Wiki FKKT - User contributions [en]

Uporaba pristopa načrtovanja eksperimentov za optimizacijo proizvodnje rekombinantnega fragmenta protitelesa v periplazmi Escherichie coli: izbira signalnega peptida in optimalnih pogojev rasti

2019-04-09T17:51:23Z

Nina Mavec: New page: Proizvodnja rekombinantih proteinov je danes najpomembnejši način pridobivanja terapevtskih proteinov; leta 2015 je bilo 400 od 650 terapevtskih proteinov rezultat rekombinantne proizvod...

Proizvodnja rekombinantih proteinov je danes najpomembnejši način pridobivanja terapevtskih proteinov; leta 2015 je bilo 400 od 650 terapevtskih proteinov rezultat rekombinantne proizvodnje, vedno več pa jih je tudi v razvoju<ref>Garcia, L. S. et al. Recombinant pharmaceuticals from microbial cells : a 2015 update. Microb. Cell Fact. 1–7 (2016). doi:10.1186/s12934-016-0437-3</ref>. Echerichia coli zaenkrat ostaja najbolj uporabljena vrsta bakterije, okrog tretjina bioterapevtikov, odobrenih s strani FDA, je namreč proizvedenih v E. coli. Pomembno je torej, da dobro poznamo pogoje rasti E. coli, ki dajo čim večjo količino rekombinantnega proteina, ki pa mora biti hkrati v čim večji meri topen <ref name="dva">Kasli, I. M., Thomas, O. R. T. & Overton, T. W. Use of a design of experiments approach to optimise production of a recombinant antibody fragment in the periplasm of Escherichia coli : selection of signal peptide and optimal growth conditions. AMB Express (2019). doi:10.1186/s13568-018-0727-8</ref>.

== Fragment protitelesa scFv 13R4 ==
V raziskavi so preučevali proizvodnjo rekombinantnega fragmenta protitelesa scFv. To je fuzijski protein, ki je sestavljen iz variabilnih regij težke in lahke verige, povezanih s fleksibilnim linkerjem. Izbrali so modelni scFv 134R.
scFv 134R so z dvema različnima signalnima peptidoma usmerili v periplazmo. To je v mnogih primerih boljše kot izražanje v citoplazmi, predvsem zaradi oksidativnega okolja, ki omogoča nastanek disulfidnih vezi. Prav tako se v periplazmi nahajajo encimi Dsb, ki katalizirajo nastanek in popravljanje disulfidnih vezi. Poleg tega se v periplazmi nahaja manj proteinov, zaradi česar se zmanjša tveganje za proteolitično razgradnjo med rastjo bakterij, prav tako pa je na tak način možna lažja izolacija, ki temelji na razgradnji zunanje celične stene, ne pa tudi notranje<ref name="dva"/>.

== Načrtovanje eksperimentov ==
V raziskavi so uporabili pristop načrtovanja eksperimentov. To je statistična metoda za preučevanje medsebojnega vpliva določenih faktorjev na nek odziv sistema. Kot odziv sistema so določili produktivnost (količino proizvedenega scFv v ug scFv na mL kulture na uro), delež scFv v periplazmi, delež topnega scFv, delež zdravih celic in delež retencije plazmidov, od katerih pa sta bila statistično ustrezna produktivnost in delež topnega proteina, zato so se osredotočili nanju. Odločili so se za preučevanje treh faktorjev, ki vplivajo na odziv sistema: fermentacijska temperatura (25 – 40 °C), optična gostota (OD600), pri kateri so sprožili indukcijo (0,2 – 1,2) in količino induktorja (0 – 0,26 % w/v)<ref name="dva"/>.

Vse to so testirali za dva različna signalna peptida, DsbA, ki usmeri protein v periplazmo preko SRP poti (kotranslacijske) in PelB, ki deluje preko SecB (posttranslacijske) poti. V obeh primerih je bil zapis za scFv za promotorjem pBAD, kot induktor pa so uporabili arabinozo<ref name="dva"/>.

== Rezultati ==
Pri signalnem peptidu DsbA je bil najpomembnejši faktor za produktivnost temperatura. Ob zvišanju temperature, predvsem v kombinaciji z nizkim OD600 on indukciji, je produktivnost dosegla 40 ug mL-1 h-1, medtem ko je imela koncentracija arabinoze minimalen vpliv na produktivnost. Pri signalnem peptidu PelB pa je bil vpliv koncentracije arabinoze na produktivnost velik – zviševanje produktivnosti v odvisnosti od koncentracije arabinoze je bilo skoraj linearno. Najvišja produktivnost je bila dosežena pri visoki koncentraciji arabinoze in nizkem OD600 ob indukciji (pod 0,7). Optimalna temperatura je bila v tem primeru pri 32 ˚C. Na splošno pa je bila v vseh pogojih produktivnost večja pri signalnem peptidu DsbA<ref name="dva"/>.

Po drugi strani pa je bil delež topnega scFv pri vseh pogojih višji pri signalnem peptidu PelB. Najpomembnejši faktor za delež topnega scFv je bila pri obeh signalnih peptidih temperatura, pri čemer je bila topnost večja pri manjših temperaturah. Pri signalnem peptidu DsbA so zaznali tudi manjše vplive ostalih dveh faktorjev, pri čemer je bila zgodnja indukcija v skupaj z nizko temperaturo najboljša kombinacija, pri kateri je bilo 90 % proteina v topni obliki. Pri PelB pa je bil vpliv OD600 ob indukciji zanemarljiv, najboljša kombinacija pa je bila nizka temperatura z nizko koncentracijo arabinoze<ref name="dva"/>.

Odločili so se preveriti tudi, kako je z rastjo pri višjih celičnih gostotah, kar pride v poštev v primeru večje proizvodnje rekombinantnih proteinov. Zaradi boljših lastnosti signalnega peptida PelB (večja topnost in lokalizacija, boljša fiziologija celic) so te eksperimente naredili le s celicami z zapisom za scFv s signalnim peptidom PelB. Ugotovili so, da so optimalni pogoji, ki dajo največ proteina, ki je topen in pravilno lokaliziran v periplazmi, nizka temperatura in indukcija pri visokem OD600. Pri 25 ˚C, OD600 = 25 in 6 ur po indukciji je koncentracija dosegla 20 ug mL-1 , pri čemer je bilo 80 % proteina v periplazmi<ref name="dva"/>

Zvišanje produktivnosti s temperaturo je po vsej verjetnosti posledica hiterjše translacije in translokacije proteinov, kar pa je imelo tudi negativen vpliv na topnost. Verjetno je razlog v tem, da pride do neravnotežja translacije in translokacije. Že iz prejšnjih študij je znano, da je pri translokaciji v periplazmo pomemben porni kompleks SecYEG – če je ta preveč zaseden, pride do nabiranja tako nativnih kot rekombinantnega proteina v citoplazmi, kar povzroči napačno zvijanje in ima na splošno slab vpliv na fiziologijo celice <ref>Schlegel, S., Rujas, E., Ytterberg, A. J., Zubarev, R. A. & Luirink, J. Optimizing heterologous protein production in the periplasm of E . coli by regulating gene expression levels. 1–12 (2013)</ref>.

Drug znan vpliv signalnih peptidov je povezan s translacijo, ki je odvisna od morebitnih struktur mRNA. V raziskavi so uporabili program za napoved struktur mRNA in ugotovili, da je pri mRNA za peptid PelB na Shine-Dalgarnovem zaporedju prisotna dvoverižna RNA, medtem ko je pri DsbA to zaporedje na enoverižni RNA <ref name="dva"/>

== Viri ==
<references/>

MBT seminarji 2019

2019-04-09T17:19:27Z

Nina Mavec:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2018/19'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (14. marec) 
# Production of functional human interleukin 37 using plants (N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma; Plant Cell Rep. 38 (3), Mar. 2019; https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_funkcionalnega_%C4%8Dlove%C5%A1kega_IL37_v_rastlinah Proizvodnja funkcionalnega človeškega interlevkina 37 v rastlinah. Špela Malenšek]

'''Gensko spremenjene živali''' (21. marec) 
# Myopia disease mouse models: a missense point mutation (S673G) and a protein-truncating mutation of the ''Zfp644'' mimic human disease phenotype. (K. I. Szczerkowska ''et al.''; Cell Biosci. 9, 2019; https://doi.org/10.1186/s13578-019-0280-4). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mi%C5%A1ji_modeli_kratkovidnosti:_druga%C4%8Dnopomenska_to%C4%8Dkovna_mutacija_%28S673G%29_in_skraj%C5%A1evalna_mutacija_v_Zfp644_posnemata_fenotip_%C4%8Dlove%C5%A1ke_bolezni Mišji modeli kratkovidnosti: drugačnopomenska točkovna mutacija (S673G) in skrajševalna mutacija v ''Zfp644'' posnemata fenotip človeške bolezni] Rok Miklavčič
# A chicken bioreactor for efficient production of functional cytokines (Herron L.R. ''et al.''; BMC Biotechnol. 18 (1), Dec. 2018; https://doi.org/10.1186/s12896-018-0495-1).[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_kokošjega_bioreaktorja_za_učinkovito_proizvodnjo_funkcionalnih_citokinov Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov] Blaž Lebar
# Influence of a growth hormone transgene on the genetic architecture of growth-related traits: A comparative analysis between transgenic and wild-type coho salmon (M. Kodama, K. A. Naish in R. H. Devlin; Evol Appl. 11(10), 2018; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6231474/). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vpliv_transgena_rastnega_hormona_na_genetsko_arhitekturo_lastnosti_povezanimi_z_rastjo Vpliv transgena rastnega hormona na genetsko arhitekturo lastnosti povezanimi z rastjo: primerjalna analiza transgenega srebrnega lososa in srebrnega lososa divjega tipa] Nuša Kelhar

'''Okolje''' (4. april) 
# Bioremediation of soil long-term contaminated with PAHs by algal-bacterial synergy of Chlorella sp. MM3 and Rhodococcus wratislaviensis strain 9 in slurry phase (S.R.Subashchandrabose, K. Venkateswarlu in K. Venkidusamy; Sci. Total Environ., 2019; https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S004896971835349X). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bioremediacija_zemlje%2C_dolgotrajno_kontaminirane_s_PAH Bioremediacija zemlje, dolgotrajno kontaminirane s policikličnimi aromatskimi ogljikovodiki z sinergijo alge Chlorella sp. MM3 in seva 9 bakterije Rhodococcus wratislaviensis v suspenziji.] Eva Rajh
# Anaerobic degradation of xenobiotic isophthalate by the fermenting bacterium ''Syntrophorhabdus aromaticivorans'' (M. Junghare, D. Spiteller in B. Schink; ISME J, 2019; https://doi.org/10.1038/s41396-019-0348-5). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Anaerobna_razgradnja_izoftalata_pri_fermentacijski_bakteriji_Syntrophorhabdus_aromaticivorans Anaerobna razgradnja ksenobiotika izoftalata pri fermentirajoči bakteriji ''Syntrophorhabdus aromaticivorans'']. Elvira Boršič
# Biodegradation and toxicity of emerging contaminants: Isolation of an exopolysaccharide-producing ''Sphingomonas sp.'' for ionic liquids bioremediation. (M. Koutinas ''et al.''; J. Haz. Mat. 365, Mar. 2019; https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2018.10.059). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biorazgradnja_in_toksičnost_nastalih_produktov Biorazgradnja in toksičnost nastalih produktov: izolacija mikroorganizma Sphingomonas MKIV, ki proizvaja eksopolisaharide, za bioremediacijo ionskih tekočin] Katja Dolenc

'''Terapevtski proteini in protitelesa''' (11. april) 
# Constructive approach for synthesis of a functional IgG using a reconstituted cell-free protein synthesis system (S. Murakami ''et al''; Scientific Reports 9, 2019; https://doi.org/10.1038/s41598-018-36691-8). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovit_pristop_za_sintezo_funkcionalnega_IgG_z_uporabo_rekonstruiranega_brezceli%C4%8Dnega_sistema_za_sintezo_proteinov Učinkovit pristop za sintezo funkcionalnega IgG z uporabo rekonstruiranega brezceličnega sistema za sintezo proteinov.] Vida Štrancar
# New therapeutic approach for targeting Hippo signalling pathway (L. Dominguez-Berrocal ''et al''; Scientific Reports 9(4771), 2019; https://www.nature.com/articles/s41598-019-41404-w). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nov_terapevtski_pristop_za_ciljanje_signalne_poti_Hippo Nov terapevtski pristop za ciljanje signalne poti Hippo.] Ana Halužan Vasle
# Use of a design of experiments approach to optimise production of a recombinant antibody fragment in the periplasm of Escherichia coli: selection of signal peptide and optimal growth conditions (Kasli ''et al''. AMB Expr (2019) 9:5; https://doi.org/10.1186/s13568-018-0727-8). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_pristopa_načrtovanja_eksperimentov_za_optimizacijo_proizvodnje_rekombinantnega_fragmenta_protitelesa_v_periplazmi_Escherichie_coli:_izbira_signalnega_peptida_in_optimalnih_pogojev_rasti Uporaba pristopa načrtovanja eksperimentov za optimizacijo proizvodnje rekombinantnega fragmenta protitelesa v periplazmi ''Escherichie coli'': izbira signalnega peptida in optimalnih pogojev rasti.] Nina Mavec

'''Diagnostiki in cepiva''' (18. april) 
# A viral-vectored RSV vaccine induces long-lived humoral immunity in cotton rats (J. Grieves, Z. Yin, A. Garcia-Sastre et al.; Vaccine 36(26), 2018; https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2018.04.089) Cepivo proti RSV, pripravljeno z virusnim vektorjem, inducira dolgotrajno humoralno imunost pri bombažnih podganah. Nina Kobe
# Optimization of a multivalent peptide vaccine for nicotine addiction (D. F. Zeigler, R. Roque, C. H. Clegg; Vaccine 37(12), 2019; https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.02.003) Optimizacija multivalentnega peptidnega cepiva za nikotinsko odvisnost. Iza Oblak
# Design of a Type-1 Diabetes Vaccine Candidate Using Edible Plants Expressing a Major Autoantigen (E. Bertini ''et al''., Front. Plant Sci. 9, 2018 https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00572) Načrtovnaje kandidatnega cepiva za diabetes tipa I s pomočjo užitnih rastlin, ki izražajo pomemben avtoantigen. Katarina Petra van Midden

'''LMW učinkovine''' (25. april) 
# Metabolic engineering of ''Escherichia coli'' for de novo biosynthesis of vitamin B12 (H. Fang ''et al.'', Nat Commun. 9(1), 2018 https://doi.org/10.1038/s41467-018-07412-6). Metabolno inženirstvo bakterije ''Escherichia coli'' za de novo sintezo vitamina B12. Valentina Novak
# David Titovšek
# Bor Klančnik

'''Male molekule in polimeri''' (9. maj) 
# Primož Bembič
# Karin Dobravc Škof
# Jaka Kos

'''Pretvorba biomase in bioenergenti''' (16. maj) 
# Maksimiljan Adamek
# Aljoša Marinko
# Jošt Hočevar

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (23. maj) 
# Nives Ražnjević
# Katja Kunčič
# Peter Pečan

'''Rezervni termin''' (30. maj) 
# Mia Žganjar
# Ana Müller

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

MBT seminarji 2019

2019-04-09T17:18:38Z

Nina Mavec:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2018/19'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (14. marec) 
# Production of functional human interleukin 37 using plants (N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma; Plant Cell Rep. 38 (3), Mar. 2019; https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_funkcionalnega_%C4%8Dlove%C5%A1kega_IL37_v_rastlinah Proizvodnja funkcionalnega človeškega interlevkina 37 v rastlinah. Špela Malenšek]

'''Gensko spremenjene živali''' (21. marec) 
# Myopia disease mouse models: a missense point mutation (S673G) and a protein-truncating mutation of the ''Zfp644'' mimic human disease phenotype. (K. I. Szczerkowska ''et al.''; Cell Biosci. 9, 2019; https://doi.org/10.1186/s13578-019-0280-4). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mi%C5%A1ji_modeli_kratkovidnosti:_druga%C4%8Dnopomenska_to%C4%8Dkovna_mutacija_%28S673G%29_in_skraj%C5%A1evalna_mutacija_v_Zfp644_posnemata_fenotip_%C4%8Dlove%C5%A1ke_bolezni Mišji modeli kratkovidnosti: drugačnopomenska točkovna mutacija (S673G) in skrajševalna mutacija v ''Zfp644'' posnemata fenotip človeške bolezni] Rok Miklavčič
# A chicken bioreactor for efficient production of functional cytokines (Herron L.R. ''et al.''; BMC Biotechnol. 18 (1), Dec. 2018; https://doi.org/10.1186/s12896-018-0495-1).[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_kokošjega_bioreaktorja_za_učinkovito_proizvodnjo_funkcionalnih_citokinov Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov] Blaž Lebar
# Influence of a growth hormone transgene on the genetic architecture of growth-related traits: A comparative analysis between transgenic and wild-type coho salmon (M. Kodama, K. A. Naish in R. H. Devlin; Evol Appl. 11(10), 2018; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6231474/). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vpliv_transgena_rastnega_hormona_na_genetsko_arhitekturo_lastnosti_povezanimi_z_rastjo Vpliv transgena rastnega hormona na genetsko arhitekturo lastnosti povezanimi z rastjo: primerjalna analiza transgenega srebrnega lososa in srebrnega lososa divjega tipa] Nuša Kelhar

'''Okolje''' (4. april) 
# Bioremediation of soil long-term contaminated with PAHs by algal-bacterial synergy of Chlorella sp. MM3 and Rhodococcus wratislaviensis strain 9 in slurry phase (S.R.Subashchandrabose, K. Venkateswarlu in K. Venkidusamy; Sci. Total Environ., 2019; https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S004896971835349X). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bioremediacija_zemlje%2C_dolgotrajno_kontaminirane_s_PAH Bioremediacija zemlje, dolgotrajno kontaminirane s policikličnimi aromatskimi ogljikovodiki z sinergijo alge Chlorella sp. MM3 in seva 9 bakterije Rhodococcus wratislaviensis v suspenziji.] Eva Rajh
# Anaerobic degradation of xenobiotic isophthalate by the fermenting bacterium ''Syntrophorhabdus aromaticivorans'' (M. Junghare, D. Spiteller in B. Schink; ISME J, 2019; https://doi.org/10.1038/s41396-019-0348-5). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Anaerobna_razgradnja_izoftalata_pri_fermentacijski_bakteriji_Syntrophorhabdus_aromaticivorans Anaerobna razgradnja ksenobiotika izoftalata pri fermentirajoči bakteriji ''Syntrophorhabdus aromaticivorans'']. Elvira Boršič
# Biodegradation and toxicity of emerging contaminants: Isolation of an exopolysaccharide-producing ''Sphingomonas sp.'' for ionic liquids bioremediation. (M. Koutinas ''et al.''; J. Haz. Mat. 365, Mar. 2019; https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2018.10.059). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biorazgradnja_in_toksičnost_nastalih_produktov Biorazgradnja in toksičnost nastalih produktov: izolacija mikroorganizma Sphingomonas MKIV, ki proizvaja eksopolisaharide, za bioremediacijo ionskih tekočin] Katja Dolenc

'''Terapevtski proteini in protitelesa''' (11. april) 
# Constructive approach for synthesis of a functional IgG using a reconstituted cell-free protein synthesis system (S. Murakami ''et al''; Scientific Reports 9, 2019; https://doi.org/10.1038/s41598-018-36691-8). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovit_pristop_za_sintezo_funkcionalnega_IgG_z_uporabo_rekonstruiranega_brezceli%C4%8Dnega_sistema_za_sintezo_proteinov Učinkovit pristop za sintezo funkcionalnega IgG z uporabo rekonstruiranega brezceličnega sistema za sintezo proteinov.] Vida Štrancar
# New therapeutic approach for targeting Hippo signalling pathway (L. Dominguez-Berrocal ''et al''; Scientific Reports 9(4771), 2019; https://www.nature.com/articles/s41598-019-41404-w). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nov_terapevtski_pristop_za_ciljanje_signalne_poti_Hippo Nov terapevtski pristop za ciljanje signalne poti Hippo.] Ana Halužan Vasle
# Use of a design of experiments approach to optimise production of a recombinant antibody fragment in the periplasm of Escherichia coli: selection of signal peptide and optimal growth conditions (Kasli ''et al''. AMB Expr (2019) 9:5; https://doi.org/10.1186/s13568-018-0727-8). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_pristopa_načrtovanja_eksperimentov_za_optimizacijo_proizvodnje_rekombinantnega_fragmenta_protitelesa_v_periplazmi_Escherichie_coli:_izbira_signalnega_peptida_in_optimalnih_pogojev_rasti Uporaba pristopa načrtovanja eksperimentov za optimizacijo proizvodnje rekombinantnega fragmenta protitelesa v periplazmi ''Escherichie'' coli: izbira signalnega peptida in optimalnih pogojev rasti.] Nina Mavec

'''Diagnostiki in cepiva''' (18. april) 
# A viral-vectored RSV vaccine induces long-lived humoral immunity in cotton rats (J. Grieves, Z. Yin, A. Garcia-Sastre et al.; Vaccine 36(26), 2018; https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2018.04.089) Cepivo proti RSV, pripravljeno z virusnim vektorjem, inducira dolgotrajno humoralno imunost pri bombažnih podganah. Nina Kobe
# Optimization of a multivalent peptide vaccine for nicotine addiction (D. F. Zeigler, R. Roque, C. H. Clegg; Vaccine 37(12), 2019; https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.02.003) Optimizacija multivalentnega peptidnega cepiva za nikotinsko odvisnost. Iza Oblak
# Design of a Type-1 Diabetes Vaccine Candidate Using Edible Plants Expressing a Major Autoantigen (E. Bertini ''et al''., Front. Plant Sci. 9, 2018 https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00572) Načrtovnaje kandidatnega cepiva za diabetes tipa I s pomočjo užitnih rastlin, ki izražajo pomemben avtoantigen. Katarina Petra van Midden

'''LMW učinkovine''' (25. april) 
# Metabolic engineering of ''Escherichia coli'' for de novo biosynthesis of vitamin B12 (H. Fang ''et al.'', Nat Commun. 9(1), 2018 https://doi.org/10.1038/s41467-018-07412-6). Metabolno inženirstvo bakterije ''Escherichia coli'' za de novo sintezo vitamina B12. Valentina Novak
# David Titovšek
# Bor Klančnik

'''Male molekule in polimeri''' (9. maj) 
# Primož Bembič
# Karin Dobravc Škof
# Jaka Kos

'''Pretvorba biomase in bioenergenti''' (16. maj) 
# Maksimiljan Adamek
# Aljoša Marinko
# Jošt Hočevar

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (23. maj) 
# Nives Ražnjević
# Katja Kunčič
# Peter Pečan

'''Rezervni termin''' (30. maj) 
# Mia Žganjar
# Ana Müller

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

MBT seminarji 2019

2019-04-09T17:14:49Z

Nina Mavec:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2018/19'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (14. marec) 
# Production of functional human interleukin 37 using plants (N. Alqazlan, H. Diao, A. M. Jevnikar, and S. Ma; Plant Cell Rep. 38 (3), Mar. 2019; https://doi.org/10.1007/s00299-019-02377-2). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_funkcionalnega_%C4%8Dlove%C5%A1kega_IL37_v_rastlinah Proizvodnja funkcionalnega človeškega interlevkina 37 v rastlinah. Špela Malenšek]

'''Gensko spremenjene živali''' (21. marec) 
# Myopia disease mouse models: a missense point mutation (S673G) and a protein-truncating mutation of the ''Zfp644'' mimic human disease phenotype. (K. I. Szczerkowska ''et al.''; Cell Biosci. 9, 2019; https://doi.org/10.1186/s13578-019-0280-4). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Mi%C5%A1ji_modeli_kratkovidnosti:_druga%C4%8Dnopomenska_to%C4%8Dkovna_mutacija_%28S673G%29_in_skraj%C5%A1evalna_mutacija_v_Zfp644_posnemata_fenotip_%C4%8Dlove%C5%A1ke_bolezni Mišji modeli kratkovidnosti: drugačnopomenska točkovna mutacija (S673G) in skrajševalna mutacija v ''Zfp644'' posnemata fenotip človeške bolezni] Rok Miklavčič
# A chicken bioreactor for efficient production of functional cytokines (Herron L.R. ''et al.''; BMC Biotechnol. 18 (1), Dec. 2018; https://doi.org/10.1186/s12896-018-0495-1).[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Uporaba_kokošjega_bioreaktorja_za_učinkovito_proizvodnjo_funkcionalnih_citokinov Uporaba kokošjega bioreaktorja za učinkovito proizvodnjo funkcionalnih citokinov] Blaž Lebar
# Influence of a growth hormone transgene on the genetic architecture of growth-related traits: A comparative analysis between transgenic and wild-type coho salmon (M. Kodama, K. A. Naish in R. H. Devlin; Evol Appl. 11(10), 2018; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6231474/). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vpliv_transgena_rastnega_hormona_na_genetsko_arhitekturo_lastnosti_povezanimi_z_rastjo Vpliv transgena rastnega hormona na genetsko arhitekturo lastnosti povezanimi z rastjo: primerjalna analiza transgenega srebrnega lososa in srebrnega lososa divjega tipa] Nuša Kelhar

'''Okolje''' (4. april) 
# Bioremediation of soil long-term contaminated with PAHs by algal-bacterial synergy of Chlorella sp. MM3 and Rhodococcus wratislaviensis strain 9 in slurry phase (S.R.Subashchandrabose, K. Venkateswarlu in K. Venkidusamy; Sci. Total Environ., 2019; https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S004896971835349X). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bioremediacija_zemlje%2C_dolgotrajno_kontaminirane_s_PAH Bioremediacija zemlje, dolgotrajno kontaminirane s policikličnimi aromatskimi ogljikovodiki z sinergijo alge Chlorella sp. MM3 in seva 9 bakterije Rhodococcus wratislaviensis v suspenziji.] Eva Rajh
# Anaerobic degradation of xenobiotic isophthalate by the fermenting bacterium ''Syntrophorhabdus aromaticivorans'' (M. Junghare, D. Spiteller in B. Schink; ISME J, 2019; https://doi.org/10.1038/s41396-019-0348-5). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Anaerobna_razgradnja_izoftalata_pri_fermentacijski_bakteriji_Syntrophorhabdus_aromaticivorans Anaerobna razgradnja ksenobiotika izoftalata pri fermentirajoči bakteriji ''Syntrophorhabdus aromaticivorans'']. Elvira Boršič
# Biodegradation and toxicity of emerging contaminants: Isolation of an exopolysaccharide-producing ''Sphingomonas sp.'' for ionic liquids bioremediation. (M. Koutinas ''et al.''; J. Haz. Mat. 365, Mar. 2019; https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2018.10.059). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biorazgradnja_in_toksičnost_nastalih_produktov Biorazgradnja in toksičnost nastalih produktov: izolacija mikroorganizma Sphingomonas MKIV, ki proizvaja eksopolisaharide, za bioremediacijo ionskih tekočin] Katja Dolenc

'''Terapevtski proteini in protitelesa''' (11. april) 
# Constructive approach for synthesis of a functional IgG using a reconstituted cell-free protein synthesis system (S. Murakami ''et al''; Scientific Reports 9, 2019; https://doi.org/10.1038/s41598-018-36691-8). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovit_pristop_za_sintezo_funkcionalnega_IgG_z_uporabo_rekonstruiranega_brezceli%C4%8Dnega_sistema_za_sintezo_proteinov Učinkovit pristop za sintezo funkcionalnega IgG z uporabo rekonstruiranega brezceličnega sistema za sintezo proteinov.] Vida Štrancar
# New therapeutic approach for targeting Hippo signalling pathway (L. Dominguez-Berrocal ''et al''; Scientific Reports 9(4771), 2019; https://www.nature.com/articles/s41598-019-41404-w). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nov_terapevtski_pristop_za_ciljanje_signalne_poti_Hippo Nov terapevtski pristop za ciljanje signalne poti Hippo.] Ana Halužan Vasle
# Use of a design of experiments approach to optimise production of a recombinant antibody fragment in the periplasm of Escherichia coli: selection of signal peptide and optimal growth conditions (Kasli ''et al''. AMB Expr (2019) 9:5; https://doi.org/10.1186/s13568-018-0727-8). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ Uporaba pristopa načrtovanja eksperimentov za optimizacijo proizvodnje rekombinantnega fragmenta protitelesa v periplazmi ''Escherichie'' coli: izbira signalnega peptida in optimalnih pogojev rasti.] Nina Mavec

'''Diagnostiki in cepiva''' (18. april) 
# A viral-vectored RSV vaccine induces long-lived humoral immunity in cotton rats (J. Grieves, Z. Yin, A. Garcia-Sastre et al.; Vaccine 36(26), 2018; https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2018.04.089) Cepivo proti RSV, pripravljeno z virusnim vektorjem, inducira dolgotrajno humoralno imunost pri bombažnih podganah. Nina Kobe
# Optimization of a multivalent peptide vaccine for nicotine addiction (D. F. Zeigler, R. Roque, C. H. Clegg; Vaccine 37(12), 2019; https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2019.02.003) Optimizacija multivalentnega peptidnega cepiva za nikotinsko odvisnost. Iza Oblak
# Design of a Type-1 Diabetes Vaccine Candidate Using Edible Plants Expressing a Major Autoantigen (E. Bertini ''et al''., Front. Plant Sci. 9, 2018 https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00572) Načrtovnaje kandidatnega cepiva za diabetes tipa I s pomočjo užitnih rastlin, ki izražajo pomemben avtoantigen. Katarina Petra van Midden

'''LMW učinkovine''' (25. april) 
# Metabolic engineering of ''Escherichia coli'' for de novo biosynthesis of vitamin B12 (H. Fang ''et al.'', Nat Commun. 9(1), 2018 https://doi.org/10.1038/s41467-018-07412-6). Metabolno inženirstvo bakterije ''Escherichia coli'' za de novo sintezo vitamina B12. Valentina Novak
# David Titovšek
# Bor Klančnik

'''Male molekule in polimeri''' (9. maj) 
# Primož Bembič
# Karin Dobravc Škof
# Jaka Kos

'''Pretvorba biomase in bioenergenti''' (16. maj) 
# Maksimiljan Adamek
# Aljoša Marinko
# Jošt Hočevar

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (23. maj) 
# Nives Ražnjević
# Katja Kunčič
# Peter Pečan

'''Rezervni termin''' (30. maj) 
# Mia Žganjar
# Ana Müller

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

MBT seminarji 2019

2019-03-04T15:07:39Z

Nina Mavec:

MBT seminarji 2019

2019-03-04T15:06:13Z

Nina Mavec:

BioWatcher pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni

2019-01-02T12:16:14Z

Nina Mavec: /* Rezultati eksperimenta */

[http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 BioWatcher] je projekt študentske ekipe NTHU Formosa s Tajvana, ki je bil nagrajen z zlato medaljo na tekmovanju iGEM 2018.

== Uvod ==

V zadnjih letih se ljudje vse bolj zavedajo pomena čim bolj natančnega spremljanja in zavedanja svojega zdravstvenega stanja. Vedno več ljudi se odloča za zdrav življenjski slog, pri tem pa prihaja do večjega povpraševanja po raznih pametnih urah ali zapestnicah, ki pa vseeno lahko dajejo le nek omejen nabor informacij o zdravju. Študenti s tem projektom želijo ljudem ponuditi bolj natančen vpogled v lastno zdravje in napredovanje bolezni, kakršnega je trenutno mogoče doseči s krvnim testom, želijo pa se izogniti nepraktičnosti in invazivnosti takih testov. Tako želijo razviti pametno uro, BioWatcher, ki bo v realnem času zaznavala raven biomarkerjev za razne bolezni v krvi<ref>Rapisuwon S, Vietsch EE, Wellstein A. Circulating biomarkers to monitor cancer progression and treatment. ''Computational and structural biotechnology journal.'' 2016;14:211–222. </ref> in ob dosegu neke mejne vrednosti določenega biomarkerja uporabnika obvestila. Tak pristop k diagnostiki bi bil predvsem pomemben v primeru raka, pri večini katerih je ključnega pomena pravočasna diagnoza. Kot rešitev tega problema predstavljajo načrtane celice, ki bodo biomarkerje v krvi zaznavale in ob njihovi prisotnosti proizvedle bioluminiscenco. To bi zaznavala pametna ura in raven bioluminiscence s primernim programom pretvorila v konkretne vrednosti in pregledne grafe<ref>iGEM NTHU_Formosa: BioWatcher. http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 [citirano 1. 1. 2019]</ref>.

== Načrt projekta ==

Cilj projetka je bil torej načrtati celice in ki bi ob zaznani prisotnosti biomarkerja proizvedle bioluminiscenco. Kot receptorje, ki bi biomarkerje zaznavali, so se odločili uporabiti nanotelesa, fragmente protiteles, ki vsebujejo le variabilno domeno težke verige (VHH). Zanje so se odločili zaradi znanih ugodnih lastnosti (stabilnost, visoka afiniteta in specifičnost do antigenov) in predvsem, ker obstajajo nanotelesa za mnoge različne antigene, kar bi celotnemu projektu dalo veliko fleksibilnost in možnost prilagoditve. Nanotelesa prav tako omogočajo zaznavo tako topnih kot na celično membrano vezanih antigenov<ref>Muyldermans S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. ''Annu Rev Biochem.'' (2013) 82:775–97. </ref>.

Nanotelesa bi bila zasidrana v celično membrano preko fuzijskih transmembranskih (TM) regij in razdeljena na C- in N-konec tako, da vezava antigena povzroči dimerizacijo nanoteles<ref>Tang J.C.Y., Szikra T., Kozorovitskiy Y., Teixiera M., Sabatini B.L., Roska B., Cepko C.L. A nanobody-based system using fluorescent proteins as scaffolds for cell-specific gene manipulation. ''Cell.'' 2013; 154:928–939.</ref>. Poleg TM regij tak fuzijski receptor vsebuje še proteazo iz mozaičnega virusa tobaka (ang. ''tobacco etch virus'', TEV) na intracelularni strani, ki je prav tako razdeljena na dva dela in postane aktivna šele ob dimerizaciji receptorja. Za fragmenti proteaz TEV receptor vsebuje transkripcijski aktivator tTA, na vsakem koncu katerega je zaporedje TCS (ang. ''TEV cutting site''), ki ga TEV proteaza reže. Tako se po rezanju tTA sprosti iz membrane in potuje v jedro, kjer sproži transkripcijo tarčnih genov, in sicer se veže na promotor TRE3G [2].

Tarčni geni zapisujejo za reporterski sistem. V tem projektu so še študenti odločili za reporterski sistem Lux. To je sistem za proizvajanje bioluminiscence, ki izvira in mikroorganizmov in temelji na encimu luciferazi, ki deluje na določene substrate in pri tem proizvaja svetlobo valovne dolžine 490 nm. Uporabili so tak sistem, kjer je bila raba kodonov optimizirana in ki je bil že uspešno uporabljen v človeških celicah. Glavna prednost tega spremenjenega sistema je, da ni potrebno dodajanje substratov (luciferinov), ki so sicer za človeške celice citotoksični. Sistem vsebuje dva seta genov pod dvema različnima promotorjema. Geni za LuxC, LuxD, LuxE in frp zapisujejo za encime, ki skupaj omogočajo pretvorbo določenih metabolitov, naravno prisotnih v sesalčjih celicah, v substrate za luciferazo. Ti geni so pod promotorjem iz citalomegavirusa (CMV), ki omogoča konstituitivno izražanje. Drugi set genov pa vsebuje LuxA in LuxB, ki zapoisujeta za samo luciferazo in sta pod promotrjem TRE3G. Ta pa je inducibilen in sicer omogoči izražanje ob vezavi prej omenjenega aktivatorja tTA, ki se z membrane sprosti ob vezavi antigena in dimerizaciji receptorja. Rezultat tega je, da so v celici vedno prisotni substrati za luciferazo, sama bioluminiscenca pa je samo posledica vezave pravega antigena na nanotelo<ref>Xu T., Ripp S., Sayler G.S., Close D.M. Expression of a humanized viral 2A-mediated lux operon efficiently generates autonomous bioluminescence in human cells. ''PLoS ONE.'' 2014;9:1704</ref>.

== Rezultati eksperimenta ==

Študenti so opravili dva različna poskusa. Najprej so preizkusili delovanje receptorjev, torej sposobnost nanoteles, da vežejo želen antigen in sprožijo izražanje enostavnega reporterskega proteina. Nato so preizkusili še delovanje reporterskega sistema Lux za bioluminiscenco, ki predstavlja bolj komercialno in uporabniško zanimiv pristop kot le enostaven reporterski protein.

'''Delovanje receptorjev'''

Za preizkus učinkovitosti delovanja receptorjev so uporabili GFP-vezavni protein GBP (ang. ''GFP binding protein''), dobro preučevano nanotelo, ki veže zeleni fluorescirajoči protein (GFP). Kot je opisano v načrtu poskusa, so GBP razdelili na C- in N- končni del in mu fuzijsko dodali prav tako razdeljeno proteazo TEV in transkripcijski aktivator tTA. Sestavljen biološki del, ki vsebuje vse te komponente, se imenuje pCAG-GBP-tTA in je dostopen v registru standardnih bioloških delov: [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2635001 BBa_K2635001].

V tem poskusu so za reporterski sistem uporabili le izražanje rdečega fluorescirajočega proteina mCherry. Njegovo izražanje je bilo pod promotorjem TRE3G, ki ga inducira vezava tTA. Uporabljen biološki del je dostopen v registru [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2635000 BBa_K2635000]

Za poskus so uporabili celice 293T, ki so jih transfecirali z pCAG-GBP-tTA and pTRE3G-mCherry in jih 24 ur inkubirali z GFP-jem s koncentracijo 100 ng/mL. Celice so analizirali z fluorescenčno mikroskopijo. Ugotovili so, da je 94,7 % celic, na katere se je vezal GFP, izražale tudi mCherry in svetile rdeče. Le 5,3 % celic, na katere se je GFP uspešno vezal, ni izražalo mCherry. Na nekatere celice se ni vezal niti GFP, te pa pričakovano tudi niso izražale mCherry.

S poskusoma so ocenili tudi občutljivost in odzivni čas tega sistema . Za testiranje občutljivosti so enake celice kot prej prav tako 24 ur inkubirali z različnimi koncentracijami GFP-ja in opazovali rdečo fluorescenco kot odziv. Pričakovano se je je fluorecsenca večala z višanjem koncentracije GFP, s čimer so pokazali, da je odziv sistema odvisen od doze. Sicer pa je bilo znaten odziv opaziti že pri koncentraciji GFP 10 ng/mL, plato pa je bil dosežen pri koncentraciji 75 ng/mL. Za oceno hitrosti odziva so naredili podoben poskus, kjer je bila koncentracija GFP-ja spet 100 ng/mL in konstantna, spreminjali pa so čas inkubacije, in sicer v območju od 0 do 24 ur. Pokazali do, da do znatnega odziva pride pri 6 urah inkubacije.

'''Reporterski sistem Lux'''

Da bi pokazali delovanje reporterskega sistema Lux, so študenti celice 293T transfecirali z že prej uporabljenim pCAG-GBP-tTA in s pTRE3G-LuxAB ter pCMVLuxCDEfrp, ki zapisujeta za luciferazo pod inducibilnim promotorjem in encime za generiranje primernih substratov pod konstituitivnim promotorjem CMV. Za merjenje bioluminiscence so uporabili IVIS Spectrum sitem.
Bioluminiscenco kot odziv sistema so merili pri celicah, ki so bile inkubirane z GFP-jem in za negativno kontrolo pri celicah, ki GFP-ju niso bile izpostavljene. Pokazali so, da pri inkubaciji z GFP pride do signifikantno večje bioluminiscence, ki jo je mogoče brez težav ločiti od šuma.

Za kontrolo so preizkusili, kako se sitem obnaša, če so vsi Lux geni pod konstituitivnim promotorjem CMV in se torej izražajo neodvisno od vezave antigena. Pri teh pogojih brez dodanega GFP ali drugih substratov je prišlo do učinkovitega proizvajanja bioluminiscence.

== Biološka varnost ==

Ker gre pri projektu za vnašanje celic v paciente, je bilo seveda potrebno dodati sistem, ki bi ob morebitnem imunskem odzivu ali uporabnikovi želji omogočal odstranitev celic iz človeka. Tak sistem so si zamislili v dveh stopnjah. Prvi del je namenjen urgentnim stanjem in omogoča hitro razgraditev receptorjev. Za ta namen želijo uporabiti sistem AID (ang. ''auxin-inducible degron''), ki omogoča razgradnjo tarčnega proteina ob dodatku avksina. Potrebna je fuzija tarčnega proteina z AK zaporedjem Aid, ob dodatku avksina pa pride do interakcije tako označenega proteina z E3 ubikvitin ligazo, sledi pa ubikvitinacija in razgradnja v proteasomu. Tak odziv se zgodi že v 9 minutah<ref>Nishimura K, Fukagawa T, Takisawa H, Kakimoto T, Kanemaki M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. ''Nat. Methods.'' 2009;6:917–U978</ref>.

Druga stopnja varnostnega sistema pa je set genov, ki vključujejo zapis za kaspazo 3 pod avksinskim promotorjem. To pa ob prisotnosti avksina privede do apoptoze vnesenih celic in dokončno odstranitev BioWatcherja [2].

== Zaključek ==

Študenti v projektu poudarjajo predvsem neinvazivnost sistema BioWatcher in možnost sledenja stanju biomarkerjev v realnem času kot njegovi veliki prednosti. Sistem bi torej stanje biomarkerjev spremljal neprestano, uporabnika pa opozoril, ko bi nivo določenega biomarkerja dosegel previsoke vrednosti.

Zelo pomembno pa je tudi, da je mogoče kot receptorsko nanotelo uporabiti nanotelesa za praktično katerikoli antigen. Z menjavo nanoteles ali reporterskih genov je torej mogoče sistem prilagoditi za zelo različne uporabe, npr. za zaznavanje toksinov, težkih kovin ali drugih snovi iz okolja. Tudi reporterske gene je mogoče zamenjati za gene, ki bi na primer služili dostavi ali celo proizvajanju zdravilnih učinkovin, kot signal za apoptozo in podobno. Prav tako pa sistem ni omejen na človeka. Kot alternativni primer uporabe bi lahko sistem vnesli v ribe, ki bi zaznavale raven onesnaženosti vod [2].

Sicer pa želijo z BioWatcherjem predvsem omogočiti ljudem sledenje lastnemu zdravju in tako izboljšati njihovo zdravje ter preprečiti prepozno zdravljenje zaradi pozne diagnoze in svoj sistem vidijo kot revolucionaren na področju diagnostike.

== Viri ==

<references/>

BioWatcher pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni

2019-01-02T12:15:23Z

Nina Mavec: /* Rezultati eksperimenta */

[http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 BioWatcher] je projekt študentske ekipe NTHU Formosa s Tajvana, ki je bil nagrajen z zlato medaljo na tekmovanju iGEM 2018.

== Uvod ==

V zadnjih letih se ljudje vse bolj zavedajo pomena čim bolj natančnega spremljanja in zavedanja svojega zdravstvenega stanja. Vedno več ljudi se odloča za zdrav življenjski slog, pri tem pa prihaja do večjega povpraševanja po raznih pametnih urah ali zapestnicah, ki pa vseeno lahko dajejo le nek omejen nabor informacij o zdravju. Študenti s tem projektom želijo ljudem ponuditi bolj natančen vpogled v lastno zdravje in napredovanje bolezni, kakršnega je trenutno mogoče doseči s krvnim testom, želijo pa se izogniti nepraktičnosti in invazivnosti takih testov. Tako želijo razviti pametno uro, BioWatcher, ki bo v realnem času zaznavala raven biomarkerjev za razne bolezni v krvi<ref>Rapisuwon S, Vietsch EE, Wellstein A. Circulating biomarkers to monitor cancer progression and treatment. ''Computational and structural biotechnology journal.'' 2016;14:211–222. </ref> in ob dosegu neke mejne vrednosti določenega biomarkerja uporabnika obvestila. Tak pristop k diagnostiki bi bil predvsem pomemben v primeru raka, pri večini katerih je ključnega pomena pravočasna diagnoza. Kot rešitev tega problema predstavljajo načrtane celice, ki bodo biomarkerje v krvi zaznavale in ob njihovi prisotnosti proizvedle bioluminiscenco. To bi zaznavala pametna ura in raven bioluminiscence s primernim programom pretvorila v konkretne vrednosti in pregledne grafe<ref>iGEM NTHU_Formosa: BioWatcher. http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 [citirano 1. 1. 2019]</ref>.

== Načrt projekta ==

Cilj projetka je bil torej načrtati celice in ki bi ob zaznani prisotnosti biomarkerja proizvedle bioluminiscenco. Kot receptorje, ki bi biomarkerje zaznavali, so se odločili uporabiti nanotelesa, fragmente protiteles, ki vsebujejo le variabilno domeno težke verige (VHH). Zanje so se odločili zaradi znanih ugodnih lastnosti (stabilnost, visoka afiniteta in specifičnost do antigenov) in predvsem, ker obstajajo nanotelesa za mnoge različne antigene, kar bi celotnemu projektu dalo veliko fleksibilnost in možnost prilagoditve. Nanotelesa prav tako omogočajo zaznavo tako topnih kot na celično membrano vezanih antigenov<ref>Muyldermans S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. ''Annu Rev Biochem.'' (2013) 82:775–97. </ref>.

Nanotelesa bi bila zasidrana v celično membrano preko fuzijskih transmembranskih (TM) regij in razdeljena na C- in N-konec tako, da vezava antigena povzroči dimerizacijo nanoteles<ref>Tang J.C.Y., Szikra T., Kozorovitskiy Y., Teixiera M., Sabatini B.L., Roska B., Cepko C.L. A nanobody-based system using fluorescent proteins as scaffolds for cell-specific gene manipulation. ''Cell.'' 2013; 154:928–939.</ref>. Poleg TM regij tak fuzijski receptor vsebuje še proteazo iz mozaičnega virusa tobaka (ang. ''tobacco etch virus'', TEV) na intracelularni strani, ki je prav tako razdeljena na dva dela in postane aktivna šele ob dimerizaciji receptorja. Za fragmenti proteaz TEV receptor vsebuje transkripcijski aktivator tTA, na vsakem koncu katerega je zaporedje TCS (ang. ''TEV cutting site''), ki ga TEV proteaza reže. Tako se po rezanju tTA sprosti iz membrane in potuje v jedro, kjer sproži transkripcijo tarčnih genov, in sicer se veže na promotor TRE3G [2].

Tarčni geni zapisujejo za reporterski sistem. V tem projektu so še študenti odločili za reporterski sistem Lux. To je sistem za proizvajanje bioluminiscence, ki izvira in mikroorganizmov in temelji na encimu luciferazi, ki deluje na določene substrate in pri tem proizvaja svetlobo valovne dolžine 490 nm. Uporabili so tak sistem, kjer je bila raba kodonov optimizirana in ki je bil že uspešno uporabljen v človeških celicah. Glavna prednost tega spremenjenega sistema je, da ni potrebno dodajanje substratov (luciferinov), ki so sicer za človeške celice citotoksični. Sistem vsebuje dva seta genov pod dvema različnima promotorjema. Geni za LuxC, LuxD, LuxE in frp zapisujejo za encime, ki skupaj omogočajo pretvorbo določenih metabolitov, naravno prisotnih v sesalčjih celicah, v substrate za luciferazo. Ti geni so pod promotorjem iz citalomegavirusa (CMV), ki omogoča konstituitivno izražanje. Drugi set genov pa vsebuje LuxA in LuxB, ki zapoisujeta za samo luciferazo in sta pod promotrjem TRE3G. Ta pa je inducibilen in sicer omogoči izražanje ob vezavi prej omenjenega aktivatorja tTA, ki se z membrane sprosti ob vezavi antigena in dimerizaciji receptorja. Rezultat tega je, da so v celici vedno prisotni substrati za luciferazo, sama bioluminiscenca pa je samo posledica vezave pravega antigena na nanotelo<ref>Xu T., Ripp S., Sayler G.S., Close D.M. Expression of a humanized viral 2A-mediated lux operon efficiently generates autonomous bioluminescence in human cells. ''PLoS ONE.'' 2014;9:1704</ref>.

== Rezultati eksperimenta ==

Študenti so opravili dva različna poskusa. Najprej so preizkusili delovanje receptorjev, torej sposobnost nanoteles, da vežejo želen antigen in sprožijo izražanje enostavnega reporterskega proteina. Nato so preizkusili še delovanje reporterskega sistema Lux za bioluminiscenco, ki predstavlja bolj komercialno in uporabniško zanimiv pristop kot le enostaven reporterski protein.

'''Delovanje receptorjev'''

Za preizkus učinkovitosti delovanja receptorjev so uporabili GFP-vezavni protein GBP (ang. ''GFP binding protein''), dobro preučevano nanotelo, ki veže zeleni fluorescirajoči protein (GFP). Kot je opisano v načrtu poskusa, so GBP razdelili na C- in N- končni del in mu fuzijsko dodali prav tako razdeljeno proteazo TEV in transkripcijski aktivator tTA. Sestavljen biološki del, ki vsebuje vse te komponente, se imenuje pCAG-GBP-tTA in je dostopen v registru standardnih bioloških delov: [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2635001 BBa_K2635000].

V tem poskusu so za reporterski sistem uporabili le izražanje rdečega fluorescirajočega proteina mCherry. Njegovo izražanje je bilo pod promotorjem TRE3G, ki ga inducira vezava tTA. Uporabljen biološki del je dostopen v registru [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2635000 BBa_K2635000]

Za poskus so uporabili celice 293T, ki so jih transfecirali z pCAG-GBP-tTA and pTRE3G-mCherry in jih 24 ur inkubirali z GFP-jem s koncentracijo 100 ng/mL. Celice so analizirali z fluorescenčno mikroskopijo. Ugotovili so, da je 94,7 % celic, na katere se je vezal GFP, izražale tudi mCherry in svetile rdeče. Le 5,3 % celic, na katere se je GFP uspešno vezal, ni izražalo mCherry. Na nekatere celice se ni vezal niti GFP, te pa pričakovano tudi niso izražale mCherry.

S poskusoma so ocenili tudi občutljivost in odzivni čas tega sistema . Za testiranje občutljivosti so enake celice kot prej prav tako 24 ur inkubirali z različnimi koncentracijami GFP-ja in opazovali rdečo fluorescenco kot odziv. Pričakovano se je je fluorecsenca večala z višanjem koncentracije GFP, s čimer so pokazali, da je odziv sistema odvisen od doze. Sicer pa je bilo znaten odziv opaziti že pri koncentraciji GFP 10 ng/mL, plato pa je bil dosežen pri koncentraciji 75 ng/mL. Za oceno hitrosti odziva so naredili podoben poskus, kjer je bila koncentracija GFP-ja spet 100 ng/mL in konstantna, spreminjali pa so čas inkubacije, in sicer v območju od 0 do 24 ur. Pokazali do, da do znatnega odziva pride pri 6 urah inkubacije.

'''Reporterski sistem Lux'''

Da bi pokazali delovanje reporterskega sistema Lux, so študenti celice 293T transfecirali z že prej uporabljenim pCAG-GBP-tTA in s pTRE3G-LuxAB ter pCMVLuxCDEfrp, ki zapisujeta za luciferazo pod inducibilnim promotorjem in encime za generiranje primernih substratov pod konstituitivnim promotorjem CMV. Za merjenje bioluminiscence so uporabili IVIS Spectrum sitem.
Bioluminiscenco kot odziv sistema so merili pri celicah, ki so bile inkubirane z GFP-jem in za negativno kontrolo pri celicah, ki GFP-ju niso bile izpostavljene. Pokazali so, da pri inkubaciji z GFP pride do signifikantno večje bioluminiscence, ki jo je mogoče brez težav ločiti od šuma.

Za kontrolo so preizkusili, kako se sitem obnaša, če so vsi Lux geni pod konstituitivnim promotorjem CMV in se torej izražajo neodvisno od vezave antigena. Pri teh pogojih brez dodanega GFP ali drugih substratov je prišlo do učinkovitega proizvajanja bioluminiscence.

== Biološka varnost ==

Ker gre pri projektu za vnašanje celic v paciente, je bilo seveda potrebno dodati sistem, ki bi ob morebitnem imunskem odzivu ali uporabnikovi želji omogočal odstranitev celic iz človeka. Tak sistem so si zamislili v dveh stopnjah. Prvi del je namenjen urgentnim stanjem in omogoča hitro razgraditev receptorjev. Za ta namen želijo uporabiti sistem AID (ang. ''auxin-inducible degron''), ki omogoča razgradnjo tarčnega proteina ob dodatku avksina. Potrebna je fuzija tarčnega proteina z AK zaporedjem Aid, ob dodatku avksina pa pride do interakcije tako označenega proteina z E3 ubikvitin ligazo, sledi pa ubikvitinacija in razgradnja v proteasomu. Tak odziv se zgodi že v 9 minutah<ref>Nishimura K, Fukagawa T, Takisawa H, Kakimoto T, Kanemaki M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. ''Nat. Methods.'' 2009;6:917–U978</ref>.

Druga stopnja varnostnega sistema pa je set genov, ki vključujejo zapis za kaspazo 3 pod avksinskim promotorjem. To pa ob prisotnosti avksina privede do apoptoze vnesenih celic in dokončno odstranitev BioWatcherja [2].

== Zaključek ==

Študenti v projektu poudarjajo predvsem neinvazivnost sistema BioWatcher in možnost sledenja stanju biomarkerjev v realnem času kot njegovi veliki prednosti. Sistem bi torej stanje biomarkerjev spremljal neprestano, uporabnika pa opozoril, ko bi nivo določenega biomarkerja dosegel previsoke vrednosti.

Zelo pomembno pa je tudi, da je mogoče kot receptorsko nanotelo uporabiti nanotelesa za praktično katerikoli antigen. Z menjavo nanoteles ali reporterskih genov je torej mogoče sistem prilagoditi za zelo različne uporabe, npr. za zaznavanje toksinov, težkih kovin ali drugih snovi iz okolja. Tudi reporterske gene je mogoče zamenjati za gene, ki bi na primer služili dostavi ali celo proizvajanju zdravilnih učinkovin, kot signal za apoptozo in podobno. Prav tako pa sistem ni omejen na človeka. Kot alternativni primer uporabe bi lahko sistem vnesli v ribe, ki bi zaznavale raven onesnaženosti vod [2].

Sicer pa želijo z BioWatcherjem predvsem omogočiti ljudem sledenje lastnemu zdravju in tako izboljšati njihovo zdravje ter preprečiti prepozno zdravljenje zaradi pozne diagnoze in svoj sistem vidijo kot revolucionaren na področju diagnostike.

== Viri ==

<references/>

BioWatcher pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni

2019-01-02T12:14:16Z

Nina Mavec:

[http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 BioWatcher] je projekt študentske ekipe NTHU Formosa s Tajvana, ki je bil nagrajen z zlato medaljo na tekmovanju iGEM 2018.

== Uvod ==

V zadnjih letih se ljudje vse bolj zavedajo pomena čim bolj natančnega spremljanja in zavedanja svojega zdravstvenega stanja. Vedno več ljudi se odloča za zdrav življenjski slog, pri tem pa prihaja do večjega povpraševanja po raznih pametnih urah ali zapestnicah, ki pa vseeno lahko dajejo le nek omejen nabor informacij o zdravju. Študenti s tem projektom želijo ljudem ponuditi bolj natančen vpogled v lastno zdravje in napredovanje bolezni, kakršnega je trenutno mogoče doseči s krvnim testom, želijo pa se izogniti nepraktičnosti in invazivnosti takih testov. Tako želijo razviti pametno uro, BioWatcher, ki bo v realnem času zaznavala raven biomarkerjev za razne bolezni v krvi<ref>Rapisuwon S, Vietsch EE, Wellstein A. Circulating biomarkers to monitor cancer progression and treatment. ''Computational and structural biotechnology journal.'' 2016;14:211–222. </ref> in ob dosegu neke mejne vrednosti določenega biomarkerja uporabnika obvestila. Tak pristop k diagnostiki bi bil predvsem pomemben v primeru raka, pri večini katerih je ključnega pomena pravočasna diagnoza. Kot rešitev tega problema predstavljajo načrtane celice, ki bodo biomarkerje v krvi zaznavale in ob njihovi prisotnosti proizvedle bioluminiscenco. To bi zaznavala pametna ura in raven bioluminiscence s primernim programom pretvorila v konkretne vrednosti in pregledne grafe<ref>iGEM NTHU_Formosa: BioWatcher. http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 [citirano 1. 1. 2019]</ref>.

== Načrt projekta ==

Cilj projetka je bil torej načrtati celice in ki bi ob zaznani prisotnosti biomarkerja proizvedle bioluminiscenco. Kot receptorje, ki bi biomarkerje zaznavali, so se odločili uporabiti nanotelesa, fragmente protiteles, ki vsebujejo le variabilno domeno težke verige (VHH). Zanje so se odločili zaradi znanih ugodnih lastnosti (stabilnost, visoka afiniteta in specifičnost do antigenov) in predvsem, ker obstajajo nanotelesa za mnoge različne antigene, kar bi celotnemu projektu dalo veliko fleksibilnost in možnost prilagoditve. Nanotelesa prav tako omogočajo zaznavo tako topnih kot na celično membrano vezanih antigenov<ref>Muyldermans S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. ''Annu Rev Biochem.'' (2013) 82:775–97. </ref>.

Nanotelesa bi bila zasidrana v celično membrano preko fuzijskih transmembranskih (TM) regij in razdeljena na C- in N-konec tako, da vezava antigena povzroči dimerizacijo nanoteles<ref>Tang J.C.Y., Szikra T., Kozorovitskiy Y., Teixiera M., Sabatini B.L., Roska B., Cepko C.L. A nanobody-based system using fluorescent proteins as scaffolds for cell-specific gene manipulation. ''Cell.'' 2013; 154:928–939.</ref>. Poleg TM regij tak fuzijski receptor vsebuje še proteazo iz mozaičnega virusa tobaka (ang. ''tobacco etch virus'', TEV) na intracelularni strani, ki je prav tako razdeljena na dva dela in postane aktivna šele ob dimerizaciji receptorja. Za fragmenti proteaz TEV receptor vsebuje transkripcijski aktivator tTA, na vsakem koncu katerega je zaporedje TCS (ang. ''TEV cutting site''), ki ga TEV proteaza reže. Tako se po rezanju tTA sprosti iz membrane in potuje v jedro, kjer sproži transkripcijo tarčnih genov, in sicer se veže na promotor TRE3G [2].

Tarčni geni zapisujejo za reporterski sistem. V tem projektu so še študenti odločili za reporterski sistem Lux. To je sistem za proizvajanje bioluminiscence, ki izvira in mikroorganizmov in temelji na encimu luciferazi, ki deluje na določene substrate in pri tem proizvaja svetlobo valovne dolžine 490 nm. Uporabili so tak sistem, kjer je bila raba kodonov optimizirana in ki je bil že uspešno uporabljen v človeških celicah. Glavna prednost tega spremenjenega sistema je, da ni potrebno dodajanje substratov (luciferinov), ki so sicer za človeške celice citotoksični. Sistem vsebuje dva seta genov pod dvema različnima promotorjema. Geni za LuxC, LuxD, LuxE in frp zapisujejo za encime, ki skupaj omogočajo pretvorbo določenih metabolitov, naravno prisotnih v sesalčjih celicah, v substrate za luciferazo. Ti geni so pod promotorjem iz citalomegavirusa (CMV), ki omogoča konstituitivno izražanje. Drugi set genov pa vsebuje LuxA in LuxB, ki zapoisujeta za samo luciferazo in sta pod promotrjem TRE3G. Ta pa je inducibilen in sicer omogoči izražanje ob vezavi prej omenjenega aktivatorja tTA, ki se z membrane sprosti ob vezavi antigena in dimerizaciji receptorja. Rezultat tega je, da so v celici vedno prisotni substrati za luciferazo, sama bioluminiscenca pa je samo posledica vezave pravega antigena na nanotelo<ref>Xu T., Ripp S., Sayler G.S., Close D.M. Expression of a humanized viral 2A-mediated lux operon efficiently generates autonomous bioluminescence in human cells. ''PLoS ONE.'' 2014;9:1704</ref>.

== Rezultati eksperimenta ==

Študenti so opravili dva različna poskusa. Najprej so preizkusili delovanje receptorjev, torej sposobnost nanoteles, da vežejo želen antigen in sprožijo izražanje enostavnega reporterskega proteina. Nato so preizkusili še delovanje reporterskega sistema Lux za bioluminiscenco, ki predstavlja bolj komercialno in uporabniško zanimiv pristop kot le enostaven reporterski protein.

'''Delovanje receptorjev'''

Za preizkus učinkovitosti delovanja receptorjev so uporabili GFP-vezavni protein GBP (ang. ''GFP binding protein''), dobro preučevano nanotelo, ki veže zeleni fluorescirajoči protein (GFP). Kot je opisano v načrtu poskusa, so GBP razdelili na C- in N- končni del in mu fuzijsko dodali prav tako razdeljeno proteazo TEV in transkripcijski aktivator tTA. Sestavljen biološki del, ki vsebuje vse te komponente, se imenuje pCAG-GBP-tTA in je dostopen v registru standardnih bioloških delov: [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2635001 BBa_K2635000].

V tem poskusu so za reporterski sistem uporabili le izražanje rdečega fluorescirajočega proteina mCherry. Njegovo izražanje je bilo pod promotorjem TRE3G, ki ga inducira vezava tTA. Uporabljen biološki del je dostopen v registru [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2635000 BBa_K2635000]

Za poskus so uporabili celice 293T, ki so jih transfecirali z pCAG-GBP-tTA and pTRE3G-mCherry in jih 24 ur inkubirali z GFP-jem s koncentracijo 100 ng/mL. Celice so analizirali z fluorescenčno mikroskopijo. Ugotovili so, da je 94,7 % celic, na katere se je vezal GFP, izražale tudi mCherry in svetile rdeče. Le 5,3 % celic, na katere se je GFP uspešno vezal, ni izražalo mCherry. Na nekatere celice se ni vezal niti GFP, te pa pričakovano tudi niso izražale mCherry.

S poskusoma so ocenili tudi občutljivost in odzivni čas tega sistema . Za testiranje občutljivosti so enake celice kot prej prav tako 24 ur inkubirali z različnimi koncentracijami GFP-ja in opazovali rdečo fluorescenco kot odziv. Pričakovano se je je fluorecsenca večala z višanjem koncentracije GFP, s čimer so pokazali, da je odziv sistema odvisen od doze. Sicer pa je bilo znaten odziv opaziti že pri koncentraciji GFP 10 ng/mL, plato pa je bil dosežen pri koncentraciji 75 ng/mL. Za oceno hitrosti odziva so naredili podoben poskus, kjer je bila koncentracija GFP-ja spet 100 ng/mL in konstantna, spreminjali pa so čas inkubacije, in sicer v območju od 0 do 24 ur. Pokazali do, da do znatnega odziva pride pri 6 urah inkubacije.

'''Reporterski sistem Lux'''

Da bi pokazali delovanje reporterskega sistema Lux, so študenti celice 293T transfecirali z že prej uporabljenim pCAG-GBP-tTA in s pTRE3G-LuxAB ter pCMVLuxCDEfrp, ki zapisujeta za luciferazo pod inducibilnim promotorjem in encimi za generiranje primernih substratov pod konstituitivnim promotorjem CMV. Za merjenje bioluminiscence so uporabili IVIS Spectrum sitem.
Bioluminiscenco kot odziv sistema so merili pri celicah, ki so bile inkubirane z GFP-jem in za negativno kontrolo pri celicah, ki GFP-ju niso bile izpostavljene. Pokazali so, da pri inkubaciji z GFP pride do signifikantno večje bioluminiscence, ki jo je mogoče brez težav ločiti od šuma.

Za kontrolo so preizkusili, kako se sitem obnaša, če so vsi Lux geni pod konstituitivnim promotorjem CMV in se torej izražajo neodvisno od vezave antigena. Pri teh pogojih brez dodanega GFP ali drugih substratov je prišlo do učinkovitega proizvajanja bioluminiscence.

== Biološka varnost ==

Ker gre pri projektu za vnašanje celic v paciente, je bilo seveda potrebno dodati sistem, ki bi ob morebitnem imunskem odzivu ali uporabnikovi želji omogočal odstranitev celic iz človeka. Tak sistem so si zamislili v dveh stopnjah. Prvi del je namenjen urgentnim stanjem in omogoča hitro razgraditev receptorjev. Za ta namen želijo uporabiti sistem AID (ang. ''auxin-inducible degron''), ki omogoča razgradnjo tarčnega proteina ob dodatku avksina. Potrebna je fuzija tarčnega proteina z AK zaporedjem Aid, ob dodatku avksina pa pride do interakcije tako označenega proteina z E3 ubikvitin ligazo, sledi pa ubikvitinacija in razgradnja v proteasomu. Tak odziv se zgodi že v 9 minutah<ref>Nishimura K, Fukagawa T, Takisawa H, Kakimoto T, Kanemaki M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. ''Nat. Methods.'' 2009;6:917–U978</ref>.

Druga stopnja varnostnega sistema pa je set genov, ki vključujejo zapis za kaspazo 3 pod avksinskim promotorjem. To pa ob prisotnosti avksina privede do apoptoze vnesenih celic in dokončno odstranitev BioWatcherja [2].

== Zaključek ==

Študenti v projektu poudarjajo predvsem neinvazivnost sistema BioWatcher in možnost sledenja stanju biomarkerjev v realnem času kot njegovi veliki prednosti. Sistem bi torej stanje biomarkerjev spremljal neprestano, uporabnika pa opozoril, ko bi nivo določenega biomarkerja dosegel previsoke vrednosti.

Zelo pomembno pa je tudi, da je mogoče kot receptorsko nanotelo uporabiti nanotelesa za praktično katerikoli antigen. Z menjavo nanoteles ali reporterskih genov je torej mogoče sistem prilagoditi za zelo različne uporabe, npr. za zaznavanje toksinov, težkih kovin ali drugih snovi iz okolja. Tudi reporterske gene je mogoče zamenjati za gene, ki bi na primer služili dostavi ali celo proizvajanju zdravilnih učinkovin, kot signal za apoptozo in podobno. Prav tako pa sistem ni omejen na človeka. Kot alternativni primer uporabe bi lahko sistem vnesli v ribe, ki bi zaznavale raven onesnaženosti vod [2].

Sicer pa želijo z BioWatcherjem predvsem omogočiti ljudem sledenje lastnemu zdravju in tako izboljšati njihovo zdravje ter preprečiti prepozno zdravljenje zaradi pozne diagnoze in svoj sistem vidijo kot revolucionaren na področju diagnostike.

== Viri ==

<references/>

BioWatcher pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni

2019-01-02T12:13:52Z

Nina Mavec: /* Rezultati eksperimenta */

[http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 BioWatcher] je projekt študentske ekipe NTHU Formosa s Tajvana, ki je bil nagrajen z zlato medaljo na tekmovanju iGEM 2018.

== Uvod ==

V zadnjih letih se ljudje vse bolj zavedajo pomena čim bolj natančnega spremljanja in zavedanja svojega zdravstvenega stanja. Vedno več ljudi se odloča za zdrav življenjski slog, pri tem pa prihaja do večjega povpraševanja po raznih pametnih urah ali zapestnicah, ki pa vseeno lahko dajejo le nek omejen nabor informacij o zdravju. Študenti s tem projektom želijo ljudem ponuditi bolj natančen vpogled v lastno zdravje in napredovanje bolezni, kakršnega je trenutno mogoče doseči s krvnim testom, želijo pa se izogniti nepraktičnosti in invazivnosti takih testov. Tako želijo razviti pametno uro, BioWatcher, ki bo v realnem času zaznavala raven biomarkerjev za razne bolezni v krvi<ref>Rapisuwon S, Vietsch EE, Wellstein A. Circulating biomarkers to monitor cancer progression and treatment. ''Computational and structural biotechnology journal.'' 2016;14:211–222. </ref> in ob dosegu neke mejne vrednosti določenega biomarkerja uporabnika obvestila. Tak pristop k diagnostiki bi bil predvsem pomemben v primeru raka, pri večini katerih je ključnega pomena pravočasna diagnoza. Kot rešitev tega problema predstavljajo načrtane celice, ki bodo biomarkerje v krvi zaznavale in ob njihovi prisotnosti proizvedle bioluminiscenco. To bi zaznavala pametna ura in raven bioluminiscence s primernim programom pretvorila v konkretne vrednosti in pregledne grafe<ref>iGEM NTHU_Formosa: BioWatcher. http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 [citirano 1. 1. 2019]</ref>.

== Načrt projekta ==

Cilj projetka je bil torej načrtati celice in ki bi ob zaznani prisotnosti biomarkerja proizvedle bioluminiscenco. Kot receptorje, ki bi biomarkerje zaznavali, so se odločili uporabiti nanotelesa, fragmente protiteles, ki vsebujejo le variabilno domeno težke verige (VHH). Zanje so se odločili zaradi znanih ugodnih lastnosti (stabilnost, visoka afiniteta in specifičnost do antigenov) in predvsem, ker obstajajo nanotelesa za mnoge različne antigene, kar bi celotnemu projektu dalo veliko fleksibilnost in možnost prilagoditve. Nanotelesa prav tako omogočajo zaznavo tako topnih kot na celično membrano vezanih antigenov<ref>Muyldermans S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. ''Annu Rev Biochem.'' (2013) 82:775–97. </ref>.

Nanotelesa bi bila zasidrana v celično membrano preko fuzijskih transmembranskih (TM) regij in razdeljena na C- in N-konec tako, da vezava antigena povzroči dimerizacijo nanoteles<ref>Tang J.C.Y., Szikra T., Kozorovitskiy Y., Teixiera M., Sabatini B.L., Roska B., Cepko C.L. A nanobody-based system using fluorescent proteins as scaffolds for cell-specific gene manipulation. ''Cell.'' 2013; 154:928–939.</ref>. Poleg TM regij tak fuzijski receptor vsebuje še proteazo iz mozaičnega virusa tobaka (ang. ''tobacco etch virus'', TEV) na intracelularni strani, ki je prav tako razdeljena na dva dela in postane aktivna šele ob dimerizaciji receptorja. Za fragmenti proteaz TEV receptor vsebuje transkripcijski aktivator tTA, na vsakem koncu katerega je zaporedje TCS (ang. ''TEV cutting site''), ki ga TEV proteaza reže. Tako se po rezanju tTA sprosti iz membrane in potuje v jedro, kjer sproži transkripcijo tarčnih genov, in sicer se veže na promotor TRE3G [2].

Tarčni geni zapisujejo za reporterski sistem. V tem projektu so še študenti odločili za reporterski sistem Lux. To je sistem za proizvajanje bioluminiscence, ki izvira in mikroorganizmov in temelji na encimu luciferazi, ki deluje na določene substrate in pri tem proizvaja svetlobo valovne dolžine 490 nm. Uporabili so tak sistem, kjer je bila raba kodonov optimizirana in ki je bil že uspešno uporabljen v človeških celicah. Glavna prednost tega spremenjenega sistema je, da ni potrebno dodajanje substratov (luciferinov), ki so sicer za človeške celice citotoksični. Sistem vsebuje dva seta genov pod dvema različnima promotorjema. Geni za LuxC, LuxD, LuxE in frp zapisujejo za encime, ki skupaj omogočajo pretvorbo določenih metabolitov, naravno prisotnih v sesalčjih celicah, v substrate za luciferazo. Ti geni so pod promotorjem iz citalomegavirusa (CMV), ki omogoča konstituitivno izražanje. Drugi set genov pa vsebuje LuxA in LuxB, ki zapoisujeta za samo luciferazo in sta pod promotrjem TRE3G. Ta pa je inducibilen in sicer omogoči izražanje ob vezavi prej omenjenega aktivatorja tTA, ki se z membrane sprosti ob vezavi antigena in dimerizaciji receptorja. Rezultat tega je, da so v celici vedno prisotni substrati za luciferazo, sama bioluminiscenca pa je samo posledica vezave pravega antigena na nanotelo<ref>Xu T., Ripp S., Sayler G.S., Close D.M. Expression of a humanized viral 2A-mediated lux operon efficiently generates autonomous bioluminescence in human cells. ''PLoS ONE.'' 2014;9:1704</ref>.

== Rezultati eksperimenta ==

Študenti so opravili dva različna poskusa. Najprej so preizkusili delovanje receptorjev, torej sposobnost nanoteles, da vežejo želen antigen in sprožijo izražanje enostavnega reporterskega proteina. Nato so preizkusili še delovanje reporterskega sistema Lux za bioluminiscenco, ki predstavlja bolj komercialno in uporabniško zanimiv pristop kot le enostaven reporterski protein.

'''Delovanje receptorjev'''

Za preizkus učinkovitosti delovanja receptorjev so uporabili GFP-vezavni protein GBP (ang. ''GFP binding protein''), dobro preučevano nanotelo, ki veže zeleni fluorescirajoči protein (GFP). Kot je opisano v načrtu poskusa, so GBP razdelili na C- in N- končni del in mu fuzijsko dodali prav tako razdeljeno proteazo TEV in transkripcijski aktivator tTA. Sestavljen biološki del, ki vsebuje vse te komponente, se imenuje pCAG-GBP-tTA in je dostopen v registru standardnih bioloških delov: [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2635001 BBa_K2635000].

V tem poskusu so za reporterski sistem uporabili le izražanje rdečega fluorescirajočega proteina mCherry. Njegovo izražanje je bilo pod promotorjem TRE3G, ki ga inducira vezava tTA. Uporabljen biološki del je dostopen v registru [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2635000 BBa_K2635000]

Za poskus so uporabili celice 293T, ki so jih transfecirali z pCAG-GBP-tTA and pTRE3G-mCherry in jih 24 ur inkubirali z GFP-jem s koncentracijo 100 ng/mL. Celice so analizirali z fluorescenčno mikroskopijo. Ugotovili so, da je 94,7 % celic, na katere se je vezal GFP, izražale tudi mCherry in svetile rdeče. Le 5,3 % celic, na katere se je GFP uspešno vezal, ni izražalo mCherry. Na nekatere celice se ni vezal niti GFP, te pa pričakovano tudi niso izražale mCherry.

S poskusoma so ocenili tudi občutljivost in odzivni čas tega sistema . Za testiranje občutljivosti so enake celice kot prej prav tako 24 ur inkubirali z različnimi koncentracijami GFP-ja in opazovali rdečo fluorescenco kot odziv. Pričakovano se je je fluorecsenca večala z višanjem koncentracije GFP, s čimer so pokazali, da je odziv sistema odvisen od doze. Sicer pa je bilo znaten odziv opaziti že pri koncentraciji GFP 10 ng/mL, plato pa je bil dosežen pri koncentraciji 75 ng/mL. Za oceno hitrosti odziva so naredili podoben poskus, kjer je bila koncentracija GFP-ja spet 100 ng/mL in konstantna, spreminjali pa so čas inkubacije, in sicer v območju od 0 do 24 ur. Pokazali do, da do znatnega odziva pride pri 6 urah inkubacije.

'''Reporterski sistem Lux'''

Da bi pokazali delovanje reporterskega sistema Lux, so študenti celice 293T transfecirali z že prej uporabljenim pCAG-GBP-tTA in s pTRE3G-LuxAB ter pCMVLuxCDEfrp, ki zapisujeta za luciferazo pod inducibilnim promotorjem in encimi za generiranje primernih substratov pod konstituitivnim promotorjem CMV. Za merjenje bioluminiscence so uporabili IVIS Spectrum sitem.
Bioluminiscenco kot odziv sistema so merili pri celicah, ki so bile inkubirane z GFP-jem in za negativno kontrolo pri celicah, ki GFP-ju niso bile izpostavljene. Pokazali so, da pri inkubaciji z GFP pride do signifikantno večje bioluminiscence, ki jo je mogoče brez težav ločiti od šuma.

Za kontrolo so preizkusili, kako se sitem obnaša, če so vsi Lux geni pod konstituitivnim promotorjem CMV in se torej izražajo neodvisno od vezave antigena. Pri teh pogojih brez dodanega GFP ali drugih substratov je prišlo do učinkovitega proizvajanja bioluminiscence.

== Biološka varnost ==

Ker gre pri projektu za vnašanje celic v paciente, je bilo seveda potrebno dodati sistem, ki bi ob morebitnem imunskem odzivu ali uporabnikovi želji omogočal odstranitev celic iz človeka. Tak sistem so si zamislili v dveh stopnjah. Prvi del je namenjen urgentnim stanjem in omogoča hitro razgraditev receptorjev. Za ta namen želijo uporabiti sistem AID (ang. ''auxin-inducible degron''), ki omogoča razgradnjo tarčnega proteina ob dodatku avksina. Potrebna je fuzija tarčnega proteina z AK zaporedjem Aid, ob dodatku avksina pa pride do interakcije tako označenega proteina z E3 ubikvitin ligazo, sledi pa ubikvitinacija in razgradnja v proteasomu. Tak odziv se zgodi že v 9 minutah<ref>Nishimura K, Fukagawa T, Takisawa H, Kakimoto T, Kanemaki M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. ''Nat. Methods.'' 2009;6:917–U978</ref>.

Druga stopnja varnostnega sistema pa je set genov, ki vključujejo zapis za kaspazo 3 pod avksinskim promotorjem. To pa ob prisotnosti avksina privede do apoptoze vnesenih celic in dokončno odstranitev BioWatcherja [2].

== Zaključek ==

Študenti v projektu poudarjajo predvsem neinvazivnost sistema BioWatcher in možnost sledenja stanju biomarkerjev v realnem času kot njegovi veliki prednosti. Sistem bi torej stanje biomarkerjev spremljal neprestano, uporabnika pa opozoril, ko bi nivo določenega biomarkerja dosegel previsoke vrednosti.

Zelo pomembno pa je tudi, da je mogoče kot receptorsko nanotelo uporabiti nanotelesa za praktično katerikoli antigen. Z menjavo nanoteles ali reporterskih genov je torej mogoče sistem prilagoditi za zelo različne uporabe, npr. za zaznavanje toksinov, težkih kovin ali drugih snovi iz okolja. Tudi reporterske gene je mogoče zamenjati za gene, ki bi na primer služili dostavi ali celo proizvajanju zdravilnih učinkovin, kot signal za apoptozo in podobno. Prav tako pa sistem ni omejen na človeka. Kot alternativni primer uporabe bi lahko sistem vnesli v ribe, ki bi zaznavale raven onesnaženosti vod [2].

Sicer pa želijo z BioWatcherjem predvsem omogočiti ljudem sledenje lastnemu zdravju in tako izboljšati njihovo zdravje ter preprečiti prepozno zdravljenje zaradi pozne diagnoze in svoj sistem vidijo kot revolucionaren na področju diagnostike.

== Viri ==

<references/>

BioWatcher pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni

2019-01-02T12:11:04Z

Nina Mavec: /* Rezultati eksperimenta */

[http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 BioWatcher] je projekt študentske ekipe NTHU Formosa s Tajvana, ki je bil nagrajen z zlato medaljo na tekmovanju iGEM 2018.

== Uvod ==

V zadnjih letih se ljudje vse bolj zavedajo pomena čim bolj natančnega spremljanja in zavedanja svojega zdravstvenega stanja. Vedno več ljudi se odloča za zdrav življenjski slog, pri tem pa prihaja do večjega povpraševanja po raznih pametnih urah ali zapestnicah, ki pa vseeno lahko dajejo le nek omejen nabor informacij o zdravju. Študenti s tem projektom želijo ljudem ponuditi bolj natančen vpogled v lastno zdravje in napredovanje bolezni, kakršnega je trenutno mogoče doseči s krvnim testom, želijo pa se izogniti nepraktičnosti in invazivnosti takih testov. Tako želijo razviti pametno uro, BioWatcher, ki bo v realnem času zaznavala raven biomarkerjev za razne bolezni v krvi<ref>Rapisuwon S, Vietsch EE, Wellstein A. Circulating biomarkers to monitor cancer progression and treatment. ''Computational and structural biotechnology journal.'' 2016;14:211–222. </ref> in ob dosegu neke mejne vrednosti določenega biomarkerja uporabnika obvestila. Tak pristop k diagnostiki bi bil predvsem pomemben v primeru raka, pri večini katerih je ključnega pomena pravočasna diagnoza. Kot rešitev tega problema predstavljajo načrtane celice, ki bodo biomarkerje v krvi zaznavale in ob njihovi prisotnosti proizvedle bioluminiscenco. To bi zaznavala pametna ura in raven bioluminiscence s primernim programom pretvorila v konkretne vrednosti in pregledne grafe<ref>iGEM NTHU_Formosa: BioWatcher. http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 [citirano 1. 1. 2019]</ref>.

== Načrt projekta ==

Cilj projetka je bil torej načrtati celice in ki bi ob zaznani prisotnosti biomarkerja proizvedle bioluminiscenco. Kot receptorje, ki bi biomarkerje zaznavali, so se odločili uporabiti nanotelesa, fragmente protiteles, ki vsebujejo le variabilno domeno težke verige (VHH). Zanje so se odločili zaradi znanih ugodnih lastnosti (stabilnost, visoka afiniteta in specifičnost do antigenov) in predvsem, ker obstajajo nanotelesa za mnoge različne antigene, kar bi celotnemu projektu dalo veliko fleksibilnost in možnost prilagoditve. Nanotelesa prav tako omogočajo zaznavo tako topnih kot na celično membrano vezanih antigenov<ref>Muyldermans S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. ''Annu Rev Biochem.'' (2013) 82:775–97. </ref>.

Nanotelesa bi bila zasidrana v celično membrano preko fuzijskih transmembranskih (TM) regij in razdeljena na C- in N-konec tako, da vezava antigena povzroči dimerizacijo nanoteles<ref>Tang J.C.Y., Szikra T., Kozorovitskiy Y., Teixiera M., Sabatini B.L., Roska B., Cepko C.L. A nanobody-based system using fluorescent proteins as scaffolds for cell-specific gene manipulation. ''Cell.'' 2013; 154:928–939.</ref>. Poleg TM regij tak fuzijski receptor vsebuje še proteazo iz mozaičnega virusa tobaka (ang. ''tobacco etch virus'', TEV) na intracelularni strani, ki je prav tako razdeljena na dva dela in postane aktivna šele ob dimerizaciji receptorja. Za fragmenti proteaz TEV receptor vsebuje transkripcijski aktivator tTA, na vsakem koncu katerega je zaporedje TCS (ang. ''TEV cutting site''), ki ga TEV proteaza reže. Tako se po rezanju tTA sprosti iz membrane in potuje v jedro, kjer sproži transkripcijo tarčnih genov, in sicer se veže na promotor TRE3G [2].

Tarčni geni zapisujejo za reporterski sistem. V tem projektu so še študenti odločili za reporterski sistem Lux. To je sistem za proizvajanje bioluminiscence, ki izvira in mikroorganizmov in temelji na encimu luciferazi, ki deluje na določene substrate in pri tem proizvaja svetlobo valovne dolžine 490 nm. Uporabili so tak sistem, kjer je bila raba kodonov optimizirana in ki je bil že uspešno uporabljen v človeških celicah. Glavna prednost tega spremenjenega sistema je, da ni potrebno dodajanje substratov (luciferinov), ki so sicer za človeške celice citotoksični. Sistem vsebuje dva seta genov pod dvema različnima promotorjema. Geni za LuxC, LuxD, LuxE in frp zapisujejo za encime, ki skupaj omogočajo pretvorbo določenih metabolitov, naravno prisotnih v sesalčjih celicah, v substrate za luciferazo. Ti geni so pod promotorjem iz citalomegavirusa (CMV), ki omogoča konstituitivno izražanje. Drugi set genov pa vsebuje LuxA in LuxB, ki zapoisujeta za samo luciferazo in sta pod promotrjem TRE3G. Ta pa je inducibilen in sicer omogoči izražanje ob vezavi prej omenjenega aktivatorja tTA, ki se z membrane sprosti ob vezavi antigena in dimerizaciji receptorja. Rezultat tega je, da so v celici vedno prisotni substrati za luciferazo, sama bioluminiscenca pa je samo posledica vezave pravega antigena na nanotelo<ref>Xu T., Ripp S., Sayler G.S., Close D.M. Expression of a humanized viral 2A-mediated lux operon efficiently generates autonomous bioluminescence in human cells. ''PLoS ONE.'' 2014;9:1704</ref>.

== Rezultati eksperimenta ==

Študenti so opravili dva različna poskusa. Najprej so preizkusili delovanje receptorjev, torej sposobnost nanoteles, da vežejo želen antigen in sprožijo izražanje enostavnega reporterskega proteina. Nato so preizkusili še delovanje reporterskega sistema Lux za bioluminiscenco, ki predstavlja bolj komercialno in uporabniško zanimiv pristop kot le enostaven reporterski protein.

'''Delovanje receptorjev'''

Za preizkus učinkovitosti delovanja receptorjev so uporabili GFP-vezavni protein GBP (ang. ''GFP binding protein''), dobro preučevano nanotelo, ki veže zeleni fluorescirajoči protein (GFP). Kot je opisano v načrtu poskusa, so GBP razdelili na C- in N- končni del in mu fuzijsko dodali prav tako razdeljeno proteazo TEV in transkripcijski aktivator tTA. Sestavljen biološki del, ki vsebuje vse te komponente, se imenuje pCAG-GBP-tTA in je dostopen v registru standardnih bioloških delov: [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2635001 BBa_K2635000].

V tem poskusu so za reporterski sistem uporabili le izražanje rdečega fluorescirajočega proteina mCherry. Njegovo izražanje je bilo pod promotorjem TRE3G, ki ga inducira vezava tTA. Uporabljen biološki del je dostopen v registru [http://parts.igem.org/Part:BBa_K2635000 BBa_K2635000]

Za poskus so uporabili celice 293T, ki so jih transfecirali z pCAG-GBP-tTA and pTRE3G-mCherry in jih 24 ur inkubirali z GFP-jem s koncentracijo 100 ng/mL. Celice so analizirali z fluorescenčno mikroskopijo. Ugotovili so, da je 94,7 % celic, na katere se je vezal GFP, izražale tudi mCherry in svetile rdeče. Le 5,3 % celic, na katere se je GFP uspešno vezal, ni izražalo mCherry. Na nekatere celice se ni vezal niti GFP, te pa pričakovano tudi niso izražale mCherry.

S poskusoma so ocenili tudi občutljivost in odzivni čas tega sistema . Za testiranje občutljivosti so enake celice kot prej prav tako 24 ur inkubirali z različnimi koncentracijami GFP-ja in opazovali rdečo fluorescenco kot odziv. Pričakovano se je je fluorecsenca večala z višanjem koncentracije GFP, s čimer so pokazali, da je odziv sistema odvisen od doze. Sicer pa je bilo znaten odziv opaziti že pri koncentraciji GFP 10 ng/mL, plato pa je bil dosežen pri koncentraciji 75 ng/mL. Za oceno hitrosti odziva so naredili podoben poskus, kjer je bila koncentracija GFP-ja spet 100 ng/mL in konstantna, spreminjali pa so čas inkubacije, in sicer v območju od 0 do 24 ur. Pokazali do, da do znatnega odziva pride pri 6 urah inkubacije.

'''Reporterski sistem Lux'''

Da bi pokazali delovanje reporterskega sistema Lux, so študenti celice 293T transfecirali z že prej uporabljenim pCAG-GBP-tTA in s pTRE3G-LuxAB ter pCMVLuxCDEfrp, ki zapisujeta za luciferazo pod inducibilnim promotorjem in encimi za generiranje primernih substratov pod konstituitivnim promotorjem CMV. Za merjenje bioluminiscence so uporabili IVIS Spectrum sitem.
Bioluminiscenco kot odziv sistema so merili pri celicah, ki so bile inkubirane z GFP-jem in za negativno kontrolo pri celicah, ki GFP-ju niso bile izpostavljene. Pokazali so, da pri inkubaciji z GFP pride do signifikantno večje bioluminiscence, ki jo je mogoče brez težav ločiti od šuma.

Za kontrolo so preizkusili, kako se sitem obnaša, če so vsi Lux geni pod konstituitivnim promotorjem CMV in se torej izražajo neodvisno od vezave antigena. Pri teh pogojih brez dodanega GFP ali drugih substratov je prišlo do učinkovitega proizvajanja bioluminiscence.

== Biološka varnost ==

Ker gre pri projektu za vnašanje celic v paciente, je bilo seveda potrebno dodati sistem, ki bi ob morebitnem imunskem odzivu ali uporabnikovi želji omogočal odstranitev celic iz človeka. Tak sistem so si zamislili v dveh stopnjah. Prvi del je namenjen urgentnim stanjem in omogoča hitro razgraditev receptorjev. Za ta namen želijo uporabiti sistem AID (ang. ''auxin-inducible degron''), ki omogoča razgradnjo tarčnega proteina ob dodatku avksina. Potrebna je fuzija tarčnega proteina z AK zaporedjem Aid, ob dodatku avksina pa pride do interakcije tako označenega proteina z E3 ubikvitin ligazo, sledi pa ubikvitinacija in razgradnja v proteasomu. Tak odziv se zgodi že v 9 minutah<ref>Nishimura K, Fukagawa T, Takisawa H, Kakimoto T, Kanemaki M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. ''Nat. Methods.'' 2009;6:917–U978</ref>.

Druga stopnja varnostnega sistema pa je set genov, ki vključujejo zapis za kaspazo 3 pod avksinskim promotorjem. To pa ob prisotnosti avksina privede do apoptoze vnesenih celic in dokončno odstranitev BioWatcherja [2].

== Zaključek ==

Študenti v projektu poudarjajo predvsem neinvazivnost sistema BioWatcher in možnost sledenja stanju biomarkerjev v realnem času kot njegovi veliki prednosti. Sistem bi torej stanje biomarkerjev spremljal neprestano, uporabnika pa opozoril, ko bi nivo določenega biomarkerja dosegel previsoke vrednosti.

Zelo pomembno pa je tudi, da je mogoče kot receptorsko nanotelo uporabiti nanotelesa za praktično katerikoli antigen. Z menjavo nanoteles ali reporterskih genov je torej mogoče sistem prilagoditi za zelo različne uporabe, npr. za zaznavanje toksinov, težkih kovin ali drugih snovi iz okolja. Tudi reporterske gene je mogoče zamenjati za gene, ki bi na primer služili dostavi ali celo proizvajanju zdravilnih učinkovin, kot signal za apoptozo in podobno. Prav tako pa sistem ni omejen na človeka. Kot alternativni primer uporabe bi lahko sistem vnesli v ribe, ki bi zaznavale raven onesnaženosti vod [2].

Sicer pa želijo z BioWatcherjem predvsem omogočiti ljudem sledenje lastnemu zdravju in tako izboljšati njihovo zdravje ter preprečiti prepozno zdravljenje zaradi pozne diagnoze in svoj sistem vidijo kot revolucionaren na področju diagnostike.

== Viri ==

<references/>

BioWatcher pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni

2019-01-02T12:06:33Z

Nina Mavec: /* Rezultati eksperimenta */

[http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 BioWatcher] je projekt študentske ekipe NTHU Formosa s Tajvana, ki je bil nagrajen z zlato medaljo na tekmovanju iGEM 2018.

== Uvod ==

V zadnjih letih se ljudje vse bolj zavedajo pomena čim bolj natančnega spremljanja in zavedanja svojega zdravstvenega stanja. Vedno več ljudi se odloča za zdrav življenjski slog, pri tem pa prihaja do večjega povpraševanja po raznih pametnih urah ali zapestnicah, ki pa vseeno lahko dajejo le nek omejen nabor informacij o zdravju. Študenti s tem projektom želijo ljudem ponuditi bolj natančen vpogled v lastno zdravje in napredovanje bolezni, kakršnega je trenutno mogoče doseči s krvnim testom, želijo pa se izogniti nepraktičnosti in invazivnosti takih testov. Tako želijo razviti pametno uro, BioWatcher, ki bo v realnem času zaznavala raven biomarkerjev za razne bolezni v krvi<ref>Rapisuwon S, Vietsch EE, Wellstein A. Circulating biomarkers to monitor cancer progression and treatment. ''Computational and structural biotechnology journal.'' 2016;14:211–222. </ref> in ob dosegu neke mejne vrednosti določenega biomarkerja uporabnika obvestila. Tak pristop k diagnostiki bi bil predvsem pomemben v primeru raka, pri večini katerih je ključnega pomena pravočasna diagnoza. Kot rešitev tega problema predstavljajo načrtane celice, ki bodo biomarkerje v krvi zaznavale in ob njihovi prisotnosti proizvedle bioluminiscenco. To bi zaznavala pametna ura in raven bioluminiscence s primernim programom pretvorila v konkretne vrednosti in pregledne grafe<ref>iGEM NTHU_Formosa: BioWatcher. http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 [citirano 1. 1. 2019]</ref>.

== Načrt projekta ==

Cilj projetka je bil torej načrtati celice in ki bi ob zaznani prisotnosti biomarkerja proizvedle bioluminiscenco. Kot receptorje, ki bi biomarkerje zaznavali, so se odločili uporabiti nanotelesa, fragmente protiteles, ki vsebujejo le variabilno domeno težke verige (VHH). Zanje so se odločili zaradi znanih ugodnih lastnosti (stabilnost, visoka afiniteta in specifičnost do antigenov) in predvsem, ker obstajajo nanotelesa za mnoge različne antigene, kar bi celotnemu projektu dalo veliko fleksibilnost in možnost prilagoditve. Nanotelesa prav tako omogočajo zaznavo tako topnih kot na celično membrano vezanih antigenov<ref>Muyldermans S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. ''Annu Rev Biochem.'' (2013) 82:775–97. </ref>.

Nanotelesa bi bila zasidrana v celično membrano preko fuzijskih transmembranskih (TM) regij in razdeljena na C- in N-konec tako, da vezava antigena povzroči dimerizacijo nanoteles<ref>Tang J.C.Y., Szikra T., Kozorovitskiy Y., Teixiera M., Sabatini B.L., Roska B., Cepko C.L. A nanobody-based system using fluorescent proteins as scaffolds for cell-specific gene manipulation. ''Cell.'' 2013; 154:928–939.</ref>. Poleg TM regij tak fuzijski receptor vsebuje še proteazo iz mozaičnega virusa tobaka (ang. ''tobacco etch virus'', TEV) na intracelularni strani, ki je prav tako razdeljena na dva dela in postane aktivna šele ob dimerizaciji receptorja. Za fragmenti proteaz TEV receptor vsebuje transkripcijski aktivator tTA, na vsakem koncu katerega je zaporedje TCS (ang. ''TEV cutting site''), ki ga TEV proteaza reže. Tako se po rezanju tTA sprosti iz membrane in potuje v jedro, kjer sproži transkripcijo tarčnih genov, in sicer se veže na promotor TRE3G [2].

Tarčni geni zapisujejo za reporterski sistem. V tem projektu so še študenti odločili za reporterski sistem Lux. To je sistem za proizvajanje bioluminiscence, ki izvira in mikroorganizmov in temelji na encimu luciferazi, ki deluje na določene substrate in pri tem proizvaja svetlobo valovne dolžine 490 nm. Uporabili so tak sistem, kjer je bila raba kodonov optimizirana in ki je bil že uspešno uporabljen v človeških celicah. Glavna prednost tega spremenjenega sistema je, da ni potrebno dodajanje substratov (luciferinov), ki so sicer za človeške celice citotoksični. Sistem vsebuje dva seta genov pod dvema različnima promotorjema. Geni za LuxC, LuxD, LuxE in frp zapisujejo za encime, ki skupaj omogočajo pretvorbo določenih metabolitov, naravno prisotnih v sesalčjih celicah, v substrate za luciferazo. Ti geni so pod promotorjem iz citalomegavirusa (CMV), ki omogoča konstituitivno izražanje. Drugi set genov pa vsebuje LuxA in LuxB, ki zapoisujeta za samo luciferazo in sta pod promotrjem TRE3G. Ta pa je inducibilen in sicer omogoči izražanje ob vezavi prej omenjenega aktivatorja tTA, ki se z membrane sprosti ob vezavi antigena in dimerizaciji receptorja. Rezultat tega je, da so v celici vedno prisotni substrati za luciferazo, sama bioluminiscenca pa je samo posledica vezave pravega antigena na nanotelo<ref>Xu T., Ripp S., Sayler G.S., Close D.M. Expression of a humanized viral 2A-mediated lux operon efficiently generates autonomous bioluminescence in human cells. ''PLoS ONE.'' 2014;9:1704</ref>.

== Rezultati eksperimenta ==

Študenti so opravili dva različna poskusa. Najprej so preizkusili delovanje receptorjev, torej sposobnost nanoteles, da vežejo želen antigen in sprožijo izražanje enostavnega reporterskega proteina. Nato so preizkusili še delovanje reporterskega sistema Lux za bioluminiscenco, ki predstavlja bolj komercialno in uporabniško zanimiv pristop kot le enostaven reporterski protein.

'''Delovanje receptorjev'''

Za preizkus učinkovitosti delovanja receptorjev so uporabili GFP-vezavni protein GBP (ang. ''GFP binding protein''), dobro preučevano nanotelo, ki veže zeleni fluorescirajoči protein (GFP). Kot je opisano v načrtu poskusa, so GBP razdelili na C- in N- končni del in mu fuzijsko dodali prav tako razdeljeno proteazo TEV in transkripcijski aktivator tTA. Sestavljen biološki del, ki vsebuje vse te komponente, se imenuje pCAG-GBP-tTA in je dostopen v registru standardnih bioloških delov: BBa_K2635001.

V tem poskusu so za reporterski sistem uporabili le izražanje rdečega fluorescirajočega proteina mCherry. Njegovo izražanje je bilo pod promotorjem TRE3G, ki ga inducira vezava tTA. Uporabljen biološki del je dostopen v registru BBa_K2635000.

Za poskus so uporabili celice 293T, ki so jih transfecirali z pCAG-GBP-tTA and pTRE3G-mCherry in jih 24 ur inkubirali z GFP-jem s koncentracijo 100 ng/mL. Celice so analizirali z fluorescenčno mikroskopijo. Ugotovili so, da je 94,7 % celic, na katere se je vezal GFP, izražale tudi mCherry in svetile rdeče. Le 5,3 % celic, na katere se je GFP uspešno vezal, ni izražalo mCherry. Na nekatere celice se ni vezal niti GFP, te pa pričakovano tudi niso izražale mCherry.

S poskusoma so ocenili tudi občutljivost in odzivni čas tega sistema . Za testiranje občutljivosti so enake celice kot prej prav tako 24 ur inkubirali z različnimi koncentracijami GFP-ja in opazovali rdečo fluorescenco kot odziv. Pričakovano se je je fluorecsenca večala z višanjem koncentracije GFP, s čimer so pokazali, da je odziv sistema odvisen od doze. Sicer pa je bilo znaten odziv opaziti že pri koncentraciji GFP 10 ng/mL, plato pa je bil dosežen pri koncentraciji 75 ng/mL. Za oceno hitrosti odziva so naredili podoben poskus, kjer je bila koncentracija GFP-ja spet 100 ng/mL in konstantna, spreminjali pa so čas inkubacije, in sicer v območju od 0 do 24 ur. Pokazali do, da do znatnega odziva pride pri 6 urah inkubacije.

'''Reporterski sistem Lux'''

Da bi pokazali delovanje reporterskega sistema Lux, so študenti celice 293T transfecirali z že prej uporabljenim pCAG-GBP-tTA in s pTRE3G-LuxAB ter pCMVLuxCDEfrp, ki zapisujeta za luciferazo pod inducibilnim promotorjem in encimi za generiranje primernih substratov pod konstituitivnim promotorjem CMV. Za merjenje bioluminiscence so uporabili IVIS Spectrum sitem.
Bioluminiscenco kot odziv sistema so merili pri celicah, ki so bile inkubirane z GFP-jem in za negativno kontrolo pri celicah, ki GFP-ju niso bile izpostavljene. Pokazali so, da pri inkubaciji z GFP pride do signifikantno večje bioluminiscence, ki jo je mogoče brez težav ločiti od šuma.

Za kontrolo so preizkusili, kako se sitem obnaša, če so vsi Lux geni pod konstituitivnim promotorjem CMV in se torej izražajo neodvisno od vezave antigena. Pri teh pogojih brez dodanega GFP ali drugih substratov je prišlo do učinkovitega proizvajanja bioluminiscence.

== Biološka varnost ==

Ker gre pri projektu za vnašanje celic v paciente, je bilo seveda potrebno dodati sistem, ki bi ob morebitnem imunskem odzivu ali uporabnikovi želji omogočal odstranitev celic iz človeka. Tak sistem so si zamislili v dveh stopnjah. Prvi del je namenjen urgentnim stanjem in omogoča hitro razgraditev receptorjev. Za ta namen želijo uporabiti sistem AID (ang. ''auxin-inducible degron''), ki omogoča razgradnjo tarčnega proteina ob dodatku avksina. Potrebna je fuzija tarčnega proteina z AK zaporedjem Aid, ob dodatku avksina pa pride do interakcije tako označenega proteina z E3 ubikvitin ligazo, sledi pa ubikvitinacija in razgradnja v proteasomu. Tak odziv se zgodi že v 9 minutah<ref>Nishimura K, Fukagawa T, Takisawa H, Kakimoto T, Kanemaki M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. ''Nat. Methods.'' 2009;6:917–U978</ref>.

Druga stopnja varnostnega sistema pa je set genov, ki vključujejo zapis za kaspazo 3 pod avksinskim promotorjem. To pa ob prisotnosti avksina privede do apoptoze vnesenih celic in dokončno odstranitev BioWatcherja [2].

== Zaključek ==

Študenti v projektu poudarjajo predvsem neinvazivnost sistema BioWatcher in možnost sledenja stanju biomarkerjev v realnem času kot njegovi veliki prednosti. Sistem bi torej stanje biomarkerjev spremljal neprestano, uporabnika pa opozoril, ko bi nivo določenega biomarkerja dosegel previsoke vrednosti.

Zelo pomembno pa je tudi, da je mogoče kot receptorsko nanotelo uporabiti nanotelesa za praktično katerikoli antigen. Z menjavo nanoteles ali reporterskih genov je torej mogoče sistem prilagoditi za zelo različne uporabe, npr. za zaznavanje toksinov, težkih kovin ali drugih snovi iz okolja. Tudi reporterske gene je mogoče zamenjati za gene, ki bi na primer služili dostavi ali celo proizvajanju zdravilnih učinkovin, kot signal za apoptozo in podobno. Prav tako pa sistem ni omejen na človeka. Kot alternativni primer uporabe bi lahko sistem vnesli v ribe, ki bi zaznavale raven onesnaženosti vod [2].

Sicer pa želijo z BioWatcherjem predvsem omogočiti ljudem sledenje lastnemu zdravju in tako izboljšati njihovo zdravje ter preprečiti prepozno zdravljenje zaradi pozne diagnoze in svoj sistem vidijo kot revolucionaren na področju diagnostike.

== Viri ==

<references/>

BioWatcher pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni

2019-01-02T12:05:30Z

Nina Mavec:

[http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 BioWatcher] je projekt študentske ekipe NTHU Formosa s Tajvana, ki je bil nagrajen z zlato medaljo na tekmovanju iGEM 2018.

== Uvod ==

V zadnjih letih se ljudje vse bolj zavedajo pomena čim bolj natančnega spremljanja in zavedanja svojega zdravstvenega stanja. Vedno več ljudi se odloča za zdrav življenjski slog, pri tem pa prihaja do večjega povpraševanja po raznih pametnih urah ali zapestnicah, ki pa vseeno lahko dajejo le nek omejen nabor informacij o zdravju. Študenti s tem projektom želijo ljudem ponuditi bolj natančen vpogled v lastno zdravje in napredovanje bolezni, kakršnega je trenutno mogoče doseči s krvnim testom, želijo pa se izogniti nepraktičnosti in invazivnosti takih testov. Tako želijo razviti pametno uro, BioWatcher, ki bo v realnem času zaznavala raven biomarkerjev za razne bolezni v krvi<ref>Rapisuwon S, Vietsch EE, Wellstein A. Circulating biomarkers to monitor cancer progression and treatment. ''Computational and structural biotechnology journal.'' 2016;14:211–222. </ref> in ob dosegu neke mejne vrednosti določenega biomarkerja uporabnika obvestila. Tak pristop k diagnostiki bi bil predvsem pomemben v primeru raka, pri večini katerih je ključnega pomena pravočasna diagnoza. Kot rešitev tega problema predstavljajo načrtane celice, ki bodo biomarkerje v krvi zaznavale in ob njihovi prisotnosti proizvedle bioluminiscenco. To bi zaznavala pametna ura in raven bioluminiscence s primernim programom pretvorila v konkretne vrednosti in pregledne grafe<ref>iGEM NTHU_Formosa: BioWatcher. http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 [citirano 1. 1. 2019]</ref>.

== Načrt projekta ==

Cilj projetka je bil torej načrtati celice in ki bi ob zaznani prisotnosti biomarkerja proizvedle bioluminiscenco. Kot receptorje, ki bi biomarkerje zaznavali, so se odločili uporabiti nanotelesa, fragmente protiteles, ki vsebujejo le variabilno domeno težke verige (VHH). Zanje so se odločili zaradi znanih ugodnih lastnosti (stabilnost, visoka afiniteta in specifičnost do antigenov) in predvsem, ker obstajajo nanotelesa za mnoge različne antigene, kar bi celotnemu projektu dalo veliko fleksibilnost in možnost prilagoditve. Nanotelesa prav tako omogočajo zaznavo tako topnih kot na celično membrano vezanih antigenov<ref>Muyldermans S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. ''Annu Rev Biochem.'' (2013) 82:775–97. </ref>.

Nanotelesa bi bila zasidrana v celično membrano preko fuzijskih transmembranskih (TM) regij in razdeljena na C- in N-konec tako, da vezava antigena povzroči dimerizacijo nanoteles<ref>Tang J.C.Y., Szikra T., Kozorovitskiy Y., Teixiera M., Sabatini B.L., Roska B., Cepko C.L. A nanobody-based system using fluorescent proteins as scaffolds for cell-specific gene manipulation. ''Cell.'' 2013; 154:928–939.</ref>. Poleg TM regij tak fuzijski receptor vsebuje še proteazo iz mozaičnega virusa tobaka (ang. ''tobacco etch virus'', TEV) na intracelularni strani, ki je prav tako razdeljena na dva dela in postane aktivna šele ob dimerizaciji receptorja. Za fragmenti proteaz TEV receptor vsebuje transkripcijski aktivator tTA, na vsakem koncu katerega je zaporedje TCS (ang. ''TEV cutting site''), ki ga TEV proteaza reže. Tako se po rezanju tTA sprosti iz membrane in potuje v jedro, kjer sproži transkripcijo tarčnih genov, in sicer se veže na promotor TRE3G [2].

Tarčni geni zapisujejo za reporterski sistem. V tem projektu so še študenti odločili za reporterski sistem Lux. To je sistem za proizvajanje bioluminiscence, ki izvira in mikroorganizmov in temelji na encimu luciferazi, ki deluje na določene substrate in pri tem proizvaja svetlobo valovne dolžine 490 nm. Uporabili so tak sistem, kjer je bila raba kodonov optimizirana in ki je bil že uspešno uporabljen v človeških celicah. Glavna prednost tega spremenjenega sistema je, da ni potrebno dodajanje substratov (luciferinov), ki so sicer za človeške celice citotoksični. Sistem vsebuje dva seta genov pod dvema različnima promotorjema. Geni za LuxC, LuxD, LuxE in frp zapisujejo za encime, ki skupaj omogočajo pretvorbo določenih metabolitov, naravno prisotnih v sesalčjih celicah, v substrate za luciferazo. Ti geni so pod promotorjem iz citalomegavirusa (CMV), ki omogoča konstituitivno izražanje. Drugi set genov pa vsebuje LuxA in LuxB, ki zapoisujeta za samo luciferazo in sta pod promotrjem TRE3G. Ta pa je inducibilen in sicer omogoči izražanje ob vezavi prej omenjenega aktivatorja tTA, ki se z membrane sprosti ob vezavi antigena in dimerizaciji receptorja. Rezultat tega je, da so v celici vedno prisotni substrati za luciferazo, sama bioluminiscenca pa je samo posledica vezave pravega antigena na nanotelo<ref>Xu T., Ripp S., Sayler G.S., Close D.M. Expression of a humanized viral 2A-mediated lux operon efficiently generates autonomous bioluminescence in human cells. ''PLoS ONE.'' 2014;9:1704</ref>.

== Rezultati eksperimenta ==

Študenti so opravili dva različna poskusa. Najprej so preizkusili delovanje receptorjev, torej sposobnost nanoteles, da vežejo želen antigen in sprožijo izražanje enostavnega reporterskega proteina. Nato so preizkusili še delovanje reporterskega sistema Lux za bioluminiscenco, ki predstavlja bolj komercialno in uporabniško zanimiv pristop kot le enostaven reporterski protein.

'''Delovanje receptorjev'''

Za preizkus učinkovitosti delovanja receptorjev so uporabili GFP-vezavni protein GBP (ang. [[GFP binding protein]]), dobro preučevano nanotelo, ki veže zeleni fluorescirajoči protein (GFP). Kot je opisano v načrtu poskusa, so GBP razdelili na C- in N- končni del in mu fuzijsko dodali prav tako razdeljeno proteazo TEV in transkripcijski aktivator tTA. Sestavljen biološki del, ki vsebuje vse te komponente, se imenuje pCAG-GBP-tTA in je dostopen v registru standardnih bioloških delov: BBa_K2635001.

V tem poskusu so za reporterski sistem uporabili le izražanje rdečega fluorescirajočega proteina mCherry. Njegovo izražanje je bilo pod promotorjem TRE3G, ki ga inducira vezava tTA. Uporabljen biološki del je dostopen v registru BBa_K2635000.

Za poskus so uporabili celice 293T, ki so jih transfecirali z pCAG-GBP-tTA and pTRE3G-mCherry in jih 24 ur inkubirali z GFP-jem s koncentracijo 100 ng/mL. Celice so analizirali z fluorescenčno mikroskopijo. Ugotovili so, da je 94,7 % celic, na katere se je vezal GFP, izražale tudi mCherry in svetile rdeče. Le 5,3 % celic, na katere se je GFP uspešno vezal, ni izražalo mCherry. Na nekatere celice se ni vezal niti GFP, te pa pričakovano tudi niso izražale mCherry.

S poskusoma so ocenili tudi občutljivost in odzivni čas tega sistema . Za testiranje občutljivosti so enake celice kot prej prav tako 24 ur inkubirali z različnimi koncentracijami GFP-ja in opazovali rdečo fluorescenco kot odziv. Pričakovano se je je fluorecsenca večala z višanjem koncentracije GFP, s čimer so pokazali, da je odziv sistema odvisen od doze. Sicer pa je bilo znaten odziv opaziti že pri koncentraciji GFP 10 ng/mL, plato pa je bil dosežen pri koncentraciji 75 ng/mL. Za oceno hitrosti odziva so naredili podoben poskus, kjer je bila koncentracija GFP-ja spet 100 ng/mL in konstantna, spreminjali pa so čas inkubacije, in sicer v območju od 0 do 24 ur. Pokazali do, da do znatnega odziva pride pri 6 urah inkubacije.

'''Reporterski sistem Lux'''

Da bi pokazali delovanje reporterskega sistema Lux, so študenti celice 293T transfecirali z že prej uporabljenim pCAG-GBP-tTA in s pTRE3G-LuxAB ter pCMVLuxCDEfrp, ki zapisujeta za luciferazo pod inducibilnim promotorjem in encimi za generiranje primernih substratov pod konstituitivnim promotorjem CMV. Za merjenje bioluminiscence so uporabili IVIS Spectrum sitem.
Bioluminiscenco kot odziv sistema so merili pri celicah, ki so bile inkubirane z GFP-jem in za negativno kontrolo pri celicah, ki GFP-ju niso bile izpostavljene. Pokazali so, da pri inkubaciji z GFP pride do signifikantno večje bioluminiscence, ki jo je mogoče brez težav ločiti od šuma.

Za kontrolo so preizkusili, kako se sitem obnaša, če so vsi Lux geni pod konstituitivnim promotorjem CMV in se torej izražajo neodvisno od vezave antigena. Pri teh pogojih brez dodanega GFP ali drugih substratov je prišlo do učinkovitega proizvajanja bioluminiscence.

== Biološka varnost ==

Ker gre pri projektu za vnašanje celic v paciente, je bilo seveda potrebno dodati sistem, ki bi ob morebitnem imunskem odzivu ali uporabnikovi želji omogočal odstranitev celic iz človeka. Tak sistem so si zamislili v dveh stopnjah. Prvi del je namenjen urgentnim stanjem in omogoča hitro razgraditev receptorjev. Za ta namen želijo uporabiti sistem AID (ang. ''auxin-inducible degron''), ki omogoča razgradnjo tarčnega proteina ob dodatku avksina. Potrebna je fuzija tarčnega proteina z AK zaporedjem Aid, ob dodatku avksina pa pride do interakcije tako označenega proteina z E3 ubikvitin ligazo, sledi pa ubikvitinacija in razgradnja v proteasomu. Tak odziv se zgodi že v 9 minutah<ref>Nishimura K, Fukagawa T, Takisawa H, Kakimoto T, Kanemaki M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. ''Nat. Methods.'' 2009;6:917–U978</ref>.

Druga stopnja varnostnega sistema pa je set genov, ki vključujejo zapis za kaspazo 3 pod avksinskim promotorjem. To pa ob prisotnosti avksina privede do apoptoze vnesenih celic in dokončno odstranitev BioWatcherja [2].

== Zaključek ==

Študenti v projektu poudarjajo predvsem neinvazivnost sistema BioWatcher in možnost sledenja stanju biomarkerjev v realnem času kot njegovi veliki prednosti. Sistem bi torej stanje biomarkerjev spremljal neprestano, uporabnika pa opozoril, ko bi nivo določenega biomarkerja dosegel previsoke vrednosti.

Zelo pomembno pa je tudi, da je mogoče kot receptorsko nanotelo uporabiti nanotelesa za praktično katerikoli antigen. Z menjavo nanoteles ali reporterskih genov je torej mogoče sistem prilagoditi za zelo različne uporabe, npr. za zaznavanje toksinov, težkih kovin ali drugih snovi iz okolja. Tudi reporterske gene je mogoče zamenjati za gene, ki bi na primer služili dostavi ali celo proizvajanju zdravilnih učinkovin, kot signal za apoptozo in podobno. Prav tako pa sistem ni omejen na človeka. Kot alternativni primer uporabe bi lahko sistem vnesli v ribe, ki bi zaznavale raven onesnaženosti vod [2].

Sicer pa želijo z BioWatcherjem predvsem omogočiti ljudem sledenje lastnemu zdravju in tako izboljšati njihovo zdravje ter preprečiti prepozno zdravljenje zaradi pozne diagnoze in svoj sistem vidijo kot revolucionaren na področju diagnostike.

== Viri ==

<references/>

BioWatcher pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni

2019-01-02T11:12:40Z

Nina Mavec: /* Rezultati eksperimenta */

[http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 BioWatcher] je projekt študentske ekipe NTHU Formosa s Tajvana, ki je bil nagrajen z zlato medaljo na tekmovanju iGEM 2018.

== Uvod ==

V zadnjih letih se ljudje vse bolj zavedajo pomena čim bolj natančnega spremljanja in zavedanja svojega zdravstvenega stanja. Vedno več ljudi se odloča za zdrav življenjski slog, pri tem pa prihaja do večjega povpraševanja po raznih pametnih urah ali zapestnicah, ki pa vseeno lahko dajejo le nek omejen nabor informacij o zdravju. Študenti s tem projektom želijo ljudem ponuditi bolj natančen vpogled v lastno zdravje in napredovanje bolezni, kakršnega je trenutno mogoče doseči s krvnim testom, želijo pa se izogniti nepraktičnosti in invazivnosti takih testov. Tako želijo razviti pametno uro, BioWatcher, ki bo v realnem času zaznavala raven biomarkerjev za razne bolezni v krvi<ref>Rapisuwon S, Vietsch EE, Wellstein A. Circulating biomarkers to monitor cancer progression and treatment. ''Computational and structural biotechnology journal.'' 2016;14:211–222. </ref> in ob dosegu neke mejne vrednosti določenega biomarkerja uporabnika obvestila. Tak pristop k diagnostiki bi bil predvsem pomemben v primeru raka, pri večini katerih je ključnega pomena pravočasna diagnoza. Kot rešitev tega problema predstavljajo načrtane celice, ki bodo biomarkerje v krvi zaznavale in ob njihovi prisotnosti proizvedle bioluminiscenco. To bi zaznavala pametna ura in raven bioluminiscence s primernim programom pretvorila v konkretne vrednosti in pregledne grafe<ref>iGEM NTHU_Formosa: BioWatcher. http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 [citirano 1. 1. 2019]</ref>.

== Načrt projekta ==

Cilj projetka je bil torej načrtati celice in ki bi ob zaznani prisotnosti biomarkerja proizvedle bioluminiscenco. Kot receptorje, ki bi biomarkerje zaznavali, so se odločili uporabiti nanotelesa, fragmente protiteles, ki vsebujejo le variabilno domeno težke verige (VHH). Zanje so se odločili zaradi znanih ugodnih lastnosti (stabilnost, visoka afiniteta in specifičnost do antigenov) in predvsem, ker obstajajo nanotelesa za mnoge različne antigene, kar bi celotnemu projektu dalo veliko fleksibilnost in možnost prilagoditve. Nanotelesa prav tako omogočajo zaznavo tako topnih kot na celično membrano vezanih antigenov<ref>Muyldermans S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. ''Annu Rev Biochem.'' (2013) 82:775–97. </ref>.

Nanotelesa bi bila zasidrana v celično membrano preko fuzijskih transmembranskih (TM) regij in razdeljena na C- in N-konec tako, da vezava antigena povzroči dimerizacijo nanoteles<ref>Tang J.C.Y., Szikra T., Kozorovitskiy Y., Teixiera M., Sabatini B.L., Roska B., Cepko C.L. A nanobody-based system using fluorescent proteins as scaffolds for cell-specific gene manipulation. ''Cell.'' 2013; 154:928–939.</ref>. Poleg TM regij tak fuzijski receptor vsebuje še proteazo iz mozaičnega virusa tobaka (ang. tobacco etch virus, TEV) na intracelularni strani, ki je prav tako razdeljena na dva dela in postane aktivna šele ob dimerizaciji receptorja. Za fragmenti proteaz TEV receptor vsebuje transkripcijski aktivator tTA, na vsakem koncu katerega je zaporedje TCS (ang. TEV cutting site), ki ga TEV proteaza reže. Tako se po rezanju tTA sprosti iz membrane in potuje v jedro, kjer sproži transkripcijo tarčnih genov, in sicer se veže na promotor TRE3G [2].

Tarčni geni zapisujejo za reporterski sistem. V tem projektu so še študenti odločili za reporterski sistem Lux. To je sistem za proizvajanje bioluminiscence, ki izvira in mikroorganizmov in temelji na encimu luciferazi, ki deluje na določene substrate in pri tem proizvaja svetlobo valovne dolžine 490 nm. Uporabili so tak sistem, kjer je bila raba kodonov optimizirana in ki je bil že uspešno uporabljen v človeških celicah. Glavna prednost tega spremenjenega sistema je, da ni potrebno dodajanje substratov (luciferinov), ki so sicer za človeške celice citotoksični. Sistem vsebuje dva seta genov pod dvema različnima promotorjema. Geni za LuxC, LuxD, LuxE in frp zapisujejo za encime, ki skupaj omogočajo pretvorbo določenih metabolitov, naravno prisotnih v sesalčjih celicah, v substrate za luciferazo. Ti geni so pod promotorjem iz citalomegavirusa (CMV), ki omogoča konstituitivno izražanje. Drugi set genov pa vsebuje LuxA in LuxB, ki zapoisujeta za samo luciferazo in sta pod promotrjem TRE3G. Ta pa je inducibilen in sicer omogoči izražanje ob vezavi prej omenjenega aktivatorja tTA, ki se z membrane sprosti ob vezavi antigena in dimerizaciji receptorja. Rezultat tega je, da so v celici vedno prisotni substrati za luciferazo, sama bioluminiscenca pa je samo posledica vezave pravega antigena na nanotelo<ref>Xu T., Ripp S., Sayler G.S., Close D.M. Expression of a humanized viral 2A-mediated lux operon efficiently generates autonomous bioluminescence in human cells. ''PLoS ONE.'' 2014;9:1704</ref>.

== Rezultati eksperimenta ==

Študenti so opravili dva različna poskusa. Najprej so preizkusili delovanje receptorjev, torej sposobnost nanoteles, da vežejo želen antigen in sprožijo izražanje enostavnega reporterskega proteina. Nato so preizkusili še delovanje reporterskega sistema Lux za bioluminiscenco, ki predstavlja bolj komercialno in uporabniško zanimiv pristop kot le enostaven reporterski protein.

'''Delovanje receptorjev'''

Za preizkus učinkovitosti delovanja receptorjev so uporabili GFP-vezavni protein GBP (ang. GFP binding protein), dobro preučevano nanotelo, ki veže zeleni fluorescirajoči protein (GFP). Kot je opisano v načrtu poskusa, so GBP razdelili na C- in N- končni del in mu fuzijsko dodali prav tako razdeljeno proteazo TEV in transkripcijski aktivator tTA. Sestavljen biološki del, ki vsebuje vse te komponente, se imenuje pCAG-GBP-tTA in je dostopen v registru standardnih bioloških delov: BBa_K2635001.

V tem poskusu so za reporterski sistem uporabili le izražanje rdečega fluorescirajočega proteina mCherry. Njegovo izražanje je bilo pod promotorjem TRE3G, ki ga inducira vezava tTA. Uporabljen biološki del je dostopen v registru BBa_K2635000.

Za poskus so uporabili celice 293T, ki so jih transfecirali z pCAG-GBP-tTA and pTRE3G-mCherry in jih 24 ur inkubirali z GFP-jem s koncentracijo 100 ng/mL. Celice so analizirali z fluorescenčno mikroskopijo. Ugotovili so, da je 94,7 % celic, na katere se je vezal GFP, izražale tudi mCherry in svetile rdeče. Le 5,3 % celic, na katere se je GFP uspešno vezal, ni izražalo mCherry. Na nekatere celice se ni vezal niti GFP, te pa pričakovano tudi niso izražale mCherry.

S poskusoma so ocenili tudi občutljivost in odzivni čas tega sistema . Za testiranje občutljivosti so enake celice kot prej prav tako 24 ur inkubirali z različnimi koncentracijami GFP-ja in opazovali rdečo fluorescenco kot odziv. Pričakovano se je je fluorecsenca večala z višanjem koncentracije GFP, s čimer so pokazali, da je odziv sistema odvisen od doze. Sicer pa je bilo znaten odziv opaziti že pri koncentraciji GFP 10 ng/mL, plato pa je bil dosežen pri koncentraciji 75 ng/mL. Za oceno hitrosti odziva so naredili podoben poskus, kjer je bila koncentracija GFP-ja spet 100 ng/mL in konstantna, spreminjali pa so čas inkubacije, in sicer v območju od 0 do 24 ur. Pokazali do, da do znatnega odziva pride pri 6 urah inkubacije.

'''Reporterski sistem Lux'''

Da bi pokazali delovanje reporterskega sistema Lux, so študenti celice 293T transfecirali z že prej uporabljenim pCAG-GBP-tTA in s pTRE3G-LuxAB ter pCMVLuxCDEfrp, ki zapisujeta za luciferazo pod inducibilnim promotorjem in encimi za generiranje primernih substratov pod konstituitivnim promotorjem CMV. Za merjenje bioluminiscence so uporabili IVIS Spectrum sitem.
Bioluminiscenco kot odziv sistema so merili pri celicah, ki so bile inkubirane z GFP-jem in za negativno kontrolo pri celicah, ki GFP-ju niso bile izpostavljene. Pokazali so, da pri inkubaciji z GFP pride do signifikantno večje bioluminiscence, ki jo je mogoče brez težav ločiti od šuma.

Za kontrolo so preizkusili, kako se sitem obnaša, če so vsi Lux geni pod konstituitivnim promotorjem CMV in se torej izražajo neodvisno od vezave antigena. Pri teh pogojih brez dodanega GFP ali drugih substratov je prišlo do učinkovitega proizvajanja bioluminiscence.

== Biološka varnost ==

Ker gre pri projektu za vnašanje celic v paciente, je bilo seveda potrebno dodati sistem, ki bi ob morebitnem imunskem odzivu ali uporabnikovi želji omogočal odstranitev celic iz človeka. Tak sistem so si zamislili v dveh stopnjah. Prvi del je namenjen urgentnim stanjem in omogoča hitro razgraditev receptorjev. Za ta namen želijo uporabiti sistem AID (ang. auxin-inducible degron), ki omogoča razgradnjo tarčnega proteina ob dodatku avksina. Potrebna je fuzija tarčnega proteina z AK zaporedjem Aid, ob dodatku avksina pa pride do interakcije tako označenega proteina z E3 ubikvitin ligazo, sledi pa ubikvitinacija in razgradnja v proteasomu. Tak odziv se zgodi že v 9 minutah<ref>Nishimura K, Fukagawa T, Takisawa H, Kakimoto T, Kanemaki M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. ''Nat. Methods.'' 2009;6:917–U978</ref>.

Druga stopnja varnostnega sistema pa je set genov, ki vključujejo zapis za kaspazo 3 pod avksinskim promotorjem. To pa ob prisotnosti avksina privede do apoptoze vnesenih celic in dokončno odstranitev BioWatcherja [2].

== Zaključek ==

Študenti v projektu poudarjajo predvsem neinvazivnost sistema BioWatcher in možnost sledenja stanju biomarkerjev v realnem času kot njegovi veliki prednosti. Sistem bi torej stanje biomarkerjev spremljal neprestano, uporabnika pa opozoril, ko bi nivo določenega biomarkerja dosegel previsoke vrednosti.

Zelo pomembno pa je tudi, da je mogoče kot receptorsko nanotelo uporabiti nanotelesa za praktično katerikoli antigen. Z menjavo nanoteles ali reporterskih genov je torej mogoče sistem prilagoditi za zelo različne uporabe, npr. za zaznavanje toksinov, težkih kovin ali drugih snovi iz okolja. Tudi reporterske gene je mogoče zamenjati za gene, ki bi na primer služili dostavi ali celo proizvajanju zdravilnih učinkovin, kot signal za apoptozo in podobno. Prav tako pa sistem ni omejen na človeka. Kot alternativni primer uporabe bi lahko sistem vnesli v ribe, ki bi zaznavale raven onesnaženosti vod [2].

Sicer pa želijo z BioWatcherjem predvsem omogočiti ljudem sledenje lastnemu zdravju in tako izboljšati njihovo zdravje ter preprečiti prepozno zdravljenje zaradi pozne diagnoze in svoj sistem vidijo kot revolucionaren na področju diagnostike.

== Viri ==

<references/>

BioWatcher pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni

2019-01-02T11:12:27Z

Nina Mavec: /* Načrt projekta */

[http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 BioWatcher] je projekt študentske ekipe NTHU Formosa s Tajvana, ki je bil nagrajen z zlato medaljo na tekmovanju iGEM 2018.

== Uvod ==

V zadnjih letih se ljudje vse bolj zavedajo pomena čim bolj natančnega spremljanja in zavedanja svojega zdravstvenega stanja. Vedno več ljudi se odloča za zdrav življenjski slog, pri tem pa prihaja do večjega povpraševanja po raznih pametnih urah ali zapestnicah, ki pa vseeno lahko dajejo le nek omejen nabor informacij o zdravju. Študenti s tem projektom želijo ljudem ponuditi bolj natančen vpogled v lastno zdravje in napredovanje bolezni, kakršnega je trenutno mogoče doseči s krvnim testom, želijo pa se izogniti nepraktičnosti in invazivnosti takih testov. Tako želijo razviti pametno uro, BioWatcher, ki bo v realnem času zaznavala raven biomarkerjev za razne bolezni v krvi<ref>Rapisuwon S, Vietsch EE, Wellstein A. Circulating biomarkers to monitor cancer progression and treatment. ''Computational and structural biotechnology journal.'' 2016;14:211–222. </ref> in ob dosegu neke mejne vrednosti določenega biomarkerja uporabnika obvestila. Tak pristop k diagnostiki bi bil predvsem pomemben v primeru raka, pri večini katerih je ključnega pomena pravočasna diagnoza. Kot rešitev tega problema predstavljajo načrtane celice, ki bodo biomarkerje v krvi zaznavale in ob njihovi prisotnosti proizvedle bioluminiscenco. To bi zaznavala pametna ura in raven bioluminiscence s primernim programom pretvorila v konkretne vrednosti in pregledne grafe<ref>iGEM NTHU_Formosa: BioWatcher. http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 [citirano 1. 1. 2019]</ref>.

== Načrt projekta ==

Cilj projetka je bil torej načrtati celice in ki bi ob zaznani prisotnosti biomarkerja proizvedle bioluminiscenco. Kot receptorje, ki bi biomarkerje zaznavali, so se odločili uporabiti nanotelesa, fragmente protiteles, ki vsebujejo le variabilno domeno težke verige (VHH). Zanje so se odločili zaradi znanih ugodnih lastnosti (stabilnost, visoka afiniteta in specifičnost do antigenov) in predvsem, ker obstajajo nanotelesa za mnoge različne antigene, kar bi celotnemu projektu dalo veliko fleksibilnost in možnost prilagoditve. Nanotelesa prav tako omogočajo zaznavo tako topnih kot na celično membrano vezanih antigenov<ref>Muyldermans S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. ''Annu Rev Biochem.'' (2013) 82:775–97. </ref>.

Nanotelesa bi bila zasidrana v celično membrano preko fuzijskih transmembranskih (TM) regij in razdeljena na C- in N-konec tako, da vezava antigena povzroči dimerizacijo nanoteles<ref>Tang J.C.Y., Szikra T., Kozorovitskiy Y., Teixiera M., Sabatini B.L., Roska B., Cepko C.L. A nanobody-based system using fluorescent proteins as scaffolds for cell-specific gene manipulation. ''Cell.'' 2013; 154:928–939.</ref>. Poleg TM regij tak fuzijski receptor vsebuje še proteazo iz mozaičnega virusa tobaka (ang. tobacco etch virus, TEV) na intracelularni strani, ki je prav tako razdeljena na dva dela in postane aktivna šele ob dimerizaciji receptorja. Za fragmenti proteaz TEV receptor vsebuje transkripcijski aktivator tTA, na vsakem koncu katerega je zaporedje TCS (ang. TEV cutting site), ki ga TEV proteaza reže. Tako se po rezanju tTA sprosti iz membrane in potuje v jedro, kjer sproži transkripcijo tarčnih genov, in sicer se veže na promotor TRE3G [2].

Tarčni geni zapisujejo za reporterski sistem. V tem projektu so še študenti odločili za reporterski sistem Lux. To je sistem za proizvajanje bioluminiscence, ki izvira in mikroorganizmov in temelji na encimu luciferazi, ki deluje na določene substrate in pri tem proizvaja svetlobo valovne dolžine 490 nm. Uporabili so tak sistem, kjer je bila raba kodonov optimizirana in ki je bil že uspešno uporabljen v človeških celicah. Glavna prednost tega spremenjenega sistema je, da ni potrebno dodajanje substratov (luciferinov), ki so sicer za človeške celice citotoksični. Sistem vsebuje dva seta genov pod dvema različnima promotorjema. Geni za LuxC, LuxD, LuxE in frp zapisujejo za encime, ki skupaj omogočajo pretvorbo določenih metabolitov, naravno prisotnih v sesalčjih celicah, v substrate za luciferazo. Ti geni so pod promotorjem iz citalomegavirusa (CMV), ki omogoča konstituitivno izražanje. Drugi set genov pa vsebuje LuxA in LuxB, ki zapoisujeta za samo luciferazo in sta pod promotrjem TRE3G. Ta pa je inducibilen in sicer omogoči izražanje ob vezavi prej omenjenega aktivatorja tTA, ki se z membrane sprosti ob vezavi antigena in dimerizaciji receptorja. Rezultat tega je, da so v celici vedno prisotni substrati za luciferazo, sama bioluminiscenca pa je samo posledica vezave pravega antigena na nanotelo<ref>Xu T., Ripp S., Sayler G.S., Close D.M. Expression of a humanized viral 2A-mediated lux operon efficiently generates autonomous bioluminescence in human cells. ''PLoS ONE.'' 2014;9:1704</ref>.

== Rezultati eksperimenta ==

Študenti so opravili dva različna poskusa. Najprej so preizkusili delovanje receptorjev, torej sposobnost nanoteles, da vežejo želen antigen in sprožijo izražanje enostavnega reporterskega proteina. Nato so preizkusili še delovanje reporterskega sistema Lux za bioluminiscenco, ki predstavlja bolj komercialno in uporabniško zanimiv pristop kot le enostaven reporterski protein.

'''Delovanje receptorjev'''

Za preizkus učinkovitosti delovanja receptorjev so uporabili GFP-vezavni protein GBP (ang. GFP binding protein), dobro preučevano nanotelo, ki veže zeleni fluorescirajoči protein (GFP). Kot je opisano v načrtu poskusa, so GBP razdelili na C- in N- končni del in mu fuzijsko dodali prav tako razdeljeno proteazo TEV in transkripcijski aktivator tTA. Sestavljen biološki del, ki vsebuje vse te komponente, se imenuje pCAG-GBP-tTA in je dostopen v registru standardnih bioloških delov: BBa_K2635001.

V tem poskusu so za reporterski sistem uporabili le izražanje rdečega fluorescirajočega proteina mCherry. Njegovo izražanje je bilo pod promotorjem TRE3G, ki ga inducira vezava tTA. Uporabljen biološki del je dostopne v registru BBa_K2635000.

Za poskus so uporabili celice 293T, ki so jih transfecirali z pCAG-GBP-tTA and pTRE3G-mCherry in jih 24 ur inkubirali z GFP-jem s koncentracijo 100 ng/mL. Celice so analizirali z fluorescenčno mikroskopijo. Ugotovili so, da je 94,7 % celic, na katere se je vezal GFP, izražale tudi mCherry in svetile rdeče. Le 5,3 % celic, na katere se je GFP uspešno vezal, ni izražalo mCherry. Na nekatere celice se ni vezal niti GFP, te pa pričakovano tudi niso izražale mCherry.

S poskusoma so ocenili tudi občutljivost in odzivni čas tega sistema . Za testiranje občutljivosti so enake celice kot prej prav tako 24 ur inkubirali z različnimi koncentracijami GFP-ja in opazovali rdečo fluorescenco kot odziv. Pričakovano se je je fluorecsenca večala z višanjem koncentracije GFP, s čimer so pokazali, da je odziv sistema odvisen od doze. Sicer pa je bilo znaten odziv opaziti že pri koncentraciji GFP 10 ng/mL, plato pa je bil dosežen pri koncentraciji 75 ng/mL. Za oceno hitrosti odziva so naredili podoben poskus, kjer je bila koncentracija GFP-ja spet 100 ng/mL in konstantna, spreminjali pa so čas inkubacije, in sicer v območju od 0 do 24 ur. Pokazali do, da do znatnega odziva pride pri 6 urah inkubacije.

'''Reporterski sistem Lux'''

Da bi pokazali delovanje reporterskega sistema Lux, so študenti celice 293T transfecirali z že prej uporabljenim pCAG-GBP-tTA in s pTRE3G-LuxAB ter pCMVLuxCDEfrp, ki zapisujeta za luciferazo pod inducibilnim promotorjem in encimi za generiranje primernih substratov pod konstituitivnim promotorjem CMV. Za merjenje bioluminiscence so uporabili IVIS Spectrum sitem.
Bioluminiscenco kot odziv sistema so merili pri celicah, ki so bile inkubirane z GFP-jem in za negativno kontrolo pri celicah, ki GFP-ju niso bile izpostavljene. Pokazali so, da pri inkubaciji z GFP pride do signifikantno večje bioluminiscence, ki jo je mogoče brez težav ločiti od šuma.

Za kontrolo so preizkusili, kako se sitem obnaša, če so vsi Lux geni pod konstituitivnim promotorjem CMV in se torej izražajo neodvisno od vezave antigena. Pri teh pogojih brez dodanega GFP ali drugih substratov je prišlo do učinkovitega proizvajanja bioluminiscence.

== Biološka varnost ==

Ker gre pri projektu za vnašanje celic v paciente, je bilo seveda potrebno dodati sistem, ki bi ob morebitnem imunskem odzivu ali uporabnikovi želji omogočal odstranitev celic iz človeka. Tak sistem so si zamislili v dveh stopnjah. Prvi del je namenjen urgentnim stanjem in omogoča hitro razgraditev receptorjev. Za ta namen želijo uporabiti sistem AID (ang. auxin-inducible degron), ki omogoča razgradnjo tarčnega proteina ob dodatku avksina. Potrebna je fuzija tarčnega proteina z AK zaporedjem Aid, ob dodatku avksina pa pride do interakcije tako označenega proteina z E3 ubikvitin ligazo, sledi pa ubikvitinacija in razgradnja v proteasomu. Tak odziv se zgodi že v 9 minutah<ref>Nishimura K, Fukagawa T, Takisawa H, Kakimoto T, Kanemaki M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. ''Nat. Methods.'' 2009;6:917–U978</ref>.

Druga stopnja varnostnega sistema pa je set genov, ki vključujejo zapis za kaspazo 3 pod avksinskim promotorjem. To pa ob prisotnosti avksina privede do apoptoze vnesenih celic in dokončno odstranitev BioWatcherja [2].

== Zaključek ==

Študenti v projektu poudarjajo predvsem neinvazivnost sistema BioWatcher in možnost sledenja stanju biomarkerjev v realnem času kot njegovi veliki prednosti. Sistem bi torej stanje biomarkerjev spremljal neprestano, uporabnika pa opozoril, ko bi nivo določenega biomarkerja dosegel previsoke vrednosti.

Zelo pomembno pa je tudi, da je mogoče kot receptorsko nanotelo uporabiti nanotelesa za praktično katerikoli antigen. Z menjavo nanoteles ali reporterskih genov je torej mogoče sistem prilagoditi za zelo različne uporabe, npr. za zaznavanje toksinov, težkih kovin ali drugih snovi iz okolja. Tudi reporterske gene je mogoče zamenjati za gene, ki bi na primer služili dostavi ali celo proizvajanju zdravilnih učinkovin, kot signal za apoptozo in podobno. Prav tako pa sistem ni omejen na človeka. Kot alternativni primer uporabe bi lahko sistem vnesli v ribe, ki bi zaznavale raven onesnaženosti vod [2].

Sicer pa želijo z BioWatcherjem predvsem omogočiti ljudem sledenje lastnemu zdravju in tako izboljšati njihovo zdravje ter preprečiti prepozno zdravljenje zaradi pozne diagnoze in svoj sistem vidijo kot revolucionaren na področju diagnostike.

== Viri ==

<references/>

BioWatcher pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni

2019-01-02T11:09:07Z

Nina Mavec:

[http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 BioWatcher] je projekt študentske ekipe NTHU Formosa s Tajvana, ki je bil nagrajen z zlato medaljo na tekmovanju iGEM 2018.

== Uvod ==

V zadnjih letih se ljudje vse bolj zavedajo pomena čim bolj natančnega spremljanja in zavedanja svojega zdravstvenega stanja. Vedno več ljudi se odloča za zdrav življenjski slog, pri tem pa prihaja do večjega povpraševanja po raznih pametnih urah ali zapestnicah, ki pa vseeno lahko dajejo le nek omejen nabor informacij o zdravju. Študenti s tem projektom želijo ljudem ponuditi bolj natančen vpogled v lastno zdravje in napredovanje bolezni, kakršnega je trenutno mogoče doseči s krvnim testom, želijo pa se izogniti nepraktičnosti in invazivnosti takih testov. Tako želijo razviti pametno uro, BioWatcher, ki bo v realnem času zaznavala raven biomarkerjev za razne bolezni v krvi<ref>Rapisuwon S, Vietsch EE, Wellstein A. Circulating biomarkers to monitor cancer progression and treatment. ''Computational and structural biotechnology journal.'' 2016;14:211–222. </ref> in ob dosegu neke mejne vrednosti določenega biomarkerja uporabnika obvestila. Tak pristop k diagnostiki bi bil predvsem pomemben v primeru raka, pri večini katerih je ključnega pomena pravočasna diagnoza. Kot rešitev tega problema predstavljajo načrtane celice, ki bodo biomarkerje v krvi zaznavale in ob njihovi prisotnosti proizvedle bioluminiscenco. To bi zaznavala pametna ura in raven bioluminiscence s primernim programom pretvorila v konkretne vrednosti in pregledne grafe<ref>iGEM NTHU_Formosa: BioWatcher. http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 [citirano 1. 1. 2019]</ref>.

== Načrt projekta ==

Cilj projetka je bil torej načrtati celice in ki bi ob zaznani prisotnosti biomarkerja proizvedle bioluminiscenco. Kot receptorje, ki bi biomarkerje zaznavali, so se odločili uporabiti nanotelesa, fragmente protiteles, ki vsebujejo le variabilno domeno težke verige (VHH). Zanje so se odločili zaradi znanih ugodnih lastnosti (stabilnost, visoka afiniteta in specifičnost do antigenov) in predvsem, ker obstajajo nanotelesa za mnoge različne antigene, kar bi celotnemu projektu dalo veliko fleksibilnost in možnost prilagoditve. Nanotelesa prav tako omogočajo zaznavo tako topnih kot na celično membrano vezanih antigenov<ref>Muyldermans S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. ''Annu Rev Biochem.'' (2013) 82:775–97. </ref>.

Nanotelesa bi bila zasidrana v celično membrano preko fuzijskih transmembranskih (TM) regij in razdeljena na C- in N-konec tako, da vezava antigena povzroči dimerizacijo nanoteles <ref>Tang J.C.Y., Szikra T., Kozorovitskiy Y., Teixiera M., Sabatini B.L., Roska B., Cepko C.L. A nanobody-based system using fluorescent proteins as scaffolds for cell-specific gene manipulation. ''Cell.'' 2013; 154:928–939.</ref>. Poleg TM regij tak fuzijski receptor vsebuje še proteazo iz mozaičnega virusa tobaka (ang. tobacco etch virus, TEV) na intracelularni strani, ki je prav tako razdeljena na dva dela in postane aktivna šele ob dimerizaciji receptorja. Za fragmenti proteaz TEV receptor vsebuje transkripcijski aktivator tTA, na vsakem koncu katerega je zaporedje TCS (ang. TEV cutting site), ki ga TEV proteaza reže. Tako se po rezanju tTA sprosti iz membrane in potuje v jedro, kjer sproži transkripcijo tarčnih genov, in sicer se veže na promotor TRE3G [2].

Tarčni geni zapisujejo za reporterski sistem. V tem projektu so še študenti odločili za reporterski sistem Lux. To je sistem za proizvajanje bioluminiscence, ki izvira in mikroorganizmov in temelji na encimu luciferazi, ki deluje na določene substrate in pri tem proizvaja svetlobo valovne dolžine 490 nm. Uporabili so tak sistem, kjer je bila raba kodonov optimizirana in ki je bil že uspešno uporabljen v človeških celicah. Glavna prednost tega spremenjenega sistema je, da ni potrebno dodajanje substratov (luciferinov), ki so sicer za človeške celice citotoksični. Sistem vsebuje dva seta genov pod dvema različnima promotorjema. Geni za LuxC, LuxD, LuxE in frp zapisujejo za encime, ki skupaj omogočajo pretvorbo določenih metabolitov, naravno prisotnih v sesalčjih celicah, v substrate za luciferazo. Ti geni so pod promotorjem iz citalomegavirusa (CMV), ki omogoča konstituitivno izražanje. Drugi set genov pa vsebuje LuxA in LuxB, ki zapoisujeta za samo luciferazo in sta pod promotrjem TRE3G. Ta pa je inducibilen in sicer omogoči izražanje ob vezavi prej omenjenega aktivatorja tTA, ki se z membrane sprosti ob vezavi antigena in dimerizaciji receptorja. Rezultat tega je, da so v celici vedno prisotni substrati za luciferazo, sama bioluminiscenca pa je samo posledica vezave pravega antigena na nanotelo<ref>Xu T., Ripp S., Sayler G.S., Close D.M. Expression of a humanized viral 2A-mediated lux operon efficiently generates autonomous bioluminescence in human cells. ''PLoS ONE.'' 2014;9:1704</ref>.

== Rezultati eksperimenta ==

Študenti so opravili dva različna poskusa. Najprej so preizkusili delovanje receptorjev, torej sposobnost nanoteles, da vežejo želen antigen in sprožijo izražanje enostavnega reporterskega proteina. Nato so preizkusili še delovanje reporterskega sistema Lux za bioluminiscenco, ki predstavlja bolj komercialno in uporabniško zanimiv pristop kot le enostaven reporterski protein.

'''Delovanje receptorjev'''

Za preizkus učinkovitosti delovanja receptorjev so uporabili GFP-vezavni protein GBP (ang. GFP binding protein), dobro preučevano nanotelo, ki veže zeleni fluorescirajoči protein (GFP). Kot je opisano v načrtu poskusa, so GBP razdelili na C- in N- končni del in mu fuzijsko dodali prav tako razdeljeno proteazo TEV in transkripcijski aktivator tTA. Sestavljen biološki del, ki vsebuje vse te komponente, se imenuje pCAG-GBP-tTA in je dostopen v registru standardnih bioloških delov: BBa_K2635001.

V tem poskusu so za reporterski sistem uporabili le izražanje rdečega fluorescirajočega proteina mCherry. Njegovo izražanje je bilo pod promotorjem TRE3G, ki ga inducira vezava tTA. Uporabljen biološki del je dostopne v registru BBa_K2635000.

Za poskus so uporabili celice 293T, ki so jih transfecirali z pCAG-GBP-tTA and pTRE3G-mCherry in jih 24 ur inkubirali z GFP-jem s koncentracijo 100 ng/mL. Celice so analizirali z fluorescenčno mikroskopijo. Ugotovili so, da je 94,7 % celic, na katere se je vezal GFP, izražale tudi mCherry in svetile rdeče. Le 5,3 % celic, na katere se je GFP uspešno vezal, ni izražalo mCherry. Na nekatere celice se ni vezal niti GFP, te pa pričakovano tudi niso izražale mCherry.

S poskusoma so ocenili tudi občutljivost in odzivni čas tega sistema . Za testiranje občutljivosti so enake celice kot prej prav tako 24 ur inkubirali z različnimi koncentracijami GFP-ja in opazovali rdečo fluorescenco kot odziv. Pričakovano se je je fluorecsenca večala z višanjem koncentracije GFP, s čimer so pokazali, da je odziv sistema odvisen od doze. Sicer pa je bilo znaten odziv opaziti že pri koncentraciji GFP 10 ng/mL, plato pa je bil dosežen pri koncentraciji 75 ng/mL. Za oceno hitrosti odziva so naredili podoben poskus, kjer je bila koncentracija GFP-ja spet 100 ng/mL in konstantna, spreminjali pa so čas inkubacije, in sicer v območju od 0 do 24 ur. Pokazali do, da do znatnega odziva pride pri 6 urah inkubacije.

'''Reporterski sistem Lux'''

Da bi pokazali delovanje reporterskega sistema Lux, so študenti celice 293T transfecirali z že prej uporabljenim pCAG-GBP-tTA in s pTRE3G-LuxAB ter pCMVLuxCDEfrp, ki zapisujeta za luciferazo pod inducibilnim promotorjem in encimi za generiranje primernih substratov pod konstituitivnim promotorjem CMV. Za merjenje bioluminiscence so uporabili IVIS Spectrum sitem.
Bioluminiscenco kot odziv sistema so merili pri celicah, ki so bile inkubirane z GFP-jem in za negativno kontrolo pri celicah, ki GFP-ju niso bile izpostavljene. Pokazali so, da pri inkubaciji z GFP pride do signifikantno večje bioluminiscence, ki jo je mogoče brez težav ločiti od šuma.

Za kontrolo so preizkusili, kako se sitem obnaša, če so vsi Lux geni pod konstituitivnim promotorjem CMV in se torej izražajo neodvisno od vezave antigena. Pri teh pogojih brez dodanega GFP ali drugih substratov je prišlo do učinkovitega proizvajanja bioluminiscence.

== Biološka varnost ==

Ker gre pri projektu za vnašanje celic v paciente, je bilo seveda potrebno dodati sistem, ki bi ob morebitnem imunskem odzivu ali uporabnikovi želji omogočal odstranitev celic iz človeka. Tak sistem so si zamislili v dveh stopnjah. Prvi del je namenjen urgentnim stanjem in omogoča hitro razgraditev receptorjev. Za ta namen želijo uporabiti sistem AID (ang. auxin-inducible degron), ki omogoča razgradnjo tarčnega proteina ob dodatku avksina. Potrebna je fuzija tarčnega proteina z AK zaporedjem Aid, ob dodatku avksina pa pride do interakcije tako označenega proteina z E3 ubikvitin ligazo, sledi pa ubikvitinacija in razgradnja v proteasomu. Tak odziv se zgodi že v 9 minutah<ref>Nishimura K, Fukagawa T, Takisawa H, Kakimoto T, Kanemaki M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. ''Nat. Methods.'' 2009;6:917–U978</ref>.

Druga stopnja varnostnega sistema pa je set genov, ki vključujejo zapis za kaspazo 3 pod avksinskim promotorjem. To pa ob prisotnosti avksina privede do apoptoze vnesenih celic in dokončno odstranitev BioWatcherja [2].

== Zaključek ==

Študenti v projektu poudarjajo predvsem neinvazivnost sistema BioWatcher in možnost sledenja stanju biomarkerjev v realnem času kot njegovi veliki prednosti. Sistem bi torej stanje biomarkerjev spremljal neprestano, uporabnika pa opozoril, ko bi nivo določenega biomarkerja dosegel previsoke vrednosti.

Zelo pomembno pa je tudi, da je mogoče kot receptorsko nanotelo uporabiti nanotelesa za praktično katerikoli antigen. Z menjavo nanoteles ali reporterskih genov je torej mogoče sistem prilagoditi za zelo različne uporabe, npr. za zaznavanje toksinov, težkih kovin ali drugih snovi iz okolja. Tudi reporterske gene je mogoče zamenjati za gene, ki bi na primer služili dostavi ali celo proizvajanju zdravilnih učinkovin, kot signal za apoptozo in podobno. Prav tako pa sistem ni omejen na človeka. Kot alternativni primer uporabe bi lahko sistem vnesli v ribe, ki bi zaznavale raven onesnaženosti vod [2].

Sicer pa želijo z BioWatcherjem predvsem omogočiti ljudem sledenje lastnemu zdravju in tako izboljšati njihovo zdravje ter preprečiti prepozno zdravljenje zaradi pozne diagnoze in svoj sistem vidijo kot revolucionaren na področju diagnostike.

== Viri ==

<references/>

BioWatcher pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni

2019-01-02T10:57:13Z

Nina Mavec: /* Rezultati eksperimenta */

[http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 BioWatcher] je projekt študentske ekipe NTHU Formosa s Tajvana, ki je bil nagrajen z zlato medaljo na tekmovanju iGEM 2018.

== Uvod ==

V zadnjih letih se ljudje vse bolj zavedajo pomena čim bolj natančnega spremljanja in zavedanja svojega zdravstvenega stanja. Vedno več ljudi se odloča za zdrav življenjski slog, pri tem pa prihaja do večjega povpraševanja po raznih pametnih urah ali zapestnicah, ki pa vseeno lahko dajejo le nek omejen nabor informacij o zdravju. Študenti s tem projektom želijo ljudem ponuditi bolj natančen vpogled v lastno zdravje in napredovanje bolezni, kakršnega je trenutno mogoče doseči s krvnim testom, želijo pa se izogniti nepraktičnosti in invazivnosti takih testov. Tako želijo razviti pametno uro, BioWatcher, ki bo v realnem času zaznavala raven biomarkerjev za razne bolezni v krvi [1] in ob dosegu neke mejne vrednosti določenega biomarkerja uporabnika obvestila. Tak pristop k diagnostiki bi bil predvsem pomemben v primeru raka, pri večini katerih je ključnega pomena pravočasna diagnoza. Kot rešitev tega problema predstavljajo načrtane celice, ki bodo biomarkerje v krvi zaznavale in ob njihovi prisotnosti proizvedle bioluminiscenco. To bi zaznavala pametna ura in raven bioluminiscence s primernim programom pretvorila v konkretne vrednosti in pregledne grafe [2].

== Načrt projekta ==

Cilj projetka je bil torej načrtati celice in ki bi ob zaznani prisotnosti biomarkerja proizvedle bioluminiscenco. Kot receptorje, ki bi biomarkerje zaznavali, so se odločili uporabiti nanotelesa, fragmente protiteles, ki vsebujejo le variabilno domeno težke verige (VHH). Zanje so se odločili zaradi znanih ugodnih lastnosti (stabilnost, visoka afiniteta in specifičnost do antigenov) in predvsem, ker obstajajo nanotelesa za mnoge različne antigene, kar bi celotnemu projektu dalo veliko fleksibilnost in možnost prilagoditve. Nanotelesa prav tako omogočajo zaznavo tako topnih kot na celično membrano vezanih antigenov [3].

Nanotelesa bi bila zasidrana v celično membrano preko fuzijskih transmembranskih (TM) regij in razdeljena na C- in N-konec tako, da vezava antigena povzroči dimerizacijo nanoteles [4]. Poleg TM regij tak fuzijski receptor vsebuje še proteazo iz mozaičnega virusa tobaka (ang. tobacco etch virus, TEV) na intracelularni strani, ki je prav tako razdeljena na dva dela in postane aktivna šele ob dimerizaciji receptorja. Za fragmenti proteaz TEV receptor vsebuje transkripcijski aktivator tTA, na vsakem koncu katerega je zaporedje TCS (ang. TEV cutting site), ki ga TEV proteaza reže. Tako se po rezanju tTA sprosti iz membrane in potuje v jedro, kjer sproži transkripcijo tarčnih genov, in sicer se veže na promotor TRE3G [2].

Tarčni geni zapisujejo za reporterski sistem. V tem projektu so še študenti odločili za reporterski sistem Lux. To je sistem za proizvajanje bioluminiscence, ki izvira in mikroorganizmov in temelji na encimu luciferazi, ki deluje na določene substrate in pri tem proizvaja svetlobo valovne dolžine 490 nm. Uporabili so tak sistem, kjer je bila raba kodonov optimizirana in ki je bil že uspešno uporabljen v človeških celicah. Glavna prednost tega spremenjenega sistema je, da ni potrebno dodajanje substratov (luciferinov), ki so sicer za človeške celice citotoksični [5].

Sistem vsebuje dva seta genov pod dvema različnima promotorjema. Geni za LuxC, LuxD, LuxE in frp zapisujejo za encime, ki skupaj omogočajo pretvorbo določenih metabolitov, naravno prisotnih v sesalčjih celicah v substrate za luciferazo. Ti geni so pod promotorjem iz citalomegavirusa (CMV), ki omogoča konstituitivno izražanje. Drugi set genov pa vsebuje LuxA in LuxB, ki zapoisujeta za samo luciferazo in sta pod promotrjem TRE3G. Ta pa je inducibilen in sicer omogoči izražanje ob vezavi prej omenjenega aktivatorja tTA, ki se z membrane sprosti ob vezavi antigena in dimerizaciji receptorja. Rezultat tega je, da so v celici vedno prisotni substrati za luciferazo, sama bioluminiscenca pa je samo posledica vezave pravega antigena na nanotelo [5].

== Rezultati eksperimenta ==

Študenti so opravili dva različna poskusa. Najprej so preizkusili delovanje receptorjev, torej sposobnost nanoteles, da vežejo želen antigen in sprožijo izražanje enostavnega reporterskega proteina. Nato so preizkusili še delovanje reporterskega sistema Lux za bioluminiscenco, ki predstavlja bolj komercialno in uporabniško zanimiv pristop kot le enostaven reporterski protein.

'''Delovanje receptorjev'''

Za preizkus učinkovitosti delovanja receptorjev so uporabili GFP-vezavni protein GBP (ang. GFP binding protein), dobro preučevano nanotelo, ki veže zeleni fluorescirajoči protein (GFP). Kot je opisano v načrtu poskusa, so GBP razdelili na C- in N- končni del in mu fuzijsko dodali prav tako razdeljeno proteazo TEV in transkripcijski aktivator tTA. Sestavljen biološki del, ki vsebuje vse te komponente, se imenuje pCAG-GBP-tTA in je dostopen v registru standardnih bioloških delov: BBa_K2635001 [2].

V tem poskusu so za reporterski sistem uporabili le izražanje rdečega fluorescirajočega proteina mCherry. Njegovo izražanje je bilo pod promotorjem TRE3G, ki ga inducira vezava tTA. Uporabljen biološki del je dostopne v registru BBa_K2635000 [2].

Za poskus so uporabili celice 293T, ki so jih transfecirali z pCAG-GBP-tTA and pTRE3G-mCherry in jih 24 ur inkubirali z GFP-jem s koncentracijo 100 ng/mL. Celice so analizirali z fluorescenčno mikroskopijo. Ugotovili so, da je 94,7 % celic, na katere se je vezal GFP, izražale tudi mCherry in svetile rdeče. Le 5,3 % celic, na katere se je GFP uspešno vezal, ni izražalo mCherry. Na nekatere celice se ni vezal niti GFP, te pa pričakovano tudi niso izražale mCherry [2].

S poskusoma so ocenili tudi občutljivost in odzivni čas tega sistema . Za testiranje občutljivosti so enake celice kot prej prav tako 24 ur inkubirali z različnimi koncentracijami GFP-ja in opazovali rdečo fluorescenco kot odziv. Pričakovano se je je fluorecsenca večala z višanjem koncentracije GFP, s čimer so pokazali, da je odziv sistema odvisen od doze. Sicer pa je bilo znaten odziv opaziti že pri koncentraciji GFP 10 ng/mL, plato pa je bil dosežen pri koncentraciji 75 ng/mL. Za oceno hitrosti odziva so naredili podoben poskus, kjer je bila koncentracija GFP-ja spet 100 ng/mL in konstantna, spreminjali pa so čas inkubacije, in sicer v območju od 0 do 24 ur. Pokazali do, da do znatnega odziva pride pri 6 urah inkubacije [2].

'''Reporterski sistem Lux'''

Da bi pokazali delovanje reporterskega sistema Lux, so študenti celice 293T transfecirali z že prej uporabljenim pCAG-GBP-tTA in s pTRE3G-LuxAB ter pCMVLuxCDEfrp, ki zapisujeta za luciferazo pod inducibilnim promotorjem in encimi za generiranje primernih substratov pod konstituitivnim promotorjem CMV. Za merjenje bioluminiscence so uporabili IVIS Spectrum sitem.
Bioluminiscenco kot odziv sistema so merili pri celicah, ki so bile inkubirane z GFP-jem in za negativno kontrolo pri celicah, ki GFP-ju niso bile izpostavljene. Pokazali so, da pri inkubaciji z GFP pride do signifikantno večje bioluminiscence, ki jo je mogoče brez težav ločiti od šuma [2].

Za kontrolo so preizkusili, kako se sitem obnaša, če so vsi Lux geni pod konstituitivnim promotorjem CMV in se torej izražajo neodvisno od vezave antigena. Pri teh pogojih brez dodanega GFP ali drugih substratov je prišlo do učinkovitega proizvajanja bioluminiscence [2].

== Biološka varnost ==

Ker gre pri projektu za vnašanje celic v paciente, je bilo seveda potrebno dodati sistem, ki bi ob morebitnem imunskem odzivu ali uporabnikovi želji omogočal odstranitev celic iz človeka. Tak sistem so si zamislili v dveh stopnjah. Prvi del je namenjen urgentnim stanjem in omogoča hitro razgraditev receptorjev. Za ta namen želijo uporabiti sistem AID (ang. auxin-inducible degron), ki omogoča razgradnjo tarčnega proteina ob dodatku avksina. Potrebna je fuzija tarčnega proteina z AK zaporedjem Aid, ob dodatku avksina pa pride do interakcije tako označenega proteina z E3 ubikvitin ligazo, sledi pa ubikvitinacija in razgradnja v proteasomu. Tak odziv se zgodi že v 9 minutah [6].

Druga stopnja varnostnega sistema pa je set genov, ki vključujejo zapis za kaspazo 3 pod avksinskim promotorjem. To pa ob prisotnosti avksina privede do apoptoze vnesenih celic in dokončno odstranitev BioWatcherja [2].

== Zaključek ==

Študenti v projektu poudarjajo predvsem neinvazivnost sistema BioWatcher in možnost sledenja stanju biomarkerjev v realnem času kot njegovi veliki prednosti. Sistem bi torej stanje biomarkerjev spremljal neprestano, uporabnika pa opozoril, ko bi nivo določenega biomarkerja dosegel previsoke vrednosti.

Zelo pomembno pa je tudi, da je mogoče kot receptorsko nanotelo uporabiti nanotelesa za praktično katerikoli antigen. Z menjavo nanoteles ali reporterskih genov je torej mogoče sistem prilagoditi za zelo različne uporabe, npr. za zaznavanje toksinov, težkih kovin ali drugih snovi iz okolja. Tudi reporterske gene je mogoče zamenjati za gene, ki bi na primer služili dostavi ali celo proizvajanju zdravilnih učinkovin, kot signal za apoptozo in podobno. Prav tako pa sistem ni omejen na človeka. Kot alternativni primer uporabe bi lahko sistem vnesli v ribe, ki bi zaznavale raven onesnaženosti vod [2].

Sicer pa želijo z BioWatcherjem predvsem omogočiti ljudem sledenje lastnemu zdravju in tako izboljšati njihovo zdravje ter preprečiti prepozno zdravljenje zaradi pozne diagnoze in svoj sistem vidijo kot revolucionaren na področju diagnostike.

== VIRI ==

[1] Rapisuwon S, Vietsch EE, Wellstein A. Circulating biomarkers to monitor cancer progression and treatment. ''Computational and structural biotechnology journal.'' 2016;14:211–222.

[2] iGEM NTHU_Formosa: BioWatcher. http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 [citirano 1. 1. 2019]

[3] Muyldermans S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. ''Annu Rev Biochem.'' (2013) 82:775–97.

[4] Tang J.C.Y., Szikra T., Kozorovitskiy Y., Teixiera M., Sabatini B.L., Roska B., Cepko C.L. A nanobody-based system using fluorescent proteins as scaffolds for cell-specific gene manipulation. ''Cell.'' 2013; 154:928–939.

[5] Xu T., Ripp S., Sayler G.S., Close D.M. Expression of a humanized viral 2A-mediated lux operon efficiently generates autonomous bioluminescence in human cells. ''PLoS ONE.'' 2014;9:1704

[6] Nishimura K, Fukagawa T, Takisawa H, Kakimoto T, Kanemaki M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. ''Nat. Methods.'' 2009;6:917–U978.

BioWatcher pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni

2019-01-02T10:55:31Z

Nina Mavec:

[http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 BioWatcher] je projekt študentske ekipe NTHU Formosa s Tajvana, ki je bil nagrajen z zlato medaljo na tekmovanju iGEM 2018.

== Uvod ==

V zadnjih letih se ljudje vse bolj zavedajo pomena čim bolj natančnega spremljanja in zavedanja svojega zdravstvenega stanja. Vedno več ljudi se odloča za zdrav življenjski slog, pri tem pa prihaja do večjega povpraševanja po raznih pametnih urah ali zapestnicah, ki pa vseeno lahko dajejo le nek omejen nabor informacij o zdravju. Študenti s tem projektom želijo ljudem ponuditi bolj natančen vpogled v lastno zdravje in napredovanje bolezni, kakršnega je trenutno mogoče doseči s krvnim testom, želijo pa se izogniti nepraktičnosti in invazivnosti takih testov. Tako želijo razviti pametno uro, BioWatcher, ki bo v realnem času zaznavala raven biomarkerjev za razne bolezni v krvi [1] in ob dosegu neke mejne vrednosti določenega biomarkerja uporabnika obvestila. Tak pristop k diagnostiki bi bil predvsem pomemben v primeru raka, pri večini katerih je ključnega pomena pravočasna diagnoza. Kot rešitev tega problema predstavljajo načrtane celice, ki bodo biomarkerje v krvi zaznavale in ob njihovi prisotnosti proizvedle bioluminiscenco. To bi zaznavala pametna ura in raven bioluminiscence s primernim programom pretvorila v konkretne vrednosti in pregledne grafe [2].

== Načrt projekta ==

Cilj projetka je bil torej načrtati celice in ki bi ob zaznani prisotnosti biomarkerja proizvedle bioluminiscenco. Kot receptorje, ki bi biomarkerje zaznavali, so se odločili uporabiti nanotelesa, fragmente protiteles, ki vsebujejo le variabilno domeno težke verige (VHH). Zanje so se odločili zaradi znanih ugodnih lastnosti (stabilnost, visoka afiniteta in specifičnost do antigenov) in predvsem, ker obstajajo nanotelesa za mnoge različne antigene, kar bi celotnemu projektu dalo veliko fleksibilnost in možnost prilagoditve. Nanotelesa prav tako omogočajo zaznavo tako topnih kot na celično membrano vezanih antigenov [3].

Nanotelesa bi bila zasidrana v celično membrano preko fuzijskih transmembranskih (TM) regij in razdeljena na C- in N-konec tako, da vezava antigena povzroči dimerizacijo nanoteles [4]. Poleg TM regij tak fuzijski receptor vsebuje še proteazo iz mozaičnega virusa tobaka (ang. tobacco etch virus, TEV) na intracelularni strani, ki je prav tako razdeljena na dva dela in postane aktivna šele ob dimerizaciji receptorja. Za fragmenti proteaz TEV receptor vsebuje transkripcijski aktivator tTA, na vsakem koncu katerega je zaporedje TCS (ang. TEV cutting site), ki ga TEV proteaza reže. Tako se po rezanju tTA sprosti iz membrane in potuje v jedro, kjer sproži transkripcijo tarčnih genov, in sicer se veže na promotor TRE3G [2].

Tarčni geni zapisujejo za reporterski sistem. V tem projektu so še študenti odločili za reporterski sistem Lux. To je sistem za proizvajanje bioluminiscence, ki izvira in mikroorganizmov in temelji na encimu luciferazi, ki deluje na določene substrate in pri tem proizvaja svetlobo valovne dolžine 490 nm. Uporabili so tak sistem, kjer je bila raba kodonov optimizirana in ki je bil že uspešno uporabljen v človeških celicah. Glavna prednost tega spremenjenega sistema je, da ni potrebno dodajanje substratov (luciferinov), ki so sicer za človeške celice citotoksični [5].

Sistem vsebuje dva seta genov pod dvema različnima promotorjema. Geni za LuxC, LuxD, LuxE in frp zapisujejo za encime, ki skupaj omogočajo pretvorbo določenih metabolitov, naravno prisotnih v sesalčjih celicah v substrate za luciferazo. Ti geni so pod promotorjem iz citalomegavirusa (CMV), ki omogoča konstituitivno izražanje. Drugi set genov pa vsebuje LuxA in LuxB, ki zapoisujeta za samo luciferazo in sta pod promotrjem TRE3G. Ta pa je inducibilen in sicer omogoči izražanje ob vezavi prej omenjenega aktivatorja tTA, ki se z membrane sprosti ob vezavi antigena in dimerizaciji receptorja. Rezultat tega je, da so v celici vedno prisotni substrati za luciferazo, sama bioluminiscenca pa je samo posledica vezave pravega antigena na nanotelo [5].

== Rezultati eksperimenta ==

Študenti so opravili dva različna poskusa. Najprej so preizkusili delovanje receptorjev, torej sposobnost nanoteles, da vežejo želen antigen in sprožijo izražanje enostavnega reporterskega proteina. Nato so preizkusili še delovanje reporterskega sistema Lux za bioluminiscenco, ki predstavlja bolj komercialno in uporabniško zanimiv pristop kot le enostaven reporterski protein.

'''Delovanje receptorjev'''

Za preizkus učinkovitosti delovanja receptorjev so uporabili GFP-vezavni protein GBP (ang. GFP binding protein), dobro preučevano nanotelo, ki veže zeleni fluorescirajoči protein (GFP). Kot je opisano v načrtu poskusa, so GBP razdelili na C- in N- končni del in mu fuzijsko dodali prav tako razdeljeno proteazo TEV in transkripcijski aktivator tTA. Sestavljen biološki del, ki vsebuje vse te komponente, se imenuje pCAG-GBP-tTA in je dostopen v registru standardnih bioloških delov: BBa_K2635001.

V tem poskusu so za reporterski sistem uporabili le izražanje rdečega fluorescirajočega proteina mCherry. Njegovo izražanje je bilo pod promotorjem TRE3G, ki ga inducira vezava tTA. Uporabljen biološki del je dostopne v registru BBa_K2635000.

Za poskus so uporabili celice 293T, ki so jih transfecirali z pCAG-GBP-tTA and pTRE3G-mCherry in jih 24 ur inkubirali z GFP-jem s koncentracijo 100 ng/mL. Celice so analizirali z fluorescenčno mikroskopijo. Ugotovili so, da je 94,7 % celic, na katere se je vezal GFP, izražale tudi mCherry in svetile rdeče. Le 5,3 % celic, na katere se je GFP uspešno vezal, ni izražalo mCherry. Na nekatere celice se ni vezal niti GFP, te pa pričakovano tudi niso izražale mCherry.

S poskusoma so ocenili tudi občutljivost in odzivni čas tega sistema . Za testiranje občutljivosti so enake celice kot prej prav tako 24 ur inkubirali z različnimi koncentracijami GFP-ja in opazovali rdečo fluorescenco kot odziv. Pričakovano se je je fluorecsenca večala z višanjem koncentracije GFP, s čimer so pokazali, da je odziv sistema odvisen od doze. Sicer pa je bilo znaten odziv opaziti že pri koncentraciji GFP 10 ng/mL, plato pa je bil dosežen pri koncentraciji 75 ng/mL. Za oceno hitrosti odziva so naredili podoben poskus, kjer je bila koncentracija GFP-ja spet 100 ng/mL in konstantna, spreminjali pa so čas inkubacije, in sicer v območju od 0 do 24 ur. Pokazali do, da do znatnega odziva pride pri 6 urah inkubacije.

'''Reporterski sistem Lux'''

Da bi pokazali delovanje reporterskega sistema Lux, so študenti celice 293T transfecirali z že prej uporabljenim pCAG-GBP-tTA in s pTRE3G-LuxAB ter pCMVLuxCDEfrp, ki zapisujeta za luciferazo pod inducibilnim promotorjem in encimi za generiranje primernih substratov pod konstituitivnim promotorjem CMV. Za merjenje bioluminiscence so uporabili IVIS Spectrum sitem.
Bioluminiscenco kot odziv sistema so merili pri celicah, ki so bile inkubirane z GFP-jem in za negativno kontrolo pri celicah, ki GFP-ju niso bile izpostavljene. Pokazali so, da pri inkubaciji z GFP pride do signifikantno večje bioluminiscence, ki jo je mogoče brez težav ločiti od šuma.

Za kontrolo so preizkusili, kako se sitem obnaša, če so vsi Lux geni pod konstituitivnim promotorjem CMV in se torej izražajo neodvisno od vezave antigena. Pri teh pogojih brez dodanega GFP ali drugih substratov je prišlo do učinkovitega proizvajanja bioluminiscence.

== Biološka varnost ==

Ker gre pri projektu za vnašanje celic v paciente, je bilo seveda potrebno dodati sistem, ki bi ob morebitnem imunskem odzivu ali uporabnikovi želji omogočal odstranitev celic iz človeka. Tak sistem so si zamislili v dveh stopnjah. Prvi del je namenjen urgentnim stanjem in omogoča hitro razgraditev receptorjev. Za ta namen želijo uporabiti sistem AID (ang. auxin-inducible degron), ki omogoča razgradnjo tarčnega proteina ob dodatku avksina. Potrebna je fuzija tarčnega proteina z AK zaporedjem Aid, ob dodatku avksina pa pride do interakcije tako označenega proteina z E3 ubikvitin ligazo, sledi pa ubikvitinacija in razgradnja v proteasomu. Tak odziv se zgodi že v 9 minutah [6].

Druga stopnja varnostnega sistema pa je set genov, ki vključujejo zapis za kaspazo 3 pod avksinskim promotorjem. To pa ob prisotnosti avksina privede do apoptoze vnesenih celic in dokončno odstranitev BioWatcherja [2].

== Zaključek ==

Študenti v projektu poudarjajo predvsem neinvazivnost sistema BioWatcher in možnost sledenja stanju biomarkerjev v realnem času kot njegovi veliki prednosti. Sistem bi torej stanje biomarkerjev spremljal neprestano, uporabnika pa opozoril, ko bi nivo določenega biomarkerja dosegel previsoke vrednosti.

Zelo pomembno pa je tudi, da je mogoče kot receptorsko nanotelo uporabiti nanotelesa za praktično katerikoli antigen. Z menjavo nanoteles ali reporterskih genov je torej mogoče sistem prilagoditi za zelo različne uporabe, npr. za zaznavanje toksinov, težkih kovin ali drugih snovi iz okolja. Tudi reporterske gene je mogoče zamenjati za gene, ki bi na primer služili dostavi ali celo proizvajanju zdravilnih učinkovin, kot signal za apoptozo in podobno. Prav tako pa sistem ni omejen na človeka. Kot alternativni primer uporabe bi lahko sistem vnesli v ribe, ki bi zaznavale raven onesnaženosti vod [2].

Sicer pa želijo z BioWatcherjem predvsem omogočiti ljudem sledenje lastnemu zdravju in tako izboljšati njihovo zdravje ter preprečiti prepozno zdravljenje zaradi pozne diagnoze in svoj sistem vidijo kot revolucionaren na področju diagnostike.

== VIRI ==

[1] Rapisuwon S, Vietsch EE, Wellstein A. Circulating biomarkers to monitor cancer progression and treatment. ''Computational and structural biotechnology journal.'' 2016;14:211–222.

[2] iGEM NTHU_Formosa: BioWatcher. http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 [citirano 1. 1. 2019]

[3] Muyldermans S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. ''Annu Rev Biochem.'' (2013) 82:775–97.

[4] Tang J.C.Y., Szikra T., Kozorovitskiy Y., Teixiera M., Sabatini B.L., Roska B., Cepko C.L. A nanobody-based system using fluorescent proteins as scaffolds for cell-specific gene manipulation. ''Cell.'' 2013; 154:928–939.

[5] Xu T., Ripp S., Sayler G.S., Close D.M. Expression of a humanized viral 2A-mediated lux operon efficiently generates autonomous bioluminescence in human cells. ''PLoS ONE.'' 2014;9:1704

[6] Nishimura K, Fukagawa T, Takisawa H, Kakimoto T, Kanemaki M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. ''Nat. Methods.'' 2009;6:917–U978.

BioWatcher pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni

2019-01-02T10:53:12Z

Nina Mavec:

[http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 BioWatcher] je projekt študentske ekipe NTHU Formosa s Tajvana, ki je bil nagrajena z zlato medaljo na tekmovanju iGEM 2018.

== Uvod ==

V zadnjih letih se ljudje vse bolj zavedajo pomena čim bolj natančnega spremljanja in zavedanja svojega zdravstvenega stanja. Vedno več ljudi se odloča za zdrav življenjski slog, pri tem pa prihaja do večjega povpraševanja po raznih pametnih urah ali zapestnicah, ki pa vseeno lahko dajejo le nek omejen nabor informacij o zdravju. Študenti s tem projektom želijo ljudem ponuditi bolj natančen vpogled v lastno zdravje in napredovanje bolezni, kakršnega je trenutno mogoče doseči s krvnim testom, želijo pa se izogniti nepraktičnosti in invazivnosti takih testov. Tako želijo razviti pametno uro, BioWatcher, ki bo v realnem času zaznavala raven biomarkerjev za razne bolezni v krvi [1] in ob dosegu neke mejne vrednosti določenega biomarkerja uporabnika obvestila. Tak pristop k diagnostiki bi bil predvsem pomemben v primeru raka, pri večini katerih je ključnega pomena pravočasna diagnoza. Kot rešitev tega problema predstavljajo načrtane celice, ki bodo biomarkerje v krvi zaznavale in ob njihovi prisotnosti proizvedle bioluminiscenco. To bi zaznavala pametna ura in raven bioluminiscence s primernim programom pretvorila v konkretne vrednosti in pregledne grafe [2].

== Načrt projekta ==

Cilj projetka je bil torej načrtati celice in ki bi ob zaznani prisotnosti biomarkerja proizvedle bioluminiscenco. Kot receptorje, ki bi biomarkerje zaznavali, so se odločili uporabiti nanotelesa, fragmente protiteles, ki vsebujejo le variabilno domeno težke verige (VHH). Zanje so se odločili zaradi znanih ugodnih lastnosti (stabilnost, visoka afiniteta in specifičnost do antigenov) in predvsem, ker obstajajo nanotelesa za mnoge različne antigene, kar bi celotnemu projektu dalo veliko fleksibilnost in možnost prilagoditve. Nanotelesa prav tako omogočajo zaznavo tako topnih kot na celično membrano vezanih antigenov [3].

Nanotelesa bi bila zasidrana v celično membrano preko fuzijskih transmembranskih (TM) regij in razdeljena na C- in N-konec tako, da vezava antigena povzroči dimerizacijo nanoteles [4]. Poleg TM regij tak fuzijski receptor vsebuje še proteazo iz mozaičnega virusa tobaka (ang. tobacco etch virus, TEV) na intracelularni strani, ki je prav tako razdeljena na dva dela in postane aktivna šele ob dimerizaciji receptorja. Za fragmenti proteaz TEV receptor vsebuje transkripcijski aktivator tTA, na vsakem koncu katerega je zaporedje TCS (ang. TEV cutting site), ki ga TEV proteaza reže. Tako se po rezanju tTA sprosti iz membrane in potuje v jedro, kjer sproži transkripcijo tarčnih genov, in sicer se veže na promotor TRE3G [2].

Tarčni geni zapisujejo za reporterski sistem. V tem projektu so še študenti odločili za reporterski sistem Lux. To je sistem za proizvajanje bioluminiscence, ki izvira in mikroorganizmov in temelji na encimu luciferazi, ki deluje na določene substrate in pri tem proizvaja svetlobo valovne dolžine 490 nm. Uporabili so tak sistem, kjer je bila raba kodonov optimizirana in ki je bil že uspešno uporabljen v človeških celicah. Glavna prednost tega spremenjenega sistema je, da ni potrebno dodajanje substratov (luciferinov), ki so sicer za človeške celice citotoksični [5].

Sistem vsebuje dva seta genov pod dvema različnima promotorjema. Geni za LuxC, LuxD, LuxE in frp zapisujejo za encime, ki skupaj omogočajo pretvorbo določenih metabolitov, naravno prisotnih v sesalčjih celicah v substrate za luciferazo. Ti geni so pod promotorjem iz citalomegavirusa (CMV), ki omogoča konstituitivno izražanje. Drugi set genov pa vsebuje LuxA in LuxB, ki zapoisujeta za samo luciferazo in sta pod promotrjem TRE3G. Ta pa je inducibilen in sicer omogoči izražanje ob vezavi prej omenjenega aktivatorja tTA, ki se z membrane sprosti ob vezavi antigena in dimerizaciji receptorja. Rezultat tega je, da so v celici vedno prisotni substrati za luciferazo, sama bioluminiscenca pa je samo posledica vezave pravega antigena na nanotelo [5].

== Rezultati eksperimenta ==

Študenti so opravili dva različna poskusa. Najprej so preizkusili delovanje receptorjev, torej sposobnost nanoteles, da vežejo želen antigen in sprožijo izražanje enostavnega reporterskega proteina. Nato so preizkusili še delovanje reporterskega sistema Lux za bioluminiscenco, ki predstavlja bolj komercialno in uporabniško zanimiv pristop kot le enostaven reporterski protein.

'''Delovanje receptorjev'''

Za preizkus učinkovitosti delovanja receptorjev so uporabili GFP-vezavni protein GBP (ang. GFP binding protein), dobro preučevano nanotelo, ki veže zeleni fluorescirajoči protein (GFP). Kot je opisano v načrtu poskusa, so GBP razdelili na C- in N- končni del in mu fuzijsko dodali prav tako razdeljeno proteazo TEV in transkripcijski aktivator tTA. Sestavljen biološki del, ki vsebuje vse te komponente, se imenuje pCAG-GBP-tTA in je dostopen v registru standardnih bioloških delov: BBa_K2635001.

V tem poskusu so za reporterski sistem uporabili le izražanje rdečega fluorescirajočega proteina mCherry. Njegovo izražanje je bilo pod promotorjem TRE3G, ki ga inducira vezava tTA. Uporabljen biološki del je dostopne v registru BBa_K2635000.

Za poskus so uporabili celice 293T, ki so jih transfecirali z pCAG-GBP-tTA and pTRE3G-mCherry in jih 24 ur inkubirali z GFP-jem s koncentracijo 100 ng/mL. Celice so analizirali z fluorescenčno mikroskopijo. Ugotovili so, da je 94,7 % celic, na katere se je vezal GFP, izražale tudi mCherry in svetile rdeče. Le 5,3 % celic, na katere se je GFP uspešno vezal, ni izražalo mCherry. Na nekatere celice se ni vezal niti GFP, te pa pričakovano tudi niso izražale mCherry.

S poskusoma so ocenili tudi občutljivost in odzivni čas tega sistema . Za testiranje občutljivosti so enake celice kot prej prav tako 24 ur inkubirali z različnimi koncentracijami GFP-ja in opazovali rdečo fluorescenco kot odziv. Pričakovano se je je fluorecsenca večala z višanjem koncentracije GFP, s čimer so pokazali, da je odziv sistema odvisen od doze. Sicer pa je bilo znaten odziv opaziti že pri koncentraciji GFP 10 ng/mL, plato pa je bil dosežen pri koncentraciji 75 ng/mL. Za oceno hitrosti odziva so naredili podoben poskus, kjer je bila koncentracija GFP-ja spet 100 ng/mL in konstantna, spreminjali pa so čas inkubacije, in sicer v območju od 0 do 24 ur. Pokazali do, da do znatnega odziva pride pri 6 urah inkubacije.

'''Reporterski sistem Lux'''

Da bi pokazali delovanje reporterskega sistema Lux, so študenti celice 293T transfecirali z že prej uporabljenim pCAG-GBP-tTA in s pTRE3G-LuxAB ter pCMVLuxCDEfrp, ki zapisujeta za luciferazo pod inducibilnim promotorjem in encimi za generiranje primernih substratov pod konstituitivnim promotorjem CMV. Za merjenje bioluminiscence so uporabili IVIS Spectrum sitem.
Bioluminiscenco kot odziv sistema so merili pri celicah, ki so bile inkubirane z GFP-jem in za negativno kontrolo pri celicah, ki GFP-ju niso bile izpostavljene. Pokazali so, da pri inkubaciji z GFP pride do signifikantno večje bioluminiscence, ki jo je mogoče brez težav ločiti od šuma.

Za kontrolo so preizkusili, kako se sitem obnaša, če so vsi Lux geni pod konstituitivnim promotorjem CMV in se torej izražajo neodvisno od vezave antigena. Pri teh pogojih brez dodanega GFP ali drugih substratov je prišlo do učinkovitega proizvajanja bioluminiscence.

== Biološka varnost ==

Ker gre pri projektu za vnašanje celic v paciente, je bilo seveda potrebno dodati sistem, ki bi ob morebitnem imunskem odzivu ali uporabnikovi želji omogočal odstranitev celic iz človeka. Tak sistem so si zamislili v dveh stopnjah. Prvi del je namenjen urgentnim stanjem in omogoča hitro razgraditev receptorjev. Za ta namen želijo uporabiti sistem AID (ang. auxin-inducible degron), ki omogoča razgradnjo tarčnega proteina ob dodatku avksina. Potrebna je fuzija tarčnega proteina z AK zaporedjem Aid, ob dodatku avksina pa pride do interakcije tako označenega proteina z E3 ubikvitin ligazo, sledi pa ubikvitinacija in razgradnja v proteasomu. Tak odziv se zgodi že v 9 minutah [6].

Druga stopnja varnostnega sistema pa je set genov, ki vključujejo zapis za kaspazo 3 pod avksinskim promotorjem. To pa ob prisotnosti avksina privede do apoptoze vnesenih celic in dokončno odstranitev BioWatcherja [2].

== Zaključek ==

Študenti v projektu poudarjajo predvsem neinvazivnost sistema BioWatcher in možnost sledenja stanju biomarkerjev v realnem času kot njegovi veliki prednosti. Sistem bi torej stanje biomarkerjev spremljal neprestano, uporabnika pa opozoril, ko bi nivo določenega biomarkerja dosegel previsoke vrednosti.

Zelo pomembno pa je tudi, da je mogoče kot receptorsko nanotelo uporabiti nanotelesa za praktično katerikoli antigen. Z menjavo nanoteles ali reporterskih genov je torej mogoče sistem prilagoditi za zelo različne uporabe, npr. za zaznavanje toksinov, težkih kovin ali drugih snovi iz okolja. Tudi reporterske gene je mogoče zamenjati za gene, ki bi na primer služili dostavi ali celo proizvajanju zdravilnih učinkovin, kot signal za apoptozo in podobno. Prav tako pa sistem ni omejen na človeka. Kot alternativni primer uporabe bi lahko sistem vnesli v ribe, ki bi zaznavale raven onesnaženosti vod [2].

Sicer pa želijo z BioWatcherjem predvsem omogočiti ljudem sledenje lastnemu zdravju in tako izboljšati njihovo zdravje ter preprečiti prepozno zdravljenje zaradi pozne diagnoze in svoj sistem vidijo kot revolucionaren na področju diagnostike.

== VIRI ==

[1] Rapisuwon S, Vietsch EE, Wellstein A. Circulating biomarkers to monitor cancer progression and treatment. ''Computational and structural biotechnology journal.'' 2016;14:211–222.

[2] iGEM NTHU_Formosa: BioWatcher. http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 [citirano 1. 1. 2019]

[3] Muyldermans S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. ''Annu Rev Biochem.'' (2013) 82:775–97.

[4] Tang J.C.Y., Szikra T., Kozorovitskiy Y., Teixiera M., Sabatini B.L., Roska B., Cepko C.L. A nanobody-based system using fluorescent proteins as scaffolds for cell-specific gene manipulation. ''Cell.'' 2013; 154:928–939.

[5] Xu T., Ripp S., Sayler G.S., Close D.M. Expression of a humanized viral 2A-mediated lux operon efficiently generates autonomous bioluminescence in human cells. ''PLoS ONE.'' 2014;9:1704

[6] Nishimura K, Fukagawa T, Takisawa H, Kakimoto T, Kanemaki M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. ''Nat. Methods.'' 2009;6:917–U978.

BioWatcher pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni

2019-01-02T10:51:49Z

Nina Mavec:

[http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 BioWatcher] je projekt študentske ekipe NTHU Formosa s Tajvana, ki je bil nagrajena z zlato medaljo na tekmovanju iGEM 2018.

== UVOD ==

V zadnjih letih se ljudje vse bolj zavedajo pomena čim bolj natančnega spremljanja in zavedanja svojega zdravstvenega stanja. Vedno več ljudi se odloča za zdrav življenjski slog, pri tem pa prihaja do večjega povpraševanja po raznih pametnih urah ali zapestnicah, ki pa vseeno lahko dajejo le nek omejen nabor informacij o zdravju. Študenti s tem projektom želijo ljudem ponuditi bolj natančen vpogled v lastno zdravje in napredovanje bolezni, kakršnega je trenutno mogoče doseči s krvnim testom, želijo pa se izogniti nepraktičnosti in invazivnosti takih testov. Tako želijo razviti pametno uro, BioWatcher, ki bo v realnem času zaznavala raven biomarkerjev za razne bolezni v krvi [1] in ob dosegu neke mejne vrednosti določenega biomarkerja uporabnika obvestila. Tak pristop k diagnostiki bi bil predvsem pomemben v primeru raka, pri večini katerih je ključnega pomena pravočasna diagnoza. Kot rešitev tega problema predstavljajo načrtane celice, ki bodo biomarkerje v krvi zaznavale in ob njihovi prisotnosti proizvedle bioluminiscenco. To bi zaznavala pametna ura in raven bioluminiscence s primernim programom pretvorila v konkretne vrednosti in pregledne grafe [2].

== NAČRT PROJEKTA ==

Cilj projetka je bil torej načrtati celice in ki bi ob zaznani prisotnosti biomarkerja proizvedle bioluminiscenco. Kot receptorje, ki bi biomarkerje zaznavali, so se odločili uporabiti nanotelesa, fragmente protiteles, ki vsebujejo le variabilno domeno težke verige (VHH). Zanje so se odločili zaradi znanih ugodnih lastnosti (stabilnost, visoka afiniteta in specifičnost do antigenov) in predvsem, ker obstajajo nanotelesa za mnoge različne antigene, kar bi celotnemu projektu dalo veliko fleksibilnost in možnost prilagoditve. Nanotelesa prav tako omogočajo zaznavo tako topnih kot na celično membrano vezanih antigenov [3].

Nanotelesa bi bila zasidrana v celično membrano preko fuzijskih transmembranskih (TM) regij in razdeljena na C- in N-konec tako, da vezava antigena povzroči dimerizacijo nanoteles [4]. Poleg TM regij tak fuzijski receptor vsebuje še proteazo iz mozaičnega virusa tobaka (ang. tobacco etch virus, TEV) na intracelularni strani, ki je prav tako razdeljena na dva dela in postane aktivna šele ob dimerizaciji receptorja. Za fragmenti proteaz TEV receptor vsebuje transkripcijski aktivator tTA, na vsakem koncu katerega je zaporedje TCS (ang. TEV cutting site), ki ga TEV proteaza reže. Tako se po rezanju tTA sprosti iz membrane in potuje v jedro, kjer sproži transkripcijo tarčnih genov, in sicer se veže na promotor TRE3G [2].

Tarčni geni zapisujejo za reporterski sistem. V tem projektu so še študenti odločili za reporterski sistem Lux. To je sistem za proizvajanje bioluminiscence, ki izvira in mikroorganizmov in temelji na encimu luciferazi, ki deluje na določene substrate in pri tem proizvaja svetlobo valovne dolžine 490 nm. Uporabili so tak sistem, kjer je bila raba kodonov optimizirana in ki je bil že uspešno uporabljen v človeških celicah. Glavna prednost tega spremenjenega sistema je, da ni potrebno dodajanje substratov (luciferinov), ki so sicer za človeške celice citotoksični [5].

Sistem vsebuje dva seta genov pod dvema različnima promotorjema. Geni za LuxC, LuxD, LuxE in frp zapisujejo za encime, ki skupaj omogočajo pretvorbo določenih metabolitov, naravno prisotnih v sesalčjih celicah v substrate za luciferazo. Ti geni so pod promotorjem iz citalomegavirusa (CMV), ki omogoča konstituitivno izražanje. Drugi set genov pa vsebuje LuxA in LuxB, ki zapoisujeta za samo luciferazo in sta pod promotrjem TRE3G. Ta pa je inducibilen in sicer omogoči izražanje ob vezavi prej omenjenega aktivatorja tTA, ki se z membrane sprosti ob vezavi antigena in dimerizaciji receptorja. Rezultat tega je, da so v celici vedno prisotni substrati za luciferazo, sama bioluminiscenca pa je samo posledica vezave pravega antigena na nanotelo [5].

== REZULTATI EKSPERIMENTA ==

Študenti so opravili dva različna poskusa. Najprej so preizkusili delovanje receptorjev, torej sposobnost nanoteles, da vežejo želen antigen in sprožijo izražanje enostavnega reporterskega proteina. Nato so preizkusili še delovanje reporterskega sistema Lux za bioluminiscenco, ki predstavlja bolj komercialno in uporabniško zanimiv pristop kot le enostaven reporterski protein.

'''Delovanje receptorjev'''

Za preizkus učinkovitosti delovanja receptorjev so uporabili GFP-vezavni protein GBP (ang. GFP binding protein), dobro preučevano nanotelo, ki veže zeleni fluorescirajoči protein (GFP). Kot je opisano v načrtu poskusa, so GBP razdelili na C- in N- končni del in mu fuzijsko dodali prav tako razdeljeno proteazo TEV in transkripcijski aktivator tTA. Sestavljen biološki del, ki vsebuje vse te komponente, se imenuje pCAG-GBP-tTA in je dostopen v registru standardnih bioloških delov: BBa_K2635001.

V tem poskusu so za reporterski sistem uporabili le izražanje rdečega fluorescirajočega proteina mCherry. Njegovo izražanje je bilo pod promotorjem TRE3G, ki ga inducira vezava tTA. Uporabljen biološki del je dostopne v registru BBa_K2635000.

Za poskus so uporabili celice 293T, ki so jih transfecirali z pCAG-GBP-tTA and pTRE3G-mCherry in jih 24 ur inkubirali z GFP-jem s koncentracijo 100 ng/mL. Celice so analizirali z fluorescenčno mikroskopijo. Ugotovili so, da je 94,7 % celic, na katere se je vezal GFP, izražale tudi mCherry in svetile rdeče. Le 5,3 % celic, na katere se je GFP uspešno vezal, ni izražalo mCherry. Na nekatere celice se ni vezal niti GFP, te pa pričakovano tudi niso izražale mCherry.

S poskusoma so ocenili tudi občutljivost in odzivni čas tega sistema . Za testiranje občutljivosti so enake celice kot prej prav tako 24 ur inkubirali z različnimi koncentracijami GFP-ja in opazovali rdečo fluorescenco kot odziv. Pričakovano se je je fluorecsenca večala z višanjem koncentracije GFP, s čimer so pokazali, da je odziv sistema odvisen od doze. Sicer pa je bilo znaten odziv opaziti že pri koncentraciji GFP 10 ng/mL, plato pa je bil dosežen pri koncentraciji 75 ng/mL. Za oceno hitrosti odziva so naredili podoben poskus, kjer je bila koncentracija GFP-ja spet 100 ng/mL in konstantna, spreminjali pa so čas inkubacije, in sicer v območju od 0 do 24 ur. Pokazali do, da do znatnega odziva pride pri 6 urah inkubacije.

'''Reporterski sistem Lux'''

Da bi pokazali delovanje reporterskega sistema Lux, so študenti celice 293T transfecirali z že prej uporabljenim pCAG-GBP-tTA in s pTRE3G-LuxAB ter pCMVLuxCDEfrp, ki zapisujeta za luciferazo pod inducibilnim promotorjem in encimi za generiranje primernih substratov pod konstituitivnim promotorjem CMV. Za merjenje bioluminiscence so uporabili IVIS Spectrum sitem.
Bioluminiscenco kot odziv sistema so merili pri celicah, ki so bile inkubirane z GFP-jem in za negativno kontrolo pri celicah, ki GFP-ju niso bile izpostavljene. Pokazali so, da pri inkubaciji z GFP pride do signifikantno večje bioluminiscence, ki jo je mogoče brez težav ločiti od šuma.

Za kontrolo so preizkusili, kako se sitem obnaša, če so vsi Lux geni pod konstituitivnim promotorjem CMV in se torej izražajo neodvisno od vezave antigena. Pri teh pogojih brez dodanega GFP ali drugih substratov je prišlo do učinkovitega proizvajanja bioluminiscence.

== BIOLOŠKA VARNOST ==

Ker gre pri projektu za vnašanje celic v paciente, je bilo seveda potrebno dodati sistem, ki bi ob morebitnem imunskem odzivu ali uporabnikovi želji omogočal odstranitev celic iz človeka. Tak sistem so si zamislili v dveh stopnjah. Prvi del je namenjen urgentnim stanjem in omogoča hitro razgraditev receptorjev. Za ta namen želijo uporabiti sistem AID (ang. auxin-inducible degron), ki omogoča razgradnjo tarčnega proteina ob dodatku avksina. Potrebna je fuzija tarčnega proteina z AK zaporedjem Aid, ob dodatku avksina pa pride do interakcije tako označenega proteina z E3 ubikvitin ligazo, sledi pa ubikvitinacija in razgradnja v proteasomu. Tak odziv se zgodi že v 9 minutah [6].

Druga stopnja varnostnega sistema pa je set genov, ki vključujejo zapis za kaspazo 3 pod avksinskim promotorjem. To pa ob prisotnosti avksina privede do apoptoze vnesenih celic in dokončno odstranitev BioWatcherja [2].

== Zaključek ==

Študenti v projektu poudarjajo predvsem neinvazivnost sistema BioWatcher in možnost sledenja stanju biomarkerjev v realnem času kot njegovi veliki prednosti. Sistem bi torej stanje biomarkerjev spremljal neprestano, uporabnika pa opozoril, ko bi nivo določenega biomarkerja dosegel previsoke vrednosti.

Zelo pomembno pa je tudi, da je mogoče kot receptorsko nanotelo uporabiti nanotelesa za praktično katerikoli antigen. Z menjavo nanoteles ali reporterskih genov je torej mogoče sistem prilagoditi za zelo različne uporabe, npr. za zaznavanje toksinov, težkih kovin ali drugih snovi iz okolja. Tudi reporterske gene je mogoče zamenjati za gene, ki bi na primer služili dostavi ali celo proizvajanju zdravilnih učinkovin, kot signal za apoptozo in podobno. Prav tako pa sistem ni omejen na človeka. Kot alternativni primer uporabe bi lahko sistem vnesli v ribe, ki bi zaznavale raven onesnaženosti vod [2].

Sicer pa želijo z BioWatcherjem predvsem omogočiti ljudem sledenje lastnemu zdravju in tako izboljšati njihovo zdravje ter preprečiti prepozno zdravljenje zaradi pozne diagnoze in svoj sistem vidijo kot revolucionaren na področju diagnostike.

== VIRI ==

[1] Rapisuwon S, Vietsch EE, Wellstein A. Circulating biomarkers to monitor cancer progression and treatment. ''Computational and structural biotechnology journal.'' 2016;14:211–222.

[2] iGEM NTHU_Formosa: BioWatcher. http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 [citirano 1. 1. 2019]

[3] Muyldermans S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. ''Annu Rev Biochem.'' (2013) 82:775–97.

[4] Tang J.C.Y., Szikra T., Kozorovitskiy Y., Teixiera M., Sabatini B.L., Roska B., Cepko C.L. A nanobody-based system using fluorescent proteins as scaffolds for cell-specific gene manipulation. ''Cell.'' 2013; 154:928–939.

[5] Xu T., Ripp S., Sayler G.S., Close D.M. Expression of a humanized viral 2A-mediated lux operon efficiently generates autonomous bioluminescence in human cells. ''PLoS ONE.'' 2014;9:1704

[6] Nishimura K, Fukagawa T, Takisawa H, Kakimoto T, Kanemaki M. An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells. ''Nat. Methods.'' 2009;6:917–U978.

BioWatcher pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni

2019-01-02T10:43:20Z

Nina Mavec:

[http://2018.igem.org/Team:NTHU_Formosa#0 BioWatcher] je projekt študentske ekipe NTHU_Formosa s Tajvana, ki je bil nagrajena z zlato medaljo na tekmovanju iGEM 2018.

BioWatcher pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni

2019-01-02T10:42:59Z

Nina Mavec: New page: [http://2018.igem.org/Team:NTHU Formosa#0 BioWatcher] je projekt študentske ekipe NTHU_Formosa s Tajvana, ki je bil nagrajena z zlato medaljo na tekmovanju iGEM 2018.

[http://2018.igem.org/Team:NTHU Formosa#0 BioWatcher] je projekt študentske ekipe NTHU_Formosa s Tajvana, ki je bil nagrajena z zlato medaljo na tekmovanju iGEM 2018.

Seminarji SB 2018/19

2019-01-02T10:41:13Z

Nina Mavec:

V študijskem letu 2018/19 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MoClo:_modularni_klonirni_sistem_za_standardizirano_sestavljanje_ve%C4%8Dgenskih_konstruktov MoClo: modularni klonirni sistem za standardizirano sestavljanje večgenskih konstruktov] (Valentina Levak)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RNA-stikala_tipa_%C2%BBToehold%C2%AB:_de_novo_oblikovani_regulatorji_izra%C5%BEanja_genov RNA-stikala tipa Toehold: de novo oblikovani regulatorji izražanja genov] (Špela Malenšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Raznoliko_in_modelno_zasnovana_priprava_sinteti%C4%8Dnih_genskih_vezij_s_predvidenimi_lastnostmi Raznoliko in modelno zasnovana priprava sintetičnih genskih vezij s predvidenimi lastnostmi] (Matej Kolarič)

[[Dispersing biofilms with engineered enzymatic bacteriophage]] (Fran Krstanović)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Nekaj_pogledov_na_sistemsko_biologijo_kvasovke Nekaj pogledov na sistemsko biologijo kvasovke] (Gašper Žun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Organizacija_znotrajceli%C4%8Dnih_reakcij_z_razumsko_na%C4%8Drtovanimi_RNA_sestavi#Na.C4.8Drtovanje_in_sestavljanje_RNA_sestavov Organizacija znotrajceličnih reakcij z razumsko načrtovanimi RNA sestavi] (Urška Jelenovec)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biolo%C5%A1ko_vezje_na_osnovi_RNA-interference_za_identifikacijo_specifi%C4%8Dnih_rakavih_celic Biološko vezje na osnovi RNA-interference za identifikacijo specifičnih rakavih celic] (Gašper Marinšek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kontrola_hitrosti_translacije_preko_pomožnega_mesta_5’-UTR:_energijski_kompromis_med_dostopnostjo%2C_selektivnim_razvijanjem_RNA-struktur_in_drsenjem_30S_ribosomske_podenote_po_RNA-strukturah Kontrola hitrosti translacije preko pomožnega mesta 5’-UTR: energijski kompromis med dostopnostjo, selektivnim razvijanjem RNA-struktur in drsenjem 30S ribosomske podenote po RNA-strukturah] (Neža Koritnik)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Preoblikovanje_genskega_skupka_za_fiksacijo_dušika_bakterije_Klebsiella_oxytoca Preoblikovanje genskega skupka za fiksacijo dušika bakterije ''Klebsiella oxytoca''] (Gašper Virant)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Negativna_samoregulacija_linearizira_odziv_na_odmerek_in_zavira_heterogenost_genskega_izražanja Negativna samoregulacija linearizira odziv na odmerek in zavira heterogenost genskega izražanja] (Primož Tič)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 
[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Phactory:_proizvodnja_bakteriofagov_za_precizno_zdravljenje Phactory: proizvodnja bakteriofagov za precizno zdravljenje] (Rok Miklavčič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Canditect:_hitra_detekcija_vaginalne_infekcije_s_Candido_albicans_z_uporabo_sistema_CRISPR/dCas9 Canditect – hitra detekcija vaginalne infekcije s Candido albicans z uporabo sistema CRISPR/dCas9] (Jerneja Ovčar)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CAPOEIRA_-_razvoj_personaliziranega_cepiva_proti_raku_in_sistema_za_spremljanje_odziva_na_zdravljenje CAPOEIRA – razvoj personaliziranega cepiva proti raku in sistema za spremljanje odziva na zdravljenje] (Anamarija Habič)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Biotic_Blue_-_encimska_razgradnja_zdravilnih_u%C4%8Dinkovin_v_odpadnih_vodah#BIOTIC_BLUE BIOTIC BLUE - encimska razgradnja zdravilnih učinkovin v odpadnih vodah] (Tina Požun)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Of_CO2urse_-_sistem_za_zmanj%C5%A1evanje_izpustov_ogljikovega_dioksida_v_industriji Of CO2urse - sistem za zmanjševanje izpustov ogljikovega dioksida v industriji] (Kity Požek)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Cockroach_terminator Cockroach terminator]] (Roberta Mulac)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MiBiome_-_probioti%C4%8Dna_bakterija_za_zdravljenje_kroni%C4%8Dne_vnetne_%C4%8Drevesne_bolezni MiBiome - probiotična bakterija za zdravljenje kronične vnetne črevesne bolezni] (Ernest Šprager)

[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BioWatcher_pametna_ura_za_sledenje_ravni_biomarkerjev_za_bolezni BioWatcher: Pametna ura za sledenje ravni biomarkerjev za bolezni] (Nina Mavec)

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

----

Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

22.11. 
1 
2 Valentina Levak 

27.11. 
1 
2 
3 
4 

29.11. 
1 Matej Kolarič 
2 Špela Malenšek 
3 
4 

4.12. 
1 Gašper Žun 
2 Fran Krstanovic 
3 
4 

6.12. 
1 Urška Jelenovec 
2 Rok Miklavčič 
3 
4 

11.12. 
1 Jerneja Ovčar 
2 Neža Koritnik 
3 Gašper Virant 
4 Gašper Marinšek 

18.12. 
1 Tina Požun 
2 Anamarija Habič 
3 Roberta Mulac 
4 Kity Požek 

3.1. 
1 Nina Mavec 
2 Primož Tič 
3 Ernest Šprager 
4 

8.1. 
1 Marija Atanasova 
2 Bine Tršavec 
3 Peter Pečan 
4 Tjaša Sorčan 

10.1. 
1 Špela Koren 
2 Natalija Pucihar 
3 Karmen Žbogar 
4 Uroš Zavrtanik 

15.1. 
1 Jerneja Kocutar 
2 Blaž Lebar 
3 Tadej Satler 
4 Miha Koprivnikar Krajnc 

17.1. 
1 Milena Stojkovska 
2 Urška Kašnik

Seminarji SB 2018/19

2018-11-26T10:13:14Z

Nina Mavec:

Uravnavanje X-inaktivacije pri boleznih

2015-05-19T20:10:50Z

Nina Mavec: /* Bolezni, povezane z reaktivacijo kromosoma X v somatskih tkivih */

Naključna inaktivacija enega izmed X kromosomov (XCI) pri ženskah omogoči uravnavanje količine genov v primerjavi z moškimi, ki imajo le en X kromosom. To je seveda reguliran proces, vseeno pa se lahko v zvezi z njim zgodijo določene nepravilnosti, ki vplivajo na razvoj bolezni. Zaradi razlik med moškimi in ženskami je tudi razvoj bolezni, povezanih z X kromosomom močno odvisen od spola.
Ker imajo moški le en X kromosom, so podvrženi tako recesivnim kot dominantnim mutacijam zaradi prisotnosti le enega alela. Pri moških je tudi zelo problematično, če se pojavi podvojitev X genov, saj za razliko od žensk nimajo mehanizma za utišanje. Pri ženskah pa se zgodi, da se alel z mutacijo v približno polovici celic inaktivira, kar je velikokrat dovolj, da ne pride do kliničnih znakov bolezni. Lahko pa se zgodi tudi neenakomerna XCI, torej, da se v več celicah inaktivira isti X kromosom; to je lahko posledica inaktivacije, ki ni bila naključna, oziroma se zaradi naključnosti statistično zgodi. Posledica tega je lahko torej, da se mutacija izraža v večini celic in pride do bolezni ali pa se v večini celic ne izraža in se bolezen ne razvije (odvisno od tega, ali je mutacija, ki povzroča bolezen na tistem X kromosomu, ki se izraža v večini celic). Fenotipski znaki se razlikujejo tudi glede na to, kateri geni uidejo XCI. Lahko se namreč zgodi, da ravno mutiran gen uide XCI in se izraža, kar pa privede do bolezni. Pride pa lahko tudi no nenormalnega procesa reaktivacije X kromosoma v somatskih celicah, kar je prav tako lahko vzrok za bolezen.
==Prednostna inaktivacija enega izmed kromosomov X==
Prednostna inaktivacija kromosoma X pomeni, da v celici obstaja pot, ki vodi k temu, da se eden izmed para kromosomov X z večjo verjetnostjo inaktivira. Če gen pobegne inaktivaciji kromosoma X, bo prednostna inaktivacija le delno povrnila normalen fenotip. Za gene, ki so udeleženi pri inaktivaciji kromosoma X je zaščita pred delecijskimi učinki odvisna od stopnje prednostne inaktivacije enega od kormosomov X, ki je povezana z razširjenostjo celičnega izbora v posameznih tkivih. Na prednostno inaktivacijo vplivajo mutacija gena, ki nosi zapis za avtonomen ali za sekrecijski protein ter če je ta proteinski produkt drugače del multimernega kompleksa. Prednostna inaktivacija se lahko selektivno pojavi pojavi v celicah, kjer je izražanje normalnega alela ključno. Nivo prednostne inaktivacije je povezan tudi s starostjo in fazo razvoja celic. Napredna prednostna inaktivacija je občasno lahko tudi razlog za delecije pri odkritih mutacijah, kar se lahko pokaže pri avtoimunih boleznih pri ženskah. Prednostna inaktivacija ima pomembno vlogo tudi pri raku. Tak primer je ekspresija tumor supresorskega gena FoxP3, ki je spreminjajoča ravno zaradi prednostne inaktivacije kromosoma X.
==Mutacije na pobeglih genih==
Pobegli geni so tisti geni, ki se v ženski somatski celici izražajo bialelično – torej gre za podksupino genov na paru kromosomov X, kjer se prepisujeta obe kopiji tega gena. Mutacije, delecije in duplikacije pobeglih genov povzročajo veliko število različnih nepravilnosti in bolezni. Preoblikovalci kromatina lahko vplivajo na ekspresijo celotnega gena preko epigenetskih sprememb. Mutacije pobeglega gena KDM6A so vpletene v malignem možganskem tumorju, raku prostate in ledvic. KDM6A je gen, ki nosi zapis za histonsko demetilazo, ki interagira z encimom MLL2. Čeprav se KDM6A izogne inaktivaciji, obstaja vzorec prednostne inaktivacije kromosoma X, kjer se inaktivira tisti kromosom, ki smo mu izbrisali gen za KDM6A. Neločljivo povezan z mutacijo tega gena pa je tudi Kabukijev sindrom. Gre za sindrom povezan z prirojenimi nepravilnostmi in intelektualnimi nezmožnostmi. Različna mera vpliva na ženske, ki imajo dva različna alela za ta gen, je najverjetneje posledica nizke ekspresije gena iz običajnega alela, ki je na inaktiviranem kromosomu X. Osebe z Kabukijevim sindromom ne morejo imeti hkrati tudi Turnerjevega sindroma, kar kaže na to, da je monoalelno izražanje KDM6A dovolj učinkovito, da prepreči fenotip Turnerjevega sindroma. Izmed pobeglih genov je znan tudi t.i. KDM5C gen, ki je pomemben pri razvoju živčnih celic. Z mutacijo okvarjen gen vpliva sicer le na moške, kar kaže na to, da haploinsuficienca (ko ima diploidni organizem le eno funkcionalno kopijo gena) na ženskah pusti le blage posledice.
==Spolna kromosomska anevploidija==
Pri anevploidiji gre za variacije v številu kromosomov, pri kateri gre za neaktivnost enega ali več kromosomov, ali pa povečanje števila kromosomov.
Eden od poznanih sindromov je Klinefelterjev sindrom, pri katerem imajo osebe moškega spola kromosom odveč, sicer gre za dokaj pogost pojav, ki se pojavi na enega izmed 700 rojenih, vendar pa se ne deduje. Do tega sindroma pride, ker se spolni kromosomi pri mejozi I pri moškem oz. pri mejozi II pri ženski ne razdvajajo. Z višanjem starosti matere se povečuje možnost otroka, da bi dobil ta sindrom. Za take o, ki dobijo sindrom je fenotipsko značilno, da so zelo visoki, imajo široke boke in so skoraj ne poraščeni, so tudi mišično šibkejši pogosto neplodni in imajo psihološke motnje. Ta bolezen se drugače imenuje tudi 47XXY, ker imajo osebe s tem sindromom 47 kromosomov, obstajajo pa tudi osebki z 48, XXYY in 48, XXXY kromosomi, ali celo 49, XXXXY kromosomi, pri slednjem primeru gre za hudo oblike retardacije. Pri osebah z Klinefelterjevim sindromom poteka zdravljenje oz. uravnavanje bolezni v obliki testosteronske terapije pri kateri fantu v puberteti dodajajo hormon testosteron, ki mu omogoča spremembo telesa v puberteti, mutacijo glasu in pa poraščenost, ter povečanje spolovila. Poleg testosterona je pomembna tudi psihična podpora v puberteti in pa pomoč kirurga pri odstranjevanju tkiva dojk.
Drugi poznani sindrom pa je Turnerjev sindrom oz. tako imenovan X sindrom, pri katerem gre za celotno oz. delno odsotnost X kromosoma pri dekletih, zato pravimo, da gre za kromosomsko anomalijo. To je sicer bolj redek primer, vendar pa se pojavlja na povprečno vsako 2000 deklico. Za osebe s Turnerjevim sindromom je značilno, da so nizke rasti, imajo širok prstni koš, temne madeže po telesu in pa otečene noge, gležnje ter prste na rokah in nogah. Anomalija se kaže tudi pri razvijanju spolovil, spolnih organov, imajo tudi probleme z dihanjem oz. rebri ter žilami. Dosti otrok s tem sindromom v 99%, se rodi mrtvih ali pa še pred rojstvom pride do spontanega splava.
V večini primerov, se pravi več kot polovici, se zgubi oz. je ne aktiven celoten kromosom X, zaradi česar posledično pride do pojava kariotipa 45,X. Zdravljenje oz. uravnavanje posledic inaktiviranega kromosoma X, poteka z dodajanjem rastnega hormona v letih, ko se dekleta najbolj razvijajo, kar pomeni v zgodnji puberteti, če pa je napredek majhen se dodaja tudi androgen imenovan Oxandrin. Pri večini deklet poteka tudi estrogenska terapija, se pravi hormonska terapija, ki pa običajno poteka vse od pubertete pa do menopavze.
==Bolezni, povezane z reaktivacijo kromosoma X v somatskih tkivih==
Sprva je veljalo, da je lncRNA Xist ni nujen za vzdrževanje utišanja X kromosoma, vendar se je pri poskusih, kjer so odstranili Xist pokazalo, da ima to precejšnje posledice. V miših z odstranjenim Xist v krvi se je razvila oblika raka, ki naj bi bil posledica motenj v homeostatskih poteh zaradi povečanega izražanja genov z X kromosoma (kar se je očitno zgodilo zaradi odsotnosti Xist). Pokazalo pa se je tudi obratno; reaktivacija Xist v mišjih imunskih celicah je povzročila ponovno utišanje X kromosoma.
Tudi pri ljudeh so nepravilnosti pri XCI povezane z razvojem raka (na primer gen za encim OGT). Tudi pri avtoimunih boleznih se začenjajo odkrivati povezave z XCI. Primer take bolezni je lupus, h kateremu naj bi prispevale povišanje koncentracije proteinov, ki jih povzroči reaktivacija gena CD40LG, kar se zgodi zaradi hipometilacije. Ta bolezen je pogostejša pri ženskah, kar utrjuje vedno bolj raziskan sklep , da obstaja pomembna povezava med pogostostjo pojava avtoimunskih motenj pri ženskah in reaktivacijo genov na X kromosomu. Sicer pa je veliko raziskav usmerjenih tudi v pojav od starosti odvisne reaktivacije kromosoma X, saj je je vedno več raziskav, ki dokazujejo, da se reaktivacija kromosoma poveča v starejših osebkih.

==Viri==
*Deng, X., Berletch, J. B., Nguyen, D. K., Disteche, C. M. X chromosome regulation: diverse patterns in development, tissues and disease. Nature, 2014, letnik 15, str. 367-378.
*Medema, R. H. in Burgering, B. M. The X Factor: Skewing X Inactivation towards Cancer. Cell, 2007, letnik 129, str. 1253-1254.
*Lederer, D., Grisart, B., Digilio, M. C., Benoit, V., Crespin, M., Ghariani, S. C., Maystadt, I., Dallapiccola, B., Verellen-Dumoulin, C. Deletion of KDM6A, a Histone Demethylase Interacting with MLL2, in Three Patients with Kabuki Syndrome. The American Journal of Human Genetics, 2012, letnik 90, str. 119-124.
*Puck, Jennifer M., Willard, Huntington F. X Inactivation in Females with X-Linked Disease. The New England Journal of Medicine, 1998, letnik 338, str. 325-328.

BIO2 Seminar 2014

2014-11-04T21:07:31Z

Nina Mavec: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime Priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Tema*'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum oddaje'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum recenzije'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
|-
| Dominik Dekleva||12||[http://bit.ly/1xURyBR Aktivacija Gpcr-jev v povezavi z vodo]||Anja Tanšek||Inge Sotlar||Bine Tršavec||14.10.2014||21.10.2014||28.10.2014
|-
| Nuša Kelhar||12||[http://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674%2814%2900198-6 Soodvisnost oblike membrane in medceličnega sporočanja]||Monika Pepelnjak||Jerneja Ovčar||Enja Kokalj||14.10.2014||21.10.2014||28.10.2014
|-
| Tadej Ulčnik||12||[http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0105204 Različna dinamika in aktivnost dveh steroidnih receptorjev na istem promotorju]||Liza Otorepec ||Valentina Levak||Peter Pečan||14.10.2014||21.10.2014||28.10.2014
|-
| Marija Srnko||14-15||[http://www.croh-online.com/article/S1040-8428(14)00086-9/abstract Fosfofruktokinaza: Posrednik med glikolitičnim pretokom in razvojem tumorja]||Tomaž Žagar||Gašper Marinšek||Luka Dejanović||28.10.2014||2.11.2014||04.11.2014
|-
| Luka Lavrič||14-15||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000409002072 Glikoliza - Metabolizem v možganih]||Jerneja Kocutar||Urška Černe||Jernej Vidmar||28.10.2014||2.11.2014||04.11.2014
|-
| Naida Hajdarević||14-15||[http://www.nature.com/nature/journal/v510/n7506/full/nature13270.html Skrivnost metformina končno odkrita?]||Amadeja Lapornik||Živa Moravec||Inge Sotlar||28.10.2014||2.11.2014||04.11.2014
|-
| Vesna Podgrajšek||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1931312812003551 Mitohondrijski metabolizem je potreben za znotrajcelično rast toxoplasme gondii ]||Dominik Dekleva||Anja Tanšek||Jerneja Ovčar||28.10.2014||2.11.2014||04.11.2014
|-
| Katja Malovrh||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0047637405002460 Zmanjšanje aktivnosti encimov citratnega cikla s staranjem]||Nuša Kelhar||Monika Pepelnjak||Valentina Levak||28.10.2014||04.11.2014||11.11.2014
|-
| Primož Tič||16||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096719210002076 Primanjkljaj encima piruvat karboksilaze]||Tadej Ulčnik||Liza Otorepec ||Gašper Marinšek||28.10.2014||04.11.2014||11.11.2014
|-
| Urška Kašnik||17||[http://www.sciencedirect.com.nukweb.nuk.uni-lj.si/science/article/pii/S016378270800060X Transport maščobnih kislin skozi človeško placento]||Marija Srnko||Tomaž Žagar||Urška Černe||28.10.2014||04.11.2014||11.11.2014
|-
| Ernest Šprager||17||[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0300908413002812 Vloga nekaterih proteinov tankega črevesa pri tvorbi hilomikronov]||Luka Lavrič||Jerneja Kocutar||Živa Moravec||28.10.2014||04.11.2014||11.11.2014
|-
| Tjaša Sorčan||17||Moj izbrani naslov||Naida Hajdarević||Amadeja Lapornik||Anja Tanšek||04.11.2014||11.11.2014||18.11.2014
|-
| Nina Mavec||18||[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23090118 Katabolizem triptofana in rak]||Vesna Podgrajšek||Dominik Dekleva||Monika Pepelnjak||04.11.2014||11.11.2014||18.11.2014
|-
| Bine Tršavec||18||Moj izbrani naslov||Katja Malovrh||Nuša Kelhar||Liza Otorepec ||04.11.2014||11.11.2014||18.11.2014
|-
| Enja Kokalj||18||[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23109059 Toksičnost amonijaka za možgane]||Primož Tič||Tadej Ulčnik||Tomaž Žagar||04.11.2014||11.11.2014||18.11.2014
|-
| Peter Pečan||19||Moj izbrani naslov||Urška Kašnik||Marija Srnko||Jerneja Kocutar||11.11.2014||18.11.2014||25.11.2014
|-
| Luka Dejanović||19||Moj izbrani naslov||Ernest Šprager||Luka Lavrič||Amadeja Lapornik||11.11.2014||18.11.2014||25.11.2014
|-
| Jernej Vidmar||19||Moj izbrani naslov||Tjaša Sorčan||Naida Hajdarević||Dominik Dekleva||11.11.2014||18.11.2014||25.11.2014
|-
| Inge Sotlar||20||Moj izbrani naslov||Nina Mavec||Vesna Podgrajšek||Nuša Kelhar||11.11.2014||18.11.2014||25.11.2014
|-
| Jerneja Ovčar||20||Moj izbrani naslov||Bine Tršavec||Katja Malovrh||Tadej Ulčnik||25.11.2014||02.12.2014||09.12.2014
|-
| Valentina Levak||20||Moj izbrani naslov||Enja Kokalj||Primož Tič||Marija Srnko||25.11.2014||02.12.2014||09.12.2014
|-
| Gašper Marinšek||21||Moj izbrani naslov||Peter Pečan||Urška Kašnik||Luka Lavrič||25.11.2014||02.12.2014||09.12.2014
|-
| Urška Černe||21||Moj izbrani naslov||Luka Dejanović||Ernest Šprager||Naida Hajdarević||25.11.2014||02.12.2014||09.12.2014
|-
| Živa Moravec||21||Moj izbrani naslov||Jernej Vidmar||Tjaša Sorčan||Vesna Podgrajšek||02.12.2014||09.12.2014||16.12.2014
|-
| Anja Tanšek||22||Moj izbrani naslov||Inge Sotlar||Nina Mavec||Katja Malovrh||02.12.2014||09.12.2014||16.12.2014
|-
| Monika Pepelnjak||22||Moj izbrani naslov||Jerneja Ovčar||Bine Tršavec||Primož Tič||02.12.2014||09.12.2014||16.12.2014
|-
| Liza Otorepec ||22||Moj izbrani naslov||Valentina Levak||Enja Kokalj||Urška Kašnik||02.12.2014||09.12.2014||16.12.2014
|-
| Tomaž Žagar||23||Moj izbrani naslov||Gašper Marinšek||Peter Pečan||Ernest Šprager||23.12.2014||03.01.2015||06.01.2015
|-
| Jerneja Kocutar||23||Moj izbrani naslov||Urška Černe||Luka Dejanović||Tjaša Sorčan||23.12.2014||03.01.2015||06.01.2015
|-
| Amadeja Lapornik||23||Moj izbrani naslov||Živa Moravec||Jernej Vidmar||Nina Mavec||23.12.2014||03.01.2015||06.01.2015
|-
| ||||||||||||03.01.2014||06.01.2014||13.01.2015
|}

*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo!

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2014|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-9 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi; važno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed), vsebovati mora najmanj tri slike. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 25 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja.
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar, tako da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/19bnx0Yh4RIuC2Kzkdaa8t8WqRTBgXYNTV_IWfjrO0W4/viewform?usp=send_form mnenje] najkasneje v sedmih dneh po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Povzetki seminarjev 2014

2014-11-04T21:05:59Z

Nina Mavec: /* Biokemija- Povzetki seminarjev 2014/2015 */

== Biokemija- Povzetki seminarjev 2014/2015 ==
Nazaj na osnovno [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Seminar_2014 stran]

=== Tadej Ulčnik: Različna dinamika in aktivnost dveh steroidnih receptorjev na istem promotorju ===

Transkripcijski faktorji so proteini, ki se specifično vežejo na DNA ter s tem omogočijo vezavo RNA polimeraze. Delujejo kot regulatorji izražanja genov. Primer transkripcijskih faktorjev so jedrni steroidni receptorji. Steroidni receptorji se nahajajo v citosolu in se aktivirajo ob vezavi steroidnih hormonov. Določeni vsebujejo med sabo podobno domeno, s katero se lahko več različnih receptorjev veže na isto zaporedje na promotorju. Še vedno ni znano kaj vse vpliva na potek translacije, tudi sami mehanizmi delovanja ostajajo še skrivnost. Primerjava aktivnosti in dinamike dveh podobnih steroidnih receptorjev, androgenega in glukokortikoidnega, ki imata v celici vlogo transkripcijskih faktorjev, je pokazala, da čeprav sta si receptorja podobna, to ne velja za njuno delovanje. Na promotorju nista bila ves čas prisotna v enaki količini, tudi količina prepisanega gena je bila različna. Ob dodatku inhibitorjev sta ta različno uspešno preprečevala transkripcijo, kar se je poznalo pri številu vezanih polimeraz in pri količini prepisanih mRNA. Za ta konkretni primer je bilo dokazano, da čeprav sta oba receptorja vplivala na izražanje gena, nista delovala na enak način in v enaki meri. Kaj vse je vplivalo na to je težko določiti, tako da to ostaja predmet nadaljnjih raziskav.

=== Dominik Dekleva: Aktivacija GPCR-jev v povezavi z vodo ===

Pomanjkljivosti do sedaj znanih metod za preučevanje proteinov, kot sta NMR- spektroskopija in rentgenska difrakcija, se kažejo, med drugim, pri preučevanju različnih proteinov in receptorjev, udeleženih v biosignalnih poti na atomarnem nivoju. Statične strukture nam ne povedo veliko o reorganizaciji vezi in dinamiki spreminjajočih se interakcij v proteinih, ki so ključne pri signalizacijskih poteh v celicah. Z uporabo nove metode, molekularnih dinamičnih (MD) simulacij, za katero stoji precej statistične matematike, lahko modele makromolekul opazujemo na atomarnem nivoju ter v mikrosekundnem časovnem oknu. Uporabnost omenjene metode se je dobro obnesla tudi v primeru švicarskih znanstvenikov iz Ecole Polytechnique Federale de Lausanne, ki so preiskovali vlogo vode pri aktivaciji treh prototipskih GPCR-jev: adenozin A2A R, β2-adrenergični receptor in rodopsin, kar bom povzel v nadaljevanju. Dokazali so, da se z vezavo liganda znotraj sedmih α-vijačnic GPCR vzpostavi urejen vodni tunel, ki močno vpliva na spremembo konformacije proteina GPCR-ja, ki se zgodi zaradi reorganizacije številnih vodikovih vezi v notranjosti proteina GPCR. Ob vezavi liganda na molekulo GPCR se torej ustvari vodni tunel v molekuli, kar omogoča nadaljnjo signalizacijo in ustrezen odziv celice na primarni sporočevalec.

=== Nuša Kelhar: Soodvisnost oblike membrane in medceličnega sporočanja ===
Celična membrana ali plazmalema je nekakšen ovoj celice, ki služi predvsem kot selektivna pregrada med celično zunanjostjo in notranjostjo. Sestavljena je iz lipidnega dvosloja in številnih proteinov, ki so povezani z membrano ali so vezani nanjo. Celične membrane se stalno spreminjajo zaradi odcepljanja in zlivanja veziklov ter zaradi interakcij z dinamičnim citoskeletom. Površina in oblika membrane močno vplivata na učinkovitost njene signalne aktivnosti. Ker reakcije pri prenosu signalov vključujejo tudi membranske komponente in vplivajo na citoskeletsko dinamiko, se s tem spreminja oblika membrane in oblika celice. Če poznamo odvisnost signalizacije od teh mehanizmov lahko že iz oblike celice napovemo, kakšne signale je prenesla ali prejela pred kratkim in prepoznamo nekatere znake nepravilnega delovanja signalnih poti, kar je pomembno pri identifikaciji rakavih celic in zdravljenju. Pomembni mehanizmi, s katerimi membrana sodeluje pri sporočanju so redukcija dimenzij, kjer se spremeni prostor gibanja delcev, ukrivljanje zaradi prostorskih gradientov receptorjev, kjer se receptorji združujejo na membranskih izboklinah in nato lateralno prehajajo, in sodelovanje s citoskeletom, ki izbokline stabilizira in omogoča, da delujejo kot nekakšna tipala. Pogledali si bomo tudi primere delovanja nekaterih načinov sporočanja med celicami in reakcije na določene signale, nekaj pa bomo povedali še o tem, kako njihovo nepravilno delovanje vpliva na razvoj rakavih celic.

=== Luka Lavrič: Glikoliza - Metabolizem v možganih ===
V svoji seminarski nalogi, sem se osredotočil na metabolizem v možganih. Za osnovni članek, sem si izbral temo, ki preučuje kakšni so vplivi na nevrone in astrocite, živčne celice, ki se nahajajo v možganih. Opisal sem raziskave in odzive astrocitov in nevronov na dušikov oksid, ki so jih izvedli na miših. Zaradi dušikovega oksida pride do zaviranja mitohondričnega dihanja, zaradi katerega nevroni hitro umrejo, medtem, ko astrociti izkoriščajo glikolizo-tipično-generirano ATP za povečanje svoje potencialne mitohondrijske membrane, s čimer postajajo vse bolj odporni na pro-apoptotične dražljaje. Nevroni ne morejo povečati glikolize zaradi pomanjkanja aktivnosti-glikolizne spodbude encima 6-fosfofrukto-2-kinaza / fruktoza 2,6-bisfosfatna izooblika 3 (PFKFB3), ki je pomemben za aktivacijo 6-fosfofrukto-1-kinaze (PFK1), ki je glavni regluator glikolize. V nevronih, se PFKFB3 neprestano razgrajuje preko E3 ubikvitin ligaze, ki spodbuja kompleksne/cyclosome (APC / C) - CDH1. Metabolizem glukoze v nevronih je usmerjen predvsem po poti pentoze-fosfata, ki vodi do regeneracije glutationa, ki je za nas zelo pomemben. Regulacija aktivnosti PFKFB3 s APC/C-CDH1 sistemom proteasoma je pomembna za razumevanje presnove glukoze, bioenergetsko oskrbo in po možnosti odziva na stres v delujočih možganih. Pri nevronih je visoka aktivnost regulatornega sistema APC/C-CDH1 vključena v preusmeritev presnove glukoze v smeri regeneracije reduciranega glutationa.

=== Primož Tič: Primanjkljaj encima piruvat karboksilaze ===
Citratni cikel je pomemben člen metabolizma, saj njegovi intermediati vstopajo v mnoge anabolne poti. Zato so vsakršne napake v njegovem delovanju lahko usodne za organizem. Zelo pomemben encim citratnega cikla je piruvat karboksilaza, ki spremeni piruvat v oksaloacetat. Oksaloacetat je pomemben intermediat, saj lahko vstopi npr. v cikel glukoneogeneze in tako prepreči laktatno acidozo, ki je skupni simptom te metabolne okvare. Ker je cilj metabolizma proizvodnja energije v obliki molekul ATP, se celica na moteno delovanje metabolizma odzove s senzornimi proteini AMPK (''AMP-activated protein kinase''). Proteini spodbudijo katabolne procese, kjer nastajajo molekule ATP in zavirajo neesencialne anabolne procese, kjer se ATP porablja. Obratno deluje protein mTOR (''mammalian target of rapamycin''), ki spodbuja sintezo maščobnih kislin, proteinov in ogljikovih hidratov. Poznamo tri tipe bolezni: tip A, tip B in tip C. Najhujša oblika je tip B, kjer oseba umre v roku treh mesecev po rojstvu. Zaenkrat se bolezen še ne da zdraviti, jo pa lahko blažimo npr. z anaplerotično dieto. Anaplerotične reackije nadomeščajo intermediate npr. v citratnem ciklu, ko jih je malo. Anaplerotična dieta izkorišča alternativne intermediate, ki lahko zaobidejo nedelujoče encime in poteka metabolizem normalno. Tako se vsaj približno vzpostavi homeostaza celice. Primer takšnega intermediata je triglicerid triheptanoin, ki se lahko vključi v citratni cikel. V prihodnosti bi lahko takšne in podobne okvare zdravili z gensko terapijo.

=== Naida Hajdarević: Skrivnost metformina končno odkrita? ===
Metformin je eno najučinkovitejših zdravil za zdravljenje diabetesa tipa 2, saj zmanjša hepatično glukoneogenezo brez povečanja izločanja inzulina, povečanja telesne teže ali tveganja za razvoj hipoglikemije. Kljub temu, da se pacientom z diabetesom tipa 2 predpisuje že več kot pol stoletja, je njegov mehanizem delovanja prava uganka.
Raziskav na to temo je malo morje, z vsako so bili znanstveniki korak bližje odkritju skrivnosti metformina. Tako so leta 2000 v eni izmed raziskav prišli do prvega pravega zaključka: terapija z metforminom pri diabetikih zniža stopnjo proizvodnje glukoze preko inhibicije glukoneogeneze. Odgovoru, kako metformin inhibira glukoneogenezo, je bila bližje naslednja skupina raziskovalcev, ki je ugotovila, da je primarno mesto njegovega delovanja preko direktne inhibicije kompleksa I dihalne verige. Tako smo korak za korakom prišli do zadnjih raziskav, ki so mehanizem delovanja metformina razložile še natančneje – pokazale so, da metformin nekompetativno inhibira encim glicerol-3-fosfat dehidrogenazo, kar zmanjša pretvorbo laktata in glicerola ter zmanjša hepatično glukoneogenezo.

=== Marija Srnko: Fosfofruktokinaza: Posrednik med glikolitičnim pretokom in razvojem tumorja ===

Rak-bolezen sodobne družbe. V večini primerov se njegova rast prične iz neznanih vzrokov. Neznan dražljaj v telesu sproži spremembe v genih in kot posledica se pojavi nenadzorovana in hitra rast spremenjenih celic. Določen delež obolenj pa je tudi dedno pogojen. Torej se mutacija genov prenaša iz generacije v generacijo. Že samo zdrav življenjski slog pa lahko pripomore k manjšemu tveganju za njegov razvoj. S hitrejšo rastjo oziroma poliferacijo celic pa pride do sprememba v metabolizmu. Bistvena razlika v primerjavi z metabolizmom normalnih celic je povečana potreba po glukozi. Kar bi lahko povezali s povečano potrebo makromolekul, potrebnih za pospešeno rast celic. Dosedanje najučinkovitejše zdravljenje temelji na kemoterapiji. Vendar si znanstveniki prizadevajo odkritje za organizem manj škodljivih snovi in procesov zdravljenja. V dani nalogi sem se posvetila zbiranju podatkov iz raziskav, ki temeljijo na inhibiranju glikoliznih reakcij. Izpostaviti sem žele encime oz reakcija na katerih je bilo do sedaj izvedenih največ poskusov in dejansko pomujajo možnosti za razvoj pacientu prijaznejšega zdravljenja. Zanimalo me je kakšen vpliv bi imela redukcija določenih reakcij na druga tkiva. Nekaj pozornosti pa sem namenila tudi razvoju nanotehnologije, ki bo kljub odkritju mehanizma inhibicije igrala pomembno vlogo pri transportu substratov do prizadetega tkiva.

=== Vesna Podgrajšek: Mitohondrijski metabolizem je potreben za znotrajcelično rast toxoplasme gondii ===
Toxoplasma gondii je znotrajcelična pražival in povzroča bolezen toksoplazmozo. Toxoplasma gondii pospešeno raste znotraj gostiteljevih vakuol, kjer se za svojo rast in replikacijo zanaša na gostiteljev ogljik in hranila. Ena izmed oblik parazita je tahizoit, kateri so se sposobni razmnoževati in napadati v vsakršni gostiteljski celici z jedrom. Proučevali in primerjali so metabolno pot ogljika v znotrajcelični in sproščeni oz. zunajcelični stopnji parazita. Ugotovili so, da toxoplasma gondii v znotrajcelični stopnji, aktivno katabolizira gostiteljevo glukozo preko cikla citronske kisline (TCA). Te stopnje tudi katabolizirajo glutamin preko TCA cikla in poti γ-aminobuturične kisline (GABA), ki generira molekule, ki vstopijo v TCA cikel. Mehanizem preoblikovanja piruvata v acetil-CoA še obstaja nepojasnjen, saj jim manjka PDH kompleks, ki povezuje glikolizo s TCA ciklom. Kemiča inhibicija (NaFAc) TCA cikla popolnoma prepreči znotrajcelično replikacijo parazita, kar pomeni da je potrebna popolna aktivnost TCA cikla. Paraziti, ki jim manjka GABA pot, imajo zavrto rast in niso sposobni ohraniti drsno motiliteto pod razmerami, kjer so hranila omejena (npr. zunaj celice), kar nakazuje, da ima GABA funkcijo kratkotrajne rezerve energije. Zatorej ima toxoplasma gondii tahizoiti metabolno fleksebilnost, ki najverjetneje dovoljuje zajedalcem inficiranje različnih tipov celic.

=== Ernest Šprager: Vloga nekaterih proteinov tankega črevesa pri tvorbi hilomikronov ===
Z razgradnjo maščob, ki predstavljajo estre glicerola in treh maščobnih kislin, pridobimo do 40 % vse energije. Maščobne kisline se, preden vstopijo v celice tankega črevesa, protonirajo in s tem postanejo nepolarne. Kljub temu, da se jih večina absorbira kar s pasivno difuzijo, membrane celic tankega črevesa vsebuje ogromno proteinov, ki imajo zelo različne funkcije. Nekateri med njimi olajšajo pasivno difuzijo preko ohranjanja kontracijskega gradienta maščobnih kislin, spet drugi uravnavajo število in velikost hilomikronov, s katerimi se maščobe prenesejo iz tankega črevesa v kri. Za nastanek hilomikrona se morajo v lumnu endoplazemskega retikuluma s pomočjo mikrosomalnega triglicerid transfer proteina okoli apolipoproteinskega jedra povezati triacilgliceridi skupaj z fosfolipidi. Celotna pot maščob od njihove absorbcije v tankem črevesu do sprostitve iz hilomikronov je natančno regulirana. Pomembno vlogo ima protein CD36, ki med drugim deluje kot nekakšen senzor, ki sporoča celicam količino maščob v tankem črevesu. Signalizacija deluje tako, da lahko CD36, kadar je povezan k maščobno kislino, fosforilira ostale encime, ti pa nato lahko vplivajo število hilomikronov, njihovo velikost in s tem tudi količino triacilgliceridov. Prav povišana količina triacilgliceridov v krvi je povezana z kardiovaskularnimi boleznimi, odpornostjo na inzulin in debelost, zato je boljše razumevanje sprejema maščob in njihovo pakiranje v hilomikrone pomembno.

=== Katja Malovrh: Zmanjšanje aktivnosti encimov citratnega cikla s staranjem ===
Citratni cikel je niz kemijskih reakcij, ki v aerobnih organizmih potekajo v mitohondrijih. Cikel je na prvem mestu reguliran s količino piruvata, pretvorjenega v Acetil-CoA, ki vanj lahko vstopi. V nadaljevanju procesa pa pri regulaciji sodelujejo tudi številni encimi, ki pretvarjajo intermediate iz ene oblike v drugo. Tako striktna regulacija procesa je izrednega pomena, saj bi brez nje lahko prišlo do prekomerne sinteze ATP, kar bi povzročilo velike izgube energije in mnoge zdravju škodljive spremembe. Kako pa se encimi citratnega cikla spreminjajo s staranjem? Raziskovalci so ugotovili, da se škoda, povzročena s strani prostih radikalov, ki nastajajo kot stranski produkti številnih reakcij, s staranjem močno povečuje. Škodljivi radikali povzročajo poškodbe vsepovsod v celici, najobičajnejša tarča pa so mitohondriji. Mitohondrijska DNA, ki prosto plava po matriksu je zaradi nezaščitenosti dovzetna za številne napade radikalov, ki povzročajo mutacije. Pri translaciji tako dobimo napačno zaporedje na mRNA, posledično nastajajo neaktivni oziroma predrugačeni proteini, ki ne opravljajo svojih nalog. V raziskavi, so znanstveniki ugotavljali če se kateri od encimov, vključenih v citratni cikel s staranjem spremeni, kako se spremeni in kakšne škodljive posledice imajo take spremembe za živi organizem. Ugotovili so, da se encimi spremenijo, da to povzroči nepopolno delovanje citratnega cikla in posledično slabšo proizvodnjo intermediatov, ki so za celice vitalnega pomena.

=== Urška Kašnik: Transport maščobnih kislin skozi človeško placento ===
Esencialne maščobne kisline in njihovi derivati dolgih verig večkrat nenasičenih maščobnih kislin (20c) kot sta dokosaheksaenoična kislina (DHA) in arahidonska kislina so bistvenega pomena za pravilno rast in razvoj zarodka. Vnos s hrano kot tudi presnova teh maščobnih kislin, ter njihov nadaljnji prenos iz matere na plod so zato pomembni rekviziti za razvoj plodu. Posteljica je ključni organ, prek katerega hranilne snovi, kot so te maščobne kisline, odtekajo iz matere na plod. Celični privzem (cellular uptake) in translokacija dolgih verig maščobnih kislin (LCFAs) v različnih tkivih se doseže s povezavo soobstoječih mehanizmov. Čeprav lahko LCFA vstopi v celico s pasivno difuzijo, nastajajoča poročila kažejo, da je vnos LCFA nadzorovan z membranskimi transportnimi/vezavnimi proteini kot so maščobnokislinska translokaza (FAT/CD36), plazmatski maščobnokislinski povezovalni protein (FABPpm), maščobnokislinski transportni protein (FATP) in znotrajcelični FABPs v številnih tkivih vključno z človeško posteljico. Za z maščobnimi kislinami aktivirane transkripcijske faktorje (PPARs, LXR, RXR in SREBP-1) je bilo pokazano, da regulirajo te maščobnokislinske transportne/povezovalne proteine in funkcije posteljice. Materinske maščobne kisline lahko tako morda same uravnavajo svoj transport skozi posteljico, kakor tudi funkcije posteljice preko z maščobnimi kislinami aktiviranih transkripcijskih faktorjev. V svoji seminarski nalogi sem povzela nedavni razvoj na področju transporta in metabolizma maščobnih kislin posteljice in vlogo regulacije omenjenih proteinov v teh procesih.

=== Bine Tršavec: Odkritja o zgradbi in delovanju glutamat dehidrogenaze ===
Glutamat dehidrogenaza (GDH) je eden izmed encimov potrebnih pri metabolizmu aminokislin. Kot nam pove ime, je njegova naloga, da dehidrogenira glutamat, kar vodi do oksidativne deaminacije glutamata v α-ketoglutarat. Brez encima ta reakcija ne bi potekala, ker je sprememba gibbsonove proste energije za reakcijo pozitivna. α-ketoglutarat se potem prenese v Krebsov cikel, kjer se na koncu pretvori v energijo v obliki ATP. Encim je prisoten pri vseh živih bitjih, saj omogoča povezavo med razgradnjo aminokislin in energijskimi potrebami celice. Zaradi različnih potreb po regulaciji obstaja več vrst tega encima. Zaradi njene naloge se glutamat dehidrogenaza pri evkariontih nahaja v mitohondrijih (kjer poteka tudi Krebsov cikel), v manjši količini pa tudi v endoplazmatskem retiklu (kjer se sintetizira). Lokacija v celici je bila dokazana z vezavo GFP-ja. V nekaterih primerih lahko predstavlja kar 10% vseh mitohondrijskih proteinov. Regulacija encima je zelo kompleksna. Nanj delujejo številni alostreični regulatorji, ki z vezavo naredijo mehanske ovire in zmanjšajo njegovo aktivnost. Najnovejše raziskave dokazujejo, da pri tem pomagajo tudi sirtuini. Dolga leta so znanstveniki preučevali natančno zgradbo in delovanje GDH, ter pri tem naleteli na kar nekaj težav. Po 50 letih raziskav tako boljše razumemo pomen in evolucijski razvoj tega pomembnega encima. V mojem seminarju sem se osredotočil na zgradbo in reguliranje encima.

=== Nina Mavec: Katabolizem triptofana in rak ===
Ker je rak v sodobnem svetu ena izmed bolezni, ki povzročijo največ smrti, se v zadnjem času izvaja vse več raziskav o samih vzrokih in mehanizmih za nastanek te nevarne bolezni v upanju, da bi s pomočjo ugotovitev lahko razvili, nove, boljše metode zdravljenja. Že nekaj časa je znano, da metabolizem triptofana vpliva na rast in maligni razvoj tumorjev, tako da oslabi imunski odziv celice. Pri katabolizmu te esencialne aminokisline je pomembna kinureninska pot, preko katere se katalizira večina triptofana, nastajajo pa razni metaboliti, med katerimi je tudi kinurenin. Obstajajo trije encimi, ki katalizirajo prvo stopnjo te reakcije, to so indolamin 2,3-dioksigenaza (IDO), triptofan 2,3-dioksigenaza (TDO) in indolamin 2,3-dioksigenaza 2 (IDO2). Ob povečanem katabolizmu triptofana v tumorskem tkivu se vzpostavi imunosupresivno okolje, ki tumorjem omogoča, da se izognejo imunskemu odzivu organizma. To se zgodi preko dveh mehanizmov, ki pa oba prispevata k vzpostavitvi take imunosupresije. Zmanjšana količina triptofana preko protein-kinaze GCN2 povzroči apoptozo limfocitov T. Več kinurenina, ki pri katabolizmu triptofana nastaja, pa preko transkripcijskega faktorja AhR povzroči diferenciacijo regulatornih limfocitov T, ki tumorju omogočajo imunsko toleranco. Inhibitorji teh treh encimov, ki omogočajo katabolizem triptofana, so torej privlačno potencialno zdravilo in raziskave v tej smeri že potekajo.

TBK2014-seminar

2014-05-13T12:21:42Z

Nina Mavec: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič in so na urniku vsak ponedeljek od 11:00 do 12:30. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prištejeh končnipisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.

== Seznam seminarjev ==
{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Črt Kovač||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#.C4.8Crt_Kova.C4.8D:_Naslov_v_sloven.C5.A1.C4.8Dini Naslov]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2013/06/130627142551.htm link]||03.03.||06.03.||10.03.||Liza Otorepec||Marija Srnko||Luka Dejanović
|-
| Bine Tršavec||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Bine_Tršavec:_Stikalo,_ki_pove,_da_je_čas_za_spanje Stikalo, ki pove, da je čas za spanje]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/02/140219124730.htm Povezava]||03.03.||06.03.||10.03.||Naida Hajdarević||Eva Škrjanec||Katja Malovrh
|-
| Jernej Vidmar||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Jernej_Vidmar:_Boljša_slikovna_obdelava_z_nanozamrzovanjem Boljša slikovna obdelava z nanozamrzovanjem]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/02/140226133000.htm Povezava]||03.03.||06.03.||10.03.||Nuša Kelhar||Vesna Podgrajšek||Nina Mavec
|-
| Ernest Šprager||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Ernest_Sprager:_ Doslej najuspešnejše utišanje genov v jetrih z RNA interferenco po zaslugi novih nanodelcev]||[http://www.pnas.org/content/early/2014/02/06/1322937111.full.pdf+html Povezava]||03.03.||06.03.||10.03.||Tamara Božič||Nives Mikešić||Ana Kompan
|-
| Andrej Žulič|| [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Andrej_.C5.BDuli.C4.8D:_Prva_umetna_celica_z_delujo.C4.8Dimi_organeli Prva umetna celica z delujočimi organeli] || [http://www.sciencedaily.com/releases/2014/01/140114091707.htm Povezava] ||10.03.||13.03.||17.03.||Črt Kovač||Liza Otorepec||Marija Srnko
|-
| Urška Černe||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Ur.C5.A1ka_.C4.8Cerne:_Boj_imunskega_sistema_proti_malariji Boj imunskega sistema proti malariji]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/01/140113154225.htm Povezava]||10.03.||13.03.||17.03.||Bine Tršavec||Naida Hajdarević||Eva Škrjanec
|-
| Tadej Ulčnik||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Tadej_Ul.C4.8Dnik:_Prisotnost_proteinov_UCP_dolo.C4.8Da_metabolizem_celice Prisotnost proteinov UCP določa metabolizem celice] ||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/03/140304071208.htm Povezava]||10.03.||13.03.||17.03.||Jernej Vidmar||Nuša Kelhar||Vesna Podgrajšek
|-
| Jerneja Kocutar||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Jerneja_Kocutar:_Odziv_celic_na_stresne_situacije Odziv celic na stresne situacije]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/02/140228103435.htm Povezava]||10.03.||13.03.||17.03.||Ernest Šprager||Tamara Božič||Nives Mikešić
|-
| Hrvoje Malkoč||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Hrvoje_Malkoč:_Adsorbcija_mielinskega_bazičnega_proteina_na_membrane_mielinskih_lipidnih_dvoslojev Adsorbcija mielinskega bazičnega proteina na membrane mielinskih lipidnih dvoslojev]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/02/140225143937.htm Povezava]||17.03.||20.03.||24.03.||Andrej Žulič||Črt Kovač||Liza Otorepec
|-
| Janja Krapež||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Janja_Krape.C5.BE:_Nanopore_omogo.C4.8Dajo_transport_DNA_skozi_membrane Nanopore omogočajo transport DNA skozi membrane]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2013/10/131023090540.htm Povezava]||17.03.||20.03.||24.03.||Urška Černe||Bine Tršavec||Naida Hajdarević
|-
| Inge Sotlar||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Inge_Sotlar:_CPEB_proteini_oblikujejo_dolgoročni_spomin CPEB proteini oblikujejo dolgoročni spomin]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/02/140211174613.htm Povezava]||24.03.||27.03.||31.03.||Tadej Ulčnik||Jernej Vidmar||Nuša Kelhar
|-
| Monika Pepelnjak||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Monika_Pepelnjak:_Odpornost_tumorjev_na_kemoterapijo Odpornost tumorjev na kemoterapijo]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2013/12/131202094320.htm Povezava]||24.03.||27.03.||31.03.||Jerneja Kocutar||Ernest Šprager||Tamara Božič
|-
| Jerneja Ovčar||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Jerneja_Ov.C4.8Dar:_Vztrajno_zavezujo.C4.8D_mehanizem_za_vizualni_nadzor_gibanja Vztrajno zavezujoč mehanizem za vizualni nadzor gibanja]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/03/140313123139.htm Povezava]||24.03.||27.03.||31.03.||Hrvoje Malkoč||Andrej Žulič||Črt Kovač
|-
| Anja Tanšek||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Anja_Tan.C5.A1ek:_Potrditev_klju.C4.8Dne_beljakovine_odgovorne_za_razre.C5.A1itev_skrivnosti_mitoze Potrditev ključne beljakovine odgovorne za razrešitev skrivnosti mitoze]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/02/140218101018.htm Povezava]||24.03.||27.03.||31.03.||Janja Krapež||Urška Černe||Bine Tršavec
|-
| ||||||24.03.||27.03.||31.03.||Inge Sotlar||Tadej Ulčnik||Jernej Vidmar
|-
| Angela Mihajloska||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Angela_Mihajloska:_Proteine.2Cki_so_odkriti_v_gonoreje_lahko_ponudijo_novi_pristop_k_zdravljenju Proteine ki so odkriti v gonoreje lahko ponudijo novi pristop k zdravljenju]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/03/140331131010.htm Povezava]||31.03.||03.04.||07.04.||Monika Pepelnjak||Jerneja Kocutar||Ernest Šprager
|-
| Božin Krstanoski||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Božin_Krstanoski:_Uporaba_bakterij_pri_naftnih_razlitjih Uporaba bakterij pri naftnih razlitjih]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/03/140310090615.htm Povezava]||31.03.||03.04.||07.04.||Jerneja Ovčar||Hrvoje Malkoč||Andrej Žulič
|-
| Domagoj Majić||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Domagoj_Maji.C4.87:_Low_vitamin_D_levels_raise_anemia_risk_in_children Low vitamin D levels raise anemia risk in children]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2013/10/131021155625.htm Povezava]||31.03.||03.04.||07.04.||Anja Tanšek||Janja Krapež||Urška Černe
|-
| Amadeja Lapornik||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Amadeja_Lapornik:_Nanodelci,_ki_omogočajo_zgodnje_odkrivanje_krvnih_strdkov Nanodelci, ki omogočajo zgodnje odkrivanje krvnih strdkov]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2013/10/131016123038.htm Povezava]||31.03.||03.04.||07.04.||Anja Šantl||Inge Sotlar||Tadej Ulčnik
|-
| Peter Pečan|| [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Peter_Pe.C4.8Dan:_Reprogramiranje_ko.C5.BEnih_celic_v_sr.C4.8Dne, Reprogramiranje kožnih celic v srčne]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/02/140220132202.htm Povezava]||07.04.||10.04.||14.04.||Angela Mihajloska||Monika Pepelnjak||Jerneja Kocutar
|-
| Živa Moravec|| [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#.C5.BDiva_Moravec:_Klju.C4.8Den_korak_naprej_pri_tiskanju_3D_tkiv, Ključen korak naprej pri tiskanju 3D tkiv]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/02/140219095501.htm Povezava]||07.04.||10.04.||14.04.||Božin Krstanoski||Jerneja Ovčar||Hrvoje Malkoč
|-
| Tjaša Sorčan||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Tja.C5.A1a_Sor.C4.8Dan:_Posamezni_Iks_kanali_na_povr.C5.A1ini_sr.C4.8Dnih_celic_sesalcev_vsebujejo_dve_KCNE1_podenoti, Posamezni Iks kanali na površini celic sesalcev vsebujejo dve KCNE1 podenoti]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/03/140304141740.htm Povezava]||21.04.||24.04.||05.05.||Domagoj Majić||Anja Tanšek||Janja Krapež
|-
| Tomaž Žagar|| [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Toma.C5.BE_.C5.BDagar:_Klju.C4.8Dna_proteina_pri_uravnavanju_celi.C4.8Dne_smrti Ključna proteina pri uravnavanju celične smrti]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/03/140327140059.htm Povezava]||21.04.||24.04.||05.05.||Amadeja Lapornik||Anja Šantl||Inge Sotlar
|-
| Fran Krstanović|| [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Fran_Krstanovi.C4.87:_Breast_milk_protein_may_be_key_to_protecting_babies_from_HIV Breast milk protein may be key to protecting babies from HIV] ||[http://www.sciencedaily.com/releases/2013/10/131021153200.htm Povezava]||21.04.||24.04.||05.05.||Peter Pečan||Angela Mihajloska||Monika Pepelnjak
|-
| Jure Zadravec|| [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Jure_Zadravec:_Vloga_tumorskih_ozna.C4.8Devalcev_CA19-9.2C_CA125_in_CA72-4_pri_diagnozi_raka_trebu.C5.A1ne_slinavke Vloga tumorskih označevalcev CA19-9, CA125 in CA72-4 pri diagnozi raka trebušne slinavke]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/01/140121164754.htm Povezava]||21.04.||24.04.||05.05.||Živa Moravec||Božin Krstanoski||Jerneja Ovčar
|-
| Primož Tič||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Primo.C5.BE_Ti.C4.8D:_Regeneracija_osterelega_pri.C5.BEeljca_z_enim_samim_transkripcijskim_faktorjem Regeneracija ostarelega priželjca z enim samim transkripcijskim faktorjem]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/04/140408115610.htm Povezava]||05.05.||08.05.||12.05.||Tjaša Sorčan||Domagoj Majić||Anja Tanšek
|-
| Valentina Levak||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Valentina_Levak:_Protein_Juno_je_receptor_proteina_Izumo1_in_potreben_za_fertilizacijo Protein Juno je receptor proteina Izumo1 in potreben za fertilizacijo]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/04/140416133253.htm Povezava]||05.05.||08.05.||12.05.||Tomaž Žagar||Amadeja Lapornik||Anja Šantl
|-
| Enja Kokalj||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Enja_Kokalj:_Celice_med_mitozo_onemogo.C4.8Dijo_popravljanje_DNA_zaradi_spajanja_telomer Celice med mitozo onemogočijo popravljanje DNA zaradi spajanja telomer]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/03/140320173506.htm Povezava]||05.05.||08.05.||12.05.||Fran Krstanović||Peter Pečan||Angela Mihajloska
|-

|-
| Luka Dejanović||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Luka_Dejanović:_Zaščita_mrežnice_s_pomočjo_kave Zaščita mrežnice s pomočjo kave]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/05/140502213047.htm Povezava]||12.05.||15.05.||19.05.||Primož Tič||Tjaša Sorčan||Domagoj Majić
|-
| Katja Malovrh||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Katja_Malovrh:_Spremembe_cistinskih_ledvičnih_kamnov_ob_zdrvaljenju Spremembe cistinskih ledvičnih kamnov ob zdravljenju]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/04/140417101156.htm Povezava]||12.05.||15.05.||19.05.||Valentina Levak||Tomaž Žagar||Amadeja Lapornik
|-
| Nina Mavec||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Nina_Mavec:_Specifi.C4.8Dne_spremembe_serumskih_proteinov_pri_ljudeh_s_Parkinsonovo_boleznijo Specifične spremembe serumskih proteinov pri ljudeh s Parkinsonovo boleznijo]||[http://www.plosone.org/article/fetchObject.action?uri=info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0095684&representation=PDF Povezava]||12.05.||15.05.||19.05.||Enja Kokalj||Fran Krstanović||Peter Pečan
|-
| Anja Šantl||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Anja_.C5.A0antl:_.C4.8Cernobilske_ptice_so_se_prilagodile_ionizirajo.C4.8Demu_sevanju Černobilske ptice so se prilagodile ionizirajočemu sevanju]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/04/140424223057.htm Povezava]||12.05.||15.05.||19.05.||Hasiba Kamenjaković||Jure Zadravec||Živa Moravec
|-
| Marija Srnko||||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/05/140508110935.htm Povezava]||19.05.||22.05.||26.05.||Luka Dejanović||Primož Tič||Tjaša Sorčan
|-
| Eva Škrjanec||||||19.05.||22.05.||26.05.||Katja Malovrh||Valentina Levak||Tomaž Žagar
|-
| Vesna Podgrajšek||||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/01/140130210734.htm Povezava]||19.05.||22.05.||26.05.||Nina Mavec||Enja Kokalj||Fran Krstanović
|-
| Nives Mikešić||||||19.05.||22.05.||26.05.||Ana Kompan||Hasiba Kamenjaković||Jure Zadravec
|-
| Liza Otorepec||||||26.05.||29.05.||02.06.||Marija Srnko||Luka Dejanović||Primož Tič
|-
| Naida Hajdarević||||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/05/140504133205.htm Povezava][http://www.sciencedaily.com/releases/2014/05/140501075055.htm Povezava2]||26.05.||29.05.||02.06.||Eva Škrjanec||Katja Malovrh||Valentina Levak
|-
| Nuša Kelhar||||||26.05.||29.05.||02.06.||Vesna Podgrajšek||Nina Mavec||Enja Kokalj
|-
| Tamara Božič||||||26.05.||29.05.||02.06.||Nives Mikešić||Ana Kompan||Hasiba Kamenjaković
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2013. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete v PubMed povezavi [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ tukaj]
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2014 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
* TBK_2014_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2014_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2014_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2014_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2014_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2014_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2014_Guncar_Gregor.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1oW_38CbGfOhTcS8zqMEFvdAOS66yRtDMd_e52uoUYLw/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1XbEJ2iXlXsT3b7-jpM3pCGQazdIwskieL07-vBmRU8k/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).'''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2014 Povzetki seminarjev

2014-05-13T12:13:32Z

Nina Mavec: /* 19.5. */

[[TBK2014-seminar|Nazaj na osnovno stran]]

== 17.3. ==

=== Andrej Žulič: Prva umetna celica z delujočimi organeli ===

Prvič v zgodovini je znanstvenikom na nizozemski univerzu Radboud v Nijmegenu uspelo ustvariti umetno celico z delujočimi organeli, ki lahko v večih korakih, kemičnih reakcijah, reagent preko raznih vmesnih stopenj privedejo do končnega produkta, rezorufina, ki je fluorescenten in se ga zato na koncu reakcije lažje opazi. Te organele so ustvarili tako, da so majhne polimerosome narejene iz PS-b-PIAT polprepustnega polimera napolnili z encimi in jih potem vnesli v miniskulno kapljico vode, ki je vsebovala še proste encime in substrate, in to kapljico še enkrat obdali s lipidnim slojem – celično steno narejeno iz PB-b-PEO hidrofobnega polimera. Zaradi fluorescence produkta so lahko preverili, da se predvidene reakcije resnično dogajajo po korakih v polimerosomnih nanoreaktorjih ali organelih. Produkti posameznih organelov lahko prestopijo steno organela v celično plazmo od koder najdejo pot v druge celične organele, kjer se izvršujejo posledični koraki te ''kaskadne'' reakcije. Obstaja več načinov kako zgraditi strukture podobne celicam. Poleg opisanega, ki kombinira več pristopov, se lahko umetne celice gradi iz majhnih kapljic tekočine podobne citoplazmi, iz polimerov ali maščobnih kislin. Naslednjih korak je nedvomno narediti umetno celico, ki lahko sama proizvaja svojo energijo. S preučevanjem tega področja lahko biokemiki vedno bolje razumemo kaj se dogaja na celičnem nivoju in kako to uporabiti v nadaljnih raziskavah.

=== Urška Černe: Boj imunskega sistema proti malariji ===
Malarijo povzroča infekcija z parazitom, vrste Plasmodium falciparum, ki se prenese na človeka z pikom okuženega komarja mrzličarja. Ko piči človeka, se trosi prenesejo v njegovo kri in se začnejo množiti v jetrih. Nastanejo merozoiti, ki vstopajo v rdeča krvna telesca (eritrocite), kjer se nadalje delijo, dokler eritrocit ne poči. P. falciparum je specifični gostitelj, kar predstavlja težavo pri izvedbi človeške infekcije na laboratorijskih živalih kot so miši. Za premagovanje tega izziva so raziskovalci razvili miš z človeškimi eritrociti in jim dodali človeške imunske celice (miš RICH). Imunski sistem ima pri obvladovanju okužbe ključno vlogo. Študije na miših z uporabo človeških sevov Plasmodium so pokazale, da imunske celice (naravne celice ubijalke = celice NK, T celice in celice B) prispevajo k antiparazitski imunosti, pri čemer so bistvenega pomena celice NK. Te reagirajo z okuženimi eritrociti in jih tudi eliminirajo. Okuženi eritrociti postanejo sploščeni, kar kaže na uhajanje celične vsebine in izgubo volumna celice. Celični receptor LFA-1 je vključen v interakcijo celic NK z okuženimi eritrociti in njihov pomor. Pojasnitev molekularne narave vseh teh interakcij je bistveno za razumevanje mehanizma odzivanja naravnih celic ubijalk na infekcijo s P. falciparum.

=== Jerneja Kocutar: Odziv celic na stresne situacije ===
Kadar so celice izpostavljene stresnim pogojem, ki ogrozajo njihovo prezivetje se v njih aktivira stresni odziv, da bi čimprej spet vzpostavile homeostazo. Tak odziv je univerzalen in ga lahko najdemo v vseh organizmih in v vseh vrstah celic. Celice proizvajajo stresne proteine, ki izpolnjujejo razlicne naloge npr. preprečujejo tvorbo agregatov in neaktivnih intermediatov, odstranjujejo že poškodovane proteine, varujejo celične strukture, reorganizirajo celično oskrbo z energijo...Preden pa celica začne tvoriti proteine se aktivirajo transkripcijski receptrorji, od katerih je najpomembnejši HSF1. Aktivni HSF1 je trimer in ima dolčcene skupine fosolizirane. Regulacija stresnega odziva je odvisna od več celičnih procesov in organelov, najpomembnejši pa so procesi v jedru. Za uravnavanje stresnega odziva imamo 55 pozitivnih in 14 negativnih modulatorjev, ki so locirani v jedru, citoplazmi ali organelih. Pozitivni stresni odziv podaljšujejo in preprečujejo agregacijo proteinov, negativni pa odziv zavirajo. Vsi modulatorji so zelo tesno povezani med seboj, saj opazimo veliko več povezav kot med nakljičnim proteini. Kot najpomembnejši modulator je bila spoznana acetiltransferaza EP300, ki z acetiliranjem lizinov uravnava delovanje HSF1. V prihodnosti bi stresni odziv lahko uporabili tudi za zdravljenje bolezni pri katerih je problem obsežno propadanje celic. S tarčno aktivacijo stresnega odziva bi lahko reducirali poškodbe na celicah.

=== Tadej Ulčnik: Prisotnost proteinov UCP določa metabolizem celice ===
Vzorec izražanja razklopnih proteinov med diferenciacijo matičnih celic daje nov namig o njihovii vlogi. Izmed družine petih razklopnih proteinov je znana le vloga razklopnega proteina UCP1, funkcija ostalih štirih pa še vedno ni znana. Znanstveniki so na podlagi rezultatov več analiz domnevali, da vzorec izražanja UPC proteinov sovpada s specifičnimi celicami, ki imajo podoben metabolizem, in se spremeni, če se celice same spremenijo. Analizirali so izražanje UCP2 v mišjih embrionalnih matičnih celicah pred in po diferenciaciji v nevrone. Dokazali so, da je samo UCP2 prisoten v nediferenciranih matičnih celicah in izgine takoj, ko se te začnejo diferencirati v nevrone. Nasprotno od tega se istočasno poviša raven izražanja UCP4 in tipičnih nevralnih označevalnih proteinov. Prisotnost proteina UCP2 v matičnih, rakavih in imunskih celicah, kaže na to, da je UCP2 prisoten v celicah z veliko zmožnostjo razmnoževanja, za katere je tudi značilen metabolizem, ki temelji na glikolizi. Protein UCP4 pa je prisoten samo v diferenciranih živčnih celicah, ki se niso sposobne deliti. Odkrili so da se UCP2 izraža tudi v nevroblastomih, katerih metabolizem je podoben rakavim celicam, ne izraža pa se UCP4. Te ugotovitve bi lahko pripomogle k hitrejšem odkrivanju rakavih celic, ki se od ostalih razlikujejo v metabolizmu in nekaterih proteinih.

== 24.3. ==

=== Hrvoje Malkoč: Adsorbcija mielinskega bazičnega proteina na membrane mielinskih lipidnih dvoslojev ===

Da bi razumeli demielizacijske bolezni moramo najprej vedeti, kako pride do njih. Zato so znanstveniki iz Kalifornijske univerze Santa Barbara izvedli poskus s katerim so preverjali sestavo in lastnosti mielinskih dvoslojev. Mielin je več lipidnih dvoslojev skupaj, ki morajo biti kompaktni in med seboj vsebovati čim manjše količine vode. Že majhna sprememba v zgradbi mielinske ovojnice lahko povzroči težave pri izolaciji aksona in s tem povzroči različne motnje ali celo to, da impulz ne prispe na cilj. Posledice so lahko bolezni, kot je multipla skleroza, vzroki pa so lahko avtoimunski odzivi, infekcije, izpostavljenost določenim kemikalijam, pa tudi genetika. Opravljene so bile raziskave o adsorbciji mielinskega bazičnega proteina (MBP) na membrane mielinskih lipidnih dvoslojev in njihov vpliv na strukturo, ravnovesni razmik in adhezijske sile med njima. Znanstveniki so na obe strani aparata površinskih sil postavili lipidni dvosloj, ga dali v pufersko raztopino z MBP-jem in jih približali da so se zlepili. Nato so jih dali narazen in merili adhezijo in debelino filma. Ugotovili so, da je zdrav mielin veliko bolj kompakten in vsebuje manj vode med membranami, pa tudi ima močnejšo adhezijo, in se bolj prijema na nasprotnega. Ta raziskava se razlikuje od drugih po tem, da ima molekularen pristop za razliko od drugih in bi zato lahko omogočila napredek v raziskavi demielizacijskih bolezni.

=== Janja Krapež: Nanopore omogočajo transport DNA skozi membrane ===

Celice obdaja lipidni dvosloj, ki je polprepusten in loči zunanjost celice od notranjosti (vse snovi torej ne morejo v celico). Prehod molekul je v veliki meri odvisen od transmebranskih proteinov, ki omogočajo transport snovi, ki ne morejo direktno skozi lipidni dvosloj, to so ioni in druge večje molekule. Nekateri proteini pa v neki drugi celici povzročijo majhne pore – nanopore. Pri tem ioni in molekule prosto prehajajo, kar privede do celične smrti, ker prehod snovi ni več nadzorovan. Raziskovalci želijo skozi take nanopore spraviti tudi DNA ali proteine. Težava je le v tem, da je težko nadzorovati prehode molekul skozi nanopore. Raziskovalci namreč ne želijo, da bi skozi nanopre lahko v celico vstopale vse molekule. Vstopale naj bi le tiste molekule, ki imajo za to pravo gensko informacijo. Profesorju Maglia in njegovi ekipi je uspelo sestaviti nanoporo, ki deluje kot cikel in prepušča DNA. Točno določeni deli DNA v raztopini hibridizirajo in se transportirajo skozi DNA poro. Na nasprotni strani pore pa je druga DNA, ki izpusti iskano genetsko zaporedje iz pore v celico. Ta prenos se zgodi vsakokrat, ko ima DNA, ki želi skozi membrano, pravilno zaporedje. Ta prehod poteka spontano in deluje kot tekoči trak. DNA vijačnico so združili z vrhom proteinske nanopore. Tako so dobili membranski sistem, ki je omogočil transport specifične DNA molekule skozi nanoporo.

== 31.3. ==

=== Monika Pepelnjak: Odpornost tumorjev na kemoterapijo ===

Rak debelega črevesja in danke je drugi najpogostejši rak v Sloveniji. Kadar bolezen ni odkrita dovolj hitro, je za zdravljenje poleg kirurške odstranitve malignega tumorja potrebno tudi zdravljenje s citostatiki (kemoterapija). Najpogosteje uporabljen citostatik pri kolorektalnem raku je oksaliplatin, ki poškoduje DNA zaporedje in tako prepreči delovanje in hitro delitev celic. Velik problem pri zdravljenju pa povzročata primarna in pridobljena odpornost na oksaliplatin. Odpornost je lahko posledica več različnih dejavnikov, eden izmed njih so tudi epigenetske spremembe. Raziskovalci so odkrivali razloge za odpornost z epigenetskega vidika in primerjali metilacije različnih genov v odpornih in odzivnih celicah. Ugotovili do, da se največje razlike pojavljajo v metilaciji SRBC gena, ki je znan kot interaktor s produktom gena BRCA1. Dokazali so, da je metilacija tega gena, in s tem njegovo utišanje, resnično odgovorna za zmanjšano odzivnost celic na oksaliplatin. Epigenetska inaktivacija SRBC gena se je pojavila pri 29.8% pacientov, povezali pa so tudi utišanje tega gena in krajše obdobje preživetja brez nadaljevanja bolezni pri pacientih, ki so se zdravili z oksaliplatinom, vendar jim metastaz kirurško niso mogli odstraniti. Rezultati postavljajo osnovo za nadaljne študije, kjer bi lahko metilacijo gena SRBC uporabili kot predhodnji pokazatelj odpornosti na oksaliplatin.

=== Anja Tanšek: Potrditev ključne beljakovine odgovorne za razrešitev skrivnosti mitoze ===

V celicah sesalcev je endocitoza, posredovana s klatrinom (CME), glavna pot za vstop večjih molekul skozi membrano preko različnih receptorjev. Mehanizem CME se zaustavi kmalu po tem, ko celica vstopi v profazo in začne ponovno delovati v pozni anafazi, kjer je potreben za membransko dinamiko pri citokinezi. Predlagana sta bila dva glavna mehanizma, ki bi lahko povzročila inhibicijo CME. Prva hipoteza pravi, da direktna mitotska fosforilacija CME sistema zmanjša njegovo aktivnost. V podporo tej predpostavki so številni endocitozni proteini, ki so fosforilirani med mitozo, vendar vpliv teh modifikacij na CME ni jasen, niti dokazan. Druga hipoteza pravi, da povečana membranska napetost mitotskih celic prepreči nastanek jamice in izoblikovanje v vezikel med CME. Celicam, ki so v fazi mitoze, se membranska napetost poveča. Posledično se poveča tudi potreba po aktinskem citoskeletu, ker se formira celični korteks. Zato aktinski citoskelet ni na voljo mehanizmu CME za premagovanje povečane obremenitve zaradi membranske napetosti in se endocitoza v celici ustavi. V tej študiji so raziskovalci dokazali, da je za zaviranje CME v času mitoze odgovorno pomanjkanje aktina. Dokazali so, da lahko CME poteka tudi v mitotskih celicah, kljub visoki membranski napetosti, tako da so omogočili delovanje aktina pri CME. Mitotska fosforilacija endocitoznih proteinov je bila prisotna tudi v celicah s ponovno vzpostavljeno CME, kar kaže, da direktna fosforilacija CME mehanizma ni odgovorna za njegovo inhibicijo.

=== Jerneja Ovčar: Vztrajno zavezujoč mehanizem za vizualni nadzor gibanja ===

Človeški motorični sistem je izjemno napreden pri nadzoru vizualno vodenih premikov, saj se zelo hitro prilagaja spremembam. To doseže skozi niz visoko avtomatičnih procesov, ki prevajajo vizualne informacije v predstavitve. Motorični sistem je del osrednjega živčnega sistema in se ukvarja z gibanjem. Sestoji iz piramidalnega in ekstrapiramidalnega sistema. Da pa se lahko doseže takšen niz visoko avtomatičnih procesov za oblikovanje predstavitev, ki so primerne za vklop motoričnega nadzora, potrebuje motorični nadzor vizualne informacije, ki se nanašajo na cilj. V ta namen je bila raziskana vloga pozornosti v vizualno povratnem nadzoru, tako da je bil motorični sistem izzvan z več poskusi. Rezultati so pokazali, da vizualna pozornost spreminja obdelavo ciljne informacije. Ugotovili so, da je učinek spremembe pozornosti večji pri premikih ciljev (nek predmet) kot pa pri premikih kurzorjev (npr. rok). Zato sklepamo na obstoj ločenega vizualno-motoričnega zavezujočega mehanizma, ki daje prednost vizualnim podatkom, ki predstavljajo gibanje premikajočega uda. Vizualno-motoričen mehanizem pojasnjuje učinkovitost in hitrost, s katero lahko človek hkrati izvaja več ciljno usmerjenih gibanj. Njegova prednost je, da loči med ciljem in motečimi predmeti na poti. Zaznavanje vizualnih dražljajev, ki se nanašajo na naše gibanje, je temeljni proces pri nadzoru segajočih gibanj. Vizualno-motorični mehanizem je skupen vsem vrstam, ki se pri usmerjanju gibanja opirajo na vid.

=== Inge Sotlar: CPEB proteini oblikujejo dolgoročni spomin ===
,
Dolgoročni spomin hrani vse, kar se v življenju naučimo. Spomin z leti slabi, motnje spomina pa se pojavijo tudi pri nevrodegenerativnih boleznih, kot sta npr. Alzheimerjeva in Parkinsonova bolezen. Znanstveniki so poskušali odkriti proteine, odgovorne za ohranjanje dolgoročnega spomina. Za pomembne regulatorje sinteze proteinov v sinaptičnih membranah so se izkazali CPEB proteini, ki največkrat delujejo kot aktivatorji translacije mRNA v različnih tipih celic, tudi v nevronih. Pri raziskavi na vinskih mušicah so našli protein iz družine CPEB, Orb2, ki je s svojimi oligomeri, podobnim amiloidom, potreben za shranjevanje informacij v dolgoročni spomin. Njegov monomer, Orb2A, je v živčnem sistemu prisoten v zelo majhnih količinah, a tvori pomemben kompleks s proteinom Tob, regulatorjem celičnega cikla. Da povezavo Tob-Orb2A uravnava fosforilacija, so dokazali z dodatkom kalikulina, inhibitorjem, ki blokira proteinsko fosfatazo 2 (PP2A). Dodatek je povzročil, da se je število povezav Tob-2A zmanjšalo. Pri iskanju kinaz, ki fosforilirajo protein Tob, so se osredotočili na kinazo LimK, saj se sintetizira le v sinapsah in je potrebna za njihovo oblikovanje. Dokazali so, da gre pri nastanku oligomerov Orb2 za součinkovanje med proteinom Tob, kinazo LimK in fosfatazo PP2A. Kako se podatki shranjujejo v spomin je zapleten proces, vendar raziskovanje biokemijskih reakcij nudi možnosti za zdravljenje neozdravljivih bolezni živčevja.

== 7.4. ==

=== Božin Krstanoski: Uporaba bakterij pri naftnih razlitjih ===

Kljub sodobni tehnologiji so razlitja nafte še vedno pogosta težava za oceane. Zaradi kompleksne strukture molekule nafte lahko čiščenje razlitja traja tudi mesece ali leta, kar pa je zelo škodljivo za morsko okolje. Znanstveniki so ugotovili, da si je narava sposobna sama pomagati ob nesrečah kot so razlitja nafte - z morskimi bakterijami. Poznamo tri vrste bakterij, ki pripomorejo k bioremediaciji - bakterije, ki proizvajajo kislino in so anaerobne, bakterije, ki zmanjšujejo sulfate ter splošne aerobne bakterije. Najnovejše raziskave pa kažejo, da je mogoče s pravo mero vzpodbude povzročiti, da so te bakterije pri bioremediaciji še bolj učinkovite. Ugotovili so, da so bakterije pri poskusih, ko so imele dovolj zalog nutrientov kot so fosfati in dušik dosegle večjo in bolj učinkovito razgradnjo nafte. Najpomembnejša morska bakterija, ki je sposobna razgradnje nafte je Alcanivorax borkumensis. A. borkumensis primarno uporablja alkane kot vir energije, vendar lahko prebavi tudi nekatere druge organske spojine. Ko uporablja alkane za vir energije, vsaka celica A. borkumensis tvori biosurfaktant na svoji površini, ki je dodatna plast, ki nastane ob celični membrani. Snovi, ki sestavljajo biosurfaktant znižajo površinsko napetost vode, kar pripomore k boljši razgradnji nafte. Druga pomembna morska bakterija, ki je pomembna ob razlitjih nafte, je Oleispira antarctica. Ker je ta bakterija psihrofil, je sposobna preživeti ekstremne pogoje, kot so nizke temperature in je zato zelo učinkovita pri bioremediaciji v polarnih morjih. Odkritje Oleispire antarctice je zelo pomembno, saj nam je njihova ekološka tekmovalnost v hladnih okoljih odprla nove poti za iskanje biotehnoloških rešitev za zmanjšanje onesnaževanja v polarnih morjih.

=== Amadeja Lapornik: Nanodelci, ki omogočajo zgodnje odkrivanje krvnih strdkov ===

Koagulacija je proces pri katerem v krvi nastajajo strdki. Strjevanje krvi je pomemben mehanizem odziva na poškodbe, saj strdki ob raztrganju stene žil preprečijo uhajanje krvi. Tromboza je nastanek krvnega strdka (trombusa) v žili, kar onemogoča normalen pretok krvi po krvožilnem sistemu. Najpogostejši vzroki za nastanek venske tromboze so poškodbe žilnih sten in upočasnitve toka krvi na mestu poškodbe, dolgotrajna nepremičnost, rakava in internistična obolenja. Najpomembnejši encim, ki je regulator hemostaze (proces, zaustavljanja krvavitve) je trombin. Je encim, ki se nahaja v krvni plazmi, spada v skupino serin proteaz. V članku so predvidevali, da je možno odkrivanje krvnih strdkov (in s tem nevarnost tromboze) s posebnimi nanodelci. Kot pomoč za zgodnje odkrivanje nevarnih bolezni so znanstveniki razvili beljakovinske substrate, ki so občutljivi na proteaze in jih poimenovali sintezni biomarkerji. Predpostavili so, da so sintezni biomarkerji oblikovani za preiskovanje notranjosti žil, zaznavanje aktivnosti proteaze in posledično odkrivanja zasnov akutne tromboze. V raziskavi so znanstveniki uporabili fluorescenčno spektroskopijo in encimskoimunski test (ELISA), ki se uporablja za detekcijo protiteles ali antigenov v vzorcu. Takšen način testiranj lahko odkriva zgodnje nevarnosti bolezni, ki se nahajajo globoko v telesu, kot so pljuča. Testiranja omogočajo analizo urina za kvantitativno oceno količine krvnih strdkov, ki bremenijo žilo.

=== Angela Mihajloska: Proteine,ki so odkriti v gonoreje lahko ponudijo novi pristop k zdravljenju ===
Gonoreja (lat. gonorrhoea) ali kapavica je močno razširjena spolno prenosljiva bolezen, ki se večinoma prenaša s spolnim stikom in jo povzroča gonokok, kateri nastane na sluznicah spolovil gnojno vnetje z gnojnim izločkom. Bacterija Neisseria gonorrhoeae (GC) najpogoste se prenese iz enega partnerja na drugega med spolnim odnosom preko semenske oziroma vaginalne tekočine pri nezaščitenih spolnih odnosih in večinoma prizadane spolne organe.Znanstveniki so odkrili nove proteine v ali na površini bakterije, ki povzroča gonorejo. Ti ponujajo obetavne novi pogled za napada proti spolne bolezne, ki imajo se večjo odpornost na antibiotike. Samo tretja generacija cefalosporinskih antibiotih še vedno povejo dobro učinkovitost proti gonoreji, ustvarjajo teki s časom, da bi našli nekaj alternativni način za zdravljenje te bolezni, ki imajo resne posledice za zdravje.So odkrili skupno 22 različite proteinov. Med temi proteinov ki so prikazani podobno obilje v štirih GC sevov, 32 so bili ugotovljeni v obeh celične ovojnice in membranske mehurčke frakciji.
Osredotočiti na eno od njih, in homolog protein zunajne membrane LptD, smo dokazali da je njena izčrpavanje povzrčil izgubo GC.

=== Domagoj Majić: Low vitamin D levels raise anemia risk in children ===
Low levels of the “sunshine” vitamin D appear to increase a child’s risk of anemia, according to new research. The study is believed to be the first one to extensively explore the link between the two conditions in children.

== 14.4. ==

=== Peter Pečan: Reprogramiranje kožnih celic v srčne ===
Srčni zastoj, ki je v razvitem svetu med glavnimi razlogi za smrt, povzroči pri osebah, ki ga preživijo, izgubo ali okvaro srčnega tkiva. Kljub napredkom na področju biomedicine, je vračanje funkcionalnosti poškodovanemu srčnemu tkivu precejšen izziv. Napredki na področju induciranih pluripotentnih matičnih celic (angl. »induced pluripotent stem cell«) so vzpodbudili raziskovanje možnosti reprogramiranja enga tipa celice v drugega, ne da bi pri tem šle skozi pluripotentno stanje; ta proces se imenuje transdiferenciacija. Postopek obeta možnost popravkov poškodovanih srčnih celic brez povečanega tveganja za nastanek tumorjev, povezanega s pluripotentnimi celicami pri terapiji z zamenjavo celic in/ali pri in vivo regeneraciji s pomočjo reprogramiranja. Čeprav do zdaj znani načini, ki uporabljajo več genskih faktorjev (med 4 in 7), dokazujejo možnost reprogramiranja, takšne genske manipulacije prinašajo številne težave, predvsem na področju varnosti in učinkovitosti. Poleg tega bi bilo za učinkovitejšo uporabo transdiferencialne terapije potrebno zmanjšati ali pa povsem odstraniti potrebo po genski manipulaciji. To bi lahko dosegli z zamenjavo transkripcijskih faktorjev s tako imenovanimi majhnimi molekulami (angl. »small molecules«), ki bi lahko ustvarile pogoje za reprogramiranje z enim samim transkripcijskim faktorjem.

=== Živa Moravec: Ključen korak naprej pri tiskanju 3D tkiv ===
Znanstveniki se že leta trudijo ustvariti umetna tkiva, ki bi bila čim bolj podobna pravim. Če želijo to doseči, morajo biti umetno ustvarjeni tkivni konstrukti sestavljeni iz treh glavnih komponent – celic, zunajceličnega matriksa in žil, ki morajo biti urejene v pravilne geometrijske vzorce. Verjetno najpomembnejše je ožiljenje tkiva. Če žilno omrežje manjka, bo slej ko prej prišlo do razvoja nekrotičnega jedra zaradi odsotnosti učinkovitega dotoka hranil, rastnih in signalnih faktorjev ter odvajanja odvečnih produktov. V študiji, predstavljeni v članku, so razvili novo metodo 3D biotiskanja, ki omogoča izdelovanje tkiv, opremljenih z žilami, več tipi celic naenkrat in zunajceličnim matriksom. Za te potrebe so razvili tiskalnik s štirimi neodvisnimi tiskalnimi šobami in več črnil, glede na različne lastnosti posameznih glavnih komponent: za izdelavo ožilja so razvili začasno podporno črnilo na osnovi praška Pluronic F127, za izdelavo zunajceličnega matriksa in črnila, ki so ga uporabili kot nosilec celic, pa so sintetizirali gelatin metakrilat. Z uporabo teh črnil so najprej natisnili več vzorčnih 1D, 2D in 3D omrežij, s katerimi so posnemali osnovne strukture v tkivih, nato so se osredotočili na endotelizacijo žilnih sten, pri čemer so v vzorec tkiva injicirali raztopino človeških endotelnih celic. Kot zadnjo in najbolj kompleksno strukturo so natisnili model tkiva iz štirih plasti, v katerega so vključili dva tipa celic (človeške in mišje). Taka tridimenzionalna okolja odpirajo nove možnosti testiranja zdravil in raziskave na več medicinskih področjih, z nadaljnjimi izboljšavami pa bi lahko ta tehnika vodila tudi do proizvodnje funkcionalnih tridimenzionalnih tkiv, morda tudi organov.

== 5.5 ==

=== Jure Zadravec: Vloga tumorskih označevalcev CA19-9, CA125 in CA72-4 pri diagnozi raka trebušne slinavke ===

CA125 in CA72-4 spadata v družino glikoliziranih proteinov z visoko molekulsko maso in se pogosto uporabljata kot tumorska označevalca pri diagnozi raka jajčnikov ter raka želodca. Zadnje raziskave pa so pokazale, da omenjena označevalca igrata pomembno vlogo tudi pri diagnosticiranju raka trebušne slinavke. Ker je pri tem raku razpoložljivost podatkov o tumorskih označevalcih omejena, je bil cilj te raziskave ugotoviti klinično vlogo CA19-9 (specifičen za raka trebušne slinavke), CA125 in CA72-4 ter povezavo z mednarodno klasifikacijo tumorjev - TNM (Tumor Node Metastasis). Z imunoradiometrično metodo so merili koncentracijo tumorskih označevalcev pri pacientih z rakom ter pri pacientih z benignimi spremembami na trebušni slinavki. Rezultati so pokazali občutno višje koncentracije označevalcev pri pacientih z rakom v primerjavi s tistimi z benignimi spremembami. Raziskavo so zaključili z ugotovitvijo, da odkrivanje s kombinacijo označevalcev CA19-9 in CA72-4 močno izboljša specifičnost diagnoze.

=== Tomaž Žagar: Ključna proteina pri uravnavanju celične smrti ===

Za normalno delovanje večceličnega organizma je potrebno, da se celice delijo in rastejo kontrolirano, ker drugače lahko to privede razvoja raka. Celice pa so tekom evolucije razvile nekatere mehanizme, s katerimi lahko samo sebe pokončajo/razgradijo, če prejmejo signal, da je čas da propadejo. Ta mehanizma sta avtofagija in apoptoza. Signali pa lahko pridejo od zunaj ali od znotraj. Če pridejo od znotraj, se vežejo na mitohondrijsko membrano in začnejo proces celične smrti. Ključna proteina, ki uravnavata celično smrt sta protein Bcl-2 in protein NAF-1. Prvi protein ima med drugim na svoji površini dve domeni. Ena inhibira, druga pa inducira apoptozo. Protein NAP-1 se lahko veže na katerokoli izmed dome, res pa je, da se močneje veže na dome, ki inhibira apoptozo. Kljub temu, da natančen mehanizem še ni poznan, so se raziskovalci odločili raziskati kje se proteina vežeta in kakšne so posledice vezave na aktivnost proteinov. S tem so hoteli ustvariti temelje za bodoče raziskave na področju odkrivanja zdravila proti raku, saj se je izkazalo, da je pri rakastih celicah povečano število NAF-1 proteinov.

=== Tjaša Sorčan: Posamezni Iks kanali na površini srčnih celic sesalcev vsebujejo dve KCNE1 podenoti ===

Da se naše srce lahko krči in razteza, potrebujemo posebne IKS kanale, ki se nahajajo na površini srčnih celic. Sestavljata jih dva proteina: E1, katerega število je bilo do nedavnega neznano, in Q1, za katerega vemo da tvori poro s štirimi podenotami. Kljub temu da Q1 lahko sam tvori napetostno odvisni kalijev kanal, pa je nujno potreben tudi E1, ker nadzira kinetiko prehoda, površinsko izražanje, kako so celice regulirane z zdravili, napetostno odvisnost, enotno prevodnost in farmakologijo nastalih kompleksov. Njuno razmerje se ne spreminja, tudi če povečamo ali znižamo raven le enega proteina. V članku sta opisani dve nasprotujoči raziskavi. Prva pripada Morinu in Kobertzu, ki sta s pomočjo škorpijonovega strupa CTX in njegove povezave s E1 določila dve podenoti. Nasprotovala pa jima je raziskava Nakajo et al. , ki je zagovarjala spreminjajočo stehiometrijo med dvema in štirimi E1 podenotami. Vendar naj bi bile njegove domneve napačne, kar so tudi dokazali z fotobeljenjem z enim fluorescenčnim delčkom na površini žive celice sesalca. Demonstrirali so tri spektroskopske metode štetja in za oceno rezultatov uporabili dva statistična pristopa. Te so dokazale, da posamezni IKS kanali na površini celic sesalca res vsebujejo le in samo dve E1 podenoti.

=== Fran Krstanović: Breast milk protein may be key to protecting babies from HIV ===

HIV is an incurable disease that attacks our immune system leaving it shattered. One of the many ways of transmission is with breastfeeding from a HIV-1 positive mother,but not all of the children get effected. Breast milk is full of healthy benefits such as antibodies that help babies build their own immune system. A study at Duke Medical Science has found a protein(TNC) that is responsible for repression of HIV-1 and the explanation why a higher rate of children are not effected via breastfeeding.Further studies will show if TNC neutralizing characteristics could be used as a breakthrough in HIV-prevention therapy if given orally to infants prior to breastfeeding.

== 12.5. ==

=== Hasiba Kamenjaković: Podobnosti med HIV / AIDS, opioidne odvisnosti epidemije ===
Bolezni uporabe opioidov so najhitreje rastoča vrsta težav z drogami . Po mnenju raziskovalcev , veliko od trenutne izpostavljenosti opioidov je povezana z eksplozijo široko dostopna , močnih protibolečinskih zdravil na recept , ki imajo enak učinek v možganih kot heroin . Čeprav je veliko koristi od znatnega lajšanje bolečin in izboljšanje kakovosti življenja , opioidi na recept, zdaj ubil več ljudi kot heroin in kokain skupaj. Raziskovalci so ugotovili , da medtem ko razširjena, je zasvojenost marginalizirana kot ga določa ločeno od drugih bolezni, socialni problem , z ovirami za zdravljenje , od strogih meril za vstop v omejene razpoložljivosti zdravljenja.

Tudi so opisal potrebo po celovitem preprečevanju, diagnostiko in zdravljenje kampanjo za boj proti prevelik odmerek , skupaj s standardno -of- nego modele zdravljenja , ki temeljijo na obstoječih dokazov . Predlagajo, več izobraževanja za medicinske stroke in da izobraževalni viri za zasvojenost v medicinsko usposabljanje se na par z drugih kroničnih bolezni . Prav tako, kot s HIV / AIDS , bolniki , ki trpijo zaradi odvisnosti bi morali biti vključeni v oblikovanje in izvajanje programov in izdelkov , namenjenih , da jim služi .

===Primož Tič: Regeneracija osterelega priželjca z enim samim transkripcijskim faktorjem===
Priželjc je zelo pomemben člen našega imunskega sistema, saj proizvaja T-celice, ki nevtralizirajo antigene. S staranjem pride do naravnega procesa involucije, kjer pride do degeneracije strukture in odpovedi funkcij priželjca. To ima negativni učinek na imunski sistem, saj je osebek manj odziven na nove antigene in se z njimi težje spopada. Znanstvenikom je uspelo s prekomernim stimuliranjem oziroma izražanjem posebne oblike mišjega gena FOXN1 (FOXN1ER) s tamoksifenom obnoviti strukturo in funkcije priželjca. Preko enega samega transkripcijskega faktorja jim je uspelo regenerirati celoten organ ''in vivo'' do skoraj enake mere, kot ga najdemo v mladih miših. Povečano število proteinov FOXN1ER je vplivalo na transkripcijo genov, ki so vpleteni v cikel celične delitve, tako se je zakrneli organ obnovil s proliferacijo TEC celic (thymic epithelial cell). Raziskava je tudi pokazala, da se z obnovo priželjca poveča število T-celic in s tem izboljša imunski sistem. Rezultati bi lahko pomagali pri zdravljenju bolnikov, ki imajo šibek imunski sistem ali okvare priželjca. Dejstvo, da lahko z enim transkripcijskim faktorjem obnoviš celoten organ pa odpira nova vprašanja na področju regenerativne biologije, kjer bi lahko na podoben način poskusili regenerirati tudi ostale organe.

===Enja Kokalj: Celice med mitozo onemogočijo popravljanje DNA zaradi spajanja telomer===
Za obstoj vsakega posameznega organizma je bistveno, da se njegove celice neprestano delijo. Mitoza je delitev celic, pri kateri iz ene celice nastaneta dve genetsko enaki celici. Dedna informacija se prenaša iz ene generacije v drugo v molekulah DNA, zato je ključnega pomena, da je njihovo podvojevanje brezhibno. Vendar pa je DNA v naših celicah neprestano izpostavljena številnim škodljivim dejavnikom, ki na njej povzročajo napake. Te si celica seveda neprestano prizadeva popraviti. Ena izmed izredno nevarnih poškodb DNA je pretrganje obeh verig (angl. Double-strand break) saj lahko to vodi do premestitev znotraj genoma. Kljub temu, da je nenehna skrb za dobro stanje DNA ena izmed najpomembnejših nalog celice, pa je bilo ugotovljeno, da je med mitozo popravljanje pretrganja obeh verig zaustavljeno. Za sprožitev popravljanja DNA sta pomembna predvsem proteina RNF8 in MDC1, ki omogočata delovanje proteinov BRCA1 in 53BP1, ki po različnih mehanizmih popravljata nastalo škodo. V naravnih okoliščinah je to delovanje onemogočeno, znanstvenikom pa je uspelo z umetno kombinacijo proteinov in njihovih mutiranih vezavnih mest celice takorekoč prisiliti v popravljanje pretrganih verig med mitozo. Rezultati so pokazali, da to vodi do spajanja sestrskih telomer, posledica tega pa je anevploidija, to je povečanje ali zmanjšanje števila kromosomov, kar za celico nikakor ni ugodno.

===Valentina Levak: Protein Juno je receptor proteina Izumo1 in potreben za fertilizacijo===
Fertilizacija (oploditev) pomeni združitev moške in ženske spolne celice, pri čemer nastane zigota, zarodek. Proces je zahtevnejši, kot izgleda na prvi pogled, saj se morata spolni celici najprej ''najti'' (kemotaksija), nato povezati in nazadnje spojiti. Članek obravnava drugi korak, in sicer kako se celici povežeta preko proteinov na površini membrane. Leta 2005 so odkrili protein Izumo1 na spermalni celici, leta 2014 pa še protein Juno, receptorski protein Izuma1 na jajčni celici. Rezultati raziskave 2005 so pokazali, da je Izumo1 nujno potreben za fertilizacijo, izsledki zadnje raziskave pa, da je za fertilizacijo prav tako esencialen tudi protein Juno, da interagirata neposredno, da so ženski osebki brez Juna neplodni, rezultati pa namigujejo tudi na to, da je Juno povezan s kortikalno reakcijo in nastankom protispermalnega bloka, ki prepreči polispermijo in posledično odmrtje zarodka. Raziskovalci ocenjujejo, da bi lahko z nadaljnjim delom na tem področju tudi s pomočjo zadnjih odkritij razvili nove možnosti zdravljenja neplodnosti in nove oblike kontracepcije. Raziskava je potekala na inštitutu Wellcome Trust Sanger.

==19.5.==

===Anja Šantl: Černobilske ptice so se prilagodile ionizirajočemu sevanju===
26. aprila leta 1986 se je zgodila najhujša nesreča s sproščanjem radioaktivnih snovi doslej. V Černobilu se je jedrski reaktor stalil in v okolje spustil ogromne količine sevanja ter kontaminirane snovi. Splošno znano je, da so bile posledice na telesih organizmov katastrofalne. Ionizirajoča radiacija ali sevanje je pojav, ko v nestabilnih atomih jedro zaradi presežka notranje energije razpade in nastane popolnoma nov atom. Najpogostejše so reaktivne kisikove spojine, ki so visoko reaktivni prosti radikali, ki nastanejo kot produkt metabolizma in imajo pomembno vlogo pri celičnem signaliziranju in imajo tudi citotoksično delovanje. Med okoljskim stresom količina teh snovi zelo naraste, kar povzroči poškodbe celičnih struktur; to stanje imenujemo oksidativni stres. Prosti radikali lahko nastanejo tudi preko zunanjih virov kot je ionizirajoče sevanje. Organizmi so ustvarili obrambne mehanizme, eden izmed načinov je proizvajanje reducentov, ki nevtralizirajo proste radikale. V članku so se osredotočili na reducent glutation. V članku, ki sem si ga izbrala je poudarek na zakasnelih poškodbah, ki jih povzroča ionizirajoče sevanje. Znanstveniki so želeli ugotoviti, ali so se ptice v okolici jedrske elektrarne Černobil prilagodile tamkajšnjemu sevanju. Izkazalo se je, da so se ob prisotnosti sevanja stopnje antioksidantov povečale, pri večji vrednosti sevanja pa so našli manj oksidativnih poškodb. Dokazali so torej, da so se ptice v okolici
jedrske elektrarne prilagodile na ionizirajoče sevanje.

===Luka Dejanović: Zaščita mrežnice s pomočjo kave===
Comming soon :)

===Katja Malovrh: Spremembe cistinskih ledvičnih kamnov===
Ledvični kamen ali renalni kalkulus, je trda tvorba, sestavljena iz anorganskih soli ali organskih spojin. Kamni se razvijajo v ledvicah, natančneje v nefronih kot posledica kristalizacije različnih spojin, do katere pride zaradi prenasičenega urina. Kamni lahko zrastejo do različnih dimenzij in ob potovanju skozi sečila zaradi tega povzročajo hude bolečine. Nastanek cistinskih ledvičnih kamnov povzroča dedna avtosomno-recesivna bolezen Cistinurija. Bolezen povzročata mutaciji dveh genov, ki kodirata del transportnega proteina v epitelnih celicah ledvic. Posledica je slabša absorpcija cistina, ki se začne v večjih količinah nabirati znotraj nefronov. Nato pride do prenasičenja in tvorbe ledvičnih kamnov. Kamni so zgrajeni iz kristalitov, ti pa še iz manjši delcev, nanokristalov. Morfologijo in velikost kristalitov določamo s pomočjo SEM, strukturne lastnosti nanokristalov pa določamo z posebnim postopkom imenovanim PND. Članek raziskuje vpliv različnih načinov zdravljenj na morfologijo in strukturo ledvičnih kamnov. Med drugim med sabo primerja zdravljenje z natrijevim bikarbonatom, tiolovimi derivati, Tiopropinom, D-penicillaminom, Kaptoprilom, Foncitrilom in Alkaforjem. Glede na lastnosti ločimo dva tipa ledvičnih kamnov, Tip Va in tip Vb. Ugotovili so, da se je med različnimi načini zdravljenja za najuspešnejšega izkazalo zdravljenje z natrijevim bikarbonatom, saj na cistinske kamne vpliva na obeh nivojih – mikrometerskem in nanometerskem. Preostale načine terapije vplivajo le na površino kristalitov, na samo velikost pa ne vplivajo bistveno.

===Nina Mavec: Specifične spremembe serumskih proteinov pri ljudeh s Parkinsonovo boleznijo===
Parkinsonova bolezen je razmeroma pogosta in zaskrbljujoča nevrodegenerativna bolezen. Vzroki te bolezni so še precej neraziskani in posledično še ne poznamo zdravila, ki bi zaustavilo ravoj bolezni, ne poznamo pa niti zanesljivega laboratorijskega testa, ki bi to bolezen nedvoumno potrdil. Diagnoza se zaenkrat navadno postavi glede na simptome, ki pa postanejo opazni šele, ko je bolezen prizadela že precej živčnega sistema. Znanstveniki so zato izvedli raziskave krvnega seruma, oziroma proteinov v njem pri Parkinsonovih bolnikih in jih primerjali z zdravimi serumi ljudi istega spola in starosti. Najprej so iz serumov z afinitetno kromatografijo odstranili odvečne proteine, nato pa z gelsko elektroforezo ločili ostale proteine in primerjali gela serumov Parkinsonovih bolnikov in zdravih ljudi. Pri 13 lisah se je pokazala drugačna izraženost, te lise pa so identificirali kot 6 različnih proteinov. Od teh so pri treh opazili največjo razliko v izražanju. Gama veriga fibrinogena (FGG) se pri kontrolnih vzorcih sploh ni pojavila, medtem ko so jo opazili pri 70% bolnikov. Pri Parkinsonovih bolnikih se je precej spremenilo tudi razmerje med različno velikimi enotami proteinov ITI-H4 in Apo A-IV. Tej rezultati bi ob nadaljnih obsežnejših raziskavah lahko precej pripomogli k razvoju preprostega diagnostičnega testa za Parkinsonovo bolezen, ki bi temeljil le na neinvazivnem in enostavnem odvzemu in preiskavi krvi.

TBK2014 Povzetki seminarjev

2014-05-13T12:13:18Z

Nina Mavec: /* 19.5. */

TBK2014-seminar

2014-05-07T16:43:15Z

Nina Mavec: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič in so na urniku vsak ponedeljek od 11:00 do 12:30. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prištejeh končnipisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.

== Seznam seminarjev ==
{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Črt Kovač||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#.C4.8Crt_Kova.C4.8D:_Naslov_v_sloven.C5.A1.C4.8Dini Naslov]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2013/06/130627142551.htm link]||03.03.||06.03.||10.03.||Liza Otorepec||Marija Srnko||Luka Dejanović
|-
| Bine Tršavec||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Bine_Tršavec:_Stikalo,_ki_pove,_da_je_čas_za_spanje Stikalo, ki pove, da je čas za spanje]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/02/140219124730.htm Povezava]||03.03.||06.03.||10.03.||Naida Hajdarević||Eva Škrjanec||Katja Malovrh
|-
| Jernej Vidmar||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Jernej_Vidmar:_Boljša_slikovna_obdelava_z_nanozamrzovanjem Boljša slikovna obdelava z nanozamrzovanjem]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/02/140226133000.htm Povezava]||03.03.||06.03.||10.03.||Nuša Kelhar||Vesna Podgrajšek||Nina Mavec
|-
| Ernest Šprager||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Ernest_Sprager:_ Doslej najuspešnejše utišanje genov v jetrih z RNA interferenco po zaslugi novih nanodelcev]||[http://www.pnas.org/content/early/2014/02/06/1322937111.full.pdf+html Povezava]||03.03.||06.03.||10.03.||Tamara Božič||Nives Mikešić||Ana Kompan
|-
| Andrej Žulič|| [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Andrej_.C5.BDuli.C4.8D:_Prva_umetna_celica_z_delujo.C4.8Dimi_organeli Prva umetna celica z delujočimi organeli] || [http://www.sciencedaily.com/releases/2014/01/140114091707.htm Povezava] ||10.03.||13.03.||17.03.||Črt Kovač||Liza Otorepec||Marija Srnko
|-
| Urška Černe||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Ur.C5.A1ka_.C4.8Cerne:_Boj_imunskega_sistema_proti_malariji Boj imunskega sistema proti malariji]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/01/140113154225.htm Povezava]||10.03.||13.03.||17.03.||Bine Tršavec||Naida Hajdarević||Eva Škrjanec
|-
| Tadej Ulčnik||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Tadej_Ul.C4.8Dnik:_Prisotnost_proteinov_UCP_dolo.C4.8Da_metabolizem_celice Prisotnost proteinov UCP določa metabolizem celice] ||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/03/140304071208.htm Povezava]||10.03.||13.03.||17.03.||Jernej Vidmar||Nuša Kelhar||Vesna Podgrajšek
|-
| Jerneja Kocutar||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Jerneja_Kocutar:_Odziv_celic_na_stresne_situacije Odziv celic na stresne situacije]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/02/140228103435.htm Povezava]||10.03.||13.03.||17.03.||Ernest Šprager||Tamara Božič||Nives Mikešić
|-
| Hrvoje Malkoč||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Hrvoje_Malkoč:_Adsorbcija_mielinskega_bazičnega_proteina_na_membrane_mielinskih_lipidnih_dvoslojev Adsorbcija mielinskega bazičnega proteina na membrane mielinskih lipidnih dvoslojev]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/02/140225143937.htm Povezava]||17.03.||20.03.||24.03.||Andrej Žulič||Črt Kovač||Liza Otorepec
|-
| Janja Krapež||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Janja_Krape.C5.BE:_Nanopore_omogo.C4.8Dajo_transport_DNA_skozi_membrane Nanopore omogočajo transport DNA skozi membrane]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2013/10/131023090540.htm Povezava]||17.03.||20.03.||24.03.||Urška Černe||Bine Tršavec||Naida Hajdarević
|-
| Inge Sotlar||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Inge_Sotlar:_CPEB_proteini_oblikujejo_dolgoročni_spomin CPEB proteini oblikujejo dolgoročni spomin]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/02/140211174613.htm Povezava]||24.03.||27.03.||31.03.||Tadej Ulčnik||Jernej Vidmar||Nuša Kelhar
|-
| Monika Pepelnjak||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Monika_Pepelnjak:_Odpornost_tumorjev_na_kemoterapijo Odpornost tumorjev na kemoterapijo]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2013/12/131202094320.htm Povezava]||24.03.||27.03.||31.03.||Jerneja Kocutar||Ernest Šprager||Tamara Božič
|-
| Jerneja Ovčar||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Jerneja_Ov.C4.8Dar:_Vztrajno_zavezujo.C4.8D_mehanizem_za_vizualni_nadzor_gibanja Vztrajno zavezujoč mehanizem za vizualni nadzor gibanja]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/03/140313123139.htm Povezava]||24.03.||27.03.||31.03.||Hrvoje Malkoč||Andrej Žulič||Črt Kovač
|-
| Anja Tanšek||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Anja_Tan.C5.A1ek:_Potrditev_klju.C4.8Dne_beljakovine_odgovorne_za_razre.C5.A1itev_skrivnosti_mitoze Potrditev ključne beljakovine odgovorne za razrešitev skrivnosti mitoze]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/02/140218101018.htm Povezava]||24.03.||27.03.||31.03.||Janja Krapež||Urška Černe||Bine Tršavec
|-
| ||||||24.03.||27.03.||31.03.||Inge Sotlar||Tadej Ulčnik||Jernej Vidmar
|-
| Angela Mihajloska||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Angela_Mihajloska:_Proteine.2Cki_so_odkriti_v_gonoreje_lahko_ponudijo_novi_pristop_k_zdravljenju Proteine ki so odkriti v gonoreje lahko ponudijo novi pristop k zdravljenju]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/03/140331131010.htm Povezava]||31.03.||03.04.||07.04.||Monika Pepelnjak||Jerneja Kocutar||Ernest Šprager
|-
| Božin Krstanoski||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Božin_Krstanoski:_Uporaba_bakterij_pri_naftnih_razlitjih Uporaba bakterij pri naftnih razlitjih]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/03/140310090615.htm Povezava]||31.03.||03.04.||07.04.||Jerneja Ovčar||Hrvoje Malkoč||Andrej Žulič
|-
| Domagoj Majić||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Domagoj_Maji.C4.87:_Low_vitamin_D_levels_raise_anemia_risk_in_children Low vitamin D levels raise anemia risk in children]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2013/10/131021155625.htm Povezava]||31.03.||03.04.||07.04.||Anja Tanšek||Janja Krapež||Urška Černe
|-
| Amadeja Lapornik||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Amadeja_Lapornik:_Nanodelci,_ki_omogočajo_zgodnje_odkrivanje_krvnih_strdkov Nanodelci, ki omogočajo zgodnje odkrivanje krvnih strdkov]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2013/10/131016123038.htm Povezava]||31.03.||03.04.||07.04.||Anja Šantl||Inge Sotlar||Tadej Ulčnik
|-
| Peter Pečan|| [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Peter_Pe.C4.8Dan:_Reprogramiranje_ko.C5.BEnih_celic_v_sr.C4.8Dne, Reprogramiranje kožnih celic v srčne]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/02/140220132202.htm Povezava]||07.04.||10.04.||14.04.||Angela Mihajloska||Monika Pepelnjak||Jerneja Kocutar
|-
| Živa Moravec|| [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#.C5.BDiva_Moravec:_Klju.C4.8Den_korak_naprej_pri_tiskanju_3D_tkiv, Ključen korak naprej pri tiskanju 3D tkiv]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/02/140219095501.htm Povezava]||07.04.||10.04.||14.04.||Božin Krstanoski||Jerneja Ovčar||Hrvoje Malkoč
|-
| Tjaša Sorčan||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Tja.C5.A1a_Sor.C4.8Dan:_Posamezni_Iks_kanali_na_povr.C5.A1ini_sr.C4.8Dnih_celic_sesalcev_vsebujejo_dve_KCNE1_podenoti, Posamezni Iks kanali na površini celic sesalcev vsebujejo dve KCNE1 podenoti]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/03/140304141740.htm Povezava]||21.04.||24.04.||05.05.||Domagoj Majić||Anja Tanšek||Janja Krapež
|-
| Tomaž Žagar|| [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Toma.C5.BE_.C5.BDagar:_Klju.C4.8Dna_proteina_pri_uravnavanju_celi.C4.8Dne_smrti Ključna proteina pri uravnavanju celične smrti]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/03/140327140059.htm Povezava]||21.04.||24.04.||05.05.||Amadeja Lapornik||Anja Šantl||Inge Sotlar
|-
| Fran Krstanović|| [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Fran_Krstanovi.C4.87:_Breast_milk_protein_may_be_key_to_protecting_babies_from_HIV Breast milk protein may be key to protecting babies from HIV] ||[http://www.sciencedaily.com/releases/2013/10/131021153200.htm Povezava]||21.04.||24.04.||05.05.||Peter Pečan||Angela Mihajloska||Monika Pepelnjak
|-
| Jure Zadravec|| [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Jure_Zadravec:_Vloga_tumorskih_ozna.C4.8Devalcev_CA19-9.2C_CA125_in_CA72-4_pri_diagnozi_raka_trebu.C5.A1ne_slinavke Vloga tumorskih označevalcev CA19-9, CA125 in CA72-4 pri diagnozi raka trebušne slinavke]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/01/140121164754.htm Povezava]||21.04.||24.04.||05.05.||Živa Moravec||Božin Krstanoski||Jerneja Ovčar
|-
| Primož Tič||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Primo.C5.BE_Ti.C4.8D:_Regeneracija_osterelega_pri.C5.BEeljca_z_enim_samim_transkripcijskim_faktorjem Regeneracija ostarelega priželjca z enim samim transkripcijskim faktorjem]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/04/140408115610.htm Povezava]||05.05.||08.05.||12.05.||Tjaša Sorčan||Domagoj Majić||Anja Tanšek
|-
| Valentina Levak||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Valentina_Levak:_Protein_Juno_je_receptor_proteina_Izumo1_in_potreben_za_fertilizacijo Protein Juno je receptor proteina Izumo1 in potreben za fertilizacijo]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/04/140416133253.htm Povezava]||05.05.||08.05.||12.05.||Tomaž Žagar||Amadeja Lapornik||Anja Šantl
|-
| Enja Kokalj||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Enja_Kokalj:_Celice_med_mitozo_onemogo.C4.8Dijo_popravljanje_DNA_zaradi_spajanja_telomer Celice med mitozo onemogočijo popravljanje DNA zaradi spajanja telomer]||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/03/140320173506.htm Povezava]||05.05.||08.05.||12.05.||Fran Krstanović||Peter Pečan||Angela Mihajloska
|-
| Hasiba Kamenjaković||[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TBK2014_Povzetki_seminarjev#Hasiba_Kamenjaković:_Podobnosti_med_HIV./.AIDS.opioidne_odvisnosti_epidemije Podobnosti med HIV / AIDS, opioidne odvisnosti epidemije] ||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/04/140401162205.htm Povezava]|| 05.05.||08.05.||12.05.||Jure Zadravec||Živa Moravec||Božin Krstanoski
|-
| Luka Dejanović||||||12.05.||15.05.||19.05.||Primož Tič||Tjaša Sorčan||Domagoj Majić
|-
| Katja Malovrh||||||12.05.||15.05.||19.05.||Valentina Levak||Tomaž Žagar||Amadeja Lapornik
|-
| Nina Mavec||||[http://www.plosone.org/article/fetchObject.action?uri=info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0095684&representation=PDF Povezava]||12.05.||15.05.||19.05.||Enja Kokalj||Fran Krstanović||Peter Pečan
|-
| Anja Šantl||||||12.05.||15.05.||19.05.||Hasiba Kamenjaković||Jure Zadravec||Živa Moravec
|-
| Marija Srnko||||||19.05.||22.05.||26.05.||Luka Dejanović||Primož Tič||Tjaša Sorčan
|-
| Eva Škrjanec||||||19.05.||22.05.||26.05.||Katja Malovrh||Valentina Levak||Tomaž Žagar
|-
| Vesna Podgrajšek||||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/01/140130210734.htm Povezava]||19.05.||22.05.||26.05.||Nina Mavec||Enja Kokalj||Fran Krstanović
|-
| Nives Mikešić||||||19.05.||22.05.||26.05.||Ana Kompan||Hasiba Kamenjaković||Jure Zadravec
|-
| Liza Otorepec||||||26.05.||29.05.||02.06.||Marija Srnko||Luka Dejanović||Primož Tič
|-
| Naida Hajdarević||||[http://www.sciencedaily.com/releases/2014/05/140504133205.htm Povezava][http://www.sciencedaily.com/releases/2014/05/140501075055.htm Povezava2]||26.05.||29.05.||02.06.||Eva Škrjanec||Katja Malovrh||Valentina Levak
|-
| Nuša Kelhar||||||26.05.||29.05.||02.06.||Vesna Podgrajšek||Nina Mavec||Enja Kokalj
|-
| Tamara Božič||||||26.05.||29.05.||02.06.||Nives Mikešić||Ana Kompan||Hasiba Kamenjaković
|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2013. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete v PubMed povezavi [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ tukaj]
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2014 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
* TBK_2014_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2014_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2014_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2014_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2014_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2014_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2014_Guncar_Gregor.pptx

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1oW_38CbGfOhTcS8zqMEFvdAOS66yRtDMd_e52uoUYLw/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1XbEJ2iXlXsT3b7-jpM3pCGQazdIwskieL07-vBmRU8k/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za leto 2011 faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same.Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.google.com/url?sa=t&source=web&cd=6&sqi=2&ved=0CEUQFjAF&url=http%3A%2F%2Fwww.tre.sik.si%2Fmain%2Fpomoc%2Ffiles%2Fcitiranje_in_navajanje_virov.pdf&rct=j&q=citiranje%20po%20pravilniku%20ISO%20690&ei=jPBqTe6FC9DKswaWk-TmDA&usg=AFQjCNF8r6X9Y781sanDObaXNdCew4suUg&sig2=cTqKObSJsTicekWGRGa72g&cad=rja Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne).'''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.