Wiki FKKT - User contributions [en]

Seminarji SB 2021/22

2022-04-05T13:06:16Z

NinaV:

V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
Lanski primer:

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline] (Liza Ulčakar) 
#

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)

----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Seminarji SB 2021/22

2022-04-02T18:03:01Z

NinaV:

V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 
Lanski primer:

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline] (Liza Ulčakar) 
#

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin]

----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin

2022-04-02T18:01:22Z

NinaV:

Projekt »Kissed by Light« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 in bil nagrajen s prvim mestom v kategoriji zdravljenje. Zasnovala ga je skupina SZTP-CHINA, ki je želela narediti efektiven terapevtik, ki bi poškodovanim z opeklinami omogočal manj boleče okrevanje in preprečeval bakterijske okužbe [1]. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA iGEM:SZPT-CHINA]

== Uvod ==
Opekline predstavljajo globalen zdravstveni problem, pri čemer, po poročanju Svetovne zdravstvene organizacije, zaradi njih umre 180 000 ljudi na leto [2]. Ob opeklini pride do poškodbe kože – organa, ki nas ščiti pred okužbami, zato je eden glavnih ciljev oskrbe opeklin preprečevanje in zdravljenje bakterijskih okužb. Pri oskrbi poškodovancev v bolnišničnem okolju so najbolj pogoste okužbe z bakterijo ''Pseudomonas aeruginosa''. Izbor antibiotične terapije pri tej bakteriji je zapleten, saj je rezistentna na mnoge antibiotike, poleg tega pa lahko antibiotiki negativno vplivajo na mikrobiom kože, kar poškoduje okoliške kožne celice [1], [3].
Poleg antimikrobne terapije pa je pri oskrbi pomemba tudi pravilna obložitev ran. To varuje površino opekline in jo ščiti pred vdorom tujih mikroorganizmov. Prav tako pomaga pri ohranjanju vlažnega okolja. Problem komercialnih materialov, ki se uporabljajo v ta namen npr. bombažne gaze, je, da se ti velikokrat primejo na rano in ob odstranitvi povzročijo sekundarne poškodbe [1].

== Cilj projekta Kissed by light ==
Uporabo antibiotikov so želeli so zamenjati s specifičnim antipseudomonalnim proteinom. Potencial so videli tudi v uporabi bakterijske celuloze (BC), ki ima visoko mehansko moč in dobro zadržuje vodo, hkrati pa se zaradi svoje biokompatibilnosti ne prijema na rane [4]. V projektu so združili obe ideji, tako da bi omogočili boljši nadzor nad okužbo in spodbudili zdravljenje opekline.
Kot produkt so si zamislil gensko spremenjen živ bakterijski terapevtik. Za šasijo so izbrali ''Gluconacetobacteri hansenii'' ATCC 53582, ki sama proizvaja bakterijsko celulozo. To so gensko spremenili tako, da lahko kontinuirano proizvaja antipseudomonalne proteine. Hkrati so uporabili optogenetiko (tehniko, ki omogoča nadzor bakterij s svetlobo). Tako so bakterije spremenili na tak način, da proizvajajo BC le, ko je to potrebno. S tem so zmanjšali metabolno breme in hitrost mutacij [1].
Pričakovali so, da v temi ''G. hansenii'' ne bo proizvedel skoraj nič BC, pod skoraj infrardečo svetlobo (NIR) bo začel proizvajati BC in pod modro svetlobo bodo bakterije lizirale in sprostile antipseudomonalni protein [1].

== Načrt ==
Načrt projekta ima tri module: proizvodnja antipseudomonalnega proteina, prenos signala c-di-GMP in proizvodnja BC, varnost in sproščanje zdravila. Pred začetkom eksperimentov so pripravili model, ki opiše potek signaliziranja s c-di-GMP [1].

=== Računalniško modeliranje ===
V ''G. hansenii'' produkcija BC poteka pod nadzorom sekundarnega sporočevalca cikličnega digvanidil monofosfata (c-di-GMP)[5]. BphS je digvanilat ciklaza, ki se aktivira s svetlobo in regulira sintezo c-di-GMP. Pod NIR svetlobo bo BphS spremenil konformacijo in se aktiviral ter začel sintetizirati c-di-GMP[6]. FcsR je c-di-GMP fosfodiesteraza, ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Kadar je hitrost nastajanja c-di-GMP večja kot njegova hidroliza, bo njegova koncentracija v celici naraščala in bakterije bodo proizvajale BC [1].
Za opis sistema so uporabili 6 reakcij in na njihovi osnovi oblikovali 5 enačb, ki so bile uporabljene za matematični model.
Model je napovedal, da ima osvetljevanje z NIR svetlobo signifikanten učinek na sintezo c-di-GMP, pri čemer je brez osvetljevanja koncentracija c-di-GMP skoraj nič [1].

=== Proizvodnja antipseudomonalnega proteina ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740050 BBa_K3740050]) ===
==== Načrt ====
Piocin S2 je topen protein, ki ga proizvajajo bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'' in lahko ubije ne imune ''P. aeruginosa'' bakterije. Imunost nekaterim sevom omogoča protein IMMS2, ki se specifično veže na nukleazno domeno piocina S2 in tako inhibira njegovo aktivnost [7]. Da bi pridobili protein, ki bi lahko ubil širši spekter ''P. aeruginosa'', so nukleazno domeno piocina S2 zamenjali z nukleazno domeno kolicina E3 in himerni protein poimenovali SE. Protein, ki omogoča imunost IMME3, je izpeljan iz imunskega proteina, ki ustreza kolicinu E3 [1], [8].
Protein SE ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740057 BBa_K3740057]) prepozna tarče preko ''Pseudomonas''-specifičnega receptorja in translokazne domene, celice pa ubije preko nukleazne domene iz kolicina E. Poleg tega protein SE vsebuje tudi neidentificirano funkcionalno domeno piocina 2. Gostiteljske celice ''G. hansenii'' so na SE odporne, saj izražajo imunski protein IMME3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740034 BBa_K3740034]) [1].
Normalno izražanje proteina SE ter nemoteno rast gostiteljskih celic so zagotovili tako, da so protein SE in imunski protein IMME3 izražali pod različnimi promotorji in RBSji. SE se je izražal pod promotorjem pR in RBS300, IMME3 pa pod promotorjem J23118 in RBSII [1].

==== Izvedba ====
Protein SE in protein S2 so najprej izrazili v bakterijah ''E. coli'' BL21. Za to so pripravili plazmide SE-PET28A IN S2-PET28A in izražanje inducirali z IPTG. Na NaDS-PAGE gel so nanesli surov proteinski ekstrakt in potrdili prisotnost obeh proteinov. S tem so potrdili, da je plazmidni konstrukt primeren za izražanje fuzijskega proteina. Raztopino obeh proteinov in PBS (kontrola) so dodali kulturam ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1, ''P. aeruginosa'' PAO1 Δ1150-1151 in ''E. coli'' MG1655. Pokazali so, da lahko protein SE inhibira rast ''P. aeruginosa'' ne glede na prisotnost regije PA1150-1151, medtem ko lahko S2 inhibira le mutanto PAO1 Δ1150-1151. Noben protein ni vplival na rast ''E. coli'' [1].
Sledila je optimizacija RBS. Plazmidne konstrukte, ki so jih pripravili v ''E .coli'', so nato prenesli v ''G. hansenii'' ATCC 53582, kjer so izvedli izražanje. Nato so kapljico raztopine s proteinom SE nanesli na FAB ploščo, na katero so bile enakomerno nanešene PAO1. Določili so, da je sev pR-RBS300-SE-B1006-J23118-RBSII-IMM-rrnB T1-pSEVA331-''G. hansenii'' ATCC najboljši, saj je imel največjo cono inhibicije [1].

=== c-di-GMP signalizacija in produkcija BC filma ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740030 BBa_K3740030]) ===
Ker je proizvodnja BC v ''G. hansenii'' regulirana s koncentracijo c-di-GMP [6], lahko nastanjanje BC posredno reguliramo z reguliranjem koncentracije c-di-GMP. Za natančno regulacijo so uvedli 2 podmodula. Prvi je digvanilat ciklazni (DGC) modul, ki regulira sintezo c-di-GMP, drugi pa c-di-GMP fosfodiesterazni (PDE), ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Uporabili so bphS ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740019 BBa_K3740019]) – kodirajoči gen za DGC, ki je aktivirana s svetlobo (BphS) in fcsR ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740022 BBa_K3740022]) – dele kodirajočih genov c-di-GMP PDE iz različnih bakterij in ju pripravili za konstrukcijo plazmidov, ki so bili klonirani v ''E. coli'' in nato preneseni v ''G. hansenii'' ATCC53582. Pokazali so, da ima J23109-fcsR-pSEVA331 hidrolizno funkcijo in da J23100-bphS-bphO-pSEVA331 ob osvetljevanju z NIR proizvedejo več BC kot v temi. Optimizirali so tudi promotorske regije in glede na količino BC določili najbolj primeren promotor. Odločili so se za konstrukt J23100-B0034-bphS-pET RBS-bphO-rrnB T1-J23109-B0034-fcsR-rrnB T1, pri katerem pride do signifikantne razlike med izkoristkom BC pri osvetljevanju in v temi [1].

=== Varnost in sproščanje zdravila ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740044 BBa_K3740044]) ===
V modulu so zasnovali foto-induciran sistem za lizo. Gre za varnostni modul, ki lahko mehanistično zmanjša posledice sprostitve gensko spremenjenih bakterij v okolje. Hkrati pa nadzira sprostitev antipseudomonalnega proteina SE [1].
Uporabili so sistem pDawn, ki je odziven na modro svetlobo. Ob osvetljevanju dvokomponentni sistem YF1/FixJ v pDawn zavre izražanje represorja cI iz faga λ, kar omogoča da je izražanje »downstream« genov aktivirano s svetlobo [1], [9].
Delovanje promotorja pDawn so testirali s plazmidom pDawn-RFP-pSEVA331, ki so ga vnesli v ''G. hansenii'' ATCC53582 in prvo skupino bakterij gojili pod modro lučjo, drugo pa v temi. Pri prvi skupini se je izražal RFP pri drugi skupini pa ne [1].
Promotor pDawn so nato uporabili za izražanje različnih litičnih genov, med drugim S105 (Lambda litična kaseta brez antiholina), X174 (litični gen, ki kodira litični protein iz Escherichia faga PhiX174) in LKD16 (litična kaseta). Pripravljene plazmide so najprej testirali v ''E. coli'', nato pa jih prenesli v ''G. hansenii''. Sev pDawn-X174 E-pSEVA331-''G. hansenii'' ATCC 53582 (vsebuje X174 E – Bba_K2656015) je stabilno liziral pod modro lučjo [1].

== Izboljšave ==
Za povzročitev lize so pogosto uporabljeni inducibilni promotorji. V takem primeru se vseeno lahko izraža majhen delež proteina, kar z akumulacijo litičnega proteina privede do avtolize. Da bi dobili bolj stabilno proizvodnjo litičnega proteina, so izvedli mutagenezo z naključnimi oligonukleotidi na RBS (BBa_B0034). S tem so dobili kolonije, ki so pod modro svetlobo lizirale. Poleg tega so potrdili, da so vnesene mutacije povečale sintezo proteinov s tem RBS [1].
Prihodnje izboljšave bodo vključevale spremembe vezja za produkcijo BC, saj želijo zmanjšati izražanje BC v temi [1].

== Končni produkt ==
Kot končni produkt so si zamislili živ bioterapevtik v obliki bakterijske emulzije in liofilizirane bakterije. Dve obliki produkta potrebujeta drugačne pogoje shranjevanja in imata različen rok uporabe in tako služita različnim potrebam uporabnikov [1].

== Viri ==
[1] “Team:SZPT-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA. [Accessed: 27-Mar-2022].

[2] WHO, “Burns,” 2018. [Online]. Available: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/burns. [Accessed: 27-Mar-2022].

[3] P. Bielecki, J. Glik, M. Kawecki, and V. A. P. Martins Dos Santos, “Towards understanding ''Pseudomonas aeruginosa'' burn wound infections by profiling gene expression,” Biotechnol. Lett., vol. 30, no. 5, pp. 777–790, May 2008, doi: 10.1007/S10529-007-9620-2.

[4] L. Fu et al., “Skin tissue repair materials from bacterial cellulose by a multilayer fermentation method,” J. Mater. Chem., vol. 22, no. 24, pp. 12349–12357, May 2012, doi: 10.1039/C2JM00134A.

[5] E. Sajadi, S. S. A. Fatemi, V. Babaeipour, A. A. Deldar, B. Yakhchali, and M. S. Anvar, “Increased cellulose production by heterologous expression of bcsA and B genes from Gluconacetobacterxylinus in ''E. coli'' Nissle 1917,” Bioprocess Biosyst. Eng., vol. 42, no. 12, pp. 2023–2034, Dec. 2019, doi: 10.1007/S00449-019-02197-4.

[6] M. H. Ryu and M. Gomelsky, “Near-infrared light responsive synthetic c-di-GMP module for optogenetic applications,” ACS Synth. Biol., vol. 3, no. 11, pp. 802–810, Nov. 2014, doi: 10.1021/SB400182X.

[7] S. Denayer, S. Matthijs, and P. Cornelis, “Pyocin S2 (Sa) Kills ''Pseudomonas aeruginosa'' Strains via the FpvA Type I Ferripyoverdine Receptor,” J. Bacteriol., vol. 189, no. 21, p. 7663, Nov. 2007, doi: 10.1128/JB.00992-07.

[8] H.-X. Zhou, “Association and dissociation kinetics of colicin E3 and immunity protein 3: Convergence of theory and experiment,” Protein Sci., vol. 12, no. 10, p. 2379, Jan. 2003, doi: 10.1110/PS.03216203.

[9] R. Ohlendorf, R. R. Vidavski, A. Eldar, K. Moffat, and A. Möglich, “From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression,” J. Mol. Biol., vol. 416, no. 4, pp. 534–542, Mar. 2012, doi: 10.1016/J.JMB.2012.01.001.

Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin

2022-04-02T17:54:29Z

NinaV: /* Načrt */

Projekt »Kissed by Light« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 in bil nagrajen s prvim mestom v kategoriji zdravljenje. Zasnovala ga je skupina SZTP-CHINA, ki je želela narediti efektiven terapevtik, ki bi poškodovanim z opeklinami omogočal manj boleče okrevanje in preprečeval bakterijske okužbe [1]. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA iGEM:SZPT-CHINA]

== Uvod ==
Opekline predstavljajo globalen zdravstveni problem, pri čemer, po poročanju Svetovne zdravstvene organizacije, zaradi njih umre 180 000 ljudi na leto [2]. Ob opeklini pride do poškodbe kože – organa, ki nas ščiti pred okužbami, zato je eden glavnih ciljev oskrbe opeklin preprečevanje in zdravljenje bakterijskih okužb. Pri oskrbi poškodovancev v bolnišničnem okolju so najbolj pogoste okužbe z bakterijo ''Pseudomonas aeruginosa''. Izbor antibiotične terapije pri tej bakteriji je zapleten, saj je rezistentna na mnoge antibiotike, poleg tega pa lahko antibiotiki negativno vplivajo na mikrobiom kože, kar poškoduje okoliške kožne celice [1], [3].
Poleg antimikrobne terapije pa je pri oskrbi pomemba tudi pravilna obložitev ran. To varuje površino opekline in jo ščiti pred vdorom tujih mikroorganizmov. Prav tako pomaga pri ohranjanju vlažnega okolja. Problem komercialnih materialov, ki se uporabljajo v ta namen npr. bombažne gaze, je, da se ti velikokrat primejo na rano in ob odstranitvi povzročijo sekundarne poškodbe [1].

== Cilj projekta Kissed by light ==
Uporabo antibiotikov so želeli so zamenjati s specifičnim antipseudomonalnim proteinom. Potencial so videli tudi v uporabi bakterijske celuloze (BC), ki ima visoko mehansko moč in dobro zadržuje vodo, hkrati pa se zaradi svoje biokompatibilnosti ne prijema na rane [4]. V projektu so združili obe ideji, tako da bi omogočili boljši nadzor nad okužbo in spodbudili zdravljenje opekline.
Kot produkt so si zamislil gensko spremenjen živ bakterijski terapevtik. Za šasijo so izbrali ''Gluconacetobacteri hansenii'' ATCC 53582, ki sama proizvaja bakterijsko celulozo. To so gensko spremenili tako, da lahko kontinuirano proizvaja antipseudomonalne proteine. Hkrati so uporabili optogenetiko (tehniko, ki omogoča nadzor bakterij s svetlobo). Tako so bakterije spremenili na tak način, da proizvajajo BC le, ko je to potrebno. S tem so zmanjšali metabolno breme in hitrost mutacij [1].
Pričakovali so, da v temi ''G. hansenii'' ne bo proizvedel skoraj nič BC, pod skoraj infrardečo svetlobo (NIR) bo začel proizvajati BC in pod modro svetlobo bodo bakterije lizirale in sprostile antipseudomonalni protein [1].

== Načrt ==
Načrt projekta ima tri module: proizvodnja antipseudomonalnega proteina, prenos signala c-di-GMP in proizvodnja BC, varnost in sproščanje zdravila. Pred začetkom eksperimentov so pripravili model, ki opiše potek signaliziranja s c-di-GMP [1].

=== Računalniško modeliranje ===
V ''G. hansenii'' produkcija BC poteka pod nadzorom sekundarnega sporočevalca cikličnega digvanidil monofosfata (c-di-GMP)[5]. BphS je digvanilat ciklaza, ki se aktivira s svetlobo in regulira sintezo c-di-GMP. Pod NIR svetlobo bo BphS spremenil konformacijo in se aktiviral ter začel sintetizirati c-di-GMP[6]. FcsR je c-di-GMP fosfodiesteraza, ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Kadar je hitrost nastajanja c-di-GMP večja kot njegova hidroliza, bo njegova koncentracija v celici naraščala in bakterije bodo proizvajale BC [1].
Za opis sistema so uporabili 6 reakcij in na njihovi osnovi oblikovali 5 enačb, ki so bile uporabljene za matematični model.
Model je napovedal, da ima osvetljevanje z NIR svetlobo signifikanten učinek na sintezo c-di-GMP, pri čemer je brez osvetljevanja koncentracija c-di-GMP skoraj nič [1].

=== Proizvodnja antipseudomonalnega proteina ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740050 BBa_K3740050]) ===
==== Načrt ====
Piocin S2 je topen protein, ki ga proizvajajo bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'' in lahko ubije ne imune ''P. aeruginosa'' bakterije. Imunost nekaterim sevom omogoča protein IMMS2, ki se specifično veže na nukleazno domeno piocina S2 in tako inhibira njegovo aktivnost [7]. Da bi pridobili protein, ki bi lahko ubil širši spekter ''P. aeruginosa'', so nukleazno domeno piocina S2 zamenjali z nukleazno domeno kolicina E3 in himerni protein poimenovali SE. Protein, ki omogoča imunost IMME3, je izpeljan iz imunskega proteina, ki ustreza kolicinu E3 [1], [8].
Protein SE ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740057 BBa_K3740057]) prepozna tarče preko ''Pseudomonas''-specifičnega receptorja in translokazne domene, celice pa ubije preko nukleazne domene iz kolicina E. Poleg tega protein SE vsebuje tudi neidentificirano funkcionalno domeno piocina 2. Gostiteljske celice ''G. hansenii'' so na SE odporne, saj izražajo imunski protein IMME3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740034 BBa_K3740034]) [1].
Normalno izražanje proteina SE ter nemoteno rast gostiteljskih celic so zagotovili tako, da so protein SE in imunski protein IMME3 izražali pod različnimi promotorji in RBSji. SE se je izražal pod promotorjem pR in RBS300, IMME3 pa pod promotorjem J23118 in RBSII [1].

==== Izvedba ====
Protein SE in protein S2 so najprej izrazili v bakterijah E. coli BL21. Za to so pripravili plazmide SE-PET28A IN S2-PET28A in izražanje inducirali z IPTG. Na NaDS-PAGE gel so nanesli surov proteinski ekstrakt in potrdili prisotnost obeh proteinov. S tem so potrdili, da je plazmidni konstrukt primeren za izražanje fuzijskega proteina. Raztopino obeh proteinov in PBS (kontrola) so dodali kulturam ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1, ''P. aeruginosa'' PAO1 Δ1150-1151 in E. coli MG1655. Pokazali so, da lahko protein SE inhibira rast ''P. aeruginosa'' ne glede na prisotnost regije PA1150-1151, medtem ko lahko S2 inhibira le mutanto PAO1 Δ1150-1151. Noben protein ni vplival na rast E. coli [1].
Sledila je optimizacija RBS. Plazmidne konstrukte, ki so jih pripravili v E .coli, so nato prenesli v ''G. hansenii'' ATCC 53582, kjer so izvedli izražanje. Nato so kapljico raztopine s proteinom SE nanesli na FAB ploščo, na katero so bile enakomerno nanešene PAO1. Določili so, da je sev pR-RBS300-SE-B1006-J23118-RBSII-IMM-rrnB T1-pSEVA331-''G. hansenii'' ATCC najboljši, saj je imel največjo cono inhibicije [1].

=== c-di-GMP signalizacija in produkcija BC filma ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740030 BBa_K3740030]) ===
Ker je proizvodnja BC v ''G. hansenii'' regulirana s koncentracijo c-di-GMP [6], lahko nastanjanje BC posredno reguliramo z reguliranjem koncentracije c-di-GMP. Za natančno regulacijo so uvedli 2 podmodula. Prvi je digvanilat ciklazni (DGC) modul, ki regulira sintezo c-di-GMP, drugi pa c-di-GMP fosfodiesterazni (PDE), ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Uporabili so bphS ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740019 BBa_K3740019]) – kodirajoči gen za DGC, ki je aktivirana s svetlobo (BphS) in fcsR ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740022 BBa_K3740022]) – dele kodirajočih genov c-di-GMP PDE iz različnih bakterij in ju pripravili za konstrukcijo plazmidov, ki so bili klonirani v E. coli in nato preneseni v ''G. hansenii'' ATCC53582. Pokazali so, da ima J23109-fcsR-pSEVA331 hidrolizno funkcijo in da J23100-bphS-bphO-pSEVA331 ob osvetljevanju z NIR proizvedejo več BC kot v temi. Optimizirali so tudi promotorske regije in glede na količino BC določili najbolj primeren promotor. Odločili so se za konstrukt J23100-B0034-bphS-pET RBS-bphO-rrnB T1-J23109-B0034-fcsR-rrnB T1, pri katerem pride do signifikantne razlike med izkoristkom BC pri osvetljevanju in v temi [1].

=== Varnost in sproščanje zdravila ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740044 BBa_K3740044]) ===
V modulu so zasnovali foto-induciran sistem za lizo. Gre za varnostni modul, ki lahko mehanistično zmanjša posledice sprostitve gensko spremenjenih bakterij v okolje. Hkrati pa nadzira sprostitev antipseudomonalnega proteina SE [1].
Uporabili so sistem pDawn, ki je odziven na modro svetlobo. Ob osvetljevanju dvokomponentni sistem YF1/FixJ v pDawn zavre izražanje represorja cI iz faga λ, kar omogoča da je izražanje »downstream« genov aktivirano s svetlobo [1], [9].
Delovanje promotorja pDawn so testirali s plazmidom pDawn-RFP-pSEVA331, ki so ga vnesli v ''G. hansenii'' ATCC53582 in prvo skupino bakterij gojili pod modro lučjo, drugo pa v temi. Pri prvi skupini se je izražal RFP pri drugi skupini pa ne [1].
Promotor pDawn so nato uporabili za izražanje različnih litičnih genov, med drugim S105 (Lambda litična kaseta brez antiholina), X174 (litični gen, ki kodira litični protein iz Escherichia faga PhiX174) in LKD16 (litična kaseta). Pripravljene plazmide so najprej testirali v E. coli, nato pa jih prenesli v ''G. hansenii''. Sev pDawn-X174 E-pSEVA331-''G. hansenii'' ATCC 53582 (vsebuje X174 E – Bba_K2656015) je stabilno liziral pod modro lučjo [1].

== Izboljšave ==
Za povzročitev lize so pogosto uporabljeni inducibilni promotorji. V takem primeru se vseeno lahko izraža majhen delež proteina, kar z akumulacijo litičnega proteina privede do avtolize. Da bi dobili bolj stabilno proizvodnjo litičnega proteina, so izvedli mutagenezo z naključnimi oligonukleotidi na RBS (BBa_B0034). S tem so dobili kolonije, ki so pod modro svetlobo lizirale. Poleg tega so potrdili, da so vnesene mutacije povečale sintezo proteinov s tem RBS [1].
Prihodnje izboljšave bodo vključevale spremembe vezja za produkcijo BC, saj želijo zmanjšati izražanje BC v temi [1].

== Končni produkt ==
Kot končni produkt so si zamislili živ bioterapevtik v obliki bakterijske emulzije in liofilizirane bakterije. Dve obliki produkta potrebujeta drugačne pogoje shranjevanja in imata različen rok uporabe in tako služita različnim potrebam uporabnikov [1].

== Viri ==
[1] “Team:SZPT-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA. [Accessed: 27-Mar-2022].

[2] WHO, “Burns,” 2018. [Online]. Available: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/burns. [Accessed: 27-Mar-2022].

[3] P. Bielecki, J. Glik, M. Kawecki, and V. A. P. Martins Dos Santos, “Towards understanding ''Pseudomonas aeruginosa'' burn wound infections by profiling gene expression,” Biotechnol. Lett., vol. 30, no. 5, pp. 777–790, May 2008, doi: 10.1007/S10529-007-9620-2.

[4] L. Fu et al., “Skin tissue repair materials from bacterial cellulose by a multilayer fermentation method,” J. Mater. Chem., vol. 22, no. 24, pp. 12349–12357, May 2012, doi: 10.1039/C2JM00134A.

[5] E. Sajadi, S. S. A. Fatemi, V. Babaeipour, A. A. Deldar, B. Yakhchali, and M. S. Anvar, “Increased cellulose production by heterologous expression of bcsA and B genes from Gluconacetobacterxylinus in ''E. coli'' Nissle 1917,” Bioprocess Biosyst. Eng., vol. 42, no. 12, pp. 2023–2034, Dec. 2019, doi: 10.1007/S00449-019-02197-4.

[6] M. H. Ryu and M. Gomelsky, “Near-infrared light responsive synthetic c-di-GMP module for optogenetic applications,” ACS Synth. Biol., vol. 3, no. 11, pp. 802–810, Nov. 2014, doi: 10.1021/SB400182X.

[7] S. Denayer, S. Matthijs, and P. Cornelis, “Pyocin S2 (Sa) Kills ''Pseudomonas aeruginosa'' Strains via the FpvA Type I Ferripyoverdine Receptor,” J. Bacteriol., vol. 189, no. 21, p. 7663, Nov. 2007, doi: 10.1128/JB.00992-07.

[8] H.-X. Zhou, “Association and dissociation kinetics of colicin E3 and immunity protein 3: Convergence of theory and experiment,” Protein Sci., vol. 12, no. 10, p. 2379, Jan. 2003, doi: 10.1110/PS.03216203.

[9] R. Ohlendorf, R. R. Vidavski, A. Eldar, K. Moffat, and A. Möglich, “From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression,” J. Mol. Biol., vol. 416, no. 4, pp. 534–542, Mar. 2012, doi: 10.1016/J.JMB.2012.01.001.

Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin

2022-04-02T17:53:36Z

NinaV:

Projekt »Kissed by Light« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 in bil nagrajen s prvim mestom v kategoriji zdravljenje. Zasnovala ga je skupina SZTP-CHINA, ki je želela narediti efektiven terapevtik, ki bi poškodovanim z opeklinami omogočal manj boleče okrevanje in preprečeval bakterijske okužbe [1]. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA iGEM:SZPT-CHINA]

== Uvod ==
Opekline predstavljajo globalen zdravstveni problem, pri čemer, po poročanju Svetovne zdravstvene organizacije, zaradi njih umre 180 000 ljudi na leto [2]. Ob opeklini pride do poškodbe kože – organa, ki nas ščiti pred okužbami, zato je eden glavnih ciljev oskrbe opeklin preprečevanje in zdravljenje bakterijskih okužb. Pri oskrbi poškodovancev v bolnišničnem okolju so najbolj pogoste okužbe z bakterijo ''Pseudomonas aeruginosa''. Izbor antibiotične terapije pri tej bakteriji je zapleten, saj je rezistentna na mnoge antibiotike, poleg tega pa lahko antibiotiki negativno vplivajo na mikrobiom kože, kar poškoduje okoliške kožne celice [1], [3].
Poleg antimikrobne terapije pa je pri oskrbi pomemba tudi pravilna obložitev ran. To varuje površino opekline in jo ščiti pred vdorom tujih mikroorganizmov. Prav tako pomaga pri ohranjanju vlažnega okolja. Problem komercialnih materialov, ki se uporabljajo v ta namen npr. bombažne gaze, je, da se ti velikokrat primejo na rano in ob odstranitvi povzročijo sekundarne poškodbe [1].

== Cilj projekta Kissed by light ==
Uporabo antibiotikov so želeli so zamenjati s specifičnim antipseudomonalnim proteinom. Potencial so videli tudi v uporabi bakterijske celuloze (BC), ki ima visoko mehansko moč in dobro zadržuje vodo, hkrati pa se zaradi svoje biokompatibilnosti ne prijema na rane [4]. V projektu so združili obe ideji, tako da bi omogočili boljši nadzor nad okužbo in spodbudili zdravljenje opekline.
Kot produkt so si zamislil gensko spremenjen živ bakterijski terapevtik. Za šasijo so izbrali ''Gluconacetobacteri hansenii'' ATCC 53582, ki sama proizvaja bakterijsko celulozo. To so gensko spremenili tako, da lahko kontinuirano proizvaja antipseudomonalne proteine. Hkrati so uporabili optogenetiko (tehniko, ki omogoča nadzor bakterij s svetlobo). Tako so bakterije spremenili na tak način, da proizvajajo BC le, ko je to potrebno. S tem so zmanjšali metabolno breme in hitrost mutacij [1].
Pričakovali so, da v temi ''G. hansenii'' ne bo proizvedel skoraj nič BC, pod skoraj infrardečo svetlobo (NIR) bo začel proizvajati BC in pod modro svetlobo bodo bakterije lizirale in sprostile antipseudomonalni protein [1].

== Načrt ==
Načrt projekta ima tri module: proizvodnja antipseudomonalnega proteina, prenos signala c-di-GMP in proizvodnja BC, varnost in sproščanje zdravila. Pred začetkom eksperimentov so pripravili model, ki opiše potek signaliziranja s c-di-GMP [1].

=== Računalniško modeliranje ===
V ''G. hansenii'' produkcija BC poteka pod nadzorom sekundarnega sporočevalca cikličnega digvanidil monofosfata (c-di-GMP)[5]. BphS je digvanilat ciklaza, ki se aktivira s svetlobo in regulira sintezo c-di-GMP. Pod NIR svetlobo bo BphS spremenil konformacijo in se aktiviral ter začel sintetizirati c-di-GMP[6]. FcsR je c-di-GMP fosfodiesteraza, ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Kadar je hitrost nastajanja c-di-GMP večja kot njegova hidroliza, bo njegova koncentracija v celici naraščala in bakterije bodo proizvajale BC [1].
Za opis sistema so uporabili 6 reakcij in na njihovi osnovi oblikovali 5 enačb, ki so bile uporabljene za matematični model.
Model je napovedal, da ima osvetljevanje z NIR svetlobo signifikanten učinek na sintezo c-di-GMP, pri čemer je brez osvetljevanja koncentracija c-di-GMP skoraj nič [1].

=== Proizvodnja antipseudomonalnega proteina ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740050 BBa_K3740050]) ===
==== Načrt ====
Piocin S2 je topen protein, ki ga proizvajajo bakterije ''Pseudomonas aeruginosa'' in lahko ubije ne imune ''P. aeruginosa bakterije''. Imunost nekaterim sevom omogoča protein IMMS2, ki se specifično veže na nukleazno domeno piocina S2 in tako inhibira njegovo aktivnost [7]. Da bi pridobili protein, ki bi lahko ubil širši spekter ''P. aeruginosa'', so nukleazno domeno piocina S2 zamenjali z nukleazno domeno kolicina E3 in himerni protein poimenovali SE. Protein, ki omogoča imunost IMME3, je izpeljan iz imunskega proteina, ki ustreza kolicinu E3 [1], [8].
Protein SE ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740057 BBa_K3740057]) prepozna tarče preko ''Pseudomonas''-specifičnega receptorja in translokazne domene, celice pa ubije preko nukleazne domene iz kolicina E. Poleg tega protein SE vsebuje tudi neidentificirano funkcionalno domeno piocina 2. Gostiteljske celice ''G. hansenii'' so na SE odporne, saj izražajo imunski protein IMME3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740034 BBa_K3740034]) [1].
Normalno izražanje proteina SE ter nemoteno rast gostiteljskih celic so zagotovili tako, da so protein SE in imunski protein IMME3 izražali pod različnimi promotorji in RBSji. SE se je izražal pod promotorjem pR in RBS300, IMME3 pa pod promotorjem J23118 in RBSII [1].
==== Izvedba ====
Protein SE in protein S2 so najprej izrazili v bakterijah E. coli BL21. Za to so pripravili plazmide SE-PET28A IN S2-PET28A in izražanje inducirali z IPTG. Na NaDS-PAGE gel so nanesli surov proteinski ekstrakt in potrdili prisotnost obeh proteinov. S tem so potrdili, da je plazmidni konstrukt primeren za izražanje fuzijskega proteina. Raztopino obeh proteinov in PBS (kontrola) so dodali kulturam ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1, ''P. aeruginosa'' PAO1 Δ1150-1151 in E. coli MG1655. Pokazali so, da lahko protein SE inhibira rast ''P. aeruginosa'' ne glede na prisotnost regije PA1150-1151, medtem ko lahko S2 inhibira le mutanto PAO1 Δ1150-1151. Noben protein ni vplival na rast E. coli [1].
Sledila je optimizacija RBS. Plazmidne konstrukte, ki so jih pripravili v E .coli, so nato prenesli v ''G. hansenii'' ATCC 53582, kjer so izvedli izražanje. Nato so kapljico raztopine s proteinom SE nanesli na FAB ploščo, na katero so bile enakomerno nanešene PAO1. Določili so, da je sev pR-RBS300-SE-B1006-J23118-RBSII-IMM-rrnB T1-pSEVA331-''G. hansenii'' ATCC najboljši, saj je imel največjo cono inhibicije [1].

=== c-di-GMP signalizacija in produkcija BC filma ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740030 BBa_K3740030]) ===
Ker je proizvodnja BC v ''G. hansenii'' regulirana s koncentracijo c-di-GMP [6], lahko nastanjanje BC posredno reguliramo z reguliranjem koncentracije c-di-GMP. Za natančno regulacijo so uvedli 2 podmodula. Prvi je digvanilat ciklazni (DGC) modul, ki regulira sintezo c-di-GMP, drugi pa c-di-GMP fosfodiesterazni (PDE), ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Uporabili so bphS ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740019 BBa_K3740019]) – kodirajoči gen za DGC, ki je aktivirana s svetlobo (BphS) in fcsR ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740022 BBa_K3740022]) – dele kodirajočih genov c-di-GMP PDE iz različnih bakterij in ju pripravili za konstrukcijo plazmidov, ki so bili klonirani v E. coli in nato preneseni v ''G. hansenii'' ATCC53582. Pokazali so, da ima J23109-fcsR-pSEVA331 hidrolizno funkcijo in da J23100-bphS-bphO-pSEVA331 ob osvetljevanju z NIR proizvedejo več BC kot v temi. Optimizirali so tudi promotorske regije in glede na količino BC določili najbolj primeren promotor. Odločili so se za konstrukt J23100-B0034-bphS-pET RBS-bphO-rrnB T1-J23109-B0034-fcsR-rrnB T1, pri katerem pride do signifikantne razlike med izkoristkom BC pri osvetljevanju in v temi [1].

=== Varnost in sproščanje zdravila ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740044 BBa_K3740044]) ===
V modulu so zasnovali foto-induciran sistem za lizo. Gre za varnostni modul, ki lahko mehanistično zmanjša posledice sprostitve gensko spremenjenih bakterij v okolje. Hkrati pa nadzira sprostitev antipseudomonalnega proteina SE [1].
Uporabili so sistem pDawn, ki je odziven na modro svetlobo. Ob osvetljevanju dvokomponentni sistem YF1/FixJ v pDawn zavre izražanje represorja cI iz faga λ, kar omogoča da je izražanje »downstream« genov aktivirano s svetlobo [1], [9].
Delovanje promotorja pDawn so testirali s plazmidom pDawn-RFP-pSEVA331, ki so ga vnesli v ''G. hansenii'' ATCC53582 in prvo skupino bakterij gojili pod modro lučjo, drugo pa v temi. Pri prvi skupini se je izražal RFP pri drugi skupini pa ne [1].
Promotor pDawn so nato uporabili za izražanje različnih litičnih genov, med drugim S105 (Lambda litična kaseta brez antiholina), X174 (litični gen, ki kodira litični protein iz Escherichia faga PhiX174) in LKD16 (litična kaseta). Pripravljene plazmide so najprej testirali v E. coli, nato pa jih prenesli v ''G. hansenii''. Sev pDawn-X174 E-pSEVA331-''G. hansenii'' ATCC 53582 (vsebuje X174 E – Bba_K2656015) je stabilno liziral pod modro lučjo [1].

== Izboljšave ==
Za povzročitev lize so pogosto uporabljeni inducibilni promotorji. V takem primeru se vseeno lahko izraža majhen delež proteina, kar z akumulacijo litičnega proteina privede do avtolize. Da bi dobili bolj stabilno proizvodnjo litičnega proteina, so izvedli mutagenezo z naključnimi oligonukleotidi na RBS (BBa_B0034). S tem so dobili kolonije, ki so pod modro svetlobo lizirale. Poleg tega so potrdili, da so vnesene mutacije povečale sintezo proteinov s tem RBS [1].
Prihodnje izboljšave bodo vključevale spremembe vezja za produkcijo BC, saj želijo zmanjšati izražanje BC v temi [1].

== Končni produkt ==
Kot končni produkt so si zamislili živ bioterapevtik v obliki bakterijske emulzije in liofilizirane bakterije. Dve obliki produkta potrebujeta drugačne pogoje shranjevanja in imata različen rok uporabe in tako služita različnim potrebam uporabnikov [1].

== Viri ==
[1] “Team:SZPT-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA. [Accessed: 27-Mar-2022].

[2] WHO, “Burns,” 2018. [Online]. Available: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/burns. [Accessed: 27-Mar-2022].

[3] P. Bielecki, J. Glik, M. Kawecki, and V. A. P. Martins Dos Santos, “Towards understanding ''Pseudomonas aeruginosa'' burn wound infections by profiling gene expression,” Biotechnol. Lett., vol. 30, no. 5, pp. 777–790, May 2008, doi: 10.1007/S10529-007-9620-2.

[4] L. Fu et al., “Skin tissue repair materials from bacterial cellulose by a multilayer fermentation method,” J. Mater. Chem., vol. 22, no. 24, pp. 12349–12357, May 2012, doi: 10.1039/C2JM00134A.

[5] E. Sajadi, S. S. A. Fatemi, V. Babaeipour, A. A. Deldar, B. Yakhchali, and M. S. Anvar, “Increased cellulose production by heterologous expression of bcsA and B genes from Gluconacetobacterxylinus in ''E. coli'' Nissle 1917,” Bioprocess Biosyst. Eng., vol. 42, no. 12, pp. 2023–2034, Dec. 2019, doi: 10.1007/S00449-019-02197-4.

[6] M. H. Ryu and M. Gomelsky, “Near-infrared light responsive synthetic c-di-GMP module for optogenetic applications,” ACS Synth. Biol., vol. 3, no. 11, pp. 802–810, Nov. 2014, doi: 10.1021/SB400182X.

[7] S. Denayer, S. Matthijs, and P. Cornelis, “Pyocin S2 (Sa) Kills ''Pseudomonas aeruginosa'' Strains via the FpvA Type I Ferripyoverdine Receptor,” J. Bacteriol., vol. 189, no. 21, p. 7663, Nov. 2007, doi: 10.1128/JB.00992-07.

[8] H.-X. Zhou, “Association and dissociation kinetics of colicin E3 and immunity protein 3: Convergence of theory and experiment,” Protein Sci., vol. 12, no. 10, p. 2379, Jan. 2003, doi: 10.1110/PS.03216203.

[9] R. Ohlendorf, R. R. Vidavski, A. Eldar, K. Moffat, and A. Möglich, “From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression,” J. Mol. Biol., vol. 416, no. 4, pp. 534–542, Mar. 2012, doi: 10.1016/J.JMB.2012.01.001.

Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin

2022-04-02T17:44:53Z

NinaV: /* Načrt */

Projekt »Kissed by Light« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 in bil nagrajen s prvim mestom v kategoriji zdravljenje. Zasnovala ga je skupina SZTP-CHINA, ki je želela narediti efektiven terapevtik, ki bi poškodovanim z opeklinami omogočal manj boleče okrevanje in preprečeval bakterijske okužbe [1]. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA iGEM:SZPT-CHINA]

== Uvod ==
Opekline predstavljajo globalen zdravstveni problem, pri čemer, po poročanju Svetovne zdravstvene organizacije, zaradi njih umre 180 000 ljudi na leto [2]. Ob opeklini pride do poškodbe kože – organa, ki nas ščiti pred okužbami, zato je eden glavnih ciljev oskrbe opeklin preprečevanje in zdravljenje bakterijskih okužb. Pri oskrbi poškodovancev v bolnišničnem okolju so najbolj pogoste okužbe z bakterijo Pseudomonas aeruginosa. Izbor antibiotične terapije pri tej bakteriji je zapleten, saj je rezistentna na mnoge antibiotike, poleg tega pa lahko antibiotiki negativno vplivajo na mikrobiom kože, kar poškoduje okoliške kožne celice [1], [3].
Poleg antimikrobne terapije pa je pri oskrbi pomemba tudi pravilna obložitev ran. To varuje površino opekline in jo ščiti pred vdorom tujih mikroorganizmov. Prav tako pomaga pri ohranjanju vlažnega okolja. Problem komercialnih materialov, ki se uporabljajo v ta namen npr. bombažne gaze, je, da se ti velikokrat primejo na rano in ob odstranitvi povzročijo sekundarne poškodbe [1].

== Cilj projekta Kissed by light ==
Uporabo antibiotikov so želeli so zamenjati s specifičnim antipseudomonalnim proteinom. Potencial so videli tudi v uporabi bakterijske celuloze (BC), ki ima visoko mehansko moč in dobro zadržuje vodo, hkrati pa se zaradi svoje biokompatibilnosti ne prijema na rane [4]. V projektu so združili obe ideji, tako da bi omogočili boljši nadzor nad okužbo in spodbudili zdravljenje opekline.
Kot produkt so si zamislil gensko spremenjen živ bakterijski terapevtik. Za šasijo so izbrali Gluconacetobacteri hansenii ATCC 53582, ki sama proizvaja bakterijsko celulozo. To so gensko spremenili tako, da lahko kontinuirano proizvaja antipseudomonalne proteine. Hkrati so uporabili optogenetiko (tehniko, ki omogoča nadzor bakterij s svetlobo). Tako so bakterije spremenili na tak način, da proizvajajo BC le, ko je to potrebno. S tem so zmanjšali metabolno breme in hitrost mutacij [1].
Pričakovali so, da v temi G. hansenii ne bo proizvedel skoraj nič BC, pod skoraj infrardečo svetlobo (NIR) bo začel proizvajati BC in pod modro svetlobo bodo bakterije lizirale in sprostile antipseudomonalni protein [1].

== Načrt ==
Načrt projekta ima tri module: proizvodnja antipseudomonalnega proteina, prenos signala c-di-GMP in proizvodnja BC, varnost in sproščanje zdravila. Pred začetkom eksperimentov so pripravili model, ki opiše potek signaliziranja s c-di-GMP [1].

=== Računalniško modeliranje ===
V G. hansenii produkcija BC poteka pod nadzorom sekundarnega sporočevalca cikličnega digvanidil monofosfata (c-di-GMP)[5]. BphS je digvanilat ciklaza, ki se aktivira s svetlobo in regulira sintezo c-di-GMP. Pod NIR svetlobo bo BphS spremenil konformacijo in se aktiviral ter začel sintetizirati c-di-GMP[6]. FcsR je c-di-GMP fosfodiesteraza, ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Kadar je hitrost nastajanja c-di-GMP večja kot njegova hidroliza, bo njegova koncentracija v celici naraščala in bakterije bodo proizvajale BC [1].
Za opis sistema so uporabili 6 reakcij in na njihovi osnovi oblikovali 5 enačb, ki so bile uporabljene za matematični model.
Model je napovedal, da ima osvetljevanje z NIR svetlobo signifikanten učinek na sintezo c-di-GMP, pri čemer je brez osvetljevanja koncentracija c-di-GMP skoraj nič [1].

=== Proizvodnja pseudomonalnega proteina ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740050 BBa_K3740050]) ===
==== Načrt ====
Piocin S2 je topen protein, ki ga proizvajajo bakterije Pseudomonas aeruginosa in lahko ubije ne imune P. aeruginosa bakterije. Imunost nekaterim sevom omogoča protein IMMS2, ki se specifično veže na nukleazno domeno piocina S2 in tako inhibira njegovo aktivnost [7]. Da bi pridobili protein, ki bi lahko ubil širši spekter P. aeruginosa, so nukleazno domeno piocina S2 zamenjali z nukleazno domeno kolicina E3 in himerni protein poimenovali SE. Protein, ki omogoča imunost IMME3, je izpeljan iz imunskega proteina, ki ustreza kolicinu E3 [1], [8].
Protein SE ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740057 BBa_K3740057]) prepozna tarče preko Pseudomonas-specifičnega receptorja in translokazne domene, celice pa ubije preko nukleazne domene iz kolicina E. Poleg tega protein SE vsebuje tudi neidentificirano funkcionalno domeno piocina 2. Gostiteljske celice G. hansenii so na SE odporne, saj izražajo imunski protein IMME3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740034 BBa_K3740034]) [1].
Normalno izražanje proteina SE ter nemoteno rast gostiteljskih celic so zagotovili tako, da so protein SE in imunski protein IMME3 izražali pod različnimi promotorji in RBSji. SE se je izražal pod promotorjem pR in RBS300, IMME3 pa pod promotorjem J23118 in RBSII [1].
==== Izvedba ====
Protein SE in protein S2 so najprej izrazili v bakterijah E. coli BL21. Za to so pripravili plazmide SE-PET28A IN S2-PET28A in izražanje inducirali z IPTG. Na NaDS-PAGE gel so nanesli surov proteinski ekstrakt in potrdili prisotnost obeh proteinov. S tem so potrdili, da je plazmidni konstrukt primeren za izražanje fuzijskega proteina. Raztopino obeh proteinov in PBS (kontrola) so dodali kulturam Pseudomonas aeruginosa PAO1, P. aeruginosa PAO1 Δ1150-1151 in E. coli MG1655. Pokazali so, da lahko protein SE inhibira rast P. aeruginosa ne glede na prisotnost regije PA1150-1151, medtem ko lahko S2 inhibira le mutanto PAO1 Δ1150-1151. Noben protein ni vplival na rast E. coli [1].
Sledila je optimizacija RBS. Plazmidne konstrukte, ki so jih pripravili v E .coli, so nato prenesli v G. hansenii ATCC 53582, kjer so izvedli izražanje. Nato so kapljico raztopine s proteinom SE nanesli na FAB ploščo, na katero so bile enakomerno nanešene PAO1. Določili so, da je sev pR-RBS300-SE-B1006-J23118-RBSII-IMM-rrnB T1-pSEVA331-G. hansenii ATCC najboljši, saj je imel največjo cono inhibicije [1].

=== c-di-GMP signalizacija in produkcija BC filma ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740030 BBa_K3740030]) ===
Ker je proizvodnja BC v G. hansenii regulirana s koncentracijo c-di-GMP [6], lahko nastanjanje BC posredno reguliramo z reguliranjem koncentracije c-di-GMP. Za natančno regulacijo so uvedli 2 podmodula. Prvi je digvanilat ciklazni (DGC) modul, ki regulira sintezo c-di-GMP, drugi pa c-di-GMP fosfodiesterazni (PDE), ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Uporabili so bphS ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740019 BBa_K3740019]) – kodirajoči gen za DGC, ki je aktivirana s svetlobo (BphS) in fcsR ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740022 BBa_K3740022]) – dele kodirajočih genov c-di-GMP PDE iz različnih bakterij in ju pripravili za konstrukcijo plazmidov, ki so bili klonirani v E. coli in nato preneseni v G. hansenii ATCC53582. Pokazali so, da ima J23109-fcsR-pSEVA331 hidrolizno funkcijo in da J23100-bphS-bphO-pSEVA331 ob osvetljevanju z NIR proizvedejo več BC kot v temi. Optimizirali so tudi promotorske regije in glede na količino BC določili najbolj primeren promotor. Odločili so se za konstrukt J23100-B0034-bphS-pET RBS-bphO-rrnB T1-J23109-B0034-fcsR-rrnB T1, pri katerem pride do signifikantne razlike med izkoristkom BC pri osvetljevanju in v temi [1].

=== Varnost in sproščanje zdravila ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740044 BBa_K3740044]) ===
V modulu so zasnovali foto-induciran sistem za lizo. Gre za varnostni modul, ki lahko mehanistično zmanjša posledice sprostitve gensko spremenjenih bakterij v okolje. Hkrati pa nadzira sprostitev antipseudomonalnega proteina SE [1].
Uporabili so sistem pDawn, ki je odziven na modro svetlobo. Ob osvetljevanju dvokomponentni sistem YF1/FixJ v pDawn zavre izražanje represorja cI iz faga λ, kar omogoča da je izražanje »downstream« genov aktivirano s svetlobo [1], [9].
Delovanje promotorja pDawn so testirali s plazmidom pDawn-RFP-pSEVA331, ki so ga vnesli v G. hansenii ATCC53582 in prvo skupino bakterij gojili pod modro lučjo, drugo pa v temi. Pri prvi skupini se je izražal RFP pri drugi skupini pa ne [1].
Promotor pDawn so nato uporabili za izražanje različnih litičnih genov, med drugim S105 (Lambda litična kaseta brez antiholina), X174 (litični gen, ki kodira litični protein iz Escherichia faga PhiX174) in LKD16 (litična kaseta). Pripravljene plazmide so najprej testirali v E. coli, nato pa jih prenesli v G. hansenii. Sev pDawn-X174 E-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 (vsebuje X174 E – Bba_K2656015) je stabilno liziral pod modro lučjo [1].

== Izboljšave ==
Za povzročitev lize so pogosto uporabljeni inducibilni promotorji. V takem primeru se vseeno lahko izraža majhen delež proteina, kar z akumulacijo litičnega proteina privede do avtolize. Da bi dobili bolj stabilno proizvodnjo litičnega proteina, so izvedli mutagenezo z naključnimi oligonukleotidi na RBS (BBa_B0034). S tem so dobili kolonije, ki so pod modro svetlobo lizirale. Poleg tega so potrdili, da so vnesene mutacije povečale sintezo proteinov s tem RBS [1].
Prihodnje izboljšave bodo vključevale spremembe vezja za produkcijo BC, saj želijo zmanjšati izražanje BC v temi [1].

== Končni produkt ==
Kot končni produkt so si zamislili živ bioterapevtik v obliki bakterijske emulzije in liofilizirane bakterije. Dve obliki produkta potrebujeta drugačne pogoje shranjevanja in imata različen rok uporabe in tako služita različnim potrebam uporabnikov [1].

== Viri ==
[1] “Team:SZPT-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA. [Accessed: 27-Mar-2022].

[2] WHO, “Burns,” 2018. [Online]. Available: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/burns. [Accessed: 27-Mar-2022].

[3] P. Bielecki, J. Glik, M. Kawecki, and V. A. P. Martins Dos Santos, “Towards understanding Pseudomonas aeruginosa burn wound infections by profiling gene expression,” Biotechnol. Lett., vol. 30, no. 5, pp. 777–790, May 2008, doi: 10.1007/S10529-007-9620-2.

[4] L. Fu et al., “Skin tissue repair materials from bacterial cellulose by a multilayer fermentation method,” J. Mater. Chem., vol. 22, no. 24, pp. 12349–12357, May 2012, doi: 10.1039/C2JM00134A.

[5] E. Sajadi, S. S. A. Fatemi, V. Babaeipour, A. A. Deldar, B. Yakhchali, and M. S. Anvar, “Increased cellulose production by heterologous expression of bcsA and B genes from Gluconacetobacterxylinus in E. coli Nissle 1917,” Bioprocess Biosyst. Eng., vol. 42, no. 12, pp. 2023–2034, Dec. 2019, doi: 10.1007/S00449-019-02197-4.

[6] M. H. Ryu and M. Gomelsky, “Near-infrared light responsive synthetic c-di-GMP module for optogenetic applications,” ACS Synth. Biol., vol. 3, no. 11, pp. 802–810, Nov. 2014, doi: 10.1021/SB400182X.

[7] S. Denayer, S. Matthijs, and P. Cornelis, “Pyocin S2 (Sa) Kills Pseudomonas aeruginosa Strains via the FpvA Type I Ferripyoverdine Receptor,” J. Bacteriol., vol. 189, no. 21, p. 7663, Nov. 2007, doi: 10.1128/JB.00992-07.

[8] H.-X. Zhou, “Association and dissociation kinetics of colicin E3 and immunity protein 3: Convergence of theory and experiment,” Protein Sci., vol. 12, no. 10, p. 2379, Jan. 2003, doi: 10.1110/PS.03216203.

[9] R. Ohlendorf, R. R. Vidavski, A. Eldar, K. Moffat, and A. Möglich, “From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression,” J. Mol. Biol., vol. 416, no. 4, pp. 534–542, Mar. 2012, doi: 10.1016/J.JMB.2012.01.001.

Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin

2022-04-02T17:42:43Z

NinaV:

Projekt »Kissed by Light« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 in bil nagrajen s prvim mestom v kategoriji zdravljenje. Zasnovala ga je skupina SZTP-CHINA, ki je želela narediti efektiven terapevtik, ki bi poškodovanim z opeklinami omogočal manj boleče okrevanje in preprečeval bakterijske okužbe [1]. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA iGEM:SZPT-CHINA]

== Uvod ==
Opekline predstavljajo globalen zdravstveni problem, pri čemer, po poročanju Svetovne zdravstvene organizacije, zaradi njih umre 180 000 ljudi na leto [2]. Ob opeklini pride do poškodbe kože – organa, ki nas ščiti pred okužbami, zato je eden glavnih ciljev oskrbe opeklin preprečevanje in zdravljenje bakterijskih okužb. Pri oskrbi poškodovancev v bolnišničnem okolju so najbolj pogoste okužbe z bakterijo Pseudomonas aeruginosa. Izbor antibiotične terapije pri tej bakteriji je zapleten, saj je rezistentna na mnoge antibiotike, poleg tega pa lahko antibiotiki negativno vplivajo na mikrobiom kože, kar poškoduje okoliške kožne celice [1], [3].
Poleg antimikrobne terapije pa je pri oskrbi pomemba tudi pravilna obložitev ran. To varuje površino opekline in jo ščiti pred vdorom tujih mikroorganizmov. Prav tako pomaga pri ohranjanju vlažnega okolja. Problem komercialnih materialov, ki se uporabljajo v ta namen npr. bombažne gaze, je, da se ti velikokrat primejo na rano in ob odstranitvi povzročijo sekundarne poškodbe [1].

== Cilj projekta Kissed by light ==
Uporabo antibiotikov so želeli so zamenjati s specifičnim antipseudomonalnim proteinom. Potencial so videli tudi v uporabi bakterijske celuloze (BC), ki ima visoko mehansko moč in dobro zadržuje vodo, hkrati pa se zaradi svoje biokompatibilnosti ne prijema na rane [4]. V projektu so združili obe ideji, tako da bi omogočili boljši nadzor nad okužbo in spodbudili zdravljenje opekline.
Kot produkt so si zamislil gensko spremenjen živ bakterijski terapevtik. Za šasijo so izbrali Gluconacetobacteri hansenii ATCC 53582, ki sama proizvaja bakterijsko celulozo. To so gensko spremenili tako, da lahko kontinuirano proizvaja antipseudomonalne proteine. Hkrati so uporabili optogenetiko (tehniko, ki omogoča nadzor bakterij s svetlobo). Tako so bakterije spremenili na tak način, da proizvajajo BC le, ko je to potrebno. S tem so zmanjšali metabolno breme in hitrost mutacij [1].
Pričakovali so, da v temi G. hansenii ne bo proizvedel skoraj nič BC, pod skoraj infrardečo svetlobo (NIR) bo začel proizvajati BC in pod modro svetlobo bodo bakterije lizirale in sprostile antipseudomonalni protein [1].

== Načrt ==
Načrt projekta ima tri module: proizvodnja antipseudomonalnega proteina, prenos signala c-di-GMP in proizvodnja BC, varnost in sproščanje zdravila. Pred začetkom eksperimentov so pripravili model, ki opiše potek signaliziranja z c-di-GMP [1].

=== Računalniško modeliranje ===
V G. hansenii produkcija BC poteka pod nadzorom sekundarnega sporočevalca cikličnega digvanidil monofosfata (c-di-GMP)[5]. BphS je digvanilat ciklaza, ki se aktivira s svetlobo in regulira sintezo c-di-GMP. Pod NIR svetlobo bo BphS spremenil konformacijo in se aktiviral ter začel sintetizirati c-di-GMP[6]. FcsR je c-di-GMP fosfodiesteraza, ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Kadar je hitrost nastajanja c-di-GMP večja kot njegova hidroliza, bo njegova koncentracija v celici naraščala in bakterije bodo proizvajale BC [1].
Za opis sistema so uporabili 6 reakcij in na njihovi osnovi oblikovali 5 enačb, ki so bile uporabljene za matematični model.
Model je napovedal, da ima osvetljevanje z NIR svetlobo signifikanten učinek na sintezo c-di-GMP, pri čemer je brez osvetljevanja koncentracija c-di-GMP skoraj nič [1].

=== Proizvodnja pseudomonalnega proteina([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740050 BBa_K3740050]) ===
==== Načrt ====
Piocin S2 je topen protein, ki ga proizvajajo bakterije Pseudomonas aeruginosa in lahko ubije ne imune P. aeruginosa bakterije. Imunost nekaterim sevom omogoča protein IMMS2, ki se specifično veže na nukleazno domeno piocina S2 in tako inhibira njegovo aktivnost [7]. Da bi pridobili protein, ki bi lahko ubil širši spekter P. aeruginosa, so nukleazno domeno piocina S2 zamenjali z nukleazno domeno kolicina E3 in himerni protein poimenovali SE. Protein, ki omogoča imunost IMME3, je izpeljan iz imunskega proteina, ki ustreza kolicinu E3 [1], [8].
Protein SE ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740057 BBa_K3740057]) prepozna tarče preko Pseudomonas-specifičnega receptorja in translokazne domene, celice pa ubije preko nukleazne domene iz kolicina E. Poleg tega protein SE vsebuje tudi neidentificirano funkcionalno domeno piocina 2. Gostiteljske celice G. hansenii so na SE odporne, saj izražajo imunski protein IMME3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740034 BBa_K3740034]) [1].
Normalno izražanje proteina SE ter nemoteno rast gostiteljskih celic so zagotovili tako, da so protein SE in imunski protein IMME3 izražali pod različnimi promotorji in RBSji. SE se je izražal pod promotorjem pR in RBS300, IMME3 pa pod promotorjem J23118 in RBSII [1].
==== Izvedba ====
Protein SE in protein S2 so najprej izrazili v bakterijah E. coli BL21. Za to so pripravili plazmide SE-PET28A IN S2-PET28A in izražanje inducirali z IPTG. Na NaDS-PAGE gel so nanesli surov proteinski ekstrakt in potrdili prisotnost obeh proteinov. S tem so potrdili, da je plazmidni konstrukt primeren za izražanje fuzijskega proteina. Raztopino obeh proteinov in PBS (kontrola) so dodali kulturam Pseudomonas aeruginosa PAO1, P. aeruginosa PAO1 Δ1150-1151 in E. coli MG1655. Pokazali so, da lahko protein SE inhibira rast P. aeruginosa ne glede na prisotnost regije PA1150-1151, medtem ko lahko S2 inhibira le mutanto PAO1 Δ1150-1151. Noben protein ni vplival na rast E. coli [1].
Sledila je optimizacija RBS. Plazmidne konstrukte, ki so jih pripravili v E .coli, so nato prenesli v G. hansenii ATCC 53582, kjer so izvedli izražanje. Nato so kapljico raztopine s proteinom SE nanesli na FAB ploščo, na katero so bile enakomerno nanešene PAO1. Določili so, da je sev pR-RBS300-SE-B1006-J23118-RBSII-IMM-rrnB T1-pSEVA331-G. hansenii ATCC najboljši, saj je imel največjo cono inhibicije [1].

=== c-di-GMP signalizacija in produkcija BC filma ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740030 BBa_K3740030]) ===
Ker je proizvodnja BC v G. hansenii regulirana s koncentracijo c-di-GMP [6], lahko nastanjanje BC posredno reguliramo z reguliranjem koncentracije c-di-GMP. Za natančno regulacijo so uvedli 2 podmodula. Prvi je digvanilat ciklazni (DGC) modul, ki regulira sintezo c-di-GMP, drugi pa c-di-GMP fosfodiesterazni (PDE), ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Uporabili so bphS ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740019 BBa_K3740019]) – kodirajoči gen za DGC, ki je aktivirana s svetlobo (BphS) in fcsR ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740022 BBa_K3740022]) – dele kodirajočih genov c-di-GMP PDE iz različnih bakterij in ju pripravili za konstrukcijo plazmidov, ki so bili klonirani v E. coli in nato preneseni v G. hansenii ATCC53582. Pokazali so, da ima J23109-fcsR-pSEVA331 hidrolizno funkcijo in da J23100-bphS-bphO-pSEVA331 ob osvetljevanju z NIR proizvedejo več BC kot v temi. Optimizirali so tudi promotorske regije in glede na količino BC določili najbolj primeren promotor. Odločili so se za konstrukt J23100-B0034-bphS-pET RBS-bphO-rrnB T1-J23109-B0034-fcsR-rrnB T1, pri katerem pride do signifikantne razlike med izkoristkom BC pri osvetljevanju in v temi [1].

=== Varnost in sproščanje zdravila ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740044 BBa_K3740044]) ===
V modulu so zasnovali foto-induciran sistem za lizo. Gre za varnostni modul, ki lahko mehanistično zmanjša posledice sprostitve gensko spremenjenih bakterij v okolje. Hkrati pa nadzira sprostitev antipseudomonalnega proteina SE [1].
Uporabili so sistem pDawn, ki je odziven na modro svetlobo. Ob osvetljevanju dvokomponentni sistem YF1/FixJ v pDawn zavre izražanje represorja cI iz faga λ, kar omogoča da je izražanje »downstream« genov aktivirano s svetlobo [1], [9].
Delovanje promotorja pDawn so testirali s plazmidom pDawn-RFP-pSEVA331, ki so ga vnesli v G. hansenii ATCC53582 in prvo skupino bakterij gojili pod modro lučjo, drugo pa v temi. Pri prvi skupini se je izražal RFP pri drugi skupini pa ne [1].
Promotor pDawn so nato uporabili za izražanje različnih litičnih genov, med drugim S105 (Lambda litična kaseta brez antiholina), X174 (litični gen, ki kodira litični protein iz Escherichia faga PhiX174) in LKD16 (litična kaseta). Pripravljene plazmide so najprej testirali v E. coli, nato pa jih prenesli v G. hansenii. Sev pDawn-X174 E-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 (vsebuje X174 E – Bba_K2656015) je stabilno liziral pod modro lučjo [1].
== Izboljšave ==
Za povzročitev lize so pogosto uporabljeni inducibilni promotorji. V takem primeru se vseeno lahko izraža majhen delež proteina, kar z akumulacijo litičnega proteina privede do avtolize. Da bi dobili bolj stabilno proizvodnjo litičnega proteina, so izvedli mutagenezo z naključnimi oligonukleotidi na RBS (BBa_B0034). S tem so dobili kolonije, ki so pod modro svetlobo lizirale. Poleg tega so potrdili, da so vnesene mutacije povečale sintezo proteinov s tem RBS [1].
Prihodnje izboljšave bodo vključevale spremembe vezja za produkcijo BC, saj želijo zmanjšati izražanje BC v temi [1].

== Končni produkt ==
Kot končni produkt so si zamislili živ bioterapevtik v obliki bakterijske emulzije in liofilizirane bakterije. Dve obliki produkta potrebujeta drugačne pogoje shranjevanja in imata različen rok uporabe in tako služita različnim potrebam uporabnikov [1].

== Viri ==
[1] “Team:SZPT-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA. [Accessed: 27-Mar-2022].

[2] WHO, “Burns,” 2018. [Online]. Available: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/burns. [Accessed: 27-Mar-2022].

[3] P. Bielecki, J. Glik, M. Kawecki, and V. A. P. Martins Dos Santos, “Towards understanding Pseudomonas aeruginosa burn wound infections by profiling gene expression,” Biotechnol. Lett., vol. 30, no. 5, pp. 777–790, May 2008, doi: 10.1007/S10529-007-9620-2.

[4] L. Fu et al., “Skin tissue repair materials from bacterial cellulose by a multilayer fermentation method,” J. Mater. Chem., vol. 22, no. 24, pp. 12349–12357, May 2012, doi: 10.1039/C2JM00134A.

[5] E. Sajadi, S. S. A. Fatemi, V. Babaeipour, A. A. Deldar, B. Yakhchali, and M. S. Anvar, “Increased cellulose production by heterologous expression of bcsA and B genes from Gluconacetobacterxylinus in E. coli Nissle 1917,” Bioprocess Biosyst. Eng., vol. 42, no. 12, pp. 2023–2034, Dec. 2019, doi: 10.1007/S00449-019-02197-4.

[6] M. H. Ryu and M. Gomelsky, “Near-infrared light responsive synthetic c-di-GMP module for optogenetic applications,” ACS Synth. Biol., vol. 3, no. 11, pp. 802–810, Nov. 2014, doi: 10.1021/SB400182X.

[7] S. Denayer, S. Matthijs, and P. Cornelis, “Pyocin S2 (Sa) Kills Pseudomonas aeruginosa Strains via the FpvA Type I Ferripyoverdine Receptor,” J. Bacteriol., vol. 189, no. 21, p. 7663, Nov. 2007, doi: 10.1128/JB.00992-07.

[8] H.-X. Zhou, “Association and dissociation kinetics of colicin E3 and immunity protein 3: Convergence of theory and experiment,” Protein Sci., vol. 12, no. 10, p. 2379, Jan. 2003, doi: 10.1110/PS.03216203.

[9] R. Ohlendorf, R. R. Vidavski, A. Eldar, K. Moffat, and A. Möglich, “From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression,” J. Mol. Biol., vol. 416, no. 4, pp. 534–542, Mar. 2012, doi: 10.1016/J.JMB.2012.01.001.

Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin

2022-04-02T17:41:25Z

NinaV: /* Cilj projekta Kissed by light */

Projekt »Kissed by Light« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 in bil nagrajen s prvim mestom v kategoriji zdravljenje. Zasnovala ga je skupina SZTP-CHINA, ki je želela narediti efektiven terapevtik, ki bi poškodovanim z opeklinami omogočal manj boleče okrevanje in preprečeval bakterijske okužbe [1]. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA iGEM:SZPT-CHINA]

== Uvod ==
Opekline predstavljajo globalen zdravstveni problem, pri čemer, po poročanju Svetovne zdravstvene organizacije, zaradi njih umre 180 000 ljudi na leto [2]. Ob opeklini pride do poškodbe kože – organa, ki nas ščiti pred okužbami, zato je eden glavnih ciljev oskrbe opeklin preprečevanje in zdravljenje bakterijskih okužb. Pri oskrbi poškodovancev v bolnišničnem okolju so najbolj pogoste okužbe z bakterijo Pseudomonas aeruginosa. Izbor antibiotične terapije pri tej bakteriji je zapleten, saj je rezistentna na mnoge antibiotike, poleg tega pa lahko antibiotiki negativno vplivajo na mikrobiom kože, kar poškoduje okoliške kožne celice [1], [3].
Poleg antimikrobne terapije pa je pri oskrbi pomemba tudi pravilna obložitev ran. To varuje površino opekline in jo ščiti pred vdorom tujih mikroorganizmov. Prav tako pomaga pri ohranjanju vlažnega okolja. Problem komercialnih materialov, ki se uporabljajo v ta namen npr. bombažne gaze, je, da se ti velikokrat primejo na rano in ob odstranitvi povzročijo sekundarne poškodbe [1].

== Cilj projekta Kissed by light ==
Uporabo antibiotikov so želeli so zamenjati s specifičnim antipseudomonalnim proteinom. Potencial so videli tudi v uporabi bakterijske celuloze (BC), ki ima visoko mehansko moč in dobro zadržuje vodo, hkrati pa se zaradi svoje biokompatibilnosti ne prijema na rane [4]. V projektu so združili obe ideji, tako da bi omogočili boljši nadzor nad okužbo in spodbudili zdravljenje opekline.
Kot produkt so si zamislil gensko spremenjen živ bakterijski terapevtik. Za šasijo so izbrali Gluconacetobacteri hansenii ATCC 53582, ki sama proizvaja bakterijsko celulozo. To so gensko spremenili tako, da lahko kontinuirano proizvaja antipseudomonalne proteine. Hkrati so uporabili optogenetiko (tehniko, ki omogoča nadzor bakterij s svetlobo). Tako so bakterije spremenili na tak način, da proizvajajo BC le, ko je to potrebno. S tem so zmanjšali metabolno breme in hitrost mutacij [1].
Pričakovali so, da v temi G. hansenii ne bo proizvedel skoraj nič BC, pod skoraj infrardečo svetlobo (NIR) bo začel proizvajati BC in pod modro svetlobo bodo bakterije lizirale in sprostile antipseudomonalni protein [1].

== Načrt ==
Načrt projekta ima tri module: proizvodnja antipseudomonalnega proteina, prenos signala c-di-GMP in proizvodnja BC, varnost in sproščanje zdravila. Pred začetkom eksperimentov so pripravili model, ki opiše potek signaliziranja z c-di-GMP [1].

=== Računalniško modeliranje ===
V G. hansenii produkcija BC poteka pod nadzorom sekundarnega sporočevalca cikličnega digvanidil monofosfata (c-di-GMP)[5]. BphS je digvanilat ciklaza, ki se aktivira s svetlobo in regulira sintezo c-di-GMP. Pod NIR svetlobo bo BphS spremenil konformacijo in se aktiviral ter začel sintetizirati c-di-GMP[6]. FcsR je c-di-GMP fosfodiesteraza, ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Kadar je hitrost nastajanja c-di-GMP večja kot njegova hidroliza, bo njegova koncentracija v celici naraščala in bakterije bodo proizvajale BC [1].
Za opis sistema so uporabili 6 reakcij in na njihovi osnovi oblikovali 5 enačb, ki so bile uporabljene za matematični model.
Model je napovedal, da ima osvetljevanje z NIR svetlobo signifikanten učinek na sintezo c-di-GMP, pri čemer je brez osvetljevanja koncentracija c-di-GMP skoraj nič [1].

=== Uvodni eksperimenti ===
Pred izvedbo zadanih modulov so določili optimalen medij za nadaljnje eksperimente z G. hansenii, pri čemer sta se za rast te bakterije najbolje izkazala SOC in HS. V obeh medijih so kvantificirali produkcijo BC, za kar so uporabili tekočo kulturo J23100-mcherry-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 v različnih volumnih obeh medijev in ugotovili, da je najbolj optimalen medij za zadano nalogo HS [1].

=== Proizvodnja pseudomonalnega proteina([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740050 BBa_K3740050]) ===
==== Načrt ====
Piocin S2 je topen protein, ki ga proizvajajo bakterije Pseudomonas aeruginosa in lahko ubije ne imune P. aeruginosa bakterije. Imunost nekaterim sevom omogoča protein IMMS2, ki se specifično veže na nukleazno domeno piocina S2 in tako inhibira njegovo aktivnost [7]. Da bi pridobili protein, ki bi lahko ubil širši spekter P. aeruginosa, so nukleazno domeno piocina S2 zamenjali z nukleazno domeno kolicina E3 in himerni protein poimenovali SE. Protein, ki omogoča imunost IMME3, je izpeljan iz imunskega proteina, ki ustreza kolicinu E3 [1], [8].
Protein SE ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740057 BBa_K3740057]) prepozna tarče preko Pseudomonas-specifičnega receptorja in translokazne domene, celice pa ubije preko nukleazne domene iz kolicina E. Poleg tega protein SE vsebuje tudi neidentificirano funkcionalno domeno piocina 2. Gostiteljske celice G. hansenii so na SE odporne, saj izražajo imunski protein IMME3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740034 BBa_K3740034]) [1].
Normalno izražanje proteina SE ter nemoteno rast gostiteljskih celic so zagotovili tako, da so protein SE in imunski protein IMME3 izražali pod različnimi promotorji in RBSji. SE se je izražal pod promotorjem pR in RBS300, IMME3 pa pod promotorjem J23118 in RBSII [1].
==== Izvedba ====
Protein SE in protein S2 so najprej izrazili v bakterijah E. coli BL21. Za to so pripravili plazmide SE-PET28A IN S2-PET28A in izražanje inducirali z IPTG. Na NaDS-PAGE gel so nanesli surov proteinski ekstrakt in potrdili prisotnost obeh proteinov. S tem so potrdili, da je plazmidni konstrukt primeren za izražanje fuzijskega proteina. Raztopino obeh proteinov in PBS (kontrola) so dodali kulturam Pseudomonas aeruginosa PAO1, P. aeruginosa PAO1 Δ1150-1151 in E. coli MG1655. Pokazali so, da lahko protein SE inhibira rast P. aeruginosa ne glede na prisotnost regije PA1150-1151, medtem ko lahko S2 inhibira le mutanto PAO1 Δ1150-1151. Noben protein ni vplival na rast E. coli [1].
Sledila je optimizacija RBS. Plazmidne konstrukte, ki so jih pripravili v E .coli, so nato prenesli v G. hansenii ATCC 53582, kjer so izvedli izražanje. Nato so kapljico raztopine s proteinom SE nanesli na FAB ploščo, na katero so bile enakomerno nanešene PAO1. Določili so, da je sev pR-RBS300-SE-B1006-J23118-RBSII-IMM-rrnB T1-pSEVA331-G. hansenii ATCC najboljši, saj je imel največjo cono inhibicije [1].

=== c-di-GMP signalizacija in produkcija BC filma ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740030 BBa_K3740030]) ===
Ker je proizvodnja BC v G. hansenii regulirana s koncentracijo c-di-GMP [6], lahko nastanjanje BC posredno reguliramo z reguliranjem koncentracije c-di-GMP. Za natančno regulacijo so uvedli 2 podmodula. Prvi je digvanilat ciklazni (DGC) modul, ki regulira sintezo c-di-GMP, drugi pa c-di-GMP fosfodiesterazni (PDE), ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Uporabili so bphS ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740019 BBa_K3740019]) – kodirajoči gen za DGC, ki je aktivirana s svetlobo (BphS) in fcsR ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740022 BBa_K3740022]) – dele kodirajočih genov c-di-GMP PDE iz različnih bakterij in ju pripravili za konstrukcijo plazmidov, ki so bili klonirani v E. coli in nato preneseni v G. hansenii ATCC53582. Pokazali so, da ima J23109-fcsR-pSEVA331 hidrolizno funkcijo in da J23100-bphS-bphO-pSEVA331 ob osvetljevanju z NIR proizvedejo več BC kot v temi. Optimizirali so tudi promotorske regije in glede na količino BC določili najbolj primeren promotor. Odločili so se za konstrukt J23100-B0034-bphS-pET RBS-bphO-rrnB T1-J23109-B0034-fcsR-rrnB T1, pri katerem pride do signifikantne razlike med izkoristkom BC pri osvetljevanju in v temi [1].

=== Varnost in sproščanje zdravila ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740044 BBa_K3740044]) ===
V modulu so zasnovali foto-induciran sistem za lizo. Gre za varnostni modul, ki lahko mehanistično zmanjša posledice sprostitve gensko spremenjenih bakterij v okolje. Hkrati pa nadzira sprostitev antipseudomonalnega proteina SE [1].
Uporabili so sistem pDawn, ki je odziven na modro svetlobo. Ob osvetljevanju dvokomponentni sistem YF1/FixJ v pDawn zavre izražanje represorja cI iz faga λ, kar omogoča da je izražanje »downstream« genov aktivirano s svetlobo [1], [9].
Delovanje promotorja pDawn so testirali s plazmidom pDawn-RFP-pSEVA331, ki so ga vnesli v G. hansenii ATCC53582 in prvo skupino bakterij gojili pod modro lučjo, drugo pa v temi. Pri prvi skupini se je izražal RFP pri drugi skupini pa ne [1].
Promotor pDawn so nato uporabili za izražanje različnih litičnih genov, med drugim S105 (Lambda litična kaseta brez antiholina), X174 (litični gen, ki kodira litični protein iz Escherichia faga PhiX174) in LKD16 (litična kaseta). Pripravljene plazmide so najprej testirali v E. coli, nato pa jih prenesli v G. hansenii. Sev pDawn-X174 E-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 (vsebuje X174 E – Bba_K2656015) je stabilno liziral pod modro lučjo [1].
== Izboljšave ==
Za povzročitev lize so pogosto uporabljeni inducibilni promotorji. V takem primeru se vseeno lahko izraža majhen delež proteina, kar z akumulacijo litičnega proteina privede do avtolize. Da bi dobili bolj stabilno proizvodnjo litičnega proteina, so izvedli mutagenezo z naključnimi oligonukleotidi na RBS (BBa_B0034). S tem so dobili kolonije, ki so pod modro svetlobo lizirale. Poleg tega so potrdili, da so vnesene mutacije povečale sintezo proteinov s tem RBS [1].
Prihodnje izboljšave bodo vključevale spremembe vezja za produkcijo BC, saj želijo zmanjšati izražanje BC v temi [1].

== Končni produkt ==
Kot končni produkt so si zamislili živ bioterapevtik v obliki bakterijske emulzije in liofilizirane bakterije. Dve obliki produkta potrebujeta drugačne pogoje shranjevanja in imata različen rok uporabe in tako služita različnim potrebam uporabnikov [1].

== Viri ==
[1] “Team:SZPT-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA. [Accessed: 27-Mar-2022].

[2] WHO, “Burns,” 2018. [Online]. Available: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/burns. [Accessed: 27-Mar-2022].

[3] P. Bielecki, J. Glik, M. Kawecki, and V. A. P. Martins Dos Santos, “Towards understanding Pseudomonas aeruginosa burn wound infections by profiling gene expression,” Biotechnol. Lett., vol. 30, no. 5, pp. 777–790, May 2008, doi: 10.1007/S10529-007-9620-2.

[4] L. Fu et al., “Skin tissue repair materials from bacterial cellulose by a multilayer fermentation method,” J. Mater. Chem., vol. 22, no. 24, pp. 12349–12357, May 2012, doi: 10.1039/C2JM00134A.

[5] E. Sajadi, S. S. A. Fatemi, V. Babaeipour, A. A. Deldar, B. Yakhchali, and M. S. Anvar, “Increased cellulose production by heterologous expression of bcsA and B genes from Gluconacetobacterxylinus in E. coli Nissle 1917,” Bioprocess Biosyst. Eng., vol. 42, no. 12, pp. 2023–2034, Dec. 2019, doi: 10.1007/S00449-019-02197-4.

[6] M. H. Ryu and M. Gomelsky, “Near-infrared light responsive synthetic c-di-GMP module for optogenetic applications,” ACS Synth. Biol., vol. 3, no. 11, pp. 802–810, Nov. 2014, doi: 10.1021/SB400182X.

[7] S. Denayer, S. Matthijs, and P. Cornelis, “Pyocin S2 (Sa) Kills Pseudomonas aeruginosa Strains via the FpvA Type I Ferripyoverdine Receptor,” J. Bacteriol., vol. 189, no. 21, p. 7663, Nov. 2007, doi: 10.1128/JB.00992-07.

[8] H.-X. Zhou, “Association and dissociation kinetics of colicin E3 and immunity protein 3: Convergence of theory and experiment,” Protein Sci., vol. 12, no. 10, p. 2379, Jan. 2003, doi: 10.1110/PS.03216203.

[9] R. Ohlendorf, R. R. Vidavski, A. Eldar, K. Moffat, and A. Möglich, “From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression,” J. Mol. Biol., vol. 416, no. 4, pp. 534–542, Mar. 2012, doi: 10.1016/J.JMB.2012.01.001.

Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin

2022-04-02T17:39:34Z

NinaV: /* Računalniško modeliranje */

Projekt »Kissed by Light« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 in bil nagrajen s prvim mestom v kategoriji zdravljenje. Zasnovala ga je skupina SZTP-CHINA, ki je želela narediti efektiven terapevtik, ki bi poškodovanim z opeklinami omogočal manj boleče okrevanje in preprečeval bakterijske okužbe [1]. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA iGEM:SZPT-CHINA]

== Uvod ==
Opekline predstavljajo globalen zdravstveni problem, pri čemer, po poročanju Svetovne zdravstvene organizacije, zaradi njih umre 180 000 ljudi na leto [2]. Ob opeklini pride do poškodbe kože – organa, ki nas ščiti pred okužbami, zato je eden glavnih ciljev oskrbe opeklin preprečevanje in zdravljenje bakterijskih okužb. Pri oskrbi poškodovancev v bolnišničnem okolju so najbolj pogoste okužbe z bakterijo Pseudomonas aeruginosa. Izbor antibiotične terapije pri tej bakteriji je zapleten, saj je rezistentna na mnoge antibiotike, poleg tega pa lahko antibiotiki negativno vplivajo na mikrobiom kože, kar poškoduje okoliške kožne celice [1], [3].
Poleg antimikrobne terapije pa je pri oskrbi pomemba tudi pravilna obložitev ran. To varuje površino opekline in jo ščiti pred vdorom tujih mikroorganizmov. Prav tako pomaga pri ohranjanju vlažnega okolja. Problem komercialnih materialov, ki se uporabljajo v ta namen npr. bombažne gaze, je, da se ti velikokrat primejo na rano in ob odstranitvi povzročijo sekundarne poškodbe [1].

== Cilj projekta Kissed by light ==
Uporabo antibiotikov so želeli so zamenjati s specifičnim antipseudomonalnim proteinom. Potencial so videli tudi v uporabi bakterijske celuloze (BC), ki ima visoko mehansko moč in dobro zadržuje vodo, hkrati pa se zaradi svoje biokompatibilnosti ne prijema na rane [4]. V projektu so združili obe ideji, tako da bi omogočili boljši nadzor nad okužbo in spodbudili zdravljenje opekline.
Kot produkt so si zamislil gensko spremenjen živ bakterijski terapevtik. Za šasijo so izbrali Gluconacetobacteri hansenii ATCC 53582, ki sama proizvaja bakterijsko celulozo. To so gensko spremenili tako, da lahko kontinuirano proizvaja antipseudomonalne proteine. Hkrati souporabili optogenetiko (tehniko, ki omogoča nadzor bakterij s svetlobo). Tako so bakterije spremenili na tak način, da proizvajajo BC le, ko je to potrebno. S tem so zmanjšali metabolno breme in hitrost mutacij [1].
Pričakovali so, da v temi G. hansenii ne bo proizvedel skoraj nič BC, pod skoraj infrardečo svetlobo (NIR) bo začel proizvajati BC in pod modro svetlobo bodo bakterije lizirale in sprostile antipseudomonalni protein [1].

== Načrt ==
Načrt projekta ima tri module: proizvodnja antipseudomonalnega proteina, prenos signala c-di-GMP in proizvodnja BC, varnost in sproščanje zdravila. Pred začetkom eksperimentov so pripravili model, ki opiše potek signaliziranja z c-di-GMP [1].

=== Računalniško modeliranje ===
V G. hansenii produkcija BC poteka pod nadzorom sekundarnega sporočevalca cikličnega digvanidil monofosfata (c-di-GMP)[5]. BphS je digvanilat ciklaza, ki se aktivira s svetlobo in regulira sintezo c-di-GMP. Pod NIR svetlobo bo BphS spremenil konformacijo in se aktiviral ter začel sintetizirati c-di-GMP[6]. FcsR je c-di-GMP fosfodiesteraza, ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Kadar je hitrost nastajanja c-di-GMP večja kot njegova hidroliza, bo njegova koncentracija v celici naraščala in bakterije bodo proizvajale BC [1].
Za opis sistema so uporabili 6 reakcij in na njihovi osnovi oblikovali 5 enačb, ki so bile uporabljene za matematični model.
Model je napovedal, da ima osvetljevanje z NIR svetlobo signifikanten učinek na sintezo c-di-GMP, pri čemer je brez osvetljevanja koncentracija c-di-GMP skoraj nič [1].

=== Uvodni eksperimenti ===
Pred izvedbo zadanih modulov so določili optimalen medij za nadaljnje eksperimente z G. hansenii, pri čemer sta se za rast te bakterije najbolje izkazala SOC in HS. V obeh medijih so kvantificirali produkcijo BC, za kar so uporabili tekočo kulturo J23100-mcherry-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 v različnih volumnih obeh medijev in ugotovili, da je najbolj optimalen medij za zadano nalogo HS [1].

=== Proizvodnja pseudomonalnega proteina([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740050 BBa_K3740050]) ===
==== Načrt ====
Piocin S2 je topen protein, ki ga proizvajajo bakterije Pseudomonas aeruginosa in lahko ubije ne imune P. aeruginosa bakterije. Imunost nekaterim sevom omogoča protein IMMS2, ki se specifično veže na nukleazno domeno piocina S2 in tako inhibira njegovo aktivnost [7]. Da bi pridobili protein, ki bi lahko ubil širši spekter P. aeruginosa, so nukleazno domeno piocina S2 zamenjali z nukleazno domeno kolicina E3 in himerni protein poimenovali SE. Protein, ki omogoča imunost IMME3, je izpeljan iz imunskega proteina, ki ustreza kolicinu E3 [1], [8].
Protein SE ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740057 BBa_K3740057]) prepozna tarče preko Pseudomonas-specifičnega receptorja in translokazne domene, celice pa ubije preko nukleazne domene iz kolicina E. Poleg tega protein SE vsebuje tudi neidentificirano funkcionalno domeno piocina 2. Gostiteljske celice G. hansenii so na SE odporne, saj izražajo imunski protein IMME3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740034 BBa_K3740034]) [1].
Normalno izražanje proteina SE ter nemoteno rast gostiteljskih celic so zagotovili tako, da so protein SE in imunski protein IMME3 izražali pod različnimi promotorji in RBSji. SE se je izražal pod promotorjem pR in RBS300, IMME3 pa pod promotorjem J23118 in RBSII [1].
==== Izvedba ====
Protein SE in protein S2 so najprej izrazili v bakterijah E. coli BL21. Za to so pripravili plazmide SE-PET28A IN S2-PET28A in izražanje inducirali z IPTG. Na NaDS-PAGE gel so nanesli surov proteinski ekstrakt in potrdili prisotnost obeh proteinov. S tem so potrdili, da je plazmidni konstrukt primeren za izražanje fuzijskega proteina. Raztopino obeh proteinov in PBS (kontrola) so dodali kulturam Pseudomonas aeruginosa PAO1, P. aeruginosa PAO1 Δ1150-1151 in E. coli MG1655. Pokazali so, da lahko protein SE inhibira rast P. aeruginosa ne glede na prisotnost regije PA1150-1151, medtem ko lahko S2 inhibira le mutanto PAO1 Δ1150-1151. Noben protein ni vplival na rast E. coli [1].
Sledila je optimizacija RBS. Plazmidne konstrukte, ki so jih pripravili v E .coli, so nato prenesli v G. hansenii ATCC 53582, kjer so izvedli izražanje. Nato so kapljico raztopine s proteinom SE nanesli na FAB ploščo, na katero so bile enakomerno nanešene PAO1. Določili so, da je sev pR-RBS300-SE-B1006-J23118-RBSII-IMM-rrnB T1-pSEVA331-G. hansenii ATCC najboljši, saj je imel največjo cono inhibicije [1].

=== c-di-GMP signalizacija in produkcija BC filma ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740030 BBa_K3740030]) ===
Ker je proizvodnja BC v G. hansenii regulirana s koncentracijo c-di-GMP [6], lahko nastanjanje BC posredno reguliramo z reguliranjem koncentracije c-di-GMP. Za natančno regulacijo so uvedli 2 podmodula. Prvi je digvanilat ciklazni (DGC) modul, ki regulira sintezo c-di-GMP, drugi pa c-di-GMP fosfodiesterazni (PDE), ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Uporabili so bphS ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740019 BBa_K3740019]) – kodirajoči gen za DGC, ki je aktivirana s svetlobo (BphS) in fcsR ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740022 BBa_K3740022]) – dele kodirajočih genov c-di-GMP PDE iz različnih bakterij in ju pripravili za konstrukcijo plazmidov, ki so bili klonirani v E. coli in nato preneseni v G. hansenii ATCC53582. Pokazali so, da ima J23109-fcsR-pSEVA331 hidrolizno funkcijo in da J23100-bphS-bphO-pSEVA331 ob osvetljevanju z NIR proizvedejo več BC kot v temi. Optimizirali so tudi promotorske regije in glede na količino BC določili najbolj primeren promotor. Odločili so se za konstrukt J23100-B0034-bphS-pET RBS-bphO-rrnB T1-J23109-B0034-fcsR-rrnB T1, pri katerem pride do signifikantne razlike med izkoristkom BC pri osvetljevanju in v temi [1].

=== Varnost in sproščanje zdravila ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740044 BBa_K3740044]) ===
V modulu so zasnovali foto-induciran sistem za lizo. Gre za varnostni modul, ki lahko mehanistično zmanjša posledice sprostitve gensko spremenjenih bakterij v okolje. Hkrati pa nadzira sprostitev antipseudomonalnega proteina SE [1].
Uporabili so sistem pDawn, ki je odziven na modro svetlobo. Ob osvetljevanju dvokomponentni sistem YF1/FixJ v pDawn zavre izražanje represorja cI iz faga λ, kar omogoča da je izražanje »downstream« genov aktivirano s svetlobo [1], [9].
Delovanje promotorja pDawn so testirali s plazmidom pDawn-RFP-pSEVA331, ki so ga vnesli v G. hansenii ATCC53582 in prvo skupino bakterij gojili pod modro lučjo, drugo pa v temi. Pri prvi skupini se je izražal RFP pri drugi skupini pa ne [1].
Promotor pDawn so nato uporabili za izražanje različnih litičnih genov, med drugim S105 (Lambda litična kaseta brez antiholina), X174 (litični gen, ki kodira litični protein iz Escherichia faga PhiX174) in LKD16 (litična kaseta). Pripravljene plazmide so najprej testirali v E. coli, nato pa jih prenesli v G. hansenii. Sev pDawn-X174 E-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 (vsebuje X174 E – Bba_K2656015) je stabilno liziral pod modro lučjo [1].
== Izboljšave ==
Za povzročitev lize so pogosto uporabljeni inducibilni promotorji. V takem primeru se vseeno lahko izraža majhen delež proteina, kar z akumulacijo litičnega proteina privede do avtolize. Da bi dobili bolj stabilno proizvodnjo litičnega proteina, so izvedli mutagenezo z naključnimi oligonukleotidi na RBS (BBa_B0034). S tem so dobili kolonije, ki so pod modro svetlobo lizirale. Poleg tega so potrdili, da so vnesene mutacije povečale sintezo proteinov s tem RBS [1].
Prihodnje izboljšave bodo vključevale spremembe vezja za produkcijo BC, saj želijo zmanjšati izražanje BC v temi [1].

== Končni produkt ==
Kot končni produkt so si zamislili živ bioterapevtik v obliki bakterijske emulzije in liofilizirane bakterije. Dve obliki produkta potrebujeta drugačne pogoje shranjevanja in imata različen rok uporabe in tako služita različnim potrebam uporabnikov [1].

== Viri ==
[1] “Team:SZPT-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA. [Accessed: 27-Mar-2022].

[2] WHO, “Burns,” 2018. [Online]. Available: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/burns. [Accessed: 27-Mar-2022].

[3] P. Bielecki, J. Glik, M. Kawecki, and V. A. P. Martins Dos Santos, “Towards understanding Pseudomonas aeruginosa burn wound infections by profiling gene expression,” Biotechnol. Lett., vol. 30, no. 5, pp. 777–790, May 2008, doi: 10.1007/S10529-007-9620-2.

[4] L. Fu et al., “Skin tissue repair materials from bacterial cellulose by a multilayer fermentation method,” J. Mater. Chem., vol. 22, no. 24, pp. 12349–12357, May 2012, doi: 10.1039/C2JM00134A.

[5] E. Sajadi, S. S. A. Fatemi, V. Babaeipour, A. A. Deldar, B. Yakhchali, and M. S. Anvar, “Increased cellulose production by heterologous expression of bcsA and B genes from Gluconacetobacterxylinus in E. coli Nissle 1917,” Bioprocess Biosyst. Eng., vol. 42, no. 12, pp. 2023–2034, Dec. 2019, doi: 10.1007/S00449-019-02197-4.

[6] M. H. Ryu and M. Gomelsky, “Near-infrared light responsive synthetic c-di-GMP module for optogenetic applications,” ACS Synth. Biol., vol. 3, no. 11, pp. 802–810, Nov. 2014, doi: 10.1021/SB400182X.

[7] S. Denayer, S. Matthijs, and P. Cornelis, “Pyocin S2 (Sa) Kills Pseudomonas aeruginosa Strains via the FpvA Type I Ferripyoverdine Receptor,” J. Bacteriol., vol. 189, no. 21, p. 7663, Nov. 2007, doi: 10.1128/JB.00992-07.

[8] H.-X. Zhou, “Association and dissociation kinetics of colicin E3 and immunity protein 3: Convergence of theory and experiment,” Protein Sci., vol. 12, no. 10, p. 2379, Jan. 2003, doi: 10.1110/PS.03216203.

[9] R. Ohlendorf, R. R. Vidavski, A. Eldar, K. Moffat, and A. Möglich, “From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression,” J. Mol. Biol., vol. 416, no. 4, pp. 534–542, Mar. 2012, doi: 10.1016/J.JMB.2012.01.001.

Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin

2022-03-27T11:59:18Z

NinaV: /* c-di-GMP signalizacija in produkcija BC filma (BBa_K3740030 BBa_K3740030) */

Projekt »Kissed by Light« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 in bil nagrajen s prvim mestom v kategoriji zdravljenje. Zasnovala ga je skupina SZTP-CHINA, ki je želela narediti efektiven terapevtik, ki bi poškodovanim z opeklinami omogočal manj boleče okrevanje in preprečeval bakterijske okužbe [1]. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA iGEM:SZPT-CHINA]

== Uvod ==
Opekline predstavljajo globalen zdravstveni problem, pri čemer, po poročanju Svetovne zdravstvene organizacije, zaradi njih umre 180 000 ljudi na leto [2]. Ob opeklini pride do poškodbe kože – organa, ki nas ščiti pred okužbami, zato je eden glavnih ciljev oskrbe opeklin preprečevanje in zdravljenje bakterijskih okužb. Pri oskrbi poškodovancev v bolnišničnem okolju so najbolj pogoste okužbe z bakterijo Pseudomonas aeruginosa. Izbor antibiotične terapije pri tej bakteriji je zapleten, saj je rezistentna na mnoge antibiotike, poleg tega pa lahko antibiotiki negativno vplivajo na mikrobiom kože, kar poškoduje okoliške kožne celice [1], [3].
Poleg antimikrobne terapije pa je pri oskrbi pomemba tudi pravilna obložitev ran. To varuje površino opekline in jo ščiti pred vdorom tujih mikroorganizmov. Prav tako pomaga pri ohranjanju vlažnega okolja. Problem komercialnih materialov, ki se uporabljajo v ta namen npr. bombažne gaze, je, da se ti velikokrat primejo na rano in ob odstranitvi povzročijo sekundarne poškodbe [1].

== Cilj projekta Kissed by light ==
Uporabo antibiotikov so želeli so zamenjati s specifičnim antipseudomonalnim proteinom. Potencial so videli tudi v uporabi bakterijske celuloze (BC), ki ima visoko mehansko moč in dobro zadržuje vodo, hkrati pa se zaradi svoje biokompatibilnosti ne prijema na rane [4]. V projektu so združili obe ideji, tako da bi omogočili boljši nadzor nad okužbo in spodbudili zdravljenje opekline.
Kot produkt so si zamislil gensko spremenjen živ bakterijski terapevtik. Za šasijo so izbrali Gluconacetobacteri hansenii ATCC 53582, ki sama proizvaja bakterijsko celulozo. To so gensko spremenili tako, da lahko kontinuirano proizvaja antipseudomonalne proteine. Hkrati souporabili optogenetiko (tehniko, ki omogoča nadzor bakterij s svetlobo). Tako so bakterije spremenili na tak način, da proizvajajo BC le, ko je to potrebno. S tem so zmanjšali metabolno breme in hitrost mutacij [1].
Pričakovali so, da v temi G. hansenii ne bo proizvedel skoraj nič BC, pod skoraj infrardečo svetlobo (NIR) bo začel proizvajati BC in pod modro svetlobo bodo bakterije lizirale in sprostile antipseudomonalni protein [1].

== Načrt ==
Načrt projekta ima tri module: proizvodnja antipseudomonalnega proteina, prenos signala c-di-GMP in proizvodnja BC, varnost in sproščanje zdravila. Pred začetkom eksperimentov so pripravili model, ki opiše potek signaliziranja z c-di-GMP [1].

=== Računalniško modeliranje ===
V G. hansenii produkcija BC poteka pod nadzorom sekundarnega sporočevalca cikličnega digvanidil monofosfata (c-di-GMP)[5]. BphS je digvanilat ciklaza, ki se aktivira s svetlobo in regulira sintezo c-di-GMP. Pod NIR svetlobo bo BphS spremenil konformacijo in se aktiviral ter začel sintetizirati c-di-GMP[6]. FcsR je c-di-GMP fosfodiesteraza, ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Kadar je hitrost nastajanja c-di-GMP večja kot njegova hidroliza, bo njegova koncentracija v celici naraščala in bakterije bodo proizvajale BC [1].
Za opis dogajanja so uporabili 6 reakcij in na njihovi osnovi oblikovali 5 enačb, ki so bile uporabljene za matematični model.
Model je napovedal, da ima osvetljevanje z NIR svetlobo signifikanten učinek na sintezo c-di-GMP, pri čemer je brez osvetljevanja koncentracija c-di-GMP skoraj nič [1].

=== Uvodni eksperimenti ===
Pred izvedbo zadanih modulov so določili optimalen medij za nadaljnje eksperimente z G. hansenii, pri čemer sta se za rast te bakterije najbolje izkazala SOC in HS. V obeh medijih so kvantificirali produkcijo BC, za kar so uporabili tekočo kulturo J23100-mcherry-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 v različnih volumnih obeh medijev in ugotovili, da je najbolj optimalen medij za zadano nalogo HS [1].

=== Proizvodnja pseudomonalnega proteina([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740050 BBa_K3740050]) ===
==== Načrt ====
Piocin S2 je topen protein, ki ga proizvajajo bakterije Pseudomonas aeruginosa in lahko ubije ne imune P. aeruginosa bakterije. Imunost nekaterim sevom omogoča protein IMMS2, ki se specifično veže na nukleazno domeno piocina S2 in tako inhibira njegovo aktivnost [7]. Da bi pridobili protein, ki bi lahko ubil širši spekter P. aeruginosa, so nukleazno domeno piocina S2 zamenjali z nukleazno domeno kolicina E3 in himerni protein poimenovali SE. Protein, ki omogoča imunost IMME3, je izpeljan iz imunskega proteina, ki ustreza kolicinu E3 [1], [8].
Protein SE ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740057 BBa_K3740057]) prepozna tarče preko Pseudomonas-specifičnega receptorja in translokazne domene, celice pa ubije preko nukleazne domene iz kolicina E. Poleg tega protein SE vsebuje tudi neidentificirano funkcionalno domeno piocina 2. Gostiteljske celice G. hansenii so na SE odporne, saj izražajo imunski protein IMME3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740034 BBa_K3740034]) [1].
Normalno izražanje proteina SE ter nemoteno rast gostiteljskih celic so zagotovili tako, da so protein SE in imunski protein IMME3 izražali pod različnimi promotorji in RBSji. SE se je izražal pod promotorjem pR in RBS300, IMME3 pa pod promotorjem J23118 in RBSII [1].
==== Izvedba ====
Protein SE in protein S2 so najprej izrazili v bakterijah E. coli BL21. Za to so pripravili plazmide SE-PET28A IN S2-PET28A in izražanje inducirali z IPTG. Na NaDS-PAGE gel so nanesli surov proteinski ekstrakt in potrdili prisotnost obeh proteinov. S tem so potrdili, da je plazmidni konstrukt primeren za izražanje fuzijskega proteina. Raztopino obeh proteinov in PBS (kontrola) so dodali kulturam Pseudomonas aeruginosa PAO1, P. aeruginosa PAO1 Δ1150-1151 in E. coli MG1655. Pokazali so, da lahko protein SE inhibira rast P. aeruginosa ne glede na prisotnost regije PA1150-1151, medtem ko lahko S2 inhibira le mutanto PAO1 Δ1150-1151. Noben protein ni vplival na rast E. coli [1].
Sledila je optimizacija RBS. Plazmidne konstrukte, ki so jih pripravili v E .coli, so nato prenesli v G. hansenii ATCC 53582, kjer so izvedli izražanje. Nato so kapljico raztopine s proteinom SE nanesli na FAB ploščo, na katero so bile enakomerno nanešene PAO1. Določili so, da je sev pR-RBS300-SE-B1006-J23118-RBSII-IMM-rrnB T1-pSEVA331-G. hansenii ATCC najboljši, saj je imel največjo cono inhibicije [1].

=== c-di-GMP signalizacija in produkcija BC filma ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740030 BBa_K3740030]) ===
Ker je proizvodnja BC v G. hansenii regulirana s koncentracijo c-di-GMP [6], lahko nastanjanje BC posredno reguliramo z reguliranjem koncentracije c-di-GMP. Za natančno regulacijo so uvedli 2 podmodula. Prvi je digvanilat ciklazni (DGC) modul, ki regulira sintezo c-di-GMP, drugi pa c-di-GMP fosfodiesterazni (PDE), ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Uporabili so bphS ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740019 BBa_K3740019]) – kodirajoči gen za DGC, ki je aktivirana s svetlobo (BphS) in fcsR ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740022 BBa_K3740022]) – dele kodirajočih genov c-di-GMP PDE iz različnih bakterij in ju pripravili za konstrukcijo plazmidov, ki so bili klonirani v E. coli in nato preneseni v G. hansenii ATCC53582. Pokazali so, da ima J23109-fcsR-pSEVA331 hidrolizno funkcijo in da J23100-bphS-bphO-pSEVA331 ob osvetljevanju z NIR proizvedejo več BC kot v temi. Optimizirali so tudi promotorske regije in glede na količino BC določili najbolj primeren promotor. Odločili so se za konstrukt J23100-B0034-bphS-pET RBS-bphO-rrnB T1-J23109-B0034-fcsR-rrnB T1, pri katerem pride do signifikantne razlike med izkoristkom BC pri osvetljevanju in v temi [1].

=== Varnost in sproščanje zdravila ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740044 BBa_K3740044]) ===
V modulu so zasnovali foto-induciran sistem za lizo. Gre za varnostni modul, ki lahko mehanistično zmanjša posledice sprostitve gensko spremenjenih bakterij v okolje. Hkrati pa nadzira sprostitev antipseudomonalnega proteina SE [1].
Uporabili so sistem pDawn, ki je odziven na modro svetlobo. Ob osvetljevanju dvokomponentni sistem YF1/FixJ v pDawn zavre izražanje represorja cI iz faga λ, kar omogoča da je izražanje »downstream« genov aktivirano s svetlobo [1], [9].
Delovanje promotorja pDawn so testirali s plazmidom pDawn-RFP-pSEVA331, ki so ga vnesli v G. hansenii ATCC53582 in prvo skupino bakterij gojili pod modro lučjo, drugo pa v temi. Pri prvi skupini se je izražal RFP pri drugi skupini pa ne [1].
Promotor pDawn so nato uporabili za izražanje različnih litičnih genov, med drugim S105 (Lambda litična kaseta brez antiholina), X174 (litični gen, ki kodira litični protein iz Escherichia faga PhiX174) in LKD16 (litična kaseta). Pripravljene plazmide so najprej testirali v E. coli, nato pa jih prenesli v G. hansenii. Sev pDawn-X174 E-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 (vsebuje X174 E – Bba_K2656015) je stabilno liziral pod modro lučjo [1].
== Izboljšave ==
Za povzročitev lize so pogosto uporabljeni inducibilni promotorji. V takem primeru se vseeno lahko izraža majhen delež proteina, kar z akumulacijo litičnega proteina privede do avtolize. Da bi dobili bolj stabilno proizvodnjo litičnega proteina, so izvedli mutagenezo z naključnimi oligonukleotidi na RBS (BBa_B0034). S tem so dobili kolonije, ki so pod modro svetlobo lizirale. Poleg tega so potrdili, da so vnesene mutacije povečale sintezo proteinov s tem RBS [1].
Prihodnje izboljšave bodo vključevale spremembe vezja za produkcijo BC, saj želijo zmanjšati izražanje BC v temi [1].

== Končni produkt ==
Kot končni produkt so si zamislili živ bioterapevtik v obliki bakterijske emulzije in liofilizirane bakterije. Dve obliki produkta potrebujeta drugačne pogoje shranjevanja in imata različen rok uporabe in tako služita različnim potrebam uporabnikov [1].

== Viri ==
[1] “Team:SZPT-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA. [Accessed: 27-Mar-2022].

[2] WHO, “Burns,” 2018. [Online]. Available: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/burns. [Accessed: 27-Mar-2022].

[3] P. Bielecki, J. Glik, M. Kawecki, and V. A. P. Martins Dos Santos, “Towards understanding Pseudomonas aeruginosa burn wound infections by profiling gene expression,” Biotechnol. Lett., vol. 30, no. 5, pp. 777–790, May 2008, doi: 10.1007/S10529-007-9620-2.

[4] L. Fu et al., “Skin tissue repair materials from bacterial cellulose by a multilayer fermentation method,” J. Mater. Chem., vol. 22, no. 24, pp. 12349–12357, May 2012, doi: 10.1039/C2JM00134A.

[5] E. Sajadi, S. S. A. Fatemi, V. Babaeipour, A. A. Deldar, B. Yakhchali, and M. S. Anvar, “Increased cellulose production by heterologous expression of bcsA and B genes from Gluconacetobacterxylinus in E. coli Nissle 1917,” Bioprocess Biosyst. Eng., vol. 42, no. 12, pp. 2023–2034, Dec. 2019, doi: 10.1007/S00449-019-02197-4.

[6] M. H. Ryu and M. Gomelsky, “Near-infrared light responsive synthetic c-di-GMP module for optogenetic applications,” ACS Synth. Biol., vol. 3, no. 11, pp. 802–810, Nov. 2014, doi: 10.1021/SB400182X.

[7] S. Denayer, S. Matthijs, and P. Cornelis, “Pyocin S2 (Sa) Kills Pseudomonas aeruginosa Strains via the FpvA Type I Ferripyoverdine Receptor,” J. Bacteriol., vol. 189, no. 21, p. 7663, Nov. 2007, doi: 10.1128/JB.00992-07.

[8] H.-X. Zhou, “Association and dissociation kinetics of colicin E3 and immunity protein 3: Convergence of theory and experiment,” Protein Sci., vol. 12, no. 10, p. 2379, Jan. 2003, doi: 10.1110/PS.03216203.

[9] R. Ohlendorf, R. R. Vidavski, A. Eldar, K. Moffat, and A. Möglich, “From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression,” J. Mol. Biol., vol. 416, no. 4, pp. 534–542, Mar. 2012, doi: 10.1016/J.JMB.2012.01.001.

Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin

2022-03-27T11:58:58Z

NinaV: /* c-di-GMP signalizacija in produkcija BC filma ([BBa_K3740030http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740030 BBa_K3740030]) */

Projekt »Kissed by Light« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 in bil nagrajen s prvim mestom v kategoriji zdravljenje. Zasnovala ga je skupina SZTP-CHINA, ki je želela narediti efektiven terapevtik, ki bi poškodovanim z opeklinami omogočal manj boleče okrevanje in preprečeval bakterijske okužbe [1]. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA iGEM:SZPT-CHINA]

== Uvod ==
Opekline predstavljajo globalen zdravstveni problem, pri čemer, po poročanju Svetovne zdravstvene organizacije, zaradi njih umre 180 000 ljudi na leto [2]. Ob opeklini pride do poškodbe kože – organa, ki nas ščiti pred okužbami, zato je eden glavnih ciljev oskrbe opeklin preprečevanje in zdravljenje bakterijskih okužb. Pri oskrbi poškodovancev v bolnišničnem okolju so najbolj pogoste okužbe z bakterijo Pseudomonas aeruginosa. Izbor antibiotične terapije pri tej bakteriji je zapleten, saj je rezistentna na mnoge antibiotike, poleg tega pa lahko antibiotiki negativno vplivajo na mikrobiom kože, kar poškoduje okoliške kožne celice [1], [3].
Poleg antimikrobne terapije pa je pri oskrbi pomemba tudi pravilna obložitev ran. To varuje površino opekline in jo ščiti pred vdorom tujih mikroorganizmov. Prav tako pomaga pri ohranjanju vlažnega okolja. Problem komercialnih materialov, ki se uporabljajo v ta namen npr. bombažne gaze, je, da se ti velikokrat primejo na rano in ob odstranitvi povzročijo sekundarne poškodbe [1].

== Cilj projekta Kissed by light ==
Uporabo antibiotikov so želeli so zamenjati s specifičnim antipseudomonalnim proteinom. Potencial so videli tudi v uporabi bakterijske celuloze (BC), ki ima visoko mehansko moč in dobro zadržuje vodo, hkrati pa se zaradi svoje biokompatibilnosti ne prijema na rane [4]. V projektu so združili obe ideji, tako da bi omogočili boljši nadzor nad okužbo in spodbudili zdravljenje opekline.
Kot produkt so si zamislil gensko spremenjen živ bakterijski terapevtik. Za šasijo so izbrali Gluconacetobacteri hansenii ATCC 53582, ki sama proizvaja bakterijsko celulozo. To so gensko spremenili tako, da lahko kontinuirano proizvaja antipseudomonalne proteine. Hkrati souporabili optogenetiko (tehniko, ki omogoča nadzor bakterij s svetlobo). Tako so bakterije spremenili na tak način, da proizvajajo BC le, ko je to potrebno. S tem so zmanjšali metabolno breme in hitrost mutacij [1].
Pričakovali so, da v temi G. hansenii ne bo proizvedel skoraj nič BC, pod skoraj infrardečo svetlobo (NIR) bo začel proizvajati BC in pod modro svetlobo bodo bakterije lizirale in sprostile antipseudomonalni protein [1].

== Načrt ==
Načrt projekta ima tri module: proizvodnja antipseudomonalnega proteina, prenos signala c-di-GMP in proizvodnja BC, varnost in sproščanje zdravila. Pred začetkom eksperimentov so pripravili model, ki opiše potek signaliziranja z c-di-GMP [1].

=== Računalniško modeliranje ===
V G. hansenii produkcija BC poteka pod nadzorom sekundarnega sporočevalca cikličnega digvanidil monofosfata (c-di-GMP)[5]. BphS je digvanilat ciklaza, ki se aktivira s svetlobo in regulira sintezo c-di-GMP. Pod NIR svetlobo bo BphS spremenil konformacijo in se aktiviral ter začel sintetizirati c-di-GMP[6]. FcsR je c-di-GMP fosfodiesteraza, ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Kadar je hitrost nastajanja c-di-GMP večja kot njegova hidroliza, bo njegova koncentracija v celici naraščala in bakterije bodo proizvajale BC [1].
Za opis dogajanja so uporabili 6 reakcij in na njihovi osnovi oblikovali 5 enačb, ki so bile uporabljene za matematični model.
Model je napovedal, da ima osvetljevanje z NIR svetlobo signifikanten učinek na sintezo c-di-GMP, pri čemer je brez osvetljevanja koncentracija c-di-GMP skoraj nič [1].

=== Uvodni eksperimenti ===
Pred izvedbo zadanih modulov so določili optimalen medij za nadaljnje eksperimente z G. hansenii, pri čemer sta se za rast te bakterije najbolje izkazala SOC in HS. V obeh medijih so kvantificirali produkcijo BC, za kar so uporabili tekočo kulturo J23100-mcherry-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 v različnih volumnih obeh medijev in ugotovili, da je najbolj optimalen medij za zadano nalogo HS [1].

=== Proizvodnja pseudomonalnega proteina([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740050 BBa_K3740050]) ===
==== Načrt ====
Piocin S2 je topen protein, ki ga proizvajajo bakterije Pseudomonas aeruginosa in lahko ubije ne imune P. aeruginosa bakterije. Imunost nekaterim sevom omogoča protein IMMS2, ki se specifično veže na nukleazno domeno piocina S2 in tako inhibira njegovo aktivnost [7]. Da bi pridobili protein, ki bi lahko ubil širši spekter P. aeruginosa, so nukleazno domeno piocina S2 zamenjali z nukleazno domeno kolicina E3 in himerni protein poimenovali SE. Protein, ki omogoča imunost IMME3, je izpeljan iz imunskega proteina, ki ustreza kolicinu E3 [1], [8].
Protein SE ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740057 BBa_K3740057]) prepozna tarče preko Pseudomonas-specifičnega receptorja in translokazne domene, celice pa ubije preko nukleazne domene iz kolicina E. Poleg tega protein SE vsebuje tudi neidentificirano funkcionalno domeno piocina 2. Gostiteljske celice G. hansenii so na SE odporne, saj izražajo imunski protein IMME3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740034 BBa_K3740034]) [1].
Normalno izražanje proteina SE ter nemoteno rast gostiteljskih celic so zagotovili tako, da so protein SE in imunski protein IMME3 izražali pod različnimi promotorji in RBSji. SE se je izražal pod promotorjem pR in RBS300, IMME3 pa pod promotorjem J23118 in RBSII [1].
==== Izvedba ====
Protein SE in protein S2 so najprej izrazili v bakterijah E. coli BL21. Za to so pripravili plazmide SE-PET28A IN S2-PET28A in izražanje inducirali z IPTG. Na NaDS-PAGE gel so nanesli surov proteinski ekstrakt in potrdili prisotnost obeh proteinov. S tem so potrdili, da je plazmidni konstrukt primeren za izražanje fuzijskega proteina. Raztopino obeh proteinov in PBS (kontrola) so dodali kulturam Pseudomonas aeruginosa PAO1, P. aeruginosa PAO1 Δ1150-1151 in E. coli MG1655. Pokazali so, da lahko protein SE inhibira rast P. aeruginosa ne glede na prisotnost regije PA1150-1151, medtem ko lahko S2 inhibira le mutanto PAO1 Δ1150-1151. Noben protein ni vplival na rast E. coli [1].
Sledila je optimizacija RBS. Plazmidne konstrukte, ki so jih pripravili v E .coli, so nato prenesli v G. hansenii ATCC 53582, kjer so izvedli izražanje. Nato so kapljico raztopine s proteinom SE nanesli na FAB ploščo, na katero so bile enakomerno nanešene PAO1. Določili so, da je sev pR-RBS300-SE-B1006-J23118-RBSII-IMM-rrnB T1-pSEVA331-G. hansenii ATCC najboljši, saj je imel največjo cono inhibicije [1].

=== c-di-GMP signalizacija in produkcija BC filma ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740030 BBa_K3740030 BBa_K3740030]) ===
Ker je proizvodnja BC v G. hansenii regulirana s koncentracijo c-di-GMP [6], lahko nastanjanje BC posredno reguliramo z reguliranjem koncentracije c-di-GMP. Za natančno regulacijo so uvedli 2 podmodula. Prvi je digvanilat ciklazni (DGC) modul, ki regulira sintezo c-di-GMP, drugi pa c-di-GMP fosfodiesterazni (PDE), ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Uporabili so bphS ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740019 BBa_K3740019]) – kodirajoči gen za DGC, ki je aktivirana s svetlobo (BphS) in fcsR ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740022 BBa_K3740022]) – dele kodirajočih genov c-di-GMP PDE iz različnih bakterij in ju pripravili za konstrukcijo plazmidov, ki so bili klonirani v E. coli in nato preneseni v G. hansenii ATCC53582. Pokazali so, da ima J23109-fcsR-pSEVA331 hidrolizno funkcijo in da J23100-bphS-bphO-pSEVA331 ob osvetljevanju z NIR proizvedejo več BC kot v temi. Optimizirali so tudi promotorske regije in glede na količino BC določili najbolj primeren promotor. Odločili so se za konstrukt J23100-B0034-bphS-pET RBS-bphO-rrnB T1-J23109-B0034-fcsR-rrnB T1, pri katerem pride do signifikantne razlike med izkoristkom BC pri osvetljevanju in v temi [1].

=== Varnost in sproščanje zdravila ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740044 BBa_K3740044]) ===
V modulu so zasnovali foto-induciran sistem za lizo. Gre za varnostni modul, ki lahko mehanistično zmanjša posledice sprostitve gensko spremenjenih bakterij v okolje. Hkrati pa nadzira sprostitev antipseudomonalnega proteina SE [1].
Uporabili so sistem pDawn, ki je odziven na modro svetlobo. Ob osvetljevanju dvokomponentni sistem YF1/FixJ v pDawn zavre izražanje represorja cI iz faga λ, kar omogoča da je izražanje »downstream« genov aktivirano s svetlobo [1], [9].
Delovanje promotorja pDawn so testirali s plazmidom pDawn-RFP-pSEVA331, ki so ga vnesli v G. hansenii ATCC53582 in prvo skupino bakterij gojili pod modro lučjo, drugo pa v temi. Pri prvi skupini se je izražal RFP pri drugi skupini pa ne [1].
Promotor pDawn so nato uporabili za izražanje različnih litičnih genov, med drugim S105 (Lambda litična kaseta brez antiholina), X174 (litični gen, ki kodira litični protein iz Escherichia faga PhiX174) in LKD16 (litična kaseta). Pripravljene plazmide so najprej testirali v E. coli, nato pa jih prenesli v G. hansenii. Sev pDawn-X174 E-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 (vsebuje X174 E – Bba_K2656015) je stabilno liziral pod modro lučjo [1].
== Izboljšave ==
Za povzročitev lize so pogosto uporabljeni inducibilni promotorji. V takem primeru se vseeno lahko izraža majhen delež proteina, kar z akumulacijo litičnega proteina privede do avtolize. Da bi dobili bolj stabilno proizvodnjo litičnega proteina, so izvedli mutagenezo z naključnimi oligonukleotidi na RBS (BBa_B0034). S tem so dobili kolonije, ki so pod modro svetlobo lizirale. Poleg tega so potrdili, da so vnesene mutacije povečale sintezo proteinov s tem RBS [1].
Prihodnje izboljšave bodo vključevale spremembe vezja za produkcijo BC, saj želijo zmanjšati izražanje BC v temi [1].

== Končni produkt ==
Kot končni produkt so si zamislili živ bioterapevtik v obliki bakterijske emulzije in liofilizirane bakterije. Dve obliki produkta potrebujeta drugačne pogoje shranjevanja in imata različen rok uporabe in tako služita različnim potrebam uporabnikov [1].

== Viri ==
[1] “Team:SZPT-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA. [Accessed: 27-Mar-2022].

[2] WHO, “Burns,” 2018. [Online]. Available: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/burns. [Accessed: 27-Mar-2022].

[3] P. Bielecki, J. Glik, M. Kawecki, and V. A. P. Martins Dos Santos, “Towards understanding Pseudomonas aeruginosa burn wound infections by profiling gene expression,” Biotechnol. Lett., vol. 30, no. 5, pp. 777–790, May 2008, doi: 10.1007/S10529-007-9620-2.

[4] L. Fu et al., “Skin tissue repair materials from bacterial cellulose by a multilayer fermentation method,” J. Mater. Chem., vol. 22, no. 24, pp. 12349–12357, May 2012, doi: 10.1039/C2JM00134A.

[5] E. Sajadi, S. S. A. Fatemi, V. Babaeipour, A. A. Deldar, B. Yakhchali, and M. S. Anvar, “Increased cellulose production by heterologous expression of bcsA and B genes from Gluconacetobacterxylinus in E. coli Nissle 1917,” Bioprocess Biosyst. Eng., vol. 42, no. 12, pp. 2023–2034, Dec. 2019, doi: 10.1007/S00449-019-02197-4.

[6] M. H. Ryu and M. Gomelsky, “Near-infrared light responsive synthetic c-di-GMP module for optogenetic applications,” ACS Synth. Biol., vol. 3, no. 11, pp. 802–810, Nov. 2014, doi: 10.1021/SB400182X.

[7] S. Denayer, S. Matthijs, and P. Cornelis, “Pyocin S2 (Sa) Kills Pseudomonas aeruginosa Strains via the FpvA Type I Ferripyoverdine Receptor,” J. Bacteriol., vol. 189, no. 21, p. 7663, Nov. 2007, doi: 10.1128/JB.00992-07.

[8] H.-X. Zhou, “Association and dissociation kinetics of colicin E3 and immunity protein 3: Convergence of theory and experiment,” Protein Sci., vol. 12, no. 10, p. 2379, Jan. 2003, doi: 10.1110/PS.03216203.

[9] R. Ohlendorf, R. R. Vidavski, A. Eldar, K. Moffat, and A. Möglich, “From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression,” J. Mol. Biol., vol. 416, no. 4, pp. 534–542, Mar. 2012, doi: 10.1016/J.JMB.2012.01.001.

Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin

2022-03-27T11:36:52Z

NinaV: /* Viri */

Projekt »Kissed by Light« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 in bil nagrajen s prvim mestom v kategoriji zdravljenje. Zasnovala ga je skupina SZTP-CHINA, ki je želela narediti efektiven terapevtik, ki bi poškodovanim z opeklinami omogočal manj boleče okrevanje in preprečeval bakterijske okužbe [1]. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA iGEM:SZPT-CHINA]

== Uvod ==
Opekline predstavljajo globalen zdravstveni problem, pri čemer, po poročanju Svetovne zdravstvene organizacije, zaradi njih umre 180 000 ljudi na leto [2]. Ob opeklini pride do poškodbe kože – organa, ki nas ščiti pred okužbami, zato je eden glavnih ciljev oskrbe opeklin preprečevanje in zdravljenje bakterijskih okužb. Pri oskrbi poškodovancev v bolnišničnem okolju so najbolj pogoste okužbe z bakterijo Pseudomonas aeruginosa. Izbor antibiotične terapije pri tej bakteriji je zapleten, saj je rezistentna na mnoge antibiotike, poleg tega pa lahko antibiotiki negativno vplivajo na mikrobiom kože, kar poškoduje okoliške kožne celice [1], [3].
Poleg antimikrobne terapije pa je pri oskrbi pomemba tudi pravilna obložitev ran. To varuje površino opekline in jo ščiti pred vdorom tujih mikroorganizmov. Prav tako pomaga pri ohranjanju vlažnega okolja. Problem komercialnih materialov, ki se uporabljajo v ta namen npr. bombažne gaze, je, da se ti velikokrat primejo na rano in ob odstranitvi povzročijo sekundarne poškodbe [1].

== Cilj projekta Kissed by light ==
Uporabo antibiotikov so želeli so zamenjati s specifičnim antipseudomonalnim proteinom. Potencial so videli tudi v uporabi bakterijske celuloze (BC), ki ima visoko mehansko moč in dobro zadržuje vodo, hkrati pa se zaradi svoje biokompatibilnosti ne prijema na rane [4]. V projektu so združili obe ideji, tako da bi omogočili boljši nadzor nad okužbo in spodbudili zdravljenje opekline.
Kot produkt so si zamislil gensko spremenjen živ bakterijski terapevtik. Za šasijo so izbrali Gluconacetobacteri hansenii ATCC 53582, ki sama proizvaja bakterijsko celulozo. To so gensko spremenili tako, da lahko kontinuirano proizvaja antipseudomonalne proteine. Hkrati souporabili optogenetiko (tehniko, ki omogoča nadzor bakterij s svetlobo). Tako so bakterije spremenili na tak način, da proizvajajo BC le, ko je to potrebno. S tem so zmanjšali metabolno breme in hitrost mutacij [1].
Pričakovali so, da v temi G. hansenii ne bo proizvedel skoraj nič BC, pod skoraj infrardečo svetlobo (NIR) bo začel proizvajati BC in pod modro svetlobo bodo bakterije lizirale in sprostile antipseudomonalni protein [1].

== Načrt ==
Načrt projekta ima tri module: proizvodnja antipseudomonalnega proteina, prenos signala c-di-GMP in proizvodnja BC, varnost in sproščanje zdravila. Pred začetkom eksperimentov so pripravili model, ki opiše potek signaliziranja z c-di-GMP [1].

=== Računalniško modeliranje ===
V G. hansenii produkcija BC poteka pod nadzorom sekundarnega sporočevalca cikličnega digvanidil monofosfata (c-di-GMP)[5]. BphS je digvanilat ciklaza, ki se aktivira s svetlobo in regulira sintezo c-di-GMP. Pod NIR svetlobo bo BphS spremenil konformacijo in se aktiviral ter začel sintetizirati c-di-GMP[6]. FcsR je c-di-GMP fosfodiesteraza, ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Kadar je hitrost nastajanja c-di-GMP večja kot njegova hidroliza, bo njegova koncentracija v celici naraščala in bakterije bodo proizvajale BC [1].
Za opis dogajanja so uporabili 6 reakcij in na njihovi osnovi oblikovali 5 enačb, ki so bile uporabljene za matematični model.
Model je napovedal, da ima osvetljevanje z NIR svetlobo signifikanten učinek na sintezo c-di-GMP, pri čemer je brez osvetljevanja koncentracija c-di-GMP skoraj nič [1].

=== Uvodni eksperimenti ===
Pred izvedbo zadanih modulov so določili optimalen medij za nadaljnje eksperimente z G. hansenii, pri čemer sta se za rast te bakterije najbolje izkazala SOC in HS. V obeh medijih so kvantificirali produkcijo BC, za kar so uporabili tekočo kulturo J23100-mcherry-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 v različnih volumnih obeh medijev in ugotovili, da je najbolj optimalen medij za zadano nalogo HS [1].

=== Proizvodnja pseudomonalnega proteina([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740050 BBa_K3740050]) ===
==== Načrt ====
Piocin S2 je topen protein, ki ga proizvajajo bakterije Pseudomonas aeruginosa in lahko ubije ne imune P. aeruginosa bakterije. Imunost nekaterim sevom omogoča protein IMMS2, ki se specifično veže na nukleazno domeno piocina S2 in tako inhibira njegovo aktivnost [7]. Da bi pridobili protein, ki bi lahko ubil širši spekter P. aeruginosa, so nukleazno domeno piocina S2 zamenjali z nukleazno domeno kolicina E3 in himerni protein poimenovali SE. Protein, ki omogoča imunost IMME3, je izpeljan iz imunskega proteina, ki ustreza kolicinu E3 [1], [8].
Protein SE ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740057 BBa_K3740057]) prepozna tarče preko Pseudomonas-specifičnega receptorja in translokazne domene, celice pa ubije preko nukleazne domene iz kolicina E. Poleg tega protein SE vsebuje tudi neidentificirano funkcionalno domeno piocina 2. Gostiteljske celice G. hansenii so na SE odporne, saj izražajo imunski protein IMME3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740034 BBa_K3740034]) [1].
Normalno izražanje proteina SE ter nemoteno rast gostiteljskih celic so zagotovili tako, da so protein SE in imunski protein IMME3 izražali pod različnimi promotorji in RBSji. SE se je izražal pod promotorjem pR in RBS300, IMME3 pa pod promotorjem J23118 in RBSII [1].
==== Izvedba ====
Protein SE in protein S2 so najprej izrazili v bakterijah E. coli BL21. Za to so pripravili plazmide SE-PET28A IN S2-PET28A in izražanje inducirali z IPTG. Na NaDS-PAGE gel so nanesli surov proteinski ekstrakt in potrdili prisotnost obeh proteinov. S tem so potrdili, da je plazmidni konstrukt primeren za izražanje fuzijskega proteina. Raztopino obeh proteinov in PBS (kontrola) so dodali kulturam Pseudomonas aeruginosa PAO1, P. aeruginosa PAO1 Δ1150-1151 in E. coli MG1655. Pokazali so, da lahko protein SE inhibira rast P. aeruginosa ne glede na prisotnost regije PA1150-1151, medtem ko lahko S2 inhibira le mutanto PAO1 Δ1150-1151. Noben protein ni vplival na rast E. coli [1].
Sledila je optimizacija RBS. Plazmidne konstrukte, ki so jih pripravili v E .coli, so nato prenesli v G. hansenii ATCC 53582, kjer so izvedli izražanje. Nato so kapljico raztopine s proteinom SE nanesli na FAB ploščo, na katero so bile enakomerno nanešene PAO1. Določili so, da je sev pR-RBS300-SE-B1006-J23118-RBSII-IMM-rrnB T1-pSEVA331-G. hansenii ATCC najboljši, saj je imel največjo cono inhibicije [1].

=== c-di-GMP signalizacija in produkcija BC filma ([BBa_K3740030http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740030 BBa_K3740030]) ===
Ker je proizvodnja BC v G. hansenii regulirana s koncentracijo c-di-GMP [6], lahko nastanjanje BC posredno reguliramo z reguliranjem koncentracije c-di-GMP. Za natančno regulacijo so uvedli 2 podmodula. Prvi je digvanilat ciklazni (DGC) modul, ki regulira sintezo c-di-GMP, drugi pa c-di-GMP fosfodiesterazni (PDE), ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Uporabili so bphS ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740019 BBa_K3740019]) – kodirajoči gen za DGC, ki je aktivirana s svetlobo (BphS) in fcsR ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740022 BBa_K3740022]) – dele kodirajočih genov c-di-GMP PDE iz različnih bakterij in ju pripravili za konstrukcijo plazmidov, ki so bili klonirani v E. coli in nato preneseni v G. hansenii ATCC53582. Pokazali so, da ima J23109-fcsR-pSEVA331 hidrolizno funkcijo in da J23100-bphS-bphO-pSEVA331 ob osvetljevanju z NIR proizvedejo več BC kot v temi. Optimizirali so tudi promotorske regije in glede na količino BC določili najbolj primeren promotor. Odločili so se za konstrukt J23100-B0034-bphS-pET RBS-bphO-rrnB T1-J23109-B0034-fcsR-rrnB T1, pri katerem pride do signifikantne razlike med izkoristkom BC pri osvetljevanju in v temi [1].

=== Varnost in sproščanje zdravila ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740044 BBa_K3740044]) ===
V modulu so zasnovali foto-induciran sistem za lizo. Gre za varnostni modul, ki lahko mehanistično zmanjša posledice sprostitve gensko spremenjenih bakterij v okolje. Hkrati pa nadzira sprostitev antipseudomonalnega proteina SE [1].
Uporabili so sistem pDawn, ki je odziven na modro svetlobo. Ob osvetljevanju dvokomponentni sistem YF1/FixJ v pDawn zavre izražanje represorja cI iz faga λ, kar omogoča da je izražanje »downstream« genov aktivirano s svetlobo [1], [9].
Delovanje promotorja pDawn so testirali s plazmidom pDawn-RFP-pSEVA331, ki so ga vnesli v G. hansenii ATCC53582 in prvo skupino bakterij gojili pod modro lučjo, drugo pa v temi. Pri prvi skupini se je izražal RFP pri drugi skupini pa ne [1].
Promotor pDawn so nato uporabili za izražanje različnih litičnih genov, med drugim S105 (Lambda litična kaseta brez antiholina), X174 (litični gen, ki kodira litični protein iz Escherichia faga PhiX174) in LKD16 (litična kaseta). Pripravljene plazmide so najprej testirali v E. coli, nato pa jih prenesli v G. hansenii. Sev pDawn-X174 E-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 (vsebuje X174 E – Bba_K2656015) je stabilno liziral pod modro lučjo [1].
== Izboljšave ==
Za povzročitev lize so pogosto uporabljeni inducibilni promotorji. V takem primeru se vseeno lahko izraža majhen delež proteina, kar z akumulacijo litičnega proteina privede do avtolize. Da bi dobili bolj stabilno proizvodnjo litičnega proteina, so izvedli mutagenezo z naključnimi oligonukleotidi na RBS (BBa_B0034). S tem so dobili kolonije, ki so pod modro svetlobo lizirale. Poleg tega so potrdili, da so vnesene mutacije povečale sintezo proteinov s tem RBS [1].
Prihodnje izboljšave bodo vključevale spremembe vezja za produkcijo BC, saj želijo zmanjšati izražanje BC v temi [1].

== Končni produkt ==
Kot končni produkt so si zamislili živ bioterapevtik v obliki bakterijske emulzije in liofilizirane bakterije. Dve obliki produkta potrebujeta drugačne pogoje shranjevanja in imata različen rok uporabe in tako služita različnim potrebam uporabnikov [1].

== Viri ==
[1] “Team:SZPT-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA. [Accessed: 27-Mar-2022].

[2] WHO, “Burns,” 2018. [Online]. Available: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/burns. [Accessed: 27-Mar-2022].

[3] P. Bielecki, J. Glik, M. Kawecki, and V. A. P. Martins Dos Santos, “Towards understanding Pseudomonas aeruginosa burn wound infections by profiling gene expression,” Biotechnol. Lett., vol. 30, no. 5, pp. 777–790, May 2008, doi: 10.1007/S10529-007-9620-2.

[4] L. Fu et al., “Skin tissue repair materials from bacterial cellulose by a multilayer fermentation method,” J. Mater. Chem., vol. 22, no. 24, pp. 12349–12357, May 2012, doi: 10.1039/C2JM00134A.

[5] E. Sajadi, S. S. A. Fatemi, V. Babaeipour, A. A. Deldar, B. Yakhchali, and M. S. Anvar, “Increased cellulose production by heterologous expression of bcsA and B genes from Gluconacetobacterxylinus in E. coli Nissle 1917,” Bioprocess Biosyst. Eng., vol. 42, no. 12, pp. 2023–2034, Dec. 2019, doi: 10.1007/S00449-019-02197-4.

[6] M. H. Ryu and M. Gomelsky, “Near-infrared light responsive synthetic c-di-GMP module for optogenetic applications,” ACS Synth. Biol., vol. 3, no. 11, pp. 802–810, Nov. 2014, doi: 10.1021/SB400182X.

[7] S. Denayer, S. Matthijs, and P. Cornelis, “Pyocin S2 (Sa) Kills Pseudomonas aeruginosa Strains via the FpvA Type I Ferripyoverdine Receptor,” J. Bacteriol., vol. 189, no. 21, p. 7663, Nov. 2007, doi: 10.1128/JB.00992-07.

[8] H.-X. Zhou, “Association and dissociation kinetics of colicin E3 and immunity protein 3: Convergence of theory and experiment,” Protein Sci., vol. 12, no. 10, p. 2379, Jan. 2003, doi: 10.1110/PS.03216203.

[9] R. Ohlendorf, R. R. Vidavski, A. Eldar, K. Moffat, and A. Möglich, “From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression,” J. Mol. Biol., vol. 416, no. 4, pp. 534–542, Mar. 2012, doi: 10.1016/J.JMB.2012.01.001.

Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin

2022-03-27T11:36:29Z

NinaV: /* c-di-GMP signalizacija in produkcija BC filma ([BBa_K3740030http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740030 BBa_K3740030]) */

Projekt »Kissed by Light« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 in bil nagrajen s prvim mestom v kategoriji zdravljenje. Zasnovala ga je skupina SZTP-CHINA, ki je želela narediti efektiven terapevtik, ki bi poškodovanim z opeklinami omogočal manj boleče okrevanje in preprečeval bakterijske okužbe [1]. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA iGEM:SZPT-CHINA]

== Uvod ==
Opekline predstavljajo globalen zdravstveni problem, pri čemer, po poročanju Svetovne zdravstvene organizacije, zaradi njih umre 180 000 ljudi na leto [2]. Ob opeklini pride do poškodbe kože – organa, ki nas ščiti pred okužbami, zato je eden glavnih ciljev oskrbe opeklin preprečevanje in zdravljenje bakterijskih okužb. Pri oskrbi poškodovancev v bolnišničnem okolju so najbolj pogoste okužbe z bakterijo Pseudomonas aeruginosa. Izbor antibiotične terapije pri tej bakteriji je zapleten, saj je rezistentna na mnoge antibiotike, poleg tega pa lahko antibiotiki negativno vplivajo na mikrobiom kože, kar poškoduje okoliške kožne celice [1], [3].
Poleg antimikrobne terapije pa je pri oskrbi pomemba tudi pravilna obložitev ran. To varuje površino opekline in jo ščiti pred vdorom tujih mikroorganizmov. Prav tako pomaga pri ohranjanju vlažnega okolja. Problem komercialnih materialov, ki se uporabljajo v ta namen npr. bombažne gaze, je, da se ti velikokrat primejo na rano in ob odstranitvi povzročijo sekundarne poškodbe [1].

== Cilj projekta Kissed by light ==
Uporabo antibiotikov so želeli so zamenjati s specifičnim antipseudomonalnim proteinom. Potencial so videli tudi v uporabi bakterijske celuloze (BC), ki ima visoko mehansko moč in dobro zadržuje vodo, hkrati pa se zaradi svoje biokompatibilnosti ne prijema na rane [4]. V projektu so združili obe ideji, tako da bi omogočili boljši nadzor nad okužbo in spodbudili zdravljenje opekline.
Kot produkt so si zamislil gensko spremenjen živ bakterijski terapevtik. Za šasijo so izbrali Gluconacetobacteri hansenii ATCC 53582, ki sama proizvaja bakterijsko celulozo. To so gensko spremenili tako, da lahko kontinuirano proizvaja antipseudomonalne proteine. Hkrati souporabili optogenetiko (tehniko, ki omogoča nadzor bakterij s svetlobo). Tako so bakterije spremenili na tak način, da proizvajajo BC le, ko je to potrebno. S tem so zmanjšali metabolno breme in hitrost mutacij [1].
Pričakovali so, da v temi G. hansenii ne bo proizvedel skoraj nič BC, pod skoraj infrardečo svetlobo (NIR) bo začel proizvajati BC in pod modro svetlobo bodo bakterije lizirale in sprostile antipseudomonalni protein [1].

== Načrt ==
Načrt projekta ima tri module: proizvodnja antipseudomonalnega proteina, prenos signala c-di-GMP in proizvodnja BC, varnost in sproščanje zdravila. Pred začetkom eksperimentov so pripravili model, ki opiše potek signaliziranja z c-di-GMP [1].

=== Računalniško modeliranje ===
V G. hansenii produkcija BC poteka pod nadzorom sekundarnega sporočevalca cikličnega digvanidil monofosfata (c-di-GMP)[5]. BphS je digvanilat ciklaza, ki se aktivira s svetlobo in regulira sintezo c-di-GMP. Pod NIR svetlobo bo BphS spremenil konformacijo in se aktiviral ter začel sintetizirati c-di-GMP[6]. FcsR je c-di-GMP fosfodiesteraza, ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Kadar je hitrost nastajanja c-di-GMP večja kot njegova hidroliza, bo njegova koncentracija v celici naraščala in bakterije bodo proizvajale BC [1].
Za opis dogajanja so uporabili 6 reakcij in na njihovi osnovi oblikovali 5 enačb, ki so bile uporabljene za matematični model.
Model je napovedal, da ima osvetljevanje z NIR svetlobo signifikanten učinek na sintezo c-di-GMP, pri čemer je brez osvetljevanja koncentracija c-di-GMP skoraj nič [1].

=== Uvodni eksperimenti ===
Pred izvedbo zadanih modulov so določili optimalen medij za nadaljnje eksperimente z G. hansenii, pri čemer sta se za rast te bakterije najbolje izkazala SOC in HS. V obeh medijih so kvantificirali produkcijo BC, za kar so uporabili tekočo kulturo J23100-mcherry-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 v različnih volumnih obeh medijev in ugotovili, da je najbolj optimalen medij za zadano nalogo HS [1].

=== Proizvodnja pseudomonalnega proteina([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740050 BBa_K3740050]) ===
==== Načrt ====
Piocin S2 je topen protein, ki ga proizvajajo bakterije Pseudomonas aeruginosa in lahko ubije ne imune P. aeruginosa bakterije. Imunost nekaterim sevom omogoča protein IMMS2, ki se specifično veže na nukleazno domeno piocina S2 in tako inhibira njegovo aktivnost [7]. Da bi pridobili protein, ki bi lahko ubil širši spekter P. aeruginosa, so nukleazno domeno piocina S2 zamenjali z nukleazno domeno kolicina E3 in himerni protein poimenovali SE. Protein, ki omogoča imunost IMME3, je izpeljan iz imunskega proteina, ki ustreza kolicinu E3 [1], [8].
Protein SE ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740057 BBa_K3740057]) prepozna tarče preko Pseudomonas-specifičnega receptorja in translokazne domene, celice pa ubije preko nukleazne domene iz kolicina E. Poleg tega protein SE vsebuje tudi neidentificirano funkcionalno domeno piocina 2. Gostiteljske celice G. hansenii so na SE odporne, saj izražajo imunski protein IMME3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740034 BBa_K3740034]) [1].
Normalno izražanje proteina SE ter nemoteno rast gostiteljskih celic so zagotovili tako, da so protein SE in imunski protein IMME3 izražali pod različnimi promotorji in RBSji. SE se je izražal pod promotorjem pR in RBS300, IMME3 pa pod promotorjem J23118 in RBSII [1].
==== Izvedba ====
Protein SE in protein S2 so najprej izrazili v bakterijah E. coli BL21. Za to so pripravili plazmide SE-PET28A IN S2-PET28A in izražanje inducirali z IPTG. Na NaDS-PAGE gel so nanesli surov proteinski ekstrakt in potrdili prisotnost obeh proteinov. S tem so potrdili, da je plazmidni konstrukt primeren za izražanje fuzijskega proteina. Raztopino obeh proteinov in PBS (kontrola) so dodali kulturam Pseudomonas aeruginosa PAO1, P. aeruginosa PAO1 Δ1150-1151 in E. coli MG1655. Pokazali so, da lahko protein SE inhibira rast P. aeruginosa ne glede na prisotnost regije PA1150-1151, medtem ko lahko S2 inhibira le mutanto PAO1 Δ1150-1151. Noben protein ni vplival na rast E. coli [1].
Sledila je optimizacija RBS. Plazmidne konstrukte, ki so jih pripravili v E .coli, so nato prenesli v G. hansenii ATCC 53582, kjer so izvedli izražanje. Nato so kapljico raztopine s proteinom SE nanesli na FAB ploščo, na katero so bile enakomerno nanešene PAO1. Določili so, da je sev pR-RBS300-SE-B1006-J23118-RBSII-IMM-rrnB T1-pSEVA331-G. hansenii ATCC najboljši, saj je imel največjo cono inhibicije [1].

=== c-di-GMP signalizacija in produkcija BC filma ([BBa_K3740030http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740030 BBa_K3740030]) ===
Ker je proizvodnja BC v G. hansenii regulirana s koncentracijo c-di-GMP [6], lahko nastanjanje BC posredno reguliramo z reguliranjem koncentracije c-di-GMP. Za natančno regulacijo so uvedli 2 podmodula. Prvi je digvanilat ciklazni (DGC) modul, ki regulira sintezo c-di-GMP, drugi pa c-di-GMP fosfodiesterazni (PDE), ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Uporabili so bphS ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740019 BBa_K3740019]) – kodirajoči gen za DGC, ki je aktivirana s svetlobo (BphS) in fcsR ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740022 BBa_K3740022]) – dele kodirajočih genov c-di-GMP PDE iz različnih bakterij in ju pripravili za konstrukcijo plazmidov, ki so bili klonirani v E. coli in nato preneseni v G. hansenii ATCC53582. Pokazali so, da ima J23109-fcsR-pSEVA331 hidrolizno funkcijo in da J23100-bphS-bphO-pSEVA331 ob osvetljevanju z NIR proizvedejo več BC kot v temi. Optimizirali so tudi promotorske regije in glede na količino BC določili najbolj primeren promotor. Odločili so se za konstrukt J23100-B0034-bphS-pET RBS-bphO-rrnB T1-J23109-B0034-fcsR-rrnB T1, pri katerem pride do signifikantne razlike med izkoristkom BC pri osvetljevanju in v temi [1].

=== Varnost in sproščanje zdravila ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740044 BBa_K3740044]) ===
V modulu so zasnovali foto-induciran sistem za lizo. Gre za varnostni modul, ki lahko mehanistično zmanjša posledice sprostitve gensko spremenjenih bakterij v okolje. Hkrati pa nadzira sprostitev antipseudomonalnega proteina SE [1].
Uporabili so sistem pDawn, ki je odziven na modro svetlobo. Ob osvetljevanju dvokomponentni sistem YF1/FixJ v pDawn zavre izražanje represorja cI iz faga λ, kar omogoča da je izražanje »downstream« genov aktivirano s svetlobo [1], [9].
Delovanje promotorja pDawn so testirali s plazmidom pDawn-RFP-pSEVA331, ki so ga vnesli v G. hansenii ATCC53582 in prvo skupino bakterij gojili pod modro lučjo, drugo pa v temi. Pri prvi skupini se je izražal RFP pri drugi skupini pa ne [1].
Promotor pDawn so nato uporabili za izražanje različnih litičnih genov, med drugim S105 (Lambda litična kaseta brez antiholina), X174 (litični gen, ki kodira litični protein iz Escherichia faga PhiX174) in LKD16 (litična kaseta). Pripravljene plazmide so najprej testirali v E. coli, nato pa jih prenesli v G. hansenii. Sev pDawn-X174 E-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 (vsebuje X174 E – Bba_K2656015) je stabilno liziral pod modro lučjo [1].
== Izboljšave ==
Za povzročitev lize so pogosto uporabljeni inducibilni promotorji. V takem primeru se vseeno lahko izraža majhen delež proteina, kar z akumulacijo litičnega proteina privede do avtolize. Da bi dobili bolj stabilno proizvodnjo litičnega proteina, so izvedli mutagenezo z naključnimi oligonukleotidi na RBS (BBa_B0034). S tem so dobili kolonije, ki so pod modro svetlobo lizirale. Poleg tega so potrdili, da so vnesene mutacije povečale sintezo proteinov s tem RBS [1].
Prihodnje izboljšave bodo vključevale spremembe vezja za produkcijo BC, saj želijo zmanjšati izražanje BC v temi [1].

== Končni produkt ==
Kot končni produkt so si zamislili živ bioterapevtik v obliki bakterijske emulzije in liofilizirane bakterije. Dve obliki produkta potrebujeta drugačne pogoje shranjevanja in imata različen rok uporabe in tako služita različnim potrebam uporabnikov [1].

== Viri ==
[1] “Team:SZPT-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA. [Accessed: 27-Mar-2022].
[2] WHO, “Burns,” 2018. [Online]. Available: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/burns. [Accessed: 27-Mar-2022].
[3] P. Bielecki, J. Glik, M. Kawecki, and V. A. P. Martins Dos Santos, “Towards understanding Pseudomonas aeruginosa burn wound infections by profiling gene expression,” Biotechnol. Lett., vol. 30, no. 5, pp. 777–790, May 2008, doi: 10.1007/S10529-007-9620-2.
[4] L. Fu et al., “Skin tissue repair materials from bacterial cellulose by a multilayer fermentation method,” J. Mater. Chem., vol. 22, no. 24, pp. 12349–12357, May 2012, doi: 10.1039/C2JM00134A.
[5] E. Sajadi, S. S. A. Fatemi, V. Babaeipour, A. A. Deldar, B. Yakhchali, and M. S. Anvar, “Increased cellulose production by heterologous expression of bcsA and B genes from Gluconacetobacterxylinus in E. coli Nissle 1917,” Bioprocess Biosyst. Eng., vol. 42, no. 12, pp. 2023–2034, Dec. 2019, doi: 10.1007/S00449-019-02197-4.
[6] M. H. Ryu and M. Gomelsky, “Near-infrared light responsive synthetic c-di-GMP module for optogenetic applications,” ACS Synth. Biol., vol. 3, no. 11, pp. 802–810, Nov. 2014, doi: 10.1021/SB400182X.
[7] S. Denayer, S. Matthijs, and P. Cornelis, “Pyocin S2 (Sa) Kills Pseudomonas aeruginosa Strains via the FpvA Type I Ferripyoverdine Receptor,” J. Bacteriol., vol. 189, no. 21, p. 7663, Nov. 2007, doi: 10.1128/JB.00992-07.
[8] H.-X. Zhou, “Association and dissociation kinetics of colicin E3 and immunity protein 3: Convergence of theory and experiment,” Protein Sci., vol. 12, no. 10, p. 2379, Jan. 2003, doi: 10.1110/PS.03216203.
[9] R. Ohlendorf, R. R. Vidavski, A. Eldar, K. Moffat, and A. Möglich, “From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression,” J. Mol. Biol., vol. 416, no. 4, pp. 534–542, Mar. 2012, doi: 10.1016/J.JMB.2012.01.001.

Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin

2022-03-27T11:35:45Z

NinaV:

Projekt »Kissed by Light« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 in bil nagrajen s prvim mestom v kategoriji zdravljenje. Zasnovala ga je skupina SZTP-CHINA, ki je želela narediti efektiven terapevtik, ki bi poškodovanim z opeklinami omogočal manj boleče okrevanje in preprečeval bakterijske okužbe [1]. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA iGEM:SZPT-CHINA]

== Uvod ==
Opekline predstavljajo globalen zdravstveni problem, pri čemer, po poročanju Svetovne zdravstvene organizacije, zaradi njih umre 180 000 ljudi na leto [2]. Ob opeklini pride do poškodbe kože – organa, ki nas ščiti pred okužbami, zato je eden glavnih ciljev oskrbe opeklin preprečevanje in zdravljenje bakterijskih okužb. Pri oskrbi poškodovancev v bolnišničnem okolju so najbolj pogoste okužbe z bakterijo Pseudomonas aeruginosa. Izbor antibiotične terapije pri tej bakteriji je zapleten, saj je rezistentna na mnoge antibiotike, poleg tega pa lahko antibiotiki negativno vplivajo na mikrobiom kože, kar poškoduje okoliške kožne celice [1], [3].
Poleg antimikrobne terapije pa je pri oskrbi pomemba tudi pravilna obložitev ran. To varuje površino opekline in jo ščiti pred vdorom tujih mikroorganizmov. Prav tako pomaga pri ohranjanju vlažnega okolja. Problem komercialnih materialov, ki se uporabljajo v ta namen npr. bombažne gaze, je, da se ti velikokrat primejo na rano in ob odstranitvi povzročijo sekundarne poškodbe [1].

== Cilj projekta Kissed by light ==
Uporabo antibiotikov so želeli so zamenjati s specifičnim antipseudomonalnim proteinom. Potencial so videli tudi v uporabi bakterijske celuloze (BC), ki ima visoko mehansko moč in dobro zadržuje vodo, hkrati pa se zaradi svoje biokompatibilnosti ne prijema na rane [4]. V projektu so združili obe ideji, tako da bi omogočili boljši nadzor nad okužbo in spodbudili zdravljenje opekline.
Kot produkt so si zamislil gensko spremenjen živ bakterijski terapevtik. Za šasijo so izbrali Gluconacetobacteri hansenii ATCC 53582, ki sama proizvaja bakterijsko celulozo. To so gensko spremenili tako, da lahko kontinuirano proizvaja antipseudomonalne proteine. Hkrati souporabili optogenetiko (tehniko, ki omogoča nadzor bakterij s svetlobo). Tako so bakterije spremenili na tak način, da proizvajajo BC le, ko je to potrebno. S tem so zmanjšali metabolno breme in hitrost mutacij [1].
Pričakovali so, da v temi G. hansenii ne bo proizvedel skoraj nič BC, pod skoraj infrardečo svetlobo (NIR) bo začel proizvajati BC in pod modro svetlobo bodo bakterije lizirale in sprostile antipseudomonalni protein [1].

== Načrt ==
Načrt projekta ima tri module: proizvodnja antipseudomonalnega proteina, prenos signala c-di-GMP in proizvodnja BC, varnost in sproščanje zdravila. Pred začetkom eksperimentov so pripravili model, ki opiše potek signaliziranja z c-di-GMP [1].

=== Računalniško modeliranje ===
V G. hansenii produkcija BC poteka pod nadzorom sekundarnega sporočevalca cikličnega digvanidil monofosfata (c-di-GMP)[5]. BphS je digvanilat ciklaza, ki se aktivira s svetlobo in regulira sintezo c-di-GMP. Pod NIR svetlobo bo BphS spremenil konformacijo in se aktiviral ter začel sintetizirati c-di-GMP[6]. FcsR je c-di-GMP fosfodiesteraza, ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Kadar je hitrost nastajanja c-di-GMP večja kot njegova hidroliza, bo njegova koncentracija v celici naraščala in bakterije bodo proizvajale BC [1].
Za opis dogajanja so uporabili 6 reakcij in na njihovi osnovi oblikovali 5 enačb, ki so bile uporabljene za matematični model.
Model je napovedal, da ima osvetljevanje z NIR svetlobo signifikanten učinek na sintezo c-di-GMP, pri čemer je brez osvetljevanja koncentracija c-di-GMP skoraj nič [1].

=== Uvodni eksperimenti ===
Pred izvedbo zadanih modulov so določili optimalen medij za nadaljnje eksperimente z G. hansenii, pri čemer sta se za rast te bakterije najbolje izkazala SOC in HS. V obeh medijih so kvantificirali produkcijo BC, za kar so uporabili tekočo kulturo J23100-mcherry-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 v različnih volumnih obeh medijev in ugotovili, da je najbolj optimalen medij za zadano nalogo HS [1].

=== Proizvodnja pseudomonalnega proteina([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740050 BBa_K3740050]) ===
==== Načrt ====
Piocin S2 je topen protein, ki ga proizvajajo bakterije Pseudomonas aeruginosa in lahko ubije ne imune P. aeruginosa bakterije. Imunost nekaterim sevom omogoča protein IMMS2, ki se specifično veže na nukleazno domeno piocina S2 in tako inhibira njegovo aktivnost [7]. Da bi pridobili protein, ki bi lahko ubil širši spekter P. aeruginosa, so nukleazno domeno piocina S2 zamenjali z nukleazno domeno kolicina E3 in himerni protein poimenovali SE. Protein, ki omogoča imunost IMME3, je izpeljan iz imunskega proteina, ki ustreza kolicinu E3 [1], [8].
Protein SE ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740057 BBa_K3740057]) prepozna tarče preko Pseudomonas-specifičnega receptorja in translokazne domene, celice pa ubije preko nukleazne domene iz kolicina E. Poleg tega protein SE vsebuje tudi neidentificirano funkcionalno domeno piocina 2. Gostiteljske celice G. hansenii so na SE odporne, saj izražajo imunski protein IMME3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740034 BBa_K3740034]) [1].
Normalno izražanje proteina SE ter nemoteno rast gostiteljskih celic so zagotovili tako, da so protein SE in imunski protein IMME3 izražali pod različnimi promotorji in RBSji. SE se je izražal pod promotorjem pR in RBS300, IMME3 pa pod promotorjem J23118 in RBSII [1].
==== Izvedba ====
Protein SE in protein S2 so najprej izrazili v bakterijah E. coli BL21. Za to so pripravili plazmide SE-PET28A IN S2-PET28A in izražanje inducirali z IPTG. Na NaDS-PAGE gel so nanesli surov proteinski ekstrakt in potrdili prisotnost obeh proteinov. S tem so potrdili, da je plazmidni konstrukt primeren za izražanje fuzijskega proteina. Raztopino obeh proteinov in PBS (kontrola) so dodali kulturam Pseudomonas aeruginosa PAO1, P. aeruginosa PAO1 Δ1150-1151 in E. coli MG1655. Pokazali so, da lahko protein SE inhibira rast P. aeruginosa ne glede na prisotnost regije PA1150-1151, medtem ko lahko S2 inhibira le mutanto PAO1 Δ1150-1151. Noben protein ni vplival na rast E. coli [1].
Sledila je optimizacija RBS. Plazmidne konstrukte, ki so jih pripravili v E .coli, so nato prenesli v G. hansenii ATCC 53582, kjer so izvedli izražanje. Nato so kapljico raztopine s proteinom SE nanesli na FAB ploščo, na katero so bile enakomerno nanešene PAO1. Določili so, da je sev pR-RBS300-SE-B1006-J23118-RBSII-IMM-rrnB T1-pSEVA331-G. hansenii ATCC najboljši, saj je imel največjo cono inhibicije [1].

=== c-di-GMP signalizacija in produkcija BC filma ([BBa_K3740030http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740030 BBa_K3740030]) ===
Ker je proizvodnja BC v G. hansenii regulirana s koncentracijo c-di-GMP [6], lahko nastanjanje BC posredno reguliramo z reguliranjem koncentracije c-di-GMP. Za natančno regulacijo so uvedli 2 podmodula. Prvi je digvanilat ciklazni (DGC) modul, ki regulira sintezo c-di-GMP, drugi pa c-di-GMP fosfodiesterazni (PDE), ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Uporabili so bphS (http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740019 BBa_K3740019) – kodirajoči gen za DGC, ki je aktivirana s svetlobo (BphS) in fcsR (http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740022 BBa_K3740022) – dele kodirajočih genov c-di-GMP PDE iz različnih bakterij in ju pripravili za konstrukcijo plazmidov, ki so bili klonirani v E. coli in nato preneseni v G. hansenii ATCC53582. Pokazali so, da ima J23109-fcsR-pSEVA331 hidrolizno funkcijo in da J23100-bphS-bphO-pSEVA331 ob osvetljevanju z NIR proizvedejo več BC kot v temi. Optimizirali so tudi promotorske regije in glede na količino BC določili najbolj primeren promotor. Odločili so se za konstrukt J23100-B0034-bphS-pET RBS-bphO-rrnB T1-J23109-B0034-fcsR-rrnB T1, pri katerem pride do signifikantne razlike med izkoristkom BC pri osvetljevanju in v temi [1].

=== Varnost in sproščanje zdravila ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740044 BBa_K3740044]) ===
V modulu so zasnovali foto-induciran sistem za lizo. Gre za varnostni modul, ki lahko mehanistično zmanjša posledice sprostitve gensko spremenjenih bakterij v okolje. Hkrati pa nadzira sprostitev antipseudomonalnega proteina SE [1].
Uporabili so sistem pDawn, ki je odziven na modro svetlobo. Ob osvetljevanju dvokomponentni sistem YF1/FixJ v pDawn zavre izražanje represorja cI iz faga λ, kar omogoča da je izražanje »downstream« genov aktivirano s svetlobo [1], [9].
Delovanje promotorja pDawn so testirali s plazmidom pDawn-RFP-pSEVA331, ki so ga vnesli v G. hansenii ATCC53582 in prvo skupino bakterij gojili pod modro lučjo, drugo pa v temi. Pri prvi skupini se je izražal RFP pri drugi skupini pa ne [1].
Promotor pDawn so nato uporabili za izražanje različnih litičnih genov, med drugim S105 (Lambda litična kaseta brez antiholina), X174 (litični gen, ki kodira litični protein iz Escherichia faga PhiX174) in LKD16 (litična kaseta). Pripravljene plazmide so najprej testirali v E. coli, nato pa jih prenesli v G. hansenii. Sev pDawn-X174 E-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 (vsebuje X174 E – Bba_K2656015) je stabilno liziral pod modro lučjo [1].
== Izboljšave ==
Za povzročitev lize so pogosto uporabljeni inducibilni promotorji. V takem primeru se vseeno lahko izraža majhen delež proteina, kar z akumulacijo litičnega proteina privede do avtolize. Da bi dobili bolj stabilno proizvodnjo litičnega proteina, so izvedli mutagenezo z naključnimi oligonukleotidi na RBS (BBa_B0034). S tem so dobili kolonije, ki so pod modro svetlobo lizirale. Poleg tega so potrdili, da so vnesene mutacije povečale sintezo proteinov s tem RBS [1].
Prihodnje izboljšave bodo vključevale spremembe vezja za produkcijo BC, saj želijo zmanjšati izražanje BC v temi [1].

== Končni produkt ==
Kot končni produkt so si zamislili živ bioterapevtik v obliki bakterijske emulzije in liofilizirane bakterije. Dve obliki produkta potrebujeta drugačne pogoje shranjevanja in imata različen rok uporabe in tako služita različnim potrebam uporabnikov [1].

== Viri ==
[1] “Team:SZPT-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA. [Accessed: 27-Mar-2022].
[2] WHO, “Burns,” 2018. [Online]. Available: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/burns. [Accessed: 27-Mar-2022].
[3] P. Bielecki, J. Glik, M. Kawecki, and V. A. P. Martins Dos Santos, “Towards understanding Pseudomonas aeruginosa burn wound infections by profiling gene expression,” Biotechnol. Lett., vol. 30, no. 5, pp. 777–790, May 2008, doi: 10.1007/S10529-007-9620-2.
[4] L. Fu et al., “Skin tissue repair materials from bacterial cellulose by a multilayer fermentation method,” J. Mater. Chem., vol. 22, no. 24, pp. 12349–12357, May 2012, doi: 10.1039/C2JM00134A.
[5] E. Sajadi, S. S. A. Fatemi, V. Babaeipour, A. A. Deldar, B. Yakhchali, and M. S. Anvar, “Increased cellulose production by heterologous expression of bcsA and B genes from Gluconacetobacterxylinus in E. coli Nissle 1917,” Bioprocess Biosyst. Eng., vol. 42, no. 12, pp. 2023–2034, Dec. 2019, doi: 10.1007/S00449-019-02197-4.
[6] M. H. Ryu and M. Gomelsky, “Near-infrared light responsive synthetic c-di-GMP module for optogenetic applications,” ACS Synth. Biol., vol. 3, no. 11, pp. 802–810, Nov. 2014, doi: 10.1021/SB400182X.
[7] S. Denayer, S. Matthijs, and P. Cornelis, “Pyocin S2 (Sa) Kills Pseudomonas aeruginosa Strains via the FpvA Type I Ferripyoverdine Receptor,” J. Bacteriol., vol. 189, no. 21, p. 7663, Nov. 2007, doi: 10.1128/JB.00992-07.
[8] H.-X. Zhou, “Association and dissociation kinetics of colicin E3 and immunity protein 3: Convergence of theory and experiment,” Protein Sci., vol. 12, no. 10, p. 2379, Jan. 2003, doi: 10.1110/PS.03216203.
[9] R. Ohlendorf, R. R. Vidavski, A. Eldar, K. Moffat, and A. Möglich, “From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression,” J. Mol. Biol., vol. 416, no. 4, pp. 534–542, Mar. 2012, doi: 10.1016/J.JMB.2012.01.001.

Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin

2022-03-27T11:32:06Z

NinaV:

Projekt »Kissed by Light« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 in bil nagrajen s prvim mestom v kategoriji zdravljenje. Zasnovala ga je skupina SZTP-CHINA, ki je želela narediti efektiven terapevtik, ki bi poškodovanim z opeklinami omogočal manj boleče okrevanje in preprečeval bakterijske okužbe [1]. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA iGEM:SZPT-CHINA]

= Uvod =
Opekline predstavljajo globalen zdravstveni problem, pri čemer, po poročanju Svetovne zdravstvene organizacije, zaradi njih umre 180 000 ljudi na leto [2]. Ob opeklini pride do poškodbe kože – organa, ki nas ščiti pred okužbami, zato je eden glavnih ciljev oskrbe opeklin preprečevanje in zdravljenje bakterijskih okužb. Pri oskrbi poškodovancev v bolnišničnem okolju so najbolj pogoste okužbe z bakterijo Pseudomonas aeruginosa. Izbor antibiotične terapije pri tej bakteriji je zapleten, saj je rezistentna na mnoge antibiotike, poleg tega pa lahko antibiotiki negativno vplivajo na mikrobiom kože, kar poškoduje okoliške kožne celice [1], [3].
Poleg antimikrobne terapije pa je pri oskrbi pomemba tudi pravilna obložitev ran. To varuje površino opekline in jo ščiti pred vdorom tujih mikroorganizmov. Prav tako pomaga pri ohranjanju vlažnega okolja. Problem komercialnih materialov, ki se uporabljajo v ta namen npr. bombažne gaze, je, da se ti velikokrat primejo na rano in ob odstranitvi povzročijo sekundarne poškodbe [1].

= Cilj projekta Kissed by light =
Uporabo antibiotikov so želeli so zamenjati s specifičnim antipseudomonalnim proteinom. Potencial so videli tudi v uporabi bakterijske celuloze (BC), ki ima visoko mehansko moč in dobro zadržuje vodo, hkrati pa se zaradi svoje biokompatibilnosti ne prijema na rane [4]. V projektu so združili obe ideji, tako da bi omogočili boljši nadzor nad okužbo in spodbudili zdravljenje opekline.
Kot produkt so si zamislil gensko spremenjen živ bakterijski terapevtik. Za šasijo so izbrali Gluconacetobacteri hansenii ATCC 53582, ki sama proizvaja bakterijsko celulozo. To so gensko spremenili tako, da lahko kontinuirano proizvaja antipseudomonalne proteine. Hkrati souporabili optogenetiko (tehniko, ki omogoča nadzor bakterij s svetlobo). Tako so bakterije spremenili na tak način, da proizvajajo BC le, ko je to potrebno. S tem so zmanjšali metabolno breme in hitrost mutacij [1].
Pričakovali so, da v temi G. hansenii ne bo proizvedel skoraj nič BC, pod skoraj infrardečo svetlobo (NIR) bo začel proizvajati BC in pod modro svetlobo bodo bakterije lizirale in sprostile antipseudomonalni protein [1].

= Načrt =
Načrt projekta ima tri module: proizvodnja antipseudomonalnega proteina, prenos signala c-di-GMP in proizvodnja BC, varnost in sproščanje zdravila. Pred začetkom eksperimentov so pripravili model, ki opiše potek signaliziranja z c-di-GMP [1].

== Računalniško modeliranje ==
V G. hansenii produkcija BC poteka pod nadzorom sekundarnega sporočevalca cikličnega digvanidil monofosfata (c-di-GMP)[5]. BphS je digvanilat ciklaza, ki se aktivira s svetlobo in regulira sintezo c-di-GMP. Pod NIR svetlobo bo BphS spremenil konformacijo in se aktiviral ter začel sintetizirati c-di-GMP[6]. FcsR je c-di-GMP fosfodiesteraza, ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Kadar je hitrost nastajanja c-di-GMP večja kot njegova hidroliza, bo njegova koncentracija v celici naraščala in bakterije bodo proizvajale BC [1].
Za opis dogajanja so uporabili 6 reakcij in na njihovi osnovi oblikovali 5 enačb, ki so bile uporabljene za matematični model.
Model je napovedal, da ima osvetljevanje z NIR svetlobo signifikanten učinek na sintezo c-di-GMP, pri čemer je brez osvetljevanja koncentracija c-di-GMP skoraj nič [1].

== Uvodni eksperimenti ==
Pred izvedbo zadanih modulov so določili optimalen medij za nadaljnje eksperimente z G. hansenii, pri čemer sta se za rast te bakterije najbolje izkazala SOC in HS. V obeh medijih so kvantificirali produkcijo BC, za kar so uporabili tekočo kulturo J23100-mcherry-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 v različnih volumnih obeh medijev in ugotovili, da je najbolj optimalen medij za zadano nalogo HS [1].

== Proizvodnja pseudomonalnega proteina([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740050 BBa_K3740050]) ==
=== Načrt===
Piocin S2 je topen protein, ki ga proizvajajo bakterije Pseudomonas aeruginosa in lahko ubije ne imune P. aeruginosa bakterije. Imunost nekaterim sevom omogoča protein IMMS2, ki se specifično veže na nukleazno domeno piocina S2 in tako inhibira njegovo aktivnost [7]. Da bi pridobili protein, ki bi lahko ubil širši spekter P. aeruginosa, so nukleazno domeno piocina S2 zamenjali z nukleazno domeno kolicina E3 in himerni protein poimenovali SE. Protein, ki omogoča imunost IMME3, je izpeljan iz imunskega proteina, ki ustreza kolicinu E3 [1], [8].
Protein SE ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740057 BBa_K3740057]) prepozna tarče preko Pseudomonas-specifičnega receptorja in translokazne domene, celice pa ubije preko nukleazne domene iz kolicina E. Poleg tega protein SE vsebuje tudi neidentificirano funkcionalno domeno piocina 2. Gostiteljske celice G. hansenii so na SE odporne, saj izražajo imunski protein IMME3 ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740034 BBa_K3740034]) [1].
Normalno izražanje proteina SE ter nemoteno rast gostiteljskih celic so zagotovili tako, da so protein SE in imunski protein IMME3 izražali pod različnimi promotorji in RBSji. SE se je izražal pod promotorjem pR in RBS300, IMME3 pa pod promotorjem J23118 in RBSII [1].
=== Izvedba ===
Protein SEE in protein S2 so najprej izrazili v bakterijah E. coli BL21. Za to so pripravili plazmide SE-PET28A IN S2-PET28A in izražanje inducirali z IPTG. Na NaDS-PAGE gel so nanesli surov proteinski ekstrakt in potrdili prisotnost obeh proteinov. S tem so potrdili, da je plazmidni konstrukt primeren za izražanje fuzijskega proteina. Raztopino obeh proteinov in PBS (kontrola) so dodali kulturam Pseudomonas aeruginosa PAO1, P. aeruginosa PAO1 Δ1150-1151 in E. coli MG1655. Pokazali so, da lahko protein SE inhibira rast P. aeruginosa ne glede na prisotnost regije PA1150-1151, medtem ko lahko S2 inhibira le mutanto PAO1 Δ1150-1151. Noben protein ni vplival na rast E. coli [1].
Sledila je optimizacija RBS. Plazmidne konstrukte, ki so jih pripravili v E .coli, so nato prenesli v G. hansenii ATCC 53582, kjer so izvedli izražanje. Nato so kapljico raztopine s proteinom SE nanesli na FAB ploščo, na katero so bile enakomerno nanešene PAO1. Določili so, da je sev pR-RBS300-SE-B1006-J23118-RBSII-IMM-rrnB T1-pSEVA331-G. hansenii ATCC najboljši, saj je imel največjo cono inhibicije [1].

== c-di-GMP signalizacija in produkcija BC filma ([BBa_K3740030http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740030 BBa_K3740030]) ==
Ker je proizvodnja BC v G. hansenii regulirana s koncentracijo c-di-GMP [6], lahko nastanjanje BC posredno reguliramo z reguliranjem koncentracije c-di-GMP. Za natančno regulacijo so uvedli 2 podmodula. Prvi je digvanilat ciklazni (DGC) modul, ki regulira sintezo c-di-GMP, drugi pa c-di-GMP fosfodiesterazni (PDE), ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Uporabili so bphS (BBa_K3740019) – kodirajoči gen za DGC, ki je aktivirana s svetlobo (BphS) in fcsR (BBa_K3740022) – dele kodirajočih genov c-di-GMP PDE iz različnih bakterij in ju pripravili za konstrukcijo plazmidov, ki so bili klonirani v E. coli in nato preneseni v G. hansenii ATCC53582. Pokazali so, da ima J23109-fcsR-pSEVA331 hidrolizno funkcijo in da J23100-bphS-bphO-pSEVA331 ob osvetljevanju z NIR proizvedejo več BC kot v temi. Optimizirali so tudi promotorske regije in glede na količino BC določili najbolj primeren promotor. Odločili so se za konstrukt J23100-B0034-bphS-pET RBS-bphO-rrnB T1-J23109-B0034-fcsR-rrnB T1, pri katerem pride do signifikantne razlike med izkoristkom BC pri osvetljevanju in v temi [1].

== Varnost in sproščanje zdravila ([http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740044 BBa_K3740044]) ==
V modulu so zasnovali foto-induciran sistem za lizo. Gre za varnostni modul, ki lahko mehanistično zmanjša posledice sprostitve gensko spremenjenih bakterij v okolje. Hkrati pa nadzira sprostitev antipseudomonalnega proteina SE [1].
Uporabili so sistem pDawn, ki je odziven na modro svetlobo. Ob osvetljevanju dvokomponentni sistem YF1/FixJ v pDawn zavre izražanje represorja cI iz faga λ, kar omogoča da je izražanje »downstream« genov aktivirano s svetlobo [1], [9].
Delovanje promotorja pDawn so testirali s plazmidom pDawn-RFP-pSEVA331, ki so ga vnesli v G. hansenii ATCC53582 in prvo skupino bakterij gojili pod modro lučjo, drugo pa v temi. Pri prvi skupini se je izražal RFP pri drugi skupini pa ne [1].
Promotor pDawn so nato uporabili za izražanje različnih litičnih genov, med drugim S105 (Lambda litična kaseta brez antiholina), X174 (litični gen, ki kodira litični protein iz Escherichia faga PhiX174) in LKD16 (litična kaseta). Pripravljene plazmide so najprej testirali v E. coli, nato pa jih prenesli v G. hansenii. Sev pDawn-X174 E-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 (vsebuje X174 E – Bba_K2656015) je stabilno liziral pod modro lučjo [1].
= Izboljšave =
Za povzročitev lize so pogosto uporabljeni inducibilni promotorji. V takem primeru se vseeno lahko izraža majhen delež proteina, kar z akumulacijo litičnega proteina privede do avtolize. Da bi dobili bolj stabilno proizvodnjo litičnega proteina, so izvedli mutagenezo z naključnimi oligonukleotidi na RBS (BBa_B0034). S tem so dobili kolonije, ki so pod modro svetlobo lizirale. Poleg tega so potrdili, da so vnesene mutacije povečale sintezo proteinov s tem RBS [1].
Prihodnje izboljšave bodo vključevale spremembe vezja za produkcijo BC, saj želijo zmanjšati izražanje BC v temi [1].

= Končni produkt =
Kot končni produkt so si zamislili živ bioterapevtik v obliki bakterijske emulzije in liofilizirane bakterije. Dve obliki produkta potrebujeta drugačne pogoje shranjevanja in imata različen rok uporabe in tako služita različnim potrebam uporabnikov [1].

= Viri=
[1] “Team:SZPT-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA. [Accessed: 27-Mar-2022].
[2] WHO, “Burns,” 2018. [Online]. Available: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/burns. [Accessed: 27-Mar-2022].
[3] P. Bielecki, J. Glik, M. Kawecki, and V. A. P. Martins Dos Santos, “Towards understanding Pseudomonas aeruginosa burn wound infections by profiling gene expression,” Biotechnol. Lett., vol. 30, no. 5, pp. 777–790, May 2008, doi: 10.1007/S10529-007-9620-2.
[4] L. Fu et al., “Skin tissue repair materials from bacterial cellulose by a multilayer fermentation method,” J. Mater. Chem., vol. 22, no. 24, pp. 12349–12357, May 2012, doi: 10.1039/C2JM00134A.
[5] E. Sajadi, S. S. A. Fatemi, V. Babaeipour, A. A. Deldar, B. Yakhchali, and M. S. Anvar, “Increased cellulose production by heterologous expression of bcsA and B genes from Gluconacetobacterxylinus in E. coli Nissle 1917,” Bioprocess Biosyst. Eng., vol. 42, no. 12, pp. 2023–2034, Dec. 2019, doi: 10.1007/S00449-019-02197-4.
[6] M. H. Ryu and M. Gomelsky, “Near-infrared light responsive synthetic c-di-GMP module for optogenetic applications,” ACS Synth. Biol., vol. 3, no. 11, pp. 802–810, Nov. 2014, doi: 10.1021/SB400182X.
[7] S. Denayer, S. Matthijs, and P. Cornelis, “Pyocin S2 (Sa) Kills Pseudomonas aeruginosa Strains via the FpvA Type I Ferripyoverdine Receptor,” J. Bacteriol., vol. 189, no. 21, p. 7663, Nov. 2007, doi: 10.1128/JB.00992-07.
[8] H.-X. Zhou, “Association and dissociation kinetics of colicin E3 and immunity protein 3: Convergence of theory and experiment,” Protein Sci., vol. 12, no. 10, p. 2379, Jan. 2003, doi: 10.1110/PS.03216203.
[9] R. Ohlendorf, R. R. Vidavski, A. Eldar, K. Moffat, and A. Möglich, “From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression,” J. Mol. Biol., vol. 416, no. 4, pp. 534–542, Mar. 2012, doi: 10.1016/J.JMB.2012.01.001.

Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin

2022-03-27T11:29:45Z

NinaV:

Projekt »Kissed by Light« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 in bil nagrajen s prvim mestom v kategoriji zdravljenje. Zasnovala ga je skupina SZTP-CHINA, ki je želela narediti efektiven terapevtik, ki bi poškodovanim z opeklinami omogočal manj boleče okrevanje in preprečeval bakterijske okužbe [1]. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA iGEM:SZPT-CHINA]

= Uvod =
Opekline predstavljajo globalen zdravstveni problem, pri čemer, po poročanju Svetovne zdravstvene organizacije, zaradi njih umre 180 000 ljudi na leto [2]. Ob opeklini pride do poškodbe kože – organa, ki nas ščiti pred okužbami, zato je eden glavnih ciljev oskrbe opeklin preprečevanje in zdravljenje bakterijskih okužb. Pri oskrbi poškodovancev v bolnišničnem okolju so najbolj pogoste okužbe z bakterijo Pseudomonas aeruginosa. Izbor antibiotične terapije pri tej bakteriji je zapleten, saj je rezistentna na mnoge antibiotike, poleg tega pa lahko antibiotiki negativno vplivajo na mikrobiom kože, kar poškoduje okoliške kožne celice [1], [3].
Poleg antimikrobne terapije pa je pri oskrbi pomemba tudi pravilna obložitev ran. To varuje površino opekline in jo ščiti pred vdorom tujih mikroorganizmov. Prav tako pomaga pri ohranjanju vlažnega okolja. Problem komercialnih materialov, ki se uporabljajo v ta namen npr. bombažne gaze, je, da se ti velikokrat primejo na rano in ob odstranitvi povzročijo sekundarne poškodbe [1].

= Cilj projekta Kissed by light =
Uporabo antibiotikov so želeli so zamenjati s specifičnim antipseudomonalnim proteinom. Potencial so videli tudi v uporabi bakterijske celuloze (BC), ki ima visoko mehansko moč in dobro zadržuje vodo, hkrati pa se zaradi svoje biokompatibilnosti ne prijema na rane [4]. V projektu so združili obe ideji, tako da bi omogočili boljši nadzor nad okužbo in spodbudili zdravljenje opekline.
Kot produkt so si zamislil gensko spremenjen živ bakterijski terapevtik. Za šasijo so izbrali Gluconacetobacteri hansenii ATCC 53582, ki sama proizvaja bakterijsko celulozo. To so gensko spremenili tako, da lahko kontinuirano proizvaja antipseudomonalne proteine. Hkrati souporabili optogenetiko (tehniko, ki omogoča nadzor bakterij s svetlobo). Tako so bakterije spremenili na tak način, da proizvajajo BC le, ko je to potrebno. S tem so zmanjšali metabolno breme in hitrost mutacij [1].
Pričakovali so, da v temi G. hansenii ne bo proizvedel skoraj nič BC, pod skoraj infrardečo svetlobo (NIR) bo začel proizvajati BC in pod modro svetlobo bodo bakterije lizirale in sprostile antipseudomonalni protein [1].

= Načrt =
Načrt projekta ima tri module: proizvodnja antipseudomonalnega proteina, prenos signala c-di-GMP in proizvodnja BC, varnost in sproščanje zdravila. Pred začetkom eksperimentov so pripravili model, ki opiše potek signaliziranja z c-di-GMP [1].

== Računalniško modeliranje ==
V G. hansenii produkcija BC poteka pod nadzorom sekundarnega sporočevalca cikličnega digvanidil monofosfata (c-di-GMP)[5]. BphS je digvanilat ciklaza, ki se aktivira s svetlobo in regulira sintezo c-di-GMP. Pod NIR svetlobo bo BphS spremenil konformacijo in se aktiviral ter začel sintetizirati c-di-GMP[6]. FcsR je c-di-GMP fosfodiesteraza, ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Kadar je hitrost nastajanja c-di-GMP večja kot njegova hidroliza, bo njegova koncentracija v celici naraščala in bakterije bodo proizvajale BC [1].
Za opis dogajanja so uporabili 6 reakcij in na njihovi osnovi oblikovali 5 enačb, ki so bile uporabljene za matematični model.
Model je napovedal, da ima osvetljevanje z NIR svetlobo signifikanten učinek na sintezo c-di-GMP, pri čemer je brez osvetljevanja koncentracija c-di-GMP skoraj nič [1].

== Uvodni eksperimenti ==
Pred izvedbo zadanih modulov so določili optimalen medij za nadaljnje eksperimente z G. hansenii, pri čemer sta se za rast te bakterije najbolje izkazala SOC in HS. V obeh medijih so kvantificirali produkcijo BC, za kar so uporabili tekočo kulturo J23100-mcherry-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 v različnih volumnih obeh medijev in ugotovili, da je najbolj optimalen medij za zadano nalogo HS [1].

== Proizvodnja pseudomonalnega proteina([BBa_K3740050;http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740050]) ==
=== Načrt===
Piocin S2 je topen protein, ki ga proizvajajo bakterije Pseudomonas aeruginosa in lahko ubije ne imune P. aeruginosa bakterije. Imunost nekaterim sevom omogoča protein IMMS2, ki se specifično veže na nukleazno domeno piocina S2 in tako inhibira njegovo aktivnost [7]. Da bi pridobili protein, ki bi lahko ubil širši spekter P. aeruginosa, so nukleazno domeno piocina S2 zamenjali z nukleazno domeno kolicina E3 in himerni protein poimenovali SE. Protein, ki omogoča imunost IMME3, je izpeljan iz imunskega proteina, ki ustreza kolicinu E3 [1], [8].
Protein SE ([BBa_K3740057; http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740057]) prepozna tarče preko Pseudomonas-specifičnega receptorja in translokazne domene, celice pa ubije preko nukleazne domene iz kolicina E. Poleg tega protein SE vsebuje tudi neidentificirano funkcionalno domeno piocina 2. Gostiteljske celice G. hansenii so na SE odporne, saj izražajo imunski protein IMME3 ([BBa_K3740034; http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740034]) [1].
Normalno izražanje proteina SE ter nemoteno rast gostiteljskih celic so zagotovili tako, da so protein SE in imunski protein IMME3 izražali pod različnimi promotorji in RBSji. SE se je izražal pod promotorjem pR in RBS300, IMME3 pa pod promotorjem J23118 in RBSII [1].
=== Izvedba ===
Protein SEE in protein S2 so najprej izrazili v bakterijah E. coli BL21. Za to so pripravili plazmide SE-PET28A IN S2-PET28A in izražanje inducirali z IPTG. Na NaDS-PAGE gel so nanesli surov proteinski ekstrakt in potrdili prisotnost obeh proteinov. S tem so potrdili, da je plazmidni konstrukt primeren za izražanje fuzijskega proteina. Raztopino obeh proteinov in PBS (kontrola) so dodali kulturam Pseudomonas aeruginosa PAO1, P. aeruginosa PAO1 Δ1150-1151 in E. coli MG1655. Pokazali so, da lahko protein SE inhibira rast P. aeruginosa ne glede na prisotnost regije PA1150-1151, medtem ko lahko S2 inhibira le mutanto PAO1 Δ1150-1151. Noben protein ni vplival na rast E. coli [1].
Sledila je optimizacija RBS. Plazmidne konstrukte, ki so jih pripravili v E .coli, so nato prenesli v G. hansenii ATCC 53582, kjer so izvedli izražanje. Nato so kapljico raztopine s proteinom SE nanesli na FAB ploščo, na katero so bile enakomerno nanešene PAO1. Določili so, da je sev pR-RBS300-SE-B1006-J23118-RBSII-IMM-rrnB T1-pSEVA331-G. hansenii ATCC najboljši, saj je imel največjo cono inhibicije [1].

== c-di-GMP signalizacija in produkcija BC filma ([BBa_K3740030;http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740030]) ==
Ker je proizvodnja BC v G. hansenii regulirana s koncentracijo c-di-GMP [6], lahko nastanjanje BC posredno reguliramo z reguliranjem koncentracije c-di-GMP. Za natančno regulacijo so uvedli 2 podmodula. Prvi je digvanilat ciklazni (DGC) modul, ki regulira sintezo c-di-GMP, drugi pa c-di-GMP fosfodiesterazni (PDE), ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Uporabili so bphS (BBa_K3740019) – kodirajoči gen za DGC, ki je aktivirana s svetlobo (BphS) in fcsR (BBa_K3740022) – dele kodirajočih genov c-di-GMP PDE iz različnih bakterij in ju pripravili za konstrukcijo plazmidov, ki so bili klonirani v E. coli in nato preneseni v G. hansenii ATCC53582. Pokazali so, da ima J23109-fcsR-pSEVA331 hidrolizno funkcijo in da J23100-bphS-bphO-pSEVA331 ob osvetljevanju z NIR proizvedejo več BC kot v temi. Optimizirali so tudi promotorske regije in glede na količino BC določili najbolj primeren promotor. Odločili so se za konstrukt J23100-B0034-bphS-pET RBS-bphO-rrnB T1-J23109-B0034-fcsR-rrnB T1, pri katerem pride do signifikantne razlike med izkoristkom BC pri osvetljevanju in v temi [1].

== Varnost in sproščanje zdravila ([BBa_K3740044;http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740044]) ==
V modulu so zasnovali foto-induciran sistem za lizo. Gre za varnostni modul, ki lahko mehanistično zmanjša posledice sprostitve gensko spremenjenih bakterij v okolje. Hkrati pa nadzira sprostitev antipseudomonalnega proteina SE [1].
Uporabili so sistem pDawn, ki je odziven na modro svetlobo. Ob osvetljevanju dvokomponentni sistem YF1/FixJ v pDawn zavre izražanje represorja cI iz faga λ, kar omogoča da je izražanje »downstream« genov aktivirano s svetlobo [1], [9].
Delovanje promotorja pDawn so testirali s plazmidom pDawn-RFP-pSEVA331, ki so ga vnesli v G. hansenii ATCC53582 in prvo skupino bakterij gojili pod modro lučjo, drugo pa v temi. Pri prvi skupini se je izražal RFP pri drugi skupini pa ne [1].
Promotor pDawn so nato uporabili za izražanje različnih litičnih genov, med drugim S105 (Lambda litična kaseta brez antiholina), X174 (litični gen, ki kodira litični protein iz Escherichia faga PhiX174) in LKD16 (litična kaseta). Pripravljene plazmide so najprej testirali v E. coli, nato pa jih prenesli v G. hansenii. Sev pDawn-X174 E-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 (vsebuje X174 E – Bba_K2656015) je stabilno liziral pod modro lučjo [1].
= Izboljšave =
Za povzročitev lize so pogosto uporabljeni inducibilni promotorji. V takem primeru se vseeno lahko izraža majhen delež proteina, kar z akumulacijo litičnega proteina privede do avtolize. Da bi dobili bolj stabilno proizvodnjo litičnega proteina, so izvedli mutagenezo z naključnimi oligonukleotidi na RBS (BBa_B0034). S tem so dobili kolonije, ki so pod modro svetlobo lizirale. Poleg tega so potrdili, da so vnesene mutacije povečale sintezo proteinov s tem RBS [1].
Prihodnje izboljšave bodo vključevale spremembe vezja za produkcijo BC, saj želijo zmanjšati izražanje BC v temi [1].

= Končni produkt =
Kot končni produkt so si zamislili živ bioterapevtik v obliki bakterijske emulzije in liofilizirane bakterije. Dve obliki produkta potrebujeta drugačne pogoje shranjevanja in imata različen rok uporabe in tako služita različnim potrebam uporabnikov [1].

= Viri=
[1] “Team:SZPT-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA. [Accessed: 27-Mar-2022].
[2] WHO, “Burns,” 2018. [Online]. Available: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/burns. [Accessed: 27-Mar-2022].
[3] P. Bielecki, J. Glik, M. Kawecki, and V. A. P. Martins Dos Santos, “Towards understanding Pseudomonas aeruginosa burn wound infections by profiling gene expression,” Biotechnol. Lett., vol. 30, no. 5, pp. 777–790, May 2008, doi: 10.1007/S10529-007-9620-2.
[4] L. Fu et al., “Skin tissue repair materials from bacterial cellulose by a multilayer fermentation method,” J. Mater. Chem., vol. 22, no. 24, pp. 12349–12357, May 2012, doi: 10.1039/C2JM00134A.
[5] E. Sajadi, S. S. A. Fatemi, V. Babaeipour, A. A. Deldar, B. Yakhchali, and M. S. Anvar, “Increased cellulose production by heterologous expression of bcsA and B genes from Gluconacetobacterxylinus in E. coli Nissle 1917,” Bioprocess Biosyst. Eng., vol. 42, no. 12, pp. 2023–2034, Dec. 2019, doi: 10.1007/S00449-019-02197-4.
[6] M. H. Ryu and M. Gomelsky, “Near-infrared light responsive synthetic c-di-GMP module for optogenetic applications,” ACS Synth. Biol., vol. 3, no. 11, pp. 802–810, Nov. 2014, doi: 10.1021/SB400182X.
[7] S. Denayer, S. Matthijs, and P. Cornelis, “Pyocin S2 (Sa) Kills Pseudomonas aeruginosa Strains via the FpvA Type I Ferripyoverdine Receptor,” J. Bacteriol., vol. 189, no. 21, p. 7663, Nov. 2007, doi: 10.1128/JB.00992-07.
[8] H.-X. Zhou, “Association and dissociation kinetics of colicin E3 and immunity protein 3: Convergence of theory and experiment,” Protein Sci., vol. 12, no. 10, p. 2379, Jan. 2003, doi: 10.1110/PS.03216203.
[9] R. Ohlendorf, R. R. Vidavski, A. Eldar, K. Moffat, and A. Möglich, “From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression,” J. Mol. Biol., vol. 416, no. 4, pp. 534–542, Mar. 2012, doi: 10.1016/J.JMB.2012.01.001.

Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin

2022-03-27T11:21:42Z

NinaV:

Projekt »Kissed by Light« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 in bil nagrajen s prvim mestom v kategoriji zdravljenje. Zasnovala ga je skupina SZTP-CHINA, ki je želela narediti efektiven terapevtik, ki bi poškodovanim z opeklinami omogočal manj boleče okrevanje in preprečeval bakterijske okužbe [1]. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA]

= Uvod =
Opekline predstavljajo globalen zdravstveni problem, pri čemer, po poročanju Svetovne zdravstvene organizacije, zaradi njih umre 180 000 ljudi na leto [2]. Ob opeklini pride do poškodbe kože – organa, ki nas ščiti pred okužbami, zato je eden glavnih ciljev oskrbe opeklin preprečevanje in zdravljenje bakterijskih okužb. Pri oskrbi poškodovancev v bolnišničnem okolju so najbolj pogoste okužbe z bakterijo Pseudomonas aeruginosa. Izbor antibiotične terapije pri tej bakteriji je zapleten, saj je rezistentna na mnoge antibiotike, poleg tega pa lahko antibiotiki negativno vplivajo na mikrobiom kože, kar poškoduje okoliške kožne celice [1], [3].
Poleg antimikrobne terapije pa je pri oskrbi pomemba tudi pravilna obložitev ran. To varuje površino opekline in jo ščiti pred vdorom tujih mikroorganizmov. Prav tako pomaga pri ohranjanju vlažnega okolja. Problem komercialnih materialov, ki se uporabljajo v ta namen npr. bombažne gaze, je, da se ti velikokrat primejo na rano in ob odstranitvi povzročijo sekundarne poškodbe [1].

= Cilj projekta Kissed by light =
Uporabo antibiotikov so želeli so zamenjati s specifičnim antipseudomonalnim proteinom. Potencial so videli tudi v uporabi bakterijske celuloze (BC), ki ima visoko mehansko moč in dobro zadržuje vodo, hkrati pa se zaradi svoje biokompatibilnosti ne prijema na rane [4]. V projektu so združili obe ideji, tako da bi omogočili boljši nadzor nad okužbo in spodbudili zdravljenje opekline.
Kot produkt so si zamislil gensko spremenjen živ bakterijski terapevtik. Za šasijo so izbrali Gluconacetobacteri hansenii ATCC 53582, ki sama proizvaja bakterijsko celulozo. To so gensko spremenili tako, da lahko kontinuirano proizvaja antipseudomonalne proteine. Hkrati souporabili optogenetiko (tehniko, ki omogoča nadzor bakterij s svetlobo). Tako so bakterije spremenili na tak način, da proizvajajo BC le, ko je to potrebno. S tem so zmanjšali metabolno breme in hitrost mutacij [1].
Pričakovali so, da v temi G. hansenii ne bo proizvedel skoraj nič BC, pod skoraj infrardečo svetlobo (NIR) bo začel proizvajati BC in pod modro svetlobo bodo bakterije lizirale in sprostile antipseudomonalni protein [1].

= Načrt =
Načrt projekta ima tri module: proizvodnja antipseudomonalnega proteina, prenos signala c-di-GMP in proizvodnja BC, varnost in sproščanje zdravila. Pred začetkom eksperimentov so pripravili model, ki opiše potek signaliziranja z c-di-GMP [1].

== Računalniško modeliranje ==
V G. hansenii produkcija BC poteka pod nadzorom sekundarnega sporočevalca cikličnega digvanidil monofosfata (c-di-GMP)[5]. BphS je digvanilat ciklaza, ki se aktivira s svetlobo in regulira sintezo c-di-GMP. Pod NIR svetlobo bo BphS spremenil konformacijo in se aktiviral ter začel sintetizirati c-di-GMP[6]. FcsR je c-di-GMP fosfodiesteraza, ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Kadar je hitrost nastajanja c-di-GMP večja kot njegova hidroliza, bo njegova koncentracija v celici naraščala in bakterije bodo proizvajale BC [1].
Za opis dogajanja so uporabili 6 reakcij in na njihovi osnovi oblikovali 5 enačb, ki so bile uporabljene za matematični model.
Model je napovedal, da ima osvetljevanje z NIR svetlobo signifikanten učinek na sintezo c-di-GMP, pri čemer je brez osvetljevanja koncentracija c-di-GMP skoraj nič [1].

== Uvodni eksperimenti ==
Pred izvedbo zadanih modulov so določili optimalen medij za nadaljnje eksperimente z G. hansenii, pri čemer sta se za rast te bakterije najbolje izkazala SOC in HS. V obeh medijih so kvantificirali produkcijo BC, za kar so uporabili tekočo kulturo J23100-mcherry-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 v različnih volumnih obeh medijev in ugotovili, da je najbolj optimalen medij za zadano nalogo HS [1].

== Proizvodnja pseudomonalnega proteina([BBa_K3740050;http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740050]) ==
=== Načrt===
Piocin S2 je topen protein, ki ga proizvajajo bakterije Pseudomonas aeruginosa in lahko ubije ne imune P. aeruginosa bakterije. Imunost nekaterim sevom omogoča protein IMMS2, ki se specifično veže na nukleazno domeno piocina S2 in tako inhibira njegovo aktivnost [7]. Da bi pridobili protein, ki bi lahko ubil širši spekter P. aeruginosa, so nukleazno domeno piocina S2 zamenjali z nukleazno domeno kolicina E3 in himerni protein poimenovali SE. Protein, ki omogoča imunost IMME3, je izpeljan iz imunskega proteina, ki ustreza kolicinu E3 [1], [8].
Protein SE ([BBa_K3740057; http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740057]) prepozna tarče preko Pseudomonas-specifičnega receptorja in translokazne domene, celice pa ubije preko nukleazne domene iz kolicina E. Poleg tega protein SE vsebuje tudi neidentificirano funkcionalno domeno piocina 2. Gostiteljske celice G. hansenii so na SE odporne, saj izražajo imunski protein IMME3 ([BBa_K3740034; http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740034]) [1].
Normalno izražanje proteina SE ter nemoteno rast gostiteljskih celic so zagotovili tako, da so protein SE in imunski protein IMME3 izražali pod različnimi promotorji in RBSji. SE se je izražal pod promotorjem pR in RBS300, IMME3 pa pod promotorjem J23118 in RBSII [1].
=== Izvedba ===
Protein SEE in protein S2 so najprej izrazili v bakterijah E. coli BL21. Za to so pripravili plazmide SE-PET28A IN S2-PET28A in izražanje inducirali z IPTG. Na NaDS-PAGE gel so nanesli surov proteinski ekstrakt in potrdili prisotnost obeh proteinov. S tem so potrdili, da je plazmidni konstrukt primeren za izražanje fuzijskega proteina. Raztopino obeh proteinov in PBS (kontrola) so dodali kulturam Pseudomonas aeruginosa PAO1, P. aeruginosa PAO1 Δ1150-1151 in E. coli MG1655. Pokazali so, da lahko protein SE inhibira rast P. aeruginosa ne glede na prisotnost regije PA1150-1151, medtem ko lahko S2 inhibira le mutanto PAO1 Δ1150-1151. Noben protein ni vplival na rast E. coli [1].
Sledila je optimizacija RBS. Plazmidne konstrukte, ki so jih pripravili v E .coli, so nato prenesli v G. hansenii ATCC 53582, kjer so izvedli izražanje. Nato so kapljico raztopine s proteinom SE nanesli na FAB ploščo, na katero so bile enakomerno nanešene PAO1. Določili so, da je sev pR-RBS300-SE-B1006-J23118-RBSII-IMM-rrnB T1-pSEVA331-G. hansenii ATCC najboljši, saj je imel največjo cono inhibicije [1].

== c-di-GMP signalizacija in produkcija BC filma ([BBa_K3740030;http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740030]) ==
Ker je proizvodnja BC v G. hansenii regulirana s koncentracijo c-di-GMP [6], lahko nastanjanje BC posredno reguliramo z reguliranjem koncentracije c-di-GMP. Za natančno regulacijo so uvedli 2 podmodula. Prvi je digvanilat ciklazni (DGC) modul, ki regulira sintezo c-di-GMP, drugi pa c-di-GMP fosfodiesterazni (PDE), ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Uporabili so bphS (BBa_K3740019) – kodirajoči gen za DGC, ki je aktivirana s svetlobo (BphS) in fcsR (BBa_K3740022) – dele kodirajočih genov c-di-GMP PDE iz različnih bakterij in ju pripravili za konstrukcijo plazmidov, ki so bili klonirani v E. coli in nato preneseni v G. hansenii ATCC53582. Pokazali so, da ima J23109-fcsR-pSEVA331 hidrolizno funkcijo in da J23100-bphS-bphO-pSEVA331 ob osvetljevanju z NIR proizvedejo več BC kot v temi. Optimizirali so tudi promotorske regije in glede na količino BC določili najbolj primeren promotor. Odločili so se za konstrukt J23100-B0034-bphS-pET RBS-bphO-rrnB T1-J23109-B0034-fcsR-rrnB T1, pri katerem pride do signifikantne razlike med izkoristkom BC pri osvetljevanju in v temi [1].

== Varnost in sproščanje zdravila ([BBa_K3740044;http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740044]) ==
V modulu so zasnovali foto-induciran sistem za lizo. Gre za varnostni modul, ki lahko mehanistično zmanjša posledice sprostitve gensko spremenjenih bakterij v okolje. Hkrati pa nadzira sprostitev antipseudomonalnega proteina SE [1].
Uporabili so sistem pDawn, ki je odziven na modro svetlobo. Ob osvetljevanju dvokomponentni sistem YF1/FixJ v pDawn zavre izražanje represorja cI iz faga λ, kar omogoča da je izražanje »downstream« genov aktivirano s svetlobo [1], [9].
Delovanje promotorja pDawn so testirali s plazmidom pDawn-RFP-pSEVA331, ki so ga vnesli v G. hansenii ATCC53582 in prvo skupino bakterij gojili pod modro lučjo, drugo pa v temi. Pri prvi skupini se je izražal RFP pri drugi skupini pa ne [1].
Promotor pDawn so nato uporabili za izražanje različnih litičnih genov, med drugim S105 (Lambda litična kaseta brez antiholina), X174 (litični gen, ki kodira litični protein iz Escherichia faga PhiX174) in LKD16 (litična kaseta). Pripravljene plazmide so najprej testirali v E. coli, nato pa jih prenesli v G. hansenii. Sev pDawn-X174 E-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 (vsebuje X174 E – Bba_K2656015) je stabilno liziral pod modro lučjo [1].
= Izboljšave =
Za povzročitev lize so pogosto uporabljeni inducibilni promotorji. V takem primeru se vseeno lahko izraža majhen delež proteina, kar z akumulacijo litičnega proteina privede do avtolize. Da bi dobili bolj stabilno proizvodnjo litičnega proteina, so izvedli mutagenezo z naključnimi oligonukleotidi na RBS (BBa_B0034). S tem so dobili kolonije, ki so pod modro svetlobo lizirale. Poleg tega so potrdili, da so vnesene mutacije povečale sintezo proteinov s tem RBS [1].
Prihodnje izboljšave bodo vključevale spremembe vezja za produkcijo BC, saj želijo zmanjšati izražanje BC v temi [1].

= Končni produkt =
Kot končni produkt so si zamislili živ bioterapevtik v obliki bakterijske emulzije in liofilizirane bakterije. Dve obliki produkta potrebujeta drugačne pogoje shranjevanja in imata različen rok uporabe in tako služita različnim potrebam uporabnikov [1].

= Viri=
[1] “Team:SZPT-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA. [Accessed: 27-Mar-2022].
[2] WHO, “Burns,” 2018. [Online]. Available: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/burns. [Accessed: 27-Mar-2022].
[3] P. Bielecki, J. Glik, M. Kawecki, and V. A. P. Martins Dos Santos, “Towards understanding Pseudomonas aeruginosa burn wound infections by profiling gene expression,” Biotechnol. Lett., vol. 30, no. 5, pp. 777–790, May 2008, doi: 10.1007/S10529-007-9620-2.
[4] L. Fu et al., “Skin tissue repair materials from bacterial cellulose by a multilayer fermentation method,” J. Mater. Chem., vol. 22, no. 24, pp. 12349–12357, May 2012, doi: 10.1039/C2JM00134A.
[5] E. Sajadi, S. S. A. Fatemi, V. Babaeipour, A. A. Deldar, B. Yakhchali, and M. S. Anvar, “Increased cellulose production by heterologous expression of bcsA and B genes from Gluconacetobacterxylinus in E. coli Nissle 1917,” Bioprocess Biosyst. Eng., vol. 42, no. 12, pp. 2023–2034, Dec. 2019, doi: 10.1007/S00449-019-02197-4.
[6] M. H. Ryu and M. Gomelsky, “Near-infrared light responsive synthetic c-di-GMP module for optogenetic applications,” ACS Synth. Biol., vol. 3, no. 11, pp. 802–810, Nov. 2014, doi: 10.1021/SB400182X.
[7] S. Denayer, S. Matthijs, and P. Cornelis, “Pyocin S2 (Sa) Kills Pseudomonas aeruginosa Strains via the FpvA Type I Ferripyoverdine Receptor,” J. Bacteriol., vol. 189, no. 21, p. 7663, Nov. 2007, doi: 10.1128/JB.00992-07.
[8] H.-X. Zhou, “Association and dissociation kinetics of colicin E3 and immunity protein 3: Convergence of theory and experiment,” Protein Sci., vol. 12, no. 10, p. 2379, Jan. 2003, doi: 10.1110/PS.03216203.
[9] R. Ohlendorf, R. R. Vidavski, A. Eldar, K. Moffat, and A. Möglich, “From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression,” J. Mol. Biol., vol. 416, no. 4, pp. 534–542, Mar. 2012, doi: 10.1016/J.JMB.2012.01.001.

Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin

2022-03-27T11:19:41Z

NinaV: New page: Projekt »Kissed by Light« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 in bil nagrajen s prvim mestom v kategoriji zdravljenje. Zasnovala ga je skupina SZTP-CHINA, ki je želela narediti efektiv...

Projekt »Kissed by Light« je sodeloval na tekmovanju iGEM 2021 in bil nagrajen s prvim mestom v kategoriji zdravljenje. Zasnovala ga je skupina SZTP-CHINA, ki je želela narediti efektiven terapevtik, ki bi poškodovanim z opeklinami omogočal manj boleče okrevanje in preprečeval bakterijske okužbe [1]. Predstavitev projekta je dostopna na spletni strani: [https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA]

== Uvod =
Opekline predstavljajo globalen zdravstveni problem, pri čemer, po poročanju Svetovne zdravstvene organizacije, zaradi njih umre 180 000 ljudi na leto [2]. Ob opeklini pride do poškodbe kože – organa, ki nas ščiti pred okužbami, zato je eden glavnih ciljev oskrbe opeklin preprečevanje in zdravljenje bakterijskih okužb. Pri oskrbi poškodovancev v bolnišničnem okolju so najbolj pogoste okužbe z bakterijo Pseudomonas aeruginosa. Izbor antibiotične terapije pri tej bakteriji je zapleten, saj je rezistentna na mnoge antibiotike, poleg tega pa lahko antibiotiki negativno vplivajo na mikrobiom kože, kar poškoduje okoliške kožne celice [1], [3].
Poleg antimikrobne terapije pa je pri oskrbi pomemba tudi pravilna obložitev ran. To varuje površino opekline in jo ščiti pred vdorom tujih mikroorganizmov. Prav tako pomaga pri ohranjanju vlažnega okolja. Problem komercialnih materialov, ki se uporabljajo v ta namen npr. bombažne gaze, je, da se ti velikokrat primejo na rano in ob odstranitvi povzročijo sekundarne poškodbe [1].

== Cilj projekta Kissed by light ==
Uporabo antibiotikov so želeli so zamenjati s specifičnim antipseudomonalnim proteinom. Potencial so videli tudi v uporabi bakterijske celuloze (BC), ki ima visoko mehansko moč in dobro zadržuje vodo, hkrati pa se zaradi svoje biokompatibilnosti ne prijema na rane [4]. V projektu so združili obe ideji, tako da bi omogočili boljši nadzor nad okužbo in spodbudili zdravljenje opekline.
Kot produkt so si zamislil gensko spremenjen živ bakterijski terapevtik. Za šasijo so izbrali Gluconacetobacteri hansenii ATCC 53582, ki sama proizvaja bakterijsko celulozo. To so gensko spremenili tako, da lahko kontinuirano proizvaja antipseudomonalne proteine. Hkrati souporabili optogenetiko (tehniko, ki omogoča nadzor bakterij s svetlobo). Tako so bakterije spremenili na tak način, da proizvajajo BC le, ko je to potrebno. S tem so zmanjšali metabolno breme in hitrost mutacij [1].
Pričakovali so, da v temi G. hansenii ne bo proizvedel skoraj nič BC, pod skoraj infrardečo svetlobo (NIR) bo začel proizvajati BC in pod modro svetlobo bodo bakterije lizirale in sprostile antipseudomonalni protein [1].

== Načrt ==
Načrt projekta ima tri module: proizvodnja antipseudomonalnega proteina, prenos signala c-di-GMP in proizvodnja BC, varnost in sproščanje zdravila. Pred začetkom eksperimentov so pripravili model, ki opiše potek signaliziranja z c-di-GMP [1].

=== Računalniško modeliranje ===
V G. hansenii produkcija BC poteka pod nadzorom sekundarnega sporočevalca cikličnega digvanidil monofosfata (c-di-GMP)[5]. BphS je digvanilat ciklaza, ki se aktivira s svetlobo in regulira sintezo c-di-GMP. Pod NIR svetlobo bo BphS spremenil konformacijo in se aktiviral ter začel sintetizirati c-di-GMP[6]. FcsR je c-di-GMP fosfodiesteraza, ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Kadar je hitrost nastajanja c-di-GMP večja kot njegova hidroliza, bo njegova koncentracija v celici naraščala in bakterije bodo proizvajale BC [1].
Za opis dogajanja so uporabili 6 reakcij in na njihovi osnovi oblikovali 5 enačb, ki so bile uporabljene za matematični model.
Model je napovedal, da ima osvetljevanje z NIR svetlobo signifikanten učinek na sintezo c-di-GMP, pri čemer je brez osvetljevanja koncentracija c-di-GMP skoraj nič [1].

=== Uvodni eksperimenti ===
Pred izvedbo zadanih modulov so določili optimalen medij za nadaljnje eksperimente z G. hansenii, pri čemer sta se za rast te bakterije najbolje izkazala SOC in HS. V obeh medijih so kvantificirali produkcijo BC, za kar so uporabili tekočo kulturo J23100-mcherry-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 v različnih volumnih obeh medijev in ugotovili, da je najbolj optimalen medij za zadano nalogo HS [1].

=== Proizvodnja pseudomonalnega proteina([BBa_K3740050;http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740050]) ===
==== Načrt====
Piocin S2 je topen protein, ki ga proizvajajo bakterije Pseudomonas aeruginosa in lahko ubije ne imune P. aeruginosa bakterije. Imunost nekaterim sevom omogoča protein IMMS2, ki se specifično veže na nukleazno domeno piocina S2 in tako inhibira njegovo aktivnost [7]. Da bi pridobili protein, ki bi lahko ubil širši spekter P. aeruginosa, so nukleazno domeno piocina S2 zamenjali z nukleazno domeno kolicina E3 in himerni protein poimenovali SE. Protein, ki omogoča imunost IMME3, je izpeljan iz imunskega proteina, ki ustreza kolicinu E3 [1], [8].
Protein SE ([BBa_K3740057; http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740057]) prepozna tarče preko Pseudomonas-specifičnega receptorja in translokazne domene, celice pa ubije preko nukleazne domene iz kolicina E. Poleg tega protein SE vsebuje tudi neidentificirano funkcionalno domeno piocina 2. Gostiteljske celice G. hansenii so na SE odporne, saj izražajo imunski protein IMME3 ([BBa_K3740034; http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740034]) [1].
Normalno izražanje proteina SE ter nemoteno rast gostiteljskih celic so zagotovili tako, da so protein SE in imunski protein IMME3 izražali pod različnimi promotorji in RBSji. SE se je izražal pod promotorjem pR in RBS300, IMME3 pa pod promotorjem J23118 in RBSII [1].
==== Izvedba ====
Protein SEE in protein S2 so najprej izrazili v bakterijah E. coli BL21. Za to so pripravili plazmide SE-PET28A IN S2-PET28A in izražanje inducirali z IPTG. Na NaDS-PAGE gel so nanesli surov proteinski ekstrakt in potrdili prisotnost obeh proteinov. S tem so potrdili, da je plazmidni konstrukt primeren za izražanje fuzijskega proteina. Raztopino obeh proteinov in PBS (kontrola) so dodali kulturam Pseudomonas aeruginosa PAO1, P. aeruginosa PAO1 Δ1150-1151 in E. coli MG1655. Pokazali so, da lahko protein SE inhibira rast P. aeruginosa ne glede na prisotnost regije PA1150-1151, medtem ko lahko S2 inhibira le mutanto PAO1 Δ1150-1151. Noben protein ni vplival na rast E. coli [1].
Sledila je optimizacija RBS. Plazmidne konstrukte, ki so jih pripravili v E .coli, so nato prenesli v G. hansenii ATCC 53582, kjer so izvedli izražanje. Nato so kapljico raztopine s proteinom SE nanesli na FAB ploščo, na katero so bile enakomerno nanešene PAO1. Določili so, da je sev pR-RBS300-SE-B1006-J23118-RBSII-IMM-rrnB T1-pSEVA331-G. hansenii ATCC najboljši, saj je imel največjo cono inhibicije [1].

=== c-di-GMP signalizacija in produkcija BC filma ([BBa_K3740030;http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740030]) ===
Ker je proizvodnja BC v G. hansenii regulirana s koncentracijo c-di-GMP [6], lahko nastanjanje BC posredno reguliramo z reguliranjem koncentracije c-di-GMP. Za natančno regulacijo so uvedli 2 podmodula. Prvi je digvanilat ciklazni (DGC) modul, ki regulira sintezo c-di-GMP, drugi pa c-di-GMP fosfodiesterazni (PDE), ki regulira hidrolizo c-di-GMP. Uporabili so bphS (BBa_K3740019) – kodirajoči gen za DGC, ki je aktivirana s svetlobo (BphS) in fcsR (BBa_K3740022) – dele kodirajočih genov c-di-GMP PDE iz različnih bakterij in ju pripravili za konstrukcijo plazmidov, ki so bili klonirani v E. coli in nato preneseni v G. hansenii ATCC53582. Pokazali so, da ima J23109-fcsR-pSEVA331 hidrolizno funkcijo in da J23100-bphS-bphO-pSEVA331 ob osvetljevanju z NIR proizvedejo več BC kot v temi. Optimizirali so tudi promotorske regije in glede na količino BC določili najbolj primeren promotor. Odločili so se za konstrukt J23100-B0034-bphS-pET RBS-bphO-rrnB T1-J23109-B0034-fcsR-rrnB T1, pri katerem pride do signifikantne razlike med izkoristkom BC pri osvetljevanju in v temi [1].

=== Varnost in sproščanje zdravila ([BBa_K3740044;http://parts.igem.org/Part:BBa_K3740044])
V modulu so zasnovali foto-induciran sistem za lizo. Gre za varnostni modul, ki lahko mehanistično zmanjša posledice sprostitve gensko spremenjenih bakterij v okolje. Hkrati pa nadzira sprostitev antipseudomonalnega proteina SE [1].
Uporabili so sistem pDawn, ki je odziven na modro svetlobo. Ob osvetljevanju dvokomponentni sistem YF1/FixJ v pDawn zavre izražanje represorja cI iz faga λ, kar omogoča da je izražanje »downstream« genov aktivirano s svetlobo [1], [9].
Delovanje promotorja pDawn so testirali s plazmidom pDawn-RFP-pSEVA331, ki so ga vnesli v G. hansenii ATCC53582 in prvo skupino bakterij gojili pod modro lučjo, drugo pa v temi. Pri prvi skupini se je izražal RFP pri drugi skupini pa ne [1].
Promotor pDawn so nato uporabili za izražanje različnih litičnih genov, med drugim S105 (Lambda litična kaseta brez antiholina), X174 (litični gen, ki kodira litični protein iz Escherichia faga PhiX174) in LKD16 (litična kaseta). Pripravljene plazmide so najprej testirali v E. coli, nato pa jih prenesli v G. hansenii. Sev pDawn-X174 E-pSEVA331-G. hansenii ATCC 53582 (vsebuje X174 E – Bba_K2656015) je stabilno liziral pod modro lučjo [1].
== Izboljšave ==
Za povzročitev lize so pogosto uporabljeni inducibilni promotorji. V takem primeru se vseeno lahko izraža majhen delež proteina, kar z akumulacijo litičnega proteina privede do avtolize. Da bi dobili bolj stabilno proizvodnjo litičnega proteina, so izvedli mutagenezo z naključnimi oligonukleotidi na RBS (BBa_B0034). S tem so dobili kolonije, ki so pod modro svetlobo lizirale. Poleg tega so potrdili, da so vnesene mutacije povečale sintezo proteinov s tem RBS [1].
Prihodnje izboljšave bodo vključevale spremembe vezja za produkcijo BC, saj želijo zmanjšati izražanje BC v temi [1].

== Končni produkt ==
Kot končni produkt so si zamislili živ bioterapevtik v obliki bakterijske emulzije in liofilizirane bakterije. Dve obliki produkta potrebujeta drugačne pogoje shranjevanja in imata različen rok uporabe in tako služita različnim potrebam uporabnikov [1].

== Viri==
[1] “Team:SZPT-CHINA - 2021.igem.org.” [Online]. Available: https://2021.igem.org/Team:SZPT-CHINA. [Accessed: 27-Mar-2022].
[2] WHO, “Burns,” 2018. [Online]. Available: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/burns. [Accessed: 27-Mar-2022].
[3] P. Bielecki, J. Glik, M. Kawecki, and V. A. P. Martins Dos Santos, “Towards understanding Pseudomonas aeruginosa burn wound infections by profiling gene expression,” Biotechnol. Lett., vol. 30, no. 5, pp. 777–790, May 2008, doi: 10.1007/S10529-007-9620-2.
[4] L. Fu et al., “Skin tissue repair materials from bacterial cellulose by a multilayer fermentation method,” J. Mater. Chem., vol. 22, no. 24, pp. 12349–12357, May 2012, doi: 10.1039/C2JM00134A.
[5] E. Sajadi, S. S. A. Fatemi, V. Babaeipour, A. A. Deldar, B. Yakhchali, and M. S. Anvar, “Increased cellulose production by heterologous expression of bcsA and B genes from Gluconacetobacterxylinus in E. coli Nissle 1917,” Bioprocess Biosyst. Eng., vol. 42, no. 12, pp. 2023–2034, Dec. 2019, doi: 10.1007/S00449-019-02197-4.
[6] M. H. Ryu and M. Gomelsky, “Near-infrared light responsive synthetic c-di-GMP module for optogenetic applications,” ACS Synth. Biol., vol. 3, no. 11, pp. 802–810, Nov. 2014, doi: 10.1021/SB400182X.
[7] S. Denayer, S. Matthijs, and P. Cornelis, “Pyocin S2 (Sa) Kills Pseudomonas aeruginosa Strains via the FpvA Type I Ferripyoverdine Receptor,” J. Bacteriol., vol. 189, no. 21, p. 7663, Nov. 2007, doi: 10.1128/JB.00992-07.
[8] H.-X. Zhou, “Association and dissociation kinetics of colicin E3 and immunity protein 3: Convergence of theory and experiment,” Protein Sci., vol. 12, no. 10, p. 2379, Jan. 2003, doi: 10.1110/PS.03216203.
[9] R. Ohlendorf, R. R. Vidavski, A. Eldar, K. Moffat, and A. Möglich, “From dusk till dawn: one-plasmid systems for light-regulated gene expression,” J. Mol. Biol., vol. 416, no. 4, pp. 534–542, Mar. 2012, doi: 10.1016/J.JMB.2012.01.001.

Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda

2020-05-04T14:27:01Z

NinaV: /* Regulacija genov */

Bakteriofag lambda je virus, ki okuži E. Coli. Okužba z virusom se lahko začne razvijati v dve smeri, razvije se lahko litični ali lizogeni cikel. Odločitev kateri cikel se bo razvil, je odvisna od mnogih dejavnikov kot so temperatura, velikost celice, št. fagov, ki okuži posamezno celico … Čeprav je že veliko znano o genih, ki so ključni pri odločitvi med cikloma, pa še vedno obstaja veliko neznank pri samem poteku odločanja. Prav tako se moramo zavedati, da posamezno celico ponavadi okuži več virusov hkrati, vendar ne vsi ob istem času. Tako je pomembno kakšno kapaciteto transkripcije ima posamezna celica, torej koliko RNA polimeraze in DnaA replikatorskega iniciatorskega proteina je na voljo, ter kje v celici se nahajajo ti proteini glede na položaj virusne DNA v celici.
V sestavku je najprej pojasnjen mehanizem odločanja z izražanjem in regulacijo genov, nato vpliv na odločitev z upoštevanjem prisotnosti več različnih fagov, na koncu pa še časovni potek okužbe in sprememba odločitve.

== Regulacija genov ==

Takoj ob vstopu virusne DNA v citoplazmo se začne transkripcija genov, ki so ključni za odločitev med litičnim in lizogenim ciklom. Ti se nahajajo na operonih, ki so pod kontrolo promotorjev pR in pL. Na operonu s promotorjem pL se nahajajo geni za N in CIII, na operonu s promotorjem pR pa geni za Cro, CII, O, P in Q.

'''Ključni geni vključeni v odločitev'''

Protein N je transkripcijski antiterminator in omogoči, da se iz pL in pR transkriptov prepišejo ostali zgodnji geni. Na pL in pR se nahaja več terminatorskih mest in ko N ni prisoten na teh pride do terminacije. Ko pa je prisotnega dovolj N, se veže na ''nut'' (N utilization site)in omogoča nastanek daljših transkriptov.

Cro se veže na operator oR in po negativni povratni zanki nadzira delovanje promotorja pR.

CII je pomemben za odločitev in spodbuja lizogeni cikel ter spodbudi izražanje CI, ki je lizogeni efektor. CI se izraža iz promotorjev pRE in pRM.
CIII je pozitivni regulator lizogenega cikla. Deluje kot inhibitor CII inhibitorja.

Q je 'vratar' litičnega cikla. Če doseže pražno vrednost se začne transkripcija poznih genov in litični cikel. Q deluje kot antiterminator poznih genov.

O in P sta ključna za iniciacijo replikacije fagne DNA.

'''Vplivi na odločitev'''

Okolje v katerem se celica nahaja fluktuira, kar se odrazi v različnih celičnih odzivih. To fagi izkoriščajo za povečanje fenotipske diverzitete. Zaradi fluktuacije v okolju pride do fluktuacij v sintezi proteinov, kar vpliva na odločitev med litičnim in lizogenim ciklom.
Poleg tega pa je ključen proces za vzpostavitev katerega koli od ciklov replikacija DNA. Če v fagih ni prisoten gen za P, ti ne morejo niti lizirati celic, niti ne poteče lizogeni cikel. Torej ena sama kopija virusne DNA ni dovolj, da bi se vzpostavil kateri koli od ciklov. Za odločitev je pomembna tudi hitrost replikacije. Z njo se poveča število fagnih DNA v celici, kar spremeni hitrost transkripcije in s tem translacije.

'''Potek odločitve'''

Prva faza je pri obeh ciklih enaka. Najprej poteče transkripcija N in Cro. Sledi izražanje CIII, CII, O, P in Q. Prehitro odločitev za enega od ciklov prepreči Cro (preko zgoraj omenjene negativne povratne zanke). Sledi faza odločitve na katero vpliva tekmovanje med CII in Q. Za vzpostavitev lizogenega cikla se mora nakopičiti CII, ki spodbudi sintezo CI, ki pa ohranja odločitev na strani lizogenega cikla. CI in Cro tekmujeta za vezavna mesta na operatorjih oL in oR in s tem regulirata izražanje drug drugega. CI zavre sintezo Cro in replikacijo DNA. Fluktuacija hitrosti replikacije DNA vpliva, hitrost izražanja CI. Njegovo izražanje pa se regulira tudi preko pozitivne povratne zanke. Če je aktivnost CII nizka in se poveča izražanje Q se bo razvil litični cikel. Pri tem bo Cro zaustavil sintezo CI in dodatno prispeval k izbrani odločitvi.

== Glasovanje fagov za odločitev med litičnim in lizogenim ciklom ==

Do nedavnega je prevladovalo mišljenje, da je odločitev med litičnim in lizogenim ciklom izvedena na ravni celice. To bi pomenilo, da bi vsi fagi, ki so okužili neko celico vstopili v enak cikel. Lizogeni cikel naj bi prevladal v neugodnem okolju za razmnoževanje fagov (npr. celično stradanje), saj virusu omogoči shrambo njegove DNA vse dokler niso pogoji za njegov razvoj optimalni. Pri pogojih, ki so ugodni za razmnoževanje fagov, pa naj bi prevladal litični cikel.
Novejše raziskave so s pomočjo razvoja tehnologije, ki je omogočil spremljanje procesov pri boljši resoluciji, pokazale, da se fagi, ki okužujejo celico, vsak zase odločijo za litični ali lizogeni cikel . Odločitev med tema dvema cikloma je torej individualna za posamezen fag.

Skladno s to ugotovitvijo lahko govorimo o obstoju treh možnih izidov po okužbi bakterijske celice. Poteče lahko lizogeni cikel, litični cikel ali pa hkrati potečeta oba cikla. Lizogeni cikel poteče, ko se vsi fagi, ki okužijo celico, odločijo za ta cikel. Enako velja za litični cikel. Če se zgodi, da odločitve med cikli posameznih fagov, niso skladne, poteče tisti, ki prevlada. Običajno je to litični cikel, a vseeno ne smemo izključiti možnosti poteka lizogenega cikla. Pri nekaterih izmed teh celic, pri katerih prevlada litični cikel pa je mogoče opaziti tudi integracijo nekaterih fagnih DNA v genom gostiteljske celice. V tem primeru potečeta oba cikla.

== Potek obeh ciklov ==

Potek obeh ciklov je posledica tako imenovane zmedenosti fagov, kar lahko obrazložimo s pomočjo regulacije njihovih genov. Raziskovalci predvidevajo, da je zmedenost fagov posledica prisotnosti določene količine proteina CII med potekom litičnega cikla, saj aktivnost CII povzroči tudi izražanje integraze (Int), ki je ključna za vključevanje fagne DNA v genom gostiteljske celice.

Integracija fagne DNA je zelo reguliran proces, odvisen tako od Int kot tudi ekscizionaze (Xis), ki inhibira integracijo fagne DNA. Zgodaj po virusni okužbi celice se pod nadzorom promotorja pL izražata Int in Xis, a je zaradi retroregulacije Int količina nastalega proteina Int manjša od količine proteina Xis. Zato ni verjetno, da bi se integracija DNA zgodila zgodaj po okužbi. Kasneje v celicah, kjer bo potekel lizogeni cikel protein CI povzroči utišanje izražanja Int in Xis, ki sta pod nadzorom promotorja pL. Protein CII pa aktivira izražanje genov, ki jih nadzoruje promotor pI. To rezultira v izražanju Int, ne pa tudi Xis. DNA integracija zato poteče.
Predvideva se, da je pri zmedenih fagih, kljub poteku litičnega cikla, prisotna zadostna količina CII, kar povzroči izražanje Int, ki je pod nadzorom promotorja pI. Ta količina je najverjetneje premajhna da bi aktivirala pRE, ki bi povzročil potek zgolj lizogenega cikla. Posledično potečeta oba cikla in sicer se profagi najprej integrirajo v genom celice, nato pa poteče še litični cikel.

== Medsebojni vpliv fagov ==

Pri poteku lizogenega cikla fagi med seboj sodelujejo, kar rezultira v integraciji različnih verig fagne DNA v gostiteljski genom. Sodelovanje fagov je pri pogojih, ki so neugodni za njihovo razmnoževanje, ugodno, saj tako skupaj spodbujajo integracijo.
Ker litični cikel poteka predvsem pri pogojih, ki so ugodni za razmnoževanje fagov, ti pri poteku litičnega cikla med seboj tekmujejo. Dominanca omogoči maksimalno razmnoževanje, zato je večina novonastalih virusnih delcev genetskih potomcev dominantnega faga. Vzpostavitev dominance je posledica mnogih dejavnikov, kot sta na primer čas infekcije faga in sredstva gostiteljske celice.

Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda

2020-05-04T14:21:21Z

NinaV: /* Regulacija genov */

Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda

2020-05-04T14:20:41Z

NinaV: /* Regulacija genov */

Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda

2020-05-04T14:18:33Z

NinaV:

Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda

2020-05-04T14:17:57Z

NinaV:

Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda

2020-05-04T14:16:44Z

NinaV:

Bakteriofagi

2020-03-12T18:54:00Z

NinaV:

Seminarji pri Molekularni biologiji v študijskem letu 2019/20 obravnavajo različne vidike bakteriofagov, od njihove zgradbe in delovanja, do vloge v okolju in izrabe za zdravljenje. Okvirni naslovi oz. teme so navedeni na prvem seznamu. Za orientacijo in splošno poznavanje tematike si oglejte prosojnice v spletni učilnici - 3. teden marca. V okviru posameznih glavnih poglavij lahko predlagate še kakšen seminar po lastni presoji (pošljite predlog po e-pošti!).

Vsako temo obdelajo praviloma trije študenti (lahko tudi dva, če pa bi kakšno temo na vsak način rad obdelal en sam, mi prej pišite, da se pogovorimo glede vsebine in obsega). Vsaka skupina mora pripraviti povzetek seminarja z vsaj 1200 besedami in ne več kot 1800 besedami in ga objaviti na tem wikiju. Povzetek ne vsebuje slikovnega gradiva, lahko pa vključuje povezave do slik in videov na spletu. Navedite do 5 ključnih virov (ti ne štejejo v vsoto 1200-1800 besed), ki ste jih uporabili.

Vsaka skupina mora objaviti povzetek seminarja na wikiju najkasneje 24 h pred predstavitvijo svojega seminarja. Kateri del povzetka je napisal kdo, navedite v zavihku 'discussion'.
Predstavitev naj bo dolga 15-20 minut, temu pa bo sledila razprava (pribl. 5 minut). Vsak član skupine mora predstaviti en del seminarja, pri čemer mora biti delo enakomerno razdeljeno med vse. Osredotočite se na osnovno temo, ki ste si jo izbrali in vključite le malo splošnega uvoda, ki naj ima za nalogo, da umesti vašo temo v kontekst problematike bakteriofagov.

Predvidena umestitev seminarjev v semestru je razvidna iz spletne učilnice, a zaenkrat ni mogoče zagotovo reči, da ne bo kakšnih sprememb zaradi ukrepov proti širjenju koronavirusa.

Vsebina seminarjev je izpitna snov. Iz teme seminarjev je ~10 % vprašanj na izpitu (oz. 10 % točk dobite za odgovore iz snovi seminarjev).

Spodnji seznam vključuje povezave do nekaterih preglednih člankov iz zadnjega obdobja, ki jih lahko uporabite za osnovo pri pripravi. Večinoma pa navedeni viri ne zadoščajo, da bi pripravili 15-minutni seminar, zato boste morali pregledati tudi nekaj primarnih virov (raziskovalnih člankov), ki jih boste poiskali sami oz. jih boste našli citirane v preglednih člankih. Vaši seminarji naj se osredotočijo na osnovno temo iz naslova in naj nimajo dolgih splošnih uvodov. Seminarji si bodo namreč sledili dokaj hitro en za drugim - predvidoma po 8 na teden), tako da boste osnove hitro osvojili in jih ni treba ponavljati.

Poglavja za seminarje so:

'''STRUKTURA IN DELOVANJE FAGOV''' 
https://www.intechopen.com/books/bacteriophages-perspectives-and-future/bacteriophages-their-structural-organisation-and-function (poglavje, 2019) 
1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov 
2. Struktura kapsid in prokapsid 
3. Struktura konektorjev in repov 
4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6416446/ (pregledni, 2019) 
5. Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6209105/ (pregledni, 2018) 
6. Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1879625718300142?via% 
(pregledni, 2018) 
7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1570963919301888?via% 
(pregledni, 2020) 
8. Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave 

'''INTERAKCIJE in EKOLOGIJA''' 

https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm (pregledni, 2019) 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29523063 
9. Interakcija faga z bakterijo 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X19300031 (pregledni, 2019) 
10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi 

https://www.mdpi.com/2076-0817/8/3/100/htm (pregledni, 2019) 
11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih (brez človeka - to je predhodna tema) 

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/08927014.2019.1613525 in https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32125643 
(pregledni, 2019+2020) 
12. Delovanje fagov na heterogene biofilme 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0966842X19300599?via% 
(pregledni, 2019) 
13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom 

https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11274-013-1358-5 (pregledni, 2013) 
14. Cianofagi 

'''UPORABA BAKTERIOFAGOV''' 

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2019.00513/full (pregledni, 2019) 
15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb 
16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh 
17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5371805/ 
(pregledni, 2017 - samo kratko poglavje o uporabi na rastlinah) 
18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0160412019305410 (pregledni, 2019) 
19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti 

https://www.aimspress.com/fileOther/PDF/microbiology/microbiol-05-04- 
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S095816691930093X?via%3Dihub 
(pregledni, 2019 + 2020) 
20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih 

https://www.mdpi.com/1999-4915/11/6/567/htm 
in https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166919301296?via%3Dihub 
(pregledni, 2019 + 2020) 
21. Biotehnološka izraba fagov 

----

Za seminar se prijavite tako, da se vpišete v oklepaj za naslovom seminarja, tako kot je prikazano pri izmišljenem ničtem seminarju.
Seminarje bomo izvedli v enakem vrstnem redu, kot so navedeni zgoraj.

0. Analiza bakteriofagov v smrekovem gozdu (Jana Dolenc, Tilen Deželak, Sonja Mavrič) 

1. Klasifikacija in splošna strukturna organizacija fagov 
2. Struktura kapsid in prokapsid 
3. Struktura konektorjev in repov 
4. Adsorpcijski aparat bakteriofagov 
5. Zgradba kompleksa za odločanje med lizogenim in litičnim ciklom faga lambda (Nastja Feguš, Nina Varda) 
6. Vzajemna regulacija med fagom in bakterijo na posttranskripcijski ravni 
7. Sestavljanje fagnih delcev in vloga portalnega proteina 
8. Fagni endolizini: mehanizem delovanja in možnosti za izboljšave 
9. Interakcija faga z bakterijo 
10. Interakcije fagov s človeškimi tkivi 
11. Fagi v naravnih in umetnih okoljih 
12. Delovanje fagov na heterogene biofilme 
13. Fagi kot naravni rezervoar odpornosti proti antibiotikom 
14. Cianofagi 
15. Prednosti fagov za zdravljenje bakterijskih okužb 
16. Uporaba fagov za zdravljenje okužb pri živalih in ljudeh 
17. Tveganja pri uporabi fagov za zdravljenje 
18. Uporaba fagov proti bakterijskim okužbam rastlin 
19. Uporaba fagov za odstranjevanje patogenih bakterij v prsti 
20. Uporaba fagov v boju proti patogenim bakterijam v živilih 
21. Biotehnološka izraba fagov 

Ko boste pripravljali povzetek, naslov teme na tem, drugem, seznamu povežite z novo wiki stranjo, ki bo vsebovala povzetek. Na koncu besedila povzetka (pod viri) v novo vrstico dodajte oznako: <nowiki>[[Category:SEM]] [[Category:BMB]]</nowiki> 

Primer, kako so bili urejeni seminarji v prejšnjih letih, si lahko ogledate na strani [[Struktura kromatina]] (2013/14).

#[http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Herpesvirusi_in_sorodni_dsDNA_virusi Herpesvirusi in sorodni dsDNA virusi] (Veronika Razpotnik, Ines Medved, Andrej Ivanovski)

BIO2 Seminar 2019

2019-12-12T23:06:34Z

NinaV: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
! ime in priimek !! poglavje !! naslov seminarja !! recenzent 1 !! recenzent 2 !! datum oddaje !! datum recenzije !! datum predstavitve
|-
! Tevž Levstek
| 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Glicinski transporterji kot terapevtske tarče] || Sašo Jakob || Andrej Špenko || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Ana Potočnik
| 12 || Fosfatidilserin kot signalna molekula || Marjeta Milostnik || Maja Mahorič || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Kim Glavič
| 12 || ATP kot signalna molekula živali in rastlin || Tina Logonder || Tim Nograšek || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Special:UserLogout&returnto=BIO2_Seminar_2019
! Nika Vegelj
| 12 || Formacija biofilma v povezavi s c-di-GMP signalizacijo. || Žan Fortuna || Nina Varda || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Tadej Uršič
| 12 || TLR signalizacija in njena vloga pri revmatičnih boleznih || Michelle Oletič || Tina Arnšek || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Natalija Razpotnik
| 12 || || Maša Gabrič || Timotej Zgonik || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Maja Kolar
| 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Biokemijska logika glikolize] || Tevž Levstek || Sašo Jakob || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Jure Povšin
| 14-15 || Vpliv dimetil fumarata na GAPDH in aerobno glikolizo pri modulaciji imunosti || Ana Potočnik || Marjeta Milostnik || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Manca Osolin
| 14-15 || Regulacija metabolizma glukoze in laktata v možganih || Kim Glavič || Tina Logonder || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Greta Junger
| 16 || Intermediati cikla citronske kisline: signalne molekule pod krinko || Nika Vegelj || Žan Fortuna || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Oskar Nemec
| 16 || Uravnavanje delovanja levkocitov z intermediati cikla citronske kisline || Tadej Uršič || Michelle Oletič || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Teo Nograšek
| 16 ||GPR91: Premikanje meja intermediatov Krebsovega cikla || Natalija Razpotnik || Maša Gabrič || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Ana Babnik
| 17 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Regulacija oksidacije maščobnih kislin v skeletnih mišicah pri aerobni vadbi] || Maja Kolar || Tevž Levstek || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Maša Andoljšek
| 17 || Dobre stare maščobe: Povezava med signalizacijo lipidov in življenjsko dobo || Jure Povšin || Ana Potočnik || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Nastja Feguš
| 17 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Večdimenzionalna vloga ketonskih teles] || Manca Osolin || Kim Glavič || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Vivian Nemanič
| 18 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Vpliv stresa in glukokortikoidov na prenos glutamata] || Greta Junger || Nika Vegelj || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
! Lena Trnovec
| 18 || Karbamoilacija: mehanizmi in posledice || Oskar Nemec || Tadej Uršič || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
! Sonja Gabrijelčič
| 18 || || Teo Nograšek || Natalija Razpotnik || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
| Maja Trifkovič || 19 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Vpliv mutacij mitohondrijske DNA na delovanje celic] || Ana Babnik || Maja Kolar || 29/11/2019 || 02/12/2019 || 04/12/2019
|-
| Anja Konjc || 19 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Superkompleksi] || Maša Andoljšek || Jure Povšin || 29/11/2019 || 02/12/2019 || 04/12/2019
|-
| Ana Vičič || 19 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Vloga mitohondrijev pri oksidativnem stresu] || Nastja Feguš || Manca Osolin || 29/11/2019 || 02/12/2019 || 04/12/2019
|-
| Andrej Špenko || 20 || || Vivian Nemanič || Greta Junger || 06/12/2019 || 09/12/2019 || 11/12/2019
|-
| Maja Mahorič || 20 || Poti fiksacije ogljika pri avtotrofih || Lena Trnovec || Oskar Nemec || 06/12/2019 || 09/12/2019 || 11/12/2019
|-
| Tim Nograšek || 20 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Tioredoksini in njihov vpliv pri fotosintezi in biosintezi ogljikovih hidratov ] ||| Sonja Gabrijelčič || Teo Nograšek || 06/12/2019 || 09/12/2019 || 11/12/2019
|-
| Nina Varda || 21 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019#Nina_Varda:_BIOSINTEZA_LEVKOTRIENA_B4 Biosinteza levkotriena B4] || Maja Trifkovič || Ana Babnik || 13/12/2019 || 16/12/2019 || 18/12/2019
|-
| Tina Arnšek || 21 || Regulacija sinteze lipidov s fosfatidatom || Anja Konjc || Maša Andoljšek || 13/12/2019 || 16/12/2019 || 18/12/2019
|-
| Timotej Zgonik || 21 || Nadzor homeostaze lipidnega dvosloja || Ana Vičič || Nastja Feguš || 13/12/2019 || 16/12/2019 || 18/12/2019
|-
| Sašo Jakob || 22 || || Andrej Špenko || Vivian Nemanič || 03/01/2020 || 06/01/2020 || 08/01/2020
|-
| Marjeta Milostnik || 22 || || Maja Mahorič || Lena Trnovec || 03/01/2020 || 06/01/2020 || 08/01/2020
|-
| Tina Logonder || 22 || Serin v rastlinah || Tim Nograšek || Sonja Gabrijelčič || 03/01/2020 || 06/01/2020 || 08/01/2020
|-
| Žan Fortuna || 23 || || Nina Varda || Maja Trifkovič || 10/01/2020 || 13/01/2020 || 15/01/2020
|-
| Michelle Oletič || 23 || || Tina Arnšek || Anja Konjc || 10/01/2020 || 13/01/2020 || 15/01/2020
|-
| Maša Gabrič || 23 || || Timotej Zgonik || Ana Vičič || 10/01/2020 || 13/01/2020 || 15/01/2020
|}

Dokončno razporeditev bom objavil naknadno.
*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2019|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

BIO2 Povzetki seminarjev 2019

2019-12-12T23:04:41Z

NinaV:

== Kim Glavič: ATP KOT SIGNALNA MOLEKULA ŽIVALI IN RASTLIN ==

Molekula ATP ni le temeljni vir energije za mnoge procese v celici, temveč tudi signalna molekula v zunajceličnem matriksu živali in rastlin. ATP, kot velika polarna molekula, se iz celic rastlin izloči s pomočjo eksocitotskih veziklov ali ATP prenašalcev. Iz živalskih celic pa s pomočjo eksocitotskih veziklov, ATP prenašalcev ali koneksonskih hemikanalčkov. Ob povečanih koncentracijah molekul ATP v zunajceličnem matriksu se te vežejo na ustrezne P2- receptorje. Po sprostitvi nazaj v matriks pa njihovo koncentracijo uravnavajo ekto-nukleotidaze. Na splošno aktivacija P2- receptorjev povzroči povišanje koncentracije kalcijevih ionov in dušikovega monoksida v citosolu celice ter nastanek reaktivnih kisikovih zvrsti v zunajceličnem matriksu. Kalcijevi ioni, dušikov monoksid in reaktivne kisikove zvrsti so sekundarni obveščevalci, ki so ključni za fiziološki odziv celice. Rastlinska ATP-signalizacija ima pomembno vlogo pri časovni regulaciji kalitve cvetnega prahu, rasti pelodne cevke, nastanku koreninskih gomoljev in zaznavanju ter posledično izogibanju oviram pri rasti korenin. Živalska ATP-signalizacija sodeluje pri nastanku imunskega odziva, prenosu živčnih signalov, celični smrti in regulaciji mnogih drugih procesov.

== Tevž Levstek: GLICINSKI TRANSPORTERJI KOT TERAPEVTSKE TARČE ==

Glicin je proteinogena aminokislina, ki opravlja tudi funkcijo signalne molekule, natančneje nevrotransmiterja. Najdemo ga v dveh vrstah sinaps: glicinergičnih, kjer je glavni nevrotransmiter in glutamatergičnih, kjer ima pomožno vlogo, saj pomaga glutamatu pri signaliziranju. Koncentracije glicina v medceličnini regulirajo glicinski transporterji, ki jih delimo na GlyT1 in GlyT2. Glicinergična sinapsa je inhibitorna, kar pomeni, da če glicin aktivira svoj receptor, posinaptično celico hiperpolarizira (še poveča raven kloridnih ionov v njej). V tej sinapsi GlyT1 zmanjšuje koncentracijo glicina, saj ga transportira v okoliške glia celice. GlyT2 po drugi strani pa zvišuje koncentracijo glicina, saj zbira razpršen glicin, ga reciklira in omogoči ponovno usmerjeno pošiljanje proti receptorjem. V glutamatergičnih sinapsah pa je glicin skupaj z glutamatom ekscitatorna signalna molekula. Če se glicin veže na protein NMDA, ki je na posinaptični membrani, mu s pozitivno alosterično modifikacijo olajša vezavo z glutamatom, ki odpre kationski kanalček in depolarizira celico. Tu regulira koncentracijo glicina le GlyT1, ki jo zmanjšuje, GlyT2 pa tu ne nastopa. Razumevanje delovanja obeh sinaps nam lahko omogoči sintezo novih zdravil, ki bi bolj učinkovito delovala proti nekaterim duševnim boleznim kot so shizofrenija, alkoholizem, obsesivno-kompulzivna motnja in še precej drugim. Ta zdravila najpogosteje inhibirajo delovanje GlyT1 in imajo veliko uspešnost pri glodalcih. Pri ljudeh pa na žalost še ni bilo dobrih rezultatov in na razvoj tovrstnega zdravila še čakamo.

== Ana Potočnik: FOSFATIDILSERIN KOT SIGNALNA MOLEKULA ==

Fosfatidilserin je glicerofosfolipid in pomemben gradnik celičnih membran. V zdravih in živečih celicah se nahaja izključno na notranji, citosolni strani fosfolipidnega dvosloja. To asimetrično razporeditev s pomočjo ATP vzpostavlja aminofosfolipidna translokaza. Poleg svoje strukturne vloge ima fosfatidilserin tudi pomembno funkcijo v mnogih signalizacijskih poteh. Kot signalna molekula sodeluje pri koagulaciji krvi, fagocitozi apoptoznih celic, celični fuziji in odlaganju mineralov v osteoblaste. Ključna lastnost fosfatidilserina kot signalne molekule je njegova negativno nabita polarna glava. Preko nje fosfatidilserin z drugimi signalnimi molekulami ali receptorji tvori elektrostatske ali stereospecifične interakcije. Sodeluje pri signalizaciji znotraj celice in tudi pri ekstracelularni signalizaciji. Ko sodeluje pri ekstracelularni signalizaciji, se nahaja tudi na ekstracelularni strani fosfolipidnega dvosloja. Prehod fosfatidilserina iz notranje na zunanjo stran uravnavajo skramblaze. Te so lahko aktivirane s pomočjo kaspaz, ki so encimi, prisotni v apoptozni celici. Med molekulami, ki se vežejo na fosfatidilserin, so najbolj preučevane tiste, ki za vezavo nanj uporabijo Gla domeno. Laktahedrin, ki je na fagocit vezan preko integrinov αvβ3, z vezavo na fosfatidilserin apoptozno celico pritrdi k makrofagu. Gas6 in protein S, ki se prav tako vežeta na fosfatidilserin, pa preko TAM receptorjev sprožita tirozinkinazno aktivnost. Aktivira se Rac1 in polimerizacija aktina sproži fagocitozo apoptozne celice. Izpostavljenost fosfatidilserina na ekstracelularni strani celice je zadosten signal makrofagu, da fagocitira celico. To nakazuje na pomembno vlogo fosfatidilserina kot signalne molekule.

== Tadej Uršič: TLR SIGNALIZACIJA IN NJENA VLOGA PRI REVMATIČNIH BOLEZNIH ==

Prirojeni imunski sistem predstavlja prvi obrambni mehanizem organizma. Celice prirojenega imunskega sistema izražajo receptorje, ki zaznavajo določene gradnike bakterij in virusov in pa molekule, ki nastanejo pri poškodbah samega organizma. Ti receptorji sprožijo signalne poti ki privedejo do odgovora organizma na vdor patogena. Ena od skupin teh receptorjev so TLR (Toll-Like Receptors). So integralni proteini za katere je značilna z levcini bogata ektodomena za prepoznavanje ligandov in pa TIR domena za navzdoljno signalizacijo. TLR-ji prepoznavajo komponente membran (lipide, lipopolisaharide, lipoproteini, …) in nukleinske kisline bakterij in virusov in kot odgovor sprožijo vnetno reakcijo. Če je le ta normalno regulirana le ta pripomore pri odpravi vdirajočih patogenov v organizem. Če pa pride do napak v regulaciji to lahko privede do kroničnega vnetja tkiva. Pri revmatičnih obolenjih, kot so na primer revmatoidni artritis, putiki, lymski artritis, lupus… , so odkrili večjo izraženost TLR-jev, kar je lahko glavni razlog za njihov nastanek. Znanstveniki sedaj testirajo razne inhibitorje TLR-jev ali pa njihovih adaptornih proteinov, kot potencialna zdravila za te bolezni.

== Nika Vegelj : FORMACIJA BIOFILMA V POVEZAVI S C-DI-GMP MOLEKULO ==

Za bakterijo, kot tudi za vsa ostala živa bitja je nujno, da se prilagajajo na spreminjanje življenjskih pogojev, saj jim to omogoča preživetje. Molekula c-di-GMP je sekundarni sporočevalev pri baktrerijah, ki regulira različne celične procese. C-di-GMP so prvič odkrili kot alosterični aktivator celulozne sintetaze v bakteriji Gluconacetobacter xylinum. Pri patogenih organizmih molekula c-di-GMP kontrolira virulentni odgovor, ki je povezan s quorum sensingom, procesom s katerim bakterije med seboj komunicirajo. Koncentracija molekule c-di-GMP je v celici regulirana s pomočjo encimov fosfodiesteraz in gvanilat ciklaz. C-di-GMP je sintetizirana znotraj celice iz dveh molekul GTP s pomočjo encima digvanilat ciklaze, ki na aktivni strani nosi domeno GGDEF. Razpad molekule pa omogoča encim fosfodiesteraza, ki nosi domeno EAL, ta omogoča, da molekula razpade na linearni nukleotid pGpG. Glavni namen raziskovanja molekule c-di-GMP ter njene vloge pri tvorbi biofilma, je bil, da bi ugotovili nove metode, ki bi preprečile nastanek biofilma in tako pozdravile z njim povezane bolezni. Cistična fibroza je ena izmed najpogostejših bolezni v evropi, za njo pa je odgovorna bakterija pseudomonas aeruginosa, ki s tvorbo biofilma povzroča kronično obolenje, saj antibiotiki ne delujejo direktno na biofilm. C-di-GMP je sekundarni sporočevalec pri bakterijah, ne pa tudi pri evkariontih in arhejah. Prav zato je tako zanimiv za znanstvenike, saj lahko z razvojem zdravil, ki bi vplivale na molekulo, razvili potencialna zdravila za kronične bolezni.

== Maja Kolar: BIOKEMIJSKA LOGIKA GLIKOLIZE ==
Čeprav glikoliza sprva zgleda zapletena in naključna, je v smislu zadovoljevanja vsem biokemijskim zahtevam ena najenostavnejših metabolnih poti. Pri načrtovanju poti se je treba zavedati kompromisov za zadovoljevanje različnim omejitvam, zato lahko skozi analizo vseh teoretično možnih poti ugotovimo katera je celici najugodnejša. Termodinamske omejitve vključujejo Gibbsovo prosto entalpijo reakcij, ki jo lahko izračunamo iz redoks potencialov in ugotovimo katere poti v metabolizmu so ender-/eksergonske. Pri encimskih mehanizmih moramo upoštevati aktivacijske skupine, ki pa lahko povečajo reaktivnost intermediatov, kar spada pod fizikalno-kemijske lastnosti intermediatov. Med njih štejemo tudi prepustnost skozi membrano, afiniteto do encimov in toksičnost. Slednjo celica izniči z izogibanjem reakcijskim potem ali sistemi endogene detoksifikacije kot je sistem glioksalaz za intermediat metilglioksal. Pri glikolizi se jim celica izogne z delitvijo elektronske prerazporeditve, kjer po podobnih poteh ne nastopajo toksične spojine. Preko energij vezi in elektronskih prerazporeditev lahko določimo kje na glikolizni poti bo nastajal ATP. Najobsežnejše zastopana je glikoliza Embden-Meyerhof-Parnas, vendar njene naravne alternative dokazujejo, da so skozi evolucijo različni organizmi kot so anaerobne/aerobne bakterije, termofili obravnavali določene zahteve kot bolj ali manj pomembne. Znanje različnih bioloških zahtev pa lahko prenesemo na metabolni inženiring, kjer iščemo učinkovite rešitve za proizvodnjo industrijsko iskanih metabolitov.

== Jure Povšin: VPLIV DIMETIL FUMARATA NA GAPDH IN AEROBNO GLIKOLIZO PRI MODULACIJI IMUNOSTI ==
Aktivirane imunske celice se po Warburgovi hipotezi osredotočijo na izvajanje aerobne glikolize namesto na izvajanje oksidativne fosforilacije, s čimer predstavljajo potencialno terapevtsko tarčo pri avtoimunski boleznih. Dimetil fumarat (DMF), je derivat od intermediarnega fumarata iz Krebsovega cikla. DMF je ester fumarne kisline ter imunomodulacijsko zdravilo, ki se uporablja za zdravljenje multiple skleroze in luskavice. Čeprav njegov terapevtski mehanizem zaenkrat ostaja še negotov, je znano, da DMF kovalentno spreminja ostanke cisteina v procesu, imenovanem succination. Preiskovanje aktivnost DMF-ja dodatno zapleta njegova hidroliza in vivo do monometil fumarata (MMF), ki lahko tudi sam modulira imunski odziv in vnetje tkiv. Kornberg in sodelavci so ugotovili , da DMF pri procesu, imenovanem succination, inaktivira katalitični cistein glikolitičnega encima gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) pri miših in ljudeh, tako in vitro kot in vivo. S tem navzdol uravnava aerobno glikolizo v aktiviranih mieloidnih in limfoidnih celicah, kar povrzoča njene protivnetne učinke. Rezultati znanstvenikov zagotavljajo mehanski vpogled v imunsko modulacijo z DMF in predstavljajo dokaz koncepta, da je aerobna glikoliza lahko zelo pomembna terapevtska tarča v avtoimunosti in da nas lahko nadaljnje raziskovanje pripelje do dolgo iskanih zdravil proti hudim avtoimunim boleznim.

== Manca Osolin: REGULACIJA METABOLIZMA GLUKOZE IN LAKTATA V MOŽGANIH ==
Aerobna glikoliza je proces razgradnje glukoze do laktata v prisotnosti kisika. Proces aerobne glikolize je med drugim značilen tudi za astrocite, posebne celice v možganih. Ker imajo nevroni večjo potrebo po energiji kot astrociti, vzdržujejo visok nivo oksidativnega metabolizma, medtem ko astrociti favorizirajo aerobno glikolizo in omejujejo oksidativno aktivnost. Številne raziskave so pokazale, da astrociti laktat, ki nastane v procesu aerobne glikolize, posredujejo nevronom. Ta koncept se imenuje ANLS hipoteza. Nevroni morajo vzdrževati ravnotežje med pentoza fosfatno potjo in glikolitično potjo, da dosežejo potrebe po energiji in da vzdržujejo antioksidativni potencial. Zato uporaba laktata kot oksidativnega substrata lahko zagotavlja ugoden način za nevrone, da proizvedejo visoke količine ATP med zaobidenjem glikolitične poti, saj tako varčujejo glukozo za pentoza fosfatno pot. Aerobna glikoliza, ki poteka v astrocitih in katere končni produkt je laktat, ima pomembno vlogo pri vzdrževanju nevronske aktivnosti. Laktat se prenese iz astrocitov v nevrone, da zadosti energijskim potrebam nevronov, prav tako pa laktat deluje tudi kot signalna molekula, ki regulira nevronske funkcije, kot so vzdražnost in plastičnost nevronov ter okrepitev spomina. V možganih se nahaja tudi posebna vrsta nevronov, ki na različne mehanizme zaznavajo spremembe koncentracije glukoze, kar jim omogoča prilagajanje na zunanje spremembe preko depolarizacije.

== Greta Junger: INTERMEDIATI CIKLA CITRONSKE KISLINE: SIGNALNE MOLEKULE POD KRINKO ==
Cikel citronske kisline je centralna metabolna pot, pri kateri se energetsko bogata molekula acetil-CoA oksidira ter svoje elektrone odda prenašalcem. Oksidacija je postopna in poteka preko več intermediatov. Za njih je dolgo časa veljalo, da je to njihova edina vloga, vendar pa se je ta domneva izkazala za napačno. Večina intermediatov cikla citronske kisline ima namreč večstransko vlogo, saj sodelujejo tako pri signalizaciji kot tudi regulaciji različnih procesov. Za delovanje α ketoglutarat-odvisnih dioksigenaz (2-OGDO) je nujno potreben α ketoglutarat. Zaradi podobne kemijske zgradbe se na 2-OGDO lahko vežeta tudi sukcinat in fumarat, ki pa encima ne aktivirata, pač pa delujeta kot kompetitivna inhibitorja. Kot taka lahko v celici ustvarita pseudo-hipoksično stanje ali pa posredno vplivata na spremembo demetilacije DNA in histonov. Poleg omenjenega imajo nekateri intermediati ključno vlogo tudi pri post-translacijski modifikaciji proteinov, natančneje acetilaciji, sukcinaciji in sukcinilaciji Lys in Cys ostankov. Za sukcinat in α ketoglutarat obstajata specifična GPC-receptorja - SUCNR1 in OXGR1. Fiziološki pomen SUCNR1, ki se med drugim nahaja v ledvicah, srčnem tkivu in očeh, je bolje raziskan od OXGR1O. Nedolgo nazaj so pojasnili tudi vlogo sukcinata pri nastanku reaktivnih kisikovih zvrsti in obratnega toka elektronov.

== Oskar Nemec: Uravnavanje delovanja levkocitov z intermediati cikla citronske kisline ==
Glede na to, da je cikel citronske kisline (TCA) osnovno vozlišče (energijskega) metabolizma celic, je smiselno sklepati, da je aktivacija celic naravne imunosti in njihova regulacija s tem procesom povezana. Imunski odziv je namreč energijsko potraten proces in v veliki meri odvisen od mitohondrijskega metabolizma. Izkazalo se je, da intermediati TCA, kot so sukcinat, itakonat, citrat in fumarat, posredujejo ali uravnavajo pomembne funkcije mieloidnih celic (levkocitov) med okužbo in vnetjem. Aktivacija levkocitov, ki se zgodi v sklopu vnetnega procesa z vnetnimi dejavniki vodi v preoblikovanje cikla in kopičenje teh intermediatov v celici. Sukcinat ima vnetni učinek, ker povzroči stabilizacijo HIF-1 (hypoxia inducible factor 1), povečanje količine mROS (reaktivne kisikove zvrsti mitohondrija), postranslacijske modifikacije proteinov z sukcinilacijo in signalizacijo preko z G-proteinom sklopljenimi receptorji (klasična kaskada). Citrat prav tako spodbuja vnetni odziv, saj se zaradi njega sintetizirajo reaktivne kisikove in dušikove zvrsti ter prostaglandin E2. Itakonat pa ima protivnetno vlogo, saj zavira SDH in omeji vnetne učinke sukcinata, sposoben je pa tudi, v nasprotju s sukcinatom, sam ubiti patogene. Vloga fumarata v vnetnem procesu ni dokončno pojasnjena, znano pa je da povzroča med drugimi zmanjšanje količine ROS in tako zmanjša vnetni odziv.

== Teo Nograšek: GPR91: PREMIKANJE MEJA INTERMEDIATOV KREBSOVEGA CIKLA ==
Sukcinat je najbolj poznan kot intermediat Krebsovega cikla, vendar so novejše raziskave pokazale, da ima tudi pomembno funkcijo kot signalna molekula. Celice v hipoksiji sintetizirajo in izločajo sukcinat, ki se nato veže na receptor GPR91. GPR91 je najden v celicah jeter, krvnih celicah, maščobnih celicah, ledvičnih celicah in celicah mrežnice. V jetrih signal iz receptorja GPR91 vpliva na Itove celice, ki so zadolžene za izločanje kolagena pri poškodbi jeter. V mrežnici je GPR91 izražen v nevronskih celicah ganglijev in njegova aktivacija povzroči neovaskularizacijo. Aktivacija GPR91 v ledvicah povzroči povišanje krvnega tlaka preko renina. Povišan krvni tlak lahko povzroči hipertrofijo, na nastanek hipertrofije pa vpliva tudi sama vezava med sukcinatom in receptorjem GPR91 na srčnih mišičnih celicah, kar povzroči transkripcijo genov za nastanek hipertrofije. Poleg tega visoka koncentracija sukcinata povzroči apoptozo srčnih celic. Raziskave na področju zaviranja delovanja GPR91 bi lahko omilile zaplete, ki nastanejo pri transplantaciji, ker je bilo odkrito, da imajo pacienti po transplantaciji povišano količino sukcinata v krvi, kar vodi do zapletov.

== Ana Babnik: REGULACIJA OKSIDACIJE MAŠČOBNIH KISLIN V SKELETNIH MIŠICAH PRI AEROBNI VADBI ==
Krčenje mišic pri aerobni vadbi zahteva dodatno energijo, ki jo lahko celice pridobijo iz znotrajceličnih in telesnih virov glukoze in maščobnih kislin. Na izbiro substrata, ki se bo v večji meri porabljal za končno sintezo ATP, vplivata intenzivnost in trajanje vadbe. Oksidacija maščobnih kislin je regulirana z mnogimi prepletenimi signalnimi potmi in regulacijskimi mehanizmi, kateri pa še niso v celoti poznani. Glavni regulator vnosa maščobnih kislin v celico je CD1/SR-B2 (receptor čistilec B2), ki s svojo translokacijo iz veziklov na membrano in interakcijo s FABP olajša vnos maščobnih kislin v celico. Naslednja pomembna točka je prenos substratov v celico v obliki acil-CoA, pri čimer sodeluje CPT1, ki za prenos potrebuje prosti karnitin, na njegovo delovanje pa vpliva mnogo regulatorjev. Sama regulacija delovanja CPT1 pa je povezana tudi s celično homeostazo acetil-CoA in kot že omenjenega prostega karnitina, saj se ta pri presežkih v količini acetil-CoA porablja za nastanek acetilkarnitina. Regulatorni mehanizmi β-oksidacije dokazujejo, da se pri daljši oziroma vadbi z nižjo intenziteto za sintezo acetil-CoA (in nadaljnjo sintezo ATP) porabljajo predvsem maščobne kisline, medtem ko se pri bolj intenzivni vadbi porablja glukoza.

== Nastja Feguš: VEČDIMENZIONALNA VLOGA KETONSKIH TELES ==
Aceton, acetoacetat in D-β-hidroksibutirat so ketonska telesa. Bakterije, arheje in evkarionti jih uporabljamo kot alternativni vir energije. Pri sesalcih so ketonska telesa pomemben alternativni vir energije za možgane, srce in skeletne mišice. Ketosnka telesa na dan prispevajo med 5 % in 20 % energije. Tvorba ketonskih teles primarno poteka v jetrih, saj imajo le jetra in celice kolonskega epitela v črevesju izražen encim, ki katalizira prvo reakcijo nastanka ketonskih teles, vendar obstajajo tudi mehanizmi nehepatične sinteze ketonskih teles. Usoda ketonskih teles ni vedno oksidacija oziroma pretvorba v acetil-CoA, lahko se pretvorijo v različne intermediate, ki se lahko uporabijo v biosintezi sterolov in maščobnih kislin. Ketonska telesa so zelo dobri antioksidanti, njihova funkcija je zelo pomembna v možganih, kjer znižajo stopnjo celičnih poškodb nevronov. D-β-hidroksibutirat je epigenetski modifikator, saj direktno modificira lizinske ostanke histonov. D-β-hidroksibutirat je tudi pomembna signalna molekula. Je direkten inhibitor encimov razreda HDACs. Inhibicija teh encimov poveča acetilacijo encimov in inducira izražanje genov, ki zmanjšajo oksidativni stres. Prav tako se veže na dva različna z G proteinom povezana receptorja, preko te signalne poti zmanjša lipolizo, upočasni srčni utrip in zmanjša porabo energije.

== Maša Andoljšek: DOBRE STARE MAŠČOBE: POVEZAVA MED SIGNALIZACIJO LIPIDOV IN ŽIVLJENJSKO DOBO ==
Lipidi kot signalne molekule ali transkripcijski faktorji sodelujejo v procesih, ki podaljšujejo življenje. Večina raziskav poteka na glisti ''Caenorhabditis elegans'', saj ima kratko življenjsko dobo in se lahko genetsko manipulira. Obstajajo tri metode podaljševanja življenja, ki delujejo na več vrstah organizmov. Prva je inzulin signalirajoča pot, ki s pomočjo dafakronske kisline, holesterola in jedrnih receptorjev DAF-12 ter DAF-16, regulira življenjsko dobo in sproža avtofagijo. Drug način je dietna restrikcija, ki pa lahko poteka preko mutacije eat-2, preko razredčevanja hrane in preko občasnega postenja. Pri tem načinu sodeluje DAF-16, NHR-8 in NHR-64. Dietna restrikcija ima pozitivne vplive na zdravje. Zadnji način podaljšanja življenjske dobe je izrez signalov zarodne plasti, kar promovira lipolizo, metabolizem lipidov itd. Te raziskave kažejo, da je možna uporaba lipidov tudi za zdravljenje različnih bolezni, za kar pa se nekateri že uporabljajo. Pomembna je tudi akumulacija različnih molekul, na primer oleinske kisline pri staranju. Veda, ki se ukvarja s tem je lipodomika, ki preučuje metabolne poti lipidov in njihove strukture. Pri dalj živečih organizmih so strukturni lipidi v nasičenem stanju, lipidi v energijskih zalogah pa v nenasičenem stanju.

== Vivian Nemanič: VPLIV STRESA IN GLUKOKORTIKOIDOV NA PRENOS GLUTAMATA ==
Stres lahko opišemo kot nespecifičen odziv telesa na nek stresor, ki je lahko dogodek ali izkušnja, ki onemogoči posamezniku, da se bi odzval. Akuten in kroničen stres in s stresom povezana sprostitev glukokortikoidov lahko sproži spremembe v prefrontalnemu korteksu in v hipokampusu, saj povzroča spremembe v glutamatnih nevrotransmitorjih. Stres tudi dokazano povzroča kompleksne strukturne spremembe v različnih možganskih regijah. Glede na glutamatergično sinapso, ima lahko stres vpliv na plastičnost in sicer v pozitivnem smislu, da izboljša delovanje možganov, ali pa v slabem smislu, ko lahko vodi do psiholoških motenj. Vemo tudi to, da so s stresom povezane spremembe v različnih aspektih povezane z nevrotransmisijo oz. prenosom glutamata in z vlogo glukokortikoidov. Akutni stres ima generalni učinek na povečanje glutamatergične nevrotransmisije v prefrontalnem korteksu in drugih regijah, ki so povezane s spominom in učenjem ter vpliv na genimočne in negenomične spremembe na različnih straneh tridelne sinapse. Presinaptično sproščanje glutamata je povečano, če sodelujejo mineralokortikoidni in glukokortikoidni receptorji, saj ga oni regulirajo. Na postsinaptični strani akutni stres poveča ekspresijo in gostoto ionotropnih glutamat receptorjev (NDMA), kar vodi v sinaptično potenciranje. V nedavnih raziskavah poskušajo razumeti kako bi lahko mehanizmi, ki kontrolirajo funkcije glutamatne sinapse, lahko pomagali pri razvoju zdravil za različne duševne motnje.

== Lena Trnovec: KARBAMOILACIJA: MEHANIZMI IN POSLEDICE ==
Sečnina že več desetletij velja za relativno nestrupeno spojino. Že nekaj časa pa se nabirajo dokazi, ki podpirajo dejstvo, da post-translacijska modifikacija karbamoilacija, ki je neločljivo povezana s kopičenjem sečnine in odpovedjo ledvic, pripelje do mnogih bioloških in kliničnih posledic. Karbamoilacija proteinov je neencimska post-translacijska modifikacija, ki veže prosto aminsko skupino mnogih proteinov z izociansko kislino. Ta nastane pri disociaciji sečnine ali iz tiocianata, katerega razgradnjo usmerjajo mieloperoksidaze. Glede na vrsto spremenjene molekule (na primer kolagen, albumin, lipoprotein z nizko gostoto ali lipoprotein z visoko gostoto), ima karbamoilacija različne patofiziološke učinke. Karbamoilirani proteini naj bi bili povezani z aterosklerozo, presnovo maščob, motnjami imunskega sistema (kot je inhibicija klasične poti aktivacije komplementa, inhibicija od komplementa odvisne celične citotoksičnosti rituksimaba, zmanjšan oksidativni izbruh nevtrofilcev) in fibrozo jeter. Tako v in vitro kot in vivo raziskavah ima karbamoilacija škodljive posledice na vseh nivojih fiziologije, njena povezava z vnetjem in uremijo pa razsvetli faktorje tveganja pri bolnikih s kronično odpovedjo ledvic. Zmanjšanje stopnje karbamoilacije bi tako lahko bil zanimiv terapevtski pristop k zmanjšanju posledic bolezni ledvic. Obstaja mnogo možnosti za zmanjšanje stopnje karbamoilacije – prehranjevalni pristop (aminokislinska dopolnila), prilagoditev dialize in protivnetne terapije.

== Ana Vičič: VLOGA MITOHONDRIJA V TOKSIČNEM OKSIDATIVNEM STRESU ==
Do oksidativnega stresa v mitohondrijih pride, ko koncentracija oksidativnih zvrsti preseže kapaciteto mitohondrijskih antioksidativnih sistemov. V dihalni verigi nastajajo zelo reaktivni ROS-i, ki hitro po nastanku reagirajo z bližnjimi biološkimi makromolekulami in jih pri tem poškodujejo. Ker so biološke makromolekule, kot so mtDNA, kardiolipin, akonitaza, in UCP2, ključne za pravilno delovanje celice, imajo njihove poškodbe velike posledice, ki se lahko akumulirajo in nato odražajo v celični nekrozi in na nivoju človeškega organizma v nevrogenerativnih boleznih in staranju. Oksidacija mtDNA lahko vodi do napak v genskem zapisu za proteine in nukleinske kisline, ključne za delovanje celičnega dihanja. Oksidacija kardiolipina lahko sproži signalizacijo za celično apoptozo. ROS-i deaktivirajo encim akonitazo in s tem ovirajo potek Krebsovega cikla. Poleg tega se pri oksidaciji akonitaze sprostita Fe2+ in H2O2, ki tvorita proste nove proste radikale. ROS-i po mehanizmu ki še ni jasen, povzročajo razklop dihalne verige in sinteze ATP, torej tudi na ta način ovirajo energijski metabolizem celice. Zato da bi zmanjšali oksidativni stres v mitohondrijih, bi lahko vanje dodajali encimske ali ne encimske, naravne ali sintetične antioksidante. Ti zmanjšujejo koncentracijo ROS-ov v mitohondrijih in s tem zaščitijo pomembne biološke makromolekule. S tem, ko bi z antioksidanti povečali odpornost mitohondrija na oksidativni stres, bi zaščitili celico in celoten organizem.

== Maja Trifkovič: VPLIV MUTACIJ MITOHONDRIJSKE DNA NA DELOVANJE CELIC ==
Najpomembnejša naloga mitohondrijev je sintetiziranje ATP, ki ga celice potrebujejo za različne procese. Večina tega ATP se sintetizira pri procesu oksidativne fosforilacije, ki poteka s pomočjo proteinskih kompleksov na notranji membrani mitohondrija. Proteini, ki sestavljajo te komplekse, so kodirani tako z jedrno, kot tudi mitohondrijsko DNA (mtDNA). Ta je krožna in dvoverižna, poleg genov za že omenjenih 13 proteinov pa vsebuje še gene za 22 molekul tRNA in 2 molekuli rRNA. Najpogosteje mutacije mtDNA povzročijo nepravilnosti v zgradbi in delovanju enega izmed kompleksov elektronske prenašalne verige ali ATP sintaze, zaradi česar se sintetizira manj ATP, poveča koncentracija reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) in spremeni struktura mitohondrijev. Takšne spremembe najbolj vplivajo na celice, ki potrebujejo več energije (npr. mišične in živčne celice). Nekatere mutacije mtDNA se pojavijo pogosteje kot druge in povzročijo mitohondrijske bolezni, kot so na primer MELAS, MERRF, LHON, NARP in KSS, ki se večinoma izrazijo kot motnje v delovanju mišic (predvsem mišic oči in vek ali nenadzorovani gibi skeletnih mišic) ali živčnega sistema (največkrat optičnih živcev). Čeprav so bile številne mitohondrijske bolezni in mutacije, ki jih povzročajo, odkrite že pred nekaj časa in bile predmet številnih raziskav, nekaterih mehanizmov in posledic še ni mogoče natančno razložiti, prav tako za večino bolezni še ne poznamo zdravila.

== Anja Konjc: SUPERKOMPLEKSI ==
Elektronska prenašalna veriga je sestavljena iz petih kompleksov. Ti kompleksi se med seboj lahko združujejo v organizirane enote višjega reda, ki jim pravimo superkompleksi. Sestavljanje le-teh poteka v točno določenem vrstnem redu. Najprej se morajo namreč izgraditi posamezni kompleksi, šele potem lahko pride do njihovega združevanja. Pri tem sodelujejo posebni proteini (''ang''. »assembly factors«), ki imajo pomembno vlogo tudi pri stabilizaciji superkompleksov. Obstajata dve poti združitve kompleksov v superkomplekse. Razlikujeta se v vrstnem redu dodajanja podenot in po proteinih, ki pomagajo pri združevanju kompleksov. Še vedno ni čisto jasno, kaj je glavni razlog za nastanek superkompleksov, vendar se predvideva, da ima združevanje kompleksov več pozitivnih posledic. Tvorba superkompleksov naj bi izboljšala transport elektronov preko usmerjanja substrata. Poleg tega naj bi superkompleksi pomagali pri zmanjšanju proizvodnje reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS). Povezovanje v superkomplekse naj bi vplivalo tudi na komplekse same, saj bi se tako povečala stabilnost posameznih kompleksov. Med podenotami namreč obstajajo številne nekovalentne interakcije, kot je solni most. Proteini, ki pomagajo pri izgradnji kompleksov so povezani tudi s številnimi boleznimi. Če namreč pride do napak pri izgradnji posameznih kompleksov, to vpliva na potek oksidativne fosforilacije.

== Tim Nograsek: TIOREDOKSINI IN NJIHOVA VLOGA PRI FOTOSINTEZI IN BIOSINTEZI ŠKROBA ==
Tioredoksini so proteini, ki vsebujejo na aktivnem mestu dve aminokislini in sicer dva cisteina. Njihova vloga je regulacija in aktivacija različnih encimov v celici. To jim omogoča zmožnost prehajanja cisteinov iz enega redoks stanja v drugega. Ko so reducirani imajo dve tiolni skupini (-SH), v reduciranem stanju pa oddajo dva elektrona in protona in pri tem vzpostavijo sulfidno vez med atomoma žvepla. Encime, ki sodelujejo pri Calvinovem ciklu, biosintezi škroba (AGPaza), sintezi malata in še drugi ob vezavi tioredoksinov prevzamejo njihove elektrone in pri tem pride do komformacijske spremembe, ki se odraža kot aktivnost encima in večja afiniteta za vezavo substratov. Obnavljajo se lahko preko feredoskina, kjer prejmejo elektrone iz elektronske trasnportne verige, lahko pa tudi s pomočjo molekule NADPH, ki odda svoje elektrone tioredoskinom in se ob tem sama oksidira. Trenutno so znanstveniki odkrili ževeliko različnih izoformov tioredoksinov, ki se med seboj razlikujejo po tipu naloge, ki jo opravljajo. Tako lahko najdemo v kloroplastu najpomembnejša izoforma - tioredoksin f in tioredoksin m. Tioredoksini so povečini odvisni od svetlobe, ki je vir elektronov zanje, obstaja pa tudiposeben tip NADP-Trx reduktaza NTRC, ki vsebuje tako NADP-Trx reduktazo kot Trx funkcionalno skupino na enojnem polipeptidu in je zmožna kontrole biosinteze škroba tudi v temi oziroma ob slabših svetlobnih pogojih.

==Maja Mahorič: POTI FIKSACIJE OGLJIKA PRI AVTOTROFIH ==
Organizme glede na vir ogljika delimo na heterotrofe in avtotrofe. Hererotrofi ogljik pridobivajo iz organskih spojin, medtem ko imajo avtotrofi zmožnost fiksacije anorganskega ogljika, ki se nahaja v obliki ogljikovega dioksida v zraku in hidrogenkarbonatnih ionov v vodi. Ti organizmi skupaj omogočajo kroženje ogljika in s tem življenje na Zemlji. Najbolj razširjena pot je Calvinov cikel, razširjen med rastlinami, algami in cianobakterijami, ki je dolgo veljal za edino pot fiksacije ogljika. Med bakterijami in arhejami pa danes poznamo še pet drugih poti fiksacije. Razširjene so med kemolitoavtotrofih, ki živijo v ekstremnih okoljih in so temu primerno prilagojeni. Preučevanje teh poti, njihovih encimov in intermediatov nam daje vpogled v razvoj prvih organizmov na Zemlji ter v razvoj in delitev bakterij in arhej. Te poti so rTCA (cikel citronske kisline, kjer potekajo reakcije redukcije), Wood-Ljungdahlova pot, 3-hidroksipropionatni bicikel, 3-hidroksipropionatni/4-hidroksibutiratni cikel in dikarboksilatni/4-hidroksibutiratni cikel. Končna produkta teh poti sta acetil-CoA in piruvat, ki sta prekurzorja za biosintezo ogljikovih hidratov. Poti fiksacije ogljika, ki potekajo v aerobnih pogojih in tolerirajo kisik praviloma porabijo več energije za njuno sintezo v primerjavi z energijsko učinkovitejšimi potmi, ki pa so občutljive na kisik in morajo zato potekati v anaerobnih okoljih.

==Nina Varda: BIOSINTEZA LEVKOTRIENA B4 ==
Levkotrien B4 (LTB4) je lipidni vnetni mediator, ki spada med eikozanoide. Sintetizirajo ga levkociti, mast celice in makrofagi. Spodbuja migracijo levkocitov v vnetno tkivo, podaljšuje vnetni odziv in poveča fagocitozo. Iz arahidonske kisline nastane v treh korakih. Prva dva koraka (nastanek 5-hidroperoksieikozatetraenojske kisline, nastanek levkotriena A4 (LTA4)) katalizira encim 5-lipoksigenaza (5-LOX). Ta za svoje delovanje potrebuje 5-lipoksigenaza aktivirajoči protein (FLAP). Zadnji korak pa katalizira LTA4 hidrolaza (LTA4H). Za to reakcijo sta predlagana dva možna mehanizma, ni pa še znano po katerem poteče. Poleg sinteze LTB4 ima LTA4H tudi peptidazno aktivnost. Tako kot ostali eikozanoidi, se tudi LTB4 lahko sintetizira transcelularno . Torej en del biosinteze poteče v prvi celici, po prenosu intermediata pa v drugi celici poteče še preostali del biosinteze. Če se LTB4 sintetizira v presežku lahko povzroči patogenezo in vzdržuje kronične vnetne bolezni (artritis, kronična obstruktivna pljučna bolezen, srčnožilne bolezni, rak, metabolna bolezen). Zato poteka razvoj inhibitorjev, ki pa so zaenkrat večinoma še neselektivni in slabo učinkoviti. Preko odsotnosti genov za proteine biosinteze LTB4 se opazuje fiziološki pomen LTB4. Na tak način so potrdili, da je LTB4 ključen pri nastanku alergičnega vnetja kože, zbiranju nevtrofilcev in povzročitvi povečanega pritiska v dihalih poteh.

BIO2 Seminar 2019

2019-11-27T11:10:21Z

NinaV: /* Seznam seminarjev */

= Biokemijski seminar =
doc. dr. Gregor Gunčar, K2.022

== Seznam seminarjev ==
{| {{table}}
! ime in priimek !! poglavje !! naslov seminarja !! recenzent 1 !! recenzent 2 !! datum oddaje !! datum recenzije !! datum predstavitve
|-
! Tevž Levstek
| 12 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Glicinski transporterji kot terapevtske tarče] || Sašo Jakob || Andrej Špenko || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Ana Potočnik
| 12 || Fosfatidilserin kot signalna molekula || Marjeta Milostnik || Maja Mahorič || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-
! Kim Glavič
| 12 || ATP kot signalna molekula živali in rastlin || Tina Logonder || Tim Nograšek || 18/10/2019 || 21/10/2019 || 23/10/2019
|-http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=Special:UserLogout&returnto=BIO2_Seminar_2019
! Nika Vegelj
| 12 || Formacija biofilma v povezavi s c-di-GMP signalizacijo. || Žan Fortuna || Nina Varda || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Tadej Uršič
| 12 || TLR signalizacija in njena vloga pri revmatičnih boleznih || Michelle Oletič || Tina Arnšek || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Natalija Razpotnik
| 12 || || Maša Gabrič || Timotej Zgonik || 25/10/2019 || 28/10/2019 || 30/10/2019
|-
! Maja Kolar
| 14-15 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Biokemijska logika glikolize] || Tevž Levstek || Sašo Jakob || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Jure Povšin
| 14-15 || Vpliv dimetil fumarata na GAPDH in aerobno glikolizo pri modulaciji imunosti || Ana Potočnik || Marjeta Milostnik || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Manca Osolin
| 14-15 || Regulacija metabolizma glukoze in laktata v možganih || Kim Glavič || Tina Logonder || 01/11/2019 || 04/11/2019 || 06/11/2019
|-
! Greta Junger
| 16 || Intermediati cikla citronske kisline: signalne molekule pod krinko || Nika Vegelj || Žan Fortuna || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Oskar Nemec
| 16 || Uravnavanje delovanja levkocitov z intermediati cikla citronske kisline || Tadej Uršič || Michelle Oletič || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Teo Nograšek
| 16 ||GPR91: Premikanje meja intermediatov Krebsovega cikla || Natalija Razpotnik || Maša Gabrič || 08/11/2019 || 11/11/2019 || 13/11/2019
|-
! Ana Babnik
| 17 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Regulacija oksidacije maščobnih kislin v skeletnih mišicah pri aerobni vadbi] || Maja Kolar || Tevž Levstek || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Maša Andoljšek
| 17 || Dobre stare maščobe: Povezava med signalizacijo lipidov in življenjsko dobo || Jure Povšin || Ana Potočnik || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Nastja Feguš
| 17 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Večdimenzionalna vloga ketonskih teles] || Manca Osolin || Kim Glavič || 15/11/2019 || 18/11/2019 || 20/11/2019
|-
! Vivian Nemanič
| 18 || [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BIO2_Povzetki_seminarjev_2019 Vpliv stresa in glukokortikoidov na prenos glutamata] || Greta Junger || Nika Vegelj || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
! Lena Trnovec
| 18 || Karbamoilacija: mehanizmi in posledice || Oskar Nemec || Tadej Uršič || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
! Sonja Gabrijelčič
| 18 || || Teo Nograšek || Natalija Razpotnik || 22/11/2019 || 25/11/2019 || 27/11/2019
|-
| Maja Trifkovič || 19 || || Ana Babnik || Maja Kolar || 29/11/2019 || 02/12/2019 || 04/12/2019
|-
| Anja Konjc || 19 || || Maša Andoljšek || Jure Povšin || 29/11/2019 || 02/12/2019 || 04/12/2019
|-
| Ana Vičič || 19 || Vloga mitohondrijev pri oksidativnem stresu || Nastja Feguš || Manca Osolin || 29/11/2019 || 02/12/2019 || 04/12/2019
|-
| Andrej Špenko || 20 || || Vivian Nemanič || Greta Junger || 06/12/2019 || 09/12/2019 || 11/12/2019
|-
| Maja Mahorič || 20 || Poti fiksacije ogljika pri avtotrofih || Lena Trnovec || Oskar Nemec || 06/12/2019 || 09/12/2019 || 11/12/2019
|-
| Tim Nograšek || 20 || Tioredoksini in njihov vpliv pri sintezi ogljikovih hidratov || Sonja Gabrijelčič || Teo Nograšek || 06/12/2019 || 09/12/2019 || 11/12/2019
|-
| Nina Varda || 21 || Biosinteza levkotriena B4 || Maja Trifkovič || Ana Babnik || 13/12/2019 || 16/12/2019 || 18/12/2019
|-
| Tina Arnšek || 21 || || Anja Konjc || Maša Andoljšek || 13/12/2019 || 16/12/2019 || 18/12/2019
|-
| Timotej Zgonik || 21 || || Ana Vičič || Nastja Feguš || 13/12/2019 || 16/12/2019 || 18/12/2019
|-
| Sašo Jakob || 22 || || Andrej Špenko || Vivian Nemanič || 03/01/2020 || 06/01/2020 || 08/01/2020
|-
| Marjeta Milostnik || 22 || || Maja Mahorič || Lena Trnovec || 03/01/2020 || 06/01/2020 || 08/01/2020
|-
| Tina Logonder || 22 || Serin v rastlinah || Tim Nograšek || Sonja Gabrijelčič || 03/01/2020 || 06/01/2020 || 08/01/2020
|-
| Žan Fortuna || 23 || || Nina Varda || Maja Trifkovič || 10/01/2020 || 13/01/2020 || 15/01/2020
|-
| Michelle Oletič || 23 || || Tina Arnšek || Anja Konjc || 10/01/2020 || 13/01/2020 || 15/01/2020
|-
| Maša Gabrič || 23 || || Timotej Zgonik || Ana Vičič || 10/01/2020 || 13/01/2020 || 15/01/2020
|}

Dokončno razporeditev bom objavil naknadno.
*številka v okencu za temo pomeni poglavje v Lehningerju, v katerega naj izbrana tema spada
Sporočite mi morebitne napake ali če vas nisem razporedil.

== Gradivo za predavanja ==
Gradivo za predavanja in seminarje najdete na http://bio.ijs.si/~zajec/bio2/
username: bio2
password: samozame

==Naloga==
'''Vaša naloga za seminar je: '''
Samostojno pripraviti seminar o seminarski temi, ki vam je bila dodeljena. Za osnovo morate vzeti pregledni članek iz revije, ki ima faktor vpliva nad 5 (npr. [http://www.sciencedirect.com/science/journal/09680004/ TIBS]. Poiskati morate še vsaj tri znanstvene članke, ki se nanašajo na opisano temo in jih uporabiti kot podlago za seminarsko nalogo! Članki so dostopni [http://93.174.95.27/scimag/ tukaj].

Za pripravo seminarja velja naslednje: 
* [[BIO2 Povzetki seminarjev 2019|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju '''v 200 besedah''' (+- dvajset besed) - najkasneje do dne ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge na ~5-12 straneh A4 (pisava 12, enojni razmak, 2,5 cm robovi). Zelo pomembno je, da je obseg od 2700 do 3000 besed , a ne več kot 3500 besed. Seminarska naloga mora vsebovati najmanj tri slike. Eno sliko morate narisati sami in to pod sliko posebej označiti. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. 
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke (v elektronski obliki) in podajo oceno pisnega dela. Popravljen seminar oddajte z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/poslji/ tega obrazca].
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 20 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni.
* Predstavitvi sledi razprava. Recenzenti podajo oceno predstavitve in postavijo najmanj dve vprašanji.Vsi ostali morajo postaviti še dve dodatni vprašanji v toku celega seminarskega obdobja. Vprašanja, ki ste jih postavili vpišite na [https://docs.google.com/forms/d/e/1FAIpQLSdV9OFlNzI3XyS8FRGnuIbG89gwH_36uwz29ocigV--2CXSbQ/viewform tukaj].
* Na dan predstavitve morate docentu še pred predstavitvijo oddati končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu, elektronsko verzijo seminarja in predstavitev pa oddati na strežnik na dan predstavitve do polnoči.
* Seminarska naloga in povzetek morajo biti v slovenskem jeziku, razen za študente, katerih materni jezik ni slovenščina. Ti lahko oddajo seminar v angleškem jeziku.

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki mi jih pošiljate poimenujete po naslednjem receptu:
* 312_BIO_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor.docx
* 312_BIO_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* 312_BIO_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. 312_BIO_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* 312_BIO_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr 312_BIO_Guncar_Gregor.pptx
* 312_BIO_Priimek_ime_poprava.doc(x) za popravljeno končno verzijo seminarja, če so popravki manjši

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [https://docs.google.com/forms/d/1EQDYwFO-DEzZ2R7jf8DhLqIeV4FFxRd3-ScceEASpt4/viewform recenzentsko poročilo] na spletu. Recenzentsko poročilo morate oddati najkasneje do 21:00, en dan pred predstavitvijo seminarja.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik odda svoje mnenje o predstavitvi takoj po predstavitvi z online glasovanjem.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Citiranje virov==
Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se držite ene same. V seminarskih nalogah in diplomskih nalogah FKKT uprabljajte shemo citiranja, ki je pobarvana zeleno.
Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati.
Za citate v naravoslovju je najpogostejše citiranje po pravilniku ISO 690. [http://www.zveza-zotks.si/gzm/dokumenti/literatura.html Pravila], ki upoštevajo omenjeni standard, so pripravili pri ZTKS. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. 
'''Citiranje knjig:''' 
Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. 
Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. 

Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. 
Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. 
Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.).

'''Citiranje člankov:''' 
Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. 
Lartigue, C., Glass, J. I., Alperovich, N., Pieper, R., Parmar, P. P., Hutchison III, C. A., Smith, H. O. in Venter, J. C.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, 317, str. 632-638.

Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: 
Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. 
Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.

Revija Science uporablja skrajšani zapis: 
C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) 

V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). Navesti morate tudi vse avtorje dela, razen v primeru, ko jih je 10 ali več. Takrat navedite le prvih devet, za ostale pa uporabite okrajšavo in sod. (in sodelavci). Pred zadnjim avtorjem naj bo vedno besedica "in".

'''Citiranje spletnih virov:''' 
Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov 
strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life 
Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2019 Povzetki seminarjev

2019-03-02T17:01:34Z

NinaV: /* Timotej Zgonik: Vijačna struktura v biomolekulah se lahko razvije na dokaj preprost način */

=== Maja Kolar: Pomen velikosti aksonskih mitohondrijev v možganih ===
Nevroni spadajo med najbolj polarizirane celice v naravi. To jim omogoča oblikovanje različnih lokaliziranih struktur, kot so akson in dendriti. Možgansko skorjo sestavljajo kortikalni nevroni, v katerih se oblike mitohondrijev razlikujejo glede na lokacijo; v dendritih in somi so dolge, cevaste oblike, medtem ko so v izrastkih aksona veliko krajši in kroglasti. Majhnost aksonskih mitohondrijev je povezana predvsem s fizijo oz. binarno cepitvijo, ki poteka prek oligomerizacije Drp1 proteina iz skupine dinaminov zunanji membrani. Ker je Drp1 citoplazemski protein, se z mitohondrijsko zunanjo membrano veže prek 4 različnih receptorjev, nevroznanstveniki Univerze v Columbiji, Lewis in sodelavci, pa so raziskovali predvsem receptor MFF (ang. mitochondrial fission factor), saj je v kortikalnih nevronih najpogostejši. Ekspresijo MFF gena so Lewis in sodelavci zavirali prek uporabe shRNA (ang. short hairpin RNA) ki je umetno izdelan RNA in se uporablja za RNA posege pri zaviranju ekspresije tarčnih genov. Z raziskavo so dokazali, da MFF nima znatnega vpliva na membranski potencial mitohondrijev in na njihovo skupno sposobnost pridelave ATP, je pa z zmanjšanim delovanjem izrazito vplival na povečanje presinaptičnih mitohondrijev. To je povečalo mitohondrijsko sposobnost absorpcije Ca2+ ionov med nevrotransmisijo, kar je vodilo do zmanjšanega presinaptičnega citoplazemskega kopičenja Ca2+. Posledično se je zmanjšalo sproščanje nevrotransmitorjev v sinaptično špranjo, zmanjšala aksonska razvejanost v možganih in oslabila medsebojna povezanost nevronov.
=== Timotej Zgonik: Vijačna struktura v biomolekulah se lahko razvije na dokaj preprost način ===
Že dolgo časa v biokemiji obstaja problem, kako so iz akiralnih molekul nastali kiralni komplesksi, saj je pri eksperimentih vedno bilo treba dodati kiralni center, da so se ostale molekule pravilno zvile. Raziskovalci Tehnološkega inštituta v Georgiji so izvedli tri eksperimente, ki so demonstrirali tvorbo homokiralnih struktur iz akiralnih komponent. V prvem eksperimentu so pripravili raztopino triaminopirimidina (TAP) in 6-(2,4,6-triokso-1,3,5-triazinan-1-il)heksanojske kisline (CyCo6). Spojini sta se povezali v heksamerne rozete, te pa so se nalagale v stolpiče tako leve in desne kiralnosti. Ko so v drugem eksperimentu v raztopini zamenjali CyCo6 z analogno, a kiralno spojino, je bila kiralnost vseh posledično nastalih struktur enaka. Tudi če je bila le vsaka tisoča molekula CyCo6 zamenjana s kiralnim analogom, so bile strukture še vedno homokiralne. Enako je veljalo tudi, če sta bila v raztopini prisotna enantiomera obeh kiralnosti, a je bil eden v rahlem presežku. Pri tretjem poskusu so rezultate uspeli ponoviti tudi za organske spojine, ki bi na Zemlji lahko bile prisotne pred nastankom življenja, čeprav je bil pri tem bil učinek ojačitve kiralnosti šibkejši, enantiomerski presežek, potreben za homokiralnost, pa večji. Vendarle gre pri tem za prvi primer, ko so spontano nastali analogi nukleotidov povzročili tvorbo homokiralnih struktur.

=== Nina Varda: Kompleksne molekule, ki se zvijajo kot proteini, lahko nastanejo spontano ===
Proteini in nukleinske kisline so ključne za delovanje živih organizmov. Zanje je značilno, da se zvijejo v posebne konformacije, ki določajo njihove funkcije. A načrt po katerem bi se makromolekule zvijale še ni bil odkrit. Tako se je razvilo področje raziskovanja foldamerov (sintetičnih oligomerov, ki se zvijajo v sekundarne in terciarne strukture npr. v vijačnice in plošče). Otto in sodelavci so v svoji raziskavi predstavili kompleksno molekulo, ki lahko nastane spontano. Iz gradnika, ki ga sestavljata aminokislinska in adeninska podenota, so pridobili makrocikel iz 15 gradnikov. 15mer se je tako v kristalni obliki, kot tudi v raztopini zvil, zaradi nekovalentnih interakcij med gradniki. Najbolj opazen strukturni motiv je nalaganje aromatskih obročev v kupe (sekundarne strukture). Ena molekula se zvije v 5 kupov, pri čemer je vsak sestavljen iz treh fenilnih obročev in dveh adeninskih obročev. Ker so kupi med sabo orientirani, je prisotna tudi terciarna struktura. Pri nekaterih foldamerih so že bile odkrite katalitske in inhibitorne lastnosti. Ker so foldameri, ki so zaradi svoje terciarne zgradbe relativno kompleksni, sposobni spontanega nastanka, je možno, da so se pojavili in imeli pomembno vlogo že v zgodnjih fazah nastanka življenja.

TBK2017 Povzetki seminarjev

2019-03-01T07:06:02Z

NinaV: /* Nina Varda: Kompleksne molekule, ki se zvijajo kot proteini, lahko nastanejo spontano */

[[TBK2017-seminar|Nazaj na osnovno stran]]
===Ana Scott: Nukleaza, ki povzroči partanatos oziroma od PARP-1 odvisno celično smrt===

Partanatos je ena izmed vrst celične smrti, ki nastopi zaradi prevelike aktivnosti poli(ADP-riboza) polimeraze 1 (PARP-1) v jedru. Pogost je v primeru možganske kapi, infarkta in nevrodegenerativnih boleznih, zaradi česar bi boljše poznavanje samega procesa omogočilo razvoj novih načinov zdravljenja teh obolenj. V predhodnih raziskavah so ugotovili, da partanatos nastopi, ko molekule poli-ADP-riboze, ki jih PARP-1 sintetizira, preidejo iz jedra v citosol, kjer aktivirajo premestitev indukcijskega faktorja apoptoze (AIF) iz mitohondrijev v jedro. Temu sledi razrez DNA. Nukleaza, ki povzroči razrez DNA, je bila do nedavnega manjkajoči člen v partanatosu. Skupini raziskovalcev je uspelo odkriti, da je iskana nukleaza inhibitorni dejavnik migracije makrofagov (MIF). Pokazali so, da se med partanatosom MIF veže na AIF in se skupaj z njim premesti v jedro, kjer povzroči fragmentacijo DNA. Inhibicija nukleazne aktivnosti MIF se je v modelu možganske kapi pri miših odrazila v 75-odstotnem zmanjšanju volumna prizadetega tkiva, pospešeno pa je bilo tudi okrevanje. Rezultati raziskave odpirajo potencialne možnosti za zdravljenje akutnih in kroničnih nevroloških bolezni, v katerih nastopi partanatos.

===Nina Varda: Kompleksne molekule, ki se zvijajo kot proteini, lahko nastanejo spontano===

Proteini in nukleinske kisline so ključne za delovanje živih organizmov. Zanje je značilno, da se zvijejo v posebne konformacije, ki določajo njihove funkcije. A načrt po katerem bi se makromolekule zvijale še ni bil odkrit. Tako se je razvilo področje raziskovanja foldamerov (sintetičnih oligomerov, ki se zvijajo v sekundarne in terciarne strukture npr. v vijačnice in plošče). Otto in sodelavci so v svoji raziskavi predstavili kompleksno molekulo, ki lahko nastane spontano. Iz gradnika, ki ga sestavljata aminokislinska in adeninska podenota, so pridobili makrocikel iz 15 gradnikov. 15mer se je tako v kristalni obliki, kot tudi v raztopini zvil, zaradi nekovalentnih interakcij med gradniki. Najbolj opazen strukturni motiv je nalaganje aromatskih obročev v kupe (sekundarne strukture). Ena molekula se zvije v 5 kupov, pri čemer je vsak sestavljen iz treh fenilnih obročev in dveh adeninskih obročev. Ker so kupi med sabo orientirani, je prisotna tudi terciarna struktura. Pri nekaterih foldamerih so že bile odkrite katalitske in inhibitorne lastnosti. Ker so foldameri, ki so zaradi svoje terciarne zgradbe relativno kompleksni, sposobni spontanega nastanka, je možno, da so se pojavili in imeli pomembno vlogo že v zgodnjih fazah nastanka življenja.

===Anja Konjc: Nanodelci v boju proti raku===

Nanodelci postajajo čedalje pomembnejši pri razvoju zdravil, saj imajo določene posebnosti, ki omogočajo tarčno usmerjanje zdravil in zmanjševanje njihovih stranskih učinkov (npr. pri kemoterapiji). Vendar so predhodne raziskave pokazale določene pomanjkljivosti. S sintezo posebnega ščita, imenovanega proteinski koronski ščit (PCS), so raziskovalci rešili te omejitve. Ugotovili so namreč, da PCS zmanjša interakcije nanodelcev s serumskimi proteini in omogoči, da makrofagi teh delcev ne fagocitirajo. Tako nanodelci ostanejo več časa v krvi in prenesejo zdravila na ciljno mesto (npr. v tumorje). Nanodelci so namreč sposobni prenašati sorazmerno velike količine molekul (npr. zdravil), ki jih vstavimo v njihove pore. Znanstveniki so PCS sintetizirali tako, da so nanodelce prevlekli s posebnimi proteini. Obnašanje tako prevlečenih nanodelcev so opazovali z različnimi poskusi. Ko so mišim vbrizgali različne nanodelce, so ugotovili, da so se v tumorjih najbolj nakopičili tisti s PCS. To je dokazalo hipotezo, da lahko ti nanodelci uspešno prinesejo zdravila v tumorje, ne da bi pri tem prišlo do imunskega odziva, torej fagocitoze delcev. Zato bodo tudi v prihodnje nanodelci s PCS imeli pomembno vlogo pri zdravljenju različnih obolenj, ne le rakavih, saj povečujejo učinkovitost zdravljenja.

TBK2017 Povzetki seminarjev

2019-02-28T20:30:33Z

NinaV: /* Ana Scott: Nukleaza, ki povzroči partanatos oziroma od PARP-1 odvisno celično smrt */

TBK2019-seminar

2019-02-21T07:52:44Z

NinaV: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Maša Andoljšek||Zrele človeške celice lahko spremenijo svojo funkcijo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190213132309.htm||21.02.||22.02.||25.02.|| Isidora Stevanoska|| Tina Arnšek|| Lena Trnovec
|-
| Maja Trifkovič||naslov||povezava do novice||21.02.||22.02.||25.02.|| Manca Osolin|| Tadej Uršič|| Ana Vičič
|-
| Teo Nograšek||Kako se proteini vgradijo v celično membrano||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||21.02.||22.02.||25.02.|| Ajda Košorok|| Ana Potočnik|| Maša Gabrič
|-
| Maja Kolar||Vpliv aksonskih mitohondrijev v možganih na prenos impulzov ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181127110959.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Hana Zajc|| Mateja Milošević|| Laura Unuk
|-
| Nina Varda||Kompleksne molekule, ki se zvijajo kot proteini, lahko nastanejo spontano||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190117110824.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Katja Benčuk|| Nastja Feguš|| Sašo Jakob
|-
| Anja Konjc||||||28.02.||01.03.||04.03.|| Tina Logonder|| Maja Mahorič|| Alliana Kolar
|-
| Timotej Zgonik||Vijačna struktura v biomolekulah se lahko razvije na dokaj preprost način||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190124095112.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Špela Sotlar|| Nika Banovšek|| Nika Ramšak
|-
| Ela Sabadin||||||05.03.||08.03.||11.03.|| Maša Andoljšek|| Greta Junger|| Tim Nograšek
|-
| Kim Glavič||||||05.03.||08.03.||11.03.|| Maja Trifkovič|| Isidora Stevanoska|| Žan Fortuna
|-
| Oskar Nemec||Shizofrenija je povezana z nenavadnim imunskim odzivom na virus Epstein-Barr||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190109090911.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Teo Nograšek|| Manca Osolin|| Jure Povšin
|-
| Vivian Nemanič||||||05.03.||08.03.||11.03.|| Maja Kolar|| Ajda Košorok|| Jernej Kastelic
|-
| Srna Anastasovska||||||12.03.||15.03.||18.03.|| Nina Varda|| Hana Zajc|| Tina Arnšek
|-
| Karmen Ferjan||||||12.03.||15.03.||18.03.|| Anja Konjc|| Katja Benčuk|| Tadej Uršič
|-
| Ana Babnik||||||12.03.||15.03.||18.03.|| Timotej Zgonik|| Tina Logonder|| Ana Potočnik
|-
| Aleksandra Rauter||||||12.03.||15.03.||18.03.|| Ela Sabadin|| Špela Sotlar|| Mateja Milošević
|-
| Nika Vegelj||||||19.03.||22.03.||25.03.|| Kim Glavič|| Maša Andoljšek|| Nastja Feguš
|-
| Adela Šajn||||||19.03.||22.03.||25.03.|| Oskar Nemec|| Maja Trifkovič|| Maja Mahorič
|-
| Michelle Oletič||||||19.03.||22.03.||25.03.|| Vivian Nemanič|| Teo Nograšek|| Nika Banovšek
|-
| Tevž Levstek||||||19.03.||22.03.||25.03.|| Srna Anastasovska|| Maja Kolar|| Greta Junger
|-
| Matevž Drnovšek||||||26.03.||29.03.||01.04.|| Karmen Ferjan|| Nina Varda|| Isidora Stevanoska
|-
| Marjeta Milostnik||||||26.03.||29.03.||01.04.|| Ana Babnik|| Anja Konjc|| Manca Osolin
|-
| Lena Trnovec||||||26.03.||29.03.||01.04.|| Aleksandra Rauter|| Timotej Zgonik|| Ajda Košorok
|-
| Ana Vičič||||||26.03.||29.03.||01.04.|| Nika Vegelj|| Ela Sabadin|| Hana Zajc
|-
| Maša Gabrič||||||02.04.||05.04.||08.04.|| Adela Šajn|| Kim Glavič|| Katja Benčuk
|-
| Laura Unuk||||||02.04.||05.04.||08.04.|| Michelle Oletič|| Oskar Nemec|| Tina Logonder
|-
| Sašo Jakob||Terapija pljučnih bolezni z vdihavanjem mRNA ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190104104032.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Tevž Levstek|| Vivian Nemanič|| Špela Sotlar
|-
| Alliana Kolar||||||02.04.||05.04.||08.04.|| Matevž Drnovšek|| Srna Anastasovska|| Maša Andoljšek
|-
| Nika Ramšak||||||09.04.||12.04.||15.04.|| Marjeta Milostnik|| Karmen Ferjan|| Maja Trifkovič
|-
| Tim Nograšek||||||09.04.||12.04.||15.04.|| Lena Trnovec|| Ana Babnik|| Teo Nograšek
|-
| Žan Fortuna||||||09.04.||12.04.||15.04.|| Ana Vičič|| Aleksandra Rauter|| Maja Kolar
|-
| Jure Povšin||||||09.04.||12.04.||15.04.|| Maša Gabrič|| Nika Vegelj|| Nina Varda
|-
| Jernej Kastelic||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Laura Unuk|| Adela Šajn|| Anja Konjc
|-
| Tina Arnšek||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Sašo Jakob|| Michelle Oletič|| Timotej Zgonik
|-
| Tadej Uršič||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Alliana Kolar|| Tevž Levstek|| Ela Sabadin
|-
| Ana Potočnik||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Nika Ramšak|| Matevž Drnovšek|| Kim Glavič
|-
| Mateja Milošević||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Tim Nograšek|| Marjeta Milostnik|| Oskar Nemec
|-
| Nastja Feguš||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Žan Fortuna|| Lena Trnovec|| Vivian Nemanič
|-
| Maja Mahorič||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Jure Povšin|| Ana Vičič|| Srna Anastasovska
|-
| Nika Banovšek||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Jernej Kastelic|| Maša Gabrič|| Karmen Ferjan
|-
| Greta Junger||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Tina Arnšek|| Laura Unuk|| Ana Babnik
|-
| Isidora Stevanoska||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Tadej Uršič|| Sašo Jakob|| Aleksandra Rauter
|-
| Manca Osolin||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Ana Potočnik|| Alliana Kolar|| Nika Vegelj
|-
| Ajda Košorok||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Mateja Milošević|| Nika Ramšak|| Adela Šajn
|-
| Hana Zajc||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Nastja Feguš|| Tim Nograšek|| Michelle Oletič
|-
| Katja Benčuk||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Maja Mahorič|| Žan Fortuna|| Tevž Levstek
|-
| Tina Logonder||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Nika Banovšek|| Jure Povšin|| Matevž Drnovšek
|-
| Špela Sotlar||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Greta Junger|| Jernej Kastelic|| Marjeta Milostnik

|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2018. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2019_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2019_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2019_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2019_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2019_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2019_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.

TBK2019-seminar

2019-02-20T23:01:55Z

NinaV: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Maša Andoljšek||Zrele človeške celice lahko spremenijo svojo funkcijo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190213132309.htm||21.02.||22.02.||25.02.|| Isidora Stevanoska|| Tina Arnšek|| Lena Trnovec
|-
| Maja Trifkovič||naslov||povezava do novice||21.02.||22.02.||25.02.|| Manca Osolin|| Tadej Uršič|| Ana Vičič
|-
| Teo Nograšek||Kako se proteini vgradijo v celično membrano||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||21.02.||22.02.||25.02.|| Ajda Košorok|| Ana Potočnik|| Maša Gabrič
|-
| Maja Kolar||Vpliv aksonskih mitohondrijev v možganih na prenos impulzov ||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181127110959.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Hana Zajc|| Mateja Milošević|| Laura Unuk
|-
| Nina Varda||Nadzor kromosomov: ena od nalog heterokromatina||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190124095045.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Katja Benčuk|| Nastja Feguš|| Sašo Jakob
|-
| Anja Konjc||||||28.02.||01.03.||04.03.|| Tina Logonder|| Maja Mahorič|| Alliana Kolar
|-
| Timotej Zgonik||Vijačna struktura v biomolekulah se lahko razvije na dokaj preprost način||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190124095112.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Špela Sotlar|| Nika Banovšek|| Nika Ramšak
|-
| Ela Sabadin||||||05.03.||08.03.||11.03.|| Maša Andoljšek|| Greta Junger|| Tim Nograšek
|-
| Kim Glavič||||||05.03.||08.03.||11.03.|| Maja Trifkovič|| Isidora Stevanoska|| Žan Fortuna
|-
| Oskar Nemec||Shizofrenija je povezana z nenavadnim imunskim odzivom na virus Epstein-Barr||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190109090911.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Teo Nograšek|| Manca Osolin|| Jure Povšin
|-
| Vivian Nemanič||||||05.03.||08.03.||11.03.|| Maja Kolar|| Ajda Košorok|| Jernej Kastelic
|-
| Srna Anastasovska||||||12.03.||15.03.||18.03.|| Nina Varda|| Hana Zajc|| Tina Arnšek
|-
| Karmen Ferjan||||||12.03.||15.03.||18.03.|| Anja Konjc|| Katja Benčuk|| Tadej Uršič
|-
| Ana Babnik||||||12.03.||15.03.||18.03.|| Timotej Zgonik|| Tina Logonder|| Ana Potočnik
|-
| Aleksandra Rauter||||||12.03.||15.03.||18.03.|| Ela Sabadin|| Špela Sotlar|| Mateja Milošević
|-
| Nika Vegelj||||||19.03.||22.03.||25.03.|| Kim Glavič|| Maša Andoljšek|| Nastja Feguš
|-
| Adela Šajn||||||19.03.||22.03.||25.03.|| Oskar Nemec|| Maja Trifkovič|| Maja Mahorič
|-
| Michelle Oletič||||||19.03.||22.03.||25.03.|| Vivian Nemanič|| Teo Nograšek|| Nika Banovšek
|-
| Tevž Levstek||||||19.03.||22.03.||25.03.|| Srna Anastasovska|| Maja Kolar|| Greta Junger
|-
| Matevž Drnovšek||||||26.03.||29.03.||01.04.|| Karmen Ferjan|| Nina Varda|| Isidora Stevanoska
|-
| Marjeta Milostnik||||||26.03.||29.03.||01.04.|| Ana Babnik|| Anja Konjc|| Manca Osolin
|-
| Lena Trnovec||||||26.03.||29.03.||01.04.|| Aleksandra Rauter|| Timotej Zgonik|| Ajda Košorok
|-
| Ana Vičič||||||26.03.||29.03.||01.04.|| Nika Vegelj|| Ela Sabadin|| Hana Zajc
|-
| Maša Gabrič||||||02.04.||05.04.||08.04.|| Adela Šajn|| Kim Glavič|| Katja Benčuk
|-
| Laura Unuk||||||02.04.||05.04.||08.04.|| Michelle Oletič|| Oskar Nemec|| Tina Logonder
|-
| Sašo Jakob||Terapija pljučnih bolezni z vdihavanjem mRNA ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190104104032.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Tevž Levstek|| Vivian Nemanič|| Špela Sotlar
|-
| Alliana Kolar||||||02.04.||05.04.||08.04.|| Matevž Drnovšek|| Srna Anastasovska|| Maša Andoljšek
|-
| Nika Ramšak||||||09.04.||12.04.||15.04.|| Marjeta Milostnik|| Karmen Ferjan|| Maja Trifkovič
|-
| Tim Nograšek||||||09.04.||12.04.||15.04.|| Lena Trnovec|| Ana Babnik|| Teo Nograšek
|-
| Žan Fortuna||||||09.04.||12.04.||15.04.|| Ana Vičič|| Aleksandra Rauter|| Maja Kolar
|-
| Jure Povšin||||||09.04.||12.04.||15.04.|| Maša Gabrič|| Nika Vegelj|| Nina Varda
|-
| Jernej Kastelic||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Laura Unuk|| Adela Šajn|| Anja Konjc
|-
| Tina Arnšek||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Sašo Jakob|| Michelle Oletič|| Timotej Zgonik
|-
| Tadej Uršič||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Alliana Kolar|| Tevž Levstek|| Ela Sabadin
|-
| Ana Potočnik||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Nika Ramšak|| Matevž Drnovšek|| Kim Glavič
|-
| Mateja Milošević||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Tim Nograšek|| Marjeta Milostnik|| Oskar Nemec
|-
| Nastja Feguš||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Žan Fortuna|| Lena Trnovec|| Vivian Nemanič
|-
| Maja Mahorič||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Jure Povšin|| Ana Vičič|| Srna Anastasovska
|-
| Nika Banovšek||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Jernej Kastelic|| Maša Gabrič|| Karmen Ferjan
|-
| Greta Junger||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Tina Arnšek|| Laura Unuk|| Ana Babnik
|-
| Isidora Stevanoska||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Tadej Uršič|| Sašo Jakob|| Aleksandra Rauter
|-
| Manca Osolin||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Ana Potočnik|| Alliana Kolar|| Nika Vegelj
|-
| Ajda Košorok||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Mateja Milošević|| Nika Ramšak|| Adela Šajn
|-
| Hana Zajc||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Nastja Feguš|| Tim Nograšek|| Michelle Oletič
|-
| Katja Benčuk||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Maja Mahorič|| Žan Fortuna|| Tevž Levstek
|-
| Tina Logonder||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Nika Banovšek|| Jure Povšin|| Matevž Drnovšek
|-
| Špela Sotlar||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Greta Junger|| Jernej Kastelic|| Marjeta Milostnik

|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2018. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2017 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2019_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2019_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2019_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2019_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2019_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2019_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.