Z integrazo nadzorovan diferenciacijski sistem izboljša evolucijsko stabilnost bremenskih in toksičnih funkcij v E.coli

2023-05-08T14:57:08Z

Nika.banovsek:

Z integrazo nadzorovan diferenciacijski sistem izboljša evolucijsko stabilnost bremenskih in toksičnih funkcij v E.coli

2023-05-08T14:56:46Z

Nika.banovsek: /* Zaključek */

Z integrazo nadzorovan diferenciacijski sistem izboljša evolucijsko stabilnost bremenskih in toksičnih funkcij v E.coli

2023-05-08T10:02:21Z

Nika.banovsek:

''Povzeto po članku: [https://www.nature.com/articles/s41467-022-34361-y R.L. Williams, R.M. Murray. Integrase-mediated differentiation circuits improve evolutionary stability of burdensome and toxic functions in E. coli. Nat Commun. 2022,13, 6822. ]''

== Uvod ==

Cilj sintezne biologije je narediti celice z močno regulacijo in izražanjem kompleksnih funkcij. Slednje zanje predstavlja veliko breme, kar rezultira v negativni evolucijski stabilizaciji in posledično izgubi željene funkcije. Tako smo omejeni na vstavljanje genov, ki so za celico netoksični in ne odražajo bremena. Pri večceličnih sistemih in nekaterih mikroorganizmih pride do diferenciacije celic, ki opravljajo specifično vlogo in tako prevzamejo del bremena celotne kulture. Pri takšnih sistemih govorimo o delitvi dela, ki je lahko metabolična ali reprodukcijska. Naravni sistemi uporabljajo diferenciacijo za koordinacijo pomembnih in esencialnih funkcij. Williams in Murray sta razvila diferenciacijsko strategijo, kjer bi na dane celice aplicirali neesencialne funkcije (niso pomembne za celično preživetje), hkrati pa predstavljajo breme in ovirajo celično rast [1,2].
Diferenciacijska strategija temelji na razdelitvi dela dveh pomembnih funkcij, to sta reprodukcija in izražanje funkcije željenega gena. Hkrati preprečuje selekcijo nastanka mutacij, ki našo funkcijo omejujejo. Razvili so sistem, ki je sestavljen iz dveh celičnih tipov: progenitorske celice, ki so specializirane za replikacijo kodirane funkcije in diferencirane celice, ki kodirajo funkcijo izražajo. Slednje se lahko neskončno delijo. Delitev so omejili preko uporabe rekombinacije z Bxb1 integrazo in omogočili aktivacijo ekspresije bremenske funkcije, ki je pod kontorlo T7 RNA polimeraze. Hkrati so povzročili inaktivacijo izražanja π proteina, ki je esencialen faktor za replikacijo plazmida R6K. Ob delitvi in rasti diferenciacijskih celic pride do izgube plazmida R6K, proliferacijo lahko nato omejimo s selekcijo antibiotikov. Takšne diferenciacijske celice so omejene preko t.i. terminalne diferenciacije (celice se ne morejo več delit). Ekspresija željenega gena se ne aktivira pred diferenciacijo, zato v progenitorskih celicah ni selekcijskega pritiska na mutacije, ki to funkcijo ovirajo. Terminalna diferenciacija diferenciranih celic omeji razširitev takšnih mutacij v populaciji. Celice s terminalno diferenciacijo povečajo evolucijsko stabilnost in so bolj odporne na mutacije, ki zmanjšajo ekspresijo bremenskega gena [1,3].

== Rezultati ==
'''Razvoj diferenciacijskega sistema'''

V osnovi je prvotna populacija izvajajočih/producirajočih (''angl.'' producer cells) celic imela zmanjšano porast, zaradi bremena, ki je povezan z željenim genom. Preko t.i. bremenskih mutacij, ki inaktivirajo izražanje našega gena, pride do namnožitve neizvajajočih/neproducirajočih (''angl.'' non-prudcer cells) celic, ki ne izražajo željene funkcije in imajo normalno rast. Da pride do nastanka neproducirajočih celic, morata reprodukcija in ekspresija željene funkcije nastati v isti celici. Strategija terminalne diferenciacije omogoči ločitev teh dveh lasnosti preko razdelitve dela in posledično omogoči ohranjanje ekspresije željenega gena.

Za ločitev prej omenjenih lastnosti so razvili sintezno biološki sistem, kjer so v genom ''E.coli'' vstavili gen za bakteriofagno serinsko integrazo Bxb1. Za nastavljanje ekspresije Bxb1 in posledično stopnje diferenciacije, so uporabili preko salicilata inducibilen promotor PSalTTC in njegov transkripcijski faktor NahR. V sam genom so hkrati vstavili gen za T7 RNA polimerazo. Gen so postavili pod IPTG inducibilni promotor PTac , skupaj z LacI represorjem. Da so omejili proliferacijo diferenciranih celic v primeru terminalne diferenciacije, so tarčili replikacijo R6K plazmida, ki je odvisna od π proteina (kodira ga gen ''pir''). Za to so uporabili inducibilni promotor PLasAM in njegov transkripcijski faktor LasRAM za kontrolo ekspresije π proteina. Kaseto so postavili tako, da v primeru rekombinacij preko integraze pride do njegove izključitve in π protein se ne izraža več. Obilica π proteina in število kopij R6K plazmida se v času diferenciacije lahko nastavljata preko Las-AHL promotorja. R6K plazmid kodira tudi za odpornost na kloramfenikol. Preko nivojev izražanja π proteina slednji omeji število kopij plazmida v času diferenciacije ob prisotnosti selekcije s kloramfenikolom. Delovanje T7 RNA polimeraze so preverjali preko plazmida ColE1-AmpR, ki je vseboval zapis za sfGFP (bremenska funkcija), ki je pod promotrojem PT7. Začetno vezje so skonstruirali tako, da je zapis za polimerazo sledil za genom ''pir'', kar se je v progenitorskih celicah odražalo kot puščanje promotorja. Za preprečitev tega, so gen razcepili preko inserta za π protein. Na mestih deljene T7 RNA polimeraze so primerno umestili rekombinacijska mesta, kamor se je lahko vezala Bxb1 integraza. Slednja je ob vezavi povzročila delecijo inserta z genom ''pir'' in nastanek funkcionalne T7 RNA polimeraze. Ta se veže na PT7 ColE1-AmpR plazmida in aktivira transkripcijo željenega gena. Ob odsotnosti Bxb1 integraze, je bilo sfGFP izražanje enako kot pri negativni kontroli brez RNA polimeraze. Induciranje z Bxb1 je povzročilo povišanje koncentracije T7 RNA polimeraze in posledično povečanje izražanja sfGFP. Opisan sistem so opazovali v progenitorskih celicah, diferenciranih celicah in terminalno diferenciranih celicah.

'''Optimizacija diferenciacijskega sistema'''

Problem, ki se pojavi, je, da je pri tako obremenjenih sistemih pride do t.i. diferenciacijskih mutacij. Slednje progenitorskim celicam onemogočijo diferenciacijo. Z zmanjšanjem verjetnosti, da takšne mutacije nastanejo, se podaljša čas izražanja funkcije pri terminalni diferenciaciji (zakasnimo pojav nediferenciacije). V prvotnem primeru so imeli le eno T7 RNA polimerazno kaseto, ki aktivira izražanje željenega gena in hkrati omeji rast diferenciranih celic. Ena mutacija, ki preprečuje rekombinacijo naše kasete, bi bila dovolj, da onemogoči selekcijo preko antibiotika in povroči kupičenje bremenskih mutacij. Če v naš sistem vključimo dve T7 RNA polimerazni kaseti, kjer vsaka kodira za polovico π proteina, potrebujemo oba dela, da dobimo funkcionalen protein π. Tako bi v primeru le ene rekombinacije (ob delovanju integraze) prišli do neaktivnega π proteina in do zmanjšanja replikacije R6K plazmida. Za pojav nediferenciacije v podvojenem sistemu bi tako potrebovali dve neodvisni mutaciji. Dan sistem so naredli preko vezave Cfa-inteina na N- in C- terminalni del π proteina. Ob odsotnosti integraze pride do nastanka funkcionalnega proteina. 1x (ena kaseta s T7 RNA polimerazo) in 2x (dve kaseti s T7 RNA polimerazo) vstavljen sistem sta imela v genomu zapis za dve integrazni kaseti. Celice s dvakratnim sistemom, so bile bolj občutljive na koncentracijo Las-AHL (N-(3-oxododekanoil)-L-homoserin lakton) kot celice z enkratnim sistemom. Opazovali so kakšen je odziv neterminalno diferenciarnih in terminalno diferenciranih celic (pri 1x in 2x vstavljenem sistemu) na različne koncentracije salicilne kisline (promovira izražanje integraze). Ugotovili so, da je bil podvojen sistem nekoliko bolj občutljiv na koncentracijo Las-AHL (10-30 µM). Da so lahko lahko pozitivne učinke diferenciacije in terminalne diferenciacije potrdili, so slednji poskus izvedli na osnovnih nediferenciranih celicah. Slednje so izražale bremensko funkcijo in opravljale funkcijo replokacije.

'''Odpornost na toksične funkcije'''

Glede na prejšnje rezultate so predostavili, da bi tako diferenciran sistem omogočil izražanje toksičnih funkcij, ki rezultirajo v celični lizi. Da bi slednje potrdili, so kot gen uporabili dnaseI (DNAzaI). Predpostavili so, da se v progenitorskih celicah brez T7 RNA polimeraze DNAzaI ne bi izražala, zato njena toksičnost ne pride do izraza. Problem je nastal, ker so uporabili isti plazmid ColE1-AmpR, kot doslej, le da so namesto sfGFP vstavili zapis za DNAzoI. Prišlo je do nastanka mutiranih plazmidov, ki so puščali. Da bi to preprečili, so vključili dva izolirana terminaroja pred T7 RNA polimerazni promotor promotor (je ublažilo puščanje), hkrati so zmanjšali moč RBS. Slednje je rezultiralo v izražanju pravilnega dnaznega konstrukta. Pri enojnem in dvojnem sistemu v celicah skupaj z danim plazmidom, so te zrastle ~600 cfu in ~1000 cfu, medtem ko pri enojnem in dvojnem sistemu v osnovne progenitorskem sevu zrastlo 1 in 0 kolonij. Kot kontrolo so vzel kolonijo s plazmidom za GFP, ki je imela več kot 104 kolonij.

== Zaključek ==

Celice lahko v naravi opravjajo različne funkcije, ki so lahko sintetsko bolj ali manj zapletene. Slednje želimo doseči tudi v laboratorijih, a vstavljanje različnih vezij za celico predstavlja veliko breme. Slednje rezultira v veliki evolucijski nestabilnosti in izgubi željenega produkta. Da bi preprečili izgube izraženega produkta, so v sev E.coli (JS006) vstavili sintezno biološko »vezje« za diferenciacijo in terminalno diferenciacijo celic. Slednje izražajo željeno funkcijo pod vplivom T7 RNA polimeraze. Omejevanje rasti diferenciranim celicam rezultira v odpornosti na bremenske nivoje in mutacije. Preko zmanjšanja bremenskih mutacij se porast nediferenciranih celic upočasni in se izboljša evolucijska stabilnost terminalno diferenciranih celic ter posledično željena funkcija. Terminalna diferenciacija je odporna tudi proti mutacijam plazmida, saj na pram diferenciranim in nediferenciranim celicam njegove efekte ublaži. Dvakratno uporabljeno vezje pa se je izkazalo kot učinkovito v primeru uporabe izražanja toksičnega gena. Terminalno diferencirane celice so imele veliko porast glede na nediferencirane, ki te niso izražale. Slednje nakazuje, da je skonstruirano vezje uporabno za izražanje toksičnih funkcij, brez da bi prišlo do popolne lize celic v kulturi.

== Viri ==

[1] R.L. Williams, R.M. Murray. Integrase-mediated differentiation circuits improve evolutionary stability of burdensome and toxic functions in E. coli. Nat Commun. 2022,13, 6822.

[2] J. van Gestel, H. Vlamakis, R. Kolter, Division of Labor in Biofilms: the Ecology of Cell Differentiation. Microbiology Spectrum. 2015, 3.

[3] K. E. McGinness, T. A. Baker, R. T. Sauer, Engineering Controllable Protein Degradation. Molecular Cell. 2006, 22, 701–707.

Z integrazo nadzorovan diferenciacijski sistem izboljša evolucijsko stabilnost bremenskih in toksičnih funkcij v E.coli

2023-05-08T10:01:52Z

Nika.banovsek:

''Povzeto po članku: [https://www.nature.com/articles/s41467-022-34361-y R.L. Williams, R.M. Murray. Integrase-mediated differentiation circuits improve evolutionary stability of burdensome and toxic functions in E. coli. Nat Commun. 2022,13, 6822. ]''

== Uvod ==

Cilj sintezne biologije je narediti celice z močno regulacijo in izražanjem kompleksnih funkcij. Slednje zanje predstavlja veliko breme, kar rezultira v negativni evolucijski stabilizaciji in posledično izgubi željene funkcije. Tako smo omejeni na vstavljanje genov, ki so za celico netoksični in ne odražajo bremena. Pri večceličnih sistemih in nekaterih mikroorganizmih pride do diferenciacije celic, ki opravljajo specifično vlogo in tako prevzamejo del bremena celotne kulture. Pri takšnih sistemih govorimo o delitvi dela, ki je lahko metabolična ali reprodukcijska. Naravni sistemi uporabljajo diferenciacijo za koordinacijo pomembnih in esencialnih funkcij. Williams in Murray sta razvila diferenciacijsko strategijo, kjer bi na dane celice aplicirali neesencialne funkcije (niso pomembne za celično preživetje), hkrati pa predstavljajo breme in ovirajo celično rast [1,2].
Diferenciacijska strategija temelji na razdelitvi dela dveh pomembnih funkcij, to sta reprodukcija in izražanje funkcije željenega gena. Hkrati preprečuje selekcijo nastanka mutacij, ki našo funkcijo omejujejo. Razvili so sistem, ki je sestavljen iz dveh celičnih tipov: progenitorske celice, ki so specializirane za replikacijo kodirane funkcije in diferencirane celice, ki kodirajo funkcijo izražajo. Slednje se lahko neskončno delijo. Delitev so omejili preko uporabe rekombinacije z Bxb1 integrazo in omogočili aktivacijo ekspresije bremenske funkcije, ki je pod kontorlo T7 RNA polimeraze. Hkrati so povzročili inaktivacijo izražanja π proteina, ki je esencialen faktor za replikacijo plazmida R6K. Ob delitvi in rasti diferenciacijskih celic pride do izgube plazmida R6K, proliferacijo lahko nato omejimo s selekcijo antibiotikov. Takšne diferenciacijske celice so omejene preko t.i. terminalne diferenciacije (celice se ne morejo več delit). Ekspresija željenega gena se ne aktivira pred diferenciacijo, zato v progenitorskih celicah ni selekcijskega pritiska na mutacije, ki to funkcijo ovirajo. Terminalna diferenciacija diferenciranih celic omeji razširitev takšnih mutacij v populaciji. Celice s terminalno diferenciacijo povečajo evolucijsko stabilnost in so bolj odporne na mutacije, ki zmanjšajo ekspresijo bremenskega gena [1,3].

== Rezultati ==
'''Razvoj diferenciacijskega sistema'''

V osnovi je prvotna populacija izvajajočih/producirajočih (''angl.'' producer cells) celic imela zmanjšano porast, zaradi bremena, ki je povezan z željenim genom. Preko t.i. bremenskih mutacij, ki inaktivirajo izražanje našega gena, pride do namnožitve neizvajajočih/neproducirajočih (''angl.'' non-prudcer cells) celic, ki ne izražajo željene funkcije in imajo normalno rast. Da pride do nastanka neproducirajočih celic, morata reprodukcija in ekspresija željene funkcije nastati v isti celici. Strategija terminalne diferenciacije omogoči ločitev teh dveh lasnosti preko razdelitve dela in posledično omogoči ohranjanje ekspresije željenega gena.

Za ločitev prej omenjenih lastnosti so razvili sintezno biološki sistem, kjer so v genom ''E.coli'' vstavili gen za bakteriofagno serinsko integrazo Bxb1. Za nastavljanje ekspresije Bxb1 in posledično stopnje diferenciacije, so uporabili preko salicilata inducibilen promotor PSalTTC in njegov transkripcijski faktor NahR. V sam genom so hkrati vstavili gen za T7 RNA polimerazo. Gen so postavili pod IPTG inducibilni promotor PTac , skupaj z LacI represorjem. Da so omejili proliferacijo diferenciranih celic v primeru terminalne diferenciacije, so tarčili replikacijo R6K plazmida, ki je odvisna od π proteina (kodira ga gen ''pir''). Za to so uporabili inducibilni promotor PLasAM in njegov transkripcijski faktor LasRAM za kontrolo ekspresije π proteina. Kaseto so postavili tako, da v primeru rekombinacij preko integraze pride do njegove izključitve in π protein se ne izraža več. Obilica π proteina in število kopij R6K plazmida se v času diferenciacije lahko nastavljata preko Las-AHL promotorja. R6K plazmid kodira tudi za odpornost na kloramfenikol. Preko nivojev izražanja π proteina slednji omeji število kopij plazmida v času diferenciacije ob prisotnosti selekcije s kloramfenikolom. Delovanje T7 RNA polimeraze so preverjali preko plazmida ColE1-AmpR, ki je vseboval zapis za sfGFP (bremenska funkcija), ki je pod promotrojem PT7. Začetno vezje so skonstruirali tako, da je zapis za polimerazo sledil za genom ''pir'', kar se je v progenitorskih celicah odražalo kot puščanje promotorja. Za preprečitev tega, so gen razcepili preko inserta za π protein. Na mestih deljene T7 RNA polimeraze so primerno umestili rekombinacijska mesta, kamor se je lahko vezala Bxb1 integraza. Slednja je ob vezavi povzročila delecijo inserta z genom ''pir'' in nastanek funkcionalne T7 RNA polimeraze. Ta se veže na PT7 ColE1-AmpR plazmida in aktivira transkripcijo željenega gena. Ob odsotnosti Bxb1 integraze, je bilo sfGFP izražanje enako kot pri negativni kontroli brez RNA polimeraze. Induciranje z Bxb1 je povzročilo povišanje koncentracije T7 RNA polimeraze in posledično povečanje izražanja sfGFP. Opisan sistem so opazovali v progenitorskih celicah, diferenciranih celicah in terminalno diferenciranih celicah.

'''Optimizacija diferenciacijskega sistema'''

Problem, ki se pojavi, je, da je pri tako obremenjenih sistemih pride do t.i. diferenciacijskih mutacij. Slednje progenitorskim celicam onemogočijo diferenciacijo. Z zmanjšanjem verjetnosti, da takšne mutacije nastanejo, se podaljša čas izražanja funkcije pri terminalni diferenciaciji (zakasnimo pojav nediferenciacije). V prvotnem primeru so imeli le eno T7 RNA polimerazno kaseto, ki aktivira izražanje željenega gena in hkrati omeji rast diferenciranih celic. Ena mutacija, ki preprečuje rekombinacijo naše kasete, bi bila dovolj, da onemogoči selekcijo preko antibiotika in povroči kupičenje bremenskih mutacij. Če v naš sistem vključimo dve T7 RNA polimerazni kaseti, kjer vsaka kodira za polovico π proteina, potrebujemo oba dela, da dobimo funkcionalen protein π. Tako bi v primeru le ene rekombinacije (ob delovanju integraze) prišli do neaktivnega π proteina in do zmanjšanja replikacije R6K plazmida. Za pojav nediferenciacije v podvojenem sistemu bi tako potrebovali dve neodvisni mutaciji. Dan sistem so naredli preko vezave Cfa-inteina na N- in C- terminalni del π proteina. Ob odsotnosti integraze pride do nastanka funkcionalnega proteina. 1x (ena kaseta s T7 RNA polimerazo) in 2x (dve kaseti s T7 RNA polimerazo) vstavljen sistem sta imela v genomu zapis za dve integrazni kaseti. Celice s dvakratnim sistemom, so bile bolj občutljive na koncentracijo Las-AHL (N-(3-oxododekanoil)-L-homoserin lakton) kot celice z enkratnim sistemom. Opazovali so kakšen je odziv neterminalno diferenciarnih in terminalno diferenciranih celic (pri 1x in 2x vstavljenem sistemu) na različne koncentracije salicilne kisline (promovira izražanje integraze). Ugotovili so, da je bil podvojen sistem nekoliko bolj občutljiv na koncentracijo Las-AHL (10-30 µM). Da so lahko lahko pozitivne učinke diferenciacije in terminalne diferenciacije potrdili, so slednji poskus izvedli na osnovnih nediferenciranih celicah. Slednje so izražale bremensko funkcijo in opravljale funkcijo replokacije.

'''Odpornost na toksične funkcije'''

Glede na prejšnje rezultate so predostavili, da bi tako diferenciran sistem omogočil izražanje toksičnih funkcij, ki rezultirajo v celični lizi. Da bi slednje potrdili, so kot gen uporabili dnaseI (DNAzaI). Predpostavili so, da se v progenitorskih celicah brez T7 RNA polimeraze DNAzaI ne bi izražala, zato njena toksičnost ne pride do izraza. Problem je nastal, ker so uporabili isti plazmid ColE1-AmpR, kot doslej, le da so namesto sfGFP vstavili zapis za DNAzoI. Prišlo je do nastanka mutiranih plazmidov, ki so puščali. Da bi to preprečili, so vključili dva izolirana terminaroja pred T7 RNA polimerazni promotor promotor (je ublažilo puščanje), hkrati so zmanjšali moč RBS. Slednje je rezultiralo v izražanju pravilnega dnaznega konstrukta. Pri enojnem in dvojnem sistemu v celicah skupaj z danim plazmidom, so te zrastle ~600 cfu in ~1000 cfu, medtem ko pri enojnem in dvojnem sistemu v osnovne progenitorskem sevu zrastlo 1 in 0 kolonij. Kot kontrolo so vzel kolonijo s plazmidom za GFP, ki je imela več kot 104 kolonij.

== Zaključek ==

Celice lahko v naravi opravjajo različne funkcije, ki so lahko sintetsko bolj ali manj zapletene. Slednje želimo doseči tudi v laboratorijih, a vstavljanje različnih vezij za celico predstavlja veliko breme. Slednje rezultira v veliki evolucijski nestabilnosti in izgubi željenega produkta. Da bi preprečili izgube izraženega produkta, so v sev E.coli (JS006) vstavili sintezno biološko »vezje« za diferenciacijo in terminalno diferenciacijo celic. Slednje izražajo željeno funkcijo pod vplivom T7 RNA polimeraze. Omejevanje rasti diferenciranim celicam rezultira v odpornosti na bremenske nivoje in mutacije. Preko zmanjšanja bremenskih mutacij se porast nediferenciranih celic upočasni in se izboljša evolucijska stabilnost terminalno diferenciranih celic ter posledično željena funkcija. Terminalna diferenciacija je odporna tudi proti mutacijam plazmida, saj na pram diferenciranim in nediferenciranim celicam njegove efekte ublaži. Dvakratno uporabljeno vezje pa se je izkazalo kot učinkovito v primeru uporabe izražanja toksičnega gena. Terminalno diferencirane celice so imele veliko porast glede na nediferencirane, ki te niso izražale. Slednje nakazuje, da je skonstruirano vezje uporabno za izražanje toksičnih funkcij, brez da bi prišlo do popolne lize celic v kulturi.

== Viri ==

[1] R.L. Williams, R.M. Murray. Integrase-mediated differentiation circuits improve evolutionary stability of burdensome and toxic functions in E. coli. Nat Commun. 2022,13, 6822.

[2] J. van Gestel, H. Vlamakis, R. Kolter, Division of Labor in Biofilms: the Ecology of Cell Differentiation. Microbiology Spectrum. 2015, 3.

[3] K. E. McGinness, T. A. Baker, R. T. Sauer, Engineering Controllable Protein Degradation. Molecular Cell. 2006, 22, 701–707.

Z integrazo nadzorovan diferenciacijski sistem izboljša evolucijsko stabilnost bremenskih in toksičnih funkcij v E.coli

2023-05-08T10:00:29Z

Nika.banovsek:

''Povzeto po članku: [https://www.nature.com/articles/s41467-022-34361-y R.L. Williams, R.M. Murray. Integrase-mediated differentiation circuits improve evolutionary stability of burdensome and toxic functions in E. coli. Nat Commun. 2022,13, 6822. ]''

== Uvod ==

Cilj sintezne biologije je narediti celice z močno regulacijo in izražanjem kompleksnih funkcij. Slednje zanje predstavlja veliko breme, kar rezultira v negativni evolucijski stabilizaciji in posledično izgubi željene funkcije. Tako smo omejeni na vstavljanje genov, ki so za celico netoksični in ne odražajo bremena. Pri večceličnih sistemih in nekaterih mikroorganizmih pride do diferenciacije celic, ki opravljajo specifično vlogo in tako prevzamejo del bremena celotne kulture. Pri takšnih sistemih govorimo o delitvi dela, ki je lahko metabolična ali reprodukcijska. Naravni sistemi uporabljajo diferenciacijo za koordinacijo pomembnih in esencialnih funkcij. Williams in Murray sta razvila diferenciacijsko strategijo, kjer bi na dane celice aplicirali neesencialne funkcije (niso pomembne za celično preživetje), hkrati pa predstavljajo breme in ovirajo celično rast [1,2].
Diferenciacijska strategija temelji na razdelitvi dela dveh pomembnih funkcij, to sta reprodukcija in izražanje funkcije željenega gena. Hkrati preprečuje selekcijo nastanka mutacij, ki našo funkcijo omejujejo. Razvili so sistem, ki je sestavljen iz dveh celičnih tipov: progenitorske celice, ki so specializirane za replikacijo kodirane funkcije in diferencirane celice, ki kodirajo funkcijo izražajo. Slednje se lahko neskončno delijo. Delitev so omejili preko uporabe rekombinacije z Bxb1 integrazo in omogočili aktivacijo ekspresije bremenske funkcije, ki je pod kontorlo T7 RNA polimeraze. Hkrati so povzročili inaktivacijo izražanja π proteina, ki je esencialen faktor za replikacijo plazmida R6K. Ob delitvi in rasti diferenciacijskih celic pride do izgube plazmida R6K, proliferacijo lahko nato omejimo s selekcijo antibiotikov. Takšne diferenciacijske celice so omejene preko t.i. terminalne diferenciacije (celice se ne morejo več delit). Ekspresija željenega gena se ne aktivira pred diferenciacijo, zato v progenitorskih celicah ni selekcijskega pritiska na mutacije, ki to funkcijo ovirajo. Terminalna diferenciacija diferenciranih celic omeji razširitev takšnih mutacij v populaciji. Celice s terminalno diferenciacijo povečajo evolucijsko stabilnost in so bolj odporne na mutacije, ki zmanjšajo ekspresijo bremenskega gena [1,3].

== Rezultati ==
'''Razvoj diferenciacijskega sistema'''

V osnovi je prvotna populacija izvajajočih/producirajočih (''angl.'' producer cells) celic imela zmanjšano porast, zaradi bremena, ki je povezan z željenim genom. Preko t.i. bremenskih mutacij, ki inaktivirajo izražanje našega gena, pride do namnožitve neizvajajočih/neproducirajočih (''angl.'' non-prudcer cells) celic, ki ne izražajo željene funkcije in imajo normalno rast. Da pride do nastanka neproducirajočih celic, morata reprodukcija in ekspresija željene funkcije nastati v isti celici. Strategija terminalne diferenciacije omogoči ločitev teh dveh lasnosti preko razdelitve dela in posledično omogoči ohranjanje ekspresije željenega gena.

Za ločitev prej omenjenih lastnosti so razvili sintezno biološki sistem, kjer so v genom ''E.coli'' vstavili gen za bakteriofagno serinsko integrazo Bxb1. Za nastavljanje ekspresije Bxb1 in posledično stopnje diferenciacije, so uporabili preko salicilata inducibilen promotor PSalTTC in njegov transkripcijski faktor NahR. V sam genom so hkrati vstavili gen za T7 RNA polimerazo. Gen so postavili pod IPTG inducibilni promotor PTac , skupaj z LacI represorjem. Da so omejili proliferacijo diferenciranih celic v primeru terminalne diferenciacije, so tarčili replikacijo R6K plazmida, ki je odvisna od π proteina (kodira ga gen ''pir''). Za to so uporabili inducibilni promotor PLasAM in njegov transkripcijski faktor LasRAM za kontrolo ekspresije π proteina. Kaseto so postavili tako, da v primeru rekombinacij preko integraze pride do njegove izključitve in π protein se ne izraža več. Obilica π proteina in število kopij R6K plazmida se v času diferenciacije lahko nastavljata preko Las-AHL promotorja. R6K plazmid kodira tudi za odpornost na kloramfenikol. Preko nivojev izražanja π proteina slednji omeji število kopij plazmida v času diferenciacije ob prisotnosti selekcije s kloramfenikolom. Delovanje T7 RNA polimeraze so preverjali preko plazmida ColE1-AmpR, ki je vseboval zapis za sfGFP (bremenska funkcija), ki je pod promotrojem PT7. Začetno vezje so skonstruirali tako, da je zapis za polimerazo sledil za genom ''pir'', kar se je v progenitorskih celicah odražalo kot puščanje promotorja. Za preprečitev tega, so gen razcepili preko inserta za π protein. Na mestih deljene T7 RNA polimeraze so primerno umestili rekombinacijska mesta, kamor se je lahko vezala Bxb1 integraza. Slednja je ob vezavi povzročila delecijo inserta z genom ''pir'' in nastanek funkcionalne T7 RNA polimeraze. Ta se veže na PT7 ColE1-AmpR plazmida in aktivira transkripcijo željenega gena. Ob odsotnosti Bxb1 integraze, je bilo sfGFP izražanje enako kot pri negativni kontroli brez RNA polimeraze. Induciranje z Bxb1 je povzročilo povišanje koncentracije T7 RNA polimeraze in posledično povečanje izražanja sfGFP. Opisan sistem so opazovali v progenitorskih celicah, diferenciranih celicah in terminalno diferenciranih celicah.

'''Optimizacija diferenciacijskega sistema'''

Problem, ki se pojavi, je, da je pri tako obremenjenih sistemih pride do t.i. diferenciacijskih mutacij. Slednje progenitorskim celicam onemogočijo diferenciacijo. Z zmanjšanjem verjetnosti, da takšne mutacije nastanejo, se podaljša čas izražanja funkcije pri terminalni diferenciaciji (zakasnimo pojav nediferenciacije). V prvotnem primeru so imeli le eno T7 RNA polimerazno kaseto, ki aktivira izražanje željenega gena in hkrati omeji rast diferenciranih celic. Ena mutacija, ki preprečuje rekombinacijo naše kasete, bi bila dovolj, da onemogoči selekcijo preko antibiotika in povroči kupičenje bremenskih mutacij. Če v naš sistem vključimo dve T7 RNA polimerazni kaseti, kjer vsaka kodira za polovico π proteina, potrebujemo oba dela, da dobimo funkcionalen protein π. Tako bi v primeru le ene rekombinacije (ob delovanju integraze) prišli do neaktivnega π proteina in do zmanjšanja replikacije R6K plazmida. Za pojav nediferenciacije v podvojenem sistemu bi tako potrebovali dve neodvisni mutaciji. Dan sistem so naredli preko vezave Cfa-inteina na N- in C- terminalni del π proteina. Ob odsotnosti integraze pride do nastanka funkcionalnega proteina. 1x (ena kaseta s T7 RNA polimerazo) in 2x (dve kaseti s T7 RNA polimerazo) vstavljen sistem sta imela v genomu zapis za dve integrazni kaseti. Celice s dvakratnim sistemom, so bile bolj občutljive na koncentracijo Las-AHL (N-(3-oxododekanoil)-L-homoserin lakton) kot celice z enkratnim sistemom. Opazovali so kakšen je odziv neterminalno diferenciarnih in terminalno diferenciranih celic (pri 1x in 2x vstavljenem sistemu) na različne koncentracije salicilne kisline (promovira izražanje integraze). Ugotovili so, da je bil podvojen sistem nekoliko bolj občutljiv na koncentracijo Las-AHL (10-30 µM). Da so lahko lahko pozitivne učinke diferenciacije in terminalne diferenciacije potrdili, so slednji poskus izvedli na osnovnih nediferenciranih celicah. Slednje so izražale bremensko funkcijo in opravljale funkcijo replokacije.

'''Odpornost na toksične funkcije'''

Glede na prejšnje rezultate so predostavili, da bi tako diferenciran sistem omogočil izražanje toksičnih funkcij, ki rezultirajo v celični lizi. Da bi slednje potrdili, so kot gen uporabili dnaseI (DNAzaI). Predpostavili so, da se v progenitorskih celicah brez T7 RNA polimeraze DNAzaI ne bi izražala, zato njena toksičnost ne pride do izraza. Problem je nastal, ker so uporabili isti plazmid ColE1-AmpR, kot doslej, le da so namesto sfGFP vstavili zapis za DNAzoI. Prišlo je do nastanka mutiranih plazmidov, ki so puščali. Da bi to preprečili, so vključili dva izolirana terminaroja pred T7 RNA polimerazni promotor promotor (je ublažilo puščanje), hkrati so zmanjšali moč RBS. Slednje je rezultiralo v izražanju pravilnega dnaznega konstrukta. Pri enojnem in dvojnem sistemu v celicah skupaj z danim plazmidom, so te zrastle ~600 cfu in ~1000 cfu, medtem ko pri enojnem in dvojnem sistemu v osnovne progenitorskem sevu zrastlo 1 in 0 kolonij. Kot kontrolo so vzel kolonijo s plazmidom za GFP, ki je imela več kot 104 kolonij.

== Zaključek ==

Celice lahko v naravi opravjajo različne funkcije, ki so lahko sintetsko bolj ali manj zapletene. Slednje želimo doseči tudi v laboratorijih, a vstavljanje različnih vezij za celico predstavlja veliko breme. Slednje rezultira v veliki evolucijski nestabilnosti in izgubi željenega produkta. Da bi preprečili izgube izraženega produkta, so v sev E.coli (JS006) vstavili sintezno biološko »vezje« za diferenciacijo in terminalno diferenciacijo celic. Slednje izražajo željeno funkcijo pod vplivom T7 RNA polimeraze. Omejevanje rasti diferenciranim celicam rezultira v odpornosti na bremenske nivoje in mutacije. Preko zmanjšanja bremenskih mutacij se porast nediferenciranih celic upočasni in se izboljša evolucijska stabilnost terminalno diferenciranih celic ter posledično željena funkcija. Terminalna diferenciacija je odporna tudi proti mutacijam plazmida, saj na pram diferenciranim in nediferenciranim celicam njegove efekte ublaži. Dvakratno uporabljeno vezje pa se je izkazalo kot učinkovito v primeru uporabe izražanja toksičnega gena. Terminalno diferencirane celice so imele veliko porast glede na nediferencirane, ki te niso izražale. Slednje nakazuje, da je skonstruirano vezje uporabno za izražanje toksičnih funkcij, brez da bi prišlo do popolne lize celic v kulturi.

== Viri ==

[1] R.L. Williams, R.M. Murray. Integrase-mediated differentiation circuits improve evolutionary stability of burdensome and toxic functions in E. coli. Nat Commun. 2022,13, 6822.
[2] J. van Gestel, H. Vlamakis, R. Kolter, Division of Labor in Biofilms: the Ecology of Cell Differentiation. Microbiology Spectrum. 2015, 3.
[3] K. E. McGinness, T. A. Baker, R. T. Sauer, Engineering Controllable Protein Degradation. Molecular Cell. 2006, 22, 701–707.

2020-12-11T16:40:54Z

Nika.banovsek: /* POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2020/21 */

= POVZETKI SEMINARJEV BIOKEMIJA 2020/21 =

==Jan Bregar - Protein retinoblastoma==

Protein retinoblastoma (pRb) je eden ključnih proteinov, ki regulirajo celični cikel in njegova inaktivacija lahko povzroči različna bolezenska stanja. Ta protein regulira ključni prehod iz G1 v S fazo celičnega cikla s pomočjo interakcij z družino E2F, ki je vrsta transkripcijskih faktorjev celičnega cikla. Retinoblastoma protein (pRb) nadzoruje tudi izstop celice iz celičnega cikla. Njeno aktivnost regulira več mehanizmov, ki zaznavajo znotraj- in zunajcelične signale, ki blokirajo ali dovoljujejo fosforilacijo. pRb fosforilirajo od ciklina odvisne kinaze (Cdk-ji) in s tem protein Rb bodisi inaktivirajo ali pa rahlo spremenijo njegove lastnosti, protein pa vseeno ohrani svojo funkcijo. Odkrili so tudi, da pRb regulira apoptozo s pomočjo enakih interakcij s transkripcijskimi faktorji E2F. To, da je pRb vpleten pri apoptozi, popolno dopolnjuje pRb kot pomemben določevalec usode celice. Med trajanjem celičenga cikla je pRb inaktiviran, kar povzroči, da je celica bolj občutljiva na apoptotske stimuluse. Regulacijo apoptoze lahko onesposobijo nekateri virusi, ki s svojimi onkoproteini povzročijo napake v delovanju proteina Rb, kar lahko predstavlja tveganje za organizem. pRb – E2F kompleksi imajo pomembno vlogo pri regulaciji transkripcije genov, ki so vključeni v diferenciaciji in razvoju.

==Ajda Beltram - Struktura in dinamika signalnih komplekov GPCR==

Receptorji sklopljeni z G-proteinom (GPCR) so transmembranski proteini, ki kot odgovor na ligande regulirajo veliko signalnih poti preko heterotrimernih G-proteinov ali pa preko fosforilacije receptorja s kinazo GRK in arestinov. Vendar ti proteini ne obstajajo le v aktivirani ali neaktivirani obliki, pač pa imajo veliko konformacijskih stanj, ki vsaka sproži svojo signalno pot. Mene je zanimala podrobna razlaga konformacijskih sprememb, ki se zgodijo med prenosom signala. Za aktivacijo G-proteinov je potrebna zamenjava GDP z GTP, kjer igra ključno vlogo razcep domen podenote α G-proteina in destabilizacija vezavnega mesta za nukleotid na Ras-domeni podenote α, kar so posledice konformacijskih sprememb, ki jih povzroči vezava na receptor. Različni ligandi, ki se vežejo na receptorje, pa lahko vplivajo tudi na afiniteto G-proteina do GDP. Kompleksi receptor-G-protein, ki nastanejo z vezavo popolnih agonistov, imajo manjšo afiniteto do GDP, kot tisti, ki so nastali z vezavo delnih agonistov. Pri arestinih pa so prav tako prišli do novega spoznanja. Aktivacija arestinov je večinoma prikazana kot proces iz dveh delov in sicer vezave na fosforiliran C-rep receptorja in nato vezave na jedro receptorja, vendar pa so odkrili, da lahko obe vezavi posebej aktivirata arestin. To nakazuje na to, da verjetno obstaja veliko različnih kompleksov arestina in receptorja, ki regulirajo vsak svojo signalno pot.

==Anja Moškrič - Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmitorjev==

Signalizacija živčnih celic med drugim poteka s prenosom nevrotransmitorjev preko sinaps. Pri kemični sinapsi gre za pretvarjanje električnih impulzov v eksocitotsko sprostitev nevrotransmitorja (npr. glutamat, GABA, epinefrin, norepinefrin). Pri pretvarjanju signala imajo ključno vlogo napetostno uravnavani kalcijevi ionski kanalčki (Cav), v presinaptičnem predelu. Ti, kot odgovor na depolarizacijo nevrona, usmerjajo kalcijeve ione v notranjost celice in posledično sprožijo fuzijo mešička (z nevrotransmitorjem) s presinaptično membrano. Zgrajeni so iz več podenot, od teh je glavna α1, ki tvori poro za pretok ionov. Podenoti α2δ in β pa regulirata lastnosti. Kanalčke glede na obliko glavne podenote klasificiramo v 3 večje skupine: Cav1, Cav2 in Cav3. V večini sinaps so prisotni kanalčki iz družine Cav2. Da eksocitoza lahko poteče hitro in učinkovito, morajo biti Cav locirani znotraj aktivne regije presinaptične membrane, v bližini mesta eksocitoze. Slednjo kalcijevi kanalčki regulirajo preko različnih proteinov. Pomembnejši predstavnik je družina proteinov RIM (z rab3 vezavne molekule). Ti se na kanalček vežejo z RIM vezavnimi proteini (RBP). Z njimi asociira tudi protein munc13, ki je v membrani vezikla in nevrona vezani s proteini SNARE. Ti so mediatorji pri fuziji membran. Delovanje kanalčka inaktivirajo procesi, kot sta od napetosti odvisni mehanizem in od kalcija odvisen mehanizem, ki je povezan s kalmodulinom.

==Gregor Strniša - Načini aktivacije GPCR==

GPCR, oziroma z G proteinom sklopljeni receptorji, so transmembranski proteini, ki s svojim delovanjem vplivajo na dogajanje v celici. Zaradi vezave liganda na njihovo zunajcelično stran se jim spremeni konformacija in omogoči prenos signala preko različnih signalnih molekul. Signal se preko različnih G proteinov in β-arrestinov prenaša do drugih proteinov v celici. Kmalu po odkritju GPCR se je izkazalo, da vsi ne delujejo po istem principu. Nove raziskovalne metode so omogočile napredek na področju vizualizacije molekul in njihovega sledenja v celici. Tako so znanstveniki prišli do odkritja petih novih metod aktivacije GPCR, ki lažje razložijo delovanje receptorjev. Med seboj so si različne, a se lahko pogosto prekrivajo in dopolnjujejo. GPCR omogočijo več možnosti odgovora na določen ligand in njegovo koncentracijo. Načini aktivacije, predstavljeni v moji seminarski nalogi, so pristranska aktivacija, znotrajcelična aktivacija, dimerizacijska aktivacija, transaktivacija in dvofazna aktivacija. Posamezen receptor navadno deluje na več načinov. Ob posameznem načinu so podani primeri receptorjev in njihovega delovanja. Z razumevanjem načinov njihove aktivacije se odprejo nove možnosti razvoja zdravil, ki bi delovale preko GPCR, ali vplivale na njihove signalne poti.

==Nikola Janakievski - Selective Androgen Receptor Modulators==

Selective Androgen Receptors Modulators or better known as SARMs, were discovered 30 years ago, as a potential replacement to steroid therapy. SARMs are a type of Selective Receptor Modulators (SRM), compounds which can act both as agonists and antagonists in androgen receptors (ARs) (as a non-steroid replacement), according to the tissue they are in. The main idea behind SARMs, is improving the hormone therapies we have currently, which use synthetic steroids. An ideal SARM could have all the benefits of steroid hormones, without the side effects. The potential benefits and safety of SARMs is yet to be determined, there are numerous ongoing studies for various applications. It is important to have a summary of all these potential application and past examples of studies. In this seminar, we aim to do just that, by comparing all past studies and future potential applications related to SARMs. We conclude that, SARMs are a viable alternative, possibly an improvement to synthetic steroids, although much more research and clinical trials are required for SARMs to become truly applicable.

==Vid Dobrovoljc - Medsebojni vpliv signalnih poti na primeru RTK in GPCR signalnih poti==

Preučevanje součinkovanja med signalnimi potmi v celici je zelo zanimivo področje, vendar dokaj težko za raziskovanje. S seminarjem sem poizkusil predstaviti sovplivanje inzulinske(RTK) in β-adrenergične (GCPR) poti v srcu. . Inzulin na β-adrenergične (βAR) poti vpliva s fosforilacijo receptorja z različnimi kinazami, na primer protein kinazo A (PKA) G-protein kinazo (GRK2) in celo sam inzulinskim receptorjem (INSR), kar vodi do desenzitacije in včasih tudi internalizacije receptorja z vezavo β-arestina. Drug način vplivanja je z delovanjem na nižje člene v signalni poti, na primer na koncentracijo cAMP s fosfodiesterazami (PDE). Inzulin lahko tudi s pomočjo fosforilacije uporabi β-adrenergično pot za krepitev svojega signala. Zelo pomembna točka obeh signalnih poti je GRK2, ki po naravi deluje inhibirajoče na obe signalni poti, po zadnjih rezultatih pa jo poleg tega inzulin uporablja za še dodatno inhibicijo GPCR poti. Vplivanje βAR poti na inzulinsko pot je manj jasno, vendar kaže, da lahko βAR na sprejem glukoze v odvisnosti od situacije vpliva tako pozitivno kot negativno, dokaj pomembno vlogo pri tem pa ima PKB. Domnevam, da bo v prihodnosti vedno več raziskav na temo povezav med signalnimi potmi, saj bodo razvite nove opazovalne tehnike, poleg tega pa je razumevanje povezav koristno tako pri razvoju novih tehnik zdravljenja, kot pri samem študiju razvoja celične signalizacije

==Rebeka Jerina - Kofein kot antagonist adenozinskih receptorjev==

Veliko ljudi po svetu pije kavo, čaj ali kokakolo. Vsem naštetim pijačam je skupen kofein, najpogosteje zaužit psihostimulant na svetu. Kofein povzroča veliko učinkov, med katerimi je najbolj znan vpliv na budnost. Zanima me ali vemo kako in zakaj jo povzroči. Kofein je antagonist adenozinskih receptorjev (ARs). Ima podobno strukturo kot adenozin, zato lahko zaseda njegova vezavna mesta. Adenozinski receptorji so izraženi v mnogih tkivih, veliko pa jih najdemo v centralnem živčnem sistemu (CNS). Raziskala sem, da kofein večinoma vpliva na adenozinska receptorja podtipa A1 in A2A. Te dva podtipa adenozinskih receptorjev (ARs) vplivata na regulacijo mnogih fizioloških funkcij kot so spanje, kognicija, motivacija in čustva. Kofein tako z antagonizmom adenozinskih receptorjev (ARs) prepreči signalno kaskado, ki bi spodbudila zaspanost in posledično ohranja budnost. Adenozinski receptorji (ARs) spadajo pod receptorje povezane z G-proteini. Zgradba A1AR in A2AAR se nekoliko razlikuje, zato je tudi mehanizem delovanja teh dveh podtipov nekoliko drugačen. Signalizacija adenozinskih receptorjev (ARs) lahko poteka po več različnih signalnih poteh. Kofein bi zaradi pozitivnih okrepitvenih učinkov, pojava različnih duševnih motenj in pojava negativnih simptomov po prenehanju uživanja lahko prištevali med droge. Raziskave so pokazale, da se z antagonizmom adenozinskih receptorjev da uspešno zdraviti tudi številne bolezni. Glede na učinke in uporabo kofeina bi lahko rekli, da velja za hranilo, zdravilo ali drogo.

==Zala Perko - Mehanizmi vezave ligandov in regeneracija fotoreceptorjev očesne mrežnice==

Fotoreceptorji v membrani celic očesne mrežnice so značilni predstavniki z G-proteinom sklopljenih receptorjev. Njihova naloga je absorpcija svetlobe določene valovne dolžine in prenos signala preko G-proteina na citoplazemsko stran, kjer poteče veriga encimsko kataliziranih reakcij. Aktiviran fotoreceptor mora v procesu regeneracije ponovno zavzeti neaktivno konformacijo in vezati naravni ligand 11-cis-retinal. Barvni fotoreceptorji jodopsini zahtevajo učinkovit regeneracijski mehanizem, ker morajo stalno procesirati veliko količino svetlobnih signalov. Aktivna konformacija jodopsina razpade veliko hitreje v primerjavi z rodopsinom in tudi sam potek regeneracije je pri jodopsinih hitrejši. Vzrok za to bi lahko bila različna usoda desenzibiliziranih receptorjev. Nedavno so odkrili možnost, da pri regeneraciji jodopsinov pride do preusmeritve signalne poti. Namesto, da se receptor deaktivira preko internalizacije z arestinom, ostane v membrani in veže ligand glede na prehodno konformacijsko stanje v katerem se nahaja. Na različen potek regeneracije jodopsinov bi lahko vplivala tudi vezava druge molekule retinala v alosterično mesto, ki je posledica konformacijskih sprememb. Povezava med interakcijo retinala in njegovih analogov z določenim konformacijskim intermediatom ima pomembno vlogo tudi s terapevtskega vidika, saj GPCR-ji v splošnem predstavljajo terapevtske tarče za zdravljenje mnogih obolenj. Uporaba analogov 11-cis-retinala, kot sta 9CR in 6mr, ki se vežeta v aktivno ali eno od alosteričnih mest, bi lahko predstavljala učinkovit pristop pri zdravljenju prirojenih mutacij v fotoreceptorjih.

==Eva Vene - Povezava bolečine z vezavo kapsaicina na TRPV1==

Družina TRP kanalčkov pri živalih združuje devet manjših skupin kationskih prenašalcev, ki odločilno vplivajo na pravilno delovanje organizma. Eden od tovrstnih kanalčkov je tudi TRPV1 z angleškim imenom »transient receptor potential vanilloid 1«. Tega najdemo v mnogih organih in organskih sistemih, natančneje pa se v tem seminarju osredotočamo na njegovo vlogo v perifernem živčevju. TRPV1 vsebuje okoli polovica vseh somatskih in visceralnih senzoričnih nevronov, zato je pomemben mediator pri nocicepciji oziroma zaznavanju možno nevarnih stimulov ter njihovim prevodom v akcijskih potencial. Njegovo delovanje, poleg nekaterih drugih dražljajev, lahko vzbudi organska molekula, imenovana kapsaicin. Slednjega najdemo v sadežih rastlin rodu Capsicum in ga pojmujemo kot eno odločilnih molekul za pekoč okus teh plodov. Ob vezavi kapsaicina na TRPV1 v celico vdrejo kationi, ki spodbudijo različne celične procese, ključne za oblikovanje in prenos živčnega signala do možganov ter pojav vnetja. Posebej zanimive so dvolične posledice vezave kapsaicina, ki sicer vodijo do bolečine, draženja in vnetja, a omogočijo tudi refrakcijsko dobo kanalčka, ki predstavlja čas, ko slednjega ne moremo aktivirati ter desenzitacijo in degradacijo živčnih vlaken, kar povezujemo z analgetičnim učinkom te molekule. Ob redni daljši izpostavitvi kapsaicinu, ki ga lahko administriramo transdermalno ali injiciramo, se tako uspešno uporablja pri lajšanju kroničnih bolečin.

==Erik Putar - AMPK: senzor glukoze ter celičnega energijskega stanja ==

Celica uporablja z AMP aktivirano protein kinazo (AMPK) kot senzor celičnega energijskega stanja in glukoze. Njen glavni aktivator je AMP, ki promovira fosforilacijo Thr172 na AMPK, inhibira defosforilacijo fosforiliranega Thr172 ter alosterično aktivira AMPK. Aktivacija AMPK poteče že ob majhem energijskem deficitu in sproži regulatorni odgovor, ki preusmeri celični metabolizem iz anabolizma v katabolizem. Fosforilacija Thr172 poteče preko kinaze LKB1, medtem ko sta glikogen sintaza in acetil koencim A karboksilaza (ACC) dve tarči izmed mnogih kinazne aktivnosti AMPK. AMPK je heterotrimer sestavljen iz podenot α, β in γ. V α podenoti je prisotno kinazno aktivno mesto ter Thr172, medtem ko so na γ podenoti prisotna vezavna mesta za adenin nukleotide. β podenota je miristilirana na svojem N koncu, kar je ključnega pomena za delovanje glukoznega senzorja. Ta mehanizem poteka na lizosomih in sicer s tvorbo velikega kompleksa, ki vsebuje aldolazo, v-ATPazo, Ragulator, AXIN, LKB1 ter AMPK. Aldolaza je sicer tista, ki čuti prisotnost glukoze in to preko fruktoze 1,6-bisfosfata (FBP): odsotnost FBP v njenem aktivnem mestu aktivira AMPK neodvisno od razmerja koncentracijah adenin nukleotidov in tako preusmeri celico iz glikolitične v alternativne oksidativne poti.

==Timotej Sotošek - Regulacija mišičnega glikogena: granule in njeni proteini ==

Glikogen je primarna oblika shranjevanja glukoze, ki je hitra in dostopna oblika energije. Kljub njegovi pomembnosti pa procesi regulacije glikogena še vedno niso popolnoma jasni. Metabolizem glikogena je zelo reguliran, hkrati pa dinamičen. Kako se bo metabolizem glikogena usmeril, je odvisno od mnogih dejavnikov. Zaloge glikogena v skeletnih mišicah so razdeljena na tri območja: podsarkomerno, intermiofibrilarno in intramiofibrilarno. Vsako od teh območij ima drugačno funkcijo v celici in temu primerno vsaka zase regulira sintezo in razgradnjo glikogenskih granul. Vsaka granula glikogena pa je sposobna tudi samostojnega izvajanja regulacije, pri kateri sodelujejo različni proteini. Eden pomembnejših je protein fosfataza 1 (PP1), ki nadzoruje aktivnost ključnih encimov, kot so glikogen sintaza (GS) in glikogen fosforilaza (GP), pri tem pa mu pomaga glikogen tarčni protein (PTG), ki deluje kot ogrodni protein med PP1 in drugimi proteini. Ta proces je reguliran preko kompleksa laforin-malin, ki prekine povezavo med PP1 in PTG. V seminarju so predstavljene naloge in lastnosti glikogena v treh oddelkih znotraj skeletnih mišic. Predstavljen bo vpliv, ki ga imajo našteti proteini na sintezo glikogena, podrobnejši opis naloge, zgradbe proteinov laforina in malina, kako kompleks laforin-malin inhibira glikogen sintezo ter kakšne so posledice nedelovanja tega proteinskega kompleksa.

==Nika Tomsič - Acetil-CoA: glavni metabolit in sekundarni obveščevalec ==

Acetil-CoA je eden glavnih metabolitov. Deluje kot mejna točka med glikolizo in Krebsovim ciklom. Poleg tega so pomembne tudi njegove naloge kot sekundarni obveščevalec. Nadzoruje ključne celične procese, vključno z energetsko presnovo, mitozo in avtofagijo, tako neposredno kot preko regulacije ekspresije genov. Acetil-CoA običajno nastane v mitohondrijskem matriksu iz piruvata ali kot posledica β-oksidacije dolge verige maščobnih kislin. Lahko pa nastane tudi v citosolu z oksidacijo aminokislin, etanola ali z delovanjem acetil-CoA sintetaze, ki združuje dve glavni komponenti: acetil in koencim A. Razmerje med koncentracijama v mitohondrijskem matriksu in v citosolu je vedno enako. Govorimo torej o nekem dinamičnem ravnotežju, ki ga omogočajo številni prenašalci. Mitohondrijska memebrana je sicer neprepustna za acetil-CoA, zato mora najprej zreagirati v drugo obliko, da lahko vstopa ali iztopa iz mitohondrija. V mitohondrij vstopa piruvat s pomočjo citrat – piruvatnih prenašalcev. Tu piruvat dehidrogenazni kompleks katalizira reakcijo v acetil-CoA. Ko pa je v mitohondriju preveč acetil-CoA, se lahko ta prenese v citosol ali jedro v obliki acetilkarnitina preko karnitinskega prenašalca. V citosolu se spet povrne v acetil-CoA in je lahko vir anabolizma maščobnih kislin ali aminokislin, v jedru pa je njegova funkcija acetiliranje histonov. To omogoči prepisovanje genskega materiala. Lahko pa tudi nadaljuje svojo pot v mitohondriju in vstopi v citratni cikel, kjer je prvi korak pretvorba v citrat preko citratnega sinteznega kompleksa.

==Aleksandra Rauter - Vloga intermediatov Krebsovega cikla v makrofagih==

Makrofagi so nepogrešljive komponente imunskega sistema, ki izhajajo iz matičnih celic kostnega mozga in nastajajo v procesu hematopoeze. Glavne funkcije, ki jih opravljajo so fagocitoza, izločanje citokinov in sodelovanje pri humoralnem imunskem odzivu skupaj z limfociti. Njihovo aktivacijo povzroči prisotnost različnih citokinov, ki se vežejo na specifične TLR receptorje. Najpogostejši ligand klasične aktivacije je lipopolisaharid (LPS), strukturna komponenta celičnih sten bakterij. Zaznava vezanega liganda preko adapterskih proteinov, signalne kaskade, transkripcijskih faktorjev vodi do razvoja enega od dveh fenotipov makrofagov. M1 fenotip ima baktericidno in fagocitno delovanje, M2 pa sodeluje predvsem pri reparaciji tkiv. Točni mehanizmi, ki to povzročijo, še niso poznani. M1 makrofag ima reprogramiran Krebsov cikel, kar povzroči akumulacijo različnih intermediatov v mitohondriju. Ti se lahko prenesejo v citosol preko specifičnih transporterjev in sodelujejo pri različnih regulatornih mehanizmih. Sukcinat povzroči povečano izločanje vnetnih citokinov preko stabilizacije transkripcijskega faktorja HIF-1α, povečanja količine mROS, posttranslacijskih modifikacij proteinov in signalizacije preko z GPCR. Spremenjen Krebsov cikel povzroči akumulacijo citrata, ki je perkurzor itakonata. Ta preko transkripcijske regulacije in inhibicije določenih encimov regulira protivnetni in protimikrobni odziv. Fumarat in α-ketoglutarat sodelujeta pri epigenetski regulaciji celičnih procesov.

==Jakob Tomšič - Funkcije ketonskih telesc v centralnem živčevju ==

Acetoacetat, β-hidroksibutirat in aceton, drugače imenovani tudi ketonska telesca, so produkti našega metabolizma, ki ob pomankanju hranil možgansko tkivo, srce in skeletne mišice oskrbujejo z energijo. Ketogeneze pa danes ne povezujemo le s stanjem pomankanja hranil, ampak jo lahko spodbudimo tudi s tako imenovano ketogeno dieto, ki ji pripisujejo mnoge pozitivne učinke. Vloga ketogene diete pri epilepsiji in drugih nevroloških boleznih je poznana že skoraj stoletje, vendar so bili mehanizmi za antiepileptično delovanje vedno uganka. Trenutno poznamo več funkcij ketonskih telesc, ki presegajo njihovo osnovno metabolno vlogo. Ketonska telesca imajo epigenetski vpliv in lahko spodbujajo izražanje antioksidativnih genov. Prav tako je viden vpliv na vezikularni transport glutamatata z VGLUT v nevronih in zaviranje prenosa signala z GABA nevrotransmiterji. Ketonska telesca izražajo nevrozaščitno in protivnetno vlogo z vplivom na imunski sistem, z vezavo na HCA2 receptor, ki spodbuja nastanek prostagladina D2, in inhibicijo NLRP3 inflamasoma. Nevrološke motnje, kot je epilepsija, imajo več vzrokov, med katerimi sta neizpodbitno prevelika vzburjenost nevronov ter vnetno stanje tkiva. Vedno več dokazov kaže na vlogo ketonskih telesc pri nadziranju in manjšanju števila epileptičnih napadov pri bolnikih. Kljub vsem dokazom in povezavam pa še vedno obstajajo dvomi, da so ravno ketonska telesca tista, ki imajo antiepileptične funkcijo.

==Laura Unuk - Motnje oksidacije dolgoverižnih maščobnih kislin in karnitinskega transporta ==

Motnje oksidacije dolgoverižnih maščobnih kislin (lcFAOD) so dedne avtosomske recesivne bolezni, ki onemogočajo metabolizem maščobnih kislin. Gre za mutacije genov, ki kodirajo encime oksidacije in karnitinskega transporta. Pri oksidaciji dolgoverižnih maščobnih kislin (12-18 C-atomov) sodeluje več kot 15 encimov, vendar le motnja enega lahko pripelje do kliničnih simptomov, kot so šibkost mišic, odpoved jeter, odpoved srca, itd. Glavni encimi, ki katalizirajo karnitinski transport so OCTN2 (organski-kationski-transporter-novel-2), CPT1 (karnitin-palmitoil-transferaza-tipa-1A), CPT2 (karnitin-palmitoil-transferaza-tipa-2) in CACT (karnitin-acilkarnitin-translokaza); encimi, ki pa katalizirajo oksidacijo so VLCAD (zelo-dolgoverižna-acil-CoA-dehidrogenaza), MTP (mitohondrijski-trifunkcijski-protein), LCHAD (dolgoverižna-3-hidroksiacil-CoA-dehidrogenaza) in LCKAT (dolgoverižna-3-ketoacil-CoA-tiolaza). Karnitin je pomembna molekula za prenos dolgoverižnih maščobnih kislin skozi membrano mitohondrija, saj dolgoverižna maščobna kislina lahko vstopi v mitohondrij le v obliki acil-karnitin estra. Najpogostejša motnja pri oksidaciji dolgoverižnih maščobnih kislin pa je motnja VLCAD encima, ki katalizira reakcije odcepa dveh ogljikovih atomov iz maščobne kisline na CoA. Nastali acil-CoA lahko nato vstopi v cikel citronske kisline, kjer nastane ATP. Ob nedelovanju VLCAD pride do pomanjkanja ATP v celici in posledično kliničnih simptomov. Zaznavanje napake enega od encimov je izvedena preko profila acilkarnitina v krvi, plazmi ali DBS. Z metodo NBS ('newborn screening') lahko kmalu po rojstvu že zaznajo motnjo in tako s hitrim zdravljenjem preprečijo neprijetno napredovanje bolezni. Poleg trenutnega zdravljenja so v razvoju različne terapije za zdravljenje motenj, ki pa imajo velik potencial.

==Stefanija Ivanova - Vpliv telovadbe na metabolizem ketonskih telesc ==

Ketonska telesca predstavljajo alternativno energijo za možgane, srce in skeletne mišice pod določenimi pogoji, kot so stradanje, intenzivna vadba, nenadzorovan diabetes ali po zaužitju ketonskih dodatkov. Zanimanje za delovanje ketonskih telesc se je povečalo predvsem pri športnikih. Ker ima uživanje eksogenih ketonov dramatične učinke na metabolizem skeletnih mišic med vadbo, imajo lahko športniki od tega koristi. Pomembna premisleka sta, kako športniki tolerirajo vnos ketonskih estrov med vadbo in ali dodatek ogroža ali vpliva na vnos ogljikovih hidratov. Zaužitje ketonskih dodatkov lahko hitro poveča koncentracijo ketonskih telesc, v primerjavi s ketogeno prehrano ali stradanjem, ki potrebujeta vsaj nekaj dni. Dodatek eksogenih ketonov predstavlja vir energije in ima lahko učinke pri varčevanju zalog ogljikovih hidratov med treningom v času nizke razpoložljivosti ogljikovih hidratov. Varčevanje zalog endogenih ogljikovih hidratov bi teoretično povzročilo večjo zmogljivost med ključnimi deli, med katerim so ogljikovi hidrati prevladujoči substrat. Dokler niso metabolne interakcije dodatkov ketonskih estrov s skeletnimi mišicami med vadbo popolnoma razjasnjene, vse predlagane ergogene lastnosti ostanejo teoretične. Glavni razlog za utemeljevanje eksogenih dodatkov ketonov morajo biti ugotovitve, da se ketoliza med vadbo poveča in pomembno prispeva k oskrbi z energijo. Čeprav obstajajo predlogi, da so dodatki ketonskih telesc koristni za športnike, je trenutno premalo informacij o učinkih dodatkov na metabolizem ketonskih telesc med vadbo. Na številna vprašanja je še treba odgovoriti.

==Nika Perko - Encim karbamoil fosfat sintetaza 1 ==

Karbamoil fosfat sintetaza 1 (CPS1) je limitni encim cikla uree, ker katalizira njeno prvo tristopenjsko reakcijo. Nahaja se v matriksu mitohondrija v celicah jeter, ledvic in tankega črevesa. Sestavljen je iz šestih domen: interakcijske, glutaminazne, integracijske, alosterične in dveh katalitskih. Encim je lahko v neaktivni ali aktivni obliki. Alosterično ga aktivira N-acetil-L-glutamat. Encim se lahko pozitivno regulira s proteinom Sirtuin 5 in glukagonom, negativno pa z mikro RNA miR-19b in od ATP odvisno kinazo (AMPK). Napačno delovanje kateregakoli od petih encimov ali transporterjev cikla uree vodi v zelo redko bolezen – motnje cikla sečnine. Prav motnja v delovanju encima CPS1 povzročajo najhujšo obliko te bolezni. Izrazi se lahko tako v neonatalni dobi kot tudi kasneje, določi pa se jo preko encimske ali genske analize. Simptomi so lahko letargija, bruhanje, encefalopatija in koma. Mutacije tega in tudi preostalih encimov ciklusa povzročijo hiperamoniemijo, ki se jo zdravi s hemodializo in raznimi zdravili, kot so L-arginin hidroklorid, natrijev benzoat in natrijev fenilbutirat. Bolniki se morajo držati stroge diete, bogate z ogljikovimi hidrati in maščobami. Poleg omenjenih zdravil lahko uživajo tudi N-karbamil-L-glutamat, ki deluje kot šaperon, stabilizator in aktivator. Trenutno je edina trajna in učinkovita rešitev transplantacija jeter, v prihodnosti pa bo morda učinkovita tudi genska terapija.

==Neža Leskovar - Urea transporterji in regulacija skoncentriranosti urina ==

Urea je vodotopna polarna molekula, ki lahko počasi prehaja čez celične membrane z difuzijo, hiter in učinkovit transport pa ji omogočajo urea transporterji UT-A in UT-B. Ti sodelujejo pri izločanju odvečnega dušika iz telesa, koncentriranju urina in s tem pri regulaciji tekočinskega ravnovesja ter ponovni uporabi dušika vezanega v urei s pomočjo črevesnih bakterij. Transporterji so v osnovi sestavljeni iz dveh hidrofobnih transmembranskih domen in velike ekstracelularne povezovalne zanke, razen UT-A1, ki je rezultat podvojene osnovne strukture. So N-glikozilirani in imajo znotrajcelični aminski in karboksilni konec. UT-A transporterji se večinoma nahajajo v ledvicah. UT-A1 najdemo v spodnjem predelu ledvičnega zbiralca, v apikalnih delih celic, kjer omogoča prehod uree iz zbiralca v epitelne celice. UT-A3 se prav tako nahaja v spodnjem predelu ledvičnega zbiralca, le da v bazalnih delih celic in omogoča prehod uree nazaj v telesni obtok. UT-A2 se nahaja v Henlejevi zanki in skrbi za prehod uree iz ledvične sredice nazaj v Henlejevo zanko. UT-A4 je bil najden v ledvicah podgan, UT-A5 so našli v testisih miši in UT-A6 v človeškem črevesju. UT-B transporterji se nahajajo v ledvičnih kapilarah, najdemo jih tudi v različnih tkivih. Transport uree je dobro reguliran z vazopresinom, hiperosmolarnostjo, ubikvinacijo in drugimi načini.

==Ela Bizjak - Mutacije mitohondrijske DNA, heterogenost in mitohondrijske bolezni==

Mutacije mitohondrijske DNA so del mitohondriju lastnega dednega zapisa. Mitohondrijska DNA je krožna molekula, ki je stabilizirana z zvitjem v nukleoide. Najpogosteje mutacije nastanejo med replikacijo, saj je po predvidenih mehanizmih takrat DNA dolgo izpostavljena in enoverižna, prav tako pa je podvajanje pogosto. Poleg tega, da ima mitohondrijska polimeraza šibko eksonukleazno aktivnost, se v bližini dednega materiala nahaja tudi respiratorna veriga, ki proizvaja reaktivne kisikove radikale. Mutacije se širijo glede na njihovo vrsto. Delecije imajo pri podvajanju prednost, ker so manjše kot nemutirane molekule, zato v organelu hitro prevladujejo, dedni prenos delecij pa je zelo redek. Točkovne mutacije se širijo s sproščeno replikacijo, delitvami in fisijami mitohondrijev. Če so prisotne v spolnih celicah matere, jih podedujejo vsi njeni potomci. Heteroplazmija se lahko med tkivi osebka razlikuje. Te razlike so opazne v nepravilnostih na proteinskih superkompleksih, oblikah krist, sestavi mitohondrijske membrane, napetostnem potencialu in okvarah respiratorne verige. S sledenjem mutacijam ali različnim haploskupinam lahko sledimo tudi migracijam populacij. Nekatere dedne mutacije so odgovorne tudi za bolezenska stanja, če je nosilka mutacij mati. Najpogosteje prizadenejo živčevje, pojavijo pa se lahko ob rojstvu ali kasneje med 20. in 40. letom.

==Bor Krajnik - Reaktivne kisikove zvrsti in njihova vloga pri regulaciji celične proliferacije ==

Kisikove reaktivne zvrsti ali krajše ROS so zelo reaktivne zvrsti, ki nastajajo pri redukciji molekularnega kisika, med seboj pa se pretvarjajo spontano ali s pomočjo encimov. V celici sta najpomembnejša predstavnika vodikov peroksid in superoksidni anion. Glaven vir ROS v celici so mitohondriji, kjer nastajajo kot produkt preobremenjenih elektronskih prenašalnih verig. Sprva se je njihova pristnost v organizmih smatrala za izključno škodljivo, ampak danes vemo, da imajo v človeškem organizmu več funkcij. V celici igrajo pomembno vlogo v določenih signalnih poteh, kar dosežejo z oksidacijo predvsem cisteinskih ostankov. Ob hipoksiji so ROS pomembne pri stabilizaciji ene od podenot hipoksija inducibilnih faktorjev (HIF), to so transkripcijski fakorji, ki regulirajo ekspresijo genov in so pomembni za angiogenezo in celično proliferacijo. Prav tako so pomemben člen signalne poti preko katere hormon angiotenzin II spodbuja delitev celic gladkih mišic v žilah. Regulirajo aktivacijo T-celic, kar privede do njihove proliferacije. ROS so vpletene tudi v proliferacijo rakastih celic, v katerih visoki nivoji ROS pomagajo pri angiogenezi, ki je potrebna zaradi hitre rasti tumorja kar vodi v hipoksijo. Zaradi tega so bile preizkušene kot potencialna tarča pri zdravljenju raka vendar so rezultati mešani.

==Maja Kobal - Od UCP1 odvisna in neodvisna termogeneza==

Termogeneza je proces nastajanja toplote in je eden od mehanizmov termoregulacije. Glavni regulator adaptivne nedrgetajoče termogeneze je protein UCP1, imenovan tudi termogenin. To je razklopitveni (ang. uncoupling) protein, ki se nahaja v notranji mitohondrijski membrani rjavih in bež adipocitov (maščobne celice), kjer razklaplja protonski gradient, ki se ustvari med procesom dihalne verige. Gradient protonov preusmeri nazaj v matriks mitohondrija, namesto da bi ta šel preko ATP-sintaze. Tako torej ne nastane ATP, ampak sprosti se toplota, ki segreje celico in pomaga ohranjati stalno telesno temperaturo. Glavni regulatorji delovanja UCP1 so maščobne kisline in purinski nukleotidi; prvi delujejo kot aktivatorji, slednji pa kot inhibitorji. Novejše raziskave pa so pokazale mehanizme in termogene regulatorje v adipocitih, ki so neodvisni od UCP1. Ti mehanizmi so kroženje kalcijevih ionov preko mehanizma SERCA, kreatin-substratni cikel, kroženje lipidov, transport glicerol-3-fosfata in razklop preko N-acil aminokislin. Natančno poznavanje mehanizmov termogeneze bi ponudilo številne nove možnosti za zdravljenje debelosti in sladkorne bolezni tipa 2. Znanje o UCP1 neodvisnih mehanizmih termogeneze bi bilo zelo uporabno za zdravljenje predebelih in starejših ljudi, ki nimajo UCP1-pozitivnih adipocitov. Čeprav že več desetletij potekajo raziskave o termogenezi, je znanje na tem področju pomanjkljivo, tako da bodo potrebne še številne raziskave.

==Martin Stanonik - Ekofiziologija obstoječih fototrofov in vplivi na evolucijo oksigene fotosinteze==

Oksigena fotosinteza je pomemben mikrobiološki proces, ki je omogočil dvig atmosferske koncentracije kisika in posledični razvoj večceličnih organizmov. Pred tem procesom so že obstajali mehanizmi, ki so proizvajali energijo. Za to so potrebovali molekule bogate z elektroni, kot H2S. Vendar ti procesi niso proizvajali kisika, kot stranskega produkta. Zato je sprememba kompozicije atmosfere, ali GOE (Great Oxidation Event) povzročila smrt mnogih organizmov kake 2.5 milijarde let nazaj. Tisti, ki pa so preživeli, so pa razvili obrambne mehanizme proti radikalnimi molekulami (ROS), ki so nastale iz kisika, ali pa so se umaknili v globje predele takratnih oceanov, kjer so še zmeraj prevladovali pogoji pred GOE. Kljub temu znanju natančen pojav in razvoj teh procesov še ni poznan. Danes še obstajajo organizmi, ki izvajajo te procese, nekateri lahko celo oba, vendar je to odvisno od okolja. To, vključno z fosili in filogenetskimi raziskavami, bi nam lahko pomagalo razumeti kako se je razvilo življenje na Zemlji. Organizmi z oskigeno fotosintezo so pomemben vir kisika v okoljih. Oksigena fotosinteza vključuje mnoge dele, kot reaktivne centre (RCI in RCII) in fotosisteme PSI in PSII ter OEC, ki je sistem ,ki tvori stranski produkt kisik. Pojav teh mehanizmov tudi še ni natančno poznan zato bodo potrebne še številne raziskave.

==Tinkara Božič - Pomen saharoze in njenega metabolizma za rastline==
Saharoza je pomemben disaharid, ki vpliva na rast rastlin, njihov razvoj, reprodukcijo in obrambne odgovore. Višek trioza fosfata, ki nastane iz ogljika med aktivno fotosintezo, se v citoplazmi pretvori v saharozo. Z delovanjem saharoze je tesno povezana še trehaloza, oligosaharid iz dveh molekul glukoze, ki ima v celicah regulatorno vlogo. Saharoza pa je pomembna predvsem zaradi cepitve na glukozo in fruktozo, kar poteka na dva načina – lahko jo cepi saharozna sintaza ali jo hidrolizirajo invertaze. Slednje encime inhibirajo posebni proteini, imenovani invertazni inhibitorji. Saharozna pot se v rastlinah začne v fotosintetskih tkivih, nadaljuje z nalaganjem v floem, zaključi pa se z odlaganjem iz floema v ponore oz. nefotosintetska tkiva. Invertaze so treh vrst in jih klasificiramo glede na njihov pH ter mesto v celici – poznamo invertaze celične stene, vakuolne invertaze in citoplazemske invertaze. Nastopijo v celicah ponora, ko je potrebna cepitev saharoze na njeni sestavni molekuli. Invertaze celične stene pa sodelujejo še pri obrambnih odgovorih celice na napad patogenih organizmov, ko jo ti izkoriščajo za sladkorje. Če pa patogeni v navezo s celicami prinašajo hranila, ki jih gostitelji potrebujejo, to povezavo imenujemo mikoriza. Ta hranila so v glavnem fosfati, sladkor, ki ga od rastlin prejemajo patogeni organizmi, pa je glukoza.

==Mateja Milošević - CAM tip fotosinteze: Crassualacean Acid Metabolism==
CAM tip fotosinteze je evolucijska prilagoditev določenih vrst rastlinah na razmere v katerih živijo. To so ponavadi ekstremne razmere, za katere je značilno pomanjkljivost vode in zelo visoke ambijentalne temperature – klasičen primer takih tipov bi bili kaktusi v puščavi – ali razmere, ko rastlina čez dan ne more privoščiti si CO₂. Takšen tip fotosinteze se razlikuje od klasičnega C3 tipa po tem, da vsebuje dodaten encim, ki sodeluje v asimilaciji CO₂ - PEPC, oziroma fosfoenolpiruvat karboksilazo, ki skupaj z encimom RuBisCO asimilirata zunanji CO₂. Delovanje teh dveh encimov je časovno ločeno, kar ga razlikuje od tretjega tipa fotosinteze – C4 tip. Asimilacija zunanjega CO₂ je ločena po fazah. Čez dan rastlina zapre svoje stomate zaradi neugodnih razmerah in uporablja molekule, ki je že shranila kako bi si zagotovila energijo. To naredi tudi zato, da se izogne nevarni izgubi vode. Potem ko pride noč ali v odvisnosti od zunanjih pogojev, odpre svoje stomate in propušča zunanji CO₂. Pomemben intermediat je malat2-, ki nastaja z obdelavom zunanjega CO₂ in, ki se shranjuje v vakuoli v obliki malatne kisline. Potem, se odpušča iz vakuole, se dekarboksilira in produkta tiste karboksilacije – piruvat in molekularni CO₂, daljše gresta v metabolne procese, ki prinesejo energijo ali pomembne intermediate.

==NikaBanovšek - Regulacija mlečnih lipidov preko hrane in transkripcijskih faktorjev ter vpliv mleka na novorojenčka==
Mleko je edina in zato glavna prehrana novorojenčka, ki je v začetnih fazah svojega obstoja zelo ranljiv. V mlečnih žlezah matere nastajajo primerne sestavine, ki so pomembne za periferni kakor tudi centralni razvoj mladiča. Mlečni lipidi so glavna komponenta mleka ter nastajajo preko različnih substratov; med glavne štejemo maščobe kisline, glukozo in glicerol. V citosolu mlečnih epitelnih celic se iz slednjih tvorijo predvsem srednje dolge verige mašobnih kislin, ki igrajo pomembno vlogo v telesu novorojenčka, saj mu prinašajo hranilne vrednosti in energijo, kakor tudi nekatere signalne molekule. Triacilgliceroli nastajajo v endoplazmatskem retikulumu, kjer se nato zapakirajo kot mehurčki in se iz mlečne epitelne celice izločajo v obliki mleka. Na sestavo mleka in regulacijo njegovih sestavin vplivajo številni dejavniki. Med ključne štejemo transkripcijske faktorje, kot sta npr. SREBP-1 in PPARγ, kakor tudi samo prehrano. Če imajo matere novorojenčkov genetske okvare ali slabe prehranske navade, se v celici zgodijo napačne regulacije v sintezi mlečnih lipidov ter pride do tvorbe in izločanja »toksičnega« mleka v alveolih mlečnih žlez. Takšno mleko lahko povzroči velike nepravilnosti v telesu novorojenčka, saj ta zaužije sebi škodljive snovi, ki vodijo do raznih notranjih vnetij. Zaužitje takšne vrste mleka se lahko odraža tudi v dolgoročnem razvoju otroka v obliki različnih bolezni.

BIO2 Seminar 2020

2020-12-09T19:35:27Z

Nika.banovsek: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''poglavje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''datum predstavitve'''
|-
| Ajda Beltram||12||Zgradba in dinamika signalnih kompleksov GPCR||Luka Hafner||Tinkara Božič||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Jan Bregar||12||Protein retinoblastoma||Nika Bedrač||Martin Stanonik||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Anja Moškrič||12|| Presinaptični kalcijevi kanalčki kot specializiran nadzor za sproščanje nevrotransmiterjev||Srna Anastasovska||Luka Stanković||16/10/20||19/10/20||21/10/20
|-
| Gregor Strniša||12||Načini aktivacije GPCR||Manca Pirc||Ana Pervanja||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Vid Dobrovoljc||12||Medsebojni vpliv signalnih poti na primeru RTK in GPCR signalnih poti||Maruša Sernc||Nika Banovšek||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Nikola Janakievski||12||Selective androgen receptor modulators||Ajda Beltram||Aljaž Simonič||23/10/20||26/10/20||28/10/20
|-
| Rebeka Jerina||12||Kofein kot antagonist adenozinskih receptorjev||Jan Bregar||Luka Hafner||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Eva Vene||12||Povezava bolečine z vezavo kapsaicina na TRPV1||Anja Moškrič||Nika Bedrač||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Zala Perko||12||Mehanizmi vezave ligandov in regeneracija fotoreceptorjev očesne mrežnice||Gregor Strniša||Srna Anastasovska||30/10/20||02/11/20||04/11/20
|-
| Erik Putar||14-15||AMPK: senzor glukoze in celičnega energijskega stanja||Nikola Janakievski||Manca Pirc||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Iva Matić||14-15||||Rebeka Jerina||Maruša Sernc||06/11/20||09/11/20||13/01/21
|-
| Timotej Sotošek||14-15||Regulacija mišičnega glikogena: granula in njeni proteini||Eva Vene||Ajda Beltram||06/11/20||09/11/20||11/11/20
|-
| Nika Tomsič||16||Acetil-CoA: glavni metabolit in sekundarni obveščevalec||Zala Perko||Jan Bregar||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Andrej Špenko||16||||Erik Putar||Anja Moškrič||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Aleksandra Rauter||16||Vloga intermediatov Krebsovega cikla v makrofagih||Iva Matić||Gregor Strniša||13/11/20||16/11/20||18/11/20
|-
| Laura Unuk||17||Motnje oksidacije dolgoverižnih maščobnih kislin in karnitinskega transporta||Timotej Sotošek||Nikola Janakievski||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Stefanija Ivanova||17||Vpliv telovadbe na metabolizem ketonskih telesc||Nika Tomsič||Rebeka Jerina||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Jakob Tomšič||17||Funkcije ketonskih telesc v centralnem živčevju||Andrej Špenko||Eva Vene||20/11/20||23/11/20||25/11/20
|-
| Neža Leskovar||18||Urea transporterji in regulacija skoncentriranosti urina||Aleksandra Rauter||Zala Perko||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Luka Šegota||18||||Laura Unuk||Erik Putar||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Nika Perko||18||Encim karbamoil fosfat sintetaza 1||Stefanija Ivanova||Iva Matić||27/11/20||30/11/20||02/12/20
|-
| Ela Bizjak||19||Mutacije mitohondrijske DNA, heterogenost in mitohondrijske bolezni||Jakob Tomšič||Timotej Sotošek||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Bor Krajnik||19||Reaktivne kisikove zvrsti in njihova vloga pri regulaciji celične proliferacije||Neža Leskovar||Nika Tomsič||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Maja Kobal||19||Od UCP1 odvisna in neodvisna termogeneza||Luka Šegota||Vid Dobrovoljc||04/12/20||07/12/20||09/12/20
|-
| Mateja Milošević||20||CAM tip fotosinteze: Crassualacean Acid Metabolism||Nika Perko||Andrej Špenko||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Tinkara Božič||20||Pomen saharoze in njenega metabolizma za rastline||Ela Bizjak||Aleksandra Rauter||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Martin Stanonik||20||Ekofiziologija obstoječih fototrofov in vplivi na evolucijo oksigene fotosinteze||Bor Krajnik||Laura Unuk||11/12/20||14/12/20||16/12/20
|-
| Luka Stanković||21||Nastanek, struktura in zorenje lipidnih kapelj v organizmu||Maja Kobal||Stefanija Ivanova||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Ana Pervanja||21||Vpliv cirkadianega ritma na metabolizem lipidov||Mateja Milošević||Jakob Tomšič||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Nika Banovšek||21||Regulacija mlečnih lipidov preko hrane in transkripcijskih faktorjev ter vpliv mleka na novorojenčka||Tinkara Božič||Neža Leskovar||18/12/20||21/12/20||23/12/20
|-
| Aljaž Simonič||22||Inhibitorji sinteze pirimidinov kot protivirusna zdravila širokega spektra||Martin Stanonik||Luka Šegota||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Luka Hafner||22||||Luka Stanković||Ana Žagar||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Ana Žagar||22||||Vid Dobrovoljc||Nika Perko||23/12/20||28/12/20||30/12/20
|-
| Nika Bedrač||23||||Ana Pervanja||Ela Bizjak||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Srna Anastasovska||23||||Nika Banovšek||Bor Krajnik||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Manca Pirc||23||||Aljaž Simonič||Maja Kobal||30/12/20||04/01/21||06/01/21
|-
| Maruša Sernc||23||||Ana Žagar||Mateja Milošević||08/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Lea Nicouleau||any chapter||||||||06/01/21||11/01/21||13/01/21
|-
| Marjorie Leaud||any chapter||||||||06/01/21||11/01/21||13/01/21
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Razporeditev je začasna in se lahko še spremeni, načeloma pa se termini do vključno 18. poglavja ne bodo spreminjali.
Prosim,da mi sporočite morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2020|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Obseg seminarja naj bo 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike, bolje več. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20-25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v okviru celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.