc (luciferaza iz kresničke). Skupaj s plazmidi z zapisom za PA-Dre so jih injicirali preko repne vene miši in jih tako dostavili v jetra. Miške so nato po 8 urah osvetljevali z modro svetlobo, kontrolno skupino pa so pustili v temi. Luciferazno aktivnost so merili 24 ur po injekciji. Dobili so podobne rezultate kot in vitro; 30 min trajajoča osvetlitev je povzročila opazno luciferazno aktivnost, ki pa je tudi naraščala z daljšim časom obsevanja. Ugotovili so tudi, da lahko uspešno rekombinacijo dosežejo že s 30 sekundnim obsevanjem, če so v miške injicirali večje količine plazmidov.1

Primerjava rekombinacije, dosežene s PA-Dre in do tedaj uporabljanje PA-Cre, je pokazala, da ima PA-Dre bistveno izboljšano razmerje signal/šum, kar kaže na to, da je novi sistem dosti bolj strikten. Dokazali pa so tudi, da lahko sistem uspešno dostavljajo v tarčna tkiva (jetra, možgane) preko z adenovirusi povezanih vektorjev (AAV).1

===SISTEM CALID===
S svetlobo inducirani rekombinazi Cre in Dre sta potencialno zelo uporabni pri prostorsko in časovno kontroliranem genskem inženirstvu, a imata nekaj težav pri specifični aktivaciji glede na tip celice. Da bi naredili celično specifični sistem, so razvili dvojni rekombinazni sistem CALID. Pripravljeni konstrukti so vsebovali tkivno specifična promotorja, zapis za Cre in z mesti loxP obkrožen invertiran zapis za PA-Dre. Pri genskem inženirstvu bi tako lahko dodali samo še gen, ki nas zanima, zapisan navzdol od stop kodona, ustrezno obkroženega z dvema rox mestoma. V celicah, kjer je prisotna rekombinaza Cre, bi ta popravila orientacijo rekombinaze PA-Dre, ta pa bi šele po osvetljevanju s svetlobo izrezala stop kodon in povzročila izražanje gena. S tem bi dosežegli elegantnejšo trojno kontrolo rekombinacije.1

AVV9 z zapisom za sistem CALID so skupaj z rekombinazo Cre injicirali v hipokampus odrasle miške R26-RSR-tdTomato. Po enem tednu so jih osvetljevali z optičnimi vlakni in opazili rdečo fluorescenco samo v nevronih, ki so vsebovali Cre in so bili obsevani. Primerjali so intenziteto fluorescence v odvisnosti od časa osvetlitve med 1s in 5 min. Ugotovili so pozitivno korelacijo med trajanjem osvetlitve in obsegom fluorescence, se pravi številom označenih nevronov. Obstajajo pa številni sevi mišk s tkivno specifičnim izražanjem rekombinaze Cre, v katerih bi bil sistem CALID uporaben. Raziskave so ponovili tudi v takih miškah, krezultati so bili primerljivi.1

==ZAKLJUČEK==
V raziskavi so opisali pripravo in optimizacijo sistema svetlobno inducibilne rekombinaze Dre. Ob prisotnosti modre svetlobe fuziran sistem Magnets poskrbi za dimerizacijo rekombinaze Dre, ki šele pod temi pogoji dobi povrnjeno aktivnost. Dokazali so delovanje sistema ''in vitro'' in tudi ''in vivo'' v mišjih modelih. Za lažjo časovno in prostorsko kontrolo rekombinacije so sestavili tudi od Cre odvisen svetlobno inducibilni Dre sistem, imenovan CALID. Z njim so dosegli specifično označevanje nevronov v mišjih možganih v željenem obsegu. Predvidevajo, da bodo s takim sistemom omogočili bolj detajlne raziskave v širšem področju bioloških znanostih.1
==VIRI==
1. H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.
2. M. Karimova, O. Baker, A. Camgoz, R. Naumann, F. Buchholz, K. Anastassiadis: A single reporter mouse line for Vika, Flp, Dre, and Cre-recombination. Sci. Rep. 2018, 8(1), str. 1–12.
3. F. Kawano, R. Okazaki, M. Yazawa, M. Sato: A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat. Chem. Biol. 2016, 12(12), str. 1059–1064.

Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih

2021-04-11T20:01:53Z

Nika Mikulič: /* SVETLOBNA AKTIVACIJA EKSPRESIJE GENOV S SISTEMOM PA-Dre IN VIVO */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33318209/ H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.]
==UVOD==
Precizno gensko inženirstvo, ki bi v organizmu delovalo specifično na posamezne celice, je v časovnem in prostorskem spektru težko dosegljivo. V te namene se pri sintezni biologiji uporabljajo različne mestno specifične rekombinaze, na primer tirozinske rekombinaze. Sposobne so uvajati delecije, integracije, inverzije in tudi translokacije genomske DNA in to brez pomožnih proteinov. Kljub temu, da so v preteklosti dokazali veliko uporabnost rekombinaznih sistemov v genskem inženirstvu, imajo sistemi s samo eno rekombinazo mnoge ovire, ki preprečujejo razvoj zapletenih genetskih modelov.1,2

V raziskavi, ki jo bom kratko opisala, so pripravili zelo učinkovito svetlobno inducibilno Dre rekombinazo (PA-Dre), dokazali, da uspešno regulira gene v specifičnih mišjih tkivih, razvili pa so tudi dvojni rekombinazni sistem CALID (ang. ''Cre-activated light-inducible Dre system'').1

==UPORABA REKOMBINAZ V SINTEZNI BIOLOGIJI==
Zaradi enostavne uporabe in velike specifičnosti se v sesalskih sistemih uporablja predvsem sistem Cre/loxP. Razvili so mnoge mutirane seve mišk, ki izražajo rekombinazo Cre pod določenimi tkivno specifičnimi promotorji. Taki sevi mišk so uporabni med drugim tudi kot modeli človeških bolezni.1,2

Novejši sistem je sistem Dre/rox, ki so ga odkrili v bakteriofagu D6. Rekombinaza Dre je homologna Cre, mesto rox pa se od mesta loxP razlikuje samo v trinajst nukleotidih od dvaintridesetih. Kljub podobnostim v veliki večini primerov ne prihaja do prečne rekombinacije med sistemoma, zato lahko z njima sestavljamo dvojne rekombinazne sisteme. Prednost Dre pred Cre je prav tako, da nima nobenih toksičnih učinkov na celice.2

V zadnjih nekaj desetletjih razvijajo inducibilne variante rekombinaznih sistemov Cre, poleg kemijsko inducibilnih tudi nekaj svetlobno inducibilnih sistemov, kot sta na primer CRY2-CIB1-PA-Cre in Magnets-PA-Cre. Sistem Magnets, ki se je v tej raziskavi izkazal kot bolj učinkovit, je od modre svetlobe odvisen dimerizacijski sistem, sestavljen iz dveh svetlobnih stikal, imenovanih pozitivni magnet (pMag) in negativni magnet (nMag). Gre za flavin vezavni fotoreceptor, izoliran iz glive. Svetlobno inducibilni sistemi imajo veliko prednosti, omogočajo večjo časovno in prostorsko specifičnost, višjo možnost nadzora in hitro penetracijo tkiva, prav tako pa svetloba za tkivo ni invazivna.1,3

==REZULTATI==
===IDENTIFIKACIJA CEPITVENEGA MESTA Dre===
Ker so vse dotedanje raziskave temeljile predvsem na cepljeni Cre rekombinazi, so na podlagi podatkov o njej sklepali na določena mesta cepitve, s katerimi bi Dre ločili na N- in C-končni del tako, da bi se jima ob ponovnem združenju povrnila rekombinazna aktivnost. Uporabili so računalniške metode in identificirali 6 takih mest. Najboljše rezultate do dobili pri treh načinih cepljenja, DreN60/DreC61, DreN150/DreC151 in DreN246/DreC247.1
===OPTIMIZACIJA PA-Dre===
Pri testiranju in vitro se je kot fuzijski partner, odgovoren za dimerizacijo, najbolje izkazal sistem Magnets in sicer v primeru, da so na N konec Dre vezali nMag in na C konec Dre pMag. Ugotovili so, da zmanjšajo ozadje z uporabo linkerja L4, ki hkrati tudi ni poslabšal možnosti rekombinacije. Da bi dodatno zmanjšali ozadje s subcelično lokalizacijo polovic Dre, so dodali jedrni lokalizacijski signal iz nukleoplazmina (NLSNLP) na C konec DreC247. Dosegli so dodatno zmanjšanje ozadja in kar 102,2-kratno povečanje luciferazne aktivnosti.1

Pri sestavljanju vektorja so želeli povezati tako optimizirana fuzijska partnerja Dre-N246-nMag (PA-DreN) in pMag-DreC247 -NLSNLP (PA-DreC). Povezali so ju na tak način, da so med oba zapisa dodali zapis za enega izmed samocepilnih peptidov 2A. Ugotovili so, da uporaba T2A, ki ima sicer manjšo avtokatalitično sposobnost od P2A, izboljša razmerje signal/šum, se je pa izkazalo, da je tako razmerje singal/šum, kot tudi učinkovitost rekombinacije boljša, če uporabimo dva ločena vektorja. Prav tako je učinkovitost rekombinacije višja kot pri celem divjem tipu rekombinaze Dre. Najbrž fuzija s sistemom Magnets povzroči nastanek konformacijske oblike z višjo aktivnostjo. Z molekulsko dinamiko so potem dokazali, da je vezava na DNA približno enako stabilna kot pri divjem tipu Dre.1

Prav tako so dokazali, da sistem razpolovljene Dre deluje tudi v fuziji z drugimi dimerizacijskimi sistemi. Preizkusili so dimerizacijski sistem, občutljiv na modro svetlobo Vivid (VVD) iz gliv, sistem za zaznavo rdeče svetlobe (PhyB-PIF3) in svetlobo valovne dolžine na meji z IR (Bphp1-Q-PAS1), pa tudi s kemičnim stikalom FKBP-FRB.1

===KARAKTERIZACIJA PA-Dre ''IN VITRO''===
Najprej so natančno določili čas osvetlitve z modro svetlobo in intenziteto odziva v celicah HEK-293T, transfeciranih s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-Rluc (luciferaza iz korale). Različno dolgo so jih izpostavili svetlobi ali jih pustili rasti v temi. Ugotovili so, da pri osvetlitvi med 4 in 32 ur luciferazna aktivnost opazno raste, nato pa doseže plato. Sistem je bil odziven na modro svetlobo intenzitete 0,25 do 4 mW/cm2, maksimum je dosegel pri 1 mW/cm2. Podobne rezultate so dobili tudi, če so uporabili drugi reporter, CMV-rox-stop-rox-zsGreen (zelen fluorescenčni protein). Sistem je dobro deloval tudi v drugih celičnih linijah iz drugih sesalskih tkiv. Da je sistem kompatibilen tudi z drugimi močnimi promotorji so sklepali, ker so pri uporabi različnih promotorjev dobili dobro razmerje singal/šum in močen odziv na obsevanje z modro svetlobo. Prav tako je Dre deloval na različnih mutiranih rox zaporedjih.1

Veliko prednost pred kemijsko inducibilnimi imajo svetlobno inducibilni sistemi v prostorskem smislu. To so dokazali tako, da so z uporabo maske osvetljevali petrijevke z rastočimi celicami, transfeciranimi s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-zsGreen. Fluorescenčni odziv so zaznali samo v osvetljenih celicah, meja med fluorescirajočimi in temnimi celicami pa je bila razmeroma ostra.1

===SVETLOBNA AKTIVACIJA EKSPRESIJE GENOV S SISTEMOM PA-Dre ''IN VIVO''===
Kot reporterski sistem so pri ''in vivo'' eksperimentih uporabili rox-stop-rox-Fluc (luciferaza iz kresničke). Skupaj s plazmidi z zapisom za PA-Dre so jih injicirali preko repne vene miši in jih tako dostavili v jetra. Miške so nato po 8 urah osvetljevali z modro svetlobo, kontrolno skupino pa so pustili v temi. Luciferazno aktivnost so merili 24 ur po injekciji. Dobili so podobne rezultate kot in vitro; 30 min trajajoča osvetlitev je povzročila opazno luciferazno aktivnost, ki pa je tudi naraščala z daljšim časom obsevanja. Ugotovili so tudi, da lahko uspešno rekombinacijo dosežejo že s 30 sekundnim obsevanjem, če so v miške injicirali večje količine plazmidov.1

Primerjava rekombinacije, dosežene s PA-Dre in do tedaj uporabljanje PA-Cre, je pokazala, da ima PA-Dre bistveno izboljšano razmerje signal/šum, kar kaže na to, da je novi sistem dosti bolj strikten. Dokazali pa so tudi, da lahko sistem uspešno dostavljajo v tarčna tkiva (jetra, možgane) preko z adenovirusi povezanih vektorjev (AAV).1

===SISTEM CALID===
S svetlobo inducirani rekombinazi Cre in Dre sta potencialno zelo uporabni pri prostorsko in časovno kontroliranem genskem inženirstvu, a imata nekaj težav pri specifični aktivaciji glede na tip celice. Da bi naredili celično specifični sistem, so razvili dvojni rekombinazni sistem CALID. Pripravljeni konstrukti so vsebovali tkivno specifična promotorja, zapis za Cre in z mesti loxP obkrožen invertiran zapis za PA-Dre. Pri genskem inženirstvu bi tako lahko dodali samo še gen, ki nas zanima, zapisan navzdol od stop kodona, ustrezno obkroženega z dvema rox mestoma. V celicah, kjer je prisotna rekombinaza Cre, bi ta popravila orientacijo rekombinaze PA-Dre, ta pa bi šele po osvetljevanju s svetlobo izrezala stop kodon in povzročila izražanje gena. S tem bi dosežegli elegantnejšo trojno kontrolo rekombinacije.1
AVV9 z zapisom za sistem CALID so skupaj z rekombinazo Cre injicirali v hipokampus odrasle miške R26-RSR-tdTomato. Po enem tednu so jih osvetljevali z optičnimi vlakni in opazili rdečo fluorescenco samo v nevronih, ki so vsebovali Cre in so bili obsevani. Primerjali so intenziteto fluorescence v odvisnosti od časa osvetlitve med 1s in 5 min. Ugotovili so pozitivno korelacijo med trajanjem osvetlitve in obsegom fluorescence, se pravi številom označenih nevronov. Obstajajo pa številni sevi mišk s tkivno specifičnim izražanjem rekombinaze Cre, v katerih bi bil sistem CALID uporaben. Raziskave so ponovili tudi v takih miškah, krezultati so bili primerljivi.1
==ZAKLJUČEK==
V raziskavi so opisali pripravo in optimizacijo sistema svetlobno inducibilne rekombinaze Dre. Ob prisotnosti modre svetlobe fuziran sistem Magnets poskrbi za dimerizacijo rekombinaze Dre, ki šele pod temi pogoji dobi povrnjeno aktivnost. Dokazali so delovanje sistema ''in vitro'' in tudi ''in vivo'' v mišjih modelih. Za lažjo časovno in prostorsko kontrolo rekombinacije so sestavili tudi od Cre odvisen svetlobno inducibilni Dre sistem, imenovan CALID. Z njim so dosegli specifično označevanje nevronov v mišjih možganih v željenem obsegu. Predvidevajo, da bodo s takim sistemom omogočili bolj detajlne raziskave v širšem področju bioloških znanostih.1
==VIRI==
1. H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.
2. M. Karimova, O. Baker, A. Camgoz, R. Naumann, F. Buchholz, K. Anastassiadis: A single reporter mouse line for Vika, Flp, Dre, and Cre-recombination. Sci. Rep. 2018, 8(1), str. 1–12.
3. F. Kawano, R. Okazaki, M. Yazawa, M. Sato: A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat. Chem. Biol. 2016, 12(12), str. 1059–1064.

Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih

2021-04-11T20:01:00Z

Nika Mikulič: /* KARAKTERIZACIJA PA-Dre IN VITRO */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33318209/ H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.]
==UVOD==
Precizno gensko inženirstvo, ki bi v organizmu delovalo specifično na posamezne celice, je v časovnem in prostorskem spektru težko dosegljivo. V te namene se pri sintezni biologiji uporabljajo različne mestno specifične rekombinaze, na primer tirozinske rekombinaze. Sposobne so uvajati delecije, integracije, inverzije in tudi translokacije genomske DNA in to brez pomožnih proteinov. Kljub temu, da so v preteklosti dokazali veliko uporabnost rekombinaznih sistemov v genskem inženirstvu, imajo sistemi s samo eno rekombinazo mnoge ovire, ki preprečujejo razvoj zapletenih genetskih modelov.1,2

V raziskavi, ki jo bom kratko opisala, so pripravili zelo učinkovito svetlobno inducibilno Dre rekombinazo (PA-Dre), dokazali, da uspešno regulira gene v specifičnih mišjih tkivih, razvili pa so tudi dvojni rekombinazni sistem CALID (ang. ''Cre-activated light-inducible Dre system'').1

==UPORABA REKOMBINAZ V SINTEZNI BIOLOGIJI==
Zaradi enostavne uporabe in velike specifičnosti se v sesalskih sistemih uporablja predvsem sistem Cre/loxP. Razvili so mnoge mutirane seve mišk, ki izražajo rekombinazo Cre pod določenimi tkivno specifičnimi promotorji. Taki sevi mišk so uporabni med drugim tudi kot modeli človeških bolezni.1,2

Novejši sistem je sistem Dre/rox, ki so ga odkrili v bakteriofagu D6. Rekombinaza Dre je homologna Cre, mesto rox pa se od mesta loxP razlikuje samo v trinajst nukleotidih od dvaintridesetih. Kljub podobnostim v veliki večini primerov ne prihaja do prečne rekombinacije med sistemoma, zato lahko z njima sestavljamo dvojne rekombinazne sisteme. Prednost Dre pred Cre je prav tako, da nima nobenih toksičnih učinkov na celice.2

V zadnjih nekaj desetletjih razvijajo inducibilne variante rekombinaznih sistemov Cre, poleg kemijsko inducibilnih tudi nekaj svetlobno inducibilnih sistemov, kot sta na primer CRY2-CIB1-PA-Cre in Magnets-PA-Cre. Sistem Magnets, ki se je v tej raziskavi izkazal kot bolj učinkovit, je od modre svetlobe odvisen dimerizacijski sistem, sestavljen iz dveh svetlobnih stikal, imenovanih pozitivni magnet (pMag) in negativni magnet (nMag). Gre za flavin vezavni fotoreceptor, izoliran iz glive. Svetlobno inducibilni sistemi imajo veliko prednosti, omogočajo večjo časovno in prostorsko specifičnost, višjo možnost nadzora in hitro penetracijo tkiva, prav tako pa svetloba za tkivo ni invazivna.1,3

==REZULTATI==
===IDENTIFIKACIJA CEPITVENEGA MESTA Dre===
Ker so vse dotedanje raziskave temeljile predvsem na cepljeni Cre rekombinazi, so na podlagi podatkov o njej sklepali na določena mesta cepitve, s katerimi bi Dre ločili na N- in C-končni del tako, da bi se jima ob ponovnem združenju povrnila rekombinazna aktivnost. Uporabili so računalniške metode in identificirali 6 takih mest. Najboljše rezultate do dobili pri treh načinih cepljenja, DreN60/DreC61, DreN150/DreC151 in DreN246/DreC247.1
===OPTIMIZACIJA PA-Dre===
Pri testiranju in vitro se je kot fuzijski partner, odgovoren za dimerizacijo, najbolje izkazal sistem Magnets in sicer v primeru, da so na N konec Dre vezali nMag in na C konec Dre pMag. Ugotovili so, da zmanjšajo ozadje z uporabo linkerja L4, ki hkrati tudi ni poslabšal možnosti rekombinacije. Da bi dodatno zmanjšali ozadje s subcelično lokalizacijo polovic Dre, so dodali jedrni lokalizacijski signal iz nukleoplazmina (NLSNLP) na C konec DreC247. Dosegli so dodatno zmanjšanje ozadja in kar 102,2-kratno povečanje luciferazne aktivnosti.1

Pri sestavljanju vektorja so želeli povezati tako optimizirana fuzijska partnerja Dre-N246-nMag (PA-DreN) in pMag-DreC247 -NLSNLP (PA-DreC). Povezali so ju na tak način, da so med oba zapisa dodali zapis za enega izmed samocepilnih peptidov 2A. Ugotovili so, da uporaba T2A, ki ima sicer manjšo avtokatalitično sposobnost od P2A, izboljša razmerje signal/šum, se je pa izkazalo, da je tako razmerje singal/šum, kot tudi učinkovitost rekombinacije boljša, če uporabimo dva ločena vektorja. Prav tako je učinkovitost rekombinacije višja kot pri celem divjem tipu rekombinaze Dre. Najbrž fuzija s sistemom Magnets povzroči nastanek konformacijske oblike z višjo aktivnostjo. Z molekulsko dinamiko so potem dokazali, da je vezava na DNA približno enako stabilna kot pri divjem tipu Dre.1

Prav tako so dokazali, da sistem razpolovljene Dre deluje tudi v fuziji z drugimi dimerizacijskimi sistemi. Preizkusili so dimerizacijski sistem, občutljiv na modro svetlobo Vivid (VVD) iz gliv, sistem za zaznavo rdeče svetlobe (PhyB-PIF3) in svetlobo valovne dolžine na meji z IR (Bphp1-Q-PAS1), pa tudi s kemičnim stikalom FKBP-FRB.1

===KARAKTERIZACIJA PA-Dre ''IN VITRO''===
Najprej so natančno določili čas osvetlitve z modro svetlobo in intenziteto odziva v celicah HEK-293T, transfeciranih s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-Rluc (luciferaza iz korale). Različno dolgo so jih izpostavili svetlobi ali jih pustili rasti v temi. Ugotovili so, da pri osvetlitvi med 4 in 32 ur luciferazna aktivnost opazno raste, nato pa doseže plato. Sistem je bil odziven na modro svetlobo intenzitete 0,25 do 4 mW/cm2, maksimum je dosegel pri 1 mW/cm2. Podobne rezultate so dobili tudi, če so uporabili drugi reporter, CMV-rox-stop-rox-zsGreen (zelen fluorescenčni protein). Sistem je dobro deloval tudi v drugih celičnih linijah iz drugih sesalskih tkiv. Da je sistem kompatibilen tudi z drugimi močnimi promotorji so sklepali, ker so pri uporabi različnih promotorjev dobili dobro razmerje singal/šum in močen odziv na obsevanje z modro svetlobo. Prav tako je Dre deloval na različnih mutiranih rox zaporedjih.1

Veliko prednost pred kemijsko inducibilnimi imajo svetlobno inducibilni sistemi v prostorskem smislu. To so dokazali tako, da so z uporabo maske osvetljevali petrijevke z rastočimi celicami, transfeciranimi s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-zsGreen. Fluorescenčni odziv so zaznali samo v osvetljenih celicah, meja med fluorescirajočimi in temnimi celicami pa je bila razmeroma ostra.1

===SVETLOBNA AKTIVACIJA EKSPRESIJE GENOV S SISTEMOM PA-Dre ''IN VIVO''===
Kot reporterski sistem so pri ''in vivo'' eksperimentih uporabili rox-stop-rox-Fluc (luciferaza iz kresničke). Skupaj s plazmidi z zapisom za PA-Dre so jih injicirali preko repne vene miši in jih tako dostavili v jetra. Miške so nato po 8 urah osvetljevali z modro svetlobo, kontrolno skupino pa so pustili v temi. Luciferazno aktivnost so merili 24 ur po injekciji. Dobili so podobne rezultate kot in vitro; 30 min trajajoča osvetlitev je povzročila opazno luciferazno aktivnost, ki pa je tudi naraščala z daljšim časom obsevanja. Ugotovili so tudi, da lahko uspešno rekombinacijo dosežejo že s 30 sekundnim obsevanjem, če so v miške injicirali večje količine plazmidov. Primerjava rekombinacije, dosežene s PA-Dre in do tedaj uporabljanje PA-Cre, je pokazala, da ima PA-Dre bistveno izboljšano razmerje signal/šum, kar kaže na to, da je novi sistem dosti bolj strikten.
Dokazali pa so tudi, da lahko sistem uspešno dostavljajo v tarčna tkiva (jetra, možgane) preko z adenovirusi povezanih vektorjev (AAV).1

===SISTEM CALID===
S svetlobo inducirani rekombinazi Cre in Dre sta potencialno zelo uporabni pri prostorsko in časovno kontroliranem genskem inženirstvu, a imata nekaj težav pri specifični aktivaciji glede na tip celice. Da bi naredili celično specifični sistem, so razvili dvojni rekombinazni sistem CALID. Pripravljeni konstrukti so vsebovali tkivno specifična promotorja, zapis za Cre in z mesti loxP obkrožen invertiran zapis za PA-Dre. Pri genskem inženirstvu bi tako lahko dodali samo še gen, ki nas zanima, zapisan navzdol od stop kodona, ustrezno obkroženega z dvema rox mestoma. V celicah, kjer je prisotna rekombinaza Cre, bi ta popravila orientacijo rekombinaze PA-Dre, ta pa bi šele po osvetljevanju s svetlobo izrezala stop kodon in povzročila izražanje gena. S tem bi dosežegli elegantnejšo trojno kontrolo rekombinacije.1
AVV9 z zapisom za sistem CALID so skupaj z rekombinazo Cre injicirali v hipokampus odrasle miške R26-RSR-tdTomato. Po enem tednu so jih osvetljevali z optičnimi vlakni in opazili rdečo fluorescenco samo v nevronih, ki so vsebovali Cre in so bili obsevani. Primerjali so intenziteto fluorescence v odvisnosti od časa osvetlitve med 1s in 5 min. Ugotovili so pozitivno korelacijo med trajanjem osvetlitve in obsegom fluorescence, se pravi številom označenih nevronov. Obstajajo pa številni sevi mišk s tkivno specifičnim izražanjem rekombinaze Cre, v katerih bi bil sistem CALID uporaben. Raziskave so ponovili tudi v takih miškah, krezultati so bili primerljivi.1
==ZAKLJUČEK==
V raziskavi so opisali pripravo in optimizacijo sistema svetlobno inducibilne rekombinaze Dre. Ob prisotnosti modre svetlobe fuziran sistem Magnets poskrbi za dimerizacijo rekombinaze Dre, ki šele pod temi pogoji dobi povrnjeno aktivnost. Dokazali so delovanje sistema ''in vitro'' in tudi ''in vivo'' v mišjih modelih. Za lažjo časovno in prostorsko kontrolo rekombinacije so sestavili tudi od Cre odvisen svetlobno inducibilni Dre sistem, imenovan CALID. Z njim so dosegli specifično označevanje nevronov v mišjih možganih v željenem obsegu. Predvidevajo, da bodo s takim sistemom omogočili bolj detajlne raziskave v širšem področju bioloških znanostih.1
==VIRI==
1. H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.
2. M. Karimova, O. Baker, A. Camgoz, R. Naumann, F. Buchholz, K. Anastassiadis: A single reporter mouse line for Vika, Flp, Dre, and Cre-recombination. Sci. Rep. 2018, 8(1), str. 1–12.
3. F. Kawano, R. Okazaki, M. Yazawa, M. Sato: A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat. Chem. Biol. 2016, 12(12), str. 1059–1064.

Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih

2021-04-11T20:00:05Z

Nika Mikulič: /* OPTIMIZACIJA PA-Dre */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33318209/ H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.]
==UVOD==
Precizno gensko inženirstvo, ki bi v organizmu delovalo specifično na posamezne celice, je v časovnem in prostorskem spektru težko dosegljivo. V te namene se pri sintezni biologiji uporabljajo različne mestno specifične rekombinaze, na primer tirozinske rekombinaze. Sposobne so uvajati delecije, integracije, inverzije in tudi translokacije genomske DNA in to brez pomožnih proteinov. Kljub temu, da so v preteklosti dokazali veliko uporabnost rekombinaznih sistemov v genskem inženirstvu, imajo sistemi s samo eno rekombinazo mnoge ovire, ki preprečujejo razvoj zapletenih genetskih modelov.1,2

V raziskavi, ki jo bom kratko opisala, so pripravili zelo učinkovito svetlobno inducibilno Dre rekombinazo (PA-Dre), dokazali, da uspešno regulira gene v specifičnih mišjih tkivih, razvili pa so tudi dvojni rekombinazni sistem CALID (ang. ''Cre-activated light-inducible Dre system'').1

==UPORABA REKOMBINAZ V SINTEZNI BIOLOGIJI==
Zaradi enostavne uporabe in velike specifičnosti se v sesalskih sistemih uporablja predvsem sistem Cre/loxP. Razvili so mnoge mutirane seve mišk, ki izražajo rekombinazo Cre pod določenimi tkivno specifičnimi promotorji. Taki sevi mišk so uporabni med drugim tudi kot modeli človeških bolezni.1,2

Novejši sistem je sistem Dre/rox, ki so ga odkrili v bakteriofagu D6. Rekombinaza Dre je homologna Cre, mesto rox pa se od mesta loxP razlikuje samo v trinajst nukleotidih od dvaintridesetih. Kljub podobnostim v veliki večini primerov ne prihaja do prečne rekombinacije med sistemoma, zato lahko z njima sestavljamo dvojne rekombinazne sisteme. Prednost Dre pred Cre je prav tako, da nima nobenih toksičnih učinkov na celice.2

V zadnjih nekaj desetletjih razvijajo inducibilne variante rekombinaznih sistemov Cre, poleg kemijsko inducibilnih tudi nekaj svetlobno inducibilnih sistemov, kot sta na primer CRY2-CIB1-PA-Cre in Magnets-PA-Cre. Sistem Magnets, ki se je v tej raziskavi izkazal kot bolj učinkovit, je od modre svetlobe odvisen dimerizacijski sistem, sestavljen iz dveh svetlobnih stikal, imenovanih pozitivni magnet (pMag) in negativni magnet (nMag). Gre za flavin vezavni fotoreceptor, izoliran iz glive. Svetlobno inducibilni sistemi imajo veliko prednosti, omogočajo večjo časovno in prostorsko specifičnost, višjo možnost nadzora in hitro penetracijo tkiva, prav tako pa svetloba za tkivo ni invazivna.1,3

==REZULTATI==
===IDENTIFIKACIJA CEPITVENEGA MESTA Dre===
Ker so vse dotedanje raziskave temeljile predvsem na cepljeni Cre rekombinazi, so na podlagi podatkov o njej sklepali na določena mesta cepitve, s katerimi bi Dre ločili na N- in C-končni del tako, da bi se jima ob ponovnem združenju povrnila rekombinazna aktivnost. Uporabili so računalniške metode in identificirali 6 takih mest. Najboljše rezultate do dobili pri treh načinih cepljenja, DreN60/DreC61, DreN150/DreC151 in DreN246/DreC247.1
===OPTIMIZACIJA PA-Dre===
Pri testiranju in vitro se je kot fuzijski partner, odgovoren za dimerizacijo, najbolje izkazal sistem Magnets in sicer v primeru, da so na N konec Dre vezali nMag in na C konec Dre pMag. Ugotovili so, da zmanjšajo ozadje z uporabo linkerja L4, ki hkrati tudi ni poslabšal možnosti rekombinacije. Da bi dodatno zmanjšali ozadje s subcelično lokalizacijo polovic Dre, so dodali jedrni lokalizacijski signal iz nukleoplazmina (NLSNLP) na C konec DreC247. Dosegli so dodatno zmanjšanje ozadja in kar 102,2-kratno povečanje luciferazne aktivnosti.1

Pri sestavljanju vektorja so želeli povezati tako optimizirana fuzijska partnerja Dre-N246-nMag (PA-DreN) in pMag-DreC247 -NLSNLP (PA-DreC). Povezali so ju na tak način, da so med oba zapisa dodali zapis za enega izmed samocepilnih peptidov 2A. Ugotovili so, da uporaba T2A, ki ima sicer manjšo avtokatalitično sposobnost od P2A, izboljša razmerje signal/šum, se je pa izkazalo, da je tako razmerje singal/šum, kot tudi učinkovitost rekombinacije boljša, če uporabimo dva ločena vektorja. Prav tako je učinkovitost rekombinacije višja kot pri celem divjem tipu rekombinaze Dre. Najbrž fuzija s sistemom Magnets povzroči nastanek konformacijske oblike z višjo aktivnostjo. Z molekulsko dinamiko so potem dokazali, da je vezava na DNA približno enako stabilna kot pri divjem tipu Dre.1

Prav tako so dokazali, da sistem razpolovljene Dre deluje tudi v fuziji z drugimi dimerizacijskimi sistemi. Preizkusili so dimerizacijski sistem, občutljiv na modro svetlobo Vivid (VVD) iz gliv, sistem za zaznavo rdeče svetlobe (PhyB-PIF3) in svetlobo valovne dolžine na meji z IR (Bphp1-Q-PAS1), pa tudi s kemičnim stikalom FKBP-FRB.1

===KARAKTERIZACIJA PA-Dre ''IN VITRO''===
Najprej so natančno določili čas osvetlitve z modro svetlobo in intenziteto odziva v celicah HEK-293T, transfeciranih s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-Rluc (luciferaza iz korale). Različno dolgo so jih izpostavili svetlobi ali jih pustili rasti v temi. Ugotovili so, da pri osvetlitvi med 4 in 32 ur luciferazna aktivnost opazno raste, nato pa doseže plato. Sistem je bil odziven na modro svetlobo intenzitete 0,25 do 4 mW/cm2, maksimum je dosegel pri 1 mW/cm2. Podobne rezultate so dobili tudi, če so uporabili drugi reporter, CMV-rox-stop-rox-zsGreen (zelen fluorescenčni protein). Sistem je dobro deloval tudi v drugih celičnih linijah iz drugih sesalskih tkiv. Da je sistem kompatibilen tudi z drugimi močnimi promotorji so sklepali, ker so pri uporabi različnih promotorjev dobili dobro razmerje singal/šum in močen odziv na obsevanje z modro svetlobo. Prav tako je Dre deloval na različnih mutiranih rox zaporedjih.
Veliko prednost pred kemijsko inducibilnimi imajo svetlobno inducibilni sistemi v prostorskem smislu. To so dokazali tako, da so z uporabo maske osvetljevali petrijevke z rastočimi celicami, transfeciranimi s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-zsGreen. Fluorescenčni odziv so zaznali samo v osvetljenih celicah, meja med fluorescirajočimi in temnimi celicami pa je bila razmeroma ostra.1

===SVETLOBNA AKTIVACIJA EKSPRESIJE GENOV S SISTEMOM PA-Dre ''IN VIVO''===
Kot reporterski sistem so pri ''in vivo'' eksperimentih uporabili rox-stop-rox-Fluc (luciferaza iz kresničke). Skupaj s plazmidi z zapisom za PA-Dre so jih injicirali preko repne vene miši in jih tako dostavili v jetra. Miške so nato po 8 urah osvetljevali z modro svetlobo, kontrolno skupino pa so pustili v temi. Luciferazno aktivnost so merili 24 ur po injekciji. Dobili so podobne rezultate kot in vitro; 30 min trajajoča osvetlitev je povzročila opazno luciferazno aktivnost, ki pa je tudi naraščala z daljšim časom obsevanja. Ugotovili so tudi, da lahko uspešno rekombinacijo dosežejo že s 30 sekundnim obsevanjem, če so v miške injicirali večje količine plazmidov. Primerjava rekombinacije, dosežene s PA-Dre in do tedaj uporabljanje PA-Cre, je pokazala, da ima PA-Dre bistveno izboljšano razmerje signal/šum, kar kaže na to, da je novi sistem dosti bolj strikten.
Dokazali pa so tudi, da lahko sistem uspešno dostavljajo v tarčna tkiva (jetra, možgane) preko z adenovirusi povezanih vektorjev (AAV).1

===SISTEM CALID===
S svetlobo inducirani rekombinazi Cre in Dre sta potencialno zelo uporabni pri prostorsko in časovno kontroliranem genskem inženirstvu, a imata nekaj težav pri specifični aktivaciji glede na tip celice. Da bi naredili celično specifični sistem, so razvili dvojni rekombinazni sistem CALID. Pripravljeni konstrukti so vsebovali tkivno specifična promotorja, zapis za Cre in z mesti loxP obkrožen invertiran zapis za PA-Dre. Pri genskem inženirstvu bi tako lahko dodali samo še gen, ki nas zanima, zapisan navzdol od stop kodona, ustrezno obkroženega z dvema rox mestoma. V celicah, kjer je prisotna rekombinaza Cre, bi ta popravila orientacijo rekombinaze PA-Dre, ta pa bi šele po osvetljevanju s svetlobo izrezala stop kodon in povzročila izražanje gena. S tem bi dosežegli elegantnejšo trojno kontrolo rekombinacije.1
AVV9 z zapisom za sistem CALID so skupaj z rekombinazo Cre injicirali v hipokampus odrasle miške R26-RSR-tdTomato. Po enem tednu so jih osvetljevali z optičnimi vlakni in opazili rdečo fluorescenco samo v nevronih, ki so vsebovali Cre in so bili obsevani. Primerjali so intenziteto fluorescence v odvisnosti od časa osvetlitve med 1s in 5 min. Ugotovili so pozitivno korelacijo med trajanjem osvetlitve in obsegom fluorescence, se pravi številom označenih nevronov. Obstajajo pa številni sevi mišk s tkivno specifičnim izražanjem rekombinaze Cre, v katerih bi bil sistem CALID uporaben. Raziskave so ponovili tudi v takih miškah, krezultati so bili primerljivi.1
==ZAKLJUČEK==
V raziskavi so opisali pripravo in optimizacijo sistema svetlobno inducibilne rekombinaze Dre. Ob prisotnosti modre svetlobe fuziran sistem Magnets poskrbi za dimerizacijo rekombinaze Dre, ki šele pod temi pogoji dobi povrnjeno aktivnost. Dokazali so delovanje sistema ''in vitro'' in tudi ''in vivo'' v mišjih modelih. Za lažjo časovno in prostorsko kontrolo rekombinacije so sestavili tudi od Cre odvisen svetlobno inducibilni Dre sistem, imenovan CALID. Z njim so dosegli specifično označevanje nevronov v mišjih možganih v željenem obsegu. Predvidevajo, da bodo s takim sistemom omogočili bolj detajlne raziskave v širšem področju bioloških znanostih.1
==VIRI==
1. H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.
2. M. Karimova, O. Baker, A. Camgoz, R. Naumann, F. Buchholz, K. Anastassiadis: A single reporter mouse line for Vika, Flp, Dre, and Cre-recombination. Sci. Rep. 2018, 8(1), str. 1–12.
3. F. Kawano, R. Okazaki, M. Yazawa, M. Sato: A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat. Chem. Biol. 2016, 12(12), str. 1059–1064.

Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih

2021-04-11T19:59:26Z

Nika Mikulič: /* UPORABA REKOMBINAZ V SINTEZNI BIOLOGIJI */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33318209/ H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.]
==UVOD==
Precizno gensko inženirstvo, ki bi v organizmu delovalo specifično na posamezne celice, je v časovnem in prostorskem spektru težko dosegljivo. V te namene se pri sintezni biologiji uporabljajo različne mestno specifične rekombinaze, na primer tirozinske rekombinaze. Sposobne so uvajati delecije, integracije, inverzije in tudi translokacije genomske DNA in to brez pomožnih proteinov. Kljub temu, da so v preteklosti dokazali veliko uporabnost rekombinaznih sistemov v genskem inženirstvu, imajo sistemi s samo eno rekombinazo mnoge ovire, ki preprečujejo razvoj zapletenih genetskih modelov.1,2

V raziskavi, ki jo bom kratko opisala, so pripravili zelo učinkovito svetlobno inducibilno Dre rekombinazo (PA-Dre), dokazali, da uspešno regulira gene v specifičnih mišjih tkivih, razvili pa so tudi dvojni rekombinazni sistem CALID (ang. ''Cre-activated light-inducible Dre system'').1

==UPORABA REKOMBINAZ V SINTEZNI BIOLOGIJI==
Zaradi enostavne uporabe in velike specifičnosti se v sesalskih sistemih uporablja predvsem sistem Cre/loxP. Razvili so mnoge mutirane seve mišk, ki izražajo rekombinazo Cre pod določenimi tkivno specifičnimi promotorji. Taki sevi mišk so uporabni med drugim tudi kot modeli človeških bolezni.1,2

Novejši sistem je sistem Dre/rox, ki so ga odkrili v bakteriofagu D6. Rekombinaza Dre je homologna Cre, mesto rox pa se od mesta loxP razlikuje samo v trinajst nukleotidih od dvaintridesetih. Kljub podobnostim v veliki večini primerov ne prihaja do prečne rekombinacije med sistemoma, zato lahko z njima sestavljamo dvojne rekombinazne sisteme. Prednost Dre pred Cre je prav tako, da nima nobenih toksičnih učinkov na celice.2

V zadnjih nekaj desetletjih razvijajo inducibilne variante rekombinaznih sistemov Cre, poleg kemijsko inducibilnih tudi nekaj svetlobno inducibilnih sistemov, kot sta na primer CRY2-CIB1-PA-Cre in Magnets-PA-Cre. Sistem Magnets, ki se je v tej raziskavi izkazal kot bolj učinkovit, je od modre svetlobe odvisen dimerizacijski sistem, sestavljen iz dveh svetlobnih stikal, imenovanih pozitivni magnet (pMag) in negativni magnet (nMag). Gre za flavin vezavni fotoreceptor, izoliran iz glive. Svetlobno inducibilni sistemi imajo veliko prednosti, omogočajo večjo časovno in prostorsko specifičnost, višjo možnost nadzora in hitro penetracijo tkiva, prav tako pa svetloba za tkivo ni invazivna.1,3

==REZULTATI==
===IDENTIFIKACIJA CEPITVENEGA MESTA Dre===
Ker so vse dotedanje raziskave temeljile predvsem na cepljeni Cre rekombinazi, so na podlagi podatkov o njej sklepali na določena mesta cepitve, s katerimi bi Dre ločili na N- in C-končni del tako, da bi se jima ob ponovnem združenju povrnila rekombinazna aktivnost. Uporabili so računalniške metode in identificirali 6 takih mest. Najboljše rezultate do dobili pri treh načinih cepljenja, DreN60/DreC61, DreN150/DreC151 in DreN246/DreC247.1
===OPTIMIZACIJA PA-Dre===
Pri testiranju in vitro se je kot fuzijski partner, odgovoren za dimerizacijo, najbolje izkazal sistem Magnets in sicer v primeru, da so na N konec Dre vezali nMag in na C konec Dre pMag. Ugotovili so, da zmanjšajo ozadje z uporabo linkerja L4, ki hkrati tudi ni poslabšal možnosti rekombinacije. Da bi dodatno zmanjšali ozadje s subcelično lokalizacijo polovic Dre, so dodali jedrni lokalizacijski signal iz nukleoplazmina (NLSNLP) na C konec DreC247. Dosegli so dodatno zmanjšanje ozadja in kar 102,2-kratno povečanje luciferazne aktivnosti.1
Pri sestavljanju vektorja so želeli povezati tako optimizirana fuzijska partnerja Dre-N246-nMag (PA-DreN) in pMag-DreC247 -NLSNLP (PA-DreC). Povezali so ju na tak način, da so med oba zapisa dodali zapis za enega izmed samocepilnih peptidov 2A. Ugotovili so, da uporaba T2A, ki ima sicer manjšo avtokatalitično sposobnost od P2A, izboljša razmerje signal/šum, se je pa izkazalo, da je tako razmerje singal/šum, kot tudi učinkovitost rekombinacije boljša, če uporabimo dva ločena vektorja. Prav tako je učinkovitost rekombinacije višja kot pri celem divjem tipu rekombinaze Dre. Najbrž fuzija s sistemom Magnets povzroči nastanek konformacijske oblike z višjo aktivnostjo. Z molekulsko dinamiko so potem dokazali, da je vezava na DNA približno enako stabilna kot pri divjem tipu Dre.1
Prav tako so dokazali, da sistem razpolovljene Dre deluje tudi v fuziji z drugimi dimerizacijskimi sistemi. Preizkusili so dimerizacijski sistem, občutljiv na modro svetlobo Vivid (VVD) iz gliv, sistem za zaznavo rdeče svetlobe (PhyB-PIF3) in svetlobo valovne dolžine na meji z IR (Bphp1-Q-PAS1), pa tudi s kemičnim stikalom FKBP-FRB.1
===KARAKTERIZACIJA PA-Dre ''IN VITRO''===
Najprej so natančno določili čas osvetlitve z modro svetlobo in intenziteto odziva v celicah HEK-293T, transfeciranih s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-Rluc (luciferaza iz korale). Različno dolgo so jih izpostavili svetlobi ali jih pustili rasti v temi. Ugotovili so, da pri osvetlitvi med 4 in 32 ur luciferazna aktivnost opazno raste, nato pa doseže plato. Sistem je bil odziven na modro svetlobo intenzitete 0,25 do 4 mW/cm2, maksimum je dosegel pri 1 mW/cm2. Podobne rezultate so dobili tudi, če so uporabili drugi reporter, CMV-rox-stop-rox-zsGreen (zelen fluorescenčni protein). Sistem je dobro deloval tudi v drugih celičnih linijah iz drugih sesalskih tkiv. Da je sistem kompatibilen tudi z drugimi močnimi promotorji so sklepali, ker so pri uporabi različnih promotorjev dobili dobro razmerje singal/šum in močen odziv na obsevanje z modro svetlobo. Prav tako je Dre deloval na različnih mutiranih rox zaporedjih.
Veliko prednost pred kemijsko inducibilnimi imajo svetlobno inducibilni sistemi v prostorskem smislu. To so dokazali tako, da so z uporabo maske osvetljevali petrijevke z rastočimi celicami, transfeciranimi s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-zsGreen. Fluorescenčni odziv so zaznali samo v osvetljenih celicah, meja med fluorescirajočimi in temnimi celicami pa je bila razmeroma ostra.1

===SVETLOBNA AKTIVACIJA EKSPRESIJE GENOV S SISTEMOM PA-Dre ''IN VIVO''===
Kot reporterski sistem so pri ''in vivo'' eksperimentih uporabili rox-stop-rox-Fluc (luciferaza iz kresničke). Skupaj s plazmidi z zapisom za PA-Dre so jih injicirali preko repne vene miši in jih tako dostavili v jetra. Miške so nato po 8 urah osvetljevali z modro svetlobo, kontrolno skupino pa so pustili v temi. Luciferazno aktivnost so merili 24 ur po injekciji. Dobili so podobne rezultate kot in vitro; 30 min trajajoča osvetlitev je povzročila opazno luciferazno aktivnost, ki pa je tudi naraščala z daljšim časom obsevanja. Ugotovili so tudi, da lahko uspešno rekombinacijo dosežejo že s 30 sekundnim obsevanjem, če so v miške injicirali večje količine plazmidov. Primerjava rekombinacije, dosežene s PA-Dre in do tedaj uporabljanje PA-Cre, je pokazala, da ima PA-Dre bistveno izboljšano razmerje signal/šum, kar kaže na to, da je novi sistem dosti bolj strikten.
Dokazali pa so tudi, da lahko sistem uspešno dostavljajo v tarčna tkiva (jetra, možgane) preko z adenovirusi povezanih vektorjev (AAV).1

===SISTEM CALID===
S svetlobo inducirani rekombinazi Cre in Dre sta potencialno zelo uporabni pri prostorsko in časovno kontroliranem genskem inženirstvu, a imata nekaj težav pri specifični aktivaciji glede na tip celice. Da bi naredili celično specifični sistem, so razvili dvojni rekombinazni sistem CALID. Pripravljeni konstrukti so vsebovali tkivno specifična promotorja, zapis za Cre in z mesti loxP obkrožen invertiran zapis za PA-Dre. Pri genskem inženirstvu bi tako lahko dodali samo še gen, ki nas zanima, zapisan navzdol od stop kodona, ustrezno obkroženega z dvema rox mestoma. V celicah, kjer je prisotna rekombinaza Cre, bi ta popravila orientacijo rekombinaze PA-Dre, ta pa bi šele po osvetljevanju s svetlobo izrezala stop kodon in povzročila izražanje gena. S tem bi dosežegli elegantnejšo trojno kontrolo rekombinacije.1
AVV9 z zapisom za sistem CALID so skupaj z rekombinazo Cre injicirali v hipokampus odrasle miške R26-RSR-tdTomato. Po enem tednu so jih osvetljevali z optičnimi vlakni in opazili rdečo fluorescenco samo v nevronih, ki so vsebovali Cre in so bili obsevani. Primerjali so intenziteto fluorescence v odvisnosti od časa osvetlitve med 1s in 5 min. Ugotovili so pozitivno korelacijo med trajanjem osvetlitve in obsegom fluorescence, se pravi številom označenih nevronov. Obstajajo pa številni sevi mišk s tkivno specifičnim izražanjem rekombinaze Cre, v katerih bi bil sistem CALID uporaben. Raziskave so ponovili tudi v takih miškah, krezultati so bili primerljivi.1
==ZAKLJUČEK==
V raziskavi so opisali pripravo in optimizacijo sistema svetlobno inducibilne rekombinaze Dre. Ob prisotnosti modre svetlobe fuziran sistem Magnets poskrbi za dimerizacijo rekombinaze Dre, ki šele pod temi pogoji dobi povrnjeno aktivnost. Dokazali so delovanje sistema ''in vitro'' in tudi ''in vivo'' v mišjih modelih. Za lažjo časovno in prostorsko kontrolo rekombinacije so sestavili tudi od Cre odvisen svetlobno inducibilni Dre sistem, imenovan CALID. Z njim so dosegli specifično označevanje nevronov v mišjih možganih v željenem obsegu. Predvidevajo, da bodo s takim sistemom omogočili bolj detajlne raziskave v širšem področju bioloških znanostih.1
==VIRI==
1. H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.
2. M. Karimova, O. Baker, A. Camgoz, R. Naumann, F. Buchholz, K. Anastassiadis: A single reporter mouse line for Vika, Flp, Dre, and Cre-recombination. Sci. Rep. 2018, 8(1), str. 1–12.
3. F. Kawano, R. Okazaki, M. Yazawa, M. Sato: A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat. Chem. Biol. 2016, 12(12), str. 1059–1064.

Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih

2021-04-11T19:59:07Z

Nika Mikulič: /* UVOD */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33318209/ H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.]
==UVOD==
Precizno gensko inženirstvo, ki bi v organizmu delovalo specifično na posamezne celice, je v časovnem in prostorskem spektru težko dosegljivo. V te namene se pri sintezni biologiji uporabljajo različne mestno specifične rekombinaze, na primer tirozinske rekombinaze. Sposobne so uvajati delecije, integracije, inverzije in tudi translokacije genomske DNA in to brez pomožnih proteinov. Kljub temu, da so v preteklosti dokazali veliko uporabnost rekombinaznih sistemov v genskem inženirstvu, imajo sistemi s samo eno rekombinazo mnoge ovire, ki preprečujejo razvoj zapletenih genetskih modelov.1,2

V raziskavi, ki jo bom kratko opisala, so pripravili zelo učinkovito svetlobno inducibilno Dre rekombinazo (PA-Dre), dokazali, da uspešno regulira gene v specifičnih mišjih tkivih, razvili pa so tudi dvojni rekombinazni sistem CALID (ang. ''Cre-activated light-inducible Dre system'').1

==UPORABA REKOMBINAZ V SINTEZNI BIOLOGIJI==
Zaradi enostavne uporabe in velike specifičnosti se v sesalskih sistemih uporablja predvsem sistem Cre/loxP. Razvili so mnoge mutirane seve mišk, ki izražajo rekombinazo Cre pod določenimi tkivno specifičnimi promotorji. Taki sevi mišk so uporabni med drugim tudi kot modeli človeških bolezni.1,2
Novejši sistem je sistem Dre/rox, ki so ga odkrili v bakteriofagu D6. Rekombinaza Dre je homologna Cre, mesto rox pa se od mesta loxP razlikuje samo v trinajst nukleotidih od dvaintridesetih. Kljub podobnostim v veliki večini primerov ne prihaja do prečne rekombinacije med sistemoma, zato lahko z njima sestavljamo dvojne rekombinazne sisteme. Prednost Dre pred Cre je prav tako, da nima nobenih toksičnih učinkov na celice.2
V zadnjih nekaj desetletjih razvijajo inducibilne variante rekombinaznih sistemov Cre, poleg kemijsko inducibilnih tudi nekaj svetlobno inducibilnih sistemov, kot sta na primer CRY2-CIB1-PA-Cre in Magnets-PA-Cre. Sistem Magnets, ki se je v tej raziskavi izkazal kot bolj učinkovit, je od modre svetlobe odvisen dimerizacijski sistem, sestavljen iz dveh svetlobnih stikal, imenovanih pozitivni magnet (pMag) in negativni magnet (nMag). Gre za flavin vezavni fotoreceptor, izoliran iz glive. Svetlobno inducibilni sistemi imajo veliko prednosti, omogočajo večjo časovno in prostorsko specifičnost, višjo možnost nadzora in hitro penetracijo tkiva, prav tako pa svetloba za tkivo ni invazivna.1,3
==REZULTATI==
===IDENTIFIKACIJA CEPITVENEGA MESTA Dre===
Ker so vse dotedanje raziskave temeljile predvsem na cepljeni Cre rekombinazi, so na podlagi podatkov o njej sklepali na določena mesta cepitve, s katerimi bi Dre ločili na N- in C-končni del tako, da bi se jima ob ponovnem združenju povrnila rekombinazna aktivnost. Uporabili so računalniške metode in identificirali 6 takih mest. Najboljše rezultate do dobili pri treh načinih cepljenja, DreN60/DreC61, DreN150/DreC151 in DreN246/DreC247.1
===OPTIMIZACIJA PA-Dre===
Pri testiranju in vitro se je kot fuzijski partner, odgovoren za dimerizacijo, najbolje izkazal sistem Magnets in sicer v primeru, da so na N konec Dre vezali nMag in na C konec Dre pMag. Ugotovili so, da zmanjšajo ozadje z uporabo linkerja L4, ki hkrati tudi ni poslabšal možnosti rekombinacije. Da bi dodatno zmanjšali ozadje s subcelično lokalizacijo polovic Dre, so dodali jedrni lokalizacijski signal iz nukleoplazmina (NLSNLP) na C konec DreC247. Dosegli so dodatno zmanjšanje ozadja in kar 102,2-kratno povečanje luciferazne aktivnosti.1
Pri sestavljanju vektorja so želeli povezati tako optimizirana fuzijska partnerja Dre-N246-nMag (PA-DreN) in pMag-DreC247 -NLSNLP (PA-DreC). Povezali so ju na tak način, da so med oba zapisa dodali zapis za enega izmed samocepilnih peptidov 2A. Ugotovili so, da uporaba T2A, ki ima sicer manjšo avtokatalitično sposobnost od P2A, izboljša razmerje signal/šum, se je pa izkazalo, da je tako razmerje singal/šum, kot tudi učinkovitost rekombinacije boljša, če uporabimo dva ločena vektorja. Prav tako je učinkovitost rekombinacije višja kot pri celem divjem tipu rekombinaze Dre. Najbrž fuzija s sistemom Magnets povzroči nastanek konformacijske oblike z višjo aktivnostjo. Z molekulsko dinamiko so potem dokazali, da je vezava na DNA približno enako stabilna kot pri divjem tipu Dre.1
Prav tako so dokazali, da sistem razpolovljene Dre deluje tudi v fuziji z drugimi dimerizacijskimi sistemi. Preizkusili so dimerizacijski sistem, občutljiv na modro svetlobo Vivid (VVD) iz gliv, sistem za zaznavo rdeče svetlobe (PhyB-PIF3) in svetlobo valovne dolžine na meji z IR (Bphp1-Q-PAS1), pa tudi s kemičnim stikalom FKBP-FRB.1
===KARAKTERIZACIJA PA-Dre ''IN VITRO''===
Najprej so natančno določili čas osvetlitve z modro svetlobo in intenziteto odziva v celicah HEK-293T, transfeciranih s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-Rluc (luciferaza iz korale). Različno dolgo so jih izpostavili svetlobi ali jih pustili rasti v temi. Ugotovili so, da pri osvetlitvi med 4 in 32 ur luciferazna aktivnost opazno raste, nato pa doseže plato. Sistem je bil odziven na modro svetlobo intenzitete 0,25 do 4 mW/cm2, maksimum je dosegel pri 1 mW/cm2. Podobne rezultate so dobili tudi, če so uporabili drugi reporter, CMV-rox-stop-rox-zsGreen (zelen fluorescenčni protein). Sistem je dobro deloval tudi v drugih celičnih linijah iz drugih sesalskih tkiv. Da je sistem kompatibilen tudi z drugimi močnimi promotorji so sklepali, ker so pri uporabi različnih promotorjev dobili dobro razmerje singal/šum in močen odziv na obsevanje z modro svetlobo. Prav tako je Dre deloval na različnih mutiranih rox zaporedjih.
Veliko prednost pred kemijsko inducibilnimi imajo svetlobno inducibilni sistemi v prostorskem smislu. To so dokazali tako, da so z uporabo maske osvetljevali petrijevke z rastočimi celicami, transfeciranimi s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-zsGreen. Fluorescenčni odziv so zaznali samo v osvetljenih celicah, meja med fluorescirajočimi in temnimi celicami pa je bila razmeroma ostra.1

===SVETLOBNA AKTIVACIJA EKSPRESIJE GENOV S SISTEMOM PA-Dre ''IN VIVO''===
Kot reporterski sistem so pri ''in vivo'' eksperimentih uporabili rox-stop-rox-Fluc (luciferaza iz kresničke). Skupaj s plazmidi z zapisom za PA-Dre so jih injicirali preko repne vene miši in jih tako dostavili v jetra. Miške so nato po 8 urah osvetljevali z modro svetlobo, kontrolno skupino pa so pustili v temi. Luciferazno aktivnost so merili 24 ur po injekciji. Dobili so podobne rezultate kot in vitro; 30 min trajajoča osvetlitev je povzročila opazno luciferazno aktivnost, ki pa je tudi naraščala z daljšim časom obsevanja. Ugotovili so tudi, da lahko uspešno rekombinacijo dosežejo že s 30 sekundnim obsevanjem, če so v miške injicirali večje količine plazmidov. Primerjava rekombinacije, dosežene s PA-Dre in do tedaj uporabljanje PA-Cre, je pokazala, da ima PA-Dre bistveno izboljšano razmerje signal/šum, kar kaže na to, da je novi sistem dosti bolj strikten.
Dokazali pa so tudi, da lahko sistem uspešno dostavljajo v tarčna tkiva (jetra, možgane) preko z adenovirusi povezanih vektorjev (AAV).1

===SISTEM CALID===
S svetlobo inducirani rekombinazi Cre in Dre sta potencialno zelo uporabni pri prostorsko in časovno kontroliranem genskem inženirstvu, a imata nekaj težav pri specifični aktivaciji glede na tip celice. Da bi naredili celično specifični sistem, so razvili dvojni rekombinazni sistem CALID. Pripravljeni konstrukti so vsebovali tkivno specifična promotorja, zapis za Cre in z mesti loxP obkrožen invertiran zapis za PA-Dre. Pri genskem inženirstvu bi tako lahko dodali samo še gen, ki nas zanima, zapisan navzdol od stop kodona, ustrezno obkroženega z dvema rox mestoma. V celicah, kjer je prisotna rekombinaza Cre, bi ta popravila orientacijo rekombinaze PA-Dre, ta pa bi šele po osvetljevanju s svetlobo izrezala stop kodon in povzročila izražanje gena. S tem bi dosežegli elegantnejšo trojno kontrolo rekombinacije.1
AVV9 z zapisom za sistem CALID so skupaj z rekombinazo Cre injicirali v hipokampus odrasle miške R26-RSR-tdTomato. Po enem tednu so jih osvetljevali z optičnimi vlakni in opazili rdečo fluorescenco samo v nevronih, ki so vsebovali Cre in so bili obsevani. Primerjali so intenziteto fluorescence v odvisnosti od časa osvetlitve med 1s in 5 min. Ugotovili so pozitivno korelacijo med trajanjem osvetlitve in obsegom fluorescence, se pravi številom označenih nevronov. Obstajajo pa številni sevi mišk s tkivno specifičnim izražanjem rekombinaze Cre, v katerih bi bil sistem CALID uporaben. Raziskave so ponovili tudi v takih miškah, krezultati so bili primerljivi.1
==ZAKLJUČEK==
V raziskavi so opisali pripravo in optimizacijo sistema svetlobno inducibilne rekombinaze Dre. Ob prisotnosti modre svetlobe fuziran sistem Magnets poskrbi za dimerizacijo rekombinaze Dre, ki šele pod temi pogoji dobi povrnjeno aktivnost. Dokazali so delovanje sistema ''in vitro'' in tudi ''in vivo'' v mišjih modelih. Za lažjo časovno in prostorsko kontrolo rekombinacije so sestavili tudi od Cre odvisen svetlobno inducibilni Dre sistem, imenovan CALID. Z njim so dosegli specifično označevanje nevronov v mišjih možganih v željenem obsegu. Predvidevajo, da bodo s takim sistemom omogočili bolj detajlne raziskave v širšem področju bioloških znanostih.1
==VIRI==
1. H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.
2. M. Karimova, O. Baker, A. Camgoz, R. Naumann, F. Buchholz, K. Anastassiadis: A single reporter mouse line for Vika, Flp, Dre, and Cre-recombination. Sci. Rep. 2018, 8(1), str. 1–12.
3. F. Kawano, R. Okazaki, M. Yazawa, M. Sato: A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat. Chem. Biol. 2016, 12(12), str. 1059–1064.

Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih

2021-04-11T19:58:49Z

Nika Mikulič: /* SVETLOBNA AKTIVACIJA EKSPRESIJE GENOV S SISTEMOM PA-Dre IN VIVO */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33318209/ H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.]
==UVOD==
Precizno gensko inženirstvo, ki bi v organizmu delovalo specifično na posamezne celice, je v časovnem in prostorskem spektru težko dosegljivo. V te namene se pri sintezni biologiji uporabljajo različne mestno specifične rekombinaze, na primer tirozinske rekombinaze. Sposobne so uvajati delecije, integracije, inverzije in tudi translokacije genomske DNA in to brez pomožnih proteinov. Kljub temu, da so v preteklosti dokazali veliko uporabnost rekombinaznih sistemov v genskem inženirstvu, imajo sistemi s samo eno rekombinazo mnoge ovire, ki preprečujejo razvoj zapletenih genetskih modelov.1,2
V raziskavi, ki jo bom kratko opisala, so pripravili zelo učinkovito svetlobno inducibilno Dre rekombinazo (PA-Dre), dokazali, da uspešno regulira gene v specifičnih mišjih tkivih, razvili pa so tudi dvojni rekombinazni sistem CALID (ang. ''Cre-activated light-inducible Dre system'').1
==UPORABA REKOMBINAZ V SINTEZNI BIOLOGIJI==
Zaradi enostavne uporabe in velike specifičnosti se v sesalskih sistemih uporablja predvsem sistem Cre/loxP. Razvili so mnoge mutirane seve mišk, ki izražajo rekombinazo Cre pod določenimi tkivno specifičnimi promotorji. Taki sevi mišk so uporabni med drugim tudi kot modeli človeških bolezni.1,2
Novejši sistem je sistem Dre/rox, ki so ga odkrili v bakteriofagu D6. Rekombinaza Dre je homologna Cre, mesto rox pa se od mesta loxP razlikuje samo v trinajst nukleotidih od dvaintridesetih. Kljub podobnostim v veliki večini primerov ne prihaja do prečne rekombinacije med sistemoma, zato lahko z njima sestavljamo dvojne rekombinazne sisteme. Prednost Dre pred Cre je prav tako, da nima nobenih toksičnih učinkov na celice.2
V zadnjih nekaj desetletjih razvijajo inducibilne variante rekombinaznih sistemov Cre, poleg kemijsko inducibilnih tudi nekaj svetlobno inducibilnih sistemov, kot sta na primer CRY2-CIB1-PA-Cre in Magnets-PA-Cre. Sistem Magnets, ki se je v tej raziskavi izkazal kot bolj učinkovit, je od modre svetlobe odvisen dimerizacijski sistem, sestavljen iz dveh svetlobnih stikal, imenovanih pozitivni magnet (pMag) in negativni magnet (nMag). Gre za flavin vezavni fotoreceptor, izoliran iz glive. Svetlobno inducibilni sistemi imajo veliko prednosti, omogočajo večjo časovno in prostorsko specifičnost, višjo možnost nadzora in hitro penetracijo tkiva, prav tako pa svetloba za tkivo ni invazivna.1,3
==REZULTATI==
===IDENTIFIKACIJA CEPITVENEGA MESTA Dre===
Ker so vse dotedanje raziskave temeljile predvsem na cepljeni Cre rekombinazi, so na podlagi podatkov o njej sklepali na določena mesta cepitve, s katerimi bi Dre ločili na N- in C-končni del tako, da bi se jima ob ponovnem združenju povrnila rekombinazna aktivnost. Uporabili so računalniške metode in identificirali 6 takih mest. Najboljše rezultate do dobili pri treh načinih cepljenja, DreN60/DreC61, DreN150/DreC151 in DreN246/DreC247.1
===OPTIMIZACIJA PA-Dre===
Pri testiranju in vitro se je kot fuzijski partner, odgovoren za dimerizacijo, najbolje izkazal sistem Magnets in sicer v primeru, da so na N konec Dre vezali nMag in na C konec Dre pMag. Ugotovili so, da zmanjšajo ozadje z uporabo linkerja L4, ki hkrati tudi ni poslabšal možnosti rekombinacije. Da bi dodatno zmanjšali ozadje s subcelično lokalizacijo polovic Dre, so dodali jedrni lokalizacijski signal iz nukleoplazmina (NLSNLP) na C konec DreC247. Dosegli so dodatno zmanjšanje ozadja in kar 102,2-kratno povečanje luciferazne aktivnosti.1
Pri sestavljanju vektorja so želeli povezati tako optimizirana fuzijska partnerja Dre-N246-nMag (PA-DreN) in pMag-DreC247 -NLSNLP (PA-DreC). Povezali so ju na tak način, da so med oba zapisa dodali zapis za enega izmed samocepilnih peptidov 2A. Ugotovili so, da uporaba T2A, ki ima sicer manjšo avtokatalitično sposobnost od P2A, izboljša razmerje signal/šum, se je pa izkazalo, da je tako razmerje singal/šum, kot tudi učinkovitost rekombinacije boljša, če uporabimo dva ločena vektorja. Prav tako je učinkovitost rekombinacije višja kot pri celem divjem tipu rekombinaze Dre. Najbrž fuzija s sistemom Magnets povzroči nastanek konformacijske oblike z višjo aktivnostjo. Z molekulsko dinamiko so potem dokazali, da je vezava na DNA približno enako stabilna kot pri divjem tipu Dre.1
Prav tako so dokazali, da sistem razpolovljene Dre deluje tudi v fuziji z drugimi dimerizacijskimi sistemi. Preizkusili so dimerizacijski sistem, občutljiv na modro svetlobo Vivid (VVD) iz gliv, sistem za zaznavo rdeče svetlobe (PhyB-PIF3) in svetlobo valovne dolžine na meji z IR (Bphp1-Q-PAS1), pa tudi s kemičnim stikalom FKBP-FRB.1
===KARAKTERIZACIJA PA-Dre ''IN VITRO''===
Najprej so natančno določili čas osvetlitve z modro svetlobo in intenziteto odziva v celicah HEK-293T, transfeciranih s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-Rluc (luciferaza iz korale). Različno dolgo so jih izpostavili svetlobi ali jih pustili rasti v temi. Ugotovili so, da pri osvetlitvi med 4 in 32 ur luciferazna aktivnost opazno raste, nato pa doseže plato. Sistem je bil odziven na modro svetlobo intenzitete 0,25 do 4 mW/cm2, maksimum je dosegel pri 1 mW/cm2. Podobne rezultate so dobili tudi, če so uporabili drugi reporter, CMV-rox-stop-rox-zsGreen (zelen fluorescenčni protein). Sistem je dobro deloval tudi v drugih celičnih linijah iz drugih sesalskih tkiv. Da je sistem kompatibilen tudi z drugimi močnimi promotorji so sklepali, ker so pri uporabi različnih promotorjev dobili dobro razmerje singal/šum in močen odziv na obsevanje z modro svetlobo. Prav tako je Dre deloval na različnih mutiranih rox zaporedjih.
Veliko prednost pred kemijsko inducibilnimi imajo svetlobno inducibilni sistemi v prostorskem smislu. To so dokazali tako, da so z uporabo maske osvetljevali petrijevke z rastočimi celicami, transfeciranimi s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-zsGreen. Fluorescenčni odziv so zaznali samo v osvetljenih celicah, meja med fluorescirajočimi in temnimi celicami pa je bila razmeroma ostra.1

===SVETLOBNA AKTIVACIJA EKSPRESIJE GENOV S SISTEMOM PA-Dre ''IN VIVO''===
Kot reporterski sistem so pri ''in vivo'' eksperimentih uporabili rox-stop-rox-Fluc (luciferaza iz kresničke). Skupaj s plazmidi z zapisom za PA-Dre so jih injicirali preko repne vene miši in jih tako dostavili v jetra. Miške so nato po 8 urah osvetljevali z modro svetlobo, kontrolno skupino pa so pustili v temi. Luciferazno aktivnost so merili 24 ur po injekciji. Dobili so podobne rezultate kot in vitro; 30 min trajajoča osvetlitev je povzročila opazno luciferazno aktivnost, ki pa je tudi naraščala z daljšim časom obsevanja. Ugotovili so tudi, da lahko uspešno rekombinacijo dosežejo že s 30 sekundnim obsevanjem, če so v miške injicirali večje količine plazmidov. Primerjava rekombinacije, dosežene s PA-Dre in do tedaj uporabljanje PA-Cre, je pokazala, da ima PA-Dre bistveno izboljšano razmerje signal/šum, kar kaže na to, da je novi sistem dosti bolj strikten.
Dokazali pa so tudi, da lahko sistem uspešno dostavljajo v tarčna tkiva (jetra, možgane) preko z adenovirusi povezanih vektorjev (AAV).1

===SISTEM CALID===
S svetlobo inducirani rekombinazi Cre in Dre sta potencialno zelo uporabni pri prostorsko in časovno kontroliranem genskem inženirstvu, a imata nekaj težav pri specifični aktivaciji glede na tip celice. Da bi naredili celično specifični sistem, so razvili dvojni rekombinazni sistem CALID. Pripravljeni konstrukti so vsebovali tkivno specifična promotorja, zapis za Cre in z mesti loxP obkrožen invertiran zapis za PA-Dre. Pri genskem inženirstvu bi tako lahko dodali samo še gen, ki nas zanima, zapisan navzdol od stop kodona, ustrezno obkroženega z dvema rox mestoma. V celicah, kjer je prisotna rekombinaza Cre, bi ta popravila orientacijo rekombinaze PA-Dre, ta pa bi šele po osvetljevanju s svetlobo izrezala stop kodon in povzročila izražanje gena. S tem bi dosežegli elegantnejšo trojno kontrolo rekombinacije.1
AVV9 z zapisom za sistem CALID so skupaj z rekombinazo Cre injicirali v hipokampus odrasle miške R26-RSR-tdTomato. Po enem tednu so jih osvetljevali z optičnimi vlakni in opazili rdečo fluorescenco samo v nevronih, ki so vsebovali Cre in so bili obsevani. Primerjali so intenziteto fluorescence v odvisnosti od časa osvetlitve med 1s in 5 min. Ugotovili so pozitivno korelacijo med trajanjem osvetlitve in obsegom fluorescence, se pravi številom označenih nevronov. Obstajajo pa številni sevi mišk s tkivno specifičnim izražanjem rekombinaze Cre, v katerih bi bil sistem CALID uporaben. Raziskave so ponovili tudi v takih miškah, krezultati so bili primerljivi.1
==ZAKLJUČEK==
V raziskavi so opisali pripravo in optimizacijo sistema svetlobno inducibilne rekombinaze Dre. Ob prisotnosti modre svetlobe fuziran sistem Magnets poskrbi za dimerizacijo rekombinaze Dre, ki šele pod temi pogoji dobi povrnjeno aktivnost. Dokazali so delovanje sistema ''in vitro'' in tudi ''in vivo'' v mišjih modelih. Za lažjo časovno in prostorsko kontrolo rekombinacije so sestavili tudi od Cre odvisen svetlobno inducibilni Dre sistem, imenovan CALID. Z njim so dosegli specifično označevanje nevronov v mišjih možganih v željenem obsegu. Predvidevajo, da bodo s takim sistemom omogočili bolj detajlne raziskave v širšem področju bioloških znanostih.1
==VIRI==
1. H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.
2. M. Karimova, O. Baker, A. Camgoz, R. Naumann, F. Buchholz, K. Anastassiadis: A single reporter mouse line for Vika, Flp, Dre, and Cre-recombination. Sci. Rep. 2018, 8(1), str. 1–12.
3. F. Kawano, R. Okazaki, M. Yazawa, M. Sato: A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat. Chem. Biol. 2016, 12(12), str. 1059–1064.

Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih

2021-04-11T19:58:21Z

Nika Mikulič: /* KARAKTERIZACIJA PA-Dre IN VITRO */

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33318209/ H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.]
==UVOD==
Precizno gensko inženirstvo, ki bi v organizmu delovalo specifično na posamezne celice, je v časovnem in prostorskem spektru težko dosegljivo. V te namene se pri sintezni biologiji uporabljajo različne mestno specifične rekombinaze, na primer tirozinske rekombinaze. Sposobne so uvajati delecije, integracije, inverzije in tudi translokacije genomske DNA in to brez pomožnih proteinov. Kljub temu, da so v preteklosti dokazali veliko uporabnost rekombinaznih sistemov v genskem inženirstvu, imajo sistemi s samo eno rekombinazo mnoge ovire, ki preprečujejo razvoj zapletenih genetskih modelov.1,2
V raziskavi, ki jo bom kratko opisala, so pripravili zelo učinkovito svetlobno inducibilno Dre rekombinazo (PA-Dre), dokazali, da uspešno regulira gene v specifičnih mišjih tkivih, razvili pa so tudi dvojni rekombinazni sistem CALID (ang. ''Cre-activated light-inducible Dre system'').1
==UPORABA REKOMBINAZ V SINTEZNI BIOLOGIJI==
Zaradi enostavne uporabe in velike specifičnosti se v sesalskih sistemih uporablja predvsem sistem Cre/loxP. Razvili so mnoge mutirane seve mišk, ki izražajo rekombinazo Cre pod določenimi tkivno specifičnimi promotorji. Taki sevi mišk so uporabni med drugim tudi kot modeli človeških bolezni.1,2
Novejši sistem je sistem Dre/rox, ki so ga odkrili v bakteriofagu D6. Rekombinaza Dre je homologna Cre, mesto rox pa se od mesta loxP razlikuje samo v trinajst nukleotidih od dvaintridesetih. Kljub podobnostim v veliki večini primerov ne prihaja do prečne rekombinacije med sistemoma, zato lahko z njima sestavljamo dvojne rekombinazne sisteme. Prednost Dre pred Cre je prav tako, da nima nobenih toksičnih učinkov na celice.2
V zadnjih nekaj desetletjih razvijajo inducibilne variante rekombinaznih sistemov Cre, poleg kemijsko inducibilnih tudi nekaj svetlobno inducibilnih sistemov, kot sta na primer CRY2-CIB1-PA-Cre in Magnets-PA-Cre. Sistem Magnets, ki se je v tej raziskavi izkazal kot bolj učinkovit, je od modre svetlobe odvisen dimerizacijski sistem, sestavljen iz dveh svetlobnih stikal, imenovanih pozitivni magnet (pMag) in negativni magnet (nMag). Gre za flavin vezavni fotoreceptor, izoliran iz glive. Svetlobno inducibilni sistemi imajo veliko prednosti, omogočajo večjo časovno in prostorsko specifičnost, višjo možnost nadzora in hitro penetracijo tkiva, prav tako pa svetloba za tkivo ni invazivna.1,3
==REZULTATI==
===IDENTIFIKACIJA CEPITVENEGA MESTA Dre===
Ker so vse dotedanje raziskave temeljile predvsem na cepljeni Cre rekombinazi, so na podlagi podatkov o njej sklepali na določena mesta cepitve, s katerimi bi Dre ločili na N- in C-končni del tako, da bi se jima ob ponovnem združenju povrnila rekombinazna aktivnost. Uporabili so računalniške metode in identificirali 6 takih mest. Najboljše rezultate do dobili pri treh načinih cepljenja, DreN60/DreC61, DreN150/DreC151 in DreN246/DreC247.1
===OPTIMIZACIJA PA-Dre===
Pri testiranju in vitro se je kot fuzijski partner, odgovoren za dimerizacijo, najbolje izkazal sistem Magnets in sicer v primeru, da so na N konec Dre vezali nMag in na C konec Dre pMag. Ugotovili so, da zmanjšajo ozadje z uporabo linkerja L4, ki hkrati tudi ni poslabšal možnosti rekombinacije. Da bi dodatno zmanjšali ozadje s subcelično lokalizacijo polovic Dre, so dodali jedrni lokalizacijski signal iz nukleoplazmina (NLSNLP) na C konec DreC247. Dosegli so dodatno zmanjšanje ozadja in kar 102,2-kratno povečanje luciferazne aktivnosti.1
Pri sestavljanju vektorja so želeli povezati tako optimizirana fuzijska partnerja Dre-N246-nMag (PA-DreN) in pMag-DreC247 -NLSNLP (PA-DreC). Povezali so ju na tak način, da so med oba zapisa dodali zapis za enega izmed samocepilnih peptidov 2A. Ugotovili so, da uporaba T2A, ki ima sicer manjšo avtokatalitično sposobnost od P2A, izboljša razmerje signal/šum, se je pa izkazalo, da je tako razmerje singal/šum, kot tudi učinkovitost rekombinacije boljša, če uporabimo dva ločena vektorja. Prav tako je učinkovitost rekombinacije višja kot pri celem divjem tipu rekombinaze Dre. Najbrž fuzija s sistemom Magnets povzroči nastanek konformacijske oblike z višjo aktivnostjo. Z molekulsko dinamiko so potem dokazali, da je vezava na DNA približno enako stabilna kot pri divjem tipu Dre.1
Prav tako so dokazali, da sistem razpolovljene Dre deluje tudi v fuziji z drugimi dimerizacijskimi sistemi. Preizkusili so dimerizacijski sistem, občutljiv na modro svetlobo Vivid (VVD) iz gliv, sistem za zaznavo rdeče svetlobe (PhyB-PIF3) in svetlobo valovne dolžine na meji z IR (Bphp1-Q-PAS1), pa tudi s kemičnim stikalom FKBP-FRB.1
===KARAKTERIZACIJA PA-Dre ''IN VITRO''===
Najprej so natančno določili čas osvetlitve z modro svetlobo in intenziteto odziva v celicah HEK-293T, transfeciranih s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-Rluc (luciferaza iz korale). Različno dolgo so jih izpostavili svetlobi ali jih pustili rasti v temi. Ugotovili so, da pri osvetlitvi med 4 in 32 ur luciferazna aktivnost opazno raste, nato pa doseže plato. Sistem je bil odziven na modro svetlobo intenzitete 0,25 do 4 mW/cm2, maksimum je dosegel pri 1 mW/cm2. Podobne rezultate so dobili tudi, če so uporabili drugi reporter, CMV-rox-stop-rox-zsGreen (zelen fluorescenčni protein). Sistem je dobro deloval tudi v drugih celičnih linijah iz drugih sesalskih tkiv. Da je sistem kompatibilen tudi z drugimi močnimi promotorji so sklepali, ker so pri uporabi različnih promotorjev dobili dobro razmerje singal/šum in močen odziv na obsevanje z modro svetlobo. Prav tako je Dre deloval na različnih mutiranih rox zaporedjih.
Veliko prednost pred kemijsko inducibilnimi imajo svetlobno inducibilni sistemi v prostorskem smislu. To so dokazali tako, da so z uporabo maske osvetljevali petrijevke z rastočimi celicami, transfeciranimi s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-zsGreen. Fluorescenčni odziv so zaznali samo v osvetljenih celicah, meja med fluorescirajočimi in temnimi celicami pa je bila razmeroma ostra.1

===SVETLOBNA AKTIVACIJA EKSPRESIJE GENOV S SISTEMOM PA-Dre ''IN VIVO''===
Kot reporterski sistem so pri ''in vivo'' eksperimentih uporabili rox-stop-rox-Fluc (luciferaza iz kresničke). Skupaj s plazmidi z zapisom za PA-Dre so jih injicirali preko repne vene miši in jih tako dostavili v jetra. Miške so nato po 8 urah osvetljevali z modro svetlobo, kontrolno skupino pa so pustili v temi. Luciferazno aktivnost so merili 24 ur po injekciji. Dobili so podobne rezultate kot in vitro; 30 min trajajoča osvetlitev je povzročila opazno luciferazno aktivnost, ki pa je tudi naraščala z daljšim časom obsevanja. Ugotovili so tudi, da lahko uspešno rekombinacijo dosežejo že s 30 sekundnim obsevanjem, če so v miške injicirali večje količine plazmidov.1
Primerjava rekombinacije, dosežene s PA-Dre in do tedaj uporabljanje PA-Cre, je pokazala, da ima PA-Dre bistveno izboljšano razmerje signal/šum, kar kaže na to, da je novi sistem dosti bolj strikten.1
Dokazali pa so tudi, da lahko sistem uspešno dostavljajo v tarčna tkiva (jetra, možgane) preko z adenovirusi povezanih vektorjev (AAV).1
===SISTEM CALID===
S svetlobo inducirani rekombinazi Cre in Dre sta potencialno zelo uporabni pri prostorsko in časovno kontroliranem genskem inženirstvu, a imata nekaj težav pri specifični aktivaciji glede na tip celice. Da bi naredili celično specifični sistem, so razvili dvojni rekombinazni sistem CALID. Pripravljeni konstrukti so vsebovali tkivno specifična promotorja, zapis za Cre in z mesti loxP obkrožen invertiran zapis za PA-Dre. Pri genskem inženirstvu bi tako lahko dodali samo še gen, ki nas zanima, zapisan navzdol od stop kodona, ustrezno obkroženega z dvema rox mestoma. V celicah, kjer je prisotna rekombinaza Cre, bi ta popravila orientacijo rekombinaze PA-Dre, ta pa bi šele po osvetljevanju s svetlobo izrezala stop kodon in povzročila izražanje gena. S tem bi dosežegli elegantnejšo trojno kontrolo rekombinacije.1
AVV9 z zapisom za sistem CALID so skupaj z rekombinazo Cre injicirali v hipokampus odrasle miške R26-RSR-tdTomato. Po enem tednu so jih osvetljevali z optičnimi vlakni in opazili rdečo fluorescenco samo v nevronih, ki so vsebovali Cre in so bili obsevani. Primerjali so intenziteto fluorescence v odvisnosti od časa osvetlitve med 1s in 5 min. Ugotovili so pozitivno korelacijo med trajanjem osvetlitve in obsegom fluorescence, se pravi številom označenih nevronov. Obstajajo pa številni sevi mišk s tkivno specifičnim izražanjem rekombinaze Cre, v katerih bi bil sistem CALID uporaben. Raziskave so ponovili tudi v takih miškah, krezultati so bili primerljivi.1
==ZAKLJUČEK==
V raziskavi so opisali pripravo in optimizacijo sistema svetlobno inducibilne rekombinaze Dre. Ob prisotnosti modre svetlobe fuziran sistem Magnets poskrbi za dimerizacijo rekombinaze Dre, ki šele pod temi pogoji dobi povrnjeno aktivnost. Dokazali so delovanje sistema ''in vitro'' in tudi ''in vivo'' v mišjih modelih. Za lažjo časovno in prostorsko kontrolo rekombinacije so sestavili tudi od Cre odvisen svetlobno inducibilni Dre sistem, imenovan CALID. Z njim so dosegli specifično označevanje nevronov v mišjih možganih v željenem obsegu. Predvidevajo, da bodo s takim sistemom omogočili bolj detajlne raziskave v širšem področju bioloških znanostih.1
==VIRI==
1. H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.
2. M. Karimova, O. Baker, A. Camgoz, R. Naumann, F. Buchholz, K. Anastassiadis: A single reporter mouse line for Vika, Flp, Dre, and Cre-recombination. Sci. Rep. 2018, 8(1), str. 1–12.
3. F. Kawano, R. Okazaki, M. Yazawa, M. Sato: A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat. Chem. Biol. 2016, 12(12), str. 1059–1064.

Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih

2021-04-11T19:57:20Z

Nika Mikulič: New page: Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33318209/ H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recomb...

Izhodiščni članek: [https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33318209/ H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.]
==UVOD==
Precizno gensko inženirstvo, ki bi v organizmu delovalo specifično na posamezne celice, je v časovnem in prostorskem spektru težko dosegljivo. V te namene se pri sintezni biologiji uporabljajo različne mestno specifične rekombinaze, na primer tirozinske rekombinaze. Sposobne so uvajati delecije, integracije, inverzije in tudi translokacije genomske DNA in to brez pomožnih proteinov. Kljub temu, da so v preteklosti dokazali veliko uporabnost rekombinaznih sistemov v genskem inženirstvu, imajo sistemi s samo eno rekombinazo mnoge ovire, ki preprečujejo razvoj zapletenih genetskih modelov.1,2
V raziskavi, ki jo bom kratko opisala, so pripravili zelo učinkovito svetlobno inducibilno Dre rekombinazo (PA-Dre), dokazali, da uspešno regulira gene v specifičnih mišjih tkivih, razvili pa so tudi dvojni rekombinazni sistem CALID (ang. ''Cre-activated light-inducible Dre system'').1
==UPORABA REKOMBINAZ V SINTEZNI BIOLOGIJI==
Zaradi enostavne uporabe in velike specifičnosti se v sesalskih sistemih uporablja predvsem sistem Cre/loxP. Razvili so mnoge mutirane seve mišk, ki izražajo rekombinazo Cre pod določenimi tkivno specifičnimi promotorji. Taki sevi mišk so uporabni med drugim tudi kot modeli človeških bolezni.1,2
Novejši sistem je sistem Dre/rox, ki so ga odkrili v bakteriofagu D6. Rekombinaza Dre je homologna Cre, mesto rox pa se od mesta loxP razlikuje samo v trinajst nukleotidih od dvaintridesetih. Kljub podobnostim v veliki večini primerov ne prihaja do prečne rekombinacije med sistemoma, zato lahko z njima sestavljamo dvojne rekombinazne sisteme. Prednost Dre pred Cre je prav tako, da nima nobenih toksičnih učinkov na celice.2
V zadnjih nekaj desetletjih razvijajo inducibilne variante rekombinaznih sistemov Cre, poleg kemijsko inducibilnih tudi nekaj svetlobno inducibilnih sistemov, kot sta na primer CRY2-CIB1-PA-Cre in Magnets-PA-Cre. Sistem Magnets, ki se je v tej raziskavi izkazal kot bolj učinkovit, je od modre svetlobe odvisen dimerizacijski sistem, sestavljen iz dveh svetlobnih stikal, imenovanih pozitivni magnet (pMag) in negativni magnet (nMag). Gre za flavin vezavni fotoreceptor, izoliran iz glive. Svetlobno inducibilni sistemi imajo veliko prednosti, omogočajo večjo časovno in prostorsko specifičnost, višjo možnost nadzora in hitro penetracijo tkiva, prav tako pa svetloba za tkivo ni invazivna.1,3
==REZULTATI==
===IDENTIFIKACIJA CEPITVENEGA MESTA Dre===
Ker so vse dotedanje raziskave temeljile predvsem na cepljeni Cre rekombinazi, so na podlagi podatkov o njej sklepali na določena mesta cepitve, s katerimi bi Dre ločili na N- in C-končni del tako, da bi se jima ob ponovnem združenju povrnila rekombinazna aktivnost. Uporabili so računalniške metode in identificirali 6 takih mest. Najboljše rezultate do dobili pri treh načinih cepljenja, DreN60/DreC61, DreN150/DreC151 in DreN246/DreC247.1
===OPTIMIZACIJA PA-Dre===
Pri testiranju in vitro se je kot fuzijski partner, odgovoren za dimerizacijo, najbolje izkazal sistem Magnets in sicer v primeru, da so na N konec Dre vezali nMag in na C konec Dre pMag. Ugotovili so, da zmanjšajo ozadje z uporabo linkerja L4, ki hkrati tudi ni poslabšal možnosti rekombinacije. Da bi dodatno zmanjšali ozadje s subcelično lokalizacijo polovic Dre, so dodali jedrni lokalizacijski signal iz nukleoplazmina (NLSNLP) na C konec DreC247. Dosegli so dodatno zmanjšanje ozadja in kar 102,2-kratno povečanje luciferazne aktivnosti.1
Pri sestavljanju vektorja so želeli povezati tako optimizirana fuzijska partnerja Dre-N246-nMag (PA-DreN) in pMag-DreC247 -NLSNLP (PA-DreC). Povezali so ju na tak način, da so med oba zapisa dodali zapis za enega izmed samocepilnih peptidov 2A. Ugotovili so, da uporaba T2A, ki ima sicer manjšo avtokatalitično sposobnost od P2A, izboljša razmerje signal/šum, se je pa izkazalo, da je tako razmerje singal/šum, kot tudi učinkovitost rekombinacije boljša, če uporabimo dva ločena vektorja. Prav tako je učinkovitost rekombinacije višja kot pri celem divjem tipu rekombinaze Dre. Najbrž fuzija s sistemom Magnets povzroči nastanek konformacijske oblike z višjo aktivnostjo. Z molekulsko dinamiko so potem dokazali, da je vezava na DNA približno enako stabilna kot pri divjem tipu Dre.1
Prav tako so dokazali, da sistem razpolovljene Dre deluje tudi v fuziji z drugimi dimerizacijskimi sistemi. Preizkusili so dimerizacijski sistem, občutljiv na modro svetlobo Vivid (VVD) iz gliv, sistem za zaznavo rdeče svetlobe (PhyB-PIF3) in svetlobo valovne dolžine na meji z IR (Bphp1-Q-PAS1), pa tudi s kemičnim stikalom FKBP-FRB.1
===KARAKTERIZACIJA PA-Dre ''IN VITRO''===
Najprej so natančno določili čas osvetlitve z modro svetlobo in intenziteto odziva v celicah HEK-293T, transfeciranih s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-Rluc (luciferaza iz korale). Različno dolgo so jih izpostavili svetlobi ali jih pustili rasti v temi. Ugotovili so, da pri osvetlitvi med 4 in 32 ur luciferazna aktivnost opazno raste, nato pa doseže plato. Sistem je bil odziven na modro svetlobo intenzitete 0,25 do 4 mW/cm2, maksimum je dosegel pri 1 mW/cm2. Podobne rezultate so dobili tudi, če so uporabili drugi reporter, CMV-rox-stop-rox-zsGreen (zelen fluorescenčni protein). Sistem je dobro deloval tudi v drugih celičnih linijah iz drugih sesalskih tkiv. Da je sistem kompatibilen tudi z drugimi močnimi promotorji so sklepali, ker so pri uporabi različnih promotorjev dobili dobro razmerje singal/šum in močen odziv na obsevanje z modro svetlobo. Prav tako je Dre deloval na različnih mutiranih rox zaporedjih.1
Veliko prednost pred kemijsko inducibilnimi imajo svetlobno inducibilni sistemi v prostorskem smislu. To so dokazali tako, da so z uporabo maske osvetljevali petrijevke z rastočimi celicami, transfeciranimi s PA-Dre in reporterjem rox-stop-rox-zsGreen. Fluorescenčni odziv so zaznali samo v osvetljenih celicah, meja med fluorescirajočimi in temnimi celicami pa je bila razmeroma ostra.1
===SVETLOBNA AKTIVACIJA EKSPRESIJE GENOV S SISTEMOM PA-Dre ''IN VIVO''===
Kot reporterski sistem so pri ''in vivo'' eksperimentih uporabili rox-stop-rox-Fluc (luciferaza iz kresničke). Skupaj s plazmidi z zapisom za PA-Dre so jih injicirali preko repne vene miši in jih tako dostavili v jetra. Miške so nato po 8 urah osvetljevali z modro svetlobo, kontrolno skupino pa so pustili v temi. Luciferazno aktivnost so merili 24 ur po injekciji. Dobili so podobne rezultate kot in vitro; 30 min trajajoča osvetlitev je povzročila opazno luciferazno aktivnost, ki pa je tudi naraščala z daljšim časom obsevanja. Ugotovili so tudi, da lahko uspešno rekombinacijo dosežejo že s 30 sekundnim obsevanjem, če so v miške injicirali večje količine plazmidov.1
Primerjava rekombinacije, dosežene s PA-Dre in do tedaj uporabljanje PA-Cre, je pokazala, da ima PA-Dre bistveno izboljšano razmerje signal/šum, kar kaže na to, da je novi sistem dosti bolj strikten.1
Dokazali pa so tudi, da lahko sistem uspešno dostavljajo v tarčna tkiva (jetra, možgane) preko z adenovirusi povezanih vektorjev (AAV).1
===SISTEM CALID===
S svetlobo inducirani rekombinazi Cre in Dre sta potencialno zelo uporabni pri prostorsko in časovno kontroliranem genskem inženirstvu, a imata nekaj težav pri specifični aktivaciji glede na tip celice. Da bi naredili celično specifični sistem, so razvili dvojni rekombinazni sistem CALID. Pripravljeni konstrukti so vsebovali tkivno specifična promotorja, zapis za Cre in z mesti loxP obkrožen invertiran zapis za PA-Dre. Pri genskem inženirstvu bi tako lahko dodali samo še gen, ki nas zanima, zapisan navzdol od stop kodona, ustrezno obkroženega z dvema rox mestoma. V celicah, kjer je prisotna rekombinaza Cre, bi ta popravila orientacijo rekombinaze PA-Dre, ta pa bi šele po osvetljevanju s svetlobo izrezala stop kodon in povzročila izražanje gena. S tem bi dosežegli elegantnejšo trojno kontrolo rekombinacije.1
AVV9 z zapisom za sistem CALID so skupaj z rekombinazo Cre injicirali v hipokampus odrasle miške R26-RSR-tdTomato. Po enem tednu so jih osvetljevali z optičnimi vlakni in opazili rdečo fluorescenco samo v nevronih, ki so vsebovali Cre in so bili obsevani. Primerjali so intenziteto fluorescence v odvisnosti od časa osvetlitve med 1s in 5 min. Ugotovili so pozitivno korelacijo med trajanjem osvetlitve in obsegom fluorescence, se pravi številom označenih nevronov. Obstajajo pa številni sevi mišk s tkivno specifičnim izražanjem rekombinaze Cre, v katerih bi bil sistem CALID uporaben. Raziskave so ponovili tudi v takih miškah, krezultati so bili primerljivi.1
==ZAKLJUČEK==
V raziskavi so opisali pripravo in optimizacijo sistema svetlobno inducibilne rekombinaze Dre. Ob prisotnosti modre svetlobe fuziran sistem Magnets poskrbi za dimerizacijo rekombinaze Dre, ki šele pod temi pogoji dobi povrnjeno aktivnost. Dokazali so delovanje sistema ''in vitro'' in tudi ''in vivo'' v mišjih modelih. Za lažjo časovno in prostorsko kontrolo rekombinacije so sestavili tudi od Cre odvisen svetlobno inducibilni Dre sistem, imenovan CALID. Z njim so dosegli specifično označevanje nevronov v mišjih možganih v željenem obsegu. Predvidevajo, da bodo s takim sistemom omogočili bolj detajlne raziskave v širšem področju bioloških znanostih.1
==VIRI==
1. H. Li, Q. Zhang, Y. Gu, Y. Wu, Y. Wang, L. Wang, S. Feng, Y. Hu, Y. Zheng, … D. Li: Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2021, 117(52), str. 33426–33435.
2. M. Karimova, O. Baker, A. Camgoz, R. Naumann, F. Buchholz, K. Anastassiadis: A single reporter mouse line for Vika, Flp, Dre, and Cre-recombination. Sci. Rep. 2018, 8(1), str. 1–12.
3. F. Kawano, R. Okazaki, M. Yazawa, M. Sato: A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat. Chem. Biol. 2016, 12(12), str. 1059–1064.

BNT-seminar

2021-03-09T09:39:54Z

Nika Mikulič:

= Bionanotehnologija 2021- seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==

{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Vpisna številka'''
30170005 
30019058 
30019057 
30170131 
30170078 
30170177 
30200324 
30019063 
30170103 
30170002 
30200319 
30200309 
30200320 
30019056 
30200311 
30200306 
30170243 
30019051 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
16.3.2021 
16.3.2021 
30.3.2021 
6.4.2021 
6.4.2021 
13.4.2021 
13.4.2021 
20.4.2021 
4.5.2021 
4.5.2021 
23.3.2021 
20.4.2020 
6.4.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
18.5.2021 
4.5.2021 
11.5.2021 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent1'''
Anamarija Agnič 
Aljaž Bratina 
Barbara Slapnik 
Tina Kolenc Milavec 
Klementina Polanec 
Martin Špendl 
Tjaša Mlakar 
Sara Laznik 
Martina Lokar 
Doroteja Armič 
Martin Špendl 
Saša Slabe 
Mateja Žvipelj 
Špela Supej 
Urška Fajdiga 
Ernestina Lavrih 
Nika Mikulič Vernik 
Liza Ulčakar 
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent2'''
Urška Pečarič Strnad 
Urška Zagorc 
Sara Laznik 
Luka Gnidovec 
Irma Zeljković 
Jernej Imperl 
Barbara Slapnik 
Urša Lovše 
Mateja Žvipelj 
Neža Pavko 
Almina Tahirović 
Nika Mikulič Vernik 
Urška Fajdiga 
Saša Slabe 
Klementina Polanec 
Tjaša Mlakar 
Ajda Godec 
Jernej Imperl 
|-

==Naloga==
Pripravite projektno nalogo iz področja Bionanotehnologije. Najpomembnejša je originalna ideja za nek izvedljiv projekt, ki pa mora biti takšen, da pritegne investitorje. Ker je pomembno tudi kako boste to naredili, morate predstaviti tudi metodo in ne samo ideje. Natančno morate vedeti, kako boste projekt izvedli.

Predlagana struktura teksta:
* Uvod
* Predstavitev problema, znanstvena izhodišča, cilji
* Izvedba projekta, metodologija, tehnike, materiali, vprašanja, hipoteze
* Literatura

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* Elektronska verzija seminarja: avtor, naslov projekta, razširjeni povzetek projekta- 350-400 besed (brez literature) in grafični povzetek (čez približno pol strani). Vse naj bo na maksimalno dveh straneh, a ne sme vsebovati manj kot 350 besed (sem se ne šteje literatura).
* Elektronsko verzijo seminarja oddajte en dan pred predstavitvijo, kasneje pa boste vsebino še prekopirali na za to določeno spletno stran, predstavitev pa eno uro pred seminarjem na [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ strežnik].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo XY minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenta morate predlagati vsaj eno izboljšavo predstavljenega projekta.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke poimenujete po naslednjem modelu:
* 20_nano_Priimek.doc za seminar, npr. 20_nano_Craik_Venter.doc
* 20_nano_Priimek.ppt za prezentacijo, npr. 20_nano_Craik_Venter.ppt

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov

2019-04-15T18:25:10Z

Nika Mikulič: /* RAZISKAVA O VPLIVU NA OMEJITEV HORIZONTALNEGA PRENOSA GENOV S POMOČJO CRISPR PRI BAKTERIJAH STAPHYLOCOCCUS */

==UVOD==
Horizontalni prenos genov predstavlja velik doprinos k diverziteti v evoluciji, ni pa nujno zmeraj ugoden; lahko je celo škodljiv. Zato so bakterije in arheje razvile sistem regulacije horizontalnega prenosa genov, imenovan CRISPR/Cas. Tak imunski sistem vase integrira kose (vmesnike) DNA bakteriofaga, za zagotovitev odpornosti nanj pa potrebuje tudi proteine Cas. Sistem CRISPR/Cas deluje na plazmidno DNA in ne na sprocesirano RNA, kar je sicer značilno za evkarionte.

== ODKRITJE VLOGE CRISPR/Cas PRI OMEJEVANJU VNOSA PLAZMIDOV==

===HORIZONTALNI PRENOS GENOV===

Horizontalni ali lateralni prenos genov je prenos DNA iz enega enoceličarja na drugega. Prisoten je predvsem pri prokariontih, se pa pojavlja tudi pri evkariontskih organizmih. Za razliko od vertikalnega prenosa, kjer gre za prenos starševskih genov na potomce, tu celice prevzemajo gene iz okolice oz. od drugih organizmov. Tako pride do prenosa med različnimi vrstami. Poznamo tri glavne načine prenosa genov: transformacijo, konjugacijo in transdukcijo. Pri transformaciji gre za sprejem tuje, prosto plavajoče molekule DNA iz okolice, ki je na primer do tja prišla iz nekega drugega mrtvega mikroorganizma. Pri tem je pomembno, da so celice, ki sprejemajo tujo DNA, kompetentne. Kompetentnost je začasno stanje, ki se pojavi kot odziv na stresne spremembe v okolju. Pri naravni transformaciji postanejo kompetentne v nekem specifičnem času svojega življenja, medtem ko pri umetni transformaciji kompetentnost izzovemo z različnimi solmi (npr. CaCl2) oz. z opazno spremembo temperature. Transdukcija poteka z bakteriofagi, ki prenašajo DNA iz druge bakterijske celice. Pogoj za konjugacijo pa je, da morata biti dve celici začasno fizično povezani. Prek te povezave nato preide DNA v drug enocelični organizem. Ves zapis za konjugacijo se nahaja na konjugativnih plazmidih, izmed katerih je najbolj preučen F plazmid, ki se nahaja v donorski bakteriji (F+). Donorska bakterija sintetizira na svoji površini konjugativni pilus, s katerim prepozna prejemniško bakterijo (F-). Ob vezavi nanjo se pilus skrajša, s čimer sta si bakteriji bližje, med njima pa se vzpostavi konjugativna pora. Na mestu OriT pride do reza ene od verig F plazmida. Prerezana enoverižna DNA vstopi v F- s 5'-koncem, pri čemer se hkrati sintetizirata manjkajoča dela verige v obeh bakterijah. Nato se prenesena DNA zaokroži, s čimer dobimo novo donorsko bakterijo. Začetki odkritij horizontalnega prenosa genov segajo v leto 1959, ko so s transdukcijo prenesli genetski material ''Escherichie coli'' v ''Salmonello Typhimurium''. Bolj razsežno pa so pojav začeli spremljati, ko so ugotovili, da je vse več bakterij odpornih na vse več različnih antibiotikov, česar ni bilo mogoče pojasniti z vertikalnim prenosom genov.

V laboratoriju so prenos genov izvajali na način, ki je preprostejši od naštetih mehanizmov. Ovojnico enoceličarja so predrli mehansko, s ''pre-stresanjem'' z zrnci stekla. Analogija takšnega prenosa se dogaja tudi v naravi. Delci peska v reki se na primer s pomočjo vodnega toka povzdignejo iz tal, pri čemer prihaja do mehanskega drgnjenja s številnimi mikroorganizmi, ki se v vrtincu nahajajo. S predrtjem ovojnice, lahko tuja DNA vstopi v predrt organizem. Ovojnico lahko predremo tudi z občutnim spreminjanjem temperature, zdaj pa to počnejo predvsem z elektroporacijo, metodo odkrito pred štirimi desetletji. Elektroporacija je enostaven način, s katerim prenesemo dedni material z izpostavitvijo mikroorganizmov močnim, kratkim, visoko-električno napetostnim pulzom. Ti ovojnico naluknjajo tako, da lahko DNA med celicami prehaja. Če je ovojnica naluknjana ravno dovolj, da mikroorganizem še vedno preživi, ko DNA vstopi v celico, se v večini primerov začne tuja DNA izražati. Ker prej omenjeni glavni mehanizmi temeljijo na proteinih, katerih delovanje je zelo omejeno in so se razvili šele tekom evolucije, se je Slovenec dr. Tadej Kotnik začel spraševati, če obstaja preprost fizikalni mehanizem, ki deluje že vse od nastanka življenja. Analogijo elektroporacije v laboratoriju je našel v nevihtni streli ter napisal študijo o nevihtni streli kot naravnem mehanizmu prenosa genov ter jo objavil v reviji Physics of Life Reviews. Njegovo razmišljanje temelji na sledečih dejstvih; dnevno udari na zemeljsko površje več 10 milijonov strel. Kjer ob zemljo udari strela, se elektroporira en kubični meter, na katerem živi od 100 do 1000 milijonov mikroorganizmov. Po prej opisanem mehanizmu elektroporacije lahko v naravi pride do prenosa genov na veliko preprostejši način in omogoča vnos tujega genskega materiala tako v prokarionte kot tudi evkarionte.

===IMUNSKI SISTEM CRISPR/Cas===

Sistem CRISPR/Cas deluje kot imunski sistem bakterij in arhej. Deluje tako, da koščke tuje DNA po vstopu v celico integrira v lokus CRISPR. Take koščke imenujemo vmesniki (prekinjajo pa jih t. i. ponovitve) in služijo kot nekakšen spomin imunskega sistema. Ta se v procesu transkripcije prepiše v molekulo crRNA (CRISPR RNA), ki usmerja proteine Cas na tarčno zaporedje. Proteini Cas so endonukleaze, ki tako prepoznajo specifično tujo DNA, jo cepijo in razgradijo.

===RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE ''STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS''===

Da so vmesniki v resnici homologi tujih plazmidov, so sprva ugotovili z ''in silico'' analizami, ki so vodile do različnih hipotez o vlogah sistema CRISPR. V raziskavi iz leta 2007 so analizirali več sevov bakterije ''Streptococcus thermophilus'' za katere je značilno, da imajo dva lokusa CRISPR, oni pa so se omejili predvsem na CRISPR1.

Najprej so preverili hipotezo, da se med pridobitvijo odpornosti spremeni bakterijski lokus CRISPR. Izbrali so sev ''Streptococcus thermophilus'' DGCC7710 divjega tipa (WT) in dva virulentna bakteriofaga, fag 858 in fag 2972, katerih genoma sta 93 % identična. Neodvisno med sabo so pripravili devet različnih mutantov bakterije z izpostavitvijo okužbi s fagom 858, fagom 2972 ali obema hkrati (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F1.large.jpg]), nato pa so analizirali njihov lokus CRISPR. V divjem tipu bakterij je bilo opaznih 32, v mutantih pa še dodatnih 1 do 4 vmesnikov. Po pričakovanjih iz prejšnjih poskusov so ugotovili, da se novi vmesniki vstavijo predvsem v vodilno zaporedje lokusa CRISPR. S sekvenciranjem so našli podobnost med dodatnimi vmesniki v mutiranih sevih in genomom fagov, katerim so bili izpostavljeni. Zanimivo je bilo, da so bile podobnosti najdene po celotnem genomu virusa, na kodirajočih in nekodirajočih zaporedjih. S temi ugotovitvami so dokazali, da se lokus CRISPR po okužbi z virusom spremeni tako, da v lastno zaporedje vstavi dodatne vmesnike, ki jih pridobi iz DNA virusa.

Opazili so, da je bila od tega, kateri vmesnik se je v lokus CRISPR vstavil, odvisna tudi rezistenca na fage; pri sevih, v katerih je bil vstavljeni vmesnik 100 % enak zaporedju faga, se je pojavila odpornost. Ker sta faga 858 in 2972 93 % identična, so vmesniki iz bolj ohranjenih regij (vmesniki S3, S6, S7) povzročili odpornost na oba faga. V primerih, ko pa je bilo med 29 – 30 nukleotidi prisotnih 1 – 15 nukleotidnih polimorfizmov, pa tak vmesnik (vmesnik S1, S2, S4, S5 in S8) ni več povzročil rezistence na oba, ampak samo na fag, kateremu je bil izpostavljen. Prav tako je v mutantih, v katerih je bilo vstavljenih več vmesnikov, bila odpornost višja. Med seboj so primerjali tudi odpornost bakterij po tem, ko so iz lokusa CRISPR izbrisali ali dodali vmesnike (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F3.large.jpg]). Iz mutanta WTΦ858+S1S2 so odstranili vmesnika S1 in S2, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858. Ko so mutantu WTΦ2972+S4 zamenjali vmesnik S4 za S1 in S2, je bila bakterija odporna na fag 858. Mutantu WTΦ858+S1S2 so nato med gene Cas in CRIPSR1 vstavili zapis za eno samo ponovitev, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858, čeprav sta bila vmesnika S1 in S2 v lokusu še zmeraj prisotna. To dokazuje, da vmesniki sami po sebi ne povzročijo odpornosti.

Ker je že obstajala hipoteza, da so pri tem procesu pomembni tudi Cas geni, so v istem mutantu WTΦ858+S1S2 izbrisali gen ''cas5'' ali ''cas7''. Bakterija z izbrisanim genom ''cas5'' ni bila več odporna na fag 858, iz česar so sklepali, da Cas5 deluje kot nukleaza (ker vsebuje HNH-nukleazni motiv). V bakteriji z inaktiviranim genom ''cas7'' pa je odpornost na fag 858 ostala nespremenjena. Predvidevali so, da je Cas7 vpleten v sintezo in/ali insercijo dodatnih vmesnikov in ponovitev.

===RAZISKAVA O OMEJITVI HORIZONTALNEGA PRENOSA GENOV Z DELOVANJEM ZAPOREDJA CRISPR NA PLAZMIDNO DNA===

Pri odkrivanju vloge, ki jo pri omejevanju horizontalnega prenosa genov, predvsem s konjugacijo in transformacijo, igra mehanizem CRISPR, je pomemben del prispevala raziskava L. A. Marraffinija in E. J. Sontheimerja iz leta 2008. Raziskave sta se lotila zaradi vse večjega porasta bakterij ''Staphylococcus aureus'', rezistentnih na antibiotika meticilin in vankomicin, ki je posledica horizontalnega prenosa plazmidov iz bakterij ''Staphylococcus epidermis''. Gre za najpogostejši vrsti bakterij pri bolnišničnih okužbah.

Raziskava je potrdila dve hipotezi. Prva je bila potrjena s pomočjo že prej odkrite identičnosti vmesnika CRISPR ''spcI'' pri ''S. epidermis'' z zaporedjem ''nes'' (zapis za topoizomerazo I), najdenem na vseh izoliranih plazmidih, ki se konjugirajo med omenjenima vrstama bakterij. Ta lastnost nastali crRNA omogoči prepoznavanje konjugiranega plazmida in tako prepreči horizontalen prenos te DNA znotraj vrste. Druga značilnost CRISPR sistema, ki so jo potrdili, je delovanje na nivoju plazmidne DNA, in ne RNA kot je bilo pokazano pri evkariontskih celicah, kar je še dodatno podprlo vprašanje o sistemu, s katerim celica preprečuje napad lastne DNA z zapisom CRISPR.

V raziskavi so uporabili dva seva S. epidermis, in sicer RP62a, ki vsebuje zaporedje CRISPR ter spremljajoče gene (med drugim tudi ''cas''), ter njegovo različico LAM104, ki ima deletiran CRISPR del. Kontrolo so izvajali na sevu ''S. epidermis'' brez zaporedja CRISPR, ATCC 12228. Kot vir plazmidov so uporabili sev ''S. aureus RN4220''. Da bi dokazali, da ''spc1'' preprečuje konjugacijo plazmidov v seve s CRISPR (torej sev RP62a), so v ''nes'' zaporedje plazmida pG0400 (krajše pG0(wt)) vstavili 9 tihih mutacij. Novonastali plazmid so poimenovali pG0(mut). Uspešnost konjugacije je bila pri kontrolnem sevu enaka za oba plazmida (po pričakovanjih), medtem ko je bila pri sevu RP62a uspešna le za pG0(mut), kar je potrdilo hipotezo o preprečitvi konjugacije s pomočjo dela zaporedja CRISPR, ki je enak enemu od plazmidnih genov. Da bi izključili morebitno vlogo ostalih razlik v genomu med poskusnim in kontrolnim sevom, so bakterijam iz RP62a deletirali CRISPR sekvenco z vmesniki in nov sev poimenovali LAM104. Ponoven poskus konjugacije je potrdil rezultate, pridobljene s kontrolnim sevom.

Drugi del raziskave je preverjal, ali crRNA deluje na plazmidno DNA ali RNA. Dokazi, da CRISPR v RP62a onemogoča sprejemanje plazmidov z ''nes'', ne pa njihovega oddajanja drugim celicam, kažejo na to, da ta mehanizem očitno ne vpliva na RNA prepis ''nes'', temveč na DNA. Iz tega lahko sklepamo tudi, da je crRNA identična (in ne komplementarna) ''nes'' mRNA. Da bi ta predvidevanja potrdili, so v regijo ''nes'' na plazmidu pG0400 vnesli samoizrezujoče se introne iz skupine I in tako pridobili okrnjen zapis DNA (pG0(I2)), ki pa se po prepisu v RNA sprocesira do identičnega proteina kot originalno zaporedje. Poskusi so pokazali enako uspešnost konjugacije pri sevu, ki vsebuje CRISPR (RP62a) ter pri sevu, ki ga ne (LAM104 in kontrolni sev ATCC 12228), kar potrjuje, da crRNA ne prepozna zaporedja DNA, če to vsebuje introne in torej ne prepreči vnosa tujega plazmida v celico. Na podoben način so izvedli tudi poskus s transformacijo, ki je dal enake rezultate in potrdil, da CRISPR ne prepozna tarčnega zaporedja, ki vsebuje introne. Ker so transformacijo opravili z elektroporacijo dvoverižne DNA v bakterijske celice, ostaja ta mehanizem pri naravni transformaciji, pri kateri lahko DNA prehaja tudi v enoverižni obliki, še nepotrjen.

==VIRI IN LITERATURA==

*M. Starčič Erjavec in D. Žgur-Bertok, Teoretične osnove in navodila za vaje pri predmetu Molekulska biologija genov. Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo, 2017.
*B. N. J. Watson, R. H. J. Staals, and P. C. Fineran, “CRISPR-Cas-Mediated Phage Resistance Enhances Horizontal Gene Transfer by Transduction.,” MBio, vol. 9, no. 1, pp. e02406-17, Mar. 2018.
*R. Barrangou, “The roles of CRISPR–Cas systems in adaptive immunity and beyond,” Curr. Opin. Immunol., vol. 32, pp. 36–41, Feb. 2015.
*R. Barrangou et al., “CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes,” Science (80-. )., vol. 315, no. 5819, pp. 1709–1712, Mar. 2007.
*L. A. Marraffini and E. J. Sontheimer, “CRISPR Interference Limits Horizontal Gene Transfer in Staphylococci by Targeting DNA,” Science (80-. )., vol. 322, no. 5909, pp. 1843–1845, Dec. 2008.

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-04-15T17:43:35Z

Nika Mikulič:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315 pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so:

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Blokiranje_receptorjev_za_fage Blokiranje receptorjev za fage] (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_zunajceli%C4%8Dnega_matriksa Proizvodnja zunajceličnega matriksa] (Patricija Miklavc, Benjamin Malovrh, Vid Modic) 
3. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_kompetitivnih_inhibitorjev Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev] (Ajda Godec,Liza Ulčakar,Luka Gnidovec) 
4. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sistem_izklju%C4%8Ditve_naknadne_oku%C5%BEbe Izključitev naknadne okužbe] (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_prvih_restrikcijskih_endonukleaz Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz] (Alen Šadl, Bor Klančnik) 
7. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metilacijski_sistem_pri_bakterijah Metilacijski sistem pri bakterijah] (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Struktura_in_mehanizem_restriktaz_tipa_II Struktura in mehanizem restriktaz tipa II] (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prilagoditve_fagov_na_bakterijske_restrikcijsko-modifikacijske_sisteme Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme] (Nika Boštic, Tadej Medved, Sonja Gabrijelčič) 
10. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_in_opis_regij_CRISPR_in_Cas_%28do_leta_~2002%29 Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002)] (Eva Gartner, Neža Blaznik, Tina Zavodnik ) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mateja Špegel, Špela Friškovec Vončina, Anja Truden) 
12. [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odkritje_vloge_CRISPR/Cas_pri_omejevanju_vnosa_plazmidov Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov] (Urška Zagorc, Nika Mikulič Vernik, Anja Tavčar) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Jernej Imperl, Klementina Polanec, Gašper Anton Komatar) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' (Karmen Mlinar, Marko Pavleković, Valeriya Musina) 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom (Sanja Stanković, Karin Dobravc Škof, Neža Žerjav ) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Talk:Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov

2019-04-15T17:42:39Z

Nika Mikulič:

Urška Zagorc: Horizontalni prenos genov

Nika Mikulič Vernik: Imunski sistem CRISPR/Cas, Raziskava o vplivu vmesnika na odpornost bakterije ''Streptococcus thermophilus''

Anja Tavčar: Raziskava o vplivu na omejitev horizontalnega prenosa genov s pomočjo CRISPR pri bakterijah ''Staphylococcus''

Talk:Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov

2019-04-15T17:42:28Z

Nika Mikulič: New page: Urška Zagorc: Horizontalni prenos genov Nika Mikulič Vernik: Imunski sistem CRISPR/Cas, Raziskava o vplivu vmesnika na odpornost bakterije ''Streptococcus thermophilus'' Anja Tavčar: Ra...

Urška Zagorc: Horizontalni prenos genov
Nika Mikulič Vernik: Imunski sistem CRISPR/Cas, Raziskava o vplivu vmesnika na odpornost bakterije ''Streptococcus thermophilus''
Anja Tavčar: Raziskava o vplivu na omejitev horizontalnega prenosa genov s pomočjo CRISPR pri bakterijah ''Staphylococcus''

Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov

2019-04-15T17:37:31Z

Nika Mikulič: /* UVOD */

==UVOD==
Horizontalni prenos genov predstavlja velik doprinos k diverziteti v evoluciji, ni pa nujno zmeraj ugoden; lahko je celo škodljiv. Zato so bakterije in arheje razvile sistem regulacije horizontalnega prenosa genov, imenovan CRISPR/Cas. Tak imunski sistem vase integrira kose (vmesnike) DNA bakteriofaga, za zagotovitev odpornosti nanj pa potrebuje tudi proteine Cas. Sistem CRISPR/Cas deluje na plazmidno DNA in ne na sprocesirano RNA, kar je sicer značilno za evkarionte.

== ODKRITJE VLOGE CRISPR/Cas PRI OMEJEVANJU VNOSA PLAZMIDOV==

===HORIZONTALNI PRENOS GENOV===

Horizontalni ali lateralni prenos genov je prenos DNA iz enega enoceličarja na drugega. Prisoten je predvsem pri prokariontih, se pa pojavlja tudi pri evkariontskih organizmih. Za razliko od vertikalnega prenosa, kjer gre za prenos starševskih genov na potomce, tu celice prevzemajo gene iz okolice oz. od drugih organizmov. Tako pride do prenosa med različnimi vrstami. Poznamo tri glavne načine prenosa genov: transformacijo, konjugacijo in transdukcijo. Pri transformaciji gre za sprejem tuje, prosto plavajoče molekule DNA iz okolice, ki je na primer do tja prišla iz nekega drugega mrtvega mikroorganizma. Pri tem je pomembno, da so celice, ki sprejemajo tujo DNA, kompetentne. Kompetentnost je začasno stanje, ki se pojavi kot odziv na stresne spremembe v okolju. Pri naravni transformaciji postanejo kompetentne v nekem specifičnem času svojega življenja, medtem ko pri umetni transformaciji kompetentnost izzovemo z različnimi solmi (npr. CaCl2) oz. z opazno spremembo temperature. Transdukcija poteka z bakteriofagi, ki prenašajo DNA iz druge bakterijske celice. Pogoj za konjugacijo pa je, da morata biti dve celici začasno fizično povezani. Prek te povezave nato preide DNA v drug enocelični organizem. Ves zapis za konjugacijo se nahaja na konjugativnih plazmidih, izmed katerih je najbolj preučen F plazmid, ki se nahaja v donorski bakteriji (F+). Donorska bakterija sintetizira na svoji površini konjugativni pilus, s katerim prepozna prejemniško bakterijo (F-). Ob vezavi nanjo se pilus skrajša, s čimer sta si bakteriji bližje, med njima pa se vzpostavi konjugativna pora. Na mestu OriT pride do reza ene od verig F plazmida. Prerezana enoverižna DNA vstopi v F- s 5'-koncem, pri čemer se hkrati sintetizirata manjkajoča dela verige v obeh bakterijah. Nato se prenesena DNA zaokroži, s čimer dobimo novo donorsko bakterijo. Začetki odkritij horizontalnega prenosa genov segajo v leto 1959, ko so s transdukcijo prenesli genetski material ''Escherichie coli'' v ''Salmonello Typhimurium''. Bolj razsežno pa so pojav začeli spremljati, ko so ugotovili, da je vse več bakterij odpornih na vse več različnih antibiotikov, česar ni bilo mogoče pojasniti z vertikalnim prenosom genov.

V laboratoriju so prenos genov izvajali na način, ki je preprostejši od naštetih mehanizmov. Ovojnico enoceličarja so predrli mehansko, s ''pre-stresanjem'' z zrnci stekla. Analogija takšnega prenosa se dogaja tudi v naravi. Delci peska v reki se na primer s pomočjo vodnega toka povzdignejo iz tal, pri čemer prihaja do mehanskega drgnjenja s številnimi mikroorganizmi, ki se v vrtincu nahajajo. S predrtjem ovojnice, lahko tuja DNA vstopi v predrt organizem. Ovojnico lahko predremo tudi z občutnim spreminjanjem temperature, zdaj pa to počnejo predvsem z elektroporacijo, metodo odkrito pred štirimi desetletji. Elektroporacija je enostaven način, s katerim prenesemo dedni material z izpostavitvijo mikroorganizmov močnim, kratkim, visoko-električno napetostnim pulzom. Ti ovojnico naluknjajo tako, da lahko DNA med celicami prehaja. Če je ovojnica naluknjana ravno dovolj, da mikroorganizem še vedno preživi, ko DNA vstopi v celico, se v večini primerov začne tuja DNA izražati. Ker prej omenjeni glavni mehanizmi temeljijo na proteinih, katerih delovanje je zelo omejeno in so se razvili šele tekom evolucije, se je Slovenec dr. Tadej Kotnik začel spraševati, če obstaja preprost fizikalni mehanizem, ki deluje že vse od nastanka življenja. Analogijo elektroporacije v laboratoriju je našel v nevihtni streli ter napisal študijo o nevihtni streli kot naravnem mehanizmu prenosa genov ter jo objavil v reviji Physics of Life Reviews. Njegovo razmišljanje temelji na sledečih dejstvih; dnevno udari na zemeljsko površje več 10 milijonov strel. Kjer ob zemljo udari strela, se elektroporira en kubični meter, na katerem živi od 100 do 1000 milijonov mikroorganizmov. Po prej opisanem mehanizmu elektroporacije lahko v naravi pride do prenosa genov na veliko preprostejši način in omogoča vnos tujega genskega materiala tako v prokarionte kot tudi evkarionte.

===IMUNSKI SISTEM CRISPR/Cas===

Sistem CRISPR/Cas deluje kot imunski sistem bakterij in arhej. Deluje tako, da koščke tuje DNA po vstopu v celico integrira v lokus CRISPR. Take koščke imenujemo vmesniki (prekinjajo pa jih t. i. ponovitve) in služijo kot nekakšen spomin imunskega sistema. Ta se v procesu transkripcije prepiše v molekulo crRNA (CRISPR RNA), ki usmerja proteine Cas na tarčno zaporedje. Proteini Cas so endonukleaze, ki tako prepoznajo specifično tujo DNA, jo cepijo in razgradijo.

===RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE ''STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS''===

Da so vmesniki v resnici homologi tujih plazmidov, so sprva ugotovili z ''in silico'' analizami, ki so vodile do različnih hipotez o vlogah sistema CRISPR. V raziskavi iz leta 2007 so analizirali več sevov bakterije ''Streptococcus thermophilus'' za katere je značilno, da imajo dva lokusa CRISPR, oni pa so se omejili predvsem na CRISPR1.

Najprej so preverili hipotezo, da se med pridobitvijo odpornosti spremeni bakterijski lokus CRISPR. Izbrali so sev ''Streptococcus thermophilus'' DGCC7710 divjega tipa (WT) in dva virulentna bakteriofaga, fag 858 in fag 2972, katerih genoma sta 93 % identična. Neodvisno med sabo so pripravili devet različnih mutantov bakterije z izpostavitvijo okužbi s fagom 858, fagom 2972 ali obema hkrati (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F1.large.jpg]), nato pa so analizirali njihov lokus CRISPR. V divjem tipu bakterij je bilo opaznih 32, v mutantih pa še dodatnih 1 do 4 vmesnikov. Po pričakovanjih iz prejšnjih poskusov so ugotovili, da se novi vmesniki vstavijo predvsem v vodilno zaporedje lokusa CRISPR. S sekvenciranjem so našli podobnost med dodatnimi vmesniki v mutiranih sevih in genomom fagov, katerim so bili izpostavljeni. Zanimivo je bilo, da so bile podobnosti najdene po celotnem genomu virusa, na kodirajočih in nekodirajočih zaporedjih. S temi ugotovitvami so dokazali, da se lokus CRISPR po okužbi z virusom spremeni tako, da v lastno zaporedje vstavi dodatne vmesnike, ki jih pridobi iz DNA virusa.

Opazili so, da je bila od tega, kateri vmesnik se je v lokus CRISPR vstavil, odvisna tudi rezistenca na fage; pri sevih, v katerih je bil vstavljeni vmesnik 100 % enak zaporedju faga, se je pojavila odpornost. Ker sta faga 858 in 2972 93 % identična, so vmesniki iz bolj ohranjenih regij (vmesniki S3, S6, S7) povzročili odpornost na oba faga. V primerih, ko pa je bilo med 29 – 30 nukleotidi prisotnih 1 – 15 nukleotidnih polimorfizmov, pa tak vmesnik (vmesnik S1, S2, S4, S5 in S8) ni več povzročil rezistence na oba, ampak samo na fag, kateremu je bil izpostavljen. Prav tako je v mutantih, v katerih je bilo vstavljenih več vmesnikov, bila odpornost višja. Med seboj so primerjali tudi odpornost bakterij po tem, ko so iz lokusa CRISPR izbrisali ali dodali vmesnike (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F3.large.jpg]). Iz mutanta WTΦ858+S1S2 so odstranili vmesnika S1 in S2, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858. Ko so mutantu WTΦ2972+S4 zamenjali vmesnik S4 za S1 in S2, je bila bakterija odporna na fag 858. Mutantu WTΦ858+S1S2 so nato med gene Cas in CRIPSR1 vstavili zapis za eno samo ponovitev, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858, čeprav sta bila vmesnika S1 in S2 v lokusu še zmeraj prisotna. To dokazuje, da vmesniki sami po sebi ne povzročijo odpornosti.

Ker je že obstajala hipoteza, da so pri tem procesu pomembni tudi Cas geni, so v istem mutantu WTΦ858+S1S2 izbrisali gen ''cas5'' ali ''cas7''. Bakterija z izbrisanim genom ''cas5'' ni bila več odporna na fag 858, iz česar so sklepali, da Cas5 deluje kot nukleaza (ker vsebuje HNH-nukleazni motiv). V bakteriji z inaktiviranim genom ''cas7'' pa je odpornost na fag 858 ostala nespremenjena. Predvidevali so, da je Cas7 vpleten v sintezo in/ali insercijo dodatnih vmesnikov in ponovitev.

===RAZISKAVA O VPLIVU NA OMEJITEV HORIZONTALNEGA PRENOSA GENOV S POMOČJO CRISPR PRI BAKTERIJAH ''STAPHYLOCOCCUS''===

Pri odkrivanju vloge, ki jo pri omejevanju horizontalnega prenosa genov, predvsem s konjugacijo in transformacijo, igra mehanizem CRISPR, je pomemben del prispevala raziskava L. A. Marraffinija in E. J. Sontheimerja iz leta 2008. Raziskave sta se lotila zaradi vse večjega porasta bakterij ''Staphylococcus aureus'', rezistentnih na antibiotika meticilin in vankomicin, ki je posledica horizontalnega prenosa plazmidov iz bakterij ''Staphylococcus epidermis''. Gre za najpogostejši vrsti bakterij pri bolnišničnih okužbah.

Raziskava je potrdila dve hipotezi. Prva je bila potrjena s pomočjo že prej odkrite identičnosti vmesnika CRISPR ''spcI'' pri ''S. epidermis'' z zaporedjem ''nes'' (zapis za topoizomerazo I), najdenem na vseh izoliranih plazmidih, ki se konjugirajo med omenjenima vrstama bakterij. Ta lastnost nastali crRNA omogoči prepoznavanje konjugiranega plazmida in tako prepreči horizontalen prenos te DNA znotraj vrste. Druga značilnost CRISPR sistema, ki so jo potrdili, je delovanje na nivoju plazmidne DNA, in ne RNA kot je bilo pokazano pri evkariontskih celicah, kar je še dodatno podprlo vprašanje o sistemu, s katerim celica preprečuje napad lastne DNA z zapisom CRISPR.

V raziskavi so uporabili dva seva S. epidermis, in sicer RP62a, ki vsebuje zaporedje CRISPR ter spremljajoče gene (med drugim tudi ''cas''), ter njegovo različico LAM104, ki ima deletiran CRISPR del. Kontrolo so izvajali na sevu ''S. epidermis'' brez zaporedja CRISPR, ATCC 12228. Kot vir plazmidov so uporabili sev ''S. aureus RN4220''. Da bi dokazali, da ''spc1'' preprečuje konjugacijo plazmidov v seve s CRISPR (torej sev RP62a), so v ''nes'' zaporedje plazmida pG0400 (krajše pG0(wt)) vstavili 9 tihih mutacij. Novonastali plazmid so poimenovali pG0(mut). Uspešnost konjugacije je bila pri kontrolnem sevu enaka za oba plazmida (po pričakovanjih), medtem ko je bila pri sevu RP62a uspešna le za pG0(mut), kar je potrdilo hipotezo o preprečitvi konjugacije s pomočjo dela zaporedja CRISPR, ki je enak enemu od plazmidnih genov. Da bi izključili morebitno vlogo ostalih razlik v genomu med poskusnim in kontrolnim sevom, so bakterijam iz RP62a deletirali CRISPR sekvenco z vmesniki in nov sev poimenovali LAM104. Ponoven poskus konjugacije je potrdil rezultate, pridobljene s kontrolnim sevom.

Drugi del raziskave je preverjal, ali crRNA deluje na plazmidno DNA ali RNA. Dokazi, da CRISPR v RP62a onemogoča sprejemanje plazmidov z ''nes'', ne pa njihovega oddajanja drugim celicam, kažejo na to, da ta mehanizem očitno ne vpliva na RNA prepis ''nes'', temveč na DNA. Iz tega lahko sklepamo tudi, da je crRNA identična (in ne komplementarna) ''nes'' mRNA. Da bi ta predvidevanja potrdili, so v regijo ''nes'' na plazmidu pG0400 vnesli samoizrezujoče se introne iz skupine I in tako pridobili okrnjen zapis DNA (pG0(I2)), ki pa se po prepisu v RNA sprocesira do identičnega proteina kot originalno zaporedje. Poskusi so pokazali enako uspešnost konjugacije pri sevu, ki vsebuje CRISPR (RP62a) ter pri sevu, ki ga ne (LAM104 in kontrolni sev ATCC 12228), kar potrjuje, da crRNA ne prepozna zaporedja DNA, če to vsebuje introne in torej ne prepreči vnosa tujega plazmida v celico. Na podoben način so izvedli tudi poskus s transformacijo, ki je dal enake rezultate in potrdil, da CRISPR ne prepozna tarčnega zaporedja, ki vsebuje introne. Ker so transformacijo opravili z elektroporacijo dvoverižne DNA v bakterijske celice, ostaja ta mehanizem pri naravni transformaciji, pri kateri lahko DNA prehaja tudi v enoverižni obliki, še nepotrjen.

==VIRI IN LITERATURA==

*M. Starčič Erjavec in D. Žgur-Bertok, Teoretične osnove in navodila za vaje pri predmetu Molekulska biologija genov. Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo, 2017.
*B. N. J. Watson, R. H. J. Staals, and P. C. Fineran, “CRISPR-Cas-Mediated Phage Resistance Enhances Horizontal Gene Transfer by Transduction.,” MBio, vol. 9, no. 1, pp. e02406-17, Mar. 2018.
*R. Barrangou, “The roles of CRISPR–Cas systems in adaptive immunity and beyond,” Curr. Opin. Immunol., vol. 32, pp. 36–41, Feb. 2015.
*R. Barrangou et al., “CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes,” Science (80-. )., vol. 315, no. 5819, pp. 1709–1712, Mar. 2007.
*L. A. Marraffini and E. J. Sontheimer, “CRISPR Interference Limits Horizontal Gene Transfer in Staphylococci by Targeting DNA,” Science (80-. )., vol. 322, no. 5909, pp. 1843–1845, Dec. 2008.

Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov

2019-04-15T17:33:29Z

Nika Mikulič: /* RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS */

==UVOD==
Horizontalni prenos genov predstavlja velik doprinos k diverziteti v evoluciji, ni pa nujno zmeraj ugoden; lahko je celo škodljiv. Zato so bakterije in arheje razvile sistem regulacije horizontalnega prenosa genov, imenovan CRISPR/Cas (iz ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins). Tak imunski sistem vase integrira kose (vmesnike) DNA bakteriofaga, za zagotovitev odpornosti nanj pa potrebuje tudi proteine Cas. Sistem CRISPR/Cas deluje na plazmidno DNA in ne na sprocesirano RNA, kot je to sicer značilno za evkarionte.

== ODKRITJE VLOGE CRISPR/Cas PRI OMEJEVANJU VNOSA PLAZMIDOV==

===HORIZONTALNI PRENOS GENOV===

Horizontalni ali lateralni prenos genov je prenos DNA iz enega enoceličarja na drugega. Prisoten je predvsem pri prokariontih, se pa pojavlja tudi pri evkariontskih organizmih. Za razliko od vertikalnega prenosa, kjer gre za prenos starševskih genov na potomce, tu celice prevzemajo gene iz okolice oz. od drugih organizmov. Tako pride do prenosa med različnimi vrstami. Poznamo tri glavne načine prenosa genov: transformacijo, konjugacijo in transdukcijo. Pri transformaciji gre za sprejem tuje, prosto plavajoče molekule DNA iz okolice, ki je na primer do tja prišla iz nekega drugega mrtvega mikroorganizma. Pri tem je pomembno, da so celice, ki sprejemajo tujo DNA, kompetentne. Kompetentnost je začasno stanje, ki se pojavi kot odziv na stresne spremembe v okolju. Pri naravni transformaciji postanejo kompetentne v nekem specifičnem času svojega življenja, medtem ko pri umetni transformaciji kompetentnost izzovemo z različnimi solmi (npr. CaCl2) oz. z opazno spremembo temperature. Transdukcija poteka z bakteriofagi, ki prenašajo DNA iz druge bakterijske celice. Pogoj za konjugacijo pa je, da morata biti dve celici začasno fizično povezani. Prek te povezave nato preide DNA v drug enocelični organizem. Ves zapis za konjugacijo se nahaja na konjugativnih plazmidih, izmed katerih je najbolj preučen F plazmid, ki se nahaja v donorski bakteriji (F+). Donorska bakterija sintetizira na svoji površini konjugativni pilus, s katerim prepozna prejemniško bakterijo (F-). Ob vezavi nanjo se pilus skrajša, s čimer sta si bakteriji bližje, med njima pa se vzpostavi konjugativna pora. Na mestu OriT pride do reza ene od verig F plazmida. Prerezana enoverižna DNA vstopi v F- s 5'-koncem, pri čemer se hkrati sintetizirata manjkajoča dela verige v obeh bakterijah. Nato se prenesena DNA zaokroži, s čimer dobimo novo donorsko bakterijo. Začetki odkritij horizontalnega prenosa genov segajo v leto 1959, ko so s transdukcijo prenesli genetski material ''Escherichie coli'' v ''Salmonello Typhimurium''. Bolj razsežno pa so pojav začeli spremljati, ko so ugotovili, da je vse več bakterij odpornih na vse več različnih antibiotikov, česar ni bilo mogoče pojasniti z vertikalnim prenosom genov.

V laboratoriju so prenos genov izvajali na način, ki je preprostejši od naštetih mehanizmov. Ovojnico enoceličarja so predrli mehansko, s ''pre-stresanjem'' z zrnci stekla. Analogija takšnega prenosa se dogaja tudi v naravi. Delci peska v reki se na primer s pomočjo vodnega toka povzdignejo iz tal, pri čemer prihaja do mehanskega drgnjenja s številnimi mikroorganizmi, ki se v vrtincu nahajajo. S predrtjem ovojnice, lahko tuja DNA vstopi v predrt organizem. Ovojnico lahko predremo tudi z občutnim spreminjanjem temperature, zdaj pa to počnejo predvsem z elektroporacijo, metodo odkrito pred štirimi desetletji. Elektroporacija je enostaven način, s katerim prenesemo dedni material z izpostavitvijo mikroorganizmov močnim, kratkim, visoko-električno napetostnim pulzom. Ti ovojnico naluknjajo tako, da lahko DNA med celicami prehaja. Če je ovojnica naluknjana ravno dovolj, da mikroorganizem še vedno preživi, ko DNA vstopi v celico, se v večini primerov začne tuja DNA izražati. Ker prej omenjeni glavni mehanizmi temeljijo na proteinih, katerih delovanje je zelo omejeno in so se razvili šele tekom evolucije, se je Slovenec dr. Tadej Kotnik začel spraševati, če obstaja preprost fizikalni mehanizem, ki deluje že vse od nastanka življenja. Analogijo elektroporacije v laboratoriju je našel v nevihtni streli ter napisal študijo o nevihtni streli kot naravnem mehanizmu prenosa genov ter jo objavil v reviji Physics of Life Reviews. Njegovo razmišljanje temelji na sledečih dejstvih; dnevno udari na zemeljsko površje več 10 milijonov strel. Kjer ob zemljo udari strela, se elektroporira en kubični meter, na katerem živi od 100 do 1000 milijonov mikroorganizmov. Po prej opisanem mehanizmu elektroporacije lahko v naravi pride do prenosa genov na veliko preprostejši način in omogoča vnos tujega genskega materiala tako v prokarionte kot tudi evkarionte.

===IMUNSKI SISTEM CRISPR/Cas===

Sistem CRISPR/Cas deluje kot imunski sistem bakterij in arhej. Deluje tako, da koščke tuje DNA po vstopu v celico integrira v lokus CRISPR. Take koščke imenujemo vmesniki (prekinjajo pa jih t. i. ponovitve) in služijo kot nekakšen spomin imunskega sistema. Ta se v procesu transkripcije prepiše v molekulo crRNA (CRISPR RNA), ki usmerja proteine Cas na tarčno zaporedje. Proteini Cas so endonukleaze, ki tako prepoznajo specifično tujo DNA, jo cepijo in razgradijo.

===RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE ''STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS''===

Da so vmesniki v resnici homologi tujih plazmidov, so sprva ugotovili z ''in silico'' analizami, ki so vodile do različnih hipotez o vlogah sistema CRISPR. V raziskavi iz leta 2007 so analizirali več sevov bakterije ''Streptococcus thermophilus'' za katere je značilno, da imajo dva lokusa CRISPR, oni pa so se omejili predvsem na CRISPR1.

Najprej so preverili hipotezo, da se med pridobitvijo odpornosti spremeni bakterijski lokus CRISPR. Izbrali so sev ''Streptococcus thermophilus'' DGCC7710 divjega tipa (WT) in dva virulentna bakteriofaga, fag 858 in fag 2972, katerih genoma sta 93 % identična. Neodvisno med sabo so pripravili devet različnih mutantov bakterije z izpostavitvijo okužbi s fagom 858, fagom 2972 ali obema hkrati (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F1.large.jpg]), nato pa so analizirali njihov lokus CRISPR. V divjem tipu bakterij je bilo opaznih 32, v mutantih pa še dodatnih 1 do 4 vmesnikov. Po pričakovanjih iz prejšnjih poskusov so ugotovili, da se novi vmesniki vstavijo predvsem v vodilno zaporedje lokusa CRISPR. S sekvenciranjem so našli podobnost med dodatnimi vmesniki v mutiranih sevih in genomom fagov, katerim so bili izpostavljeni. Zanimivo je bilo, da so bile podobnosti najdene po celotnem genomu virusa, na kodirajočih in nekodirajočih zaporedjih. S temi ugotovitvami so dokazali, da se lokus CRISPR po okužbi z virusom spremeni tako, da v lastno zaporedje vstavi dodatne vmesnike, ki jih pridobi iz DNA virusa.

Opazili so, da je bila od tega, kateri vmesnik se je v lokus CRISPR vstavil, odvisna tudi rezistenca na fage; pri sevih, v katerih je bil vstavljeni vmesnik 100 % enak zaporedju faga, se je pojavila odpornost. Ker sta faga 858 in 2972 93 % identična, so vmesniki iz bolj ohranjenih regij (vmesniki S3, S6, S7) povzročili odpornost na oba faga. V primerih, ko pa je bilo med 29 – 30 nukleotidi prisotnih 1 – 15 nukleotidnih polimorfizmov, pa tak vmesnik (vmesnik S1, S2, S4, S5 in S8) ni več povzročil rezistence na oba, ampak samo na fag, kateremu je bil izpostavljen. Prav tako je v mutantih, v katerih je bilo vstavljenih več vmesnikov, bila odpornost višja. Med seboj so primerjali tudi odpornost bakterij po tem, ko so iz lokusa CRISPR izbrisali ali dodali vmesnike (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F3.large.jpg]). Iz mutanta WTΦ858+S1S2 so odstranili vmesnika S1 in S2, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858. Ko so mutantu WTΦ2972+S4 zamenjali vmesnik S4 za S1 in S2, je bila bakterija odporna na fag 858. Mutantu WTΦ858+S1S2 so nato med gene Cas in CRIPSR1 vstavili zapis za eno samo ponovitev, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858, čeprav sta bila vmesnika S1 in S2 v lokusu še zmeraj prisotna. To dokazuje, da vmesniki sami po sebi ne povzročijo odpornosti.

Ker je že obstajala hipoteza, da so pri tem procesu pomembni tudi Cas geni, so v istem mutantu WTΦ858+S1S2 izbrisali gen ''cas5'' ali ''cas7''. Bakterija z izbrisanim genom ''cas5'' ni bila več odporna na fag 858, iz česar so sklepali, da Cas5 deluje kot nukleaza (ker vsebuje HNH-nukleazni motiv). V bakteriji z inaktiviranim genom ''cas7'' pa je odpornost na fag 858 ostala nespremenjena. Predvidevali so, da je Cas7 vpleten v sintezo in/ali insercijo dodatnih vmesnikov in ponovitev.

===RAZISKAVA O VPLIVU NA OMEJITEV HORIZONTALNEGA PRENOSA GENOV S POMOČJO CRISPR PRI BAKTERIJAH ''STAPHYLOCOCCUS''===

Pri odkrivanju vloge, ki jo pri omejevanju horizontalnega prenosa genov, predvsem s konjugacijo in transformacijo, igra mehanizem CRISPR, je pomemben del prispevala raziskava L. A. Marraffinija in E. J. Sontheimerja iz leta 2008. Raziskave sta se lotila zaradi vse večjega porasta bakterij ''Staphylococcus aureus'', rezistentnih na antibiotika meticilin in vankomicin, ki je posledica horizontalnega prenosa plazmidov iz bakterij ''Staphylococcus epidermis''. Gre za najpogostejši vrsti bakterij pri bolnišničnih okužbah.

Raziskava je potrdila dve hipotezi. Prva je bila potrjena s pomočjo že prej odkrite identičnosti vmesnika CRISPR ''spcI'' pri ''S. epidermis'' z zaporedjem ''nes'' (zapis za topoizomerazo I), najdenem na vseh izoliranih plazmidih, ki se konjugirajo med omenjenima vrstama bakterij. Ta lastnost nastali crRNA omogoči prepoznavanje konjugiranega plazmida in tako prepreči horizontalen prenos te DNA znotraj vrste. Druga značilnost CRISPR sistema, ki so jo potrdili, je delovanje na nivoju plazmidne DNA, in ne RNA kot je bilo pokazano pri evkariontskih celicah, kar je še dodatno podprlo vprašanje o sistemu, s katerim celica preprečuje napad lastne DNA z zapisom CRISPR.

V raziskavi so uporabili dva seva S. epidermis, in sicer RP62a, ki vsebuje zaporedje CRISPR ter spremljajoče gene (med drugim tudi ''cas''), ter njegovo različico LAM104, ki ima deletiran CRISPR del. Kontrolo so izvajali na sevu ''S. epidermis'' brez zaporedja CRISPR, ATCC 12228. Kot vir plazmidov so uporabili sev ''S. aureus RN4220''. Da bi dokazali, da ''spc1'' preprečuje konjugacijo plazmidov v seve s CRISPR (torej sev RP62a), so v ''nes'' zaporedje plazmida pG0400 (krajše pG0(wt)) vstavili 9 tihih mutacij. Novonastali plazmid so poimenovali pG0(mut). Uspešnost konjugacije je bila pri kontrolnem sevu enaka za oba plazmida (po pričakovanjih), medtem ko je bila pri sevu RP62a uspešna le za pG0(mut), kar je potrdilo hipotezo o preprečitvi konjugacije s pomočjo dela zaporedja CRISPR, ki je enak enemu od plazmidnih genov. Da bi izključili morebitno vlogo ostalih razlik v genomu med poskusnim in kontrolnim sevom, so bakterijam iz RP62a deletirali CRISPR sekvenco z vmesniki in nov sev poimenovali LAM104. Ponoven poskus konjugacije je potrdil rezultate, pridobljene s kontrolnim sevom.

Drugi del raziskave je preverjal, ali crRNA deluje na plazmidno DNA ali RNA. Dokazi, da CRISPR v RP62a onemogoča sprejemanje plazmidov z ''nes'', ne pa njihovega oddajanja drugim celicam, kažejo na to, da ta mehanizem očitno ne vpliva na RNA prepis ''nes'', temveč na DNA. Iz tega lahko sklepamo tudi, da je crRNA identična (in ne komplementarna) ''nes'' mRNA. Da bi ta predvidevanja potrdili, so v regijo ''nes'' na plazmidu pG0400 vnesli samoizrezujoče se introne iz skupine I in tako pridobili okrnjen zapis DNA (pG0(I2)), ki pa se po prepisu v RNA sprocesira do identičnega proteina kot originalno zaporedje. Poskusi so pokazali enako uspešnost konjugacije pri sevu, ki vsebuje CRISPR (RP62a) ter pri sevu, ki ga ne (LAM104 in kontrolni sev ATCC 12228), kar potrjuje, da crRNA ne prepozna zaporedja DNA, če to vsebuje introne in torej ne prepreči vnosa tujega plazmida v celico. Na podoben način so izvedli tudi poskus s transformacijo, ki je dal enake rezultate in potrdil, da CRISPR ne prepozna tarčnega zaporedja, ki vsebuje introne. Ker so transformacijo opravili z elektroporacijo dvoverižne DNA v bakterijske celice, ostaja ta mehanizem pri naravni transformaciji, pri kateri lahko DNA prehaja tudi v enoverižni obliki, še nepotrjen.

==VIRI IN LITERATURA==

*M. Starčič Erjavec in D. Žgur-Bertok, Teoretične osnove in navodila za vaje pri predmetu Molekulska biologija genov. Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo, 2017.
*B. N. J. Watson, R. H. J. Staals, and P. C. Fineran, “CRISPR-Cas-Mediated Phage Resistance Enhances Horizontal Gene Transfer by Transduction.,” MBio, vol. 9, no. 1, pp. e02406-17, Mar. 2018.
*R. Barrangou, “The roles of CRISPR–Cas systems in adaptive immunity and beyond,” Curr. Opin. Immunol., vol. 32, pp. 36–41, Feb. 2015.
*R. Barrangou et al., “CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes,” Science (80-. )., vol. 315, no. 5819, pp. 1709–1712, Mar. 2007.
*L. A. Marraffini and E. J. Sontheimer, “CRISPR Interference Limits Horizontal Gene Transfer in Staphylococci by Targeting DNA,” Science (80-. )., vol. 322, no. 5909, pp. 1843–1845, Dec. 2008.

Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov

2019-04-15T17:31:29Z

Nika Mikulič: /* RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS */

==UVOD==
Horizontalni prenos genov predstavlja velik doprinos k diverziteti v evoluciji, ni pa nujno zmeraj ugoden; lahko je celo škodljiv. Zato so bakterije in arheje razvile sistem regulacije horizontalnega prenosa genov, imenovan CRISPR/Cas (iz ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins). Tak imunski sistem vase integrira kose (vmesnike) DNA bakteriofaga, za zagotovitev odpornosti nanj pa potrebuje tudi proteine Cas. Sistem CRISPR/Cas deluje na plazmidno DNA in ne na sprocesirano RNA, kot je to sicer značilno za evkarionte.

== ODKRITJE VLOGE CRISPR/Cas PRI OMEJEVANJU VNOSA PLAZMIDOV==

===HORIZONTALNI PRENOS GENOV===

Horizontalni ali lateralni prenos genov je prenos DNA iz enega enoceličarja na drugega. Prisoten je predvsem pri prokariontih, se pa pojavlja tudi pri evkariontskih organizmih. Za razliko od vertikalnega prenosa, kjer gre za prenos starševskih genov na potomce, tu celice prevzemajo gene iz okolice oz. od drugih organizmov. Tako pride do prenosa med različnimi vrstami. Poznamo tri glavne načine prenosa genov: transformacijo, konjugacijo in transdukcijo. Pri transformaciji gre za sprejem tuje, prosto plavajoče molekule DNA iz okolice, ki je na primer do tja prišla iz nekega drugega mrtvega mikroorganizma. Pri tem je pomembno, da so celice, ki sprejemajo tujo DNA, kompetentne. Kompetentnost je začasno stanje, ki se pojavi kot odziv na stresne spremembe v okolju. Pri naravni transformaciji postanejo kompetentne v nekem specifičnem času svojega življenja, medtem ko pri umetni transformaciji kompetentnost izzovemo z različnimi solmi (npr. CaCl2) oz. z opazno spremembo temperature. Transdukcija poteka z bakteriofagi, ki prenašajo DNA iz druge bakterijske celice. Pogoj za konjugacijo pa je, da morata biti dve celici začasno fizično povezani. Prek te povezave nato preide DNA v drug enocelični organizem. Ves zapis za konjugacijo se nahaja na konjugativnih plazmidih, izmed katerih je najbolj preučen F plazmid, ki se nahaja v donorski bakteriji (F+). Donorska bakterija sintetizira na svoji površini konjugativni pilus, s katerim prepozna prejemniško bakterijo (F-). Ob vezavi nanjo se pilus skrajša, s čimer sta si bakteriji bližje, med njima pa se vzpostavi konjugativna pora. Na mestu OriT pride do reza ene od verig F plazmida. Prerezana enoverižna DNA vstopi v F- s 5'-koncem, pri čemer se hkrati sintetizirata manjkajoča dela verige v obeh bakterijah. Nato se prenesena DNA zaokroži, s čimer dobimo novo donorsko bakterijo. Začetki odkritij horizontalnega prenosa genov segajo v leto 1959, ko so s transdukcijo prenesli genetski material ''Escherichie coli'' v ''Salmonello Typhimurium''. Bolj razsežno pa so pojav začeli spremljati, ko so ugotovili, da je vse več bakterij odpornih na vse več različnih antibiotikov, česar ni bilo mogoče pojasniti z vertikalnim prenosom genov.

V laboratoriju so prenos genov izvajali na način, ki je preprostejši od naštetih mehanizmov. Ovojnico enoceličarja so predrli mehansko, s ''pre-stresanjem'' z zrnci stekla. Analogija takšnega prenosa se dogaja tudi v naravi. Delci peska v reki se na primer s pomočjo vodnega toka povzdignejo iz tal, pri čemer prihaja do mehanskega drgnjenja s številnimi mikroorganizmi, ki se v vrtincu nahajajo. S predrtjem ovojnice, lahko tuja DNA vstopi v predrt organizem. Ovojnico lahko predremo tudi z občutnim spreminjanjem temperature, zdaj pa to počnejo predvsem z elektroporacijo, metodo odkrito pred štirimi desetletji. Elektroporacija je enostaven način, s katerim prenesemo dedni material z izpostavitvijo mikroorganizmov močnim, kratkim, visoko-električno napetostnim pulzom. Ti ovojnico naluknjajo tako, da lahko DNA med celicami prehaja. Če je ovojnica naluknjana ravno dovolj, da mikroorganizem še vedno preživi, ko DNA vstopi v celico, se v večini primerov začne tuja DNA izražati. Ker prej omenjeni glavni mehanizmi temeljijo na proteinih, katerih delovanje je zelo omejeno in so se razvili šele tekom evolucije, se je Slovenec dr. Tadej Kotnik začel spraševati, če obstaja preprost fizikalni mehanizem, ki deluje že vse od nastanka življenja. Analogijo elektroporacije v laboratoriju je našel v nevihtni streli ter napisal študijo o nevihtni streli kot naravnem mehanizmu prenosa genov ter jo objavil v reviji Physics of Life Reviews. Njegovo razmišljanje temelji na sledečih dejstvih; dnevno udari na zemeljsko površje več 10 milijonov strel. Kjer ob zemljo udari strela, se elektroporira en kubični meter, na katerem živi od 100 do 1000 milijonov mikroorganizmov. Po prej opisanem mehanizmu elektroporacije lahko v naravi pride do prenosa genov na veliko preprostejši način in omogoča vnos tujega genskega materiala tako v prokarionte kot tudi evkarionte.

===IMUNSKI SISTEM CRISPR/Cas===

Sistem CRISPR/Cas deluje kot imunski sistem bakterij in arhej. Deluje tako, da koščke tuje DNA po vstopu v celico integrira v lokus CRISPR. Take koščke imenujemo vmesniki (prekinjajo pa jih t. i. ponovitve) in služijo kot nekakšen spomin imunskega sistema. Ta se v procesu transkripcije prepiše v molekulo crRNA (CRISPR RNA), ki usmerja proteine Cas na tarčno zaporedje. Proteini Cas so endonukleaze, ki tako prepoznajo specifično tujo DNA, jo cepijo in razgradijo.

===RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE ''STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS''===

Da so vmesniki v resnici homologi tujih plazmidov, so sprva ugotovili z ''in silico'' analizami, ki so vodile do različnih hipotez o vlogah sistema CRISPR. V raziskavi iz leta 2007 so analizirali več sevov bakterije ''Streptococcus thermophilus'' za katere je značilno, da imajo dva lokusa CRISPR, oni pa so se omejili predvsem na CRISPR1.

Najprej so preverili hipotezo, da se med pridobitvijo odpornosti spremeni tudi bakterijski lokus CRISPR. Izbrali so sev ''Streptococcus thermophilus'' DGCC7710 divjega tipa (WT) in dva virulentna bakteriofaga, fag 858 in fag 2972, katerih genoma sta 93 % identična. Neodvisno med sabo so pripravili devet različnih mutantov bakterije z izpostavitvijo okužbi s fagom 858, fagom 2972 ali obema hkrati (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F1.large.jpg]), nato pa so analizirali njihov lokus CRISPR. V divjem tipu bakterij je bilo opaznih 32, v mutantih pa še dodatnih 1 do 4 vmesnikov. Po pričakovanjih iz prejšnjih poskusov so ugotovili, da se novi vmesniki vstavijo predvsem v vodilno zaporedje lokusa CRISPR. S sekvenciranjem so našli podobnost med dodatnimi vmesniki v mutiranih sevih in genomom fagov, katerim so bili izpostavljeni. Zanimivo je bilo, da so bile podobnosti najdene po celotnem genomu virusa, na kodirajočih in nekodirajočih zaporedjih. S temi ugotovitvami so dokazali, da se lokus CRISPR po okužbi z virusom spremeni tako, da v lastno zaporedje vstavi dodatne vmesnike, ki jih pridobi iz DNA virusa.

Opazili so, da je bila od tega, kateri vmesnik se je v lokus CRISPR vstavil, odvisna tudi rezistenca na fage; pri sevih, v katerih je bil vstavljeni vmesnik 100 % enak zaporedju faga, se je pojavila odpornost. Ker sta faga 858 in 2972 93 % identična, so vmesniki iz bolj ohranjenih regij (vmesniki S3, S6, S7) povzročili odpornost na oba faga. V primerih, ko pa je bilo med 29 – 30 nukleotidi prisotnih 1 – 15 nukleotidnih polimorfizmov, pa tak vmesnik (vmesnik S1, S2, S4, S5 in S8) ni več povzročil rezistence na oba, ampak samo na fag, kateremu je bil izpostavljen. Prav tako je v mutantih, v katerih je bilo vstavljenih več vmesnikov, bila odpornost višja. Med seboj so primerjali tudi odpornost bakterij po tem, ko so iz lokusa CRISPR izbrisali ali dodali vmesnike (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F3.large.jpg]). Iz mutanta WTΦ858+S1S2 so odstranili vmesnika S1 in S2, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858. Ko so mutantu WTΦ2972+S4 zamenjali vmesnik S4 za S1 in S2, je bila bakterija odporna na fag 858. Mutantu WTΦ858+S1S2 so nato med gene Cas in CRIPSR1 vstavili zapis za eno samo ponovitev, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858, čeprav sta bila vmesnika S1 in S2 v lokusu še zmeraj prisotna. To dokazuje, da vmesniki sami po sebi ne povzročijo odpornosti.

Ker je že obstajala hipoteza, da so pri tem procesu pomembni tudi Cas geni, so v istem mutantu WTΦ858+S1S2 izbrisali gen ''cas5'' ali ''cas7''. Bakterija z izbrisanim genom ''cas5'' ni bila več odporna na fag 858, iz česar so sklepali, da Cas5 deluje kot nukleaza (ker vsebuje HNH-nukleazni motiv). V bakteriji z inaktiviranim genom ''cas7'' pa je odpornost na fag 858 ostala nespremenjena. Predvidevali so, da je Cas7 vpleten v sintezo in/ali insercijo dodatnih vmesnikov in ponovitev.

===RAZISKAVA O VPLIVU NA OMEJITEV HORIZONTALNEGA PRENOSA GENOV S POMOČJO CRISPR PRI BAKTERIJAH ''STAPHYLOCOCCUS''===

Pri odkrivanju vloge, ki jo pri omejevanju horizontalnega prenosa genov, predvsem s konjugacijo in transformacijo, igra mehanizem CRISPR, je pomemben del prispevala raziskava L. A. Marraffinija in E. J. Sontheimerja iz leta 2008. Raziskave sta se lotila zaradi vse večjega porasta bakterij ''Staphylococcus aureus'', rezistentnih na antibiotika meticilin in vankomicin, ki je posledica horizontalnega prenosa plazmidov iz bakterij ''Staphylococcus epidermis''. Gre za najpogostejši vrsti bakterij pri bolnišničnih okužbah.

Raziskava je potrdila dve hipotezi. Prva je bila potrjena s pomočjo že prej odkrite identičnosti vmesnika CRISPR ''spcI'' pri ''S. epidermis'' z zaporedjem ''nes'' (zapis za topoizomerazo I), najdenem na vseh izoliranih plazmidih, ki se konjugirajo med omenjenima vrstama bakterij. Ta lastnost nastali crRNA omogoči prepoznavanje konjugiranega plazmida in tako prepreči horizontalen prenos te DNA znotraj vrste. Druga značilnost CRISPR sistema, ki so jo potrdili, je delovanje na nivoju plazmidne DNA, in ne RNA kot je bilo pokazano pri evkariontskih celicah, kar je še dodatno podprlo vprašanje o sistemu, s katerim celica preprečuje napad lastne DNA z zapisom CRISPR.

V raziskavi so uporabili dva seva S. epidermis, in sicer RP62a, ki vsebuje zaporedje CRISPR ter spremljajoče gene (med drugim tudi ''cas''), ter njegovo različico LAM104, ki ima deletiran CRISPR del. Kontrolo so izvajali na sevu ''S. epidermis'' brez zaporedja CRISPR, ATCC 12228. Kot vir plazmidov so uporabili sev ''S. aureus RN4220''. Da bi dokazali, da ''spc1'' preprečuje konjugacijo plazmidov v seve s CRISPR (torej sev RP62a), so v ''nes'' zaporedje plazmida pG0400 (krajše pG0(wt)) vstavili 9 tihih mutacij. Novonastali plazmid so poimenovali pG0(mut). Uspešnost konjugacije je bila pri kontrolnem sevu enaka za oba plazmida (po pričakovanjih), medtem ko je bila pri sevu RP62a uspešna le za pG0(mut), kar je potrdilo hipotezo o preprečitvi konjugacije s pomočjo dela zaporedja CRISPR, ki je enak enemu od plazmidnih genov. Da bi izključili morebitno vlogo ostalih razlik v genomu med poskusnim in kontrolnim sevom, so bakterijam iz RP62a deletirali CRISPR sekvenco z vmesniki in nov sev poimenovali LAM104. Ponoven poskus konjugacije je potrdil rezultate, pridobljene s kontrolnim sevom.

Drugi del raziskave je preverjal, ali crRNA deluje na plazmidno DNA ali RNA. Dokazi, da CRISPR v RP62a onemogoča sprejemanje plazmidov z ''nes'', ne pa njihovega oddajanja drugim celicam, kažejo na to, da ta mehanizem očitno ne vpliva na RNA prepis ''nes'', temveč na DNA. Iz tega lahko sklepamo tudi, da je crRNA identična (in ne komplementarna) ''nes'' mRNA. Da bi ta predvidevanja potrdili, so v regijo ''nes'' na plazmidu pG0400 vnesli samoizrezujoče se introne iz skupine I in tako pridobili okrnjen zapis DNA (pG0(I2)), ki pa se po prepisu v RNA sprocesira do identičnega proteina kot originalno zaporedje. Poskusi so pokazali enako uspešnost konjugacije pri sevu, ki vsebuje CRISPR (RP62a) ter pri sevu, ki ga ne (LAM104 in kontrolni sev ATCC 12228), kar potrjuje, da crRNA ne prepozna zaporedja DNA, če to vsebuje introne in torej ne prepreči vnosa tujega plazmida v celico. Na podoben način so izvedli tudi poskus s transformacijo, ki je dal enake rezultate in potrdil, da CRISPR ne prepozna tarčnega zaporedja, ki vsebuje introne. Ker so transformacijo opravili z elektroporacijo dvoverižne DNA v bakterijske celice, ostaja ta mehanizem pri naravni transformaciji, pri kateri lahko DNA prehaja tudi v enoverižni obliki, še nepotrjen.

==VIRI IN LITERATURA==

*M. Starčič Erjavec in D. Žgur-Bertok, Teoretične osnove in navodila za vaje pri predmetu Molekulska biologija genov. Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo, 2017.
*B. N. J. Watson, R. H. J. Staals, and P. C. Fineran, “CRISPR-Cas-Mediated Phage Resistance Enhances Horizontal Gene Transfer by Transduction.,” MBio, vol. 9, no. 1, pp. e02406-17, Mar. 2018.
*R. Barrangou, “The roles of CRISPR–Cas systems in adaptive immunity and beyond,” Curr. Opin. Immunol., vol. 32, pp. 36–41, Feb. 2015.
*R. Barrangou et al., “CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes,” Science (80-. )., vol. 315, no. 5819, pp. 1709–1712, Mar. 2007.
*L. A. Marraffini and E. J. Sontheimer, “CRISPR Interference Limits Horizontal Gene Transfer in Staphylococci by Targeting DNA,” Science (80-. )., vol. 322, no. 5909, pp. 1843–1845, Dec. 2008.

Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov

2019-04-15T17:29:39Z

Nika Mikulič: /* UVOD */

==UVOD==
Horizontalni prenos genov predstavlja velik doprinos k diverziteti v evoluciji, ni pa nujno zmeraj ugoden; lahko je celo škodljiv. Zato so bakterije in arheje razvile sistem regulacije horizontalnega prenosa genov, imenovan CRISPR/Cas (iz ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins). Tak imunski sistem vase integrira kose (vmesnike) DNA bakteriofaga, za zagotovitev odpornosti nanj pa potrebuje tudi proteine Cas. Sistem CRISPR/Cas deluje na plazmidno DNA in ne na sprocesirano RNA, kot je to sicer značilno za evkarionte.

== ODKRITJE VLOGE CRISPR/Cas PRI OMEJEVANJU VNOSA PLAZMIDOV==

===HORIZONTALNI PRENOS GENOV===

Horizontalni ali lateralni prenos genov je prenos DNA iz enega enoceličarja na drugega. Prisoten je predvsem pri prokariontih, se pa pojavlja tudi pri evkariontskih organizmih. Za razliko od vertikalnega prenosa, kjer gre za prenos starševskih genov na potomce, tu celice prevzemajo gene iz okolice oz. od drugih organizmov. Tako pride do prenosa med različnimi vrstami. Poznamo tri glavne načine prenosa genov: transformacijo, konjugacijo in transdukcijo. Pri transformaciji gre za sprejem tuje, prosto plavajoče molekule DNA iz okolice, ki je na primer do tja prišla iz nekega drugega mrtvega mikroorganizma. Pri tem je pomembno, da so celice, ki sprejemajo tujo DNA, kompetentne. Kompetentnost je začasno stanje, ki se pojavi kot odziv na stresne spremembe v okolju. Pri naravni transformaciji postanejo kompetentne v nekem specifičnem času svojega življenja, medtem ko pri umetni transformaciji kompetentnost izzovemo z različnimi solmi (npr. CaCl2) oz. z opazno spremembo temperature. Transdukcija poteka z bakteriofagi, ki prenašajo DNA iz druge bakterijske celice. Pogoj za konjugacijo pa je, da morata biti dve celici začasno fizično povezani. Prek te povezave nato preide DNA v drug enocelični organizem. Ves zapis za konjugacijo se nahaja na konjugativnih plazmidih, izmed katerih je najbolj preučen F plazmid, ki se nahaja v donorski bakteriji (F+). Donorska bakterija sintetizira na svoji površini konjugativni pilus, s katerim prepozna prejemniško bakterijo (F-). Ob vezavi nanjo se pilus skrajša, s čimer sta si bakteriji bližje, med njima pa se vzpostavi konjugativna pora. Na mestu OriT pride do reza ene od verig F plazmida. Prerezana enoverižna DNA vstopi v F- s 5'-koncem, pri čemer se hkrati sintetizirata manjkajoča dela verige v obeh bakterijah. Nato se prenesena DNA zaokroži, s čimer dobimo novo donorsko bakterijo. Začetki odkritij horizontalnega prenosa genov segajo v leto 1959, ko so s transdukcijo prenesli genetski material ''Escherichie coli'' v ''Salmonello Typhimurium''. Bolj razsežno pa so pojav začeli spremljati, ko so ugotovili, da je vse več bakterij odpornih na vse več različnih antibiotikov, česar ni bilo mogoče pojasniti z vertikalnim prenosom genov.

V laboratoriju so prenos genov izvajali na način, ki je preprostejši od naštetih mehanizmov. Ovojnico enoceličarja so predrli mehansko, s ''pre-stresanjem'' z zrnci stekla. Analogija takšnega prenosa se dogaja tudi v naravi. Delci peska v reki se na primer s pomočjo vodnega toka povzdignejo iz tal, pri čemer prihaja do mehanskega drgnjenja s številnimi mikroorganizmi, ki se v vrtincu nahajajo. S predrtjem ovojnice, lahko tuja DNA vstopi v predrt organizem. Ovojnico lahko predremo tudi z občutnim spreminjanjem temperature, zdaj pa to počnejo predvsem z elektroporacijo, metodo odkrito pred štirimi desetletji. Elektroporacija je enostaven način, s katerim prenesemo dedni material z izpostavitvijo mikroorganizmov močnim, kratkim, visoko-električno napetostnim pulzom. Ti ovojnico naluknjajo tako, da lahko DNA med celicami prehaja. Če je ovojnica naluknjana ravno dovolj, da mikroorganizem še vedno preživi, ko DNA vstopi v celico, se v večini primerov začne tuja DNA izražati. Ker prej omenjeni glavni mehanizmi temeljijo na proteinih, katerih delovanje je zelo omejeno in so se razvili šele tekom evolucije, se je Slovenec dr. Tadej Kotnik začel spraševati, če obstaja preprost fizikalni mehanizem, ki deluje že vse od nastanka življenja. Analogijo elektroporacije v laboratoriju je našel v nevihtni streli ter napisal študijo o nevihtni streli kot naravnem mehanizmu prenosa genov ter jo objavil v reviji Physics of Life Reviews. Njegovo razmišljanje temelji na sledečih dejstvih; dnevno udari na zemeljsko površje več 10 milijonov strel. Kjer ob zemljo udari strela, se elektroporira en kubični meter, na katerem živi od 100 do 1000 milijonov mikroorganizmov. Po prej opisanem mehanizmu elektroporacije lahko v naravi pride do prenosa genov na veliko preprostejši način in omogoča vnos tujega genskega materiala tako v prokarionte kot tudi evkarionte.

===IMUNSKI SISTEM CRISPR/Cas===

Sistem CRISPR/Cas deluje kot imunski sistem bakterij in arhej. Deluje tako, da koščke tuje DNA po vstopu v celico integrira v lokus CRISPR. Take koščke imenujemo vmesniki (prekinjajo pa jih t. i. ponovitve) in služijo kot nekakšen spomin imunskega sistema. Ta se v procesu transkripcije prepiše v molekulo crRNA (CRISPR RNA), ki usmerja proteine Cas na tarčno zaporedje. Proteini Cas so endonukleaze, ki tako prepoznajo specifično tujo DNA, jo cepijo in razgradijo.

===RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE ''STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS''===

Da so vmesniki v resnici homologi tujih plazmidov, so sprva ugotovili z in silico analizami, ki so vodile do različnih hipotez o vlogah sistema CRISPR. V raziskavi iz leta 2007 so analizirali več sevov bakterije ''Streptococcus thermophilus'' za katere je značilno, da imajo dva lokusa CRISPR, oni pa so se omejili predvsem na CRISPR1.

Najprej so preverili hipotezo, da se med pridobitvijo odpornosti spremeni tudi bakterijski lokus CRISPR. Izbrali so sev ''Streptococcus thermophilus'' DGCC7710 divjega tipa (WT) in dva virulentna bakteriofaga, fag 858 in fag 2972, katerih genoma sta 93 % identična. Neodvisno med sabo so pripravili devet različnih mutantov bakterije z izpostavitvijo okužbi s fagom 858, fagom 2972 ali obema hkrati (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F1.large.jpg]), nato pa so analizirali njihov lokus CRISPR. V divjem tipu bakterij je bilo opaznih 32, v mutantih pa še dodatnih 1 do 4 vmesnikov. Po pričakovanjih iz prejšnjih poskusov so ugotovili, da se novi vmesniki vstavijo predvsem v vodilno zaporedje lokusa CRISPR. S sekvenciranjem so našli podobnost med dodatnimi vmesniki v mutiranih sevih in genomom fagov, katerim so bili izpostavljeni. Zanimivo je bilo, da so bile podobnosti najdene po celotnem genomu virusa, na kodirajočih in nekodirajočih zaporedjih. S temi ugotovitvami so dokazali, da se lokus CRISPR po okužbi z virusom spremeni tako, da v lastno zaporedje vstavi dodatne vmesnike, ki jih pridobi iz DNA virusa.

Opazili so, da je bila od tega, kateri vmesnik se je v lokus CRISPR vstavil, odvisna tudi rezistenca na fage; pri sevih, v katerih je bil vstavljeni vmesnik 100 % enak zaporedju faga, se je pojavila odpornost. Ker sta faga 858 in 2972 93 % identična, so vmesniki iz bolj ohranjenih regij (vmesniki S3, S6, S7) povzročili odpornost na oba faga. V primerih, ko pa je bilo med 29 – 30 nukleotidi prisotnih 1 – 15 nukleotidnih polimorfizmov, pa tak vmesnik (vmesnik S1, S2, S4, S5 in S8) ni več povzročil rezistence na oba, ampak samo na fag, kateremu je bil izpostavljen. Prav tako je v mutantih, v katerih je bilo vstavljenih več vmesnikov, bila odpornost višja. Med seboj so primerjali tudi odpornost bakterij po tem, ko so iz lokusa CRISPR izbrisali ali dodali vmesnike (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F3.large.jpg]). Iz mutanta WTΦ858+S1S2 so odstranili vmesnika S1 in S2, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858. Ko so mutantu WTΦ2972+S4 zamenjali vmesnik S4 za S1 in S2, je bila bakterija odporna na fag 858. Mutantu WTΦ858+S1S2 so nato med gene Cas in CRIPSR1 vstavili zapis za eno samo ponovitev, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858, čeprav sta bila vmesnika S1 in S2 v lokusu še zmeraj prisotna. To dokazuje, da vmesniki sami po sebi ne povzročijo odpornosti.

Ker je že obstajala hipoteza, da so pri tem procesu pomembni tudi Cas geni, so v istem mutantu WTΦ858+S1S2 izbrisali gen ''cas5'' ali ''cas7''. Bakterija z izbrisanim genom ''cas5'' ni bila več odporna na fag 858, iz česar so sklepali, da Cas5 deluje kot nukleaza (ker vsebuje HNH-nukleazni motiv). V bakteriji z inaktiviranim genom ''cas7'' pa je odpornost na fag 858 ostala nespremenjena. Predvidevali so, da je Cas7 vpleten v sintezo in/ali insercijo dodatnih vmesnikov in ponovitev.

===RAZISKAVA O VPLIVU NA OMEJITEV HORIZONTALNEGA PRENOSA GENOV S POMOČJO CRISPR PRI BAKTERIJAH ''STAPHYLOCOCCUS''===

Pri odkrivanju vloge, ki jo pri omejevanju horizontalnega prenosa genov, predvsem s konjugacijo in transformacijo, igra mehanizem CRISPR, je pomemben del prispevala raziskava L. A. Marraffinija in E. J. Sontheimerja iz leta 2008. Raziskave sta se lotila zaradi vse večjega porasta bakterij ''Staphylococcus aureus'', rezistentnih na antibiotika meticilin in vankomicin, ki je posledica horizontalnega prenosa plazmidov iz bakterij ''Staphylococcus epidermis''. Gre za najpogostejši vrsti bakterij pri bolnišničnih okužbah.

Raziskava je potrdila dve hipotezi. Prva je bila potrjena s pomočjo že prej odkrite identičnosti vmesnika CRISPR ''spcI'' pri ''S. epidermis'' z zaporedjem ''nes'' (zapis za topoizomerazo I), najdenem na vseh izoliranih plazmidih, ki se konjugirajo med omenjenima vrstama bakterij. Ta lastnost nastali crRNA omogoči prepoznavanje konjugiranega plazmida in tako prepreči horizontalen prenos te DNA znotraj vrste. Druga značilnost CRISPR sistema, ki so jo potrdili, je delovanje na nivoju plazmidne DNA, in ne RNA kot je bilo pokazano pri evkariontskih celicah, kar je še dodatno podprlo vprašanje o sistemu, s katerim celica preprečuje napad lastne DNA z zapisom CRISPR.

V raziskavi so uporabili dva seva S. epidermis, in sicer RP62a, ki vsebuje zaporedje CRISPR ter spremljajoče gene (med drugim tudi ''cas''), ter njegovo različico LAM104, ki ima deletiran CRISPR del. Kontrolo so izvajali na sevu ''S. epidermis'' brez zaporedja CRISPR, ATCC 12228. Kot vir plazmidov so uporabili sev ''S. aureus RN4220''. Da bi dokazali, da ''spc1'' preprečuje konjugacijo plazmidov v seve s CRISPR (torej sev RP62a), so v ''nes'' zaporedje plazmida pG0400 (krajše pG0(wt)) vstavili 9 tihih mutacij. Novonastali plazmid so poimenovali pG0(mut). Uspešnost konjugacije je bila pri kontrolnem sevu enaka za oba plazmida (po pričakovanjih), medtem ko je bila pri sevu RP62a uspešna le za pG0(mut), kar je potrdilo hipotezo o preprečitvi konjugacije s pomočjo dela zaporedja CRISPR, ki je enak enemu od plazmidnih genov. Da bi izključili morebitno vlogo ostalih razlik v genomu med poskusnim in kontrolnim sevom, so bakterijam iz RP62a deletirali CRISPR sekvenco z vmesniki in nov sev poimenovali LAM104. Ponoven poskus konjugacije je potrdil rezultate, pridobljene s kontrolnim sevom.

Drugi del raziskave je preverjal, ali crRNA deluje na plazmidno DNA ali RNA. Dokazi, da CRISPR v RP62a onemogoča sprejemanje plazmidov z ''nes'', ne pa njihovega oddajanja drugim celicam, kažejo na to, da ta mehanizem očitno ne vpliva na RNA prepis ''nes'', temveč na DNA. Iz tega lahko sklepamo tudi, da je crRNA identična (in ne komplementarna) ''nes'' mRNA. Da bi ta predvidevanja potrdili, so v regijo ''nes'' na plazmidu pG0400 vnesli samoizrezujoče se introne iz skupine I in tako pridobili okrnjen zapis DNA (pG0(I2)), ki pa se po prepisu v RNA sprocesira do identičnega proteina kot originalno zaporedje. Poskusi so pokazali enako uspešnost konjugacije pri sevu, ki vsebuje CRISPR (RP62a) ter pri sevu, ki ga ne (LAM104 in kontrolni sev ATCC 12228), kar potrjuje, da crRNA ne prepozna zaporedja DNA, če to vsebuje introne in torej ne prepreči vnosa tujega plazmida v celico. Na podoben način so izvedli tudi poskus s transformacijo, ki je dal enake rezultate in potrdil, da CRISPR ne prepozna tarčnega zaporedja, ki vsebuje introne. Ker so transformacijo opravili z elektroporacijo dvoverižne DNA v bakterijske celice, ostaja ta mehanizem pri naravni transformaciji, pri kateri lahko DNA prehaja tudi v enoverižni obliki, še nepotrjen.

==VIRI IN LITERATURA==

*M. Starčič Erjavec in D. Žgur-Bertok, Teoretične osnove in navodila za vaje pri predmetu Molekulska biologija genov. Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo, 2017.
*B. N. J. Watson, R. H. J. Staals, and P. C. Fineran, “CRISPR-Cas-Mediated Phage Resistance Enhances Horizontal Gene Transfer by Transduction.,” MBio, vol. 9, no. 1, pp. e02406-17, Mar. 2018.
*R. Barrangou, “The roles of CRISPR–Cas systems in adaptive immunity and beyond,” Curr. Opin. Immunol., vol. 32, pp. 36–41, Feb. 2015.
*R. Barrangou et al., “CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes,” Science (80-. )., vol. 315, no. 5819, pp. 1709–1712, Mar. 2007.
*L. A. Marraffini and E. J. Sontheimer, “CRISPR Interference Limits Horizontal Gene Transfer in Staphylococci by Targeting DNA,” Science (80-. )., vol. 322, no. 5909, pp. 1843–1845, Dec. 2008.

Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov

2019-04-15T17:27:59Z

Nika Mikulič: /* UVOD */

==UVOD==
Horizontalni prenos genov predstavlja velik doprinos k diverziteti v evoluciji prokariontov, ni pa nujno zmeraj ugoden; lahko je zgolj nevtralen ali celo škodljiv. Zato so bakterije in arheje razvile sistem regulacije horizontalnega prenosa genov, imenovan CRISPR/Cas (iz ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins). Tak imunski sistem vase integrira kose (vmesnike) DNA bakteriofaga, za zagotovitev odpornosti nanj pa potrebuje tudi proteine Cas. Sistem CRISPR/Cas deluje na plazmidno DNA in ne na sprocesirano RNA, kot je to sicer značilno za evkarionte.

== ODKRITJE VLOGE CRISPR/Cas PRI OMEJEVANJU VNOSA PLAZMIDOV==

===HORIZONTALNI PRENOS GENOV===

Horizontalni ali lateralni prenos genov je prenos DNA iz enega enoceličarja na drugega. Prisoten je predvsem pri prokariontih, se pa pojavlja tudi pri evkariontskih organizmih. Za razliko od vertikalnega prenosa, kjer gre za prenos starševskih genov na potomce, tu celice prevzemajo gene iz okolice oz. od drugih organizmov. Tako pride do prenosa med različnimi vrstami. Poznamo tri glavne načine prenosa genov: transformacijo, konjugacijo in transdukcijo. Pri transformaciji gre za sprejem tuje, prosto plavajoče molekule DNA iz okolice, ki je na primer do tja prišla iz nekega drugega mrtvega mikroorganizma. Pri tem je pomembno, da so celice, ki sprejemajo tujo DNA, kompetentne. Kompetentnost je začasno stanje, ki se pojavi kot odziv na stresne spremembe v okolju. Pri naravni transformaciji postanejo kompetentne v nekem specifičnem času svojega življenja, medtem ko pri umetni transformaciji kompetentnost izzovemo z različnimi solmi (npr. CaCl2) oz. z opazno spremembo temperature. Transdukcija poteka z bakteriofagi, ki prenašajo DNA iz druge bakterijske celice. Pogoj za konjugacijo pa je, da morata biti dve celici začasno fizično povezani. Prek te povezave nato preide DNA v drug enocelični organizem. Ves zapis za konjugacijo se nahaja na konjugativnih plazmidih, izmed katerih je najbolj preučen F plazmid, ki se nahaja v donorski bakteriji (F+). Donorska bakterija sintetizira na svoji površini konjugativni pilus, s katerim prepozna prejemniško bakterijo (F-). Ob vezavi nanjo se pilus skrajša, s čimer sta si bakteriji bližje, med njima pa se vzpostavi konjugativna pora. Na mestu OriT pride do reza ene od verig F plazmida. Prerezana enoverižna DNA vstopi v F- s 5'-koncem, pri čemer se hkrati sintetizirata manjkajoča dela verige v obeh bakterijah. Nato se prenesena DNA zaokroži, s čimer dobimo novo donorsko bakterijo. Začetki odkritij horizontalnega prenosa genov segajo v leto 1959, ko so s transdukcijo prenesli genetski material ''Escherichie coli'' v ''Salmonello Typhimurium''. Bolj razsežno pa so pojav začeli spremljati, ko so ugotovili, da je vse več bakterij odpornih na vse več različnih antibiotikov, česar ni bilo mogoče pojasniti z vertikalnim prenosom genov.

V laboratoriju so prenos genov izvajali na način, ki je preprostejši od naštetih mehanizmov. Ovojnico enoceličarja so predrli mehansko, s ''pre-stresanjem'' z zrnci stekla. Analogija takšnega prenosa se dogaja tudi v naravi. Delci peska v reki se na primer s pomočjo vodnega toka povzdignejo iz tal, pri čemer prihaja do mehanskega drgnjenja s številnimi mikroorganizmi, ki se v vrtincu nahajajo. S predrtjem ovojnice, lahko tuja DNA vstopi v predrt organizem. Ovojnico lahko predremo tudi z občutnim spreminjanjem temperature, zdaj pa to počnejo predvsem z elektroporacijo, metodo odkrito pred štirimi desetletji. Elektroporacija je enostaven način, s katerim prenesemo dedni material z izpostavitvijo mikroorganizmov močnim, kratkim, visoko-električno napetostnim pulzom. Ti ovojnico naluknjajo tako, da lahko DNA med celicami prehaja. Če je ovojnica naluknjana ravno dovolj, da mikroorganizem še vedno preživi, ko DNA vstopi v celico, se v večini primerov začne tuja DNA izražati. Ker prej omenjeni glavni mehanizmi temeljijo na proteinih, katerih delovanje je zelo omejeno in so se razvili šele tekom evolucije, se je Slovenec dr. Tadej Kotnik začel spraševati, če obstaja preprost fizikalni mehanizem, ki deluje že vse od nastanka življenja. Analogijo elektroporacije v laboratoriju je našel v nevihtni streli ter napisal študijo o nevihtni streli kot naravnem mehanizmu prenosa genov ter jo objavil v reviji Physics of Life Reviews. Njegovo razmišljanje temelji na sledečih dejstvih; dnevno udari na zemeljsko površje več 10 milijonov strel. Kjer ob zemljo udari strela, se elektroporira en kubični meter, na katerem živi od 100 do 1000 milijonov mikroorganizmov. Po prej opisanem mehanizmu elektroporacije lahko v naravi pride do prenosa genov na veliko preprostejši način in omogoča vnos tujega genskega materiala tako v prokarionte kot tudi evkarionte.

===IMUNSKI SISTEM CRISPR/Cas===

Sistem CRISPR/Cas deluje kot imunski sistem bakterij in arhej. Deluje tako, da koščke tuje DNA po vstopu v celico integrira v lokus CRISPR. Take koščke imenujemo vmesniki (prekinjajo pa jih t. i. ponovitve) in služijo kot nekakšen spomin imunskega sistema. Ta se v procesu transkripcije prepiše v molekulo crRNA (CRISPR RNA), ki usmerja proteine Cas na tarčno zaporedje. Proteini Cas so endonukleaze, ki tako prepoznajo specifično tujo DNA, jo cepijo in razgradijo.

===RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE ''STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS''===

Da so vmesniki v resnici homologi tujih plazmidov, so sprva ugotovili z in silico analizami, ki so vodile do različnih hipotez o vlogah sistema CRISPR. V raziskavi iz leta 2007 so analizirali več sevov bakterije ''Streptococcus thermophilus'' za katere je značilno, da imajo dva lokusa CRISPR, oni pa so se omejili predvsem na CRISPR1.

Najprej so preverili hipotezo, da se med pridobitvijo odpornosti spremeni tudi bakterijski lokus CRISPR. Izbrali so sev ''Streptococcus thermophilus'' DGCC7710 divjega tipa (WT) in dva virulentna bakteriofaga, fag 858 in fag 2972, katerih genoma sta 93 % identična. Neodvisno med sabo so pripravili devet različnih mutantov bakterije z izpostavitvijo okužbi s fagom 858, fagom 2972 ali obema hkrati (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F1.large.jpg]), nato pa so analizirali njihov lokus CRISPR. V divjem tipu bakterij je bilo opaznih 32, v mutantih pa še dodatnih 1 do 4 vmesnikov. Po pričakovanjih iz prejšnjih poskusov so ugotovili, da se novi vmesniki vstavijo predvsem v vodilno zaporedje lokusa CRISPR. S sekvenciranjem so našli podobnost med dodatnimi vmesniki v mutiranih sevih in genomom fagov, katerim so bili izpostavljeni. Zanimivo je bilo, da so bile podobnosti najdene po celotnem genomu virusa, na kodirajočih in nekodirajočih zaporedjih. S temi ugotovitvami so dokazali, da se lokus CRISPR po okužbi z virusom spremeni tako, da v lastno zaporedje vstavi dodatne vmesnike, ki jih pridobi iz DNA virusa.

Opazili so, da je bila od tega, kateri vmesnik se je v lokus CRISPR vstavil, odvisna tudi rezistenca na fage; pri sevih, v katerih je bil vstavljeni vmesnik 100 % enak zaporedju faga, se je pojavila odpornost. Ker sta faga 858 in 2972 93 % identična, so vmesniki iz bolj ohranjenih regij (vmesniki S3, S6, S7) povzročili odpornost na oba faga. V primerih, ko pa je bilo med 29 – 30 nukleotidi prisotnih 1 – 15 nukleotidnih polimorfizmov, pa tak vmesnik (vmesnik S1, S2, S4, S5 in S8) ni več povzročil rezistence na oba, ampak samo na fag, kateremu je bil izpostavljen. Prav tako je v mutantih, v katerih je bilo vstavljenih več vmesnikov, bila odpornost višja. Med seboj so primerjali tudi odpornost bakterij po tem, ko so iz lokusa CRISPR izbrisali ali dodali vmesnike (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F3.large.jpg]). Iz mutanta WTΦ858+S1S2 so odstranili vmesnika S1 in S2, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858. Ko so mutantu WTΦ2972+S4 zamenjali vmesnik S4 za S1 in S2, je bila bakterija odporna na fag 858. Mutantu WTΦ858+S1S2 so nato med gene Cas in CRIPSR1 vstavili zapis za eno samo ponovitev, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858, čeprav sta bila vmesnika S1 in S2 v lokusu še zmeraj prisotna. To dokazuje, da vmesniki sami po sebi ne povzročijo odpornosti.

Ker je že obstajala hipoteza, da so pri tem procesu pomembni tudi Cas geni, so v istem mutantu WTΦ858+S1S2 izbrisali gen ''cas5'' ali ''cas7''. Bakterija z izbrisanim genom ''cas5'' ni bila več odporna na fag 858, iz česar so sklepali, da Cas5 deluje kot nukleaza (ker vsebuje HNH-nukleazni motiv). V bakteriji z inaktiviranim genom ''cas7'' pa je odpornost na fag 858 ostala nespremenjena. Predvidevali so, da je Cas7 vpleten v sintezo in/ali insercijo dodatnih vmesnikov in ponovitev.

===RAZISKAVA O VPLIVU NA OMEJITEV HORIZONTALNEGA PRENOSA GENOV S POMOČJO CRISPR PRI BAKTERIJAH ''STAPHYLOCOCCUS''===

Pri odkrivanju vloge, ki jo pri omejevanju horizontalnega prenosa genov, predvsem s konjugacijo in transformacijo, igra mehanizem CRISPR, je pomemben del prispevala raziskava L. A. Marraffinija in E. J. Sontheimerja iz leta 2008. Raziskave sta se lotila zaradi vse večjega porasta bakterij ''Staphylococcus aureus'', rezistentnih na antibiotika meticilin in vankomicin, ki je posledica horizontalnega prenosa plazmidov iz bakterij ''Staphylococcus epidermis''. Gre za najpogostejši vrsti bakterij pri bolnišničnih okužbah.

Raziskava je potrdila dve hipotezi. Prva je bila potrjena s pomočjo že prej odkrite identičnosti vmesnika CRISPR ''spcI'' pri ''S. epidermis'' z zaporedjem ''nes'' (zapis za topoizomerazo I), najdenem na vseh izoliranih plazmidih, ki se konjugirajo med omenjenima vrstama bakterij. Ta lastnost nastali crRNA omogoči prepoznavanje konjugiranega plazmida in tako prepreči horizontalen prenos te DNA znotraj vrste. Druga značilnost CRISPR sistema, ki so jo potrdili, je delovanje na nivoju plazmidne DNA, in ne RNA kot je bilo pokazano pri evkariontskih celicah, kar je še dodatno podprlo vprašanje o sistemu, s katerim celica preprečuje napad lastne DNA z zapisom CRISPR.

V raziskavi so uporabili dva seva S. epidermis, in sicer RP62a, ki vsebuje zaporedje CRISPR ter spremljajoče gene (med drugim tudi ''cas''), ter njegovo različico LAM104, ki ima deletiran CRISPR del. Kontrolo so izvajali na sevu ''S. epidermis'' brez zaporedja CRISPR, ATCC 12228. Kot vir plazmidov so uporabili sev ''S. aureus RN4220''. Da bi dokazali, da ''spc1'' preprečuje konjugacijo plazmidov v seve s CRISPR (torej sev RP62a), so v ''nes'' zaporedje plazmida pG0400 (krajše pG0(wt)) vstavili 9 tihih mutacij. Novonastali plazmid so poimenovali pG0(mut). Uspešnost konjugacije je bila pri kontrolnem sevu enaka za oba plazmida (po pričakovanjih), medtem ko je bila pri sevu RP62a uspešna le za pG0(mut), kar je potrdilo hipotezo o preprečitvi konjugacije s pomočjo dela zaporedja CRISPR, ki je enak enemu od plazmidnih genov. Da bi izključili morebitno vlogo ostalih razlik v genomu med poskusnim in kontrolnim sevom, so bakterijam iz RP62a deletirali CRISPR sekvenco z vmesniki in nov sev poimenovali LAM104. Ponoven poskus konjugacije je potrdil rezultate, pridobljene s kontrolnim sevom.

Drugi del raziskave je preverjal, ali crRNA deluje na plazmidno DNA ali RNA. Dokazi, da CRISPR v RP62a onemogoča sprejemanje plazmidov z ''nes'', ne pa njihovega oddajanja drugim celicam, kažejo na to, da ta mehanizem očitno ne vpliva na RNA prepis ''nes'', temveč na DNA. Iz tega lahko sklepamo tudi, da je crRNA identična (in ne komplementarna) ''nes'' mRNA. Da bi ta predvidevanja potrdili, so v regijo ''nes'' na plazmidu pG0400 vnesli samoizrezujoče se introne iz skupine I in tako pridobili okrnjen zapis DNA (pG0(I2)), ki pa se po prepisu v RNA sprocesira do identičnega proteina kot originalno zaporedje. Poskusi so pokazali enako uspešnost konjugacije pri sevu, ki vsebuje CRISPR (RP62a) ter pri sevu, ki ga ne (LAM104 in kontrolni sev ATCC 12228), kar potrjuje, da crRNA ne prepozna zaporedja DNA, če to vsebuje introne in torej ne prepreči vnosa tujega plazmida v celico. Na podoben način so izvedli tudi poskus s transformacijo, ki je dal enake rezultate in potrdil, da CRISPR ne prepozna tarčnega zaporedja, ki vsebuje introne. Ker so transformacijo opravili z elektroporacijo dvoverižne DNA v bakterijske celice, ostaja ta mehanizem pri naravni transformaciji, pri kateri lahko DNA prehaja tudi v enoverižni obliki, še nepotrjen.

==VIRI IN LITERATURA==

*M. Starčič Erjavec in D. Žgur-Bertok, Teoretične osnove in navodila za vaje pri predmetu Molekulska biologija genov. Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo, 2017.
*B. N. J. Watson, R. H. J. Staals, and P. C. Fineran, “CRISPR-Cas-Mediated Phage Resistance Enhances Horizontal Gene Transfer by Transduction.,” MBio, vol. 9, no. 1, pp. e02406-17, Mar. 2018.
*R. Barrangou, “The roles of CRISPR–Cas systems in adaptive immunity and beyond,” Curr. Opin. Immunol., vol. 32, pp. 36–41, Feb. 2015.
*R. Barrangou et al., “CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes,” Science (80-. )., vol. 315, no. 5819, pp. 1709–1712, Mar. 2007.
*L. A. Marraffini and E. J. Sontheimer, “CRISPR Interference Limits Horizontal Gene Transfer in Staphylococci by Targeting DNA,” Science (80-. )., vol. 322, no. 5909, pp. 1843–1845, Dec. 2008.

Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov

2019-04-15T17:22:03Z

Nika Mikulič: /* UVOD */

==UVOD==
Horizontalni prenos genov predstavlja velik doprinos k diverziteti v evoluciji prokariontov, ni pa nujno zmeraj ugoden; lahko je zgolj nevtralen ali celo škodljiv. Zato so bakterije in arheje razvile sistem regulacije horizontalnega prenosa genov, imenovan CRISPR/Cas (iz ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins).

== ODKRITJE VLOGE CRISPR/Cas PRI OMEJEVANJU VNOSA PLAZMIDOV==

===HORIZONTALNI PRENOS GENOV===

Horizontalni ali lateralni prenos genov je prenos DNA iz enega enoceličarja na drugega. Prisoten je predvsem pri prokariontih, se pa pojavlja tudi pri evkariontskih organizmih. Za razliko od vertikalnega prenosa, kjer gre za prenos starševskih genov na potomce, tu celice prevzemajo gene iz okolice oz. od drugih organizmov. Tako pride do prenosa med različnimi vrstami. Poznamo tri glavne načine prenosa genov: transformacijo, konjugacijo in transdukcijo. Pri transformaciji gre za sprejem tuje, prosto plavajoče molekule DNA iz okolice, ki je na primer do tja prišla iz nekega drugega mrtvega mikroorganizma. Pri tem je pomembno, da so celice, ki sprejemajo tujo DNA, kompetentne. Kompetentnost je začasno stanje, ki se pojavi kot odziv na stresne spremembe v okolju. Pri naravni transformaciji postanejo kompetentne v nekem specifičnem času svojega življenja, medtem ko pri umetni transformaciji kompetentnost izzovemo z različnimi solmi (npr. CaCl2) oz. z opazno spremembo temperature. Transdukcija poteka z bakteriofagi, ki prenašajo DNA iz druge bakterijske celice. Pogoj za konjugacijo pa je, da morata biti dve celici začasno fizično povezani. Prek te povezave nato preide DNA v drug enocelični organizem. Ves zapis za konjugacijo se nahaja na konjugativnih plazmidih, izmed katerih je najbolj preučen F plazmid, ki se nahaja v donorski bakteriji (F+). Donorska bakterija sintetizira na svoji površini konjugativni pilus, s katerim prepozna prejemniško bakterijo (F-). Ob vezavi nanjo se pilus skrajša, s čimer sta si bakteriji bližje, med njima pa se vzpostavi konjugativna pora. Na mestu OriT pride do reza ene od verig F plazmida. Prerezana enoverižna DNA vstopi v F- s 5'-koncem, pri čemer se hkrati sintetizirata manjkajoča dela verige v obeh bakterijah. Nato se prenesena DNA zaokroži, s čimer dobimo novo donorsko bakterijo. Začetki odkritij horizontalnega prenosa genov segajo v leto 1959, ko so s transdukcijo prenesli genetski material ''Escherichie coli'' v ''Salmonello Typhimurium''. Bolj razsežno pa so pojav začeli spremljati, ko so ugotovili, da je vse več bakterij odpornih na vse več različnih antibiotikov, česar ni bilo mogoče pojasniti z vertikalnim prenosom genov.

V laboratoriju so prenos genov izvajali na način, ki je preprostejši od naštetih mehanizmov. Ovojnico enoceličarja so predrli mehansko, s ''pre-stresanjem'' z zrnci stekla. Analogija takšnega prenosa se dogaja tudi v naravi. Delci peska v reki se na primer s pomočjo vodnega toka povzdignejo iz tal, pri čemer prihaja do mehanskega drgnjenja s številnimi mikroorganizmi, ki se v vrtincu nahajajo. S predrtjem ovojnice, lahko tuja DNA vstopi v predrt organizem. Ovojnico lahko predremo tudi z občutnim spreminjanjem temperature, zdaj pa to počnejo predvsem z elektroporacijo, metodo odkrito pred štirimi desetletji. Elektroporacija je enostaven način, s katerim prenesemo dedni material z izpostavitvijo mikroorganizmov močnim, kratkim, visoko-električno napetostnim pulzom. Ti ovojnico naluknjajo tako, da lahko DNA med celicami prehaja. Če je ovojnica naluknjana ravno dovolj, da mikroorganizem še vedno preživi, ko DNA vstopi v celico, se v večini primerov začne tuja DNA izražati. Ker prej omenjeni glavni mehanizmi temeljijo na proteinih, katerih delovanje je zelo omejeno in so se razvili šele tekom evolucije, se je Slovenec dr. Tadej Kotnik začel spraševati, če obstaja preprost fizikalni mehanizem, ki deluje že vse od nastanka življenja. Analogijo elektroporacije v laboratoriju je našel v nevihtni streli ter napisal študijo o nevihtni streli kot naravnem mehanizmu prenosa genov ter jo objavil v reviji Physics of Life Reviews. Njegovo razmišljanje temelji na sledečih dejstvih; dnevno udari na zemeljsko površje več 10 milijonov strel. Kjer ob zemljo udari strela, se elektroporira en kubični meter, na katerem živi od 100 do 1000 milijonov mikroorganizmov. Po prej opisanem mehanizmu elektroporacije lahko v naravi pride do prenosa genov na veliko preprostejši način in omogoča vnos tujega genskega materiala tako v prokarionte kot tudi evkarionte.

===IMUNSKI SISTEM CRISPR/Cas===

Sistem CRISPR/Cas deluje kot imunski sistem bakterij in arhej. Deluje tako, da koščke tuje DNA po vstopu v celico integrira v lokus CRISPR. Take koščke imenujemo vmesniki (prekinjajo pa jih t. i. ponovitve) in služijo kot nekakšen spomin imunskega sistema. Ta se v procesu transkripcije prepiše v molekulo crRNA (CRISPR RNA), ki usmerja proteine Cas na tarčno zaporedje. Proteini Cas so endonukleaze, ki tako prepoznajo specifično tujo DNA, jo cepijo in razgradijo.

===RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE ''STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS''===

Da so vmesniki v resnici homologi tujih plazmidov, so sprva ugotovili z in silico analizami, ki so vodile do različnih hipotez o vlogah sistema CRISPR. V raziskavi iz leta 2007 so analizirali več sevov bakterije ''Streptococcus thermophilus'' za katere je značilno, da imajo dva lokusa CRISPR, oni pa so se omejili predvsem na CRISPR1.

Najprej so preverili hipotezo, da se med pridobitvijo odpornosti spremeni tudi bakterijski lokus CRISPR. Izbrali so sev ''Streptococcus thermophilus'' DGCC7710 divjega tipa (WT) in dva virulentna bakteriofaga, fag 858 in fag 2972, katerih genoma sta 93 % identična. Neodvisno med sabo so pripravili devet različnih mutantov bakterije z izpostavitvijo okužbi s fagom 858, fagom 2972 ali obema hkrati (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F1.large.jpg]), nato pa so analizirali njihov lokus CRISPR. V divjem tipu bakterij je bilo opaznih 32, v mutantih pa še dodatnih 1 do 4 vmesnikov. Po pričakovanjih iz prejšnjih poskusov so ugotovili, da se novi vmesniki vstavijo predvsem v vodilno zaporedje lokusa CRISPR. S sekvenciranjem so našli podobnost med dodatnimi vmesniki v mutiranih sevih in genomom fagov, katerim so bili izpostavljeni. Zanimivo je bilo, da so bile podobnosti najdene po celotnem genomu virusa, na kodirajočih in nekodirajočih zaporedjih. S temi ugotovitvami so dokazali, da se lokus CRISPR po okužbi z virusom spremeni tako, da v lastno zaporedje vstavi dodatne vmesnike, ki jih pridobi iz DNA virusa.

Opazili so, da je bila od tega, kateri vmesnik se je v lokus CRISPR vstavil, odvisna tudi rezistenca na fage; pri sevih, v katerih je bil vstavljeni vmesnik 100 % enak zaporedju faga, se je pojavila odpornost. Ker sta faga 858 in 2972 93 % identična, so vmesniki iz bolj ohranjenih regij (vmesniki S3, S6, S7) povzročili odpornost na oba faga. V primerih, ko pa je bilo med 29 – 30 nukleotidi prisotnih 1 – 15 nukleotidnih polimorfizmov, pa tak vmesnik (vmesnik S1, S2, S4, S5 in S8) ni več povzročil rezistence na oba, ampak samo na fag, kateremu je bil izpostavljen. Prav tako je v mutantih, v katerih je bilo vstavljenih več vmesnikov, bila odpornost višja. Med seboj so primerjali tudi odpornost bakterij po tem, ko so iz lokusa CRISPR izbrisali ali dodali vmesnike (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F3.large.jpg]). Iz mutanta WTΦ858+S1S2 so odstranili vmesnika S1 in S2, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858. Ko so mutantu WTΦ2972+S4 zamenjali vmesnik S4 za S1 in S2, je bila bakterija odporna na fag 858. Mutantu WTΦ858+S1S2 so nato med gene Cas in CRIPSR1 vstavili zapis za eno samo ponovitev, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858, čeprav sta bila vmesnika S1 in S2 v lokusu še zmeraj prisotna. To dokazuje, da vmesniki sami po sebi ne povzročijo odpornosti.

Ker je že obstajala hipoteza, da so pri tem procesu pomembni tudi Cas geni, so v istem mutantu WTΦ858+S1S2 izbrisali gen ''cas5'' ali ''cas7''. Bakterija z izbrisanim genom ''cas5'' ni bila več odporna na fag 858, iz česar so sklepali, da Cas5 deluje kot nukleaza (ker vsebuje HNH-nukleazni motiv). V bakteriji z inaktiviranim genom ''cas7'' pa je odpornost na fag 858 ostala nespremenjena. Predvidevali so, da je Cas7 vpleten v sintezo in/ali insercijo dodatnih vmesnikov in ponovitev.

===RAZISKAVA O VPLIVU NA OMEJITEV HORIZONTALNEGA PRENOSA GENOV S POMOČJO CRISPR PRI BAKTERIJAH ''STAPHYLOCOCCUS''===

Pri odkrivanju vloge, ki jo pri omejevanju horizontalnega prenosa genov, predvsem s konjugacijo in transformacijo, igra mehanizem CRISPR, je pomemben del prispevala raziskava L. A. Marraffinija in E. J. Sontheimerja iz leta 2008. Raziskave sta se lotila zaradi vse večjega porasta bakterij ''Staphylococcus aureus'', rezistentnih na antibiotika meticilin in vankomicin, ki je posledica horizontalnega prenosa plazmidov iz bakterij ''Staphylococcus epidermis''. Gre za najpogostejši vrsti bakterij pri bolnišničnih okužbah.

Raziskava je potrdila dve hipotezi. Prva je bila potrjena s pomočjo že prej odkrite identičnosti vmesnika CRISPR ''spcI'' pri ''S. epidermis'' z zaporedjem ''nes'' (zapis za topoizomerazo I), najdenem na vseh izoliranih plazmidih, ki se konjugirajo med omenjenima vrstama bakterij. Ta lastnost nastali crRNA omogoči prepoznavanje konjugiranega plazmida in tako prepreči horizontalen prenos te DNA znotraj vrste. Druga značilnost CRISPR sistema, ki so jo potrdili, je delovanje na nivoju plazmidne DNA, in ne RNA kot je bilo pokazano pri evkariontskih celicah, kar je še dodatno podprlo vprašanje o sistemu, s katerim celica preprečuje napad lastne DNA z zapisom CRISPR.

V raziskavi so uporabili dva seva S. epidermis, in sicer RP62a, ki vsebuje zaporedje CRISPR ter spremljajoče gene (med drugim tudi ''cas''), ter njegovo različico LAM104, ki ima deletiran CRISPR del. Kontrolo so izvajali na sevu ''S. epidermis'' brez zaporedja CRISPR, ATCC 12228. Kot vir plazmidov so uporabili sev ''S. aureus RN4220''. Da bi dokazali, da ''spc1'' preprečuje konjugacijo plazmidov v seve s CRISPR (torej sev RP62a), so v ''nes'' zaporedje plazmida pG0400 (krajše pG0(wt)) vstavili 9 tihih mutacij. Novonastali plazmid so poimenovali pG0(mut). Uspešnost konjugacije je bila pri kontrolnem sevu enaka za oba plazmida (po pričakovanjih), medtem ko je bila pri sevu RP62a uspešna le za pG0(mut), kar je potrdilo hipotezo o preprečitvi konjugacije s pomočjo dela zaporedja CRISPR, ki je enak enemu od plazmidnih genov. Da bi izključili morebitno vlogo ostalih razlik v genomu med poskusnim in kontrolnim sevom, so bakterijam iz RP62a deletirali CRISPR sekvenco z vmesniki in nov sev poimenovali LAM104. Ponoven poskus konjugacije je potrdil rezultate, pridobljene s kontrolnim sevom.

Drugi del raziskave je preverjal, ali crRNA deluje na plazmidno DNA ali RNA. Dokazi, da CRISPR v RP62a onemogoča sprejemanje plazmidov z ''nes'', ne pa njihovega oddajanja drugim celicam, kažejo na to, da ta mehanizem očitno ne vpliva na RNA prepis ''nes'', temveč na DNA. Iz tega lahko sklepamo tudi, da je crRNA identična (in ne komplementarna) ''nes'' mRNA. Da bi ta predvidevanja potrdili, so v regijo ''nes'' na plazmidu pG0400 vnesli samoizrezujoče se introne iz skupine I in tako pridobili okrnjen zapis DNA (pG0(I2)), ki pa se po prepisu v RNA sprocesira do identičnega proteina kot originalno zaporedje. Poskusi so pokazali enako uspešnost konjugacije pri sevu, ki vsebuje CRISPR (RP62a) ter pri sevu, ki ga ne (LAM104 in kontrolni sev ATCC 12228), kar potrjuje, da crRNA ne prepozna zaporedja DNA, če to vsebuje introne in torej ne prepreči vnosa tujega plazmida v celico. Na podoben način so izvedli tudi poskus s transformacijo, ki je dal enake rezultate in potrdil, da CRISPR ne prepozna tarčnega zaporedja, ki vsebuje introne. Ker so transformacijo opravili z elektroporacijo dvoverižne DNA v bakterijske celice, ostaja ta mehanizem pri naravni transformaciji, pri kateri lahko DNA prehaja tudi v enoverižni obliki, še nepotrjen.

==VIRI IN LITERATURA==

*M. Starčič Erjavec in D. Žgur-Bertok, Teoretične osnove in navodila za vaje pri predmetu Molekulska biologija genov. Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo, 2017.
*B. N. J. Watson, R. H. J. Staals, and P. C. Fineran, “CRISPR-Cas-Mediated Phage Resistance Enhances Horizontal Gene Transfer by Transduction.,” MBio, vol. 9, no. 1, pp. e02406-17, Mar. 2018.
*R. Barrangou, “The roles of CRISPR–Cas systems in adaptive immunity and beyond,” Curr. Opin. Immunol., vol. 32, pp. 36–41, Feb. 2015.
*R. Barrangou et al., “CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes,” Science (80-. )., vol. 315, no. 5819, pp. 1709–1712, Mar. 2007.
*L. A. Marraffini and E. J. Sontheimer, “CRISPR Interference Limits Horizontal Gene Transfer in Staphylococci by Targeting DNA,” Science (80-. )., vol. 322, no. 5909, pp. 1843–1845, Dec. 2008.

Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov

2019-04-15T17:21:27Z

Nika Mikulič: /* UVOD */

==UVOD==
Horizontalni prenos genov predstavlja velik doprinos k diverziteti v evoluciji prokariontov, ni pa nujno zmeraj ugoden; lahko je zgolj nevtralen ali celo škodljiv. Zato so bakterije in arheje razvile sistem regulacije horizontalnega prenosa genov, imenovan CRISPR/Cas (iz ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins). Tak imunski sistem prokariontov uporablja dele bakteriofagne DNK, ki

== ODKRITJE VLOGE CRISPR/Cas PRI OMEJEVANJU VNOSA PLAZMIDOV==

===HORIZONTALNI PRENOS GENOV===

Horizontalni ali lateralni prenos genov je prenos DNA iz enega enoceličarja na drugega. Prisoten je predvsem pri prokariontih, se pa pojavlja tudi pri evkariontskih organizmih. Za razliko od vertikalnega prenosa, kjer gre za prenos starševskih genov na potomce, tu celice prevzemajo gene iz okolice oz. od drugih organizmov. Tako pride do prenosa med različnimi vrstami. Poznamo tri glavne načine prenosa genov: transformacijo, konjugacijo in transdukcijo. Pri transformaciji gre za sprejem tuje, prosto plavajoče molekule DNA iz okolice, ki je na primer do tja prišla iz nekega drugega mrtvega mikroorganizma. Pri tem je pomembno, da so celice, ki sprejemajo tujo DNA, kompetentne. Kompetentnost je začasno stanje, ki se pojavi kot odziv na stresne spremembe v okolju. Pri naravni transformaciji postanejo kompetentne v nekem specifičnem času svojega življenja, medtem ko pri umetni transformaciji kompetentnost izzovemo z različnimi solmi (npr. CaCl2) oz. z opazno spremembo temperature. Transdukcija poteka z bakteriofagi, ki prenašajo DNA iz druge bakterijske celice. Pogoj za konjugacijo pa je, da morata biti dve celici začasno fizično povezani. Prek te povezave nato preide DNA v drug enocelični organizem. Ves zapis za konjugacijo se nahaja na konjugativnih plazmidih, izmed katerih je najbolj preučen F plazmid, ki se nahaja v donorski bakteriji (F+). Donorska bakterija sintetizira na svoji površini konjugativni pilus, s katerim prepozna prejemniško bakterijo (F-). Ob vezavi nanjo se pilus skrajša, s čimer sta si bakteriji bližje, med njima pa se vzpostavi konjugativna pora. Na mestu OriT pride do reza ene od verig F plazmida. Prerezana enoverižna DNA vstopi v F- s 5'-koncem, pri čemer se hkrati sintetizirata manjkajoča dela verige v obeh bakterijah. Nato se prenesena DNA zaokroži, s čimer dobimo novo donorsko bakterijo. Začetki odkritij horizontalnega prenosa genov segajo v leto 1959, ko so s transdukcijo prenesli genetski material ''Escherichie coli'' v ''Salmonello Typhimurium''. Bolj razsežno pa so pojav začeli spremljati, ko so ugotovili, da je vse več bakterij odpornih na vse več različnih antibiotikov, česar ni bilo mogoče pojasniti z vertikalnim prenosom genov.

V laboratoriju so prenos genov izvajali na način, ki je preprostejši od naštetih mehanizmov. Ovojnico enoceličarja so predrli mehansko, s ''pre-stresanjem'' z zrnci stekla. Analogija takšnega prenosa se dogaja tudi v naravi. Delci peska v reki se na primer s pomočjo vodnega toka povzdignejo iz tal, pri čemer prihaja do mehanskega drgnjenja s številnimi mikroorganizmi, ki se v vrtincu nahajajo. S predrtjem ovojnice, lahko tuja DNA vstopi v predrt organizem. Ovojnico lahko predremo tudi z občutnim spreminjanjem temperature, zdaj pa to počnejo predvsem z elektroporacijo, metodo odkrito pred štirimi desetletji. Elektroporacija je enostaven način, s katerim prenesemo dedni material z izpostavitvijo mikroorganizmov močnim, kratkim, visoko-električno napetostnim pulzom. Ti ovojnico naluknjajo tako, da lahko DNA med celicami prehaja. Če je ovojnica naluknjana ravno dovolj, da mikroorganizem še vedno preživi, ko DNA vstopi v celico, se v večini primerov začne tuja DNA izražati. Ker prej omenjeni glavni mehanizmi temeljijo na proteinih, katerih delovanje je zelo omejeno in so se razvili šele tekom evolucije, se je Slovenec dr. Tadej Kotnik začel spraševati, če obstaja preprost fizikalni mehanizem, ki deluje že vse od nastanka življenja. Analogijo elektroporacije v laboratoriju je našel v nevihtni streli ter napisal študijo o nevihtni streli kot naravnem mehanizmu prenosa genov ter jo objavil v reviji Physics of Life Reviews. Njegovo razmišljanje temelji na sledečih dejstvih; dnevno udari na zemeljsko površje več 10 milijonov strel. Kjer ob zemljo udari strela, se elektroporira en kubični meter, na katerem živi od 100 do 1000 milijonov mikroorganizmov. Po prej opisanem mehanizmu elektroporacije lahko v naravi pride do prenosa genov na veliko preprostejši način in omogoča vnos tujega genskega materiala tako v prokarionte kot tudi evkarionte.

===IMUNSKI SISTEM CRISPR/Cas===

Sistem CRISPR/Cas deluje kot imunski sistem bakterij in arhej. Deluje tako, da koščke tuje DNA po vstopu v celico integrira v lokus CRISPR. Take koščke imenujemo vmesniki (prekinjajo pa jih t. i. ponovitve) in služijo kot nekakšen spomin imunskega sistema. Ta se v procesu transkripcije prepiše v molekulo crRNA (CRISPR RNA), ki usmerja proteine Cas na tarčno zaporedje. Proteini Cas so endonukleaze, ki tako prepoznajo specifično tujo DNA, jo cepijo in razgradijo.

===RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE ''STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS''===

Da so vmesniki v resnici homologi tujih plazmidov, so sprva ugotovili z in silico analizami, ki so vodile do različnih hipotez o vlogah sistema CRISPR. V raziskavi iz leta 2007 so analizirali več sevov bakterije ''Streptococcus thermophilus'' za katere je značilno, da imajo dva lokusa CRISPR, oni pa so se omejili predvsem na CRISPR1.

Najprej so preverili hipotezo, da se med pridobitvijo odpornosti spremeni tudi bakterijski lokus CRISPR. Izbrali so sev ''Streptococcus thermophilus'' DGCC7710 divjega tipa (WT) in dva virulentna bakteriofaga, fag 858 in fag 2972, katerih genoma sta 93 % identična. Neodvisno med sabo so pripravili devet različnih mutantov bakterije z izpostavitvijo okužbi s fagom 858, fagom 2972 ali obema hkrati (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F1.large.jpg]), nato pa so analizirali njihov lokus CRISPR. V divjem tipu bakterij je bilo opaznih 32, v mutantih pa še dodatnih 1 do 4 vmesnikov. Po pričakovanjih iz prejšnjih poskusov so ugotovili, da se novi vmesniki vstavijo predvsem v vodilno zaporedje lokusa CRISPR. S sekvenciranjem so našli podobnost med dodatnimi vmesniki v mutiranih sevih in genomom fagov, katerim so bili izpostavljeni. Zanimivo je bilo, da so bile podobnosti najdene po celotnem genomu virusa, na kodirajočih in nekodirajočih zaporedjih. S temi ugotovitvami so dokazali, da se lokus CRISPR po okužbi z virusom spremeni tako, da v lastno zaporedje vstavi dodatne vmesnike, ki jih pridobi iz DNA virusa.

Opazili so, da je bila od tega, kateri vmesnik se je v lokus CRISPR vstavil, odvisna tudi rezistenca na fage; pri sevih, v katerih je bil vstavljeni vmesnik 100 % enak zaporedju faga, se je pojavila odpornost. Ker sta faga 858 in 2972 93 % identična, so vmesniki iz bolj ohranjenih regij (vmesniki S3, S6, S7) povzročili odpornost na oba faga. V primerih, ko pa je bilo med 29 – 30 nukleotidi prisotnih 1 – 15 nukleotidnih polimorfizmov, pa tak vmesnik (vmesnik S1, S2, S4, S5 in S8) ni več povzročil rezistence na oba, ampak samo na fag, kateremu je bil izpostavljen. Prav tako je v mutantih, v katerih je bilo vstavljenih več vmesnikov, bila odpornost višja. Med seboj so primerjali tudi odpornost bakterij po tem, ko so iz lokusa CRISPR izbrisali ali dodali vmesnike (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F3.large.jpg]). Iz mutanta WTΦ858+S1S2 so odstranili vmesnika S1 in S2, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858. Ko so mutantu WTΦ2972+S4 zamenjali vmesnik S4 za S1 in S2, je bila bakterija odporna na fag 858. Mutantu WTΦ858+S1S2 so nato med gene Cas in CRIPSR1 vstavili zapis za eno samo ponovitev, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858, čeprav sta bila vmesnika S1 in S2 v lokusu še zmeraj prisotna. To dokazuje, da vmesniki sami po sebi ne povzročijo odpornosti.

Ker je že obstajala hipoteza, da so pri tem procesu pomembni tudi Cas geni, so v istem mutantu WTΦ858+S1S2 izbrisali gen ''cas5'' ali ''cas7''. Bakterija z izbrisanim genom ''cas5'' ni bila več odporna na fag 858, iz česar so sklepali, da Cas5 deluje kot nukleaza (ker vsebuje HNH-nukleazni motiv). V bakteriji z inaktiviranim genom ''cas7'' pa je odpornost na fag 858 ostala nespremenjena. Predvidevali so, da je Cas7 vpleten v sintezo in/ali insercijo dodatnih vmesnikov in ponovitev.

===RAZISKAVA O VPLIVU NA OMEJITEV HORIZONTALNEGA PRENOSA GENOV S POMOČJO CRISPR PRI BAKTERIJAH ''STAPHYLOCOCCUS''===

Pri odkrivanju vloge, ki jo pri omejevanju horizontalnega prenosa genov, predvsem s konjugacijo in transformacijo, igra mehanizem CRISPR, je pomemben del prispevala raziskava L. A. Marraffinija in E. J. Sontheimerja iz leta 2008. Raziskave sta se lotila zaradi vse večjega porasta bakterij ''Staphylococcus aureus'', rezistentnih na antibiotika meticilin in vankomicin, ki je posledica horizontalnega prenosa plazmidov iz bakterij ''Staphylococcus epidermis''. Gre za najpogostejši vrsti bakterij pri bolnišničnih okužbah.

Raziskava je potrdila dve hipotezi. Prva je bila potrjena s pomočjo že prej odkrite identičnosti vmesnika CRISPR ''spcI'' pri ''S. epidermis'' z zaporedjem ''nes'' (zapis za topoizomerazo I), najdenem na vseh izoliranih plazmidih, ki se konjugirajo med omenjenima vrstama bakterij. Ta lastnost nastali crRNA omogoči prepoznavanje konjugiranega plazmida in tako prepreči horizontalen prenos te DNA znotraj vrste. Druga značilnost CRISPR sistema, ki so jo potrdili, je delovanje na nivoju plazmidne DNA, in ne RNA kot je bilo pokazano pri evkariontskih celicah, kar je še dodatno podprlo vprašanje o sistemu, s katerim celica preprečuje napad lastne DNA z zapisom CRISPR.

V raziskavi so uporabili dva seva S. epidermis, in sicer RP62a, ki vsebuje zaporedje CRISPR ter spremljajoče gene (med drugim tudi ''cas''), ter njegovo različico LAM104, ki ima deletiran CRISPR del. Kontrolo so izvajali na sevu ''S. epidermis'' brez zaporedja CRISPR, ATCC 12228. Kot vir plazmidov so uporabili sev ''S. aureus RN4220''. Da bi dokazali, da ''spc1'' preprečuje konjugacijo plazmidov v seve s CRISPR (torej sev RP62a), so v ''nes'' zaporedje plazmida pG0400 (krajše pG0(wt)) vstavili 9 tihih mutacij. Novonastali plazmid so poimenovali pG0(mut). Uspešnost konjugacije je bila pri kontrolnem sevu enaka za oba plazmida (po pričakovanjih), medtem ko je bila pri sevu RP62a uspešna le za pG0(mut), kar je potrdilo hipotezo o preprečitvi konjugacije s pomočjo dela zaporedja CRISPR, ki je enak enemu od plazmidnih genov. Da bi izključili morebitno vlogo ostalih razlik v genomu med poskusnim in kontrolnim sevom, so bakterijam iz RP62a deletirali CRISPR sekvenco z vmesniki in nov sev poimenovali LAM104. Ponoven poskus konjugacije je potrdil rezultate, pridobljene s kontrolnim sevom.

Drugi del raziskave je preverjal, ali crRNA deluje na plazmidno DNA ali RNA. Dokazi, da CRISPR v RP62a onemogoča sprejemanje plazmidov z ''nes'', ne pa njihovega oddajanja drugim celicam, kažejo na to, da ta mehanizem očitno ne vpliva na RNA prepis ''nes'', temveč na DNA. Iz tega lahko sklepamo tudi, da je crRNA identična (in ne komplementarna) ''nes'' mRNA. Da bi ta predvidevanja potrdili, so v regijo ''nes'' na plazmidu pG0400 vnesli samoizrezujoče se introne iz skupine I in tako pridobili okrnjen zapis DNA (pG0(I2)), ki pa se po prepisu v RNA sprocesira do identičnega proteina kot originalno zaporedje. Poskusi so pokazali enako uspešnost konjugacije pri sevu, ki vsebuje CRISPR (RP62a) ter pri sevu, ki ga ne (LAM104 in kontrolni sev ATCC 12228), kar potrjuje, da crRNA ne prepozna zaporedja DNA, če to vsebuje introne in torej ne prepreči vnosa tujega plazmida v celico. Na podoben način so izvedli tudi poskus s transformacijo, ki je dal enake rezultate in potrdil, da CRISPR ne prepozna tarčnega zaporedja, ki vsebuje introne. Ker so transformacijo opravili z elektroporacijo dvoverižne DNA v bakterijske celice, ostaja ta mehanizem pri naravni transformaciji, pri kateri lahko DNA prehaja tudi v enoverižni obliki, še nepotrjen.

==VIRI IN LITERATURA==

*M. Starčič Erjavec in D. Žgur-Bertok, Teoretične osnove in navodila za vaje pri predmetu Molekulska biologija genov. Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo, 2017.
*B. N. J. Watson, R. H. J. Staals, and P. C. Fineran, “CRISPR-Cas-Mediated Phage Resistance Enhances Horizontal Gene Transfer by Transduction.,” MBio, vol. 9, no. 1, pp. e02406-17, Mar. 2018.
*R. Barrangou, “The roles of CRISPR–Cas systems in adaptive immunity and beyond,” Curr. Opin. Immunol., vol. 32, pp. 36–41, Feb. 2015.
*R. Barrangou et al., “CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes,” Science (80-. )., vol. 315, no. 5819, pp. 1709–1712, Mar. 2007.
*L. A. Marraffini and E. J. Sontheimer, “CRISPR Interference Limits Horizontal Gene Transfer in Staphylococci by Targeting DNA,” Science (80-. )., vol. 322, no. 5909, pp. 1843–1845, Dec. 2008.

Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov

2019-04-15T17:17:16Z

Nika Mikulič: /* IMUNSKI SISTEM CRISPR/Cas */

==UVOD==
Horizontalni prenos genov predstavlja velik doprinos k diverziteti v evoluciji prokariontov, ni pa nujno zmeraj ugoden; lahko je zgolj nevtralen ali celo škodljiv. Zato so bakterije in arheje razvile sistem regulacije horizontalnega prenosa genov, imenovan CRISPR/Cas (iz ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins).

== ODKRITJE VLOGE CRISPR/Cas PRI OMEJEVANJU VNOSA PLAZMIDOV==

===HORIZONTALNI PRENOS GENOV===

Horizontalni ali lateralni prenos genov je prenos DNA iz enega enoceličarja na drugega. Prisoten je predvsem pri prokariontih, se pa pojavlja tudi pri evkariontskih organizmih. Za razliko od vertikalnega prenosa, kjer gre za prenos starševskih genov na potomce, tu celice prevzemajo gene iz okolice oz. od drugih organizmov. Tako pride do prenosa med različnimi vrstami. Poznamo tri glavne načine prenosa genov: transformacijo, konjugacijo in transdukcijo. Pri transformaciji gre za sprejem tuje, prosto plavajoče molekule DNA iz okolice, ki je na primer do tja prišla iz nekega drugega mrtvega mikroorganizma. Pri tem je pomembno, da so celice, ki sprejemajo tujo DNA, kompetentne. Kompetentnost je začasno stanje, ki se pojavi kot odziv na stresne spremembe v okolju. Pri naravni transformaciji postanejo kompetentne v nekem specifičnem času svojega življenja, medtem ko pri umetni transformaciji kompetentnost izzovemo z različnimi solmi (npr. CaCl2) oz. z opazno spremembo temperature. Transdukcija poteka z bakteriofagi, ki prenašajo DNA iz druge bakterijske celice. Pogoj za konjugacijo pa je, da morata biti dve celici začasno fizično povezani. Prek te povezave nato preide DNA v drug enocelični organizem. Ves zapis za konjugacijo se nahaja na konjugativnih plazmidih, izmed katerih je najbolj preučen F plazmid, ki se nahaja v donorski bakteriji (F+). Donorska bakterija sintetizira na svoji površini konjugativni pilus, s katerim prepozna prejemniško bakterijo (F-). Ob vezavi nanjo se pilus skrajša, s čimer sta si bakteriji bližje, med njima pa se vzpostavi konjugativna pora. Na mestu OriT pride do reza ene od verig F plazmida. Prerezana enoverižna DNA vstopi v F- s 5'-koncem, pri čemer se hkrati sintetizirata manjkajoča dela verige v obeh bakterijah. Nato se prenesena DNA zaokroži, s čimer dobimo novo donorsko bakterijo. Začetki odkritij horizontalnega prenosa genov segajo v leto 1959, ko so s transdukcijo prenesli genetski material ''Escherichie coli'' v ''Salmonello Typhimurium''. Bolj razsežno pa so pojav začeli spremljati, ko so ugotovili, da je vse več bakterij odpornih na vse več različnih antibiotikov, česar ni bilo mogoče pojasniti z vertikalnim prenosom genov.

V laboratoriju so prenos genov izvajali na način, ki je preprostejši od naštetih mehanizmov. Ovojnico enoceličarja so predrli mehansko, s ''pre-stresanjem'' z zrnci stekla. Analogija takšnega prenosa se dogaja tudi v naravi. Delci peska v reki se na primer s pomočjo vodnega toka povzdignejo iz tal, pri čemer prihaja do mehanskega drgnjenja s številnimi mikroorganizmi, ki se v vrtincu nahajajo. S predrtjem ovojnice, lahko tuja DNA vstopi v predrt organizem. Ovojnico lahko predremo tudi z občutnim spreminjanjem temperature, zdaj pa to počnejo predvsem z elektroporacijo, metodo odkrito pred štirimi desetletji. Elektroporacija je enostaven način, s katerim prenesemo dedni material z izpostavitvijo mikroorganizmov močnim, kratkim, visoko-električno napetostnim pulzom. Ti ovojnico naluknjajo tako, da lahko DNA med celicami prehaja. Če je ovojnica naluknjana ravno dovolj, da mikroorganizem še vedno preživi, ko DNA vstopi v celico, se v večini primerov začne tuja DNA izražati. Ker prej omenjeni glavni mehanizmi temeljijo na proteinih, katerih delovanje je zelo omejeno in so se razvili šele tekom evolucije, se je Slovenec dr. Tadej Kotnik začel spraševati, če obstaja preprost fizikalni mehanizem, ki deluje že vse od nastanka življenja. Analogijo elektroporacije v laboratoriju je našel v nevihtni streli ter napisal študijo o nevihtni streli kot naravnem mehanizmu prenosa genov ter jo objavil v reviji Physics of Life Reviews. Njegovo razmišljanje temelji na sledečih dejstvih; dnevno udari na zemeljsko površje več 10 milijonov strel. Kjer ob zemljo udari strela, se elektroporira en kubični meter, na katerem živi od 100 do 1000 milijonov mikroorganizmov. Po prej opisanem mehanizmu elektroporacije lahko v naravi pride do prenosa genov na veliko preprostejši način in omogoča vnos tujega genskega materiala tako v prokarionte kot tudi evkarionte.

===IMUNSKI SISTEM CRISPR/Cas===

Sistem CRISPR/Cas deluje kot imunski sistem bakterij in arhej. Deluje tako, da koščke tuje DNA po vstopu v celico integrira v lokus CRISPR. Take koščke imenujemo vmesniki (prekinjajo pa jih t. i. ponovitve) in služijo kot nekakšen spomin imunskega sistema. Ta se v procesu transkripcije prepiše v molekulo crRNA (CRISPR RNA), ki usmerja proteine Cas na tarčno zaporedje. Proteini Cas so endonukleaze, ki tako prepoznajo specifično tujo DNA, jo cepijo in razgradijo.

===RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE ''STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS''===

Da so vmesniki v resnici homologi tujih plazmidov, so sprva ugotovili z in silico analizami, ki so vodile do različnih hipotez o vlogah sistema CRISPR. V raziskavi iz leta 2007 so analizirali več sevov bakterije ''Streptococcus thermophilus'' za katere je značilno, da imajo dva lokusa CRISPR, oni pa so se omejili predvsem na CRISPR1.

Najprej so preverili hipotezo, da se med pridobitvijo odpornosti spremeni tudi bakterijski lokus CRISPR. Izbrali so sev ''Streptococcus thermophilus'' DGCC7710 divjega tipa (WT) in dva virulentna bakteriofaga, fag 858 in fag 2972, katerih genoma sta 93 % identična. Neodvisno med sabo so pripravili devet različnih mutantov bakterije z izpostavitvijo okužbi s fagom 858, fagom 2972 ali obema hkrati (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F1.large.jpg]), nato pa so analizirali njihov lokus CRISPR. V divjem tipu bakterij je bilo opaznih 32, v mutantih pa še dodatnih 1 do 4 vmesnikov. Po pričakovanjih iz prejšnjih poskusov so ugotovili, da se novi vmesniki vstavijo predvsem v vodilno zaporedje lokusa CRISPR. S sekvenciranjem so našli podobnost med dodatnimi vmesniki v mutiranih sevih in genomom fagov, katerim so bili izpostavljeni. Zanimivo je bilo, da so bile podobnosti najdene po celotnem genomu virusa, na kodirajočih in nekodirajočih zaporedjih. S temi ugotovitvami so dokazali, da se lokus CRISPR po okužbi z virusom spremeni tako, da v lastno zaporedje vstavi dodatne vmesnike, ki jih pridobi iz DNA virusa.

Opazili so, da je bila od tega, kateri vmesnik se je v lokus CRISPR vstavil, odvisna tudi rezistenca na fage; pri sevih, v katerih je bil vstavljeni vmesnik 100 % enak zaporedju faga, se je pojavila odpornost. Ker sta faga 858 in 2972 93 % identična, so vmesniki iz bolj ohranjenih regij (vmesniki S3, S6, S7) povzročili odpornost na oba faga. V primerih, ko pa je bilo med 29 – 30 nukleotidi prisotnih 1 – 15 nukleotidnih polimorfizmov, pa tak vmesnik (vmesnik S1, S2, S4, S5 in S8) ni več povzročil rezistence na oba, ampak samo na fag, kateremu je bil izpostavljen. Prav tako je v mutantih, v katerih je bilo vstavljenih več vmesnikov, bila odpornost višja. Med seboj so primerjali tudi odpornost bakterij po tem, ko so iz lokusa CRISPR izbrisali ali dodali vmesnike (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F3.large.jpg]). Iz mutanta WTΦ858+S1S2 so odstranili vmesnika S1 in S2, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858. Ko so mutantu WTΦ2972+S4 zamenjali vmesnik S4 za S1 in S2, je bila bakterija odporna na fag 858. Mutantu WTΦ858+S1S2 so nato med gene Cas in CRIPSR1 vstavili zapis za eno samo ponovitev, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858, čeprav sta bila vmesnika S1 in S2 v lokusu še zmeraj prisotna. To dokazuje, da vmesniki sami po sebi ne povzročijo odpornosti.

Ker je že obstajala hipoteza, da so pri tem procesu pomembni tudi Cas geni, so v istem mutantu WTΦ858+S1S2 izbrisali gen ''cas5'' ali ''cas7''. Bakterija z izbrisanim genom ''cas5'' ni bila več odporna na fag 858, iz česar so sklepali, da Cas5 deluje kot nukleaza (ker vsebuje HNH-nukleazni motiv). V bakteriji z inaktiviranim genom ''cas7'' pa je odpornost na fag 858 ostala nespremenjena. Predvidevali so, da je Cas7 vpleten v sintezo in/ali insercijo dodatnih vmesnikov in ponovitev.

===RAZISKAVA O VPLIVU NA OMEJITEV HORIZONTALNEGA PRENOSA GENOV S POMOČJO CRISPR PRI BAKTERIJAH ''STAPHYLOCOCCUS''===

Pri odkrivanju vloge, ki jo pri omejevanju horizontalnega prenosa genov, predvsem s konjugacijo in transformacijo, igra mehanizem CRISPR, je pomemben del prispevala raziskava L. A. Marraffinija in E. J. Sontheimerja iz leta 2008. Raziskave sta se lotila zaradi vse večjega porasta bakterij ''Staphylococcus aureus'', rezistentnih na antibiotika meticilin in vankomicin, ki je posledica horizontalnega prenosa plazmidov iz bakterij ''Staphylococcus epidermis''. Gre za najpogostejši vrsti bakterij pri bolnišničnih okužbah.

Raziskava je potrdila dve hipotezi. Prva je bila potrjena s pomočjo že prej odkrite identičnosti vmesnika CRISPR ''spcI'' pri ''S. epidermis'' z zaporedjem ''nes'' (zapis za topoizomerazo I), najdenem na vseh izoliranih plazmidih, ki se konjugirajo med omenjenima vrstama bakterij. Ta lastnost nastali crRNA omogoči prepoznavanje konjugiranega plazmida in tako prepreči horizontalen prenos te DNA znotraj vrste. Druga značilnost CRISPR sistema, ki so jo potrdili, je delovanje na nivoju plazmidne DNA, in ne RNA kot je bilo pokazano pri evkariontskih celicah, kar je še dodatno podprlo vprašanje o sistemu, s katerim celica preprečuje napad lastne DNA z zapisom CRISPR.

V raziskavi so uporabili dva seva S. epidermis, in sicer RP62a, ki vsebuje zaporedje CRISPR ter spremljajoče gene (med drugim tudi ''cas''), ter njegovo različico LAM104, ki ima deletiran CRISPR del. Kontrolo so izvajali na sevu ''S. epidermis'' brez zaporedja CRISPR, ATCC 12228. Kot vir plazmidov so uporabili sev ''S. aureus RN4220''. Da bi dokazali, da ''spc1'' preprečuje konjugacijo plazmidov v seve s CRISPR (torej sev RP62a), so v ''nes'' zaporedje plazmida pG0400 (krajše pG0(wt)) vstavili 9 tihih mutacij. Novonastali plazmid so poimenovali pG0(mut). Uspešnost konjugacije je bila pri kontrolnem sevu enaka za oba plazmida (po pričakovanjih), medtem ko je bila pri sevu RP62a uspešna le za pG0(mut), kar je potrdilo hipotezo o preprečitvi konjugacije s pomočjo dela zaporedja CRISPR, ki je enak enemu od plazmidnih genov. Da bi izključili morebitno vlogo ostalih razlik v genomu med poskusnim in kontrolnim sevom, so bakterijam iz RP62a deletirali CRISPR sekvenco z vmesniki in nov sev poimenovali LAM104. Ponoven poskus konjugacije je potrdil rezultate, pridobljene s kontrolnim sevom.

Drugi del raziskave je preverjal, ali crRNA deluje na plazmidno DNA ali RNA. Dokazi, da CRISPR v RP62a onemogoča sprejemanje plazmidov z ''nes'', ne pa njihovega oddajanja drugim celicam, kažejo na to, da ta mehanizem očitno ne vpliva na RNA prepis ''nes'', temveč na DNA. Iz tega lahko sklepamo tudi, da je crRNA identična (in ne komplementarna) ''nes'' mRNA. Da bi ta predvidevanja potrdili, so v regijo ''nes'' na plazmidu pG0400 vnesli samoizrezujoče se introne iz skupine I in tako pridobili okrnjen zapis DNA (pG0(I2)), ki pa se po prepisu v RNA sprocesira do identičnega proteina kot originalno zaporedje. Poskusi so pokazali enako uspešnost konjugacije pri sevu, ki vsebuje CRISPR (RP62a) ter pri sevu, ki ga ne (LAM104 in kontrolni sev ATCC 12228), kar potrjuje, da crRNA ne prepozna zaporedja DNA, če to vsebuje introne in torej ne prepreči vnosa tujega plazmida v celico. Na podoben način so izvedli tudi poskus s transformacijo, ki je dal enake rezultate in potrdil, da CRISPR ne prepozna tarčnega zaporedja, ki vsebuje introne. Ker so transformacijo opravili z elektroporacijo dvoverižne DNA v bakterijske celice, ostaja ta mehanizem pri naravni transformaciji, pri kateri lahko DNA prehaja tudi v enoverižni obliki, še nepotrjen.

==VIRI IN LITERATURA==

*M. Starčič Erjavec in D. Žgur-Bertok, Teoretične osnove in navodila za vaje pri predmetu Molekulska biologija genov. Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo, 2017.
*B. N. J. Watson, R. H. J. Staals, and P. C. Fineran, “CRISPR-Cas-Mediated Phage Resistance Enhances Horizontal Gene Transfer by Transduction.,” MBio, vol. 9, no. 1, pp. e02406-17, Mar. 2018.
*R. Barrangou, “The roles of CRISPR–Cas systems in adaptive immunity and beyond,” Curr. Opin. Immunol., vol. 32, pp. 36–41, Feb. 2015.
*R. Barrangou et al., “CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes,” Science (80-. )., vol. 315, no. 5819, pp. 1709–1712, Mar. 2007.
*L. A. Marraffini and E. J. Sontheimer, “CRISPR Interference Limits Horizontal Gene Transfer in Staphylococci by Targeting DNA,” Science (80-. )., vol. 322, no. 5909, pp. 1843–1845, Dec. 2008.

Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov

2019-04-15T17:16:43Z

Nika Mikulič: /* RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS */

==UVOD==
Horizontalni prenos genov predstavlja velik doprinos k diverziteti v evoluciji prokariontov, ni pa nujno zmeraj ugoden; lahko je zgolj nevtralen ali celo škodljiv. Zato so bakterije in arheje razvile sistem regulacije horizontalnega prenosa genov, imenovan CRISPR/Cas (iz ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins).

== ODKRITJE VLOGE CRISPR/Cas PRI OMEJEVANJU VNOSA PLAZMIDOV==

===HORIZONTALNI PRENOS GENOV===

Horizontalni ali lateralni prenos genov je prenos DNA iz enega enoceličarja na drugega. Prisoten je predvsem pri prokariontih, se pa pojavlja tudi pri evkariontskih organizmih. Za razliko od vertikalnega prenosa, kjer gre za prenos starševskih genov na potomce, tu celice prevzemajo gene iz okolice oz. od drugih organizmov. Tako pride do prenosa med različnimi vrstami. Poznamo tri glavne načine prenosa genov: transformacijo, konjugacijo in transdukcijo. Pri transformaciji gre za sprejem tuje, prosto plavajoče molekule DNA iz okolice, ki je na primer do tja prišla iz nekega drugega mrtvega mikroorganizma. Pri tem je pomembno, da so celice, ki sprejemajo tujo DNA, kompetentne. Kompetentnost je začasno stanje, ki se pojavi kot odziv na stresne spremembe v okolju. Pri naravni transformaciji postanejo kompetentne v nekem specifičnem času svojega življenja, medtem ko pri umetni transformaciji kompetentnost izzovemo z različnimi solmi (npr. CaCl2) oz. z opazno spremembo temperature. Transdukcija poteka z bakteriofagi, ki prenašajo DNA iz druge bakterijske celice. Pogoj za konjugacijo pa je, da morata biti dve celici začasno fizično povezani. Prek te povezave nato preide DNA v drug enocelični organizem. Ves zapis za konjugacijo se nahaja na konjugativnih plazmidih, izmed katerih je najbolj preučen F plazmid, ki se nahaja v donorski bakteriji (F+). Donorska bakterija sintetizira na svoji površini konjugativni pilus, s katerim prepozna prejemniško bakterijo (F-). Ob vezavi nanjo se pilus skrajša, s čimer sta si bakteriji bližje, med njima pa se vzpostavi konjugativna pora. Na mestu OriT pride do reza ene od verig F plazmida. Prerezana enoverižna DNA vstopi v F- s 5'-koncem, pri čemer se hkrati sintetizirata manjkajoča dela verige v obeh bakterijah. Nato se prenesena DNA zaokroži, s čimer dobimo novo donorsko bakterijo. Začetki odkritij horizontalnega prenosa genov segajo v leto 1959, ko so s transdukcijo prenesli genetski material ''Escherichie coli'' v ''Salmonello Typhimurium''. Bolj razsežno pa so pojav začeli spremljati, ko so ugotovili, da je vse več bakterij odpornih na vse več različnih antibiotikov, česar ni bilo mogoče pojasniti z vertikalnim prenosom genov.

V laboratoriju so prenos genov izvajali na način, ki je preprostejši od naštetih mehanizmov. Ovojnico enoceličarja so predrli mehansko, s ''pre-stresanjem'' z zrnci stekla. Analogija takšnega prenosa se dogaja tudi v naravi. Delci peska v reki se na primer s pomočjo vodnega toka povzdignejo iz tal, pri čemer prihaja do mehanskega drgnjenja s številnimi mikroorganizmi, ki se v vrtincu nahajajo. S predrtjem ovojnice, lahko tuja DNA vstopi v predrt organizem. Ovojnico lahko predremo tudi z občutnim spreminjanjem temperature, zdaj pa to počnejo predvsem z elektroporacijo, metodo odkrito pred štirimi desetletji. Elektroporacija je enostaven način, s katerim prenesemo dedni material z izpostavitvijo mikroorganizmov močnim, kratkim, visoko-električno napetostnim pulzom. Ti ovojnico naluknjajo tako, da lahko DNA med celicami prehaja. Če je ovojnica naluknjana ravno dovolj, da mikroorganizem še vedno preživi, ko DNA vstopi v celico, se v večini primerov začne tuja DNA izražati. Ker prej omenjeni glavni mehanizmi temeljijo na proteinih, katerih delovanje je zelo omejeno in so se razvili šele tekom evolucije, se je Slovenec dr. Tadej Kotnik začel spraševati, če obstaja preprost fizikalni mehanizem, ki deluje že vse od nastanka življenja. Analogijo elektroporacije v laboratoriju je našel v nevihtni streli ter napisal študijo o nevihtni streli kot naravnem mehanizmu prenosa genov ter jo objavil v reviji Physics of Life Reviews. Njegovo razmišljanje temelji na sledečih dejstvih; dnevno udari na zemeljsko površje več 10 milijonov strel. Kjer ob zemljo udari strela, se elektroporira en kubični meter, na katerem živi od 100 do 1000 milijonov mikroorganizmov. Po prej opisanem mehanizmu elektroporacije lahko v naravi pride do prenosa genov na veliko preprostejši način in omogoča vnos tujega genskega materiala tako v prokarionte kot tudi evkarionte.

===IMUNSKI SISTEM CRISPR/Cas===

Sistem CRISPR/Cas deluje kot imunski sistem bakterij in arhej. Deluje tako, da koščke tuje DNK po vstopu v celico integrira v lokus CRISPR. Take koščke imenujemo vmesniki (prekinjajo pa jih t. i. ponovitve) in služijo kot nekakšen spomin imunskega sistema. Ta se v procesu transkripcije prepiše v molekulo crRNA (CRISPR RNA), ki usmerja proteine Cas na tarčno zaporedje. Proteini Cas so endonukleaze, ki tako prepoznajo specifično tujo DNK, jo cepijo in razgradijo.

===RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE ''STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS''===

Da so vmesniki v resnici homologi tujih plazmidov, so sprva ugotovili z in silico analizami, ki so vodile do različnih hipotez o vlogah sistema CRISPR. V raziskavi iz leta 2007 so analizirali več sevov bakterije ''Streptococcus thermophilus'' za katere je značilno, da imajo dva lokusa CRISPR, oni pa so se omejili predvsem na CRISPR1.

Najprej so preverili hipotezo, da se med pridobitvijo odpornosti spremeni tudi bakterijski lokus CRISPR. Izbrali so sev ''Streptococcus thermophilus'' DGCC7710 divjega tipa (WT) in dva virulentna bakteriofaga, fag 858 in fag 2972, katerih genoma sta 93 % identična. Neodvisno med sabo so pripravili devet različnih mutantov bakterije z izpostavitvijo okužbi s fagom 858, fagom 2972 ali obema hkrati (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F1.large.jpg]), nato pa so analizirali njihov lokus CRISPR. V divjem tipu bakterij je bilo opaznih 32, v mutantih pa še dodatnih 1 do 4 vmesnikov. Po pričakovanjih iz prejšnjih poskusov so ugotovili, da se novi vmesniki vstavijo predvsem v vodilno zaporedje lokusa CRISPR. S sekvenciranjem so našli podobnost med dodatnimi vmesniki v mutiranih sevih in genomom fagov, katerim so bili izpostavljeni. Zanimivo je bilo, da so bile podobnosti najdene po celotnem genomu virusa, na kodirajočih in nekodirajočih zaporedjih. S temi ugotovitvami so dokazali, da se lokus CRISPR po okužbi z virusom spremeni tako, da v lastno zaporedje vstavi dodatne vmesnike, ki jih pridobi iz DNA virusa.

Opazili so, da je bila od tega, kateri vmesnik se je v lokus CRISPR vstavil, odvisna tudi rezistenca na fage; pri sevih, v katerih je bil vstavljeni vmesnik 100 % enak zaporedju faga, se je pojavila odpornost. Ker sta faga 858 in 2972 93 % identična, so vmesniki iz bolj ohranjenih regij (vmesniki S3, S6, S7) povzročili odpornost na oba faga. V primerih, ko pa je bilo med 29 – 30 nukleotidi prisotnih 1 – 15 nukleotidnih polimorfizmov, pa tak vmesnik (vmesnik S1, S2, S4, S5 in S8) ni več povzročil rezistence na oba, ampak samo na fag, kateremu je bil izpostavljen. Prav tako je v mutantih, v katerih je bilo vstavljenih več vmesnikov, bila odpornost višja. Med seboj so primerjali tudi odpornost bakterij po tem, ko so iz lokusa CRISPR izbrisali ali dodali vmesnike (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F3.large.jpg]). Iz mutanta WTΦ858+S1S2 so odstranili vmesnika S1 in S2, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858. Ko so mutantu WTΦ2972+S4 zamenjali vmesnik S4 za S1 in S2, je bila bakterija odporna na fag 858. Mutantu WTΦ858+S1S2 so nato med gene Cas in CRIPSR1 vstavili zapis za eno samo ponovitev, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858, čeprav sta bila vmesnika S1 in S2 v lokusu še zmeraj prisotna. To dokazuje, da vmesniki sami po sebi ne povzročijo odpornosti.

Ker je že obstajala hipoteza, da so pri tem procesu pomembni tudi Cas geni, so v istem mutantu WTΦ858+S1S2 izbrisali gen ''cas5'' ali ''cas7''. Bakterija z izbrisanim genom ''cas5'' ni bila več odporna na fag 858, iz česar so sklepali, da Cas5 deluje kot nukleaza (ker vsebuje HNH-nukleazni motiv). V bakteriji z inaktiviranim genom ''cas7'' pa je odpornost na fag 858 ostala nespremenjena. Predvidevali so, da je Cas7 vpleten v sintezo in/ali insercijo dodatnih vmesnikov in ponovitev.

===RAZISKAVA O VPLIVU NA OMEJITEV HORIZONTALNEGA PRENOSA GENOV S POMOČJO CRISPR PRI BAKTERIJAH ''STAPHYLOCOCCUS''===

Pri odkrivanju vloge, ki jo pri omejevanju horizontalnega prenosa genov, predvsem s konjugacijo in transformacijo, igra mehanizem CRISPR, je pomemben del prispevala raziskava L. A. Marraffinija in E. J. Sontheimerja iz leta 2008. Raziskave sta se lotila zaradi vse večjega porasta bakterij ''Staphylococcus aureus'', rezistentnih na antibiotika meticilin in vankomicin, ki je posledica horizontalnega prenosa plazmidov iz bakterij ''Staphylococcus epidermis''. Gre za najpogostejši vrsti bakterij pri bolnišničnih okužbah.

Raziskava je potrdila dve hipotezi. Prva je bila potrjena s pomočjo že prej odkrite identičnosti vmesnika CRISPR ''spcI'' pri ''S. epidermis'' z zaporedjem ''nes'' (zapis za topoizomerazo I), najdenem na vseh izoliranih plazmidih, ki se konjugirajo med omenjenima vrstama bakterij. Ta lastnost nastali crRNA omogoči prepoznavanje konjugiranega plazmida in tako prepreči horizontalen prenos te DNA znotraj vrste. Druga značilnost CRISPR sistema, ki so jo potrdili, je delovanje na nivoju plazmidne DNA, in ne RNA kot je bilo pokazano pri evkariontskih celicah, kar je še dodatno podprlo vprašanje o sistemu, s katerim celica preprečuje napad lastne DNA z zapisom CRISPR.

V raziskavi so uporabili dva seva S. epidermis, in sicer RP62a, ki vsebuje zaporedje CRISPR ter spremljajoče gene (med drugim tudi ''cas''), ter njegovo različico LAM104, ki ima deletiran CRISPR del. Kontrolo so izvajali na sevu ''S. epidermis'' brez zaporedja CRISPR, ATCC 12228. Kot vir plazmidov so uporabili sev ''S. aureus RN4220''. Da bi dokazali, da ''spc1'' preprečuje konjugacijo plazmidov v seve s CRISPR (torej sev RP62a), so v ''nes'' zaporedje plazmida pG0400 (krajše pG0(wt)) vstavili 9 tihih mutacij. Novonastali plazmid so poimenovali pG0(mut). Uspešnost konjugacije je bila pri kontrolnem sevu enaka za oba plazmida (po pričakovanjih), medtem ko je bila pri sevu RP62a uspešna le za pG0(mut), kar je potrdilo hipotezo o preprečitvi konjugacije s pomočjo dela zaporedja CRISPR, ki je enak enemu od plazmidnih genov. Da bi izključili morebitno vlogo ostalih razlik v genomu med poskusnim in kontrolnim sevom, so bakterijam iz RP62a deletirali CRISPR sekvenco z vmesniki in nov sev poimenovali LAM104. Ponoven poskus konjugacije je potrdil rezultate, pridobljene s kontrolnim sevom.

Drugi del raziskave je preverjal, ali crRNA deluje na plazmidno DNA ali RNA. Dokazi, da CRISPR v RP62a onemogoča sprejemanje plazmidov z ''nes'', ne pa njihovega oddajanja drugim celicam, kažejo na to, da ta mehanizem očitno ne vpliva na RNA prepis ''nes'', temveč na DNA. Iz tega lahko sklepamo tudi, da je crRNA identična (in ne komplementarna) ''nes'' mRNA. Da bi ta predvidevanja potrdili, so v regijo ''nes'' na plazmidu pG0400 vnesli samoizrezujoče se introne iz skupine I in tako pridobili okrnjen zapis DNA (pG0(I2)), ki pa se po prepisu v RNA sprocesira do identičnega proteina kot originalno zaporedje. Poskusi so pokazali enako uspešnost konjugacije pri sevu, ki vsebuje CRISPR (RP62a) ter pri sevu, ki ga ne (LAM104 in kontrolni sev ATCC 12228), kar potrjuje, da crRNA ne prepozna zaporedja DNA, če to vsebuje introne in torej ne prepreči vnosa tujega plazmida v celico. Na podoben način so izvedli tudi poskus s transformacijo, ki je dal enake rezultate in potrdil, da CRISPR ne prepozna tarčnega zaporedja, ki vsebuje introne. Ker so transformacijo opravili z elektroporacijo dvoverižne DNA v bakterijske celice, ostaja ta mehanizem pri naravni transformaciji, pri kateri lahko DNA prehaja tudi v enoverižni obliki, še nepotrjen.

==VIRI IN LITERATURA==

*M. Starčič Erjavec in D. Žgur-Bertok, Teoretične osnove in navodila za vaje pri predmetu Molekulska biologija genov. Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo, 2017.
*B. N. J. Watson, R. H. J. Staals, and P. C. Fineran, “CRISPR-Cas-Mediated Phage Resistance Enhances Horizontal Gene Transfer by Transduction.,” MBio, vol. 9, no. 1, pp. e02406-17, Mar. 2018.
*R. Barrangou, “The roles of CRISPR–Cas systems in adaptive immunity and beyond,” Curr. Opin. Immunol., vol. 32, pp. 36–41, Feb. 2015.
*R. Barrangou et al., “CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes,” Science (80-. )., vol. 315, no. 5819, pp. 1709–1712, Mar. 2007.
*L. A. Marraffini and E. J. Sontheimer, “CRISPR Interference Limits Horizontal Gene Transfer in Staphylococci by Targeting DNA,” Science (80-. )., vol. 322, no. 5909, pp. 1843–1845, Dec. 2008.

Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov

2019-04-15T17:15:24Z

Nika Mikulič:

==UVOD==
Horizontalni prenos genov predstavlja velik doprinos k diverziteti v evoluciji prokariontov, ni pa nujno zmeraj ugoden; lahko je zgolj nevtralen ali celo škodljiv. Zato so bakterije in arheje razvile sistem regulacije horizontalnega prenosa genov, imenovan CRISPR/Cas (iz ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins).

== ODKRITJE VLOGE CRISPR/Cas PRI OMEJEVANJU VNOSA PLAZMIDOV==

===HORIZONTALNI PRENOS GENOV===

Horizontalni ali lateralni prenos genov je prenos DNA iz enega enoceličarja na drugega. Prisoten je predvsem pri prokariontih, se pa pojavlja tudi pri evkariontskih organizmih. Za razliko od vertikalnega prenosa, kjer gre za prenos starševskih genov na potomce, tu celice prevzemajo gene iz okolice oz. od drugih organizmov. Tako pride do prenosa med različnimi vrstami. Poznamo tri glavne načine prenosa genov: transformacijo, konjugacijo in transdukcijo. Pri transformaciji gre za sprejem tuje, prosto plavajoče molekule DNA iz okolice, ki je na primer do tja prišla iz nekega drugega mrtvega mikroorganizma. Pri tem je pomembno, da so celice, ki sprejemajo tujo DNA, kompetentne. Kompetentnost je začasno stanje, ki se pojavi kot odziv na stresne spremembe v okolju. Pri naravni transformaciji postanejo kompetentne v nekem specifičnem času svojega življenja, medtem ko pri umetni transformaciji kompetentnost izzovemo z različnimi solmi (npr. CaCl2) oz. z opazno spremembo temperature. Transdukcija poteka z bakteriofagi, ki prenašajo DNA iz druge bakterijske celice. Pogoj za konjugacijo pa je, da morata biti dve celici začasno fizično povezani. Prek te povezave nato preide DNA v drug enocelični organizem. Ves zapis za konjugacijo se nahaja na konjugativnih plazmidih, izmed katerih je najbolj preučen F plazmid, ki se nahaja v donorski bakteriji (F+). Donorska bakterija sintetizira na svoji površini konjugativni pilus, s katerim prepozna prejemniško bakterijo (F-). Ob vezavi nanjo se pilus skrajša, s čimer sta si bakteriji bližje, med njima pa se vzpostavi konjugativna pora. Na mestu OriT pride do reza ene od verig F plazmida. Prerezana enoverižna DNA vstopi v F- s 5'-koncem, pri čemer se hkrati sintetizirata manjkajoča dela verige v obeh bakterijah. Nato se prenesena DNA zaokroži, s čimer dobimo novo donorsko bakterijo. Začetki odkritij horizontalnega prenosa genov segajo v leto 1959, ko so s transdukcijo prenesli genetski material ''Escherichie coli'' v ''Salmonello Typhimurium''. Bolj razsežno pa so pojav začeli spremljati, ko so ugotovili, da je vse več bakterij odpornih na vse več različnih antibiotikov, česar ni bilo mogoče pojasniti z vertikalnim prenosom genov.

V laboratoriju so prenos genov izvajali na način, ki je preprostejši od naštetih mehanizmov. Ovojnico enoceličarja so predrli mehansko, s ''pre-stresanjem'' z zrnci stekla. Analogija takšnega prenosa se dogaja tudi v naravi. Delci peska v reki se na primer s pomočjo vodnega toka povzdignejo iz tal, pri čemer prihaja do mehanskega drgnjenja s številnimi mikroorganizmi, ki se v vrtincu nahajajo. S predrtjem ovojnice, lahko tuja DNA vstopi v predrt organizem. Ovojnico lahko predremo tudi z občutnim spreminjanjem temperature, zdaj pa to počnejo predvsem z elektroporacijo, metodo odkrito pred štirimi desetletji. Elektroporacija je enostaven način, s katerim prenesemo dedni material z izpostavitvijo mikroorganizmov močnim, kratkim, visoko-električno napetostnim pulzom. Ti ovojnico naluknjajo tako, da lahko DNA med celicami prehaja. Če je ovojnica naluknjana ravno dovolj, da mikroorganizem še vedno preživi, ko DNA vstopi v celico, se v večini primerov začne tuja DNA izražati. Ker prej omenjeni glavni mehanizmi temeljijo na proteinih, katerih delovanje je zelo omejeno in so se razvili šele tekom evolucije, se je Slovenec dr. Tadej Kotnik začel spraševati, če obstaja preprost fizikalni mehanizem, ki deluje že vse od nastanka življenja. Analogijo elektroporacije v laboratoriju je našel v nevihtni streli ter napisal študijo o nevihtni streli kot naravnem mehanizmu prenosa genov ter jo objavil v reviji Physics of Life Reviews. Njegovo razmišljanje temelji na sledečih dejstvih; dnevno udari na zemeljsko površje več 10 milijonov strel. Kjer ob zemljo udari strela, se elektroporira en kubični meter, na katerem živi od 100 do 1000 milijonov mikroorganizmov. Po prej opisanem mehanizmu elektroporacije lahko v naravi pride do prenosa genov na veliko preprostejši način in omogoča vnos tujega genskega materiala tako v prokarionte kot tudi evkarionte.

===IMUNSKI SISTEM CRISPR/Cas===

Sistem CRISPR/Cas deluje kot imunski sistem bakterij in arhej. Deluje tako, da koščke tuje DNK po vstopu v celico integrira v lokus CRISPR. Take koščke imenujemo vmesniki (prekinjajo pa jih t. i. ponovitve) in služijo kot nekakšen spomin imunskega sistema. Ta se v procesu transkripcije prepiše v molekulo crRNA (CRISPR RNA), ki usmerja proteine Cas na tarčno zaporedje. Proteini Cas so endonukleaze, ki tako prepoznajo specifično tujo DNK, jo cepijo in razgradijo.

===RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE ''STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS''===

Da so vmesniki v resnici homologi tujih plazmidov, so sprva ugotovili z in silico analizami, ki so vodile do različnih hipotez o vlogah sistema CRISPR. V raziskavi iz leta 2007 so analizirali več sevov bakterije ''Streptococcus thermophilus'' za katere je značilno, da imajo dva lokusa CRISPR, oni pa so se omejili predvsem na CRISPR1.

Najprej so preverili hipotezo, da se med pridobitvijo odpornosti spremeni tudi bakterijski lokus CRISPR. Izbrali so sev ''Streptococcus thermophilus'' DGCC7710 divjega tipa (WT) in dva virulentna bakteriofaga, fag 858 in fag 2972, katerih genoma sta 93 % identična. Neodvisno med sabo so pripravili devet različnih mutantov bakterije z izpostavitvijo okužbi s fagom 858, fagom 2972 ali obema hkrati (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F1.large.jpg]), nato pa so analizirali njihov lokus CRISPR. V divjem tipu bakterij je bilo opaznih 32, v mutantih pa še dodatnih 1 do 4 vmesnikov. Po pričakovanjih iz prejšnjih poskusov so ugotovili, da se novi vmesniki vstavijo predvsem v vodilno zaporedje lokusa CRISPR. S sekvenciranjem so našli podobnost med dodatnimi vmesniki v mutiranih sevih in genomom fagov, katerim so bili izpostavljeni. Zanimivo je bilo, da so bile podobnosti najdene po celotnem genomu virusa, na kodirajočih in nekodirajočih zaporedjih. S temi ugotovitvami so dokazali, da se lokus CRISPR po okužbi z virusom spremeni tako, da v lastno zaporedje vstavi dodatne vmesnike, ki jih pridobi iz DNK virusa.

Opazili so, da je bila od tega, kateri vmesnik se je v lokus CRISPR vstavil, odvisna tudi rezistenca na fage; pri sevih, v katerih je bil vstavljeni vmesnik 100 % enak zaporedju faga, se je pojavila odpornost. Ker sta faga 858 in 2972 93 % identična, so vmesniki iz bolj ohranjenih regij (vmesniki S3, S6, S7) povzročili odpornost na oba faga. V primerih, ko pa je bilo med 29 – 30 nukleotidi prisotnih 1 – 15 nukleotidnih polimorfizmov, pa tak vmesnik (vmesnik S1, S2, S4, S5 in S8) ni več povzročil rezistence na oba, ampak samo na fag, kateremu je bil izpostavljen. Prav tako je v mutantih, v katerih je bilo vstavljenih več vmesnikov, bila odpornost višja. Med seboj so primerjali tudi odpornost bakterij po tem, ko so iz lokusa CRISPR izbrisali ali dodali vmesnike (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F3.large.jpg]). Iz mutanta WTΦ858+S1S2 so odstranili vmesnika S1 in S2, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858. Ko so mutantu WTΦ2972+S4 zamenjali vmesnik S4 za S1 in S2, je bila bakterija odporna na fag 858. Mutantu WTΦ858+S1S2 so nato med gene Cas in CRIPSR1 vstavili zapis za eno samo ponovitev, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858, čeprav sta bila vmesnika S1 in S2 v lokusu še zmeraj prisotna. To dokazuje, da vmesniki sami po sebi ne povzročijo odpornosti.

Ker je že obstajala hipoteza, da so pri tem procesu pomembni tudi Cas geni, so v istem mutantu WTΦ858+S1S2 izbrisali gen ''cas5'' ali ''cas7''. Bakterija z izbrisanim genom ''cas5'' ni bila več odporna na fag 858, iz česar so sklepali, da Cas5 deluje kot nukleaza (ker vsebuje HNH-nukleazni motiv). V bakteriji z inaktiviranim genom ''cas7'' pa je odpornost na fag 858 ostala nespremenjena. Predvidevali so, da je Cas7 vpleten v sintezo in/ali insercijo dodatnih vmesnikov in ponovitev.

===RAZISKAVA O VPLIVU NA OMEJITEV HORIZONTALNEGA PRENOSA GENOV S POMOČJO CRISPR PRI BAKTERIJAH ''STAPHYLOCOCCUS''===

Pri odkrivanju vloge, ki jo pri omejevanju horizontalnega prenosa genov, predvsem s konjugacijo in transformacijo, igra mehanizem CRISPR, je pomemben del prispevala raziskava L. A. Marraffinija in E. J. Sontheimerja iz leta 2008. Raziskave sta se lotila zaradi vse večjega porasta bakterij ''Staphylococcus aureus'', rezistentnih na antibiotika meticilin in vankomicin, ki je posledica horizontalnega prenosa plazmidov iz bakterij ''Staphylococcus epidermis''. Gre za najpogostejši vrsti bakterij pri bolnišničnih okužbah.

Raziskava je potrdila dve hipotezi. Prva je bila potrjena s pomočjo že prej odkrite identičnosti vmesnika CRISPR ''spcI'' pri ''S. epidermis'' z zaporedjem ''nes'' (zapis za topoizomerazo I), najdenem na vseh izoliranih plazmidih, ki se konjugirajo med omenjenima vrstama bakterij. Ta lastnost nastali crRNA omogoči prepoznavanje konjugiranega plazmida in tako prepreči horizontalen prenos te DNA znotraj vrste. Druga značilnost CRISPR sistema, ki so jo potrdili, je delovanje na nivoju plazmidne DNA, in ne RNA kot je bilo pokazano pri evkariontskih celicah, kar je še dodatno podprlo vprašanje o sistemu, s katerim celica preprečuje napad lastne DNA z zapisom CRISPR.

V raziskavi so uporabili dva seva S. epidermis, in sicer RP62a, ki vsebuje zaporedje CRISPR ter spremljajoče gene (med drugim tudi ''cas''), ter njegovo različico LAM104, ki ima deletiran CRISPR del. Kontrolo so izvajali na sevu ''S. epidermis'' brez zaporedja CRISPR, ATCC 12228. Kot vir plazmidov so uporabili sev ''S. aureus RN4220''. Da bi dokazali, da ''spc1'' preprečuje konjugacijo plazmidov v seve s CRISPR (torej sev RP62a), so v ''nes'' zaporedje plazmida pG0400 (krajše pG0(wt)) vstavili 9 tihih mutacij. Novonastali plazmid so poimenovali pG0(mut). Uspešnost konjugacije je bila pri kontrolnem sevu enaka za oba plazmida (po pričakovanjih), medtem ko je bila pri sevu RP62a uspešna le za pG0(mut), kar je potrdilo hipotezo o preprečitvi konjugacije s pomočjo dela zaporedja CRISPR, ki je enak enemu od plazmidnih genov. Da bi izključili morebitno vlogo ostalih razlik v genomu med poskusnim in kontrolnim sevom, so bakterijam iz RP62a deletirali CRISPR sekvenco z vmesniki in nov sev poimenovali LAM104. Ponoven poskus konjugacije je potrdil rezultate, pridobljene s kontrolnim sevom.

Drugi del raziskave je preverjal, ali crRNA deluje na plazmidno DNA ali RNA. Dokazi, da CRISPR v RP62a onemogoča sprejemanje plazmidov z ''nes'', ne pa njihovega oddajanja drugim celicam, kažejo na to, da ta mehanizem očitno ne vpliva na RNA prepis ''nes'', temveč na DNA. Iz tega lahko sklepamo tudi, da je crRNA identična (in ne komplementarna) ''nes'' mRNA. Da bi ta predvidevanja potrdili, so v regijo ''nes'' na plazmidu pG0400 vnesli samoizrezujoče se introne iz skupine I in tako pridobili okrnjen zapis DNA (pG0(I2)), ki pa se po prepisu v RNA sprocesira do identičnega proteina kot originalno zaporedje. Poskusi so pokazali enako uspešnost konjugacije pri sevu, ki vsebuje CRISPR (RP62a) ter pri sevu, ki ga ne (LAM104 in kontrolni sev ATCC 12228), kar potrjuje, da crRNA ne prepozna zaporedja DNA, če to vsebuje introne in torej ne prepreči vnosa tujega plazmida v celico. Na podoben način so izvedli tudi poskus s transformacijo, ki je dal enake rezultate in potrdil, da CRISPR ne prepozna tarčnega zaporedja, ki vsebuje introne. Ker so transformacijo opravili z elektroporacijo dvoverižne DNA v bakterijske celice, ostaja ta mehanizem pri naravni transformaciji, pri kateri lahko DNA prehaja tudi v enoverižni obliki, še nepotrjen.

==VIRI IN LITERATURA==

*M. Starčič Erjavec in D. Žgur-Bertok, Teoretične osnove in navodila za vaje pri predmetu Molekulska biologija genov. Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo, 2017.
*B. N. J. Watson, R. H. J. Staals, and P. C. Fineran, “CRISPR-Cas-Mediated Phage Resistance Enhances Horizontal Gene Transfer by Transduction.,” MBio, vol. 9, no. 1, pp. e02406-17, Mar. 2018.
*R. Barrangou, “The roles of CRISPR–Cas systems in adaptive immunity and beyond,” Curr. Opin. Immunol., vol. 32, pp. 36–41, Feb. 2015.
*R. Barrangou et al., “CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes,” Science (80-. )., vol. 315, no. 5819, pp. 1709–1712, Mar. 2007.
*L. A. Marraffini and E. J. Sontheimer, “CRISPR Interference Limits Horizontal Gene Transfer in Staphylococci by Targeting DNA,” Science (80-. )., vol. 322, no. 5909, pp. 1843–1845, Dec. 2008.

Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov

2019-04-15T17:03:13Z

Nika Mikulič: New page: ==UVOD== Horizontalni prenos genov predstavlja velik doprinos k diverziteti v evoluciji prokariontov, ni pa nujno zmeraj ugoden; lahko je zgolj nevtralen ali celo škodljiv. Zato so bakter...

==UVOD==
Horizontalni prenos genov predstavlja velik doprinos k diverziteti v evoluciji prokariontov, ni pa nujno zmeraj ugoden; lahko je zgolj nevtralen ali celo škodljiv. Zato so bakterije in arheje razvile sistem regulacije horizontalnega prenosa genov, imenovan CRISPR/Cas (iz ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins).

== ODKRITJE VLOGE CRISPR/Cas PRI OMEJEVANJU VNOSA PLAZMIDOV==

===HORIZONTALNI PRENOS GENOV===

Horizontalni ali lateralni prenos genov je prenos DNA iz enega enoceličarja na drugega. Prisoten je predvsem pri prokariontih, se pa pojavlja tudi pri evkariontskih organizmih. Za razliko od vertikalnega prenosa, kjer gre za prenos starševskih genov na potomce, tu celice prevzemajo gene iz okolice oz. od drugih organizmov. Tako pride do prenosa med različnimi vrstami. Poznamo tri glavne načine prenosa genov: transformacijo, konjugacijo in transdukcijo. Pri transformaciji gre za sprejem tuje, prosto plavajoče molekule DNA iz okolice, ki je na primer do tja prišla iz nekega drugega mrtvega mikroorganizma. Pri tem je pomembno, da so celice, ki sprejemajo tujo DNA, kompetentne. Kompetentnost je začasno stanje, ki se pojavi kot odziv na stresne spremembe v okolju. Pri naravni transformaciji postanejo kompetentne v nekem specifičnem času svojega življenja, medtem ko pri umetni transformaciji kompetentnost izzovemo z različnimi solmi (npr. CaCl2) oz. z opazno spremembo temperature. Transdukcija poteka z bakteriofagi, ki prenašajo DNA iz druge bakterijske celice. Pogoj za konjugacijo pa je, da morata biti dve celici začasno fizično povezani. Prek te povezave nato preide DNA v drug enocelični organizem. Ves zapis za konjugacijo se nahaja na konjugativnih plazmidih, izmed katerih je najbolj preučen F plazmid, ki se nahaja v donorski bakteriji (F+). Donorska bakterija sintetizira na svoji površini konjugativni pilus, s katerim prepozna prejemniško bakterijo (F-). Ob vezavi nanjo se pilus skrajša, s čimer sta si bakteriji bližje, med njima pa se vzpostavi konjugativna pora. Na mestu OriT pride do reza ene od verig F plazmida. Prerezana enoverižna DNA vstopi v F- s 5'-koncem, pri čemer se hkrati sintetizirata manjkajoča dela verige v obeh bakterijah. Nato se prenesena DNA zaokroži, s čimer dobimo novo donorsko bakterijo. Začetki odkritij horizontalnega prenosa genov segajo v leto 1959, ko so s transdukcijo prenesli genetski material ''Escherichie coli'' v ''Salmonello Typhimurium''. Bolj razsežno pa so pojav začeli spremljati, ko so ugotovili, da je vse več bakterij odpornih na vse več različnih antibiotikov, česar ni bilo mogoče pojasniti z vertikalnim prenosom genov.

V laboratoriju so prenos genov izvajali na način, ki je preprostejši od naštetih mehanizmov. Ovojnico enoceličarja so predrli mehansko, s ''pre-stresanjem'' z zrnci stekla. Analogija takšnega prenosa se dogaja tudi v naravi. Delci peska v reki se na primer s pomočjo vodnega toka povzdignejo iz tal, pri čemer prihaja do mehanskega drgnjenja s številnimi mikroorganizmi, ki se v vrtincu nahajajo. S predrtjem ovojnice, lahko tuja DNA vstopi v predrt organizem. Ovojnico lahko predremo tudi z občutnim spreminjanjem temperature, zdaj pa to počnejo predvsem z elektroporacijo, metodo odkrito pred štirimi desetletji. Elektroporacija je enostaven način, s katerim prenesemo dedni material z izpostavitvijo mikroorganizmov močnim, kratkim, visoko-električno napetostnim pulzom. Ti ovojnico naluknjajo tako, da lahko DNA med celicami prehaja. Če je ovojnica naluknjana ravno dovolj, da mikroorganizem še vedno preživi, ko DNA vstopi v celico, se v večini primerov začne tuja DNA izražati. Ker prej omenjeni glavni mehanizmi temeljijo na proteinih, katerih delovanje je zelo omejeno in so se razvili šele tekom evolucije, se je Slovenec dr. Tadej Kotnik začel spraševati, če obstaja preprost fizikalni mehanizem, ki deluje že vse od nastanka življenja. Analogijo elektroporacije v laboratoriju je našel v nevihtni streli ter napisal študijo o nevihtni streli kot naravnem mehanizmu prenosa genov ter jo objavil v reviji Physics of Life Reviews. Njegovo razmišljanje temelji na sledečih dejstvih; dnevno udari na zemeljsko površje več 10 milijonov strel. Kjer ob zemljo udari strela, se elektroporira en kubični meter, na katerem živi od 100 do 1000 milijonov mikroorganizmov. Po prej opisanem mehanizmu elektroporacije lahko v naravi pride do prenosa genov na veliko preprostejši način in omogoča vnos tujega genskega materiala tako v prokarionte kot tudi evkarionte.

===IMUNSKI SISTEM CRISPR/Cas===

Sistem CRISPR/Cas deluje kot imunski sistem bakterij in arhej. Deluje tako, da koščke tuje DNK po vstopu v celico integrira v lokus CRISPR. Take koščke imenujemo vmesniki (prekinjajo pa jih t. i. ponovitve) in služijo kot nekakšen spomin imunskega sistema. Ta se v procesu transkripcije prepiše v molekulo crRNA (CRISPR RNA), ki usmerja proteine Cas na tarčno zaporedje. Proteini Cas so endonukleaze, ki tako prepoznajo specifično tujo DNK, jo cepijo in razgradijo.

===RAZISKAVA O VPLIVU VMESNIKA NA ODPORNOST BAKTERIJE ''STREPTOCCOCUS THERMOPHILUS''===

Da so vmesniki v resnici homologi tujih plazmidov, so sprva ugotovili z in silico analizami, ki so vodile do različnih hipotez o vlogah sistema CRISPR. V raziskavi iz leta 2007 so analizirali več sevov bakterije ''Streptococcus thermophilus'' za katere je značilno, da imajo dva lokusa CRISPR, oni pa so se omejili predvsem na CRISPR1.

Najprej so preverili hipotezo, da se med pridobitvijo odpornosti spremeni tudi bakterijski lokus CRISPR. Izbrali so sev ''Streptococcus thermophilus'' DGCC7710 divjega tipa (WT) in dva virulentna bakteriofaga, fag 858 in fag 2972, katerih genoma sta 93 % identična. Neodvisno med sabo so pripravili devet različnih mutantov bakterije z izpostavitvijo okužbi s fagom 858, fagom 2972 ali obema hkrati (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F1.large.jpg]), nato pa so analizirali njihov lokus CRISPR. V divjem tipu bakterij je bilo opaznih 32, v mutantih pa še dodatnih 1 do 4 vmesnikov. Po pričakovanjih iz prejšnjih poskusov so ugotovili, da se novi vmesniki vstavijo predvsem v vodilno zaporedje lokusa CRISPR. S sekvenciranjem so našli podobnost med dodatnimi vmesniki v mutiranih sevih in genomom fagov, katerim so bili izpostavljeni. Zanimivo je bilo, da so bile podobnosti najdene po celotnem genomu virusa, na kodirajočih in nekodirajočih zaporedjih. S temi ugotovitvami so dokazali, da se lokus CRISPR po okužbi z virusom spremeni tako, da v lastno zaporedje vstavi dodatne vmesnike, ki jih pridobi iz DNK virusa.

Opazili so, da je bila od tega, kateri vmesnik se je v lokus CRISPR vstavil, odvisna tudi rezistenca na fage; pri sevih, v katerih je bil vstavljeni vmesnik 100 % enak zaporedju faga, se je pojavila odpornost. Ker sta faga 858 in 2972 93 % identična, so vmesniki iz bolj ohranjenih regij (vmesniki S3, S6, S7) povzročili odpornost na oba faga. V primerih, ko pa je bilo med 29 – 30 nukleotidi prisotnih 1 – 15 nukleotidnih polimorfizmov, pa tak vmesnik (vmesnik S1, S2, S4, S5 in S8) ni več povzročil rezistence na oba, ampak samo na fag, kateremu je bil izpostavljen. Prav tako je v mutantih, v katerih je bilo vstavljenih več vmesnikov, bila odpornost višja. Med seboj so primerjali tudi odpornost bakterij po tem, ko so iz lokusa CRISPR izbrisali ali dodali vmesnike (glej sliko: [https://science.sciencemag.org/content/sci/315/5819/1709/F3.large.jpg]). Iz mutanta WTΦ858+S1S2 so odstranili vmesnika S1 in S2, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858. Ko so mutantu WTΦ2972+S4 zamenjali vmesnik S4 za S1 in S2, je bila bakterija odporna na fag 858. Mutantu WTΦ858+S1S2 so nato med gene Cas in CRIPSR1 vstavili zapis za eno samo ponovitev, kar je povzročilo ponovno občutljivost na fag 858, čeprav sta bila vmesnika S1 in S2 v lokusu še zmeraj prisotna. To dokazuje, da vmesniki sami po sebi ne povzročijo odpornosti.

Ker je že obstajala hipoteza, da so pri tem procesu pomembni tudi Cas geni, so v istem mutantu WTΦ858+S1S2 izbrisali gen ''cas5'' ali ''cas7''. Bakterija z izbrisanim genom ''cas5'' ni bila več odporna na fag 858, iz česar so sklepali, da Cas5 deluje kot nukleaza (ker vsebuje HNH-nukleazni motiv). V bakteriji z inaktiviranim genom ''cas7'' pa je odpornost na fag 858 ostala nespremenjena. Predvidevali so, da je Cas7 vpleten v sintezo in/ali insercijo dodatnih vmesnikov in ponovitev.

===RAZISKAVA O VPLIVU NA OMEJITEV HORIZONTALNEGA PRENOSA GENOV S POMOČJO CRISPR PRI BAKTERIJAH ''STAPHYLOCOCCUS''===

Pri odkrivanju vloge, ki jo pri omejevanju horizontalnega prenosa genov, predvsem s konjugacijo in transformacijo, igra mehanizem CRISPR, je pomemben del prispevala raziskava L. A. Marraffinija in E. J. Sontheimerja iz leta 2008. Raziskave sta se lotila zaradi vse večjega porasta bakterij ''Staphylococcus aureus'', rezistentnih na antibiotika meticilin in vankomicin, ki je posledica horizontalnega prenosa plazmidov iz bakterij ''Staphylococcus epidermis''. Gre za najpogostejši vrsti bakterij pri bolnišničnih okužbah.

Raziskava je potrdila dve hipotezi. Prva je bila potrjena s pomočjo že prej odkrite identičnosti vmesnika CRISPR ''spcI'' pri ''S. epidermis'' z zaporedjem ''nes'' (zapis za topoizomerazo I), najdenem na vseh izoliranih plazmidih, ki se konjugirajo med omenjenima vrstama bakterij. Ta lastnost nastali crRNA omogoči prepoznavanje konjugiranega plazmida in tako prepreči horizontalen prenos te DNA znotraj vrste. Druga značilnost CRISPR sistema, ki so jo potrdili, je delovanje na nivoju plazmidne DNA, in ne RNA kot je bilo pokazano pri evkariontskih celicah, kar je še dodatno podprlo vprašanje o sistemu, s katerim celica preprečuje napad lastne DNA z zapisom CRISPR.

V raziskavi so uporabili dva seva S. epidermis, in sicer RP62a, ki vsebuje zaporedje CRISPR ter spremljajoče gene (med drugim tudi ''cas''), ter njegovo različico LAM104, ki ima deletiran CRISPR del. Kontrolo so izvajali na sevu ''S. epidermis'' brez zaporedja CRISPR, ATCC 12228. Kot vir plazmidov so uporabili sev ''S. aureus RN4220''. Da bi dokazali, da ''spc1'' preprečuje konjugacijo plazmidov v seve s CRISPR (torej sev RP62a), so v ''nes'' zaporedje plazmida pG0400 (krajše pG0(wt)) vstavili 9 tihih mutacij. Novonastali plazmid so poimenovali pG0(mut). Uspešnost konjugacije je bila pri kontrolnem sevu enaka za oba plazmida (po pričakovanjih), medtem ko je bila pri sevu RP62a uspešna le za pG0(mut), kar je potrdilo hipotezo o preprečitvi konjugacije s pomočjo dela zaporedja CRISPR, ki je enak enemu od plazmidnih genov. Da bi izključili morebitno vlogo ostalih razlik v genomu med poskusnim in kontrolnim sevom, so bakterijam iz RP62a deletirali CRISPR sekvenco z vmesniki in nov sev poimenovali LAM104. Ponoven poskus konjugacije je potrdil rezultate, pridobljene s kontrolnim sevom.

Drugi del raziskave je preverjal, ali crRNA deluje na plazmidno DNA ali RNA. Dokazi, da CRISPR v RP62a onemogoča sprejemanje plazmidov z ''nes'', ne pa njihovega oddajanja drugim celicam, kažejo na to, da ta mehanizem očitno ne vpliva na RNA prepis ''nes'', temveč na DNA. Iz tega lahko sklepamo tudi, da je crRNA identična (in ne komplementarna) ''nes'' mRNA. Da bi ta predvidevanja potrdili, so v regijo ''nes'' na plazmidu pG0400 vnesli samoizrezujoče se introne iz skupine I in tako pridobili okrnjen zapis DNA (pG0(I2)), ki pa se po prepisu v RNA sprocesira do identičnega proteina kot originalno zaporedje. Poskusi so pokazali enako uspešnost konjugacije pri sevu, ki vsebuje CRISPR (RP62a) ter pri sevu, ki ga ne (LAM104 in kontrolni sev ATCC 12228), kar potrjuje, da crRNA ne prepozna zaporedja DNA, če to vsebuje introne in torej ne prepreči vnosa tujega plazmida v celico. Na podoben način so izvedli tudi poskus s transformacijo, ki je dal enake rezultate in potrdil, da CRISPR ne prepozna tarčnega zaporedja, ki vsebuje introne. Ker so transformacijo opravili z elektroporacijo dvoverižne DNA v bakterijske celice, ostaja ta mehanizem pri naravni transformaciji, pri kateri lahko DNA prehaja tudi v enoverižni obliki, še nepotrjen.

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-03-08T19:04:13Z

Nika Mikulič:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315|pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so (seznam v pripravi):

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. Blokiranje receptorjev za fage (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme (Nika Boštic,) 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Urška Zagorc, Nika Mikulič Vernik, Anja Tavčar) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Jernej Imperl, Klementina Polanec, ) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' (Karmen Mlinar, Marko Pacleković, Valeriya Musina) 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom (Sanja Stanković) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

Odgovor bakterij na tujo DNA

2019-03-08T19:00:18Z

Nika Mikulič:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2018/19 obravnavajo odziv bakterijskih celic na tujo DNA, ki vstopi vanje, oziroma na okužbo z bakteriofagi. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si preberite [https://www.nature.com/articles/nrmicro2315|pregledni članek] v Nature Rev. Microbiol. iz leta 2010. V okviru posameznih poglavij znotraj osnovne teme lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti. Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga pribl. 20 minut (tolerančni okvir je 18-23 min.), temu pa bo sledila razprava, dolga 5-10 min. Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite čim manj splošnega uvoda.

Razpored seminarjev po datumih bo razviden iz spletne učilnice. Začetek seminarjev bo 8. aprila, na dve uri (ponedeljek, četrtek) pa so predvideni po trije seminarji.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev so 2-3 vprašanja od ~30, kolikor jih ima celoten izpit.

Poglavja za seminarje so (seznam v pripravi):

'''Preprečevanje adsorpcije fagov na celično površino''' 
1. Blokiranje receptorjev za fage 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 

'''Preprečevanje ponovne okužbe z istim fagom s preprečitvijo vstopa fagne DNA''' 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 

'''Bakterijski restrikcijsko-modifikacijski sistem''' 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz ''(npr. Nobelovo predavanje Hamiltona Smitha 1978 in njegov članek iz 1970)'' 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme 

'''Sistem CRISP/Cas proti fagom in plazmidom''' 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij (Mojica et al., 2005) 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Marraffini&Sontheimer, 2008) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Brouns et al., 2008) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom 

''Kjer so ob temi navedeni članki, naj ti služijo kot osnova za iskanje dodatnih virov.''

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja:

1. Blokiranje receptorjev za fage (Martina Lokar, Tina Kolenc Milavec, Urša Štrancar) 
2. Proizvodnja zunajceličnega matriksa 
3. Proizvodnja kompetitivnih inhibitorjev 
4. Sistem Sie pri gramnegativnih bakterijah (Anamarija Agnič, Aljaž Bratina, Anže Šumah) 
5. Sistem Sie pri grampozitivnih bakterijah 
6. Odkritje prvih restrikcijskih endonukleaz 
7. Metilacijski sistem pri bakterijah (Sumeja Kudelić, Maja Škof, Maks Kumek) 
8. Struktura in mehanizem restriktaz tipa II (Meta Kodrič, Barbara Jaklič, Laura Gašperšič) 
9. Prilagoditve fagov na bakterijske restrikcijsko-modifikacijske sisteme (Nika Boštic,) 
10. Odkritje in opis regij CRISPR in Cas (do leta ~2002) 
11. Odkritje izvora ponavljajočih se zaporedij 
12. Odkritje vloge CRISPR/Cas pri omejevanju vnosa plazmidov (Urška Zagorc, Nika Mikulič Vernik, ) 
13. Mehanizem delovanja kompleksa Cascade in sistem CRISPR/Cas pri ''E. coli'' (Jernej Imperl, Klementina Polanec, ) 
14. Struktura in delovanje sistema CRISPR/Cas pri bakteriji ''Streptococcus pyogenes'' (Lara Hrvatin, Doroteja Armič, Matija Ruparčič) 

'''Sistemi abortivne infekcije (Abi)''' 
15. Sistem Rex pri bakteriji ''Escherichia coli'' (Karmen Mlinar, Marko Pacleković, Valeriya Musina) 
16. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin, usmerjeni proti fagom (Sanja Stanković) 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na spodnjem seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila (pod viri) v novo vrstico dodajte oznaki: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na primer na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

BIO2 Povzetki seminarjev 2017

2017-12-01T16:16:30Z

Nika Mikulič: /* Nika Mikulič Vernik: Hiperamoniemija in metode zdravljenja */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2017/2018 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2017 stran]

=== Luka Gregorič: Pozitivne vloge negativnih regulatorjev ===

Pri preučevanju regulacije sistemov v celici, so negativni regulatorji bolj temen, neraziskan del celotnega procesa, čeprav enako pomemben. Brez njih se lahko v celici začenja nenadzorovano deljenje in posledično rakavost tkiva, ali pa se nam poveča možnost hujšega obolenja. V živčnem sistemu lahko brez GPR-jev poteče prekomerna mielinizacija aksonov, ki pomenijo veliko zmanjšanje vseh kognitivnih sposobnosti organizma in posledično tudi manjšo zmožnost prilagajanja. V mišičnem tkivu, pa lahko pomanjkanje ali slabše delovanje negativnih regulatorjev naredi tkiva manj eksplozivna in povzroči hitrejše staranje, zaradi razlik med tkivi tipa 1 in tipa 2. V najhujšem primeru pa nam pomanjkanje negativnih regulatorjev celo povzroči mišično atofijo, medtem ko nam bi boljše poznavanje prav njih lahko omogočilo, da obdržimo mlade mišice čez celo življenje. Hitrost celotnega delovanja negativnih regulatorjev pa ni odvisna od moči signala, saj signal v zelo majhnem času lahko spravijo na prvotno raven, ne glede na to, kdaj se je ta signal začel. Visoka odzivnost signalov pa tudi pomaga telesu, ko se rabi hitro odzvati na različne dražljaje. Najhitrejše to naredi tako, da je signal vedno aktiviran in se izklopi le ob primeru, da se je potrebno hitro odzvati.

=== Ines Medved: Vohalni receptorji v epidermisu ===
Primarna vloga vohalnih receptorjev je zaznava vonja, ki je zelo pomembna. Poleg zaznave vonja pa imajo receptorji za vonj tudi druge funkcije. Ti receptorji se nahajajo v tkivih, ki niso povezana z vohalno nalogo. Nahajajo se skoraj po celotnem telesu npr. v ledvicah, možganih, srcu, koži, v krvi … V epidermisu so našli dva takšna receptorja, in sicer receptorja OR2AT4 in OR51E2. Kljub podobnemu mehanizmu delovanja se po funkciji zelo razlikujeta. OR2AT4 ob stimulaciji z agonistom poveča celično proliferacijo, vpliva na migracijo celic in sodeluje pri reepitalizaciji v procesu celjenja ran. Ugotovili so, da sodeluje tudi pri zaprtju rane. Za razliko od OR2AT4 receptor OR51E2 zmanjša celično proliferacijo, sodeluje pa v melanogenezi, dendritogenezi in pri celični diferenciaciji. Vohalni receptor OR51E2 ima vlogo tudi v rakavih celicah prostate. Receptorja sta zelo specifična. Vohalni receptor OR2AT4 stimulira le sandanol in brahmanol, OR51E2 pa β-ionon. Za oba receptorja so našli tudi antagoniste, ki blokirajo Ca2+ signal. Za OR2AT4 so odkrili dva antagonista oksifenilon in fenirat, za receptor OR51E2 pa α-ionon. Kljub podobni lokaciji in mehanizmom se receptorja zelo razlikujeta. Medtem ko bi se OR2AT4 lahko uporabljal pri zdravljenju oziroma celjenju rane, bi bil lahko receptor OR51E2 potencialni pokazatelj za rakave celice.

===Daria Latysheva: The role of intrinsically disordered proteins in signalling pathways and regulation ===

Intrinsically disordered proteins (IDPs) are proteins, which do not have a defined three – dimensional structure, yet are completely functional. Found mostly in eukaryotic cells, they play an important role in biosignalling and regulation of a cell. Undergoing coupled folding and binding, IDPs’ recognition elements are cable of taking over the structures of different targets. Since IDPs have multiple interaction motifs, they often serve as signalling centres, thus contributing to the dynamic assembly of complex molecules and varied signalling pathways. Undergoing post – translational modifications, these proteins also add complexity to the regulatory networks and can change the original output of the crosswalk. IDPs are also an important component of higher - order signalling assemblies, enabling the formation of reversible complexes. Being an attractive field of the research, IDPs were not yet studied completely and there is still much to be understood about the structure, functions and the location of IDPs in the cell. Experimental and computational techniques are being developed to identify and characterise disordered regions in proteins in order to emphasize the prevalent role of IDPs in cellular signalling and regulation.

===Polona Skrt: Mehanizem zaznavanja okusa maščobe ===

Okus je pomembna zaznavna zmožnost, saj nas usmerja pri uživanju hranilne in prebavljive hrane ter nas ščiti pred strupi in ostalimi nevarnimi snovmi. Čutne celice se nahajajo v brbončicah v ustni votlini, na jeziku in v grlu. V brbončicah se nahaja okoli 100 celic, ki jih delimo v 3 skupine. Prvi tip so celice podobne glia celicam, ki se ovijejo okoli ostalih celic in jim nudijo oporo ter preprečujejo nekontrolirano širjenje živčnih prenašalcev. Naslednji tip so t.i. receptorske celice, ki zaznavajo sladko, grenko in umami ter sproščajo nevrotransmiterje, ki signal prenesejo do živčevja. Tretji tip celic so predsinaptične celice, ki se odzivajo predvsem na kisel okus. Njihova posebnost je, da se prek sinaps direktno povezujejo z živčnim vlakni. Pri signalizaciji okusov so zelo pomembni z G-proteini povezani receptorji, ki omogočajo zaznavanje sladkega, grenkega in umami okusa ter ionski kanalčki, ki prenašajo informacijo o kislem in slanem okusu. Ne dolgo nazaj so znanstveniki, k prej omenjenim petim osnovnim okusom, dodali še šestega – okus po maščobi. Signalizacija najverjetneje poteka preko receptorja CD36, možni pa so še GPR120 in GPR40 ter DRK kanalčki. Mehanizem je še dokaj neraziskan, predpostavljajo pa sodelovanje med več receptorji.

===Peter Škrinjar: Receptorji za okus in njihova povezava z debelostjo ===

Okus je eden izmed petih osnovnih čutov, katerega naloga je prepoznavanje hranil in preprečevanje vnosa telesu nevarnih snovi. Pri tem mu pomagajo receptorji za okus. Te se razlikujejo za vseh pet osnovnih okusov – grenko, sladko in umami zaznamo s pomočjo GPCR-jev, slano in kislo pa s pomočjo ionskih kanalčkov. Raziskave še potekajo glede receptorjev za maščobnokislinski okus. Poleg receptorjev v ustih pa poznamo tudi receptorje za okus v prebavni cevi. Tam so te pomembni predvsem v enteroendokrinih celicah, kjer ob prisotnosti različnih ligandov sprožijo izločanje različnih peptidnih hormonov (GLP-1, CCK, PYY itd.). Te nato stimulirajo vagusni živec, ki prenese informacijo do možganov, ki se primerno odzovejo (npr. ob prisotnosti sladkorjev se v prebavni cevi izloča GLP-1, ki sproži izločanje inzulina iz trebušne slinavke). Receptorje za okus lahko povežemo tudi z debelostjo. Genetske razlike pri receptorjih za maščobnokislinski okus (predvsem CD36, ki je najbolj raziskan) lahko povzročijo slabše zaznavanje maščobnih kislin, kar bi nato vodilo do debelosti. To povezavo je sicer potrebno še dokazati. Podobno bi lahko predvidevali za maščobnokislinske receptorje v prebavnem traktu. Kot alternativa za zdravljenje debelosti se je pojavila hipoteza o zdravljenju preko receptorjev za okus na adipocitah brez α-gustducina, na katere imajo grenke komponente inhibicijski učinek.

===Milica Janković: Jedrni receptorji: Karakteristike in regulacija receptorjev ter identifikacija ligandov===

Jedrni receptorji so proteini prisotni v celicah, ki prenašajo signale svojih ligandov. Naddružino jedrnih receptorjev sestavlja 48 transkripcijskih faktorjev (pri ljudeh). Aktivirajo se po vezavi liganda in vključujejo receptorje za steroidne hormone, lipofilne vitamine, ščitnične hormone in retinoinsko kislino. Receptor- ligandni kompleks se veže na specifično področje na DNA, katero imenujemo hormonski responsni element (HRE). Jedrni receptorji so transkripcijski faktorji, ker delujejo direktno v jedru in spreminjajo ekspresijo genov ter na ta način vplivajo na razvoj, diferencijacijo in homeostazo in metabolizem. Obstajajo štirje tipi nuklearnih receptorjev, ki se razlikujejo po signalnih poteh.Zavzemajo tudi različne konformacije, ki so povzročene z vezavo agonista, oziroma antagonista. Morda najbolj revolucionarna ugotovitev, je bilo presenetljivo odkritje, da obstajajo številni receptorji, kateri so povezani na majhne molekulske ligande. Ker ti ligandi niso znani, receptorji so poimenovani siroti (orphans) receptorji. Vprašanje je bilo, kako bi lahko prišli do odkritja tistih ligandov? Vsi jedrni receptorji imajo podobno strukturo, na podlagi česa je bilo lahko narediti vrsto testov za identifikacijo ligandov.
Ker se pa vežejo na majhne molekule, predstavljajo zanimive terapevtske cilje. Bi bili bogat vir za razvoj sintetičnih majhnih molekul kot ligandov.

===Tina Turel: Vpliv mikroorganizmov na presnovo glukoze===

V biomedicini je v zadnjih letih prišlo do odkritja, da črevesna mikroflora sodeluje v različnih metabolnih procesih. Mikroorganizmi v črevesju komunicirajo z gostiteljem preko TLR-jev. TLR so receptorji v prirojenem imunskem sistemu, ki zaznajo določeno patogeno zaporedje in aktivirajo imunski odziv oziroma omogočajo komunikacijo med črevesno mikrofloro in gostiteljem. Prav tako pa lahko TLR-ji pa omogočijo, da v različnih metabolnih procesih lahko sodelujejo tudi mikroorganizmi. V študiji so se znanstveniki usmerili v določitev vseh členov, ki vplivajo na presnovo glukoze. Presnova glukoze je univerzalni postopek, ki je prisoten v vseh vretenčarjih in tudi v nekaterih nevretenčarjih. Študija je odkrila manjkajočo povezavo med IFNɣ in presnovo glukoze in sicer A. muciniphilo, ključni mikroorganizem, ki je odgovoren za izboljšanje tolerance na glukozo. Potrdili so, da bakterija lahko izboljša toleranco glukoze v različnih gostiteljih. Irgm1 so določili kot glavnega posrednik med IFNɣ in A. muciniphilo. Dejstvo je, da je A. muciniphila prisotna tudi v človeški mikroflori, zato so znanstveniki opravili poskuse tudi na prostovoljcih. Izkazalo se je, da je postopek in pa vpliv določenih komponent na presnovo in toleranco glukoze enak kot pri miših. Raziskava pa ponuja novo pot v zdravljenju metabolnih bolezni in sicer reguliranje ravni A. muciniphile.

===Ana Maklin: Vloga PGP in PHO13 v metabolizmu===

PGP in njegov ortolog PHO13 v kvasovkah sta bila predmet številnih raziskav. Njune funkcije so zelo raznolike, jasno pa je, da s svojo fosfatazno aktivnostjo ter drugimi lastnostmi pomembno vplivata tudi na metabolizem. Zaradi stranske aktivnosti nekaterih encimov v metabolnih procesi, nastajajo tudi produkti, ki lahko ovirajo normalno delovanje celic. Evolucijsko gledano, so organizmi torej morali ustvariti popravljalni sistem, ki prepreči nadaljnje posledice teh napak. Naloga PGP in PHO13 je, da s svojo aktivnostjo pretvorita neželjene produkte, ki nastajajo zaradi stranske aktivnosti encimov, v druge, ki niso škodljivi. V metabolizmu glukoze, zaradi stranske aktivnosti gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze in piruvat kinaze nastajata 4-fosfoeritronat in 2-fosfolaktat. Prvi je inhibitor 6-fosfoglukonat dehidrogenaze, drugi pa fosfofruktokinaze-1. Inhibicija teh dveh encimov bi brez PGP in PHO13 povzročila moteno glikolizo in pentoza fosftno pot. PHO13 oziroma njegova odsotno v celicah ima pomembo vlogo tudi pri pretvorbi rastlinske biomase v etanol. Ker uporaba etanola iz biomase kot vir obnovljive energije postaja vedno bolj razširjena, je PHO13 postal pomemben predmet za napredek v metabolnem inženirstvu. Deaktivacija PHO13 v kvasovkah z izraženimi XR/XDH/XK namreč preprečuje defosforilacijo ksiluloze 5-fosfata, kar omogoča nadaljevanje metabolnih procesov potrebnih za nastanek etanola, izboljša toleranco na običajne inhibitorje fermentacije (šibke kisline, produkti razgradnje sladkorjev) ter povzroči pospešeno transkripcijo genov, vključenih v pentozo fosfatno pot (naprimer TAL1,ki kodira protein transaldolazo, enega ključnih encimov pri neoksidativni pentoza fosfatni poti).

===Barbara Slapnik: Regulacija metabolizma glukoze v sesalskih celičnih kulturah===

Regulacija metabolizma glukoze je iz vidika celičnih kultur zelo pomembna, saj vpliva na celično rast in produktivnost celic. Boljše poznavanje regulacije metabolizma nam omogoča njegovo kontroliranje in s tem možnost za povečanje produktivnosti celic v celičnih kulturah. Regulacija metabolizma glukoze v celici poteka v več stopnjah. Pretok omejujejo intermediati, ki vstopajo še v druge metabolne poti. Zelo pomembna stopnja je regulacija z encimi. Glavni encimi, ki regulirajo glikolizo so heksokinaza, fosfofruktokinaza in piruvat kinaza. Poznamo več izooblik encimov, ki se razlikujejo po delovanju in afiniteti do substratov. Regulacija metabolizma glukoze poteka tudi na nivoju celične signalizacije. Protein kinaza B, ki ga imenujemo tudi Akt je odvisen od prisotnosti inzulina. Akt vpliva na izražanje glukoznega prenašalca 1 in delovanje heksokinaze ter fosfofruktokinaze. AMP kinaza je ključna za aktivacijo katabolnih poti in inhibicijo anabolnih poti. c-Myc je transkripcijski faktor, ki vpliva na izražanje glukoznega prenašalca 1 in delovanje fosfofruktokinaze, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze, fosfoglicerat kinaze in enolaze. p53 je transkripcijski faktor, ki zmanjša transkripcijo glukoznega prenašalca 1 in 3 ter aktivnost fosfoglicerat mutaze. Razumevanje regulacije metabolizma glukoze nam omogoča boljšo celično rast v bioreaktorjih.

===Ajda Krč: Spremembe v delovanju Krebsovega cikla in sposobnost prilagajanja parazitov na razmere v okolju===

Preučevanje parazitov, predvsem njihovega življenjskega kroga ter biokemijskih procesov, ki skrbijo za njihovo rast in razvoj, je pomembno predvsem z vidika preprečevanja bolezni, ki jih povzročajo s svojim zajedanjem v gostiteljskih organizmih. Paraziti iz debla Apicomplexa, v katerega spadata tudi Plasmodium falciparum in Toxoplasma gondii imajo značilen organel, t.i. apikoplast, s katerim prodrejo v gostiteljsko celico. Plasmodium falciparum spada v družino plazmodijev, zajedavcev eritrocitov, ki povzročajo malarijo, Toxoplazma gondii pa je glavni krivec za pojav toksoplazmoze. Življenjski krog teh parazitov se običajno deli na spolno in nespolno fazo razmnoževanja. Obe fazi spremljajo določeni procesi, ki pomagajo organizmom preživeti v najrazličnejših okoljih. Med mehanizme, ki sodelujejo pri preživetju, gotovo spada tudi ogljikov metabolizem, ki vključuje procese glikolize, glutaminolize, reakcije v Krebsovem ciklu ter elektronsko prenašalno verigo. V seminarski nalogi so opisane nekatere spremembe in prilagoditve določenih encimov Krebsovega cikla na okolje, v katerem se organizem nahaja, ter anaplerotične poti, v katere je Krebsov cikel parazitov vpleten. Prav tako so razložene nekatere alternativne poti, po katerih paraziti pridejo do potrebne energije (reakcije glutaminolize) glede na fazo v njihovem razvoju.

===Urban Hribar: Metabolizem polariziranih makrofagov===

Makrofagi lahko spremenijo svoje delovanje kot odziv na zunanje dejavnike za opravljanje različnih nalog. Temu procesu pravimo aktivacija oziroma polarizacija makrofagov. Makrofagi se lahko palarizirajo v makrofage tipa M1 (klasično aktivirani) in tipa M2 (alternativno aktivirani). Makrofagi M1 so pomembni v boju proti okužbam mikrobov in so znani kot makrofagi, ki promovirajo vnetja. Proizvajajo tudi dušikov oksid (NO) in vnetostne citokinine. Na dolgi rok lahko makrofagi M1 in njihovi produkti škodujejo tkivu lastnega oganizma. Zato makrofagi tipa M2 zavirajo vnetja in so odgovorni za popravilo tkiva. Pri funkcijah teh makrofagov imajo pomembno vlogo tudi spremenjeni metabolizmi polariziranih makrofagov. Makrofagi M1 imajo pospešeno delovanje glikolize ter zmanjšano aktivnost oksidativne fosforilacije. Z pospešeno glikolizo ter laktatno fermentacijo makrofagi proizvajajo večino svojih zalog ATP. Poleg tega ima tudi prekinjen krebsov cikel na dveh mestih. Prvo mesto je pri reakciji izocitrata v alfa-ketoglutarat, drugo mesto pa pri reakciji sukcinata v fumarat. Prekinitve v ciklu vodijo do kopičenja intermediatov, ki pa se uporabljajo za sintezo NO, prostgladinov in vnetnosnih citokinov. Hkrati je krebsov cikel makrofagov M1 povezan z ciklom sečnine, ki lahko proizvaja NO. Posebnost makrofagov M1 je tudi da v mitohondrijih proizvajajo povečane količine reaktivnih kisikovih zvrst (ROS). Te se tudi uporabljajo za boj proti bakterijam in proizvodnjo vnetnostnih citokinov.

===Urška Zagorc: Salmonela in citratni cikel===

Zastrupitev z bakterijo salmonelo spada med najpogostejše zastrupitve s hrano. Bakterija lahko živi v različnih okoljih, saj zna zelo dobro prilagoditi svoj metabolizem in se hkrati tudi izmakniti naravnemu imunskemu sistemu. Za to poskrbijo številni encimi citratnega cikla v salmoneli. Encimi akonitaza, izocitrat dehidrogenaza in izocitrat liaza inhibirajo delovanje inflamasoma NLRP3. Inflamasom je receptor imunskega sistema in aktivira kaspaze, ki vodijo v celično smrt. Z inhibiranim delovanjem teh inflamasomov posledično ne pride do celične smrti škodljivih celic. Tudi citrat in citratni cikel imata pri ohranjanju bakterije salmonele svojo vlogo. Citrat, na primer, je povezan v kompleks z železom. Ob izpostavljenosti dušikovemu oksidu, ki ima velik vpliv na celoten ogljikov metabolizem, se citrat porablja. Zmanjša se količina železa v celici, ki je bila prej v ravnotežju, hkrati pa se zmanjša tudi rast salmonele. Citratni cikel pa ni edini način, ki ga uporablja bakterija salmonela za svoje preživetje. Razvila je namreč mnogo poti, po katerih se lahko izogne oviram gostitelja. Ta se poleg inflamasomov bori s salmoneli strupenimi snovmi, kot je dušikov oksid, a tudi za to je bakterija že našla rešitev.

===Lija Srnovršnik: Hepatična oksidacija maščobnih kislin med stradanjem===

Jetra so ključna pri uravnavanju ravnotežja energije v celotnem telesu.
Da bi razumeli vlogo hepatične β-oksidacije maščobnih kislin med obdobjem stradanja, so vzredili miši z izločenim genom za delovanje karnitin acil-transferaze 2 v jetrih (Cpt2L-⁄- miši). Ta encim katalizira obvezen korak v mitohondrijski dolgoverižni β-oksidaciji maščobnih kislin. Karnitin acil-transferaza 2 namreč sodeluje pri prenosu maščobnih kislin v notranjost mitohondrija in brez nje β-oksidacija ne more potekati. Miši so stradali 24 ur, kar je povzročilo nalaganje maščobe na jetra in povišano raven lipidov v krvi, vendar pa odsotnost ketonskih telesc, medtem ko je raven glukoze ostala normalna. Če med stradanjem, hepatična oksidacija ne poteka, se inducirajo PPARα tarčni geni v jetrih. Sistemska homeostaza energije je bila večinoma vzdrževana v stradajočih Cpt2L-⁄- miših z adaptacijami v hepatični in sistemski ekspresiji genov za oksidacijo, na kar so vplivali PPARα tarčni geni, ki vključujejo prokatabolične hepatokine Fgf21, Gdf15 and Igfbp1.
Da bi primerjali rezultate, so Cpt2L-⁄- miši hranili s ketonsko dieto, prišlo je do hude lipolize ter posledično hepatomegalije (povečanja jeter), poškodb samega organa in posledično smrti. Opazili so popolno odsotnost zalog triacilglicerolov v adipocitih. Ti podatki kažejo, da hepatična oksidacija maščobnih kislin ni nujno potrebna za preživetje med pomanjkanjem hrane, vendar je ključna za omejitev lipolize v adipocitih ter regulacijo nadomestnega katabolizma, ko je glukoza omejena.

===Patrik Levačić: Ceramidi in njihova povezava z debelostjo===
V modernem svetu je debelost vse večji problem, če ne celo eden glavnih krivcev za bolezni, ki so povezane s prekomerno cirkulacijo lipidov v krvi, kot je npr. ateroskleroza ipd. Tekom debelosti je prisotnega več sladkorja v obliki glukoze, lipidov ter vnetji. Ker je presežek lipidov, natančneje maščobnih kislin v obtoku, so to primerni pogoji za tvorbo ceramidov, ki so sicer še sestavljeni iz sfingozina, ki se preko aminske skupine poveže z maščobno kislino. Ceramidi se eni glavnih krivcev za znižano stopnjo oksidacije maščobnih kislin, to pripomore k nalaganju maščobnega tkiva na organe ter v adipocitno tkivo, a žal lahko tudi adipocitno tkivo raste do neke mere, ko doseže maksimalno velikost posatne to tkivo nefunkcionalno in ne more več shranjevati lipidov. Rezultat je prekomerna cirkulacija lipidov v krvi. V seminarju je največ govora o dveh specifičnih ceramidih, ceramid C16:0 ter ceramid C18:0, ki sta v raziskavah imela vlogo negativnega regulatorja metabolizma lipidov ter slodkorjev. Kakršnekoli motnje metabolizma pa se odražajo v obliki vnetji, slabši funkcionalnosti celic, samih organelov v notranjosti celice ter kroničnih obolenj kot so npr. sladkorna bolezen. Za boj proti debelosti je večina študij ugotovila, da s povišanim procentom oksidiranih maščobnih kislin dosežemo zmanjšanje deleža prostih maščobnih kislin ter blokiramo tvorbo novih ceramidov.

===Jerneja Nimac: Ketonska telesca kot signalni metaboliti===

Nove raziskave na področju ketonskih telesc kažejo, da ta niso le pasivni prenašalci energije, ampak tudi pomembni signalni metaboliti. Najpomembnejši med njimi je β-hidroksibutirat (BHB). Signalne vloge, ki mu jih pripisujejo so inhibicija histonske deacetilaze razreda I (HDAC), aktivacija z G-proteinom sklopljenega receptorja HCAR2 in inhibicija prav tako z G-proteinom sklopljenega receptorja FFAR3. Ko BHB inhibira HDAC se poveča izražanje genov, ki zmanjšajo oksidativni stres, poleg tega pa naj bi ta inhibicija izboljšala občutljivost na inzulin. Antilipolitični učinek receptorja HCAR2 inhibira hormonsko odzivno triglicerid lipazo, kar ustvari negativno povratno zanko in zaustavitev ketogeneze. Vpliv BHB na receptor FFAR3 pa še ni popolnoma raziskan. Predpostavljajo, da BHB vpliva na FFAR3 v odvisnosti od pogojev, torej G-proteina in koncentracije BHB, je pa ena od raziskav pokazala, da molekula BHB z vezavo na FFAR3 inhibira od napetosti odvisne kalcijeve kanalčke. Molekula BHB se veže tudi na inflamasom NLRP3 in z njegovo inhibicijo prepreči izstop K+. Poleg ketonskega telesca BHB pa ima nekaj signalnih funkcij tudi acetoacetat. Slednji skupaj z molekulo BHB regulira vezikularni transporter glutamata (VGLUT2), in sicer tako da inhibira od Cl- odvisni vnos glutamata. Signalna funkcija ketonskih telesc v celici pa sproži odzive, ki naj bi pripomogli k zaviranju epilepsije, demence, raka in vplivali na staranje.

===Nika Mikulič Vernik: Hiperamoniemija in metode zdravljenja===

Amonijak se v telesu porablja v anabolizmu aminokislin, sintezi proteinov in zagotavljanju pH vrednosti. Kadar ga je v krvni plazmi preveč, ga mora telo detoksicirati in izločiti, za kar skrbi cikel uree v jetrnih celicah. Preostanek amonijaka odstrani glutamin sintetaza, ki iz glutamata tvori glutamin. Če je amonijaka v krvi preveč, to stanje imenujemo hiperamoniemija. Za razvoj te bolezni poznamo več vzrokov, glede na njih pa ločimo primarno (okvare encimov ali transporterjev, ki delujejo v ciklu uree) in sekundarno hiperamoniemijo (inhibicija cikla uree).
Ker ima amonijev ion NH4+ podoben atomski radij kot K+, lahko membrane prehaja na enak način. Preide lahko tudi krvno možgansko bariero, kar povzroča nevrološke težave, kot so zatekanje astrocitov, povečana permeabilnost krvno možganske bariere, cerebralni edem (zatekanje možganov) in hepatična encefalopatija, kar lahko vodi v komo in celo smrt.
Zdravila za zdravljenje hiperamoniemije imajo dva možna načina delovanja; 1) zmanjšanje nastanka in absorpcije amonijaka (zmanjševanje števila bakterij, ki proizvajajo ureaze, ali zmanjševanje degradacije glutamina in glicina); 2) izboljšanje sistemov za detoksikacijo in izločanje. Zraven tega se uporabljajo tudi razne dialize, genske in celične terapije ter kirurški posegi.

BIO2 Povzetki seminarjev 2017

2017-12-01T16:12:28Z

Nika Mikulič: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2017/2018 */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2017/2018 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2017 stran]

=== Luka Gregorič: Pozitivne vloge negativnih regulatorjev ===

Pri preučevanju regulacije sistemov v celici, so negativni regulatorji bolj temen, neraziskan del celotnega procesa, čeprav enako pomemben. Brez njih se lahko v celici začenja nenadzorovano deljenje in posledično rakavost tkiva, ali pa se nam poveča možnost hujšega obolenja. V živčnem sistemu lahko brez GPR-jev poteče prekomerna mielinizacija aksonov, ki pomenijo veliko zmanjšanje vseh kognitivnih sposobnosti organizma in posledično tudi manjšo zmožnost prilagajanja. V mišičnem tkivu, pa lahko pomanjkanje ali slabše delovanje negativnih regulatorjev naredi tkiva manj eksplozivna in povzroči hitrejše staranje, zaradi razlik med tkivi tipa 1 in tipa 2. V najhujšem primeru pa nam pomanjkanje negativnih regulatorjev celo povzroči mišično atofijo, medtem ko nam bi boljše poznavanje prav njih lahko omogočilo, da obdržimo mlade mišice čez celo življenje. Hitrost celotnega delovanja negativnih regulatorjev pa ni odvisna od moči signala, saj signal v zelo majhnem času lahko spravijo na prvotno raven, ne glede na to, kdaj se je ta signal začel. Visoka odzivnost signalov pa tudi pomaga telesu, ko se rabi hitro odzvati na različne dražljaje. Najhitrejše to naredi tako, da je signal vedno aktiviran in se izklopi le ob primeru, da se je potrebno hitro odzvati.

=== Ines Medved: Vohalni receptorji v epidermisu ===
Primarna vloga vohalnih receptorjev je zaznava vonja, ki je zelo pomembna. Poleg zaznave vonja pa imajo receptorji za vonj tudi druge funkcije. Ti receptorji se nahajajo v tkivih, ki niso povezana z vohalno nalogo. Nahajajo se skoraj po celotnem telesu npr. v ledvicah, možganih, srcu, koži, v krvi … V epidermisu so našli dva takšna receptorja, in sicer receptorja OR2AT4 in OR51E2. Kljub podobnemu mehanizmu delovanja se po funkciji zelo razlikujeta. OR2AT4 ob stimulaciji z agonistom poveča celično proliferacijo, vpliva na migracijo celic in sodeluje pri reepitalizaciji v procesu celjenja ran. Ugotovili so, da sodeluje tudi pri zaprtju rane. Za razliko od OR2AT4 receptor OR51E2 zmanjša celično proliferacijo, sodeluje pa v melanogenezi, dendritogenezi in pri celični diferenciaciji. Vohalni receptor OR51E2 ima vlogo tudi v rakavih celicah prostate. Receptorja sta zelo specifična. Vohalni receptor OR2AT4 stimulira le sandanol in brahmanol, OR51E2 pa β-ionon. Za oba receptorja so našli tudi antagoniste, ki blokirajo Ca2+ signal. Za OR2AT4 so odkrili dva antagonista oksifenilon in fenirat, za receptor OR51E2 pa α-ionon. Kljub podobni lokaciji in mehanizmom se receptorja zelo razlikujeta. Medtem ko bi se OR2AT4 lahko uporabljal pri zdravljenju oziroma celjenju rane, bi bil lahko receptor OR51E2 potencialni pokazatelj za rakave celice.

===Daria Latysheva: The role of intrinsically disordered proteins in signalling pathways and regulation ===

Intrinsically disordered proteins (IDPs) are proteins, which do not have a defined three – dimensional structure, yet are completely functional. Found mostly in eukaryotic cells, they play an important role in biosignalling and regulation of a cell. Undergoing coupled folding and binding, IDPs’ recognition elements are cable of taking over the structures of different targets. Since IDPs have multiple interaction motifs, they often serve as signalling centres, thus contributing to the dynamic assembly of complex molecules and varied signalling pathways. Undergoing post – translational modifications, these proteins also add complexity to the regulatory networks and can change the original output of the crosswalk. IDPs are also an important component of higher - order signalling assemblies, enabling the formation of reversible complexes. Being an attractive field of the research, IDPs were not yet studied completely and there is still much to be understood about the structure, functions and the location of IDPs in the cell. Experimental and computational techniques are being developed to identify and characterise disordered regions in proteins in order to emphasize the prevalent role of IDPs in cellular signalling and regulation.

===Polona Skrt: Mehanizem zaznavanja okusa maščobe ===

Okus je pomembna zaznavna zmožnost, saj nas usmerja pri uživanju hranilne in prebavljive hrane ter nas ščiti pred strupi in ostalimi nevarnimi snovmi. Čutne celice se nahajajo v brbončicah v ustni votlini, na jeziku in v grlu. V brbončicah se nahaja okoli 100 celic, ki jih delimo v 3 skupine. Prvi tip so celice podobne glia celicam, ki se ovijejo okoli ostalih celic in jim nudijo oporo ter preprečujejo nekontrolirano širjenje živčnih prenašalcev. Naslednji tip so t.i. receptorske celice, ki zaznavajo sladko, grenko in umami ter sproščajo nevrotransmiterje, ki signal prenesejo do živčevja. Tretji tip celic so predsinaptične celice, ki se odzivajo predvsem na kisel okus. Njihova posebnost je, da se prek sinaps direktno povezujejo z živčnim vlakni. Pri signalizaciji okusov so zelo pomembni z G-proteini povezani receptorji, ki omogočajo zaznavanje sladkega, grenkega in umami okusa ter ionski kanalčki, ki prenašajo informacijo o kislem in slanem okusu. Ne dolgo nazaj so znanstveniki, k prej omenjenim petim osnovnim okusom, dodali še šestega – okus po maščobi. Signalizacija najverjetneje poteka preko receptorja CD36, možni pa so še GPR120 in GPR40 ter DRK kanalčki. Mehanizem je še dokaj neraziskan, predpostavljajo pa sodelovanje med več receptorji.

===Peter Škrinjar: Receptorji za okus in njihova povezava z debelostjo ===

Okus je eden izmed petih osnovnih čutov, katerega naloga je prepoznavanje hranil in preprečevanje vnosa telesu nevarnih snovi. Pri tem mu pomagajo receptorji za okus. Te se razlikujejo za vseh pet osnovnih okusov – grenko, sladko in umami zaznamo s pomočjo GPCR-jev, slano in kislo pa s pomočjo ionskih kanalčkov. Raziskave še potekajo glede receptorjev za maščobnokislinski okus. Poleg receptorjev v ustih pa poznamo tudi receptorje za okus v prebavni cevi. Tam so te pomembni predvsem v enteroendokrinih celicah, kjer ob prisotnosti različnih ligandov sprožijo izločanje različnih peptidnih hormonov (GLP-1, CCK, PYY itd.). Te nato stimulirajo vagusni živec, ki prenese informacijo do možganov, ki se primerno odzovejo (npr. ob prisotnosti sladkorjev se v prebavni cevi izloča GLP-1, ki sproži izločanje inzulina iz trebušne slinavke). Receptorje za okus lahko povežemo tudi z debelostjo. Genetske razlike pri receptorjih za maščobnokislinski okus (predvsem CD36, ki je najbolj raziskan) lahko povzročijo slabše zaznavanje maščobnih kislin, kar bi nato vodilo do debelosti. To povezavo je sicer potrebno še dokazati. Podobno bi lahko predvidevali za maščobnokislinske receptorje v prebavnem traktu. Kot alternativa za zdravljenje debelosti se je pojavila hipoteza o zdravljenju preko receptorjev za okus na adipocitah brez α-gustducina, na katere imajo grenke komponente inhibicijski učinek.

===Milica Janković: Jedrni receptorji: Karakteristike in regulacija receptorjev ter identifikacija ligandov===

Jedrni receptorji so proteini prisotni v celicah, ki prenašajo signale svojih ligandov. Naddružino jedrnih receptorjev sestavlja 48 transkripcijskih faktorjev (pri ljudeh). Aktivirajo se po vezavi liganda in vključujejo receptorje za steroidne hormone, lipofilne vitamine, ščitnične hormone in retinoinsko kislino. Receptor- ligandni kompleks se veže na specifično področje na DNA, katero imenujemo hormonski responsni element (HRE). Jedrni receptorji so transkripcijski faktorji, ker delujejo direktno v jedru in spreminjajo ekspresijo genov ter na ta način vplivajo na razvoj, diferencijacijo in homeostazo in metabolizem. Obstajajo štirje tipi nuklearnih receptorjev, ki se razlikujejo po signalnih poteh.Zavzemajo tudi različne konformacije, ki so povzročene z vezavo agonista, oziroma antagonista. Morda najbolj revolucionarna ugotovitev, je bilo presenetljivo odkritje, da obstajajo številni receptorji, kateri so povezani na majhne molekulske ligande. Ker ti ligandi niso znani, receptorji so poimenovani siroti (orphans) receptorji. Vprašanje je bilo, kako bi lahko prišli do odkritja tistih ligandov? Vsi jedrni receptorji imajo podobno strukturo, na podlagi česa je bilo lahko narediti vrsto testov za identifikacijo ligandov.
Ker se pa vežejo na majhne molekule, predstavljajo zanimive terapevtske cilje. Bi bili bogat vir za razvoj sintetičnih majhnih molekul kot ligandov.

===Tina Turel: Vpliv mikroorganizmov na presnovo glukoze===

V biomedicini je v zadnjih letih prišlo do odkritja, da črevesna mikroflora sodeluje v različnih metabolnih procesih. Mikroorganizmi v črevesju komunicirajo z gostiteljem preko TLR-jev. TLR so receptorji v prirojenem imunskem sistemu, ki zaznajo določeno patogeno zaporedje in aktivirajo imunski odziv oziroma omogočajo komunikacijo med črevesno mikrofloro in gostiteljem. Prav tako pa lahko TLR-ji pa omogočijo, da v različnih metabolnih procesih lahko sodelujejo tudi mikroorganizmi. V študiji so se znanstveniki usmerili v določitev vseh členov, ki vplivajo na presnovo glukoze. Presnova glukoze je univerzalni postopek, ki je prisoten v vseh vretenčarjih in tudi v nekaterih nevretenčarjih. Študija je odkrila manjkajočo povezavo med IFNɣ in presnovo glukoze in sicer A. muciniphilo, ključni mikroorganizem, ki je odgovoren za izboljšanje tolerance na glukozo. Potrdili so, da bakterija lahko izboljša toleranco glukoze v različnih gostiteljih. Irgm1 so določili kot glavnega posrednik med IFNɣ in A. muciniphilo. Dejstvo je, da je A. muciniphila prisotna tudi v človeški mikroflori, zato so znanstveniki opravili poskuse tudi na prostovoljcih. Izkazalo se je, da je postopek in pa vpliv določenih komponent na presnovo in toleranco glukoze enak kot pri miših. Raziskava pa ponuja novo pot v zdravljenju metabolnih bolezni in sicer reguliranje ravni A. muciniphile.

===Ana Maklin: Vloga PGP in PHO13 v metabolizmu===

PGP in njegov ortolog PHO13 v kvasovkah sta bila predmet številnih raziskav. Njune funkcije so zelo raznolike, jasno pa je, da s svojo fosfatazno aktivnostjo ter drugimi lastnostmi pomembno vplivata tudi na metabolizem. Zaradi stranske aktivnosti nekaterih encimov v metabolnih procesi, nastajajo tudi produkti, ki lahko ovirajo normalno delovanje celic. Evolucijsko gledano, so organizmi torej morali ustvariti popravljalni sistem, ki prepreči nadaljnje posledice teh napak. Naloga PGP in PHO13 je, da s svojo aktivnostjo pretvorita neželjene produkte, ki nastajajo zaradi stranske aktivnosti encimov, v druge, ki niso škodljivi. V metabolizmu glukoze, zaradi stranske aktivnosti gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze in piruvat kinaze nastajata 4-fosfoeritronat in 2-fosfolaktat. Prvi je inhibitor 6-fosfoglukonat dehidrogenaze, drugi pa fosfofruktokinaze-1. Inhibicija teh dveh encimov bi brez PGP in PHO13 povzročila moteno glikolizo in pentoza fosftno pot. PHO13 oziroma njegova odsotno v celicah ima pomembo vlogo tudi pri pretvorbi rastlinske biomase v etanol. Ker uporaba etanola iz biomase kot vir obnovljive energije postaja vedno bolj razširjena, je PHO13 postal pomemben predmet za napredek v metabolnem inženirstvu. Deaktivacija PHO13 v kvasovkah z izraženimi XR/XDH/XK namreč preprečuje defosforilacijo ksiluloze 5-fosfata, kar omogoča nadaljevanje metabolnih procesov potrebnih za nastanek etanola, izboljša toleranco na običajne inhibitorje fermentacije (šibke kisline, produkti razgradnje sladkorjev) ter povzroči pospešeno transkripcijo genov, vključenih v pentozo fosfatno pot (naprimer TAL1,ki kodira protein transaldolazo, enega ključnih encimov pri neoksidativni pentoza fosfatni poti).

===Barbara Slapnik: Regulacija metabolizma glukoze v sesalskih celičnih kulturah===

Regulacija metabolizma glukoze je iz vidika celičnih kultur zelo pomembna, saj vpliva na celično rast in produktivnost celic. Boljše poznavanje regulacije metabolizma nam omogoča njegovo kontroliranje in s tem možnost za povečanje produktivnosti celic v celičnih kulturah. Regulacija metabolizma glukoze v celici poteka v več stopnjah. Pretok omejujejo intermediati, ki vstopajo še v druge metabolne poti. Zelo pomembna stopnja je regulacija z encimi. Glavni encimi, ki regulirajo glikolizo so heksokinaza, fosfofruktokinaza in piruvat kinaza. Poznamo več izooblik encimov, ki se razlikujejo po delovanju in afiniteti do substratov. Regulacija metabolizma glukoze poteka tudi na nivoju celične signalizacije. Protein kinaza B, ki ga imenujemo tudi Akt je odvisen od prisotnosti inzulina. Akt vpliva na izražanje glukoznega prenašalca 1 in delovanje heksokinaze ter fosfofruktokinaze. AMP kinaza je ključna za aktivacijo katabolnih poti in inhibicijo anabolnih poti. c-Myc je transkripcijski faktor, ki vpliva na izražanje glukoznega prenašalca 1 in delovanje fosfofruktokinaze, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze, fosfoglicerat kinaze in enolaze. p53 je transkripcijski faktor, ki zmanjša transkripcijo glukoznega prenašalca 1 in 3 ter aktivnost fosfoglicerat mutaze. Razumevanje regulacije metabolizma glukoze nam omogoča boljšo celično rast v bioreaktorjih.

===Ajda Krč: Spremembe v delovanju Krebsovega cikla in sposobnost prilagajanja parazitov na razmere v okolju===

Preučevanje parazitov, predvsem njihovega življenjskega kroga ter biokemijskih procesov, ki skrbijo za njihovo rast in razvoj, je pomembno predvsem z vidika preprečevanja bolezni, ki jih povzročajo s svojim zajedanjem v gostiteljskih organizmih. Paraziti iz debla Apicomplexa, v katerega spadata tudi Plasmodium falciparum in Toxoplasma gondii imajo značilen organel, t.i. apikoplast, s katerim prodrejo v gostiteljsko celico. Plasmodium falciparum spada v družino plazmodijev, zajedavcev eritrocitov, ki povzročajo malarijo, Toxoplazma gondii pa je glavni krivec za pojav toksoplazmoze. Življenjski krog teh parazitov se običajno deli na spolno in nespolno fazo razmnoževanja. Obe fazi spremljajo določeni procesi, ki pomagajo organizmom preživeti v najrazličnejših okoljih. Med mehanizme, ki sodelujejo pri preživetju, gotovo spada tudi ogljikov metabolizem, ki vključuje procese glikolize, glutaminolize, reakcije v Krebsovem ciklu ter elektronsko prenašalno verigo. V seminarski nalogi so opisane nekatere spremembe in prilagoditve določenih encimov Krebsovega cikla na okolje, v katerem se organizem nahaja, ter anaplerotične poti, v katere je Krebsov cikel parazitov vpleten. Prav tako so razložene nekatere alternativne poti, po katerih paraziti pridejo do potrebne energije (reakcije glutaminolize) glede na fazo v njihovem razvoju.

===Urban Hribar: Metabolizem polariziranih makrofagov===

Makrofagi lahko spremenijo svoje delovanje kot odziv na zunanje dejavnike za opravljanje različnih nalog. Temu procesu pravimo aktivacija oziroma polarizacija makrofagov. Makrofagi se lahko palarizirajo v makrofage tipa M1 (klasično aktivirani) in tipa M2 (alternativno aktivirani). Makrofagi M1 so pomembni v boju proti okužbam mikrobov in so znani kot makrofagi, ki promovirajo vnetja. Proizvajajo tudi dušikov oksid (NO) in vnetostne citokinine. Na dolgi rok lahko makrofagi M1 in njihovi produkti škodujejo tkivu lastnega oganizma. Zato makrofagi tipa M2 zavirajo vnetja in so odgovorni za popravilo tkiva. Pri funkcijah teh makrofagov imajo pomembno vlogo tudi spremenjeni metabolizmi polariziranih makrofagov. Makrofagi M1 imajo pospešeno delovanje glikolize ter zmanjšano aktivnost oksidativne fosforilacije. Z pospešeno glikolizo ter laktatno fermentacijo makrofagi proizvajajo večino svojih zalog ATP. Poleg tega ima tudi prekinjen krebsov cikel na dveh mestih. Prvo mesto je pri reakciji izocitrata v alfa-ketoglutarat, drugo mesto pa pri reakciji sukcinata v fumarat. Prekinitve v ciklu vodijo do kopičenja intermediatov, ki pa se uporabljajo za sintezo NO, prostgladinov in vnetnosnih citokinov. Hkrati je krebsov cikel makrofagov M1 povezan z ciklom sečnine, ki lahko proizvaja NO. Posebnost makrofagov M1 je tudi da v mitohondrijih proizvajajo povečane količine reaktivnih kisikovih zvrst (ROS). Te se tudi uporabljajo za boj proti bakterijam in proizvodnjo vnetnostnih citokinov.

===Urška Zagorc: Salmonela in citratni cikel===

Zastrupitev z bakterijo salmonelo spada med najpogostejše zastrupitve s hrano. Bakterija lahko živi v različnih okoljih, saj zna zelo dobro prilagoditi svoj metabolizem in se hkrati tudi izmakniti naravnemu imunskemu sistemu. Za to poskrbijo številni encimi citratnega cikla v salmoneli. Encimi akonitaza, izocitrat dehidrogenaza in izocitrat liaza inhibirajo delovanje inflamasoma NLRP3. Inflamasom je receptor imunskega sistema in aktivira kaspaze, ki vodijo v celično smrt. Z inhibiranim delovanjem teh inflamasomov posledično ne pride do celične smrti škodljivih celic. Tudi citrat in citratni cikel imata pri ohranjanju bakterije salmonele svojo vlogo. Citrat, na primer, je povezan v kompleks z železom. Ob izpostavljenosti dušikovemu oksidu, ki ima velik vpliv na celoten ogljikov metabolizem, se citrat porablja. Zmanjša se količina železa v celici, ki je bila prej v ravnotežju, hkrati pa se zmanjša tudi rast salmonele. Citratni cikel pa ni edini način, ki ga uporablja bakterija salmonela za svoje preživetje. Razvila je namreč mnogo poti, po katerih se lahko izogne oviram gostitelja. Ta se poleg inflamasomov bori s salmoneli strupenimi snovmi, kot je dušikov oksid, a tudi za to je bakterija že našla rešitev.

===Lija Srnovršnik: Hepatična oksidacija maščobnih kislin med stradanjem===

Jetra so ključna pri uravnavanju ravnotežja energije v celotnem telesu.
Da bi razumeli vlogo hepatične β-oksidacije maščobnih kislin med obdobjem stradanja, so vzredili miši z izločenim genom za delovanje karnitin acil-transferaze 2 v jetrih (Cpt2L-⁄- miši). Ta encim katalizira obvezen korak v mitohondrijski dolgoverižni β-oksidaciji maščobnih kislin. Karnitin acil-transferaza 2 namreč sodeluje pri prenosu maščobnih kislin v notranjost mitohondrija in brez nje β-oksidacija ne more potekati. Miši so stradali 24 ur, kar je povzročilo nalaganje maščobe na jetra in povišano raven lipidov v krvi, vendar pa odsotnost ketonskih telesc, medtem ko je raven glukoze ostala normalna. Če med stradanjem, hepatična oksidacija ne poteka, se inducirajo PPARα tarčni geni v jetrih. Sistemska homeostaza energije je bila večinoma vzdrževana v stradajočih Cpt2L-⁄- miših z adaptacijami v hepatični in sistemski ekspresiji genov za oksidacijo, na kar so vplivali PPARα tarčni geni, ki vključujejo prokatabolične hepatokine Fgf21, Gdf15 and Igfbp1.
Da bi primerjali rezultate, so Cpt2L-⁄- miši hranili s ketonsko dieto, prišlo je do hude lipolize ter posledično hepatomegalije (povečanja jeter), poškodb samega organa in posledično smrti. Opazili so popolno odsotnost zalog triacilglicerolov v adipocitih. Ti podatki kažejo, da hepatična oksidacija maščobnih kislin ni nujno potrebna za preživetje med pomanjkanjem hrane, vendar je ključna za omejitev lipolize v adipocitih ter regulacijo nadomestnega katabolizma, ko je glukoza omejena.

===Patrik Levačić: Ceramidi in njihova povezava z debelostjo===
V modernem svetu je debelost vse večji problem, če ne celo eden glavnih krivcev za bolezni, ki so povezane s prekomerno cirkulacijo lipidov v krvi, kot je npr. ateroskleroza ipd. Tekom debelosti je prisotnega več sladkorja v obliki glukoze, lipidov ter vnetji. Ker je presežek lipidov, natančneje maščobnih kislin v obtoku, so to primerni pogoji za tvorbo ceramidov, ki so sicer še sestavljeni iz sfingozina, ki se preko aminske skupine poveže z maščobno kislino. Ceramidi se eni glavnih krivcev za znižano stopnjo oksidacije maščobnih kislin, to pripomore k nalaganju maščobnega tkiva na organe ter v adipocitno tkivo, a žal lahko tudi adipocitno tkivo raste do neke mere, ko doseže maksimalno velikost posatne to tkivo nefunkcionalno in ne more več shranjevati lipidov. Rezultat je prekomerna cirkulacija lipidov v krvi. V seminarju je največ govora o dveh specifičnih ceramidih, ceramid C16:0 ter ceramid C18:0, ki sta v raziskavah imela vlogo negativnega regulatorja metabolizma lipidov ter slodkorjev. Kakršnekoli motnje metabolizma pa se odražajo v obliki vnetji, slabši funkcionalnosti celic, samih organelov v notranjosti celice ter kroničnih obolenj kot so npr. sladkorna bolezen. Za boj proti debelosti je večina študij ugotovila, da s povišanim procentom oksidiranih maščobnih kislin dosežemo zmanjšanje deleža prostih maščobnih kislin ter blokiramo tvorbo novih ceramidov.

===Jerneja Nimac: Ketonska telesca kot signalni metaboliti===

Nove raziskave na področju ketonskih telesc kažejo, da ta niso le pasivni prenašalci energije, ampak tudi pomembni signalni metaboliti. Najpomembnejši med njimi je β-hidroksibutirat (BHB). Signalne vloge, ki mu jih pripisujejo so inhibicija histonske deacetilaze razreda I (HDAC), aktivacija z G-proteinom sklopljenega receptorja HCAR2 in inhibicija prav tako z G-proteinom sklopljenega receptorja FFAR3. Ko BHB inhibira HDAC se poveča izražanje genov, ki zmanjšajo oksidativni stres, poleg tega pa naj bi ta inhibicija izboljšala občutljivost na inzulin. Antilipolitični učinek receptorja HCAR2 inhibira hormonsko odzivno triglicerid lipazo, kar ustvari negativno povratno zanko in zaustavitev ketogeneze. Vpliv BHB na receptor FFAR3 pa še ni popolnoma raziskan. Predpostavljajo, da BHB vpliva na FFAR3 v odvisnosti od pogojev, torej G-proteina in koncentracije BHB, je pa ena od raziskav pokazala, da molekula BHB z vezavo na FFAR3 inhibira od napetosti odvisne kalcijeve kanalčke. Molekula BHB se veže tudi na inflamasom NLRP3 in z njegovo inhibicijo prepreči izstop K+. Poleg ketonskega telesca BHB pa ima nekaj signalnih funkcij tudi acetoacetat. Slednji skupaj z molekulo BHB regulira vezikularni transporter glutamata (VGLUT2), in sicer tako da inhibira od Cl- odvisni vnos glutamata. Signalna funkcija ketonskih telesc v celici pa sproži odzive, ki naj bi pripomogli k zaviranju epilepsije, demence, raka in vplivali na staranje.

===Nika Mikulič Vernik: Hiperamoniemija in metode zdravljenja===

Amonijak se v telesu porablja v anabolizmu aminokislin, sintezi proteinov in zagotavljanju pH vrednosti. Kadar ga je v krvni plazmi preveč, ga mora telo detoksicirati in izločiti, za kar skrbi cikel uree v jetrnih celicah. Preostanek amonijaka odstrani glutamin sintetaza, ki iz glutamata tvori glutamin. Če je amonijaka v krvi preveč, to stanje imenujemo hiperamoniemija. Za razvoj te bolezni poznamo več vzrokov, glede na njih pa ločimo primarno (okvare encimov ali transporterjev, ki delujejo v ciklu uree) in sekundarno hiperamoniemijo (inhibicija cikla uree).
Ker ima amonijev ion NH4+ podoben atomski radij kot K+, lahko membrane prehaja na enak način. Preide lahko tudi krvno možgansko bariero, kjer povzroča nevrološke težave, kot so zatekanje astrocitov, povečana permeabilnost krvno možganske bariere, cerebralni edem (zatekanje možganov) in hepatična encefalopatija, kar lahko vodi v komo in celo smrt.
Zdravila za zdravljenje hiperamoniemije imajo dva možna načina delovanja; zmanjšanje nastanka in absorpcije amonijaka, ali izboljšanje sistemov za detoksikacijo in izločanje. Zraven tega se uporabljajo tudi razne dialize, genske in celične terapije ter kirurški posegi. Obstaja cela vrsta metod zdravljenja hiperamoniemije in hepatične encefalopatije. V tej seminarski nalogi so zaradi prostorske stiske opisani zgolj trije načini, ki imajo različne mehanizme delovanja.

BIO2 Seminar 2017

2017-11-27T14:40:15Z

Nika Mikulič: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Ines Medved || 12 || Receptorji za vonj v epidermisu || Špela Supej || Lea Knez || 20/10/16 || 23/10/16 || 25/10/16
|-
| Luka Gregorič || 12 || Pozitivne vloge negativnih regulatorjev || Uroš Prešern || Katja Doberšek || 20/10/16 || 23/10/16 || 25/10/16
|-
| Daria Latysheva || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2017#Daria_Latysheva:_The_role_of_intrinsically_disordered_proteins_in_signalling_pathways_and_regulation The role of intrinsically disordered proteins in signallng pathways and regulation] || Luka Fratina || Martin Špendl || 20/10/16 || 23/10/16 || 25/10/16
|-
| Polona Skrt || 12 || Mehanizem zaznavanja okusa maščobe || Andreja Habič || Ajda Galič || 03/11/16 || 06/11/16 || 08/11/16
|-
| Peter Škrinjar || 12 || Receptorji za okus in njihova povezava z debelostjo || Andrej Race || Nika Zaveršek || 03/11/16 || 06/11/16 || 08/11/16
|-
| Milica Janković || 12 || Nuklearni receptorji: Karakteristike in regulacija receptorjev ter identifikacija ligandov || Anže Jenko || Nika Goršek || 03/11/16 || 06/11/16 || 08/11/16
|-
| Tina Turel || 14-15 || Vpliv mikroorganizmov na presnovo glukoze || Ines Medved || Špela Supej || 10/11/16 || 13/11/16 || 15/11/16
|-
| Barbara Slapnik || 14-15 || Regulacija metabolizma glukoze v celičnih kulturah|| Luka Gregorič || Uroš Prešern || 10/11/16 || 13/11/16 || 15/11/16
|-
| Ana Maklin || 14-15 || Vloga PGP in PHO13 v metabolizmu || Daria Latysheva || Luka Fratina || 10/11/16 || 13/11/16 || 15/11/16
|-
| Ajda Krč || 16 || Spremembe v delovanju Krebsovega cikla in sposobnost prilagajanja parazitov na razmere v okolju || Polona Skrt || Andreja Habič || 17/11/16 || 20/11/16 || 22/11/16
|-
| Urban Hribar || 16 || Metabolizem polariziranih makrofagov || Peter Škrinjar || Andrej Race || 17/11/16 || 20/11/16 || 22/11/16
|-
| Urška Zagorc || 16 || Salmonela in citratni cikel || Milica Janković || Anže Jenko || 17/11/16 || 20/11/16 || 22/11/16
|-
| Patrik Levačić || 17 || Ceramidi in njihova povezava z debelostjo || Tina Turel || Ines Medved || 24/11/16 || 27/11/16 || 29/11/16
|-
| Jerneja Nimac || 17 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2017#Jerneja_Nimac:_Ketonska_telesca_kot_signalni_metaboliti Ketonska telesca kot signalni metaboliti] || Barbara Slapnik || Luka Gregorič || 24/11/16 || 27/11/16 || 29/11/16
|-
| Lija Srnovršnik || 17 || Hepatična oksidacija maščobnih kislin med stradanjem || Ana Maklin || Daria Latysheva || 24/11/16 || 27/11/16 || 29/11/16
|-
| Nika Mikulič || 18 || Hiperamoniemija in metode zdravljenja || Ajda Krč || Polona Skrt || 01/12/16 || 04/12/16 || 06/12/16
|-
| Tanja Zupan || 18 || Presnovne bolezni aminokislin || Urban Hribar || Peter Škrinjar || 01/12/16 || 04/12/16 || 06/12/16
|-
| Anja Tavčar || 18 || Regulacija imunskega odziva z metabolizmom l-argenina || Urška Zagorc || Milica Janković || 01/12/16 || 04/12/16 || 06/12/16
|-
| Maja Vrabec || 19 || Poškodbe mitohondrijske DNA in njihov vpliv na izražanje mitohondrijskih genov || Patrik Levačić || Tina Turel || 08/12/16 || 11/12/16 || 13/12/16
|-
| Špela Deučman || 19 || Vloga reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) pri celičnem signaliziranju || Jerneja Nimac || Barbara Slapnik || 08/12/16 || 11/12/16 || 13/12/16
|-
| Anja Černe || 19 || Mitohondrijski stres obnavlja odgovor na toplotni šok in preprečuje padec proteostaze med staranjem || Lija Srnovršnik || Ana Maklin || 08/12/16 || 11/12/16 || 13/12/16
|-
| Lea Knez || 20 || Ogljikovi hidrati kot signalne molekule v rastlinah || Nika Mikulič || Ajda Krč || 15/12/16 || 18/12/16 || 20/12/16
|-
| Katja Doberšek || 20 || || Tanja Zupan || Urban Hribar || 15/12/16 || 18/12/16 || 20/12/16
|-
| Martin Špendl || 20 || || Anja Tavčar || Urška Zagorc || 15/12/16 || 18/12/16 || 20/12/16
|-
| Ajda Galič || 21 || || Maja Vrabec || Patrik Levačić || 29/12/16 || 01/01/17 || 03/01/17
|-
| Nika Zaveršek || 21 || || Špela Deučman || Jerneja Nimac || 29/12/16 || 01/01/17 || 03/01/17
|-
| Nika Goršek || 21 || || Anja Černe || Lija Srnovršnik || 29/12/16 || 01/01/17 || 03/01/17
|-
| Špela Supej || 22 || || Lea Knez || Nika Mikulič || 05/01/17 || 08/01/17 || 10/01/17
|-
| Uroš Prešern || 22 || || Katja Doberšek || Tanja Zupan || 05/01/17 || 08/01/17 || 10/01/17
|-
| Luka Fratina || 22 || || Martin Špendl || Anja Tavčar || 05/01/17 || 08/01/17 || 10/01/17
|-
| Andreja Habič || 23 || || Ajda Galič || Maja Vrabec || 12/01/17 || 15/01/17 || 17/01/17
|-
| Andrej Race || 23 || || Nika Zaveršek || Špela Deučman || 12/01/17 || 15/01/17 || 17/01/17
|-
| Anže Jenko || 23 || || Nika Goršek || Anja Černe || 12/01/17 || 15/01/17 || 17/01/17
|-
| Katja Dolenc || 23 || || ? || ? || 20/01/17 || 22/01/17 || 24/01/17
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2017|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Seminar 2017

2017-11-19T10:36:22Z

Nika Mikulič: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Ines Medved || 12 || Receptorji za vonj v epidermisu || Špela Supej || Lea Knez || 20/10/16 || 23/10/16 || 25/10/16
|-
| Luka Gregorič || 12 || Pozitivne vloge negativnih regulatorjev || Uroš Prešern || Katja Doberšek || 20/10/16 || 23/10/16 || 25/10/16
|-
| Daria Latysheva || 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2017#Daria_Latysheva:_The_role_of_intrinsically_disordered_proteins_in_signalling_pathways_and_regulation The role of intrinsically disordered proteins in signallng pathways and regulation] || Luka Fratina || Martin Špendl || 20/10/16 || 23/10/16 || 25/10/16
|-
| Polona Skrt || 12 || Mehanizem zaznavanja okusa maščobe || Andreja Habič || Ajda Galič || 03/11/16 || 06/11/16 || 08/11/16
|-
| Peter Škrinjar || 12 || Receptorji za okus in njihova povezava z debelostjo || Andrej Race || Nika Zaveršek || 03/11/16 || 06/11/16 || 08/11/16
|-
| Milica Janković || 12 || Nuklearni receptorji: Karakteristike in regulacija receptorjev ter identifikacija ligandov || Anže Jenko || Nika Goršek || 03/11/16 || 06/11/16 || 08/11/16
|-
| Tina Turel || 14-15 || Vpliv mikroorganizmov na presnovo glukoze || Ines Medved || Špela Supej || 10/11/16 || 13/11/16 || 15/11/16
|-
| Barbara Slapnik || 14-15 || Regulacija metabolizma glukoze v celičnih kulturah|| Luka Gregorič || Uroš Prešern || 10/11/16 || 13/11/16 || 15/11/16
|-
| Ana Maklin || 14-15 || Vloga PGP in PHO13 v metabolizmu || Daria Latysheva || Luka Fratina || 10/11/16 || 13/11/16 || 15/11/16
|-
| Ajda Krč || 16 || Spremembe v delovanju Krebsovega cikla in sposobnost prilagajanja parazitov na razmere v okolju || Polona Skrt || Andreja Habič || 17/11/16 || 20/11/16 || 22/11/16
|-
| Urban Hribar || 16 || Metabolizem polariziranih makrofagov || Peter Škrinjar || Andrej Race || 17/11/16 || 20/11/16 || 22/11/16
|-
| Urška Zagorc || 16 || Salmonela in citratni cikel || Milica Janković || Anže Jenko || 17/11/16 || 20/11/16 || 22/11/16
|-
| Patrik Levačić || 17 || Ceramid ter oksidacija maščobnih kislin v mitohondriju med debelostjo || Tina Turel || Ines Medved || 24/11/16 || 27/11/16 || 29/11/16
|-
| Jerneja Nimac || 17 || Ketonska telesca kot signalni metaboliti || Barbara Slapnik || Luka Gregorič || 24/11/16 || 27/11/16 || 29/11/16
|-
| Lija Srnovršnik || 17 || || Ana Maklin || Daria Latysheva || 24/11/16 || 27/11/16 || 29/11/16
|-
| Nika Mikulič || 18 || Izboljšave na področju zdravljenja hiperamonemije || Ajda Krč || Polona Skrt || 01/12/16 || 04/12/16 || 06/12/16
|-
| Tanja Zupan || 18 || Presnovne bolezni aminokislin || Urban Hribar || Peter Škrinjar || 01/12/16 || 04/12/16 || 06/12/16
|-
| Anja Tavčar || 18 || Odstopajoče koncentracije določenih metabolitov v krvi - indikatorji bipolarne motnje || Urška Zagorc || Milica Janković || 01/12/16 || 04/12/16 || 06/12/16
|-
| Maja Vrabec || 19 || Poškodbe mitohondrijske DNA in njihov vpliv na izražanje mitohondrijskih genov || Patrik Levačić || Tina Turel || 08/12/16 || 11/12/16 || 13/12/16
|-
| Špela Deučman || 19 || || Jerneja Nimac || Barbara Slapnik || 08/12/16 || 11/12/16 || 13/12/16
|-
| Anja Černe || 19 || || Lija Srnovršnik || Ana Maklin || 08/12/16 || 11/12/16 || 13/12/16
|-
| Lea Knez || 20 || Ogljikovi hidrati kot signalne molekule v rastlinah || Nika Mikulič || Ajda Krč || 15/12/16 || 18/12/16 || 20/12/16
|-
| Katja Doberšek || 20 || || Tanja Zupan || Urban Hribar || 15/12/16 || 18/12/16 || 20/12/16
|-
| Martin Špendl || 20 || || Anja Tavčar || Urška Zagorc || 15/12/16 || 18/12/16 || 20/12/16
|-
| Ajda Galič || 21 || || Maja Vrabec || Patrik Levačić || 29/12/16 || 01/01/17 || 03/01/17
|-
| Nika Zaveršek || 21 || || Špela Deučman || Jerneja Nimac || 29/12/16 || 01/01/17 || 03/01/17
|-
| Nika Goršek || 21 || || Anja Černe || Lija Srnovršnik || 29/12/16 || 01/01/17 || 03/01/17
|-
| Špela Supej || 22 || || Lea Knez || Nika Mikulič || 05/01/17 || 08/01/17 || 10/01/17
|-
| Uroš Prešern || 22 || || Katja Doberšek || Tanja Zupan || 05/01/17 || 08/01/17 || 10/01/17
|-
| Luka Fratina || 22 || || Martin Špendl || Anja Tavčar || 05/01/17 || 08/01/17 || 10/01/17
|-
| Andreja Habič || 23 || || Ajda Galič || Maja Vrabec || 12/01/17 || 15/01/17 || 17/01/17
|-
| Andrej Race || 23 || || Nika Zaveršek || Špela Deučman || 12/01/17 || 15/01/17 || 17/01/17
|-
| Anže Jenko || 23 || || Nika Goršek || Anja Černe || 12/01/17 || 15/01/17 || 17/01/17
|-
| Katja Dolenc || 23 || || ? || ? || 20/01/17 || 22/01/17 || 24/01/17
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2017|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2017 Povzetki seminarjev

2017-04-16T16:30:37Z

Nika Mikulič: /* Ana Scott: Naslov seminarja */

[[TBK2017-seminar|Nazaj na osnovno stran]]
===Ana Scott: Naslov seminarja===
Tekst ....

'''Patrik Levaćić: Prehrambni aditivi v sladkarijah ter žvečilnih gumijih lahko spremenijo funkcionanlnost in strukturo prebavnih celic'''

Vnos nano delcev titanovega dioksida (TiO2) preko prehrambenih izdelkov kot so sladkarije ter žvečilni gumiji je praktično nemogoče. Prebavni trakt služi kot pomembna meja med telesom in zunanjim okoljem. Cilj raziskave je bilo opazovanje posledic vnosa 30 nano meterskih delcev titanovega dioksida preko modela celične strukture tankega črevesja ter določitev kako akutna ter kronična izpostavljenost takim delcem lahko vpliva na funkcionalnost in strukturo celice. Postopek prepoznavanja TiO2 delcev je zelo kompleksen, navadno se uporablja Ramanova spektroskopija, ki izkorišča lastnosti molekule kot so vibracijska ter rotacijska stanja, s tem pa dobimo tako imenovani ''finger-print'' molekule, saj ima vsaka molekula svoje lastnosti in se po njih loči od drugih molekul. Rezultati raziskave so potrdili, da čeprav akutna izpostavljenost ni pustila resnejših posledic na celični strukturi, ima kronična izpostavljenost kar nekaj posledic na celičnem nivoju. Spremeni se funkcionalnost celice, nivo delovanja membranskih encimov vpade, spremeni se prav tako tudi struktura, saj se zmanjša sposobnost vsrkavanja nutrientov preko mikrovilov.

'''Tina Turel: Povezanost retrovirusov z razvojem možganov'''

Možgani človeka so bistveno bolj razviti od možganov drugih sesalcev in zato veliko težji za raziskovanje in razumevanje. Številne raziskave so dokazale, da bi transportni elementi (TE-ji), ki so še pred nekaj leti veljali za neuporaben del DNA, tako imenovan »junk DNK«, lahko bili odgovorni za današnjo stopnjo razvitosti človeških možganov.
Retrovirusi so posebna skupina virusov. Nekateri veljajo za škodljive (HIV), drugi pa so povsem neškodljivi. V našem DNA je več kot 1000 različnih retrovirusov. V raziskavi, ki jo je vodil Johan Jakobsson in se je odvijala v Lundu, so dokazovali pomembno vlogo ERV-ja, endogenega retrovirusa v razvoju človeških možganov. Želeli so pokazati, da nekaj tisoč ERV-jev, mnogi so primarno specifični, delujejo kot priklopna podlaga za epigenetske represorsko beljakovino TRIM28, ki vzpostavi lokalni hetero kromatin okoli ERV-jev. Retrovirusi lahko pri vsakem človeku reagirajo drugače, saj so tak tip genetskega materiala, da se lahko nahajajo v katerem koli delu v genomu. Različna izražanja ERV-ja pa bi bila lahko tudi razlog za možganske okvare, ki povzročijo bolezni, kot so ALS, shizofrenija in bipolarna motnja .

'''Nina Mezgec Mrzlikar: Regulacija gena DISC-1 kot potencialnega zdravila za shizofrenijo'''

Shizofrenija je duševna motnja, ki se razvije v zgodnjem odraslem obdobju. DISC-1 (Disrupted-In-Schizophrenia-1) je protein, kodiran z genom DISC-1 in je močno izražen v možganskem hipokampusu. Sodeluje pri razvoju aksonov in povezovanju celic. Caveolin-1 je ogrodni protein bistven pri regulaciji receptorjev na membranah in spodbuja razvoj novih povezav med živčnimi celicami. V tej raziskavi so znanstveniki proučevali vpliv proteina Cav-1 na izražanje gena DISC-1 v živčnih celicah. Ugotovljeno je bilo, da prekomerno izražen gen Cav-1 povzroči večje izražanje gena DISC-1 in drugih sinaptičnih proteinov, ki so potrebni za prenos živčnega signala. V miših, katerim so iz hipokampusa odstranili Cav-1 je posledično prišlo do manjšega izražanja DISC-1 in hkrati drugih sinaptičnih proteinov. Izguba Cav-1 torej zmanjšuje aktivnost sinaps, kar pa je vzrok za številne nevrodegenerativne bolezni, kot je tudi shizofrenija. Ugotovitve kažejo na pomembno vlogo proteina Caveolin-1 v celicah, saj vzdržuje pravilno delovanje receptorjev in s tem prenos živčnega signala.

'''Sonja Gabrijelčič: Ribosomske mutacije spodbujajo razvoj odpornosti proti antibiotikom v okolju z več zdravilnimi učinkovinami'''

Odpornost bakterij na antibiotike je v porastu po vsem svetu. Pojavlja se tako v državah v razvoju, kjer je predvsem posledica nekvalitetnih antibiotikov, kot v najrazvitejših državah sveta, kjer se pojavlja več in več patogenov, ki lahko preživijo v okolju z več zdravilnimi učinkovinami oziroma antibiotiki. Bakterije lahko pridobijo odpornost ali z izmenjavo mobilnih genetskih elementov ali z mutacijo genetskega materiala, ki je že v celici. V raziskavi, ki jo opisuje članek, so raziskovalci želeli opazovati slednje, zato so izmed bakterij, ki so lahko sočasno odporne na več antibiotikov, izbrali Mycobacterium smegmatis, sorodnico bakterije, ki povzroča tuberkulozo, in eno od predstavnic skupine bakterij, pri kateri do izmenjevanja plazmidov praktično ne pride. Klasificirali so tipe mutacij, do katerih je prišlo, in se osredotočili predvsem na mutacije, ki so se zgodile na mestih genoma, kjer se kodirajo proteini, ki so sestavni deli ribosomov. Ugotovili so, da so taki mutanti odporni na antibiotike z različnimi mehanizmi delovanja, ki jim niso bili še nikoli izpostavljeni, na antibiotike širokega spektra in poleg tega tudi na nekatere druge mehanske strese na membrane.

'''Daria Latysheva: Mehanski raztezek sproži hitro delitev epitelijskih celic'''

Mehansko aktivni kanalčki so membranski proteini, ki so neposredno odvisni od sile in pretvarjajo mehanske držljaje v električne oz. biokemijske signale. Piezo1 je mehansko aktiven ionski kanalček, ki spodbuja celično smrt v predelih z visoko gostoto celic. V raziskavi so ugotovili, da kotrolira tudi mitotsko delitev. Raziskali so mehanizem delovanja Piezo1 v procesu celične delitve. Pri nizki gostoti celic oz. kjer so celice raztegnjene se Piezo1 lokalizira na celični membrani ter se odpre; posledično sproži influks kalcija v celico. ERK1 se aktivira zaradi povečane koncentracije Ca2+ ionov, kar vpliva na aktivnost ciklina B v G2 fazi mitotske delitve in povzroči proliferacijo. Način, na kateri Piezo1 aktivira dva nasprotna procesa je odvisen od lokacije in načina aktivacije kanalčka. V predelih z nizko gostoto celic se Piezo1 lokalizira na celični membrani ter hitro aktivira celično delitev. Če so celice razporejene tesno druga ob drugi, se Piezo1 oblikuje v velike citiplazemske agregate in spodbuja celično smrt. Zaradi sposobnosti zaznave mehanskega raztezka ter prevelike in premajhne gostote celic Piezo 1 deluje kot homeostatski senzor in kontrolira število epitelijskih celic.

'''Nika Goršek: Nove študije razkrivajo delovanje molekulske črpalke, ki izloča zdravila proti raku'''

MRP1 ali »Multidrug resistance protein« je protein, ki spada v družino ABC-transporterjev. Pomemben je pri reguliranju redoks homeostaze, vnetij in sekrecije hormonov. Znano je tudi, da ima pomembno vlogo pri odpornosti na zdravila in njihovem črpanju iz celic. V raziskavi na univerzi Rockefeller so z uporabo elektronske kriomikroskopije določili njegovo zgradbo. Sestavljajo ga štirje glavni deli: dva transmembranska dela, ki tvorita telo transporterja, dva dela, ki vežeta ATP, motiv v obliki lase in N-terminalni transmembranski del. Čeprav ima MRP1 dva dela, ki bi lahko vezala ATP, pa tega veže le en, saj pri drugem delu pride do drugačnega zaporedja aminokislin. V raziskavah so dokazali, da mutacije določenih delov proteina vodijo v bolezenska stanja in da bi sprememba le ene aminokisline v zaporedju vplivala na aktivnost proteina. MRP1 ima le eno dvojno vezavno mesto, ki je pozitivno nabito. Pestrost substratov je zaradi takega vezavnega mesta veliko večja, kot pri nekaterih drugih znanih proteinih. Prenaša lahko organske, amfipatične in aninonske molekule, na primer zdravila proti raku, opijate, antidepresive in tudi nekatere za življenje pomembne snovi (hormoni in protivnetne molekule). Ob vezavi substrata se oblika proteina MRP1 spremeni, aktivnost pa se poveča. Po končanem transportu pa protein preide nazaj v prvotno, neaktivno obliko.

'''Dragana Savković: Stopnja preživetja evkariontskih celic po elektroforezni nanoinjekciji'''

Znotrajcelična dostava makromolekul je pomemben korak za terapevtske in raziskovalne namene. Za uvajanje tujih molekul v citoplazmo živih celic uporabljale so se metode, katere so se v večini primerov uporabljale za veliko število celic v kulturi in je splošno znano, da veliko število teh celic (do 50%) ne preživi ta proces. Da bi rešili ta problem, razvili so alternativno metodo znotrajcelične dobave, oziroma znotrajcelično elektroforezno nanoinjekcijo. V raziskavi so primerjali stopnjo preživetja celic injiciranih z pipeto s premerom 100 nm in pipeto s premerom 500 nm. Ugotovili so, da je stopnja preživetja z uporabo 100 nm pipeto veliko večja kot s 500 nm pipeto in tudi da ostale preživele celice kažejo bolj naraven cikel celic.

'''Urška Zagorc: Proteini, zgodnje opozorilo sladkorne bolezni tipa 1'''

Sladkorna bolezen tipa 1, ki je značilna predvsem za otroke in mladostnike, je posledica motnje v imunskem sistemu. Organizem uniči lastne celice v trebušni slinavki, ki proizvajajo inzulin. Ta omogoča glukozi iz hrane vstop v celico, s čimer celica dobi hrano in energijo. V raziskavi nemškega raziskovalnega centra za zdravje in okolje Helmholtz Zentrum München so sodelovali otroci, katerih ožji družinski član ima diabetes tipa 1 in otroci brez dednih dispozicij. Analizirali so krvne vzorce otrok z avto-protitelesi ter jih primerjala z vzorci otrok, ki ne kažejo znakov bolezni niti nimajo protiteles.Identificirali so 41 peptidov iz 26 proteinov, ki se razlikujejo v krvnih vzorcih tistih otrok s protitelesi in tistih brez. Glede na koncentracijo peptidov v treh proteinih (hepatocitni rastni faktor HGF, istem komplementa H in ceruloplazmin) in glede na starost otroka, so dosegli tudi boljšo oceno hitrosti razvoja bolezni. Večja koncentracija sistema komplementa H in hepatocitnega rastnega faktorja ter nižja koncentracija ceruloplazmina pri tem nižji starosti bolnika, pomenijo hitrejši napredek bolezni. Identificirani proteini nam pokažejo bolj natančno oceno stopnje pred pojavom simptomov. Zaradi njih je možno tudi ugotoviti ali ima bolnik s protitelesi, večjo ali manjšo možnost za razvoj sladkorne bolezni tipa 1 in kako hitro se bo bolezen razvila.

'''Anja Černe: Uporaba askorbata pri zdravljenju raka'''

Če askorbat vnesemo v organizem v manjših koncentracijah ima antioksidativne učinke, medtem ko se pri vnosu v večjih koncentracijah obnaša kot prooksidant. Farmakološko koncentriran askorbat povzroča tok izvenceličnega H2O2 v celico in vse celice, tako zdrave kot rakave, encimsko razgrajujejo H2O2, ki je zanje toksičen. Glavni encimi, ki razgrajujejo H2O2 pri velikih količinah so katalaze. Ker pa je katalaz v rakavih celicah malo, so rakave celice bolj dovzetne škodljive učinke, zato je askorbat zanje selektivno toksičen. Katalazna aktivnost v rakavih celicah lahko napove, kako se bo tumor odzval na terapijo z askorbatom. Pri nekaterih vrstah tkiv je rast tumorjev bolj upočasnjena, pri drugih manj (odvisnost od količine katalaz, ki jih tkivo vsebuje). Število aktivnih katalaznih monomerov na celico in ED50 (koločina snovi, ki učinkuje pri 50% osebkih) sta sorazmerna s konstanto celične razgradnje H2O2. Radikali, ki nastanejo pri reakciji med ionom kovine in H2O2, poškodujejo DNA, v kolikšni meri se to zgodi pa je odvisno od količine askorbata.

'''Jerneja Nimac: S CRISPR/Cas9 nad X-vezavno kronično granulomatozno bolezen'''

Kronična granulomatozna bolezen je dedna bolezen imunskega sistema, ki nastane zaradi mutacije v genu CYBB, ki kodira gp91phox. Slednji je katalitični center NADPH oksidaze 2 (NOX2), ki ima pomembno vlogo pri obrambi organizma pred okužbami. Mutacije v genu CYBB na kromosomu Xp21.1 pa so odgovorne za X-vezavno obliko kronične granulomatozne bolezni. Za popravljanje takšne monogenske mutacije so v raziskavi uporabili sistem CRISPR/Cas9. Ta sistem so za obrambo pred virusnimi okužbami razvile bakterije in arheje, gre pa za poseben od RNA odvisen sistem pridobljene imunosti, ki specifično prepozna in reže tujo tarčno DNA. V raziskavi so skušali s sistemom CRISPR/Cas9 popraviti mutacijo C676T na eksonu 7 gena CYBB. Z DHR testi so ugotovili, da s CRISPR/Cas9 popravljene mieloične celice obnovijo aktivnost NOX2 in ponovno izražajo protein gp91phox. S spreminjanjem količine ssODN pa so dokazali, da je stopnja popravljenih genov večja, če je količina ssODN večja, delež indelov pa se zmanjša. Prav tako so potrdili uspešno presaditev s CRISPR/Cas9 popravljenih krvotvornih matičnih in predniških celic in njihovo diferenciacijo v nepoškodovane mieloične in limfocitne celice v NSG miših v obdobju petih mesecev.

'''Barbara Slapnik: Holesterol v celični membrani'''

Holesterol je razporejen po celični membrani. Pomemben je za vzdrževanje membranske fluidnosti, membrano naredi bolj togo in manj prepustno. Njegova porazdelitev med zunanjim in notranjim fosfolipidnim slojem pa ni enakomerna. V raziskavi so razvili dopolnilne senzorje, ki omogočajo vpogled holesterola v obeh slojih sočasno in določili njegovo točno koncentracijo. Ugotovili so, da je koncentracija holesterola v zunanjem sloju celične membrane znatno višja kot koncentracija v notranjem sloju. Visoka koncentracija holesterola v zunanjem sloju celične membrane zmanjša njeno prepustnost, medtem ko nizka koncentracija holesterola v notranjem sloju omogoča celično sporočanje. Rezultati prikazujejo pomen transbilarne asimetrije holesterola v celični membrani in njegovo prerazporeditev za celično homeostazo, rast in razmnoževanje. Podajajo tudi povezavo med holesterolom v notranjem sloju celične membrane in rakom. Določili so točno koncentracijo holesterola, kar jim omogoča boljšo diagnostiko in zdravljenje raka, vendar so za to potrebne še nadaljnje raziskave. Rezultati prav tako predstavljajo osnovo za nadaljnje študije transbilarne dinamike in funkcij holesterola in drugih lipidov v celici.

'''Nadja Škafar: Dostava protitumorskih zdravil s pomočjo makrofagov in biorazgradljivih nanodelcev'''

Nanotehnologija igra pomembno vlogo v moderni medicini, še posebej na področju zdravljenja bolezni s tarčno dostavo zdravil. Glavna prednost nanodostavnih sistemov (NS) pred danes uveljavljenimi metodami zdravljenja raka je selektivna dostava protitumorskih učinkovin tumorskim celicam, kar zmanjša možnost pojava neželenih stranskih učinkov, s tem pa se bolniku omogoči boljša kakovost življenja med in po zdravljenju. Dosedanje raziskave na področju NS so temeljile na injiciranju nanodelcev v krvni obtok. Ker pa ob vnosu nanodelcev v telo prihaja do medsebojnega delovanja NS s celicami imunskega sistema, jih te, še preden lahko nanodelci dostavijo zdravila do željenega mesta, odstranijo s fagocitozo. Raziskovalca Jian Yang in Cheng Dong sta zato s svojo ekipo skušala razviti novo tehniko NS, ki problematiko reakcij med NS in makrofagi v bioloških sistemih odpravi tako, da makrofage uporablja kot nosilce nanodelcev do tumorskih celic. Rezultati so pokazali, da so lahko makrofagi uspešni nosilci nanodelcev ter da bi lahko bili NS takšnega tipa v prihodnosti uspešna metoda za zdravljenje številnih bolezni.

'''Špela Deučman: Raziskovanje vzrokov kronične zavrnitve presajenih pljuč'''

Pri presajenih organih je največja skrb zavrnitev, ki je lahko akutna ali kronična. Pri slednji presadek sčasoma izgubi funkcijo in odmre, kar lahko povzroči smrt prejemnika. Stopnja preživetja presaditve pljuč je nižja od vseh ostalih presaditev organov. Pri 50% pacientov se pojavi obliterantni bronhiolitis oz. BOS, ki je glavni razlog kronične zavrnitve pljuč. Namen raziskave je bil odkriti signalno pot med NFAT1 (transkripcijski faktor), β-cateninom (koregulator transkripcije), ATX (eksoencim) in LPA1 (receptor) oz. LPA (sporočevalec) ter predlagati potencialno terapevtsko vlogo LPA1 antagonistov ter ATX inhibitorjev z namenom, da bi preprečili BOS. Odkrili so pozitivno korelacijo ekspresije med β-cateninom in kolagenom I. Ker LPA prepreči razgradnjo aktivnega β-catenina in ker je za nastanek LPA odgovoren ATX, so raziskali mehanizme reguliranja ekspresije ATX. Ugotovili so, da ekspresijo ATX regulira transkripcijski faktor NFAT1. Znano je, da LPA povečuje znotrajcelično koncentracijo prostih Ca2+ ionov, ti pa so povezani z aktivacijo in jedrsko translokacijo NFAT1. To pomeni, da LPA regulira ekspresijo NFAT1 in posledično tudi ATX. Pri raziskovanju na miših so uporabili LPA1 antagoniste in ATX inhibitorje, ki so vidno zmanjšali napredek BOS.

'''Anže Jenko: Koriščenje kemiluminiscence dioksietanovih sond za prikazovanje celice'''

Kemiluminiscenčne sonde veljajo za eno izmed najbolj občutljivih diagnostičnih metod pri določanju encimske aktivnosti in koncentracije analita, kar v praktičnem življenju denimo koristi forenzikom. Ker pa je splošno uveljavljen princip koriščenje kemiluminiscence slabo dodelan in privede do velikih energetskih izgub. Raziskovalci so tako v sami raziskavi preizkušali kemiluminiscenčne in fluorescenčne lastnosti različnih derivatov Schaapovega adamatiliden-dioksetana, na katerega so vezali različne substituente, ki pa so imeli znaten vpliv. Na ta način so želeli ustvariti enokomponentni sistem, z visoko intenziteto izseva, ki pa je tudi primeren v fizioloških razmerah. To jim je na koncu tudi uspelo. Na najbolj ustrezni izmed sintetiziranih sond, so hidroksilno skupino na benzenovem obroču ''zamaskirali'' z drugačnimi zaščitnimi skupinami. Vsaka izmed teh skupin pa je bila občutljiva na različne molekule (denimo beta-galaktoza na encim beta-galaktozidaza), reakcija s katerimi je povzročila destabilizacijo - vzbujeno stanje sonde in posledično kemiluminiscenco. Ta mehanizem je pokazal visoko mero selektivnosti, zato so ga lahko praktično koristili pri mikroskopskem prikazovanju celic. Pri celicah z genom za prekomerno izražanje beta-galaktozidaze je z uporabo relavantne sonde (ustrezna zaščitna skupina) prišlo do obarvanja, pri takšni, kjer pa tega encima ni bilo prisotnega, pa do obarvanja ni prišlo.

'''Jana Kotnik: Sintetični membranski receptorji'''

Znanstveniki na Univerzi Bristol so našli način za posnemanje sporazumevanja celic z okolico. Ustvarili so sintetični receptor, ki se odziva na kemične signale podobno kot njegova naravna ekvivalenta. Vsadijo se v membrano in so sposobni vezave določenih ligandov. Receptor je sestavljen iz 3 delov: Vezavnega žepka konstruiranega iz kationskega kovinskega kompleksa, hidrofobne oligomerne vijačnice (jedro receptorja) in sonde s pirensko fluorescenco. V raziskavi so na podlagi sevanja sonde preučevali vpliv kiralnih ligandov na receptor in njegovo obliko v topilu ter v umetnih membranah veziklov. Umetni receptorji ponujajo redko možnost primerjanja obnašanja (oblike) molekul v raztopini in v membrani ter priložnost raziskovanja učinka membrane na razporeditvene preference in vezave ligandov. Kontroliranje prenašanja biokemijskih informacij čez fosfolipidni dvosloj predstavlja veliko priložnost za razvoj sintezne biologije - predstavljamo si lahko npr. umetne celice, s katerimi bi z nadzorovanjem receptorjev v membranah proizvajali koristne materiale ali zdravila.

'''Andrej Špenko: Nova tehnika za regeneracijo kostnega tkiva'''

Ruski znanstveniki so odkrili učinkovit način za izdelavo mineraliziranih vlaken, ki so mehansko odporna in hkrati celicam nudijo ugodne pogoje za preživetje. Vlakna, ki so bila narejena z elektrostatskim sukanjem, da so čim bolj posnemala človeški matriks, so potopili v raztopino Na2CO3 in CaCl2. Na vlaknih so se je tako formirali kristali CaCO3, katerih oblika pa je bila zelo odvisna od pogojev, v katerih so nastali. Pri nadaljnjih poskusih so raztopine z ogrodjem obdelali z ultrazvočnim valovanjem, da so ioni prodrli tudi v spodnje sloje ter v sredino vlaken. Ugotovili so, da se s pomočjo ultrazvočnega obdelovanja v prvih 30 sekundah formira vaterit, nestabilna oblika kristalov CaCO3, ki vlakna v nekaj kratkih ponovitvah popolnoma obda. Pri kasnejših ponovitvah pa se formira kalcit, ki pa je bolj pravilen in mehansko odporen kot vaterit. Če bi vlakna pustili v raztopini za daljše časovno obdobje, bi imel kalcit čas, da se formira. To bi pomenilo manjšo mehansko obstojnost, saj bi se na vlaknih raje formirali pravilni kristali, kot pa da bi vlakna obdali in tako pripravili enakomeren sloj okoli vlaken, na katere bi se kasneje zlagali dodatni kristali. Znanstveniki so v dokončana vlakna položili človeške kožne celice in po treh dneh so testi pokazali, da je sposobnost preživetja celic skoraj enaka tisti, v kontroli.

'''Ana Maklin: Termična stabilnost proteinov'''

Temperatura ima velik vpliv na fiziologijo celice. Organizmi rastejo najbolj optimalno le v omejenih temperaturnih razsežnostih. Občutljivost na temperaturo je v veliki meri posledica vpliva temperature na strukturo in funkcijo proteinov. Leuenberg et al. so opazovali termično stabilnost proteinov, z uporabo postopka LiS-MS, ki omogoča preučevanje proteinov neposredno v celičnem matriksu. Postopek so uporabili na ''Escherichia coli'', ''Saccharomyces cerevisiae'', ''Thermus thermophilus'' in človeških celicah, pridobili pa so podatke za več kot 8000 proteinov. Med raziskavo so prišli med drugim do naslednjih spoznanj: (i) do temperaturno sprožene celične smrti pride zaradi izgube določenih proteinov s ključnimi funkcijami, (ii) stabilnost nekaterih proteinov je posledica evolucijskega ohranjanja, (iii) dolžina proteinov in njihova termična stabilnost sta v obratnem sorazmerju, (iv) proteini, manj podvrženi termični agregaciji, so stabilnejši, (v) stabilni proteini imajo več beta ploskev, nestabilni pa alfa vijačnic.

'''Luka Gregorič: Merjenje količine urina v plavalnih bazenih s pomočjo merjenja koncentracije umetnih sladil'''

Uriniranje v bazene povzroča precej preglavic veliko lastnikom bazenov in tudi njihovim obiskovalcem. Zato se raziskovalci že dolgo trudijo ugotoviti učinkovit način s katerim bi lahko nadzirali koncentracijo urina v bazenih, da bi lahko se tudi lažje in bolj učinkovito spopadli z razkuževanjem le tega. Zato so začeli meriti vsebnost umetnega sladila ACE (acetilsulfam-K), ki se pojavlja v človeškem urinu in je zelo odporen na zunanje dejavnike (na velike spremembe pH in temperature). Hkrati pa je njegove koncentracije v podtalnici relativno malo, tako da velika odstopanja le tega ne moremo pripisati zunanjim dejavnikom. Koncentracija ACE v urinu je 4000 μg/L. Testirali so 21 različnih bazenov in 8 vročih vrelcev v Kanadi. Zbiranje vzorcev je trajalo 3 tedne. Testirali so jih skupaj z praznim vzorcem in ugotovili, da ima voda v bazenih in vročih vrelcih veliko večjo koncentracijo ACE kot prazen vzorec (ki je imel koncentracijo 0 ng/L) in podtalnica (10 ng/L). Te koncentracije so imele razpon vse od najmanjših vrednostih 50 ng/L do 7100 ng/L v vročih vrelcih. Ker v bazenih ni nobenega drugega očitnega vira ACE kot človeški urin so zaključili, da je v tistih bazenih, ki vsebujejo več ACE, tudi koncentracija urina večja.

'''Andrej Race: Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency'''

NADPH is an important molecule for cells biosythesis and detoxification of H2O2,because of its reductive power. Glucose-6-phosphate (G6PD) is one of the enzymes that is responsible for its production in the pentose phosphate pathway. The lacking of this protein can create problems for some blood cells, like erythrocytes. Erythrocytes do not have any other way of making this essential cofactor, so this deficiency may lead to their destruction and disease called favism. The distribution of this disease is remarkably similar to distribution of malaria, leading to a research that found out that parasitized erythrocytes in G6PD deficient person are more likeliy to get phagocytised by white blood cells and with that better chance of defending against this disease. The other type of cells that are affeceted by this deficiency are granulocytes, they require NADPH for chain of reactions that lead to formation of neutrophil extracellular trap, protection against bacteria and fungi. This lead to a conclusion that severe G6PD deficient people should be treated with antibiotics and antimycotics.

'''Bogatinova Emilija: NO3-anioni lahko delujejo kot Lewisovo kislino v tvrdnem stanju'''

Anioni kot so NO3 so tipični elektron donatorji. Vender izračuni napovedujejo da, je poraudelitev naboja NO3 je anizotropen in minimalen na dušiku. Tukaj so pokazali da ko je naboj nitrata v zadosni meri ovira odmevalo čež večjih obročjih, ki lahko stapijo v interakcijo z elektronskimi bogatimi partnerji. Ankete o Cambridge strukturnih Database in Protein Data Bank kažejo geometrijske nastavitve nekaterih kisika in žvepla, ki vsebuje subjektov okrog anioni nitrata, ki so v skladu s tem "π-lujenj lepljenje". Izračuni pokažejo donor-akceptor orbitalne interakcije, ki potrjujejo kontraintuitivnim Lewisova π-kislost nitrata.

'''Zaveršek Nika: BAKTERIJE LAHKO S POMOČJO SINTETIZIRANIH ŽELEZOVIH MOLEKUL POSTANEJO ELEKTRIČNI GENERATORJI'''
Bakterije in še nekateri ostali mikroorganizmi so samoobnovljivi 'nanoreaktorji', ki živijo povsod na Zemeljskem površju. Če bi ti organizmi lahko anodam oddali električno energijo, bi bil to nov način pridobivanja tako imenovane čiste energije. Problem je, da veliko organizmov ne more oddati električne energije, ki nastane pri njihovem metabolizmu, elektrodi.[1] Zanimivo pa se je vprašati, kako je sploh možno, da bi bakterije lahko oddale elektrone glede na to, da elektrode niso prisotne v naravnem okolju teh bakterij. Ena izmed teorij je, da so nekatere bakterije zmožne oddajanja elektronov elektrodi zato, ker v naravi elektrone lahko oddajo nekaterim netopnim mineralom. poleg tega, da bakterije lahko oddajajo elektrone, jih lahko tudi sprejemajo in jih uporabijo, da optimizirajo svoj metabolizem. Električni tok nastaja pri bakterijskem metabolizmu, ki poteka po principu redoks reakcij, iz organskih goriv. To lastnost bakterij bi lahko uporablili za nižje stroške ćiščenja vode, saj bi bakterije razgradile ogranske snovi, ki so v vodi, poleg tega pa bi proizvedle elektriko.

'''Zupan Tanja: Razlike v funkcionalni povezavi možganov v mirujočem stanju med športniki in ne športniki
Strokovnjaki na področju finih motoričnih sposobnosti, ki so povezane s spremembami v strukturi možganov so preučevali razliko v funkciji in povezljivosti možganov športnikov in ne športnikov v stanju mirovanja (v stanju mirovanja, v naših možganih delujejo tri povezave, ki so povezane z motoričnimi funkcijami: DMN (default mode network), FPN (frontoparietal network) in MN (motor network)) s pomočjo magnetne resonance. Pri raziskavi je sodelovalo dvaindvajset zdravih odraslih moškega spola med 18-25 let. Od tega 11 športnikov in 11 ne športnikov, ki pa se po starosti ujemajo s športniki. Rezultati so pokazali, da ukvarjanje z visoko aerobično vadbo v mladosti vpliva na razlike, ki nastanejo v povezovanju možganov, ki so opazne v stanju mirovanja. Posledice gibanja niso opazne le pri motoričnih sposobnostih ampak tudi pri delovanju izvršilnih funkcij, prostorski orientaciji in pri spominskih sposobnostih. Razlike v povezovanju se lahko pojavijo kot odziv na kognitivne zahteve teka na dolge razdalje v kombinaciji z aerobno vadbo. Poleg tega pa lahko kognitivne zahteve pri visoki intenzivni vzdržljivi vadbi privedejo tudi do razlik pri opravljanju dejavnosti, ki pa niso povezane s športom. V prihodnjih raziskavah na tem področju bodo v raziskovanje vključili tudi rekreativne športnike in ženske, ki v to raziskavo niso bili vključeni.

'''Mikulič Vernik Nika: ONKOLITIČNI VIRUSI, KI SELEKTIVNO NAPADAJO RAKASTE CELICE'''

Onkolitični virusi lahko s svojimi replikacijami znotraj gostiteljskih celic uničijo tumorska tkiva. Da bi izboljšali to njihovo sposobnost, znanstveniki neprestano razvijajo nove, močnejše viruse, ki pa s svojo močjo postajajo zmeraj bolj toksični. Zaradi tega narašča potreba po razvoju visoko specifičnih virusov, ki bi napadali zgolj tumorska tkiva, zdrava pa bi pustili nepoškodovana. Raziskovalci so določili optimalno sekvenco proteinov na 3'-UTR virusne mRNA, potrebno za onkoselektivnost virusov. Izdelali so adenovirus AdCPE s to sekvenco in primerjali njegovo učinkovitost pri uničevanju tumorskega tkiva z učinkovitostjo divjega tipa virusa ''in vitro'' in ''in vivo''. Primerjali so tudi vpliv virusa na normalno tkivo in prišli do zaključkov; 1) Virus AdCPE ni nič manj učinkovit pri uničevanju tumorskega tkiva kot divji tip virusa; 2) AdCPE je dosti manj toksičen od divjega tipa virusa.

TBK2017 Povzetki seminarjev

2017-04-16T16:27:31Z

Nika Mikulič: /* Ana Scott: Naslov seminarja */

[[TBK2017-seminar|Nazaj na osnovno stran]]
===Ana Scott: Naslov seminarja===
Tekst ....

'''Patrik Levaćić: Prehrambni aditivi v sladkarijah ter žvečilnih gumijih lahko spremenijo funkcionanlnost in strukturo prebavnih celic'''

Vnos nano delcev titanovega dioksida (TiO2) preko prehrambenih izdelkov kot so sladkarije ter žvečilni gumiji je praktično nemogoče. Prebavni trakt služi kot pomembna meja med telesom in zunanjim okoljem. Cilj raziskave je bilo opazovanje posledic vnosa 30 nano meterskih delcev titanovega dioksida preko modela celične strukture tankega črevesja ter določitev kako akutna ter kronična izpostavljenost takim delcem lahko vpliva na funkcionalnost in strukturo celice. Postopek prepoznavanja TiO2 delcev je zelo kompleksen, navadno se uporablja Ramanova spektroskopija, ki izkorišča lastnosti molekule kot so vibracijska ter rotacijska stanja, s tem pa dobimo tako imenovani ''finger-print'' molekule, saj ima vsaka molekula svoje lastnosti in se po njih loči od drugih molekul. Rezultati raziskave so potrdili, da čeprav akutna izpostavljenost ni pustila resnejših posledic na celični strukturi, ima kronična izpostavljenost kar nekaj posledic na celičnem nivoju. Spremeni se funkcionalnost celice, nivo delovanja membranskih encimov vpade, spremeni se prav tako tudi struktura, saj se zmanjša sposobnost vsrkavanja nutrientov preko mikrovilov.

'''Tina Turel: Povezanost retrovirusov z razvojem možganov'''

Možgani človeka so bistveno bolj razviti od možganov drugih sesalcev in zato veliko težji za raziskovanje in razumevanje. Številne raziskave so dokazale, da bi transportni elementi (TE-ji), ki so še pred nekaj leti veljali za neuporaben del DNA, tako imenovan »junk DNK«, lahko bili odgovorni za današnjo stopnjo razvitosti človeških možganov.
Retrovirusi so posebna skupina virusov. Nekateri veljajo za škodljive (HIV), drugi pa so povsem neškodljivi. V našem DNA je več kot 1000 različnih retrovirusov. V raziskavi, ki jo je vodil Johan Jakobsson in se je odvijala v Lundu, so dokazovali pomembno vlogo ERV-ja, endogenega retrovirusa v razvoju človeških možganov. Želeli so pokazati, da nekaj tisoč ERV-jev, mnogi so primarno specifični, delujejo kot priklopna podlaga za epigenetske represorsko beljakovino TRIM28, ki vzpostavi lokalni hetero kromatin okoli ERV-jev. Retrovirusi lahko pri vsakem človeku reagirajo drugače, saj so tak tip genetskega materiala, da se lahko nahajajo v katerem koli delu v genomu. Različna izražanja ERV-ja pa bi bila lahko tudi razlog za možganske okvare, ki povzročijo bolezni, kot so ALS, shizofrenija in bipolarna motnja .

'''Nina Mezgec Mrzlikar: Regulacija gena DISC-1 kot potencialnega zdravila za shizofrenijo'''

Shizofrenija je duševna motnja, ki se razvije v zgodnjem odraslem obdobju. DISC-1 (Disrupted-In-Schizophrenia-1) je protein, kodiran z genom DISC-1 in je močno izražen v možganskem hipokampusu. Sodeluje pri razvoju aksonov in povezovanju celic. Caveolin-1 je ogrodni protein bistven pri regulaciji receptorjev na membranah in spodbuja razvoj novih povezav med živčnimi celicami. V tej raziskavi so znanstveniki proučevali vpliv proteina Cav-1 na izražanje gena DISC-1 v živčnih celicah. Ugotovljeno je bilo, da prekomerno izražen gen Cav-1 povzroči večje izražanje gena DISC-1 in drugih sinaptičnih proteinov, ki so potrebni za prenos živčnega signala. V miših, katerim so iz hipokampusa odstranili Cav-1 je posledično prišlo do manjšega izražanja DISC-1 in hkrati drugih sinaptičnih proteinov. Izguba Cav-1 torej zmanjšuje aktivnost sinaps, kar pa je vzrok za številne nevrodegenerativne bolezni, kot je tudi shizofrenija. Ugotovitve kažejo na pomembno vlogo proteina Caveolin-1 v celicah, saj vzdržuje pravilno delovanje receptorjev in s tem prenos živčnega signala.

'''Sonja Gabrijelčič: Ribosomske mutacije spodbujajo razvoj odpornosti proti antibiotikom v okolju z več zdravilnimi učinkovinami'''

Odpornost bakterij na antibiotike je v porastu po vsem svetu. Pojavlja se tako v državah v razvoju, kjer je predvsem posledica nekvalitetnih antibiotikov, kot v najrazvitejših državah sveta, kjer se pojavlja več in več patogenov, ki lahko preživijo v okolju z več zdravilnimi učinkovinami oziroma antibiotiki. Bakterije lahko pridobijo odpornost ali z izmenjavo mobilnih genetskih elementov ali z mutacijo genetskega materiala, ki je že v celici. V raziskavi, ki jo opisuje članek, so raziskovalci želeli opazovati slednje, zato so izmed bakterij, ki so lahko sočasno odporne na več antibiotikov, izbrali Mycobacterium smegmatis, sorodnico bakterije, ki povzroča tuberkulozo, in eno od predstavnic skupine bakterij, pri kateri do izmenjevanja plazmidov praktično ne pride. Klasificirali so tipe mutacij, do katerih je prišlo, in se osredotočili predvsem na mutacije, ki so se zgodile na mestih genoma, kjer se kodirajo proteini, ki so sestavni deli ribosomov. Ugotovili so, da so taki mutanti odporni na antibiotike z različnimi mehanizmi delovanja, ki jim niso bili še nikoli izpostavljeni, na antibiotike širokega spektra in poleg tega tudi na nekatere druge mehanske strese na membrane.

'''Daria Latysheva: Mehanski raztezek sproži hitro delitev epitelijskih celic'''

Mehansko aktivni kanalčki so membranski proteini, ki so neposredno odvisni od sile in pretvarjajo mehanske držljaje v električne oz. biokemijske signale. Piezo1 je mehansko aktiven ionski kanalček, ki spodbuja celično smrt v predelih z visoko gostoto celic. V raziskavi so ugotovili, da kotrolira tudi mitotsko delitev. Raziskali so mehanizem delovanja Piezo1 v procesu celične delitve. Pri nizki gostoti celic oz. kjer so celice raztegnjene se Piezo1 lokalizira na celični membrani ter se odpre; posledično sproži influks kalcija v celico. ERK1 se aktivira zaradi povečane koncentracije Ca2+ ionov, kar vpliva na aktivnost ciklina B v G2 fazi mitotske delitve in povzroči proliferacijo. Način, na kateri Piezo1 aktivira dva nasprotna procesa je odvisen od lokacije in načina aktivacije kanalčka. V predelih z nizko gostoto celic se Piezo1 lokalizira na celični membrani ter hitro aktivira celično delitev. Če so celice razporejene tesno druga ob drugi, se Piezo1 oblikuje v velike citiplazemske agregate in spodbuja celično smrt. Zaradi sposobnosti zaznave mehanskega raztezka ter prevelike in premajhne gostote celic Piezo 1 deluje kot homeostatski senzor in kontrolira število epitelijskih celic.

'''Nika Goršek: Nove študije razkrivajo delovanje molekulske črpalke, ki izloča zdravila proti raku'''

MRP1 ali »Multidrug resistance protein« je protein, ki spada v družino ABC-transporterjev. Pomemben je pri reguliranju redoks homeostaze, vnetij in sekrecije hormonov. Znano je tudi, da ima pomembno vlogo pri odpornosti na zdravila in njihovem črpanju iz celic. V raziskavi na univerzi Rockefeller so z uporabo elektronske kriomikroskopije določili njegovo zgradbo. Sestavljajo ga štirje glavni deli: dva transmembranska dela, ki tvorita telo transporterja, dva dela, ki vežeta ATP, motiv v obliki lase in N-terminalni transmembranski del. Čeprav ima MRP1 dva dela, ki bi lahko vezala ATP, pa tega veže le en, saj pri drugem delu pride do drugačnega zaporedja aminokislin. V raziskavah so dokazali, da mutacije določenih delov proteina vodijo v bolezenska stanja in da bi sprememba le ene aminokisline v zaporedju vplivala na aktivnost proteina. MRP1 ima le eno dvojno vezavno mesto, ki je pozitivno nabito. Pestrost substratov je zaradi takega vezavnega mesta veliko večja, kot pri nekaterih drugih znanih proteinih. Prenaša lahko organske, amfipatične in aninonske molekule, na primer zdravila proti raku, opijate, antidepresive in tudi nekatere za življenje pomembne snovi (hormoni in protivnetne molekule). Ob vezavi substrata se oblika proteina MRP1 spremeni, aktivnost pa se poveča. Po končanem transportu pa protein preide nazaj v prvotno, neaktivno obliko.

'''Dragana Savković: Stopnja preživetja evkariontskih celic po elektroforezni nanoinjekciji'''

Znotrajcelična dostava makromolekul je pomemben korak za terapevtske in raziskovalne namene. Za uvajanje tujih molekul v citoplazmo živih celic uporabljale so se metode, katere so se v večini primerov uporabljale za veliko število celic v kulturi in je splošno znano, da veliko število teh celic (do 50%) ne preživi ta proces. Da bi rešili ta problem, razvili so alternativno metodo znotrajcelične dobave, oziroma znotrajcelično elektroforezno nanoinjekcijo. V raziskavi so primerjali stopnjo preživetja celic injiciranih z pipeto s premerom 100 nm in pipeto s premerom 500 nm. Ugotovili so, da je stopnja preživetja z uporabo 100 nm pipeto veliko večja kot s 500 nm pipeto in tudi da ostale preživele celice kažejo bolj naraven cikel celic.

'''Urška Zagorc: Proteini, zgodnje opozorilo sladkorne bolezni tipa 1'''

Sladkorna bolezen tipa 1, ki je značilna predvsem za otroke in mladostnike, je posledica motnje v imunskem sistemu. Organizem uniči lastne celice v trebušni slinavki, ki proizvajajo inzulin. Ta omogoča glukozi iz hrane vstop v celico, s čimer celica dobi hrano in energijo. V raziskavi nemškega raziskovalnega centra za zdravje in okolje Helmholtz Zentrum München so sodelovali otroci, katerih ožji družinski član ima diabetes tipa 1 in otroci brez dednih dispozicij. Analizirali so krvne vzorce otrok z avto-protitelesi ter jih primerjala z vzorci otrok, ki ne kažejo znakov bolezni niti nimajo protiteles.Identificirali so 41 peptidov iz 26 proteinov, ki se razlikujejo v krvnih vzorcih tistih otrok s protitelesi in tistih brez. Glede na koncentracijo peptidov v treh proteinih (hepatocitni rastni faktor HGF, istem komplementa H in ceruloplazmin) in glede na starost otroka, so dosegli tudi boljšo oceno hitrosti razvoja bolezni. Večja koncentracija sistema komplementa H in hepatocitnega rastnega faktorja ter nižja koncentracija ceruloplazmina pri tem nižji starosti bolnika, pomenijo hitrejši napredek bolezni. Identificirani proteini nam pokažejo bolj natančno oceno stopnje pred pojavom simptomov. Zaradi njih je možno tudi ugotoviti ali ima bolnik s protitelesi, večjo ali manjšo možnost za razvoj sladkorne bolezni tipa 1 in kako hitro se bo bolezen razvila.

'''Anja Černe: Uporaba askorbata pri zdravljenju raka'''

Če askorbat vnesemo v organizem v manjših koncentracijah ima antioksidativne učinke, medtem ko se pri vnosu v večjih koncentracijah obnaša kot prooksidant. Farmakološko koncentriran askorbat povzroča tok izvenceličnega H2O2 v celico in vse celice, tako zdrave kot rakave, encimsko razgrajujejo H2O2, ki je zanje toksičen. Glavni encimi, ki razgrajujejo H2O2 pri velikih količinah so katalaze. Ker pa je katalaz v rakavih celicah malo, so rakave celice bolj dovzetne škodljive učinke, zato je askorbat zanje selektivno toksičen. Katalazna aktivnost v rakavih celicah lahko napove, kako se bo tumor odzval na terapijo z askorbatom. Pri nekaterih vrstah tkiv je rast tumorjev bolj upočasnjena, pri drugih manj (odvisnost od količine katalaz, ki jih tkivo vsebuje). Število aktivnih katalaznih monomerov na celico in ED50 (koločina snovi, ki učinkuje pri 50% osebkih) sta sorazmerna s konstanto celične razgradnje H2O2. Radikali, ki nastanejo pri reakciji med ionom kovine in H2O2, poškodujejo DNA, v kolikšni meri se to zgodi pa je odvisno od količine askorbata.

'''Jerneja Nimac: S CRISPR/Cas9 nad X-vezavno kronično granulomatozno bolezen'''

Kronična granulomatozna bolezen je dedna bolezen imunskega sistema, ki nastane zaradi mutacije v genu CYBB, ki kodira gp91phox. Slednji je katalitični center NADPH oksidaze 2 (NOX2), ki ima pomembno vlogo pri obrambi organizma pred okužbami. Mutacije v genu CYBB na kromosomu Xp21.1 pa so odgovorne za X-vezavno obliko kronične granulomatozne bolezni. Za popravljanje takšne monogenske mutacije so v raziskavi uporabili sistem CRISPR/Cas9. Ta sistem so za obrambo pred virusnimi okužbami razvile bakterije in arheje, gre pa za poseben od RNA odvisen sistem pridobljene imunosti, ki specifično prepozna in reže tujo tarčno DNA. V raziskavi so skušali s sistemom CRISPR/Cas9 popraviti mutacijo C676T na eksonu 7 gena CYBB. Z DHR testi so ugotovili, da s CRISPR/Cas9 popravljene mieloične celice obnovijo aktivnost NOX2 in ponovno izražajo protein gp91phox. S spreminjanjem količine ssODN pa so dokazali, da je stopnja popravljenih genov večja, če je količina ssODN večja, delež indelov pa se zmanjša. Prav tako so potrdili uspešno presaditev s CRISPR/Cas9 popravljenih krvotvornih matičnih in predniških celic in njihovo diferenciacijo v nepoškodovane mieloične in limfocitne celice v NSG miših v obdobju petih mesecev.

'''Barbara Slapnik: Holesterol v celični membrani'''

Holesterol je razporejen po celični membrani. Pomemben je za vzdrževanje membranske fluidnosti, membrano naredi bolj togo in manj prepustno. Njegova porazdelitev med zunanjim in notranjim fosfolipidnim slojem pa ni enakomerna. V raziskavi so razvili dopolnilne senzorje, ki omogočajo vpogled holesterola v obeh slojih sočasno in določili njegovo točno koncentracijo. Ugotovili so, da je koncentracija holesterola v zunanjem sloju celične membrane znatno višja kot koncentracija v notranjem sloju. Visoka koncentracija holesterola v zunanjem sloju celične membrane zmanjša njeno prepustnost, medtem ko nizka koncentracija holesterola v notranjem sloju omogoča celično sporočanje. Rezultati prikazujejo pomen transbilarne asimetrije holesterola v celični membrani in njegovo prerazporeditev za celično homeostazo, rast in razmnoževanje. Podajajo tudi povezavo med holesterolom v notranjem sloju celične membrane in rakom. Določili so točno koncentracijo holesterola, kar jim omogoča boljšo diagnostiko in zdravljenje raka, vendar so za to potrebne še nadaljnje raziskave. Rezultati prav tako predstavljajo osnovo za nadaljnje študije transbilarne dinamike in funkcij holesterola in drugih lipidov v celici.

'''Nadja Škafar: Dostava protitumorskih zdravil s pomočjo makrofagov in biorazgradljivih nanodelcev'''

Nanotehnologija igra pomembno vlogo v moderni medicini, še posebej na področju zdravljenja bolezni s tarčno dostavo zdravil. Glavna prednost nanodostavnih sistemov (NS) pred danes uveljavljenimi metodami zdravljenja raka je selektivna dostava protitumorskih učinkovin tumorskim celicam, kar zmanjša možnost pojava neželenih stranskih učinkov, s tem pa se bolniku omogoči boljša kakovost življenja med in po zdravljenju. Dosedanje raziskave na področju NS so temeljile na injiciranju nanodelcev v krvni obtok. Ker pa ob vnosu nanodelcev v telo prihaja do medsebojnega delovanja NS s celicami imunskega sistema, jih te, še preden lahko nanodelci dostavijo zdravila do željenega mesta, odstranijo s fagocitozo. Raziskovalca Jian Yang in Cheng Dong sta zato s svojo ekipo skušala razviti novo tehniko NS, ki problematiko reakcij med NS in makrofagi v bioloških sistemih odpravi tako, da makrofage uporablja kot nosilce nanodelcev do tumorskih celic. Rezultati so pokazali, da so lahko makrofagi uspešni nosilci nanodelcev ter da bi lahko bili NS takšnega tipa v prihodnosti uspešna metoda za zdravljenje številnih bolezni.

'''Špela Deučman: Raziskovanje vzrokov kronične zavrnitve presajenih pljuč'''

Pri presajenih organih je največja skrb zavrnitev, ki je lahko akutna ali kronična. Pri slednji presadek sčasoma izgubi funkcijo in odmre, kar lahko povzroči smrt prejemnika. Stopnja preživetja presaditve pljuč je nižja od vseh ostalih presaditev organov. Pri 50% pacientov se pojavi obliterantni bronhiolitis oz. BOS, ki je glavni razlog kronične zavrnitve pljuč. Namen raziskave je bil odkriti signalno pot med NFAT1 (transkripcijski faktor), β-cateninom (koregulator transkripcije), ATX (eksoencim) in LPA1 (receptor) oz. LPA (sporočevalec) ter predlagati potencialno terapevtsko vlogo LPA1 antagonistov ter ATX inhibitorjev z namenom, da bi preprečili BOS. Odkrili so pozitivno korelacijo ekspresije med β-cateninom in kolagenom I. Ker LPA prepreči razgradnjo aktivnega β-catenina in ker je za nastanek LPA odgovoren ATX, so raziskali mehanizme reguliranja ekspresije ATX. Ugotovili so, da ekspresijo ATX regulira transkripcijski faktor NFAT1. Znano je, da LPA povečuje znotrajcelično koncentracijo prostih Ca2+ ionov, ti pa so povezani z aktivacijo in jedrsko translokacijo NFAT1. To pomeni, da LPA regulira ekspresijo NFAT1 in posledično tudi ATX. Pri raziskovanju na miših so uporabili LPA1 antagoniste in ATX inhibitorje, ki so vidno zmanjšali napredek BOS.

'''Anže Jenko: Koriščenje kemiluminiscence dioksietanovih sond za prikazovanje celice'''

Kemiluminiscenčne sonde veljajo za eno izmed najbolj občutljivih diagnostičnih metod pri določanju encimske aktivnosti in koncentracije analita, kar v praktičnem življenju denimo koristi forenzikom. Ker pa je splošno uveljavljen princip koriščenje kemiluminiscence slabo dodelan in privede do velikih energetskih izgub. Raziskovalci so tako v sami raziskavi preizkušali kemiluminiscenčne in fluorescenčne lastnosti različnih derivatov Schaapovega adamatiliden-dioksetana, na katerega so vezali različne substituente, ki pa so imeli znaten vpliv. Na ta način so želeli ustvariti enokomponentni sistem, z visoko intenziteto izseva, ki pa je tudi primeren v fizioloških razmerah. To jim je na koncu tudi uspelo. Na najbolj ustrezni izmed sintetiziranih sond, so hidroksilno skupino na benzenovem obroču ''zamaskirali'' z drugačnimi zaščitnimi skupinami. Vsaka izmed teh skupin pa je bila občutljiva na različne molekule (denimo beta-galaktoza na encim beta-galaktozidaza), reakcija s katerimi je povzročila destabilizacijo - vzbujeno stanje sonde in posledično kemiluminiscenco. Ta mehanizem je pokazal visoko mero selektivnosti, zato so ga lahko praktično koristili pri mikroskopskem prikazovanju celic. Pri celicah z genom za prekomerno izražanje beta-galaktozidaze je z uporabo relavantne sonde (ustrezna zaščitna skupina) prišlo do obarvanja, pri takšni, kjer pa tega encima ni bilo prisotnega, pa do obarvanja ni prišlo.

'''Jana Kotnik: Sintetični membranski receptorji'''

Znanstveniki na Univerzi Bristol so našli način za posnemanje sporazumevanja celic z okolico. Ustvarili so sintetični receptor, ki se odziva na kemične signale podobno kot njegova naravna ekvivalenta. Vsadijo se v membrano in so sposobni vezave določenih ligandov. Receptor je sestavljen iz 3 delov: Vezavnega žepka konstruiranega iz kationskega kovinskega kompleksa, hidrofobne oligomerne vijačnice (jedro receptorja) in sonde s pirensko fluorescenco. V raziskavi so na podlagi sevanja sonde preučevali vpliv kiralnih ligandov na receptor in njegovo obliko v topilu ter v umetnih membranah veziklov. Umetni receptorji ponujajo redko možnost primerjanja obnašanja (oblike) molekul v raztopini in v membrani ter priložnost raziskovanja učinka membrane na razporeditvene preference in vezave ligandov. Kontroliranje prenašanja biokemijskih informacij čez fosfolipidni dvosloj predstavlja veliko priložnost za razvoj sintezne biologije - predstavljamo si lahko npr. umetne celice, s katerimi bi z nadzorovanjem receptorjev v membranah proizvajali koristne materiale ali zdravila.

'''Andrej Špenko: Nova tehnika za regeneracijo kostnega tkiva'''

Ruski znanstveniki so odkrili učinkovit način za izdelavo mineraliziranih vlaken, ki so mehansko odporna in hkrati celicam nudijo ugodne pogoje za preživetje. Vlakna, ki so bila narejena z elektrostatskim sukanjem, da so čim bolj posnemala človeški matriks, so potopili v raztopino Na2CO3 in CaCl2. Na vlaknih so se je tako formirali kristali CaCO3, katerih oblika pa je bila zelo odvisna od pogojev, v katerih so nastali. Pri nadaljnjih poskusih so raztopine z ogrodjem obdelali z ultrazvočnim valovanjem, da so ioni prodrli tudi v spodnje sloje ter v sredino vlaken. Ugotovili so, da se s pomočjo ultrazvočnega obdelovanja v prvih 30 sekundah formira vaterit, nestabilna oblika kristalov CaCO3, ki vlakna v nekaj kratkih ponovitvah popolnoma obda. Pri kasnejših ponovitvah pa se formira kalcit, ki pa je bolj pravilen in mehansko odporen kot vaterit. Če bi vlakna pustili v raztopini za daljše časovno obdobje, bi imel kalcit čas, da se formira. To bi pomenilo manjšo mehansko obstojnost, saj bi se na vlaknih raje formirali pravilni kristali, kot pa da bi vlakna obdali in tako pripravili enakomeren sloj okoli vlaken, na katere bi se kasneje zlagali dodatni kristali. Znanstveniki so v dokončana vlakna položili človeške kožne celice in po treh dneh so testi pokazali, da je sposobnost preživetja celic skoraj enaka tisti, v kontroli.

'''Ana Maklin: Termična stabilnost proteinov'''

Temperatura ima velik vpliv na fiziologijo celice. Organizmi rastejo najbolj optimalno le v omejenih temperaturnih razsežnostih. Občutljivost na temperaturo je v veliki meri posledica vpliva temperature na strukturo in funkcijo proteinov. Leuenberg et al. so opazovali termično stabilnost proteinov, z uporabo postopka LiS-MS, ki omogoča preučevanje proteinov neposredno v celičnem matriksu. Postopek so uporabili na ''Escherichia coli'', ''Saccharomyces cerevisiae'', ''Thermus thermophilus'' in človeških celicah, pridobili pa so podatke za več kot 8000 proteinov. Med raziskavo so prišli med drugim do naslednjih spoznanj: (i) do temperaturno sprožene celične smrti pride zaradi izgube določenih proteinov s ključnimi funkcijami, (ii) stabilnost nekaterih proteinov je posledica evolucijskega ohranjanja, (iii) dolžina proteinov in njihova termična stabilnost sta v obratnem sorazmerju, (iv) proteini, manj podvrženi termični agregaciji, so stabilnejši, (v) stabilni proteini imajo več beta ploskev, nestabilni pa alfa vijačnic.

'''Luka Gregorič: Merjenje količine urina v plavalnih bazenih s pomočjo merjenja koncentracije umetnih sladil'''

Uriniranje v bazene povzroča precej preglavic veliko lastnikom bazenov in tudi njihovim obiskovalcem. Zato se raziskovalci že dolgo trudijo ugotoviti učinkovit način s katerim bi lahko nadzirali koncentracijo urina v bazenih, da bi lahko se tudi lažje in bolj učinkovito spopadli z razkuževanjem le tega. Zato so začeli meriti vsebnost umetnega sladila ACE (acetilsulfam-K), ki se pojavlja v človeškem urinu in je zelo odporen na zunanje dejavnike (na velike spremembe pH in temperature). Hkrati pa je njegove koncentracije v podtalnici relativno malo, tako da velika odstopanja le tega ne moremo pripisati zunanjim dejavnikom. Koncentracija ACE v urinu je 4000 μg/L. Testirali so 21 različnih bazenov in 8 vročih vrelcev v Kanadi. Zbiranje vzorcev je trajalo 3 tedne. Testirali so jih skupaj z praznim vzorcem in ugotovili, da ima voda v bazenih in vročih vrelcih veliko večjo koncentracijo ACE kot prazen vzorec (ki je imel koncentracijo 0 ng/L) in podtalnica (10 ng/L). Te koncentracije so imele razpon vse od najmanjših vrednostih 50 ng/L do 7100 ng/L v vročih vrelcih. Ker v bazenih ni nobenega drugega očitnega vira ACE kot človeški urin so zaključili, da je v tistih bazenih, ki vsebujejo več ACE, tudi koncentracija urina večja.

'''Andrej Race: Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency'''

NADPH is an important molecule for cells biosythesis and detoxification of H2O2,because of its reductive power. Glucose-6-phosphate (G6PD) is one of the enzymes that is responsible for its production in the pentose phosphate pathway. The lacking of this protein can create problems for some blood cells, like erythrocytes. Erythrocytes do not have any other way of making this essential cofactor, so this deficiency may lead to their destruction and disease called favism. The distribution of this disease is remarkably similar to distribution of malaria, leading to a research that found out that parasitized erythrocytes in G6PD deficient person are more likeliy to get phagocytised by white blood cells and with that better chance of defending against this disease. The other type of cells that are affeceted by this deficiency are granulocytes, they require NADPH for chain of reactions that lead to formation of neutrophil extracellular trap, protection against bacteria and fungi. This lead to a conclusion that severe G6PD deficient people should be treated with antibiotics and antimycotics.

'''Bogatinova Emilija: NO3-anioni lahko delujejo kot Lewisovo kislino v tvrdnem stanju'''

Anioni kot so NO3 so tipični elektron donatorji. Vender izračuni napovedujejo da, je poraudelitev naboja NO3 je anizotropen in minimalen na dušiku. Tukaj so pokazali da ko je naboj nitrata v zadosni meri ovira odmevalo čež večjih obročjih, ki lahko stapijo v interakcijo z elektronskimi bogatimi partnerji. Ankete o Cambridge strukturnih Database in Protein Data Bank kažejo geometrijske nastavitve nekaterih kisika in žvepla, ki vsebuje subjektov okrog anioni nitrata, ki so v skladu s tem "π-lujenj lepljenje". Izračuni pokažejo donor-akceptor orbitalne interakcije, ki potrjujejo kontraintuitivnim Lewisova π-kislost nitrata.

'''Zaveršek Nika: BAKTERIJE LAHKO S POMOČJO SINTETIZIRANIH ŽELEZOVIH MOLEKUL POSTANEJO ELEKTRIČNI GENERATORJI'''
Bakterije in še nekateri ostali mikroorganizmi so samoobnovljivi 'nanoreaktorji', ki živijo povsod na Zemeljskem površju. Če bi ti organizmi lahko anodam oddali električno energijo, bi bil to nov način pridobivanja tako imenovane čiste energije. Problem je, da veliko organizmov ne more oddati električne energije, ki nastane pri njihovem metabolizmu, elektrodi.[1] Zanimivo pa se je vprašati, kako je sploh možno, da bi bakterije lahko oddale elektrone glede na to, da elektrode niso prisotne v naravnem okolju teh bakterij. Ena izmed teorij je, da so nekatere bakterije zmožne oddajanja elektronov elektrodi zato, ker v naravi elektrone lahko oddajo nekaterim netopnim mineralom. poleg tega, da bakterije lahko oddajajo elektrone, jih lahko tudi sprejemajo in jih uporabijo, da optimizirajo svoj metabolizem. Električni tok nastaja pri bakterijskem metabolizmu, ki poteka po principu redoks reakcij, iz organskih goriv. To lastnost bakterij bi lahko uporablili za nižje stroške ćiščenja vode, saj bi bakterije razgradile ogranske snovi, ki so v vodi, poleg tega pa bi proizvedle elektriko.

'''Zupan Tanja: Razlike v funkcionalni povezavi možganov v mirujočem stanju med športniki in ne športniki
Strokovnjaki na področju finih motoričnih sposobnosti, ki so povezane s spremembami v strukturi možganov so preučevali razliko v funkciji in povezljivosti možganov športnikov in ne športnikov v stanju mirovanja (v stanju mirovanja, v naših možganih delujejo tri povezave, ki so povezane z motoričnimi funkcijami: DMN (default mode network), FPN (frontoparietal network) in MN (motor network)) s pomočjo magnetne resonance. Pri raziskavi je sodelovalo dvaindvajset zdravih odraslih moškega spola med 18-25 let. Od tega 11 športnikov in 11 ne športnikov, ki pa se po starosti ujemajo s športniki. Rezultati so pokazali, da ukvarjanje z visoko aerobično vadbo v mladosti vpliva na razlike, ki nastanejo v povezovanju možganov, ki so opazne v stanju mirovanja. Posledice gibanja niso opazne le pri motoričnih sposobnostih ampak tudi pri delovanju izvršilnih funkcij, prostorski orientaciji in pri spominskih sposobnostih. Razlike v povezovanju se lahko pojavijo kot odziv na kognitivne zahteve teka na dolge razdalje v kombinaciji z aerobno vadbo. Poleg tega pa lahko kognitivne zahteve pri visoki intenzivni vzdržljivi vadbi privedejo tudi do razlik pri opravljanju dejavnosti, ki pa niso povezane s športom. V prihodnjih raziskavah na tem področju bodo v raziskovanje vključili tudi rekreativne športnike in ženske, ki v to raziskavo niso bili vključeni.

'''Mikulič Vernik Nika: ONKOLITIČNI VIRUSI, KI SELEKTIVNO NAPADAJO RAKASTE CELICE'''
Onkolitični virusi lahko s svojimi replikacijami znotraj gostiteljskih celic uničijo tumorska tkiva. Da bi izboljšali to njihovo sposobnost, znanstveniki neprestano razvijajo nove, močnejše viruse, ki pa s svojo močjo postajajo zmeraj bolj toksični. Zaradi tega narašča potreba po razvoju visoko specifičnih virusov, ki bi napadali zgolj tumorska tkiva, zdrava pa bi pustili nepoškodovana. Raziskovalci so določili optimalno sekvenco proteinov na 3'-UTR virusne mRNA, potrebno za onkoselektivnost virusov. Izdelali so adenovirus AdCPE s to sekvenco in primerjali njegovo učinkovitost pri uničevanju tumorskega tkiva z učinkovitostjo divjega tipa virusa in vitro in in vivo. Primerjali so tudi vpliv virusa na normalno tkivo in prišli do zaključkov; 1) Virus AdCPE ni nič manj učinkovit pri uničevanju tumorskega tkiva kot divji tip virusa; 2) AdCPE je dosti manj toksičen od divjega tipa virusa.

TBK2017-seminar

2017-04-11T17:26:50Z

Nika Mikulič: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||12.12.||12.12.||12.12.||r1||r2||r3
|-
| Nina Mezgec Mrzlikar || Regulacija gena DISC-1 kot potencialnega zdravila za shizofrenijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170105144339.htm || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Vesna Dimitrovski || Urban Hribar || Emilija Bogatinova
|-
| Tina Turel || Povezanost retrovirusov z razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170112110840.htm || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Katja Doberšek || Uroš Prešern || Nika Zaveršek
|-
| Sonja Gabrijelčič || Ribosomske mutacije spodbujajo razvoj odpornosti proti antibiotikom v okolju z več zdravilnimi učinkovinami ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170221110808.htm https://elifesciences.org/content/6/e20420 || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Mariša Cvitanič || Špela Supej || Tanja Zupan
|-
| Patrik Levačić || Prehrambni aditivi v sladkarijah ter žvečilnih gumijih lahko spremenijo funkcionalnost in strukturo prebavnih celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170217012450.htm|| 28.02. || 03.03. || 06.03. || Ajda Krč || Lea Knez || Andrej Race
|-
| Nika Goršek ||Nove študije razkrivajo delovanje molekulske črpalke, ki izloča zdravila proti raku || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170224160629.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Adela Šajn || Maja Jankovič || Urška Košir
|-
| Dragana Savković || Stopnja preživetja evkariotskih celic po elektroforezni nano-injekciji || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301105437.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Milica Janković || Luka Fratina || Martin Špendl
|-
| Hana Hiršman || || || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Ajda Godec || Anja Tavčar || Nika Mikulič Vernik
|-
| Daria Latysheva || Mehanski raztezek sproži hitro delitev epitelijskih celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170215131543.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Andreja Habič || Maja Vrabec || Ines Medved
|-
| Urška Zagorc || Proteini, zgodnje opozorilo sladkorne bolezni tipa 1 || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/11/161107112428.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Nina Mezgec Mrzlikar || Vesna Dimitrovski || Urban Hribar
|-
| Anja Černe || Učinek farmakološkega askorbata na rakave celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170109134014.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Tina Turel || Katja Doberšek || Uroš Prešern
|-
| Barbara Slapnik ||Holesterol v celični membrani || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170117163039.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Sonja Gabrijelčič || Mariša Cvitanič || Špela Supej
|-
| Jerneja Nimac || S CRISPR/Cas9 nad x-vezavno obliko kronične granulomatozne bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170112110734.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Patrik Levačić || Ajda Krč || Lea Knez
|-
| Gašper Anton Komatar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170309132308.htm || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Nika Goršek || Adela Šajn || Maja Jankovič
|-
| Nadja Škafar ||Dostava protitumorskih zdravil s pomočjo makrofagov in biorazgradljivih nanodelcev||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170104154408.htm|| 21.03. || 24.03. || 27.03. || Dragana Savković || Milica Janković || Luka Fratina
|-
| Anže Jenko || Koriščenje kemiluminiscence dioksietanovih sond za prikazovanje celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170308081051.htm || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Hana Hiršman || Ajda Godec || Anja Tavčar
|-
| Špela Deučman || Raziskovanje vzrokov kronične zavrnitve presajenih pljuč || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301105426.htm || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Daria Latysheva || Andreja Habič || Maja Vrabec
|-
| Luka Gregorič || Merjenje količine urina v plavalnih bazenih s pomočjo merjenja koncentracije umetnih sladil || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301084913.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Urška Zagorc || Nina Mezgec Mrzlikar || Vesna Dimitrovski
|-
| Jana Kotnik || Sintetični membranski receptorji || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170306114231.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Anja Černe || Tina Turel || Katja Doberšek
|-
| Andrej Špenko || Nova tehnika za boljšo regeneracijo kostnega tkiva || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/12/161220093946.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Barbara Slapnik || Sonja Gabrijelčič || Mariša Cvitanič
|-
| Ana Maklin || Termična stabilnost proteinov || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170228131046.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Jerneja Nimac || Patrik Levačić || Ajda Krč
|-
| Emilija Bogatinova ||NO3-anioni lahko delujejo kot Lewisovo kislino v tvrdnem stanju || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170222131802.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Gašper Anton Komatar || Nika Goršek || Adela Šajn
|-
| Nika Zaveršek || Bakterije lahko s pomočjo posebnih sintetičnih molekul spremenimo v električne generatorje || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170209133509.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Nadja Škafar || Dragana Savković || Milica Janković
|-
| Tanja Zupan || Razlike v funkcionalni povezavi možganov v mirujočem stanju med športniki in ne športniki ||https://www.sciencedaily.com/releases/2016/12/161214151637.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Anže Jenko || Hana Hiršman || Ajda Godec
|-
| Andrej Race || Deficit Glukoze-6-fosfat-dehidrogenaze || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/07/160726094319.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Špela Deučman || Daria Latysheva || Andreja Habič
|-
| Urška Košir || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Luka Gregorič || Urška Zagorc || Nina Mezgec Mrzlikar
|-
| Martin Špendl || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Jana Kotnik || Anja Černe || Tina Turel
|-
| Nika Mikulič Vernik || Onkolitični virusi, ki selektivno napadajo rakaste celice ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170316112147.htm || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Andrej Špenko || Barbara Slapnik || Sonja Gabrijelčič
|-
| Ines Medved ||Kako lahko z zmanjšanim vnosom hrane upočasnimo proces staranja ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170213151306.htm || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Ana Maklin || Jerneja Nimac || Patrik Levačić
|-
| Urban Hribar || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170309120519.htm || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Emilija Bogatinova || Gašper Anton Komatar || Nika Goršek
|-
| Uroš Prešern || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Nika Zaveršek || Nadja Škafar || Dragana Savković
|-
| Špela Supej || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170315125623.htm|| 02.05. || 05.05. || 08.05. || Tanja Zupan || Anže Jenko || Hana Hiršman
|-
| Lea Knez || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170217012518.htm || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Andrej Race || Špela Deučman || Daria Latysheva
|-
| Maja Jankovič || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Urška Košir || Luka Gregorič || Urška Zagorc
|-
| Luka Fratina || || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/12/161221111327.htm || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Martin Špendl || Jana Kotnik || Anja Černe
|-
| Anja Tavčar || Zdravilo proti raku, ki zmanjšuje nastanek začetnih celic ter povečuje regresijo tumorja|| https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170316151821.htm || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Nika Mikulič Vernik || Andrej Špenko || Barbara Slapnik
|-
| Maja Vrabec || || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170119163345.htm || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Ines Medved || Ana Maklin || Jerneja Nimac
|-
| Vesna Dimitrovski || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Urban Hribar || Emilija Bogatinova || Gašper Anton Komatar
|-
| Katja Doberšek || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170213083810.htm || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Uroš Prešern || Nika Zaveršek || Nadja Škafar
|-
| Mariša Cvitanič || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Špela Supej || Tanja Zupan || Anže Jenko
|-
| Ajda Krč || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Lea Knez || Andrej Race || Špela Deučman
|-
| Adela Šajn || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Maja Jankovič || Urška Košir || Luka Gregorič
|-
| Milica Janković || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Luka Fratina || Martin Špendl || Jana Kotnik
|-
| Ajda Godec || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Anja Tavčar || Nika Mikulič Vernik || Andrej Špenko
|-
| Andreja Habič || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Maja Vrabec || Ines Medved || Ana Maklin
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete v PubMed povezavi [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ tukaj]
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2017_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2017_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2017_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2017_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2017_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).'''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2017-seminar

2017-03-25T14:52:30Z

Nika Mikulič: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||http://www.bioscirep.org/content/36/1/e00291.long||12.12.||12.12.||12.12.||r1||r2||r3
|-
| Nina Mezgec Mrzlikar || Regulacija gena DISC-1 kot potencialnega zdravila za shizofrenijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170105144339.htm || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Vesna Dimitrovski || Urban Hribar || Emilija Bogatinova
|-
| Tina Turel || Povezanost retrovirusov z razvojem možganov || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170112110840.htm || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Katja Doberšek || Uroš Prešern || Nika Zaveršek
|-
| Sonja Gabrijelčič || Ribosomske mutacije spodbujajo razvoj odpornosti proti antibiotikom v okolju z več zdravilnimi učinkovinami ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170221110808.htm https://elifesciences.org/content/6/e20420 || 28.02. || 03.03. || 06.03. || Mariša Cvitanič || Špela Supej || Tanja Zupan
|-
| Patrik Levačić || Prehrambni aditivi v sladkarijah ter žvečilnih gumijih lahko spremenijo funkcionalnost in strukturo prebavnih celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170217012450.htm|| 28.02. || 03.03. || 06.03. || Ajda Krč || Lea Knez || Andrej Race
|-
| Nika Goršek ||Nove študije razkrivajo delovanje molekulske črpalke, ki izloča zdravila proti raku || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170224160629.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Adela Šajn || Maja Jankovič || Urška Košir
|-
| Dragana Savković || Stopnja preživetja evkariotskih celic po elektroforezni nano-injekciji || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301105437.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Milica Janković || Luka Fratina || Martin Špendl
|-
| Hana Hiršman || || || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Ajda Godec || Anja Tavčar || Nika Mikulič Vernik
|-
| Daria Latysheva || Mehanski raztezek sproži hitro delitev epitelijskih celic || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170215131543.htm || 07.03. || 10.03. || 13.03. || Andreja Habič || Maja Vrabec || Ines Medved
|-
| Urška Zagorc || Proteini, zgodnje opozorilo sladkorne bolezni tipa 1 || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/11/161107112428.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Nina Mezgec Mrzlikar || Vesna Dimitrovski || Urban Hribar
|-
| Anja Černe || Učinek farmakološkega askorbata na rakave celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170109134014.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Tina Turel || Katja Doberšek || Uroš Prešern
|-
| Barbara Slapnik ||Holesterol v celični membrani || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170117163039.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Sonja Gabrijelčič || Mariša Cvitanič || Špela Supej
|-
| Jerneja Nimac || S CRISPR/Cas9 nad x-vezavno obliko kronične granulomatozne bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170112110734.htm || 14.03. || 17.03. || 20.03. || Patrik Levačić || Ajda Krč || Lea Knez
|-
| Gašper Anton Komatar || || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170309132308.htm || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Nika Goršek || Adela Šajn || Maja Jankovič
|-
| Nadja Škafar ||Dostava protitumorskih zdravil s pomočjo makrofagov in biorazgradljivih nanodelcev||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170104154408.htm|| 21.03. || 24.03. || 27.03. || Dragana Savković || Milica Janković || Luka Fratina
|-
| Anže Jenko || Koriščenje kemiluminiscence dioksietanovih sond za prikazovanje celice || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170308081051.htm || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Hana Hiršman || Ajda Godec || Anja Tavčar
|-
| Špela Deučman || Raziskovanje vzrokov kronične zavrnitve presajenih pljuč || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301105426.htm || 21.03. || 24.03. || 27.03. || Daria Latysheva || Andreja Habič || Maja Vrabec
|-
| Luka Gregorič || Merjenje količine urina v plavalnih bazenih s pomočjo merjenja koncentracije umetnih sladil || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170301084913.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Urška Zagorc || Nina Mezgec Mrzlikar || Vesna Dimitrovski
|-
| Jana Kotnik || || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170306114231.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Anja Černe || Tina Turel || Katja Doberšek
|-
| Andrej Špenko || Nova tehnika za boljšo regeneracijo kostnega tkiva || https://www.sciencedaily.com/releases/2016/12/161220093946.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Barbara Slapnik || Sonja Gabrijelčič || Mariša Cvitanič
|-
| Ana Maklin || || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170228131046.htm || 28.03. || 31.03. || 03.04. || Jerneja Nimac || Patrik Levačić || Ajda Krč
|-
| Emilija Bogatinova ||NO3-anioni lahko delujejo kot Lewisovo kislino v tvrdnem stanju || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170222131802.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Gašper Anton Komatar || Nika Goršek || Adela Šajn
|-
| Nika Zaveršek || Bakterije lahko s pomočjo posebnih sintetičnih molekul spremenimo v električne generatorje || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170209133509.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Nadja Škafar || Dragana Savković || Milica Janković
|-
| Tanja Zupan || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2016/12/161214151637.htm || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Anže Jenko || Hana Hiršman || Ajda Godec
|-
| Andrej Race || || || 04.04. || 07.04. || 10.04. || Špela Deučman || Daria Latysheva || Andreja Habič
|-
| Urška Košir || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Luka Gregorič || Urška Zagorc || Nina Mezgec Mrzlikar
|-
| Martin Špendl || || || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Jana Kotnik || Anja Černe || Tina Turel
|-
| Nika Mikulič Vernik || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170316112147.htm || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Andrej Špenko || Barbara Slapnik || Sonja Gabrijelčič
|-
| Ines Medved ||Kako lahko z zmanjšanim vnosom hrane upočasnimo proces staranja ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170213151306.htm || 18.04. || 21.04. || 24.04. || Ana Maklin || Jerneja Nimac || Patrik Levačić
|-
| Urban Hribar || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170309120519.htm || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Emilija Bogatinova || Gašper Anton Komatar || Nika Goršek
|-
| Uroš Prešern || || || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Nika Zaveršek || Nadja Škafar || Dragana Savković
|-
| Špela Supej || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/03/170315125623.htm|| 02.05. || 05.05. || 08.05. || Tanja Zupan || Anže Jenko || Hana Hiršman
|-
| Lea Knez || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170217012518.htm || 02.05. || 05.05. || 08.05. || Andrej Race || Špela Deučman || Daria Latysheva
|-
| Maja Jankovič || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Urška Košir || Luka Gregorič || Urška Zagorc
|-
| Luka Fratina || || || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Martin Špendl || Jana Kotnik || Anja Černe
|-
| Anja Tavčar || Zdravilo proti raku, ki zmanjšuje nastanek začetnih celic ter povečuje regresijo tumorja|| http://stm.sciencemag.org/content/9/372/eaag2611 || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Nika Mikulič Vernik || Andrej Špenko || Barbara Slapnik
|-
| Maja Vrabec || || https://www.sciencedaily.com/releases/2017/01/170119163345.htm || 09.05. || 12.05. || 15.05. || Ines Medved || Ana Maklin || Jerneja Nimac
|-
| Vesna Dimitrovski || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Urban Hribar || Emilija Bogatinova || Gašper Anton Komatar
|-
| Katja Doberšek || ||https://www.sciencedaily.com/releases/2017/02/170213083810.htm || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Uroš Prešern || Nika Zaveršek || Nadja Škafar
|-
| Mariša Cvitanič || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Špela Supej || Tanja Zupan || Anže Jenko
|-
| Ajda Krč || || || 16.05. || 19.05. || 22.05. || Lea Knez || Andrej Race || Špela Deučman
|-
| Adela Šajn || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Maja Jankovič || Urška Košir || Luka Gregorič
|-
| Milica Janković || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Luka Fratina || Martin Špendl || Jana Kotnik
|-
| Ajda Godec || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Anja Tavčar || Nika Mikulič Vernik || Andrej Špenko
|-
| Andreja Habič || || || 23.05. || 26.05. || 29.05. || Maja Vrabec || Ines Medved || Ana Maklin
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2016. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete v PubMed povezavi [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ tukaj]
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2017_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2017_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2017_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2017_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2017_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).'''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.