Wiki FKKT - User contributions [en]

Case13a Sistem za zaznavanje genov za odpornost proti antibiotiku

2018-01-08T15:39:28Z

Nina Roštan: /* Prenos proteina v vezikle */

(Nina Roštan)
Povzeto po projektu: [http://2017.igem.org/Team:TUDelft Projekt iGEM 2017, ekipa TU Delft] 
==Uvod==
Po podatkih WHO organizacije je problematika odpornosti bakterij proti antibiotikom danes ena največjih groženj za globalno zdravje in varnost preskrbe s hrano. Cilj ekipe TU Delft na iGEM je bil reševati problem odpornosti na antibiotike s pomočjo sintezne biologije. Prvi korak k temu cilju je zmanšanje uporabe antibiotikov, ko niso nujni. Osredotočili so se na mlekarsko industrijo. Najpogostejša bolezen v mlekarski industriji je mastitis, ki je okužba kravjih vimen. Testiranje ali je okužba za določeno kravo z mastitisom povzročena z bakterijami, ki so odporne na antibiotik, je trenutno drag in težak proces. Zato običajno kmet najprej kravo zdravi s standardnimi antibiotiki. Ko ti ne delujejo, bo kmet šele poslal vzorce mleka podjetju, specializirano za diagnostiko. Po analizi vzorcev bi nato tretirali kravo z bolj primernim antibiotikom. Ekipa se je zato osredotočila na izdelavo sistema, ki na mestu zlahka in hitro odkrije gene za odpornost na antibiotike.

==Cas13a==
Za metodo detekcije genov za odpornost na antibiotike so se odločili za CRISPR-Cas sistem. Nekateri Cas proteini imajo sposobnost, da najdejo specifično RNA ali DNA sekvenco s pomočjo vodeče RNA oziroma crRNA. Ko Cas protein najde svojo ciljno DNA ali RNA, ki ustreza vodeči RNA, ciljno DNA ali RNA razcepi. Primeri teh Cas proteinov, ki imajo funkcijo iskanja in rezanja so Cas9, Cpf1 in Cas13a. Prva dva ciljata DNA, medtem ko Cas13a cilja RNA. Ekipa se je odločila za Cas13a, ki cilja RNA, po rezanju ciljne RNA pa se podvrže konformacijski spremembi in prične nespecifično rezati preostale RNA, s katerimi se sreča. Ta funkcija naredi Cas13a primerno tudi za detekcijo specifične RNA, saj je lahko aktivirana le s pomočjo specifične ciljne molekule. Po aktivaciji pa pride do iniciacije kolateralnega cepljenja molekul RNA, kar se lahko uporabi za tvorbo signala, ki ga je mogoče zaznati. Ekipa je pripravila biokocko z zapisom za Cas13a protein. Za promotor so izbrali LacUV5, ki se ga pogosto uporablja v Cas sistemih, za RBS mesto so izbrali RBS za nižjo raven izražanja. Pred sekvenco za protein so dodali zaporedje za His značko, mesto za trombin, strep značko in SUMO mesto za cepitev, ki omogočajo očiščenje proteina. Po sekvenci za protein Cas13a sledi dvojni terminator in obrnjena CRISPR sekvenca z dvema dolgima ponovitvama in vmesno sekvenco, ki se jo lahko spremeni glede na vodečo RNA, ki jo želimo uporabiti, saj ima dve restrikcijski mesti.

==Dizajn projekta==
===Iskanje motiva===
Geni bakterij, ki so odgovorni za odpornost proti določenim antibiotikom, so dobro znani in dokumentirani. Z detekcijo teh genov lahko predvidimo, ali bo določen antibiotik učinkovit ali ne. Tako bi lahko spodbudili usmerjeno uporabo antibiotikov in delno preprečili širjenje odpornosti proti antibiotikom. Iskanje motivov je problematično, saj se geni, ki kodirajo enako odpornost na antibiotike, v manjši meri razlikujejo. Ekipa je v ta namen razvila programsko orodje, ki med različicami odpornega gena identificira ohranjeno regijo. Ohranjene regije se nato naknadno pregleda, če lahko ustrezajo vodeči RNA na Cas13a proteinu. Nazadnje so zanesljivost sistema za odkrivanje ustrezne ciljne RNA ocenili s pomočjo biofizikalnega modela, ki napoveduje verjetnost pridobitve lažno pozitivnega rezultata. Ekipa je poudarila, da je modeliranje ključnega pomena za podporo laboratorijskemu delu projekta, saj želijo uporabiti sekvence vodeče RNA, ki usmerjajo Cas13a zgolj proti želenemu cilju.

===Priprava vzorca===
Da lahko Cas13a odkrije gene, odporne na antibiotike, potrebuje ciljno RNA. Ker lahko trenutne metode zaznajo samo aktivne gene, so želeli razviti metodo, ki bo sposobna zaznati prisotnost patogene DNA, tudi če ta ni aktivna. Iz okuženega mleka je potrebno DNA izolirati, ciljno DNA pa je potrebno namnožiti in prepisati v RNA. Sestavili so protokol, kjer bi DNA izolirali z segrevanjem celic na 100°C (z mikrovalovko), nato bi vzorec centrifugirali, DNA pa bi ostala v supernatantu. Nato bi DNA pomnožili s pomočjo rekombinaza polimeraza amplifikacijo (RPA), alternativa PCR, ki se jo lahko uporabi pri konstantni temperaturi 37°C in zazna tako RNA kot DNA. Oligonukleotide bi načrtali tako, da bi med pomnoževanjem vstavili tudi promotorsko mesto za T7 polimerazo. Z dodatkom T7 polimeraze bi prepisali ciljno DNA v RNA. S to pripravo vzorca je RNA sintetizirana ob konstantni temperaturi na mestu in ne potrebujemo termocikla.

===Koacervacija in metoda CINDY Seq (Coacervate Induced Nucleotide Detection of Your Sequence)===
Ime koacervat (ang. coacervate) izhaja iz latinske besede coacervare, ki pomeni »zbrati skupaj ali gruča«. Koacervat je kapljica, ki nastane v tekočini z neenako gostoto sestavin ali zaradi različnega naboja molekul. Ekipa je razvila metodo CINDY Seq, ki uporabi ta biokemijski fenomen. Dolgi negativno nabiti polimeri (vključno RNA) v kombinaciji s pozitivno nabitimi polimeri fazno separirajo v koacervate, bogate s polimeri. Ti koacervati povečajo motnost raztopine do te mere, da jo lahko opazimo z golim očesom.
Cas13a se aktivira, ko z vodečo RNA najde ciljno RNA in jo cepi. Po aktivaciji prične cepiti vse RNA molekule, ki jih sreča in jim tako prepreči, da bi prišlo do koacervacije po dodatku pozitivno nabitih molekul, saj so RNA molekule prekratke, raztopina pa bo ostala bistra. Če pa se Cas13a ne aktivira (ko ne najde ciljne RNA), pa bo raztopina postala motna.

===TDP (Tardigrad specifični intrinzično neurejeni proteini)===
Drugi del zagotavljanja sistema, ki je primeren za gospodinjsko uporabo, je zagotovitev, da je sistem enostavno prevažati in shranjevati, ne da bi ovirali njegovo funkcionalnost.
Tardigradi oziroma počasniki, znani tudi kot vodni ali vesoljski medvedki, so mikro živali sposobne preživeti številne ekstremne pogoje, med katerimi je tudi dehidracija. Nedavno so identificirali skupino Tardigrad-specifičnih proteinov, ki nimajo terciarne strukture. Tardigradi jih prozvajajo po sušenju in tvorijo steklasto matriko, ki ščiti celične sestavine. iGEM ekipa je izbrala več TDP proteinov, od katerih fragmente so naročili in izrazili v E. coli, jih izolirali ter očistili. TDP proteine so nato posušili s Cas13a proteini. Po sušenju z določenimi TDP proteini je Cas13a ohranila RNAzno aktivnost, vendar izgubila specifičnost. Ne glede na te proteine, so bili rezultati pozitivni za en TDP protein in sicer SAHS 33020, saj je po sušenju protein Cas13a znatno ohranil aktivnost in specifičnost.

===Vezikli===
Kot je tipično za sintezno biologijo, si je ekipa zamislila, da bi imeli bakterijo, ki bi vse njihove potrebne proteine (Cas13a in TDP) pridobila skupaj v paketu. Kot paket so si zamislili vezikle zunanje membrane. E. coli bakterije, proizvajajo vezikle zunanje membrane, vendar premalo in premajhne za proizvodnjo proteinov v veziklih. Zato je ekipa želela ustvariti celice, ki bi proizvajale več veziklov (hipervezikulacija), vezikle pa bi povečali iz premera od 80 do 100 nm v velikost premera od 115 do 300 nm. Glede hipervezikulacije so starejša znanstvena dela pokazala, da mutacije v genih, ki kodirajo proteinske komplekse odgovorne za stabilnost bakterijske celične stene (Tol-Pal kompleks), destabilizirajo zunanjo membrano in imajo celice več veziklov. Za destabilizacijo membrane je zato potrebno le izbiti gen za TolA protein. Za povečanje veziklov pa je lanska iGEM ekipa iz Avstralije pripravila biokocko, ki vsebuje zapis za prekomerno izražanje TolR gena, ki povzroči produkcijo večjih veziklov. Kombinacija izbitega TolA gena in prekomerno izraženega TolR gena, povzroči hipervezikulacijo veziklov velikosti do 300 nm v premeru, ki naj bi glede na računalniški model ekipe iz Delfta, lahko zajel od 80 do 900 Cas13a proteinov.

=====Prenos proteina v vezikle=====
Vezikli se proizvajajo v periplazmi, zato morajo biti proteini, ki jih želijo v veziklih, preneseni v periplazmo. Ekipa se je odločila za Tat pot. Zamislili so si, da bi pripravili fuzijski protein s TorA značko za eksport na N koncu. Fuzijski protein se v citoplazmi zloži v terciarno strukturo, nato pa se prenese v periplazmo skozi poro, ki jo tvorijo TatC proteini. Značka za eksport se nato odcepi. Da bi ekipa preverila, ali se bo protein transportiral v vezikle, so pripravili fuzijski protein TorA-GFP. Ekipa je kombinirala GFP-TA vključek v sevu divjega tipa in KEIO sevu. Preverili so, če se protein večinsko nahaja v veziklih. Po indukciji GFP-TA proteina so odfiltrirali vezikle. Rezultati so pokazali, da je intenziteta fluorescenc signifikantno višja v KEIO sevih v primerjavi z divjim tipom, ki nima TolR mutacije. Ekipa je tako lahko zaključila, da se GFP uspešno prenese v vezikle.

==Zaključek==
Namen projekta je bil, da razvijejo varno in zanesljivo metodo za zaznavanje genov, rezistentnih na antibiotik. Da so dosegli visoko specifičnost so uporabili protein Cas13a. Da so poiskali najbolj primerne vodeče RNA so razvili iskalec motiva, ki identificira ohranjene regije v bakterijskih genih, ki omogočajo rezistenco na antibiotik. Za oblikovanje signala so uporabili fenomen koacervacije, jo optimizirali in razložili biofizikalne principe. Da se lahko orodje shranjuje za dlje časa so uporabili TDP proteine tardigrada, da zaščiti Cas13a proteine. V njihovem predvidenem končnem izdelku se bakterije uporabljajo kot celične tovarne tako, da jim omogočajo proizvodnjo in izločanje vseh potrebnih proteinov v majhnih veziklih.

==Literatura==
1. [http://2017.igem.org/Team:TUDelft Projekt iGEM 2017, ekipa TU Delft] 
2. Baker, J., Chen, L., Rosenthal, J., Putnam, D., & DeLisa, M. (2014). Microbial biosynthesis of designer outer membrane vesicles. Current Opinion In Biotechnology, 29, 76-84. doi:10.1016/j.copbio.2014.02.018 
3. Boothby, T., Tapia, H., Brozena, A., Piszkiewicz, S., Smith, A., & Giovannini, I. et al. (2017). Tardigrades Use Intrinsically Disordered Proteins to Survive Desiccation. Molecular Cell, 65(6), 975-984.e5. doi:10.1016/j.molcel.2017.02.018 
4. Gootenberg, J., Abudayyeh, O., Lee, J., Essletzbichler, P., Dy, A., & Joung, J. et al. (2017). Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 356(6336), 438-442. doi:10.1126/science.aam9321

Case13a Sistem za zaznavanje genov za odpornost proti antibiotiku

2018-01-08T11:20:44Z

Nina Roštan:

(Nina Roštan)
Povzeto po projektu: [http://2017.igem.org/Team:TUDelft Projekt iGEM 2017, ekipa TU Delft] 
==Uvod==
Po podatkih WHO organizacije je problematika odpornosti bakterij proti antibiotikom danes ena največjih groženj za globalno zdravje in varnost preskrbe s hrano. Cilj ekipe TU Delft na iGEM je bil reševati problem odpornosti na antibiotike s pomočjo sintezne biologije. Prvi korak k temu cilju je zmanšanje uporabe antibiotikov, ko niso nujni. Osredotočili so se na mlekarsko industrijo. Najpogostejša bolezen v mlekarski industriji je mastitis, ki je okužba kravjih vimen. Testiranje ali je okužba za določeno kravo z mastitisom povzročena z bakterijami, ki so odporne na antibiotik, je trenutno drag in težak proces. Zato običajno kmet najprej kravo zdravi s standardnimi antibiotiki. Ko ti ne delujejo, bo kmet šele poslal vzorce mleka podjetju, specializirano za diagnostiko. Po analizi vzorcev bi nato tretirali kravo z bolj primernim antibiotikom. Ekipa se je zato osredotočila na izdelavo sistema, ki na mestu zlahka in hitro odkrije gene za odpornost na antibiotike.

==Cas13a==
Za metodo detekcije genov za odpornost na antibiotike so se odločili za CRISPR-Cas sistem. Nekateri Cas proteini imajo sposobnost, da najdejo specifično RNA ali DNA sekvenco s pomočjo vodeče RNA oziroma crRNA. Ko Cas protein najde svojo ciljno DNA ali RNA, ki ustreza vodeči RNA, ciljno DNA ali RNA razcepi. Primeri teh Cas proteinov, ki imajo funkcijo iskanja in rezanja so Cas9, Cpf1 in Cas13a. Prva dva ciljata DNA, medtem ko Cas13a cilja RNA. Ekipa se je odločila za Cas13a, ki cilja RNA, po rezanju ciljne RNA pa se podvrže konformacijski spremembi in prične nespecifično rezati preostale RNA, s katerimi se sreča. Ta funkcija naredi Cas13a primerno tudi za detekcijo specifične RNA, saj je lahko aktivirana le s pomočjo specifične ciljne molekule. Po aktivaciji pa pride do iniciacije kolateralnega cepljenja molekul RNA, kar se lahko uporabi za tvorbo signala, ki ga je mogoče zaznati. Ekipa je pripravila biokocko z zapisom za Cas13a protein. Za promotor so izbrali LacUV5, ki se ga pogosto uporablja v Cas sistemih, za RBS mesto so izbrali RBS za nižjo raven izražanja. Pred sekvenco za protein so dodali zaporedje za His značko, mesto za trombin, strep značko in SUMO mesto za cepitev, ki omogočajo očiščenje proteina. Po sekvenci za protein Cas13a sledi dvojni terminator in obrnjena CRISPR sekvenca z dvema dolgima ponovitvama in vmesno sekvenco, ki se jo lahko spremeni glede na vodečo RNA, ki jo želimo uporabiti, saj ima dve restrikcijski mesti.

==Dizajn projekta==
===Iskanje motiva===
Geni bakterij, ki so odgovorni za odpornost proti določenim antibiotikom, so dobro znani in dokumentirani. Z detekcijo teh genov lahko predvidimo, ali bo določen antibiotik učinkovit ali ne. Tako bi lahko spodbudili usmerjeno uporabo antibiotikov in delno preprečili širjenje odpornosti proti antibiotikom. Iskanje motivov je problematično, saj se geni, ki kodirajo enako odpornost na antibiotike, v manjši meri razlikujejo. Ekipa je v ta namen razvila programsko orodje, ki med različicami odpornega gena identificira ohranjeno regijo. Ohranjene regije se nato naknadno pregleda, če lahko ustrezajo vodeči RNA na Cas13a proteinu. Nazadnje so zanesljivost sistema za odkrivanje ustrezne ciljne RNA ocenili s pomočjo biofizikalnega modela, ki napoveduje verjetnost pridobitve lažno pozitivnega rezultata. Ekipa je poudarila, da je modeliranje ključnega pomena za podporo laboratorijskemu delu projekta, saj želijo uporabiti sekvence vodeče RNA, ki usmerjajo Cas13a zgolj proti želenemu cilju.

===Priprava vzorca===
Da lahko Cas13a odkrije gene, odporne na antibiotike, potrebuje ciljno RNA. Ker lahko trenutne metode zaznajo samo aktivne gene, so želeli razviti metodo, ki bo sposobna zaznati prisotnost patogene DNA, tudi če ta ni aktivna. Iz okuženega mleka je potrebno DNA izolirati, ciljno DNA pa je potrebno namnožiti in prepisati v RNA. Sestavili so protokol, kjer bi DNA izolirali z segrevanjem celic na 100°C (z mikrovalovko), nato bi vzorec centrifugirali, DNA pa bi ostala v supernatantu. Nato bi DNA pomnožili s pomočjo rekombinaza polimeraza amplifikacijo (RPA), alternativa PCR, ki se jo lahko uporabi pri konstantni temperaturi 37°C in zazna tako RNA kot DNA. Oligonukleotide bi načrtali tako, da bi med pomnoževanjem vstavili tudi promotorsko mesto za T7 polimerazo. Z dodatkom T7 polimeraze bi prepisali ciljno DNA v RNA. S to pripravo vzorca je RNA sintetizirana ob konstantni temperaturi na mestu in ne potrebujemo termocikla.

===Koacervacija in metoda CINDY Seq (Coacervate Induced Nucleotide Detection of Your Sequence)===
Ime koacervat (ang. coacervate) izhaja iz latinske besede coacervare, ki pomeni »zbrati skupaj ali gruča«. Koacervat je kapljica, ki nastane v tekočini z neenako gostoto sestavin ali zaradi različnega naboja molekul. Ekipa je razvila metodo CINDY Seq, ki uporabi ta biokemijski fenomen. Dolgi negativno nabiti polimeri (vključno RNA) v kombinaciji s pozitivno nabitimi polimeri fazno separirajo v koacervate, bogate s polimeri. Ti koacervati povečajo motnost raztopine do te mere, da jo lahko opazimo z golim očesom.
Cas13a se aktivira, ko z vodečo RNA najde ciljno RNA in jo cepi. Po aktivaciji prične cepiti vse RNA molekule, ki jih sreča in jim tako prepreči, da bi prišlo do koacervacije po dodatku pozitivno nabitih molekul, saj so RNA molekule prekratke, raztopina pa bo ostala bistra. Če pa se Cas13a ne aktivira (ko ne najde ciljne RNA), pa bo raztopina postala motna.

===TDP (Tardigrad specifični intrinzično neurejeni proteini)===
Drugi del zagotavljanja sistema, ki je primeren za gospodinjsko uporabo, je zagotovitev, da je sistem enostavno prevažati in shranjevati, ne da bi ovirali njegovo funkcionalnost.
Tardigradi oziroma počasniki, znani tudi kot vodni ali vesoljski medvedki, so mikro živali sposobne preživeti številne ekstremne pogoje, med katerimi je tudi dehidracija. Nedavno so identificirali skupino Tardigrad-specifičnih proteinov, ki nimajo terciarne strukture. Tardigradi jih prozvajajo po sušenju in tvorijo steklasto matriko, ki ščiti celične sestavine. iGEM ekipa je izbrala več TDP proteinov, od katerih fragmente so naročili in izrazili v E. coli, jih izolirali ter očistili. TDP proteine so nato posušili s Cas13a proteini. Po sušenju z določenimi TDP proteini je Cas13a ohranila RNAzno aktivnost, vendar izgubila specifičnost. Ne glede na te proteine, so bili rezultati pozitivni za en TDP protein in sicer SAHS 33020, saj je po sušenju protein Cas13a znatno ohranil aktivnost in specifičnost.

===Vezikli===
Kot je tipično za sintezno biologijo, si je ekipa zamislila, da bi imeli bakterijo, ki bi vse njihove potrebne proteine (Cas13a in TDP) pridobila skupaj v paketu. Kot paket so si zamislili vezikle zunanje membrane. E. coli bakterije, proizvajajo vezikle zunanje membrane, vendar premalo in premajhne za proizvodnjo proteinov v veziklih. Zato je ekipa želela ustvariti celice, ki bi proizvajale več veziklov (hipervezikulacija), vezikle pa bi povečali iz premera od 80 do 100 nm v velikost premera od 115 do 300 nm. Glede hipervezikulacije so starejša znanstvena dela pokazala, da mutacije v genih, ki kodirajo proteinske komplekse odgovorne za stabilnost bakterijske celične stene (Tol-Pal kompleks), destabilizirajo zunanjo membrano in imajo celice več veziklov. Za destabilizacijo membrane je zato potrebno le izbiti gen za TolA protein. Za povečanje veziklov pa je lanska iGEM ekipa iz Avstralije pripravila biokocko, ki vsebuje zapis za prekomerno izražanje TolR gena, ki povzroči produkcijo večjih veziklov. Kombinacija izbitega TolA gena in prekomerno izraženega TolR gena, povzroči hipervezikulacijo veziklov velikosti do 300 nm v premeru, ki naj bi glede na računalniški model ekipe iz Delfta, lahko zajel od 80 do 900 Cas13a proteinov.

=====Prenos proteina v vezikle=====
Vezikli se proizvajajo v periplazmi, zato morajo biti proteini, ki jih želijo v veziklih, preneseni v periplazmo. Ekipa se je odločila za Tat pot, ki vsebuje TorA fuzijski protein z značko za eksport na N koncu. Fuzijski protein se v citoplazmi zloži v terciarno strukturo, nato pa se prenese v periplazmo skozi poro, ki jo tvorijo TatC proteini. Značka za eksport se nato odcepi. Da bi ekipa preverila, ali se bo protein transportiral v vezikle, so pripravili fuzijski protein TorA-GFP. Ekipa je kombinirala GFP-TA vključek v sevu divjega tipa in KEIO sevu. Preverili so, če se protein večinsko nahaja v veziklih. Po indukciji GFP-TA proteina so odfiltrirali vezikle. Rezultati so pokazali, da je intenziteta fluorescenc signifikantno višja v KEIO sevih v primerjavi z divjim tipom, ki nima TolR mutacije. Ekipa je tako lahko zaključila, da se GFP uspešno prenese v vezikle.

==Zaključek==
Namen projekta je bil, da razvijejo varno in zanesljivo metodo za zaznavanje genov, rezistentnih na antibiotik. Da so dosegli visoko specifičnost so uporabili protein Cas13a. Da so poiskali najbolj primerne vodeče RNA so razvili iskalec motiva, ki identificira ohranjene regije v bakterijskih genih, ki omogočajo rezistenco na antibiotik. Za oblikovanje signala so uporabili fenomen koacervacije, jo optimizirali in razložili biofizikalne principe. Da se lahko orodje shranjuje za dlje časa so uporabili TDP proteine tardigrada, da zaščiti Cas13a proteine. V njihovem predvidenem končnem izdelku se bakterije uporabljajo kot celične tovarne tako, da jim omogočajo proizvodnjo in izločanje vseh potrebnih proteinov v majhnih veziklih.

==Literatura==
1. [http://2017.igem.org/Team:TUDelft Projekt iGEM 2017, ekipa TU Delft] 
2. Baker, J., Chen, L., Rosenthal, J., Putnam, D., & DeLisa, M. (2014). Microbial biosynthesis of designer outer membrane vesicles. Current Opinion In Biotechnology, 29, 76-84. doi:10.1016/j.copbio.2014.02.018 
3. Boothby, T., Tapia, H., Brozena, A., Piszkiewicz, S., Smith, A., & Giovannini, I. et al. (2017). Tardigrades Use Intrinsically Disordered Proteins to Survive Desiccation. Molecular Cell, 65(6), 975-984.e5. doi:10.1016/j.molcel.2017.02.018 
4. Gootenberg, J., Abudayyeh, O., Lee, J., Essletzbichler, P., Dy, A., & Joung, J. et al. (2017). Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 356(6336), 438-442. doi:10.1126/science.aam9321

Case13a Sistem za zaznavanje genov za odpornost proti antibiotiku

2018-01-08T10:49:09Z

Nina Roštan: /* Uvod */

(Nina Roštan)
Povzeto po projektu: [http://2017.igem.org/Team:TUDelft Projekt iGEM 2017, ekipa TU Delft] 
==Uvod==
Po podatkih WHO organizacije je problematika odpornosti bakterij proti antibiotikom danes ena največjih groženj za globalno zdravje in varnost preskrbe s hrano. Cilj ekipe TU Delft na iGEM je bil reševati problem odpornosti na antibiotike s pomočjo sintezne biologije. Prvi korak k temu cilju je zmanšanje uporabe antibiotikov, ko niso nujni. Osredotočili so se na mlekarsko industrijo. Najpogostejša bolezen v mlekarski industriji je mastitis, ki je okužba kravjih vimen. Testiranje ali je okužba za določeno kravo z mastitisom povzročena z bakterijami, ki so odporne na antibiotik, je trenutno drag in težak proces. Zato običajno kmet najprej kravo zdravi s standardnimi antibiotiki. Ko ti ne delujejo, bo kmet šele poslal vzorce mleka podjetju, specializirano za diagnostiko. Po analizi vzorcev bi nato tretirali kravo z bolj primernim antibiotikom. Ekipa se je zato osredotočila na izdelavo sistema, ki na mestu zlahka in hitro odkrije gene za odpornost na antibiotike.

==Cas13a==
Za metodo detekcije genov za odpornost na antibiotike so se odločili za CRISPR-Cas sistem. Nekateri Cas proteini imajo sposobnost, da najdejo specifično RNA ali DNA sekvenco s pomočjo vodeče RNA oziroma crRNA. Ko Cas protein najde svojo ciljno DNA ali RNA, ki ustreza vodeči RNA, ciljno DNA ali RNA razcepi. Primeri teh Cas proteinov, ki imajo funkcijo iskanja in rezanja so Cas9, Cpf1 in Cas13a. Prva dva ciljata DNA, medtem ko Cas13a cilja RNA. Ekipa se je odločila za Cas13a, ki cilja RNA, po rezanju ciljne RNA pa se podvrže konformacijski spremembi in prične nespecifično rezati preostale RNA, s katerimi se sreča. Ta funkcija naredi Cas13a primerno tudi za detekcijo specifične RNA, saj je lahko aktivirana le s pomočjo specifične ciljne molekule. Po aktivaciji pa pride do iniciacije kolateralnega cepljenja molekul RNA, kar se lahko uporabi za tvorbo signala, ki ga je mogoče zaznati. Ekipa je pripravila biokocko z zapisom za Cas13a protein. Za promotor so izbrali LacUV5, ki se ga pogosto uporablja v Cas sistemih, za RBS mesto so izbrali mesto z zmanjšanim vezanjem ribosoma. Pred sekvenco za protein so dodali zaporedje za His značko, mesto za trombin, strep značko in SUMO mesto za cepitev, ki omogočajo očiščenje proteina. Po sekvenci za protein Cas13a sledi dvojni terminator in obrnjena CRISPR sekvenca z dvema dolgima ponovitvama in vmesno sekvenco, ki se jo lahko spremeni glede na vodečo RNA, ki jo želimo uporabiti, saj ima dve restrikcijski mesti.

==Dizajn projekta==
===Iskanje motiva===
Geni bakterij, ki so odgovorni za odpornost proti določenim antibiotikom, so dobro znani in dokumentirani. Z detekcijo teh genov lahko predvidimo, ali bo določen antibiotik učinkovit ali ne. Tako bi lahko spodbudili usmerjeno uporabo antibiotikov in delno preprečili širjenje odpornosti proti antibiotikom. Iskanje motivov je problematično, saj se geni, ki kodirajo enako odpornost na antibiotike, v manjši meri razlikujejo. Ekipa je v ta namen razvila programsko orodje, ki med različicami odpornega gena identificira ohranjeno regijo. Ohranjene regije se nato naknadno pregleda, če lahko ustrezajo vodeči RNA na Cas13a proteinu. Nazadnje so zanesljivost sistema za odkrivanje ustrezne ciljne RNA ocenili s pomočjo biofizikalnega modela, ki napoveduje verjetnost pridobitve lažno pozitivnega rezultata. Ekipa je poudarila, da je modeliranje ključnega pomena za podporo laboratorijskemu delu projekta, saj želijo uporabiti sekvence vodeče RNA, ki usmerjajo Cas13a zgolj proti želenemu cilju.

===Priprava vzorca===
Da lahko Cas13a odkrije gene, odporne na antibiotike, potrebuje ciljno RNA. Ker lahko trenutne metode zaznajo samo aktivne gene, so želeli razviti metodo, ki bo sposobna zaznati prisotnost patogene DNA, tudi če ta ni aktivna. Iz okuženega mleka je potrebno DNA izolirati, ciljno DNA pa je potrebno namnožiti in prepisati v RNA. Sestavili so protokol, kjer bi DNA izolirali z segrevanjem celic na 100°C (z mikrovalovko), nato bi vzorec centrifugirali, DNA pa bi ostala v supernatantu. Nato bi DNA pomnožili s pomočjo rekombinaza polimeraza amplifikacijo (RPA), alternativa PCR, ki se jo lahko uporabi pri konstantni temperaturi 37°C in zazna tako RNA kot DNA. Oligonukleotide bi načrtali tako, da bi med pomnoževanjem vstavili tudi promotorsko mesto za T7 polimerazo. Z dodatkom T7 polimeraze bi prepisali ciljno DNA v RNA. S to pripravo vzorca je RNA sintetizirana ob konstantni temperaturi na mestu in ne potrebujemo termocikla.

===Koacervacija in metoda CINDY Seq (Coacervate Induced Nucleotide Detection of Your Sequence)===
Ime koacervat (ang. coacervate) izhaja iz latinske besede coacervare, ki pomeni »zbrati skupaj ali gruča«. Koacervat je kapljica, ki nastane v tekočini z neenako gostoto sestavin ali zaradi različnega naboja molekul. Ekipa je razvila metodo CINDY Seq, ki uporabi ta biokemijski fenomen. Dolgi negativno nabiti polimeri (vključno RNA) v kombinaciji s pozitivno nabitimi polimeri fazno separirajo v koacervate, bogate s polimeri. Ti koacervati povečajo motnost raztopine do te mere, da jo lahko opazimo z golim očesom.
Cas13a se aktivira, ko z vodečo RNA najde ciljno RNA in jo cepi. Po aktivaciji prične cepiti vse RNA molekule, ki jih sreča in jim tako prepreči, da bi prišlo do koacervacije po dodatku pozitivno nabitih molekul, saj so RNA molekule prekratke, raztopina pa bo ostala bistra. Če pa se Cas13a ne aktivira (ko ne najde ciljne RNA), pa bo raztopina postala motna.

===TDP (Tardigrad specifični intrinzično neurejeni proteini)===
Drugi del zagotavljanja sistema, ki je primeren za gospodinjsko uporabo, je zagotovitev, da je sistem enostavno prevažati in shranjevati, ne da bi ovirali njegovo funkcionalnost.
Tardigradi oziroma počasniki, znani tudi kot vodni ali vesoljski medvedki, so mikro živali sposobne preživeti številne ekstremne pogoje, med katerimi je tudi dehidracija. Nedavno so identificirali skupino Tardigrad-specifičnih proteinov, ki nimajo terciarne strukture. Tardigradi jih prozvajajo po sušenju in tvorijo steklasto matriko, ki ščiti celične sestavine. iGEM ekipa je izbrala več TDP proteinov, od katerih fragmente so naročili in izrazili v E. coli, jih izolirali ter očistili. TDP proteine so nato posušili s Cas13a proteini. Po sušenju z določenimi TDP proteini je Cas13a ohranila RNAzno aktivnost, vendar izgubila specifičnost. Ne glede na te proteine, so bili rezultati pozitivni za en TDP protein in sicer SAHS 33020, saj je po sušenju protein Cas13a znatno ohranil aktivnost in specifičnost.

===Vezikli===
Kot je tipično za sintezno biologijo, si je ekipa zamislila, da bi imeli bakterijo, ki bi vse njihove potrebne proteine (Cas13a in TDP) pridobila skupaj v paketu. Kot paket so si zamislili vezikle zunanje membrane. E. coli bakterije, proizvajajo vezikle zunanje membrane, vendar premalo in premajhne za proizvodnjo proteinov v veziklih. Zato je ekipa želela ustvariti celice, ki bi proizvajale več veziklov (hipervezikulacija), vezikle pa bi povečali iz premera od 80 do 100 nm v velikost premera od 115 do 300 nm. Glede hipervezikulacije so starejša znanstvena dela pokazala, da mutacije v genih, ki kodirajo proteinske komplekse odgovorne za stabilnost bakterijske celične stene (Tol-Pal kompleks), destabilizirajo zunanjo membrano in imajo celice več veziklov. Za destabilizacijo membrane je zato potrebno le izbiti gen za TolA protein. Za povečanje veziklov pa je lanska iGEM ekipa iz Avstralije pripravila biokocko, ki vsebuje zapis za prekomerno izražanje TolR gena, ki povzroči produkcijo večjih veziklov. Kombinacija izbitega TolA gena in prekomerno izraženega TolR gena, povzroči hipervezikulacijo veziklov velikosti do 300 nm v premeru, ki naj bi glede na računalniški model ekipe iz Delfta, lahko zajel od 80 do 900 Cas13a proteinov.

=====Prenos proteina v vezikle=====
Vezikli se proizvajajo v periplazmi, zato morajo biti proteini, ki jih želijo v veziklih, preneseni v periplazmo. Ekipa se je odločila za Tat pot, ki vsebuje TorA fuzijski protein z značko za eksport na N koncu. Fuzijski protein se v citoplazmi zloži v terciarno strukturo, nato pa se prenese v periplazmo skozi poro, ki jo tvorijo TatC proteini. Značka za eksport se nato odcepi. Da bi ekipa preverila, ali se bo protein transportiral v vezikle, so pripravili fuzijski protein TorA-GFP. Ekipa je kombinirala GFP-TA vključek v sevu divjega tipa in KEIO sevu. Preverili so, če se protein večinsko nahaja v veziklih. Po indukciji GFP-TA proteina so odfiltrirali vezikle. Rezultati so pokazali, da je intenziteta fluorescenc signifikantno višja v KEIO sevih v primerjavi z divjim tipom, ki nima TolR mutacije. Ekipa je tako lahko zaključila, da se GFP uspešno prenese v vezikle.

==Zaključek==
Namen projekta je bil, da razvijejo varno in zanesljivo metodo za zaznavanje genov, rezistentnih na antibiotik. Da so dosegli visoko specifičnost so uporabili protein Cas13a. Da so poiskali najbolj primerne vodeče RNA so razvili iskalec motiva, ki identificira ohranjene regije v bakterijskih genih, ki omogočajo rezistenco na antibiotik. Za oblikovanje signala so uporabili fenomen koacervacije, jo optimizirali in razložili biofizikalne principe. Da se lahko orodje shranjuje za dlje časa so uporabili TDP proteine tardigrada, da zaščiti Cas13a proteine. V njihovem predvidenem končnem izdelku se bakterije uporabljajo kot celične tovarne tako, da jim omogočajo proizvodnjo in izločanje vseh potrebnih proteinov v majhnih veziklih.

==Literatura==
1. [http://2017.igem.org/Team:TUDelft Projekt iGEM 2017, ekipa TU Delft] 
2. Baker, J., Chen, L., Rosenthal, J., Putnam, D., & DeLisa, M. (2014). Microbial biosynthesis of designer outer membrane vesicles. Current Opinion In Biotechnology, 29, 76-84. doi:10.1016/j.copbio.2014.02.018 
3. Boothby, T., Tapia, H., Brozena, A., Piszkiewicz, S., Smith, A., & Giovannini, I. et al. (2017). Tardigrades Use Intrinsically Disordered Proteins to Survive Desiccation. Molecular Cell, 65(6), 975-984.e5. doi:10.1016/j.molcel.2017.02.018 
4. Gootenberg, J., Abudayyeh, O., Lee, J., Essletzbichler, P., Dy, A., & Joung, J. et al. (2017). Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 356(6336), 438-442. doi:10.1126/science.aam9321

Case13a Sistem za zaznavanje genov za odpornost proti antibiotiku

2018-01-08T10:47:46Z

Nina Roštan: /* Uvod */

(Nina Roštan)
Povzeto po projektu: [http://2017.igem.org/Team:TUDelft Projekt iGEM 2017, ekipa TU Delft] 
==Uvod==
Po podatkih WHO organizacije je problematika odpornosti bakterij proti antibiotikom danes ena največjih groženj za globalno zdravje in varnost preskrbe s hrano. Cilj ekipe TU Delft na iGEM je bil reševati problem odpornosti na antibiotike s pomočjo sintezne biologije. Prvi korak k temu cilju je zmanšanje uporabe antibiotikov, ko niso nujni. Osredotočili so se na mlekarsko industrijo. Najpogostejša bolezen v mlekarski industriji je mastitis, ki je okužba kravjih vimen. Testiranje, ali je okužba za določeno kravo z mastitisom povzročena z bakterijami, ki so odporne na antibiotik, je trenutno drag in težak proces. Zato običajno kmet najprej kravo zdravi s standardnimi antibiotiki. Ko ti ne delujejo, bo kmet šele poslal vzorce mleka podjetju, specializirano za diagnostiko. Po analizi vzorcev bi nato tretirali kravo z bolj primernim antibiotikom. Ekipa se je zato osredotočila na izdelavo sistema, ki na mestu zlahka in hitro odkrije gene za odpornost na antibiotike.

==Cas13a==
Za metodo detekcije genov za odpornost na antibiotike so se odločili za CRISPR-Cas sistem. Nekateri Cas proteini imajo sposobnost, da najdejo specifično RNA ali DNA sekvenco s pomočjo vodeče RNA oziroma crRNA. Ko Cas protein najde svojo ciljno DNA ali RNA, ki ustreza vodeči RNA, ciljno DNA ali RNA razcepi. Primeri teh Cas proteinov, ki imajo funkcijo iskanja in rezanja so Cas9, Cpf1 in Cas13a. Prva dva ciljata DNA, medtem ko Cas13a cilja RNA. Ekipa se je odločila za Cas13a, ki cilja RNA, po rezanju ciljne RNA pa se podvrže konformacijski spremembi in prične nespecifično rezati preostale RNA, s katerimi se sreča. Ta funkcija naredi Cas13a primerno tudi za detekcijo specifične RNA, saj je lahko aktivirana le s pomočjo specifične ciljne molekule. Po aktivaciji pa pride do iniciacije kolateralnega cepljenja molekul RNA, kar se lahko uporabi za tvorbo signala, ki ga je mogoče zaznati. Ekipa je pripravila biokocko z zapisom za Cas13a protein. Za promotor so izbrali LacUV5, ki se ga pogosto uporablja v Cas sistemih, za RBS mesto so izbrali mesto z zmanjšanim vezanjem ribosoma. Pred sekvenco za protein so dodali zaporedje za His značko, mesto za trombin, strep značko in SUMO mesto za cepitev, ki omogočajo očiščenje proteina. Po sekvenci za protein Cas13a sledi dvojni terminator in obrnjena CRISPR sekvenca z dvema dolgima ponovitvama in vmesno sekvenco, ki se jo lahko spremeni glede na vodečo RNA, ki jo želimo uporabiti, saj ima dve restrikcijski mesti.

==Dizajn projekta==
===Iskanje motiva===
Geni bakterij, ki so odgovorni za odpornost proti določenim antibiotikom, so dobro znani in dokumentirani. Z detekcijo teh genov lahko predvidimo, ali bo določen antibiotik učinkovit ali ne. Tako bi lahko spodbudili usmerjeno uporabo antibiotikov in delno preprečili širjenje odpornosti proti antibiotikom. Iskanje motivov je problematično, saj se geni, ki kodirajo enako odpornost na antibiotike, v manjši meri razlikujejo. Ekipa je v ta namen razvila programsko orodje, ki med različicami odpornega gena identificira ohranjeno regijo. Ohranjene regije se nato naknadno pregleda, če lahko ustrezajo vodeči RNA na Cas13a proteinu. Nazadnje so zanesljivost sistema za odkrivanje ustrezne ciljne RNA ocenili s pomočjo biofizikalnega modela, ki napoveduje verjetnost pridobitve lažno pozitivnega rezultata. Ekipa je poudarila, da je modeliranje ključnega pomena za podporo laboratorijskemu delu projekta, saj želijo uporabiti sekvence vodeče RNA, ki usmerjajo Cas13a zgolj proti želenemu cilju.

===Priprava vzorca===
Da lahko Cas13a odkrije gene, odporne na antibiotike, potrebuje ciljno RNA. Ker lahko trenutne metode zaznajo samo aktivne gene, so želeli razviti metodo, ki bo sposobna zaznati prisotnost patogene DNA, tudi če ta ni aktivna. Iz okuženega mleka je potrebno DNA izolirati, ciljno DNA pa je potrebno namnožiti in prepisati v RNA. Sestavili so protokol, kjer bi DNA izolirali z segrevanjem celic na 100°C (z mikrovalovko), nato bi vzorec centrifugirali, DNA pa bi ostala v supernatantu. Nato bi DNA pomnožili s pomočjo rekombinaza polimeraza amplifikacijo (RPA), alternativa PCR, ki se jo lahko uporabi pri konstantni temperaturi 37°C in zazna tako RNA kot DNA. Oligonukleotide bi načrtali tako, da bi med pomnoževanjem vstavili tudi promotorsko mesto za T7 polimerazo. Z dodatkom T7 polimeraze bi prepisali ciljno DNA v RNA. S to pripravo vzorca je RNA sintetizirana ob konstantni temperaturi na mestu in ne potrebujemo termocikla.

===Koacervacija in metoda CINDY Seq (Coacervate Induced Nucleotide Detection of Your Sequence)===
Ime koacervat (ang. coacervate) izhaja iz latinske besede coacervare, ki pomeni »zbrati skupaj ali gruča«. Koacervat je kapljica, ki nastane v tekočini z neenako gostoto sestavin ali zaradi različnega naboja molekul. Ekipa je razvila metodo CINDY Seq, ki uporabi ta biokemijski fenomen. Dolgi negativno nabiti polimeri (vključno RNA) v kombinaciji s pozitivno nabitimi polimeri fazno separirajo v koacervate, bogate s polimeri. Ti koacervati povečajo motnost raztopine do te mere, da jo lahko opazimo z golim očesom.
Cas13a se aktivira, ko z vodečo RNA najde ciljno RNA in jo cepi. Po aktivaciji prične cepiti vse RNA molekule, ki jih sreča in jim tako prepreči, da bi prišlo do koacervacije po dodatku pozitivno nabitih molekul, saj so RNA molekule prekratke, raztopina pa bo ostala bistra. Če pa se Cas13a ne aktivira (ko ne najde ciljne RNA), pa bo raztopina postala motna.

===TDP (Tardigrad specifični intrinzično neurejeni proteini)===
Drugi del zagotavljanja sistema, ki je primeren za gospodinjsko uporabo, je zagotovitev, da je sistem enostavno prevažati in shranjevati, ne da bi ovirali njegovo funkcionalnost.
Tardigradi oziroma počasniki, znani tudi kot vodni ali vesoljski medvedki, so mikro živali sposobne preživeti številne ekstremne pogoje, med katerimi je tudi dehidracija. Nedavno so identificirali skupino Tardigrad-specifičnih proteinov, ki nimajo terciarne strukture. Tardigradi jih prozvajajo po sušenju in tvorijo steklasto matriko, ki ščiti celične sestavine. iGEM ekipa je izbrala več TDP proteinov, od katerih fragmente so naročili in izrazili v E. coli, jih izolirali ter očistili. TDP proteine so nato posušili s Cas13a proteini. Po sušenju z določenimi TDP proteini je Cas13a ohranila RNAzno aktivnost, vendar izgubila specifičnost. Ne glede na te proteine, so bili rezultati pozitivni za en TDP protein in sicer SAHS 33020, saj je po sušenju protein Cas13a znatno ohranil aktivnost in specifičnost.

===Vezikli===
Kot je tipično za sintezno biologijo, si je ekipa zamislila, da bi imeli bakterijo, ki bi vse njihove potrebne proteine (Cas13a in TDP) pridobila skupaj v paketu. Kot paket so si zamislili vezikle zunanje membrane. E. coli bakterije, proizvajajo vezikle zunanje membrane, vendar premalo in premajhne za proizvodnjo proteinov v veziklih. Zato je ekipa želela ustvariti celice, ki bi proizvajale več veziklov (hipervezikulacija), vezikle pa bi povečali iz premera od 80 do 100 nm v velikost premera od 115 do 300 nm. Glede hipervezikulacije so starejša znanstvena dela pokazala, da mutacije v genih, ki kodirajo proteinske komplekse odgovorne za stabilnost bakterijske celične stene (Tol-Pal kompleks), destabilizirajo zunanjo membrano in imajo celice več veziklov. Za destabilizacijo membrane je zato potrebno le izbiti gen za TolA protein. Za povečanje veziklov pa je lanska iGEM ekipa iz Avstralije pripravila biokocko, ki vsebuje zapis za prekomerno izražanje TolR gena, ki povzroči produkcijo večjih veziklov. Kombinacija izbitega TolA gena in prekomerno izraženega TolR gena, povzroči hipervezikulacijo veziklov velikosti do 300 nm v premeru, ki naj bi glede na računalniški model ekipe iz Delfta, lahko zajel od 80 do 900 Cas13a proteinov.

=====Prenos proteina v vezikle=====
Vezikli se proizvajajo v periplazmi, zato morajo biti proteini, ki jih želijo v veziklih, preneseni v periplazmo. Ekipa se je odločila za Tat pot, ki vsebuje TorA fuzijski protein z značko za eksport na N koncu. Fuzijski protein se v citoplazmi zloži v terciarno strukturo, nato pa se prenese v periplazmo skozi poro, ki jo tvorijo TatC proteini. Značka za eksport se nato odcepi. Da bi ekipa preverila, ali se bo protein transportiral v vezikle, so pripravili fuzijski protein TorA-GFP. Ekipa je kombinirala GFP-TA vključek v sevu divjega tipa in KEIO sevu. Preverili so, če se protein večinsko nahaja v veziklih. Po indukciji GFP-TA proteina so odfiltrirali vezikle. Rezultati so pokazali, da je intenziteta fluorescenc signifikantno višja v KEIO sevih v primerjavi z divjim tipom, ki nima TolR mutacije. Ekipa je tako lahko zaključila, da se GFP uspešno prenese v vezikle.

==Zaključek==
Namen projekta je bil, da razvijejo varno in zanesljivo metodo za zaznavanje genov, rezistentnih na antibiotik. Da so dosegli visoko specifičnost so uporabili protein Cas13a. Da so poiskali najbolj primerne vodeče RNA so razvili iskalec motiva, ki identificira ohranjene regije v bakterijskih genih, ki omogočajo rezistenco na antibiotik. Za oblikovanje signala so uporabili fenomen koacervacije, jo optimizirali in razložili biofizikalne principe. Da se lahko orodje shranjuje za dlje časa so uporabili TDP proteine tardigrada, da zaščiti Cas13a proteine. V njihovem predvidenem končnem izdelku se bakterije uporabljajo kot celične tovarne tako, da jim omogočajo proizvodnjo in izločanje vseh potrebnih proteinov v majhnih veziklih.

==Literatura==
1. [http://2017.igem.org/Team:TUDelft Projekt iGEM 2017, ekipa TU Delft] 
2. Baker, J., Chen, L., Rosenthal, J., Putnam, D., & DeLisa, M. (2014). Microbial biosynthesis of designer outer membrane vesicles. Current Opinion In Biotechnology, 29, 76-84. doi:10.1016/j.copbio.2014.02.018 
3. Boothby, T., Tapia, H., Brozena, A., Piszkiewicz, S., Smith, A., & Giovannini, I. et al. (2017). Tardigrades Use Intrinsically Disordered Proteins to Survive Desiccation. Molecular Cell, 65(6), 975-984.e5. doi:10.1016/j.molcel.2017.02.018 
4. Gootenberg, J., Abudayyeh, O., Lee, J., Essletzbichler, P., Dy, A., & Joung, J. et al. (2017). Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 356(6336), 438-442. doi:10.1126/science.aam9321

Case13a Sistem za zaznavanje genov za odpornost proti antibiotiku

2018-01-08T10:46:55Z

Nina Roštan: /* Uvod */

(Nina Roštan)
Povzeto po projektu: [http://2017.igem.org/Team:TUDelft Projekt iGEM 2017, ekipa TU Delft] 
==Uvod==
Po podatkih WHO organizacije je problematika odpornosti bakterij proti antibiotikom danes ena največjih groženj za globalno zdravje in varnost preskrbe s hrano. Cilj ekipe TU Delft na iGEM je bil reševati problem odpornosti na antibiotike s pomočjo sintezne biologije. Prvi korak k temu cilju je bil zmanjšati uporabo antibiotikov, ko niso nujni. Osredotočili so se na mlekarsko industrijo. Najpogostejša bolezen v mlekarski industriji je mastitis, ki je okužba kravjih vimen. Testiranje, ali je okužba za določeno kravo z mastitisom povzročena z bakterijami, ki so odporne na antibiotik, je trenutno drag in težak proces. Zato običajno kmet najprej kravo zdravi s standardnimi antibiotiki. Ko ti ne delujejo, bo kmet šele poslal vzorce mleka podjetju, specializirano za diagnostiko. Po analizi vzorcev bi nato tretirali kravo z bolj primernim antibiotikom. Ekipa se je zato osredotočila na izdelavo sistema, ki na mestu zlahka in hitro odkrije gene za odpornost na antibiotike.

==Cas13a==
Za metodo detekcije genov za odpornost na antibiotike so se odločili za CRISPR-Cas sistem. Nekateri Cas proteini imajo sposobnost, da najdejo specifično RNA ali DNA sekvenco s pomočjo vodeče RNA oziroma crRNA. Ko Cas protein najde svojo ciljno DNA ali RNA, ki ustreza vodeči RNA, ciljno DNA ali RNA razcepi. Primeri teh Cas proteinov, ki imajo funkcijo iskanja in rezanja so Cas9, Cpf1 in Cas13a. Prva dva ciljata DNA, medtem ko Cas13a cilja RNA. Ekipa se je odločila za Cas13a, ki cilja RNA, po rezanju ciljne RNA pa se podvrže konformacijski spremembi in prične nespecifično rezati preostale RNA, s katerimi se sreča. Ta funkcija naredi Cas13a primerno tudi za detekcijo specifične RNA, saj je lahko aktivirana le s pomočjo specifične ciljne molekule. Po aktivaciji pa pride do iniciacije kolateralnega cepljenja molekul RNA, kar se lahko uporabi za tvorbo signala, ki ga je mogoče zaznati. Ekipa je pripravila biokocko z zapisom za Cas13a protein. Za promotor so izbrali LacUV5, ki se ga pogosto uporablja v Cas sistemih, za RBS mesto so izbrali mesto z zmanjšanim vezanjem ribosoma. Pred sekvenco za protein so dodali zaporedje za His značko, mesto za trombin, strep značko in SUMO mesto za cepitev, ki omogočajo očiščenje proteina. Po sekvenci za protein Cas13a sledi dvojni terminator in obrnjena CRISPR sekvenca z dvema dolgima ponovitvama in vmesno sekvenco, ki se jo lahko spremeni glede na vodečo RNA, ki jo želimo uporabiti, saj ima dve restrikcijski mesti.

==Dizajn projekta==
===Iskanje motiva===
Geni bakterij, ki so odgovorni za odpornost proti določenim antibiotikom, so dobro znani in dokumentirani. Z detekcijo teh genov lahko predvidimo, ali bo določen antibiotik učinkovit ali ne. Tako bi lahko spodbudili usmerjeno uporabo antibiotikov in delno preprečili širjenje odpornosti proti antibiotikom. Iskanje motivov je problematično, saj se geni, ki kodirajo enako odpornost na antibiotike, v manjši meri razlikujejo. Ekipa je v ta namen razvila programsko orodje, ki med različicami odpornega gena identificira ohranjeno regijo. Ohranjene regije se nato naknadno pregleda, če lahko ustrezajo vodeči RNA na Cas13a proteinu. Nazadnje so zanesljivost sistema za odkrivanje ustrezne ciljne RNA ocenili s pomočjo biofizikalnega modela, ki napoveduje verjetnost pridobitve lažno pozitivnega rezultata. Ekipa je poudarila, da je modeliranje ključnega pomena za podporo laboratorijskemu delu projekta, saj želijo uporabiti sekvence vodeče RNA, ki usmerjajo Cas13a zgolj proti želenemu cilju.

===Priprava vzorca===
Da lahko Cas13a odkrije gene, odporne na antibiotike, potrebuje ciljno RNA. Ker lahko trenutne metode zaznajo samo aktivne gene, so želeli razviti metodo, ki bo sposobna zaznati prisotnost patogene DNA, tudi če ta ni aktivna. Iz okuženega mleka je potrebno DNA izolirati, ciljno DNA pa je potrebno namnožiti in prepisati v RNA. Sestavili so protokol, kjer bi DNA izolirali z segrevanjem celic na 100°C (z mikrovalovko), nato bi vzorec centrifugirali, DNA pa bi ostala v supernatantu. Nato bi DNA pomnožili s pomočjo rekombinaza polimeraza amplifikacijo (RPA), alternativa PCR, ki se jo lahko uporabi pri konstantni temperaturi 37°C in zazna tako RNA kot DNA. Oligonukleotide bi načrtali tako, da bi med pomnoževanjem vstavili tudi promotorsko mesto za T7 polimerazo. Z dodatkom T7 polimeraze bi prepisali ciljno DNA v RNA. S to pripravo vzorca je RNA sintetizirana ob konstantni temperaturi na mestu in ne potrebujemo termocikla.

===Koacervacija in metoda CINDY Seq (Coacervate Induced Nucleotide Detection of Your Sequence)===
Ime koacervat (ang. coacervate) izhaja iz latinske besede coacervare, ki pomeni »zbrati skupaj ali gruča«. Koacervat je kapljica, ki nastane v tekočini z neenako gostoto sestavin ali zaradi različnega naboja molekul. Ekipa je razvila metodo CINDY Seq, ki uporabi ta biokemijski fenomen. Dolgi negativno nabiti polimeri (vključno RNA) v kombinaciji s pozitivno nabitimi polimeri fazno separirajo v koacervate, bogate s polimeri. Ti koacervati povečajo motnost raztopine do te mere, da jo lahko opazimo z golim očesom.
Cas13a se aktivira, ko z vodečo RNA najde ciljno RNA in jo cepi. Po aktivaciji prične cepiti vse RNA molekule, ki jih sreča in jim tako prepreči, da bi prišlo do koacervacije po dodatku pozitivno nabitih molekul, saj so RNA molekule prekratke, raztopina pa bo ostala bistra. Če pa se Cas13a ne aktivira (ko ne najde ciljne RNA), pa bo raztopina postala motna.

===TDP (Tardigrad specifični intrinzično neurejeni proteini)===
Drugi del zagotavljanja sistema, ki je primeren za gospodinjsko uporabo, je zagotovitev, da je sistem enostavno prevažati in shranjevati, ne da bi ovirali njegovo funkcionalnost.
Tardigradi oziroma počasniki, znani tudi kot vodni ali vesoljski medvedki, so mikro živali sposobne preživeti številne ekstremne pogoje, med katerimi je tudi dehidracija. Nedavno so identificirali skupino Tardigrad-specifičnih proteinov, ki nimajo terciarne strukture. Tardigradi jih prozvajajo po sušenju in tvorijo steklasto matriko, ki ščiti celične sestavine. iGEM ekipa je izbrala več TDP proteinov, od katerih fragmente so naročili in izrazili v E. coli, jih izolirali ter očistili. TDP proteine so nato posušili s Cas13a proteini. Po sušenju z določenimi TDP proteini je Cas13a ohranila RNAzno aktivnost, vendar izgubila specifičnost. Ne glede na te proteine, so bili rezultati pozitivni za en TDP protein in sicer SAHS 33020, saj je po sušenju protein Cas13a znatno ohranil aktivnost in specifičnost.

===Vezikli===
Kot je tipično za sintezno biologijo, si je ekipa zamislila, da bi imeli bakterijo, ki bi vse njihove potrebne proteine (Cas13a in TDP) pridobila skupaj v paketu. Kot paket so si zamislili vezikle zunanje membrane. E. coli bakterije, proizvajajo vezikle zunanje membrane, vendar premalo in premajhne za proizvodnjo proteinov v veziklih. Zato je ekipa želela ustvariti celice, ki bi proizvajale več veziklov (hipervezikulacija), vezikle pa bi povečali iz premera od 80 do 100 nm v velikost premera od 115 do 300 nm. Glede hipervezikulacije so starejša znanstvena dela pokazala, da mutacije v genih, ki kodirajo proteinske komplekse odgovorne za stabilnost bakterijske celične stene (Tol-Pal kompleks), destabilizirajo zunanjo membrano in imajo celice več veziklov. Za destabilizacijo membrane je zato potrebno le izbiti gen za TolA protein. Za povečanje veziklov pa je lanska iGEM ekipa iz Avstralije pripravila biokocko, ki vsebuje zapis za prekomerno izražanje TolR gena, ki povzroči produkcijo večjih veziklov. Kombinacija izbitega TolA gena in prekomerno izraženega TolR gena, povzroči hipervezikulacijo veziklov velikosti do 300 nm v premeru, ki naj bi glede na računalniški model ekipe iz Delfta, lahko zajel od 80 do 900 Cas13a proteinov.

=====Prenos proteina v vezikle=====
Vezikli se proizvajajo v periplazmi, zato morajo biti proteini, ki jih želijo v veziklih, preneseni v periplazmo. Ekipa se je odločila za Tat pot, ki vsebuje TorA fuzijski protein z značko za eksport na N koncu. Fuzijski protein se v citoplazmi zloži v terciarno strukturo, nato pa se prenese v periplazmo skozi poro, ki jo tvorijo TatC proteini. Značka za eksport se nato odcepi. Da bi ekipa preverila, ali se bo protein transportiral v vezikle, so pripravili fuzijski protein TorA-GFP. Ekipa je kombinirala GFP-TA vključek v sevu divjega tipa in KEIO sevu. Preverili so, če se protein večinsko nahaja v veziklih. Po indukciji GFP-TA proteina so odfiltrirali vezikle. Rezultati so pokazali, da je intenziteta fluorescenc signifikantno višja v KEIO sevih v primerjavi z divjim tipom, ki nima TolR mutacije. Ekipa je tako lahko zaključila, da se GFP uspešno prenese v vezikle.

==Zaključek==
Namen projekta je bil, da razvijejo varno in zanesljivo metodo za zaznavanje genov, rezistentnih na antibiotik. Da so dosegli visoko specifičnost so uporabili protein Cas13a. Da so poiskali najbolj primerne vodeče RNA so razvili iskalec motiva, ki identificira ohranjene regije v bakterijskih genih, ki omogočajo rezistenco na antibiotik. Za oblikovanje signala so uporabili fenomen koacervacije, jo optimizirali in razložili biofizikalne principe. Da se lahko orodje shranjuje za dlje časa so uporabili TDP proteine tardigrada, da zaščiti Cas13a proteine. V njihovem predvidenem končnem izdelku se bakterije uporabljajo kot celične tovarne tako, da jim omogočajo proizvodnjo in izločanje vseh potrebnih proteinov v majhnih veziklih.

==Literatura==
1. [http://2017.igem.org/Team:TUDelft Projekt iGEM 2017, ekipa TU Delft] 
2. Baker, J., Chen, L., Rosenthal, J., Putnam, D., & DeLisa, M. (2014). Microbial biosynthesis of designer outer membrane vesicles. Current Opinion In Biotechnology, 29, 76-84. doi:10.1016/j.copbio.2014.02.018 
3. Boothby, T., Tapia, H., Brozena, A., Piszkiewicz, S., Smith, A., & Giovannini, I. et al. (2017). Tardigrades Use Intrinsically Disordered Proteins to Survive Desiccation. Molecular Cell, 65(6), 975-984.e5. doi:10.1016/j.molcel.2017.02.018 
4. Gootenberg, J., Abudayyeh, O., Lee, J., Essletzbichler, P., Dy, A., & Joung, J. et al. (2017). Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 356(6336), 438-442. doi:10.1126/science.aam9321

Seminarji SB 2017/18

2018-01-08T10:44:34Z

Nina Roštan:

V študijskem letu 2017/18 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola] 
#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah] 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prostorsko-%C4%8Dasovni_nadzor_izra%C5%BEanja_genov_z_mre%C5%BEami_generatorjev_impulzov Prostorsko-časovni nadzor izražanja genov z mrežami generatorjev impulzov] 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezceli%C4%8Dna_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni CascAID - test s Cas13a za diagnostiko nalezljivih bolezni]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Case13a_Sistem_za_zaznavanje_genov_za_odpornost_proti_antibiotiku Case13a - Sistem za zaznavanje genov za odpornost proti antibiotiku]

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

---------------------------
Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

27.11. 
1 Marija Srnko -[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem] 
2 Neža Brezovar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SLOVO_RAKU Slovo raku] 

28.11. 
1 Tjaša Grum - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola] 
2 Urška Černe [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] 
3 Petra Vivod - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense] 
4 

4.12. 
1 Sara Kimm Fuhrmann - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ] 
2 Anja Tanšek - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DNA_assembler - DNA assembler] 

5.12. 
1 Urška Furar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah] 
2 Tina Lekan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] 
3 Katja Malovrh [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin] 
4 Jernej Vidmar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka] 

12.12. 
1 Helena Jakše - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka] 
2 Tjaša Bensa - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezcelična_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni] 
3 Sabina Štukelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MagicBlock:_interaktivna_platforma_za_sintezno_biologijo MagicBlock: interaktivna platforma za sintezno biologijo] 
4 Amadeja Lapornik [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano] 

19.12. 
1 Ana Krišelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED] 
2 Vanna Imširović [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Beton-samoporavljaju%C4%87i_sistem Beton-samopopravljajući sistem] 
3 Dominik Dekleva - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] 
4 Neža Gaube [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni CascAID - test s Cas13a za diagnostiko nalezljivih bolezni] 

9.1. 
1 Nastja Marondini 
2 Elizabeta Jevnikar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prostorsko-%C4%8Dasovni_nadzor_izra%C5%BEanja_genov_z_mre%C5%BEami_generatorjev_impulzov Prostorsko-časovni nadzor izražanja genov z mrežami generatorjev impulzov] 
3 Nina Roštan - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Case13a_Sistem_za_zaznavanje_genov_za_odpornost_proti_antibiotiku Case13a - Sistem za zaznavanje genov za odpornost proti antibiotiku] 
4 

15.1. 
1 Matic Kovačič - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/%C5%A0irjenje_genetskega_koda Širjenje genetskega koda] 

16.1. 
1 Inge Sotlar 
2 Marija Kisilak 
3 Nataša Traven 
4 Tina Šimunović 

22.1. 
1 Mojca Hunski 
2 Tomaž Žagar 
3 Tadej Ulčnik 
4 Jakob Rupert 

23.1. 
1 Ana Cirnski 
2 Rok Ferenc 
3 Barbara Lipovšek 
4

Seminarji SB 2017/18

2018-01-08T10:43:26Z

Nina Roštan:

V študijskem letu 2017/18 študentje predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola] 
#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah] 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prostorsko-%C4%8Dasovni_nadzor_izra%C5%BEanja_genov_z_mre%C5%BEami_generatorjev_impulzov Prostorsko-časovni nadzor izražanja genov z mrežami generatorjev impulzov] 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezceli%C4%8Dna_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni CascAID - test s Cas13a za diagnostiko nalezljivih bolezni]
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Case13a_Sistem_za_zaznavanje_genov_za_odpornost_proti_antibiotiku Case13a - Sistem za zaznavanje genov za odpornost proti antibiotiku]

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

---------------------------
Razpored po datumih predstavitev (pri vsakem terminu je navedeno število možnih seminarjev; vpišite ime in priimek pri dnevu, ko želite predstaviti seminar ter dopišite naslov seminarja, ki naj bo povezan s povzetkom):

27.11. 
1 Marija Srnko -[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/No_problem NO problem] 
2 Neža Brezovar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SLOVO_RAKU Slovo raku] 

28.11. 
1 Tjaša Grum - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Metabolno_in%C5%BEenirstvo_kvasovke_Saccharomyces_cerevisiae_za_pridobivanje_n-butanola Metabolno inženirstvo kvasovke Saccharomyces cerevisiae za pridobivanje n-butanola] 
2 Urška Černe [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Croc_%27n_Cholera_-_mikrobni_sistem_za_zaznavanje_in_odstranjevanje_Vibrio_cholerae Croc 'n Cholera - mikrobni sistem za zaznavanje in odstranjevanje Vibrio cholerae] 
3 Petra Vivod - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aptasense Aptasense] 
4 

4.12. 
1 Sara Kimm Fuhrmann - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Crafting_crocin_%E2%80%93_vzpostavitev_biosintezne_poti_za_pridobivanje_krocina_v_bakteriji_Escherichia_coli Crafting crocin – vzpostavitev biosintezne poti za pridobivanje krocina v bakteriji ''Escherichia coli'' ] 
2 Anja Tanšek - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/DNA_assembler - DNA assembler] 

5.12. 
1 Urška Furar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Visoko_frekven%C4%8Dna_mutageneza_na_ne_pravem_mestu%2C_ki_jo_inducirajo_nukleaze_sistema_CRISPR-Cas_v_%C4%8Dlove%C5%A1kih_celicah Visoko frekvenčna mutageneza na ne pravem mestu, ki jo inducirajo nukleaze sistema CRISPR-Cas v človeških celicah] 
2 Tina Lekan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/In_vivo_urejanje_genoma_z_uporabo_visoko_u%C4%8Dinkovitih_TALEN-ov In vivo urejanje genoma z uporabo visoko učinkovitih TALEN-ov] 
3 Katja Malovrh [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/User:Kmalovrh Zmanjšan temperaturni stres rastlin] 
4 Jernej Vidmar [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Oblikovanje_prilagodljivega_celi%C4%8Dnega_predelka Oblikovanje prilagodljivega celičnega predelka] 

12.12. 
1 Helena Jakše - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/E.coli_tar%C4%8Dno_usmerjena_na_raka E. coli tarčno usmerjena na raka] 
2 Tjaša Bensa - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Brezcelična_detekcija_proteaze_za_diagnozo_zapostavljene_tropske_bolezni Brezcelična detekcija proteaze za diagnozo zapostavljene tropske bolezni] 
3 Sabina Štukelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MagicBlock:_interaktivna_platforma_za_sintezno_biologijo MagicBlock: interaktivna platforma za sintezno biologijo] 
4 Amadeja Lapornik [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CampyLOCATOR_-_detekcija_bakterije_Campylobacter_jejuni_pri_zastrupitvah_s_hrano CampyLOCATOR - detekcija bakterije ''Campylobacter jejuni'' pri zastrupitvah s hrano] 

19.12. 
1 Ana Krišelj - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PhagED PhagED] 
2 Vanna Imširović [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Beton-samoporavljaju%C4%87i_sistem Beton-samopopravljajući sistem] 
3 Dominik Dekleva - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Integracija_okoljskih_signalov_z_modularnimi_IN_vrati Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati] 
4 Neža Gaube [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CascAID_-_Cas13a_test_za_diagnostiko_nalezljivih_bolezni CascAID - test s Cas13a za diagnostiko nalezljivih bolezni] 

9.1. 
1 Nastja Marondini 
2 Elizabeta Jevnikar - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prostorsko-%C4%8Dasovni_nadzor_izra%C5%BEanja_genov_z_mre%C5%BEami_generatorjev_impulzov Prostorsko-časovni nadzor izražanja genov z mrežami generatorjev impulzov] 
3 Nina Roštan 
4 

15.1. 
1 Matic Kovačič - [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/%C5%A0irjenje_genetskega_koda Širjenje genetskega koda] 

16.1. 
1 Inge Sotlar 
2 Marija Kisilak 
3 Nataša Traven 
4 Tina Šimunović 

22.1. 
1 Mojca Hunski 
2 Tomaž Žagar 
3 Tadej Ulčnik 
4 Jakob Rupert 

23.1. 
1 Ana Cirnski 
2 Rok Ferenc 
3 Barbara Lipovšek 
4

Case13a Sistem za zaznavanje genov za odpornost proti antibiotiku

2018-01-08T10:39:25Z

Nina Roštan:

(Nina Roštan)
Povzeto po projektu: [http://2017.igem.org/Team:TUDelft Projekt iGEM 2017, ekipa TU Delft] 
==Uvod==
Po podatkih WHO organizacije je problematika odpornosti bakterij proti antibiotikom danes ena največjih groženj za globalno zdravje in varnost preskrbe s hrano. Cilj letošnje ekipe TU Delft na iGEM je reševati problem odpornosti na antibiotike s pomočjo sintezne biologije. Prvi korak k temu cilju je zmanjšati uporabo antibiotikov, ko niso nujni. Osredotočili so se na mlekarsko industrijo. Najpogostejša bolezen v mlekarski industriji je mastitis, ki je okužba kravjih vimen. Testiranje, ali je okužba za določeno kravo z mastitisom povzročena z bakterijami, ki so odporne na antibiotik, je trenutno drag in težak proces. Zato običajno kmet najprej kravo zdravi s standardnimi antibiotiki. Ko ti ne delujejo, bo kmet šele poslal vzorce mleka podjetju, specializirano za diagnostiko. Po analizi vzorcev bi nato tretirali kravo z bolj primernim antibiotikom. Ekipa se je zato osredotočila na izdelavo sistema, ki na mestu zlahka in hitro odkrije gene za odpornost na antibiotike.

==Cas13a==
Za metodo detekcije genov za odpornost na antibiotike so se odločili za CRISPR-Cas sistem. Nekateri Cas proteini imajo sposobnost, da najdejo specifično RNA ali DNA sekvenco s pomočjo vodeče RNA oziroma crRNA. Ko Cas protein najde svojo ciljno DNA ali RNA, ki ustreza vodeči RNA, ciljno DNA ali RNA razcepi. Primeri teh Cas proteinov, ki imajo funkcijo iskanja in rezanja so Cas9, Cpf1 in Cas13a. Prva dva ciljata DNA, medtem ko Cas13a cilja RNA. Ekipa se je odločila za Cas13a, ki cilja RNA, po rezanju ciljne RNA pa se podvrže konformacijski spremembi in prične nespecifično rezati preostale RNA, s katerimi se sreča. Ta funkcija naredi Cas13a primerno tudi za detekcijo specifične RNA, saj je lahko aktivirana le s pomočjo specifične ciljne molekule. Po aktivaciji pa pride do iniciacije kolateralnega cepljenja molekul RNA, kar se lahko uporabi za tvorbo signala, ki ga je mogoče zaznati. Ekipa je pripravila biokocko z zapisom za Cas13a protein. Za promotor so izbrali LacUV5, ki se ga pogosto uporablja v Cas sistemih, za RBS mesto so izbrali mesto z zmanjšanim vezanjem ribosoma. Pred sekvenco za protein so dodali zaporedje za His značko, mesto za trombin, strep značko in SUMO mesto za cepitev, ki omogočajo očiščenje proteina. Po sekvenci za protein Cas13a sledi dvojni terminator in obrnjena CRISPR sekvenca z dvema dolgima ponovitvama in vmesno sekvenco, ki se jo lahko spremeni glede na vodečo RNA, ki jo želimo uporabiti, saj ima dve restrikcijski mesti.

==Dizajn projekta==
===Iskanje motiva===
Geni bakterij, ki so odgovorni za odpornost proti določenim antibiotikom, so dobro znani in dokumentirani. Z detekcijo teh genov lahko predvidimo, ali bo določen antibiotik učinkovit ali ne. Tako bi lahko spodbudili usmerjeno uporabo antibiotikov in delno preprečili širjenje odpornosti proti antibiotikom. Iskanje motivov je problematično, saj se geni, ki kodirajo enako odpornost na antibiotike, v manjši meri razlikujejo. Ekipa je v ta namen razvila programsko orodje, ki med različicami odpornega gena identificira ohranjeno regijo. Ohranjene regije se nato naknadno pregleda, če lahko ustrezajo vodeči RNA na Cas13a proteinu. Nazadnje so zanesljivost sistema za odkrivanje ustrezne ciljne RNA ocenili s pomočjo biofizikalnega modela, ki napoveduje verjetnost pridobitve lažno pozitivnega rezultata. Ekipa je poudarila, da je modeliranje ključnega pomena za podporo laboratorijskemu delu projekta, saj želijo uporabiti sekvence vodeče RNA, ki usmerjajo Cas13a zgolj proti želenemu cilju.

===Priprava vzorca===
Da lahko Cas13a odkrije gene, odporne na antibiotike, potrebuje ciljno RNA. Ker lahko trenutne metode zaznajo samo aktivne gene, so želeli razviti metodo, ki bo sposobna zaznati prisotnost patogene DNA, tudi če ta ni aktivna. Iz okuženega mleka je potrebno DNA izolirati, ciljno DNA pa je potrebno namnožiti in prepisati v RNA. Sestavili so protokol, kjer bi DNA izolirali z segrevanjem celic na 100°C (z mikrovalovko), nato bi vzorec centrifugirali, DNA pa bi ostala v supernatantu. Nato bi DNA pomnožili s pomočjo rekombinaza polimeraza amplifikacijo (RPA), alternativa PCR, ki se jo lahko uporabi pri konstantni temperaturi 37°C in zazna tako RNA kot DNA. Oligonukleotide bi načrtali tako, da bi med pomnoževanjem vstavili tudi promotorsko mesto za T7 polimerazo. Z dodatkom T7 polimeraze bi prepisali ciljno DNA v RNA. S to pripravo vzorca je RNA sintetizirana ob konstantni temperaturi na mestu in ne potrebujemo termocikla.

===Koacervacija in metoda CINDY Seq (Coacervate Induced Nucleotide Detection of Your Sequence)===
Ime koacervat (ang. coacervate) izhaja iz latinske besede coacervare, ki pomeni »zbrati skupaj ali gruča«. Koacervat je kapljica, ki nastane v tekočini z neenako gostoto sestavin ali zaradi različnega naboja molekul. Ekipa je razvila metodo CINDY Seq, ki uporabi ta biokemijski fenomen. Dolgi negativno nabiti polimeri (vključno RNA) v kombinaciji s pozitivno nabitimi polimeri fazno separirajo v koacervate, bogate s polimeri. Ti koacervati povečajo motnost raztopine do te mere, da jo lahko opazimo z golim očesom.
Cas13a se aktivira, ko z vodečo RNA najde ciljno RNA in jo cepi. Po aktivaciji prične cepiti vse RNA molekule, ki jih sreča in jim tako prepreči, da bi prišlo do koacervacije po dodatku pozitivno nabitih molekul, saj so RNA molekule prekratke, raztopina pa bo ostala bistra. Če pa se Cas13a ne aktivira (ko ne najde ciljne RNA), pa bo raztopina postala motna.

===TDP (Tardigrad specifični intrinzično neurejeni proteini)===
Drugi del zagotavljanja sistema, ki je primeren za gospodinjsko uporabo, je zagotovitev, da je sistem enostavno prevažati in shranjevati, ne da bi ovirali njegovo funkcionalnost.
Tardigradi oziroma počasniki, znani tudi kot vodni ali vesoljski medvedki, so mikro živali sposobne preživeti številne ekstremne pogoje, med katerimi je tudi dehidracija. Nedavno so identificirali skupino Tardigrad-specifičnih proteinov, ki nimajo terciarne strukture. Tardigradi jih prozvajajo po sušenju in tvorijo steklasto matriko, ki ščiti celične sestavine. iGEM ekipa je izbrala več TDP proteinov, od katerih fragmente so naročili in izrazili v E. coli, jih izolirali ter očistili. TDP proteine so nato posušili s Cas13a proteini. Po sušenju z določenimi TDP proteini je Cas13a ohranila RNAzno aktivnost, vendar izgubila specifičnost. Ne glede na te proteine, so bili rezultati pozitivni za en TDP protein in sicer SAHS 33020, saj je po sušenju protein Cas13a znatno ohranil aktivnost in specifičnost.

===Vezikli===
Kot je tipično za sintezno biologijo, si je ekipa zamislila, da bi imeli bakterijo, ki bi vse njihove potrebne proteine (Cas13a in TDP) pridobila skupaj v paketu. Kot paket so si zamislili vezikle zunanje membrane. E. coli bakterije, proizvajajo vezikle zunanje membrane, vendar premalo in premajhne za proizvodnjo proteinov v veziklih. Zato je ekipa želela ustvariti celice, ki bi proizvajale več veziklov (hipervezikulacija), vezikle pa bi povečali iz premera od 80 do 100 nm v velikost premera od 115 do 300 nm. Glede hipervezikulacije so starejša znanstvena dela pokazala, da mutacije v genih, ki kodirajo proteinske komplekse odgovorne za stabilnost bakterijske celične stene (Tol-Pal kompleks), destabilizirajo zunanjo membrano in imajo celice več veziklov. Za destabilizacijo membrane je zato potrebno le izbiti gen za TolA protein. Za povečanje veziklov pa je lanska iGEM ekipa iz Avstralije pripravila biokocko, ki vsebuje zapis za prekomerno izražanje TolR gena, ki povzroči produkcijo večjih veziklov. Kombinacija izbitega TolA gena in prekomerno izraženega TolR gena, povzroči hipervezikulacijo veziklov velikosti do 300 nm v premeru, ki naj bi glede na računalniški model ekipe iz Delfta, lahko zajel od 80 do 900 Cas13a proteinov.

=====Prenos proteina v vezikle=====
Vezikli se proizvajajo v periplazmi, zato morajo biti proteini, ki jih želijo v veziklih, preneseni v periplazmo. Ekipa se je odločila za Tat pot, ki vsebuje TorA fuzijski protein z značko za eksport na N koncu. Fuzijski protein se v citoplazmi zloži v terciarno strukturo, nato pa se prenese v periplazmo skozi poro, ki jo tvorijo TatC proteini. Značka za eksport se nato odcepi. Da bi ekipa preverila, ali se bo protein transportiral v vezikle, so pripravili fuzijski protein TorA-GFP. Ekipa je kombinirala GFP-TA vključek v sevu divjega tipa in KEIO sevu. Preverili so, če se protein večinsko nahaja v veziklih. Po indukciji GFP-TA proteina so odfiltrirali vezikle. Rezultati so pokazali, da je intenziteta fluorescenc signifikantno višja v KEIO sevih v primerjavi z divjim tipom, ki nima TolR mutacije. Ekipa je tako lahko zaključila, da se GFP uspešno prenese v vezikle.

==Zaključek==
Namen projekta je bil, da razvijejo varno in zanesljivo metodo za zaznavanje genov, rezistentnih na antibiotik. Da so dosegli visoko specifičnost so uporabili protein Cas13a. Da so poiskali najbolj primerne vodeče RNA so razvili iskalec motiva, ki identificira ohranjene regije v bakterijskih genih, ki omogočajo rezistenco na antibiotik. Za oblikovanje signala so uporabili fenomen koacervacije, jo optimizirali in razložili biofizikalne principe. Da se lahko orodje shranjuje za dlje časa so uporabili TDP proteine tardigrada, da zaščiti Cas13a proteine. V njihovem predvidenem končnem izdelku se bakterije uporabljajo kot celične tovarne tako, da jim omogočajo proizvodnjo in izločanje vseh potrebnih proteinov v majhnih veziklih.

==Literatura==
1. [http://2017.igem.org/Team:TUDelft Projekt iGEM 2017, ekipa TU Delft] 
2. Baker, J., Chen, L., Rosenthal, J., Putnam, D., & DeLisa, M. (2014). Microbial biosynthesis of designer outer membrane vesicles. Current Opinion In Biotechnology, 29, 76-84. doi:10.1016/j.copbio.2014.02.018 
3. Boothby, T., Tapia, H., Brozena, A., Piszkiewicz, S., Smith, A., & Giovannini, I. et al. (2017). Tardigrades Use Intrinsically Disordered Proteins to Survive Desiccation. Molecular Cell, 65(6), 975-984.e5. doi:10.1016/j.molcel.2017.02.018 
4. Gootenberg, J., Abudayyeh, O., Lee, J., Essletzbichler, P., Dy, A., & Joung, J. et al. (2017). Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 356(6336), 438-442. doi:10.1126/science.aam9321

Case13a Sistem za zaznavanje genov za odpornost proti antibiotiku

2018-01-08T10:36:02Z

Nina Roštan:

(Nina Roštan)
==Uvod==
Po podatkih WHO organizacije je problematika odpornosti bakterij proti antibiotikom danes ena največjih groženj za globalno zdravje in varnost preskrbe s hrano. Cilj letošnje ekipe TU Delft na iGEM je reševati problem odpornosti na antibiotike s pomočjo sintezne biologije. Prvi korak k temu cilju je zmanjšati uporabo antibiotikov, ko niso nujni. Osredotočili so se na mlekarsko industrijo. Najpogostejša bolezen v mlekarski industriji je mastitis, ki je okužba kravjih vimen. Testiranje, ali je okužba za določeno kravo z mastitisom povzročena z bakterijami, ki so odporne na antibiotik, je trenutno drag in težak proces. Zato običajno kmet najprej kravo zdravi s standardnimi antibiotiki. Ko ti ne delujejo, bo kmet šele poslal vzorce mleka podjetju, specializirano za diagnostiko. Po analizi vzorcev bi nato tretirali kravo z bolj primernim antibiotikom. Ekipa se je zato osredotočila na izdelavo sistema, ki na mestu zlahka in hitro odkrije gene za odpornost na antibiotike.

==Cas13a==
Za metodo detekcije genov za odpornost na antibiotike so se odločili za CRISPR-Cas sistem. Nekateri Cas proteini imajo sposobnost, da najdejo specifično RNA ali DNA sekvenco s pomočjo vodeče RNA oziroma crRNA. Ko Cas protein najde svojo ciljno DNA ali RNA, ki ustreza vodeči RNA, ciljno DNA ali RNA razcepi. Primeri teh Cas proteinov, ki imajo funkcijo iskanja in rezanja so Cas9, Cpf1 in Cas13a. Prva dva ciljata DNA, medtem ko Cas13a cilja RNA. Ekipa se je odločila za Cas13a, ki cilja RNA, po rezanju ciljne RNA pa se podvrže konformacijski spremembi in prične nespecifično rezati preostale RNA, s katerimi se sreča. Ta funkcija naredi Cas13a primerno tudi za detekcijo specifične RNA, saj je lahko aktivirana le s pomočjo specifične ciljne molekule. Po aktivaciji pa pride do iniciacije kolateralnega cepljenja molekul RNA, kar se lahko uporabi za tvorbo signala, ki ga je mogoče zaznati. Ekipa je pripravila biokocko z zapisom za Cas13a protein. Za promotor so izbrali LacUV5, ki se ga pogosto uporablja v Cas sistemih, za RBS mesto so izbrali mesto z zmanjšanim vezanjem ribosoma. Pred sekvenco za protein so dodali zaporedje za His značko, mesto za trombin, strep značko in SUMO mesto za cepitev, ki omogočajo očiščenje proteina. Po sekvenci za protein Cas13a sledi dvojni terminator in obrnjena CRISPR sekvenca z dvema dolgima ponovitvama in vmesno sekvenco, ki se jo lahko spremeni glede na vodečo RNA, ki jo želimo uporabiti, saj ima dve restrikcijski mesti.

==Dizajn projekta==
===Iskanje motiva===
Geni bakterij, ki so odgovorni za odpornost proti določenim antibiotikom, so dobro znani in dokumentirani. Z detekcijo teh genov lahko predvidimo, ali bo določen antibiotik učinkovit ali ne. Tako bi lahko spodbudili usmerjeno uporabo antibiotikov in delno preprečili širjenje odpornosti proti antibiotikom. Iskanje motivov je problematično, saj se geni, ki kodirajo enako odpornost na antibiotike, v manjši meri razlikujejo. Ekipa je v ta namen razvila programsko orodje, ki med različicami odpornega gena identificira ohranjeno regijo. Ohranjene regije se nato naknadno pregleda, če lahko ustrezajo vodeči RNA na Cas13a proteinu. Nazadnje so zanesljivost sistema za odkrivanje ustrezne ciljne RNA ocenili s pomočjo biofizikalnega modela, ki napoveduje verjetnost pridobitve lažno pozitivnega rezultata. Ekipa je poudarila, da je modeliranje ključnega pomena za podporo laboratorijskemu delu projekta, saj želijo uporabiti sekvence vodeče RNA, ki usmerjajo Cas13a zgolj proti želenemu cilju.

===Priprava vzorca===
Da lahko Cas13a odkrije gene, odporne na antibiotike, potrebuje ciljno RNA. Ker lahko trenutne metode zaznajo samo aktivne gene, so želeli razviti metodo, ki bo sposobna zaznati prisotnost patogene DNA, tudi če ta ni aktivna. Iz okuženega mleka je potrebno DNA izolirati, ciljno DNA pa je potrebno namnožiti in prepisati v RNA. Sestavili so protokol, kjer bi DNA izolirali z segrevanjem celic na 100°C (z mikrovalovko), nato bi vzorec centrifugirali, DNA pa bi ostala v supernatantu. Nato bi DNA pomnožili s pomočjo rekombinaza polimeraza amplifikacijo (RPA), alternativa PCR, ki se jo lahko uporabi pri konstantni temperaturi 37°C in zazna tako RNA kot DNA. Oligonukleotide bi načrtali tako, da bi med pomnoževanjem vstavili tudi promotorsko mesto za T7 polimerazo. Z dodatkom T7 polimeraze bi prepisali ciljno DNA v RNA. S to pripravo vzorca je RNA sintetizirana ob konstantni temperaturi na mestu in ne potrebujemo termocikla.

===Koacervacija in metoda CINDY Seq (Coacervate Induced Nucleotide Detection of Your Sequence)===
Ime koacervat (ang. coacervate) izhaja iz latinske besede coacervare, ki pomeni »zbrati skupaj ali gruča«. Koacervat je kapljica, ki nastane v tekočini z neenako gostoto sestavin ali zaradi različnega naboja molekul. Ekipa je razvila metodo CINDY Seq, ki uporabi ta biokemijski fenomen. Dolgi negativno nabiti polimeri (vključno RNA) v kombinaciji s pozitivno nabitimi polimeri fazno separirajo v koacervate, bogate s polimeri. Ti koacervati povečajo motnost raztopine do te mere, da jo lahko opazimo z golim očesom.
Cas13a se aktivira, ko z vodečo RNA najde ciljno RNA in jo cepi. Po aktivaciji prične cepiti vse RNA molekule, ki jih sreča in jim tako prepreči, da bi prišlo do koacervacije po dodatku pozitivno nabitih molekul, saj so RNA molekule prekratke, raztopina pa bo ostala bistra. Če pa se Cas13a ne aktivira (ko ne najde ciljne RNA), pa bo raztopina postala motna.

===TDP (Tardigrad specifični intrinzično neurejeni proteini)===
Drugi del zagotavljanja sistema, ki je primeren za gospodinjsko uporabo, je zagotovitev, da je sistem enostavno prevažati in shranjevati, ne da bi ovirali njegovo funkcionalnost.
Tardigradi oziroma počasniki, znani tudi kot vodni ali vesoljski medvedki, so mikro živali sposobne preživeti številne ekstremne pogoje, med katerimi je tudi dehidracija. Nedavno so identificirali skupino Tardigrad-specifičnih proteinov, ki nimajo terciarne strukture. Tardigradi jih prozvajajo po sušenju in tvorijo steklasto matriko, ki ščiti celične sestavine. iGEM ekipa je izbrala več TDP proteinov, od katerih fragmente so naročili in izrazili v E. coli, jih izolirali ter očistili. TDP proteine so nato posušili s Cas13a proteini. Po sušenju z določenimi TDP proteini je Cas13a ohranila RNAzno aktivnost, vendar izgubila specifičnost. Ne glede na te proteine, so bili rezultati pozitivni za en TDP protein in sicer SAHS 33020, saj je po sušenju protein Cas13a znatno ohranil aktivnost in specifičnost.

===Vezikli===
Kot je tipično za sintezno biologijo, si je ekipa zamislila, da bi imeli bakterijo, ki bi vse njihove potrebne proteine (Cas13a in TDP) pridobila skupaj v paketu. Kot paket so si zamislili vezikle zunanje membrane. E. coli bakterije, proizvajajo vezikle zunanje membrane, vendar premalo in premajhne za proizvodnjo proteinov v veziklih. Zato je ekipa želela ustvariti celice, ki bi proizvajale več veziklov (hipervezikulacija), vezikle pa bi povečali iz premera od 80 do 100 nm v velikost premera od 115 do 300 nm. Glede hipervezikulacije so starejša znanstvena dela pokazala, da mutacije v genih, ki kodirajo proteinske komplekse odgovorne za stabilnost bakterijske celične stene (Tol-Pal kompleks), destabilizirajo zunanjo membrano in imajo celice več veziklov. Za destabilizacijo membrane je zato potrebno le izbiti gen za TolA protein. Za povečanje veziklov pa je lanska iGEM ekipa iz Avstralije pripravila biokocko, ki vsebuje zapis za prekomerno izražanje TolR gena, ki povzroči produkcijo večjih veziklov. Kombinacija izbitega TolA gena in prekomerno izraženega TolR gena, povzroči hipervezikulacijo veziklov velikosti do 300 nm v premeru, ki naj bi glede na računalniški model ekipe iz Delfta, lahko zajel od 80 do 900 Cas13a proteinov.

=====Prenos proteina v vezikle=====
Vezikli se proizvajajo v periplazmi, zato morajo biti proteini, ki jih želijo v veziklih, preneseni v periplazmo. Ekipa se je odločila za Tat pot, ki vsebuje TorA fuzijski protein z značko za eksport na N koncu. Fuzijski protein se v citoplazmi zloži v terciarno strukturo, nato pa se prenese v periplazmo skozi poro, ki jo tvorijo TatC proteini. Značka za eksport se nato odcepi. Da bi ekipa preverila, ali se bo protein transportiral v vezikle, so pripravili fuzijski protein TorA-GFP. Ekipa je kombinirala GFP-TA vključek v sevu divjega tipa in KEIO sevu. Preverili so, če se protein večinsko nahaja v veziklih. Po indukciji GFP-TA proteina so odfiltrirali vezikle. Rezultati so pokazali, da je intenziteta fluorescenc signifikantno višja v KEIO sevih v primerjavi z divjim tipom, ki nima TolR mutacije. Ekipa je tako lahko zaključila, da se GFP uspešno prenese v vezikle.

==Zaključek==
Namen projekta je bil, da razvijejo varno in zanesljivo metodo za zaznavanje genov, rezistentnih na antibiotik. Da so dosegli visoko specifičnost so uporabili protein Cas13a. Da so poiskali najbolj primerne vodeče RNA so razvili iskalec motiva, ki identificira ohranjene regije v bakterijskih genih, ki omogočajo rezistenco na antibiotik. Za oblikovanje signala so uporabili fenomen koacervacije, jo optimizirali in razložili biofizikalne principe. Da se lahko orodje shranjuje za dlje časa so uporabili TDP proteine tardigrada, da zaščiti Cas13a proteine. V njihovem predvidenem končnem izdelku se bakterije uporabljajo kot celične tovarne tako, da jim omogočajo proizvodnjo in izločanje vseh potrebnih proteinov v majhnih veziklih.

==Literatura==
1. [http://2017.igem.org/Team:TUDelft Projekt iGEM 2017, ekipa TU Delft] 
2. Baker, J., Chen, L., Rosenthal, J., Putnam, D., & DeLisa, M. (2014). Microbial biosynthesis of designer outer membrane vesicles. Current Opinion In Biotechnology, 29, 76-84. doi:10.1016/j.copbio.2014.02.018 
3. Boothby, T., Tapia, H., Brozena, A., Piszkiewicz, S., Smith, A., & Giovannini, I. et al. (2017). Tardigrades Use Intrinsically Disordered Proteins to Survive Desiccation. Molecular Cell, 65(6), 975-984.e5. doi:10.1016/j.molcel.2017.02.018 
4. Gootenberg, J., Abudayyeh, O., Lee, J., Essletzbichler, P., Dy, A., & Joung, J. et al. (2017). Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 356(6336), 438-442. doi:10.1126/science.aam9321

Case13a Sistem za zaznavanje genov za odpornost proti antibiotiku

2018-01-08T10:10:50Z

Nina Roštan: New page: (Nina Roštan) ==Uvod== Po podatkih WHO organizacije je problematika odpornosti bakterij proti antibiotikom danes ena največjih groženj za globalno zdravje in varnost preskrbe s hrano. C...

Seminarji SB 2017/18

2017-11-16T15:56:55Z

Nina Roštan:

Seminarji SB 2017/18

2017-11-16T15:31:50Z

Nina Roštan:

Seminarji SB 2017/18

2017-11-16T15:25:40Z

Nina Roštan:

Seminarji SB 2017/18

2017-11-16T15:24:40Z

Nina Roštan:

MBT seminarji 2017

2017-03-22T15:02:55Z

Nina Roštan:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja iz sline transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) Mechano rastni faktor-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za inženirstvo tkiva ligamentov. Peter Prezelj, 29. marca 2017
#Domen Klofutar

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Ema Guštin <3
# Jan Rozman
# A Therapeutic Antibody for Cancer, Derived from Single Human B Cells (R. T. Bushey ''et al''; Cell Reports 15(7), 2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221112471630465X) Terapevtsko protitelo proti raku, pridobljeno iz človeške B celice. Alja Zgonc, 5. april 2017

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Tjaša Košir
# Petra Vivod
# Marija Kisilak

'''Cepiva''' (19. april) 
#Tomaž Rozmarič
#Amadeja Lapornik
#Mojca Hunski

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
#Vid Jazbec <3 <3
#Zala Gluhić
#Katja Malovrh

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola. Petra Tavčar,3. marec 2017
# Tim Božič
# Tajda Buh

'''Encimi''' (10. maj) 
# Nataša Traven
# Bine Tršavec
#

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Inge Sotlar
# Anja Herceg
# The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5). Anja Tanšek, 17. maj 2017

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# Barbara Dušak
# Tjaša Grum
# Sara Kimm Fuhrmann

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017
#

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij) 
# Matjaž Ivanuša
#
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

Okrasitev veziklov zunanje membrane z organofosforno hidrolazo in celuloza vezavno domeno za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-22T14:55:49Z

Nina Roštan: Okrasitev veziklov zunanje membrane z organofosforno hidrolazo in celuloza vezavno domeno za razgradnjo organofosfatnih pesticidov moved to [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za ra

#REDIRECT [[Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-22T14:55:49Z

==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženega okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju, zato so nekatere organokloridne pesticide (kot je DDT) že prepovedali v veliko državah sveta. Organofosfati so priljubljena alternativa sintetičnega pesticida zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu pa ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. Zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj je visoko akutno toksičen.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Organofosfatna hidrolaza je bila identificirana v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih preiskovanih proteinov oziroma encimov na površini. Prednost imobilizacije encima na vezikel je majhnost veziklov in majhen strošek njihove proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosfatno hidrolazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi heksahis oznako, oba pa sta imela tudi lac operator. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

==Analiza==
Izražanje fuzijskih proteinov na površini so preverili z različnimi testi. Najprej so preverili in potrdili izražanje organofosfatne hidrolaze na površini bakterij s pomočjo imunofluorescence, saj protitelesa ne morejo preiti bakterijske membrane. Izražanje encima na veziklih so potrdili z Western prenosom. Protein s celuloza vezavno domeno so preverili tako, da so vezikle izpostavili celulozni površini in vezanje potrdili s slikanjem z vrstičnim elektronskim mikroskopom. Aktivnost encima pa so preverili na substratu pesticidu paraokson, katerega produkt hidrolize je barvni p-nitrofenol, ki ga je možno meriti spektrofotometrično.

==Imobilizacija encima==
V številnih primerih imobilizacije encima se je encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali pa se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer so kot visoko prednost videli v tem, da encimska imobilizacija poteka ''in vivo'', kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo.
Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima. Sistem encima imobiliziranega na vezikel lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfatnih pesticidov v okolju.

==Viri==
Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-22T14:44:59Z

Nina Roštan: /* Zaključek */

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-22T14:44:41Z

Nina Roštan: /* Analiza */

==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženega okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju, zato so nekatere organokloridne pesticide (kot je DDT) že prepovedali v veliko državah sveta. Organofosfati so priljubljena alternativa sintetičnega pesticida zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu pa ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. Zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj je visoko akutno toksičen.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Organofosfatna hidrolaza je bila identificirana v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih preiskovanih proteinov oziroma encimov na površini. Prednost imobilizacije encima na vezikel je majhnost veziklov in majhen strošek njihove proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosfatno hidrolazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi heksahis oznako, oba pa sta imela tudi lac operator. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

==Analiza==
Izražanje fuzijskih proteinov na površini so preverili z različnimi testi. Najprej so preverili in potrdili izražanje organofosfatne hidrolaze na površini bakterij s pomočjo imunofluorescence, saj protitelesa ne morejo preiti bakterijske membrane. Izražanje encima na veziklih so potrdili z Western prenosom. Protein s celuloza vezavno domeno so preverili tako, da so vezikle izpostavili celulozni površini in vezanje potrdili s slikanjem z vrstičnim elektronskim mikroskopom. Aktivnost encima pa so preverili na substratu pesticidu paraokson, katerega produkt hidrolize je barvni p-nitrofenol, ki ga je možno meriti spektrofotometrično.

==Imobilizacija encima==
V številnih primerih imobilizacije encima se je encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali pa se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer so kot visoko prednost videli v tem, da encimska imobilizacija poteka ''in vivo'', kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo.
Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima. Sistem encima imobiliziranega na vezikel lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfornih pesticidov v okolju.

==Viri==
Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-22T14:42:54Z

Nina Roštan: /* Priprava vektorskih konstruktov */

==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženega okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju, zato so nekatere organokloridne pesticide (kot je DDT) že prepovedali v veliko državah sveta. Organofosfati so priljubljena alternativa sintetičnega pesticida zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu pa ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. Zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj je visoko akutno toksičen.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Organofosfatna hidrolaza je bila identificirana v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih preiskovanih proteinov oziroma encimov na površini. Prednost imobilizacije encima na vezikel je majhnost veziklov in majhen strošek njihove proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosfatno hidrolazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi heksahis oznako, oba pa sta imela tudi lac operator. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

==Analiza==
Izražanje fuzijskih proteinov na površini so preverili z različnimi testi. Najprej so preverili in potrdili izražanje organofosforne hidrolaze na površini bakterij s pomočjo imunofluorescence, saj protitelesa ne morejo preiti bakterijske membrane. Izražanje encima na veziklih so potrdili z Western prenosom. Protein s celuloza vezavno domeno so preverili tako, da so vezikle izpostavili celulozni površini in vezanje potrdili s slikanjem z vrstičnim elektronskim mikroskopom. Aktivnost encima pa so preverili na substratu pesticidu paraokson, katerega produkt hidrolize je barvni p-nitrofenol, ki ga je možno meriti spektrofotometrično.

==Imobilizacija encima==
V številnih primerih imobilizacije encima se je encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali pa se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer so kot visoko prednost videli v tem, da encimska imobilizacija poteka ''in vivo'', kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo.
Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima. Sistem encima imobiliziranega na vezikel lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfornih pesticidov v okolju.

==Viri==
Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-22T14:42:17Z

Nina Roštan: /* Priprava vektorskih konstruktov */

==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženega okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju, zato so nekatere organokloridne pesticide (kot je DDT) že prepovedali v veliko državah sveta. Organofosfati so priljubljena alternativa sintetičnega pesticida zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu pa ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. Zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj je visoko akutno toksičen.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Organofosfatna hidrolaza je bila identificirana v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih preiskovanih proteinov oziroma encimov na površini. Prednost imobilizacije encima na vezikel je majhnost veziklov in majhen strošek njihove proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosforno hidroazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi heksahis oznako, oba pa sta imela tudi lac operator. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

==Analiza==
Izražanje fuzijskih proteinov na površini so preverili z različnimi testi. Najprej so preverili in potrdili izražanje organofosforne hidrolaze na površini bakterij s pomočjo imunofluorescence, saj protitelesa ne morejo preiti bakterijske membrane. Izražanje encima na veziklih so potrdili z Western prenosom. Protein s celuloza vezavno domeno so preverili tako, da so vezikle izpostavili celulozni površini in vezanje potrdili s slikanjem z vrstičnim elektronskim mikroskopom. Aktivnost encima pa so preverili na substratu pesticidu paraokson, katerega produkt hidrolize je barvni p-nitrofenol, ki ga je možno meriti spektrofotometrično.

==Imobilizacija encima==
V številnih primerih imobilizacije encima se je encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali pa se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer so kot visoko prednost videli v tem, da encimska imobilizacija poteka ''in vivo'', kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo.
Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima. Sistem encima imobiliziranega na vezikel lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfornih pesticidov v okolju.

==Viri==
Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-22T14:41:30Z

Nina Roštan: /* Bioremediacija */

==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženega okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju, zato so nekatere organokloridne pesticide (kot je DDT) že prepovedali v veliko državah sveta. Organofosfati so priljubljena alternativa sintetičnega pesticida zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu pa ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. Zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj je visoko akutno toksičen.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Organofosfatna hidrolaza je bila identificirana v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih preiskovanih proteinov oziroma encimov na površini. Prednost imobilizacije encima na vezikel je majhnost veziklov in majhen strošek njihove proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosforno hidroazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi his značko, oba pa sta imela tudi lac operon. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

==Analiza==
Izražanje fuzijskih proteinov na površini so preverili z različnimi testi. Najprej so preverili in potrdili izražanje organofosforne hidrolaze na površini bakterij s pomočjo imunofluorescence, saj protitelesa ne morejo preiti bakterijske membrane. Izražanje encima na veziklih so potrdili z Western prenosom. Protein s celuloza vezavno domeno so preverili tako, da so vezikle izpostavili celulozni površini in vezanje potrdili s slikanjem z vrstičnim elektronskim mikroskopom. Aktivnost encima pa so preverili na substratu pesticidu paraokson, katerega produkt hidrolize je barvni p-nitrofenol, ki ga je možno meriti spektrofotometrično.

==Imobilizacija encima==
V številnih primerih imobilizacije encima se je encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali pa se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer so kot visoko prednost videli v tem, da encimska imobilizacija poteka ''in vivo'', kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo.
Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima. Sistem encima imobiliziranega na vezikel lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfornih pesticidov v okolju.

==Viri==
Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-22T14:40:45Z

Nina Roštan: /* Bioremediacija */

==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženega okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju, zato so nekatere organokloridne pesticide (kot je DDT) že prepovedali v veliko državah sveta. Organofosfati so priljubljena alternativa sintetičnega pesticida zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu pa ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. Zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj je visoko akutno toksičen.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Encim organofosfatna hidrolaza, ki hidrolizira organofosfate, je bil identificirana v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih preiskovanih proteinov oziroma encimov na površini. Prednost imobilizacije encima na vezikel je majhnost veziklov in majhen strošek njihove proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosforno hidroazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi his značko, oba pa sta imela tudi lac operon. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

==Analiza==
Izražanje fuzijskih proteinov na površini so preverili z različnimi testi. Najprej so preverili in potrdili izražanje organofosforne hidrolaze na površini bakterij s pomočjo imunofluorescence, saj protitelesa ne morejo preiti bakterijske membrane. Izražanje encima na veziklih so potrdili z Western prenosom. Protein s celuloza vezavno domeno so preverili tako, da so vezikle izpostavili celulozni površini in vezanje potrdili s slikanjem z vrstičnim elektronskim mikroskopom. Aktivnost encima pa so preverili na substratu pesticidu paraokson, katerega produkt hidrolize je barvni p-nitrofenol, ki ga je možno meriti spektrofotometrično.

==Imobilizacija encima==
V številnih primerih imobilizacije encima se je encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali pa se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer so kot visoko prednost videli v tem, da encimska imobilizacija poteka ''in vivo'', kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo.
Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima. Sistem encima imobiliziranega na vezikel lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfornih pesticidov v okolju.

==Viri==
Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-21T15:59:19Z

Nina Roštan: /* Onesnaževanje */

==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženega okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju, zato so nekatere organokloridne pesticide (kot je DDT) že prepovedali v veliko državah sveta. Organofosfati so priljubljena alternativa sintetičnega pesticida zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu pa ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. Zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj je visoko akutno toksičen.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Encim organofosforna hidrolaza, ki hidrolizira organofosfate, je bil identificirana v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih preiskovanih proteinov oziroma encimov na površini. Prednost imobilizacije encima na vezikel je majhnost veziklov in majhen strošek njihove proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosforno hidroazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi his značko, oba pa sta imela tudi lac operon. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

==Analiza==
Izražanje fuzijskih proteinov na površini so preverili z različnimi testi. Najprej so preverili in potrdili izražanje organofosforne hidrolaze na površini bakterij s pomočjo imunofluorescence, saj protitelesa ne morejo preiti bakterijske membrane. Izražanje encima na veziklih so potrdili z Western prenosom. Protein s celuloza vezavno domeno so preverili tako, da so vezikle izpostavili celulozni površini in vezanje potrdili s slikanjem z vrstičnim elektronskim mikroskopom. Aktivnost encima pa so preverili na substratu pesticidu paraokson, katerega produkt hidrolize je barvni p-nitrofenol, ki ga je možno meriti spektrofotometrično.

==Imobilizacija encima==
V številnih primerih imobilizacije encima se je encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali pa se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer so kot visoko prednost videli v tem, da encimska imobilizacija poteka ''in vivo'', kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo.
Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima. Sistem encima imobiliziranega na vezikel lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfornih pesticidov v okolju.

==Viri==
Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-21T15:54:36Z

Nina Roštan: /* Imobilizacija encima */

==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženega okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju zato so nekatere organokloridne pesticide (kot je DDT) že prepovedali v veliko državah sveta. Medtem pa so organofosfati priljubljena alternativa zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu pa ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. Zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj povzroči smrt že pri nizkih odmerkih.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Encim organofosforna hidrolaza, ki hidrolizira organofosfate, je bil identificirana v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih preiskovanih proteinov oziroma encimov na površini. Prednost imobilizacije encima na vezikel je majhnost veziklov in majhen strošek njihove proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosforno hidroazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi his značko, oba pa sta imela tudi lac operon. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

==Analiza==
Izražanje fuzijskih proteinov na površini so preverili z različnimi testi. Najprej so preverili in potrdili izražanje organofosforne hidrolaze na površini bakterij s pomočjo imunofluorescence, saj protitelesa ne morejo preiti bakterijske membrane. Izražanje encima na veziklih so potrdili z Western prenosom. Protein s celuloza vezavno domeno so preverili tako, da so vezikle izpostavili celulozni površini in vezanje potrdili s slikanjem z vrstičnim elektronskim mikroskopom. Aktivnost encima pa so preverili na substratu pesticidu paraokson, katerega produkt hidrolize je barvni p-nitrofenol, ki ga je možno meriti spektrofotometrično.

==Imobilizacija encima==
V številnih primerih imobilizacije encima se je encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali pa se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer so kot visoko prednost videli v tem, da encimska imobilizacija poteka ''in vivo'', kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo.
Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima. Sistem encima imobiliziranega na vezikel lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfornih pesticidov v okolju.

==Viri==
Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-21T15:53:10Z

Nina Roštan: /* Analiza */

==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženega okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju zato so nekatere organokloridne pesticide (kot je DDT) že prepovedali v veliko državah sveta. Medtem pa so organofosfati priljubljena alternativa zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu pa ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. Zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj povzroči smrt že pri nizkih odmerkih.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Encim organofosforna hidrolaza, ki hidrolizira organofosfate, je bil identificirana v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih preiskovanih proteinov oziroma encimov na površini. Prednost imobilizacije encima na vezikel je majhnost veziklov in majhen strošek njihove proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosforno hidroazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi his značko, oba pa sta imela tudi lac operon. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

==Analiza==
Izražanje fuzijskih proteinov na površini so preverili z različnimi testi. Najprej so preverili in potrdili izražanje organofosforne hidrolaze na površini bakterij s pomočjo imunofluorescence, saj protitelesa ne morejo preiti bakterijske membrane. Izražanje encima na veziklih so potrdili z Western prenosom. Protein s celuloza vezavno domeno so preverili tako, da so vezikle izpostavili celulozni površini in vezanje potrdili s slikanjem z vrstičnim elektronskim mikroskopom. Aktivnost encima pa so preverili na substratu pesticidu paraokson, katerega produkt hidrolize je barvni p-nitrofenol, ki ga je možno meriti spektrofotometrično.

==Imobilizacija encima==
V številnih primerih imobilizacije encima se je njegova encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali pa se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer. Kot visoko prednost vidijo v tem, da encimska imobilizacija poteka ''in vivo'', kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo.
Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima. Sistem encima imobiliziranega na vezikel lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfornih pesticidov v okolju.

==Viri==
Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-21T15:51:42Z

Nina Roštan: /* Vezikli zunanje membrane */

==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženega okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju zato so nekatere organokloridne pesticide (kot je DDT) že prepovedali v veliko državah sveta. Medtem pa so organofosfati priljubljena alternativa zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu pa ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. Zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj povzroči smrt že pri nizkih odmerkih.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Encim organofosforna hidrolaza, ki hidrolizira organofosfate, je bil identificirana v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih preiskovanih proteinov oziroma encimov na površini. Prednost imobilizacije encima na vezikel je majhnost veziklov in majhen strošek njihove proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosforno hidroazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi his značko, oba pa sta imela tudi lac operon. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

==Analiza==
Izražanje fuzijskih proteinov na površini so preverili z različnimi testi. Najprej so preverili in potrdili izražanje organofosforne hidrolaze na površini bakterij s pomočjo imunofluorescence, saj protitelesa ne morejo preiti bakterijske membrane. Izražanje encima na veziklih so potrdili z Western prenosom. Protein s celuloza vezavno domeno so preverili tako, da so vezikle izpostavili celulozni površini in vezanje potrdili z slikanjem z vrstičnim elektronskim mikroskopom. Aktivnost encima pa so preverili na substratu pesticidu paraokson, katerega produkt je barvni p-nitrofenol, ki ga je bilo možno meriti spektrofotometrično.

==Imobilizacija encima==
V številnih primerih imobilizacije encima se je njegova encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali pa se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer. Kot visoko prednost vidijo v tem, da encimska imobilizacija poteka ''in vivo'', kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo.
Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima. Sistem encima imobiliziranega na vezikel lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfornih pesticidov v okolju.

==Viri==
Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-21T15:49:30Z

Nina Roštan: /* Onesnaževanje */

==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženega okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju zato so nekatere organokloridne pesticide (kot je DDT) že prepovedali v veliko državah sveta. Medtem pa so organofosfati priljubljena alternativa zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu pa ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. Zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj povzroči smrt že pri nizkih odmerkih.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Encim organofosforna hidrolaza, ki hidrolizira organofosfate, je bil identificirana v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih encimov na njihovi površini kot fuzijski protein. Tako dobimo imobilizirane encime. Njihova prednost je tudi majhnost in majhen strošek proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosforno hidroazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi his značko, oba pa sta imela tudi lac operon. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

==Analiza==
Izražanje fuzijskih proteinov na površini so preverili z različnimi testi. Najprej so preverili in potrdili izražanje organofosforne hidrolaze na površini bakterij s pomočjo imunofluorescence, saj protitelesa ne morejo preiti bakterijske membrane. Izražanje encima na veziklih so potrdili z Western prenosom. Protein s celuloza vezavno domeno so preverili tako, da so vezikle izpostavili celulozni površini in vezanje potrdili z slikanjem z vrstičnim elektronskim mikroskopom. Aktivnost encima pa so preverili na substratu pesticidu paraokson, katerega produkt je barvni p-nitrofenol, ki ga je bilo možno meriti spektrofotometrično.

==Imobilizacija encima==
V številnih primerih imobilizacije encima se je njegova encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali pa se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer. Kot visoko prednost vidijo v tem, da encimska imobilizacija poteka ''in vivo'', kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo.
Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima. Sistem encima imobiliziranega na vezikel lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfornih pesticidov v okolju.

==Viri==
Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-21T15:49:04Z

Nina Roštan: /* Onesnaževanje */

==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženega okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju zato so nekatere organokloridne pesticide (kot je DDT) že prepovedali v veliko državah sveta. Medtem pa so organofosfati priljubljena alternativa zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu pa ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj povzroči smrt že pri nizkih odmerkih.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Encim organofosforna hidrolaza, ki hidrolizira organofosfate, je bil identificirana v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih encimov na njihovi površini kot fuzijski protein. Tako dobimo imobilizirane encime. Njihova prednost je tudi majhnost in majhen strošek proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosforno hidroazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi his značko, oba pa sta imela tudi lac operon. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

==Analiza==
Izražanje fuzijskih proteinov na površini so preverili z različnimi testi. Najprej so preverili in potrdili izražanje organofosforne hidrolaze na površini bakterij s pomočjo imunofluorescence, saj protitelesa ne morejo preiti bakterijske membrane. Izražanje encima na veziklih so potrdili z Western prenosom. Protein s celuloza vezavno domeno so preverili tako, da so vezikle izpostavili celulozni površini in vezanje potrdili z slikanjem z vrstičnim elektronskim mikroskopom. Aktivnost encima pa so preverili na substratu pesticidu paraokson, katerega produkt je barvni p-nitrofenol, ki ga je bilo možno meriti spektrofotometrično.

==Imobilizacija encima==
V številnih primerih imobilizacije encima se je njegova encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali pa se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer. Kot visoko prednost vidijo v tem, da encimska imobilizacija poteka ''in vivo'', kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo.
Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima. Sistem encima imobiliziranega na vezikel lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfornih pesticidov v okolju.

==Viri==
Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-21T15:47:29Z

Nina Roštan:

==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženega okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju zato so nekateri tipi organokloridov že prepovedani v veliko državah sveta. Medtem pa so organofosfati priljubljena alternativa zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu pa ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj povzroči smrt že pri nizkih odmerkih.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Encim organofosforna hidrolaza, ki hidrolizira organofosfate, je bil identificirana v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih encimov na njihovi površini kot fuzijski protein. Tako dobimo imobilizirane encime. Njihova prednost je tudi majhnost in majhen strošek proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosforno hidroazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi his značko, oba pa sta imela tudi lac operon. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

==Analiza==
Izražanje fuzijskih proteinov na površini so preverili z različnimi testi. Najprej so preverili in potrdili izražanje organofosforne hidrolaze na površini bakterij s pomočjo imunofluorescence, saj protitelesa ne morejo preiti bakterijske membrane. Izražanje encima na veziklih so potrdili z Western prenosom. Protein s celuloza vezavno domeno so preverili tako, da so vezikle izpostavili celulozni površini in vezanje potrdili z slikanjem z vrstičnim elektronskim mikroskopom. Aktivnost encima pa so preverili na substratu pesticidu paraokson, katerega produkt je barvni p-nitrofenol, ki ga je bilo možno meriti spektrofotometrično.

==Imobilizacija encima==
V številnih primerih imobilizacije encima se je njegova encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali pa se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer. Kot visoko prednost vidijo v tem, da encimska imobilizacija poteka ''in vivo'', kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo.
Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima. Sistem encima imobiliziranega na vezikel lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfornih pesticidov v okolju.

==Viri==
Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-21T15:40:57Z

Nina Roštan: /* Analiza */

==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženega okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju in so že prepovedani v veliko državah sveta. Medtem pa so organofosfati priljubljena alternativa zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu pa ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj povzroči smrt že pri nizkih odmerkih.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Encim organofosforna hidrolaza, ki hidrolizira organofosfate, je bil identificirana v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih encimov na njihovi površini kot fuzijski protein. Tako dobimo imobilizirane encime. Njihova prednost je tudi majhnost in majhen strošek proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosforno hidroazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi his značko, oba pa sta imela tudi lac operon. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

==Analiza==
Izražanje fuzijskih proteinov na površini so preverili z različnimi testi. Najprej so preverili in potrdili izražanje organofosforne hidrolaze na površini bakterij s pomočjo imunofluorescence, saj protitelesa ne morejo preiti bakterijske membrane. Izražanje encima na veziklih so potrdili z Western prenosom. Protein s celuloza vezavno domeno so preverili tako, da so vezikle izpostavili celulozni površini in vezanje potrdili z slikanjem z vrstičnim elektronskim mikroskopom. Aktivnost encima pa so preverili na substratu pesticidu paraokson, katerega produkt je barvni p-nitrofenol, ki ga je bilo možno meriti spektrofotometrično.

==Imobilizacija encima==
V številnih primerih imobilizacije encima se je njegova encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali pa se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer. Kot visoko prednost vidijo v tem, da encimska imobilizacija poteka ''in vivo'', kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo.
Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima. Sistem encima imobiliziranega na vezikel lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfornih pesticidov v okolju.

==Viri==
Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-21T15:33:31Z

Nina Roštan: /* Onesnaževanje */

==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženega okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju in so že prepovedani v veliko državah sveta. Medtem pa so organofosfati priljubljena alternativa zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu pa ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj povzroči smrt že pri nizkih odmerkih.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Encim organofosforna hidrolaza, ki hidrolizira organofosfate, je bil identificirana v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih encimov na njihovi površini kot fuzijski protein. Tako dobimo imobilizirane encime. Njihova prednost je tudi majhnost in majhen strošek proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosforno hidroazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi his značko, oba pa sta imela tudi lac operon. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

==Analiza==
Izražanje fuzijskih proteinov na površini so preverili z različnimi testi. Najprej so preverili izražanje organofosforne hidrolaze na površini bakterij s pomočjo imunofluorescence, saj protitelesa ne morejo preiti bakterijske membrane. Izražanje encima na veziklih so preverili z Western prenosom. Protein s celuloza vezavno domeno so preverili tako, da so vezikle izpostavili celulozni površini in vezanje potrdili z slikanjem z vrstičnim elektronskim mikroskopom. Aktivnost encima pa so preverili na substratu pesticidu paraokson, katerega produkt je barvni p-nitrofenol, ki ga je bilo možno meriti spektrofotometrično.

==Imobilizacija encima==
V številnih primerih imobilizacije encima se je njegova encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali pa se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer. Kot visoko prednost vidijo v tem, da encimska imobilizacija poteka ''in vivo'', kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo.
Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima. Sistem encima imobiliziranega na vezikel lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfornih pesticidov v okolju.

==Viri==
Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-21T15:31:34Z

Nina Roštan: /* Analiza */

==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženega okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju in so že prepovedani v veliko državah sveta. Medtem ko so organofosfati priljubljena alternativa zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu pa ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj povzroči smrt že pri nizkih odmerkih.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Encim organofosforna hidrolaza, ki hidrolizira organofosfate, je bil identificirana v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih encimov na njihovi površini kot fuzijski protein. Tako dobimo imobilizirane encime. Njihova prednost je tudi majhnost in majhen strošek proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosforno hidroazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi his značko, oba pa sta imela tudi lac operon. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

==Analiza==
Izražanje fuzijskih proteinov na površini so preverili z različnimi testi. Najprej so preverili izražanje organofosforne hidrolaze na površini bakterij s pomočjo imunofluorescence, saj protitelesa ne morejo preiti bakterijske membrane. Izražanje encima na veziklih so preverili z Western prenosom. Protein s celuloza vezavno domeno so preverili tako, da so vezikle izpostavili celulozni površini in vezanje potrdili z slikanjem z vrstičnim elektronskim mikroskopom. Aktivnost encima pa so preverili na substratu pesticidu paraokson, katerega produkt je barvni p-nitrofenol, ki ga je bilo možno meriti spektrofotometrično.

==Imobilizacija encima==
V številnih primerih imobilizacije encima se je njegova encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali pa se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer. Kot visoko prednost vidijo v tem, da encimska imobilizacija poteka ''in vivo'', kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo.
Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima. Sistem encima imobiliziranega na vezikel lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfornih pesticidov v okolju.

==Viri==
Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-21T15:30:27Z

Nina Roštan:

==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženega okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju in so že prepovedani v veliko državah sveta. Medtem ko so organofosfati priljubljena alternativa zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu pa ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj povzroči smrt že pri nizkih odmerkih.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Encim organofosforna hidrolaza, ki hidrolizira organofosfate, je bil identificirana v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih encimov na njihovi površini kot fuzijski protein. Tako dobimo imobilizirane encime. Njihova prednost je tudi majhnost in majhen strošek proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosforno hidroazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi his značko, oba pa sta imela tudi lac operon. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

==Analiza==
Izražanje fuzijskih roteinov na površino so preverili z različnimi testi. Najprej so preverili izražanje organofosforne hidrolaze na površini bakterij s pomočjo imunofluorescence, saj protitelesa ne morejo preiti bakterijske membrane. Izražanje na veziklih so preverili z Western prenosom. Protein s celuloza vezavno domeno so preverili tako, da so vezikle izpostavili celulozni površini in vezanje potrdili z slikanjem z vrstičnim elektronskim mikroskopom. Aktivnost encima pa so preverili na substratu pesticidu paraokson, katerega produkt je barvni p-nitrofenol, ki ga je bilo možno meriti spektrofotometrično.

==Imobilizacija encima==
V številnih primerih imobilizacije encima se je njegova encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali pa se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer. Kot visoko prednost vidijo v tem, da encimska imobilizacija poteka ''in vivo'', kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo.
Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima. Sistem encima imobiliziranega na vezikel lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfornih pesticidov v okolju.

==Viri==
Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-21T15:25:52Z

Nina Roštan: /* Imobilizacija encima */

==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženega okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju in so že prepovedani v veliko državah sveta. Medtem ko so organofosfati priljubljena alternativa zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu pa ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj povzroči smrt že pri nizkih odmerkih.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Encim organofosforna hidrolaza, ki hidrolizira organofosfate, je bil identificirana v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih encimov na njihovi površini kot fuzijski protein. Tako dobimo imobilizirane encime. Njihova prednost je tudi majhnost in majhen strošek proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosforno hidroazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi his značko, oba pa sta imela tudi lac operon. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

==Imobilizacija encima==
V številnih primerih imobilizacije encima se je njegova encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali pa se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer. Kot visoko prednost vidijo v tem, da encimska imobilizacija poteka ''in vivo'', kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo.
Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima. Sistem encima imobiliziranega na vezikel lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfornih pesticidov v okolju.

==Viri==
Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-21T15:25:24Z

Nina Roštan: /* Priprava vektorskih konstruktov */

==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženega okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju in so že prepovedani v veliko državah sveta. Medtem ko so organofosfati priljubljena alternativa zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu pa ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj povzroči smrt že pri nizkih odmerkih.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Encim organofosforna hidrolaza, ki hidrolizira organofosfate, je bil identificirana v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih encimov na njihovi površini kot fuzijski protein. Tako dobimo imobilizirane encime. Njihova prednost je tudi majhnost in majhen strošek proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosforno hidroazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi his značko, oba pa sta imela tudi lac operon. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

==Imobilizacija encima==
V številnih primerih imobilizacije encima se je njegova encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer. Kot visoko prednost vidijo v tem, da encimska imobilizacija poteka ''in vivo'', kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo.
Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima. Sistem encima imobiliziranega na vezikel lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfornih pesticidov v okolju.

==Viri==
Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-21T15:24:42Z

Nina Roštan: /* Vezikli zunanje membrane */

==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženega okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju in so že prepovedani v veliko državah sveta. Medtem ko so organofosfati priljubljena alternativa zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu pa ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj povzroči smrt že pri nizkih odmerkih.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Encim organofosforna hidrolaza, ki hidrolizira organofosfate, je bil identificirana v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih encimov na njihovi površini kot fuzijski protein. Tako dobimo imobilizirane encime. Njihova prednost je tudi majhnost in majhen strošek proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je tudi naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosforno hidroazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi his značko, oba pa sta imela tudi lac operon. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

==Imobilizacija encima==
V številnih primerih imobilizacije encima se je njegova encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer. Kot visoko prednost vidijo v tem, da encimska imobilizacija poteka ''in vivo'', kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo.
Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima. Sistem encima imobiliziranega na vezikel lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfornih pesticidov v okolju.

==Viri==
Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-21T15:24:01Z

Nina Roštan: /* Bioremediacija */

==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženega okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju in so že prepovedani v veliko državah sveta. Medtem ko so organofosfati priljubljena alternativa zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu pa ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj povzroči smrt že pri nizkih odmerkih.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Encim organofosforna hidrolaza, ki hidrolizira organofosfate, je bil identificirana v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih encimov na njihovi površini kot fuzijski protein. Tako dobimo imobilizirane encime. Njihova prednost je tudi majhnost in majhen strošek njihove proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je tudi naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosforno hidroazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi his značko, oba pa sta imela tudi lac operon. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

==Imobilizacija encima==
V številnih primerih imobilizacije encima se je njegova encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer. Kot visoko prednost vidijo v tem, da encimska imobilizacija poteka ''in vivo'', kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo.
Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima. Sistem encima imobiliziranega na vezikel lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfornih pesticidov v okolju.

==Viri==
Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-21T15:23:27Z

Nina Roštan: /* Onesnaževanje */

==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženega okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju in so že prepovedani v veliko državah sveta. Medtem ko so organofosfati priljubljena alternativa zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu pa ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj povzroči smrt že pri nizkih odmerkih.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Encim organofosforna hidrolaza, ki hidrolizira organofosfate, je bil identificiran v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih encimov na njihovi površini kot fuzijski protein. Tako dobimo imobilizirane encime. Njihova prednost je tudi majhnost in majhen strošek njihove proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je tudi naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosforno hidroazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi his značko, oba pa sta imela tudi lac operon. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

==Imobilizacija encima==
V številnih primerih imobilizacije encima se je njegova encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer. Kot visoko prednost vidijo v tem, da encimska imobilizacija poteka ''in vivo'', kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo.
Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima. Sistem encima imobiliziranega na vezikel lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfornih pesticidov v okolju.

==Viri==
Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

MBT seminarji 2017

2017-03-21T15:22:30Z

Nina Roštan:

'''Seznam seminarjev iz Molekularne biotehnologije v študijskem letu 2016/17'''

Na tej strani je seznam odobrenih člankov za seminar ter povezave do člankov in do povzetkov, ki jih morate objaviti najkasneje do ponedeljka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v sredo). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

# The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak, 15. marca 2017
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

'''Naslovi odobrenih člankov po temah:'''

'''Gensko spremenjene rastline''' (8. marec) 
# Synthesis of bacteriophage lytic proteins against ''Streptococcus pneumoniae'' in the chloroplast of ''Chlamydomonas reinhardtii'' (L. Stoffels ''et al''; Plant Biotechnol. J., 2017; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12703/epdf) [[Sinteza bakteriofagnih litičnih proteinov proti Streptococcus pneumoniae v kloroplastih alge Chlamydomonas reinhardtii]]. Eva Vidak, 8. marec 2017
# Bioengineering of the Plant Culture of ''Capsicum frutescens'' with Vanillin Synthase Gene for the Production of Vanillin (M. Jenn Yang Chee ''et al''; Molecular Biotechnology 59(1), 2017; http://link.springer.com/article/10.1007/s12033-016-9986-2) [[Bioinženiring rastlinske kulture Capsicum frutescens z genom za vanilin sintazo za pridobivanje vanilina]]. Mojca Juteršek, 8. marec 2017
# The production of human glucocerebrosidase in glyco-engineered ''Nicotiana benthamiana'' plants (Limkul, J. ''et al''; Plant Biotechnol J., 2016; http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12529/full) [[Proizvodnja človeške glukocerebrozidaze v rastlini Nicotiana benthamiana s spremenjeno glikozilacijo]]. Vita Vidmar, 8. marec 2017

'''Gensko spremenjene živali''' (15. marec) 
# Evaluation of porcine stem cells competence for somatic cell nuclear transfer and production of cloned animals (J. O. Secher; Animal Reproduction Science, 2017;http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432016304274) [[Določanje kompetence prašičjih matičnih celic za somatski jedrni prenos in kloniranje živali]]. Jerneja Kocutar, 15. marec 2017
# High-level expression of a novel recombinant human plasminogen activator (rhPA) in the milk of transgenic rabbits and its thrombolytic bioactivity ''in vitro'' (Song, S. ''et al''; Molecular Biology Reports ,2016; https://link-springer-com.nukweb.nuk.uni-lj.si/article/10.1007%2Fs11033-016-4020-0) [[Visoka stopnja izražanja rekombinantnega tkivnega aktivatorja plazminogena v mleku transgenskih zajcev in njegova trombolitična aktivnost in vitro]]. Tjaša Lapanja, 15. marec 2017
# Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function (C. Burcard ''et al''; PLOS Pathogens 13 (2) 2017; http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006206) [[Makrofagi iz gensko spremenjenih prašičev z delecijo domene CD163 SRCR5 odporni na okužbo s PRRSV]]. Urška Černe, 15. marec 2017

'''Okolje''' (22. marec) 
# Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang ''et al''; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815) [[Okrasitev veziklov zunanje membrane z organofosforno hidrolazo in celuloza vezavno domeno za razgradnjo organofosfatnih pesticidov]]. Nina Roštan, 22. marec 2017
# Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies (P. Gupta in B. Diwan; Biotechnology Reports, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382) [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Odstranjevanje_te%C5%BEkih_kovin_s_pomo%C4%8Djo_bakterijskih_eksopolisaharidov:_biosinteza%2C_mehanizem_in_strategije_remediacije Odstranjevanje težkih kovin s pomočjo bakterijskih eksopolisaharidov: biosinteza, mehanizem in strategije remediacije]. Eva Korošec, 22. marec 2017
# Disulfide isomerase-like protein AtPDIL1–2 is a good candidate for trichlorophenol phytodetoxification (Peng, R.-H. in sod.; Sci. Rep. 7, 2017; http://www.nature.com/articles/srep40130#s1) [[Disulfid izomerazi podoben protein AtPDIL1-2 kot kandidat za fitodetoksifikacijo 2,4,6-triklorofenola]]. Ana Cirnski, 22. marca 2017

'''Terapevtski proteini''' (29. marec) 
# Production of functional human nerve growth factor from the saliva of transgenic mice by using salivary glands as bioreactors (F. Zeng in sodelavci; Scientific Reports 7(41270), 2017; http://www.nature.com/articles/srep41270) Proizvodnja humanega živčnega rastnega faktorja iz sline transgenskih miši z uporabo žlez slinavk kot bioreaktorjev. Neža Levičnik, 29. marca 2017
# Mechano growth factor-C24E, a potential promoting biochemical factor for ligament tissue engineering (Y. Song in sodelavci; Biochemical Engineering Journal 105(2016) 249-263,2016, http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X15300681) Mechano rastni faktor-C24E, potencialni promovirajoči biokemijski faktor za inženirstvo tkiva ligamentov. Peter Prezelj, 29. marca 2017
#Domen Klofutar

'''Protitelesa kot terapevtiki''' (5. april) 
# Ema Guštin <3
# Jan Rozman
# Alja Zgonc

'''Diagnostiki''' (12. april) 
# Tjaša Košir
# Petra Vivod
# Marija Kisilak

'''Cepiva''' (19. april) 
#Tomaž Rozmarič
#Amadeja Lapornik
#Mojca Hunski

'''Antibiotiki in LMW učinkovine''' (26. april) 
#Vid Jazbec <3 <3
#Zala Gluhić
#Katja Malovrh

'''Male molekule in polimeri''' (3. maj) 
# Engineering of a microbial coculture of ''Escherichia coli'' strains for the biosynthesis of resveratrol (José M. Camacho-Zaragoza ''et al''; Microbal Cell factories 15(163), 2016; https://microbialcellfactories.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12934-016-0562-z) Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov ''Escherichia coli'' za biosintezo resveratrola. Petra Tavčar,3. marec 2017
# Tim Božič
# Tajda Buh

'''Encimi''' (10. maj) 
# Nataša Traven
# Bine Tršavec
#

'''Pretvorba biomase''' (17. maj) 
# Inge Sotlar
# Anja Herceg
# The ''Podospora anserina'' lytic polysaccharide monooxygenase PaLPMO9H catalyzes oxidative cleavage of diverse plant cell wall matrix glycans (M. Fanuel ''et al''; Biotechnology for Biofuels, 2017; https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-0749-5). Anja Tanšek, 17. maj 2017

'''Metabolno inženirstvo''' (24. maj) 
# Barbara Dušak
# Tjaša Grum
# Sara Kimm Fuhrmann

'''Biološki viri energije''' (31. maj) 
# Self-regulated 1-butanol production in ''Escherichia coli'' based on the endogenous fermentative control (RC. Wen, CR. Shen; Biotechnol Biofuels, 2016; http://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-016-0680-1) Samoregulirana proizvodnja 1-butanola v ''Escherichia coli'', ki temelji na endogeni kontroli fermentacije. Barbara Lipovšek, 31. maj 2017
# A Ferrocene-Based Conjugated Oligoelectrolyte Catalyzes Bacterial Electrode Respiration (N. D. Kirchhofer in sodelavci; Chem 2, 240-257, 2017; http://www.cell.com/chem/abstract/S2451-9294(17)30001-3). Konjugirani oligoelektrolit na osnovi ferocena katalizira bakterijsko elektrodno respiracijo. Matic Kovačič, 31. maj 2017
#

'''Novi pristopi v molekularni biotehnologiji''' (6. junij) 
# Matjaž Ivanuša
#
#

Nazaj na predmet [[Molekularna_biotehnologija]].

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-21T15:18:11Z

Nina Roštan: /* Zaključek */

==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženja okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju in so že prepovedani v veliko državah sveta. Medtem ko so organofosfati priljubljena alternativa zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj povzroči smrt že pri nizkih odmerkih.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Encim organofosforna hidrolaza, ki hidrolizira organofosfate, je bil identificiran v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih encimov na njihovi površini kot fuzijski protein. Tako dobimo imobilizirane encime. Njihova prednost je tudi majhnost in majhen strošek njihove proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je tudi naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosforno hidroazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi his značko, oba pa sta imela tudi lac operon. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

==Imobilizacija encima==
V številnih primerih imobilizacije encima se je njegova encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer. Kot visoko prednost vidijo v tem, da encimska imobilizacija poteka ''in vivo'', kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo.
Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima. Sistem encima imobiliziranega na vezikel lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfornih pesticidov v okolju.

==Viri==
Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-21T15:15:45Z

Nina Roštan:

==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženja okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju in so že prepovedani v veliko državah sveta. Medtem ko so organofosfati priljubljena alternativa zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj povzroči smrt že pri nizkih odmerkih.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Encim organofosforna hidrolaza, ki hidrolizira organofosfate, je bil identificiran v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih encimov na njihovi površini kot fuzijski protein. Tako dobimo imobilizirane encime. Njihova prednost je tudi majhnost in majhen strošek njihove proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je tudi naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosforno hidroazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi his značko, oba pa sta imela tudi lac operon. Oba konstrukta so vstavili v E. coli.

==Imobilizacija encima==
V številnih primerih imobilizacije encima se je njegova encimska aktivnost zmanjšala, saj se je ali preveč spremenila nativna konformacija proteina ali se je zmanjšala dostopnost substrata. So pa bili tudi primeri, kjer je imobilizacija zvišala aktivnost encima. Raziskovalci so določili več prednosti imobilizacije encima v njihovi študiji in sicer. Kot visoko prednost vidijo v tem, da encimska imobilizacija poteka ''in vivo'', kar prepreči denaturacijo in zmanjšanje aktivnosti encima zaradi kemijske konjugacije. Prav tako je bila ohranjena integriteta in neodvisnost encima. Aktivnost encima so tako preverili v treh različnih konfiguracijah in sicer v obliki prostega topnega encima, encima imobiliziranega na vezikel in encima, ki je imobiliziran na vezikel, ta pa vezan na celulozo.
Vpliv veziklov in celuloze na encim so preverili s časovnim profiliranjem razgradnje paraoksona. Opazili so hitrejšo razgradnjo pri imobiliziranem encimu. Preverili so tudi katalitično aktivnost na drugih organofosfatnih pesticidih in dobili podobne rezultate.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima, ki lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfornih pesticidov v okolju.

==Viri==
Decorating outer membrane vesicles with organophosphorus hydrolase and cellulose binding domain for organophosphate pesticide degradation (S. Fu-Hsiang et al; Chemical Engineering Journal, 2017; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894716312815)

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-21T15:11:14Z

Nina Roštan:

Predstavitev organofosfatne hidrolaze in celuloza vezavne domene na površini veziklov zunanje membrane za razgradnjo organofosfatnih pesticidov

2017-03-21T15:10:42Z

Nina Roštan: New page: [http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382 Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies...

[http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2215017X16301382 Bacterial Exopolysaccharide mediated heavy metal removal: A Review on biosynthesis, mechanism and remediation strategies]
==Onesnaževanje==
Intenzivna raba herbicidov in pesticidov je med glavnimi krivci onesnaženja okolja. Zato je pomembno, da jih po tem, ko svojo nalogo opravijo, odstranimo iz okolja. Poznamo več oblik pesticidov, med sintetičnimi pesticidi so najbolj znani organokloridi in organofosfati. Organokloridi se težje razgradijo v okolju in so že prepovedani v veliko državah sveta. Medtem ko so organofosfati priljubljena alternativa zaradi hitrejše razgradnje v okolju. Kljub temu ga je še vedno možno zaznati v pitni vodi in hrani ljudi. zaradi nespecifičnega delovanja škodi veliko netarčnim organizmom, saj povzroči smrt že pri nizkih odmerkih.

==Bioremediacija==
Bioremediacija se nanaša na uporabo bioloških sistemov kot so bakterije ali glive in njihovih encimov za razgradnjo kontaminantov. Prepoznava se kot potencialno orodje za zmanjšanje okoljskih kontaminatov, saj so encimi bolj specifični za substrat, ki ga želimo razgraditi in imajo višjo toleranco ter manj stranskih produktov kot na primer kemijska razgradnja.
Encim organofosforna hidrolaza, ki hidrolizira organofosfate, je bil identificiran v številnih mikrobnih vrstah.

==Vezikli zunanje membrane==
Vezikli zunanje membrane izhajajo iz različnih gram negativnih bakterij kot del njihovega naravnega rastnega cikla. Vezikli so predvsem zanimivi za izražanje želenih encimov na njihovi površini kot fuzijski protein. Tako dobimo imobilizirane encime. Njihova prednost je tudi majhnost in majhen strošek njihove proizvodnje. Več študij je tudi pokazalo, da so stabilni v različnih razmerah v okolju.

==Priprava vektorskih konstruktov==
Celuloza vezavna domena je pogosto v uporabi na področju biotehnologije. Domeno združijo s tarčnim proteinom, da nastane fuzijski protein, ki ga bo mogoče afinitetno ločiti od preostale biomase s pomočjo celuloze. Celuloza je tudi naravno bogat in poceni material.
Tu so raziskovalci začeli razmišljati o njihovem končnem produktu, ki bi bil vezikel z izraženima dvema proteinoma na površini in sicer bi imel dva fuzijska proteina.
Pripravili so dva vektorska konstrukta, prvi je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval preiskovani encim organofosforno hidroazo in protein za nukleacijo ledu, ki je membranski protein. Drugi vektorski konstrukt pa je vseboval zapis za fuzijski protein, ki je vseboval celuloza vezavno domeno in Lpp-ompA membranski protein. Prvi je vseboval tudi his značko, oba pa sta imela tudi lac operon.

==Zaključek==
Encimi imobilizirani na vezikel omogočajo ohranitev stabilnega in aktivnega encima, ki lahko postane močno in robustno orodje za razgradnjo organofosfornih pesticidov v okolju.

==Viri==

Nazaj na stran [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MBT_seminarji_2017 MBT seminarji]

MBT seminarji 2017

2017-03-01T14:35:47Z

Nina Roštan:

MBT seminarji 2017

2017-03-01T14:27:23Z

Nina Roštan:

MBT seminarji 2017

2017-02-27T22:37:47Z

Nina Roštan: