Wiki FKKT - User contributions [en]

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-21T19:45:33Z

Nika Testen: /* Izražanje gena NisI v L. Lactis MG1363 */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA<ref>iGEM 2019 team SZPT China. Antihypertensive probiotic [citirano dne 16. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA</ref>

Avtorica povzetka: Nika Testen

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za matematematično metodo, ki z algoritmičnim pristopom uporablja 27 spremenljivk, da z njimi zajame vse možne oblike zvijanja proteinov in s tem pomaga preučevati njihovo konformacijo<ref>Yang, J. Protein Structure Fingerprint Technology. Bioinform,Genomics,Proteomics.2018, 3(2):1-3.</ref><ref>Yang, J. Comprehensive description of protein structures using protein folding shape code. Proteins. 2008, 71:1497–1518.</ref>. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:''' 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref><ref>Ismail AKYOL, Ugur COMLEKCIOGLU, Asuman KARAKAS, et,al. Regulation of the acid inducible rcfB promoter in Lactococcus lactis subsp. Lactis. Annals of Microbiology. 2008, 58 (2): 269-273</ref>.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45<ref>Sun Qiangzheng, Xiong Yanwen, Ye Changyu, et, al. Construction of food-grade secretory expression vector and expression of reporter protein in Lactococcus lactis. Acta Microbiologica Sinica.2008,48(3)：293-298</ref>. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operator O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinskih bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen za PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli na ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v gojišča GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp<ref>William Henry Bothfeld, Grace Kapov, and Keith Tyo. A glucose-sensing toggle switch for autonomous, high productivity genetic control. ACS Synth. 2017, 6(7):1296-1304.</ref>.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzor:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB+LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za izražanje AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg+AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP+acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščenje ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T20:40:00Z

Nika Testen: /* Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA<ref>iGEM 2019 team SZPT China. Antihypertensive probiotic [citirano dne 16. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA</ref>

Avtorica povzetka: Nika Testen

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za matematematično metodo, ki z algoritmičnim pristopom uporablja 27 spremenljivk, da z njimi zajame vse možne oblike zvijanja proteinov in s tem pomaga preučevati njihovo konformacijo<ref>Yang, J. Protein Structure Fingerprint Technology. Bioinform,Genomics,Proteomics.2018, 3(2):1-3.</ref><ref>Yang, J. Comprehensive description of protein structures using protein folding shape code. Proteins. 2008, 71:1497–1518.</ref>. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:''' 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref><ref>Ismail AKYOL, Ugur COMLEKCIOGLU, Asuman KARAKAS, et,al. Regulation of the acid inducible rcfB promoter in Lactococcus lactis subsp. Lactis. Annals of Microbiology. 2008, 58 (2): 269-273</ref>.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45<ref>Sun Qiangzheng, Xiong Yanwen, Ye Changyu, et, al. Construction of food-grade secretory expression vector and expression of reporter protein in Lactococcus lactis. Acta Microbiologica Sinica.2008,48(3)：293-298</ref>. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operator O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinskih bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen za PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli na ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp<ref>William Henry Bothfeld, Grace Kapov, and Keith Tyo. A glucose-sensing toggle switch for autonomous, high productivity genetic control. ACS Synth. 2017, 6(7):1296-1304.</ref>.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzor:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB+LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za izražanje AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg+AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP+acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščenje ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T20:28:33Z

Nika Testen: /* Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA<ref>iGEM 2019 team SZPT China. Antihypertensive probiotic [citirano dne 16. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA</ref>

Avtorica povzetka: Nika Testen

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za matematematično metodo, ki z algoritmičnim pristopom uporablja 27 spremenljivk, da z njimi zajame vse možne oblike zlaganja proteinov in s tem pomaga preučevati njihovo konformacijo<ref>Yang, J. Protein Structure Fingerprint Technology. Bioinform,Genomics,Proteomics.2018, 3(2):1-3.</ref><ref>Yang, J. Comprehensive description of protein structures using protein folding shape code. Proteins. 2008, 71:1497–1518.</ref>. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:''' 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref><ref>Ismail AKYOL, Ugur COMLEKCIOGLU, Asuman KARAKAS, et,al. Regulation of the acid inducible rcfB promoter in Lactococcus lactis subsp. Lactis. Annals of Microbiology. 2008, 58 (2): 269-273</ref>.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45<ref>Sun Qiangzheng, Xiong Yanwen, Ye Changyu, et, al. Construction of food-grade secretory expression vector and expression of reporter protein in Lactococcus lactis. Acta Microbiologica Sinica.2008,48(3)：293-298</ref>. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operator O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinskih bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen za PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli na ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp<ref>William Henry Bothfeld, Grace Kapov, and Keith Tyo. A glucose-sensing toggle switch for autonomous, high productivity genetic control. ACS Synth. 2017, 6(7):1296-1304.</ref>.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzor:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB+LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za izražanje AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg+AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP+acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščenje ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T19:32:11Z

Nika Testen: /* Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA<ref>iGEM 2019 team SZPT China. Antihypertensive probiotic [citirano dne 16. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA</ref>

Avtorica povzetka: Nika Testen

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za matematematično metodo, ki z algoritmičnim pristopom uporablja 27 spremenljivk, da z njimi zajame vse možne oblike zlaganja proteinov in s tem pomaga preučevati njihovo konformacijo<ref>Yang, J. Protein Structure Fingerprint Technology. Bioinform,Genomics,Proteomics.2018, 3(2):1-3.</ref><ref>Yang, J. Comprehensive description of protein structures using protein folding shape code. Proteins. 2008, 71:1497–1518.</ref>. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:''' 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref><ref>Ismail AKYOL, Ugur COMLEKCIOGLU, Asuman KARAKAS, et,al. Regulation of the acid inducible rcfB promoter in Lactococcus lactis subsp. Lactis. Annals of Microbiology. 2008, 58 (2): 269-273</ref>.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45<ref>Sun Qiangzheng, Xiong Yanwen, Ye Changyu, et, al. Construction of food-grade secretory expression vector and expression of reporter protein in Lactococcus lactis. Acta Microbiologica Sinica.2008,48(3)：293-298</ref>. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operator O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinskih bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli na ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp<ref>William Henry Bothfeld, Grace Kapov, and Keith Tyo. A glucose-sensing toggle switch for autonomous, high productivity genetic control. ACS Synth. 2017, 6(7):1296-1304.</ref>.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzor:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB+LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za izražanje AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg+AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP+acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščenje ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T16:47:35Z

Nika Testen: /* Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA<ref>iGEM 2019 team SZPT China. Antihypertensive probiotic [citirano dne 16. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA</ref>

Avtorica povzetka: Nika Testen

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov <ref>Yang, J. Protein Structure Fingerprint Technology. Bioinform,Genomics,Proteomics.2018, 3(2):1-3.</ref><ref>Yang, J. Comprehensive description of protein structures using protein folding shape code. Proteins. 2008, 71:1497–1518.</ref>. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:''' 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref><ref>Ismail AKYOL, Ugur COMLEKCIOGLU, Asuman KARAKAS, et,al. Regulation of the acid inducible rcfB promoter in Lactococcus lactis subsp. Lactis. Annals of Microbiology. 2008, 58 (2): 269-273</ref>.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45<ref>Sun Qiangzheng, Xiong Yanwen, Ye Changyu, et, al. Construction of food-grade secretory expression vector and expression of reporter protein in Lactococcus lactis. Acta Microbiologica Sinica.2008,48(3)：293-298</ref>. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operator O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinskih bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli na ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp<ref>William Henry Bothfeld, Grace Kapov, and Keith Tyo. A glucose-sensing toggle switch for autonomous, high productivity genetic control. ACS Synth. 2017, 6(7):1296-1304.</ref>.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzor:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB+LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za izražanje AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg+AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP+acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščenje ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T16:46:59Z

Nika Testen: /* Izražanje gena NisI v L. Lactis MG1363 */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA<ref>iGEM 2019 team SZPT China. Antihypertensive probiotic [citirano dne 16. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA</ref>

Avtorica povzetka: Nika Testen

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov <ref>Yang, J. Protein Structure Fingerprint Technology. Bioinform,Genomics,Proteomics.2018, 3(2):1-3.</ref><ref>Yang, J. Comprehensive description of protein structures using protein folding shape code. Proteins. 2008, 71:1497–1518.</ref>. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:''' 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref><ref>Ismail AKYOL, Ugur COMLEKCIOGLU, Asuman KARAKAS, et,al. Regulation of the acid inducible rcfB promoter in Lactococcus lactis subsp. Lactis. Annals of Microbiology. 2008, 58 (2): 269-273</ref>.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45<ref>Sun Qiangzheng, Xiong Yanwen, Ye Changyu, et, al. Construction of food-grade secretory expression vector and expression of reporter protein in Lactococcus lactis. Acta Microbiologica Sinica.2008,48(3)：293-298</ref>. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operator O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinskih bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli na ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp<ref>William Henry Bothfeld, Grace Kapov, and Keith Tyo. A glucose-sensing toggle switch for autonomous, high productivity genetic control. ACS Synth. 2017, 6(7):1296-1304.</ref>.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzor:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB+LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za izražanje AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg+AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP+acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščenje ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T16:40:50Z

Nika Testen: /* Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA<ref>iGEM 2019 team SZPT China. Antihypertensive probiotic [citirano dne 16. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA</ref>

Avtorica povzetka: Nika Testen

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov <ref>Yang, J. Protein Structure Fingerprint Technology. Bioinform,Genomics,Proteomics.2018, 3(2):1-3.</ref><ref>Yang, J. Comprehensive description of protein structures using protein folding shape code. Proteins. 2008, 71:1497–1518.</ref>. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:''' 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref><ref>Ismail AKYOL, Ugur COMLEKCIOGLU, Asuman KARAKAS, et,al. Regulation of the acid inducible rcfB promoter in Lactococcus lactis subsp. Lactis. Annals of Microbiology. 2008, 58 (2): 269-273</ref>.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45<ref>Sun Qiangzheng, Xiong Yanwen, Ye Changyu, et, al. Construction of food-grade secretory expression vector and expression of reporter protein in Lactococcus lactis. Acta Microbiologica Sinica.2008,48(3)：293-298</ref>. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operator O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinskih bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp<ref>William Henry Bothfeld, Grace Kapov, and Keith Tyo. A glucose-sensing toggle switch for autonomous, high productivity genetic control. ACS Synth. 2017, 6(7):1296-1304.</ref>.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzor:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB+LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za izražanje AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg+AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP+acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščenje ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T16:38:41Z

Nika Testen: /* Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA<ref>iGEM 2019 team SZPT China. Antihypertensive probiotic [citirano dne 16. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA</ref>

Avtorica povzetka: Nika Testen

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov <ref>Yang, J. Protein Structure Fingerprint Technology. Bioinform,Genomics,Proteomics.2018, 3(2):1-3.</ref><ref>Yang, J. Comprehensive description of protein structures using protein folding shape code. Proteins. 2008, 71:1497–1518.</ref>. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:''' 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref><ref>Ismail AKYOL, Ugur COMLEKCIOGLU, Asuman KARAKAS, et,al. Regulation of the acid inducible rcfB promoter in Lactococcus lactis subsp. Lactis. Annals of Microbiology. 2008, 58 (2): 269-273</ref>.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45<ref>Sun Qiangzheng, Xiong Yanwen, Ye Changyu, et, al. Construction of food-grade secretory expression vector and expression of reporter protein in Lactococcus lactis. Acta Microbiologica Sinica.2008,48(3)：293-298</ref>. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinskih bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp<ref>William Henry Bothfeld, Grace Kapov, and Keith Tyo. A glucose-sensing toggle switch for autonomous, high productivity genetic control. ACS Synth. 2017, 6(7):1296-1304.</ref>.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzor:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB+LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za izražanje AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg+AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP+acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščenje ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T16:36:59Z

Nika Testen: /* Zaključek */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA<ref>iGEM 2019 team SZPT China. Antihypertensive probiotic [citirano dne 16. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA</ref>

Avtorica povzetka: Nika Testen

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov <ref>Yang, J. Protein Structure Fingerprint Technology. Bioinform,Genomics,Proteomics.2018, 3(2):1-3.</ref><ref>Yang, J. Comprehensive description of protein structures using protein folding shape code. Proteins. 2008, 71:1497–1518.</ref>. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:''' 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref><ref>Ismail AKYOL, Ugur COMLEKCIOGLU, Asuman KARAKAS, et,al. Regulation of the acid inducible rcfB promoter in Lactococcus lactis subsp. Lactis. Annals of Microbiology. 2008, 58 (2): 269-273</ref>.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45<ref>Sun Qiangzheng, Xiong Yanwen, Ye Changyu, et, al. Construction of food-grade secretory expression vector and expression of reporter protein in Lactococcus lactis. Acta Microbiologica Sinica.2008,48(3)：293-298</ref>. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinskih bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp<ref>William Henry Bothfeld, Grace Kapov, and Keith Tyo. A glucose-sensing toggle switch for autonomous, high productivity genetic control. ACS Synth. 2017, 6(7):1296-1304.</ref>.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzor:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB+LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za izražanje AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg+AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP+acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščenje ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T16:36:19Z

Nika Testen: /* Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA<ref>iGEM 2019 team SZPT China. Antihypertensive probiotic [citirano dne 16. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA</ref>

Avtorica povzetka: Nika Testen

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov <ref>Yang, J. Protein Structure Fingerprint Technology. Bioinform,Genomics,Proteomics.2018, 3(2):1-3.</ref><ref>Yang, J. Comprehensive description of protein structures using protein folding shape code. Proteins. 2008, 71:1497–1518.</ref>. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:''' 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref><ref>Ismail AKYOL, Ugur COMLEKCIOGLU, Asuman KARAKAS, et,al. Regulation of the acid inducible rcfB promoter in Lactococcus lactis subsp. Lactis. Annals of Microbiology. 2008, 58 (2): 269-273</ref>.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45<ref>Sun Qiangzheng, Xiong Yanwen, Ye Changyu, et, al. Construction of food-grade secretory expression vector and expression of reporter protein in Lactococcus lactis. Acta Microbiologica Sinica.2008,48(3)：293-298</ref>. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinskih bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp<ref>William Henry Bothfeld, Grace Kapov, and Keith Tyo. A glucose-sensing toggle switch for autonomous, high productivity genetic control. ACS Synth. 2017, 6(7):1296-1304.</ref>.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzor:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB+LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za izražanje AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg+AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP+acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T13:49:48Z

Nika Testen: /* Biokocke */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA<ref>iGEM 2019 team SZPT China. Antihypertensive probiotic [citirano dne 16. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA</ref>

Avtorica povzetka: Nika Testen

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov <ref>Yang, J. Protein Structure Fingerprint Technology. Bioinform,Genomics,Proteomics.2018, 3(2):1-3.</ref><ref>Yang, J. Comprehensive description of protein structures using protein folding shape code. Proteins. 2008, 71:1497–1518.</ref>. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:''' 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref><ref>Ismail AKYOL, Ugur COMLEKCIOGLU, Asuman KARAKAS, et,al. Regulation of the acid inducible rcfB promoter in Lactococcus lactis subsp. Lactis. Annals of Microbiology. 2008, 58 (2): 269-273</ref>.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45<ref>Sun Qiangzheng, Xiong Yanwen, Ye Changyu, et, al. Construction of food-grade secretory expression vector and expression of reporter protein in Lactococcus lactis. Acta Microbiologica Sinica.2008,48(3)：293-298</ref>. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp<ref>William Henry Bothfeld, Grace Kapov, and Keith Tyo. A glucose-sensing toggle switch for autonomous, high productivity genetic control. ACS Synth. 2017, 6(7):1296-1304.</ref>.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzor:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB+LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za izražanje AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg+AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP+acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T13:49:32Z

Nika Testen: /* Biokocke */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA<ref>iGEM 2019 team SZPT China. Antihypertensive probiotic [citirano dne 16. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA</ref>

Avtorica povzetka: Nika Testen

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov <ref>Yang, J. Protein Structure Fingerprint Technology. Bioinform,Genomics,Proteomics.2018, 3(2):1-3.</ref><ref>Yang, J. Comprehensive description of protein structures using protein folding shape code. Proteins. 2008, 71:1497–1518.</ref>. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:''' 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref><ref>Ismail AKYOL, Ugur COMLEKCIOGLU, Asuman KARAKAS, et,al. Regulation of the acid inducible rcfB promoter in Lactococcus lactis subsp. Lactis. Annals of Microbiology. 2008, 58 (2): 269-273</ref>.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45<ref>Sun Qiangzheng, Xiong Yanwen, Ye Changyu, et, al. Construction of food-grade secretory expression vector and expression of reporter protein in Lactococcus lactis. Acta Microbiologica Sinica.2008,48(3)：293-298</ref>. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp<ref>William Henry Bothfeld, Grace Kapov, and Keith Tyo. A glucose-sensing toggle switch for autonomous, high productivity genetic control. ACS Synth. 2017, 6(7):1296-1304.</ref>.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzor:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za izražanje AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg+AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP+acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T13:49:11Z

Nika Testen: /* Biokocke */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA<ref>iGEM 2019 team SZPT China. Antihypertensive probiotic [citirano dne 16. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA</ref>

Avtorica povzetka: Nika Testen

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov <ref>Yang, J. Protein Structure Fingerprint Technology. Bioinform,Genomics,Proteomics.2018, 3(2):1-3.</ref><ref>Yang, J. Comprehensive description of protein structures using protein folding shape code. Proteins. 2008, 71:1497–1518.</ref>. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:''' 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref><ref>Ismail AKYOL, Ugur COMLEKCIOGLU, Asuman KARAKAS, et,al. Regulation of the acid inducible rcfB promoter in Lactococcus lactis subsp. Lactis. Annals of Microbiology. 2008, 58 (2): 269-273</ref>.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45<ref>Sun Qiangzheng, Xiong Yanwen, Ye Changyu, et, al. Construction of food-grade secretory expression vector and expression of reporter protein in Lactococcus lactis. Acta Microbiologica Sinica.2008,48(3)：293-298</ref>. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp<ref>William Henry Bothfeld, Grace Kapov, and Keith Tyo. A glucose-sensing toggle switch for autonomous, high productivity genetic control. ACS Synth. 2017, 6(7):1296-1304.</ref>.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzor:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za izražanje AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg+AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T13:45:01Z

Nika Testen: /* Biokocke */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA<ref>iGEM 2019 team SZPT China. Antihypertensive probiotic [citirano dne 16. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA</ref>

Avtorica povzetka: Nika Testen

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov <ref>Yang, J. Protein Structure Fingerprint Technology. Bioinform,Genomics,Proteomics.2018, 3(2):1-3.</ref><ref>Yang, J. Comprehensive description of protein structures using protein folding shape code. Proteins. 2008, 71:1497–1518.</ref>. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:''' 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref><ref>Ismail AKYOL, Ugur COMLEKCIOGLU, Asuman KARAKAS, et,al. Regulation of the acid inducible rcfB promoter in Lactococcus lactis subsp. Lactis. Annals of Microbiology. 2008, 58 (2): 269-273</ref>.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45<ref>Sun Qiangzheng, Xiong Yanwen, Ye Changyu, et, al. Construction of food-grade secretory expression vector and expression of reporter protein in Lactococcus lactis. Acta Microbiologica Sinica.2008,48(3)：293-298</ref>. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp<ref>William Henry Bothfeld, Grace Kapov, and Keith Tyo. A glucose-sensing toggle switch for autonomous, high productivity genetic control. ACS Synth. 2017, 6(7):1296-1304.</ref>.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzor:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za izražanje AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T13:44:23Z

Nika Testen: /* Biokocke */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA<ref>iGEM 2019 team SZPT China. Antihypertensive probiotic [citirano dne 16. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA</ref>

Avtorica povzetka: Nika Testen

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov <ref>Yang, J. Protein Structure Fingerprint Technology. Bioinform,Genomics,Proteomics.2018, 3(2):1-3.</ref><ref>Yang, J. Comprehensive description of protein structures using protein folding shape code. Proteins. 2008, 71:1497–1518.</ref>. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:''' 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref><ref>Ismail AKYOL, Ugur COMLEKCIOGLU, Asuman KARAKAS, et,al. Regulation of the acid inducible rcfB promoter in Lactococcus lactis subsp. Lactis. Annals of Microbiology. 2008, 58 (2): 269-273</ref>.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45<ref>Sun Qiangzheng, Xiong Yanwen, Ye Changyu, et, al. Construction of food-grade secretory expression vector and expression of reporter protein in Lactococcus lactis. Acta Microbiologica Sinica.2008,48(3)：293-298</ref>. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp<ref>William Henry Bothfeld, Grace Kapov, and Keith Tyo. A glucose-sensing toggle switch for autonomous, high productivity genetic control. ACS Synth. 2017, 6(7):1296-1304.</ref>.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzor:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T10:39:35Z

Nika Testen:

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA<ref>iGEM 2019 team SZPT China. Antihypertensive probiotic [citirano dne 16. 04. 2020] https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA</ref>

Avtorica povzetka: Nika Testen

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov <ref>Yang, J. Protein Structure Fingerprint Technology. Bioinform,Genomics,Proteomics.2018, 3(2):1-3.</ref><ref>Yang, J. Comprehensive description of protein structures using protein folding shape code. Proteins. 2008, 71:1497–1518.</ref>. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:''' 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref><ref>Ismail AKYOL, Ugur COMLEKCIOGLU, Asuman KARAKAS, et,al. Regulation of the acid inducible rcfB promoter in Lactococcus lactis subsp. Lactis. Annals of Microbiology. 2008, 58 (2): 269-273</ref>.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45<ref>Sun Qiangzheng, Xiong Yanwen, Ye Changyu, et, al. Construction of food-grade secretory expression vector and expression of reporter protein in Lactococcus lactis. Acta Microbiologica Sinica.2008,48(3)：293-298</ref>. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp<ref>William Henry Bothfeld, Grace Kapov, and Keith Tyo. A glucose-sensing toggle switch for autonomous, high productivity genetic control. ACS Synth. 2017, 6(7):1296-1304.</ref>.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T10:37:18Z

Nika Testen:

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA<ref>https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA</ref>

Avtorica povzetka: Nika Testen

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov <ref>Yang, J. Protein Structure Fingerprint Technology. Bioinform,Genomics,Proteomics.2018, 3(2):1-3.</ref><ref>Yang, J. Comprehensive description of protein structures using protein folding shape code. Proteins. 2008, 71:1497–1518.</ref>. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:''' 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref><ref>Ismail AKYOL, Ugur COMLEKCIOGLU, Asuman KARAKAS, et,al. Regulation of the acid inducible rcfB promoter in Lactococcus lactis subsp. Lactis. Annals of Microbiology. 2008, 58 (2): 269-273</ref>.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45<ref>Sun Qiangzheng, Xiong Yanwen, Ye Changyu, et, al. Construction of food-grade secretory expression vector and expression of reporter protein in Lactococcus lactis. Acta Microbiologica Sinica.2008,48(3)：293-298</ref>. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp<ref>William Henry Bothfeld, Grace Kapov, and Keith Tyo. A glucose-sensing toggle switch for autonomous, high productivity genetic control. ACS Synth. 2017, 6(7):1296-1304.</ref>.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T10:35:21Z

Nika Testen: /* Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

Avtorica povzetka: Nika Testen

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov <ref>Yang, J. Protein Structure Fingerprint Technology. Bioinform,Genomics,Proteomics.2018, 3(2):1-3.</ref><ref>Yang, J. Comprehensive description of protein structures using protein folding shape code. Proteins. 2008, 71:1497–1518.</ref>. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:''' 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR 
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref><ref>Ismail AKYOL, Ugur COMLEKCIOGLU, Asuman KARAKAS, et,al. Regulation of the acid inducible rcfB promoter in Lactococcus lactis subsp. Lactis. Annals of Microbiology. 2008, 58 (2): 269-273</ref>.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45<ref>Sun Qiangzheng, Xiong Yanwen, Ye Changyu, et, al. Construction of food-grade secretory expression vector and expression of reporter protein in Lactococcus lactis. Acta Microbiologica Sinica.2008,48(3)：293-298</ref>. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp<ref>William Henry Bothfeld, Grace Kapov, and Keith Tyo. A glucose-sensing toggle switch for autonomous, high productivity genetic control. ACS Synth. 2017, 6(7):1296-1304.</ref>.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T10:34:40Z

Nika Testen:

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

Avtorica povzetka: Nika Testen

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov <ref>Yang, J. Protein Structure Fingerprint Technology. Bioinform,Genomics,Proteomics.2018, 3(2):1-3.</ref><ref>Yang, J. Comprehensive description of protein structures using protein folding shape code. Proteins. 2008, 71:1497–1518.</ref>. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref><ref>Ismail AKYOL, Ugur COMLEKCIOGLU, Asuman KARAKAS, et,al. Regulation of the acid inducible rcfB promoter in Lactococcus lactis subsp. Lactis. Annals of Microbiology. 2008, 58 (2): 269-273</ref>.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45<ref>Sun Qiangzheng, Xiong Yanwen, Ye Changyu, et, al. Construction of food-grade secretory expression vector and expression of reporter protein in Lactococcus lactis. Acta Microbiologica Sinica.2008,48(3)：293-298</ref>. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp<ref>William Henry Bothfeld, Grace Kapov, and Keith Tyo. A glucose-sensing toggle switch for autonomous, high productivity genetic control. ACS Synth. 2017, 6(7):1296-1304.</ref>.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Seminarji SB 2019/20

2020-04-20T10:34:08Z

Nika Testen:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 

21.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije] (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 

22.4. 
1 Milica Janković 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Antihipertenzivni_probiotik_-_nov_pristop_zni%C5%BEevanja_krvnega_tlaka Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka] (Nika Testen) 
3 Ana Obaha 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 

5.5. 
1 Ajda Lenardič 
2 Jelena Štrbac 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
4 Uroš Prešern 

6.5. 
1 Sara Korošec 
2 Peter Škrinjar 
3 Luka Gregorič 
4 Urban Hribar 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
3 Daria Latysheva 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Seminarji SB 2019/20

2020-04-20T10:33:03Z

Nika Testen:

V študijskem letu 2019/20 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
Primer: 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu so možni največ 4 seminarji; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar):

15.4. 
1 [[Robustno večcelično računanje z uporabo gensko kodiranih vrat NE-ALI in kemičnih 'žic']] (Tanja Zupan) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PETEXE_-_sistem_za_filtracijo_mikroplastike_v_pralnih_strojih PETEXE - sistem za filtracijo mikroplastike v pralnih strojih]
(Lana Vogrinec) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Magi.Coli:_sinteza_psilocibina_s_pomo%C4%8Djo_E.coli Magi.Coli: sinteza psilocibina s pomočjo ''E.coli''] (Luka Lavrič) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SONOBE_-_proteinski_sistem_za_agregacijo_mikroplastike SONOBE - proteinski sistem za agregacijo mikroplastike] (Vesna Podgrajšek) 

21.4. 
1 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_real_MVP:_ekspresijski_sistem_za_pripravo_modularnih_virusom_podobnih_delcev The real MVP: ekspresijski sistem za pripravo modularnih virusom podobnih delcev] (Žiga Vičič) 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1inorina%2C_naravne_za%C5%A1%C4%8Dite_pred_soncem%2C_z_uporabo_cianobakterije Proizvodnja šinorina, naravne zaščite pred soncem, z uporabo cianobakterije] (Tina Turel) 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prenos_informacije_med_bakterijami_v_sesalskem_%C4%8Drevesju_z_uporabo_sistema_zaznavanja_gostote_populacije] (Anže Jenko) 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BI%28OIL%29OGICAL_FACTORY_-_sistem_za_proizvodnjo_sestavin_palmovega_olja_v_mikroalgi BI(OIL)OGICAL FACTORY - sistem za proizvodnjo sestavin palmovega olja v mikroalgi](Dunia Sahir) 

22.4. 
1 Milica Janković 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Antihipertenzivni_probiotik_-_nov_pristop_zni%C5%BEevanja_krvnega_tlaka#Samomorilni_mehanizem Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka] (Nika Testen) 
3 Ana Obaha 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ProQuorum:_probiotik_kot_zdravilo_proti_okužbi_s_C._difficile ProQuorum: probiotik kot zdravilo proti okužbi s ''C. difficile''] (Ana Maklin) 

5.5. 
1 Ajda Lenardič 
2 Jelena Štrbac 
3 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Programabilni_enocelični_sesalski_bioračunalniki Programabilni enocelični sesalski bioračunalniki] (Andreja Habič) 
4 Uroš Prešern 

6.5. 
1 Sara Korošec 
2 Peter Škrinjar 
3 Luka Gregorič 
4 Urban Hribar 

12.5. 
1 Jerneja Nimac 
2 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Orodje_za_modularno_sestavljanje_večgenskih_konstruktov_v_kvasovki: Orodje za modularno sestavljanje večgenskih konstruktov v kvasovki] (Katja Doberšek) 
3 Daria Latysheva 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_klonirni_sistem_MoClo_za_biološko_sintezo_v_mikroalgi_C._reinhardtii Modularni klonirni sistem MoClo za biološko sintezo v mikroalgi ''C. reinhardtii''] (Veronika Razpotnik) 

13.5. 
1 Ines Medved 
2 Željka Erić 
3 Patricija Miklavc 
4 [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In%C5%BEenirsko_pripravljeni_promotorji%2C_ki_omogo%C4%8Dajo_izra%C5%BEanje_ne_glede_na_%C5%A1tevilo_kopij Inženirsko pripravljeni promotorji, ki omogočajo izražanje ne glede na število kopij] (Benjamin Malovrh) 

19.5. 
1 Samo Purič 
2 Sara Jereb 
3 Primož Bembič 
4 Andrej Race 

20.5. 
1 Katja Malenšek 
2 Vid Modic 
3 Andrej Ivanovski 
4 Maja Globočnik 

26.5. 
1 Nika Zaveršek 
2 Janina Gea Cvikl 
3 
4 

27.5. Rezervni termin 
1 
2 
3 
4

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T10:27:59Z

Nika Testen: /* Samomorilni mehanizem */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov <ref>Yang, J. Protein Structure Fingerprint Technology. Bioinform,Genomics,Proteomics.2018, 3(2):1-3.</ref><ref>Yang, J. Comprehensive description of protein structures using protein folding shape code. Proteins. 2008, 71:1497–1518.</ref>. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref><ref>Ismail AKYOL, Ugur COMLEKCIOGLU, Asuman KARAKAS, et,al. Regulation of the acid inducible rcfB promoter in Lactococcus lactis subsp. Lactis. Annals of Microbiology. 2008, 58 (2): 269-273</ref>.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45<ref>Sun Qiangzheng, Xiong Yanwen, Ye Changyu, et, al. Construction of food-grade secretory expression vector and expression of reporter protein in Lactococcus lactis. Acta Microbiologica Sinica.2008,48(3)：293-298</ref>. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp<ref>William Henry Bothfeld, Grace Kapov, and Keith Tyo. A glucose-sensing toggle switch for autonomous, high productivity genetic control. ACS Synth. 2017, 6(7):1296-1304.</ref>.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T10:27:19Z

Nika Testen: /* Regulacija izražanja AHP */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov <ref>Yang, J. Protein Structure Fingerprint Technology. Bioinform,Genomics,Proteomics.2018, 3(2):1-3.</ref><ref>Yang, J. Comprehensive description of protein structures using protein folding shape code. Proteins. 2008, 71:1497–1518.</ref>. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref><ref>Ismail AKYOL, Ugur COMLEKCIOGLU, Asuman KARAKAS, et,al. Regulation of the acid inducible rcfB promoter in Lactococcus lactis subsp. Lactis. Annals of Microbiology. 2008, 58 (2): 269-273</ref>.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45<ref>Sun Qiangzheng, Xiong Yanwen, Ye Changyu, et, al. Construction of food-grade secretory expression vector and expression of reporter protein in Lactococcus lactis. Acta Microbiologica Sinica.2008,48(3)：293-298</ref>. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T10:26:11Z

Nika Testen: /* Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov <ref>Yang, J. Protein Structure Fingerprint Technology. Bioinform,Genomics,Proteomics.2018, 3(2):1-3.</ref><ref>Yang, J. Comprehensive description of protein structures using protein folding shape code. Proteins. 2008, 71:1497–1518.</ref>. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref>.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45<ref>Sun Qiangzheng, Xiong Yanwen, Ye Changyu, et, al. Construction of food-grade secretory expression vector and expression of reporter protein in Lactococcus lactis. Acta Microbiologica Sinica.2008,48(3)：293-298</ref>. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T10:22:36Z

Nika Testen: /* Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov <ref>Yang, J. Protein Structure Fingerprint Technology. Bioinform,Genomics,Proteomics.2018, 3(2):1-3.</ref><ref>Yang, J. Comprehensive description of protein structures using protein folding shape code. Proteins. 2008, 71:1497–1518.</ref>. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref>.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T10:19:36Z

Nika Testen: /* Regulacija izražanja AHP */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref>.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T10:18:59Z

Nika Testen: /* Regulacija izražanja AHP */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen <ref>Ke Liu, et al. The sensitivity and significance analysis of parameters in the model of pH regulation on lactic acid production by Lactobacillus bulgaricus. [J] BMC Bioinformatics 2014, 15(Suppl 13):S5.</ref>.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T10:16:28Z

Nika Testen: /* Uvod */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu <ref>Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013</ref>. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T10:15:21Z

Nika Testen: /* Viri */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
<references/>

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T10:14:02Z

Nika Testen: /* Viri */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==
[1] Global Overview of Hypertension. World Health Organization. 2013

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T10:08:17Z

Nika Testen: /* Izražanje gena NisI v L. Lactis MG1363 */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom pri vseh koncentracijah znatno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se s povečevanjem koncentracije nisina tudi rast bakterij MG1363 z vektorjem pMG36N zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T10:01:00Z

Nika Testen: /* Izražanje gena NisI v L. Lactis MG1363 */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z dodanimi različnimi koncentracijami nisina (od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL). Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom močno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se pri povečevanju koncentracije nisina tudi rast tega seva zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T09:55:57Z

Nika Testen: /* Izražanje gena NisI v L. Lactis MG1363 */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z od 0 enot/mL do 100 enot/mL s korakom po 10 enot/mL nisina. Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom močno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se pri povečevanju koncentracije nisina tudi rast tega seva zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T09:53:08Z

Nika Testen: /* Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski organizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z od 0 do 100 s korakom po 10 enot/ml nisina. Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom močno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se pri povečevanju koncentracije nisina tudi rast tega seva zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T09:52:56Z

Nika Testen: /* Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski sistem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z od 0 do 100 s korakom po 10 enot/ml nisina. Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom močno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se pri povečevanju koncentracije nisina tudi rast tega seva zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T09:36:55Z

Nika Testen: /* Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski mehanizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z od 0 do 100 s korakom po 10 enot/ml nisina. Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom močno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se pri povečevanju koncentracije nisina tudi rast tega seva zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T09:33:56Z

Nika Testen: /* Regulacija izražanja AHP */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo pH-uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski mehanizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z od 0 do 100 s korakom po 10 enot/ml nisina. Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom močno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se pri povečevanju koncentracije nisina tudi rast tega seva zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T09:31:19Z

Nika Testen: /* Regulacija izražanja AHP */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, ti pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo pH-uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski mehanizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z od 0 do 100 s korakom po 10 enot/ml nisina. Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom močno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se pri povečevanju koncentracije nisina tudi rast tega seva zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T09:29:58Z

Nika Testen: /* Regulacija izražanja AHP */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotik. Uporabnik probiotike zaužije, nato pa se ti kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM.

Za regulacijo izražanja rekombinantnega proteina AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo pH-uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski mehanizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z od 0 do 100 s korakom po 10 enot/ml nisina. Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom močno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se pri povečevanju koncentracije nisina tudi rast tega seva zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T09:24:43Z

Nika Testen: /* Uvod */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Za regulacijo izražanja rekombinantnega proteina AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo pH-uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski mehanizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z od 0 do 100 s korakom po 10 enot/ml nisina. Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom močno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se pri povečevanju koncentracije nisina tudi rast tega seva zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T09:12:21Z

Nika Testen: /* Zaključek */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično zdravilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Za regulacijo izražanja rekombinantnega proteina AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo pH-uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski mehanizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z od 0 do 100 s korakom po 10 enot/ml nisina. Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom močno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se pri povečevanju koncentracije nisina tudi rast tega seva zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T09:11:43Z

Nika Testen: /* Zaključek */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično zdravilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Za regulacijo izražanja rekombinantnega proteina AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo pH-uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski mehanizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z od 0 do 100 s korakom po 10 enot/ml nisina. Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom močno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se pri povečevanju koncentracije nisina tudi rast tega seva zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni ''in vitro'' aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. Načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.

== Viri ==

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T08:45:13Z

Nika Testen: /* Samomorilni mehanizem */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično zdravilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Za regulacijo izražanja rekombinantnega proteina AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo pH-uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski mehanizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z od 0 do 100 s korakom po 10 enot/ml nisina. Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom močno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se pri povečevanju koncentracije nisina tudi rast tega seva zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena ''acmA,'' ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp.

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

== Viri ==

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T08:44:00Z

Nika Testen: /* Izražanje gena NisI v L. Lactis MG1363 */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično zdravilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Za regulacijo izražanja rekombinantnega proteina AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo pH-uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski mehanizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z od 0 do 100 s korakom po 10 enot/ml nisina. Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom močno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen ''nisI,'' ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se pri povečevanju koncentracije nisina tudi rast tega seva zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To sproži promotor T-αcrp, da spodbudi izražanje gena ''acmA.''

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

== Viri ==

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T08:40:07Z

Nika Testen: /* Izražanje gena NisI v L. Lactis MG1363 */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično zdravilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Za regulacijo izražanja rekombinantnega proteina AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo pH-uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski mehanizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z od 0 do 100 s korakom po 10 enot/ml nisina. Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e močno inhibirana v gojišču GM17 z nisinom. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da je gen ''nisI,'' ki kodira lipoprotein nisin, izražen v MG1363 in daje odpornost na nisin v tem sevu. Vseeno pa se pri povečevanju koncentracije nisina tudi rast tega seva zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To sproži promotor T-αcrp, da spodbudi izražanje gena ''acmA.''

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

== Viri ==

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T08:39:46Z

Nika Testen: /* Izražanje gena NisI v L. Lactis MG1363 */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično zdravilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Za regulacijo izražanja rekombinantnega proteina AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo pH-uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski mehanizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medij GM17 z od 0 do 100 s korakom po 10 enot/ml nisina. Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e močno inhibirana v gojišču GM17 z nisinom. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da je gen ''nisI,'' ki kodira lipoprotein nisin, izražen v MG1363 in daje odpornost na nisin v tem sevu. Vseeno pa se pri povečevanju koncentracije nisina tudi rast tega seva zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To sproži promotor T-αcrp, da spodbudi izražanje gena ''acmA.''

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

== Viri ==

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T08:38:03Z

Nika Testen: /* Izražanje gena NisI v L. Lactis MG1363 */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično zdravilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Za regulacijo izražanja rekombinantnega proteina AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo pH-uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski mehanizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu ''nisI'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči, odporni na nisin, ne pa tudi na tisti, odporni na eritromicin, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medij GM17 z od 0 do 100 s korakom po 10 enot/ml nisina. Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e močno inhibirana v gojišču GM17 z nisinom. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da je gen ''nisI,'' ki kodira lipoprotein nisin, izražen v MG1363 in daje odpornost na nisin v tem sevu. Vseeno pa se pri povečevanju koncentracije nisina tudi rast tega seva zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To sproži promotor T-αcrp, da spodbudi izražanje gena ''acmA.''

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

== Viri ==

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T08:34:23Z

Nika Testen: /* Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično zdravilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Za regulacijo izražanja rekombinantnega proteina AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo pH-uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski mehanizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost na eritromicin originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost na nisin ''nisI.'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči, odporni na nisin, ne pa tudi na tisti, odporni na eritromicin, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medij GM17 z od 0 do 100 s korakom po 10 enot/ml nisina. Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e močno inhibirana v gojišču GM17 z nisinom. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da je gen ''nisI,'' ki kodira lipoprotein nisin, izražen v MG1363 in daje odpornost na nisin v tem sevu. Vseeno pa se pri povečevanju koncentracije nisina tudi rast tega seva zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To sproži promotor T-αcrp, da spodbudi izražanje gena ''acmA.''

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

== Viri ==

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T08:33:55Z

Nika Testen: /* Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično zdravilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Za regulacijo izražanja rekombinantnega proteina AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo pH-uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski mehanizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do ekspresije pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost na eritromicin originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost na nisin ''nisI.'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči, odporni na nisin, ne pa tudi na tisti, odporni na eritromicin, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medij GM17 z od 0 do 100 s korakom po 10 enot/ml nisina. Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e močno inhibirana v gojišču GM17 z nisinom. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da je gen ''nisI,'' ki kodira lipoprotein nisin, izražen v MG1363 in daje odpornost na nisin v tem sevu. Vseeno pa se pri povečevanju koncentracije nisina tudi rast tega seva zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To sproži promotor T-αcrp, da spodbudi izražanje gena ''acmA.''

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

== Viri ==

Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

2020-04-20T08:32:24Z

Nika Testen: /* Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah */

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

== Uvod ==
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično zdravilo.

== Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov ==

Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. ''protein structure fingerprinting technology).'' Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo ''in vitro'' aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

'''Aminokislinsko zaporedje AHPM:'''

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR

== Regulacija izražanja AHP ==

Za regulacijo izražanja rekombinantnega proteina AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi ''in vivo.'' Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.

== Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah ==

Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v ''E. Coli'' in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.

A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo pH-uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.

Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo ''Lactococcus Lactis.'' Ta predstavlja dober gostiteljski mehanizem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.

Za določevanje ''in vitro'' aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.

Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v različnih pH medijih. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do ekspresije pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.

== Izražanje gena ''NisI'' v ''L. Lactis'' MG1363 ==
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost na eritromicin originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost na nisin ''nisI.'' in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.

Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči, odporni na nisin, ne pa tudi na tisti, odporni na eritromicin, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.

Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medij GM17 z od 0 do 100 s korakom po 10 enot/ml nisina. Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e močno inhibirana v gojišču GM17 z nisinom. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da je gen ''nisI,'' ki kodira lipoprotein nisin, izražen v MG1363 in daje odpornost na nisin v tem sevu. Vseeno pa se pri povečevanju koncentracije nisina tudi rast tega seva zmanjšuje.

== Samomorilni mehanizem ==

Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije ''L. Lactis.'' Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To sproži promotor T-αcrp, da spodbudi izražanje gena ''acmA.''

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

== Biokocke ==

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) '''biokocke za pH senzorje:''' promotor PrcfB [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142000 (Ba_K3142000)], laktozni operator O1/O2 [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142001 (BBa_K3142001)], Lac represor LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142015 (BBa_K3142015)] in sestavljena biokocka PrcfB + LacR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142002 (BBa_K3142002)],

(II) '''biokocke za ekspresijo AHP:''' argininski linker FR [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142003 (Ba_K3142003)], 11S globulin iz amaranta A11Sg [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142004 (Ba_K3142004)], antihipertenzivni peptidi VY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142005 (Ba_K3142005)], IPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142006 (Ba_K3142006)], VPP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142007 (Ba_K3142007)], KYLCY [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142008 (Ba_K3142008)] in FKGKYYP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142009 (Ba_K3142009)], sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142010 (Ba_K3142010)] ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142011 (Ba_K3142011)] in

(III) '''biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij:''' promotor PT-αCRP [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142012 (Ba_K3142012)], N-acetilmuramidaza acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142013 (Ba_K3142013)] in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA [http://parts.igem.org/Part:BBa_K3142014 (Ba_K3142014)].

== Zaključek ==

== Viri ==