https://wiki.fkkt.uni-lj.si/api.php?action=feedcontributions&feedformat=atom&user=Nika+Tomsi%C4%8D 2026-04-10T13:01:21Z User contributions MediaWiki 1.39.3 https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MonChassis&diff=21726 2023-04-04T10:21:36Z

<p>Nika Tomsič: </p> <hr /> <div>Svet se trenutno sooča z velikimi globalnimi težavami, zato je potrebno iskanje novih, trajnostnih rešitev. Poseben razred z obetajočimi aplikacijami so monoterpenoidi. Monoterpenoidi imajo širok spekter uporabe, na primer v kozmetiki, medicini, zatiranju škodljivcev, živilski industriji in biogorivih. Toda obsežna uporaba monoterpenoidov je redka zaradi cene in časa, ki so potrebni za njihovo pripravo. Skupina iGem iz Muenstera je leta 2022 raziskovala možnost njihove sinteze v kvasovkah. Predstavitev projekta je dostopna na sledeči povezavi: https://2022.igem.wiki/wwu-muenster/.<br /> <br /> <br /> == PROIZVODNJA MONOTERPENOIDOV ==<br /> <br /> <br /> === Ekstrakcija iz rastlin ===<br /> <br /> <br /> Primarni vir monoterpenoidov so rastline, kjer imajo pomembno vlogo v številnih fizioloških procesih. Rastlinska eterična olja vsebujejo več kot 80 % monoterpenoidov, vendar ima ekstrakcija eteričnih olj iz rastlin nizek izkoristek. Poleg tega je zaradi kompleksnosti eteričnih olj čiščenje posameznih monoterpenoidov stroškovno obsežno, naporno in neučinkovito. Sestava je namreč odvisna od pogojev rasti rastlin in njihovega shranjevanja &lt;ref&gt;[1]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Kemijska sinteza: ===<br /> <br /> Kemijska sinteza je bolj zanesljiva možnost za proizvajanje monoterpenov. Priprava enostavnih molekul je možna, medtem ko se cena in potrebna energija večata z večanjem kompleksnosti molekule. Poleg tega pe je kemijska sinteza okolju neprijazna zaradi onesnažujočih topil in katalizatorjev ter je včasih odvisna od neobnovljivih virov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v bakterijah ===<br /> <br /> <br /> Bakterije so pogosto prva izbira za proizvodnjo kemikalij ''in vivo'', saj je taka proizvodnja hitra in poceni. Za proizvodnjo monoterpenoidov pa ima delo z bakterijami več pomanjkljivosti. Prvič, obstaja pomanjkanje prekurzorja geranil difosfata (GPP) v bakterijskem gostitelju. Za povečanje sinteze je treba celotno pot mevalonata preoblikovati v bakterije&lt;ref&gt;[3]&lt;/ref&gt;. Drugič, koraki monoterpenoidne biosinteze zahtevajo funkcionalno izražanje CYP, kar je izziv pri bakterijah&lt;ref&gt;[4]&lt;/ref&gt;. Tretjič, tudi če se vsi heterologni geni lahko funkcionalno izrazijo, proizvodnja monoterpenoidov z bakterijami morda ne bo učinkovita. Kopičenje prekurzorjev vodi do zmanjšane rasti celic, različni monoterpenoidi pa imajo toksične učinke na bakterije z motnjami v celični membrani&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v kvasovkah ===<br /> <br /> <br /> Kvasovke predstavljajo privlačno alternativo za proizvodnjo monoterpenoidov. Kvasovke imajo pot endogenega mevalonata (MVA), pri kateri se GPP, predhodnik vseh monoterpenoidov, hitro pretvori v farnezil difosfat (FPP)&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Druga omejitev pri proizvodnji monoterpenoidov s kvasom je toksičnost proizvoda, ki lahko omeji količino proizvodnje&lt;ref&gt;[6]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> == MON CHASSIS ==<br /> <br /> MonChassis je prilagodljiva platforma na osnovi kvasovk za obsežno proizvodnjo monoterpenoidov. Temelji na pripravi terpenskih prekurzorjev v kvasovkah z uporabo sinteznobiološkega inženiringa ter s katalizo v končne produkte z brezceličnim sistemov encima CYP. Raziskovana je bila proizvodnja v ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica'' s spremembo moči promotorjev ključnih encimov in uvedbo novih zapisov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Monoterpenoide se lahko učinkovito sintetizira z modifikacijo mevalonantne poti kvasovk&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Da bi povečali presnovni tok poti MVA, je bilo identificiranih in optimiziranih več pomembnih encimov, ki omejujejo hitrost poti. Z uvedbo dodatnih heterolognih genov in utišanjem endogenih genov je možno optimizirati proizvodnjo monoterpenoidov. Glavni cilj je bil povečati proizvodnjo geranil difosfata (GPP) v ''Saccharomyces cerevisiae'', saj deluje kot bistveni prekurzor za sintezo monoterpenoidov, kot je α-pinen. Med temi sta najbolj omejujoča ERG13 in 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A (tHMGR). Če gena za ta encima prekomerno izrazimo, se poveča tudi proizvodnja prekurzorjev monoterpenoidov.&lt;br /&gt;<br /> Dodatna skupna omejitev modelov je sinteza ergosterola iz GPP, iz katerega nastajajo tudi prekurzorji monoterpenoidov. Ker je sinteza ergosterola nujna za celično rast, bodo modeli, ki temeljijo na endogeni poti MVA kvasovk, vedno omejeni v svojih donosih. Zaradi tega je bila preverjena učinkovitost proizvodnje tudi v peroksisomih, ker bi tako bila proizvodnja monoterpenoidov in ergosterola ločena. Peroksisomi predstavljajo zagotavljajo ugodne fiziološke pogoje za sintezo prekurzorjev monoterpenoidov&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;. Usmerjanje encimov v peroksisome je mogoče zlahka doseči z dodajanjem tripeptida C-terminalnega peroksisomskega ciljnega signala-1 (PTS1)&lt;ref&gt;[8]&lt;/ref&gt;. Skupaj se je preverjalo učinkovitost proizvodnje v citosolu in v peroksisomu bodisi v organizmih ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica''. &lt;br /&gt;<br /> MonChassis je sestavljena iz dveh komponent: sestava prekurzorjev terpenov v kvasovkah in in vitro kataliza spremembe prekurzerjev v monoterpenoide. V ta namen MonChassis uporablja samozasnovan bioreaktor za encimsko elektrosintezo (BREES) in modificirano citokrom P450 monooksigenazo BM3. Kot dokaz delovanja je potekla kataliza reakcije iz α-pinena v verbenon.<br /> <br /> <br /> == BREES ==<br /> <br /> Najlažji način za spopadanje s toksičnostjo produktov je uporaba brezceličnih sistemov. Tradicionalna biokataliza brez celic zahteva dodajanje kofaktorjev, kot je NADPH, ki zvišuje stroške za obsežne aplikacije. Da bi bila komponenta MonChassis ''in vitro'' uporabna v industrijskem obsegu je bilo potrebno razviti poceni alternativa. Zato je bil sestavljen BREES, bioreaktor za encimsko elektrosintezo. BM3, znan tudi kot citokrom P450 BM3 ali CYP102A1, je bakterijski encim citokroma P450, pridobljen iz ''Bacillus megaterium''. Je vsestranski encim z aktivnostmi monooksigenaze in hidroksilaze maščobnih kislin. Čeprav ni neposredno vpleten v proizvodnjo terpenoidov, so bili BM3 in njegove različice uporabljeni kot biokatalizatorji za modificiranje terpenoidnih spojin. Raziskovalci so izdelali BM3 in druge encime citokroma P450 za uvedbo hidroksilnih skupin, epoksidov ali drugih funkcionalnih skupin v terpenoidne molekule, kar omogoča katalizo α-pinena v končne monoterpenoide. Modificiran encim ima dodan peptidni povezovalec, ki lahko imobilizira encim na elektrodo iz indijevega kositrovega oksida in omogoči neposreden prenos elektronov z elektrode na encim&lt;ref&gt;[9]&lt;/ref&gt;. Encim lahko uporablja elektrone neposredno iz električne energije in ne zahteva dovajanja drugih kofaktorjev. V kombinaciji z inženirskimi sevi kvasovk MonChassis BREES omogoča hitro, prilagodljivo in obsežno proizvodnjo monoterpenoidov.<br /> <br /> <br /> == STRATEGIJA KLONIRANJA ==<br /> <br /> <br /> Po uradnih pravilih iGEM je bilo splošno kloniranje izvedeno v skladu z modularnim sistemom kloniranja RFC1000 (MoClo).<br /> Sistem MoClo se opira na restrikcijske encime tipa IIS, ki cepijo DNA tako, da nastanejo lepljivi konci. Ustvarjanje različnih koncev pri različnih fragmentih omogoča učinkovito sestavljanje več fragmentov DNA v eni preprosti reakciji ligacije. Primerna zasnova koncev omogoča, da se fragmenti sestavljajo samo v vnaprej določenem vrstnem redu. Vsi geni so bili pomnoženi z začetno verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo specifičnih začetnih oligonukleotidov z ustreznimi pritrjenimi konci.&lt;br /&gt;<br /> Končni zapisi so bil sestavljeni z metodo Golden Gate v vektor pSB1C00. V vektor so dovajali zapis transkripcijskih enot, ki so ga sestavljali promotorji, kodirno zaporedje in terminator. Z uporabo različnih promotorjev je bila mogoča sprememba ravni izražanja genov. Uspešno integracijo so preverili s selekcijo transformiranih kolonij, saj so celice konstitutivno izražale rdeči fluorescenčni protein (mRFP1).&lt;br /&gt;<br /> <br /> Za transformacijo kvasovk sta bili uporabljeni metodi Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-assotiated protein 9 (CRISPR-Cas9) in uporaba ekstrakromosomskih prenosljivih vektorjev. Vsak vektor vsebuje enega od štirih različnih selekcijskih markerjev (HIS3, TRP1, LEU2 ali URA3) za genomsko integracijo.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> Mevalonatna pot ''Saccharomyces cerevisiae'' so spremenili z metodo Golden Gate Assembly in ustavili heterolognega gena PptAPS ter povečali izražanje endogenih genov ScERG13 ali SctHMGR.&lt;br /&gt;<br /> Genske spremembe so temlejile na sistemu CRISPR-Cas9. Z namenom povečanja koncentracije mevalonata sta bila utišana ScROX1 in ScERG13 ter SctHMGR uravnavan z močnim promotorjem. Izločitev ScROX1 je bila ugodna za povečanje koncentracije mevalonata, saj zavira encime v MVA&lt;ref&gt;[10]&lt;/ref&gt;. Pri drugi varianti sta bila uvedena gena GgmFPS144 iz ''Gallus gallus'' in AgtGPPS2 iz ''Abies grandis'', da bi povečali koncentracijo geranil difosfata (GPP). Izločitev ScERG20 in vstavljanje GgmFPS144 sta bila potrebna za zaviranje reakcije GPP v (FPP)&lt;ref&gt;[11]&lt;/ref&gt;. Uvedba heterologne α-pinen sintaze (PptAPS) iz ''Pinus ponderosa'' je povečala proizvodnjo α-pinena v citosolu.&lt;br /&gt;<br /> Analiza z GC-MS je potrdila prisotnost α-pinena v lizatu.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v peroksisomih ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> Poleg citosola je peroksisom postal obetavna tarča za presnovni inženiring, saj naj bi njegove fiziološke lastnosti, kot je razpoložljivost substrata, znatno izboljšale sintezo produkta&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;.&lt;br /&gt;<br /> Ker se metabolizem mevalonata ne pojavlja naravno v peroksisomih&lt;ref&gt;[12]&lt;/ref&gt;, je bilo treba v vsak sev kvasovk pod nadzorom konstitutivnega promotorja pADH vključiti potrebne gene ScERG13, SctHMGR, ScERG12, ScERG8 in ScERG19, spojene s PTS1. V različnih primerih so v zapis vključili sintazo SltNPPS1 iz ''Solanum lycopersicum'', kar omogoča proizvodnjo monoterpenoidnega prekurzorja neril difosfata (NPP), ali heterologna gena GgmFPS144 in AgtGPPS2 iz ''Gallus gallus'' oziroma ''Abies grandis'', kar omogoča proizvodnjo NPP, strukturnega izomera geranil difosfata (GPP). V obeh primerih je bil dodan še zapis za PptAPS, ki katalizira reakcijo NPP ali GPP v α-pinen. Povečanje izražanja ScERG13 in SctHMGR je poteklo z uporabo promotorja ScpTEF.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Za primerjavo brezcelične proizvodnje verbenona v in vitro poskusih so pripravili tudi sev kvasovk, ki vsebuje citokrom P450 monooksigenazo (CYP) limonen-3-hidroksilazo (L3H) za sintezo verbenona iz α-pinena.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Končna ocena spremenjenih sevov kvasovk je bila izvedena s kvantifikacijo z uporabo GC-MS analize, ki je potrdila prisotnost α-pinena v obeh variantah kvasovk. <br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> ''Yarrowia lipolytica'' je obetaven organizem za sintezo monoterpenoidov, saj vsebuje visoko koncentracijo acetil-CoA, je sposoben učinkovito kopičiti lipide in kaže visoko toleranco do monoterpenoidov. Za izražanje terpinoidnih prekurzorjev v ''Yarrowia lipolytica'' so izrazili gena SctHMGR in ScERG13 organizma Saccharomyces cerevisiae. Uvedba genov AgtGPPS2 in GgMFPS144 bi pomenili zmanjšano količino proizvedenega farnezil pirofosfata (FPP) in povečano količino geranil pirofosfata (GPP). Drugi poskus je predvideval zmanjšanje količine proizvedenega FPP. To so poskušali narediti z uvedbo SltNPPS1 za proizvodnjo neril pirofosfata (NPP). Dodan je bil še gen PptAPS za proizvodnjo α-pinena.&lt;br /&gt;<br /> <br /> cPCR nikoli ni pokazal uspešne vstavitve genov, temveč so opazili le dolžine, ki bi jih pričakovali od prvotnega genomskega zaporedja. Zaradi časovnih omejitev pa poskus ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> ''Y. lipolytica'' je zaradi njegovega obsežnega metabolizma maščobnih kislin zanimiv organizem za peroksisomsko proizvodnjo monoterpenoidov. Poskus je predvideval implementacijo presnovnih poti, ki uporabljajo GPP ali NPP kot substrat za monoterpensko sintazo PptAPS v peroksisomih ''Y. lipolytica''. Geni, ki naj bi bili močno izraženi, so bili pod regulacijo promotorja YlpTEF, medtem ko so bili geni, ki so zahtevali šibkejšo ekspresijo, sestavljeni s promotorjem YlpGAP. &lt;br /&gt;<br /> <br /> Vsi geni poti, ki uporabljajo NPP, so bili uspešno sestavljeni, vendar zaradi pomanjkanja časa projekt ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> == LITERATURA ==<br /> <br /> [1] A. El Asbahani, K. Miladi, W. Badri, M. Sala, E. H. A. Addi, H. Casabianca, A. El Mousadik, D. Hartmann, A. Jilale, F. N. R. Renaud, et al.: Essential oils: From extraction to encapsulation. International Journal of Pharmaceutics. Elsevier B.V. April 15, 2015, pp 220–243.&lt;br /&gt;<br /> [2] Q. Gao, L. Wang, M. Zhang, Y. Wei, W. Lin: Recent Advances on Feasible Strategies for Monoterpenoid Production in Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. Frontiers Media S.A. December 1, 2020.&lt;br /&gt;<br /> [3] O. A. Carter, R. J. Peters, R. Croteau: Monoterpene biosynthesis pathway construction in Escherichia coli. Phytochemistry 2003, 64, 425–433.&lt;br /&gt;<br /> [4] M. T. Lundemo, J. M. Woodley: Guidelines for development and implementation of biocatalytic P450 processes. Applied Microbiology and Biotechnology. Springer Verlag February 28, 2015, pp 2465–2483.&lt;br /&gt;<br /> [5] C. Ignea, M. H. Raadam, M. S. Motawia, A. M. Makris, C. E. Vickers, S. C. Kampranis: Orthogonal monoterpenoid biosynthesis in yeast constructed on an isomeric substrate. Nat. Commun. 2019, 10.&lt;br /&gt;<br /> [6] J. Zhao, X. Bao, C. Li, Y. Shen, J. Hou: Improving monoterpene geraniol production through geranyl diphosphate synthesis regulation in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 4561–4571.&lt;br /&gt;<br /> [7] S. Dusséaux, W. T. Wajn, Y. Liu, C. Ignea, S. C. Kampranis: Transforming yeast peroxisomes into microfactories for the efficient production of high-value isoprenoids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020, 117, 31789–31799.&lt;br /&gt;<br /> [8] C. Brocard, A. Hartig: Peroxisome targeting signal 1: Is it really a simple tripeptide? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. Biochim Biophys Acta December 2006, pp 1565–1573.&lt;br /&gt;<br /> [9] S. Zernia, F. Ott, K. Bellmann-Sickert, R. Frank, M. Klenner, H. G. Jahnke, A. Prager, B. Abel, A. Robitzki, A. G. Beck-Sickinger: Peptide-Mediated Specific Immobilization of Catalytically Active Cytochrome P450 BM3 Variant. Bioconjug. Chem. 2016, 27, 1090–1097.&lt;br /&gt;<br /> [10] J. N. Bröker, B. Müller, N. van Deenen, D. Prüfer, C. Schulze Gronover: Upregulating the mevalonate pathway and repressing sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae enhances the production of triterpenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 6923–6934.&lt;br /&gt;<br /> [11] S. Brown, M. Clastre, V. Courdavault, S. E. O’Connor: De novo production of the plant-derived alkaloid strictosidine in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015, 112, 3205–3210.&lt;br /&gt;<br /> [12] C. Y. Zhang, N. B. Lin, X. S. Chai, Zhong-Li, D. G. Barnes: A rapid method for simultaneously determining ethanol and methanol content in wines by full evaporation headspace gas chromatography. Food Chem. 2015, 183, 169–172.&lt;br /&gt;</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MonChassis&diff=21725 2023-04-04T10:07:50Z

<p>Nika Tomsič: </p> <hr /> <div>Svet se trenutno sooča z velikimi globalnimi težavami, zato je potrebno iskanje novih, trajnostnih rešitev. Poseben razred z obetajočimi aplikacijami so monoterpenoidi. Monoterpenoidi imajo širok spekter uporabe, na primer v kozmetiki, medicini, zatiranju škodljivcev, živilski industriji in biogorivih. Toda obsežna uporaba monoterpenoidov je redka zaradi cene in časa, ki so potrebni za njihovo pripravo. Skupina iGem iz Muenstera je leta 2022 raziskovala možnost njihove sinteze v kvasovkah. Predstavitev projekta je dostopna na sledeči povezavi: https://2022.igem.wiki/wwu-muenster/.<br /> <br /> <br /> == PROIZVODNJA MONOTERPENOIDOV ==<br /> <br /> <br /> === Ekstrakcija iz rastlin ===<br /> <br /> <br /> Primarni vir monoterpenoidov so rastline, kjer imajo pomembno vlogo v številnih fizioloških procesih. Rastlinska eterična olja vsebujejo več kot 80 % monoterpenoidov, vendar ima ekstrakcija eteričnih olj iz rastlin nizek izkoristek. Poleg tega je zaradi kompleksnosti eteričnih olj čiščenje posameznih monoterpenoidov stroškovno obsežno, naporno in neučinkovito. Sestava je namreč odvisna od pogojev rasti rastlin in njihovega shranjevanja &lt;ref&gt;[1]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Kemijska sinteza: ===<br /> <br /> Kemijska sinteza je bolj zanesljiva možnost za proizvajanje monoterpenov. Priprava enostavnih molekul je možna, medtem ko se cena in potrebna energija večata z večanjem kompleksnosti molekule. Poleg tega pe je kemijska sinteza okolju neprijazna zaradi onesnažujočih topil in katalizatorjev ter je včasih odvisna od neobnovljivih virov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v bakterijah ===<br /> <br /> <br /> Bakterije so pogosto prva izbira za proizvodnjo kemikalij ''in vivo'', saj je taka proizvodnja hitra in poceni. Za proizvodnjo monoterpenoidov pa ima delo z bakterijami več pomanjkljivosti. Prvič, obstaja pomanjkanje prekurzorja geranil difosfata (GPP) v bakterijskem gostitelju. Za povečanje sinteze je treba celotno pot mevalonata preoblikovati v bakterije&lt;ref&gt;[3]&lt;/ref&gt;. Drugič, koraki monoterpenoidne biosinteze zahtevajo funkcionalno izražanje CYP, kar je izziv pri bakterijah&lt;ref&gt;[4]&lt;/ref&gt;. Tretjič, tudi če se vsi heterologni geni lahko funkcionalno izrazijo, proizvodnja monoterpenoidov z bakterijami morda ne bo učinkovita. Kopičenje prekurzorjev vodi do zmanjšane rasti celic, različni monoterpenoidi pa imajo toksične učinke na bakterije z motnjami v celični membrani&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v kvasovkah ===<br /> <br /> <br /> Kvasovke predstavljajo privlačno alternativo za proizvodnjo monoterpenoidov. Kvasovke imajo pot endogenega mevalonata (MVA), pri kateri se GPP, predhodnik vseh monoterpenoidov, hitro pretvori v farnezil difosfat (FPP)&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Druga omejitev pri proizvodnji monoterpenoidov s kvasom je toksičnost proizvoda, ki lahko omeji količino proizvodnje&lt;ref&gt;[6]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> == MON CHASSIS ==<br /> <br /> MonChassis je prilagodljiva platforma na osnovi kvasovk za obsežno proizvodnjo monoterpenoidov. Temelji na pripravi terpenskih prekurzorjev v kvasovkah z uporabo sinteznobiološkega inženiringa ter s katalizo v končne produkte z brezceličnim sistemov encima CYP. Raziskovana je bila proizvodnja v ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica'' s spremembo moči promotorjev ključnih encimov in uvedbo novih zapisov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Monoterpenoide se lahko učinkovito sintetizira z modifikacijo mevalonantne poti kvasovk&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Da bi povečali presnovni tok poti MVA, je bilo identificiranih in optimiziranih več pomembnih encimov, ki omejujejo hitrost poti. Z uvedbo dodatnih heterolognih genov in utišanjem endogenih genov je možno optimizirati proizvodnjo monoterpenoidov. Glavni cilj je bil povečati proizvodnjo geranil difosfata (GPP) v ''Saccharomyces cerevisiae'', saj deluje kot bistveni prekurzor za sintezo monoterpenoidov, kot je α-pinen. Med temi sta najbolj omejujoča ERG13 in 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A (tHMGR). Če gena za ta encima prekomerno izrazimo, se poveča tudi proizvodnja prekurzorjev monoterpenoidov.&lt;br /&gt;<br /> Dodatna skupna omejitev modelov je sinteza ergosterola iz GPP, iz katerega nastajajo tudi prekurzorji monoterpenoidov. Ker je sinteza ergosterola nujna za celično rast, bodo modeli, ki temeljijo na endogeni poti MVA kvasovk, vedno omejeni v svojih donosih. Zaradi tega je bila preverjena učinkovitost proizvodnje tudi v peroksisomih, ker bi tako bila proizvodnja monoterpenoidov in ergosterola ločena. Peroksisomi predstavljajo zagotavljajo ugodne fiziološke pogoje za sintezo prekurzorjev monoterpenoidov&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;. Usmerjanje encimov v peroksisome je mogoče zlahka doseči z dodajanjem tripeptida C-terminalnega peroksisomskega ciljnega signala-1 (PTS1)&lt;ref&gt;[8]&lt;/ref&gt;. Skupaj se je preverjalo učinkovitost proizvodnje v citosolu in v peroksisomu bodisi v organizmih ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica''. &lt;br /&gt;<br /> MonChassis je sestavljena iz dveh komponent: sestava prekurzorjev terpenov v kvasovkah in in vitro kataliza spremembe prekurzerjev v monoterpenoide. V ta namen MonChassis uporablja samozasnovan bioreaktor za encimsko elektrosintezo (BREES) in modificirano citokrom P450 monooksigenazo BM3. Kot dokaz delovanja je potekla kataliza reakcije iz α-pinena v verbenon.<br /> <br /> <br /> == BREES ==<br /> <br /> Najlažji način za spopadanje s toksičnostjo produktov je uporaba brezceličnih sistemov. Tradicionalna biokataliza brez celic zahteva dodajanje kofaktorjev, kot je NADPH, ki zvišuje stroške za obsežne aplikacije. Da bi bila komponenta MonChassis ''in vitro'' uporabna v industrijskem obsegu je bilo potrebno razviti poceni alternativa. Zato je bil sestavljen BREES, bioreaktor za encimsko elektrosintezo. BM3, znan tudi kot citokrom P450 BM3 ali CYP102A1, je bakterijski encim citokroma P450, pridobljen iz ''Bacillus megaterium''. Je vsestranski encim z aktivnostmi monooksigenaze in hidroksilaze maščobnih kislin. Čeprav ni neposredno vpleten v proizvodnjo terpenoidov, so bili BM3 in njegove različice uporabljeni kot biokatalizatorji za modificiranje terpenoidnih spojin. Raziskovalci so izdelali BM3 in druge encime citokroma P450 za uvedbo hidroksilnih skupin, epoksidov ali drugih funkcionalnih skupin v terpenoidne molekule, kar omogoča katalizo α-pinena v končne monoterpenoide. Modificiran encim ima dodan peptidni povezovalec, ki lahko imobilizira encim na elektrodo iz indijevega kositrovega oksida in omogoči neposreden prenos elektronov z elektrode na encim&lt;ref&gt;[9]&lt;/ref&gt;. Zato lahko encim uporablja elektrone neposredno iz električne energije in ne zahteva dovajanja drugih kofaktorjev. V kombinaciji z inženirskimi sevi kvasovk MonChassis BREES omogoča hitro, prilagodljivo in obsežno proizvodnjo monoterpenoidov.<br /> <br /> <br /> == STRATEGIJA KLONIRANJA ==<br /> <br /> <br /> Po uradnih pravilih iGEM je bilo splošno kloniranje izvedeno v skladu z modularnim sistemom kloniranja RFC1000 (MoClo).<br /> Sistem MoClo se opira na restrikcijske encime tipa IIS, ki cepijo DNA tako, da nastanejo lepljivi konci. Ustvarjanje različnih koncev pri različnih fragmentih omogoča učinkovito sestavljanje več fragmentov DNA v eni preprosti reakciji ligacije. Primerna zasnova koncev omogoča, da se fragmenti sestavljajo samo v vnaprej določenem vrstnem redu. Vsi geni so bili pomnoženi z začetno verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo specifičnih začetnih oligonukleotidov z ustreznimi pritrjenimi konci.&lt;br /&gt;<br /> Končni zapisi so bil sestavljeni z metodo Golden Gate v vektor pSB1C00. V vektor so dovajali zapis transkripcijskih enot, ki so ga sestavljali promotorji, kodirno zaporedje in terminator. Z uporabo različnih promotorjev je bila mogoča sprememba ravni izražanja genov. Uspešno integracijo so preverili s selekcijo transformiranih kolonij, saj so celice konstitutivno izražale rdeči fluorescenčni protein (mRFP1).&lt;br /&gt;<br /> <br /> Za transformacijo kvasovk sta bili uporabljeni metodi Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-assotiated protein 9 (CRISPR-Cas9) in uporaba ekstrakromosomskih prenosljivih vektorjev. Vsak vektor vsebuje enega od štirih različnih selekcijskih markerjev (HIS3, TRP1, LEU2 ali URA3) za genomsko integracijo.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> Mevalonatna pot ''Saccharomyces cerevisiae'' so spremenili z metodo Golden Gate Assembly in ustavili heterolognega gena PptAPS ter povečali izražanje endogenih genov ScERG13 ali SctHMGR.&lt;br /&gt;<br /> Genske spremembe so temlejile na sistemu CRISPR-Cas9. Z namenom povečanja koncentracije mevalonata sta bila utišana ScROX1 in ScERG13 ter SctHMGR uravnavan z močnim promotorjem. Izločitev ScROX1 je bila ugodna za povečanje koncentracije mevalonata, saj zavira encime v MVA&lt;ref&gt;[10]&lt;/ref&gt;. Pri drugi varianti sta bila uvedena gena GgmFPS144 iz ''Gallus gallus'' in AgtGPPS2 iz ''Abies grandis'', da bi povečali koncentracijo geranil difosfata (GPP). Izločitev ScERG20 in vstavljanje GgmFPS144 sta bila potrebna za zaviranje reakcije GPP v (FPP)&lt;ref&gt;[11]&lt;/ref&gt;. Uvedba heterologne α-pinen sintaze (PptAPS) iz ''Pinus ponderosa'' je povečala proizvodnjo α-pinena v citosolu.&lt;br /&gt;<br /> Analiza z GC-MS je potrdila prisotnost α-pinena v lizatu.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v peroksisomih ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> Poleg citosola je peroksisom postal obetavna tarča za presnovni inženiring, saj naj bi njegove fiziološke lastnosti, kot je razpoložljivost substrata, znatno izboljšale sintezo produkta&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;.&lt;br /&gt;<br /> Ker se metabolizem mevalonata ne pojavlja naravno v peroksisomih&lt;ref&gt;[12]&lt;/ref&gt;, je bilo treba v vsak sev kvasovk pod nadzorom konstitutivnega promotorja pADH vključiti potrebne gene ScERG13, SctHMGR, ScERG12, ScERG8 in ScERG19, spojene s PTS1. V različnih primerih so v zapis vključili sintazo SltNPPS1 iz ''Solanum lycopersicum'', kar omogoča proizvodnjo monoterpenoidnega prekurzorja neril difosfata (NPP), ali heterologna gena GgmFPS144 in AgtGPPS2 iz ''Gallus gallus'' oziroma ''Abies grandis'', kar omogoča proizvodnjo NPP, strukturnega izomera geranil difosfata (GPP). V obeh primerih je bil dodan še zapis za PptAPS, ki katalizira reakcijo NPP ali GPP v α-pinen. Povečanje izražanja ScERG13 in SctHMGR je poteklo z uporabo promotorja ScpTEF.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Za primerjavo brezcelične proizvodnje verbenona v in vitro poskusih so pripravili tudi sev kvasovk, ki vsebuje citokrom P450 monooksigenazo (CYP) limonen-3-hidroksilazo (L3H) za sintezo verbenona iz α-pinena.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Končna ocena spremenjenih sevov kvasovk je bila izvedena s kvantifikacijo z uporabo GC-MS analize, ki je potrdila prisotnost α-pinena v obeh variantah kvasovk. <br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> ''Yarrowia lipolytica'' je obetaven organizem za sintezo monoterpenoidov, saj vsebuje visoko koncentracijo acetil-CoA, je sposoben učinkovito kopičiti lipide in kaže visoko toleranco do monoterpenoidov. Za izražanje terpinoidnih prekurzorjev v ''Yarrowia lipolytica'' so izrazili gena SctHMGR in ScERG13 organizma Saccharomyces cerevisiae. Uvedba genov AgtGPPS2 in GgMFPS144 bi pomenili zmanjšano količino proizvedenega farnezil pirofosfata (FPP) in povečano količino geranil pirofosfata (GPP). Drugi poskus je predvideval zmanjšanje količine proizvedenega FPP. To so poskušali narediti z uvedbo SltNPPS1 za proizvodnjo neril pirofosfata (NPP). Dodan je bil še gen PptAPS za proizvodnjo α-pinena.&lt;br /&gt;<br /> <br /> cPCR nikoli ni pokazal uspešne vstavitve genov, temveč so opazili le dolžine, ki bi jih pričakovali od prvotnega genomskega zaporedja. Zaradi časovnih omejitev pa poskus ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> ''Y. lipolytica'' je zaradi njegovega obsežnega metabolizma maščobnih kislin zanimiv organizem za peroksisomsko proizvodnjo monoterpenoidov. Poskus je predvideval implementacijo presnovnih poti, ki uporabljajo GPP ali NPP kot substrat za monoterpensko sintazo PptAPS v peroksisomih ''Y. lipolytica''. Geni, ki naj bi bili močno izraženi, so bili pod regulacijo promotorja YlpTEF, medtem ko so bili geni, ki so zahtevali šibkejšo ekspresijo, sestavljeni s promotorjem YlpGAP. &lt;br /&gt;<br /> <br /> Vsi geni poti, ki uporabljajo NPP, so bili uspešno sestavljeni, vendar zaradi pomanjkanja časa projekt ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> == LITERATURA ==<br /> <br /> [1] A. El Asbahani, K. Miladi, W. Badri, M. Sala, E. H. A. Addi, H. Casabianca, A. El Mousadik, D. Hartmann, A. Jilale, F. N. R. Renaud, et al.: Essential oils: From extraction to encapsulation. International Journal of Pharmaceutics. Elsevier B.V. April 15, 2015, pp 220–243.&lt;br /&gt;<br /> [2] Q. Gao, L. Wang, M. Zhang, Y. Wei, W. Lin: Recent Advances on Feasible Strategies for Monoterpenoid Production in Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. Frontiers Media S.A. December 1, 2020.&lt;br /&gt;<br /> [3] O. A. Carter, R. J. Peters, R. Croteau: Monoterpene biosynthesis pathway construction in Escherichia coli. Phytochemistry 2003, 64, 425–433.&lt;br /&gt;<br /> [4] M. T. Lundemo, J. M. Woodley: Guidelines for development and implementation of biocatalytic P450 processes. Applied Microbiology and Biotechnology. Springer Verlag February 28, 2015, pp 2465–2483.&lt;br /&gt;<br /> [5] C. Ignea, M. H. Raadam, M. S. Motawia, A. M. Makris, C. E. Vickers, S. C. Kampranis: Orthogonal monoterpenoid biosynthesis in yeast constructed on an isomeric substrate. Nat. Commun. 2019, 10.&lt;br /&gt;<br /> [6] J. Zhao, X. Bao, C. Li, Y. Shen, J. Hou: Improving monoterpene geraniol production through geranyl diphosphate synthesis regulation in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 4561–4571.&lt;br /&gt;<br /> [7] S. Dusséaux, W. T. Wajn, Y. Liu, C. Ignea, S. C. Kampranis: Transforming yeast peroxisomes into microfactories for the efficient production of high-value isoprenoids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020, 117, 31789–31799.&lt;br /&gt;<br /> [8] C. Brocard, A. Hartig: Peroxisome targeting signal 1: Is it really a simple tripeptide? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. Biochim Biophys Acta December 2006, pp 1565–1573.&lt;br /&gt;<br /> [9] S. Zernia, F. Ott, K. Bellmann-Sickert, R. Frank, M. Klenner, H. G. Jahnke, A. Prager, B. Abel, A. Robitzki, A. G. Beck-Sickinger: Peptide-Mediated Specific Immobilization of Catalytically Active Cytochrome P450 BM3 Variant. Bioconjug. Chem. 2016, 27, 1090–1097.&lt;br /&gt;<br /> [10] J. N. Bröker, B. Müller, N. van Deenen, D. Prüfer, C. Schulze Gronover: Upregulating the mevalonate pathway and repressing sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae enhances the production of triterpenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 6923–6934.&lt;br /&gt;<br /> [11] S. Brown, M. Clastre, V. Courdavault, S. E. O’Connor: De novo production of the plant-derived alkaloid strictosidine in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015, 112, 3205–3210.&lt;br /&gt;<br /> [12] C. Y. Zhang, N. B. Lin, X. S. Chai, Zhong-Li, D. G. Barnes: A rapid method for simultaneously determining ethanol and methanol content in wines by full evaporation headspace gas chromatography. Food Chem. 2015, 183, 169–172.&lt;br /&gt;</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MonChassis&diff=21724 2023-04-04T10:06:47Z

<p>Nika Tomsič: </p> <hr /> <div>Svet se trenutno sooča z velikimi globalnimi težavami, zato je potrebno iskanje novih, trajnostnih rešitev. Poseben razred z obetajočimi aplikacijami so monoterpenoidi. Monoterpenoidi imajo širok spekter uporabe, na primer v kozmetiki, medicini, zatiranju škodljivcev, živilski industriji in biogorivih. Toda obsežna uporaba monoterpenoidov je redka zaradi cene in časa, ki so potrebni za njihovo pripravo. Skupina iGem iz Muenstera je leta 2022 raziskovala možnost njihove sinteze v kvasovkah. Predstavitev projekta je dostopna na sledeči povezavi: https://2022.igem.wiki/wwu-muenster/.<br /> <br /> <br /> == PROIZVODNJA MONOTERPENOIDOV ==<br /> <br /> <br /> === Ekstrakcija iz rastlin ===<br /> <br /> <br /> Primarni vir monoterpenoidov so rastline, kjer imajo pomembno vlogo v številnih fizioloških procesih. Rastlinska eterična olja vsebujejo več kot 80 % monoterpenoidov, vendar ima ekstrakcija eteričnih olj iz rastlin nizek izkoristek. Poleg tega je zaradi kompleksnosti eteričnih olj čiščenje posameznih monoterpenoidov stroškovno obsežno, naporno in neučinkovito. Sestava je namreč odvisna od pogojev rasti rastlin in njihovega shranjevanja &lt;ref&gt;[1]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Kemijska sinteza: ===<br /> <br /> Kemijska sinteza je bolj zanesljiva možnost za proizvajanje monoterpenov. Priprava enostavnih molekul je možna, medtem ko se cena in potrebna energija večata z večanjem kompleksnosti molekule. Poleg tega pe je kemijska sinteza okolju neprijazna zaradi onesnažujočih topil in katalizatorjev ter je včasih odvisna od neobnovljivih virov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v bakterijah ===<br /> <br /> <br /> Bakterije so pogosto prva izbira za proizvodnjo kemikalij ''in vivo'', saj je taka proizvodnja hitra in poceni. Za proizvodnjo monoterpenoidov pa ima delo z bakterijami več pomanjkljivosti. Prvič, obstaja pomanjkanje prekurzorja geranil difosfata (GPP) v bakterijskem gostitelju. Za povečanje sinteze je treba celotno pot mevalonata preoblikovati v bakterije&lt;ref&gt;[3]&lt;/ref&gt;. Drugič, koraki monoterpenoidne biosinteze zahtevajo funkcionalno izražanje CYP, kar je izziv pri bakterijah&lt;ref&gt;[4]&lt;/ref&gt;. Tretjič, tudi če se vsi heterologni geni lahko funkcionalno izrazijo, proizvodnja monoterpenoidov z bakterijami morda ne bo učinkovita. Kopičenje prekurzorjev vodi do zmanjšane rasti celic, različni monoterpenoidi pa imajo toksične učinke na bakterije z motnjami v celični membrani&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v kvasovkah ===<br /> <br /> <br /> Kvasovke predstavljajo privlačno alternativo za proizvodnjo monoterpenoidov. Kvasovke imajo pot endogenega mevalonata (MVA), pri kateri se GPP, predhodnik vseh monoterpenoidov, hitro pretvori v farnezil difosfat (FPP)&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Druga omejitev pri proizvodnji monoterpenoidov s kvasom je toksičnost proizvoda, ki lahko omeji količino proizvodnje&lt;ref&gt;[6]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> == MON CHASSIS ==<br /> <br /> MonChassis je prilagodljiva platforma na osnovi kvasovk za obsežno proizvodnjo monoterpenoidov. Temelji na pripravi terpenskih prekurzorjev v kvasovkah z uporabo sinteznobiološkega inženiringa ter s katalizo v končne produkte z brezceličnim sistemov encima CYP. Raziskovana je bila proizvodnja v ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica'' s spremembo moči promotorjev ključnih encimov in uvedbo novih zapisov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Monoterpenoide se lahko učinkovito sintetizira z modifikacijo mevalonantne poti kvasovk&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Da bi povečali presnovni tok poti MVA, je bilo identificiranih in optimiziranih več pomembnih encimov, ki omejujejo hitrost poti. Z uvedbo dodatnih heterolognih genov in utišanjem endogenih genov je možno optimizirati proizvodnjo monoterpenoidov. Glavni cilj je bil povečati proizvodnjo geranil difosfata (GPP) v ''Saccharomyces cerevisiae'', saj deluje kot bistveni prekurzor za sintezo monoterpenoidov, kot je α-pinen. Med temi sta najbolj omejujoča ERG13 in 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A (tHMGR). Če gena za ta encima prekomerno izrazimo, se poveča tudi proizvodnja prekurzorjev monoterpenoidov.&lt;br /&gt;<br /> Dodatna skupna omejitev modelov je sinteza ergosterola iz GPP, iz katerega nastajajo tudi prekurzorji monoterpenoidov. Ker je sinteza ergosterola nujna za celično rast, bodo modeli, ki temeljijo na endogeni poti MVA kvasovk, vedno omejeni v svojih donosih. Zaradi tega je bila preverjena učinkovitost proizvodnje tudi v peroksisomih, ker bi tako bila proizvodnja monoterpenoidov in ergosterola ločena. Peroksisomi predstavljajo zagotavljajo ugodne fiziološke pogoje za sintezo prekurzorjev monoterpenoidov&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;. Usmerjanje encimov V peroksisome je mogoče zlahka doseči z dodajanjem tripeptida C-terminalnega peroksisomskega ciljnega signala-1 (PTS1)&lt;ref&gt;[8]&lt;/ref&gt;. Skupaj se je preverjalo učinkovitost proizvodnje v citosolu in v peroksisomu bodisi v organizmih ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica''. &lt;br /&gt;<br /> MonChassis je sestavljena iz dveh komponent: sestava prekurzorjev terpenov v kvasovkah in in vitro kataliza spremembe prekurzerjev v monoterpenoide. V ta namen MonChassis uporablja samozasnovan bioreaktor za encimsko elektrosintezo (BREES) in modificirano citokrom P450 monooksigenazo BM3. Kot dokaz delovanja je potekla kataliza reakcije iz α-pinena v verbenon.<br /> <br /> <br /> == BREES ==<br /> <br /> Najlažji način za spopadanje s toksičnostjo produktov je uporaba brezceličnih sistemov. Tradicionalna biokataliza brez celic zahteva dodajanje kofaktorjev, kot je NADPH, ki zvišuje stroške za obsežne aplikacije. Da bi bila komponenta MonChassis ''in vitro'' uporabna v industrijskem obsegu je bilo potrebno razviti poceni alternativa. Zato je bil sestavljen BREES, bioreaktor za encimsko elektrosintezo. BM3, znan tudi kot citokrom P450 BM3 ali CYP102A1, je bakterijski encim citokroma P450, pridobljen iz ''Bacillus megaterium''. Je vsestranski encim z aktivnostmi monooksigenaze in hidroksilaze maščobnih kislin. Čeprav ni neposredno vpleten v proizvodnjo terpenoidov, so bili BM3 in njegove različice uporabljeni kot biokatalizatorji za modificiranje terpenoidnih spojin. Raziskovalci so izdelali BM3 in druge encime citokroma P450 za uvedbo hidroksilnih skupin, epoksidov ali drugih funkcionalnih skupin v terpenoidne molekule, kar omogoča katalizo α-pinena v končne monoterpenoide. Modificiran encim ima dodan peptidni povezovalec, ki lahko imobilizira encim na elektrodo iz indijevega kositrovega oksida in omogoči neposreden prenos elektronov z elektrode na encim&lt;ref&gt;[9]&lt;/ref&gt;. Zato lahko encim uporablja elektrone neposredno iz električne energije in ne zahteva dovajanja drugih kofaktorjev. V kombinaciji z inženirskimi sevi kvasovk MonChassis BREES omogoča hitro, prilagodljivo in obsežno proizvodnjo monoterpenoidov.<br /> <br /> <br /> == STRATEGIJA KLONIRANJA ==<br /> <br /> <br /> Po uradnih pravilih iGEM je bilo splošno kloniranje izvedeno v skladu z modularnim sistemom kloniranja RFC1000 (MoClo).<br /> Sistem MoClo se opira na restrikcijske encime tipa IIS, ki cepijo DNA tako, da nastanejo lepljivi konci. Ustvarjanje različnih koncev pri različnih fragmentih omogoča učinkovito sestavljanje več fragmentov DNA v eni preprosti reakciji ligacije. Primerna zasnova koncev omogoča, da se fragmenti sestavljajo samo v vnaprej določenem vrstnem redu. Vsi geni so bili pomnoženi z začetno verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo specifičnih začetnih oligonukleotidov z ustreznimi pritrjenimi konci.&lt;br /&gt;<br /> Končni zapisi so bil sestavljeni z metodo Golden Gate v vektor pSB1C00. V vektor so dovajali zapis transkripcijskih enot, ki so ga sestavljali promotorji, kodirno zaporedje in terminator. Z uporabo različnih promotorjev je bila mogoča sprememba ravni izražanja genov. Uspešno integracijo so preverili s selekcijo transformiranih kolonij, saj so celice konstitutivno izražale rdeči fluorescenčni protein (mRFP1).&lt;br /&gt;<br /> <br /> Za transformacijo kvasovk sta bili uporabljeni metodi Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-assotiated protein 9 (CRISPR-Cas9) in uporaba ekstrakromosomskih prenosljivih vektorjev. Vsak vektor vsebuje enega od štirih različnih selekcijskih markerjev (HIS3, TRP1, LEU2 ali URA3) za genomsko integracijo.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> Mevalonatna pot ''Saccharomyces cerevisiae'' so spremenili z metodo Golden Gate Assembly in ustavili heterolognega gena PptAPS ter povečali izražanje endogenih genov ScERG13 ali SctHMGR.&lt;br /&gt;<br /> Genske spremembe so temlejile na sistemu CRISPR-Cas9. Z namenom povečanja koncentracije mevalonata sta bila utišana ScROX1 in ScERG13 ter SctHMGR uravnavan z močnim promotorjem. Izločitev ScROX1 je bila ugodna za povečanje koncentracije mevalonata, saj zavira encime v MVA&lt;ref&gt;[10]&lt;/ref&gt;. Pri drugi varianti sta bila uvedena gena GgmFPS144 iz ''Gallus gallus'' in AgtGPPS2 iz ''Abies grandis'', da bi povečali koncentracijo geranil difosfata (GPP). Izločitev ScERG20 in vstavljanje GgmFPS144 sta bila potrebna za zaviranje reakcije GPP v (FPP)&lt;ref&gt;[11]&lt;/ref&gt;. Uvedba heterologne α-pinen sintaze (PptAPS) iz ''Pinus ponderosa'' je povečala proizvodnjo α-pinena v citosolu.&lt;br /&gt;<br /> Analiza z GC-MS je potrdila prisotnost α-pinena v lizatu.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v peroksisomih ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> Poleg citosola je peroksisom postal obetavna tarča za presnovni inženiring, saj naj bi njegove fiziološke lastnosti, kot je razpoložljivost substrata, znatno izboljšale sintezo produkta&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;.&lt;br /&gt;<br /> Ker se metabolizem mevalonata ne pojavlja naravno v peroksisomih&lt;ref&gt;[12]&lt;/ref&gt;, je bilo treba v vsak sev kvasovk pod nadzorom konstitutivnega promotorja pADH vključiti potrebne gene ScERG13, SctHMGR, ScERG12, ScERG8 in ScERG19, spojene s PTS1. V različnih primerih so v zapis vključili sintazo SltNPPS1 iz ''Solanum lycopersicum'', kar omogoča proizvodnjo monoterpenoidnega prekurzorja neril difosfata (NPP), ali heterologna gena GgmFPS144 in AgtGPPS2 iz ''Gallus gallus'' oziroma ''Abies grandis'', kar omogoča proizvodnjo NPP, strukturnega izomera geranil difosfata (GPP). V obeh primerih je bil dodan še zapis za PptAPS, ki katalizira reakcijo NPP ali GPP v α-pinen. Povečanje izražanja ScERG13 in SctHMGR je poteklo z uporabo promotorja ScpTEF.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Za primerjavo brezcelične proizvodnje verbenona v in vitro poskusih so pripravili tudi sev kvasovk, ki vsebuje citokrom P450 monooksigenazo (CYP) limonen-3-hidroksilazo (L3H) za sintezo verbenona iz α-pinena.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Končna ocena spremenjenih sevov kvasovk je bila izvedena s kvantifikacijo z uporabo GC-MS analize, ki je potrdila prisotnost α-pinena v obeh variantah kvasovk. <br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> ''Yarrowia lipolytica'' je obetaven organizem za sintezo monoterpenoidov, saj vsebuje visoko koncentracijo acetil-CoA, je sposoben učinkovito kopičiti lipide in kaže visoko toleranco do monoterpenoidov. Za izražanje terpinoidnih prekurzorjev v ''Yarrowia lipolytica'' so izrazili gena SctHMGR in ScERG13 organizma Saccharomyces cerevisiae. Uvedba genov AgtGPPS2 in GgMFPS144 bi pomenili zmanjšano količino proizvedenega farnezil pirofosfata (FPP) in povečano količino geranil pirofosfata (GPP). Drugi poskus je predvideval zmanjšanje količine proizvedenega FPP. To so poskušali narediti z uvedbo SltNPPS1 za proizvodnjo neril pirofosfata (NPP). Dodan je bil še gen PptAPS za proizvodnjo α-pinena.&lt;br /&gt;<br /> <br /> cPCR nikoli ni pokazal uspešne vstavitve genov, temveč so opazili le dolžine, ki bi jih pričakovali od prvotnega genomskega zaporedja. Zaradi časovnih omejitev pa poskus ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> ''Y. lipolytica'' je zaradi njegovega obsežnega metabolizma maščobnih kislin zanimiv organizem za peroksisomsko proizvodnjo monoterpenoidov. Poskus je predvideval implementacijo presnovnih poti, ki uporabljajo GPP ali NPP kot substrat za monoterpensko sintazo PptAPS v peroksisomih ''Y. lipolytica''. Geni, ki naj bi bili močno izraženi, so bili pod regulacijo promotorja YlpTEF, medtem ko so bili geni, ki so zahtevali šibkejšo ekspresijo, sestavljeni s promotorjem YlpGAP. &lt;br /&gt;<br /> <br /> Vsi geni poti, ki uporabljajo NPP, so bili uspešno sestavljeni, vendar zaradi pomanjkanja časa projekt ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> == LITERATURA ==<br /> <br /> [1] A. El Asbahani, K. Miladi, W. Badri, M. Sala, E. H. A. Addi, H. Casabianca, A. El Mousadik, D. Hartmann, A. Jilale, F. N. R. Renaud, et al.: Essential oils: From extraction to encapsulation. International Journal of Pharmaceutics. Elsevier B.V. April 15, 2015, pp 220–243.&lt;br /&gt;<br /> [2] Q. Gao, L. Wang, M. Zhang, Y. Wei, W. Lin: Recent Advances on Feasible Strategies for Monoterpenoid Production in Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. Frontiers Media S.A. December 1, 2020.&lt;br /&gt;<br /> [3] O. A. Carter, R. J. Peters, R. Croteau: Monoterpene biosynthesis pathway construction in Escherichia coli. Phytochemistry 2003, 64, 425–433.&lt;br /&gt;<br /> [4] M. T. Lundemo, J. M. Woodley: Guidelines for development and implementation of biocatalytic P450 processes. Applied Microbiology and Biotechnology. Springer Verlag February 28, 2015, pp 2465–2483.&lt;br /&gt;<br /> [5] C. Ignea, M. H. Raadam, M. S. Motawia, A. M. Makris, C. E. Vickers, S. C. Kampranis: Orthogonal monoterpenoid biosynthesis in yeast constructed on an isomeric substrate. Nat. Commun. 2019, 10.&lt;br /&gt;<br /> [6] J. Zhao, X. Bao, C. Li, Y. Shen, J. Hou: Improving monoterpene geraniol production through geranyl diphosphate synthesis regulation in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 4561–4571.&lt;br /&gt;<br /> [7] S. Dusséaux, W. T. Wajn, Y. Liu, C. Ignea, S. C. Kampranis: Transforming yeast peroxisomes into microfactories for the efficient production of high-value isoprenoids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020, 117, 31789–31799.&lt;br /&gt;<br /> [8] C. Brocard, A. Hartig: Peroxisome targeting signal 1: Is it really a simple tripeptide? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. Biochim Biophys Acta December 2006, pp 1565–1573.&lt;br /&gt;<br /> [9] S. Zernia, F. Ott, K. Bellmann-Sickert, R. Frank, M. Klenner, H. G. Jahnke, A. Prager, B. Abel, A. Robitzki, A. G. Beck-Sickinger: Peptide-Mediated Specific Immobilization of Catalytically Active Cytochrome P450 BM3 Variant. Bioconjug. Chem. 2016, 27, 1090–1097.&lt;br /&gt;<br /> [10] J. N. Bröker, B. Müller, N. van Deenen, D. Prüfer, C. Schulze Gronover: Upregulating the mevalonate pathway and repressing sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae enhances the production of triterpenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 6923–6934.&lt;br /&gt;<br /> [11] S. Brown, M. Clastre, V. Courdavault, S. E. O’Connor: De novo production of the plant-derived alkaloid strictosidine in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015, 112, 3205–3210.&lt;br /&gt;<br /> [12] C. Y. Zhang, N. B. Lin, X. S. Chai, Zhong-Li, D. G. Barnes: A rapid method for simultaneously determining ethanol and methanol content in wines by full evaporation headspace gas chromatography. Food Chem. 2015, 183, 169–172.&lt;br /&gt;</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MonChassis&diff=21723 2023-04-04T08:18:03Z

<p>Nika Tomsič: </p> <hr /> <div>Svet se trenutno sooča z velikimi globalnimi težavami, zato je potrebno iskanje novih, trajnostnih rešitev. Poseben razred z obetajočimi aplikacijami so monoterpenoidi. Monoterpenoidi imajo širok spekter uporabe, na primer v kozmetiki, medicini, zatiranju škodljivcev, živilski industriji in biogorivih. Toda obsežna uporaba monoterpenoidov je redka zaradi cene in časa, ki so potrebni za njihovo pripravo. Skupina iGem iz Muenstera je leta 2022 raziskovala možnost njihove sinteze v kvasovkah. Predstavitev projekta je dostopna na sledeči povezavi: https://2022.igem.wiki/wwu-muenster/.<br /> <br /> <br /> == PROIZVODNJA MONOTERPENOIDOV ==<br /> <br /> <br /> === Ekstrakcija iz rastlin ===<br /> <br /> <br /> Primarni vir monoterpenoidov so rastline, kjer imajo pomembno vlogo v številnih fizioloških procesih. Rastlinska eterična olja vsebujejo več kot 80 % monoterpenoidov, vendar ima ekstrakcija eteričnih olj iz rastlin nizek izkoristek. Poleg tega je zaradi kompleksnosti eteričnih olj čiščenje posameznih monoterpenoidov stroškovno obsežno, naporno in neučinkovito. Sestava je namreč odvisna od pogojev rasti rastlin in njihovega shranjevanja &lt;ref&gt;[1]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> == Kemijska sinteza: ==<br /> <br /> Kemijska sinteza je bolj zanesljiva možnost za proizvajanje monoterpenov. Priprava enostavnih molekul je možna, medtem ko se cena in potrebna energija večata z večanjem kompleksnosti molekule. Poleg tega pe je kemijska sinteza okolju neprijazna zaradi onesnažujočih topil in katalizatorjev ter je včasih odvisna od neobnovljivih virov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v bakterijah ===<br /> <br /> <br /> Bakterije so pogosto prva izbira za proizvodnjo kemikalij ''in vivo'', saj je taka proizvodnja hitra in poceni. Za proizvodnjo monoterpenoidov pa ima delo z bakterijami več pomanjkljivosti. Prvič, obstaja pomanjkanje prekurzorja geranil difosfata (GPP) v bakterijskem gostitelju. Za povečanje sinteze je treba celotno pot mevalonata preoblikovati v bakterije&lt;ref&gt;[3]&lt;/ref&gt;. Drugič, koraki monoterpenoidne biosinteze zahtevajo funkcionalno izražanje CYP, kar je izziv pri bakterijah&lt;ref&gt;[4]&lt;/ref&gt;. Tretjič, tudi če se vsi heterologni geni lahko funkcionalno izrazijo, proizvodnja monoterpenoidov z bakterijami morda ne bo učinkovita. Kopičenje prekurzorjev vodi do zmanjšane rasti celic, različni monoterpenoidi pa imajo toksične učinke na bakterije z motnjami v celični membrani&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v kvasovkah ===<br /> <br /> <br /> Kvasovke predstavljajo privlačno alternativo za proizvodnjo monoterpenoidov. Kvasovke imajo pot endogenega mevalonata (MVA), pri kateri se GPP, predhodnik vseh monoterpenoidov, hitro pretvori v farnezil difosfat (FPP)&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Druga omejitev pri proizvodnji monoterpenoidov s kvasom je toksičnost proizvoda, ki lahko omeji količino proizvodnje&lt;ref&gt;[6]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> == MON CHASSIS ==<br /> <br /> MonChassis je prilagodljiva platforma na osnovi kvasovk za obsežno proizvodnjo monoterpenoidov. Temelji na pripravi terpenskih prekurzorjev v kvasovkah z uporabo sinteznobiološkega inženiringa ter s katalizo v končne produkte z brezceličnim sistemov encima CYP. Raziskovana je bila proizvodnja v ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica'' s spremembo moči promotorjev ključnih encimov in uvedbo novih zapisov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Monoterpenoide se lahko učinkovito sintetizira z modifikacijo mevalonantne poti kvasovk&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Da bi povečali presnovni tok poti MVA, je bilo identificiranih in optimiziranih več pomembnih encimov, ki omejujejo hitrost poti. Z uvedbo dodatnih heterolognih genov in utišanjem endogenih genov je možno optimizirati proizvodnjo monoterpenoidov. Glavni cilj je bil povečati proizvodnjo geranil difosfata (GPP) v ''Saccharomyces cerevisiae'', saj deluje kot bistveni prekurzor za sintezo monoterpenoidov, kot je α-pinen. Med temi sta najbolj omejujoča ERG13 in 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A (tHMGR). Če gena za ta encima prekomerno izrazimo, se poveča tudi proizvodnja prekurzorjev monoterpenoidov.&lt;br /&gt;<br /> Dodatna skupna omejitev modelov je sinteza ergosterola iz GPP, iz katerega nastajajo tudi prekurzorji monoterpenoidov. Ker je sinteza ergosterola nujna za celično rast, bodo modeli, ki temeljijo na endogeni poti MVA kvasovk, vedno omejeni v svojih donosih. Zaradi tega je bila preverjena učinkovitost proizvodnje tudi v peroksisomih, ker bi tako bila proizvodnja monoterpenoidov in ergosterola ločena. Peroksisomi predstavljajo zagotavljajo ugodne fiziološke pogoje za sintezo prekurzorjev monoterpenoidov&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;. Usmerjanje encimov V peroksisome je mogoče zlahka doseči z dodajanjem tripeptida C-terminalnega peroksisomskega ciljnega signala-1 (PTS1)&lt;ref&gt;[8]&lt;/ref&gt;. Skupaj se je preverjalo učinkovitost proizvodnje v citosolu in v peroksisomu bodisi v organizmih ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica''. &lt;br /&gt;<br /> MonChassis je sestavljena iz dveh komponent: sestava prekurzorjev terpenov v kvasovkah in in vitro kataliza spremembe prekurzerjev v monoterpenoide. V ta namen MonChassis uporablja samozasnovan bioreaktor za encimsko elektrosintezo (BREES) in modificirano citokrom P450 monooksigenazo BM3. Kot dokaz delovanja je potekla kataliza reakcije iz α-pinena v verbenon.<br /> <br /> <br /> == BREES ==<br /> <br /> Najlažji način za spopadanje s toksičnostjo produktov je uporaba brezceličnih sistemov. Tradicionalna biokataliza brez celic zahteva dodajanje kofaktorjev, kot je NADPH, ki zvišuje stroške za obsežne aplikacije. Da bi bila komponenta MonChassis ''in vitro'' uporabna v industrijskem obsegu je bilo potrebno razviti poceni alternativa. Zato je bil sestavljen BREES, bioreaktor za encimsko elektrosintezo. BM3, znan tudi kot citokrom P450 BM3 ali CYP102A1, je bakterijski encim citokroma P450, pridobljen iz ''Bacillus megaterium''. Je vsestranski encim z aktivnostmi monooksigenaze in hidroksilaze maščobnih kislin. Čeprav ni neposredno vpleten v proizvodnjo terpenoidov, so bili BM3 in njegove različice uporabljeni kot biokatalizatorji za modificiranje terpenoidnih spojin. Raziskovalci so izdelali BM3 in druge encime citokroma P450 za uvedbo hidroksilnih skupin, epoksidov ali drugih funkcionalnih skupin v terpenoidne molekule, kar omogoča katalizo α-pinena v končne monoterpenoide. Modificiran encim ima dodan peptidni povezovalec, ki lahko imobilizira encim na elektrodo iz indijevega kositrovega oksida in omogoči neposreden prenos elektronov z elektrode na encim&lt;ref&gt;[9]&lt;/ref&gt;. Zato lahko encim uporablja elektrone neposredno iz električne energije in ne zahteva dovajanja drugih kofaktorjev. V kombinaciji z inženirskimi sevi kvasovk MonChassis BREES omogoča hitro, prilagodljivo in obsežno proizvodnjo monoterpenoidov.<br /> <br /> <br /> == STRATEGIJA KLONIRANJA ==<br /> <br /> <br /> Po uradnih pravilih iGEM je bilo splošno kloniranje izvedeno v skladu z modularnim sistemom kloniranja RFC1000 (MoClo).<br /> Sistem MoClo se opira na restrikcijske encime tipa IIS, ki cepijo DNA tako, da nastanejo lepljivi konci. Ustvarjanje različnih koncev pri različnih fragmentih omogoča učinkovito sestavljanje več fragmentov DNA v eni preprosti reakciji ligacije. Primerna zasnova koncev omogoča, da se fragmenti sestavljajo samo v vnaprej določenem vrstnem redu. Vsi geni so bili pomnoženi z začetno verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo specifičnih začetnih oligonukleotidov z ustreznimi pritrjenimi konci.&lt;br /&gt;<br /> Končni zapisi so bil sestavljeni z metodo Golden Gate v vektor pSB1C00. V vektor so dovajali zapis transkripcijskih enot, ki so ga sestavljali promotorji, kodirno zaporedje in terminator. Z uporabo različnih promotorjev je bila mogoča sprememba ravni izražanja genov. Uspešno integracijo so preverili s selekcijo transformiranih kolonij, saj so celice konstitutivno izražale rdeči fluorescenčni protein (mRFP1).&lt;br /&gt;<br /> <br /> Za transformacijo kvasovk sta bili uporabljeni metodi Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-assotiated protein 9 (CRISPR-Cas9) in uporaba ekstrakromosomskih prenosljivih vektorjev. Vsak vektor vsebuje enega od štirih različnih selekcijskih markerjev (HIS3, TRP1, LEU2 ali URA3) za genomsko integracijo.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> Mevalonatna pot ''Saccharomyces cerevisiae'' so spremenili z metodo Golden Gate Assembly in ustavili heterolognega gena PptAPS ter povečali izražanje endogenih genov ScERG13 ali SctHMGR.&lt;br /&gt;<br /> Genske spremembe so temlejile na sistemu CRISPR-Cas9. Z namenom povečanja koncentracije mevalonata sta bila utišana ScROX1 in ScERG13 ter SctHMGR uravnavan z močnim promotorjem. Izločitev ScROX1 je bila ugodna za povečanje koncentracije mevalonata, saj zavira encime v MVA&lt;ref&gt;[10]&lt;/ref&gt;. Pri drugi varianti sta bila uvedena gena GgmFPS144 iz ''Gallus gallus'' in AgtGPPS2 iz ''Abies grandis'', da bi povečali koncentracijo geranil difosfata (GPP). Izločitev ScERG20 in vstavljanje GgmFPS144 sta bila potrebna za zaviranje reakcije GPP v (FPP)&lt;ref&gt;[11]&lt;/ref&gt;. Uvedba heterologne α-pinen sintaze (PptAPS) iz ''Pinus ponderosa'' je povečala proizvodnjo α-pinena v citosolu.&lt;br /&gt;<br /> Analiza z GC-MS je potrdila prisotnost α-pinena v lizatu.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v peroksisomih ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> Poleg citosola je peroksisom postal obetavna tarča za presnovni inženiring, saj naj bi njegove fiziološke lastnosti, kot je razpoložljivost substrata, znatno izboljšale sintezo produkta&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;.&lt;br /&gt;<br /> Ker se metabolizem mevalonata ne pojavlja naravno v peroksisomih&lt;ref&gt;[12]&lt;/ref&gt;, je bilo treba v vsak sev kvasovk pod nadzorom konstitutivnega promotorja pADH vključiti potrebne gene ScERG13, SctHMGR, ScERG12, ScERG8 in ScERG19, spojene s PTS1. V različnih primerih so v zapis vključili sintazo SltNPPS1 iz ''Solanum lycopersicum'', kar omogoča proizvodnjo monoterpenoidnega prekurzorja neril difosfata (NPP), ali heterologna gena GgmFPS144 in AgtGPPS2 iz ''Gallus gallus'' oziroma ''Abies grandis'', kar omogoča proizvodnjo NPP, strukturnega izomera geranil difosfata (GPP). V obeh primerih je bil dodan še zapis za PptAPS, ki katalizira reakcijo NPP ali GPP v α-pinen. Povečanje izražanja ScERG13 in SctHMGR je poteklo z uporabo promotorja ScpTEF.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Za primerjavo brezcelične proizvodnje verbenona v in vitro poskusih so pripravili tudi sev kvasovk, ki vsebuje citokrom P450 monooksigenazo (CYP) limonen-3-hidroksilazo (L3H) za sintezo verbenona iz α-pinena.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Končna ocena spremenjenih sevov kvasovk je bila izvedena s kvantifikacijo z uporabo GC-MS analize, ki je potrdila prisotnost α-pinena v obeh variantah kvasovk. <br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> ''Yarrowia lipolytica'' je obetaven organizem za sintezo monoterpenoidov, saj vsebuje visoko koncentracijo acetil-CoA, je sposoben učinkovito kopičiti lipide in kaže visoko toleranco do monoterpenoidov. Za izražanje terpinoidnih prekurzorjev v ''Yarrowia lipolytica'' so izrazili gena SctHMGR in ScERG13 organizma Saccharomyces cerevisiae. Uvedba genov AgtGPPS2 in GgMFPS144 bi pomenili zmanjšano količino proizvedenega farnezil pirofosfata (FPP) in povečano količino geranil pirofosfata (GPP). Drugi poskus je predvideval zmanjšanje količine proizvedenega FPP. To so poskušali narediti z uvedbo SltNPPS1 za proizvodnjo neril pirofosfata (NPP). Dodan je bil še gen PptAPS za proizvodnjo α-pinena.&lt;br /&gt;<br /> <br /> cPCR nikoli ni pokazal uspešne vstavitve genov, temveč so opazili le dolžine, ki bi jih pričakovali od prvotnega genomskega zaporedja. Zaradi časovnih omejitev pa poskus ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> ''Y. lipolytica'' je zaradi njegovega obsežnega metabolizma maščobnih kislin zanimiv organizem za peroksisomsko proizvodnjo monoterpenoidov. Poskus je predvideval implementacijo presnovnih poti, ki uporabljajo GPP ali NPP kot substrat za monoterpensko sintazo PptAPS v peroksisomih ''Y. lipolytica''. Geni, ki naj bi bili močno izraženi, so bili pod regulacijo promotorja YlpTEF, medtem ko so bili geni, ki so zahtevali šibkejšo ekspresijo, sestavljeni s promotorjem YlpGAP. &lt;br /&gt;<br /> <br /> Vsi geni poti, ki uporabljajo NPP, so bili uspešno sestavljeni, vendar zaradi pomanjkanja časa projekt ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> == LITERATURA ==<br /> <br /> [1] A. El Asbahani, K. Miladi, W. Badri, M. Sala, E. H. A. Addi, H. Casabianca, A. El Mousadik, D. Hartmann, A. Jilale, F. N. R. Renaud, et al.: Essential oils: From extraction to encapsulation. International Journal of Pharmaceutics. Elsevier B.V. April 15, 2015, pp 220–243.&lt;br /&gt;<br /> [2] Q. Gao, L. Wang, M. Zhang, Y. Wei, W. Lin: Recent Advances on Feasible Strategies for Monoterpenoid Production in Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. Frontiers Media S.A. December 1, 2020.&lt;br /&gt;<br /> [3] O. A. Carter, R. J. Peters, R. Croteau: Monoterpene biosynthesis pathway construction in Escherichia coli. Phytochemistry 2003, 64, 425–433.&lt;br /&gt;<br /> [4] M. T. Lundemo, J. M. Woodley: Guidelines for development and implementation of biocatalytic P450 processes. Applied Microbiology and Biotechnology. Springer Verlag February 28, 2015, pp 2465–2483.&lt;br /&gt;<br /> [5] C. Ignea, M. H. Raadam, M. S. Motawia, A. M. Makris, C. E. Vickers, S. C. Kampranis: Orthogonal monoterpenoid biosynthesis in yeast constructed on an isomeric substrate. Nat. Commun. 2019, 10.&lt;br /&gt;<br /> [6] J. Zhao, X. Bao, C. Li, Y. Shen, J. Hou: Improving monoterpene geraniol production through geranyl diphosphate synthesis regulation in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 4561–4571.&lt;br /&gt;<br /> [7] S. Dusséaux, W. T. Wajn, Y. Liu, C. Ignea, S. C. Kampranis: Transforming yeast peroxisomes into microfactories for the efficient production of high-value isoprenoids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020, 117, 31789–31799.&lt;br /&gt;<br /> [8] C. Brocard, A. Hartig: Peroxisome targeting signal 1: Is it really a simple tripeptide? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. Biochim Biophys Acta December 2006, pp 1565–1573.&lt;br /&gt;<br /> [9] S. Zernia, F. Ott, K. Bellmann-Sickert, R. Frank, M. Klenner, H. G. Jahnke, A. Prager, B. Abel, A. Robitzki, A. G. Beck-Sickinger: Peptide-Mediated Specific Immobilization of Catalytically Active Cytochrome P450 BM3 Variant. Bioconjug. Chem. 2016, 27, 1090–1097.&lt;br /&gt;<br /> [10] J. N. Bröker, B. Müller, N. van Deenen, D. Prüfer, C. Schulze Gronover: Upregulating the mevalonate pathway and repressing sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae enhances the production of triterpenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 6923–6934.&lt;br /&gt;<br /> [11] S. Brown, M. Clastre, V. Courdavault, S. E. O’Connor: De novo production of the plant-derived alkaloid strictosidine in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015, 112, 3205–3210.&lt;br /&gt;<br /> [12] C. Y. Zhang, N. B. Lin, X. S. Chai, Zhong-Li, D. G. Barnes: A rapid method for simultaneously determining ethanol and methanol content in wines by full evaporation headspace gas chromatography. Food Chem. 2015, 183, 169–172.&lt;br /&gt;</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MonChassis&diff=21683 2023-04-03T08:23:37Z

<p>Nika Tomsič: </p> <hr /> <div>Svet se trenutno sooča z velikimi globalnimi težavami, zato je potrebno iskanje novih, trajnostnih rešitev. Poseben razred z obetajočimi aplikacijami so monoterpenoidi. Monoterpenoidi imajo širok spekter uporabe, na primer v kozmetiki, medicini, zatiranju škodljivcev, živilski industriji in biogorivih. Toda obsežna uporaba monoterpenoidov je redka zaradi cene in časa, ki so potrebni za njihovo pripravo. Skupina iGem iz Muenstera je leta 2022 raziskovala možnost njihove sinteze v kvasovkah. Predstavitev projekta je dostopna na sledeči povezavi: https://2022.igem.wiki/wwu-muenster/.<br /> <br /> <br /> == PROIZVODNJA MONOTERPENOIDOV ==<br /> <br /> <br /> === Ekstrakcija iz rastlin ===<br /> <br /> <br /> Primarni vir monoterpenoidov so rastline, kjer imajo pomembno vlogo v številnih fizioloških procesih. Rastlinska eterična olja vsebujejo več kot 80 % monoterpenoidov, vendar ima ekstrakcija eteričnih olj iz rastlin nizek izkoristek. Poleg tega je zaradi kompleksnosti eteričnih olj čiščenje posameznih monoterpenoidov stroškovno obsežno, naporno in neučinkovito. Sestava je namreč odvisna od pogojev rasti rastlin in njihovega shranjevanja &lt;ref&gt;[1]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> == Kemijska sinteza: ==<br /> <br /> Kemijska sinteza je bolj zanesljiva možnost za proizvajanje monoterpenov. Priprava enostavnih molekul je možna, medtem ko se cena in potrebna energija večata z večanjem kompleksnosti molekule. Poleg tega pe je kemijska sinteza okolju neprijazna zaradi onesnažujočih topil in katalizatorjev ter je včasih odvisna od neobnovljivih virov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v bakterijah ===<br /> <br /> <br /> Bakterije so pogosto prva izbira za proizvodnjo kemikalij ''in vivo'', saj je taka proizvodnja hitra in poceni. Za proizvodnjo monoterpenoidov pa ima delo z bakterijami več pomanjkljivosti. Prvič, obstaja pomanjkanje prekurzorja geranil difosfata (GPP) v bakterijskem gostitelju. Za povečanje sinteze je treba celotno pot mevalonata preoblikovati v bakterije&lt;ref&gt;[3]&lt;/ref&gt;. Drugič, koraki monoterpenoidne biosinteze zahtevajo funkcionalno izražanje CYP, kar je izziv pri bakterijah&lt;ref&gt;[4]&lt;/ref&gt;. Tretjič, tudi če se vsi heterologni geni lahko funkcionalno izrazijo, proizvodnja monoterpenoidov z bakterijami morda ne bo učinkovita. Kopičenje prekurzorjev vodi do zmanjšane rasti celic, različni monoterpenoidi pa imajo toksične učinke na bakterije z motnjami v celični membrani&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v kvasovkah ===<br /> <br /> <br /> Kvasovke predstavljajo privlačno alternativo za proizvodnjo monoterpenoidov. Kvasovke imajo pot endogenega mevalonata (MVA), pri kateri se GPP, predhodnik vseh monoterpenoidov, hitro pretvori v farnezil difosfat (FPP)&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Druga omejitev pri proizvodnji monoterpenoidov s kvasom je toksičnost proizvoda, ki lahko omeji količino proizvodnje&lt;ref&gt;[6]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> == MON CHASSIS ==<br /> <br /> MonChassis je prilagodljiva platforma na osnovi kvasovk za obsežno proizvodnjo monoterpenoidov. Temelji na pripravi terpenskih prekurzorjev v kvasovkah z uporabo sinteznobiološkega inženiringa ter s katalizo v končne produkte z brezceličnim sistemov encima CYP. Raziskovana je bila proizvodnja v ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica'' s spremembo moči promotorjev ključnih encimov in uvedbo novih zapisov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Monoterpenoide se lahko učinkovito sintetizira z modifikacijo mevalonantne poti kvasovk&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Da bi povečali presnovni tok poti MVA, je bilo identificiranih in optimiziranih več pomembnih encimov, ki omejujejo hitrost poti. Z uvedbo dodatnih heterolognih genov in utišanjem endogenih genov je možno optimizirati proizvodnjo monoterpenoidov. Glavni cilj je bil povečati proizvodnjo geranil difosfata (GPP) v ''Saccharomyces cerevisiae'', saj deluje kot bistveni prekurzor za sintezo monoterpenoidov, kot je α-pinen. Med temi sta najbolj omejujoča ERG13 in 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A (tHMGR). Če gena za ta encima prekomerno izrazimo, se poveča tudi proizvodnja prekurzorjev monoterpenoidov.&lt;br /&gt;<br /> Dodatna skupna omejitev modelov je sinteza ergosterola iz GPP, iz katerega nastajajo tudi prekurzorji monoterpenoidov. Ker je sinteza ergosterola nujna za celično rast, bodo modeli, ki temeljijo na endogeni poti MVA kvasovk, vedno omejeni v svojih donosih. Zaradi tega je bila preverjena učinkovitost proizvodnje tudi v peroksisomih, ker bi tako bila proizvodnja monoterpenoidov in ergosterola ločena. Peroksisomi predstavljajo zagotavljajo ugodne fiziološke pogoje za sintezo prekurzorjev monoterpenoidov&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;. Usmerjanje encimov V peroksisome je mogoče zlahka doseči z dodajanjem tripeptida C-terminalnega peroksisomskega ciljnega signala-1 (PTS1)&lt;ref&gt;[8]&lt;/ref&gt;. Skupaj se je preverjalo učinkovitost proizvodnje v citosolu in v peroksisomu bodisi v organizmih ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica''. &lt;br /&gt;<br /> MonChassis je sestavljena iz dveh komponent: sestava prekurzorjev terpenov v kvasovkah in in vitro kataliza spremembe prekurzerjev v monoterpenoide. V ta namen MonChassis uporablja samozasnovan bioreaktor za encimsko elektrosintezo (BREES) in modificirano citokrom P450 monooksigenazo BM3. Kot dokaz delovanja je potekla kataliza reakcije iz α-pinena v verbenon.<br /> <br /> <br /> == BREES ==<br /> <br /> Najlažji način za spopadanje s toksičnostjo produktov je uporaba brezceličnih sistemov. Tradicionalna biokataliza brez celic zahteva dodajanje kofaktorjev, kot je NADPH, ki zvišuje stroške za obsežne aplikacije. Da bi bila komponenta MonChassis ''in vitro'' uporabna v industrijskem obsegu je bilo potrebno razviti poceni alternativa. Zato je bil sestavljen BREES, bioreaktor za encimsko elektrosintezo. BM3, znan tudi kot citokrom P450 BM3 ali CYP102A1, je bakterijski encim citokroma P450, pridobljen iz ''Bacillus megaterium''. Je vsestranski encim z aktivnostmi monooksigenaze in hidroksilaze maščobnih kislin. Čeprav ni neposredno vpleten v proizvodnjo terpenoidov, so bili BM3 in njegove različice uporabljeni kot biokatalizatorji za modificiranje terpenoidnih spojin. Raziskovalci so izdelali BM3 in druge encime citokroma P450 za uvedbo hidroksilnih skupin, epoksidov ali drugih funkcionalnih skupin v terpenoidne molekule, kar omogoča katalizo α-pinena v končne monoterpenoide. Modificiran encim ima dodan peptidni povezovalec, ki lahko imobilizira encim na elektrodo iz indijevega kositrovega oksida in omogoči neposreden prenos elektronov z elektrode na encim&lt;ref&gt;[9]&lt;/ref&gt;. Zato lahko encim uporablja elektrone neposredno iz električne energije in ne zahteva dovajanja drugih kofaktorjev. V kombinaciji z inženirskimi sevi kvasovk MonChassis BREES omogoča hitro, prilagodljivo in obsežno proizvodnjo monoterpenoidov.<br /> <br /> <br /> == STRATEGIJA KLONIRANJA ==<br /> <br /> <br /> Po uradnih pravilih iGEM je bilo splošno kloniranje izvedeno v skladu z modularnim sistemom kloniranja RFC1000 (MoClo).<br /> Sistem MoClo se opira na restrikcijske encime tipa IIS, ki cepijo DNA tako, da nastanejo lepljivi konci. Ustvarjanje različnih koncev pri različnih fragmentih omogoča učinkovito sestavljanje več fragmentov DNA v eni preprosti reakciji ligacije. Primerna zasnova koncev omogoča, da se fragmenti sestavljajo samo v vnaprej določenem vrstnem redu. Vsi geni so bili pomnoženi z začetno verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo specifičnih začetnih oligonukleotidov z ustreznimi pritrjenimi konci.&lt;br /&gt;<br /> Končni zapisi so bil sestavljeni z metodo Golden Gate v vektor pSB1C00. V vektor so dovajali zapis transkripcijskih enot, ki so ga sestavljali promotorji, kodirno zaporedje in terminator. Z uporabo različnih promotorjev je bila mogoča sprememba ravni izražanja genov. Uspešno integracijo so preverili s selekcijo transformiranih kolonij, saj so celice konstitutivno izražale rdeči fluorescenčni protein (mRFP1).&lt;br /&gt;<br /> <br /> Za transformacijo kvasovk sta bili uporabljeni metodi Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-assotiated protein 9 (CRISPR-Cas9) in uporaba ekstrakromosomskih shuttle vektorjev. Vsak vektor vsebuje enega od štirih različnih selekcijskih markerjev (HIS3, TRP1, LEU2 ali URA3) za genomsko integracijo.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> Mevalonatna pot ''Saccharomyces cerevisiae'' so spremenili z metodo Golden Gate Assembly in ustavili heterolognega gena PptAPS ter povečali izražanje endogenih genov ScERG13 ali SctHMGR.&lt;br /&gt;<br /> Genske spremembe so temlejile na sistemu CRISPR-Cas9. Z namenom povečanja koncentracije mevalonata sta bila utišana ScROX1 in ScERG13 ter SctHMGR uravnavan z močnim promotorjem. Izločitev ScROX1 je bila ugodna za povečanje koncentracije mevalonata, saj zavira encime v MVA&lt;ref&gt;[10]&lt;/ref&gt;. Pri drugi varianti sta bila uvedena gena GgmFPS144 iz ''Gallus gallus'' in AgtGPPS2 iz ''Abies grandis'', da bi povečali koncentracijo geranil difosfata (GPP). Izločitev ScERG20 in vstavljanje GgmFPS144 sta bila potrebna za zaviranje reakcije GPP v (FPP)&lt;ref&gt;[11]&lt;/ref&gt;. Uvedba heterologne α-pinen sintaze (PptAPS) iz ''Pinus ponderosa'' je povečala proizvodnjo α-pinena v citosolu.&lt;br /&gt;<br /> Analiza z GC-MS je potrdila prisotnost α-pinena v lizatu.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v peroksisomih ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> Poleg citosola je peroksisom postal obetavna tarča za presnovni inženiring, saj naj bi njegove fiziološke lastnosti, kot je razpoložljivost substrata, znatno izboljšale sintezo produkta&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;.&lt;br /&gt;<br /> Ker se metabolizem mevalonata ne pojavlja naravno v peroksisomih&lt;ref&gt;[12]&lt;/ref&gt;, je bilo treba v vsak sev kvasovk pod nadzorom konstitutivnega promotorja pADH vključiti potrebne gene ScERG13, SctHMGR, ScERG12, ScERG8 in ScERG19, spojene s PTS1. V različnih primerih so v zapis vključili sintazo SltNPPS1 iz ''Solanum lycopersicum'', kar omogoča proizvodnjo monoterpenoidnega prekurzorja neril difosfata (NPP), ali heterologna gena GgmFPS144 in AgtGPPS2 iz ''Gallus gallus'' oziroma ''Abies grandis'', kar omogoča proizvodnjo NPP, strukturnega izomera geranil difosfata (GPP). V obeh primerih je bil dodan še zapis za PptAPS, ki katalizira reakcijo NPP ali GPP v α-pinen. Povečanje izražanja ScERG13 in SctHMGR je poteklo z uporabo promotorja ScpTEF.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Za primerjavo brezcelične proizvodnje verbenona v in vitro poskusih so pripravili tudi sev kvasovk, ki vsebuje citokrom P450 monooksigenazo (CYP) limonen-3-hidroksilazo (L3H) za sintezo verbenona iz α-pinena.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Končna ocena spremenjenih sevov kvasovk je bila izvedena s kvantifikacijo z uporabo GC-MS analize, ki je potrdila prisotnost α-pinena v obeh variantah kvasovk. <br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> ''Yarrowia lipolytica'' je obetaven organizem za sintezo monoterpenoidov, saj vsebuje visoko koncentracijo acetil-CoA, je sposoben učinkovito kopičiti lipide in kaže visoko toleranco do monoterpenoidov. Za izražanje terpinoidnih prekurzorjev v ''Yarrowia lipolytica'' so izrazili gena SctHMGR in ScERG13 organizma Saccharomyces cerevisiae. Uvedba genov AgtGPPS2 in GgMFPS144 bi pomenili zmanjšano količino proizvedenega farnezil pirofosfata (FPP) in povečano količino geranil pirofosfata (GPP). Drugi poskus je predvideval zmanjšanje količine proizvedenega FPP. To so poskušali narediti z uvedbo SltNPPS1 za proizvodnjo neril pirofosfata (NPP). Dodan je bil še gen PptAPS za proizvodnjo α-pinena.&lt;br /&gt;<br /> <br /> cPCR nikoli ni pokazal uspešne vstavitve genov, temveč so opazili le dolžine, ki bi jih pričakovali od prvotnega genomskega zaporedja. Zaradi časovnih omejitev pa poskus ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> ''Y. lipolytica'' je zaradi njegovega obsežnega metabolizma maščobnih kislin zanimiv organizem za peroksisomsko proizvodnjo monoterpenoidov. Poskus je predvideval implementacijo presnovnih poti, ki uporabljajo GPP ali NPP kot substrat za monoterpensko sintazo PptAPS v peroksisomih ''Y. lipolytica''. Geni, ki naj bi bili močno izraženi, so bili pod regulacijo promotorja YlpTEF, medtem ko so bili geni, ki so zahtevali šibkejšo ekspresijo, sestavljeni s promotorjem YlpGAP. &lt;br /&gt;<br /> <br /> Vsi geni poti, ki uporabljajo NPP, so bili uspešno sestavljeni, vendar zaradi pomanjkanja časa projekt ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> == LITERATURA ==<br /> <br /> [1] A. El Asbahani, K. Miladi, W. Badri, M. Sala, E. H. A. Addi, H. Casabianca, A. El Mousadik, D. Hartmann, A. Jilale, F. N. R. Renaud, et al.: Essential oils: From extraction to encapsulation. International Journal of Pharmaceutics. Elsevier B.V. April 15, 2015, pp 220–243.&lt;br /&gt;<br /> [2] Q. Gao, L. Wang, M. Zhang, Y. Wei, W. Lin: Recent Advances on Feasible Strategies for Monoterpenoid Production in Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. Frontiers Media S.A. December 1, 2020.&lt;br /&gt;<br /> [3] O. A. Carter, R. J. Peters, R. Croteau: Monoterpene biosynthesis pathway construction in Escherichia coli. Phytochemistry 2003, 64, 425–433.&lt;br /&gt;<br /> [4] M. T. Lundemo, J. M. Woodley: Guidelines for development and implementation of biocatalytic P450 processes. Applied Microbiology and Biotechnology. Springer Verlag February 28, 2015, pp 2465–2483.&lt;br /&gt;<br /> [5] C. Ignea, M. H. Raadam, M. S. Motawia, A. M. Makris, C. E. Vickers, S. C. Kampranis: Orthogonal monoterpenoid biosynthesis in yeast constructed on an isomeric substrate. Nat. Commun. 2019, 10.&lt;br /&gt;<br /> [6] J. Zhao, X. Bao, C. Li, Y. Shen, J. Hou: Improving monoterpene geraniol production through geranyl diphosphate synthesis regulation in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 4561–4571.&lt;br /&gt;<br /> [7] S. Dusséaux, W. T. Wajn, Y. Liu, C. Ignea, S. C. Kampranis: Transforming yeast peroxisomes into microfactories for the efficient production of high-value isoprenoids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020, 117, 31789–31799.&lt;br /&gt;<br /> [8] C. Brocard, A. Hartig: Peroxisome targeting signal 1: Is it really a simple tripeptide? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. Biochim Biophys Acta December 2006, pp 1565–1573.&lt;br /&gt;<br /> [9] S. Zernia, F. Ott, K. Bellmann-Sickert, R. Frank, M. Klenner, H. G. Jahnke, A. Prager, B. Abel, A. Robitzki, A. G. Beck-Sickinger: Peptide-Mediated Specific Immobilization of Catalytically Active Cytochrome P450 BM3 Variant. Bioconjug. Chem. 2016, 27, 1090–1097.&lt;br /&gt;<br /> [10] J. N. Bröker, B. Müller, N. van Deenen, D. Prüfer, C. Schulze Gronover: Upregulating the mevalonate pathway and repressing sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae enhances the production of triterpenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 6923–6934.&lt;br /&gt;<br /> [11] S. Brown, M. Clastre, V. Courdavault, S. E. O’Connor: De novo production of the plant-derived alkaloid strictosidine in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015, 112, 3205–3210.&lt;br /&gt;<br /> [12] C. Y. Zhang, N. B. Lin, X. S. Chai, Zhong-Li, D. G. Barnes: A rapid method for simultaneously determining ethanol and methanol content in wines by full evaporation headspace gas chromatography. Food Chem. 2015, 183, 169–172.&lt;br /&gt;</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MonChassis&diff=21682 2023-04-03T08:19:32Z

<p>Nika Tomsič: </p> <hr /> <div>Svet se trenutno sooča z velikimi globalnimi težavami, zato je potrebno iskanje novih, trajnostnih rešitev. Poseben razred z obetajočimi aplikacijami so monoterpenoidi. Monoterpenoidi imajo širok spekter uporabe, na primer v kozmetiki, medicini, zatiranju škodljivcev, živilski industriji in biogorivih. Toda obsežna uporaba monoterpenoidov je redka zaradi cene in časa, ki so potrebni za njihovo pripravo. Skupina iGem iz Muenstera je leta 2022 raziskovala možnost njihove sinteze v kvasovkah. Predstavitev projekta je dostopna na sledeči povezavi: https://2022.igem.wiki/wwu-muenster/.<br /> <br /> <br /> == PROIZVODNJA MONOTERPENOIDOV ==<br /> <br /> <br /> === Ekstrakcija iz rastlin ===<br /> <br /> <br /> Primarni vir monoterpenoidov so rastline, kjer imajo pomembno vlogo v številnih fizioloških procesih. Rastlinska eterična olja vsebujejo več kot 80 % monoterpenoidov, vendar ima ekstrakcija eteričnih olj iz rastlin nizek izkoristek. Poleg tega je zaradi kompleksnosti eteričnih olj čiščenje posameznih monoterpenoidov stroškovno obsežno, naporno in neučinkovito. Sestava je namreč odvisna od pogojev rasti rastlin in njihovega shranjevanja &lt;ref&gt;[1]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> == Kemijska sinteza: ==<br /> <br /> Kemijska sinteza je bolj zanesljiva možnost za proizvajanje monoterpenov. Priprava enostavnih molekul je možna, medtem ko se cena in potrebna energija večata z večanjem kompleksnosti molekule. Poleg tega pe je kemijska sinteza okolju neprijazna zaradi onesnažujočih topil in katalizatorjev ter je včasih odvisna od neobnovljivih virov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v bakterijah ===<br /> <br /> <br /> Bakterije so pogosto prva izbira za proizvodnjo kemikalij ''in vivo'', saj je taka proizvodnja hitra in poceni. Za proizvodnjo monoterpenoidov pa ima delo z bakterijami več pomanjkljivosti. Prvič, obstaja pomanjkanje prekurzorja geranil difosfata (GPP) v bakterijskem gostitelju. Za povečanje sinteze je treba celotno pot mevalonata preoblikovati v bakterije&lt;ref&gt;[3]&lt;/ref&gt;. Drugič, koraki monoterpenoidne biosinteze zahtevajo funkcionalno izražanje CYP, kar je izziv pri bakterijah&lt;ref&gt;[4]&lt;/ref&gt;. Tretjič, tudi če se vsi heterologni geni lahko funkcionalno izrazijo, proizvodnja monoterpenoidov z bakterijami morda ne bo učinkovita. Kopičenje prekurzorjev vodi do zmanjšane rasti celic, različni monoterpenoidi pa imajo toksične učinke na bakterije z motnjami v celični membrani&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v kvasovkah ===<br /> <br /> <br /> Kvasovke predstavljajo privlačno alternativo za proizvodnjo monoterpenoidov. Kvasovke imajo pot endogenega mevalonata (MVA), pri kateri se GPP, predhodnik vseh monoterpenoidov, hitro pretvori v farnezil difosfat (FPP)&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Druga omejitev pri proizvodnji monoterpenoidov s kvasom je toksičnost proizvoda, ki lahko omeji količino proizvodnje&lt;ref&gt;[6]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> == MON CHASSIS ==<br /> <br /> MonChassis je prilagodljiva platforma na osnovi kvasovk za obsežno proizvodnjo monoterpenoidov. Temelji na pripravi terpenskih prekurzorjev v kvasovkah z uporabo sinteznobiološkega inženiringa ter s katalizo v končne produkte z brezceličnim sistemov encima CYP. Raziskovana je bila proizvodnja v ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica'' s spremembo moči promotorjev ključnih encimov in uvedbo novih zapisov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.&lt;br /&gt;<br /> <br /> <br /> Monoterpenoide se lahko učinkovito sintetizira z modifikacijo mevalonantne poti kvasovk&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Da bi povečali presnovni tok poti MVA, je bilo identificiranih in optimiziranih več pomembnih encimov, ki omejujejo hitrost poti. Z uvedbo dodatnih heterolognih genov in utišanjem endogenih genov je možno optimizirati proizvodnjo monoterpenoidov. Glavni cilj je bil povečati proizvodnjo geranil difosfata (GPP) v ''Saccharomyces cerevisiae'', saj deluje kot bistveni prekurzor za sintezo monoterpenoidov, kot je α-pinen. Med temi sta najbolj omejujoča ERG13 in 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A (tHMGR). Če gena za ta encima prekomerno izrazimo, se poveča tudi proizvodnja prekurzorjev monoterpenoidov.&lt;br /&gt;<br /> Dodatna skupna omejitev modelov je sinteza ergosterola iz GPP, iz katerega nastajajo tudi prekurzorji monoterpenoidov. Ker je sinteza ergosterola nujna za celično rast, bodo modeli, ki temeljijo na endogeni poti MVA kvasovk, vedno omejeni v svojih donosih. Zaradi tega je bila preverjena učinkovitost proizvodnje tudi v peroksisomih, ker bi tako bila proizvodnja monoterpenoidov in ergosterola ločena. Peroksisomi predstavljajo zagotavljajo ugodne fiziološke pogoje za sintezo prekurzorjev monoterpenoidov&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;. Usmerjanje encimov V peroksisome je mogoče zlahka doseči z dodajanjem tripeptida C-terminalnega peroksisomskega ciljnega signala-1 (PTS1)&lt;ref&gt;[8]&lt;/ref&gt;. Skupaj se je preverjalo učinkovitost proizvodnje v citosolu in v peroksisomu bodisi v organizmih ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica''. &lt;br /&gt;<br /> MonChassis je sestavljena iz dveh komponent: sestava prekurzorjev terpenov v kvasovkah in in vitro kataliza spremembe prekurzerjev v monoterpenoide. V ta namen MonChassis uporablja samozasnovan bioreaktor za encimsko elektrosintezo (BREES) in modificirano citokrom P450 monooksigenazo BM3. Kot dokaz delovanja je potekla kataliza reakcije iz α-pinena v verbenon.<br /> <br /> <br /> == BREES ==<br /> <br /> Najlažji način za spopadanje s toksičnostjo produktov je uporaba brezceličnih sistemov. Tradicionalna biokataliza brez celic zahteva dodajanje kofaktorjev, kot je NADPH, ki zvišuje stroške za obsežne aplikacije. Da bi bila komponenta MonChassis ''in vitro'' uporabna v industrijskem obsegu je bilo potrebno razviti poceni alternativa. Zato je bil sestavljen BREES, bioreaktor za encimsko elektrosintezo. BM3, znan tudi kot citokrom P450 BM3 ali CYP102A1, je bakterijski encim citokroma P450, pridobljen iz ''Bacillus megaterium''. Je vsestranski encim z aktivnostmi monooksigenaze in hidroksilaze maščobnih kislin. Čeprav ni neposredno vpleten v proizvodnjo terpenoidov, so bili BM3 in njegove različice uporabljeni kot biokatalizatorji za modificiranje terpenoidnih spojin. Raziskovalci so izdelali BM3 in druge encime citokroma P450 za uvedbo hidroksilnih skupin, epoksidov ali drugih funkcionalnih skupin v terpenoidne molekule, kar omogoča katalizo α-pinena v končne monoterpenoide. Modificiran encim ima dodan peptidni povezovalec, ki lahko imobilizira encim na elektrodo iz indijevega kositrovega oksida in omogoči neposreden prenos elektronov z elektrode na encim&lt;ref&gt;[9]&lt;/ref&gt;. Zato lahko encim uporablja elektrone neposredno iz električne energije in ne zahteva dovajanja drugih kofaktorjev. V kombinaciji z inženirskimi sevi kvasovk MonChassis BREES omogoča hitro, prilagodljivo in obsežno proizvodnjo monoterpenoidov.<br /> <br /> <br /> == STRATEGIJA KLONIRANJA ==<br /> <br /> <br /> Po uradnih pravilih iGEM je bilo splošno kloniranje izvedeno v skladu z modularnim sistemom kloniranja RFC1000 (MoClo).<br /> Sistem MoClo se opira na restrikcijske encime tipa IIS, ki cepijo DNA tako, da nastanejo lepljivi konci. Ustvarjanje različnih koncev pri različnih fragmentih omogoča učinkovito sestavljanje več fragmentov DNA v eni preprosti reakciji ligacije. Primerna zasnova koncev omogoča, da se fragmenti sestavljajo samo v vnaprej določenem vrstnem redu. Vsi geni so bili pomnoženi z začetno verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo specifičnih začetnih oligonukleotidov z ustreznimi pritrjenimi konci.&lt;br /&gt;<br /> Končni zapisi so bil sestavljeni z metodo Golden Gate v vektor pSB1C00. V vektor so dovajali zapis transkripcijskih enot, ki so ga sestavljali promotorji, kodirno zaporedje in terminator. Z uporabo različnih promotorjev je bila mogoča sprememba ravni izražanja genov. Uspešno integracijo so preverili s selekcijo transformiranih kolonij, saj so celice konstitutivno izražale rdeči fluorescenčni protein (mRFP1).&lt;br /&gt;<br /> <br /> Za transformacijo kvasovk sta bili uporabljeni metodi Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-assotiated protein 9 (CRISPR-Cas9) in uporaba ekstrakromosomskih shuttle vektorjev. Vsak vektor vsebuje enega od štirih različnih selekcijskih markerjev (HIS3, TRP1, LEU2 ali URA3) za genomsko integracijo.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> Mevalonatna pot ''Saccharomyces cerevisiae'' so spremenili z metodo Golden Gate Assembly in ustavili heterolognega gena PptAPS ter povečali izražanje endogenih genov ScERG13 ali SctHMGR.&lt;br /&gt;<br /> Genske spremembe so temlejile na sistemu CRISPR-Cas9. Z namenom povečanja koncentracije mevalonata sta bila utišana ScROX1 in ScERG13 ter SctHMGR uravnavan z močnim promotorjem. Izločitev ScROX1 je bila ugodna za povečanje koncentracije mevalonata, saj zavira encime v MVA&lt;ref&gt;[10]&lt;/ref&gt;. Pri drugi varianti sta bila uvedena gena GgmFPS144 iz ''Gallus gallus'' in AgtGPPS2 iz ''Abies grandis'', da bi povečali koncentracijo geranil difosfata (GPP). Izločitev ScERG20 in vstavljanje GgmFPS144 sta bila potrebna za zaviranje reakcije GPP v (FPP)&lt;ref&gt;[11]&lt;/ref&gt;. Uvedba heterologne α-pinen sintaze (PptAPS) iz ''Pinus ponderosa'' je povečala proizvodnjo α-pinena v citosolu.&lt;br /&gt;<br /> Analiza z GC-MS je potrdila prisotnost α-pinena v lizatu.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v peroksisomih ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> Poleg citosola je peroksisom postal obetavna tarča za presnovni inženiring, saj naj bi njegove fiziološke lastnosti, kot je razpoložljivost substrata, znatno izboljšale sintezo produkta&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;.&lt;br /&gt;<br /> Ker se metabolizem mevalonata ne pojavlja naravno v peroksisomih&lt;ref&gt;[12]&lt;/ref&gt;, je bilo treba v vsak sev kvasovk pod nadzorom konstitutivnega promotorja pADH vključiti potrebne gene ScERG13, SctHMGR, ScERG12, ScERG8 in ScERG19, spojene s PTS1. V različnih primerih so v zapis vključili sintazo SltNPPS1 iz ''Solanum lycopersicum'', kar omogoča proizvodnjo monoterpenoidnega prekurzorja neril difosfata (NPP), ali heterologna gena GgmFPS144 in AgtGPPS2 iz ''Gallus gallus'' oziroma ''Abies grandis'', kar omogoča proizvodnjo NPP, strukturnega izomera geranil difosfata (GPP). V obeh primerih je bil dodan še zapis za PptAPS, ki katalizira reakcijo NPP ali GPP v α-pinen. Povečanje izražanja ScERG13 in SctHMGR je poteklo z uporabo promotorja ScpTEF.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Za primerjavo brezcelične proizvodnje verbenona v in vitro poskusih so pripravili tudi sev kvasovk, ki vsebuje citokrom P450 monooksigenazo (CYP) limonen-3-hidroksilazo (L3H) za sintezo verbenona iz α-pinena.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Končna ocena spremenjenih sevov kvasovk je bila izvedena s kvantifikacijo z uporabo GC-MS analize, ki je potrdila prisotnost α-pinena v obeh variantah kvasovk. <br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> ''Yarrowia lipolytica'' je obetaven organizem za sintezo monoterpenoidov, saj vsebuje visoko koncentracijo acetil-CoA, je sposoben učinkovito kopičiti lipide in kaže visoko toleranco do monoterpenoidov. Za izražanje terpinoidnih prekurzorjev v ''Yarrowia lipolytica'' so izrazili gena SctHMGR in ScERG13 organizma Saccharomyces cerevisiae. Uvedba genov AgtGPPS2 in GgMFPS144 bi pomenili zmanjšano količino proizvedenega farnezil pirofosfata (FPP) in povečano količino geranil pirofosfata (GPP). Drugi poskus je predvideval zmanjšanje količine proizvedenega FPP. To so poskušali narediti z uvedbo SltNPPS1 za proizvodnjo neril pirofosfata (NPP). Dodan je bil še gen PptAPS za proizvodnjo α-pinena.&lt;br /&gt;<br /> <br /> cPCR nikoli ni pokazal uspešne vstavitve genov, temveč so opazili le dolžine, ki bi jih pričakovali od prvotnega genomskega zaporedja. Zaradi časovnih omejitev pa poskus ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> ''Y. lipolytica'' je zaradi njegovega obsežnega metabolizma maščobnih kislin zanimiv organizem za peroksisomsko proizvodnjo monoterpenoidov. Poskus je predvideval implementacijo presnovnih poti, ki uporabljajo GPP ali NPP kot substrat za monoterpensko sintazo PptAPS v peroksisomih ''Y. lipolytica''. Geni, ki naj bi bili močno izraženi, so bili pod regulacijo promotorja YlpTEF, medtem ko so bili geni, ki so zahtevali šibkejšo ekspresijo, sestavljeni s promotorjem YlpGAP. &lt;br /&gt;<br /> <br /> Vsi geni poti, ki uporabljajo NPP, so bili uspešno sestavljeni, vendar zaradi pomanjkanja časa projekt ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> == LITERATURA ==<br /> <br /> [1] A. El Asbahani, K. Miladi, W. Badri, M. Sala, E. H. A. Addi, H. Casabianca, A. El Mousadik, D. Hartmann, A. Jilale, F. N. R. Renaud, et al.: Essential oils: From extraction to encapsulation. International Journal of Pharmaceutics. Elsevier B.V. April 15, 2015, pp 220–243.&lt;br /&gt;<br /> [2] Q. Gao, L. Wang, M. Zhang, Y. Wei, W. Lin: Recent Advances on Feasible Strategies for Monoterpenoid Production in Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. Frontiers Media S.A. December 1, 2020.&lt;br /&gt;<br /> [3] O. A. Carter, R. J. Peters, R. Croteau: Monoterpene biosynthesis pathway construction in Escherichia coli. Phytochemistry 2003, 64, 425–433.&lt;br /&gt;<br /> [4] M. T. Lundemo, J. M. Woodley: Guidelines for development and implementation of biocatalytic P450 processes. Applied Microbiology and Biotechnology. Springer Verlag February 28, 2015, pp 2465–2483.&lt;br /&gt;<br /> [5] C. Ignea, M. H. Raadam, M. S. Motawia, A. M. Makris, C. E. Vickers, S. C. Kampranis: Orthogonal monoterpenoid biosynthesis in yeast constructed on an isomeric substrate. Nat. Commun. 2019, 10.&lt;br /&gt;<br /> [6] J. Zhao, X. Bao, C. Li, Y. Shen, J. Hou: Improving monoterpene geraniol production through geranyl diphosphate synthesis regulation in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 4561–4571.&lt;br /&gt;<br /> [7] S. Dusséaux, W. T. Wajn, Y. Liu, C. Ignea, S. C. Kampranis: Transforming yeast peroxisomes into microfactories for the efficient production of high-value isoprenoids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020, 117, 31789–31799.&lt;br /&gt;<br /> [8] C. Brocard, A. Hartig: Peroxisome targeting signal 1: Is it really a simple tripeptide? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. Biochim Biophys Acta December 2006, pp 1565–1573.&lt;br /&gt;<br /> [9] S. Zernia, F. Ott, K. Bellmann-Sickert, R. Frank, M. Klenner, H. G. Jahnke, A. Prager, B. Abel, A. Robitzki, A. G. Beck-Sickinger: Peptide-Mediated Specific Immobilization of Catalytically Active Cytochrome P450 BM3 Variant. Bioconjug. Chem. 2016, 27, 1090–1097.&lt;br /&gt;<br /> [10] J. N. Bröker, B. Müller, N. van Deenen, D. Prüfer, C. Schulze Gronover: Upregulating the mevalonate pathway and repressing sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae enhances the production of triterpenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 6923–6934.&lt;br /&gt;<br /> [11] S. Brown, M. Clastre, V. Courdavault, S. E. O’Connor: De novo production of the plant-derived alkaloid strictosidine in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015, 112, 3205–3210.&lt;br /&gt;<br /> [12] C. Y. Zhang, N. B. Lin, X. S. Chai, Zhong-Li, D. G. Barnes: A rapid method for simultaneously determining ethanol and methanol content in wines by full evaporation headspace gas chromatography. Food Chem. 2015, 183, 169–172.&lt;br /&gt;</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2022/23&diff=21681 2023-04-03T08:14:02Z

<p>Nika Tomsič: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis MonChassis] (Nika Tomsič)<br /> #<br /> <br /> <br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Seminarji_SB_2022/23&diff=21680 2023-04-03T08:12:38Z

<p>Nika Tomsič: </p> <hr /> <div>V študijskem letu 2022/23 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme: <br /> <br /> RAZISKOVALNI ČLANKI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) &lt;br&gt;<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Rudarjenje_in_uporaba_konstitutivnih_promotorjev_iz_Rhodosporidium_toruloides Rudarjenje in uporaba konstitutivnih promotorjev iz ''Rhodosporidium toruloides''] (Ana Babnik)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biomolekularni_aktuatorji_za_gensko_selektivno_akusti%C4%8Dno_manipulacijo_celic Biomolekularni aktuatorji za gensko selektivno akustično manipulacijo celic] (Greta Junger)<br /> <br /> NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI<br /> <br /> (Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)<br /> # [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MonChassis] (Nika Tomsič)<br /> #<br /> <br /> <br /> ----<br /> <br /> Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo približno 5-minutna razprava.<br /> <br /> Terminski razpored je razviden iz preglednice na strežniku Google Drive.<br /> <br /> Kako je videti seznam seminarjev, lahko preverite pri lanskem letniku: [[Seminarji_SB_2021/22]].</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MonChassis&diff=21679 2023-04-03T08:11:28Z

<p>Nika Tomsič: </p> <hr /> <div>Svet se trenutno sooča z velikimi globalnimi težavami, zato je potrebno iskanje novih, trajnostnih rešitev. Poseben razred z obetajočimi aplikacijami so monoterpenoidi. Monoterpenoidi imajo širok spekter uporabe, na primer v kozmetiki, medicini, zatiranju škodljivcev, živilski industriji in biogorivih. Toda obsežna uporaba monoterpenoidov je redka zaradi cene in časa, ki so potrebni za njihovo pripravo. Skupina iGem iz Muenstera je leta 2022 raziskovala možnost njihove sinteze v kvasovkah. Predstavitev projekta je dostopna na sledeči povezavi: https://2022.igem.wiki/wwu-muenster/.<br /> <br /> <br /> == PROIZVODNJA MONOTERPENOIDOV ==<br /> <br /> <br /> === Ekstrakcija iz rastlin ===<br /> <br /> <br /> Primarni vir monoterpenoidov so rastline, kjer imajo pomembno vlogo v številnih fizioloških procesih. Rastlinska eterična olja vsebujejo več kot 80 % monoterpenoidov, vendar ima ekstrakcija eteričnih olj iz rastlin nizek izkoristek. Poleg tega je zaradi kompleksnosti eteričnih olj čiščenje posameznih monoterpenoidov stroškovno obsežno, naporno in neučinkovito. Sestava je namreč odvisna od pogojev rasti rastlin in njihovega shranjevanja &lt;ref&gt;[1]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> == Kemijska sinteza: ==<br /> <br /> Kemijska sinteza je bolj zanesljiva možnost za proizvajanje monoterpenov. Priprava enostavnih molekul je možna, medtem ko se cena in potrebna energija večata z večanjem kompleksnosti molekule. Poleg tega pe je kemijska sinteza okolju neprijazna zaradi onesnažujočih topil in katalizatorjev ter je včasih odvisna od neobnovljivih virov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v bakterijah ===<br /> <br /> <br /> Bakterije so pogosto prva izbira za proizvodnjo kemikalij ''in vivo'', saj je taka proizvodnja hitra in poceni. Za proizvodnjo monoterpenoidov pa ima delo z bakterijami več pomanjkljivosti. Prvič, obstaja pomanjkanje prekurzorja geranil difosfata (GPP) v bakterijskem gostitelju. Za povečanje sinteze je treba celotno pot mevalonata preoblikovati v bakterije&lt;ref&gt;[3]&lt;/ref&gt;. Drugič, koraki monoterpenoidne biosinteze zahtevajo funkcionalno izražanje CYP, kar je izziv pri bakterijah&lt;ref&gt;[4]&lt;/ref&gt;. Tretjič, tudi če se vsi heterologni geni lahko funkcionalno izrazijo, proizvodnja monoterpenoidov z bakterijami morda ne bo učinkovita. Kopičenje prekurzorjev vodi do zmanjšane rasti celic, različni monoterpenoidi pa imajo toksične učinke na bakterije z motnjami v celični membrani&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v kvasovkah ===<br /> <br /> <br /> Kvasovke predstavljajo privlačno alternativo za proizvodnjo monoterpenoidov. Kvasovke imajo pot endogenega mevalonata (MVA), pri kateri se GPP, predhodnik vseh monoterpenoidov, hitro pretvori v farnezil difosfat (FPP)&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Druga omejitev pri proizvodnji monoterpenoidov s kvasom je toksičnost proizvoda, ki lahko omeji količino proizvodnje&lt;ref&gt;[6]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> == MON CHASSIS ==<br /> <br /> MonChassis je prilagodljiva platforma na osnovi kvasovk za obsežno proizvodnjo monoterpenoidov. Temelji na pripravi terpenskih prekurzorjev v kvasovkah z uporabo sinteznobiološkega inženiringa ter s katalizo v končne produkte z brezceličnim sistemov encima CYP. Raziskovana je bila proizvodnja v ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica'' s spremembo moči promotorjev ključnih encimov in uvedbo novih zapisov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.&lt;br /&gt;<br /> <br /> '''Slika1: Prikaz mevalonatne poti S. cerevisiae. V modrem so napisani potrebni encimi in s puščico navzgor označeni encimi, katerih povečana aktivnost bi pomenila potencialno povečanje poizvodnje terpenoidnih prekurzorjev.'''&lt;br /&gt;<br /> <br /> Monoterpenoide se lahko učinkovito sintetizira z modifikacijo mevalonantne poti kvasovk&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Da bi povečali presnovni tok poti MVA, je bilo identificiranih in optimiziranih več pomembnih encimov, ki omejujejo hitrost poti. Z uvedbo dodatnih heterolognih genov in utišanjem endogenih genov je možno optimizirati proizvodnjo monoterpenoidov. Glavni cilj je bil povečati proizvodnjo geranil difosfata (GPP) v ''Saccharomyces cerevisiae'', saj deluje kot bistveni prekurzor za sintezo monoterpenoidov, kot je α-pinen. Med temi sta najbolj omejujoča ERG13 in 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A (tHMGR). Če gena za ta encima prekomerno izrazimo, se poveča tudi proizvodnja prekurzorjev monoterpenoidov.&lt;br /&gt;<br /> Dodatna skupna omejitev modelov je sinteza ergosterola iz GPP, iz katerega nastajajo tudi prekurzorji monoterpenoidov. Ker je sinteza ergosterola nujna za celično rast, bodo modeli, ki temeljijo na endogeni poti MVA kvasovk, vedno omejeni v svojih donosih. Zaradi tega je bila preverjena učinkovitost proizvodnje tudi v peroksisomih, ker bi tako bila proizvodnja monoterpenoidov in ergosterola ločena. Peroksisomi predstavljajo zagotavljajo ugodne fiziološke pogoje za sintezo prekurzorjev monoterpenoidov&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;. Usmerjanje encimov V peroksisome je mogoče zlahka doseči z dodajanjem tripeptida C-terminalnega peroksisomskega ciljnega signala-1 (PTS1)&lt;ref&gt;[8]&lt;/ref&gt;. Skupaj se je preverjalo učinkovitost proizvodnje v citosolu in v peroksisomu bodisi v organizmih ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica''. &lt;br /&gt;<br /> MonChassis je sestavljena iz dveh komponent: sestava prekurzorjev terpenov v kvasovkah in in vitro kataliza spremembe prekurzerjev v monoterpenoide. V ta namen MonChassis uporablja samozasnovan bioreaktor za encimsko elektrosintezo (BREES) in modificirano citokrom P450 monooksigenazo BM3. Kot dokaz delovanja je potekla kataliza reakcije iz α-pinena v verbenon.<br /> <br /> <br /> == BREES ==<br /> <br /> Najlažji način za spopadanje s toksičnostjo produktov je uporaba brezceličnih sistemov. Tradicionalna biokataliza brez celic zahteva dodajanje kofaktorjev, kot je NADPH, ki zvišuje stroške za obsežne aplikacije. Da bi bila komponenta MonChassis ''in vitro'' uporabna v industrijskem obsegu je bilo potrebno razviti poceni alternativa. Zato je bil sestavljen BREES, bioreaktor za encimsko elektrosintezo. BM3, znan tudi kot citokrom P450 BM3 ali CYP102A1, je bakterijski encim citokroma P450, pridobljen iz ''Bacillus megaterium''. Je vsestranski encim z aktivnostmi monooksigenaze in hidroksilaze maščobnih kislin. Čeprav ni neposredno vpleten v proizvodnjo terpenoidov, so bili BM3 in njegove različice uporabljeni kot biokatalizatorji za modificiranje terpenoidnih spojin. Raziskovalci so izdelali BM3 in druge encime citokroma P450 za uvedbo hidroksilnih skupin, epoksidov ali drugih funkcionalnih skupin v terpenoidne molekule, kar omogoča katalizo α-pinena v končne monoterpenoide. Modificiran encim ima dodan peptidni povezovalec, ki lahko imobilizira encim na elektrodo iz indijevega kositrovega oksida in omogoči neposreden prenos elektronov z elektrode na encim&lt;ref&gt;[9]&lt;/ref&gt;. Zato lahko encim uporablja elektrone neposredno iz električne energije in ne zahteva dovajanja drugih kofaktorjev. V kombinaciji z inženirskimi sevi kvasovk MonChassis BREES omogoča hitro, prilagodljivo in obsežno proizvodnjo monoterpenoidov.<br /> <br /> <br /> == STRATEGIJA KLONIRANJA ==<br /> <br /> <br /> Po uradnih pravilih iGEM je bilo splošno kloniranje izvedeno v skladu z modularnim sistemom kloniranja RFC1000 (MoClo).<br /> Sistem MoClo se opira na restrikcijske encime tipa IIS, ki cepijo DNA tako, da nastanejo lepljivi konci. Ustvarjanje različnih koncev pri različnih fragmentih omogoča učinkovito sestavljanje več fragmentov DNA v eni preprosti reakciji ligacije. Primerna zasnova koncev omogoča, da se fragmenti sestavljajo samo v vnaprej določenem vrstnem redu. Vsi geni so bili pomnoženi z začetno verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo specifičnih začetnih oligonukleotidov z ustreznimi pritrjenimi konci.&lt;br /&gt;<br /> Končni zapisi so bil sestavljeni z metodo Golden Gate v vektor pSB1C00. V vektor so dovajali zapis transkripcijskih enot, ki so ga sestavljali promotorji, kodirno zaporedje in terminator. Z uporabo različnih promotorjev je bila mogoča sprememba ravni izražanja genov. Uspešno integracijo so preverili s selekcijo transformiranih kolonij, saj so celice konstitutivno izražale rdeči fluorescenčni protein (mRFP1).&lt;br /&gt;<br /> <br /> Za transformacijo kvasovk sta bili uporabljeni metodi Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-assotiated protein 9 (CRISPR-Cas9) in uporaba ekstrakromosomskih shuttle vektorjev. Vsak vektor vsebuje enega od štirih različnih selekcijskih markerjev (HIS3, TRP1, LEU2 ali URA3) za genomsko integracijo.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> Mevalonatna pot ''Saccharomyces cerevisiae'' so spremenili z metodo Golden Gate Assembly in ustavili heterolognega gena PptAPS ter povečali izražanje endogenih genov ScERG13 ali SctHMGR.&lt;br /&gt;<br /> Genske spremembe so temlejile na sistemu CRISPR-Cas9. Z namenom povečanja koncentracije mevalonata sta bila utišana ScROX1 in ScERG13 ter SctHMGR uravnavan z močnim promotorjem. Izločitev ScROX1 je bila ugodna za povečanje koncentracije mevalonata, saj zavira encime v MVA&lt;ref&gt;[10]&lt;/ref&gt;. Pri drugi varianti sta bila uvedena gena GgmFPS144 iz ''Gallus gallus'' in AgtGPPS2 iz ''Abies grandis'', da bi povečali koncentracijo geranil difosfata (GPP). Izločitev ScERG20 in vstavljanje GgmFPS144 sta bila potrebna za zaviranje reakcije GPP v (FPP)&lt;ref&gt;[11]&lt;/ref&gt;. Uvedba heterologne α-pinen sintaze (PptAPS) iz ''Pinus ponderosa'' je povečala proizvodnjo α-pinena v citosolu.&lt;br /&gt;<br /> Analiza z GC-MS je potrdila prisotnost α-pinena v lizatu.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v peroksisomih ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> Poleg citosola je peroksisom postal obetavna tarča za presnovni inženiring, saj naj bi njegove fiziološke lastnosti, kot je razpoložljivost substrata, znatno izboljšale sintezo produkta&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;.&lt;br /&gt;<br /> Ker se metabolizem mevalonata ne pojavlja naravno v peroksisomih&lt;ref&gt;[12]&lt;/ref&gt;, je bilo treba v vsak sev kvasovk pod nadzorom konstitutivnega promotorja pADH vključiti potrebne gene ScERG13, SctHMGR, ScERG12, ScERG8 in ScERG19, spojene s PTS1. V različnih primerih so v zapis vključili sintazo SltNPPS1 iz ''Solanum lycopersicum'', kar omogoča proizvodnjo monoterpenoidnega prekurzorja neril difosfata (NPP), ali heterologna gena GgmFPS144 in AgtGPPS2 iz ''Gallus gallus'' oziroma ''Abies grandis'', kar omogoča proizvodnjo NPP, strukturnega izomera geranil difosfata (GPP). V obeh primerih je bil dodan še zapis za PptAPS, ki katalizira reakcijo NPP ali GPP v α-pinen. Povečanje izražanja ScERG13 in SctHMGR je poteklo z uporabo promotorja ScpTEF.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Za primerjavo brezcelične proizvodnje verbenona v in vitro poskusih so pripravili tudi sev kvasovk, ki vsebuje citokrom P450 monooksigenazo (CYP) limonen-3-hidroksilazo (L3H) za sintezo verbenona iz α-pinena.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Končna ocena spremenjenih sevov kvasovk je bila izvedena s kvantifikacijo z uporabo GC-MS analize, ki je potrdila prisotnost α-pinena v obeh variantah kvasovk. <br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> ''Yarrowia lipolytica'' je obetaven organizem za sintezo monoterpenoidov, saj vsebuje visoko koncentracijo acetil-CoA, je sposoben učinkovito kopičiti lipide in kaže visoko toleranco do monoterpenoidov. Za izražanje terpinoidnih prekurzorjev v ''Yarrowia lipolytica'' so izrazili gena SctHMGR in ScERG13 organizma Saccharomyces cerevisiae. Uvedba genov AgtGPPS2 in GgMFPS144 bi pomenili zmanjšano količino proizvedenega farnezil pirofosfata (FPP) in povečano količino geranil pirofosfata (GPP). Drugi poskus je predvideval zmanjšanje količine proizvedenega FPP. To so poskušali narediti z uvedbo SltNPPS1 za proizvodnjo neril pirofosfata (NPP). Dodan je bil še gen PptAPS za proizvodnjo α-pinena.&lt;br /&gt;<br /> <br /> cPCR nikoli ni pokazal uspešne vstavitve genov, temveč so opazili le dolžine, ki bi jih pričakovali od prvotnega genomskega zaporedja. Zaradi časovnih omejitev pa poskus ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> ''Y. lipolytica'' je zaradi njegovega obsežnega metabolizma maščobnih kislin zanimiv organizem za peroksisomsko proizvodnjo monoterpenoidov. Poskus je predvideval implementacijo presnovnih poti, ki uporabljajo GPP ali NPP kot substrat za monoterpensko sintazo PptAPS v peroksisomih ''Y. lipolytica''. Geni, ki naj bi bili močno izraženi, so bili pod regulacijo promotorja YlpTEF, medtem ko so bili geni, ki so zahtevali šibkejšo ekspresijo, sestavljeni s promotorjem YlpGAP. &lt;br /&gt;<br /> <br /> Vsi geni poti, ki uporabljajo NPP, so bili uspešno sestavljeni, vendar zaradi pomanjkanja časa projekt ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> == LITERATURA ==<br /> <br /> [1] A. El Asbahani, K. Miladi, W. Badri, M. Sala, E. H. A. Addi, H. Casabianca, A. El Mousadik, D. Hartmann, A. Jilale, F. N. R. Renaud, et al.: Essential oils: From extraction to encapsulation. International Journal of Pharmaceutics. Elsevier B.V. April 15, 2015, pp 220–243.&lt;br /&gt;<br /> [2] Q. Gao, L. Wang, M. Zhang, Y. Wei, W. Lin: Recent Advances on Feasible Strategies for Monoterpenoid Production in Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. Frontiers Media S.A. December 1, 2020.&lt;br /&gt;<br /> [3] O. A. Carter, R. J. Peters, R. Croteau: Monoterpene biosynthesis pathway construction in Escherichia coli. Phytochemistry 2003, 64, 425–433.&lt;br /&gt;<br /> [4] M. T. Lundemo, J. M. Woodley: Guidelines for development and implementation of biocatalytic P450 processes. Applied Microbiology and Biotechnology. Springer Verlag February 28, 2015, pp 2465–2483.&lt;br /&gt;<br /> [5] C. Ignea, M. H. Raadam, M. S. Motawia, A. M. Makris, C. E. Vickers, S. C. Kampranis: Orthogonal monoterpenoid biosynthesis in yeast constructed on an isomeric substrate. Nat. Commun. 2019, 10.&lt;br /&gt;<br /> [6] J. Zhao, X. Bao, C. Li, Y. Shen, J. Hou: Improving monoterpene geraniol production through geranyl diphosphate synthesis regulation in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 4561–4571.&lt;br /&gt;<br /> [7] S. Dusséaux, W. T. Wajn, Y. Liu, C. Ignea, S. C. Kampranis: Transforming yeast peroxisomes into microfactories for the efficient production of high-value isoprenoids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020, 117, 31789–31799.&lt;br /&gt;<br /> [8] C. Brocard, A. Hartig: Peroxisome targeting signal 1: Is it really a simple tripeptide? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. Biochim Biophys Acta December 2006, pp 1565–1573.&lt;br /&gt;<br /> [9] S. Zernia, F. Ott, K. Bellmann-Sickert, R. Frank, M. Klenner, H. G. Jahnke, A. Prager, B. Abel, A. Robitzki, A. G. Beck-Sickinger: Peptide-Mediated Specific Immobilization of Catalytically Active Cytochrome P450 BM3 Variant. Bioconjug. Chem. 2016, 27, 1090–1097.&lt;br /&gt;<br /> [10] J. N. Bröker, B. Müller, N. van Deenen, D. Prüfer, C. Schulze Gronover: Upregulating the mevalonate pathway and repressing sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae enhances the production of triterpenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 6923–6934.&lt;br /&gt;<br /> [11] S. Brown, M. Clastre, V. Courdavault, S. E. O’Connor: De novo production of the plant-derived alkaloid strictosidine in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015, 112, 3205–3210.&lt;br /&gt;<br /> [12] C. Y. Zhang, N. B. Lin, X. S. Chai, Zhong-Li, D. G. Barnes: A rapid method for simultaneously determining ethanol and methanol content in wines by full evaporation headspace gas chromatography. Food Chem. 2015, 183, 169–172.&lt;br /&gt;</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MonChassis&diff=21678 2023-04-03T08:05:33Z

<p>Nika Tomsič: /* Proizvodnja v citosolu Yarrowia lipolytica */</p> <hr /> <div>Svet se trenutno sooča z velikimi globalnimi težavami, zato je potrebno iskanje novih, trajnostnih rešitev. Poseben razred z obetajočimi aplikacijami so monoterpenoidi. Monoterpenoidi imajo širok spekter uporabe, na primer v kozmetiki, medicini, zatiranju škodljivcev, živilski industriji in biogorivih. Toda obsežna uporaba monoterpenoidov je redka zaradi cene in časa, ki so potrebni za njihovo pripravo. Skupina iGem iz Muenstera je leta 2022 raziskovala možnost njihove sinteze v kvasovkah. Predstavitev projekta je dostopna na sledeči povezavi: https://2022.igem.wiki/wwu-muenster/.<br /> <br /> <br /> == PROIZVODNJA MONOTERPENOIDOV ==<br /> <br /> <br /> === Ekstrakcija iz rastlin ===<br /> <br /> <br /> Primarni vir monoterpenoidov so rastline, kjer imajo pomembno vlogo v številnih fizioloških procesih. Rastlinska eterična olja vsebujejo več kot 80 % monoterpenoidov, vendar ima ekstrakcija eteričnih olj iz rastlin nizek izkoristek. Poleg tega je zaradi kompleksnosti eteričnih olj čiščenje posameznih monoterpenoidov stroškovno obsežno, naporno in neučinkovito. Sestava je namreč odvisna od pogojev rasti rastlin in njihovega shranjevanja &lt;ref&gt;[1]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> == Kemijska sinteza: ==<br /> <br /> Kemijska sinteza je bolj zanesljiva možnost za proizvajanje monoterpenov. Priprava enostavnih molekul je možna, medtem ko se cena in potrebna energija večata z večanjem kompleksnosti molekule. Poleg tega pe je kemijska sinteza okolju neprijazna zaradi onesnažujočih topil in katalizatorjev ter je včasih odvisna od neobnovljivih virov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v bakterijah ===<br /> <br /> <br /> Bakterije so pogosto prva izbira za proizvodnjo kemikalij ''in vivo'', saj je taka proizvodnja hitra in poceni. Za proizvodnjo monoterpenoidov pa ima delo z bakterijami več pomanjkljivosti. Prvič, obstaja pomanjkanje prekurzorja geranil difosfata (GPP) v bakterijskem gostitelju. Za povečanje sinteze je treba celotno pot mevalonata preoblikovati v bakterije&lt;ref&gt;[3]&lt;/ref&gt;. Drugič, koraki monoterpenoidne biosinteze zahtevajo funkcionalno izražanje CYP, kar je izziv pri bakterijah&lt;ref&gt;[4]&lt;/ref&gt;. Tretjič, tudi če se vsi heterologni geni lahko funkcionalno izrazijo, proizvodnja monoterpenoidov z bakterijami morda ne bo učinkovita. Kopičenje prekurzorjev vodi do zmanjšane rasti celic, različni monoterpenoidi pa imajo toksične učinke na bakterije z motnjami v celični membrani&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v kvasovkah ===<br /> <br /> <br /> Kvasovke predstavljajo privlačno alternativo za proizvodnjo monoterpenoidov. Kvasovke imajo pot endogenega mevalonata (MVA), pri kateri se GPP, predhodnik vseh monoterpenoidov, hitro pretvori v farnezil difosfat (FPP)&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Druga omejitev pri proizvodnji monoterpenoidov s kvasom je toksičnost proizvoda, ki lahko omeji količino proizvodnje&lt;ref&gt;[6]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> == MON CHASSIS ==<br /> <br /> MonChassis je prilagodljiva platforma na osnovi kvasovk za obsežno proizvodnjo monoterpenoidov. Temelji na pripravi terpenskih prekurzorjev v kvasovkah z uporabo sinteznobiološkega inženiringa ter s katalizo v končne produkte z brezceličnim sistemov encima CYP. Raziskovana je bila proizvodnja v ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica'' s spremembo moči promotorjev ključnih encimov in uvedbo novih zapisov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.&lt;br /&gt;<br /> <br /> '''Slika1: Prikaz mevalonatne poti S. cerevisiae. V modrem so napisani potrebni encimi in s puščico navzgor označeni encimi, katerih povečana aktivnost bi pomenila potencialno povečanje poizvodnje terpenoidnih prekurzorjev.'''&lt;br /&gt;<br /> <br /> Monoterpenoide se lahko učinkovito sintetizira z modifikacijo mevalonantne poti kvasovk&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Da bi povečali presnovni tok poti MVA, je bilo identificiranih in optimiziranih več pomembnih encimov, ki omejujejo hitrost poti. Z uvedbo dodatnih heterolognih genov in utišanjem endogenih genov je možno optimizirati proizvodnjo monoterpenoidov. Glavni cilj je bil povečati proizvodnjo geranil difosfata (GPP) v ''Saccharomyces cerevisiae'', saj deluje kot bistveni prekurzor za sintezo monoterpenoidov, kot je α-pinen. Med temi sta najbolj omejujoča ERG13 in 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A (tHMGR). Če gena za ta encima prekomerno izrazimo, se poveča tudi proizvodnja prekurzorjev monoterpenoidov.&lt;br /&gt;<br /> Dodatna skupna omejitev modelov je sinteza ergosterola iz GPP, iz katerega nastajajo tudi prekurzorji monoterpenoidov. Ker je sinteza ergosterola nujna za celično rast, bodo modeli, ki temeljijo na endogeni poti MVA kvasovk, vedno omejeni v svojih donosih. Zaradi tega je bila preverjena učinkovitost proizvodnje tudi v peroksisomih, ker bi tako bila proizvodnja monoterpenoidov in ergosterola ločena. Peroksisomi predstavljajo zagotavljajo ugodne fiziološke pogoje za sintezo prekurzorjev monoterpenoidov&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;. Usmerjanje encimov V peroksisome je mogoče zlahka doseči z dodajanjem tripeptida C-terminalnega peroksisomskega ciljnega signala-1 (PTS1)&lt;ref&gt;[8]&lt;/ref&gt;. Skupaj se je preverjalo učinkovitost proizvodnje v citosolu in v peroksisomu bodisi v organizmih ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica''. &lt;br /&gt;<br /> MonChassis je sestavljena iz dveh komponent: sestava prekurzorjev terpenov v kvasovkah in in vitro kataliza spremembe prekurzerjev v monoterpenoide. V ta namen MonChassis uporablja samozasnovan bioreaktor za encimsko elektrosintezo (BREES) in modificirano citokrom P450 monooksigenazo BM3. Kot dokaz delovanja je potekla kataliza reakcije iz α-pinena v verbenon.<br /> <br /> <br /> == BREES ==<br /> <br /> Najlažji način za spopadanje s toksičnostjo produktov je uporaba brezceličnih sistemov. Tradicionalna biokataliza brez celic zahteva dodajanje kofaktorjev, kot je NADPH, ki zvišuje stroške za obsežne aplikacije. Da bi bila komponenta MonChassis ''in vitro'' uporabna v industrijskem obsegu je bilo potrebno razviti poceni alternativa. Zato je bil sestavljen BREES, bioreaktor za encimsko elektrosintezo. BM3, znan tudi kot citokrom P450 BM3 ali CYP102A1, je bakterijski encim citokroma P450, pridobljen iz ''Bacillus megaterium''. Je vsestranski encim z aktivnostmi monooksigenaze in hidroksilaze maščobnih kislin. Čeprav ni neposredno vpleten v proizvodnjo terpenoidov, so bili BM3 in njegove različice uporabljeni kot biokatalizatorji za modificiranje terpenoidnih spojin. Raziskovalci so izdelali BM3 in druge encime citokroma P450 za uvedbo hidroksilnih skupin, epoksidov ali drugih funkcionalnih skupin v terpenoidne molekule, kar omogoča katalizo α-pinena v končne monoterpenoide. Modificiran encim ima dodan peptidni povezovalec, ki lahko imobilizira encim na elektrodo iz indijevega kositrovega oksida in omogoči neposreden prenos elektronov z elektrode na encim&lt;ref&gt;[9]&lt;/ref&gt;. Zato lahko encim uporablja elektrone neposredno iz električne energije in ne zahteva dovajanja drugih kofaktorjev. V kombinaciji z inženirskimi sevi kvasovk MonChassis BREES omogoča hitro, prilagodljivo in obsežno proizvodnjo monoterpenoidov.<br /> <br /> <br /> == STRATEGIJA KLONIRANJA ==<br /> <br /> <br /> Po uradnih pravilih iGEM je bilo splošno kloniranje izvedeno v skladu z modularnim sistemom kloniranja RFC1000 (MoClo).<br /> Sistem MoClo se opira na restrikcijske encime tipa IIS, ki cepijo DNA tako, da nastanejo lepljivi konci. Ustvarjanje različnih koncev pri različnih fragmentih omogoča učinkovito sestavljanje več fragmentov DNA v eni preprosti reakciji ligacije. Primerna zasnova koncev omogoča, da se fragmenti sestavljajo samo v vnaprej določenem vrstnem redu. Vsi geni so bili pomnoženi z začetno verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo specifičnih začetnih oligonukleotidov z ustreznimi pritrjenimi konci.&lt;br /&gt;<br /> Končni zapisi so bil sestavljeni z metodo Golden Gate v vektor pSB1C00. V vektor so dovajali zapis transkripcijskih enot, ki so ga sestavljali promotorji, kodirno zaporedje in terminator. Z uporabo različnih promotorjev je bila mogoča sprememba ravni izražanja genov. Uspešno integracijo so preverili s selekcijo transformiranih kolonij, saj so celice konstitutivno izražale rdeči fluorescenčni protein (mRFP1).&lt;br /&gt;<br /> <br /> Za transformacijo kvasovk sta bili uporabljeni metodi Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-assotiated protein 9 (CRISPR-Cas9) in uporaba ekstrakromosomskih shuttle vektorjev. Vsak vektor vsebuje enega od štirih različnih selekcijskih markerjev (HIS3, TRP1, LEU2 ali URA3) za genomsko integracijo.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> Mevalonatna pot ''Saccharomyces cerevisiae'' so spremenili z metodo Golden Gate Assembly in ustavili heterolognega gena PptAPS ter povečali izražanje endogenih genov ScERG13 ali SctHMGR.&lt;br /&gt;<br /> Genske spremembe so temlejile na sistemu CRISPR-Cas9. Z namenom povečanja koncentracije mevalonata sta bila utišana ScROX1 in ScERG13 ter SctHMGR uravnavan z močnim promotorjem. Izločitev ScROX1 je bila ugodna za povečanje koncentracije mevalonata, saj zavira encime v MVA&lt;ref&gt;[10]&lt;/ref&gt;. Pri drugi varianti sta bila uvedena gena GgmFPS144 iz ''Gallus gallus'' in AgtGPPS2 iz ''Abies grandis'', da bi povečali koncentracijo geranil difosfata (GPP). Izločitev ScERG20 in vstavljanje GgmFPS144 sta bila potrebna za zaviranje reakcije GPP v (FPP)&lt;ref&gt;[11]&lt;/ref&gt;. Uvedba heterologne α-pinen sintaze (PptAPS) iz ''Pinus ponderosa'' je povečala proizvodnjo α-pinena v citosolu.&lt;br /&gt;<br /> Analiza z GC-MS je potrdila prisotnost α-pinena v lizatu.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v peroksisomih ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> Poleg citosola je peroksisom postal obetavna tarča za presnovni inženiring, saj naj bi njegove fiziološke lastnosti, kot je razpoložljivost substrata, znatno izboljšale sintezo produkta&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;.&lt;br /&gt;<br /> Ker se metabolizem mevalonata ne pojavlja naravno v peroksisomih&lt;ref&gt;[12]&lt;/ref&gt;, je bilo treba v vsak sev kvasovk pod nadzorom konstitutivnega promotorja pADH vključiti potrebne gene ScERG13, SctHMGR, ScERG12, ScERG8 in ScERG19, spojene s PTS1. V različnih primerih so v zapis vključili sintazo SltNPPS1 iz ''Solanum lycopersicum'', kar omogoča proizvodnjo monoterpenoidnega prekurzorja neril difosfata (NPP), ali heterologna gena GgmFPS144 in AgtGPPS2 iz ''Gallus gallus'' oziroma ''Abies grandis'', kar omogoča proizvodnjo NPP, strukturnega izomera geranil difosfata (GPP). V obeh primerih je bil dodan še zapis za PptAPS, ki katalizira reakcijo NPP ali GPP v α-pinen. Povečanje izražanja ScERG13 in SctHMGR je poteklo z uporabo promotorja ScpTEF.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Za primerjavo brezcelične proizvodnje verbenona v in vitro poskusih so pripravili tudi sev kvasovk, ki vsebuje citokrom P450 monooksigenazo (CYP) limonen-3-hidroksilazo (L3H) za sintezo verbenona iz α-pinena.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Končna ocena spremenjenih sevov kvasovk je bila izvedena s kvantifikacijo z uporabo GC-MS analize, ki je potrdila prisotnost α-pinena v obeh variantah kvasovk. <br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> ''Yarrowia lipolytica'' je obetaven organizem za sintezo monoterpenoidov, saj vsebuje visoko koncentracijo acetil-CoA, je sposoben učinkovito kopičiti lipide in kaže visoko toleranco do monoterpenoidov. Za izražanje terpinoidnih prekurzorjev v ''Yarrowia lipolytica'' so izrazili gena SctHMGR in ScERG13 organizma Saccharomyces cerevisiae. Uvedba genov AgtGPPS2 in GgMFPS144 bi pomenili zmanjšano količino proizvedenega farnezil pirofosfata (FPP) in povečano količino geranil pirofosfata (GPP). Drugi poskus je predvideval zmanjšanje količine proizvedenega FPP. To so poskušali narediti z uvedbo SltNPPS1 za proizvodnjo neril pirofosfata (NPP). Dodan je bil še gen PptAPS za proizvodnjo α-pinena.&lt;br /&gt;<br /> <br /> cPCR nikoli ni pokazal uspešne vstavitve genov, temveč so opazili le dolžine, ki bi jih pričakovali od prvotnega genomskega zaporedja. Zaradi časovnih omejitev pa poskus ni nadaljeval.<br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> ''Y. lipolytica'' je zaradi njegovega obsežnega metabolizma maščobnih kislin zanimiv organizem za peroksisomsko proizvodnjo monoterpenoidov. Poskus je predvideval implementacijo presnovnih poti, ki uporabljajo GPP ali NPP kot substrat za monoterpensko sintazo PptAPS v peroksisomih ''Y. lipolytica''. Geni, ki naj bi bili močno izraženi, so bili pod regulacijo promotorja YlpTEF, medtem ko so bili geni, ki so zahtevali šibkejšo ekspresijo, sestavljeni s promotorjem YlpGAP. &lt;br /&gt;<br /> <br /> Vsi geni poti, ki uporabljajo NPP, so bili uspešno sestavljeni, vendar zaradi pomanjkanja časa projekt ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> == LITERATURA ==<br /> <br /> [1] A. El Asbahani, K. Miladi, W. Badri, M. Sala, E. H. A. Addi, H. Casabianca, A. El Mousadik, D. Hartmann, A. Jilale, F. N. R. Renaud, et al.: Essential oils: From extraction to encapsulation. International Journal of Pharmaceutics. Elsevier B.V. April 15, 2015, pp 220–243.&lt;br /&gt;<br /> [2] Q. Gao, L. Wang, M. Zhang, Y. Wei, W. Lin: Recent Advances on Feasible Strategies for Monoterpenoid Production in Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. Frontiers Media S.A. December 1, 2020.&lt;br /&gt;<br /> [3] O. A. Carter, R. J. Peters, R. Croteau: Monoterpene biosynthesis pathway construction in Escherichia coli. Phytochemistry 2003, 64, 425–433.&lt;br /&gt;<br /> [4] M. T. Lundemo, J. M. Woodley: Guidelines for development and implementation of biocatalytic P450 processes. Applied Microbiology and Biotechnology. Springer Verlag February 28, 2015, pp 2465–2483.&lt;br /&gt;<br /> [5] C. Ignea, M. H. Raadam, M. S. Motawia, A. M. Makris, C. E. Vickers, S. C. Kampranis: Orthogonal monoterpenoid biosynthesis in yeast constructed on an isomeric substrate. Nat. Commun. 2019, 10.&lt;br /&gt;<br /> [6] J. Zhao, X. Bao, C. Li, Y. Shen, J. Hou: Improving monoterpene geraniol production through geranyl diphosphate synthesis regulation in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 4561–4571.&lt;br /&gt;<br /> [7] S. Dusséaux, W. T. Wajn, Y. Liu, C. Ignea, S. C. Kampranis: Transforming yeast peroxisomes into microfactories for the efficient production of high-value isoprenoids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020, 117, 31789–31799.&lt;br /&gt;<br /> [8] C. Brocard, A. Hartig: Peroxisome targeting signal 1: Is it really a simple tripeptide? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. Biochim Biophys Acta December 2006, pp 1565–1573.&lt;br /&gt;<br /> [9] S. Zernia, F. Ott, K. Bellmann-Sickert, R. Frank, M. Klenner, H. G. Jahnke, A. Prager, B. Abel, A. Robitzki, A. G. Beck-Sickinger: Peptide-Mediated Specific Immobilization of Catalytically Active Cytochrome P450 BM3 Variant. Bioconjug. Chem. 2016, 27, 1090–1097.&lt;br /&gt;<br /> [10] J. N. Bröker, B. Müller, N. van Deenen, D. Prüfer, C. Schulze Gronover: Upregulating the mevalonate pathway and repressing sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae enhances the production of triterpenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 6923–6934.&lt;br /&gt;<br /> [11] S. Brown, M. Clastre, V. Courdavault, S. E. O’Connor: De novo production of the plant-derived alkaloid strictosidine in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015, 112, 3205–3210.&lt;br /&gt;<br /> [12] C. Y. Zhang, N. B. Lin, X. S. Chai, Zhong-Li, D. G. Barnes: A rapid method for simultaneously determining ethanol and methanol content in wines by full evaporation headspace gas chromatography. Food Chem. 2015, 183, 169–172.&lt;br /&gt;</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MonChassis&diff=21677 2023-04-03T08:04:17Z

<p>Nika Tomsič: </p> <hr /> <div>Svet se trenutno sooča z velikimi globalnimi težavami, zato je potrebno iskanje novih, trajnostnih rešitev. Poseben razred z obetajočimi aplikacijami so monoterpenoidi. Monoterpenoidi imajo širok spekter uporabe, na primer v kozmetiki, medicini, zatiranju škodljivcev, živilski industriji in biogorivih. Toda obsežna uporaba monoterpenoidov je redka zaradi cene in časa, ki so potrebni za njihovo pripravo. Skupina iGem iz Muenstera je leta 2022 raziskovala možnost njihove sinteze v kvasovkah. Predstavitev projekta je dostopna na sledeči povezavi: https://2022.igem.wiki/wwu-muenster/.<br /> <br /> <br /> == PROIZVODNJA MONOTERPENOIDOV ==<br /> <br /> <br /> === Ekstrakcija iz rastlin ===<br /> <br /> <br /> Primarni vir monoterpenoidov so rastline, kjer imajo pomembno vlogo v številnih fizioloških procesih. Rastlinska eterična olja vsebujejo več kot 80 % monoterpenoidov, vendar ima ekstrakcija eteričnih olj iz rastlin nizek izkoristek. Poleg tega je zaradi kompleksnosti eteričnih olj čiščenje posameznih monoterpenoidov stroškovno obsežno, naporno in neučinkovito. Sestava je namreč odvisna od pogojev rasti rastlin in njihovega shranjevanja &lt;ref&gt;[1]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> == Kemijska sinteza: ==<br /> <br /> Kemijska sinteza je bolj zanesljiva možnost za proizvajanje monoterpenov. Priprava enostavnih molekul je možna, medtem ko se cena in potrebna energija večata z večanjem kompleksnosti molekule. Poleg tega pe je kemijska sinteza okolju neprijazna zaradi onesnažujočih topil in katalizatorjev ter je včasih odvisna od neobnovljivih virov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v bakterijah ===<br /> <br /> <br /> Bakterije so pogosto prva izbira za proizvodnjo kemikalij ''in vivo'', saj je taka proizvodnja hitra in poceni. Za proizvodnjo monoterpenoidov pa ima delo z bakterijami več pomanjkljivosti. Prvič, obstaja pomanjkanje prekurzorja geranil difosfata (GPP) v bakterijskem gostitelju. Za povečanje sinteze je treba celotno pot mevalonata preoblikovati v bakterije&lt;ref&gt;[3]&lt;/ref&gt;. Drugič, koraki monoterpenoidne biosinteze zahtevajo funkcionalno izražanje CYP, kar je izziv pri bakterijah&lt;ref&gt;[4]&lt;/ref&gt;. Tretjič, tudi če se vsi heterologni geni lahko funkcionalno izrazijo, proizvodnja monoterpenoidov z bakterijami morda ne bo učinkovita. Kopičenje prekurzorjev vodi do zmanjšane rasti celic, različni monoterpenoidi pa imajo toksične učinke na bakterije z motnjami v celični membrani&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v kvasovkah ===<br /> <br /> <br /> Kvasovke predstavljajo privlačno alternativo za proizvodnjo monoterpenoidov. Kvasovke imajo pot endogenega mevalonata (MVA), pri kateri se GPP, predhodnik vseh monoterpenoidov, hitro pretvori v farnezil difosfat (FPP)&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Druga omejitev pri proizvodnji monoterpenoidov s kvasom je toksičnost proizvoda, ki lahko omeji količino proizvodnje&lt;ref&gt;[6]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> == MON CHASSIS ==<br /> <br /> MonChassis je prilagodljiva platforma na osnovi kvasovk za obsežno proizvodnjo monoterpenoidov. Temelji na pripravi terpenskih prekurzorjev v kvasovkah z uporabo sinteznobiološkega inženiringa ter s katalizo v končne produkte z brezceličnim sistemov encima CYP. Raziskovana je bila proizvodnja v ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica'' s spremembo moči promotorjev ključnih encimov in uvedbo novih zapisov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.&lt;br /&gt;<br /> <br /> '''Slika1: Prikaz mevalonatne poti S. cerevisiae. V modrem so napisani potrebni encimi in s puščico navzgor označeni encimi, katerih povečana aktivnost bi pomenila potencialno povečanje poizvodnje terpenoidnih prekurzorjev.'''&lt;br /&gt;<br /> <br /> Monoterpenoide se lahko učinkovito sintetizira z modifikacijo mevalonantne poti kvasovk&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Da bi povečali presnovni tok poti MVA, je bilo identificiranih in optimiziranih več pomembnih encimov, ki omejujejo hitrost poti. Z uvedbo dodatnih heterolognih genov in utišanjem endogenih genov je možno optimizirati proizvodnjo monoterpenoidov. Glavni cilj je bil povečati proizvodnjo geranil difosfata (GPP) v ''Saccharomyces cerevisiae'', saj deluje kot bistveni prekurzor za sintezo monoterpenoidov, kot je α-pinen. Med temi sta najbolj omejujoča ERG13 in 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A (tHMGR). Če gena za ta encima prekomerno izrazimo, se poveča tudi proizvodnja prekurzorjev monoterpenoidov.&lt;br /&gt;<br /> Dodatna skupna omejitev modelov je sinteza ergosterola iz GPP, iz katerega nastajajo tudi prekurzorji monoterpenoidov. Ker je sinteza ergosterola nujna za celično rast, bodo modeli, ki temeljijo na endogeni poti MVA kvasovk, vedno omejeni v svojih donosih. Zaradi tega je bila preverjena učinkovitost proizvodnje tudi v peroksisomih, ker bi tako bila proizvodnja monoterpenoidov in ergosterola ločena. Peroksisomi predstavljajo zagotavljajo ugodne fiziološke pogoje za sintezo prekurzorjev monoterpenoidov&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;. Usmerjanje encimov V peroksisome je mogoče zlahka doseči z dodajanjem tripeptida C-terminalnega peroksisomskega ciljnega signala-1 (PTS1)&lt;ref&gt;[8]&lt;/ref&gt;. Skupaj se je preverjalo učinkovitost proizvodnje v citosolu in v peroksisomu bodisi v organizmih ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica''. &lt;br /&gt;<br /> MonChassis je sestavljena iz dveh komponent: sestava prekurzorjev terpenov v kvasovkah in in vitro kataliza spremembe prekurzerjev v monoterpenoide. V ta namen MonChassis uporablja samozasnovan bioreaktor za encimsko elektrosintezo (BREES) in modificirano citokrom P450 monooksigenazo BM3. Kot dokaz delovanja je potekla kataliza reakcije iz α-pinena v verbenon.<br /> <br /> <br /> == BREES ==<br /> <br /> Najlažji način za spopadanje s toksičnostjo produktov je uporaba brezceličnih sistemov. Tradicionalna biokataliza brez celic zahteva dodajanje kofaktorjev, kot je NADPH, ki zvišuje stroške za obsežne aplikacije. Da bi bila komponenta MonChassis ''in vitro'' uporabna v industrijskem obsegu je bilo potrebno razviti poceni alternativa. Zato je bil sestavljen BREES, bioreaktor za encimsko elektrosintezo. BM3, znan tudi kot citokrom P450 BM3 ali CYP102A1, je bakterijski encim citokroma P450, pridobljen iz ''Bacillus megaterium''. Je vsestranski encim z aktivnostmi monooksigenaze in hidroksilaze maščobnih kislin. Čeprav ni neposredno vpleten v proizvodnjo terpenoidov, so bili BM3 in njegove različice uporabljeni kot biokatalizatorji za modificiranje terpenoidnih spojin. Raziskovalci so izdelali BM3 in druge encime citokroma P450 za uvedbo hidroksilnih skupin, epoksidov ali drugih funkcionalnih skupin v terpenoidne molekule, kar omogoča katalizo α-pinena v končne monoterpenoide. Modificiran encim ima dodan peptidni povezovalec, ki lahko imobilizira encim na elektrodo iz indijevega kositrovega oksida in omogoči neposreden prenos elektronov z elektrode na encim&lt;ref&gt;[9]&lt;/ref&gt;. Zato lahko encim uporablja elektrone neposredno iz električne energije in ne zahteva dovajanja drugih kofaktorjev. V kombinaciji z inženirskimi sevi kvasovk MonChassis BREES omogoča hitro, prilagodljivo in obsežno proizvodnjo monoterpenoidov.<br /> <br /> <br /> == STRATEGIJA KLONIRANJA ==<br /> <br /> <br /> Po uradnih pravilih iGEM je bilo splošno kloniranje izvedeno v skladu z modularnim sistemom kloniranja RFC1000 (MoClo).<br /> Sistem MoClo se opira na restrikcijske encime tipa IIS, ki cepijo DNA tako, da nastanejo lepljivi konci. Ustvarjanje različnih koncev pri različnih fragmentih omogoča učinkovito sestavljanje več fragmentov DNA v eni preprosti reakciji ligacije. Primerna zasnova koncev omogoča, da se fragmenti sestavljajo samo v vnaprej določenem vrstnem redu. Vsi geni so bili pomnoženi z začetno verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo specifičnih začetnih oligonukleotidov z ustreznimi pritrjenimi konci.&lt;br /&gt;<br /> Končni zapisi so bil sestavljeni z metodo Golden Gate v vektor pSB1C00. V vektor so dovajali zapis transkripcijskih enot, ki so ga sestavljali promotorji, kodirno zaporedje in terminator. Z uporabo različnih promotorjev je bila mogoča sprememba ravni izražanja genov. Uspešno integracijo so preverili s selekcijo transformiranih kolonij, saj so celice konstitutivno izražale rdeči fluorescenčni protein (mRFP1).&lt;br /&gt;<br /> <br /> Za transformacijo kvasovk sta bili uporabljeni metodi Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-assotiated protein 9 (CRISPR-Cas9) in uporaba ekstrakromosomskih shuttle vektorjev. Vsak vektor vsebuje enega od štirih različnih selekcijskih markerjev (HIS3, TRP1, LEU2 ali URA3) za genomsko integracijo.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> Mevalonatna pot ''Saccharomyces cerevisiae'' so spremenili z metodo Golden Gate Assembly in ustavili heterolognega gena PptAPS ter povečali izražanje endogenih genov ScERG13 ali SctHMGR.&lt;br /&gt;<br /> Genske spremembe so temlejile na sistemu CRISPR-Cas9. Z namenom povečanja koncentracije mevalonata sta bila utišana ScROX1 in ScERG13 ter SctHMGR uravnavan z močnim promotorjem. Izločitev ScROX1 je bila ugodna za povečanje koncentracije mevalonata, saj zavira encime v MVA&lt;ref&gt;[10]&lt;/ref&gt;. Pri drugi varianti sta bila uvedena gena GgmFPS144 iz ''Gallus gallus'' in AgtGPPS2 iz ''Abies grandis'', da bi povečali koncentracijo geranil difosfata (GPP). Izločitev ScERG20 in vstavljanje GgmFPS144 sta bila potrebna za zaviranje reakcije GPP v (FPP)&lt;ref&gt;[11]&lt;/ref&gt;. Uvedba heterologne α-pinen sintaze (PptAPS) iz ''Pinus ponderosa'' je povečala proizvodnjo α-pinena v citosolu.&lt;br /&gt;<br /> Analiza z GC-MS je potrdila prisotnost α-pinena v lizatu.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v peroksisomih ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> Poleg citosola je peroksisom postal obetavna tarča za presnovni inženiring, saj naj bi njegove fiziološke lastnosti, kot je razpoložljivost substrata, znatno izboljšale sintezo produkta&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;.&lt;br /&gt;<br /> Ker se metabolizem mevalonata ne pojavlja naravno v peroksisomih&lt;ref&gt;[12]&lt;/ref&gt;, je bilo treba v vsak sev kvasovk pod nadzorom konstitutivnega promotorja pADH vključiti potrebne gene ScERG13, SctHMGR, ScERG12, ScERG8 in ScERG19, spojene s PTS1. V različnih primerih so v zapis vključili sintazo SltNPPS1 iz ''Solanum lycopersicum'', kar omogoča proizvodnjo monoterpenoidnega prekurzorja neril difosfata (NPP), ali heterologna gena GgmFPS144 in AgtGPPS2 iz ''Gallus gallus'' oziroma ''Abies grandis'', kar omogoča proizvodnjo NPP, strukturnega izomera geranil difosfata (GPP). V obeh primerih je bil dodan še zapis za PptAPS, ki katalizira reakcijo NPP ali GPP v α-pinen. Povečanje izražanja ScERG13 in SctHMGR je poteklo z uporabo promotorja ScpTEF.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Za primerjavo brezcelične proizvodnje verbenona v in vitro poskusih so pripravili tudi sev kvasovk, ki vsebuje citokrom P450 monooksigenazo (CYP) limonen-3-hidroksilazo (L3H) za sintezo verbenona iz α-pinena.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Končna ocena spremenjenih sevov kvasovk je bila izvedena s kvantifikacijo z uporabo GC-MS analize, ki je potrdila prisotnost α-pinena v obeh variantah kvasovk. <br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> ''Yarrowia lipolytica'' je obetaven organizem za sintezo monoterpenoidov, saj vsebuje visoko koncentracijo acetil-CoA, je sposoben učinkovito kopičiti lipide in kaže visoko toleranco do monoterpenoidov. Za izražanje terpinoidnih prekurzorjev v ''Yarrowia lipolytica'' so izrazili gena SctHMGR in ScERG13 organizma Saccharomyces cerevisiae. Uvedba genov AgtGPPS2 in GgMFPS144 bi pomenili zmanjšano količino proizvedenega farnezil pirofosfata (FPP) in povečano količino geranil pirofosfata (GPP). Drugi poskus je predvideval zmanjšanje količine proizvedenega FPP. To so poskušali narediti z uvedbo SltNPPS1 za proizvodnjo neril pirofosfata (NPP). Dodan je bil še gen PptAPS za proizvodnjo α-pinena.&lt;br /&gt;<br /> Genomska ciljna zaporedja so bila izbrana tako, da so blizu začetnemu zaporedju gena ter z visoko učinkovitostjo, specifičnostjo in brez stranskih ciljev na podlagi spletne programske opreme CRISPOR.&lt;br /&gt;<br /> cPCR nikoli ni pokazal uspešne vstavitve genov, temveč so opazili le dolžine, ki bi jih pričakovali od prvotnega genomskega zaporedja. Zaradi časovnih omejitev pa poskus ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> ''Y. lipolytica'' je zaradi njegovega obsežnega metabolizma maščobnih kislin zanimiv organizem za peroksisomsko proizvodnjo monoterpenoidov. Poskus je predvideval implementacijo presnovnih poti, ki uporabljajo GPP ali NPP kot substrat za monoterpensko sintazo PptAPS v peroksisomih ''Y. lipolytica''. Geni, ki naj bi bili močno izraženi, so bili pod regulacijo promotorja YlpTEF, medtem ko so bili geni, ki so zahtevali šibkejšo ekspresijo, sestavljeni s promotorjem YlpGAP. &lt;br /&gt;<br /> <br /> Vsi geni poti, ki uporabljajo NPP, so bili uspešno sestavljeni, vendar zaradi pomanjkanja časa projekt ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> == LITERATURA ==<br /> <br /> [1] A. El Asbahani, K. Miladi, W. Badri, M. Sala, E. H. A. Addi, H. Casabianca, A. El Mousadik, D. Hartmann, A. Jilale, F. N. R. Renaud, et al.: Essential oils: From extraction to encapsulation. International Journal of Pharmaceutics. Elsevier B.V. April 15, 2015, pp 220–243.&lt;br /&gt;<br /> [2] Q. Gao, L. Wang, M. Zhang, Y. Wei, W. Lin: Recent Advances on Feasible Strategies for Monoterpenoid Production in Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. Frontiers Media S.A. December 1, 2020.&lt;br /&gt;<br /> [3] O. A. Carter, R. J. Peters, R. Croteau: Monoterpene biosynthesis pathway construction in Escherichia coli. Phytochemistry 2003, 64, 425–433.&lt;br /&gt;<br /> [4] M. T. Lundemo, J. M. Woodley: Guidelines for development and implementation of biocatalytic P450 processes. Applied Microbiology and Biotechnology. Springer Verlag February 28, 2015, pp 2465–2483.&lt;br /&gt;<br /> [5] C. Ignea, M. H. Raadam, M. S. Motawia, A. M. Makris, C. E. Vickers, S. C. Kampranis: Orthogonal monoterpenoid biosynthesis in yeast constructed on an isomeric substrate. Nat. Commun. 2019, 10.&lt;br /&gt;<br /> [6] J. Zhao, X. Bao, C. Li, Y. Shen, J. Hou: Improving monoterpene geraniol production through geranyl diphosphate synthesis regulation in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 4561–4571.&lt;br /&gt;<br /> [7] S. Dusséaux, W. T. Wajn, Y. Liu, C. Ignea, S. C. Kampranis: Transforming yeast peroxisomes into microfactories for the efficient production of high-value isoprenoids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020, 117, 31789–31799.&lt;br /&gt;<br /> [8] C. Brocard, A. Hartig: Peroxisome targeting signal 1: Is it really a simple tripeptide? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. Biochim Biophys Acta December 2006, pp 1565–1573.&lt;br /&gt;<br /> [9] S. Zernia, F. Ott, K. Bellmann-Sickert, R. Frank, M. Klenner, H. G. Jahnke, A. Prager, B. Abel, A. Robitzki, A. G. Beck-Sickinger: Peptide-Mediated Specific Immobilization of Catalytically Active Cytochrome P450 BM3 Variant. Bioconjug. Chem. 2016, 27, 1090–1097.&lt;br /&gt;<br /> [10] J. N. Bröker, B. Müller, N. van Deenen, D. Prüfer, C. Schulze Gronover: Upregulating the mevalonate pathway and repressing sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae enhances the production of triterpenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 6923–6934.&lt;br /&gt;<br /> [11] S. Brown, M. Clastre, V. Courdavault, S. E. O’Connor: De novo production of the plant-derived alkaloid strictosidine in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015, 112, 3205–3210.&lt;br /&gt;<br /> [12] C. Y. Zhang, N. B. Lin, X. S. Chai, Zhong-Li, D. G. Barnes: A rapid method for simultaneously determining ethanol and methanol content in wines by full evaporation headspace gas chromatography. Food Chem. 2015, 183, 169–172.&lt;br /&gt;</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MonChassis&diff=21676 2023-04-03T07:59:28Z

<p>Nika Tomsič: </p> <hr /> <div>Svet se trenutno sooča z velikimi globalnimi težavami, zato je potrebno iskanje novih, trajnostnih rešitev. Poseben razred z obetajočimi aplikacijami so monoterpenoidi. Monoterpenoidi imajo širok spekter uporabe, na primer v kozmetiki, medicini, zatiranju škodljivcev, živilski industriji in biogorivih. Toda obsežna uporaba monoterpenoidov je redka zaradi cene in časa, ki so potrebni za njihovo pripravo. Skupina iGem iz Muenstera je leta 2022 raziskovala možnost njihove sinteze v kvasovkah. Predstavitev projekta je dostopna na sledeči povezavi: https://2022.igem.wiki/wwu-muenster/.<br /> <br /> <br /> == PROIZVODNJA MONOTERPENOIDOV ==<br /> <br /> <br /> === Ekstrakcija iz rastlin ===<br /> <br /> <br /> Primarni vir monoterpenoidov so rastline, kjer imajo pomembno vlogo v številnih fizioloških procesih. Rastlinska eterična olja vsebujejo več kot 80 % monoterpenoidov, vendar ima ekstrakcija eteričnih olj iz rastlin nizek izkoristek. Poleg tega je zaradi kompleksnosti eteričnih olj čiščenje posameznih monoterpenoidov stroškovno obsežno, naporno in neučinkovito. Sestava je namreč odvisna od pogojev rasti rastlin in njihovega shranjevanja &lt;ref&gt;[1]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> == Kemijska sinteza: ==<br /> <br /> Kemijska sinteza je bolj zanesljiva možnost za proizvajanje monoterpenov. Priprava enostavnih molekul je možna, medtem ko se cena in potrebna energija večata z večanjem kompleksnosti molekule. Poleg tega pe je kemijska sinteza okolju neprijazna zaradi onesnažujočih topil in katalizatorjev ter je včasih odvisna od neobnovljivih virov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v bakterijah ===<br /> <br /> <br /> Bakterije so pogosto prva izbira za proizvodnjo kemikalij ''in vivo'', saj je taka proizvodnja hitra in poceni. Za proizvodnjo monoterpenoidov pa ima delo z bakterijami več pomanjkljivosti. Prvič, obstaja pomanjkanje prekurzorja geranil difosfata (GPP) v bakterijskem gostitelju. Za povečanje sinteze je treba celotno pot mevalonata preoblikovati v bakterije&lt;ref&gt;[3]&lt;/ref&gt;. Drugič, koraki monoterpenoidne biosinteze zahtevajo funkcionalno izražanje CYP, kar je izziv pri bakterijah&lt;ref&gt;[4]&lt;/ref&gt;. Tretjič, tudi če se vsi heterologni geni lahko funkcionalno izrazijo, proizvodnja monoterpenoidov z bakterijami morda ne bo učinkovita. Kopičenje prekurzorjev vodi do zmanjšane rasti celic, različni monoterpenoidi pa imajo toksične učinke na bakterije z motnjami v celični membrani&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v kvasovkah ===<br /> <br /> <br /> Kvasovke predstavljajo privlačno alternativo za proizvodnjo monoterpenoidov. Kvasovke imajo pot endogenega mevalonata (MVA), pri kateri se GPP, predhodnik vseh monoterpenoidov, hitro pretvori v farnezil difosfat (FPP)&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Druga omejitev pri proizvodnji monoterpenoidov s kvasom je toksičnost proizvoda, ki lahko omeji količino proizvodnje&lt;ref&gt;[6]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> == MON CHASSIS ==<br /> <br /> MonChassis je prilagodljiva platforma na osnovi kvasovk za obsežno proizvodnjo monoterpenoidov. Temelji na pripravi terpenskih prekurzorjev v kvasovkah z uporabo sinteznobiološkega inženiringa ter s katalizo v končne produkte z brezceličnim sistemov encima CYP. Raziskovana je bila proizvodnja v ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica'' s spremembo moči promotorjev ključnih encimov in uvedbo novih zapisov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.&lt;br /&gt;<br /> <br /> '''Slika1: Prikaz mevalonatne poti S. cerevisiae. V modrem so napisani potrebni encimi in s puščico navzgor označeni encimi, katerih povečana aktivnost bi pomenila potencialno povečanje poizvodnje terpenoidnih prekurzorjev.'''&lt;br /&gt;<br /> <br /> Monoterpenoide se lahko učinkovito sintetizira z modifikacijo mevalonantne poti kvasovk&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Da bi povečali presnovni tok poti MVA, je bilo identificiranih in optimiziranih več pomembnih encimov, ki omejujejo hitrost poti. Z uvedbo dodatnih heterolognih genov in utišanjem endogenih genov je možno optimizirati proizvodnjo monoterpenoidov. Glavni cilj je bil povečati proizvodnjo geranil difosfata (GPP) v ''Saccharomyces cerevisiae'', saj deluje kot bistveni prekurzor za sintezo monoterpenoidov, kot je α-pinen. Med temi sta najbolj omejujoča ERG13 in 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A (tHMGR). Če gena za ta encima prekomerno izrazimo, se poveča tudi proizvodnja prekurzorjev monoterpenoidov.&lt;br /&gt;<br /> Dodatna skupna omejitev modelov je sinteza ergosterola iz GPP, iz katerega nastajajo tudi prekurzorji monoterpenoidov. Ker je sinteza ergosterola nujna za celično rast, bodo modeli, ki temeljijo na endogeni poti MVA kvasovk, vedno omejeni v svojih donosih. Zaradi tega je bila preverjena učinkovitost proizvodnje tudi v peroksisomih, ker bi tako bila proizvodnja monoterpenoidov in ergosterola ločena. Peroksisomi predstavljajo zagotavljajo ugodne fiziološke pogoje za sintezo prekurzorjev monoterpenoidov&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;. Usmerjanje encimov V peroksisome je mogoče zlahka doseči z dodajanjem tripeptida C-terminalnega peroksisomskega ciljnega signala-1 (PTS1)&lt;ref&gt;[8]&lt;/ref&gt;. Skupaj se je preverjalo učinkovitost proizvodnje v citosolu in v peroksisomu bodisi v organizmih ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica''. &lt;br /&gt;<br /> MonChassis je sestavljena iz dveh komponent: sestava prekurzorjev terpenov v kvasovkah in in vitro kataliza spremembe prekurzerjev v monoterpenoide. V ta namen MonChassis uporablja samozasnovan bioreaktor za encimsko elektrosintezo (BREES) in modificirano citokrom P450 monooksigenazo BM3. Kot dokaz delovanja je potekla kataliza reakcije iz α-pinena v verbenon.<br /> <br /> <br /> == BREES ==<br /> <br /> Najlažji način za spopadanje s toksičnostjo produktov je uporaba brezceličnih sistemov. Tradicionalna biokataliza brez celic zahteva dodajanje kofaktorjev, kot je NADPH, ki zvišuje stroške za obsežne aplikacije. Da bi bila komponenta MonChassis ''in vitro'' uporabna v industrijskem obsegu je bilo potrebno razviti poceni alternativa. Zato je bil sestavljen BREES, bioreaktor za encimsko elektrosintezo. BM3, znan tudi kot citokrom P450 BM3 ali CYP102A1, je bakterijski encim citokroma P450, pridobljen iz ''Bacillus megaterium''. Je vsestranski encim z aktivnostmi monooksigenaze in hidroksilaze maščobnih kislin. Čeprav ni neposredno vpleten v proizvodnjo terpenoidov, so bili BM3 in njegove različice uporabljeni kot biokatalizatorji za modificiranje terpenoidnih spojin. Raziskovalci so izdelali BM3 in druge encime citokroma P450 za uvedbo hidroksilnih skupin, epoksidov ali drugih funkcionalnih skupin v terpenoidne molekule, kar omogoča katalizo α-pinena v končne monoterpenoide. Modificiran encim ima dodan peptidni povezovalec, ki lahko imobilizira encim na elektrodo iz indijevega kositrovega oksida in omogoči neposreden prenos elektronov z elektrode na encim&lt;ref&gt;[9]&lt;/ref&gt;. Zato lahko encim uporablja elektrone neposredno iz električne energije in ne zahteva dovajanja drugih kofaktorjev. V kombinaciji z inženirskimi sevi kvasovk MonChassis BREES omogoča hitro, prilagodljivo in obsežno proizvodnjo monoterpenoidov.<br /> <br /> <br /> == STRATEGIJA KLONIRANJA ==<br /> <br /> <br /> Po uradnih pravilih iGEM je bilo splošno kloniranje izvedeno v skladu z modularnim sistemom kloniranja RFC1000 (MoClo).<br /> Sistem MoClo se opira na restrikcijske encime tipa IIS, ki cepijo DNA tako, da nastanejo lepljivi konci. Ustvarjanje različnih koncev pri različnih fragmentih omogoča učinkovito sestavljanje več fragmentov DNA v eni preprosti reakciji ligacije. Primerna zasnova koncev omogoča, da se fragmenti sestavljajo samo v vnaprej določenem vrstnem redu. Vsi geni so bili pomnoženi z začetno verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo specifičnih začetnih oligonukleotidov z ustreznimi pritrjenimi konci.&lt;br /&gt;<br /> Končni zapisi so bil sestavljeni z metodo Golden Gate v vektor pSB1C00. V vektor so dovajali zapis transkripcijskih enot, ki so ga sestavljali promotorji, kodirno zaporedje in terminator. Z uporabo različnih promotorjev je bila mogoča sprememba ravni izražanja genov. Uspešno integracijo so preverili s selekcijo transformiranih kolonij, saj so celice konstitutivno izražale rdeči fluorescenčni protein (mRFP1).&lt;br /&gt;<br /> <br /> Za transformacijo kvasovk sta bili uporabljeni metodi Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-assotiated protein 9 (CRISPR-Cas9) in uporaba ekstrakromosomskih shuttle vektorjev. Vsak vektor vsebuje enega od štirih različnih selekcijskih markerjev (HIS3, TRP1, LEU2 ali URA3) za genomsko integracijo.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> Mevalonatna pot ''Saccharomyces cerevisiae'' so spremenili z metodo Golden Gate Assembly in ustavili heterolognega gena PptAPS ter povečali izražanje endogenih genov ScERG13 ali SctHMGR.&lt;br /&gt;<br /> Genske spremembe so temlejile na sistemu CRISPR-Cas9. Z namenom povečanja koncentracije mevalonata sta bila utišana ScROX1 in ScERG13 ter SctHMGR uravnavan z močnim promotorjem. Izločitev ScROX1 je bila ugodna za povečanje koncentracije mevalonata, saj zavira encime v MVA&lt;ref&gt;[10]&lt;/ref&gt;. Pri drugi varianti sta bila uvedena gena GgmFPS144 iz ''Gallus gallus'' in AgtGPPS2 iz ''Abies grandis'', da bi povečali koncentracijo geranil difosfata (GPP). Izločitev ScERG20 in vstavljanje GgmFPS144 sta bila potrebna za zaviranje reakcije GPP v (FPP)&lt;ref&gt;[11]&lt;/ref&gt;. Uvedba heterologne α-pinen sintaze (PptAPS) iz ''Pinus ponderosa'' je povečala proizvodnjo α-pinena v citosolu.&lt;br /&gt;<br /> Analiza z GC-MS je potrdila prisotnost α-pinena v lizatu.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v peroksisomih ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> Poleg citosola je peroksisom postal obetavna tarča za presnovni inženiring, saj naj bi njegove fiziološke lastnosti, kot je razpoložljivost substrata, znatno izboljšale sintezo produkta&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;.&lt;br /&gt;<br /> Ker se metabolizem mevalonata ne pojavlja naravno v peroksisomih&lt;ref&gt;[12]&lt;/ref&gt;, je bilo treba v vsak sev kvasovk pod nadzorom konstitutivnega promotorja pADH vključiti potrebne gene ScERG13, SctHMGR, ScERG12, ScERG8 in ScERG19, spojene s PTS1, za enoten izražanje genov. V različnih primerih so v zapis vključili sintazo SltNPPS1 iz ''Solanum lycopersicum'', kar omogoča proizvodnjo monoterpenoidnega prekurzorja neril difosfata (NPP), ali heterologna gena GgmFPS144 in AgtGPPS2 iz ''Gallus gallus'' oziroma ''Abies grandis'', kar omogoča proizvodnjo NPP, strukturnega izomera geranil difosfata (GPP). V obeh primerih je bil dodan še zapis za PptAPS, ki katalizira reakcijo NPP ali GPP na α-pinen. Povečanje izražanja ScERG13 in SctHMGR je poteklo z uporabo promotorja ScpTEF.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Za primerjavo brezcelične proizvodnje verbenona v in vitro poskusih so pripravili tudi sev kvasovk, ki vsebuje citokrom P450 monooksigenazo (CYP) limonen-3-hidroksilazo (L3H) in je zmožen katalize α-pinena.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Končna ocena spremenjenih sevov kvasovk je bila izvedena s kvantifikacijo z uporabo GC-MS analize, ki je potrdila prisotnost α-pinena v obeh variantah kvasovk. <br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> ''Yarrowia lipolytica'' je obetaven organizem za sintezo monoterpenoidov, saj vsebuje visoko koncentracijo acetil-CoA, je sposoben učinkovito kopičiti lipide in kaže visoko toleranco do monoterpenoidov. Za izražanje terpinoidnih prekurzorjev v ''Yarrowia lipolytica'' so izrazili gena SctHMGR in ScERG13 organizma Saccharomyces cerevisiae. Uvedba genov AgtGPPS2 in GgMFPS144 bi pomenili zmanjšano količino proizvedenega farnezil pirofosfata (FPP) in povečano količino geranil pirofosfata (GPP). Drugi poskus je predvideval zmanjšanje količine proizvedenega FPP. To so poskušali narediti z uvedbo SltNPPS1 za proizvodnjo neril pirofosfata (NPP). Dodan je bil še gen PptAPS za proizvodnjo α-pinena.&lt;br /&gt;<br /> Genomska ciljna zaporedja so bila izbrana tako, da so blizu začetnemu zaporedju gena ter z visoko učinkovitostjo, specifičnostjo in brez stranskih ciljev na podlagi spletne programske opreme CRISPOR.&lt;br /&gt;<br /> cPCR nikoli ni pokazal uspešne vstavitve genov, temveč so opazili le dolžine, ki bi jih pričakovali od prvotnega genomskega zaporedja. Zaradi časovnih omejitev pa poskus ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> ''Y. lipolytica'' je zaradi njegovega obsežnega metabolizma maščobnih kislin zanimiv organizem za peroksisomsko proizvodnjo monoterpenoidov. Poskus je predvideval implementacijo presnovnih poti, ki uporabljajo GPP ali NPP kot substrat za monoterpensko sintazo PptAPS v peroksisomih ''Y. lipolytica''. Geni, ki naj bi bili močno izraženi, so bili pod regulacijo promotorja YlpTEF, medtem ko so bili geni, ki so zahtevali šibkejšo ekspresijo, sestavljeni s promotorjem YlpGAP. &lt;br /&gt;<br /> <br /> Vsi geni poti, ki uporabljajo NPP, so bili uspešno sestavljeni, vendar zaradi pomanjkanja časa projekt ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> == LITERATURA ==<br /> <br /> [1] A. El Asbahani, K. Miladi, W. Badri, M. Sala, E. H. A. Addi, H. Casabianca, A. El Mousadik, D. Hartmann, A. Jilale, F. N. R. Renaud, et al.: Essential oils: From extraction to encapsulation. International Journal of Pharmaceutics. Elsevier B.V. April 15, 2015, pp 220–243.&lt;br /&gt;<br /> [2] Q. Gao, L. Wang, M. Zhang, Y. Wei, W. Lin: Recent Advances on Feasible Strategies for Monoterpenoid Production in Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. Frontiers Media S.A. December 1, 2020.&lt;br /&gt;<br /> [3] O. A. Carter, R. J. Peters, R. Croteau: Monoterpene biosynthesis pathway construction in Escherichia coli. Phytochemistry 2003, 64, 425–433.&lt;br /&gt;<br /> [4] M. T. Lundemo, J. M. Woodley: Guidelines for development and implementation of biocatalytic P450 processes. Applied Microbiology and Biotechnology. Springer Verlag February 28, 2015, pp 2465–2483.&lt;br /&gt;<br /> [5] C. Ignea, M. H. Raadam, M. S. Motawia, A. M. Makris, C. E. Vickers, S. C. Kampranis: Orthogonal monoterpenoid biosynthesis in yeast constructed on an isomeric substrate. Nat. Commun. 2019, 10.&lt;br /&gt;<br /> [6] J. Zhao, X. Bao, C. Li, Y. Shen, J. Hou: Improving monoterpene geraniol production through geranyl diphosphate synthesis regulation in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 4561–4571.&lt;br /&gt;<br /> [7] S. Dusséaux, W. T. Wajn, Y. Liu, C. Ignea, S. C. Kampranis: Transforming yeast peroxisomes into microfactories for the efficient production of high-value isoprenoids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020, 117, 31789–31799.&lt;br /&gt;<br /> [8] C. Brocard, A. Hartig: Peroxisome targeting signal 1: Is it really a simple tripeptide? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. Biochim Biophys Acta December 2006, pp 1565–1573.&lt;br /&gt;<br /> [9] S. Zernia, F. Ott, K. Bellmann-Sickert, R. Frank, M. Klenner, H. G. Jahnke, A. Prager, B. Abel, A. Robitzki, A. G. Beck-Sickinger: Peptide-Mediated Specific Immobilization of Catalytically Active Cytochrome P450 BM3 Variant. Bioconjug. Chem. 2016, 27, 1090–1097.&lt;br /&gt;<br /> [10] J. N. Bröker, B. Müller, N. van Deenen, D. Prüfer, C. Schulze Gronover: Upregulating the mevalonate pathway and repressing sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae enhances the production of triterpenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 6923–6934.&lt;br /&gt;<br /> [11] S. Brown, M. Clastre, V. Courdavault, S. E. O’Connor: De novo production of the plant-derived alkaloid strictosidine in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015, 112, 3205–3210.&lt;br /&gt;<br /> [12] C. Y. Zhang, N. B. Lin, X. S. Chai, Zhong-Li, D. G. Barnes: A rapid method for simultaneously determining ethanol and methanol content in wines by full evaporation headspace gas chromatography. Food Chem. 2015, 183, 169–172.&lt;br /&gt;</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MonChassis&diff=21675 2023-04-03T07:46:14Z

<p>Nika Tomsič: </p> <hr /> <div>Svet se trenutno sooča z velikimi globalnimi težavami, zato je potrebno iskanje novih, trajnostnih rešitev. Poseben razred z obetajočimi aplikacijami so monoterpenoidi. Monoterpenoidi imajo širok spekter uporabe, na primer v kozmetiki, medicini, zatiranju škodljivcev, živilski industriji in biogorivih. Toda obsežna uporaba monoterpenoidov je redka zaradi cene in časa, ki so potrebni za njihovo pripravo. Skupina iGem iz Muenstera je leta 2022 raziskovala možnost njihove sinteze v kvasovkah. Predstavitev projekta je dostopna na sledeči povezavi: https://2022.igem.wiki/wwu-muenster/.<br /> <br /> <br /> == PROIZVODNJA MONOTERPENOIDOV ==<br /> <br /> <br /> === Ekstrakcija iz rastlin ===<br /> <br /> <br /> Primarni vir monoterpenoidov so rastline, kjer imajo pomembno vlogo v številnih fizioloških procesih. Rastlinska eterična olja vsebujejo več kot 80 % monoterpenoidov, vendar ima ekstrakcija eteričnih olj iz rastlin nizek izkoristek. Poleg tega je zaradi kompleksnosti eteričnih olj čiščenje posameznih monoterpenoidov stroškovno obsežno, naporno in neučinkovito. Sestava je namreč odvisna od pogojev rasti rastlin in njihovega shranjevanja &lt;ref&gt;[1]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> == Kemijska sinteza: ==<br /> <br /> Kemijska sinteza je bolj zanesljiva možnost za proizvajanje monoterpenov. Priprava enostavnih molekul je možna, medtem ko se cena in potrebna energija večata z večanjem kompleksnosti molekule. Poleg tega pe je kemijska sinteza okolju neprijazna zaradi onesnažujočih topil in katalizatorjev ter je včasih odvisna od neobnovljivih virov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v bakterijah ===<br /> <br /> <br /> Bakterije so pogosto prva izbira za proizvodnjo kemikalij ''in vivo'', saj je taka proizvodnja hitra in poceni. Za proizvodnjo monoterpenoidov pa ima delo z bakterijami več pomanjkljivosti. Prvič, obstaja pomanjkanje prekurzorja geranil difosfata (GPP) v bakterijskem gostitelju. Za povečanje sinteze je treba celotno pot mevalonata preoblikovati v bakterije&lt;ref&gt;[3]&lt;/ref&gt;. Drugič, koraki monoterpenoidne biosinteze zahtevajo funkcionalno izražanje CYP, kar je izziv pri bakterijah&lt;ref&gt;[4]&lt;/ref&gt;. Tretjič, tudi če se vsi heterologni geni lahko funkcionalno izrazijo, proizvodnja monoterpenoidov z bakterijami morda ne bo učinkovita. Kopičenje prekurzorjev vodi do zmanjšane rasti celic, različni monoterpenoidi pa imajo toksične učinke na bakterije z motnjami v celični membrani&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v kvasovkah ===<br /> <br /> <br /> Kvasovke predstavljajo privlačno alternativo za proizvodnjo monoterpenoidov. Kvasovke imajo pot endogenega mevalonata (MVA), pri kateri se GPP, predhodnik vseh monoterpenoidov, hitro pretvori v farnezil difosfat (FPP)&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Druga omejitev pri proizvodnji monoterpenoidov s kvasom je toksičnost proizvoda, ki lahko omeji količino proizvodnje&lt;ref&gt;[6]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> == MON CHASSIS ==<br /> <br /> MonChassis je prilagodljiva platforma na osnovi kvasovk za obsežno proizvodnjo monoterpenoidov. Temelji na pripravi terpenskih prekurzorjev v kvasovkah z uporabo sinteznobiološkega inženiringa ter s katalizo v končne produkte z brezceličnim sistemov encima CYP. Raziskovana je bila proizvodnja v ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica'' s spremembo moči promotorjev ključnih encimov in uvedbo novih zapisov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.&lt;br /&gt;<br /> <br /> '''Slika1: Prikaz mevalonatne poti S. cerevisiae. V modrem so napisani potrebni encimi in s puščico navzgor označeni encimi, katerih povečana aktivnost bi pomenila potencialno povečanje poizvodnje terpenoidnih prekurzorjev.'''&lt;br /&gt;<br /> <br /> Monoterpenoide se lahko učinkovito sintetizira z modifikacijo mevalonantne poti kvasovk&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Da bi povečali presnovni tok poti MVA, je bilo identificiranih in optimiziranih več pomembnih encimov, ki omejujejo hitrost poti. Z uvedbo dodatnih heterolognih genov in utišanjem endogenih genov je možno optimizirati proizvodnjo monoterpenoidov. Glavni cilj je bil povečati proizvodnjo geranil difosfata (GPP) v ''Saccharomyces cerevisiae'', saj deluje kot bistveni prekurzor za sintezo monoterpenoidov, kot je α-pinen. Med temi sta najbolj omejujoča ERG13 in 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A (tHMGR). Če gena za ta encima prekomerno izrazimo, se poveča tudi proizvodnja prekurzorjev monoterpenoidov.&lt;br /&gt;<br /> Dodatna skupna omejitev modelov je sinteza ergosterola iz GPP, iz katerega nastajajo tudi prekurzorji monoterpenoidov. Ker je sinteza ergosterola nujna za celično rast, bodo modeli, ki temeljijo na endogeni poti MVA kvasovk, vedno omejeni v svojih donosih. Zaradi tega je bila preverjena učinkovitost proizvodnje tudi v peroksisomih, ker bi tako bila proizvodnja monoterpenoidov in ergosterola ločena. Peroksisomi predstavljajo zagotavljajo ugodne fiziološke pogoje za sintezo prekurzorjev monoterpenoidov&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;. Usmerjanje encimov V peroksisome je mogoče zlahka doseči z dodajanjem tripeptida C-terminalnega peroksisomskega ciljnega signala-1 (PTS1)&lt;ref&gt;[8]&lt;/ref&gt;. Skupaj se je preverjalo učinkovitost proizvodnje v citosolu in v peroksisomu bodisi v organizmih ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica''. &lt;br /&gt;<br /> MonChassis je sestavljena iz dveh komponent: sestava prekurzorjev terpenov v kvasovkah in in vitro kataliza spremembe prekurzerjev v monoterpenoide. V ta namen MonChassis uporablja samozasnovan bioreaktor za encimsko elektrosintezo (BREES) in modificirano citokrom P450 monooksigenazo BM3. Kot dokaz delovanja je potekla kataliza reakcije iz α-pinena v verbenon.<br /> <br /> <br /> == BREES ==<br /> <br /> Najlažji način za spopadanje s toksičnostjo produktov je uporaba brezceličnih sistemov. Tradicionalna biokataliza brez celic zahteva dodajanje kofaktorjev, kot je NADPH, ki zvišuje stroške za obsežne aplikacije. Da bi bila komponenta MonChassis ''in vitro'' uporabna v industrijskem obsegu je bilo potrebno razviti poceni alternativa. Zato je bil sestavljen BREES, bioreaktor za encimsko elektrosintezo. BM3, znan tudi kot citokrom P450 BM3 ali CYP102A1, je bakterijski encim citokroma P450, pridobljen iz ''Bacillus megaterium''. Je vsestranski encim z aktivnostmi monooksigenaze in hidroksilaze maščobnih kislin. Čeprav ni neposredno vpleten v proizvodnjo terpenoidov, so bili BM3 in njegove različice uporabljeni kot biokatalizatorji za modificiranje terpenoidnih spojin. Raziskovalci so izdelali BM3 in druge encime citokroma P450 za uvedbo hidroksilnih skupin, epoksidov ali drugih funkcionalnih skupin v terpenoidne molekule, kar omogoča katalizo α-pinena v končne monoterpenoide. Modificiran encim ima dodan peptidni povezovalec, ki lahko imobilizira encim na elektrodo iz indijevega kositrovega oksida in omogoči neposreden prenos elektronov z elektrode na encim&lt;ref&gt;[9]&lt;/ref&gt;. Zato lahko encim uporablja elektrone neposredno iz električne energije in ne zahteva dovajanja drugih kofaktorjev. V kombinaciji z inženirskimi sevi kvasovk MonChassis BREES omogoča hitro, prilagodljivo in obsežno proizvodnjo monoterpenoidov.<br /> <br /> <br /> == STRATEGIJA KLONIRANJA ==<br /> <br /> <br /> Po uradnih pravilih iGEM je bilo splošno kloniranje izvedeno v skladu z modularnim sistemom kloniranja RFC1000 (MoClo).<br /> Sistem MoClo se opira na restrikcijske encime tipa IIS, ki cepijo DNA tako, da nastanejo lepljivi konci. Ustvarjanje različnih koncev pri različnih fragmentih omogoča učinkovito sestavljanje več fragmentov DNA v eni preprosti reakciji ligacije. Primerna zasnova koncev omogoča, da se fragmenti sestavljajo samo v vnaprej določenem vrstnem redu. Vsi geni so bili pomnoženi z začetno verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo specifičnih začetnih oligonukleotidov z ustreznimi pritrjenimi konci.&lt;br /&gt;<br /> Končni zapis je bil sestavljen z metodo Golden Gate v vektor pSB1C00. V vektor so dovajali zapis transkripcijskih enot, ki so ga sestavljali promotorj, kodirno zaporedje in terminator. Z uporabo različnih promotorjev je bila mogoča sprememba ravni izražanja genov. Uspešno integracijo so preverili s selekcijo transformiranih kolonij, saj so celice konstitutivno izražale rdeči fluorescenčni protein (mRFP1).&lt;br /&gt;<br /> <br /> Za transformacijo kvasovk sta bili uporabljeni metodi Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-assotiated protein 9 (CRISPR-Cas9) in uporaba ekstrakromosomskih shuttle vektorjev. Vsak vektor vsebuje enega od štirih različnih Selekcijskih markerjev (HIS3, TRP1, LEU2 ali URA3) za genomsko integracijo.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> Da bi ustvarili organizem, ki proizvaja monoterpenoid α-pinen, smo spremenili mevalonatno pot modelnega organizma ''Saccharomyces cerevisiae''. Z metodo Golden Gate Assembly so ustavili heterologne gene, kot je PptAPS ter povečali izražanje endogenih genov, kot sta ScERG13 ali SctHMGR.&lt;br /&gt;<br /> Genske spremembe so temlejile na sistemu CRISPR-Cas9. Oblikovana je bila pot do α-pinena (prekurzorja monoterpenoidov). Z namenom povečanja koncentracije mevalonata je bil utišan ScROX1 in ScERG13 ter SctHMGR uravnavana z močnim promotorjem. Izločitev ScROX1 je bila ugodna za povečanje koncentracije mevalonata, saj zavira encime v MVA&lt;ref&gt;[10]&lt;/ref&gt;. Nadalje smo uvedli heterologne gene GgmFPS144 iz Gallus gallus in AgtGPPS2 iz Abies grandis, da bi povečali koncentracijo geranil difosfata (GPP), prekurzorske molekule vseh monoterpenoidov. Izločitev ScERG20 in vstavljanje GgmFPS144 sta bila potrebna za zaviranje vitalne reakcije GPP v farnezil difosfat (FPP), vendar ne popolnoma ovirati&lt;ref&gt;[11]&lt;/ref&gt;. Uvedba heterologne α-pinen sintaze (PptAPS) iz ''Pinus ponderosa'' je povečala proizvodnjo α-pinena v citosolu ''S. cerevisiae''.&lt;br /&gt;<br /> Genomske tarče znotraj ScROX1, ScERG20 in ScpERG20 so bile predvidene s spletnim orodjem CRISPOR. Namesto da bi naše konstrukte vstavili v genomsko DNA, smo konstrukte klonirali v vektorje shuttle z različnimi avksotrofijami.<br /> Analiza z GC-MS je potrdila prisotnost α-pinena v lizatu.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v peroksisomih ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> Poleg citosola je peroksisom postal obetavna tarča za presnovni inženiring, saj naj bi njegove fiziološke lastnosti, kot je razpoložljivost substrata, znatno izboljšale sintezo produkta&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;.&lt;br /&gt;<br /> Ker se metabolizem mevalonata ne pojavlja naravno v peroksisomih&lt;ref&gt;[12]&lt;/ref&gt;, je bilo treba v vsak sev kvasovk pod nadzorom konstitutivnega promotorja pADH vključiti potrebne gene ScERG13, SctHMGR, ScERG12, ScERG8 in ScERG19, spojene s PTS1, za enoten izražanje genov. V različnih primerih so v zapis vključili sintazo SltNPPS1 iz ''Solanum lycopersicum'', kar omogoča proizvodnjo monoterpenoidnega prekurzorja neril difosfata (NPP), ali heterologna gena GgmFPS144 in AgtGPPS2 iz ''Gallus gallus'' oziroma ''Abies grandis'', kar omogoča proizvodnjo NPP, strukturnega izomera geranil difosfata (GPP). V obeh primerih je bil dodan še zapis za PptAPS, ki katalizira reakcijo NPP ali GPP na α-pinen. Povečanje izražanja ScERG13 in SctHMGR je poteklo z uporabo promotorja ScpTEF.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Za primerjavo brezcelične proizvodnje verbenona v in vitro poskusih so pripravili tudi sev kvasovk, ki vsebuje citokrom P450 monooksigenazo (CYP) limonen-3-hidroksilazo (L3H) in je zmožen katalize α-pinena.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Končna ocena spremenjenih sevov kvasovk je bila izvedena s kvantifikacijo z uporabo GC-MS analize, ki je potrdila prisotnost α-pinena v obeh variantah kvasovk. <br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> ''Yarrowia lipolytica'' je obetaven organizem za sintezo monoterpenoidov, saj vsebuje visoko koncentracijo acetil-CoA, je sposoben učinkovito kopičiti lipide in kaže visoko toleranco do monoterpenoidov. Za izražanje terpinoidnih prekurzorjev v ''Yarrowia lipolytica'' so izrazili gena SctHMGR in ScERG13 organizma Saccharomyces cerevisiae. Uvedba genov AgtGPPS2 in GgMFPS144 bi pomenili zmanjšano količino proizvedenega farnezil pirofosfata (FPP) in povečano količino geranil pirofosfata (GPP). Drugi poskus je predvideval zmanjšanje količine proizvedenega FPP. To so poskušali narediti z uvedbo SltNPPS1 za proizvodnjo neril pirofosfata (NPP). Dodan je bil še gen PptAPS za proizvodnjo α-pinena.&lt;br /&gt;<br /> Genomska ciljna zaporedja so bila izbrana tako, da so blizu začetnemu zaporedju gena ter z visoko učinkovitostjo, specifičnostjo in brez stranskih ciljev na podlagi spletne programske opreme CRISPOR.&lt;br /&gt;<br /> cPCR nikoli ni pokazal uspešne vstavitve genov, temveč so opazili le dolžine, ki bi jih pričakovali od prvotnega genomskega zaporedja. Zaradi časovnih omejitev pa poskus ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> ''Y. lipolytica'' je zaradi njegovega obsežnega metabolizma maščobnih kislin zanimiv organizem za peroksisomsko proizvodnjo monoterpenoidov. Poskus je predvideval implementacijo presnovnih poti, ki uporabljajo GPP ali NPP kot substrat za monoterpensko sintazo PptAPS v peroksisomih ''Y. lipolytica''. Geni, ki naj bi bili močno izraženi, so bili pod regulacijo promotorja YlpTEF, medtem ko so bili geni, ki so zahtevali šibkejšo ekspresijo, sestavljeni s promotorjem YlpGAP. &lt;br /&gt;<br /> <br /> Vsi geni poti, ki uporabljajo NPP, so bili uspešno sestavljeni, vendar zaradi pomanjkanja časa projekt ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> == LITERATURA ==<br /> <br /> [1] A. El Asbahani, K. Miladi, W. Badri, M. Sala, E. H. A. Addi, H. Casabianca, A. El Mousadik, D. Hartmann, A. Jilale, F. N. R. Renaud, et al.: Essential oils: From extraction to encapsulation. International Journal of Pharmaceutics. Elsevier B.V. April 15, 2015, pp 220–243.&lt;br /&gt;<br /> [2] Q. Gao, L. Wang, M. Zhang, Y. Wei, W. Lin: Recent Advances on Feasible Strategies for Monoterpenoid Production in Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. Frontiers Media S.A. December 1, 2020.&lt;br /&gt;<br /> [3] O. A. Carter, R. J. Peters, R. Croteau: Monoterpene biosynthesis pathway construction in Escherichia coli. Phytochemistry 2003, 64, 425–433.&lt;br /&gt;<br /> [4] M. T. Lundemo, J. M. Woodley: Guidelines for development and implementation of biocatalytic P450 processes. Applied Microbiology and Biotechnology. Springer Verlag February 28, 2015, pp 2465–2483.&lt;br /&gt;<br /> [5] C. Ignea, M. H. Raadam, M. S. Motawia, A. M. Makris, C. E. Vickers, S. C. Kampranis: Orthogonal monoterpenoid biosynthesis in yeast constructed on an isomeric substrate. Nat. Commun. 2019, 10.&lt;br /&gt;<br /> [6] J. Zhao, X. Bao, C. Li, Y. Shen, J. Hou: Improving monoterpene geraniol production through geranyl diphosphate synthesis regulation in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 4561–4571.&lt;br /&gt;<br /> [7] S. Dusséaux, W. T. Wajn, Y. Liu, C. Ignea, S. C. Kampranis: Transforming yeast peroxisomes into microfactories for the efficient production of high-value isoprenoids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020, 117, 31789–31799.&lt;br /&gt;<br /> [8] C. Brocard, A. Hartig: Peroxisome targeting signal 1: Is it really a simple tripeptide? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. Biochim Biophys Acta December 2006, pp 1565–1573.&lt;br /&gt;<br /> [9] S. Zernia, F. Ott, K. Bellmann-Sickert, R. Frank, M. Klenner, H. G. Jahnke, A. Prager, B. Abel, A. Robitzki, A. G. Beck-Sickinger: Peptide-Mediated Specific Immobilization of Catalytically Active Cytochrome P450 BM3 Variant. Bioconjug. Chem. 2016, 27, 1090–1097.&lt;br /&gt;<br /> [10] J. N. Bröker, B. Müller, N. van Deenen, D. Prüfer, C. Schulze Gronover: Upregulating the mevalonate pathway and repressing sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae enhances the production of triterpenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 6923–6934.&lt;br /&gt;<br /> [11] S. Brown, M. Clastre, V. Courdavault, S. E. O’Connor: De novo production of the plant-derived alkaloid strictosidine in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015, 112, 3205–3210.&lt;br /&gt;<br /> [12] C. Y. Zhang, N. B. Lin, X. S. Chai, Zhong-Li, D. G. Barnes: A rapid method for simultaneously determining ethanol and methanol content in wines by full evaporation headspace gas chromatography. Food Chem. 2015, 183, 169–172.&lt;br /&gt;</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MonChassis&diff=21674 2023-04-02T20:20:40Z

<p>Nika Tomsič: </p> <hr /> <div>Svet se trenutno sooča z velikimi globalnimi težavami, zato je potrebno iskanje novih, trajnostnih rešitev. Poseben razred z obetajočimi aplikacijami so monoterpenoidi. Monoterpenoidi imajo širok spekter uporabe, na primer v kozmetiki, medicini, zatiranju škodljivcev, živilski industriji in biogorivih. Toda obsežna uporaba monoterpenoidov je redka zaradi cene in časa, ki so potrebni za njihovo pripravo. Skupina iGem iz Muenstera je leta 2022 raziskovala možnost njihove sinteze v kvasovkah. Predstavitev projekta je dostopna na sledeči povezavi: https://2022.igem.wiki/wwu-muenster/.<br /> <br /> <br /> == PROIZVODNJA MONOTERPENOIDOV ==<br /> <br /> <br /> === Ekstrakcija iz rastlin ===<br /> <br /> <br /> Primarni vir monoterpenoidov so rastline, kjer imajo pomembno vlogo v številnih fizioloških procesih. Rastlinska eterična olja vsebujejo več kot 80 % monoterpenoidov, vendar ima ekstrakcija eteričnih olj iz rastlin nizek izkoristek. Poleg tega je zaradi kompleksnosti eteričnih olj čiščenje posameznih monoterpenoidov stroškovno obsežno, naporno in neučinkovito. Sestava je namreč odvisna od pogojev rasti rastlin in njihovega shranjevanja &lt;ref&gt;[1]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> == Kemijska sinteza: ==<br /> <br /> Kemijska sinteza je bolj zanesljiva možnost za proizvajanje monoterpenov. Priprava enostavnih molekul je možna, medtem ko se cena in potrebna energija večata z večanjem kompleksnosti molekule. Poleg tega pe je kemijska sinteza okolju neprijazna zaradi onesnažujočih topil in katalizatorjev ter je včasih odvisna od neobnovljivih virov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v bakterijah ===<br /> <br /> <br /> Bakterije so pogosto prva izbira za proizvodnjo kemikalij in vivo, saj je taka proizvodnja hitra in poceni. Za proizvodnjo monoterpenoidov pa ima delo z bakterijami več pomanjkljivosti. Prvič, obstaja pomanjkanje prekurzorja geranil difosfata (GPP) v bakterijskem gostitelju. Za povečanje sinteze je treba celotno pot mevalonata preoblikovati v bakterije&lt;ref&gt;[3]&lt;/ref&gt;. Drugič, koraki monoterpenoidne biosinteze zahtevajo funkcionalno izražanje CYP, kar je izziv pri bakterijah&lt;ref&gt;[4]&lt;/ref&gt;. Tretjič, tudi če se vsi heterologni geni lahko funkcionalno izrazijo, proizvodnja monoterpenoidov z bakterijami morda ne bo učinkovita. Kopičenje prekurzorjev vodi do zmanjšane rasti celic, različni monoterpenoidi pa imajo toksične učinke na bakterije z motnjami v celični membrani&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v kvasovkah ===<br /> <br /> <br /> Kvasovke predstavljajo privlačno alternativo za proizvodnjo monoterpenoidov. Kvasovke imajo pot endogenega mevalonata (MVA), ki jo lahko spremenimo za sintezo monoterpenoidov&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt; Vendar naravna pot MVA ne omogoča učinkovite sinteze monoterpenoidov, saj se GPP, predhodnik vseh monoterpenoidov, hitro pretvori v farnezil difosfat (FPP). Druga omejitev pri proizvodnji monoterpenoidov s kvasom je toksičnost proizvoda. Čeprav so kvasovke na splošno močnejše od bakterij, lahko toksični učinki monoterpenoidov omejijo možne donose&lt;ref&gt;[6]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> == MON CHASSIS ==<br /> <br /> MonChassis je prilagodljiva platforma na osnovi kvasovk za obsežno proizvodnjo monoterpenoidov. Temelji na pripravi terpenskih prekurzorjev v kvasovkah z uporabo sinteznobiološkega inženiringa ter s katalizo v končne produkte z brezceličnim sistemov encima CYP. Raziskovana je bila proizvodnja v ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica'' s spremembo moči promotorjev ključnih encimov in uvedbo novih zapisov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.&lt;br /&gt;<br /> <br /> '''Slika1: Prikaz mevalonatne poti S. cerevisiae. V modrem so napisani potrebni encimi in s puščico navzgor označeni encimi, katerih povečana aktivnost bi pomenila potencialno povečanje poizvodnje terpenoidnih prekurzorjev.'''&lt;br /&gt;<br /> <br /> Monoterpenoide so lahko učinkovito sintetizira z modifikacijo mevalonantne poti kvasovk&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Da bi povečali presnovni tok poti MVA, je bilo identificiranih in optimiziranih več pomembnih encimov, ki omejujejo hitrost poti. Z uvedbo dodatnih heterolognih genov in utišanjem endogenih genov je možno optimizirati proizvodnjo monoterpenoidov. Glavni cilj je bil povečati proizvodnjo geranil difosfata (GPP) v ''Saccharomyces cerevisiae'', saj deluje kot bistveni prekurzor za sintezo monoterpenoidov, kot je α-pinen. Med temi sta najbolj omejujoča ERG13 in 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A (tHMGR). Če gena za ta encima prekomerno izrazimo, se poveča tudi proizvodnja prekurzorjev monoterpenoidov.&lt;br /&gt;<br /> Dodatna skupna omejitev modelov je sinteza ergosterola iz GPP, iz katerega nastajajo tudi prekurzorji monoterpenoidov. Ker je sinteza ergosterola nujna za celično rast, bodo modeli, ki temeljijo na endogeni poti MVA kvasovk, vedno omejeni v svojih donosih. Zaradi tega je bila preverjena učinkovitost proizvodnje tudi v peroksisomih, ker bi tako bila proizvodnja monoterpenoidov in ergosterola ločena. Peroksisomi predstavljajo zagotavljajo ugodne fiziološke pogoje za sintezo prekurzorjev monoterpenoidov&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;. Usmerjanje encimov V peroksisome je mogoče zlahka doseči z dodajanjem tripeptida C-terminalnega peroksisomskega ciljnega signala-1 (PTS1)&lt;ref&gt;[8]&lt;/ref&gt;. Skupaj se je preverjalo učinkovitost proizvodnje v citosolu in v peroksisomu bodisi v organizmih ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica''. &lt;br /&gt;<br /> MonChassis je sestavljena iz dveh komponent: sestava prekurzorjev terpenov v kvasovkah in in vitro kataliza spremembe prekurzerjev v monoterpenoide. V ta namen MonChassis uporablja samozasnovan bioreaktor za encimsko elektrosintezo (BREES) in modificirano citokrom P450 monooksigenazo BM3. Kot dokaz delovanja je potekla kataliza reakcije iz α-pinena v verbenon.<br /> <br /> <br /> == BREES ==<br /> <br /> Najlažji način za spopadanje s toksičnostjo produktov je uporaba brezceličnih sistemov. Tradicionalna biokataliza brez celic zahteva dodajanje kofaktorjev, kot je NADPH, ki zvišuje stroške za obsežne aplikacije. Da bi bila komponenta MonChassis in vitro uporabna v industrijskem obsegu, smo potrebo po dragih kofaktorjih izločili iz enačbe z uporabo električne energije kot poceni alternative. Zato je bil sestavljen BREES, bioreaktor za encimsko elektrosintezo. BM3, znan tudi kot citokrom P450 BM3 ali CYP102A1, je bakterijski encim citokroma P450, pridobljen iz ''Bacillus megaterium''. Je vsestranski encim z aktivnostmi monooksigenaze in hidroksilaze maščobnih kislin. Čeprav ni neposredno vpleten v proizvodnjo terpenoidov, so bili BM3 in njegove različice uporabljeni kot biokatalizatorji za modificiranje terpenoidnih spojin, zlasti v kontekstu sintetične biologije in presnovnega inženiringa. Raziskovalci so izdelali BM3 in druge encime citokroma P450 za uvedbo hidroksilnih skupin, epoksidov ali drugih funkcionalnih skupin v terpenoidne molekule, kar lahko vodi do ustvarjanja novih spojin s potencialno duporabo za proizvodnjo farmacevtskih izdelkov, arom, dišav ali drugih. Modificiran encim CYP BM3 iz ''Priestia magaterium'' ima dodan peptidni povezovalec, ki lahko imobilizira encim na elektrodo iz indijevega kositrovega oksida in omogoči neposreden prenos elektronov z elektrode na encim&lt;ref&gt;[9]&lt;/ref&gt;. Zato lahko encim uporablja elektrone neposredno iz električne energije in ne zahteva dovajanja drugih kofaktorjev. BM3 To drastično zniža operativne stroške komponente MonChassis in vitro v primerjavi s konvencionalno biokatalizo brez celic. V kombinaciji z inženirskimi sevi kvasovk MonChassis BREES omogoča hitro, prilagodljivo in obsežno proizvodnjo monoterpenoidov.<br /> <br /> <br /> == STRATEGIJA KLONIRANJA ==<br /> <br /> <br /> Po uradnih pravilih iGEM je bilo splošno kloniranje izvedeno v skladu z modularnim sistemom kloniranja RFC1000 (MoClo).<br /> Sistem MoClo se opira na restrikcijske encime tipa IIS, ki cepijo DNA tako, da nastanejo lepljivi konci. Ustvarjanje različnih koncev pri različnih fragmentih omogoča učinkovito sestavljanje več fragmentov DNA v eni preprosti reakciji ligacije. Primerna zasnova koncev omogoča, da se fragmenti sestavljajo samo v vnaprej določenem vrstnem redu. Vsi geni so bili pomnoženi z začetno verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo specifičnih začetnih oligonukleotidov z ustreznimi pritrjenimi konci.&lt;br /&gt;<br /> Končni zapis je bil sestavljen z metodo Golden Gate v vektor pSB1C00. V vektor so dovajali zapis transkripcijskih enot, ki so ga sestavljali promotorj, kodirno zaporedje in terminator. Z uporabo različnih promotorjev je bila mogoča sprememba ravni izražanja genov. Uspešno integracijo so preverili s selekcijo transformiranih kolonij, saj so celice konstitutivno izražale rdeči fluorescenčni protein (mRFP1).&lt;br /&gt;<br /> <br /> Za transformacijo kvasovk sta bili uporabljeni metodi Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-assotiated protein 9 (CRISPR-Cas9) in uporaba ekstrakromosomskih shuttle vektorjev. Vsak vektor vsebuje enega od štirih različnih Selekcijskih markerjev (HIS3, TRP1, LEU2 ali URA3) za genomsko integracijo.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> Da bi ustvarili organizem, ki proizvaja monoterpenoid α-pinen, smo spremenili mevalonatno pot modelnega organizma ''Saccharomyces cerevisiae''. Z metodo Golden Gate Assembly so ustavili heterologne gene, kot je PptAPS ter povečali izražanje endogenih genov, kot sta ScERG13 ali SctHMGR.&lt;br /&gt;<br /> Genske spremembe so temlejile na sistemu CRISPR-Cas9. Oblikovana je bila pot do α-pinena (prekurzorja monoterpenoidov). Z namenom povečanja koncentracije mevalonata je bil utišan ScROX1 in ScERG13 ter SctHMGR uravnavana z močnim promotorjem. Izločitev ScROX1 je bila ugodna za povečanje koncentracije mevalonata, saj zavira encime v MVA&lt;ref&gt;[10]&lt;/ref&gt;. Nadalje smo uvedli heterologne gene GgmFPS144 iz Gallus gallus in AgtGPPS2 iz Abies grandis, da bi povečali koncentracijo geranil difosfata (GPP), prekurzorske molekule vseh monoterpenoidov. Izločitev ScERG20 in vstavljanje GgmFPS144 sta bila potrebna za zaviranje vitalne reakcije GPP v farnezil difosfat (FPP), vendar ne popolnoma ovirati&lt;ref&gt;[11]&lt;/ref&gt;. Uvedba heterologne α-pinen sintaze (PptAPS) iz ''Pinus ponderosa'' je povečala proizvodnjo α-pinena v citosolu ''S. cerevisiae''.&lt;br /&gt;<br /> Genomske tarče znotraj ScROX1, ScERG20 in ScpERG20 so bile predvidene s spletnim orodjem CRISPOR. Namesto da bi naše konstrukte vstavili v genomsko DNA, smo konstrukte klonirali v vektorje shuttle z različnimi avksotrofijami.<br /> Analiza z GC-MS je potrdila prisotnost α-pinena v lizatu.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v peroksisomih ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> Poleg citosola je peroksisom postal obetavna tarča za presnovni inženiring, saj naj bi njegove fiziološke lastnosti, kot je razpoložljivost substrata, znatno izboljšale sintezo produkta&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;.&lt;br /&gt;<br /> Ker se metabolizem mevalonata ne pojavlja naravno v peroksisomih&lt;ref&gt;[12]&lt;/ref&gt;, je bilo treba v vsak sev kvasovk pod nadzorom konstitutivnega promotorja pADH vključiti potrebne gene ScERG13, SctHMGR, ScERG12, ScERG8 in ScERG19, spojene s PTS1, za enoten izražanje genov. V različnih primerih so v zapis vključili sintazo SltNPPS1 iz ''Solanum lycopersicum'', kar omogoča proizvodnjo monoterpenoidnega prekurzorja neril difosfata (NPP), ali heterologna gena GgmFPS144 in AgtGPPS2 iz ''Gallus gallus'' oziroma ''Abies grandis'', kar omogoča proizvodnjo NPP, strukturnega izomera geranil difosfata (GPP). V obeh primerih je bil dodan še zapis za PptAPS, ki katalizira reakcijo NPP ali GPP na α-pinen. Povečanje izražanja ScERG13 in SctHMGR je poteklo z uporabo promotorja ScpTEF.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Za primerjavo brezcelične proizvodnje verbenona v in vitro poskusih so pripravili tudi sev kvasovk, ki vsebuje citokrom P450 monooksigenazo (CYP) limonen-3-hidroksilazo (L3H) in je zmožen katalize α-pinena.&lt;br /&gt;<br /> <br /> Končna ocena spremenjenih sevov kvasovk je bila izvedena s kvantifikacijo z uporabo GC-MS analize, ki je potrdila prisotnost α-pinena v obeh variantah kvasovk. <br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> ''Yarrowia lipolytica'' je obetaven organizem za sintezo monoterpenoidov, saj vsebuje visoko koncentracijo acetil-CoA, je sposoben učinkovito kopičiti lipide in kaže visoko toleranco do monoterpenoidov. Za izražanje terpinoidnih prekurzorjev v ''Yarrowia lipolytica'' so izrazili gena SctHMGR in ScERG13 organizma Saccharomyces cerevisiae. Uvedba genov AgtGPPS2 in GgMFPS144 bi pomenili zmanjšano količino proizvedenega farnezil pirofosfata (FPP) in povečano količino geranil pirofosfata (GPP). Drugi poskus je predvideval zmanjšanje količine proizvedenega FPP. To so poskušali narediti z uvedbo SltNPPS1 za proizvodnjo neril pirofosfata (NPP). Dodan je bil še gen PptAPS za proizvodnjo α-pinena.&lt;br /&gt;<br /> Genomska ciljna zaporedja so bila izbrana tako, da so blizu začetnemu zaporedju gena ter z visoko učinkovitostjo, specifičnostjo in brez stranskih ciljev na podlagi spletne programske opreme CRISPOR.&lt;br /&gt;<br /> cPCR nikoli ni pokazal uspešne vstavitve genov, temveč so opazili le dolžine, ki bi jih pričakovali od prvotnega genomskega zaporedja. Zaradi časovnih omejitev pa poskus ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> ''Y. lipolytica'' je zaradi njegovega obsežnega metabolizma maščobnih kislin zanimiv organizem za peroksisomsko proizvodnjo monoterpenoidov. Poskus je predvideval implementacijo presnovnih poti, ki uporabljajo GPP ali NPP kot substrat za monoterpensko sintazo PptAPS v peroksisomih ''Y. lipolytica''. Geni, ki naj bi bili močno izraženi, so bili pod regulacijo promotorja YlpTEF, medtem ko so bili geni, ki so zahtevali šibkejšo ekspresijo, sestavljeni s promotorjem YlpGAP. &lt;br /&gt;<br /> <br /> Vsi geni poti, ki uporabljajo NPP, so bili uspešno sestavljeni, vendar zaradi pomanjkanja časa projekt ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> == LITERATURA ==<br /> <br /> [1] A. El Asbahani, K. Miladi, W. Badri, M. Sala, E. H. A. Addi, H. Casabianca, A. El Mousadik, D. Hartmann, A. Jilale, F. N. R. Renaud, et al.: Essential oils: From extraction to encapsulation. International Journal of Pharmaceutics. Elsevier B.V. April 15, 2015, pp 220–243.&lt;br /&gt;<br /> [2] Q. Gao, L. Wang, M. Zhang, Y. Wei, W. Lin: Recent Advances on Feasible Strategies for Monoterpenoid Production in Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. Frontiers Media S.A. December 1, 2020.&lt;br /&gt;<br /> [3] O. A. Carter, R. J. Peters, R. Croteau: Monoterpene biosynthesis pathway construction in Escherichia coli. Phytochemistry 2003, 64, 425–433.&lt;br /&gt;<br /> [4] M. T. Lundemo, J. M. Woodley: Guidelines for development and implementation of biocatalytic P450 processes. Applied Microbiology and Biotechnology. Springer Verlag February 28, 2015, pp 2465–2483.&lt;br /&gt;<br /> [5] C. Ignea, M. H. Raadam, M. S. Motawia, A. M. Makris, C. E. Vickers, S. C. Kampranis: Orthogonal monoterpenoid biosynthesis in yeast constructed on an isomeric substrate. Nat. Commun. 2019, 10.&lt;br /&gt;<br /> [6] J. Zhao, X. Bao, C. Li, Y. Shen, J. Hou: Improving monoterpene geraniol production through geranyl diphosphate synthesis regulation in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 4561–4571.&lt;br /&gt;<br /> [7] S. Dusséaux, W. T. Wajn, Y. Liu, C. Ignea, S. C. Kampranis: Transforming yeast peroxisomes into microfactories for the efficient production of high-value isoprenoids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020, 117, 31789–31799.&lt;br /&gt;<br /> [8] C. Brocard, A. Hartig: Peroxisome targeting signal 1: Is it really a simple tripeptide? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. Biochim Biophys Acta December 2006, pp 1565–1573.&lt;br /&gt;<br /> [9] S. Zernia, F. Ott, K. Bellmann-Sickert, R. Frank, M. Klenner, H. G. Jahnke, A. Prager, B. Abel, A. Robitzki, A. G. Beck-Sickinger: Peptide-Mediated Specific Immobilization of Catalytically Active Cytochrome P450 BM3 Variant. Bioconjug. Chem. 2016, 27, 1090–1097.&lt;br /&gt;<br /> [10] J. N. Bröker, B. Müller, N. van Deenen, D. Prüfer, C. Schulze Gronover: Upregulating the mevalonate pathway and repressing sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae enhances the production of triterpenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 6923–6934.&lt;br /&gt;<br /> [11] S. Brown, M. Clastre, V. Courdavault, S. E. O’Connor: De novo production of the plant-derived alkaloid strictosidine in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015, 112, 3205–3210.&lt;br /&gt;<br /> [12] C. Y. Zhang, N. B. Lin, X. S. Chai, Zhong-Li, D. G. Barnes: A rapid method for simultaneously determining ethanol and methanol content in wines by full evaporation headspace gas chromatography. Food Chem. 2015, 183, 169–172.&lt;br /&gt;</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MonChassis&diff=21673 2023-04-02T20:06:48Z

<p>Nika Tomsič: </p> <hr /> <div>Svet se trenutno sooča z velikimi globalnimi težavami, zato je potrebno iskanje novih, trajnostnih rešitev. Poseben razred z obetajočimi aplikacijami so monoterpenoidi. Monoterpenoidi imajo širok spekter uporabe, na primer v kozmetiki, medicini, zatiranju škodljivcev, živilski industriji in biogorivih. Toda obsežna uporaba monoterpenoidov je redka zaradi cene in časa, ki so potrebni za njihovo pripravo. Skupina iGem iz Muenstera je leta 2022 raziskovala možnost njihove sinteze v kvasovkah. Predstavitev projekta je dostopna na sledeči povezavi: https://2022.igem.wiki/wwu-muenster/.<br /> <br /> <br /> == TRENUTNA PRIDELAVA ==<br /> <br /> <br /> <br /> === Ekstrakcija iz rastlin ===<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Primarni vir monoterpenoidov so rastline, kjer imajo pomembno vlogo v številnih fizioloških procesih. Rastlinska eterična olja vsebujejo več kot 80 % monoterpenoidov, vendar ima ekstrakcija eteričnih olj iz rastlin nizek izkoristek. Poleg tega je zaradi kompleksnosti eteričnih olj čiščenje posameznih monoterpenoidov stroškovno obsežno, naporno in neučinkovito. Sestava je namreč odvisna od pogojev rasti rastlin in njihovega shranjevanja &lt;ref&gt;[1]&lt;/ref&gt;.<br /> Kemijska sinteza:<br /> Kemijska sinteza je bolj zanesljiva možnost za proizvajanje monoterpenov. Priprava enostavnih molekul je možna, medtem ko se cena in potrebna energija večata z večanjem kompleksnosti molekule. Poleg tega pe je kemijska sinteza okolju neprijazna zaradi onesnažujočih topil in katalizatorjev ter je včasih odvisna od neobnovljivih virov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v bakterijah ===<br /> <br /> <br /> Bakterije so pogosto prva izbira za proizvodnjo kemikalij in vivo, saj je taka proizvodnja hitra in poceni. Za proizvodnjo monoterpenoidov pa ima delo z bakterijami več pomanjkljivosti. Prvič, obstaja pomanjkanje prekurzorja geranil difosfata (GPP) v bakterijskem gostitelju. Za povečanje sinteze je treba celotno pot mevalonata preoblikovati v bakterije&lt;ref&gt;[3]&lt;/ref&gt;. Drugič, koraki monoterpenoidne biosinteze zahtevajo funkcionalno izražanje CYP, kar je izziv pri bakterijah&lt;ref&gt;[4]&lt;/ref&gt;. Tretjič, tudi če se vsi heterologni geni lahko funkcionalno izrazijo, proizvodnja monoterpenoidov z bakterijami morda ne bo učinkovita. Kopičenje prekurzorjev vodi do zmanjšane rasti celic, različni monoterpenoidi pa imajo toksične učinke na bakterije z motnjami v celični membrani&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v kvasovkah ===<br /> <br /> <br /> Kvasovke predstavljajo privlačno alternativo za proizvodnjo monoterpenoidov. Kvasovke imajo pot endogenega mevalonata (MVA), ki jo lahko spremenimo za sintezo monoterpenoidov&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt; Vendar naravna pot MVA ne omogoča učinkovite sinteze monoterpenoidov, saj se GPP, predhodnik vseh monoterpenoidov, hitro pretvori v farnezil difosfat (FPP). Druga omejitev pri proizvodnji monoterpenoidov s kvasom je toksičnost proizvoda. Čeprav so kvasovke na splošno močnejše od bakterij, lahko toksični učinki monoterpenoidov omejijo možne donose&lt;ref&gt;[6]&lt;/ref&gt;. Zato smo ugotovili, da trenutno ni izvedljive strategije za učinkovito proizvodnjo široke palete monoterpenoidov v velikem obsegu.<br /> <br /> <br /> <br /> == MON CHASSIS ==<br /> <br /> MonChassis je prilagodljiva platforma na osnovi kvasovk za obsežno proizvodnjo monoterpenoidov. Temelji na pripravi terpenskih prekurzorjev v kvasovkah z uporabo sinteznobiološkega inženiringa ter s katalizo v končne produkte z brezceličnim sistemov encima CYP. Raziskovana je bila proizvodnja v ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica'' s spremembo moči promotorjev ključnih encimov in uvedbo novih zapisov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> '''Slika1: Prikaz mevalonatne poti S. cerevisiae. V modrem so napisani potrebni encimi in s puščico navzgor označeni encimi, katerih povečana aktivnost bi pomenila potencialno povečanje poizvodnje terpenoidnih prekurzorjev.'''<br /> <br /> Monoterpenoide so lahko učinkovito sintetizira z modifikacijo mevalonantne poti kvasovk&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Da bi povečali presnovni tok poti MVA, je bilo identificiranih in optimiziranih več pomembnih encimov, ki omejujejo hitrost poti. Z uvedbo dodatnih heterolognih genov in utišanjem endogenih genov je možno optimizirati proizvodnjo monoterpenoidov. Glavni cilj je bil povečati proizvodnjo geranil difosfata (GPP) v ''Saccharomyces cerevisiae'', saj deluje kot bistveni prekurzor za sintezo monoterpenoidov, kot je α-pinen. Med temi sta najbolj omejujoča ERG13 in 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A (tHMGR). Če gena za ta encima prekomerno izrazimo, se poveča tudi proizvodnja prekurzorjev monoterpenoidov.<br /> Dodatna skupna omejitev modelov je sinteza ergosterola iz GPP, iz katerega nastajajo tudi prekurzorji monoterpenoidov. Ker je sinteza ergosterola nujna za celično rast, bodo modeli, ki temeljijo na endogeni poti MVA kvasovk, vedno omejeni v svojih donosih. Zaradi tega je bila preverjena tudi učinkovitost proizvodnje tudi v peroksisomih, ker bi tako bila proizvodnja monoterpenoidov in ergosterola ločena. Peroksisomi predstavljajo zagotavljajo ugodne fiziološke pogoje za sintezo prekurzorjev monoterpenoidov&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;. Usmerjanje encimov na peroksisome je mogoče zlahka doseči z dodajanjem tripeptida C-terminalnega peroksisomskega ciljnega signala-1 (PTS1)&lt;ref&gt;[8]&lt;/ref&gt;. Skupaj se je preverjalo učinkovitost proizvodnje v citosolu in v peroksisomu bodisi v organizmih ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica''. <br /> MonChassis je sestavljena iz dveh komponent: sestava prekurzorjev terpenov v kvasovkah in in vitro kataliza spremembe prekurzerjev v monoterpenoide. V ta namen MonChassis uporablja samozasnovan bioreaktor za encimsko elektrosintezo (BREES) in modificirano citokrom P450 monooksigenazo BM3. Kot dokaz delovanja je potekla kataliza reakcije iz α-pinena v verbenon.<br /> <br /> <br /> == BREES ==<br /> <br /> Najlažji način za spopadanje s toksičnostjo produktov je uporaba brezceličnih sistemov. Tradicionalna biokataliza brez celic zahteva dodajanje kofaktorjev, kot je NADPH, ki zvišuje stroške za obsežne aplikacije. Da bi bila komponenta MonChassis in vitro uporabna v industrijskem obsegu, smo potrebo po dragih kofaktorjih izločili iz enačbe z uporabo električne energije kot poceni alternative. Zato je bil sestavljen BREES, bioreaktor za encimsko elektrosintezo. BM3, znan tudi kot citokrom P450 BM3 ali CYP102A1, je bakterijski encim citokroma P450, pridobljen iz ''Bacillus megaterium''. Je vsestranski encim z aktivnostmi monooksigenaze in hidroksilaze maščobnih kislin. Čeprav ni neposredno vpleten v proizvodnjo terpenoidov, so bili BM3 in njegove različice uporabljeni kot biokatalizatorji za modificiranje terpenoidnih spojin, zlasti v kontekstu sintetične biologije in presnovnega inženiringa. Raziskovalci so izdelali BM3 in druge encime citokroma P450 za uvedbo hidroksilnih skupin, epoksidov ali drugih funkcionalnih skupin v terpenoidne molekule, kar lahko vodi do ustvarjanja novih spojin s potencialno duporabo za proizvodnjo farmacevtskih izdelkov, arom, dišav ali drugih. Modificiran encim CYP BM3 iz ''Priestia magaterium'' ima dodan peptidni povezovalec, ki lahko imobilizira encim na elektrodo iz indijevega kositrovega oksida in omogoči neposreden prenos elektronov z elektrode na encim&lt;ref&gt;[9]&lt;/ref&gt;. Zato lahko encim uporablja elektrone neposredno iz električne energije in ne zahteva dovajanja drugih kofaktorjev. BM3 To drastično zniža operativne stroške komponente MonChassis in vitro v primerjavi s konvencionalno biokatalizo brez celic. V kombinaciji z inženirskimi sevi kvasovk MonChassis BREES omogoča hitro, prilagodljivo in obsežno proizvodnjo monoterpenoidov.<br /> <br /> <br /> == STRATEGIJA KLONIRANJA ==<br /> <br /> <br /> <br /> Po uradnih pravilih iGEM je bilo splošno kloniranje izvedeno v skladu z modularnim sistemom kloniranja RFC1000 (MoClo).<br /> Sistem MoClo se opira na restrikcijske encime tipa IIS, ki cepijo DNA tako, da nastanejo lepljivi konci. Ustvarjanje različnih koncev pri različnih fragmentih omogoča učinkovito sestavljanje več fragmentov DNA v eni preprosti reakciji ligacije. Primerna zasnova koncev omogoča, da se fragmenti sestavljajo samo v vnaprej določenem vrstnem redu. Vsi geni so bili pomnoženi z začetno verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo specifičnih začetnih oligonukleotidov z ustreznimi pritrjenimi konci.<br /> Končni zapis je bil sestavljen z metodo Golden Gate v vektor pSB1C00. V vektor so dovajali zapis transkripcijskih enot, ki so ga sestavljali promotorj, kodirno zaporedje in terminator. Z uporabo različnih promotorjev je bila mogoča sprememba ravni izražanja genov. Uspešno integracijo so preverili s selekcijo transformiranih kolonij, saj so celice konstitutivno izražale rdeči fluorescenčni protein (mRFP1).<br /> <br /> Za transformacijo kvasovk sta bili uporabljeni metodi Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-assotiated protein 9 (CRISPR-Cas9) in uporaba ekstrakromosomskih shuttle vektorjev. Vsak vektor vsebuje enega od štirih različnih yelekcijskih markerjev (HIS3, TRP1, LEU2 ali URA3) za genomsko integracijo.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> Da bi ustvarili organizem, ki proizvaja monoterpenoid α-pinen, smo spremenili mevalonatno pot modelnega organizma ''Saccharomyces cerevisiae''. Z metodo Golden Gate Assembly so ustavili heterologne gene, kot je PptAPS ter povečali izražanje endogenih genov, kot sta ScERG13 ali SctHMGR.<br /> Genske spremembe so temlejile na sistemu CRISPR-Cas9. Oblikovana je bila pot do α-pinena (prekurzorja monoterpenoidov). Z namenom povečanja koncentracije mevalonata je bil utišan ScROX1 in ScERG13 ter SctHMGR uravnavana z močnim promotorjem. Izločitev ScROX1 je bila ugodna za povečanje koncentracije mevalonata, saj zavira encime v MVA&lt;ref&gt;[10]&lt;/ref&gt;. Nadalje smo uvedli heterologne gene GgmFPS144 iz Gallus gallus in AgtGPPS2 iz Abies grandis, da bi povečali koncentracijo geranil difosfata (GPP), prekurzorske molekule vseh monoterpenoidov. Izločitev ScERG20 in vstavljanje GgmFPS144 sta bila potrebna za zaviranje vitalne reakcije GPP v farnezil difosfat (FPP), vendar ne popolnoma ovirati&lt;ref&gt;[11]&lt;/ref&gt;. Uvedba heterologne α-pinen sintaze (PptAPS) iz ''Pinus ponderosa'' je povečala proizvodnjo α-pinena v citosolu ''S. cerevisiae''.<br /> Genomske tarče znotraj ScROX1, ScERG20 in ScpERG20 so bile predvidene s spletnim orodjem CRISPOR. Namesto da bi naše konstrukte vstavili v genomsko DNA, smo konstrukte klonirali v vektorje shuttle z različnimi avksotrofijami.<br /> Analiza z GC-MS je potrdila prisotnost α-pinena v lizatu.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v peroksisomih ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> Poleg citosola je peroksisom postal obetavna tarča za presnovni inženiring, saj naj bi njegove fiziološke lastnosti, kot je razpoložljivost substrata, znatno izboljšale sintezo produkta&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;.<br /> Ker se metabolizem mevalonata ne pojavlja naravno v peroksisomih&lt;ref&gt;[12]&lt;/ref&gt;, je bilo treba v vsak sev kvasovk pod nadzorom konstitutivnega promotorja pADH vključiti potrebne gene ScERG13, SctHMGR, ScERG12, ScERG8 in ScERG19, spojene s PTS1, za enoten izražanje genov. V različnih primerih so v zapis vključili sintazo SltNPPS1 iz ''Solanum lycopersicum'', kar omogoča proizvodnjo monoterpenoidnega prekurzorja neril difosfata (NPP), ali heterologna gena GgmFPS144 in AgtGPPS2 iz ''Gallus gallus'' oziroma ''Abies grandis'', kar omogoča proizvodnjo NPP, strukturnega izomera geranil difosfata (GPP). V obeh primerih je bil dodan še zapis za PptAPS, ki katalizira reakcijo NPP ali GPP na α-pinen. Povečanje izražanja ScERG13 in SctHMGR je poteklo z uporabo promotorja ScpTEF.<br /> <br /> Za primerjavo brezcelične proizvodnje verbenona v in vitro poskusih so pripravili tudi sev kvasovk, ki vsebuje citokrom P450 monooksigenazo (CYP) limonen-3-hidroksilazo (L3H) in je zmožen katalize α-pinen<br /> <br /> Končna ocena spremenjenih sevov kvasovk je bila izvedena s kvantifikacijo z uporabo GC-MS analize, ki je potrdila prisotnost α-pinena v obeh variantah kvasovk. <br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> ''Yarrowia lipolytica'' je obetaven organizem za sintezo monoterpenoidov, saj vsebuje visoko koncentracijo acetil-CoA, je sposoben učinkovito kopičiti lipide in kaže visoko toleranco do monoterpenoidov. Za izražanje terpinoidnih prekurzorjev v ''Yarrowia lipolytica'' so izrazili gena SctHMGR in ScERG13 organizma Saccharomyces cerevisiae. Uvedba genov AgtGPPS2 in GgMFPS144 bi pomenili zmanjšano količino proizvedenega farnezil pirofosfata (FPP) in povečano količino geranil pirofosfata (GPP). Drugi poskus je predvideval zmanjšanje količine proizvedenega FPP. To so poskušali narediti z uvedbo SltNPPS1 za proizvodnjo neril pirofosfata (NPP). Dodan je bil še gen PptAPS za proizvodnjo α-pinena.<br /> Genomska ciljna zaporedja so bila izbrana tako, da so blizu začetnemu zaporedju gena ter z visoko učinkovitostjo, specifičnostjo in brez stranskih ciljev na podlagi spletne programske opreme CRISPOR.<br /> cPCR nikoli ni pokazal uspešne vstavitve genov, temveč so opazili le dolžine, ki bi jih pričakovali od prvotnega genomskega zaporedja. Zaradi časovnih omejitev pa poskus ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> ''Y. lipolytica'' je zaradi njegovega obsežnega metabolizma maščobnih kislin zanimiv organizem za peroksisomsko proizvodnjo monoterpenoidov. Poskus je predvideval implementacijo presnovnih poti, ki uporabljajo GPP ali NPP kot substrat za monoterpensko sintazo PptAPS v peroksisomih ''Y. lipolytica''. Geni, ki naj bi bili močno izraženi, so bili pod regulacijo promotorja YlpTEF, medtem ko so bili geni, ki so zahtevali šibkejšo ekspresijo, sestavljeni s promotorjem YlpGAP. <br /> <br /> Vsi geni poti, ki uporabljajo NPP, so bili uspešno sestavljeni, vendar zaradi pomanjkanja časa projekt ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> == LITERATURA ==<br /> <br /> [1] A. El Asbahani, K. Miladi, W. Badri, M. Sala, E. H. A. Addi, H. Casabianca, A. El Mousadik, D. Hartmann, A. Jilale, F. N. R. Renaud, et al.: Essential oils: From extraction to encapsulation. International Journal of Pharmaceutics. Elsevier B.V. April 15, 2015, pp 220–243.&lt;br /&gt;<br /> [2] Q. Gao, L. Wang, M. Zhang, Y. Wei, W. Lin: Recent Advances on Feasible Strategies for Monoterpenoid Production in Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. Frontiers Media S.A. December 1, 2020.&lt;br /&gt;<br /> [3] O. A. Carter, R. J. Peters, R. Croteau: Monoterpene biosynthesis pathway construction in Escherichia coli. Phytochemistry 2003, 64, 425–433.&lt;br /&gt;<br /> [4] M. T. Lundemo, J. M. Woodley: Guidelines for development and implementation of biocatalytic P450 processes. Applied Microbiology and Biotechnology. Springer Verlag February 28, 2015, pp 2465–2483.&lt;br /&gt;<br /> [5] C. Ignea, M. H. Raadam, M. S. Motawia, A. M. Makris, C. E. Vickers, S. C. Kampranis: Orthogonal monoterpenoid biosynthesis in yeast constructed on an isomeric substrate. Nat. Commun. 2019, 10.&lt;br /&gt;<br /> [6] J. Zhao, X. Bao, C. Li, Y. Shen, J. Hou: Improving monoterpene geraniol production through geranyl diphosphate synthesis regulation in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 4561–4571.&lt;br /&gt;<br /> [7] S. Dusséaux, W. T. Wajn, Y. Liu, C. Ignea, S. C. Kampranis: Transforming yeast peroxisomes into microfactories for the efficient production of high-value isoprenoids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020, 117, 31789–31799.&lt;br /&gt;<br /> [8] C. Brocard, A. Hartig: Peroxisome targeting signal 1: Is it really a simple tripeptide? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. Biochim Biophys Acta December 2006, pp 1565–1573.&lt;br /&gt;<br /> [9] S. Zernia, F. Ott, K. Bellmann-Sickert, R. Frank, M. Klenner, H. G. Jahnke, A. Prager, B. Abel, A. Robitzki, A. G. Beck-Sickinger: Peptide-Mediated Specific Immobilization of Catalytically Active Cytochrome P450 BM3 Variant. Bioconjug. Chem. 2016, 27, 1090–1097.&lt;br /&gt;<br /> [10] J. N. Bröker, B. Müller, N. van Deenen, D. Prüfer, C. Schulze Gronover: Upregulating the mevalonate pathway and repressing sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae enhances the production of triterpenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 6923–6934.&lt;br /&gt;<br /> [11] S. Brown, M. Clastre, V. Courdavault, S. E. O’Connor: De novo production of the plant-derived alkaloid strictosidine in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015, 112, 3205–3210.&lt;br /&gt;<br /> [12] C. Y. Zhang, N. B. Lin, X. S. Chai, Zhong-Li, D. G. Barnes: A rapid method for simultaneously determining ethanol and methanol content in wines by full evaporation headspace gas chromatography. Food Chem. 2015, 183, 169–172.&lt;br /&gt;</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MonChassis&diff=21672 2023-04-02T20:02:13Z

<p>Nika Tomsič: </p> <hr /> <div>Svet se trenutno sooča z velikimi globalnimi težavami, zato je potrebno iskanje novih, trajnostnih rešitev. Poseben razred z obetajočimi aplikacijami so monoterpenoidi. Monoterpenoidi imajo širok spekter uporabe, na primer v kozmetiki, medicini, zatiranju škodljivcev, živilski industriji in biogorivih. Toda obsežna uporaba monoterpenoidov je redka zaradi cene in časa, ki so potrebni za njihovo pripravo. Skupina iGem iz Muenstera je leta 2022 raziskovala možnost njihove sinteze v kvasovkah. Predstavitev projekta je dostopna na sledeči povezavi: https://2022.igem.wiki/wwu-muenster/.<br /> <br /> <br /> == TRENUTNA PRIDELAVA ==<br /> <br /> <br /> <br /> === Ekstrakcija iz rastlin ===<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Primarni vir monoterpenoidov so rastline, kjer imajo pomembno vlogo v številnih fizioloških procesih. Rastlinska eterična olja vsebujejo več kot 80 % monoterpenoidov, vendar ima ekstrakcija eteričnih olj iz rastlin nizek izkoristek. Poleg tega je zaradi kompleksnosti eteričnih olj čiščenje posameznih monoterpenoidov stroškovno obsežno, naporno in neučinkovito. Sestava je namreč odvisna od pogojev rasti rastlin in njihovega shranjevanja &lt;ref&gt;[1]&lt;/ref&gt;.<br /> Kemijska sinteza:<br /> Kemijska sinteza je bolj zanesljiva možnost za proizvajanje monoterpenov. Priprava enostavnih molekul je možna, medtem ko se cena in potrebna energija večata z večanjem kompleksnosti molekule. Poleg tega pe je kemijska sinteza okolju neprijazna zaradi onesnažujočih topil in katalizatorjev ter je včasih odvisna od neobnovljivih virov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v bakterijah ===<br /> <br /> <br /> Bakterije so pogosto prva izbira za proizvodnjo kemikalij in vivo, saj je taka proizvodnja hitra in poceni. Za proizvodnjo monoterpenoidov pa ima delo z bakterijami več pomanjkljivosti. Prvič, obstaja pomanjkanje prekurzorja geranil difosfata (GPP) v bakterijskem gostitelju. Za povečanje sinteze je treba celotno pot mevalonata preoblikovati v bakterije&lt;ref&gt;[3]&lt;/ref&gt;. Drugič, koraki monoterpenoidne biosinteze zahtevajo funkcionalno izražanje CYP, kar je izziv pri bakterijah&lt;ref&gt;[4]&lt;/ref&gt;. Tretjič, tudi če se vsi heterologni geni lahko funkcionalno izrazijo, proizvodnja monoterpenoidov z bakterijami morda ne bo učinkovita. Kopičenje prekurzorjev vodi do zmanjšane rasti celic, različni monoterpenoidi pa imajo toksične učinke na bakterije z motnjami v celični membrani&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v kvasovkah ===<br /> <br /> <br /> Kvasovke predstavljajo privlačno alternativo za proizvodnjo monoterpenoidov. Kvasovke imajo pot endogenega mevalonata (MVA), ki jo lahko spremenimo za sintezo monoterpenoidov&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt; Vendar naravna pot MVA ne omogoča učinkovite sinteze monoterpenoidov, saj se GPP, predhodnik vseh monoterpenoidov, hitro pretvori v farnezil difosfat (FPP). Druga omejitev pri proizvodnji monoterpenoidov s kvasom je toksičnost proizvoda. Čeprav so kvasovke na splošno močnejše od bakterij, lahko toksični učinki monoterpenoidov omejijo možne donose&lt;ref&gt;[6]&lt;/ref&gt;. Zato smo ugotovili, da trenutno ni izvedljive strategije za učinkovito proizvodnjo široke palete monoterpenoidov v velikem obsegu.<br /> <br /> <br /> <br /> == MON CHASSIS ==<br /> <br /> MonChassis je prilagodljiva platforma na osnovi kvasovk za obsežno proizvodnjo monoterpenoidov. Temelji na pripravi terpenskih prekurzorjev v kvasovkah z uporabo sinteznobiološkega inženiringa ter s katalizo v končne produkte z brezceličnim sistemov encima CYP. Raziskovana je bila proizvodnja v ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica'' s spremembo moči promotorjev ključnih encimov in uvedbo novih zapisov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> '''Slika1: Prikaz mevalonatne poti S. cerevisiae. V modrem so napisani potrebni encimi in s puščico navzgor označeni encimi, katerih povečana aktivnost bi pomenila potencialno povečanje poizvodnje terpenoidnih prekurzorjev.'''<br /> <br /> Monoterpenoide so lahko učinkovito sintetizira z modifikacijo mevalonantne poti kvasovk&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Da bi povečali presnovni tok poti MVA, je bilo identificiranih in optimiziranih več pomembnih encimov, ki omejujejo hitrost poti. Z uvedbo dodatnih heterolognih genov in utišanjem endogenih genov je možno optimizirati proizvodnjo monoterpenoidov. Glavni cilj je bil povečati proizvodnjo geranil difosfata (GPP) v ''Saccharomyces cerevisiae'', saj deluje kot bistveni prekurzor za sintezo monoterpenoidov, kot je α-pinen. Med temi sta najbolj omejujoča ERG13 in 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A (tHMGR). Če gena za ta encima prekomerno izrazimo, se poveča tudi proizvodnja prekurzorjev monoterpenoidov.<br /> Dodatna skupna omejitev modelov je sinteza ergosterola iz GPP, iz katerega nastajajo tudi prekurzorji monoterpenoidov. Ker je sinteza ergosterola nujna za celično rast, bodo modeli, ki temeljijo na endogeni poti MVA kvasovk, vedno omejeni v svojih donosih. Zaradi tega je bila preverjena tudi učinkovitost proizvodnje tudi v peroksisomih, ker bi tako bila proizvodnja monoterpenoidov in ergosterola ločena. Peroksisomi predstavljajo zagotavljajo ugodne fiziološke pogoje za sintezo prekurzorjev monoterpenoidov&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;. Usmerjanje encimov na peroksisome je mogoče zlahka doseči z dodajanjem tripeptida C-terminalnega peroksisomskega ciljnega signala-1 (PTS1)&lt;ref&gt;[8]&lt;/ref&gt;. Skupaj se je preverjalo učinkovitost proizvodnje v citosolu in v peroksisomu bodisi v organizmih ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica''. <br /> MonChassis je sestavljena iz dveh komponent: sestava prekurzorjev terpenov v kvasovkah in in vitro kataliza spremembe prekurzerjev v monoterpenoide. V ta namen MonChassis uporablja samozasnovan bioreaktor za encimsko elektrosintezo (BREES) in modificirano citokrom P450 monooksigenazo BM3. Kot dokaz delovanja je potekla kataliza reakcije iz α-pinena v verbenon.<br /> <br /> <br /> == BREES ==<br /> <br /> Najlažji način za spopadanje s toksičnostjo produktov je uporaba brezceličnih sistemov. Tradicionalna biokataliza brez celic zahteva dodajanje kofaktorjev, kot je NADPH, ki zvišuje stroške za obsežne aplikacije. Da bi bila komponenta MonChassis in vitro uporabna v industrijskem obsegu, smo potrebo po dragih kofaktorjih izločili iz enačbe z uporabo električne energije kot poceni alternative. Zato je bil sestavljen BREES, bioreaktor za encimsko elektrosintezo. BM3, znan tudi kot citokrom P450 BM3 ali CYP102A1, je bakterijski encim citokroma P450, pridobljen iz ''Bacillus megaterium''. Je vsestranski encim z aktivnostmi monooksigenaze in hidroksilaze maščobnih kislin. Čeprav ni neposredno vpleten v proizvodnjo terpenoidov, so bili BM3 in njegove različice uporabljeni kot biokatalizatorji za modificiranje terpenoidnih spojin, zlasti v kontekstu sintetične biologije in presnovnega inženiringa. Raziskovalci so izdelali BM3 in druge encime citokroma P450 za uvedbo hidroksilnih skupin, epoksidov ali drugih funkcionalnih skupin v terpenoidne molekule, kar lahko vodi do ustvarjanja novih spojin s potencialno duporabo za proizvodnjo farmacevtskih izdelkov, arom, dišav ali drugih. Modificiran encim CYP BM3 iz ''Priestia magaterium'' ima dodan peptidni povezovalec, ki lahko imobilizira encim na elektrodo iz indijevega kositrovega oksida in omogoči neposreden prenos elektronov z elektrode na encim&lt;ref&gt;[9]&lt;/ref&gt;. Zato lahko encim uporablja elektrone neposredno iz električne energije in ne zahteva dovajanja drugih kofaktorjev. BM3 To drastično zniža operativne stroške komponente MonChassis in vitro v primerjavi s konvencionalno biokatalizo brez celic. V kombinaciji z inženirskimi sevi kvasovk MonChassis BREES omogoča hitro, prilagodljivo in obsežno proizvodnjo monoterpenoidov.<br /> <br /> <br /> == STRATEGIJA KLONIRANJA ==<br /> <br /> Po uradnih pravilih iGEM je bilo splošno kloniranje izvedeno v skladu z modularnim sistemom kloniranja RFC1000 (MoClo).<br /> Sistem MoClo se opira na restrikcijske encime tipa IIS, ki cepijo DNA tako, da nastanejo lepljivi konci. Ustvarjanje različnih koncev pri različnih fragmentih omogoča učinkovito sestavljanje več fragmentov DNA v eni preprosti reakciji ligacije. Primerna zasnova koncev omogoča, da se fragmenti sestavljajo samo v vnaprej določenem vrstnem redu. Vsi geni so bili pomnoženi z začetno verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo specifičnih začetnih oligonukleotidov z ustreznimi pritrjenimi konci.<br /> Končni zapis je bil sestavljen z metodo Golden Gate v vektor pSB1C00. V vektor so dovajali zapis transkripcijskih enot, ki so ga sestavljali promotorj, kodirno zaporedje in terminator. Z uporabo različnih promotorjev je bila mogoča sprememba ravni izražanja genov. Uspešno integracijo so preverili s selekcijo transformiranih kolonij, saj so celice konstitutivno izražale rdeči fluorescenčni protein (mRFP1).<br /> <br /> Za transformacijo kvasovk sta bili uporabljeni metodi Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-assotiated protein 9 (CRISPR-Cas9) in uporaba ekstrakromosomskih shuttle vektorjev. Vsak vektor vsebuje enega od štirih različnih yelekcijskih markerjev (HIS3, TRP1, LEU2 ali URA3) za genomsko integracijo.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Saccharomyces cerevisiae' ===<br /> <br /> Da bi ustvarili organizem, ki proizvaja monoterpenoid α-pinen, smo spremenili mevalonatno pot modelnega organizma ''Saccharomyces cerevisiae''. Z metodo Golden Gate Assembly so ustavili heterologne gene, kot je PptAPS ter povečali izražanje endogenih genov, kot sta ScERG13 ali SctHMGR.<br /> Genske spremembe so temlejile na sistemu CRISPR-Cas9. Oblikovana je bila pot do α-pinena (prekurzorja monoterpenoidov). Z namenom povečanja koncentracije mevalonata je bil utišan ScROX1 in ScERG13 ter SctHMGR uravnavana z močnim promotorjem. Izločitev ScROX1 je bila ugodna za povečanje koncentracije mevalonata, saj zavira encime v MVA&lt;ref&gt;[10]&lt;/ref&gt;. Nadalje smo uvedli heterologne gene GgmFPS144 iz Gallus gallus in AgtGPPS2 iz Abies grandis, da bi povečali koncentracijo geranil difosfata (GPP), prekurzorske molekule vseh monoterpenoidov. Izločitev ScERG20 in vstavljanje GgmFPS144 sta bila potrebna za zaviranje vitalne reakcije GPP v farnezil difosfat (FPP), vendar ne popolnoma ovirati&lt;ref&gt;[11]&lt;/ref&gt;. Uvedba heterologne α-pinen sintaze (PptAPS) iz ''Pinus ponderosa'' je povečala proizvodnjo α-pinena v citosolu ''S. cerevisiae''.<br /> Genomske tarče znotraj ScROX1, ScERG20 in ScpERG20 so bile predvidene s spletnim orodjem CRISPOR. Namesto da bi naše konstrukte vstavili v genomsko DNA, smo konstrukte klonirali v vektorje shuttle z različnimi avksotrofijami.<br /> Analiza z GC-MS je potrdila prisotnost α-pinena v lizatu.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v peroksisomih ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> Poleg citosola je peroksisom postal obetavna tarča za presnovni inženiring, saj naj bi njegove fiziološke lastnosti, kot je razpoložljivost substrata, znatno izboljšale sintezo produkta&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;.<br /> Ker se metabolizem mevalonata ne pojavlja naravno v peroksisomih&lt;ref&gt;[12]&lt;/ref&gt;, je bilo treba v vsak sev kvasovk pod nadzorom konstitutivnega promotorja pADH vključiti potrebne gene ScERG13, SctHMGR, ScERG12, ScERG8 in ScERG19, spojene s PTS1, za enoten izražanje genov. V različnih primerih so v zapis vključili sintazo SltNPPS1 iz ''Solanum lycopersicum'', kar omogoča proizvodnjo monoterpenoidnega prekurzorja neril difosfata (NPP), ali heterologna gena GgmFPS144 in AgtGPPS2 iz ''Gallus gallus'' oziroma ''Abies grandis'', kar omogoča proizvodnjo NPP, strukturnega izomera geranil difosfata (GPP). V obeh primerih je bil dodan še zapis za PptAPS, ki katalizira reakcijo NPP ali GPP na α-pinen. Povečanje izražanja ScERG13 in SctHMGR je poteklo z uporabo promotorja ScpTEF.<br /> <br /> Za primerjavo brezcelične proizvodnje verbenona v in vitro poskusih so pripravili tudi sev kvasovk, ki vsebuje citokrom P450 monooksigenazo (CYP) limonen-3-hidroksilazo (L3H) in je zmožen katalize α-pinen<br /> <br /> <br /> Končna ocena spremenjenih sevov kvasovk je bila izvedena s kvantifikacijo z uporabo GC-MS analize, ki je potrdila prisotnost α-pinena v obeh variantah kvasovk. <br /> <br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> ''Yarrowia lipolytica'' je obetaven organizem za sintezo monoterpenoidov, saj vsebuje visoko koncentracijo acetil-CoA, je sposoben učinkovito kopičiti lipide in kaže visoko toleranco do monoterpenoidov. Za izražanje terpinoidnih prekurzorjev v ''Yarrowia lipolytica'' so izrazili gena SctHMGR in ScERG13 organizma Saccharomyces cerevisiae. Uvedba genov AgtGPPS2 in GgMFPS144 bi pomenili zmanjšano količino proizvedenega farnezil pirofosfata (FPP) in povečano količino geranil pirofosfata (GPP). Drugi poskus je predvideval zmanjšanje količine proizvedenega FPP. To so poskušali narediti z uvedbo SltNPPS1 za proizvodnjo neril pirofosfata (NPP). Dodan je bil še gen PptAPS za proizvodnjo α-pinena.<br /> Genomska ciljna zaporedja so bila izbrana tako, da so blizu začetnemu zaporedju gena ter z visoko učinkovitostjo, specifičnostjo in brez stranskih ciljev na podlagi spletne programske opreme CRISPOR.<br /> cPCR nikoli ni pokazal uspešne vstavitve genov, temveč so opazili le dolžine, ki bi jih pričakovali od prvotnega genomskega zaporedja. Zaradi časovnih omejitev pa poskus ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> ===<br /> Proizvodnja v peroksisomih ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> ''Y. lipolytica'' je zaradi njegovega obsežnega metabolizma maščobnih kislin zanimiv organizem za peroksisomsko proizvodnjo monoterpenoidov. Poskus je predvideval implementacijo presnovnih poti, ki uporabljajo GPP ali NPP kot substrat za monoterpensko sintazo PptAPS v peroksisomih ''Y. lipolytica''. Geni, ki naj bi bili močno izraženi, so bili pod regulacijo promotorja YlpTEF, medtem ko so bili geni, ki so zahtevali šibkejšo ekspresijo, sestavljeni s promotorjem YlpGAP. <br /> <br /> Vsi geni poti, ki uporabljajo NPP, so bili uspešno sestavljeni, vendar zaradi pomanjkanja časa projekt ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> == LITERATURA ==<br /> <br /> [1] A. El Asbahani, K. Miladi, W. Badri, M. Sala, E. H. A. Addi, H. Casabianca, A. El Mousadik, D. Hartmann, A. Jilale, F. N. R. Renaud, et al.: Essential oils: From extraction to encapsulation. International Journal of Pharmaceutics. Elsevier B.V. April 15, 2015, pp 220–243.&lt;br /&gt;<br /> [2] Q. Gao, L. Wang, M. Zhang, Y. Wei, W. Lin: Recent Advances on Feasible Strategies for Monoterpenoid Production in Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. Frontiers Media S.A. December 1, 2020.&lt;br /&gt;<br /> [3] O. A. Carter, R. J. Peters, R. Croteau: Monoterpene biosynthesis pathway construction in Escherichia coli. Phytochemistry 2003, 64, 425–433.&lt;br /&gt;<br /> [4] M. T. Lundemo, J. M. Woodley: Guidelines for development and implementation of biocatalytic P450 processes. Applied Microbiology and Biotechnology. Springer Verlag February 28, 2015, pp 2465–2483.&lt;br /&gt;<br /> [5] C. Ignea, M. H. Raadam, M. S. Motawia, A. M. Makris, C. E. Vickers, S. C. Kampranis: Orthogonal monoterpenoid biosynthesis in yeast constructed on an isomeric substrate. Nat. Commun. 2019, 10.&lt;br /&gt;<br /> [6] J. Zhao, X. Bao, C. Li, Y. Shen, J. Hou: Improving monoterpene geraniol production through geranyl diphosphate synthesis regulation in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 4561–4571.&lt;br /&gt;<br /> [7] S. Dusséaux, W. T. Wajn, Y. Liu, C. Ignea, S. C. Kampranis: Transforming yeast peroxisomes into microfactories for the efficient production of high-value isoprenoids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020, 117, 31789–31799.&lt;br /&gt;<br /> [8] C. Brocard, A. Hartig: Peroxisome targeting signal 1: Is it really a simple tripeptide? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. Biochim Biophys Acta December 2006, pp 1565–1573.&lt;br /&gt;<br /> [9] S. Zernia, F. Ott, K. Bellmann-Sickert, R. Frank, M. Klenner, H. G. Jahnke, A. Prager, B. Abel, A. Robitzki, A. G. Beck-Sickinger: Peptide-Mediated Specific Immobilization of Catalytically Active Cytochrome P450 BM3 Variant. Bioconjug. Chem. 2016, 27, 1090–1097.&lt;br /&gt;<br /> [10] J. N. Bröker, B. Müller, N. van Deenen, D. Prüfer, C. Schulze Gronover: Upregulating the mevalonate pathway and repressing sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae enhances the production of triterpenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 6923–6934.&lt;br /&gt;<br /> [11] S. Brown, M. Clastre, V. Courdavault, S. E. O’Connor: De novo production of the plant-derived alkaloid strictosidine in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015, 112, 3205–3210.&lt;br /&gt;<br /> [12] C. Y. Zhang, N. B. Lin, X. S. Chai, Zhong-Li, D. G. Barnes: A rapid method for simultaneously determining ethanol and methanol content in wines by full evaporation headspace gas chromatography. Food Chem. 2015, 183, 169–172.&lt;br /&gt;</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MonChassis&diff=21671 2023-04-02T20:00:07Z

<p>Nika Tomsič: </p> <hr /> <div>Svet se trenutno sooča z velikimi globalnimi težavami, zato je potrebno iskanje novih, trajnostnih rešitev. Poseben razred z obetajočimi aplikacijami so monoterpenoidi. Monoterpenoidi imajo širok spekter uporabe, na primer v kozmetiki, medicini, zatiranju škodljivcev, živilski industriji in biogorivih. Toda obsežna uporaba monoterpenoidov je redka zaradi cene in časa, ki so potrebni za njihovo pripravo. Skupina iGem iz Muenstera je leta 2022 raziskovala možnost njihove sinteze v kvasovkah.<br /> <br /> <br /> == TRENUTNA PRIDELAVA ==<br /> <br /> <br /> <br /> === Ekstrakcija iz rastlin ===<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Primarni vir monoterpenoidov so rastline, kjer imajo pomembno vlogo v številnih fizioloških procesih. Rastlinska eterična olja vsebujejo več kot 80 % monoterpenoidov, vendar ima ekstrakcija eteričnih olj iz rastlin nizek izkoristek. Poleg tega je zaradi kompleksnosti eteričnih olj čiščenje posameznih monoterpenoidov stroškovno obsežno, naporno in neučinkovito. Sestava je namreč odvisna od pogojev rasti rastlin in njihovega shranjevanja &lt;ref&gt;[1]&lt;/ref&gt;.<br /> Kemijska sinteza:<br /> Kemijska sinteza je bolj zanesljiva možnost za proizvajanje monoterpenov. Priprava enostavnih molekul je možna, medtem ko se cena in potrebna energija večata z večanjem kompleksnosti molekule. Poleg tega pe je kemijska sinteza okolju neprijazna zaradi onesnažujočih topil in katalizatorjev ter je včasih odvisna od neobnovljivih virov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v bakterijah ===<br /> <br /> <br /> Bakterije so pogosto prva izbira za proizvodnjo kemikalij in vivo, saj je taka proizvodnja hitra in poceni. Za proizvodnjo monoterpenoidov pa ima delo z bakterijami več pomanjkljivosti. Prvič, obstaja pomanjkanje prekurzorja geranil difosfata (GPP) v bakterijskem gostitelju. Za povečanje sinteze je treba celotno pot mevalonata preoblikovati v bakterije&lt;ref&gt;[3]&lt;/ref&gt;. Drugič, koraki monoterpenoidne biosinteze zahtevajo funkcionalno izražanje CYP, kar je izziv pri bakterijah&lt;ref&gt;[4]&lt;/ref&gt;. Tretjič, tudi če se vsi heterologni geni lahko funkcionalno izrazijo, proizvodnja monoterpenoidov z bakterijami morda ne bo učinkovita. Kopičenje prekurzorjev vodi do zmanjšane rasti celic, različni monoterpenoidi pa imajo toksične učinke na bakterije z motnjami v celični membrani&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v kvasovkah ===<br /> <br /> <br /> Kvasovke predstavljajo privlačno alternativo za proizvodnjo monoterpenoidov. Kvasovke imajo pot endogenega mevalonata (MVA), ki jo lahko spremenimo za sintezo monoterpenoidov&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt; Vendar naravna pot MVA ne omogoča učinkovite sinteze monoterpenoidov, saj se GPP, predhodnik vseh monoterpenoidov, hitro pretvori v farnezil difosfat (FPP). Druga omejitev pri proizvodnji monoterpenoidov s kvasom je toksičnost proizvoda. Čeprav so kvasovke na splošno močnejše od bakterij, lahko toksični učinki monoterpenoidov omejijo možne donose&lt;ref&gt;[6]&lt;/ref&gt;. Zato smo ugotovili, da trenutno ni izvedljive strategije za učinkovito proizvodnjo široke palete monoterpenoidov v velikem obsegu.<br /> <br /> <br /> <br /> == MON CHASSIS ==<br /> <br /> MonChassis je prilagodljiva platforma na osnovi kvasovk za obsežno proizvodnjo monoterpenoidov. Temelji na pripravi terpenskih prekurzorjev v kvasovkah z uporabo sinteznobiološkega inženiringa ter s katalizo v končne produkte z brezceličnim sistemov encima CYP. Raziskovana je bila proizvodnja v ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica'' s spremembo moči promotorjev ključnih encimov in uvedbo novih zapisov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> '''Slika1: Prikaz mevalonatne poti S. cerevisiae. V modrem so napisani potrebni encimi in s puščico navzgor označeni encimi, katerih povečana aktivnost bi pomenila potencialno povečanje poizvodnje terpenoidnih prekurzorjev.'''<br /> <br /> Monoterpenoide so lahko učinkovito sintetizira z modifikacijo mevalonantne poti kvasovk&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Da bi povečali presnovni tok poti MVA, je bilo identificiranih in optimiziranih več pomembnih encimov, ki omejujejo hitrost poti. Z uvedbo dodatnih heterolognih genov in utišanjem endogenih genov je možno optimizirati proizvodnjo monoterpenoidov. Glavni cilj je bil povečati proizvodnjo geranil difosfata (GPP) v ''Saccharomyces cerevisiae'', saj deluje kot bistveni prekurzor za sintezo monoterpenoidov, kot je α-pinen. Med temi sta najbolj omejujoča ERG13 in 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A (tHMGR). Če gena za ta encima prekomerno izrazimo, se poveča tudi proizvodnja prekurzorjev monoterpenoidov.<br /> Dodatna skupna omejitev modelov je sinteza ergosterola iz GPP, iz katerega nastajajo tudi prekurzorji monoterpenoidov. Ker je sinteza ergosterola nujna za celično rast, bodo modeli, ki temeljijo na endogeni poti MVA kvasovk, vedno omejeni v svojih donosih. Zaradi tega je bila preverjena tudi učinkovitost proizvodnje tudi v peroksisomih, ker bi tako bila proizvodnja monoterpenoidov in ergosterola ločena. Peroksisomi predstavljajo zagotavljajo ugodne fiziološke pogoje za sintezo prekurzorjev monoterpenoidov&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;. Usmerjanje encimov na peroksisome je mogoče zlahka doseči z dodajanjem tripeptida C-terminalnega peroksisomskega ciljnega signala-1 (PTS1)&lt;ref&gt;[8]&lt;/ref&gt;. Skupaj se je preverjalo učinkovitost proizvodnje v citosolu in v peroksisomu bodisi v organizmih ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica''. <br /> MonChassis je sestavljena iz dveh komponent: sestava prekurzorjev terpenov v kvasovkah in in vitro kataliza spremembe prekurzerjev v monoterpenoide. V ta namen MonChassis uporablja samozasnovan bioreaktor za encimsko elektrosintezo (BREES) in modificirano citokrom P450 monooksigenazo BM3. Kot dokaz delovanja je potekla kataliza reakcije iz α-pinena v verbenon.<br /> <br /> <br /> == BREES ==<br /> <br /> Najlažji način za spopadanje s toksičnostjo produktov je uporaba brezceličnih sistemov. Tradicionalna biokataliza brez celic zahteva dodajanje kofaktorjev, kot je NADPH, ki zvišuje stroške za obsežne aplikacije. Da bi bila komponenta MonChassis in vitro uporabna v industrijskem obsegu, smo potrebo po dragih kofaktorjih izločili iz enačbe z uporabo električne energije kot poceni alternative. Zato je bil sestavljen BREES, bioreaktor za encimsko elektrosintezo. BM3, znan tudi kot citokrom P450 BM3 ali CYP102A1, je bakterijski encim citokroma P450, pridobljen iz ''Bacillus megaterium''. Je vsestranski encim z aktivnostmi monooksigenaze in hidroksilaze maščobnih kislin. Čeprav ni neposredno vpleten v proizvodnjo terpenoidov, so bili BM3 in njegove različice uporabljeni kot biokatalizatorji za modificiranje terpenoidnih spojin, zlasti v kontekstu sintetične biologije in presnovnega inženiringa. Raziskovalci so izdelali BM3 in druge encime citokroma P450 za uvedbo hidroksilnih skupin, epoksidov ali drugih funkcionalnih skupin v terpenoidne molekule, kar lahko vodi do ustvarjanja novih spojin s potencialno duporabo za proizvodnjo farmacevtskih izdelkov, arom, dišav ali drugih. Modificiran encim CYP BM3 iz ''Priestia magaterium'' ima dodan peptidni povezovalec, ki lahko imobilizira encim na elektrodo iz indijevega kositrovega oksida in omogoči neposreden prenos elektronov z elektrode na encim&lt;ref&gt;[9]&lt;/ref&gt;. Zato lahko encim uporablja elektrone neposredno iz električne energije in ne zahteva dovajanja drugih kofaktorjev. BM3 To drastično zniža operativne stroške komponente MonChassis in vitro v primerjavi s konvencionalno biokatalizo brez celic. V kombinaciji z inženirskimi sevi kvasovk MonChassis BREES omogoča hitro, prilagodljivo in obsežno proizvodnjo monoterpenoidov.<br /> <br /> <br /> == STRATEGIJA KLONIRANJA ==<br /> <br /> Po uradnih pravilih iGEM je bilo splošno kloniranje izvedeno v skladu z modularnim sistemom kloniranja RFC1000 (MoClo).<br /> Sistem MoClo se opira na restrikcijske encime tipa IIS, ki cepijo DNA tako, da nastanejo lepljivi konci. Ustvarjanje različnih koncev pri različnih fragmentih omogoča učinkovito sestavljanje več fragmentov DNA v eni preprosti reakciji ligacije. Primerna zasnova koncev omogoča, da se fragmenti sestavljajo samo v vnaprej določenem vrstnem redu. Vsi geni so bili pomnoženi z začetno verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo specifičnih začetnih oligonukleotidov z ustreznimi pritrjenimi konci.<br /> Končni zapis je bil sestavljen z metodo Golden Gate v vektor pSB1C00. V vektor so dovajali zapis transkripcijskih enot, ki so ga sestavljali promotorj, kodirno zaporedje in terminator. Z uporabo različnih promotorjev je bila mogoča sprememba ravni izražanja genov. Uspešno integracijo so preverili s selekcijo transformiranih kolonij, saj so celice konstitutivno izražale rdeči fluorescenčni protein (mRFP1).<br /> <br /> Za transformacijo kvasovk sta bili uporabljeni metodi Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-assotiated protein 9 (CRISPR-Cas9) in uporaba ekstrakromosomskih shuttle vektorjev. Vsak vektor vsebuje enega od štirih različnih yelekcijskih markerjev (HIS3, TRP1, LEU2 ali URA3) za genomsko integracijo.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Saccharomyces cerevisiae' ===<br /> <br /> Da bi ustvarili organizem, ki proizvaja monoterpenoid α-pinen, smo spremenili mevalonatno pot modelnega organizma ''Saccharomyces cerevisiae''. Z metodo Golden Gate Assembly so ustavili heterologne gene, kot je PptAPS ter povečali izražanje endogenih genov, kot sta ScERG13 ali SctHMGR.<br /> Genske spremembe so temlejile na sistemu CRISPR-Cas9. Oblikovana je bila pot do α-pinena (prekurzorja monoterpenoidov). Z namenom povečanja koncentracije mevalonata je bil utišan ScROX1 in ScERG13 ter SctHMGR uravnavana z močnim promotorjem. Izločitev ScROX1 je bila ugodna za povečanje koncentracije mevalonata, saj zavira encime v MVA&lt;ref&gt;[10]&lt;/ref&gt;. Nadalje smo uvedli heterologne gene GgmFPS144 iz Gallus gallus in AgtGPPS2 iz Abies grandis, da bi povečali koncentracijo geranil difosfata (GPP), prekurzorske molekule vseh monoterpenoidov. Izločitev ScERG20 in vstavljanje GgmFPS144 sta bila potrebna za zaviranje vitalne reakcije GPP v farnezil difosfat (FPP), vendar ne popolnoma ovirati&lt;ref&gt;[11]&lt;/ref&gt;. Uvedba heterologne α-pinen sintaze (PptAPS) iz ''Pinus ponderosa'' je povečala proizvodnjo α-pinena v citosolu ''S. cerevisiae''.<br /> Genomske tarče znotraj ScROX1, ScERG20 in ScpERG20 so bile predvidene s spletnim orodjem CRISPOR. Namesto da bi naše konstrukte vstavili v genomsko DNA, smo konstrukte klonirali v vektorje shuttle z različnimi avksotrofijami.<br /> Analiza z GC-MS je potrdila prisotnost α-pinena v lizatu.<br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v peroksisomih ''Saccharomyces cerevisiae'' ===<br /> <br /> Poleg citosola je peroksisom postal obetavna tarča za presnovni inženiring, saj naj bi njegove fiziološke lastnosti, kot je razpoložljivost substrata, znatno izboljšale sintezo produkta&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;.<br /> Ker se metabolizem mevalonata ne pojavlja naravno v peroksisomih&lt;ref&gt;[12]&lt;/ref&gt;, je bilo treba v vsak sev kvasovk pod nadzorom konstitutivnega promotorja pADH vključiti potrebne gene ScERG13, SctHMGR, ScERG12, ScERG8 in ScERG19, spojene s PTS1, za enoten izražanje genov. V različnih primerih so v zapis vključili sintazo SltNPPS1 iz ''Solanum lycopersicum'', kar omogoča proizvodnjo monoterpenoidnega prekurzorja neril difosfata (NPP), ali heterologna gena GgmFPS144 in AgtGPPS2 iz ''Gallus gallus'' oziroma ''Abies grandis'', kar omogoča proizvodnjo NPP, strukturnega izomera geranil difosfata (GPP). V obeh primerih je bil dodan še zapis za PptAPS, ki katalizira reakcijo NPP ali GPP na α-pinen. Povečanje izražanja ScERG13 in SctHMGR je poteklo z uporabo promotorja ScpTEF.<br /> <br /> Za primerjavo brezcelične proizvodnje verbenona v in vitro poskusih so pripravili tudi sev kvasovk, ki vsebuje citokrom P450 monooksigenazo (CYP) limonen-3-hidroksilazo (L3H) in je zmožen katalize α-pinen<br /> <br /> <br /> Končna ocena spremenjenih sevov kvasovk je bila izvedena s kvantifikacijo z uporabo GC-MS analize, ki je potrdila prisotnost α-pinena v obeh variantah kvasovk. <br /> <br /> <br /> <br /> === Proizvodnja v citosolu ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> ''Yarrowia lipolytica'' je obetaven organizem za sintezo monoterpenoidov, saj vsebuje visoko koncentracijo acetil-CoA, je sposoben učinkovito kopičiti lipide in kaže visoko toleranco do monoterpenoidov. Za izražanje terpinoidnih prekurzorjev v ''Yarrowia lipolytica'' so izrazili gena SctHMGR in ScERG13 organizma Saccharomyces cerevisiae. Uvedba genov AgtGPPS2 in GgMFPS144 bi pomenili zmanjšano količino proizvedenega farnezil pirofosfata (FPP) in povečano količino geranil pirofosfata (GPP). Drugi poskus je predvideval zmanjšanje količine proizvedenega FPP. To so poskušali narediti z uvedbo SltNPPS1 za proizvodnjo neril pirofosfata (NPP). Dodan je bil še gen PptAPS za proizvodnjo α-pinena.<br /> Genomska ciljna zaporedja so bila izbrana tako, da so blizu začetnemu zaporedju gena ter z visoko učinkovitostjo, specifičnostjo in brez stranskih ciljev na podlagi spletne programske opreme CRISPOR.<br /> cPCR nikoli ni pokazal uspešne vstavitve genov, temveč so opazili le dolžine, ki bi jih pričakovali od prvotnega genomskega zaporedja. Zaradi časovnih omejitev pa poskus ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> ===<br /> Proizvodnja v peroksisomih ''Yarrowia lipolytica'' ===<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> ''Y. lipolytica'' je zaradi njegovega obsežnega metabolizma maščobnih kislin zanimiv organizem za peroksisomsko proizvodnjo monoterpenoidov. Poskus je predvideval implementacijo presnovnih poti, ki uporabljajo GPP ali NPP kot substrat za monoterpensko sintazo PptAPS v peroksisomih ''Y. lipolytica''. Geni, ki naj bi bili močno izraženi, so bili pod regulacijo promotorja YlpTEF, medtem ko so bili geni, ki so zahtevali šibkejšo ekspresijo, sestavljeni s promotorjem YlpGAP. <br /> <br /> Vsi geni poti, ki uporabljajo NPP, so bili uspešno sestavljeni, vendar zaradi pomanjkanja časa projekt ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> == LITERATURA ==<br /> <br /> [1] A. El Asbahani, K. Miladi, W. Badri, M. Sala, E. H. A. Addi, H. Casabianca, A. El Mousadik, D. Hartmann, A. Jilale, F. N. R. Renaud, et al.: Essential oils: From extraction to encapsulation. International Journal of Pharmaceutics. Elsevier B.V. April 15, 2015, pp 220–243.&lt;br /&gt;<br /> [2] Q. Gao, L. Wang, M. Zhang, Y. Wei, W. Lin: Recent Advances on Feasible Strategies for Monoterpenoid Production in Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. Frontiers Media S.A. December 1, 2020.&lt;br /&gt;<br /> [3] O. A. Carter, R. J. Peters, R. Croteau: Monoterpene biosynthesis pathway construction in Escherichia coli. Phytochemistry 2003, 64, 425–433.&lt;br /&gt;<br /> [4] M. T. Lundemo, J. M. Woodley: Guidelines for development and implementation of biocatalytic P450 processes. Applied Microbiology and Biotechnology. Springer Verlag February 28, 2015, pp 2465–2483.&lt;br /&gt;<br /> [5] C. Ignea, M. H. Raadam, M. S. Motawia, A. M. Makris, C. E. Vickers, S. C. Kampranis: Orthogonal monoterpenoid biosynthesis in yeast constructed on an isomeric substrate. Nat. Commun. 2019, 10.&lt;br /&gt;<br /> [6] J. Zhao, X. Bao, C. Li, Y. Shen, J. Hou: Improving monoterpene geraniol production through geranyl diphosphate synthesis regulation in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 4561–4571.&lt;br /&gt;<br /> [7] S. Dusséaux, W. T. Wajn, Y. Liu, C. Ignea, S. C. Kampranis: Transforming yeast peroxisomes into microfactories for the efficient production of high-value isoprenoids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020, 117, 31789–31799.&lt;br /&gt;<br /> [8] C. Brocard, A. Hartig: Peroxisome targeting signal 1: Is it really a simple tripeptide? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. Biochim Biophys Acta December 2006, pp 1565–1573.&lt;br /&gt;<br /> [9] S. Zernia, F. Ott, K. Bellmann-Sickert, R. Frank, M. Klenner, H. G. Jahnke, A. Prager, B. Abel, A. Robitzki, A. G. Beck-Sickinger: Peptide-Mediated Specific Immobilization of Catalytically Active Cytochrome P450 BM3 Variant. Bioconjug. Chem. 2016, 27, 1090–1097.&lt;br /&gt;<br /> [10] J. N. Bröker, B. Müller, N. van Deenen, D. Prüfer, C. Schulze Gronover: Upregulating the mevalonate pathway and repressing sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae enhances the production of triterpenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 6923–6934.&lt;br /&gt;<br /> [11] S. Brown, M. Clastre, V. Courdavault, S. E. O’Connor: De novo production of the plant-derived alkaloid strictosidine in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015, 112, 3205–3210.&lt;br /&gt;<br /> [12] C. Y. Zhang, N. B. Lin, X. S. Chai, Zhong-Li, D. G. Barnes: A rapid method for simultaneously determining ethanol and methanol content in wines by full evaporation headspace gas chromatography. Food Chem. 2015, 183, 169–172.&lt;br /&gt;</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MonChassis&diff=21670 2023-04-02T19:53:59Z

<p>Nika Tomsič: </p> <hr /> <div>Svet se trenutno sooča z velikimi globalnimi težavami, zato je potrebno iskanje novih, trajnostnih rešitev. Poseben razred z obetajočimi aplikacijami so monoterpenoidi. Monoterpenoidi imajo širok spekter uporabe, na primer v kozmetiki, medicini, zatiranju škodljivcev, živilski industriji in biogorivih. Toda obsežna uporaba monoterpenoidov je redka zaradi cene in časa, ki so potrebni za njihovo pripravo. Skupina iGem iz Muenstera je leta 2022 raziskovala možnost njihove sinteze v kvasovkah.<br /> <br /> <br /> == TRENUTNA PRIDELAVA ==<br /> <br /> <br /> <br /> == Ekstrakcija iz rastlin ==<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Primarni vir monoterpenoidov so rastline, kjer imajo pomembno vlogo v številnih fizioloških procesih. Rastlinska eterična olja vsebujejo več kot 80 % monoterpenoidov, vendar ima ekstrakcija eteričnih olj iz rastlin nizek izkoristek. Poleg tega je zaradi kompleksnosti eteričnih olj čiščenje posameznih monoterpenoidov stroškovno obsežno, naporno in neučinkovito. Sestava je namreč odvisna od pogojev rasti rastlin in njihovega shranjevanja &lt;ref&gt;[1]&lt;/ref&gt;.<br /> Kemijska sinteza:<br /> Kemijska sinteza je bolj zanesljiva možnost za proizvajanje monoterpenov. Priprava enostavnih molekul je možna, medtem ko se cena in potrebna energija večata z večanjem kompleksnosti molekule. Poleg tega pe je kemijska sinteza okolju neprijazna zaradi onesnažujočih topil in katalizatorjev ter je včasih odvisna od neobnovljivih virov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> <br /> == Proizvodnja v bakterijah ==<br /> <br /> <br /> Bakterije so pogosto prva izbira za proizvodnjo kemikalij in vivo, saj je taka proizvodnja hitra in poceni. Za proizvodnjo monoterpenoidov pa ima delo z bakterijami več pomanjkljivosti. Prvič, obstaja pomanjkanje prekurzorja geranil difosfata (GPP) v bakterijskem gostitelju. Za povečanje sinteze je treba celotno pot mevalonata preoblikovati v bakterije&lt;ref&gt;[3]&lt;/ref&gt;. Drugič, koraki monoterpenoidne biosinteze zahtevajo funkcionalno izražanje CYP, kar je izziv pri bakterijah&lt;ref&gt;[4]&lt;/ref&gt;. Tretjič, tudi če se vsi heterologni geni lahko funkcionalno izrazijo, proizvodnja monoterpenoidov z bakterijami morda ne bo učinkovita. Kopičenje prekurzorjev vodi do zmanjšane rasti celic, različni monoterpenoidi pa imajo toksične učinke na bakterije z motnjami v celični membrani&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> <br /> == Proizvodnja v kvasovkah ==<br /> <br /> <br /> Kvasovke predstavljajo privlačno alternativo za proizvodnjo monoterpenoidov. Kvasovke imajo pot endogenega mevalonata (MVA), ki jo lahko spremenimo za sintezo monoterpenoidov&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt; Vendar naravna pot MVA ne omogoča učinkovite sinteze monoterpenoidov, saj se GPP, predhodnik vseh monoterpenoidov, hitro pretvori v farnezil difosfat (FPP). Druga omejitev pri proizvodnji monoterpenoidov s kvasom je toksičnost proizvoda. Čeprav so kvasovke na splošno močnejše od bakterij, lahko toksični učinki monoterpenoidov omejijo možne donose&lt;ref&gt;[6]&lt;/ref&gt;. Zato smo ugotovili, da trenutno ni izvedljive strategije za učinkovito proizvodnjo široke palete monoterpenoidov v velikem obsegu.<br /> <br /> <br /> <br /> == MON CHASSIS ==<br /> <br /> MonChassis je prilagodljiva platforma na osnovi kvasovk za obsežno proizvodnjo monoterpenoidov. Temelji na pripravi terpenskih prekurzorjev v kvasovkah z uporabo sinteznobiološkega inženiringa ter s katalizo v končne produkte z brezceličnim sistemov encima CYP. Raziskovana je bila proizvodnja v ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica'' s spremembo moči promotorjev ključnih encimov in uvedbo novih zapisov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> '''Slika1: Prikaz mevalonatne poti S. cerevisiae. V modrem so napisani potrebni encimi in s puščico navzgor označeni encimi, katerih povečana aktivnost bi pomenila potencialno povečanje poizvodnje terpenoidnih prekurzorjev.'''<br /> <br /> Monoterpenoide so lahko učinkovito sintetizira z modifikacijo mevalonantne poti kvasovk&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Da bi povečali presnovni tok poti MVA, je bilo identificiranih in optimiziranih več pomembnih encimov, ki omejujejo hitrost poti. Z uvedbo dodatnih heterolognih genov in utišanjem endogenih genov je možno optimizirati proizvodnjo monoterpenoidov. Glavni cilj je bil povečati proizvodnjo geranil difosfata (GPP) v ''Saccharomyces cerevisiae'', saj deluje kot bistveni prekurzor za sintezo monoterpenoidov, kot je α-pinen. Med temi sta najbolj omejujoča ERG13 in 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A (tHMGR). Če gena za ta encima prekomerno izrazimo, se poveča tudi proizvodnja prekurzorjev monoterpenoidov.<br /> Dodatna skupna omejitev modelov je sinteza ergosterola iz GPP, iz katerega nastajajo tudi prekurzorji monoterpenoidov. Ker je sinteza ergosterola nujna za celično rast, bodo modeli, ki temeljijo na endogeni poti MVA kvasovk, vedno omejeni v svojih donosih. Zaradi tega je bila preverjena tudi učinkovitost proizvodnje tudi v peroksisomih, ker bi tako bila proizvodnja monoterpenoidov in ergosterola ločena. Peroksisomi predstavljajo zagotavljajo ugodne fiziološke pogoje za sintezo prekurzorjev monoterpenoidov&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;. Usmerjanje encimov na peroksisome je mogoče zlahka doseči z dodajanjem tripeptida C-terminalnega peroksisomskega ciljnega signala-1 (PTS1)&lt;ref&gt;[8]&lt;/ref&gt;. Skupaj se je preverjalo učinkovitost proizvodnje v citosolu in v peroksisomu bodisi v organizmih ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica''. <br /> MonChassis je sestavljena iz dveh komponent: sestava prekurzorjev terpenov v kvasovkah in in vitro kataliza spremembe prekurzerjev v monoterpenoide. V ta namen MonChassis uporablja samozasnovan bioreaktor za encimsko elektrosintezo (BREES) in modificirano citokrom P450 monooksigenazo BM3. Kot dokaz delovanja je potekla kataliza reakcije iz α-pinena v verbenon.<br /> <br /> <br /> == BREES ==<br /> <br /> Najlažji način za spopadanje s toksičnostjo produktov je uporaba brezceličnih sistemov. Tradicionalna biokataliza brez celic zahteva dodajanje kofaktorjev, kot je NADPH, ki zvišuje stroške za obsežne aplikacije. Da bi bila komponenta MonChassis in vitro uporabna v industrijskem obsegu, smo potrebo po dragih kofaktorjih izločili iz enačbe z uporabo električne energije kot poceni alternative. Zato je bil sestavljen BREES, bioreaktor za encimsko elektrosintezo. BM3, znan tudi kot citokrom P450 BM3 ali CYP102A1, je bakterijski encim citokroma P450, pridobljen iz ''Bacillus megaterium''. Je vsestranski encim z aktivnostmi monooksigenaze in hidroksilaze maščobnih kislin. Čeprav ni neposredno vpleten v proizvodnjo terpenoidov, so bili BM3 in njegove različice uporabljeni kot biokatalizatorji za modificiranje terpenoidnih spojin, zlasti v kontekstu sintetične biologije in presnovnega inženiringa. Raziskovalci so izdelali BM3 in druge encime citokroma P450 za uvedbo hidroksilnih skupin, epoksidov ali drugih funkcionalnih skupin v terpenoidne molekule, kar lahko vodi do ustvarjanja novih spojin s potencialno duporabo za proizvodnjo farmacevtskih izdelkov, arom, dišav ali drugih. Modificiran encim CYP BM3 iz ''Priestia magaterium'' ima dodan peptidni povezovalec, ki lahko imobilizira encim na elektrodo iz indijevega kositrovega oksida in omogoči neposreden prenos elektronov z elektrode na encim&lt;ref&gt;[9]&lt;/ref&gt;. Zato lahko encim uporablja elektrone neposredno iz električne energije in ne zahteva dovajanja drugih kofaktorjev. BM3 To drastično zniža operativne stroške komponente MonChassis in vitro v primerjavi s konvencionalno biokatalizo brez celic. V kombinaciji z inženirskimi sevi kvasovk MonChassis BREES omogoča hitro, prilagodljivo in obsežno proizvodnjo monoterpenoidov.<br /> <br /> <br /> == STRATEGIJA KLONIRANJA ==<br /> <br /> Po uradnih pravilih iGEM je bilo splošno kloniranje izvedeno v skladu z modularnim sistemom kloniranja RFC1000 (MoClo).<br /> Sistem MoClo se opira na restrikcijske encime tipa IIS, ki cepijo DNA tako, da nastanejo lepljivi konci. Ustvarjanje različnih koncev pri različnih fragmentih omogoča učinkovito sestavljanje več fragmentov DNA v eni preprosti reakciji ligacije. Primerna zasnova koncev omogoča, da se fragmenti sestavljajo samo v vnaprej določenem vrstnem redu. Vsi geni so bili pomnoženi z začetno verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo specifičnih začetnih oligonukleotidov z ustreznimi pritrjenimi konci.<br /> Končni zapis je bil sestavljen z metodo Golden Gate v vektor pSB1C00. V vektor so dovajali zapis transkripcijskih enot, ki so ga sestavljali promotorj, kodirno zaporedje in terminator. Z uporabo različnih promotorjev je bila mogoča sprememba ravni izražanja genov. Uspešno integracijo so preverili s selekcijo transformiranih kolonij, saj so celice konstitutivno izražale rdeči fluorescenčni protein (mRFP1).<br /> <br /> Za transformacijo kvasovk sta bili uporabljeni metodi Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-assotiated protein 9 (CRISPR-Cas9) in uporaba ekstrakromosomskih shuttle vektorjev. Vsak vektor vsebuje enega od štirih različnih yelekcijskih markerjev (HIS3, TRP1, LEU2 ali URA3) za genomsko integracijo.<br /> <br /> <br /> == CITOSOLNA PRODUKCIJA V ''SACCHAROMYCES CEREVISIAE'' ==<br /> <br /> Da bi ustvarili organizem, ki proizvaja monoterpenoid α-pinen, smo spremenili mevalonatno pot modelnega organizma ''Saccharomyces cerevisiae''. Z metodo Golden Gate Assembly so ustavili heterologne gene, kot je PptAPS ter povečali izražanje endogenih genov, kot sta ScERG13 ali SctHMGR.<br /> Genske spremembe so temlejile na sistemu CRISPR-Cas9. Oblikovana je bila pot do α-pinena (prekurzorja monoterpenoidov). Z namenom povečanja koncentracije mevalonata je bil utišan ScROX1 in ScERG13 ter SctHMGR uravnavana z močnim promotorjem. Izločitev ScROX1 je bila ugodna za povečanje koncentracije mevalonata, saj zavira encime v MVA&lt;ref&gt;[10]&lt;/ref&gt;. Nadalje smo uvedli heterologne gene GgmFPS144 iz Gallus gallus in AgtGPPS2 iz Abies grandis, da bi povečali koncentracijo geranil difosfata (GPP), prekurzorske molekule vseh monoterpenoidov. Izločitev ScERG20 in vstavljanje GgmFPS144 sta bila potrebna za zaviranje vitalne reakcije GPP v farnezil difosfat (FPP), vendar ne popolnoma ovirati&lt;ref&gt;[11]&lt;/ref&gt;. Uvedba heterologne α-pinen sintaze (PptAPS) iz ''Pinus ponderosa'' je povečala proizvodnjo α-pinena v citosolu ''S. cerevisiae''.<br /> Genomske tarče znotraj ScROX1, ScERG20 in ScpERG20 so bile predvidene s spletnim orodjem CRISPOR. Namesto da bi naše konstrukte vstavili v genomsko DNA, smo konstrukte klonirali v vektorje shuttle z različnimi avksotrofijami.<br /> Analiza z GC-MS je potrdila prisotnost α-pinena v lizatu.<br /> <br /> <br /> == PEROKSISOMSKA PRODUKCIJA V ''SACCHAROMYCES CEREVISIAE'' ==<br /> <br /> Poleg citosola je peroksisom postal obetavna tarča za presnovni inženiring, saj naj bi njegove fiziološke lastnosti, kot je razpoložljivost substrata, znatno izboljšale sintezo produkta&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;.<br /> Ker se metabolizem mevalonata ne pojavlja naravno v peroksisomih&lt;ref&gt;[12]&lt;/ref&gt;, je bilo treba v vsak sev kvasovk pod nadzorom konstitutivnega promotorja pADH vključiti potrebne gene ScERG13, SctHMGR, ScERG12, ScERG8 in ScERG19, spojene s PTS1, za enoten izražanje genov. V različnih primerih so v zapis vključili sintazo SltNPPS1 iz ''Solanum lycopersicum'', kar omogoča proizvodnjo monoterpenoidnega prekurzorja neril difosfata (NPP), ali heterologna gena GgmFPS144 in AgtGPPS2 iz ''Gallus gallus'' oziroma ''Abies grandis'', kar omogoča proizvodnjo NPP, strukturnega izomera geranil difosfata (GPP). V obeh primerih je bil dodan še zapis za PptAPS, ki katalizira reakcijo NPP ali GPP na α-pinen. Povečanje izražanja ScERG13 in SctHMGR je poteklo z uporabo promotorja ScpTEF.<br /> <br /> Za primerjavo brezcelične proizvodnje verbenona v in vitro poskusih so pripravili tudi sev kvasovk, ki vsebuje citokrom P450 monooksigenazo (CYP) limonen-3-hidroksilazo (L3H) in je zmožen katalize α-pinen<br /> <br /> <br /> Končna ocena spremenjenih sevov kvasovk je bila izvedena s kvantifikacijo z uporabo GC-MS analize, ki je potrdila prisotnost α-pinena v obeh variantah kvasovk. <br /> <br /> <br /> <br /> == CITOSOLNA PRODUKCIJA V ''YARROWIA LIPOLYTICA'' ==<br /> <br /> <br /> <br /> ''Yarrowia lipolytica'' je obetaven organizem za sintezo monoterpenoidov, saj vsebuje visoko koncentracijo acetil-CoA, je sposoben učinkovito kopičiti lipide in kaže visoko toleranco do monoterpenoidov. Za izražanje terpinoidnih prekurzorjev v ''Yarrowia lipolytica'' so izrazili gena SctHMGR in ScERG13 organizma Saccharomyces cerevisiae. Uvedba genov AgtGPPS2 in GgMFPS144 bi pomenili zmanjšano količino proizvedenega farnezil pirofosfata (FPP) in povečano količino geranil pirofosfata (GPP). Drugi poskus je predvideval zmanjšanje količine proizvedenega FPP. To so poskušali narediti z uvedbo SltNPPS1 za proizvodnjo neril pirofosfata (NPP). Dodan je bil še gen PptAPS za proizvodnjo α-pinena.<br /> Genomska ciljna zaporedja so bila izbrana tako, da so blizu začetnemu zaporedju gena ter z visoko učinkovitostjo, specifičnostjo in brez stranskih ciljev na podlagi spletne programske opreme CRISPOR.<br /> cPCR nikoli ni pokazal uspešne vstavitve genov, temveč so opazili le dolžine, ki bi jih pričakovali od prvotnega genomskega zaporedja. Zaradi časovnih omejitev pa poskus ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> == == <br /> PEROKSISOMALNA PRODUKCIJA V ''YARROWIA LIPOLYTICA'' == ==<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> ''Y. lipolytica'' je zaradi njegovega obsežnega metabolizma maščobnih kislin zanimiv organizem za peroksisomsko proizvodnjo monoterpenoidov. Poskus je predvideval implementacijo presnovnih poti, ki uporabljajo GPP ali NPP kot substrat za monoterpensko sintazo PptAPS v peroksisomih ''Y. lipolytica''. Geni, ki naj bi bili močno izraženi, so bili pod regulacijo promotorja YlpTEF, medtem ko so bili geni, ki so zahtevali šibkejšo ekspresijo, sestavljeni s promotorjem YlpGAP. <br /> <br /> Vsi geni poti, ki uporabljajo NPP, so bili uspešno sestavljeni, vendar zaradi pomanjkanja časa projekt ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> == LITERATURA ==<br /> <br /> [1] A. El Asbahani, K. Miladi, W. Badri, M. Sala, E. H. A. Addi, H. Casabianca, A. El Mousadik, D. Hartmann, A. Jilale, F. N. R. Renaud, et al.: Essential oils: From extraction to encapsulation. International Journal of Pharmaceutics. Elsevier B.V. April 15, 2015, pp 220–243.&lt;br /&gt;<br /> [2] Q. Gao, L. Wang, M. Zhang, Y. Wei, W. Lin: Recent Advances on Feasible Strategies for Monoterpenoid Production in Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. Frontiers Media S.A. December 1, 2020.&lt;br /&gt;<br /> [3] O. A. Carter, R. J. Peters, R. Croteau: Monoterpene biosynthesis pathway construction in Escherichia coli. Phytochemistry 2003, 64, 425–433.&lt;br /&gt;<br /> [4] M. T. Lundemo, J. M. Woodley: Guidelines for development and implementation of biocatalytic P450 processes. Applied Microbiology and Biotechnology. Springer Verlag February 28, 2015, pp 2465–2483.&lt;br /&gt;<br /> [5] C. Ignea, M. H. Raadam, M. S. Motawia, A. M. Makris, C. E. Vickers, S. C. Kampranis: Orthogonal monoterpenoid biosynthesis in yeast constructed on an isomeric substrate. Nat. Commun. 2019, 10.&lt;br /&gt;<br /> [6] J. Zhao, X. Bao, C. Li, Y. Shen, J. Hou: Improving monoterpene geraniol production through geranyl diphosphate synthesis regulation in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 4561–4571.&lt;br /&gt;<br /> [7] S. Dusséaux, W. T. Wajn, Y. Liu, C. Ignea, S. C. Kampranis: Transforming yeast peroxisomes into microfactories for the efficient production of high-value isoprenoids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020, 117, 31789–31799.&lt;br /&gt;<br /> [8] C. Brocard, A. Hartig: Peroxisome targeting signal 1: Is it really a simple tripeptide? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. Biochim Biophys Acta December 2006, pp 1565–1573.&lt;br /&gt;<br /> [9] S. Zernia, F. Ott, K. Bellmann-Sickert, R. Frank, M. Klenner, H. G. Jahnke, A. Prager, B. Abel, A. Robitzki, A. G. Beck-Sickinger: Peptide-Mediated Specific Immobilization of Catalytically Active Cytochrome P450 BM3 Variant. Bioconjug. Chem. 2016, 27, 1090–1097.&lt;br /&gt;<br /> [10] J. N. Bröker, B. Müller, N. van Deenen, D. Prüfer, C. Schulze Gronover: Upregulating the mevalonate pathway and repressing sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae enhances the production of triterpenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 6923–6934.&lt;br /&gt;<br /> [11] S. Brown, M. Clastre, V. Courdavault, S. E. O’Connor: De novo production of the plant-derived alkaloid strictosidine in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015, 112, 3205–3210.&lt;br /&gt;<br /> [12] C. Y. Zhang, N. B. Lin, X. S. Chai, Zhong-Li, D. G. Barnes: A rapid method for simultaneously determining ethanol and methanol content in wines by full evaporation headspace gas chromatography. Food Chem. 2015, 183, 169–172.&lt;br /&gt;</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MonChassis&diff=21669 2023-04-02T19:53:12Z

<p>Nika Tomsič: /* == CITOSOLNA PRODUKCIJA V YARROWIA LIPOLYTICA == */</p> <hr /> <div>Svet se trenutno sooča z velikimi globalnimi težavami, zato je potrebno iskanje novih, trajnostnih rešitev. Poseben razred z obetajočimi aplikacijami so monoterpenoidi. Monoterpenoidi imajo širok spekter uporabe, na primer v kozmetiki, medicini, zatiranju škodljivcev, živilski industriji in biogorivih. Toda obsežna uporaba monoterpenoidov je redka zaradi cene in časa, ki so potrebni za njihovo pripravo. Skupina iGem iz Muenstera je leta 2022 raziskovala možnost njihove sinteze v kvasovkah.<br /> <br /> <br /> == TRENUTNA PRIDELAVA ==<br /> <br /> <br /> <br /> == Ekstrakcija iz rastlin ==<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Primarni vir monoterpenoidov so rastline, kjer imajo pomembno vlogo v številnih fizioloških procesih. Rastlinska eterična olja vsebujejo več kot 80 % monoterpenoidov, vendar ima ekstrakcija eteričnih olj iz rastlin nizek izkoristek. Poleg tega je zaradi kompleksnosti eteričnih olj čiščenje posameznih monoterpenoidov stroškovno obsežno, naporno in neučinkovito. Sestava je namreč odvisna od pogojev rasti rastlin in njihovega shranjevanja &lt;ref&gt;[1]&lt;/ref&gt;.<br /> Kemijska sinteza:<br /> Kemijska sinteza je bolj zanesljiva možnost za proizvajanje monoterpenov. Priprava enostavnih molekul je možna, medtem ko se cena in potrebna energija večata z večanjem kompleksnosti molekule. Poleg tega pe je kemijska sinteza okolju neprijazna zaradi onesnažujočih topil in katalizatorjev ter je včasih odvisna od neobnovljivih virov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> <br /> == Proizvodnja v bakterijah ==<br /> <br /> <br /> Bakterije so pogosto prva izbira za proizvodnjo kemikalij in vivo, saj je taka proizvodnja hitra in poceni. Za proizvodnjo monoterpenoidov pa ima delo z bakterijami več pomanjkljivosti. Prvič, obstaja pomanjkanje prekurzorja geranil difosfata (GPP) v bakterijskem gostitelju. Za povečanje sinteze je treba celotno pot mevalonata preoblikovati v bakterije&lt;ref&gt;[3]&lt;/ref&gt;. Drugič, koraki monoterpenoidne biosinteze zahtevajo funkcionalno izražanje CYP, kar je izziv pri bakterijah&lt;ref&gt;[4]&lt;/ref&gt;. Tretjič, tudi če se vsi heterologni geni lahko funkcionalno izrazijo, proizvodnja monoterpenoidov z bakterijami morda ne bo učinkovita. Kopičenje prekurzorjev vodi do zmanjšane rasti celic, različni monoterpenoidi pa imajo toksične učinke na bakterije z motnjami v celični membrani&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> <br /> == Proizvodnja v kvasovkah ==<br /> <br /> <br /> Kvasovke predstavljajo privlačno alternativo za proizvodnjo monoterpenoidov. Kvasovke imajo pot endogenega mevalonata (MVA), ki jo lahko spremenimo za sintezo monoterpenoidov&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt; Vendar naravna pot MVA ne omogoča učinkovite sinteze monoterpenoidov, saj se GPP, predhodnik vseh monoterpenoidov, hitro pretvori v farnezil difosfat (FPP). Druga omejitev pri proizvodnji monoterpenoidov s kvasom je toksičnost proizvoda. Čeprav so kvasovke na splošno močnejše od bakterij, lahko toksični učinki monoterpenoidov omejijo možne donose&lt;ref&gt;[6]&lt;/ref&gt;. Zato smo ugotovili, da trenutno ni izvedljive strategije za učinkovito proizvodnjo široke palete monoterpenoidov v velikem obsegu.<br /> <br /> <br /> <br /> == MON CHASSIS ==<br /> <br /> MonChassis je prilagodljiva platforma na osnovi kvasovk za obsežno proizvodnjo monoterpenoidov. Temelji na pripravi terpenskih prekurzorjev v kvasovkah z uporabo sinteznobiološkega inženiringa ter s katalizo v končne produkte z brezceličnim sistemov encima CYP. Raziskovana je bila proizvodnja v ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica'' s spremembo moči promotorjev ključnih encimov in uvedbo novih zapisov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> '''Slika1: Prikaz mevalonatne poti S. cerevisiae. V modrem so napisani potrebni encimi in s puščico navzgor označeni encimi, katerih povečana aktivnost bi pomenila potencialno povečanje poizvodnje terpenoidnih prekurzorjev.'''<br /> <br /> Monoterpenoide so lahko učinkovito sintetizira z modifikacijo mevalonantne poti kvasovk&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Da bi povečali presnovni tok poti MVA, je bilo identificiranih in optimiziranih več pomembnih encimov, ki omejujejo hitrost poti. Z uvedbo dodatnih heterolognih genov in utišanjem endogenih genov je možno optimizirati proizvodnjo monoterpenoidov. Glavni cilj je bil povečati proizvodnjo geranil difosfata (GPP) v ''Saccharomyces cerevisiae'', saj deluje kot bistveni prekurzor za sintezo monoterpenoidov, kot je α-pinen. Med temi sta najbolj omejujoča ERG13 in 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A (tHMGR). Če gena za ta encima prekomerno izrazimo, se poveča tudi proizvodnja prekurzorjev monoterpenoidov.<br /> Dodatna skupna omejitev modelov je sinteza ergosterola iz GPP, iz katerega nastajajo tudi prekurzorji monoterpenoidov. Ker je sinteza ergosterola nujna za celično rast, bodo modeli, ki temeljijo na endogeni poti MVA kvasovk, vedno omejeni v svojih donosih. Zaradi tega je bila preverjena tudi učinkovitost proizvodnje tudi v peroksisomih, ker bi tako bila proizvodnja monoterpenoidov in ergosterola ločena. Peroksisomi predstavljajo zagotavljajo ugodne fiziološke pogoje za sintezo prekurzorjev monoterpenoidov&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;. Usmerjanje encimov na peroksisome je mogoče zlahka doseči z dodajanjem tripeptida C-terminalnega peroksisomskega ciljnega signala-1 (PTS1)&lt;ref&gt;[8]&lt;/ref&gt;. Skupaj se je preverjalo učinkovitost proizvodnje v citosolu in v peroksisomu bodisi v organizmih ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica''. <br /> MonChassis je sestavljena iz dveh komponent: sestava prekurzorjev terpenov v kvasovkah in in vitro kataliza spremembe prekurzerjev v monoterpenoide. V ta namen MonChassis uporablja samozasnovan bioreaktor za encimsko elektrosintezo (BREES) in modificirano citokrom P450 monooksigenazo BM3. Kot dokaz delovanja je potekla kataliza reakcije iz α-pinena v verbenon.<br /> <br /> <br /> == BREES ==<br /> <br /> Najlažji način za spopadanje s toksičnostjo produktov je uporaba brezceličnih sistemov. Tradicionalna biokataliza brez celic zahteva dodajanje kofaktorjev, kot je NADPH, ki zvišuje stroške za obsežne aplikacije. Da bi bila komponenta MonChassis in vitro uporabna v industrijskem obsegu, smo potrebo po dragih kofaktorjih izločili iz enačbe z uporabo električne energije kot poceni alternative. Zato je bil sestavljen BREES, bioreaktor za encimsko elektrosintezo. BM3, znan tudi kot citokrom P450 BM3 ali CYP102A1, je bakterijski encim citokroma P450, pridobljen iz ''Bacillus megaterium''. Je vsestranski encim z aktivnostmi monooksigenaze in hidroksilaze maščobnih kislin. Čeprav ni neposredno vpleten v proizvodnjo terpenoidov, so bili BM3 in njegove različice uporabljeni kot biokatalizatorji za modificiranje terpenoidnih spojin, zlasti v kontekstu sintetične biologije in presnovnega inženiringa. Raziskovalci so izdelali BM3 in druge encime citokroma P450 za uvedbo hidroksilnih skupin, epoksidov ali drugih funkcionalnih skupin v terpenoidne molekule, kar lahko vodi do ustvarjanja novih spojin s potencialno duporabo za proizvodnjo farmacevtskih izdelkov, arom, dišav ali drugih. Modificiran encim CYP BM3 iz ''Priestia magaterium'' ima dodan peptidni povezovalec, ki lahko imobilizira encim na elektrodo iz indijevega kositrovega oksida in omogoči neposreden prenos elektronov z elektrode na encim&lt;ref&gt;[9]&lt;/ref&gt;. Zato lahko encim uporablja elektrone neposredno iz električne energije in ne zahteva dovajanja drugih kofaktorjev. BM3 To drastično zniža operativne stroške komponente MonChassis in vitro v primerjavi s konvencionalno biokatalizo brez celic. V kombinaciji z inženirskimi sevi kvasovk MonChassis BREES omogoča hitro, prilagodljivo in obsežno proizvodnjo monoterpenoidov.<br /> <br /> <br /> == STRATEGIJA KLONIRANJA ==<br /> <br /> Po uradnih pravilih iGEM je bilo splošno kloniranje izvedeno v skladu z modularnim sistemom kloniranja RFC1000 (MoClo).<br /> Sistem MoClo se opira na restrikcijske encime tipa IIS, ki cepijo DNA tako, da nastanejo lepljivi konci. Ustvarjanje različnih koncev pri različnih fragmentih omogoča učinkovito sestavljanje več fragmentov DNA v eni preprosti reakciji ligacije. Primerna zasnova koncev omogoča, da se fragmenti sestavljajo samo v vnaprej določenem vrstnem redu. Vsi geni so bili pomnoženi z začetno verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo specifičnih začetnih oligonukleotidov z ustreznimi pritrjenimi konci.<br /> Končni zapis je bil sestavljen z metodo Golden Gate v vektor pSB1C00. V vektor so dovajali zapis transkripcijskih enot, ki so ga sestavljali promotorj, kodirno zaporedje in terminator. Z uporabo različnih promotorjev je bila mogoča sprememba ravni izražanja genov. Uspešno integracijo so preverili s selekcijo transformiranih kolonij, saj so celice konstitutivno izražale rdeči fluorescenčni protein (mRFP1).<br /> <br /> Za transformacijo kvasovk sta bili uporabljeni metodi Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-assotiated protein 9 (CRISPR-Cas9) in uporaba ekstrakromosomskih shuttle vektorjev. Vsak vektor vsebuje enega od štirih različnih yelekcijskih markerjev (HIS3, TRP1, LEU2 ali URA3) za genomsko integracijo.<br /> <br /> <br /> == CITOSOLNA PRODUKCIJA V ''SACCHAROMYCES CEREVISIAE'' ==<br /> <br /> Da bi ustvarili organizem, ki proizvaja monoterpenoid α-pinen, smo spremenili mevalonatno pot modelnega organizma ''Saccharomyces cerevisiae''. Z metodo Golden Gate Assembly so ustavili heterologne gene, kot je PptAPS ter povečali izražanje endogenih genov, kot sta ScERG13 ali SctHMGR.<br /> Genske spremembe so temlejile na sistemu CRISPR-Cas9. Oblikovana je bila pot do α-pinena (prekurzorja monoterpenoidov). Z namenom povečanja koncentracije mevalonata je bil utišan ScROX1 in ScERG13 ter SctHMGR uravnavana z močnim promotorjem. Izločitev ScROX1 je bila ugodna za povečanje koncentracije mevalonata, saj zavira encime v MVA&lt;ref&gt;[10]&lt;/ref&gt;. Nadalje smo uvedli heterologne gene GgmFPS144 iz Gallus gallus in AgtGPPS2 iz Abies grandis, da bi povečali koncentracijo geranil difosfata (GPP), prekurzorske molekule vseh monoterpenoidov. Izločitev ScERG20 in vstavljanje GgmFPS144 sta bila potrebna za zaviranje vitalne reakcije GPP v farnezil difosfat (FPP), vendar ne popolnoma ovirati&lt;ref&gt;[11]&lt;/ref&gt;. Uvedba heterologne α-pinen sintaze (PptAPS) iz ''Pinus ponderosa'' je povečala proizvodnjo α-pinena v citosolu ''S. cerevisiae''.<br /> Genomske tarče znotraj ScROX1, ScERG20 in ScpERG20 so bile predvidene s spletnim orodjem CRISPOR. Namesto da bi naše konstrukte vstavili v genomsko DNA, smo konstrukte klonirali v vektorje shuttle z različnimi avksotrofijami.<br /> Analiza z GC-MS je potrdila prisotnost α-pinena v lizatu.<br /> <br /> <br /> == PEROKSISOMSKA PRODUKCIJA V ''SACCHAROMYCES CEREVISIAE'' ==<br /> <br /> Poleg citosola je peroksisom postal obetavna tarča za presnovni inženiring, saj naj bi njegove fiziološke lastnosti, kot je razpoložljivost substrata, znatno izboljšale sintezo produkta&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;.<br /> Ker se metabolizem mevalonata ne pojavlja naravno v peroksisomih&lt;ref&gt;[12]&lt;/ref&gt;, je bilo treba v vsak sev kvasovk pod nadzorom konstitutivnega promotorja pADH vključiti potrebne gene ScERG13, SctHMGR, ScERG12, ScERG8 in ScERG19, spojene s PTS1, za enoten izražanje genov. V različnih primerih so v zapis vključili sintazo SltNPPS1 iz ''Solanum lycopersicum'', kar omogoča proizvodnjo monoterpenoidnega prekurzorja neril difosfata (NPP), ali heterologna gena GgmFPS144 in AgtGPPS2 iz ''Gallus gallus'' oziroma ''Abies grandis'', kar omogoča proizvodnjo NPP, strukturnega izomera geranil difosfata (GPP). V obeh primerih je bil dodan še zapis za PptAPS, ki katalizira reakcijo NPP ali GPP na α-pinen. Povečanje izražanja ScERG13 in SctHMGR je poteklo z uporabo promotorja ScpTEF.<br /> <br /> Za primerjavo brezcelične proizvodnje verbenona v in vitro poskusih so pripravili tudi sev kvasovk, ki vsebuje citokrom P450 monooksigenazo (CYP) limonen-3-hidroksilazo (L3H) in je zmožen katalize α-pinen<br /> <br /> <br /> Končna ocena spremenjenih sevov kvasovk je bila izvedena s kvantifikacijo z uporabo GC-MS analize, ki je potrdila prisotnost α-pinena v obeh variantah kvasovk. <br /> <br /> <br /> <br /> == CITOSOLNA PRODUKCIJA V ''YARROWIA LIPOLYTICA'' ==<br /> <br /> <br /> <br /> ''Yarrowia lipolytica'' je obetaven organizem za sintezo monoterpenoidov, saj vsebuje visoko koncentracijo acetil-CoA, je sposoben učinkovito kopičiti lipide in kaže visoko toleranco do monoterpenoidov. Za izražanje terpinoidnih prekurzorjev v ''Yarrowia lipolytica'' so izrazili gena SctHMGR in ScERG13 organizma Saccharomyces cerevisiae. Uvedba genov AgtGPPS2 in GgMFPS144 bi pomenili zmanjšano količino proizvedenega farnezil pirofosfata (FPP) in povečano količino geranil pirofosfata (GPP). Drugi poskus je predvideval zmanjšanje količine proizvedenega FPP. To so poskušali narediti z uvedbo SltNPPS1 za proizvodnjo neril pirofosfata (NPP). Dodan je bil še gen PptAPS za proizvodnjo α-pinena.<br /> Genomska ciljna zaporedja so bila izbrana tako, da so blizu začetnemu zaporedju gena ter z visoko učinkovitostjo, specifičnostjo in brez stranskih ciljev na podlagi spletne programske opreme CRISPOR.<br /> cPCR nikoli ni pokazal uspešne vstavitve genov, temveč so opazili le dolžine, ki bi jih pričakovali od prvotnega genomskega zaporedja. Zaradi časovnih omejitev pa poskus ni nadaljeval.<br /> <br /> == <br /> PEROKSISOMALNA PRODUKCIJA V ''YARROWIA LIPOLYTICA'' ==<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> ''Y. lipolytica'' je zaradi njegovega obsežnega metabolizma maščobnih kislin zanimiv organizem za peroksisomsko proizvodnjo monoterpenoidov. Poskus je predvideval implementacijo presnovnih poti, ki uporabljajo GPP ali NPP kot substrat za monoterpensko sintazo PptAPS v peroksisomih ''Y. lipolytica''. Geni, ki naj bi bili močno izraženi, so bili pod regulacijo promotorja YlpTEF, medtem ko so bili geni, ki so zahtevali šibkejšo ekspresijo, sestavljeni s promotorjem YlpGAP. <br /> <br /> Vsi geni poti, ki uporabljajo NPP, so bili uspešno sestavljeni, vendar zaradi pomanjkanja časa projekt ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> == LITERATURA ==<br /> <br /> [1] A. El Asbahani, K. Miladi, W. Badri, M. Sala, E. H. A. Addi, H. Casabianca, A. El Mousadik, D. Hartmann, A. Jilale, F. N. R. Renaud, et al.: Essential oils: From extraction to encapsulation. International Journal of Pharmaceutics. Elsevier B.V. April 15, 2015, pp 220–243.&lt;br /&gt;<br /> [2] Q. Gao, L. Wang, M. Zhang, Y. Wei, W. Lin: Recent Advances on Feasible Strategies for Monoterpenoid Production in Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. Frontiers Media S.A. December 1, 2020.&lt;br /&gt;<br /> [3] O. A. Carter, R. J. Peters, R. Croteau: Monoterpene biosynthesis pathway construction in Escherichia coli. Phytochemistry 2003, 64, 425–433.&lt;br /&gt;<br /> [4] M. T. Lundemo, J. M. Woodley: Guidelines for development and implementation of biocatalytic P450 processes. Applied Microbiology and Biotechnology. Springer Verlag February 28, 2015, pp 2465–2483.&lt;br /&gt;<br /> [5] C. Ignea, M. H. Raadam, M. S. Motawia, A. M. Makris, C. E. Vickers, S. C. Kampranis: Orthogonal monoterpenoid biosynthesis in yeast constructed on an isomeric substrate. Nat. Commun. 2019, 10.&lt;br /&gt;<br /> [6] J. Zhao, X. Bao, C. Li, Y. Shen, J. Hou: Improving monoterpene geraniol production through geranyl diphosphate synthesis regulation in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 4561–4571.&lt;br /&gt;<br /> [7] S. Dusséaux, W. T. Wajn, Y. Liu, C. Ignea, S. C. Kampranis: Transforming yeast peroxisomes into microfactories for the efficient production of high-value isoprenoids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020, 117, 31789–31799.&lt;br /&gt;<br /> [8] C. Brocard, A. Hartig: Peroxisome targeting signal 1: Is it really a simple tripeptide? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. Biochim Biophys Acta December 2006, pp 1565–1573.&lt;br /&gt;<br /> [9] S. Zernia, F. Ott, K. Bellmann-Sickert, R. Frank, M. Klenner, H. G. Jahnke, A. Prager, B. Abel, A. Robitzki, A. G. Beck-Sickinger: Peptide-Mediated Specific Immobilization of Catalytically Active Cytochrome P450 BM3 Variant. Bioconjug. Chem. 2016, 27, 1090–1097.&lt;br /&gt;<br /> [10] J. N. Bröker, B. Müller, N. van Deenen, D. Prüfer, C. Schulze Gronover: Upregulating the mevalonate pathway and repressing sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae enhances the production of triterpenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 6923–6934.&lt;br /&gt;<br /> [11] S. Brown, M. Clastre, V. Courdavault, S. E. O’Connor: De novo production of the plant-derived alkaloid strictosidine in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015, 112, 3205–3210.&lt;br /&gt;<br /> [12] C. Y. Zhang, N. B. Lin, X. S. Chai, Zhong-Li, D. G. Barnes: A rapid method for simultaneously determining ethanol and methanol content in wines by full evaporation headspace gas chromatography. Food Chem. 2015, 183, 169–172.&lt;br /&gt;</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MonChassis&diff=21668 2023-04-02T19:52:33Z

<p>Nika Tomsič: /* CITOSOLNA PRODUKCIJA V YARROWIA LIPOLYTICA */</p> <hr /> <div>Svet se trenutno sooča z velikimi globalnimi težavami, zato je potrebno iskanje novih, trajnostnih rešitev. Poseben razred z obetajočimi aplikacijami so monoterpenoidi. Monoterpenoidi imajo širok spekter uporabe, na primer v kozmetiki, medicini, zatiranju škodljivcev, živilski industriji in biogorivih. Toda obsežna uporaba monoterpenoidov je redka zaradi cene in časa, ki so potrebni za njihovo pripravo. Skupina iGem iz Muenstera je leta 2022 raziskovala možnost njihove sinteze v kvasovkah.<br /> <br /> <br /> == TRENUTNA PRIDELAVA ==<br /> <br /> <br /> <br /> == Ekstrakcija iz rastlin ==<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Primarni vir monoterpenoidov so rastline, kjer imajo pomembno vlogo v številnih fizioloških procesih. Rastlinska eterična olja vsebujejo več kot 80 % monoterpenoidov, vendar ima ekstrakcija eteričnih olj iz rastlin nizek izkoristek. Poleg tega je zaradi kompleksnosti eteričnih olj čiščenje posameznih monoterpenoidov stroškovno obsežno, naporno in neučinkovito. Sestava je namreč odvisna od pogojev rasti rastlin in njihovega shranjevanja &lt;ref&gt;[1]&lt;/ref&gt;.<br /> Kemijska sinteza:<br /> Kemijska sinteza je bolj zanesljiva možnost za proizvajanje monoterpenov. Priprava enostavnih molekul je možna, medtem ko se cena in potrebna energija večata z večanjem kompleksnosti molekule. Poleg tega pe je kemijska sinteza okolju neprijazna zaradi onesnažujočih topil in katalizatorjev ter je včasih odvisna od neobnovljivih virov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> <br /> == Proizvodnja v bakterijah ==<br /> <br /> <br /> Bakterije so pogosto prva izbira za proizvodnjo kemikalij in vivo, saj je taka proizvodnja hitra in poceni. Za proizvodnjo monoterpenoidov pa ima delo z bakterijami več pomanjkljivosti. Prvič, obstaja pomanjkanje prekurzorja geranil difosfata (GPP) v bakterijskem gostitelju. Za povečanje sinteze je treba celotno pot mevalonata preoblikovati v bakterije&lt;ref&gt;[3]&lt;/ref&gt;. Drugič, koraki monoterpenoidne biosinteze zahtevajo funkcionalno izražanje CYP, kar je izziv pri bakterijah&lt;ref&gt;[4]&lt;/ref&gt;. Tretjič, tudi če se vsi heterologni geni lahko funkcionalno izrazijo, proizvodnja monoterpenoidov z bakterijami morda ne bo učinkovita. Kopičenje prekurzorjev vodi do zmanjšane rasti celic, različni monoterpenoidi pa imajo toksične učinke na bakterije z motnjami v celični membrani&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> <br /> == Proizvodnja v kvasovkah ==<br /> <br /> <br /> Kvasovke predstavljajo privlačno alternativo za proizvodnjo monoterpenoidov. Kvasovke imajo pot endogenega mevalonata (MVA), ki jo lahko spremenimo za sintezo monoterpenoidov&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt; Vendar naravna pot MVA ne omogoča učinkovite sinteze monoterpenoidov, saj se GPP, predhodnik vseh monoterpenoidov, hitro pretvori v farnezil difosfat (FPP). Druga omejitev pri proizvodnji monoterpenoidov s kvasom je toksičnost proizvoda. Čeprav so kvasovke na splošno močnejše od bakterij, lahko toksični učinki monoterpenoidov omejijo možne donose&lt;ref&gt;[6]&lt;/ref&gt;. Zato smo ugotovili, da trenutno ni izvedljive strategije za učinkovito proizvodnjo široke palete monoterpenoidov v velikem obsegu.<br /> <br /> <br /> <br /> == MON CHASSIS ==<br /> <br /> MonChassis je prilagodljiva platforma na osnovi kvasovk za obsežno proizvodnjo monoterpenoidov. Temelji na pripravi terpenskih prekurzorjev v kvasovkah z uporabo sinteznobiološkega inženiringa ter s katalizo v končne produkte z brezceličnim sistemov encima CYP. Raziskovana je bila proizvodnja v ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica'' s spremembo moči promotorjev ključnih encimov in uvedbo novih zapisov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> '''Slika1: Prikaz mevalonatne poti S. cerevisiae. V modrem so napisani potrebni encimi in s puščico navzgor označeni encimi, katerih povečana aktivnost bi pomenila potencialno povečanje poizvodnje terpenoidnih prekurzorjev.'''<br /> <br /> Monoterpenoide so lahko učinkovito sintetizira z modifikacijo mevalonantne poti kvasovk&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Da bi povečali presnovni tok poti MVA, je bilo identificiranih in optimiziranih več pomembnih encimov, ki omejujejo hitrost poti. Z uvedbo dodatnih heterolognih genov in utišanjem endogenih genov je možno optimizirati proizvodnjo monoterpenoidov. Glavni cilj je bil povečati proizvodnjo geranil difosfata (GPP) v ''Saccharomyces cerevisiae'', saj deluje kot bistveni prekurzor za sintezo monoterpenoidov, kot je α-pinen. Med temi sta najbolj omejujoča ERG13 in 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A (tHMGR). Če gena za ta encima prekomerno izrazimo, se poveča tudi proizvodnja prekurzorjev monoterpenoidov.<br /> Dodatna skupna omejitev modelov je sinteza ergosterola iz GPP, iz katerega nastajajo tudi prekurzorji monoterpenoidov. Ker je sinteza ergosterola nujna za celično rast, bodo modeli, ki temeljijo na endogeni poti MVA kvasovk, vedno omejeni v svojih donosih. Zaradi tega je bila preverjena tudi učinkovitost proizvodnje tudi v peroksisomih, ker bi tako bila proizvodnja monoterpenoidov in ergosterola ločena. Peroksisomi predstavljajo zagotavljajo ugodne fiziološke pogoje za sintezo prekurzorjev monoterpenoidov&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;. Usmerjanje encimov na peroksisome je mogoče zlahka doseči z dodajanjem tripeptida C-terminalnega peroksisomskega ciljnega signala-1 (PTS1)&lt;ref&gt;[8]&lt;/ref&gt;. Skupaj se je preverjalo učinkovitost proizvodnje v citosolu in v peroksisomu bodisi v organizmih ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica''. <br /> MonChassis je sestavljena iz dveh komponent: sestava prekurzorjev terpenov v kvasovkah in in vitro kataliza spremembe prekurzerjev v monoterpenoide. V ta namen MonChassis uporablja samozasnovan bioreaktor za encimsko elektrosintezo (BREES) in modificirano citokrom P450 monooksigenazo BM3. Kot dokaz delovanja je potekla kataliza reakcije iz α-pinena v verbenon.<br /> <br /> <br /> == BREES ==<br /> <br /> Najlažji način za spopadanje s toksičnostjo produktov je uporaba brezceličnih sistemov. Tradicionalna biokataliza brez celic zahteva dodajanje kofaktorjev, kot je NADPH, ki zvišuje stroške za obsežne aplikacije. Da bi bila komponenta MonChassis in vitro uporabna v industrijskem obsegu, smo potrebo po dragih kofaktorjih izločili iz enačbe z uporabo električne energije kot poceni alternative. Zato je bil sestavljen BREES, bioreaktor za encimsko elektrosintezo. BM3, znan tudi kot citokrom P450 BM3 ali CYP102A1, je bakterijski encim citokroma P450, pridobljen iz ''Bacillus megaterium''. Je vsestranski encim z aktivnostmi monooksigenaze in hidroksilaze maščobnih kislin. Čeprav ni neposredno vpleten v proizvodnjo terpenoidov, so bili BM3 in njegove različice uporabljeni kot biokatalizatorji za modificiranje terpenoidnih spojin, zlasti v kontekstu sintetične biologije in presnovnega inženiringa. Raziskovalci so izdelali BM3 in druge encime citokroma P450 za uvedbo hidroksilnih skupin, epoksidov ali drugih funkcionalnih skupin v terpenoidne molekule, kar lahko vodi do ustvarjanja novih spojin s potencialno duporabo za proizvodnjo farmacevtskih izdelkov, arom, dišav ali drugih. Modificiran encim CYP BM3 iz ''Priestia magaterium'' ima dodan peptidni povezovalec, ki lahko imobilizira encim na elektrodo iz indijevega kositrovega oksida in omogoči neposreden prenos elektronov z elektrode na encim&lt;ref&gt;[9]&lt;/ref&gt;. Zato lahko encim uporablja elektrone neposredno iz električne energije in ne zahteva dovajanja drugih kofaktorjev. BM3 To drastično zniža operativne stroške komponente MonChassis in vitro v primerjavi s konvencionalno biokatalizo brez celic. V kombinaciji z inženirskimi sevi kvasovk MonChassis BREES omogoča hitro, prilagodljivo in obsežno proizvodnjo monoterpenoidov.<br /> <br /> <br /> == STRATEGIJA KLONIRANJA ==<br /> <br /> Po uradnih pravilih iGEM je bilo splošno kloniranje izvedeno v skladu z modularnim sistemom kloniranja RFC1000 (MoClo).<br /> Sistem MoClo se opira na restrikcijske encime tipa IIS, ki cepijo DNA tako, da nastanejo lepljivi konci. Ustvarjanje različnih koncev pri različnih fragmentih omogoča učinkovito sestavljanje več fragmentov DNA v eni preprosti reakciji ligacije. Primerna zasnova koncev omogoča, da se fragmenti sestavljajo samo v vnaprej določenem vrstnem redu. Vsi geni so bili pomnoženi z začetno verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo specifičnih začetnih oligonukleotidov z ustreznimi pritrjenimi konci.<br /> Končni zapis je bil sestavljen z metodo Golden Gate v vektor pSB1C00. V vektor so dovajali zapis transkripcijskih enot, ki so ga sestavljali promotorj, kodirno zaporedje in terminator. Z uporabo različnih promotorjev je bila mogoča sprememba ravni izražanja genov. Uspešno integracijo so preverili s selekcijo transformiranih kolonij, saj so celice konstitutivno izražale rdeči fluorescenčni protein (mRFP1).<br /> <br /> Za transformacijo kvasovk sta bili uporabljeni metodi Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-assotiated protein 9 (CRISPR-Cas9) in uporaba ekstrakromosomskih shuttle vektorjev. Vsak vektor vsebuje enega od štirih različnih yelekcijskih markerjev (HIS3, TRP1, LEU2 ali URA3) za genomsko integracijo.<br /> <br /> <br /> == CITOSOLNA PRODUKCIJA V ''SACCHAROMYCES CEREVISIAE'' ==<br /> <br /> Da bi ustvarili organizem, ki proizvaja monoterpenoid α-pinen, smo spremenili mevalonatno pot modelnega organizma ''Saccharomyces cerevisiae''. Z metodo Golden Gate Assembly so ustavili heterologne gene, kot je PptAPS ter povečali izražanje endogenih genov, kot sta ScERG13 ali SctHMGR.<br /> Genske spremembe so temlejile na sistemu CRISPR-Cas9. Oblikovana je bila pot do α-pinena (prekurzorja monoterpenoidov). Z namenom povečanja koncentracije mevalonata je bil utišan ScROX1 in ScERG13 ter SctHMGR uravnavana z močnim promotorjem. Izločitev ScROX1 je bila ugodna za povečanje koncentracije mevalonata, saj zavira encime v MVA&lt;ref&gt;[10]&lt;/ref&gt;. Nadalje smo uvedli heterologne gene GgmFPS144 iz Gallus gallus in AgtGPPS2 iz Abies grandis, da bi povečali koncentracijo geranil difosfata (GPP), prekurzorske molekule vseh monoterpenoidov. Izločitev ScERG20 in vstavljanje GgmFPS144 sta bila potrebna za zaviranje vitalne reakcije GPP v farnezil difosfat (FPP), vendar ne popolnoma ovirati&lt;ref&gt;[11]&lt;/ref&gt;. Uvedba heterologne α-pinen sintaze (PptAPS) iz ''Pinus ponderosa'' je povečala proizvodnjo α-pinena v citosolu ''S. cerevisiae''.<br /> Genomske tarče znotraj ScROX1, ScERG20 in ScpERG20 so bile predvidene s spletnim orodjem CRISPOR. Namesto da bi naše konstrukte vstavili v genomsko DNA, smo konstrukte klonirali v vektorje shuttle z različnimi avksotrofijami.<br /> Analiza z GC-MS je potrdila prisotnost α-pinena v lizatu.<br /> <br /> <br /> == PEROKSISOMSKA PRODUKCIJA V ''SACCHAROMYCES CEREVISIAE'' ==<br /> <br /> Poleg citosola je peroksisom postal obetavna tarča za presnovni inženiring, saj naj bi njegove fiziološke lastnosti, kot je razpoložljivost substrata, znatno izboljšale sintezo produkta&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;.<br /> Ker se metabolizem mevalonata ne pojavlja naravno v peroksisomih&lt;ref&gt;[12]&lt;/ref&gt;, je bilo treba v vsak sev kvasovk pod nadzorom konstitutivnega promotorja pADH vključiti potrebne gene ScERG13, SctHMGR, ScERG12, ScERG8 in ScERG19, spojene s PTS1, za enoten izražanje genov. V različnih primerih so v zapis vključili sintazo SltNPPS1 iz ''Solanum lycopersicum'', kar omogoča proizvodnjo monoterpenoidnega prekurzorja neril difosfata (NPP), ali heterologna gena GgmFPS144 in AgtGPPS2 iz ''Gallus gallus'' oziroma ''Abies grandis'', kar omogoča proizvodnjo NPP, strukturnega izomera geranil difosfata (GPP). V obeh primerih je bil dodan še zapis za PptAPS, ki katalizira reakcijo NPP ali GPP na α-pinen. Povečanje izražanja ScERG13 in SctHMGR je poteklo z uporabo promotorja ScpTEF.<br /> <br /> Za primerjavo brezcelične proizvodnje verbenona v in vitro poskusih so pripravili tudi sev kvasovk, ki vsebuje citokrom P450 monooksigenazo (CYP) limonen-3-hidroksilazo (L3H) in je zmožen katalize α-pinen<br /> <br /> <br /> Končna ocena spremenjenih sevov kvasovk je bila izvedena s kvantifikacijo z uporabo GC-MS analize, ki je potrdila prisotnost α-pinena v obeh variantah kvasovk. <br /> <br /> <br /> <br /> == == CITOSOLNA PRODUKCIJA V ''YARROWIA LIPOLYTICA'' == ==<br /> <br /> <br /> <br /> ''Yarrowia lipolytica'' je obetaven organizem za sintezo monoterpenoidov, saj vsebuje visoko koncentracijo acetil-CoA, je sposoben učinkovito kopičiti lipide in kaže visoko toleranco do monoterpenoidov. Za izražanje terpinoidnih prekurzorjev v ''Yarrowia lipolytica'' so izrazili gena SctHMGR in ScERG13 organizma Saccharomyces cerevisiae. Uvedba genov AgtGPPS2 in GgMFPS144 bi pomenili zmanjšano količino proizvedenega farnezil pirofosfata (FPP) in povečano količino geranil pirofosfata (GPP). Drugi poskus je predvideval zmanjšanje količine proizvedenega FPP. To so poskušali narediti z uvedbo SltNPPS1 za proizvodnjo neril pirofosfata (NPP). Dodan je bil še gen PptAPS za proizvodnjo α-pinena.<br /> Genomska ciljna zaporedja so bila izbrana tako, da so blizu začetnemu zaporedju gena ter z visoko učinkovitostjo, specifičnostjo in brez stranskih ciljev na podlagi spletne programske opreme CRISPOR.<br /> cPCR nikoli ni pokazal uspešne vstavitve genov, temveč so opazili le dolžine, ki bi jih pričakovali od prvotnega genomskega zaporedja. Zaradi časovnih omejitev pa poskus ni nadaljeval.<br /> <br /> == <br /> PEROKSISOMALNA PRODUKCIJA V ''YARROWIA LIPOLYTICA'' ==<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> ''Y. lipolytica'' je zaradi njegovega obsežnega metabolizma maščobnih kislin zanimiv organizem za peroksisomsko proizvodnjo monoterpenoidov. Poskus je predvideval implementacijo presnovnih poti, ki uporabljajo GPP ali NPP kot substrat za monoterpensko sintazo PptAPS v peroksisomih ''Y. lipolytica''. Geni, ki naj bi bili močno izraženi, so bili pod regulacijo promotorja YlpTEF, medtem ko so bili geni, ki so zahtevali šibkejšo ekspresijo, sestavljeni s promotorjem YlpGAP. <br /> <br /> Vsi geni poti, ki uporabljajo NPP, so bili uspešno sestavljeni, vendar zaradi pomanjkanja časa projekt ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> == LITERATURA ==<br /> <br /> [1] A. El Asbahani, K. Miladi, W. Badri, M. Sala, E. H. A. Addi, H. Casabianca, A. El Mousadik, D. Hartmann, A. Jilale, F. N. R. Renaud, et al.: Essential oils: From extraction to encapsulation. International Journal of Pharmaceutics. Elsevier B.V. April 15, 2015, pp 220–243.&lt;br /&gt;<br /> [2] Q. Gao, L. Wang, M. Zhang, Y. Wei, W. Lin: Recent Advances on Feasible Strategies for Monoterpenoid Production in Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. Frontiers Media S.A. December 1, 2020.&lt;br /&gt;<br /> [3] O. A. Carter, R. J. Peters, R. Croteau: Monoterpene biosynthesis pathway construction in Escherichia coli. Phytochemistry 2003, 64, 425–433.&lt;br /&gt;<br /> [4] M. T. Lundemo, J. M. Woodley: Guidelines for development and implementation of biocatalytic P450 processes. Applied Microbiology and Biotechnology. Springer Verlag February 28, 2015, pp 2465–2483.&lt;br /&gt;<br /> [5] C. Ignea, M. H. Raadam, M. S. Motawia, A. M. Makris, C. E. Vickers, S. C. Kampranis: Orthogonal monoterpenoid biosynthesis in yeast constructed on an isomeric substrate. Nat. Commun. 2019, 10.&lt;br /&gt;<br /> [6] J. Zhao, X. Bao, C. Li, Y. Shen, J. Hou: Improving monoterpene geraniol production through geranyl diphosphate synthesis regulation in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 4561–4571.&lt;br /&gt;<br /> [7] S. Dusséaux, W. T. Wajn, Y. Liu, C. Ignea, S. C. Kampranis: Transforming yeast peroxisomes into microfactories for the efficient production of high-value isoprenoids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020, 117, 31789–31799.&lt;br /&gt;<br /> [8] C. Brocard, A. Hartig: Peroxisome targeting signal 1: Is it really a simple tripeptide? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. Biochim Biophys Acta December 2006, pp 1565–1573.&lt;br /&gt;<br /> [9] S. Zernia, F. Ott, K. Bellmann-Sickert, R. Frank, M. Klenner, H. G. Jahnke, A. Prager, B. Abel, A. Robitzki, A. G. Beck-Sickinger: Peptide-Mediated Specific Immobilization of Catalytically Active Cytochrome P450 BM3 Variant. Bioconjug. Chem. 2016, 27, 1090–1097.&lt;br /&gt;<br /> [10] J. N. Bröker, B. Müller, N. van Deenen, D. Prüfer, C. Schulze Gronover: Upregulating the mevalonate pathway and repressing sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae enhances the production of triterpenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 6923–6934.&lt;br /&gt;<br /> [11] S. Brown, M. Clastre, V. Courdavault, S. E. O’Connor: De novo production of the plant-derived alkaloid strictosidine in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015, 112, 3205–3210.&lt;br /&gt;<br /> [12] C. Y. Zhang, N. B. Lin, X. S. Chai, Zhong-Li, D. G. Barnes: A rapid method for simultaneously determining ethanol and methanol content in wines by full evaporation headspace gas chromatography. Food Chem. 2015, 183, 169–172.&lt;br /&gt;</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=MonChassis&diff=21667 2023-04-02T19:49:36Z

<p>Nika Tomsič: New page: Svet se trenutno sooča z velikimi globalnimi težavami, zato je potrebno iskanje novih, trajnostnih rešitev. Poseben razred z obetajočimi aplikacijami so monoterpenoidi. Monoterpenoidi ...</p> <hr /> <div>Svet se trenutno sooča z velikimi globalnimi težavami, zato je potrebno iskanje novih, trajnostnih rešitev. Poseben razred z obetajočimi aplikacijami so monoterpenoidi. Monoterpenoidi imajo širok spekter uporabe, na primer v kozmetiki, medicini, zatiranju škodljivcev, živilski industriji in biogorivih. Toda obsežna uporaba monoterpenoidov je redka zaradi cene in časa, ki so potrebni za njihovo pripravo. Skupina iGem iz Muenstera je leta 2022 raziskovala možnost njihove sinteze v kvasovkah.<br /> <br /> <br /> == TRENUTNA PRIDELAVA ==<br /> <br /> <br /> <br /> == Ekstrakcija iz rastlin ==<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Primarni vir monoterpenoidov so rastline, kjer imajo pomembno vlogo v številnih fizioloških procesih. Rastlinska eterična olja vsebujejo več kot 80 % monoterpenoidov, vendar ima ekstrakcija eteričnih olj iz rastlin nizek izkoristek. Poleg tega je zaradi kompleksnosti eteričnih olj čiščenje posameznih monoterpenoidov stroškovno obsežno, naporno in neučinkovito. Sestava je namreč odvisna od pogojev rasti rastlin in njihovega shranjevanja &lt;ref&gt;[1]&lt;/ref&gt;.<br /> Kemijska sinteza:<br /> Kemijska sinteza je bolj zanesljiva možnost za proizvajanje monoterpenov. Priprava enostavnih molekul je možna, medtem ko se cena in potrebna energija večata z večanjem kompleksnosti molekule. Poleg tega pe je kemijska sinteza okolju neprijazna zaradi onesnažujočih topil in katalizatorjev ter je včasih odvisna od neobnovljivih virov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> <br /> == Proizvodnja v bakterijah ==<br /> <br /> <br /> Bakterije so pogosto prva izbira za proizvodnjo kemikalij in vivo, saj je taka proizvodnja hitra in poceni. Za proizvodnjo monoterpenoidov pa ima delo z bakterijami več pomanjkljivosti. Prvič, obstaja pomanjkanje prekurzorja geranil difosfata (GPP) v bakterijskem gostitelju. Za povečanje sinteze je treba celotno pot mevalonata preoblikovati v bakterije&lt;ref&gt;[3]&lt;/ref&gt;. Drugič, koraki monoterpenoidne biosinteze zahtevajo funkcionalno izražanje CYP, kar je izziv pri bakterijah&lt;ref&gt;[4]&lt;/ref&gt;. Tretjič, tudi če se vsi heterologni geni lahko funkcionalno izrazijo, proizvodnja monoterpenoidov z bakterijami morda ne bo učinkovita. Kopičenje prekurzorjev vodi do zmanjšane rasti celic, različni monoterpenoidi pa imajo toksične učinke na bakterije z motnjami v celični membrani&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> <br /> <br /> == Proizvodnja v kvasovkah ==<br /> <br /> <br /> Kvasovke predstavljajo privlačno alternativo za proizvodnjo monoterpenoidov. Kvasovke imajo pot endogenega mevalonata (MVA), ki jo lahko spremenimo za sintezo monoterpenoidov&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt; Vendar naravna pot MVA ne omogoča učinkovite sinteze monoterpenoidov, saj se GPP, predhodnik vseh monoterpenoidov, hitro pretvori v farnezil difosfat (FPP). Druga omejitev pri proizvodnji monoterpenoidov s kvasom je toksičnost proizvoda. Čeprav so kvasovke na splošno močnejše od bakterij, lahko toksični učinki monoterpenoidov omejijo možne donose&lt;ref&gt;[6]&lt;/ref&gt;. Zato smo ugotovili, da trenutno ni izvedljive strategije za učinkovito proizvodnjo široke palete monoterpenoidov v velikem obsegu.<br /> <br /> <br /> <br /> == MON CHASSIS ==<br /> <br /> MonChassis je prilagodljiva platforma na osnovi kvasovk za obsežno proizvodnjo monoterpenoidov. Temelji na pripravi terpenskih prekurzorjev v kvasovkah z uporabo sinteznobiološkega inženiringa ter s katalizo v končne produkte z brezceličnim sistemov encima CYP. Raziskovana je bila proizvodnja v ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica'' s spremembo moči promotorjev ključnih encimov in uvedbo novih zapisov&lt;ref&gt;[2]&lt;/ref&gt;.<br /> <br /> '''Slika1: Prikaz mevalonatne poti S. cerevisiae. V modrem so napisani potrebni encimi in s puščico navzgor označeni encimi, katerih povečana aktivnost bi pomenila potencialno povečanje poizvodnje terpenoidnih prekurzorjev.'''<br /> <br /> Monoterpenoide so lahko učinkovito sintetizira z modifikacijo mevalonantne poti kvasovk&lt;ref&gt;[5]&lt;/ref&gt;. Da bi povečali presnovni tok poti MVA, je bilo identificiranih in optimiziranih več pomembnih encimov, ki omejujejo hitrost poti. Z uvedbo dodatnih heterolognih genov in utišanjem endogenih genov je možno optimizirati proizvodnjo monoterpenoidov. Glavni cilj je bil povečati proizvodnjo geranil difosfata (GPP) v ''Saccharomyces cerevisiae'', saj deluje kot bistveni prekurzor za sintezo monoterpenoidov, kot je α-pinen. Med temi sta najbolj omejujoča ERG13 in 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A (tHMGR). Če gena za ta encima prekomerno izrazimo, se poveča tudi proizvodnja prekurzorjev monoterpenoidov.<br /> Dodatna skupna omejitev modelov je sinteza ergosterola iz GPP, iz katerega nastajajo tudi prekurzorji monoterpenoidov. Ker je sinteza ergosterola nujna za celično rast, bodo modeli, ki temeljijo na endogeni poti MVA kvasovk, vedno omejeni v svojih donosih. Zaradi tega je bila preverjena tudi učinkovitost proizvodnje tudi v peroksisomih, ker bi tako bila proizvodnja monoterpenoidov in ergosterola ločena. Peroksisomi predstavljajo zagotavljajo ugodne fiziološke pogoje za sintezo prekurzorjev monoterpenoidov&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;. Usmerjanje encimov na peroksisome je mogoče zlahka doseči z dodajanjem tripeptida C-terminalnega peroksisomskega ciljnega signala-1 (PTS1)&lt;ref&gt;[8]&lt;/ref&gt;. Skupaj se je preverjalo učinkovitost proizvodnje v citosolu in v peroksisomu bodisi v organizmih ''Saccharomyces cerevisiae'' in ''Yarrowia lipolytica''. <br /> MonChassis je sestavljena iz dveh komponent: sestava prekurzorjev terpenov v kvasovkah in in vitro kataliza spremembe prekurzerjev v monoterpenoide. V ta namen MonChassis uporablja samozasnovan bioreaktor za encimsko elektrosintezo (BREES) in modificirano citokrom P450 monooksigenazo BM3. Kot dokaz delovanja je potekla kataliza reakcije iz α-pinena v verbenon.<br /> <br /> <br /> == BREES ==<br /> <br /> Najlažji način za spopadanje s toksičnostjo produktov je uporaba brezceličnih sistemov. Tradicionalna biokataliza brez celic zahteva dodajanje kofaktorjev, kot je NADPH, ki zvišuje stroške za obsežne aplikacije. Da bi bila komponenta MonChassis in vitro uporabna v industrijskem obsegu, smo potrebo po dragih kofaktorjih izločili iz enačbe z uporabo električne energije kot poceni alternative. Zato je bil sestavljen BREES, bioreaktor za encimsko elektrosintezo. BM3, znan tudi kot citokrom P450 BM3 ali CYP102A1, je bakterijski encim citokroma P450, pridobljen iz ''Bacillus megaterium''. Je vsestranski encim z aktivnostmi monooksigenaze in hidroksilaze maščobnih kislin. Čeprav ni neposredno vpleten v proizvodnjo terpenoidov, so bili BM3 in njegove različice uporabljeni kot biokatalizatorji za modificiranje terpenoidnih spojin, zlasti v kontekstu sintetične biologije in presnovnega inženiringa. Raziskovalci so izdelali BM3 in druge encime citokroma P450 za uvedbo hidroksilnih skupin, epoksidov ali drugih funkcionalnih skupin v terpenoidne molekule, kar lahko vodi do ustvarjanja novih spojin s potencialno duporabo za proizvodnjo farmacevtskih izdelkov, arom, dišav ali drugih. Modificiran encim CYP BM3 iz ''Priestia magaterium'' ima dodan peptidni povezovalec, ki lahko imobilizira encim na elektrodo iz indijevega kositrovega oksida in omogoči neposreden prenos elektronov z elektrode na encim&lt;ref&gt;[9]&lt;/ref&gt;. Zato lahko encim uporablja elektrone neposredno iz električne energije in ne zahteva dovajanja drugih kofaktorjev. BM3 To drastično zniža operativne stroške komponente MonChassis in vitro v primerjavi s konvencionalno biokatalizo brez celic. V kombinaciji z inženirskimi sevi kvasovk MonChassis BREES omogoča hitro, prilagodljivo in obsežno proizvodnjo monoterpenoidov.<br /> <br /> <br /> == STRATEGIJA KLONIRANJA ==<br /> <br /> Po uradnih pravilih iGEM je bilo splošno kloniranje izvedeno v skladu z modularnim sistemom kloniranja RFC1000 (MoClo).<br /> Sistem MoClo se opira na restrikcijske encime tipa IIS, ki cepijo DNA tako, da nastanejo lepljivi konci. Ustvarjanje različnih koncev pri različnih fragmentih omogoča učinkovito sestavljanje več fragmentov DNA v eni preprosti reakciji ligacije. Primerna zasnova koncev omogoča, da se fragmenti sestavljajo samo v vnaprej določenem vrstnem redu. Vsi geni so bili pomnoženi z začetno verižno reakcijo s polimerazo (PCR) z uporabo specifičnih začetnih oligonukleotidov z ustreznimi pritrjenimi konci.<br /> Končni zapis je bil sestavljen z metodo Golden Gate v vektor pSB1C00. V vektor so dovajali zapis transkripcijskih enot, ki so ga sestavljali promotorj, kodirno zaporedje in terminator. Z uporabo različnih promotorjev je bila mogoča sprememba ravni izražanja genov. Uspešno integracijo so preverili s selekcijo transformiranih kolonij, saj so celice konstitutivno izražale rdeči fluorescenčni protein (mRFP1).<br /> <br /> Za transformacijo kvasovk sta bili uporabljeni metodi Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR-assotiated protein 9 (CRISPR-Cas9) in uporaba ekstrakromosomskih shuttle vektorjev. Vsak vektor vsebuje enega od štirih različnih yelekcijskih markerjev (HIS3, TRP1, LEU2 ali URA3) za genomsko integracijo.<br /> <br /> <br /> == CITOSOLNA PRODUKCIJA V ''SACCHAROMYCES CEREVISIAE'' ==<br /> <br /> Da bi ustvarili organizem, ki proizvaja monoterpenoid α-pinen, smo spremenili mevalonatno pot modelnega organizma ''Saccharomyces cerevisiae''. Z metodo Golden Gate Assembly so ustavili heterologne gene, kot je PptAPS ter povečali izražanje endogenih genov, kot sta ScERG13 ali SctHMGR.<br /> Genske spremembe so temlejile na sistemu CRISPR-Cas9. Oblikovana je bila pot do α-pinena (prekurzorja monoterpenoidov). Z namenom povečanja koncentracije mevalonata je bil utišan ScROX1 in ScERG13 ter SctHMGR uravnavana z močnim promotorjem. Izločitev ScROX1 je bila ugodna za povečanje koncentracije mevalonata, saj zavira encime v MVA&lt;ref&gt;[10]&lt;/ref&gt;. Nadalje smo uvedli heterologne gene GgmFPS144 iz Gallus gallus in AgtGPPS2 iz Abies grandis, da bi povečali koncentracijo geranil difosfata (GPP), prekurzorske molekule vseh monoterpenoidov. Izločitev ScERG20 in vstavljanje GgmFPS144 sta bila potrebna za zaviranje vitalne reakcije GPP v farnezil difosfat (FPP), vendar ne popolnoma ovirati&lt;ref&gt;[11]&lt;/ref&gt;. Uvedba heterologne α-pinen sintaze (PptAPS) iz ''Pinus ponderosa'' je povečala proizvodnjo α-pinena v citosolu ''S. cerevisiae''.<br /> Genomske tarče znotraj ScROX1, ScERG20 in ScpERG20 so bile predvidene s spletnim orodjem CRISPOR. Namesto da bi naše konstrukte vstavili v genomsko DNA, smo konstrukte klonirali v vektorje shuttle z različnimi avksotrofijami.<br /> Analiza z GC-MS je potrdila prisotnost α-pinena v lizatu.<br /> <br /> <br /> == PEROKSISOMSKA PRODUKCIJA V ''SACCHAROMYCES CEREVISIAE'' ==<br /> <br /> Poleg citosola je peroksisom postal obetavna tarča za presnovni inženiring, saj naj bi njegove fiziološke lastnosti, kot je razpoložljivost substrata, znatno izboljšale sintezo produkta&lt;ref&gt;[7]&lt;/ref&gt;.<br /> Ker se metabolizem mevalonata ne pojavlja naravno v peroksisomih&lt;ref&gt;[12]&lt;/ref&gt;, je bilo treba v vsak sev kvasovk pod nadzorom konstitutivnega promotorja pADH vključiti potrebne gene ScERG13, SctHMGR, ScERG12, ScERG8 in ScERG19, spojene s PTS1, za enoten izražanje genov. V različnih primerih so v zapis vključili sintazo SltNPPS1 iz ''Solanum lycopersicum'', kar omogoča proizvodnjo monoterpenoidnega prekurzorja neril difosfata (NPP), ali heterologna gena GgmFPS144 in AgtGPPS2 iz ''Gallus gallus'' oziroma ''Abies grandis'', kar omogoča proizvodnjo NPP, strukturnega izomera geranil difosfata (GPP). V obeh primerih je bil dodan še zapis za PptAPS, ki katalizira reakcijo NPP ali GPP na α-pinen. Povečanje izražanja ScERG13 in SctHMGR je poteklo z uporabo promotorja ScpTEF.<br /> <br /> Za primerjavo brezcelične proizvodnje verbenona v in vitro poskusih so pripravili tudi sev kvasovk, ki vsebuje citokrom P450 monooksigenazo (CYP) limonen-3-hidroksilazo (L3H) in je zmožen katalize α-pinen<br /> <br /> <br /> Končna ocena spremenjenih sevov kvasovk je bila izvedena s kvantifikacijo z uporabo GC-MS analize, ki je potrdila prisotnost α-pinena v obeh variantah kvasovk. <br /> <br /> <br /> == CITOSOLNA PRODUKCIJA V ''YARROWIA LIPOLYTICA'' ==<br /> <br /> <br /> ''Yarrowia lipolytica'' je obetaven organizem za sintezo monoterpenoidov, saj vsebuje visoko koncentracijo acetil-CoA, je sposoben učinkovito kopičiti lipide in kaže visoko toleranco do monoterpenoidov. Za izražanje terpinoidnih prekurzorjev v ''Yarrowia lipolytica'' so izrazili gena SctHMGR in ScERG13 organizma Saccharomyces cerevisiae. Uvedba genov AgtGPPS2 in GgMFPS144 bi pomenili zmanjšano količino proizvedenega farnezil pirofosfata (FPP) in povečano količino geranil pirofosfata (GPP). Drugi poskus je predvideval zmanjšanje količine proizvedenega FPP. To so poskušali narediti z uvedbo SltNPPS1 za proizvodnjo neril pirofosfata (NPP). Dodan je bil še gen PptAPS za proizvodnjo α-pinena.<br /> Genomska ciljna zaporedja so bila izbrana tako, da so blizu začetnemu zaporedju gena ter z visoko učinkovitostjo, specifičnostjo in brez stranskih ciljev na podlagi spletne programske opreme CRISPOR.<br /> cPCR nikoli ni pokazal uspešne vstavitve genov, temveč so opazili le dolžine, ki bi jih pričakovali od prvotnega genomskega zaporedja. Zaradi časovnih omejitev pa poskus ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> == <br /> PEROKSISOMALNA PRODUKCIJA V ''YARROWIA LIPOLYTICA'' ==<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> ''Y. lipolytica'' je zaradi njegovega obsežnega metabolizma maščobnih kislin zanimiv organizem za peroksisomsko proizvodnjo monoterpenoidov. Poskus je predvideval implementacijo presnovnih poti, ki uporabljajo GPP ali NPP kot substrat za monoterpensko sintazo PptAPS v peroksisomih ''Y. lipolytica''. Geni, ki naj bi bili močno izraženi, so bili pod regulacijo promotorja YlpTEF, medtem ko so bili geni, ki so zahtevali šibkejšo ekspresijo, sestavljeni s promotorjem YlpGAP. <br /> <br /> Vsi geni poti, ki uporabljajo NPP, so bili uspešno sestavljeni, vendar zaradi pomanjkanja časa projekt ni nadaljeval.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> == LITERATURA ==<br /> <br /> [1] A. El Asbahani, K. Miladi, W. Badri, M. Sala, E. H. A. Addi, H. Casabianca, A. El Mousadik, D. Hartmann, A. Jilale, F. N. R. Renaud, et al.: Essential oils: From extraction to encapsulation. International Journal of Pharmaceutics. Elsevier B.V. April 15, 2015, pp 220–243.&lt;br /&gt;<br /> [2] Q. Gao, L. Wang, M. Zhang, Y. Wei, W. Lin: Recent Advances on Feasible Strategies for Monoterpenoid Production in Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. Frontiers Media S.A. December 1, 2020.&lt;br /&gt;<br /> [3] O. A. Carter, R. J. Peters, R. Croteau: Monoterpene biosynthesis pathway construction in Escherichia coli. Phytochemistry 2003, 64, 425–433.&lt;br /&gt;<br /> [4] M. T. Lundemo, J. M. Woodley: Guidelines for development and implementation of biocatalytic P450 processes. Applied Microbiology and Biotechnology. Springer Verlag February 28, 2015, pp 2465–2483.&lt;br /&gt;<br /> [5] C. Ignea, M. H. Raadam, M. S. Motawia, A. M. Makris, C. E. Vickers, S. C. Kampranis: Orthogonal monoterpenoid biosynthesis in yeast constructed on an isomeric substrate. Nat. Commun. 2019, 10.&lt;br /&gt;<br /> [6] J. Zhao, X. Bao, C. Li, Y. Shen, J. Hou: Improving monoterpene geraniol production through geranyl diphosphate synthesis regulation in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 4561–4571.&lt;br /&gt;<br /> [7] S. Dusséaux, W. T. Wajn, Y. Liu, C. Ignea, S. C. Kampranis: Transforming yeast peroxisomes into microfactories for the efficient production of high-value isoprenoids. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020, 117, 31789–31799.&lt;br /&gt;<br /> [8] C. Brocard, A. Hartig: Peroxisome targeting signal 1: Is it really a simple tripeptide? Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. Biochim Biophys Acta December 2006, pp 1565–1573.&lt;br /&gt;<br /> [9] S. Zernia, F. Ott, K. Bellmann-Sickert, R. Frank, M. Klenner, H. G. Jahnke, A. Prager, B. Abel, A. Robitzki, A. G. Beck-Sickinger: Peptide-Mediated Specific Immobilization of Catalytically Active Cytochrome P450 BM3 Variant. Bioconjug. Chem. 2016, 27, 1090–1097.&lt;br /&gt;<br /> [10] J. N. Bröker, B. Müller, N. van Deenen, D. Prüfer, C. Schulze Gronover: Upregulating the mevalonate pathway and repressing sterol synthesis in Saccharomyces cerevisiae enhances the production of triterpenes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 6923–6934.&lt;br /&gt;<br /> [11] S. Brown, M. Clastre, V. Courdavault, S. E. O’Connor: De novo production of the plant-derived alkaloid strictosidine in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2015, 112, 3205–3210.&lt;br /&gt;<br /> [12] C. Y. Zhang, N. B. Lin, X. S. Chai, Zhong-Li, D. G. Barnes: A rapid method for simultaneously determining ethanol and methanol content in wines by full evaporation headspace gas chromatography. Food Chem. 2015, 183, 169–172.&lt;br /&gt;</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO2_Seminar_2020&diff=17667 2020-11-13T14:32:02Z

<p>Nika Tomsič: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>= Biokemijski seminar =<br /> doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> {| {{table}}<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''ime in priimek'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''poglavje'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''naslov seminarja'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''recenzent 1'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''recenzent 2'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''datum oddaje'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''datum recenzije'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''datum predstavitve'''<br /> |-<br /> | Ajda Beltram||12||Zgradba in dinamika signalnih kompleksov GPCR||Luka Hafner||Tinkara Božič||16/10/20||19/10/20||21/10/20<br /> |-<br /> | Jan Bregar||12||Protein retinoblastoma||Nika Bedrač||Martin Stanonik||16/10/20||19/10/20||21/10/20<br /> |-<br /> | Anja Moškrič||12|| Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmiterjev||Srna Anastasovska||Luka Stanković||16/10/20||19/10/20||21/10/20<br /> |-<br /> | Gregor Strniša||12||Načini aktivacije GPCR||Manca Pirc||Ana Pervanja||23/10/20||26/10/20||28/10/20<br /> |-<br /> | Vid Dobrovoljc||12||Medsebojni vpliv signalnih poti na primeru RTK in GPCR signalnih poti||Maruša Sernc||Nika Banovšek||23/10/20||26/10/20||28/10/20<br /> |-<br /> | Nikola Janakievski||12||Selective androgen receptor modulators||Ajda Beltram||Aljaž Simonič||23/10/20||26/10/20||28/10/20<br /> |-<br /> | Rebeka Jerina||12||Kofein kot antagonist adenozinskih receptorjev||Jan Bregar||Luka Hafner||30/10/20||02/11/20||04/11/20<br /> |-<br /> | Eva Vene||12||Povezava bolečine z vezavo kapsaicina na TRPV1||Anja Moškrič||Nika Bedrač||30/10/20||02/11/20||04/11/20<br /> |-<br /> | Zala Perko||12||Mehanizmi vezave ligandov in regeneracija fotoreceptorjev očesne mrežnice||Gregor Strniša||Srna Anastasovska||30/10/20||02/11/20||04/11/20<br /> |-<br /> | Erik Putar||14-15||AMPK: senzor glukoze in celičnega energijskega stanja||Nikola Janakievski||Manca Pirc||06/11/20||09/11/20||11/11/20<br /> |-<br /> | Iva Matić||14-15||||Rebeka Jerina||Maruša Sernc||06/11/20||09/11/20||13/01/21<br /> |-<br /> | Timotej Sotošek||14-15||Regulacija mišičnega glikogena: granula in njeni proteini||Eva Vene||Ajda Beltram||06/11/20||09/11/20||11/11/20<br /> |-<br /> | Nika Tomsič||16||Acetil-CoA: glavni metabolit in sekundarni obveščevalec||Zala Perko||Jan Bregar||13/11/20||16/11/20||18/11/20<br /> |-<br /> | Andrej Špenko||16||||Erik Putar||Anja Moškrič||13/11/20||16/11/20||18/11/20<br /> |-<br /> | Aleksandra Rauter||16||||Iva Matić||Gregor Strniša||13/11/20||16/11/20||18/11/20<br /> |-<br /> | Laura Unuk||17||Motnje pri oksidaciji dolgoverižnih maščobnih kislin||Timotej Sotošek||Nikola Janakievski||20/11/20||23/11/20||25/11/20<br /> |-<br /> | Stefanija Ivanova||17||Metabolism of ketone bodies during exercise and defects||Nika Tomsič||Rebeka Jerina||20/11/20||23/11/20||25/11/20<br /> |-<br /> | Jakob Tomšič||17||Funkcije ketonskih telesc v celicah centralnega živčevja||Andrej Špenko||Eva Vene||20/11/20||23/11/20||25/11/20<br /> |-<br /> | Neža Leskovar||18||||Aleksandra Rauter||Zala Perko||27/11/20||30/11/20||02/12/20<br /> |-<br /> | Luka Šegota||18||||Laura Unuk||Erik Putar||27/11/20||30/11/20||02/12/20<br /> |-<br /> | Nika Perko||18||||Stefanija Ivanova||Iva Matić||27/11/20||30/11/20||02/12/20<br /> |-<br /> | Ela Bizjak||19||||Jakob Tomšič||Timotej Sotošek||04/12/20||07/12/20||09/12/20<br /> |-<br /> | Bor Krajnik||19||||Neža Leskovar||Nika Tomsič||04/12/20||07/12/20||09/12/20<br /> |-<br /> | Maja Kobal||19||||Luka Šegota||Vid Dobrovoljc||04/12/20||07/12/20||09/12/20<br /> |-<br /> | Mateja Milošević||20||||Nika Perko||Andrej Špenko||11/12/20||14/12/20||16/12/20<br /> |-<br /> | Tinkara Božič||20||||Ela Bizjak||Aleksandra Rauter||11/12/20||14/12/20||16/12/20<br /> |-<br /> | Martin Stanonik||20||||Bor Krajnik||Laura Unuk||11/12/20||14/12/20||16/12/20<br /> |-<br /> | Luka Stanković||21||||Maja Kobal||Stefanija Ivanova||18/12/20||21/12/20||23/12/20<br /> |-<br /> | Ana Pervanja||21||||Mateja Milošević||Jakob Tomšič||18/12/20||21/12/20||23/12/20<br /> |-<br /> | Nika Banovšek||21||||Tinkara Božič||Neža Leskovar||18/12/20||21/12/20||23/12/20<br /> |-<br /> | Aljaž Simonič||22||||Martin Stanonik||Luka Šegota||23/12/20||28/12/20||30/12/20<br /> |-<br /> | Luka Hafner||22||||Luka Stanković||Ana Žagar||23/12/20||28/12/20||30/12/20<br /> |-<br /> | Ana Žagar||22||||Vid Dobrovoljc||Nika Perko||23/12/20||28/12/20||30/12/20<br /> |-<br /> | Nika Bedrač||23||||Ana Pervanja||Ela Bizjak||30/12/20||04/01/21||06/01/21<br /> |-<br /> | Srna Anastasovska||23||||Nika Banovšek||Bor Krajnik||30/12/20||04/01/21||06/01/21<br /> |-<br /> | Manca Pirc||23||||Aljaž Simonič||Maja Kobal||30/12/20||04/01/21||06/01/21<br /> |-<br /> | Maruša Sernc||23||||Ana Žagar||Mateja Milošević||08/01/21||11/01/21||13/01/21<br /> |}<br /> <br /> *številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada<br /> Razporeditev je začasna in se lahko še spremeni, načeloma pa se termini do vključno 18. poglavja ne bodo spreminjali. <br /> Prosim,da mi sporočite morebitne napake ali če vas nisem razporedil.<br /> <br /> == Gradivo za predavanja ==<br /> Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/<br /> username: bio2<br /> password: samozame<br /> <br /> ==Naloga==<br /> '''Vaša naloga za seminar je:&lt;br&gt;'''<br /> Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti &lt;font color=red&gt; pregledni &lt;/font&gt; članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].<br /> <br /> Za pripravo seminarja velja naslednje:&lt;br&gt;<br /> * [[BIO2 Povzetki seminarjev 2020|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom. <br /> * Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo &lt;font color=red&gt;2700 do 3000 besed &lt;/font&gt;, a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike, bolje več. &lt;font color=red&gt;Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. &lt;/font&gt;<br /> * Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].<br /> * Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].<br /> * Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20-25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.<br /> * Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v okviru celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].<br /> * Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.<br /> * Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx<br /> * 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx<br /> * &lt;font color=green&gt;312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši&lt;/font&gt;<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Citiranje virov==<br /> Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana &lt;font color=green&gt;zeleno&lt;/font&gt;.<br /> Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.<br /> Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;<br /> '''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;<br /> <br /> Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;<br /> Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;<br /> Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). <br /> <br /> '''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;<br /> &lt;font color=green&gt;Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.<br /> Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.&lt;/font&gt;<br /> <br /> Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.<br /> <br /> Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;<br /> C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;<br /> <br /> V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica &quot;in&quot;. <br /> <br /> <br /> '''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;<br /> strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;<br /> Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO2_Seminar_2020&diff=17666 2020-11-13T14:30:45Z

<p>Nika Tomsič: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>= Biokemijski seminar =<br /> doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> {| {{table}}<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''ime in priimek'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''poglavje'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''naslov seminarja'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''recenzent 1'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''recenzent 2'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''datum oddaje'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''datum recenzije'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''datum predstavitve'''<br /> |-<br /> | Ajda Beltram||12||Zgradba in dinamika signalnih kompleksov GPCR||Luka Hafner||Tinkara Božič||16/10/20||19/10/20||21/10/20<br /> |-<br /> | Jan Bregar||12||Protein retinoblastoma||Nika Bedrač||Martin Stanonik||16/10/20||19/10/20||21/10/20<br /> |-<br /> | Anja Moškrič||12|| Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmiterjev||Srna Anastasovska||Luka Stanković||16/10/20||19/10/20||21/10/20<br /> |-<br /> | Gregor Strniša||12||Načini aktivacije GPCR||Manca Pirc||Ana Pervanja||23/10/20||26/10/20||28/10/20<br /> |-<br /> | Vid Dobrovoljc||12||Medsebojni vpliv signalnih poti na primeru RTK in GPCR signalnih poti||Maruša Sernc||Nika Banovšek||23/10/20||26/10/20||28/10/20<br /> |-<br /> | Nikola Janakievski||12||Selective androgen receptor modulators||Ajda Beltram||Aljaž Simonič||23/10/20||26/10/20||28/10/20<br /> |-<br /> | Rebeka Jerina||12||Kofein kot antagonist adenozinskih receptorjev||Jan Bregar||Luka Hafner||30/10/20||02/11/20||04/11/20<br /> |-<br /> | Eva Vene||12||Povezava bolečine z vezavo kapsaicina na TRPV1||Anja Moškrič||Nika Bedrač||30/10/20||02/11/20||04/11/20<br /> |-<br /> | Zala Perko||12||Mehanizmi vezave ligandov in regeneracija fotoreceptorjev očesne mrežnice||Gregor Strniša||Srna Anastasovska||30/10/20||02/11/20||04/11/20<br /> |-<br /> | Erik Putar||14-15||AMPK: senzor glukoze in celičnega energijskega stanja||Nikola Janakievski||Manca Pirc||06/11/20||09/11/20||11/11/20<br /> |-<br /> | Iva Matić||14-15||||Rebeka Jerina||Maruša Sernc||06/11/20||09/11/20||13/01/21<br /> |-<br /> | Timotej Sotošek||14-15||Regulacija mišičnega glikogena: granula in njeni proteini||Eva Vene||Ajda Beltram||06/11/20||09/11/20||11/11/20<br /> |-<br /> | Nika Tomsič||16||http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2020#Nika_Tomsi.C4.8D_-_Acetil-CoA:_glavni_metabolit_in_sekundarni_obve.C5.A1.C4.8Devalec||Zala Perko||Jan Bregar||13/11/20||16/11/20||18/11/20<br /> |-<br /> | Andrej Špenko||16||||Erik Putar||Anja Moškrič||13/11/20||16/11/20||18/11/20<br /> |-<br /> | Aleksandra Rauter||16||||Iva Matić||Gregor Strniša||13/11/20||16/11/20||18/11/20<br /> |-<br /> | Laura Unuk||17||Motnje pri oksidaciji dolgoverižnih maščobnih kislin||Timotej Sotošek||Nikola Janakievski||20/11/20||23/11/20||25/11/20<br /> |-<br /> | Stefanija Ivanova||17||Metabolism of ketone bodies during exercise and defects||Nika Tomsič||Rebeka Jerina||20/11/20||23/11/20||25/11/20<br /> |-<br /> | Jakob Tomšič||17||Funkcije ketonskih telesc v celicah centralnega živčevja||Andrej Špenko||Eva Vene||20/11/20||23/11/20||25/11/20<br /> |-<br /> | Neža Leskovar||18||||Aleksandra Rauter||Zala Perko||27/11/20||30/11/20||02/12/20<br /> |-<br /> | Luka Šegota||18||||Laura Unuk||Erik Putar||27/11/20||30/11/20||02/12/20<br /> |-<br /> | Nika Perko||18||||Stefanija Ivanova||Iva Matić||27/11/20||30/11/20||02/12/20<br /> |-<br /> | Ela Bizjak||19||||Jakob Tomšič||Timotej Sotošek||04/12/20||07/12/20||09/12/20<br /> |-<br /> | Bor Krajnik||19||||Neža Leskovar||Nika Tomsič||04/12/20||07/12/20||09/12/20<br /> |-<br /> | Maja Kobal||19||||Luka Šegota||Vid Dobrovoljc||04/12/20||07/12/20||09/12/20<br /> |-<br /> | Mateja Milošević||20||||Nika Perko||Andrej Špenko||11/12/20||14/12/20||16/12/20<br /> |-<br /> | Tinkara Božič||20||||Ela Bizjak||Aleksandra Rauter||11/12/20||14/12/20||16/12/20<br /> |-<br /> | Martin Stanonik||20||||Bor Krajnik||Laura Unuk||11/12/20||14/12/20||16/12/20<br /> |-<br /> | Luka Stanković||21||||Maja Kobal||Stefanija Ivanova||18/12/20||21/12/20||23/12/20<br /> |-<br /> | Ana Pervanja||21||||Mateja Milošević||Jakob Tomšič||18/12/20||21/12/20||23/12/20<br /> |-<br /> | Nika Banovšek||21||||Tinkara Božič||Neža Leskovar||18/12/20||21/12/20||23/12/20<br /> |-<br /> | Aljaž Simonič||22||||Martin Stanonik||Luka Šegota||23/12/20||28/12/20||30/12/20<br /> |-<br /> | Luka Hafner||22||||Luka Stanković||Ana Žagar||23/12/20||28/12/20||30/12/20<br /> |-<br /> | Ana Žagar||22||||Vid Dobrovoljc||Nika Perko||23/12/20||28/12/20||30/12/20<br /> |-<br /> | Nika Bedrač||23||||Ana Pervanja||Ela Bizjak||30/12/20||04/01/21||06/01/21<br /> |-<br /> | Srna Anastasovska||23||||Nika Banovšek||Bor Krajnik||30/12/20||04/01/21||06/01/21<br /> |-<br /> | Manca Pirc||23||||Aljaž Simonič||Maja Kobal||30/12/20||04/01/21||06/01/21<br /> |-<br /> | Maruša Sernc||23||||Ana Žagar||Mateja Milošević||08/01/21||11/01/21||13/01/21<br /> |}<br /> <br /> *številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada<br /> Razporeditev je začasna in se lahko še spremeni, načeloma pa se termini do vključno 18. poglavja ne bodo spreminjali. <br /> Prosim,da mi sporočite morebitne napake ali če vas nisem razporedil.<br /> <br /> == Gradivo za predavanja ==<br /> Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/<br /> username: bio2<br /> password: samozame<br /> <br /> ==Naloga==<br /> '''Vaša naloga za seminar je:&lt;br&gt;'''<br /> Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti &lt;font color=red&gt; pregledni &lt;/font&gt; članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].<br /> <br /> Za pripravo seminarja velja naslednje:&lt;br&gt;<br /> * [[BIO2 Povzetki seminarjev 2020|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom. <br /> * Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo &lt;font color=red&gt;2700 do 3000 besed &lt;/font&gt;, a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike, bolje več. &lt;font color=red&gt;Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. &lt;/font&gt;<br /> * Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].<br /> * Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].<br /> * Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20-25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.<br /> * Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v okviru celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].<br /> * Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.<br /> * Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx<br /> * 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx<br /> * &lt;font color=green&gt;312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši&lt;/font&gt;<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Citiranje virov==<br /> Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana &lt;font color=green&gt;zeleno&lt;/font&gt;.<br /> Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.<br /> Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;<br /> '''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;<br /> <br /> Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;<br /> Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;<br /> Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). <br /> <br /> '''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;<br /> &lt;font color=green&gt;Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.<br /> Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.&lt;/font&gt;<br /> <br /> Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.<br /> <br /> Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;<br /> C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;<br /> <br /> V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica &quot;in&quot;. <br /> <br /> <br /> '''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;<br /> strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;<br /> Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO2_Povzetki_seminarjev_2020&diff=17665 2020-11-13T14:27:40Z

<p>Nika Tomsič: </p> <hr /> <div>= POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2020/21 =<br /> <br /> <br /> ==Jan Bregar - Protein retinoblastoma==<br /> <br /> Protein retinoblastoma (pRb) je eden ključnih proteinov, ki regulirajo celični cikel in njegova inaktivacija lahko povzroči različna bolezenska stanja. Ta protein regulira ključni prehod iz G1 v S fazo celičnega cikla s pomočjo interakcij z družino E2F, ki je vrsta transkripcijskih faktorjev celičnega cikla. Retinoblastoma protein (pRb) nadzoruje tudi izstop celice iz celičnega cikla. Njeno aktivnost regulira več mehanizmov, ki zaznavajo znotraj- in zunajcelične signale, ki blokirajo ali dovoljujejo fosforilacijo. pRb fosforilirajo od ciklina odvisne kinaze (Cdk-ji) in s tem protein Rb bodisi inaktivirajo ali pa rahlo spremenijo njegove lastnosti, protein pa vseeno ohrani svojo funkcijo. Odkrili so tudi, da pRb regulira apoptozo s pomočjo enakih interakcij s transkripcijskimi faktorji E2F. To, da je pRb vpleten pri apoptozi, popolno dopolnjuje pRb kot pomemben določevalec usode celice. Med trajanjem celičenga cikla je pRb inaktiviran, kar povzroči, da je celica bolj občutljiva na apoptotske stimuluse. Regulacijo apoptoze lahko onesposobijo nekateri virusi, ki s svojimi onkoproteini povzročijo napake v delovanju proteina Rb, kar lahko predstavlja tveganje za organizem. pRb – E2F kompleksi imajo pomembno vlogo pri regulaciji transkripcije genov, ki so vključeni v diferenciaciji in razvoju.<br /> <br /> ==Ajda Beltram - Struktura in dinamika signalnih komplekov GPCR==<br /> <br /> Receptorji sklopljeni z G-proteinom (GPCR) so transmembranski proteini, ki kot odgovor na ligande regulirajo veliko signalnih poti preko heterotrimernih G-proteinov ali pa preko fosforilacije receptorja s kinazo GRK in arestinov. Vendar ti proteini ne obstajajo le v aktivirani ali neaktivirani obliki, pač pa imajo veliko konformacijskih stanj, ki vsaka sproži svojo signalno pot. Mene je zanimala podrobna razlaga konformacijskih sprememb, ki se zgodijo med prenosom signala. Za aktivacijo G-proteinov je potrebna zamenjava GDP z GTP, kjer igra ključno vlogo razcep domen podenote α G-proteina in destabilizacija vezavnega mesta za nukleotid na Ras-domeni podenote α, kar so posledice konformacijskih sprememb, ki jih povzroči vezava na receptor. Različni ligandi, ki se vežejo na receptorje, pa lahko vplivajo tudi na afiniteto G-proteina do GDP. Kompleksi receptor-G-protein, ki nastanejo z vezavo popolnih agonistov, imajo manjšo afiniteto do GDP, kot tisti, ki so nastali z vezavo delnih agonistov. Pri arestinih pa so prav tako prišli do novega spoznanja. Aktivacija arestinov je večinoma prikazana kot proces iz dveh delov in sicer vezave na fosforiliran C-rep receptorja in nato vezave na jedro receptorja, vendar pa so odkrili, da lahko obe vezavi posebej aktivirata arestin. To nakazuje na to, da verjetno obstaja veliko različnih kompleksov arestina in receptorja, ki regulirajo vsak svojo signalno pot.<br /> <br /> <br /> ==Anja Moškrič - Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmitorjev==<br /> <br /> Signalizacija živčnih celic med drugim poteka s prenosom nevrotransmitorjev preko sinaps. Pri kemični sinapsi gre za pretvarjanje električnih impulzov v eksocitotsko sprostitev nevrotransmitorja (npr. glutamat, GABA, epinefrin, norepinefrin). Pri pretvarjanju signala imajo ključno vlogo napetostno uravnavani kalcijevi ionski kanalčki (Cav), v presinaptičnem predelu. Ti, kot odgovor na depolarizacijo nevrona, usmerjajo kalcijeve ione v notranjost celice in posledično sprožijo fuzijo mešička (z nevrotransmitorjem) s presinaptično membrano. Zgrajeni so iz več podenot, od teh je glavna α1, ki tvori poro za pretok ionov. Podenoti α2δ in β pa regulirata lastnosti. Kanalčke glede na obliko glavne podenote klasificiramo v 3 večje skupine: Cav1, Cav2 in Cav3. V večini sinaps so prisotni kanalčki iz družine Cav2. Da eksocitoza lahko poteče hitro in učinkovito, morajo biti Cav locirani znotraj aktivne regije presinaptične membrane, v bližini mesta eksocitoze. Slednjo kalcijevi kanalčki regulirajo preko različnih proteinov. Pomembnejši predstavnik je družina proteinov RIM (z rab3 vezavne molekule). Ti se na kanalček vežejo z RIM vezavnimi proteini (RBP). Z njimi asociira tudi protein munc13, ki je v membrani vezikla in nevrona vezani s proteini SNARE. Ti so mediatorji pri fuziji membran. Delovanje kanalčka inaktivirajo procesi, kot sta od napetosti odvisni mehanizem in od kalcija odvisen mehanizem, ki je povezan s kalmodulinom.<br /> <br /> <br /> ==Gregor Strniša - Načini aktivacije GPCR==<br /> <br /> GPCR, oziroma z G proteinom sklopljeni receptorji, so transmembranski proteini, ki s svojim delovanjem vplivajo na dogajanje v celici. Zaradi vezave liganda na njihovo zunajcelično stran se jim spremeni konformacija in omogoči prenos signala preko različnih signalnih molekul. Signal se preko različnih G proteinov in β-arrestinov prenaša do drugih proteinov v celici. Kmalu po odkritju GPCR se je izkazalo, da vsi ne delujejo po istem principu. Nove raziskovalne metode so omogočile napredek na področju vizualizacije molekul in njihovega sledenja v celici. Tako so znanstveniki prišli do odkritja petih novih metod aktivacije GPCR, ki lažje razložijo delovanje receptorjev. Med seboj so si različne, a se lahko pogosto prekrivajo in dopolnjujejo. GPCR omogočijo več možnosti odgovora na določen ligand in njegovo koncentracijo. Načini aktivacije, predstavljeni v moji seminarski nalogi, so pristranska aktivacija, znotrajcelična aktivacija, dimerizacijska aktivacija, transaktivacija in dvofazna aktivacija. Posamezen receptor navadno deluje na več načinov. Ob posameznem načinu so podani primeri receptorjev in njihovega delovanja. Z razumevanjem načinov njihove aktivacije se odprejo nove možnosti razvoja zdravil, ki bi delovale preko GPCR, ali vplivale na njihove signalne poti.<br /> <br /> ==Nikola Janakievski - Selective Androgen Receptor Modulators==<br /> <br /> Selective Androgen Receptors Modulators or better known as SARMs, were discovered 30 years ago, as a potential replacement to steroid therapy. SARMs are a type of Selective Receptor Modulators (SRM), compounds which can act both as agonists and antagonists in androgen receptors (ARs) (as a non-steroid replacement), according to the tissue they are in. The main idea behind SARMs, is improving the hormone therapies we have currently, which use synthetic steroids. An ideal SARM could have all the benefits of steroid hormones, without the side effects. The potential benefits and safety of SARMs is yet to be determined, there are numerous ongoing studies for various applications. It is important to have a summary of all these potential application and past examples of studies. In this seminar, we aim to do just that, by comparing all past studies and future potential applications related to SARMs. We conclude that, SARMs are a viable alternative, possibly an improvement to synthetic steroids, although much more research and clinical trials are required for SARMs to become truly applicable.<br /> <br /> ==Vid Dobrovoljc - Medsebojni vpliv signalnih poti na primeru RTK in GPCR signalnih poti==<br /> <br /> Preučevanje součinkovanja med signalnimi potmi v celici je zelo zanimivo področje, vendar dokaj težko za raziskovanje. S seminarjem sem poizkusil predstaviti sovplivanje inzulinske(RTK) in β-adrenergične (GCPR) poti v srcu. . Inzulin na β-adrenergične (βAR) poti vpliva s fosforilacijo receptorja z različnimi kinazami, na primer protein kinazo A (PKA) G-protein kinazo (GRK2) in celo sam inzulinskim receptorjem (INSR), kar vodi do desenzitacije in včasih tudi internalizacije receptorja z vezavo β-arestina. Drug način vplivanja je z delovanjem na nižje člene v signalni poti, na primer na koncentracijo cAMP s fosfodiesterazami (PDE). Inzulin lahko tudi s pomočjo fosforilacije uporabi β-adrenergično pot za krepitev svojega signala. Zelo pomembna točka obeh signalnih poti je GRK2, ki po naravi deluje inhibirajoče na obe signalni poti, po zadnjih rezultatih pa jo poleg tega inzulin uporablja za še dodatno inhibicijo GPCR poti. Vplivanje βAR poti na inzulinsko pot je manj jasno, vendar kaže, da lahko βAR na sprejem glukoze v odvisnosti od situacije vpliva tako pozitivno kot negativno, dokaj pomembno vlogo pri tem pa ima PKB. Domnevam, da bo v prihodnosti vedno več raziskav na temo povezav med signalnimi potmi, saj bodo razvite nove opazovalne tehnike, poleg tega pa je razumevanje povezav koristno tako pri razvoju novih tehnik zdravljenja, kot pri samem študiju razvoja celične signalizacije<br /> <br /> ==Rebeka Jerina - Kofein kot antagonist adenozinskih receptorjev== <br /> <br /> Veliko ljudi po svetu pije kavo, čaj ali kokakolo. Vsem naštetim pijačam je skupen kofein, najpogosteje zaužit psihostimulant na svetu. Kofein povzroča veliko učinkov, med katerimi je najbolj znan vpliv na budnost. Zanima me ali vemo kako in zakaj jo povzroči. Kofein je antagonist adenozinskih receptorjev (ARs). Ima podobno strukturo kot adenozin, zato lahko zaseda njegova vezavna mesta. Adenozinski receptorji so izraženi v mnogih tkivih, veliko pa jih najdemo v centralnem živčnem sistemu (CNS). Raziskala sem, da kofein večinoma vpliva na adenozinska receptorja podtipa A1 in A2A. Te dva podtipa adenozinskih receptorjev (ARs) vplivata na regulacijo mnogih fizioloških funkcij kot so spanje, kognicija, motivacija in čustva. Kofein tako z antagonizmom adenozinskih receptorjev (ARs) prepreči signalno kaskado, ki bi spodbudila zaspanost in posledično ohranja budnost. Adenozinski receptorji (ARs) spadajo pod receptorje povezane z G-proteini. Zgradba A1AR in A2AAR se nekoliko razlikuje, zato je tudi mehanizem delovanja teh dveh podtipov nekoliko drugačen. Signalizacija adenozinskih receptorjev (ARs) lahko poteka po več različnih signalnih poteh. Kofein bi zaradi pozitivnih okrepitvenih učinkov, pojava različnih duševnih motenj in pojava negativnih simptomov po prenehanju uživanja lahko prištevali med droge. Raziskave so pokazale, da se z antagonizmom adenozinskih receptorjev da uspešno zdraviti tudi številne bolezni. Glede na učinke in uporabo kofeina bi lahko rekli, da velja za hranilo, zdravilo ali drogo.<br /> <br /> ==Zala Perko - Mehanizmi vezave ligandov in regeneracija fotoreceptorjev očesne mrežnice== <br /> <br /> Fotoreceptorji v membrani celic očesne mrežnice so značilni predstavniki z G-proteinom sklopljenih receptorjev. Njihova naloga je absorpcija svetlobe določene valovne dolžine in prenos signala preko G-proteina na citoplazemsko stran, kjer poteče veriga encimsko kataliziranih reakcij. Aktiviran fotoreceptor mora v procesu regeneracije ponovno zavzeti neaktivno konformacijo in vezati naravni ligand 11-cis-retinal. Barvni fotoreceptorji jodopsini zahtevajo učinkovit regeneracijski mehanizem, ker morajo stalno procesirati veliko količino svetlobnih signalov. Aktivna konformacija jodopsina razpade veliko hitreje v primerjavi z rodopsinom in tudi sam potek regeneracije je pri jodopsinih hitrejši. Vzrok za to bi lahko bila različna usoda desenzibiliziranih receptorjev. Nedavno so odkrili možnost, da pri regeneraciji jodopsinov pride do preusmeritve signalne poti. Namesto, da se receptor deaktivira preko internalizacije z arestinom, ostane v membrani in veže ligand glede na prehodno konformacijsko stanje v katerem se nahaja. Na različen potek regeneracije jodopsinov bi lahko vplivala tudi vezava druge molekule retinala v alosterično mesto, ki je posledica konformacijskih sprememb. Povezava med interakcijo retinala in njegovih analogov z določenim konformacijskim intermediatom ima pomembno vlogo tudi s terapevtskega vidika, saj GPCR-ji v splošnem predstavljajo terapevtske tarče za zdravljenje mnogih obolenj. Uporaba analogov 11-cis-retinala, kot sta 9CR in 6mr, ki se vežeta v aktivno ali eno od alosteričnih mest, bi lahko predstavljala učinkovit pristop pri zdravljenju prirojenih mutacij v fotoreceptorjih.<br /> <br /> ==Eva Vene - Povezava bolečine z vezavo kapsaicina na TRPV1==<br /> <br /> Družina TRP kanalčkov pri živalih združuje devet manjših skupin kationskih prenašalcev, ki odločilno vplivajo na pravilno delovanje organizma. Eden od tovrstnih kanalčkov je tudi TRPV1 z angleškim imenom »transient receptor potential vanilloid 1«. Tega najdemo v mnogih organih in organskih sistemih, natančneje pa se v tem seminarju osredotočamo na njegovo vlogo v perifernem živčevju. TRPV1 vsebuje okoli polovica vseh somatskih in visceralnih senzoričnih nevronov, zato je pomemben mediator pri nocicepciji oziroma zaznavanju možno nevarnih stimulov ter njihovim prevodom v akcijskih potencial. Njegovo delovanje, poleg nekaterih drugih dražljajev, lahko vzbudi organska molekula, imenovana kapsaicin. Slednjega najdemo v sadežih rastlin rodu Capsicum in ga pojmujemo kot eno odločilnih molekul za pekoč okus teh plodov. Ob vezavi kapsaicina na TRPV1 v celico vdrejo kationi, ki spodbudijo različne celične procese, ključne za oblikovanje in prenos živčnega signala do možganov ter pojav vnetja. Posebej zanimive so dvolične posledice vezave kapsaicina, ki sicer vodijo do bolečine, draženja in vnetja, a omogočijo tudi refrakcijsko dobo kanalčka, ki predstavlja čas, ko slednjega ne moremo aktivirati ter desenzitacijo in degradacijo živčnih vlaken, kar povezujemo z analgetičnim učinkom te molekule. Ob redni daljši izpostavitvi kapsaicinu, ki ga lahko administriramo transdermalno ali injiciramo, se tako uspešno uporablja pri lajšanju kroničnih bolečin.<br /> <br /> ==Erik Putar - AMPK: senzor glukoze ter celičnega energijskega stanja ==<br /> <br /> Celica uporablja z AMP aktivirano protein kinazo (AMPK) kot senzor celičnega energijskega stanja in glukoze. Njen glavni aktivator je AMP, ki promovira fosforilacijo Thr172 na AMPK, inhibira defosforilacijo fosforiliranega Thr172 ter alosterično aktivira AMPK. Aktivacija AMPK poteče že ob majhem energijskem deficitu in sproži regulatorni odgovor, ki preusmeri celični metabolizem iz anabolizma v katabolizem. Fosforilacija Thr172 poteče preko kinaze LKB1, medtem ko sta glikogen sintaza in acetil koencim A karboksilaza (ACC) dve tarči izmed mnogih kinazne aktivnosti AMPK. AMPK je heterotrimer sestavljen iz podenot α, β in γ. V α podenoti je prisotno kinazno aktivno mesto ter Thr172, medtem ko so na γ podenoti prisotna vezavna mesta za adenin nukleotide. β podenota je miristilirana na svojem N koncu, kar je ključnega pomena za delovanje glukoznega senzorja. Ta mehanizem poteka na lizosomih in sicer s tvorbo velikega kompleksa, ki vsebuje aldolazo, v-ATPazo, Ragulator, AXIN, LKB1 ter AMPK. Aldolaza je sicer tista, ki čuti prisotnost glukoze in to preko fruktoze 1,6-bisfosfata (FBP): odsotnost FBP v njenem aktivnem mestu aktivira AMPK neodvisno od razmerja koncentracijah adenin nukleotidov in tako preusmeri celico iz glikolitične v alternativne oksidativne poti.<br /> <br /> ==Timotej Sotošek - Regulacija mišičnega glikogena: granule in njeni proteini ==<br /> <br /> Glikogen je primarna oblika shranjevanja glukoze, ki je hitra in dostopna oblika energije. Kljub njegovi pomembnosti pa procesi regulacije glikogena še vedno niso popolnoma jasni. Metabolizem glikogena je zelo reguliran, hkrati pa dinamičen. Kako se bo metabolizem glikogena usmeril, je odvisno od mnogih dejavnikov. Zaloge glikogena v skeletnih mišicah so razdeljena na tri območja: podsarkomerno, intermiofibrilarno in intramiofibrilarno. Vsako od teh območij ima drugačno funkcijo v celici in temu primerno vsaka zase regulira sintezo in razgradnjo glikogenskih granul. Vsaka granula glikogena pa je sposobna tudi samostojnega izvajanja regulacije, pri kateri sodelujejo različni proteini. Eden pomembnejših je protein fosfataza 1 (PP1), ki nadzoruje aktivnost ključnih encimov, kot so glikogen sintaza (GS) in glikogen fosforilaza (GP), pri tem pa mu pomaga glikogen tarčni protein (PTG), ki deluje kot ogrodni protein med PP1 in drugimi proteini. Ta proces je reguliran preko kompleksa laforin-malin, ki prekine povezavo med PP1 in PTG. V seminarju so predstavljene naloge in lastnosti glikogena v treh oddelkih znotraj skeletnih mišic. Predstavljen bo vpliv, ki ga imajo našteti proteini na sintezo glikogena, podrobnejši opis naloge, zgradbe proteinov laforina in malina, kako kompleks laforin-malin inhibira glikogen sintezo ter kakšne so posledice nedelovanja tega proteinskega kompleksa.<br /> <br /> ==Nika Tomsič - Acetil-CoA: glavni metabolit in sekundarni obveščevalec ==<br /> <br /> Acetil-CoA je eden glavnih metabolitov. Deluje kot mejna točka med glikolizo in Krebsovim ciklom. Poleg tega so pomembne tudi njegove naloge kot sekundarni obveščevalec. Nadzoruje ključne celične procese, vključno z energetsko presnovo, mitozo in avtofagijo, tako neposredno kot preko regulacije ekspresije genov. Acetil-CoA običajno nastane v mitohondrijskem matriksu iz piruvata ali kot posledica β-oksidacije dolge verige maščobnih kislin. Lahko pa nastane tudi v citosolu z oksidacijo aminokislin, etanola ali z delovanjem acetil-CoA sintetaze, ki združuje dve glavni komponenti: acetil in koencim A. Razmerje med koncentracijama v mitohondrijskem matriksu in v citosolu je vedno enako. Govorimo torej o nekem dinamičnem ravnotežju, ki ga omogočajo številni prenašalci. Mitohondrijska memebrana je sicer neprepustna za acetil-CoA, zato mora najprej zreagirati v drugo obliko, da lahko vstopa ali iztopa iz mitohondrija. V mitohondrij vstopa piruvat s pomočjo citrat – piruvatnih prenašalcev. Tu piruvat dehidrogenazni kompleks katalizira reakcijo v acetil-CoA. Ko pa je v mitohondriju preveč acetil-CoA, se lahko ta prenese v citosol ali jedro v obliki acetilkarnitina preko karnitinskega prenašalca. V citosolu se spet povrne v acetil-CoA in je lahko vir anabolizma maščobnih kislin ali aminokislin, v jedru pa je njegova funkcija acetiliranje histonov. To omogoči prepisovanje genskega materiala. Lahko pa tudi nadaljuje svojo pot v mitohondriju in vstopi v citratni cikel, kjer je prvi korak pretvorba v citrat preko citratnega sinteznega kompleksa.</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=BIO2_Seminar_2020&diff=17649 2020-10-26T15:04:01Z

<p>Nika Tomsič: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>= Biokemijski seminar =<br /> doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> {| {{table}}<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''ime in priimek'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''poglavje'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''naslov seminarja'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''recenzent 1'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''recenzent 2'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''datum oddaje'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''datum recenzije'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''datum predstavitve'''<br /> |-<br /> | Ajda Beltram||12||Zgradba in dinamika signalnih kompleksov GPCR||Luka Hafner||Tinkara Božič||16/10/20||19/10/20||21/10/20<br /> |-<br /> | Jan Bregar||12||Protein retinoblastoma||Nika Bedrač||Martin Stanonik||16/10/20||19/10/20||21/10/20<br /> |-<br /> | Anja Moškrič||12|| Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmiterjev||Srna Anastasovska||Luka Stanković||16/10/20||19/10/20||21/10/20<br /> |-<br /> | Gregor Strniša||12||Načini aktivacije GPCR||Manca Pirc||Ana Pervanja||23/10/20||26/10/20||28/10/20<br /> |-<br /> | Vid Dobrovoljc||12||Medsebojni vpliv signalnih poti na primeru RTK in GPCR signalnih poti||Maruša Sernc||Nika Banovšek||23/10/20||26/10/20||28/10/20<br /> |-<br /> | Nikola Janakievski||12||Selective androgen receptor modulators||Ajda Beltram||Aljaž Simonič||23/10/20||26/10/20||28/10/20<br /> |-<br /> | Rebeka Jerina||12||Kofein kot antagonist adenozinskih receptorjev||Jan Bregar||Luka Hafner||30/10/20||02/11/20||04/11/20<br /> |-<br /> | Eva Vene||12||Povezava bolečine z vezavo kapsaicina na TRPV1||Anja Moškrič||Nika Bedrač||30/10/20||02/11/20||04/11/20<br /> |-<br /> | Zala Perko||12||Mehanizmi vezave ligandov na vidne pigmente čepnic očesne mrežnice||Gregor Strniša||Srna Anastasovska||30/10/20||02/11/20||04/11/20<br /> |-<br /> | Erik Putar||14-15||||Nikola Janakievski||Manca Pirc||06/11/20||09/11/20||11/11/20<br /> |-<br /> | Iva Matić||14-15||||Rebeka Jerina||Maruša Sernc||06/11/20||09/11/20||11/11/20<br /> |-<br /> | Timotej Sotošek||14-15||||Eva Vene||Ajda Beltram||06/11/20||09/11/20||11/11/20<br /> |-<br /> | Nika Tomsič||16||Acetil-CoA in regulacija metabolizma||Zala Perko||Jan Bregar||13/11/20||16/11/20||18/11/20<br /> |-<br /> | Andrej Špenko||16||||Erik Putar||Anja Moškrič||13/11/20||16/11/20||18/11/20<br /> |-<br /> | Aleksandra Rauter||16||||Iva Matić||Gregor Strniša||13/11/20||16/11/20||18/11/20<br /> |-<br /> | Laura Unuk||17||||Timotej Sotošek||Nikola Janakievski||20/11/20||23/11/20||25/11/20<br /> |-<br /> | Stefanija Ivanova||17||||Nika Tomsič||Rebeka Jerina||20/11/20||23/11/20||25/11/20<br /> |-<br /> | Jakob Tomšič||17||||Andrej Špenko||Eva Vene||20/11/20||23/11/20||25/11/20<br /> |-<br /> | Neža Leskovar||18||||Aleksandra Rauter||Zala Perko||27/11/20||30/11/20||02/12/20<br /> |-<br /> | Luka Šegota||18||||Laura Unuk||Erik Putar||27/11/20||30/11/20||02/12/20<br /> |-<br /> | Nika Perko||18||||Stefanija Ivanova||Iva Matić||27/11/20||30/11/20||02/12/20<br /> |-<br /> | Ela Bizjak||19||||Jakob Tomšič||Timotej Sotošek||04/12/20||07/12/20||09/12/20<br /> |-<br /> | Bor Krajnik||19||||Neža Leskovar||Nika Tomsič||04/12/20||07/12/20||09/12/20<br /> |-<br /> | Maja Kobal||19||||Luka Šegota||Vid Dobrovoljc||04/12/20||07/12/20||09/12/20<br /> |-<br /> | Mateja Milošević||20||||Nika Perko||Andrej Špenko||11/12/20||14/12/20||16/12/20<br /> |-<br /> | Tinkara Božič||20||||Ela Bizjak||Aleksandra Rauter||11/12/20||14/12/20||16/12/20<br /> |-<br /> | Martin Stanonik||20||||Bor Krajnik||Laura Unuk||11/12/20||14/12/20||16/12/20<br /> |-<br /> | Luka Stanković||21||||Maja Kobal||Stefanija Ivanova||18/12/20||21/12/20||23/12/20<br /> |-<br /> | Ana Pervanja||21||||Mateja Milošević||Jakob Tomšič||18/12/20||21/12/20||23/12/20<br /> |-<br /> | Nika Banovšek||21||||Tinkara Božič||Neža Leskovar||18/12/20||21/12/20||23/12/20<br /> |-<br /> | Aljaž Simonič||22||||Martin Stanonik||Luka Šegota||23/12/20||28/12/20||30/12/20<br /> |-<br /> | Luka Hafner||22||||Luka Stanković||Ana Žagar||23/12/20||28/12/20||30/12/20<br /> |-<br /> | Ana Žagar||22||||Vid Dobrovoljc||Nika Perko||23/12/20||28/12/20||30/12/20<br /> |-<br /> | Nika Bedrač||23||||Ana Pervanja||Ela Bizjak||30/12/20||04/01/21||06/01/21<br /> |-<br /> | Srna Anastasovska||23||||Nika Banovšek||Bor Krajnik||30/12/20||04/01/21||06/01/21<br /> |-<br /> | Manca Pirc||23||||Aljaž Simonič||Maja Kobal||30/12/20||04/01/21||06/01/21<br /> |-<br /> | Maruša Sernc||23||||Ana Žagar||Mateja Milošević||08/01/21||11/01/21||13/01/21<br /> |}<br /> <br /> *številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada<br /> Razporeditev je začasna in se lahko še spremeni, načeloma pa se termini do vključno 18. poglavja ne bodo spreminjali. <br /> Prosim,da mi sporočite morebitne napake ali če vas nisem razporedil.<br /> <br /> == Gradivo za predavanja ==<br /> Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/<br /> username: bio2<br /> password: samozame<br /> <br /> ==Naloga==<br /> '''Vaša naloga za seminar je:&lt;br&gt;'''<br /> Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti &lt;font color=red&gt; pregledni &lt;/font&gt; članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].<br /> <br /> Za pripravo seminarja velja naslednje:&lt;br&gt;<br /> * [[BIO2 Povzetki seminarjev 2020|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom. <br /> * Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo &lt;font color=red&gt;2700 do 3000 besed &lt;/font&gt;, a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike, bolje več. &lt;font color=red&gt;Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. &lt;/font&gt;<br /> * Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].<br /> * Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].<br /> * Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20-25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.<br /> * Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v okviru celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].<br /> * Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.<br /> * Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx<br /> * 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)<br /> * 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx<br /> * &lt;font color=green&gt;312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši&lt;/font&gt;<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Citiranje virov==<br /> Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana &lt;font color=green&gt;zeleno&lt;/font&gt;.<br /> Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.<br /> Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;<br /> '''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;<br /> <br /> Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;<br /> Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;<br /> Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). <br /> <br /> '''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;<br /> &lt;font color=green&gt;Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.<br /> Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.&lt;/font&gt;<br /> <br /> Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;<br /> Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.<br /> <br /> Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;<br /> C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;<br /> <br /> V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica &quot;in&quot;. <br /> <br /> <br /> '''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;<br /> Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;<br /> strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;<br /> Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=TBK2020-seminar&diff=16108 2020-02-25T18:07:16Z

<p>Nika Tomsič: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>= Temelji biokemije- seminar =<br /> <br /> Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.<br /> <br /> Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita. <br /> Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.<br /> Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## &quot;##&quot; sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.<br /> Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> <br /> {| {{table}}<br /> {| border=&quot;1&quot; cellspacing=&quot;0&quot; style=&quot;border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;&quot; <br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Ime in priimek'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Naslov seminarja'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Povezava'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Rok za oddajo'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Rok za recenzijo'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum predstavitve'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 1'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 2'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 3'''<br /> |-<br /> | Anna Scott ||[[TBK2020_Povzetki_seminarjev#Anna_Scott:_Notting_Hill|Moj naslov v slovenščini, link pa kaže na povzetek]]||[https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm povezava] || 28.10. || 05.11. || 07.11. || r1 || r2 || r3<br /> |-<br /> | Lenka Stanković || Optimizirano antiangiogeno reprogramiranje tumorskega mikrookolja potencira imunoterapijo CD40 || https://www.pnas.org/content/117/1/541 || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Špela Došler || Zala Perko || Marija Dujaković<br /> |-<br /> | Ena Kartal || Kako celično staranje vodi do nevrodegeneracije || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200129174540.htm || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Jasmina Bešić || Ana Žagar || Neža Leskovar<br /> |-<br /> | Ema Kovačič ||Izpostavljenost ploda materinski mikrobioti || https://insight.jci.org/articles/view/127806 || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Nikola Janakievski || Karin Rak || Luka Hafner<br /> |-<br /> | Nika Tomsič || Pomembnost in delovanje sladkornega prenašalca PfHT1 v parazitu malarije || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200129131533.htm https://sci-hub.tw/10.1038/s41586-020-1963-z|| 24.02. || 27.02. || 03.03. || Maja Deutsch || Jakob Tomšič || Marigona Beqiraj<br /> |-<br /> | Sara Golob ||Vpliv virusa Herpesa simpleksa tipa 1 na razvoj Alzheimerjeve bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/10/181019100702.htm || 24.02. || 27.02. || 03.03. || Manca Pirc || Maja Kobal || Rebeka Jerina<br /> |-<br /> | Zala Puklavec ||Globoko učenje vodi do odkritja novih antibiotikov || https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(20)30102-1?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0092867420301021%3Fshowall%3Dtrue || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Nika Bedrač || Špela Došler || Zala Perko<br /> |-<br /> | Martin Stanonik || De novo pojavitev adapterskih membranskih proteinov iz timinsko bogatih genskih sekvenc || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218104740.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Ivana Trifunovska || Jasmina Bešić || Ana Žagar<br /> |-<br /> | Anja Moškrič || || || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Bor Krajnik || Nikola Janakievski || Karin Rak<br /> |-<br /> | Maša Mencigar || Izumrle celice preprečijo nezaželene imunske odzive || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200108123137.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Erik Putar || Maja Deutsch || Jakob Tomšič<br /> |-<br /> | Nevena Ješić || Lažne komunikacije med celicami vode v levkemijo || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200206144824.htm || 04.03. || 07.03. || 10.03. || Ela Bizjak || Manca Pirc || Maja Kobal<br /> |-<br /> | Nika Perko ||Kvasovke z inkapsuliranimi esencialnimi olji - naravi prijazen larvicid ||https://parasitesandvectors.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13071-019-3870-4 || 10.03. || 13.03. || 17.03. || Lenka Stanković || Nika Bedrač || Špela Došler<br /> |-<br /> | Timotej Sotošek || || || 10.03. || 13.03. || 17.03. || Ena Kartal || Ivana Trifunovska || Jasmina Bešić<br /> |-<br /> | Hana Glavnik || || || 10.03. || 13.03. || 17.03. || Ema Kovačič || Bor Krajnik || Nikola Janakievski<br /> |-<br /> | Klara Kočman || || || 10.03. || 13.03. || 17.03. || Nika Tomsič || Erik Putar || Maja Deutsch<br /> |-<br /> | Gaja Osojnik || || || 10.03. || 13.03. || 17.03. || Sara Golob || Ela Bizjak || Manca Pirc<br /> |-<br /> | Aleksandra Pajović || || || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Zala Puklavec || Lenka Stanković || Nika Bedrač<br /> |-<br /> | Aljaž Simonič || || || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Martin Stanonik || Ena Kartal || Ivana Trifunovska<br /> |-<br /> | Eva Ratajc || || || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Anja Moškrič || Ema Kovačič || Bor Krajnik<br /> |-<br /> | Lana Kores || || || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Maša Mencigar || Nika Tomsič || Erik Putar<br /> |-<br /> | Sara Borišek || || || 17.03. || 20.03. || 24.03. || Nevena Ješić || Sara Golob || Ela Bizjak<br /> |-<br /> | Jan Kogovšek || Preoblikovanje glia celic izboljša kratkoročni spomin in učenje || https://jneuroinflammation.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12974-020-1729-4 || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Nika Perko || Zala Puklavec || Lenka Stanković<br /> |-<br /> | Nina Žgajnar || || || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Timotej Sotošek || Martin Stanonik || Ena Kartal<br /> |-<br /> | Erika Rihter || || || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Hana Glavnik || Anja Moškrič || Ema Kovačič<br /> |-<br /> | Luka Šegota || || || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Klara Kočman || Maša Mencigar || Nika Tomsič<br /> |-<br /> | Eva Vene || || || 24.03. || 27.03. || 31.03. || Gaja Osojnik || Nevena Ješić || Sara Golob<br /> |-<br /> | Ajda Beltram || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Aleksandra Pajović || Nika Perko || Zala Puklavec<br /> |-<br /> | Jan Trebušak || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Aljaž Simonič || Timotej Sotošek || Martin Stanonik<br /> |-<br /> | Jan Bregar || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Eva Ratajc || Hana Glavnik || Anja Moškrič<br /> |-<br /> | Gregor Strniša || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Lana Kores || Klara Kočman || Maša Mencigar<br /> |-<br /> | Petra Pahor || || || 31.03. || 03.04. || 07.04. || Sara Borišek || Gaja Osojnik || Nevena Ješić<br /> |-<br /> | Nadja Dolničar || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Jan Kogovšek || Aleksandra Pajović || Nika Perko<br /> |-<br /> | Tina Javeršek || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Nina Žgajnar || Aljaž Simonič || Timotej Sotošek<br /> |-<br /> | Vid Dobrovoljc || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Erika Rihter || Eva Ratajc || Hana Glavnik<br /> |-<br /> | Tinkara Božič || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Luka Šegota || Lana Kores || Klara Kočman<br /> |-<br /> | Kostadin Mitkov || || || 08.04. || 11.04. || 14.04. || Eva Vene || Sara Borišek || Gaja Osojnik<br /> |-<br /> | Sara Jerič || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Ajda Beltram || Jan Kogovšek || Aleksandra Pajović<br /> |-<br /> | Polona Leban || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Jan Trebušak || Nina Žgajnar || Aljaž Simonič<br /> |-<br /> | Stefanija Ivanova || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Jan Bregar || Erika Rihter || Eva Ratajc<br /> |-<br /> | Luka Stanković || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Gregor Strniša || Luka Šegota || Lana Kores<br /> |-<br /> | Ana Pervanja || || || 15.04. || 18.04. || 21.04. || Petra Pahor || Eva Vene || Sara Borišek<br /> |-<br /> | Marija Dujaković || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Nadja Dolničar || Ajda Beltram || Jan Kogovšek<br /> |-<br /> | Neža Leskovar || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Tina Javeršek || Jan Trebušak || Nina Žgajnar<br /> |-<br /> | Luka Hafner || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Vid Dobrovoljc || Jan Bregar || Erika Rihter<br /> |-<br /> | Marigona Beqiraj || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Tinkara Božič || Gregor Strniša || Luka Šegota<br /> |-<br /> | Rebeka Jerina || || || 29.04. || 02.05. || 05.05. || Kostadin Mitkov || Petra Pahor || Eva Vene<br /> |-<br /> | Zala Perko || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Sara Jerič || Nadja Dolničar || Ajda Beltram<br /> |-<br /> | Ana Žagar || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Polona Leban || Tina Javeršek || Jan Trebušak<br /> |-<br /> | Karin Rak || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Stefanija Ivanova || Vid Dobrovoljc || Jan Bregar<br /> |-<br /> | Jakob Tomšič || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Luka Stanković || Tinkara Božič || Gregor Strniša<br /> |-<br /> | Maja Kobal || || || 06.05. || 09.05. || 12.05. || Ana Pervanja || Kostadin Mitkov || Petra Pahor<br /> |-<br /> | Špela Došler || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Marija Dujaković || Sara Jerič || Nadja Dolničar<br /> |-<br /> | Jasmina Bešić || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Neža Leskovar || Polona Leban || Tina Javeršek<br /> |-<br /> | Nikola Janakievski || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Luka Hafner || Stefanija Ivanova || Vid Dobrovoljc<br /> |-<br /> | Maja Deutsch || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Marigona Beqiraj || Luka Stanković || Tinkara Božič<br /> |-<br /> | Manca Pirc || || || 13.05. || 16.05. || 19.05. || Rebeka Jerina || Ana Pervanja || Kostadin Mitkov<br /> |-<br /> | Nika Bedrač || Nižji vnos beljakovin niža tveganje za razvoj kardiovaskularnih bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200203141501.htm || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Zala Perko || Marija Dujaković || Sara Jerič<br /> |-<br /> | Ivana Trifunovska || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Ana Žagar || Neža Leskovar || Polona Leban<br /> |-<br /> | Bor Krajnik || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Karin Rak || Luka Hafner || Stefanija Ivanova<br /> |-<br /> | Erik Putar || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Jakob Tomšič || Marigona Beqiraj || Luka Stanković<br /> |-<br /> | Ela Bizjak || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Maja Kobal || Rebeka Jerina || Ana Pervanja<br /> |}<br /> <br /> ==Naloga==<br /> * samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2018. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino. <br /> * članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].<br /> * naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo <br /> * [[TBK2020 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom. <br /> * Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!<br /> *Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).<br /> * Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].<br /> * vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].<br /> * Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 10 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.<br /> * Predstavitvi sledi razprava do 5 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.<br /> * En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.<br /> * Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!<br /> Poslati morate naslednje datoteke:<br /> * TBK_2020_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor.docx<br /> * TBK_2020_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja<br /> * TBK_2020_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)<br /> * TBK_2020_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2020_Guncar_Gregor.pptx<br /> * TBK_2020_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor_clanek.pdf<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Faktor vpliva==<br /> Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&amp;base=JCR COBISS-u]. V polje &quot;Naslov revije&quot; vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.<br /> <br /> ==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;'''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). &lt;br&gt;'''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).&lt;br&gt;'''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=TBK2020_Povzetki_seminarjev&diff=16099 2020-02-24T12:27:27Z

<p>Nika Tomsič: /* Nika Tomsič: Pomembnost in delovanje sladkornega prenašalca PfHT1 v parazitu malarije */</p> <hr /> <div>=== Anna Scott: Notting Hill ===<br /> William Thacker (Hugh Grant) is a London bookstore owner whose humdrum existence is thrown into romantic turmoil when famous American actress Anna Scott (Julia Roberts) appears in his shop. A chance encounter over spilled orange juice leads to a kiss that blossoms into a full-blown affair. As the average bloke and glamorous movie star draw closer and closer together, they struggle to reconcile their radically different lifestyles in the name of love.<br /> <br /> === Sara Golob: Vpliv virusa Herpesa simpleksa tipa 1 na razvoj Alzheimerjeve bolezni ===<br /> <br /> Pri Alzheimerjevi bolezni pride do padca kognitivnih funkcij, kot so spomin, govor, pozornost, učenje, itd. Razvije se zaradi različnih dejavnikov, ki so lahko dedni ali okoljski. Eden od okoljskih dejavnikov je okužba z virusom Herpes simpleks tip 1. Ta povzroči večje izražanje ε4 alela apolipoproteina E, ki povzroča nalaganje Tau proteina in amiloida beta, ki sestavljata senilne plake pri Alzheimerjevi bolezni. To povezavo so odkrili s protitelesi proti virusu Herpes simpleks tipa 1 ter preko lizosomske okvare, zaradi katere pride do nalaganja amiloida beta v možganih. Dokazana je bila tudi povezava med Alzheimerjevo boleznijo in drugimi boleznimi (epilepsija, demenca, shizofrenija, fibromialgija, demenca), pri katerih je opazna kognitivna disfunkcija. Pri bolnikih z epilepsijo so odkrili amiloidne plake, ki so značilni za Alzheimerjevo bolezen, zaradi česar je večja verjetnost, da oboleli za epilepsijo zbolijo še za Alzheimerjevo boleznijo in obratno. Herpes simpleks virus redko povzroča tudi akutni encefalitis, katerega posledica so epileptični napadi, izguba spomina in spremembe v vedenju. Zato znanstveniki menijo, da je povezava med epilepsijo in Alzheimerjevo boleznijo tudi v apolipoproteinu E.<br /> <br /> === Ena Kartal: Kako celično staranje vodi do nevrodegeneracije ===<br /> Čeprav je bila vzpostavljena povezava med kroničnim vnetjem in nevrodegenerativnimi boleznimi, je bilo veliko odprtih vprašanj v zvezi s tem, kako celično staranje, proces, pri katerem celice, ki se nehajo deliti pod stresom, izločijo mešanico vnetnih beljakovin, vplivajo na te patologije. Raziskovalci poročajo, da staranje v astrocitih, ki je najbolj razširjena vrsta celic v možganih, vodi do škodljive '' ekscitotoksičnosti '' na kortikalnih nevronih, ki so vključeni v spomin.In pri tem pride do Alzheimerjeve bolezni,ki je najpogostejši vzrok demence pri starejših, je nepopravljiva, napredujoča možganska motnja, ki ubija možganske celice in postopoma uničuje spomin.<br /> <br /> === Lenka Stanković: Optimizirano antiangiogeno reprogramiranje tumorskega mikrookolja potencira imunoterapijo CD40 ===<br /> <br /> Karakteristika raka je njegova sposobnost spodbujanja angiogeneze, oziroma tvorba novih krvnih žil. Angiogeneza prispeva k rasti in napredovanju tumorja z induciranjem in vzdrževanjem kislega / hipoksičnega in imunosupresivnega okolja. Krvne žile v rakih so pogosto nefunkcionalne in omejujejo promet s T-celicami. Odkritje angiogenih zaviralcev naj bi pripomoglo k zmanjšanju umrljivosti zaradi karcinomov. Imunoterapija proti raku kaže klinično učinkovitost pri izabranih vrstah raka. Ker pa se večina bolnikov ne odziva na najbolj učinkovite imunoterapije, so nove kombinacije imunoterapije obsežno raziskovane. Klinično je zanimanje za kombiniranje imunoterapije raka z antiangiogenim provzročitelji. Tukaj prikazujemo, da imunoterapija proti CD40 poveča tumorsko infiltracijo CD8+T, vendar regresijo tumorja dosežemo močneje, če anti-CD40 kombinirano z dvojno blokado Ang2 in VEGFA. Kombinacija anti-VEGFA, anti-Ang2 in agonističkih protiteles proti anti-CD40 omogoča zavrnitev tumorjev pri sintetičnih modelih tumorjev. Proučevali so odzive tumorjev na anti-VEGFA, anti-Ang2 in agonistična protitelesa proti CD40 v različnih modelih mišjega raka. V raziskavi so pokazali, da kombinacija agonističnih protiteles CD40 z dvojno blokado VEGFA/Ang2 povečuje protitumorski odziv v modelnih raka miši s pomočjo sinergistične regulacije genov in indukcije imunskega permisivnega mikrookruženja tumorja, za katero je značilno provnetno (M1 podobno) aktivacijo makrofagov, vaskularno normalizacija ter izboljšanja infiltracije in prostorska lokalizacija efektorskih T-celic. T-celice pošljejo signale drugim vrstam imunskih celic, vključno s citotoksičnimi T celicami CD8+. Citotoksične T-celice, znane tudi kot CD8 + T-celice, izražajo svoje TCR, ki jih spremlja glikoprotein CD8. CD8 + T-celice so vrsta belih krvnih celic, ki so povezane z učinkovitim ubijanjem rakavih celic: med antigensko specifično aktivacijo afiniteta med CD8 glikoproteinom, izraženim s celico CD8 + T, in molekulo MHC razreda I, izraženo z rakavo celico, ohranja obe vrsti celic skupaj. Tesna vezava T celic in rakavih celic skozi kompleks CD8 / TCR in kompleks antigen / MHC-I povzroči, da celice CD8 + T izločajo perforin in grancime, kar vodi v lizo rakavih celic.<br /> <br /> === Nika Tomsič: Pomembnost in delovanje sladkornega prenašalca PfHT1 v parazitu malarije ===<br /> Po oceni World Health Organisation- World malaria report 2019 je v letu 2018 bilo 228 milijonov primerov malarije. Sladkor je glavni vir energije parazita, zato je razumevanje presnove sladkorjev pomembna tema, ki bi lahko predstavljala pomoč pri sestavljanju zdravil in izrivanju tega parazita. Glavna razlika v presnovi sladkorjev med parazitom in drugimi organizmi je prenašalec, ki sladkorje prenaša v celico. Za to je odgovoren šeskotni prenašalec PfHT1, ki je sposoben transportirati bodisi glukozo kot fruktozo. Strukturno pa je zelo podoben prenašalcem človeške celice GLUT. Prenašalec obsega 12 transmembranskih vijačnic, ki tvorijo osrednjo pot za vstop glukoze. Ključni del proteina pa predstavljajo izrastki ki delujejo kot receptorji za sladkorje. Sladkorne prenašalce še nadaljnjo stabilizirajo solne medcelične povezave. Druga velika razlika med PfHT1 in drugimi prenašalci je brez dvoma način odpiranja in zapiranja prenašalca, saj ni sestavljenen samo iz treh običajnih stanj (odprto navznoter, zaprto, odprto navznoter), temveč ga zaznamujejo še dve vmesni stanji (zaprto navznoter in zaprto navzven, angl. inward–occluded in outward-occluded). Nadaljnjo raziskovanje bi torej lahko omogočilo razvoja novih antimalaričnih zdravil, ki blokirajo uvoz sladkorja in zastrašujejo parazita do smrti oz. razvoja novih zaviralcev, ki so bolj specifični za blokiranje funkcije PfHT1, ne da bi pri tem vplivali na transport sladkorja v človeških celicah.</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=TBK2020-seminar&diff=16097 2020-02-23T22:37:11Z

<p>Nika Tomsič: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>= Temelji biokemije- seminar =<br /> <br /> Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.<br /> <br /> Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita. <br /> Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.<br /> Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## &quot;##&quot; sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.<br /> Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> <br /> {| {{table}}<br /> {| border=&quot;1&quot; cellspacing=&quot;0&quot; style=&quot;border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;&quot; <br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Ime in priimek'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Naslov seminarja'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Povezava'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Rok za oddajo'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Rok za recenzijo'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum predstavitve'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 1'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 2'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 3'''<br /> |-<br /> | Anna Scott ||[[TBK2020_Povzetki_seminarjev#Anna_Scott:_Notting_Hill|Moj naslov v slovenščini, link pa kaže na povzetek]]||[https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm povezava] || 28.10. || 05.11. || 07.11. || r1 || r2 || r3<br /> |-<br /> | Lenka Stanković || Optimizirano antiangiogeno reprogramiranje tumorskega mikrookolja potencira imunoterapijo CD40 || https://www.pnas.org/content/117/1/541 || 24.02. || 27.02. || 02.03. || Špela Došler || Zala Perko || Marija Dujaković<br /> |-<br /> | Ena Kartal || Kako celično staranje vodi do nevrodegeneracije || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200129174540.htm || 24.02. || 27.02. || 02.03. || Jasmina Bešić || Ana Žagar || Neža Leskovar<br /> |-<br /> | Ema Kovačič ||Izpostavljenost ploda materinski mikrobioti || https://insight.jci.org/articles/view/127806 || 24.02. || 27.02. || 02.03. || Nikola Janakievski || Karin Rak || Luka Hafner<br /> |-<br /> | Nika Tomsič || Pomembnost in delovanje sladkornega prenašalca PfHT1 v parazitu malarije || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200129131533.htm http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2020_Povzetki_seminarjev#Nika_Tomsi.C4.8D:_Pomembnost_in_delovanje_sladkornega_prena.C5.A1alca_PfHT1_v_parazitu_malarije || 24.02. || 27.02. || 02.03. || Maja Deutsch || Jakob Tomšič || Marigona Beqiraj<br /> |-<br /> | Sara Golob ||Vpliv virusa Herpesa simpleksa tipa 1 na razvoj Alzheimerjeve bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/10/181019100702.htm || 24.02. || 27.02. || 02.03. || Manca Pirc || Maja Kobal || Rebeka Jerina<br /> |-<br /> | Zala Puklavec || || || 03.03. || 06.03. || 09.03. || Nika Bedrač || Špela Došler || Zala Perko<br /> |-<br /> | Martin Stanonik || Geni iz ničesar: Veliko bolj pogosti in pomembni kot smo mislili || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218104740.htm || 03.03. || 06.03. || 09.03. || Ivana Trifunovska || Jasmina Bešić || Ana Žagar<br /> |-<br /> | Anja Moškrič || || || 03.03. || 06.03. || 09.03. || Bor Krajnik || Nikola Janakievski || Karin Rak<br /> |-<br /> | Maša Mencigar || Odkritje specifičnih nevronov za spomin ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/11/191112095740.htm || 03.03. || 06.03. || 09.03. || Erik Putar || Maja Deutsch || Jakob Tomšič<br /> |-<br /> | Nevena Ješić || || || 03.03. || 06.03. || 09.03. || Ela Bizjak || Manca Pirc || Maja Kobal<br /> |-<br /> | Nika Perko || || || 10.03. || 13.03. || 16.03. || Lenka Stanković || Nika Bedrač || Špela Došler<br /> |-<br /> | Timotej Sotošek || || || 10.03. || 13.03. || 16.03. || Ena Kartal || Ivana Trifunovska || Jasmina Bešić<br /> |-<br /> | Hana Glavnik || || || 10.03. || 13.03. || 16.03. || Ema Kovačič || Bor Krajnik || Nikola Janakievski<br /> |-<br /> | Klara Kočman || || || 10.03. || 13.03. || 16.03. || Nika Tomsič || Erik Putar || Maja Deutsch<br /> |-<br /> | Gaja Osojnik || || || 10.03. || 13.03. || 16.03. || Sara Golob || Ela Bizjak || Manca Pirc<br /> |-<br /> | Aleksandra Pajović || || || 17.03. || 20.03. || 23.03. || Zala Puklavec || Lenka Stanković || Nika Bedrač<br /> |-<br /> | Aljaž Simonič || || || 17.03. || 20.03. || 23.03. || Martin Stanonik || Ena Kartal || Ivana Trifunovska<br /> |-<br /> | Eva Ratajc || || || 17.03. || 20.03. || 23.03. || Anja Moškrič || Ema Kovačič || Bor Krajnik<br /> |-<br /> | Lana Kores || || || 17.03. || 20.03. || 23.03. || Maša Mencigar || Nika Tomsič || Erik Putar<br /> |-<br /> | Sara Borišek || || || 17.03. || 20.03. || 23.03. || Nevena Ješić || Sara Golob || Ela Bizjak<br /> |-<br /> | Jan Kogovšek || Preoblikovanje glia celic izboljša kratkoročni spomin in učenje || https://jneuroinflammation.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12974-020-1729-4 || 24.03. || 27.03. || 30.03. || Nika Perko || Zala Puklavec || Lenka Stanković<br /> |-<br /> | Nina Žgajnar || || || 24.03. || 27.03. || 30.03. || Timotej Sotošek || Martin Stanonik || Ena Kartal<br /> |-<br /> | Erika Rihter || || || 24.03. || 27.03. || 30.03. || Hana Glavnik || Anja Moškrič || Ema Kovačič<br /> |-<br /> | Luka Šegota || || || 24.03. || 27.03. || 30.03. || Klara Kočman || Maša Mencigar || Nika Tomsič<br /> |-<br /> | Eva Vene || || || 24.03. || 27.03. || 30.03. || Gaja Osojnik || Nevena Ješić || Sara Golob<br /> |-<br /> | Ajda Beltram || || || 31.03. || 03.04. || 06.04. || Aleksandra Pajović || Nika Perko || Zala Puklavec<br /> |-<br /> | Jan Trebušak || || || 31.03. || 03.04. || 06.04. || Aljaž Simonič || Timotej Sotošek || Martin Stanonik<br /> |-<br /> | Jan Bregar || || || 31.03. || 03.04. || 06.04. || Eva Ratajc || Hana Glavnik || Anja Moškrič<br /> |-<br /> | Gregor Strniša || || || 31.03. || 03.04. || 06.04. || Lana Kores || Klara Kočman || Maša Mencigar<br /> |-<br /> | Petra Pahor || || || 31.03. || 03.04. || 06.04. || Sara Borišek || Gaja Osojnik || Nevena Ješić<br /> |-<br /> | Nadja Dolničar || || || 14.04. || 17.04. || 20.04. || Jan Kogovšek || Aleksandra Pajović || Nika Perko<br /> |-<br /> | Tina Javeršek || || || 14.04. || 17.04. || 20.04. || Nina Žgajnar || Aljaž Simonič || Timotej Sotošek<br /> |-<br /> | Vid Dobrovoljc || || || 14.04. || 17.04. || 20.04. || Erika Rihter || Eva Ratajc || Hana Glavnik<br /> |-<br /> | Tinkara Božič || || || 14.04. || 17.04. || 20.04. || Luka Šegota || Lana Kores || Klara Kočman<br /> |-<br /> | Kostadin Mitkov || || || 14.04. || 17.04. || 20.04. || Eva Vene || Sara Borišek || Gaja Osojnik<br /> |-<br /> | Sara Jerič || || || 28.04. || 30.04. || 04.05. || Ajda Beltram || Jan Kogovšek || Aleksandra Pajović<br /> |-<br /> | Polona Leban || || || 28.04. || 30.04. || 04.05. || Jan Trebušak || Nina Žgajnar || Aljaž Simonič<br /> |-<br /> | Stefanija Ivanova || || || 28.04. || 30.04. || 04.05. || Jan Bregar || Erika Rihter || Eva Ratajc<br /> |-<br /> | Luka Stanković || || || 28.04. || 30.04. || 04.05. || Gregor Strniša || Luka Šegota || Lana Kores<br /> |-<br /> | Ana Pervanja || || || 28.04. || 30.04. || 04.05. || Petra Pahor || Eva Vene || Sara Borišek<br /> |-<br /> | Marija Dujaković || || || 05.05. || 08.05. || 11.05. || Nadja Dolničar || Ajda Beltram || Jan Kogovšek<br /> |-<br /> | Neža Leskovar || || || 05.05. || 08.05. || 11.05. || Tina Javeršek || Jan Trebušak || Nina Žgajnar<br /> |-<br /> | Luka Hafner || || || 05.05. || 08.05. || 11.05. || Vid Dobrovoljc || Jan Bregar || Erika Rihter<br /> |-<br /> | Marigona Beqiraj || || || 05.05. || 08.05. || 11.05. || Tinkara Božič || Gregor Strniša || Luka Šegota<br /> |-<br /> | Rebeka Jerina || || || 05.05. || 08.05. || 11.05. || Kostadin Mitkov || Petra Pahor || Eva Vene<br /> |-<br /> | Zala Perko || || || 12.05. || 15.05. || 18.05. || Sara Jerič || Nadja Dolničar || Ajda Beltram<br /> |-<br /> | Ana Žagar || || || 12.05. || 15.05. || 18.05. || Polona Leban || Tina Javeršek || Jan Trebušak<br /> |-<br /> | Karin Rak || || || 12.05. || 15.05. || 18.05. || Stefanija Ivanova || Vid Dobrovoljc || Jan Bregar<br /> |-<br /> | Jakob Tomšič || || || 12.05. || 15.05. || 18.05. || Luka Stanković || Tinkara Božič || Gregor Strniša<br /> |-<br /> | Maja Kobal || || || 12.05. || 15.05. || 18.05. || Ana Pervanja || Kostadin Mitkov || Petra Pahor<br /> |-<br /> | Špela Došler || || || 19.05. || 22.05. || 25.05. || Marija Dujaković || Sara Jerič || Nadja Dolničar<br /> |-<br /> | Jasmina Bešić || || || 19.05. || 22.05. || 25.05. || Neža Leskovar || Polona Leban || Tina Javeršek<br /> |-<br /> | Nikola Janakievski || || || 19.05. || 22.05. || 25.05. || Luka Hafner || Stefanija Ivanova || Vid Dobrovoljc<br /> |-<br /> | Maja Deutsch || || || 19.05. || 22.05. || 25.05. || Marigona Beqiraj || Luka Stanković || Tinkara Božič<br /> |-<br /> | Manca Pirc || || || 19.05. || 22.05. || 25.05. || Rebeka Jerina || Ana Pervanja || Kostadin Mitkov<br /> |-<br /> | Nika Bedrač || Nižji vnos beljakovin niža tveganje za razvoj kardiovaskularnih bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200203141501.htm || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Zala Perko || Marija Dujaković || Sara Jerič<br /> |-<br /> | Ivana Trifunovska || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Ana Žagar || Neža Leskovar || Polona Leban<br /> |-<br /> | Bor Krajnik || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Karin Rak || Luka Hafner || Stefanija Ivanova<br /> |-<br /> | Erik Putar || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Jakob Tomšič || Marigona Beqiraj || Luka Stanković<br /> |-<br /> | Ela Bizjak || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Maja Kobal || Rebeka Jerina || Ana Pervanja<br /> |}<br /> <br /> ==Naloga==<br /> * samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2018. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino. <br /> * članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].<br /> * naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo <br /> * [[TBK2020 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom. <br /> * Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!<br /> *Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).<br /> * Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].<br /> * vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].<br /> * Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 10 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.<br /> * Predstavitvi sledi razprava do 5 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.<br /> * En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.<br /> * Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!<br /> Poslati morate naslednje datoteke:<br /> * TBK_2020_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor.docx<br /> * TBK_2020_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja<br /> * TBK_2020_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)<br /> * TBK_2020_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2020_Guncar_Gregor.pptx<br /> * TBK_2020_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor_clanek.pdf<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Faktor vpliva==<br /> Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&amp;base=JCR COBISS-u]. V polje &quot;Naslov revije&quot; vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.<br /> <br /> ==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;'''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). &lt;br&gt;'''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).&lt;br&gt;'''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=TBK2020_Povzetki_seminarjev&diff=16096 2020-02-23T22:36:35Z

<p>Nika Tomsič: /* Nika Tomsič: Pomembnost in delovanje sladkornega prenašalca PfHT1 v parazitu malarije */</p> <hr /> <div>=== Anna Scott: Notting Hill ===<br /> William Thacker (Hugh Grant) is a London bookstore owner whose humdrum existence is thrown into romantic turmoil when famous American actress Anna Scott (Julia Roberts) appears in his shop. A chance encounter over spilled orange juice leads to a kiss that blossoms into a full-blown affair. As the average bloke and glamorous movie star draw closer and closer together, they struggle to reconcile their radically different lifestyles in the name of love.<br /> <br /> === Sara Golob: Vpliv virusa Herpesa simpleksa tipa 1 na razvoj Alzheimerjeve bolezni ===<br /> <br /> Pri Alzheimerjevi bolezni pride do padca kognitivnih funkcij, kot so spomin, govor, pozornost, učenje, itd. Razvije se zaradi različnih dejavnikov, ki so lahko dedni ali okoljski. Eden od okoljskih dejavnikov je okužba z virusom Herpes simpleks tip 1. Ta povzroči večje izražanje ε4 alela apolipoproteina E, ki povzroča nalaganje Tau proteina in amiloida beta, ki sestavljata senilne plake pri Alzheimerjevi bolezni. To povezavo so odkrili s protitelesi proti virusu Herpes simpleks tipa 1 ter preko lizosomske okvare, zaradi katere pride do nalaganja amiloida beta v možganih. Dokazana je bila tudi povezava med Alzheimerjevo boleznijo in drugimi boleznimi (epilepsija, demenca, shizofrenija, fibromialgija, demenca), pri katerih je opazna kognitivna disfunkcija. Pri bolnikih z epilepsijo so odkrili amiloidne plake, ki so značilni za Alzheimerjevo bolezen, zaradi česar je večja verjetnost, da oboleli za epilepsijo zbolijo še za Alzheimerjevo boleznijo in obratno. Herpes simpleks virus redko povzroča tudi akutni encefalitis, katerega posledica so epileptični napadi, izguba spomina in spremembe v vedenju. Zato znanstveniki menijo, da je povezava med epilepsijo in Alzheimerjevo boleznijo tudi v apolipoproteinu E.<br /> <br /> === Ena Kartal: Kako celično staranje vodi do nevrodegeneracije ===<br /> Čeprav je bila vzpostavljena povezava med kroničnim vnetjem in nevrodegenerativnimi boleznimi, je bilo veliko odprtih vprašanj v zvezi s tem, kako celično staranje, proces, pri katerem celice, ki se nehajo deliti pod stresom, izločijo mešanico vnetnih beljakovin, vplivajo na te patologije. Raziskovalci poročajo, da staranje v astrocitih, ki je najbolj razširjena vrsta celic v možganih, vodi do škodljive '' ekscitotoksičnosti '' na kortikalnih nevronih, ki so vključeni v spomin.In pri tem pride do Alzheimerjeve bolezni,ki je najpogostejši vzrok demence pri starejših, je nepopravljiva, napredujoča možganska motnja, ki ubija možganske celice in postopoma uničuje spomin.<br /> <br /> === Lenka Stanković: Optimizirano antiangiogeno reprogramiranje tumorskega mikrookolja potencira imunoterapijo CD40 ===<br /> <br /> Karakteristika raka je njegova sposobnost spodbujanja angiogeneze, oziroma tvorba novih krvnih žil. Angiogeneza prispeva k rasti in napredovanju tumorja z induciranjem in vzdrževanjem kislega / hipoksičnega in imunosupresivnega okolja. Krvne žile v rakih so pogosto nefunkcionalne in omejujejo promet s T-celicami. Odkritje angiogenih zaviralcev naj bi pripomoglo k zmanjšanju umrljivosti zaradi karcinomov. Imunoterapija proti raku kaže klinično učinkovitost pri izabranih vrstah raka. Ker pa se večina bolnikov ne odziva na najbolj učinkovite imunoterapije, so nove kombinacije imunoterapije obsežno raziskovane. Klinično je zanimanje za kombiniranje imunoterapije raka z antiangiogenim provzročitelji. Tukaj prikazujemo, da imunoterapija proti CD40 poveča tumorsko infiltracijo CD8+T, vendar regresijo tumorja dosežemo močneje, če anti-CD40 kombinirano z dvojno blokado Ang2 in VEGFA. Kombinacija anti-VEGFA, anti-Ang2 in agonističkih protiteles proti anti-CD40 omogoča zavrnitev tumorjev pri sintetičnih modelih tumorjev. Proučevali so odzive tumorjev na anti-VEGFA, anti-Ang2 in agonistična protitelesa proti CD40 v različnih modelih mišjega raka. V raziskavi so pokazali, da kombinacija agonističnih protiteles CD40 z dvojno blokado VEGFA/Ang2 povečuje protitumorski odziv v modelnih raka miši s pomočjo sinergistične regulacije genov in indukcije imunskega permisivnega mikrookruženja tumorja, za katero je značilno provnetno (M1 podobno) aktivacijo makrofagov, vaskularno normalizacija ter izboljšanja infiltracije in prostorska lokalizacija efektorskih T-celic. T-celice pošljejo signale drugim vrstam imunskih celic, vključno s citotoksičnimi T celicami CD8+. Citotoksične T-celice, znane tudi kot CD8 + T-celice, izražajo svoje TCR, ki jih spremlja glikoprotein CD8. CD8 + T-celice so vrsta belih krvnih celic, ki so povezane z učinkovitim ubijanjem rakavih celic: med antigensko specifično aktivacijo afiniteta med CD8 glikoproteinom, izraženim s celico CD8 + T, in molekulo MHC razreda I, izraženo z rakavo celico, ohranja obe vrsti celic skupaj. Tesna vezava T celic in rakavih celic skozi kompleks CD8 / TCR in kompleks antigen / MHC-I povzroči, da celice CD8 + T izločajo perforin in grancime, kar vodi v lizo rakavih celic.<br /> <br /> === Nika Tomsič: Pomembnost in delovanje sladkornega prenašalca PfHT1 v parazitu malarije ===<br /> Po oceni World Health Organisation- World malaria report 2019 je v letu 2018 bilo 228 milijonov primerov malarije. Sladkor je glavni vir energije parazita, zato je razumevanje presnove sladkorjev pomembna tema, ki bi lahko predstavljala pomoč pri sestavljanju zdravljenju in izrivanju tega parazita. Glavna razlika v presnovi sladkorjev med parazitom in drugimi organizmi je prenašalec, ki sladkorje prenaša v celico. Za to je odgovoren šeskotni prenašalec PfHT1, ki je sposoben transportirati bodisi glukozo kot fruktozo. Strukturno pa je zelo podoben prenašalcem človeške celice GLUT. Prenašalec obsega 12 transmembranskih vijačnic, ki tvorijo osrednjo pot za vstop glukoze. Ključni del proteina pa predstavljajo izrastki ki delujejo kot receptorji za sladkorje. Sladkorne prenašalce še nadaljno stabilizirajo solne medcelične povezave. Druga velika razlika med PfHT1 in drugimi prenašalci je brez dvoma način odpiranja in zapiranja prenašalca, saj ni sestavljenen samo iz treh običajnih stanj (odprto navznoter, zaprto, odprto navznoter), temveč ga zaznamujejo še dve vmesni stanji (zaprto navznoter in zaprto navzven, angl. inward – occluded in outward - occluded). Nadaljnjo raziskovanje bi torej lahko omogočilo razvoja novih antimalaričnih zdravil, ki blokirajo uvoz sladkorja in zastrašujejo parazita do smrti oz. razvoja novih zaviralcev, ki so bolj specifični za blokiranje funkcije PfHT1, ne da bi pri tem vplivali na transport sladkorja v človeških celicah.</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=TBK2020_Povzetki_seminarjev&diff=16095 2020-02-23T22:36:03Z

<p>Nika Tomsič: /* Ime Priimek: Naslov */</p> <hr /> <div>=== Anna Scott: Notting Hill ===<br /> William Thacker (Hugh Grant) is a London bookstore owner whose humdrum existence is thrown into romantic turmoil when famous American actress Anna Scott (Julia Roberts) appears in his shop. A chance encounter over spilled orange juice leads to a kiss that blossoms into a full-blown affair. As the average bloke and glamorous movie star draw closer and closer together, they struggle to reconcile their radically different lifestyles in the name of love.<br /> <br /> === Sara Golob: Vpliv virusa Herpesa simpleksa tipa 1 na razvoj Alzheimerjeve bolezni ===<br /> <br /> Pri Alzheimerjevi bolezni pride do padca kognitivnih funkcij, kot so spomin, govor, pozornost, učenje, itd. Razvije se zaradi različnih dejavnikov, ki so lahko dedni ali okoljski. Eden od okoljskih dejavnikov je okužba z virusom Herpes simpleks tip 1. Ta povzroči večje izražanje ε4 alela apolipoproteina E, ki povzroča nalaganje Tau proteina in amiloida beta, ki sestavljata senilne plake pri Alzheimerjevi bolezni. To povezavo so odkrili s protitelesi proti virusu Herpes simpleks tipa 1 ter preko lizosomske okvare, zaradi katere pride do nalaganja amiloida beta v možganih. Dokazana je bila tudi povezava med Alzheimerjevo boleznijo in drugimi boleznimi (epilepsija, demenca, shizofrenija, fibromialgija, demenca), pri katerih je opazna kognitivna disfunkcija. Pri bolnikih z epilepsijo so odkrili amiloidne plake, ki so značilni za Alzheimerjevo bolezen, zaradi česar je večja verjetnost, da oboleli za epilepsijo zbolijo še za Alzheimerjevo boleznijo in obratno. Herpes simpleks virus redko povzroča tudi akutni encefalitis, katerega posledica so epileptični napadi, izguba spomina in spremembe v vedenju. Zato znanstveniki menijo, da je povezava med epilepsijo in Alzheimerjevo boleznijo tudi v apolipoproteinu E.<br /> <br /> === Ena Kartal: Kako celično staranje vodi do nevrodegeneracije ===<br /> Čeprav je bila vzpostavljena povezava med kroničnim vnetjem in nevrodegenerativnimi boleznimi, je bilo veliko odprtih vprašanj v zvezi s tem, kako celično staranje, proces, pri katerem celice, ki se nehajo deliti pod stresom, izločijo mešanico vnetnih beljakovin, vplivajo na te patologije. Raziskovalci poročajo, da staranje v astrocitih, ki je najbolj razširjena vrsta celic v možganih, vodi do škodljive '' ekscitotoksičnosti '' na kortikalnih nevronih, ki so vključeni v spomin.In pri tem pride do Alzheimerjeve bolezni,ki je najpogostejši vzrok demence pri starejših, je nepopravljiva, napredujoča možganska motnja, ki ubija možganske celice in postopoma uničuje spomin.<br /> <br /> === Lenka Stanković: Optimizirano antiangiogeno reprogramiranje tumorskega mikrookolja potencira imunoterapijo CD40 ===<br /> <br /> Karakteristika raka je njegova sposobnost spodbujanja angiogeneze, oziroma tvorba novih krvnih žil. Angiogeneza prispeva k rasti in napredovanju tumorja z induciranjem in vzdrževanjem kislega / hipoksičnega in imunosupresivnega okolja. Krvne žile v rakih so pogosto nefunkcionalne in omejujejo promet s T-celicami. Odkritje angiogenih zaviralcev naj bi pripomoglo k zmanjšanju umrljivosti zaradi karcinomov. Imunoterapija proti raku kaže klinično učinkovitost pri izabranih vrstah raka. Ker pa se večina bolnikov ne odziva na najbolj učinkovite imunoterapije, so nove kombinacije imunoterapije obsežno raziskovane. Klinično je zanimanje za kombiniranje imunoterapije raka z antiangiogenim provzročitelji. Tukaj prikazujemo, da imunoterapija proti CD40 poveča tumorsko infiltracijo CD8+T, vendar regresijo tumorja dosežemo močneje, če anti-CD40 kombinirano z dvojno blokado Ang2 in VEGFA. Kombinacija anti-VEGFA, anti-Ang2 in agonističkih protiteles proti anti-CD40 omogoča zavrnitev tumorjev pri sintetičnih modelih tumorjev. Proučevali so odzive tumorjev na anti-VEGFA, anti-Ang2 in agonistična protitelesa proti CD40 v različnih modelih mišjega raka. V raziskavi so pokazali, da kombinacija agonističnih protiteles CD40 z dvojno blokado VEGFA/Ang2 povečuje protitumorski odziv v modelnih raka miši s pomočjo sinergistične regulacije genov in indukcije imunskega permisivnega mikrookruženja tumorja, za katero je značilno provnetno (M1 podobno) aktivacijo makrofagov, vaskularno normalizacija ter izboljšanja infiltracije in prostorska lokalizacija efektorskih T-celic. T-celice pošljejo signale drugim vrstam imunskih celic, vključno s citotoksičnimi T celicami CD8+. Citotoksične T-celice, znane tudi kot CD8 + T-celice, izražajo svoje TCR, ki jih spremlja glikoprotein CD8. CD8 + T-celice so vrsta belih krvnih celic, ki so povezane z učinkovitim ubijanjem rakavih celic: med antigensko specifično aktivacijo afiniteta med CD8 glikoproteinom, izraženim s celico CD8 + T, in molekulo MHC razreda I, izraženo z rakavo celico, ohranja obe vrsti celic skupaj. Tesna vezava T celic in rakavih celic skozi kompleks CD8 / TCR in kompleks antigen / MHC-I povzroči, da celice CD8 + T izločajo perforin in grancime, kar vodi v lizo rakavih celic.<br /> <br /> === Nika Tomsič: Pomembnost in delovanje sladkornega prenašalca PfHT1 v parazitu malarije ===<br /> Po oceni World Health Organisation- World malaria report 2019 je v letu 2018 bilo 228 milijonov primerov malarije. Sladkor je glavni vir hranil parazita, zato je razumevanje presnove sladkorjev pomembna tema, ki bi lahko predstavljala pomoč pri sestavljanju zdravljenju in izrivanju tega parazita. Glavna razlika v presnovi sladkorjev med parazitom in drugimi organizmi je prenašalec, ki sladkorje prenaša v celico. Za to je odgovoren šeskotni prenašalec PfHT1, ki je sposoben transportirati bodisi glukozo kot fruktozo. Strukturno pa je zelo podoben prenašalcem človeške celice GLUT. Prenašalec obsega 12 transmembranskih vijačnic, ki tvorijo osrednjo pot za vstop glukoze. Ključni del proteina pa predstavljajo izrastki ki delujejo kot receptorji za sladkorje. Sladkorne prenašalce še nadaljno stabilizirajo solne medcelične povezave. Druga velika razlika med PfHT1 in drugimi prenašalci je brez dvoma način odpiranja in zapiranja prenašalca, saj ni sestavljenen samo iz treh običajnih stanj (odprto navznoter, zaprto, odprto navznoter), temveč ga zaznamujejo še dve vmesni stanji (zaprto navznoter in zaprto navzven, angl. inward – occluded in outward - occluded). Nadaljnjo raziskovanje bi torej lahko omogočilo razvoja novih antimalaričnih zdravil, ki blokirajo uvoz sladkorja in zastrašujejo parazita do smrti oz. razvoja novih zaviralcev, ki so bolj specifični za blokiranje funkcije PfHT1, ne da bi pri tem vplivali na transport sladkorja v človeških celicah.</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=TBK2020-seminar&diff=16090 2020-02-23T16:12:33Z

<p>Nika Tomsič: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>= Temelji biokemije- seminar =<br /> <br /> Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.<br /> <br /> Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita. <br /> Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.<br /> Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## &quot;##&quot; sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.<br /> Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> <br /> {| {{table}}<br /> {| border=&quot;1&quot; cellspacing=&quot;0&quot; style=&quot;border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;&quot; <br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Ime in priimek'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Naslov seminarja'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Povezava'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Rok za oddajo'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Rok za recenzijo'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum predstavitve'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 1'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 2'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 3'''<br /> |-<br /> | Anna Scott ||[[TBK2020_Povzetki_seminarjev#Anna_Scott:_Notting_Hill|Moj naslov v slovenščini, link pa kaže na povzetek]]||[https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm povezava] || 28.10. || 05.11. || 07.11. || r1 || r2 || r3<br /> |-<br /> | Lenka Stanković || Optimizirano antiangiogeno reprogramiranje tumorskega mikrookolja potencira imunoterapijo CD40 || https://www.pnas.org/content/117/1/541 ;http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povzetek_seminarja|| 24.02. || 27.02. || 02.03. || Špela Došler || Zala Perko || Marija Dujaković<br /> |-<br /> | Ena Kartal || || || 24.02. || 27.02. || 02.03. || Jasmina Bešić || Ana Žagar || Neža Leskovar<br /> |-<br /> | Ema Kovačič ||Izpostavljenost ploda materinski mikrobioti || https://insight.jci.org/articles/view/127806 || 24.02. || 27.02. || 02.03. || Nikola Janakievski || Karin Rak || Luka Hafner<br /> |-<br /> | Nika Tomsič || Pomembnost in delovanje sladkornega prenašalca PfHT1 v parazitu malarije || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200129131533.htm || 24.02. || 27.02. || 02.03. || Maja Deutsch || Jakob Tomšič || Marigona Beqiraj<br /> |-<br /> | Sara Golob ||Vpliv virusa Herpesa simpleksa tipa 1 na razvoj Alzheimerjeve bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/10/181019100702.htm || 24.02. || 27.02. || 02.03. || Manca Pirc || Maja Kobal || Rebeka Jerina<br /> |-<br /> | Zala Puklavec || || || 03.03. || 06.03. || 09.03. || Nika Bedrač || Špela Došler || Zala Perko<br /> |-<br /> | Martin Stanonik || Geni iz ničesar: Veliko bolj pogosti in pomembni kot smo mislili || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200218104740.htm || 03.03. || 06.03. || 09.03. || Ivana Trifunovska || Jasmina Bešić || Ana Žagar<br /> |-<br /> | Anja Moškrič || || || 03.03. || 06.03. || 09.03. || Bor Krajnik || Nikola Janakievski || Karin Rak<br /> |-<br /> | Maša Mencigar || Odkritje specifičnih nevronov za spomin ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/11/191112095740.htm || 03.03. || 06.03. || 09.03. || Erik Putar || Maja Deutsch || Jakob Tomšič<br /> |-<br /> | Nevena Ješić || || || 03.03. || 06.03. || 09.03. || Ela Bizjak || Manca Pirc || Maja Kobal<br /> |-<br /> | Nika Perko || || || 10.03. || 13.03. || 16.03. || Lenka Stanković || Nika Bedrač || Špela Došler<br /> |-<br /> | Timotej Sotošek || || || 10.03. || 13.03. || 16.03. || Ena Kartal || Ivana Trifunovska || Jasmina Bešić<br /> |-<br /> | Hana Glavnik || || || 10.03. || 13.03. || 16.03. || Ema Kovačič || Bor Krajnik || Nikola Janakievski<br /> |-<br /> | Klara Kočman || || || 10.03. || 13.03. || 16.03. || Nika Tomsič || Erik Putar || Maja Deutsch<br /> |-<br /> | Gaja Osojnik || || || 10.03. || 13.03. || 16.03. || Sara Golob || Ela Bizjak || Manca Pirc<br /> |-<br /> | Aleksandra Pajović || || || 17.03. || 20.03. || 23.03. || Zala Puklavec || Lenka Stanković || Nika Bedrač<br /> |-<br /> | Aljaž Simonič || || || 17.03. || 20.03. || 23.03. || Martin Stanonik || Ena Kartal || Ivana Trifunovska<br /> |-<br /> | Eva Ratajc || || || 17.03. || 20.03. || 23.03. || Anja Moškrič || Ema Kovačič || Bor Krajnik<br /> |-<br /> | Lana Kores || || || 17.03. || 20.03. || 23.03. || Maša Mencigar || Nika Tomsič || Erik Putar<br /> |-<br /> | Sara Borišek || || || 17.03. || 20.03. || 23.03. || Nevena Ješić || Sara Golob || Ela Bizjak<br /> |-<br /> | Jan Kogovšek || Preoblikovanje glia celic izboljša kratkoročni spomin in učenje || https://jneuroinflammation.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12974-020-1729-4 || 24.03. || 27.03. || 30.03. || Nika Perko || Zala Puklavec || Lenka Stanković<br /> |-<br /> | Nina Žgajnar || || || 24.03. || 27.03. || 30.03. || Timotej Sotošek || Martin Stanonik || Ena Kartal<br /> |-<br /> | Erika Rihter || || || 24.03. || 27.03. || 30.03. || Hana Glavnik || Anja Moškrič || Ema Kovačič<br /> |-<br /> | Luka Šegota || || || 24.03. || 27.03. || 30.03. || Klara Kočman || Maša Mencigar || Nika Tomsič<br /> |-<br /> | Eva Vene || || || 24.03. || 27.03. || 30.03. || Gaja Osojnik || Nevena Ješić || Sara Golob<br /> |-<br /> | Ajda Beltram || || || 31.03. || 03.04. || 06.04. || Aleksandra Pajović || Nika Perko || Zala Puklavec<br /> |-<br /> | Jan Trebušak || || || 31.03. || 03.04. || 06.04. || Aljaž Simonič || Timotej Sotošek || Martin Stanonik<br /> |-<br /> | Jan Bregar || || || 31.03. || 03.04. || 06.04. || Eva Ratajc || Hana Glavnik || Anja Moškrič<br /> |-<br /> | Gregor Strniša || || || 31.03. || 03.04. || 06.04. || Lana Kores || Klara Kočman || Maša Mencigar<br /> |-<br /> | Petra Pahor || || || 31.03. || 03.04. || 06.04. || Sara Borišek || Gaja Osojnik || Nevena Ješić<br /> |-<br /> | Nadja Dolničar || || || 14.04. || 17.04. || 20.04. || Jan Kogovšek || Aleksandra Pajović || Nika Perko<br /> |-<br /> | Tina Javeršek || || || 14.04. || 17.04. || 20.04. || Nina Žgajnar || Aljaž Simonič || Timotej Sotošek<br /> |-<br /> | Vid Dobrovoljc || || || 14.04. || 17.04. || 20.04. || Erika Rihter || Eva Ratajc || Hana Glavnik<br /> |-<br /> | Tinkara Božič || || || 14.04. || 17.04. || 20.04. || Luka Šegota || Lana Kores || Klara Kočman<br /> |-<br /> | Kostadin Mitkov || || || 14.04. || 17.04. || 20.04. || Eva Vene || Sara Borišek || Gaja Osojnik<br /> |-<br /> | Sara Jerič || || || 28.04. || 30.04. || 04.05. || Ajda Beltram || Jan Kogovšek || Aleksandra Pajović<br /> |-<br /> | Polona Leban || || || 28.04. || 30.04. || 04.05. || Jan Trebušak || Nina Žgajnar || Aljaž Simonič<br /> |-<br /> | Stefanija Ivanova || || || 28.04. || 30.04. || 04.05. || Jan Bregar || Erika Rihter || Eva Ratajc<br /> |-<br /> | Luka Stanković || || || 28.04. || 30.04. || 04.05. || Gregor Strniša || Luka Šegota || Lana Kores<br /> |-<br /> | Ana Pervanja || || || 28.04. || 30.04. || 04.05. || Petra Pahor || Eva Vene || Sara Borišek<br /> |-<br /> | Marija Dujaković || || || 05.05. || 08.05. || 11.05. || Nadja Dolničar || Ajda Beltram || Jan Kogovšek<br /> |-<br /> | Neža Leskovar || || || 05.05. || 08.05. || 11.05. || Tina Javeršek || Jan Trebušak || Nina Žgajnar<br /> |-<br /> | Luka Hafner || || || 05.05. || 08.05. || 11.05. || Vid Dobrovoljc || Jan Bregar || Erika Rihter<br /> |-<br /> | Marigona Beqiraj || || || 05.05. || 08.05. || 11.05. || Tinkara Božič || Gregor Strniša || Luka Šegota<br /> |-<br /> | Rebeka Jerina || || || 05.05. || 08.05. || 11.05. || Kostadin Mitkov || Petra Pahor || Eva Vene<br /> |-<br /> | Zala Perko || || || 12.05. || 15.05. || 18.05. || Sara Jerič || Nadja Dolničar || Ajda Beltram<br /> |-<br /> | Ana Žagar || || || 12.05. || 15.05. || 18.05. || Polona Leban || Tina Javeršek || Jan Trebušak<br /> |-<br /> | Karin Rak || || || 12.05. || 15.05. || 18.05. || Stefanija Ivanova || Vid Dobrovoljc || Jan Bregar<br /> |-<br /> | Jakob Tomšič || || || 12.05. || 15.05. || 18.05. || Luka Stanković || Tinkara Božič || Gregor Strniša<br /> |-<br /> | Maja Kobal || || || 12.05. || 15.05. || 18.05. || Ana Pervanja || Kostadin Mitkov || Petra Pahor<br /> |-<br /> | Špela Došler || || || 19.05. || 22.05. || 25.05. || Marija Dujaković || Sara Jerič || Nadja Dolničar<br /> |-<br /> | Jasmina Bešić || || || 19.05. || 22.05. || 25.05. || Neža Leskovar || Polona Leban || Tina Javeršek<br /> |-<br /> | Nikola Janakievski || || || 19.05. || 22.05. || 25.05. || Luka Hafner || Stefanija Ivanova || Vid Dobrovoljc<br /> |-<br /> | Maja Deutsch || || || 19.05. || 22.05. || 25.05. || Marigona Beqiraj || Luka Stanković || Tinkara Božič<br /> |-<br /> | Manca Pirc || || || 19.05. || 22.05. || 25.05. || Rebeka Jerina || Ana Pervanja || Kostadin Mitkov<br /> |-<br /> | Nika Bedrač || Nižji vnos beljakovin niža tveganje za razvoj kardiovaskularnih bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200203141501.htm || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Zala Perko || Marija Dujaković || Sara Jerič<br /> |-<br /> | Ivana Trifunovska || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Ana Žagar || Neža Leskovar || Polona Leban<br /> |-<br /> | Bor Krajnik || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Karin Rak || Luka Hafner || Stefanija Ivanova<br /> |-<br /> | Erik Putar || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Jakob Tomšič || Marigona Beqiraj || Luka Stanković<br /> |-<br /> | Ela Bizjak || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Maja Kobal || Rebeka Jerina || Ana Pervanja<br /> |}<br /> <br /> ==Naloga==<br /> * samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2018. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino. <br /> * članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].<br /> * naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo <br /> * [[TBK2020 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom. <br /> * Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!<br /> *Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).<br /> * Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].<br /> * vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].<br /> * Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 10 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.<br /> * Predstavitvi sledi razprava do 5 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.<br /> * En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.<br /> * Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!<br /> Poslati morate naslednje datoteke:<br /> * TBK_2020_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor.docx<br /> * TBK_2020_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja<br /> * TBK_2020_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)<br /> * TBK_2020_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2020_Guncar_Gregor.pptx<br /> * TBK_2020_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor_clanek.pdf<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Faktor vpliva==<br /> Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&amp;base=JCR COBISS-u]. V polje &quot;Naslov revije&quot; vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.<br /> <br /> ==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;'''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). &lt;br&gt;'''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).&lt;br&gt;'''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

Nika Tomsič https://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=TBK2020-seminar&diff=16084 2020-02-23T12:37:57Z

<p>Nika Tomsič: /* Seznam seminarjev */</p> <hr /> <div>= Temelji biokemije- seminar =<br /> <br /> Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.<br /> <br /> Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita. <br /> Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.<br /> Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## &quot;##&quot; sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.<br /> Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].<br /> <br /> == Seznam seminarjev ==<br /> <br /> {| {{table}}<br /> {| border=&quot;1&quot; cellspacing=&quot;0&quot; style=&quot;border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;&quot; <br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Ime in priimek'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Naslov seminarja'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Povezava'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Rok za oddajo'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Rok za recenzijo'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Datum predstavitve'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 1'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 2'''<br /> | align=&quot;center&quot; style=&quot;background:#f0f0f0;&quot;|'''Recenzent 3'''<br /> |-<br /> | Anna Scott ||[[TBK2020_Povzetki_seminarjev#Anna_Scott:_Notting_Hill|Moj naslov v slovenščini, link pa kaže na povzetek]]||[https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm povezava] || 28.10. || 05.11. || 07.11. || r1 || r2 || r3<br /> |-<br /> | Lenka Stanković || Optimizirano antiangiogeno reprogramiranje tumorskega mikrookolja potencira imunoterapijo CD40 || https://www.pnas.org/content/117/1/541 ;http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Povzetek_seminarja|| 24.02. || 27.02. || 02.03. || Špela Došler || Zala Perko || Marija Dujaković<br /> |-<br /> | Ena Kartal || || || 24.02. || 27.02. || 02.03. || Jasmina Bešić || Ana Žagar || Neža Leskovar<br /> |-<br /> | Ema Kovačič || || || 24.02. || 27.02. || 02.03. || Nikola Janakievski || Karin Rak || Luka Hafner<br /> |-<br /> | Nika Tomsič || Pomembnost in delovanje sladkornega prenašalca PfHT1 v parazitu malarije || || 24.02. || 27.02. || 02.03. || Maja Deutsch || Jakob Tomšič || Marigona Beqiraj<br /> |-<br /> | Sara Golob ||Vpliv virusa herpesa simpleksa tipa 1 na razvoj Alzheimerjeve bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2018/10/181019100702.htm || 24.02. || 27.02. || 02.03. || Manca Pirc || Maja Kobal || Rebeka Jerina<br /> |-<br /> | Zala Puklavec || || || 03.03. || 06.03. || 09.03. || Nika Bedrač || Špela Došler || Zala Perko<br /> |-<br /> | Martin Stanonik || || || 03.03. || 06.03. || 09.03. || Ivana Trifunovska || Jasmina Bešić || Ana Žagar<br /> |-<br /> | Anja Moškrič || || || 03.03. || 06.03. || 09.03. || Bor Krajnik || Nikola Janakievski || Karin Rak<br /> |-<br /> | Maša Mencigar || Odkritje specifičnih nevronov za spomin ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/11/191112095740.htm || 03.03. || 06.03. || 09.03. || Erik Putar || Maja Deutsch || Jakob Tomšič<br /> |-<br /> | Nevena Ješić || || || 03.03. || 06.03. || 09.03. || Ela Bizjak || Manca Pirc || Maja Kobal<br /> |-<br /> | Nika Perko || || || 10.03. || 13.03. || 16.03. || Lenka Stanković || Nika Bedrač || Špela Došler<br /> |-<br /> | Timotej Sotošek || || || 10.03. || 13.03. || 16.03. || Ena Kartal || Ivana Trifunovska || Jasmina Bešić<br /> |-<br /> | Hana Glavnik || || || 10.03. || 13.03. || 16.03. || Ema Kovačič || Bor Krajnik || Nikola Janakievski<br /> |-<br /> | Klara Kočman || || || 10.03. || 13.03. || 16.03. || Nika Tomsič || Erik Putar || Maja Deutsch<br /> |-<br /> | Gaja Osojnik || || || 10.03. || 13.03. || 16.03. || Sara Golob || Ela Bizjak || Manca Pirc<br /> |-<br /> | Aleksandra Pajović || || || 17.03. || 20.03. || 23.03. || Zala Puklavec || Lenka Stanković || Nika Bedrač<br /> |-<br /> | Aljaž Simonič || || || 17.03. || 20.03. || 23.03. || Martin Stanonik || Ena Kartal || Ivana Trifunovska<br /> |-<br /> | Eva Ratajc || || || 17.03. || 20.03. || 23.03. || Anja Moškrič || Ema Kovačič || Bor Krajnik<br /> |-<br /> | Lana Kores || || || 17.03. || 20.03. || 23.03. || Maša Mencigar || Nika Tomsič || Erik Putar<br /> |-<br /> | Sara Borišek || || || 17.03. || 20.03. || 23.03. || Nevena Ješić || Sara Golob || Ela Bizjak<br /> |-<br /> | Jan Kogovšek || Preoblikovanje glia celic izboljša kratkoročni spomin in učenje || https://jneuroinflammation.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12974-020-1729-4 || 24.03. || 27.03. || 30.03. || Nika Perko || Zala Puklavec || Lenka Stanković<br /> |-<br /> | Nina Žgajnar || || || 24.03. || 27.03. || 30.03. || Timotej Sotošek || Martin Stanonik || Ena Kartal<br /> |-<br /> | Erika Rihter || || || 24.03. || 27.03. || 30.03. || Hana Glavnik || Anja Moškrič || Ema Kovačič<br /> |-<br /> | Luka Šegota || || || 24.03. || 27.03. || 30.03. || Klara Kočman || Maša Mencigar || Nika Tomsič<br /> |-<br /> | Eva Vene || || || 24.03. || 27.03. || 30.03. || Gaja Osojnik || Nevena Ješić || Sara Golob<br /> |-<br /> | Ajda Beltram || || || 31.03. || 03.04. || 06.04. || Aleksandra Pajović || Nika Perko || Zala Puklavec<br /> |-<br /> | Jan Trebušak || || || 31.03. || 03.04. || 06.04. || Aljaž Simonič || Timotej Sotošek || Martin Stanonik<br /> |-<br /> | Jan Bregar || || || 31.03. || 03.04. || 06.04. || Eva Ratajc || Hana Glavnik || Anja Moškrič<br /> |-<br /> | Gregor Strniša || || || 31.03. || 03.04. || 06.04. || Lana Kores || Klara Kočman || Maša Mencigar<br /> |-<br /> | Petra Pahor || || || 31.03. || 03.04. || 06.04. || Sara Borišek || Gaja Osojnik || Nevena Ješić<br /> |-<br /> | Nadja Dolničar || || || 14.04. || 17.04. || 20.04. || Jan Kogovšek || Aleksandra Pajović || Nika Perko<br /> |-<br /> | Tina Javeršek || || || 14.04. || 17.04. || 20.04. || Nina Žgajnar || Aljaž Simonič || Timotej Sotošek<br /> |-<br /> | Vid Dobrovoljc || || || 14.04. || 17.04. || 20.04. || Erika Rihter || Eva Ratajc || Hana Glavnik<br /> |-<br /> | Tinkara Božič || || || 14.04. || 17.04. || 20.04. || Luka Šegota || Lana Kores || Klara Kočman<br /> |-<br /> | Kostadin Mitkov || || || 14.04. || 17.04. || 20.04. || Eva Vene || Sara Borišek || Gaja Osojnik<br /> |-<br /> | Sara Jerič || || || 28.04. || 30.04. || 04.05. || Ajda Beltram || Jan Kogovšek || Aleksandra Pajović<br /> |-<br /> | Polona Leban || || || 28.04. || 30.04. || 04.05. || Jan Trebušak || Nina Žgajnar || Aljaž Simonič<br /> |-<br /> | Stefanija Ivanova || || || 28.04. || 30.04. || 04.05. || Jan Bregar || Erika Rihter || Eva Ratajc<br /> |-<br /> | Luka Stanković || || || 28.04. || 30.04. || 04.05. || Gregor Strniša || Luka Šegota || Lana Kores<br /> |-<br /> | Ana Pervanja || || || 28.04. || 30.04. || 04.05. || Petra Pahor || Eva Vene || Sara Borišek<br /> |-<br /> | Marija Dujaković || || || 05.05. || 08.05. || 11.05. || Nadja Dolničar || Ajda Beltram || Jan Kogovšek<br /> |-<br /> | Neža Leskovar || || || 05.05. || 08.05. || 11.05. || Tina Javeršek || Jan Trebušak || Nina Žgajnar<br /> |-<br /> | Luka Hafner || || || 05.05. || 08.05. || 11.05. || Vid Dobrovoljc || Jan Bregar || Erika Rihter<br /> |-<br /> | Marigona Beqiraj || || || 05.05. || 08.05. || 11.05. || Tinkara Božič || Gregor Strniša || Luka Šegota<br /> |-<br /> | Rebeka Jerina || || || 05.05. || 08.05. || 11.05. || Kostadin Mitkov || Petra Pahor || Eva Vene<br /> |-<br /> | Zala Perko || || || 12.05. || 15.05. || 18.05. || Sara Jerič || Nadja Dolničar || Ajda Beltram<br /> |-<br /> | Ana Žagar || || || 12.05. || 15.05. || 18.05. || Polona Leban || Tina Javeršek || Jan Trebušak<br /> |-<br /> | Karin Rak || || || 12.05. || 15.05. || 18.05. || Stefanija Ivanova || Vid Dobrovoljc || Jan Bregar<br /> |-<br /> | Jakob Tomšič || || || 12.05. || 15.05. || 18.05. || Luka Stanković || Tinkara Božič || Gregor Strniša<br /> |-<br /> | Maja Kobal || || || 12.05. || 15.05. || 18.05. || Ana Pervanja || Kostadin Mitkov || Petra Pahor<br /> |-<br /> | Špela Došler || || || 19.05. || 22.05. || 25.05. || Marija Dujaković || Sara Jerič || Nadja Dolničar<br /> |-<br /> | Jasmina Bešić || || || 19.05. || 22.05. || 25.05. || Neža Leskovar || Polona Leban || Tina Javeršek<br /> |-<br /> | Nikola Janakievski || || || 19.05. || 22.05. || 25.05. || Luka Hafner || Stefanija Ivanova || Vid Dobrovoljc<br /> |-<br /> | Maja Deutsch || || || 19.05. || 22.05. || 25.05. || Marigona Beqiraj || Luka Stanković || Tinkara Božič<br /> |-<br /> | Manca Pirc || || || 19.05. || 22.05. || 25.05. || Rebeka Jerina || Ana Pervanja || Kostadin Mitkov<br /> |-<br /> | Nika Bedrač || Nižji vnos beljakovin niža tveganje za razvoj kardiovaskularnih bolezni || https://www.sciencedaily.com/releases/2020/02/200203141501.htm || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Zala Perko || Marija Dujaković || Sara Jerič<br /> |-<br /> | Ivana Trifunovska || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Ana Žagar || Neža Leskovar || Polona Leban<br /> |-<br /> | Bor Krajnik || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Karin Rak || Luka Hafner || Stefanija Ivanova<br /> |-<br /> | Erik Putar || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Jakob Tomšič || Marigona Beqiraj || Luka Stanković<br /> |-<br /> | Ela Bizjak || || || 20.05. || 23.05. || 26.05. || Maja Kobal || Rebeka Jerina || Ana Pervanja<br /> |}<br /> <br /> ==Naloga==<br /> * samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2018. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino. <br /> * članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].<br /> * naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo <br /> * [[TBK2020 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom. <br /> * Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.<br /> * Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!<br /> *Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).<br /> * Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].<br /> * vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].<br /> * Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.<br /> * Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 10 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.<br /> * Predstavitvi sledi razprava do 5 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.<br /> * En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.<br /> * Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!<br /> <br /> ==&lt;font color=green&gt;Imena datotek&lt;/font&gt;==<br /> Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!<br /> Poslati morate naslednje datoteke:<br /> * TBK_2020_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor.docx<br /> * TBK_2020_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja<br /> * TBK_2020_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)<br /> * TBK_2020_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2020_Guncar_Gregor.pptx<br /> * TBK_2020_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2020_Guncar_Gregor_clanek.pdf<br /> <br /> ==Ocenjevanje seminarjev==<br /> Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.<br /> <br /> == Mnenje o predstavitvi ==<br /> Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.<br /> <br /> ==Urejanje spletnih strani na wikiju==<br /> Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''<br /> <br /> ==Faktor vpliva==<br /> Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&amp;base=JCR COBISS-u]. V polje &quot;Naslov revije&quot; vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.<br /> <br /> ==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati.&lt;br&gt;'''Citiranje knjig:'''&lt;br&gt;Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica.&lt;br&gt;Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN.&lt;br&gt;Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005.&lt;br&gt;Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4.&lt;br&gt;Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). &lt;br&gt;'''Citiranje člankov:'''&lt;br&gt;Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani.&lt;br&gt;Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole:&lt;br&gt;Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani.&lt;br&gt;Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis:&lt;br&gt;C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007)&lt;br&gt;V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).&lt;br&gt;'''Citiranje spletnih virov:'''&lt;br&gt;Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov&lt;br&gt;strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life&lt;br&gt;Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.</div>

Nika Tomsič