Wiki FKKT - User contributions [en]

Identifikacija okoljskih žarišč in strategij za izboljšanje proizvodnje vanilina z oceno življenjskega cikla.

2021-05-27T11:21:54Z

Ninalukancic:

== UVOD ==

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksi benzaldehid) je pomembna aromatska spojina. Uporabljamo ga v farmacevtski, kozmetični in živilski industriji. Je intermediat pri sintezi arom, deodorantov in krem za sončenje. Vanilin lahko naravno pridobimo iz strokov vanilije (manj kot 0,2% svetovnega povpraševanja) ali pa s pomočjo sinteze, ki predstavlja večinski delež proizvodnje [1]. V študiji želijo s pomočjo ocene življenjskega cikla (LCA) zmanjšati potencialno negativne vplive proizvodnje vanilina na okolje. Osredotočili so se na štiri različne postopke sinteze. Na podlagi pridobljenih rezultatov so predlagane izboljšave za trajnosten in okolju prijazen način proizvodnje vanilina [2].

== PROIZVODNJA VANILINA IN REZULTATI ==

'''2.1 SINTEZA VANILINA Z 2-BROMO-4-METIL FENOLOM'''

Sinteza poteka v štirih korakih. Tekom sinteze se porabi ogromno električne energije zaradi oksidacijskih reakcij. Ki zahtevajo neprekinjeno delovanje črpalk. Prav tako se tekom oksidacije porabi veliko energije za vzdrževanje temperaturnih pogojev in visokega tlaka [2].

'''2.2. SINTEZA VANILINA Z GVAJAKOLOM'''

Sinteza poteka v štirih korakih. Ozko grlo procesa je v tretjem koraku, ko se uporabi natrijev hidroksid ali klorovodikova kislina za ohranitev alkalnega ali kislega okolje. V tem koraku je potrebno tudi veliko število organskih topil (toluen, etil acetat). Omejeni organski topili povzročata draženje in lahko toksično vplivata na ljudi. Dosedanje študije so pokazale, da je ena glavnih pomanjkljivosti gvajakolskega procesa ta, da ustvarja številne stranske produkte in odpadke [2].

'''2.3. BIOSINTEZA VANILINA Z IZOEVGENOLOM''' (''Pichia pastoris'')

V tem procesu so gen za izoevgenol monooksidazo kloniran iz metagenomske DNA iz tal in heterologno izrazili v ''Pichia pastoris''. Izoevgenol monooksigenaza je ključni encim za pretvorbo izoevgenola v vanilin. Biosinteza poteka v petih stopnjah. Zaradi stroge specifičnosti encimske reakcije nastane manj stranskih produktov kot pri drugih sintezah [2].

'''2.4. BIOSINTEZA VANILINA S FERULNO KISLINO''' (''Pseudomonas fluorescens'')

Za razvoj robustne bakterije, ki lahko proizvede velike količine vanilina so gen za vanilin dehidrogenazo (vdh) pri sevu ''Pseudomonas fluorescens'' BF13 inaktiviral s ciljno mutagenezo. Tekom procesa se porabi veliko energije in ultra čiste vode. Priprava ultra čiste vode je zapletena in vključuje številne tehnologije čiščenja, kot je adsorpcijska filtracija, reverzna osmoza in ionsko izmenjava. Ta postopek sprošča tudi različne okodljive spojine v zrak, podtalnico in površinsko vodo, kar povzroča precejšen pritisk na okolje [2].

== ZAKLJUČEK ==

Ocena življenjskega cikla je v tej študiji upoštevala le vplive na okolje. Predlagane izboljšave temeljijo predvsem na uporabi destilirane ali industrijske vode tekom vseh štirih opisanih postopkov proizvodnje vanilina. Prav tako, lahko zmanjšamo negativni vpliv na okolje z izbiro alternativnih virov energije (zemeljski plin, sončna, veterna energija) namesto premoga. Ker se vanilin proizvaja v komercialne namene je v oceno življenjskega cikla potrebno všteti še stroške surovin, ceno opreme in obratovalnega cikla. S tem bi oceno življenjskega cikla za sintezo vanilina izpopolnili.

== VIRI ==

[1] Martău G.A. et al. Bio-vanillin: Towards a sustainable industrial production (2021). Trends in food science and technology. Volume 109, stran 579-592.

[2] Y. Zhao et. al. Identifying environmental hotspots and improvement strategies of vanillin production with life cycle assessment (2021). Science of the total environment, stran 769.

Identifikacija okoljskih žarišč in strategij za izboljšanje proizvodnje vanilina z oceno življenjskega cikla.

2021-05-27T11:21:19Z

Ninalukancic: /* PROIZVODNJA VANILINA IN REZULTATI */

== UVOD ==

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksi benzaldehid) je pomembna aromatska spojina. Uporabljamo ga v farmacevtski, kozmetični in živilski industriji. Je intermediat pri sintezi arom, deodorantov in krem za sončenje. Vanilin lahko naravno pridobimo iz strokov vanilije (manj kot 0,2% svetovnega povpraševanja) ali pa s pomočjo sinteze, ki predstavlja večinski delež proizvodnje [1]. V študiji želijo s pomočjo ocene življenjskega cikla (LCA) zmanjšati potencialno negativne vplive proizvodnje vanilina na okolje. Osredotočili so se na 4 različne postopke sinteze. Na podlagi pridobljenih rezultatov so predlagane izboljšave za trajnosten in okolju prijazen način proizvodnje vanilina [2].

== PROIZVODNJA VANILINA IN REZULTATI ==

'''2.1 SINTEZA VANILINA Z 2-BROMO-4-METIL FENOLOM'''

Sinteza poteka v štirih korakih. Tekom sinteze se porabi ogromno električne energije zaradi oksidacijskih reakcij. Ki zahtevajo neprekinjeno delovanje črpalk. Prav tako se tekom oksidacije porabi veliko energije za vzdrževanje temperaturnih pogojev in visokega tlaka [2].

'''2.2. SINTEZA VANILINA Z GVAJAKOLOM'''

Sinteza poteka v 4 korakih. Ozko grlo procesa je v tretjem koraku, ko se uporabi natrijev hidroksid ali klorovodikova kislina za ohranitev alkalnega ali kislega okolje. V tem koraku je potrebno tudi veliko število organskih topil (toluen, etil acetat). Omejeni organski topili povzročata draženje in lahko toksično vplivata na ljudi. Dosedanje študije so pokazale, da je ena glavnih pomanjkljivosti gvajakolskega procesa ta, da ustvarja številne stranske produkte in odpadke [2].

'''2.3. BIOSINTEZA VANILINA Z IZOEVGENOLOM''' (''Pichia pastoris'')

V tem procesu so gen za izoevgenol monooksidazo kloniran iz metagenomske DNA iz tal in heterologno izrazili v ''Pichia pastoris''. Izoevgenol monooksigenaza je ključni encim za pretvorbo izoevgenola v vanilin. Biosinteza poteka v petih stopnjah. Zaradi stroge specifičnosti encimske reakcije nastane manj stranskih produktov kot pri drugih sintezah [2].

'''2.4. BIOSINTEZA VANILINA S FERULNO KISLINO''' (''Pseudomonas fluorescens'')

Za razvoj robustne bakterije, ki lahko proizvede velike količine vanilina so gen za vanilin dehidrogenazo (vdh) pri sevu ''Pseudomonas fluorescens'' BF13 inaktiviral s ciljno mutagenezo. Tekom procesa se porabi veliko energije in ultra čiste vode. Priprava ultra čiste vode je zapletena in vključuje številne tehnologije čiščenja, kot je adsorpcijska filtracija, reverzna osmoza in ionsko izmenjava. Ta postopek sprošča tudi različne okodljive spojine v zrak, podtalnico in površinsko vodo, kar povzroča precejšen pritisk na okolje [2].

== ZAKLJUČEK ==

Ocena življenjskega cikla je v tej študiji upoštevala le vplive na okolje. Predlagane izboljšave temeljijo predvsem na uporabi destilirane ali industrijske vode tekom vseh štirih opisanih postopkov proizvodnje vanilina. Prav tako, lahko zmanjšamo negativni vpliv na okolje z izbiro alternativnih virov energije (zemeljski plin, sončna, veterna energija) namesto premoga. Ker se vanilin proizvaja v komercialne namene je v oceno življenjskega cikla potrebno všteti še stroške surovin, ceno opreme in obratovalnega cikla. S tem bi oceno življenjskega cikla za sintezo vanilina izpopolnili.

== VIRI ==

[1] Martău G.A. et al. Bio-vanillin: Towards a sustainable industrial production (2021). Trends in food science and technology. Volume 109, stran 579-592.

[2] Y. Zhao et. al. Identifying environmental hotspots and improvement strategies of vanillin production with life cycle assessment (2021). Science of the total environment, stran 769.

Identifikacija okoljskih žarišč in strategij za izboljšanje proizvodnje vanilina z oceno življenjskega cikla.

2021-05-27T11:20:52Z

Ninalukancic: /* PROIZVODNJA VANILINA IN REZULTATI */

== UVOD ==

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksi benzaldehid) je pomembna aromatska spojina. Uporabljamo ga v farmacevtski, kozmetični in živilski industriji. Je intermediat pri sintezi arom, deodorantov in krem za sončenje. Vanilin lahko naravno pridobimo iz strokov vanilije (manj kot 0,2% svetovnega povpraševanja) ali pa s pomočjo sinteze, ki predstavlja večinski delež proizvodnje [1]. V študiji želijo s pomočjo ocene življenjskega cikla (LCA) zmanjšati potencialno negativne vplive proizvodnje vanilina na okolje. Osredotočili so se na 4 različne postopke sinteze. Na podlagi pridobljenih rezultatov so predlagane izboljšave za trajnosten in okolju prijazen način proizvodnje vanilina [2].

== PROIZVODNJA VANILINA IN REZULTATI ==

'''2.1 SINTEZA VANILINA Z 2-BROMO-4-METIL FENOLOM'''

Sinteza poteka v štirih korakih. Tekom sinteze se porabi ogromno električne energije zaradi oksidacijskih reakcij. Ki zahtevajo neprekinjeno delovanje črpalk. Prav tako se tekom oksidacije porabi veliko energije za vzdrževanje temperaturnih pogojev in visokega tlaka [2].

'''2.2. SINTEZA VANILINA Z GVAJAKOLOM'''

Sinteza poteka v 4 korakih. Ozko grlo procesa je v tretjem koraku, ko se uporabi natrijev hidroksid ali klorovodikova kislina za ohranitev alkalnega ali kislega okolje. V tem koraku je potrebno tudi veliko število organskih topil (toluen, etil acetat). Omejeni organski topili povzročata draženje in lahko toksično vplivata na ljudi. Dosedanje študije so pokazale, da je ena glavnih pomanjkljivosti gvajakolskega procesa ta, da ustvarja številne stranske produkte in odpadke [2].

'''2.3. BIOSINTEZA VANILINA Z IZOEVGENOLOM''' (''Pichia pastoris'')

V tem procesu so gen za izoevgenol monooksidazo kloniran iz metagenomske DNA iz tal in heterologno izrazili v ''Pichia pastoris''. Izoevgenol monooksigenaza je ključni encim za pretvorbo izoevgenola v vanilin. Biosinteza poteka v petih stopnjah. Zaradi stroge specifičnosti encimske reakcije nastane manj stranskih produktov kot pri drugih sintezah [2].

'''2.4. BIOSINTEZA VANILINA S FERULNO KISLINO''' (''Pseudomonas fluorescens'')

Za razvoj robustne bakterije, ki lahko proizvede velike količine vanilina, so gen za vanilin dehidrogenazo (vdh) pri sevu ''Pseudomonas fluorescens'' BF13 inaktiviral s ciljno mutagenezo. Tekom procesa se porabi veliko energije in ultra čiste vode. Priprava ultra čiste vode je zapletena in vključuje številne tehnologije čiščenja, kot je adsorpcijska filtracija, reverzna osmoza in ionsko izmenjava. Ta postopek sprošča tudi različne okodljive spojine v zrak, podtalnico in površinsko vodo, kar povzroča precejšen pritisk na okolje [2].

== ZAKLJUČEK ==

Ocena življenjskega cikla je v tej študiji upoštevala le vplive na okolje. Predlagane izboljšave temeljijo predvsem na uporabi destilirane ali industrijske vode tekom vseh štirih opisanih postopkov proizvodnje vanilina. Prav tako, lahko zmanjšamo negativni vpliv na okolje z izbiro alternativnih virov energije (zemeljski plin, sončna, veterna energija) namesto premoga. Ker se vanilin proizvaja v komercialne namene je v oceno življenjskega cikla potrebno všteti še stroške surovin, ceno opreme in obratovalnega cikla. S tem bi oceno življenjskega cikla za sintezo vanilina izpopolnili.

== VIRI ==

[1] Martău G.A. et al. Bio-vanillin: Towards a sustainable industrial production (2021). Trends in food science and technology. Volume 109, stran 579-592.

[2] Y. Zhao et. al. Identifying environmental hotspots and improvement strategies of vanillin production with life cycle assessment (2021). Science of the total environment, stran 769.

Identifikacija okoljskih žarišč in strategij za izboljšanje proizvodnje vanilina z oceno življenjskega cikla.

2021-05-27T11:18:52Z

Ninalukancic: /* UVOD */

== UVOD ==

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksi benzaldehid) je pomembna aromatska spojina. Uporabljamo ga v farmacevtski, kozmetični in živilski industriji. Je intermediat pri sintezi arom, deodorantov in krem za sončenje. Vanilin lahko naravno pridobimo iz strokov vanilije (manj kot 0,2% svetovnega povpraševanja) ali pa s pomočjo sinteze, ki predstavlja večinski delež proizvodnje [1]. V študiji želijo s pomočjo ocene življenjskega cikla (LCA) zmanjšati potencialno negativne vplive proizvodnje vanilina na okolje. Osredotočili so se na 4 različne postopke sinteze. Na podlagi pridobljenih rezultatov so predlagane izboljšave za trajnosten in okolju prijazen način proizvodnje vanilina [2].

== PROIZVODNJA VANILINA IN REZULTATI ==

'''2.1 SINTEZA VANILINA Z 2-BROMO-4-METIL FENOLOM'''

Sinteza poteka v štirih korakih. Tekom sinteze se porabi ogromno električne energije zaradi oksidacijskih reakcij. Ki zahtevajo neprekinjeno delovanje črpalk. Prav tako se tekom oksidacije porabi veliko energije za vzdrževanje temperaturnih pogojev in visokega tlaka [2].

'''2.2. SINTEZA VANILINA Z GVAJAKOLOM'''

Sinteza poteka v 4 korakih. Ozko grlo procesa je v tretjem koraku, ko se uporabi natrijev hidroksid ali klorovodikova kislina za ohranitev alkalnega ali kislega okolje. V tem koraku je potrebno tudi veliko število organskih topil (toluen, etil acetat). Omejeni organski topili povzročata draženje in lahko toksično vplivata na ljudi. Dosedanje študije so pokazale, da je ena glavnih pomanjkljivosti gvajakolskega procesa ta, da ustvarja številne stranske produkte in odpadke [2].

'''2.3. BIOSINTEZA VANILINA Z IZOEVGENOLOM''' (''Pichia pastoris'')

V tem procesu so gen za izoevgenol monooksidazo kloniran iz metagenomske DNA iz tal in heterologno izrazili v ''Pichia pastoris''. Izoevgenol monooksigenaza je ključni encim za pretvorbo izoevgenola v vanilin. Biosinteza poteka v petih stopnjah. Zaradi stroge specifičnosti encimske reakcije v je nastalo manj stranskih produktov kot pri drugih sintezah [2].

'''2.4. BIOSINTEZA VANILINA S FERULNO KISLINO''' (''Pseudomonas fluorescens'')

Za razvoj robustne bakterije, ki lahko proizvede velike količine vanilina, so gen za vanilin dehidrogenazo (vdh) pri sevu ''Pseudomonas fluorescens'' BF13 inaktiviral s ciljno mutagenezo. Tekom procesa se porabi veliko energije in ultra čiste vode. Priprava ultra čiste vode je zapletena in vključuje številne tehnologije čiščenja, kot je adsorpcijska filtracija, reverzna osmoza in ionsko izmenjava. Ta postopek sprošča tudi različne okodljive spojine v zrak, podtalnico in površinsko vodo, kar povzroča precejšen pritisk na okolje [2].

== ZAKLJUČEK ==

Ocena življenjskega cikla je v tej študiji upoštevala le vplive na okolje. Predlagane izboljšave temeljijo predvsem na uporabi destilirane ali industrijske vode tekom vseh štirih opisanih postopkov proizvodnje vanilina. Prav tako, lahko zmanjšamo negativni vpliv na okolje z izbiro alternativnih virov energije (zemeljski plin, sončna, veterna energija) namesto premoga. Ker se vanilin proizvaja v komercialne namene je v oceno življenjskega cikla potrebno všteti še stroške surovin, ceno opreme in obratovalnega cikla. S tem bi oceno življenjskega cikla za sintezo vanilina izpopolnili.

== VIRI ==

[1] Martău G.A. et al. Bio-vanillin: Towards a sustainable industrial production (2021). Trends in food science and technology. Volume 109, stran 579-592.

[2] Y. Zhao et. al. Identifying environmental hotspots and improvement strategies of vanillin production with life cycle assessment (2021). Science of the total environment, stran 769.

Identifikacija okoljskih žarišč in strategij za izboljšanje proizvodnje vanilina z oceno življenjskega cikla.

2021-05-27T11:18:20Z

Ninalukancic:

== UVOD ==

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksi benzaldehid) je pomembna aromatska spojina. Uporabljamo ga v farmacevtski, kozmetični in živilski industriji. Je intermediat pri sintezi arom, deodorantov in krem za sončenje. Vanilin lahko naravno pridobimo iz strokov vanilije (manj kot 0,2% svetovnega povpraševanja) ali pa s pomočjo sinteze, ki predstavlja večinski delež proizvodnje [1]. V študiji želijo s pomočjo ocene življenjskega cikla (LCA) zmanjšati potencialno negativne vplive proizvodnje vanilina na okolje. Osredotočili so se na 4 različne postopke sinteze. Na podlagi pridobljenih rezultatov so predlagane izboljšave za trajnosten in okolju prijazen način pridobitve vanilina [2].

== PROIZVODNJA VANILINA IN REZULTATI ==

'''2.1 SINTEZA VANILINA Z 2-BROMO-4-METIL FENOLOM'''

Sinteza poteka v štirih korakih. Tekom sinteze se porabi ogromno električne energije zaradi oksidacijskih reakcij. Ki zahtevajo neprekinjeno delovanje črpalk. Prav tako se tekom oksidacije porabi veliko energije za vzdrževanje temperaturnih pogojev in visokega tlaka [2].

'''2.2. SINTEZA VANILINA Z GVAJAKOLOM'''

Sinteza poteka v 4 korakih. Ozko grlo procesa je v tretjem koraku, ko se uporabi natrijev hidroksid ali klorovodikova kislina za ohranitev alkalnega ali kislega okolje. V tem koraku je potrebno tudi veliko število organskih topil (toluen, etil acetat). Omejeni organski topili povzročata draženje in lahko toksično vplivata na ljudi. Dosedanje študije so pokazale, da je ena glavnih pomanjkljivosti gvajakolskega procesa ta, da ustvarja številne stranske produkte in odpadke [2].

'''2.3. BIOSINTEZA VANILINA Z IZOEVGENOLOM''' (''Pichia pastoris'')

V tem procesu so gen za izoevgenol monooksidazo kloniran iz metagenomske DNA iz tal in heterologno izrazili v ''Pichia pastoris''. Izoevgenol monooksigenaza je ključni encim za pretvorbo izoevgenola v vanilin. Biosinteza poteka v petih stopnjah. Zaradi stroge specifičnosti encimske reakcije v je nastalo manj stranskih produktov kot pri drugih sintezah [2].

'''2.4. BIOSINTEZA VANILINA S FERULNO KISLINO''' (''Pseudomonas fluorescens'')

Za razvoj robustne bakterije, ki lahko proizvede velike količine vanilina, so gen za vanilin dehidrogenazo (vdh) pri sevu ''Pseudomonas fluorescens'' BF13 inaktiviral s ciljno mutagenezo. Tekom procesa se porabi veliko energije in ultra čiste vode. Priprava ultra čiste vode je zapletena in vključuje številne tehnologije čiščenja, kot je adsorpcijska filtracija, reverzna osmoza in ionsko izmenjava. Ta postopek sprošča tudi različne okodljive spojine v zrak, podtalnico in površinsko vodo, kar povzroča precejšen pritisk na okolje [2].

== ZAKLJUČEK ==

Ocena življenjskega cikla je v tej študiji upoštevala le vplive na okolje. Predlagane izboljšave temeljijo predvsem na uporabi destilirane ali industrijske vode tekom vseh štirih opisanih postopkov proizvodnje vanilina. Prav tako, lahko zmanjšamo negativni vpliv na okolje z izbiro alternativnih virov energije (zemeljski plin, sončna, veterna energija) namesto premoga. Ker se vanilin proizvaja v komercialne namene je v oceno življenjskega cikla potrebno všteti še stroške surovin, ceno opreme in obratovalnega cikla. S tem bi oceno življenjskega cikla za sintezo vanilina izpopolnili.

== VIRI ==

[1] Martău G.A. et al. Bio-vanillin: Towards a sustainable industrial production (2021). Trends in food science and technology. Volume 109, stran 579-592.

[2] Y. Zhao et. al. Identifying environmental hotspots and improvement strategies of vanillin production with life cycle assessment (2021). Science of the total environment, stran 769.

Identifikacija okoljskih žarišč in strategij za izboljšanje proizvodnje vanilina z oceno življenjskega cikla.

2021-05-27T11:17:41Z

Ninalukancic: /* 2. PROIZVODNJA VANILINA */

== 1. UVOD ==

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksi benzaldehid) je pomembna aromatska spojina. Uporabljamo ga v farmacevtski, kozmetični in živilski industriji. Je intermediat pri sintezi arom, deodorantov in krem za sončenje. Vanilin lahko naravno pridobimo iz strokov vanilije (manj kot 0,2% svetovnega povpraševanja) ali pa s pomočjo sinteze, ki predstavlja večinski delež proizvodnje [1]. V študiji želijo s pomočjo ocene življenjskega cikla (LCA) zmanjšati potencialno negativne vplive proizvodnje vanilina na okolje. Osredotočili so se na 4 različne postopke sinteze. Na podlagi pridobljenih rezultatov so predlagane izboljšave za trajnosten in okolju prijazen način pridobitve vanilina [2].

== 2. PROIZVODNJA VANILINA IN REZULTATI ==

'''2.1 SINTEZA VANILINA Z 2-BROMO-4-METIL FENOLOM'''

Sinteza poteka v štirih korakih. Tekom sinteze se porabi ogromno električne energije zaradi oksidacijskih reakcij. Ki zahtevajo neprekinjeno delovanje črpalk. Prav tako se tekom oksidacije porabi veliko energije za vzdrževanje temperaturnih pogojev in visokega tlaka [2].

'''2.2. SINTEZA VANILINA Z GVAJAKOLOM'''

Sinteza poteka v 4 korakih. Ozko grlo procesa je v tretjem koraku, ko se uporabi natrijev hidroksid ali klorovodikova kislina za ohranitev alkalnega ali kislega okolje. V tem koraku je potrebno tudi veliko število organskih topil (toluen, etil acetat). Omejeni organski topili povzročata draženje in lahko toksično vplivata na ljudi. Dosedanje študije so pokazale, da je ena glavnih pomanjkljivosti gvajakolskega procesa ta, da ustvarja številne stranske produkte in odpadke [2].

'''2.3. BIOSINTEZA VANILINA Z IZOEVGENOLOM''' (''Pichia pastoris'')

V tem procesu so gen za izoevgenol monooksidazo kloniran iz metagenomske DNA iz tal in heterologno izrazili v ''Pichia pastoris''. Izoevgenol monooksigenaza je ključni encim za pretvorbo izoevgenola v vanilin. Biosinteza poteka v petih stopnjah. Zaradi stroge specifičnosti encimske reakcije v je nastalo manj stranskih produktov kot pri drugih sintezah [2].

'''2.4. BIOSINTEZA VANILINA S FERULNO KISLINO''' (''Pseudomonas fluorescens'')

Za razvoj robustne bakterije, ki lahko proizvede velike količine vanilina, so gen za vanilin dehidrogenazo (vdh) pri sevu ''Pseudomonas fluorescens'' BF13 inaktiviral s ciljno mutagenezo. Tekom procesa se porabi veliko energije in ultra čiste vode. Priprava ultra čiste vode je zapletena in vključuje številne tehnologije čiščenja, kot je adsorpcijska filtracija, reverzna osmoza in ionsko izmenjava. Ta postopek sprošča tudi različne okodljive spojine v zrak, podtalnico in površinsko vodo, kar povzroča precejšen pritisk na okolje [2].

== 3. ZAKLJUČEK ==

Ocena življenjskega cikla je v tej študiji upoštevala le vplive na okolje. Predlagane izboljšave temeljijo predvsem na uporabi destilirane ali industrijske vode tekom vseh štirih opisanih postopkov proizvodnje vanilina. Prav tako, lahko zmanjšamo negativni vpliv na okolje z izbiro alternativnih virov energije (zemeljski plin, sončna, veterna energija) namesto premoga. Ker se vanilin proizvaja v komercialne namene je v oceno življenjskega cikla potrebno všteti še stroške surovin, ceno opreme in obratovalnega cikla. S tem bi oceno življenjskega cikla za sintezo vanilina izpopolnili.

== 4. VIRI ==

[1] Martău G.A. et al. Bio-vanillin: Towards a sustainable industrial production (2021). Trends in food science and technology. Volume 109, stran 579-592.

[2] Y. Zhao et. al. Identifying environmental hotspots and improvement strategies of vanillin production with life cycle assessment (2021). Science of the total environment, stran 769.

Identifikacija okoljskih žarišč in strategij za izboljšanje proizvodnje vanilina z oceno življenjskega cikla.

2021-05-27T11:17:07Z

Ninalukancic: /* 2. PROIZVODNJA VANILINA */

== 1. UVOD ==

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksi benzaldehid) je pomembna aromatska spojina. Uporabljamo ga v farmacevtski, kozmetični in živilski industriji. Je intermediat pri sintezi arom, deodorantov in krem za sončenje. Vanilin lahko naravno pridobimo iz strokov vanilije (manj kot 0,2% svetovnega povpraševanja) ali pa s pomočjo sinteze, ki predstavlja večinski delež proizvodnje [1]. V študiji želijo s pomočjo ocene življenjskega cikla (LCA) zmanjšati potencialno negativne vplive proizvodnje vanilina na okolje. Osredotočili so se na 4 različne postopke sinteze. Na podlagi pridobljenih rezultatov so predlagane izboljšave za trajnosten in okolju prijazen način pridobitve vanilina [2].

== 2. PROIZVODNJA VANILINA ==

'''2.1 SINTEZA VANILINA Z 2-BROMO-4-METIL FENOLOM'''

Sinteza poteka v štirih korakih. Tekom sinteze se porabi ogromno električne energije zaradi oksidacijskih reakcij. Ki zahtevajo neprekinjeno delovanje črpalk. Prav tako se tekom oksidacije porabi veliko energije za vzdrževanje temperaturnih pogojev in visokega tlaka [2].

'''2.2. SINTEZA VANILINA Z GVAJAKOLOM'''

Sinteza poteka v 4 korakih. Ozko grlo procesa je v tretjem koraku, ko se uporabi natrijev hidroksid ali klorovodikova kislina za ohranitev alkalnega ali kislega okolje. V tem koraku je potrebno tudi veliko število organskih topil (toluen, etil acetat). Omejeni organski topili povzročata draženje in lahko toksično vplivata na ljudi. Dosedanje študije so pokazale, da je ena glavnih pomanjkljivosti gvajakolskega procesa ta, da ustvarja številne stranske produkte in odpadke [2].

'''2.3. BIOSINTEZA VANILINA Z IZOEVGENOLOM''' (''Pichia pastoris'')

V tem procesu so gen za izoevgenol monooksidazo kloniran iz metagenomske DNA iz tal in heterologno izrazili v ''Pichia pastoris''. Izoevgenol monooksigenaza je ključni encim za pretvorbo izoevgenola v vanilin. Biosinteza poteka v petih stopnjah. Zaradi stroge specifičnosti encimske reakcije v je nastalo manj stranskih produktov kot pri drugih sintezah [2].

'''2.4. BIOSINTEZA VANILINA S FERULNO KISLINO''' (''Pseudomonas fluorescens'')

Za razvoj robustne bakterije, ki lahko proizvede velike količine vanilina, so gen za vanilin dehidrogenazo (vdh) pri sevu ''Pseudomonas fluorescens'' BF13 inaktiviral s ciljno mutagenezo. Tekom procesa se porabi veliko energije in ultra čiste vode. Priprava ultra čiste vode je zapletena in vključuje številne tehnologije čiščenja, kot je adsorpcijska filtracija, reverzna osmoza in ionsko izmenjava. Ta postopek sprošča tudi različne okodljive spojine v zrak, podtalnico in površinsko vodo, kar povzroča precejšen pritisk na okolje [2].

== 3. ZAKLJUČEK ==

Ocena življenjskega cikla je v tej študiji upoštevala le vplive na okolje. Predlagane izboljšave temeljijo predvsem na uporabi destilirane ali industrijske vode tekom vseh štirih opisanih postopkov proizvodnje vanilina. Prav tako, lahko zmanjšamo negativni vpliv na okolje z izbiro alternativnih virov energije (zemeljski plin, sončna, veterna energija) namesto premoga. Ker se vanilin proizvaja v komercialne namene je v oceno življenjskega cikla potrebno všteti še stroške surovin, ceno opreme in obratovalnega cikla. S tem bi oceno življenjskega cikla za sintezo vanilina izpopolnili.

== 4. VIRI ==

[1] Martău G.A. et al. Bio-vanillin: Towards a sustainable industrial production (2021). Trends in food science and technology. Volume 109, stran 579-592.

[2] Y. Zhao et. al. Identifying environmental hotspots and improvement strategies of vanillin production with life cycle assessment (2021). Science of the total environment, stran 769.

Identifikacija okoljskih žarišč in strategij za izboljšanje proizvodnje vanilina z oceno življenjskega cikla.

2021-05-27T11:16:21Z

Ninalukancic: /* 1. UVOD */

== 1. UVOD ==

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksi benzaldehid) je pomembna aromatska spojina. Uporabljamo ga v farmacevtski, kozmetični in živilski industriji. Je intermediat pri sintezi arom, deodorantov in krem za sončenje. Vanilin lahko naravno pridobimo iz strokov vanilije (manj kot 0,2% svetovnega povpraševanja) ali pa s pomočjo sinteze, ki predstavlja večinski delež proizvodnje [1]. V študiji želijo s pomočjo ocene življenjskega cikla (LCA) zmanjšati potencialno negativne vplive proizvodnje vanilina na okolje. Osredotočili so se na 4 različne postopke sinteze. Na podlagi pridobljenih rezultatov so predlagane izboljšave za trajnosten in okolju prijazen način pridobitve vanilina [2].

== 2. PROIZVODNJA VANILINA ==

'''2.1 SINTEZA VANILINA Z 2-BROMO-4-METIL FENOLOM'''

Sinteza poteka v štirih korakih. Tekom sinteze se porabi ogromno električne energije zaradi oksidacijskih reakcij. Ki zahtevajo neprekinjeno delovanje črpalk. Prav tako se tekom oksidacije porabi veliko energije za vzdrževanje temperaturnih pogojev in visokega tlaka.

'''2.2. SINTEZA VANILINA Z GVAJAKOLOM'''

Sinteza poteka v 4 korakih. Ozko grlo procesa je v tretjem koraku, ko se uporabi natrijev hidroksid ali klorovodikova kislina za ohranitev alkalnega ali kislega okolje. V tem koraku je potrebno tudi veliko število organskih topil (toluen, etil acetat). Omejeni organski topili povzročata draženje in lahko toksično vplivata na ljudi. Dosedanje študije so pokazale, da je ena glavnih pomanjkljivosti gvajakolskega procesa ta, da ustvarja številne stranske produkte in odpadke .

'''2.3. BIOSINTEZA VANILINA Z IZOEVGENOLOM''' (''Pichia pastoris'')

V tem procesu so gen za izoevgenol monooksidazo kloniran iz metagenomske DNA iz tal in heterologno izrazili v ''Pichia pastoris''. Izoevgenol monooksigenaza je ključni encim za pretvorbo izoevgenola v vanilin. Biosinteza poteka v petih stopnjah. Zaradi stroge specifičnosti encimske reakcije v je nastalo manj stranskih produktov kot pri drugih sintezah.

'''2.4. BIOSINTEZA VANILINA S FERULNO KISLINO''' (''Pseudomonas fluorescens'')

Za razvoj robustne bakterije, ki lahko proizvede velike količine vanilina, so gen za vanilin dehidrogenazo (vdh) pri sevu ''Pseudomonas fluorescens'' BF13 inaktiviral s ciljno mutagenezo. Tekom procesa se porabi veliko energije in ultra čiste vode. Priprava ultra čiste vode je zapletena in vključuje številne tehnologije čiščenja, kot je adsorpcijska filtracija, reverzna osmoza in ionsko izmenjava. Ta postopek sprošča tudi različne okodljive spojine v zrak, podtalnico in površinsko vodo, kar povzroča precejšen pritisk na okolje.

== 3. ZAKLJUČEK ==

Ocena življenjskega cikla je v tej študiji upoštevala le vplive na okolje. Predlagane izboljšave temeljijo predvsem na uporabi destilirane ali industrijske vode tekom vseh štirih opisanih postopkov proizvodnje vanilina. Prav tako, lahko zmanjšamo negativni vpliv na okolje z izbiro alternativnih virov energije (zemeljski plin, sončna, veterna energija) namesto premoga. Ker se vanilin proizvaja v komercialne namene je v oceno življenjskega cikla potrebno všteti še stroške surovin, ceno opreme in obratovalnega cikla. S tem bi oceno življenjskega cikla za sintezo vanilina izpopolnili.

== 4. VIRI ==

[1] Martău G.A. et al. Bio-vanillin: Towards a sustainable industrial production (2021). Trends in food science and technology. Volume 109, stran 579-592.

[2] Y. Zhao et. al. Identifying environmental hotspots and improvement strategies of vanillin production with life cycle assessment (2021). Science of the total environment, stran 769.

Identifikacija okoljskih žarišč in strategij za izboljšanje proizvodnje vanilina z oceno življenjskega cikla.

2021-05-27T11:14:45Z

Ninalukancic: /* 4. VIRI */

== 1. UVOD ==

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksi benzaldehid) je pomembna aromatska spojina. Uporabljamo ga v farmacevtski, kozmetični in živilski industriji. Je intermediat pri sintezi arom, deodorantov in krem za sončenje. Vanilin lahko naravno pridobimo iz strokov vanilije (manj kot 0,2% svetovnega povpraševanja) ali pa s pomočjo sinteze, ki predstavlja večinski delež proizvodnje. V študiji želijo s pomočjo ocene življenjskega cikla (LCA) zmanjšati potencialno negativne vplive proizvodnje vanilina na okolje. Osredotočili so se na 4 različne postopke sinteze. Na podlagi pridobljenih rezultatov so predlagane izboljšave za trajnosten in okolju prijazen način pridobitve vanilina.

== 2. PROIZVODNJA VANILINA ==

'''2.1 SINTEZA VANILINA Z 2-BROMO-4-METIL FENOLOM'''

Sinteza poteka v štirih korakih. Tekom sinteze se porabi ogromno električne energije zaradi oksidacijskih reakcij. Ki zahtevajo neprekinjeno delovanje črpalk. Prav tako se tekom oksidacije porabi veliko energije za vzdrževanje temperaturnih pogojev in visokega tlaka.

'''2.2. SINTEZA VANILINA Z GVAJAKOLOM'''

Sinteza poteka v 4 korakih. Ozko grlo procesa je v tretjem koraku, ko se uporabi natrijev hidroksid ali klorovodikova kislina za ohranitev alkalnega ali kislega okolje. V tem koraku je potrebno tudi veliko število organskih topil (toluen, etil acetat). Omejeni organski topili povzročata draženje in lahko toksično vplivata na ljudi. Dosedanje študije so pokazale, da je ena glavnih pomanjkljivosti gvajakolskega procesa ta, da ustvarja številne stranske produkte in odpadke .

'''2.3. BIOSINTEZA VANILINA Z IZOEVGENOLOM''' (''Pichia pastoris'')

V tem procesu so gen za izoevgenol monooksidazo kloniran iz metagenomske DNA iz tal in heterologno izrazili v ''Pichia pastoris''. Izoevgenol monooksigenaza je ključni encim za pretvorbo izoevgenola v vanilin. Biosinteza poteka v petih stopnjah. Zaradi stroge specifičnosti encimske reakcije v je nastalo manj stranskih produktov kot pri drugih sintezah.

'''2.4. BIOSINTEZA VANILINA S FERULNO KISLINO''' (''Pseudomonas fluorescens'')

Za razvoj robustne bakterije, ki lahko proizvede velike količine vanilina, so gen za vanilin dehidrogenazo (vdh) pri sevu ''Pseudomonas fluorescens'' BF13 inaktiviral s ciljno mutagenezo. Tekom procesa se porabi veliko energije in ultra čiste vode. Priprava ultra čiste vode je zapletena in vključuje številne tehnologije čiščenja, kot je adsorpcijska filtracija, reverzna osmoza in ionsko izmenjava. Ta postopek sprošča tudi različne okodljive spojine v zrak, podtalnico in površinsko vodo, kar povzroča precejšen pritisk na okolje.

== 3. ZAKLJUČEK ==

Ocena življenjskega cikla je v tej študiji upoštevala le vplive na okolje. Predlagane izboljšave temeljijo predvsem na uporabi destilirane ali industrijske vode tekom vseh štirih opisanih postopkov proizvodnje vanilina. Prav tako, lahko zmanjšamo negativni vpliv na okolje z izbiro alternativnih virov energije (zemeljski plin, sončna, veterna energija) namesto premoga. Ker se vanilin proizvaja v komercialne namene je v oceno življenjskega cikla potrebno všteti še stroške surovin, ceno opreme in obratovalnega cikla. S tem bi oceno življenjskega cikla za sintezo vanilina izpopolnili.

== 4. VIRI ==

[1] Martău G.A. et al. Bio-vanillin: Towards a sustainable industrial production (2021). Trends in food science and technology. Volume 109, stran 579-592.

[2] Y. Zhao et. al. Identifying environmental hotspots and improvement strategies of vanillin production with life cycle assessment (2021). Science of the total environment, stran 769.

Identifikacija okoljskih žarišč in strategij za izboljšanje proizvodnje vanilina z oceno življenjskega cikla.

2021-05-27T11:14:30Z

Ninalukancic: /* 4. VIRI */

== 1. UVOD ==

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksi benzaldehid) je pomembna aromatska spojina. Uporabljamo ga v farmacevtski, kozmetični in živilski industriji. Je intermediat pri sintezi arom, deodorantov in krem za sončenje. Vanilin lahko naravno pridobimo iz strokov vanilije (manj kot 0,2% svetovnega povpraševanja) ali pa s pomočjo sinteze, ki predstavlja večinski delež proizvodnje. V študiji želijo s pomočjo ocene življenjskega cikla (LCA) zmanjšati potencialno negativne vplive proizvodnje vanilina na okolje. Osredotočili so se na 4 različne postopke sinteze. Na podlagi pridobljenih rezultatov so predlagane izboljšave za trajnosten in okolju prijazen način pridobitve vanilina.

== 2. PROIZVODNJA VANILINA ==

'''2.1 SINTEZA VANILINA Z 2-BROMO-4-METIL FENOLOM'''

Sinteza poteka v štirih korakih. Tekom sinteze se porabi ogromno električne energije zaradi oksidacijskih reakcij. Ki zahtevajo neprekinjeno delovanje črpalk. Prav tako se tekom oksidacije porabi veliko energije za vzdrževanje temperaturnih pogojev in visokega tlaka.

'''2.2. SINTEZA VANILINA Z GVAJAKOLOM'''

Sinteza poteka v 4 korakih. Ozko grlo procesa je v tretjem koraku, ko se uporabi natrijev hidroksid ali klorovodikova kislina za ohranitev alkalnega ali kislega okolje. V tem koraku je potrebno tudi veliko število organskih topil (toluen, etil acetat). Omejeni organski topili povzročata draženje in lahko toksično vplivata na ljudi. Dosedanje študije so pokazale, da je ena glavnih pomanjkljivosti gvajakolskega procesa ta, da ustvarja številne stranske produkte in odpadke .

'''2.3. BIOSINTEZA VANILINA Z IZOEVGENOLOM''' (''Pichia pastoris'')

V tem procesu so gen za izoevgenol monooksidazo kloniran iz metagenomske DNA iz tal in heterologno izrazili v ''Pichia pastoris''. Izoevgenol monooksigenaza je ključni encim za pretvorbo izoevgenola v vanilin. Biosinteza poteka v petih stopnjah. Zaradi stroge specifičnosti encimske reakcije v je nastalo manj stranskih produktov kot pri drugih sintezah.

'''2.4. BIOSINTEZA VANILINA S FERULNO KISLINO''' (''Pseudomonas fluorescens'')

Za razvoj robustne bakterije, ki lahko proizvede velike količine vanilina, so gen za vanilin dehidrogenazo (vdh) pri sevu ''Pseudomonas fluorescens'' BF13 inaktiviral s ciljno mutagenezo. Tekom procesa se porabi veliko energije in ultra čiste vode. Priprava ultra čiste vode je zapletena in vključuje številne tehnologije čiščenja, kot je adsorpcijska filtracija, reverzna osmoza in ionsko izmenjava. Ta postopek sprošča tudi različne okodljive spojine v zrak, podtalnico in površinsko vodo, kar povzroča precejšen pritisk na okolje.

== 3. ZAKLJUČEK ==

Ocena življenjskega cikla je v tej študiji upoštevala le vplive na okolje. Predlagane izboljšave temeljijo predvsem na uporabi destilirane ali industrijske vode tekom vseh štirih opisanih postopkov proizvodnje vanilina. Prav tako, lahko zmanjšamo negativni vpliv na okolje z izbiro alternativnih virov energije (zemeljski plin, sončna, veterna energija) namesto premoga. Ker se vanilin proizvaja v komercialne namene je v oceno življenjskega cikla potrebno všteti še stroške surovin, ceno opreme in obratovalnega cikla. S tem bi oceno življenjskega cikla za sintezo vanilina izpopolnili.

== 4. VIRI ==

[1]Martău G.A. et al. Bio-vanillin: Towards a sustainable industrial production (2021). Trends in food science and technology. Volume 109, stran 579-592.

[2] Y. Zhao et. al. Identifying environmental hotspots and improvement strategies of vanillin production with life cycle assessment (2021). Science of the total environment, stran 769.

Identifikacija okoljskih žarišč in strategij za izboljšanje proizvodnje vanilina z oceno življenjskega cikla.

2021-05-27T11:09:08Z

Ninalukancic:

== 1. UVOD ==

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksi benzaldehid) je pomembna aromatska spojina. Uporabljamo ga v farmacevtski, kozmetični in živilski industriji. Je intermediat pri sintezi arom, deodorantov in krem za sončenje. Vanilin lahko naravno pridobimo iz strokov vanilije (manj kot 0,2% svetovnega povpraševanja) ali pa s pomočjo sinteze, ki predstavlja večinski delež proizvodnje. V študiji želijo s pomočjo ocene življenjskega cikla (LCA) zmanjšati potencialno negativne vplive proizvodnje vanilina na okolje. Osredotočili so se na 4 različne postopke sinteze. Na podlagi pridobljenih rezultatov so predlagane izboljšave za trajnosten in okolju prijazen način pridobitve vanilina.

== 2. PROIZVODNJA VANILINA ==

'''2.1 SINTEZA VANILINA Z 2-BROMO-4-METIL FENOLOM'''

Sinteza poteka v štirih korakih. Tekom sinteze se porabi ogromno električne energije zaradi oksidacijskih reakcij. Ki zahtevajo neprekinjeno delovanje črpalk. Prav tako se tekom oksidacije porabi veliko energije za vzdrževanje temperaturnih pogojev in visokega tlaka.

'''2.2. SINTEZA VANILINA Z GVAJAKOLOM'''

Sinteza poteka v 4 korakih. Ozko grlo procesa je v tretjem koraku, ko se uporabi natrijev hidroksid ali klorovodikova kislina za ohranitev alkalnega ali kislega okolje. V tem koraku je potrebno tudi veliko število organskih topil (toluen, etil acetat). Omejeni organski topili povzročata draženje in lahko toksično vplivata na ljudi. Dosedanje študije so pokazale, da je ena glavnih pomanjkljivosti gvajakolskega procesa ta, da ustvarja številne stranske produkte in odpadke .

'''2.3. BIOSINTEZA VANILINA Z IZOEVGENOLOM''' (''Pichia pastoris'')

V tem procesu so gen za izoevgenol monooksidazo kloniran iz metagenomske DNA iz tal in heterologno izrazili v ''Pichia pastoris''. Izoevgenol monooksigenaza je ključni encim za pretvorbo izoevgenola v vanilin. Biosinteza poteka v petih stopnjah. Zaradi stroge specifičnosti encimske reakcije v je nastalo manj stranskih produktov kot pri drugih sintezah.

'''2.4. BIOSINTEZA VANILINA S FERULNO KISLINO''' (''Pseudomonas fluorescens'')

Za razvoj robustne bakterije, ki lahko proizvede velike količine vanilina, so gen za vanilin dehidrogenazo (vdh) pri sevu ''Pseudomonas fluorescens'' BF13 inaktiviral s ciljno mutagenezo. Tekom procesa se porabi veliko energije in ultra čiste vode. Priprava ultra čiste vode je zapletena in vključuje številne tehnologije čiščenja, kot je adsorpcijska filtracija, reverzna osmoza in ionsko izmenjava. Ta postopek sprošča tudi različne okodljive spojine v zrak, podtalnico in površinsko vodo, kar povzroča precejšen pritisk na okolje.

== 3. ZAKLJUČEK ==

Ocena življenjskega cikla je v tej študiji upoštevala le vplive na okolje. Predlagane izboljšave temeljijo predvsem na uporabi destilirane ali industrijske vode tekom vseh štirih opisanih postopkov proizvodnje vanilina. Prav tako, lahko zmanjšamo negativni vpliv na okolje z izbiro alternativnih virov energije (zemeljski plin, sončna, veterna energija) namesto premoga. Ker se vanilin proizvaja v komercialne namene je v oceno življenjskega cikla potrebno všteti še stroške surovin, ceno opreme in obratovalnega cikla. S tem bi oceno življenjskega cikla za sintezo vanilina izpopolnili.

== 4. VIRI ==

[1] Y. Zhao et. al. Identifying environmental hotspots and improvement strategies of vanillin production with life cycle assessment (2021). Science of the total environment, 769.

Identifikacija okoljskih žarišč in strategij za izboljšanje proizvodnje vanilina z oceno življenjskega cikla.

2021-05-27T11:04:48Z

Ninalukancic: /* 2. PROIZVODNJA VANILINA */

== 1. UVOD ==

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksi benzaldehid) je pomembna aromatska spojina. Uporabljamo ga v farmacevtski, kozmetični in živilski industriji. Je intermediat pri sintezi arom, deodorantov in krem za sončenje. Vanilin lahko naravno pridobimo iz strokov vanilije (manj kot 0,2% svetovnega povpraševanja) ali pa s pomočjo sinteze, ki predstavlja večinski delež proizvodnje. V študiji želijo s pomočjo ocene življenjskega cikla (LCA) zmanjšati potencialno negativne vplive proizvodnje vanilina na okolje. Osredotočili so se na 4 različne postopke sinteze. Na podlagi pridobljenih rezultatov so predlagane izboljšave za trajnosten in okolju prijazen način pridobitve vanilina.

== 2. PROIZVODNJA VANILINA ==

'''2.1 SINTEZA VANILINA Z 2-BROMO-4-METIL FENOLOM'''

Sinteza poteka v štirih korakih. Tekom sinteze se porabi ogromno električne energije zaradi oksidacijskih reakcij. Ki zahtevajo neprekinjeno delovanje črpalk. Prav tako se tekom oksidacije porabi veliko energije za vzdrževanje temperaturnih pogojev in visokega tlaka.

'''2.2. SINTEZA VANILINA Z GVAJAKOLOM'''

Sinteza poteka v 4 korakih. Ozko grlo procesa je v tretjem koraku, ko se uporabi natrijev hidroksid ali klorovodikova kislina za ohranitev alkalnega ali kislega okolje. V tem koraku je potrebno tudi veliko število organskih topil (toluen, etil acetat). Omejeni organski topili povzročata draženje in lahko toksično vplivata na ljudi. Dosedanje študije so pokazale, da je ena glavnih pomanjkljivosti gvajakolskega procesa ta, da ustvarja številne stranske produkte in odpadke .

'''2.3. BIOSINTEZA VANILINA Z IZOEVGENOLOM''' (''Pichia pastoris'')

V tem procesu so gen za izoevgenol monooksidazo kloniran iz metagenomske DNA iz tal in heterologno izrazili v ''Pichia pastoris''. Izoevgenol monooksigenaza je ključni encim za pretvorbo izoevgenola v vanilin. Biosinteza poteka v petih stopnjah. Zaradi stroge specifičnosti encimske reakcije v je nastalo manj stranskih produktov kot pri drugih sintezah.

'''2.4. BIOSINTEZA VANILINA S FERULNO KISLINO''' (''Pseudomonas fluorescens'')

Za razvoj robustne bakterije, ki lahko proizvede velike količine vanilina, so gen za vanilin dehidrogenazo (vdh) pri sevu ''Pseudomonas fluorescens'' BF13 inaktiviral s ciljno mutagenezo. Tekom procesa se porabi veliko energije in ultra čiste vode. Priprava ultra čiste vode je zapletena in vključuje številne tehnologije čiščenja, kot je adsorpcijska filtracija, reverzna osmoza in ionsko izmenjava. Ta postopek sprošča tudi različne okodljive spojine v zrak, podtalnico in površinsko vodo, kar povzroča precejšen pritisk na okolje.

== 3. ZAKLJUČEK ==

Ocena življenjskega cikla je v tej študiji upoštevala le vplive na okolje. Predlagane izboljšave temeljijo predvsem na uporabi destilirane ali industrijske vode tekom vseh štirih opisanih postopkov proizvodnje vanilina. Prav tako, lahko zmanjšamo negativni vpliv na okolje z izbiro alternativnih virov energije (zemeljski plin, sončna, veterna energija) namesto premoga. Ker se vanilin proizvaja v komercialne namene je v oceno življenjskega cikla potrebno všteti še stroške surovin, ceno opreme in obratovalnega cikla. S tem bi oceno življenjskega cikla za sintezo vanilina izpopolnili.

Identifikacija okoljskih žarišč in strategij za izboljšanje proizvodnje vanilina z oceno življenjskega cikla.

2021-05-27T11:03:50Z

Ninalukancic: /* 2. PROIZVODNJA VANILINA */

== 1. UVOD ==

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksi benzaldehid) je pomembna aromatska spojina. Uporabljamo ga v farmacevtski, kozmetični in živilski industriji. Je intermediat pri sintezi arom, deodorantov in krem za sončenje. Vanilin lahko naravno pridobimo iz strokov vanilije (manj kot 0,2% svetovnega povpraševanja) ali pa s pomočjo sinteze, ki predstavlja večinski delež proizvodnje. V študiji želijo s pomočjo ocene življenjskega cikla (LCA) zmanjšati potencialno negativne vplive proizvodnje vanilina na okolje. Osredotočili so se na 4 različne postopke sinteze. Na podlagi pridobljenih rezultatov so predlagane izboljšave za trajnosten in okolju prijazen način pridobitve vanilina.

== 2. PROIZVODNJA VANILINA ==

'''2.1 SINTEZA VANILINA Z 2-BROMO-4-METIL FENOLOM'''

Sinteza poteka v štirih korakih. Tekom sinteze se porabi ogromno električne energije zaradi oksidacijskih reakcij. Ki zahtevajo neprekinjeno delovanje črpalk. Prav tako se tekom oksidacije porabi veliko energije za vzdrževanje temperaturnih pogojev in visokega tlaka.

'''2.2. SINTEZA VANILINA Z GVAJAKOLOM'''

Sinteza poteka v 4 korakih. Ozko grlo procesa je v tretjem koraku, ko se uporabi natrijev hidroksid ali klorovodikova kislina za ohranitev alkalnega ali kislega okolje. V tem koraku je potrebno tudi veliko število organskih topil (toluen, etil acetat). Omejeni organski topili povzročata draženje in lahko toksično vplivata na ljudi. Dosedanje študije so pokazale, da je ena glavnih pomanjkljivosti gvajakolskega procesa ta, da ustvarja številne stranske produkte in odpadke .

'''2.3. BIOSINTEZA VANILINA Z IZOEVGENOLOM''' (''Pichia pastoris'')

V tem procesu so gen za izoevgenol monooksidazo kloniran iz metagenomske DNA iz tal in heterologno izrazili v Pichia pastoris. Izoevgenol monooksigenaza je ključni encim za pretvorbo izoevgenola v vanilin. Biosinteza poteka v petih stopnjah. Zaradi stroge specifičnosti encimske reakcije v je nastalo manj stranskih produktov kot pri drugih sintezah.

'''2.4. BIOSINTEZA VANILINA S FERULNO KISLINO''' (''Pseudomonas fluorescens'')

Za razvoj robustne bakterije, ki lahko proizvede velike količine vanilina, so gen za vanilin dehidrogenazo (vdh) pri sevu Pseudomonas fluorescens BF13 inaktiviral s ciljno mutagenezo. Tekom procesa se porabi veliko energije in ultra čiste vode. Priprava ultra čiste vode je zapletena in vključuje številne tehnologije čiščenja, kot je adsorpcijska filtracija, reverzna osmoza in ionsko izmenjava. Ta postopek sprošča tudi različne okodljive spojine v zrak, podtalnico in površinsko vodo, kar povzroča precejšen pritisk na okolje.

== 3. ZAKLJUČEK ==

Ocena življenjskega cikla je v tej študiji upoštevala le vplive na okolje. Predlagane izboljšave temeljijo predvsem na uporabi destilirane ali industrijske vode tekom vseh štirih opisanih postopkov proizvodnje vanilina. Prav tako, lahko zmanjšamo negativni vpliv na okolje z izbiro alternativnih virov energije (zemeljski plin, sončna, veterna energija) namesto premoga. Ker se vanilin proizvaja v komercialne namene je v oceno življenjskega cikla potrebno všteti še stroške surovin, ceno opreme in obratovalnega cikla. S tem bi oceno življenjskega cikla za sintezo vanilina izpopolnili.

Identifikacija okoljskih žarišč in strategij za izboljšanje proizvodnje vanilina z oceno življenjskega cikla.

2021-05-27T11:01:15Z

Ninalukancic:

== 1. UVOD ==

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksi benzaldehid) je pomembna aromatska spojina. Uporabljamo ga v farmacevtski, kozmetični in živilski industriji. Je intermediat pri sintezi arom, deodorantov in krem za sončenje. Vanilin lahko naravno pridobimo iz strokov vanilije (manj kot 0,2% svetovnega povpraševanja) ali pa s pomočjo sinteze, ki predstavlja večinski delež proizvodnje. V študiji želijo s pomočjo ocene življenjskega cikla (LCA) zmanjšati potencialno negativne vplive proizvodnje vanilina na okolje. Osredotočili so se na 4 različne postopke sinteze. Na podlagi pridobljenih rezultatov so predlagane izboljšave za trajnosten in okolju prijazen način pridobitve vanilina.

== 2. PROIZVODNJA VANILINA ==

'''2.1 SINTEZA VANILINA Z 2-BROMO-4-METIL FENOLOM'''

Sinteza poteka v štirih korakih. Tekom sinteze se porabi ogromno električne energije zaradi oksidacijskih reakcij. Ki zahtevajo neprekinjeno delovanje črpalk. Prav tako se tekom oksidacije porabi veliko energije za vzdrževanje temperaturnih pogojev in visokega tlaka.

'''2.2. SINTEZA VANILINA Z GVAJAKOLOM'''

Sinteza poteka v 4 korakih. Ozko grlo procesa je v tretjem koraku, ko se uporabi natrijev hidroksid ali klorovodikova kislina za ohranitev alkalnega ali kislega okolje. V tem koraku je potrebno tudi veliko število organskih topil (toluen, etil acetat). Omejeni organski topili povzročata draženje in lahko toksično vplivata na ljudi. Dosedanje študije so pokazale, da je ena glavnih pomanjkljivosti gvajakolskega procesa ta, da ustvarja številne stranske produkte in odpadke .

'''2.3. BIOSINTEZA VANILINA Z IZOEVGENOLOM''' (''Pichia pastoris'')

V tem procesu so gen za izoevgenol monooksidazo kloniran iz metagenomske DNA iz tal in heterologno izrazili v Pichia pastoris. Izoevgenol monooksigenaza je ključni encim za pretvorbo izoevgenola v vanilin. Biosinteza poteka v petih stopnjah. Zaradi stroge specifičnosti encimske reakcije v je nastalo manj stranskih produktov kot pri drugih sintezah.

'''2.4. BIOSINTEZA VANILINA S FERULNO KISLINO''' (''Pseudomonas fluorescens'')

Za razvoj robustne bakterije, ki lahko proizvede velike količine vanilina, so gen za vanilin dehidrogenazo (vdh) pri sevu Pseudomonas fluorescens BF13 inaktiviral s ciljno mutagenezo. Tekom procesa se porabi veliko energije in ultra čiste vode.

== 3. ZAKLJUČEK ==

Ocena življenjskega cikla je v tej študiji upoštevala le vplive na okolje. Predlagane izboljšave temeljijo predvsem na uporabi destilirane ali industrijske vode tekom vseh štirih opisanih postopkov proizvodnje vanilina. Prav tako, lahko zmanjšamo negativni vpliv na okolje z izbiro alternativnih virov energije (zemeljski plin, sončna, veterna energija) namesto premoga. Ker se vanilin proizvaja v komercialne namene je v oceno življenjskega cikla potrebno všteti še stroške surovin, ceno opreme in obratovalnega cikla. S tem bi oceno življenjskega cikla za sintezo vanilina izpopolnili.

Identifikacija okoljskih žarišč in strategij za izboljšanje proizvodnje vanilina z oceno življenjskega cikla.

2021-05-27T10:59:12Z

Ninalukancic: /* 2. PROIZVODNJA VANILINA */

== 1. UVOD ==

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksi benzaldehid) je pomembna aromatska spojina. Uporabljamo ga v farmacevtski, kozmetični in živilski industriji. Je intermediat pri sintezi arom, deodorantov in krem za sončenje. Vanilin lahko naravno pridobimo iz strokov vanilije (manj kot 0,2% svetovnega povpraševanja) ali pa s pomočjo sinteze, ki predstavlja večinski delež proizvodnje. V študiji želijo s pomočjo ocene življenjskega cikla (LCA) zmanjšati potencialno negativne vplive proizvodnje vanilina na okolje. Osredotočili so se na 4 različne postopke sinteze. Na podlagi pridobljenih rezultatov so predlagane izboljšave za trajnosten in okolju prijazen način pridobitve vanilina.

== 2. PROIZVODNJA VANILINA ==

'''2.1 SINTEZA VANILINA Z 2-BROMO-4-METIL FENOLOM'''

Sinteza poteka v štirih korakih. Tekom sinteze se porabi ogromno električne energije zaradi oksidacijskih reakcij. Ki zahtevajo neprekinjeno delovanje črpalk. Prav tako se tekom oksidacije porabi veliko energije za vzdrževanje temperaturnih pogojev in visokega tlaka.

'''2.2. SINTEZA VANILINA Z GVAJAKOLOM'''

Sinteza poteka v 4 korakih. Ozko grlo procesa je v tretjem koraku, ko se uporabi natrijev hidroksid ali klorovodikova kislina za ohranitev alkalnega ali kislega okolje. V tem koraku je potrebno tudi veliko število organskih topil (toluen, etil acetat). Omejeni organski topili povzročata draženje in lahko toksično vplivata na ljudi. Dosedanje študije so pokazale, da je ena glavnih pomanjkljivosti gvajakolskega procesa ta, da ustvarja številne stranske produkte in odpadke .

'''2.3. BIOSINTEZA VANILINA Z IZOEVGENOLOM''' (''Pichia pastoris'')

V tem procesu so gen za izoevgenol monooksidazo kloniran iz metagenomske DNA iz tal in heterologno izrazili v Pichia pastoris. Izoevgenol monooksigenaza je ključni encim za pretvorbo izoevgenola v vanilin. Biosinteza poteka v petih stopnjah. Zaradi stroge specifičnosti encimske reakcije v je nastalo manj stranskih produktov kot pri drugih sintezah.

'''2.4. BIOSINTEZA VANILINA S FERULNO KISLINO''' (''Pseudomonas fluorescens'')

Za razvoj robustne bakterije, ki lahko proizvede velike količine vanilina, so gen za vanilin dehidrogenazo (vdh) pri sevu Pseudomonas fluorescens BF13 inaktiviral s ciljno mutagenezo. Tekom procesa se porabi veliko energije in ultra čiste vode.

== 3. ZAKLJUČEK ==

Ocena življenjskega cikla je v tej študiji upoštevala le vplive na okolje. Predlagane izboljšave temeljijo predvsem na uporabi destilirane ali industrijske vode tekom vseh štirih opisanih postopkov proizvodnje vanilina. Prav tako, lahko zmanjšamo negativni vpliv na okolje z izbiro alternativnih virov energije (zemeljski plin, sončna, veterna energija) namesto premoga. Ker se vanilin proizvaja v komercialne namene je v oceno življenjskega cikla potrebno všteti še stroške surovin, ceno opreme in obratovalnega cikla. S tem bi oceno življenjskega cikla za sintezo vanilina izpopolnili.

Identifikacija okoljskih žarišč in strategij za izboljšanje proizvodnje vanilina z oceno življenjskega cikla.

2021-05-27T10:57:31Z

Ninalukancic: /* 1. UVOD */

== 1. UVOD ==

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksi benzaldehid) je pomembna aromatska spojina. Uporabljamo ga v farmacevtski, kozmetični in živilski industriji. Je intermediat pri sintezi arom, deodorantov in krem za sončenje. Vanilin lahko naravno pridobimo iz strokov vanilije (manj kot 0,2% svetovnega povpraševanja) ali pa s pomočjo sinteze, ki predstavlja večinski delež proizvodnje. V študiji želijo s pomočjo ocene življenjskega cikla (LCA) zmanjšati potencialno negativne vplive proizvodnje vanilina na okolje. Osredotočili so se na 4 različne postopke sinteze. Na podlagi pridobljenih rezultatov so predlagane izboljšave za trajnosten in okolju prijazen način pridobitve vanilina.

== 2. PROIZVODNJA VANILINA ==

'''2.1 SINTEZA VANILINA Z 2-BROMO-4-METIL FENOLOM'''

Sinteza poteka v štirih korakih. Tekom sinteze se porabi ogromno električne energije zaradi oksidacijskih reakcij. Ki zahtevajo neprekinjeno delovanje črpalk. Prav tako se tekom oksidacije porabi veliko energije za vzdrževanje temperaturnih pogojev in visokega tlaka.

'''2.2. SINTEZA VANILINA Z GVAJAKOLOM'''
Sinteza poteka v 4 korakih. Ozko grlo procesa je v tretjem koraku, ko se uporabi natrijev hidroksid ali klorovodikova kislina za ohranitev alkalnega ali kislega okolje. V tem koraku je potrebno tudi veliko število organskih topil (toluen, etil acetat). Omejeni organski topili povzročata draženje in lahko toksično vplivata na ljudi. Dosedanje študije so pokazale, da je ena glavnih pomanjkljivosti gvajakolskega procesa ta, da ustvarja številne stranske produkte in odpadke .

'''2.3. BIOSINTEZA VANILINA Z IZOEVGENOLOM''' (''Pichia pastoris'')
V tem procesu so gen za izoevgenol monooksidazo kloniran iz metagenomske DNA iz tal in heterologno izrazili v Pichia pastoris. Izoevgenol monooksigenaza je ključni encim za pretvorbo izoevgenola v vanilin. Biosinteza poteka v petih stopnjah. Zaradi stroge specifičnosti encimske reakcije v je nastalo manj stranskih produktov kot pri drugih sintezah.

'''2.4. BIOSINTEZA VANILINA S FERULNO KISLINO''' (''Pseudomonas fluorescens'')
Za razvoj robustne bakterije, ki lahko proizvede velike količine vanilina, so gen za vanilin dehidrogenazo (vdh) pri sevu Pseudomonas fluorescens BF13 inaktiviral s ciljno mutagenezo. Tekom procesa se porabi veliko energije in ultra čiste vode.

== 3. ZAKLJUČEK ==

Ocena življenjskega cikla je v tej študiji upoštevala le vplive na okolje. Predlagane izboljšave temeljijo predvsem na uporabi destilirane ali industrijske vode tekom vseh štirih opisanih postopkov proizvodnje vanilina. Prav tako, lahko zmanjšamo negativni vpliv na okolje z izbiro alternativnih virov energije (zemeljski plin, sončna, veterna energija) namesto premoga. Ker se vanilin proizvaja v komercialne namene je v oceno življenjskega cikla potrebno všteti še stroške surovin, ceno opreme in obratovalnega cikla. S tem bi oceno življenjskega cikla za sintezo vanilina izpopolnili.

Identifikacija okoljskih žarišč in strategij za izboljšanje proizvodnje vanilina z oceno življenjskega cikla.

2021-05-27T10:57:08Z

Ninalukancic:

== 1. UVOD ==

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksi benzaldehid) je pomembna aromatska spojina. Uporabljamo ga v farmacevtski, kozmetični in živilski industriji. Je intermediat pri sintezi arom, deodorantov in krem za sončenje. Vanilin lahko naravno pridobimo iz strokov vanilije (manj kot 0,2% svetovnega povpraševanja) ali pa s pomočjo sinteze, ki predstavlja večinski delež proizvodnje. V študiji želijo s pomočjo ocene življenjskega cikla (LCA) zmanjšati potencialno negativne vplive proizvodnje vanilina na okolje. Osredotočili so se na 4 različne postopke sinteze. Na podlagi pridobljenih rezultatov so predlagane izboljšave za trajnosten in okolju prijazen način pridobitve vanilina.

'''== 2. PROIZVODNJA VANILINA =='''

'''2.1 SINTEZA VANILINA Z 2-BROMO-4-METIL FENOLOM'''

Sinteza poteka v štirih korakih. Tekom sinteze se porabi ogromno električne energije zaradi oksidacijskih reakcij. Ki zahtevajo neprekinjeno delovanje črpalk. Prav tako se tekom oksidacije porabi veliko energije za vzdrževanje temperaturnih pogojev in visokega tlaka.

'''2.2. SINTEZA VANILINA Z GVAJAKOLOM'''
Sinteza poteka v 4 korakih. Ozko grlo procesa je v tretjem koraku, ko se uporabi natrijev hidroksid ali klorovodikova kislina za ohranitev alkalnega ali kislega okolje. V tem koraku je potrebno tudi veliko število organskih topil (toluen, etil acetat). Omejeni organski topili povzročata draženje in lahko toksično vplivata na ljudi. Dosedanje študije so pokazale, da je ena glavnih pomanjkljivosti gvajakolskega procesa ta, da ustvarja številne stranske produkte in odpadke .

'''2.3. BIOSINTEZA VANILINA Z IZOEVGENOLOM''' (''Pichia pastoris'')
V tem procesu so gen za izoevgenol monooksidazo kloniran iz metagenomske DNA iz tal in heterologno izrazili v Pichia pastoris. Izoevgenol monooksigenaza je ključni encim za pretvorbo izoevgenola v vanilin. Biosinteza poteka v petih stopnjah. Zaradi stroge specifičnosti encimske reakcije v je nastalo manj stranskih produktov kot pri drugih sintezah.

'''2.4. BIOSINTEZA VANILINA S FERULNO KISLINO''' (''Pseudomonas fluorescens'')
Za razvoj robustne bakterije, ki lahko proizvede velike količine vanilina, so gen za vanilin dehidrogenazo (vdh) pri sevu Pseudomonas fluorescens BF13 inaktiviral s ciljno mutagenezo. Tekom procesa se porabi veliko energije in ultra čiste vode.

'''== 3. ZAKLJUČEK =='''

Ocena življenjskega cikla je v tej študiji upoštevala le vplive na okolje. Predlagane izboljšave temeljijo predvsem na uporabi destilirane ali industrijske vode tekom vseh štirih opisanih postopkov proizvodnje vanilina. Prav tako, lahko zmanjšamo negativni vpliv na okolje z izbiro alternativnih virov energije (zemeljski plin, sončna, veterna energija) namesto premoga. Ker se vanilin proizvaja v komercialne namene je v oceno življenjskega cikla potrebno všteti še stroške surovin, ceno opreme in obratovalnega cikla. S tem bi oceno življenjskega cikla za sintezo vanilina izpopolnili.

Identifikacija okoljskih žarišč in strategij za izboljšanje proizvodnje vanilina z oceno življenjskega cikla.

2021-05-27T10:56:53Z

Ninalukancic:

'''== 1. UVOD =='''

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksi benzaldehid) je pomembna aromatska spojina. Uporabljamo ga v farmacevtski, kozmetični in živilski industriji. Je intermediat pri sintezi arom, deodorantov in krem za sončenje. Vanilin lahko naravno pridobimo iz strokov vanilije (manj kot 0,2% svetovnega povpraševanja) ali pa s pomočjo sinteze, ki predstavlja večinski delež proizvodnje. V študiji želijo s pomočjo ocene življenjskega cikla (LCA) zmanjšati potencialno negativne vplive proizvodnje vanilina na okolje. Osredotočili so se na 4 različne postopke sinteze. Na podlagi pridobljenih rezultatov so predlagane izboljšave za trajnosten in okolju prijazen način pridobitve vanilina.

'''== 2. PROIZVODNJA VANILINA =='''

'''2.1 SINTEZA VANILINA Z 2-BROMO-4-METIL FENOLOM'''

Sinteza poteka v štirih korakih. Tekom sinteze se porabi ogromno električne energije zaradi oksidacijskih reakcij. Ki zahtevajo neprekinjeno delovanje črpalk. Prav tako se tekom oksidacije porabi veliko energije za vzdrževanje temperaturnih pogojev in visokega tlaka.

'''2.2. SINTEZA VANILINA Z GVAJAKOLOM'''
Sinteza poteka v 4 korakih. Ozko grlo procesa je v tretjem koraku, ko se uporabi natrijev hidroksid ali klorovodikova kislina za ohranitev alkalnega ali kislega okolje. V tem koraku je potrebno tudi veliko število organskih topil (toluen, etil acetat). Omejeni organski topili povzročata draženje in lahko toksično vplivata na ljudi. Dosedanje študije so pokazale, da je ena glavnih pomanjkljivosti gvajakolskega procesa ta, da ustvarja številne stranske produkte in odpadke .

'''2.3. BIOSINTEZA VANILINA Z IZOEVGENOLOM''' (''Pichia pastoris'')
V tem procesu so gen za izoevgenol monooksidazo kloniran iz metagenomske DNA iz tal in heterologno izrazili v Pichia pastoris. Izoevgenol monooksigenaza je ključni encim za pretvorbo izoevgenola v vanilin. Biosinteza poteka v petih stopnjah. Zaradi stroge specifičnosti encimske reakcije v je nastalo manj stranskih produktov kot pri drugih sintezah.

'''2.4. BIOSINTEZA VANILINA S FERULNO KISLINO''' (''Pseudomonas fluorescens'')
Za razvoj robustne bakterije, ki lahko proizvede velike količine vanilina, so gen za vanilin dehidrogenazo (vdh) pri sevu Pseudomonas fluorescens BF13 inaktiviral s ciljno mutagenezo. Tekom procesa se porabi veliko energije in ultra čiste vode.

'''== 3. ZAKLJUČEK =='''

Ocena življenjskega cikla je v tej študiji upoštevala le vplive na okolje. Predlagane izboljšave temeljijo predvsem na uporabi destilirane ali industrijske vode tekom vseh štirih opisanih postopkov proizvodnje vanilina. Prav tako, lahko zmanjšamo negativni vpliv na okolje z izbiro alternativnih virov energije (zemeljski plin, sončna, veterna energija) namesto premoga. Ker se vanilin proizvaja v komercialne namene je v oceno življenjskega cikla potrebno všteti še stroške surovin, ceno opreme in obratovalnega cikla. S tem bi oceno življenjskega cikla za sintezo vanilina izpopolnili.

Identifikacija okoljskih žarišč in strategij za izboljšanje proizvodnje vanilina z oceno življenjskega cikla.

2021-05-27T10:56:16Z

Ninalukancic:

== UVOD ==

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksi benzaldehid) je pomembna aromatska spojina. Uporabljamo ga v farmacevtski, kozmetični in živilski industriji. Je intermediat pri sintezi arom, deodorantov in krem za sončenje. Vanilin lahko naravno pridobimo iz strokov vanilije (manj kot 0,2% svetovnega povpraševanja) ali pa s pomočjo sinteze, ki predstavlja večinski delež proizvodnje. V študiji želijo s pomočjo ocene življenjskega cikla (LCA) zmanjšati potencialno negativne vplive proizvodnje vanilina na okolje. Osredotočili so se na 4 različne postopke sinteze. Na podlagi pridobljenih rezultatov so predlagane izboljšave za trajnosten in okolju prijazen način pridobitve vanilina.

== PROIZVODNJA VANILINA ==

'''2.1 SINTEZA VANILINA Z 2-BROMO-4-METIL FENOLOM'''

Sinteza poteka v štirih korakih. Tekom sinteze se porabi ogromno električne energije zaradi oksidacijskih reakcij. Ki zahtevajo neprekinjeno delovanje črpalk. Prav tako se tekom oksidacije porabi veliko energije za vzdrževanje temperaturnih pogojev in visokega tlaka.

'''2.2. SINTEZA VANILINA Z GVAJAKOLOM'''
Sinteza poteka v 4 korakih. Ozko grlo procesa je v tretjem koraku, ko se uporabi natrijev hidroksid ali klorovodikova kislina za ohranitev alkalnega ali kislega okolje. V tem koraku je potrebno tudi veliko število organskih topil (toluen, etil acetat). Omejeni organski topili povzročata draženje in lahko toksično vplivata na ljudi. Dosedanje študije so pokazale, da je ena glavnih pomanjkljivosti gvajakolskega procesa ta, da ustvarja številne stranske produkte in odpadke .

'''2.3. BIOSINTEZA VANILINA Z IZOEVGENOLOM''' (''Pichia pastoris'')
V tem procesu so gen za izoevgenol monooksidazo kloniran iz metagenomske DNA iz tal in heterologno izrazili v Pichia pastoris. Izoevgenol monooksigenaza je ključni encim za pretvorbo izoevgenola v vanilin. Biosinteza poteka v petih stopnjah. Zaradi stroge specifičnosti encimske reakcije v je nastalo manj stranskih produktov kot pri drugih sintezah.

'''2.4. BIOSINTEZA VANILINA S FERULNO KISLINO''' (''Pseudomonas fluorescens'')
Za razvoj robustne bakterije, ki lahko proizvede velike količine vanilina, so gen za vanilin dehidrogenazo (vdh) pri sevu Pseudomonas fluorescens BF13 inaktiviral s ciljno mutagenezo. Tekom procesa se porabi veliko energije in ultra čiste vode.

== ZAKLJUČEK ==

Ocena življenjskega cikla je v tej študiji upoštevala le vplive na okolje. Predlagane izboljšave temeljijo predvsem na uporabi destilirane ali industrijske vode tekom vseh štirih opisanih postopkov proizvodnje vanilina. Prav tako, lahko zmanjšamo negativni vpliv na okolje z izbiro alternativnih virov energije (zemeljski plin, sončna, veterna energija) namesto premoga. Ker se vanilin proizvaja v komercialne namene je v oceno življenjskega cikla potrebno všteti še stroške surovin, ceno opreme in obratovalnega cikla. S tem bi oceno življenjskega cikla za sintezo vanilina izpopolnili.

Identifikacija okoljskih žarišč in strategij za izboljšanje proizvodnje vanilina z oceno življenjskega cikla.

2021-05-27T10:55:27Z

Ninalukancic:

'''== UVOD =='''

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksi benzaldehid) je pomembna aromatska spojina. Uporabljamo ga v farmacevtski, kozmetični in živilski industriji. Je intermediat pri sintezi arom, deodorantov in krem za sončenje. Vanilin lahko naravno pridobimo iz strokov vanilije (manj kot 0,2% svetovnega povpraševanja) ali pa s pomočjo sinteze, ki predstavlja večinski delež proizvodnje. V študiji želijo s pomočjo ocene življenjskega cikla (LCA) zmanjšati potencialno negativne vplive proizvodnje vanilina na okolje. Osredotočili so se na 4 različne postopke sinteze. Na podlagi pridobljenih rezultatov so predlagane izboljšave za trajnosten in okolju prijazen način pridobitve vanilina.

'''== PROIZVODNJA VANILINA =='''

'''2.1 SINTEZA VANILINA Z 2-BROMO-4-METIL FENOLOM'''

Sinteza poteka v štirih korakih. Tekom sinteze se porabi ogromno električne energije zaradi oksidacijskih reakcij. Ki zahtevajo neprekinjeno delovanje črpalk. Prav tako se tekom oksidacije porabi veliko energije za vzdrževanje temperaturnih pogojev in visokega tlaka.

'''2.2. SINTEZA VANILINA Z GVAJAKOLOM'''
Sinteza poteka v 4 korakih. Ozko grlo procesa je v tretjem koraku, ko se uporabi natrijev hidroksid ali klorovodikova kislina za ohranitev alkalnega ali kislega okolje. V tem koraku je potrebno tudi veliko število organskih topil (toluen, etil acetat). Omejeni organski topili povzročata draženje in lahko toksično vplivata na ljudi. Dosedanje študije so pokazale, da je ena glavnih pomanjkljivosti gvajakolskega procesa ta, da ustvarja številne stranske produkte in odpadke .

'''2.3. BIOSINTEZA VANILINA Z IZOEVGENOLOM''' (''Pichia pastoris'')
V tem procesu so gen za izoevgenol monooksidazo kloniran iz metagenomske DNA iz tal in heterologno izrazili v Pichia pastoris. Izoevgenol monooksigenaza je ključni encim za pretvorbo izoevgenola v vanilin. Biosinteza poteka v petih stopnjah. Zaradi stroge specifičnosti encimske reakcije v je nastalo manj stranskih produktov kot pri drugih sintezah.

'''2.4. BIOSINTEZA VANILINA S FERULNO KISLINO''' (''Pseudomonas fluorescens'')
Za razvoj robustne bakterije, ki lahko proizvede velike količine vanilina, so gen za vanilin dehidrogenazo (vdh) pri sevu Pseudomonas fluorescens BF13 inaktiviral s ciljno mutagenezo. Tekom procesa se porabi veliko energije in ultra čiste vode.

'''== ZAKLJUČEK =='''

Ocena življenjskega cikla je v tej študiji upoštevala le vplive na okolje. Predlagane izboljšave temeljijo predvsem na uporabi destilirane ali industrijske vode tekom vseh štirih opisanih postopkov proizvodnje vanilina. Prav tako, lahko zmanjšamo negativni vpliv na okolje z izbiro alternativnih virov energije (zemeljski plin, sončna, veterna energija) namesto premoga. Ker se vanilin proizvaja v komercialne namene je v oceno življenjskega cikla potrebno všteti še stroške surovin, ceno opreme in obratovalnega cikla. S tem bi oceno življenjskega cikla za sintezo vanilina izpopolnili.

Identifikacija okoljskih žarišč in strategij za izboljšanje proizvodnje vanilina z oceno življenjskega cikla.

2021-05-27T10:54:26Z

Ninalukancic:

== '''== UVOD ==''' ==

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksi benzaldehid) je pomembna aromatska spojina. Uporabljamo ga v farmacevtski, kozmetični in živilski industriji. Je intermediat pri sintezi arom, deodorantov in krem za sončenje. Vanilin lahko naravno pridobimo iz strokov vanilije (manj kot 0,2% svetovnega povpraševanja) ali pa s pomočjo sinteze, ki predstavlja večinski delež proizvodnje. V študiji želijo s pomočjo ocene življenjskega cikla (LCA) zmanjšati potencialno negativne vplive proizvodnje vanilina na okolje. Osredotočili so se na 4 različne postopke sinteze. Na podlagi pridobljenih rezultatov so predlagane izboljšave za trajnosten in okolju prijazen način pridobitve vanilina.

== '''== PROIZVODNJA VANILINA ==''' ==

'''2.1 SINTEZA VANILINA Z 2-BROMO-4-METIL FENOLOM'''

Sinteza poteka v štirih korakih. Tekom sinteze se porabi ogromno električne energije zaradi oksidacijskih reakcij. Ki zahtevajo neprekinjeno delovanje črpalk. Prav tako se tekom oksidacije porabi veliko energije za vzdrževanje temperaturnih pogojev in visokega tlaka.

'''2.2. SINTEZA VANILINA Z GVAJAKOLOM'''
Sinteza poteka v 4 korakih. Ozko grlo procesa je v tretjem koraku, ko se uporabi natrijev hidroksid ali klorovodikova kislina za ohranitev alkalnega ali kislega okolje. V tem koraku je potrebno tudi veliko število organskih topil (toluen, etil acetat). Omejeni organski topili povzročata draženje in lahko toksično vplivata na ljudi. Dosedanje študije so pokazale, da je ena glavnih pomanjkljivosti gvajakolskega procesa ta, da ustvarja številne stranske produkte in odpadke .

'''2.3. BIOSINTEZA VANILINA Z IZOEVGENOLOM''' (''Pichia pastoris'')
V tem procesu so gen za izoevgenol monooksidazo kloniran iz metagenomske DNA iz tal in heterologno izrazili v Pichia pastoris. Izoevgenol monooksigenaza je ključni encim za pretvorbo izoevgenola v vanilin. Biosinteza poteka v petih stopnjah. Zaradi stroge specifičnosti encimske reakcije v je nastalo manj stranskih produktov kot pri drugih sintezah.

'''2.4. BIOSINTEZA VANILINA S FERULNO KISLINO''' (''Pseudomonas fluorescens'')
Za razvoj robustne bakterije, ki lahko proizvede velike količine vanilina, so gen za vanilin dehidrogenazo (vdh) pri sevu Pseudomonas fluorescens BF13 inaktiviral s ciljno mutagenezo. Tekom procesa se porabi veliko energije in ultra čiste vode.

== '''== ZAKLJUČEK ==''' ==

Ocena življenjskega cikla je v tej študiji upoštevala le vplive na okolje. Predlagane izboljšave temeljijo predvsem na uporabi destilirane ali industrijske vode tekom vseh štirih opisanih postopkov proizvodnje vanilina. Prav tako, lahko zmanjšamo negativni vpliv na okolje z izbiro alternativnih virov energije (zemeljski plin, sončna, veterna energija) namesto premoga. Ker se vanilin proizvaja v komercialne namene je v oceno življenjskega cikla potrebno všteti še stroške surovin, ceno opreme in obratovalnega cikla. S tem bi oceno življenjskega cikla za sintezo vanilina izpopolnili.

Identifikacija okoljskih žarišč in strategij za izboljšanje proizvodnje vanilina z oceno življenjskega cikla.

2021-05-27T10:53:25Z

Ninalukancic: New page: '''== UVOD ==''' Vanilin (4-hidroksi-3-metoksi benzaldehid) je pomembna aromatska spojina. Uporabljamo ga v farmacevtski, kozmetični in živilski industriji. Je intermediat pri sintezi ...

'''== UVOD =='''

Vanilin (4-hidroksi-3-metoksi benzaldehid) je pomembna aromatska spojina. Uporabljamo ga v farmacevtski, kozmetični in živilski industriji. Je intermediat pri sintezi arom, deodorantov in krem za sončenje. Vanilin lahko naravno pridobimo iz strokov vanilije (manj kot 0,2% svetovnega povpraševanja) ali pa s pomočjo sinteze, ki predstavlja večinski delež proizvodnje. V študiji želijo s pomočjo ocene življenjskega cikla (LCA) zmanjšati potencialno negativne vplive proizvodnje vanilina na okolje. Osredotočili so se na 4 različne postopke sinteze. Na podlagi pridobljenih rezultatov so predlagane izboljšave za trajnosten in okolju prijazen način pridobitve vanilina.

'''== PROIZVODNJA VANILINA =='''

'''2.1 SINTEZA VANILINA Z 2-BROMO-4-METIL FENOLOM'''
Sinteza poteka v štirih korakih. Tekom sinteze se porabi ogromno električne energije zaradi oksidacijskih reakcij. Ki zahtevajo neprekinjeno delovanje črpalk. Prav tako se tekom oksidacije porabi veliko energije za vzdrževanje temperaturnih pogojev in visokega tlaka.

'''2.2. SINTEZA VANILINA Z GVAJAKOLOM'''
Sinteza poteka v 4 korakih. Ozko grlo procesa je v tretjem koraku, ko se uporabi natrijev hidroksid ali klorovodikova kislina za ohranitev alkalnega ali kislega okolje. V tem koraku je potrebno tudi veliko število organskih topil (toluen, etil acetat). Omejeni organski topili povzročata draženje in lahko toksično vplivata na ljudi. Dosedanje študije so pokazale, da je ena glavnih pomanjkljivosti gvajakolskega procesa ta, da ustvarja številne stranske produkte in odpadke .

'''2.3. BIOSINTEZA VANILINA Z IZOEVGENOLOM''' (''Pichia pastoris'')
V tem procesu so gen za izoevgenol monooksidazo kloniran iz metagenomske DNA iz tal in heterologno izrazili v Pichia pastoris. Izoevgenol monooksigenaza je ključni encim za pretvorbo izoevgenola v vanilin. Biosinteza poteka v petih stopnjah. Zaradi stroge specifičnosti encimske reakcije v je nastalo manj stranskih produktov kot pri drugih sintezah.

'''2.4. BIOSINTEZA VANILINA S FERULNO KISLINO''' (''Pseudomonas fluorescens'')
Za razvoj robustne bakterije, ki lahko proizvede velike količine vanilina, so gen za vanilin dehidrogenazo (vdh) pri sevu Pseudomonas fluorescens BF13 inaktiviral s ciljno mutagenezo. Tekom procesa se porabi veliko energije in ultra čiste vode.

'''== ZAKLJUČEK =='''

Ocena življenjskega cikla je v tej študiji upoštevala le vplive na okolje. Predlagane izboljšave temeljijo predvsem na uporabi destilirane ali industrijske vode tekom vseh štirih opisanih postopkov proizvodnje vanilina. Prav tako, lahko zmanjšamo negativni vpliv na okolje z izbiro alternativnih virov energije (zemeljski plin, sončna, veterna energija) namesto premoga. Ker se vanilin proizvaja v komercialne namene je v oceno življenjskega cikla potrebno všteti še stroške surovin, ceno opreme in obratovalnega cikla. S tem bi oceno življenjskega cikla za sintezo vanilina izpopolnili.

MBT seminarji 2021

2021-05-27T10:51:03Z

Ninalukancic:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah:

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.) 
# An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.) 

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)

'''Gensko spremenjene živali in celične linije''' 
# Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout "et. al"; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)
# Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse (H. Li ''et. al''; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117(52), 2021; https://doi.org/10.1073/pnas.2003991117). [[Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.]] Matija Ruparčič (8.4.)

'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti''' 
# Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered ''Corynebacterium glutamicum''. (T. Walter ''et. al.''; Microorganisms 8(6), 2020; https://doi.org/10.3390/microorganisms8060866). [[Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum]]. Saša Slabe (14.4.)
# Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from ''Pseudomonas nitroreducens'' Jin1. (Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5). [[Učinkovita biosinteza vanilina iz izoevgenola z uporabo rekombinantne izoevgenol monooksigenaze Jin1 iz bakterije Pseudomonas nitroreducens]]. Luka Gnidovec (15.4.)
# One-pot production of butyl butyrate from glucose using a cognate “diamond-shaped” ''E. coli'' consortium (J. P. Sinumvayo "et. al"; Bioresources and Bioprocessing 8, 2021; https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-021-00372-8#Sec9). [[Proizvodnja butil butirata iz glukoze z uporabo "diamantnega" konzorcija E. coli]] Liza Ulčakar (15.4.)

'''Biotehnološki polimeri''' 
# Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors (S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” ''J. Biotechnol.'', vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001). [[Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi]] Anže Karlek (21.4.)
# Complete biosynthesis of a sulfated chondroitin in ''Escherichia coli'' (Badri, A., ''et al''; Nature communications 12 (2021); https://doi.org/10.1038/s41467-021-21692-5). [[Popolna biosinteza hondroitin sulfata v E. coli]] Ana Maklin (22.4.)
# Optimization of cultivation medium and cyclic fed-batch fermentation strategy for enhanced polyhydroxyalkanoate production by Bacillus thuringiensis using a glucose-rich hydrolyzate (Singh et al. Bioresour. Bioprocess. (2021) 8:11, https://doi.org/10.1186/s40643-021-00361-x) [[Optimizacija fermentacijske proizvodnje PHA-bioplastike z b. thuringiensis in z glukozo bogatimi hidrolizati]] Urban Hribar (22.4.)

'''Biotehnološko pridobljeni encimi''' 
# Engineering a carboxypeptidase from ''Aspergillus niger'' M00988 by mutation to increase its ability in high Fischer ratio oligopeptide preparation (Xiong K., Liu J., Wang X., Sun B., Zhang Y., Zhao Z., Pei P., & Li X.; Journal of Biotechnology, 330, 1–8, 2021, https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2021.02.015). [[Priprava karboksipeptidaze iz glive Aspergillus niger M00988 za izboljšanje priprave oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem]] Urška Fajdiga (5.5.)
# Cell-Based High-Throughput Screening Protocol for Discovering Antiviral Inhibitors Against SARS-COV-2 Main Protease (3CLpro) (Rothan, H.A., Teoh, T.C; Mol Biotechnol 63, 240–248 (2021); https://doi.org/10.1007/s12033-021-00299-7) [[Visoko zmogljiv presejalni protokol na osnovi celic za raziskovanje antivirusnih inhibitorjev proti Sars-Cov-2 glavni proteazi (3CLpro)]] Mirsad Mešić (6.5.)
# A novel cold-active type I pullulanase from a hot-spring metagenome for effective debranching and production of resistant starch (M. Thakur ''et al''.; Bioresource Technology 320, 2021; https://doi.org/10.1016/j.biortech.2020.124288). [[Pri nizkih temperaturah aktivna pululanaza tipa I iz metagenoma vročih vrelcev omogoča učinkovito klestenje in proizvodnjo odpornega škroba]] Martina Lokar (6.5.)

'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji''' 
# Production of Tyrian purple indigoid dye from tryptophan in ''Escherichia coli'' (J. Lee ''et al.''; Nat. Chem. Biol. 17, 2021; https://doi.org/10.1038/s41589-020-00684-4). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1krlatnega_indigoidnega_barvila_iz_triptofana_v_bakteriji_Escherichia_coli Proizvodnja škrlatnega indigoidnega barvila iz triptofana v bakteriji ''Escherichia coli''] Jerneja Nimac (12.5.)
# Development of ''Pseudomonas asiatica'' as a host for the production of 3-hydroxypropionic acid from glycerol (T. Thi Nguyen et al., Bioresource Technology, vol. 329, 2021; https://doi.org/10.1016/j.biortech.2021.124867). [[Razvoj gostiteljskega organizma Pseudomonas asiatica za proizvodnjo 3-hidroksipropionske kisline iz glicerola]] Urška Pečarič Strnad (12.5.)
# Generation of an engineered food-grade ''Lactococcus lactis'' strain for production of an antimicrobial peptide: ''in vitro'' and ''in silico'' evaluation (A. Tanhaeian ''et. al''; BMC Biotechnol. 20(1), 2020; https://doi.org/10.1186/s12896-020-00612-3). [[Priprava in ovrednotenje novega seva bakterij Lactococcus lactis za proizvodnjo protimikrobnega peptida]]. Klementina Polanec (13.5.)
# Metabolic engineering of ''E. coli'' for producing phloroglucinol from acetate (S. Yu et. al; Applied Microbiology and Biotechnology. 2020; https://doi.org/10.1007/s00253-020-10591-2). [[Metabolno inženirstvo bakterije Escherichia coli za pridobivanje floroglucinola iz acetata]]. Ernestina Lavrih (13.5.)

'''Biomasa in biogoriva''' 
# Green Deep Eutectic Solvents for ''Microwave-Assisted Biomass'' Delignification and Valorisation (Grillo G. ''et al.''; Molecules 2021; https://www.mdpi.com/1420-3049/26/4/798/htm) [[Zelena globoka evtektična topila za delignifikacijo in valorizacijo biomase s pomočjo mikrovalov]]. Željka Erić (19.5.)
# Incorporating a molecular antenna in diatom microalgae cells enhances photosynthesis (Leone, G., De la Cruz Valbuena, G., Cicco, S.R. ''et al.''; Sci Rep 11, 2021; https://www.nature.com/articles/s41598-021-84690-z#Sec10) [[Vključevanje molekularne antene v celice mikroskopsko majhnih kremenastih alg (diatomej) za izboljšanje fotosintetske učinkovitosti]]. Karin Dobravc Škof (20.5.)
# Integrated cascade biorefinery processes for the production of single cell oil by ''Lipomyces starkeyi'' from ''Arundo donax L.'' hydrolysates (Di Fidio N ''et al.''; ''Bioresour. Tecnhol.'', vol.325, p.124635, Apr. 2021.; https://doi.org/10.1016/j.biortech.2020.124635). [[Integrirana procesa biorafinerijske proizvodnje znotrajceličnih založnih lipidov iz Arundo donax L. v Lipomyces starkeyi]] . Katja Doberšek (20.5.)

'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija''' 
# HriGFP Novel Flourescent Protein: Expression and Applications (Saeed, S. ''et al.''; Molecular Biotechnology. 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00243-1) [[ HriGFP fluorescentni protein: Izraz in aplikacije]]. Almina Tahirović (26.5.)
# An extracellular lipase from Amycolatopsis mediterannei is a cutinase with plastic degrading activity (T. Yeqi; Computational and Structural Biotechnology Journal 19; 2021, https://doi.org/10.1016/j.csbj.2021.01.019 ) [[ Izvencelična lipaza iz Amycolatopsis Mediterannei je kutinaza z možnostjo razgradnje plastike.]] Eva Keber (27.05.)
# Identifying environmental hotspots and improvement strategies of vanillin production with life cycle assessment (Y. Zhao et. al; Science of the total environment, 769, 2021; https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.144771 ) [[ Identifikacija okoljskih žarišč in strategij za izboljšanje proizvodnje vanilina z oceno življenjskega cikla. ]] Nina Lukančič (27.5)

MBT seminarji 2021

2021-05-25T20:11:18Z

Ninalukancic:

Seminarji iz Molekularne biotehnologije so letos organizirani tako, da vsak študent (praviloma v paru, lahko pa tudi samostojno) obdela temo s področja cepiv proti virusu SARS-CoV-2 in o tem pripravi kratek poljudno napisan povzetek. Ta del seminarjev je predstavljen na [[protikovidna cepiva|ločeni strani]].
V drugem delu vsak študent predstavi nek raziskovalni dosežek s širšega področja molekularne biotehnologije. Seznam tem in predstavitev za študijsko leto 2020/21 je predstavljen tu.

Povzetke morate objaviti do torka do polnoči v tednu, ko imate seminar (v četrtek). Angleški naslov prevedite tudi v slovenščino - to bo naslov povzetka, ki ga objavite na posebni strani, tako kot so to naredili kolegi pred vami (oz. predlani).

Način vnosa:

The importance of ''Arabidopsis'' glutathione peroxidase 8 for protecting ''Arabidopsis'' plant and ''E. coli'' cells against oxidative stress (A. Gaber; GM Crops & Food 5(1), 2014; http://dx.doi.org/10.4161/gmcr.26979) Pomen glutation peroksidaze 8 iz repnjakovca za zaščito rastline ''Arabidopsis thaliana'' in bakterije ''Escherichia coli'' pred oksidativnim stresom. Janez Novak (28.2.) 
(slovenski naslov povežite z novo stranjo, na kateri bo povzetek)

----

Naslovi odobrenih člankov po temah:

'''Farmacevtsko pomembni proteini''' 
# Development of Antibody-Fragment-Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus (A. Sasou ''et. al''; Frontiers in Plant Science 12, 2021; https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953). [[Proizvodnja riža za sintezo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.]] Mateja Žvipelj (11.3.)
# A New Plant Expression System for Producing Pharmaceutical Proteins (N. Abd-Aziz ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00242-2). [[Razvoj ekspresijskega sistema za proizvodnjo farmacevtskih proteinov v rastlini Mucuna bracteata]]. Jernej Imperl (18.3.)
# Development of a Recombinant Monospecific Anti-PLGF Bivalent Nanobody and Evaluation of it in Angiogenesis Modulation (A. Nikooharf "et all"; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00275-7#additional-information) [[Razvoj rekombinantnih monospecifičnih bivalentnih nanoteles proti PLGF-u]]. Nika Zaveršek (18.3.)

'''Cepiva''' 
# Development of a DNA Vaccine for Melanoma Metastasis by Inhalation Based on an Analysis of Transgene Expression Characteristics of Naked pDNA and a Ternary Complex in Mouse Lung Tissues (Kodama ''et.al'';Pharmaceutics 12,2020; https://www.mdpi.com/1999-4923/12/6/540#framed_div_cited_count) [[ Razvoj DNA cepiva proti metastazam melanoma z vdihavanjem na podlagi analize značilnosti transgene ekspresije gole pDNA in trojni kompleks v mišjem pljučnem tkivu]]. Paula Horvat (25.3.) 
# An AMA1/MSP119 Adjuvanted Malaria Transplastomic Plant‑Based Vaccine Induces Immune Responses in Test Animals (Evelia M. Milán‑Noris ''et. al''; Molecular Biotechnology 62, 2020; https://doi.org/10.1007/s12033-020-00271-x) [[V rastlinah proizvedeno transplastomsko antimalarijsko cepivo z AMA1/MSP119 in dodanim adjuvansom inducira imunski odziv v testnih živalih]]. Neža Pavko (25.3.) 

'''Gensko spremenjene rastline''' 
# A wheat cysteine-rich receptor-like kinase confers broad-spectrum resistance against Septoria tritici blotch (C. Saintenac ''et al.''; Nat. Commun. 12, 2021, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20685-0). [[Receptorju podobna kinaza bogata s cisteini, pšenici daje odpornost proti širokemu spektru pegavosti Septoria tritici]]. Andrej Race (7.4.)
# RNAi silenced ζ-carotene desaturase developed variegated tomato transformants with increased phytoene content (M. A. Babu ''et. al''; Plant Growth Regul. 93, 2021; https://doi.org/10.1007/s10725-020-00678-1). [[Vpliv utišanja ζ-karoten desaturaze na vsebnost karotenoidov v gensko spremenjenih paradižnikih]]. Peter Škrinjar (7.4.)

'''Gensko spremenjene živali in celične linije''' 
# Engineering carotenoid production in mammalian cells for nutritionally enhanced cell-cultured foods (A. J. Stout "et. al"; Metabolic Engineering 62, 2020; https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.07.011). [[Razvoj proizvodnje karotenoidov v sesalskih celicah za prehransko izboljšano celično pridobljeno meso]]. Urša Lovše (8.4.)
# Efficient photoactivatable Dre recombinase for cell type-specific spatiotemporal control of genome engineering in the mouse (H. Li ''et. al''; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 117(52), 2021; https://doi.org/10.1073/pnas.2003991117). [[Priprava fotoinducibilne rekombinaze Dre kot orodje za prostorsko in časovno odvisno urejanje genoma v specifičnih mišjih celicah.]] Matija Ruparčič (8.4.)

'''Nizkomolekularni biotehnološki produkti''' 
# Fermentative N-Methylanthranilate Production by Engineered ''Corynebacterium glutamicum''. (T. Walter ''et. al.''; Microorganisms 8(6), 2020; https://doi.org/10.3390/microorganisms8060866). [[Fermentativna proizvodnja N-metilantranilata z inženirsko spremenjeno Corynebacterium glutamicum]]. Saša Slabe (14.4.)
# Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from ''Pseudomonas nitroreducens'' Jin1. (Wang Q, Wu X, Lu X, He Y, Ma B, Xu Y. Efficient Biosynthesis of Vanillin from Isoeugenol by Recombinant Isoeugenol Monooxygenase from Pseudomonas nitroreducens Jin1. Appl Biochem Biotechnol. 2021:1116-1128. doi:10.1007/s12010-020-03478-5). [[Učinkovita biosinteza vanilina iz izoevgenola z uporabo rekombinantne izoevgenol monooksigenaze Jin1 iz bakterije Pseudomonas nitroreducens]]. Luka Gnidovec (15.4.)
# One-pot production of butyl butyrate from glucose using a cognate “diamond-shaped” ''E. coli'' consortium (J. P. Sinumvayo "et. al"; Bioresources and Bioprocessing 8, 2021; https://bioresourcesbioprocessing.springeropen.com/articles/10.1186/s40643-021-00372-8#Sec9). [[Proizvodnja butil butirata iz glukoze z uporabo "diamantnega" konzorcija E. coli]] Liza Ulčakar (15.4.)

'''Biotehnološki polimeri''' 
# Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors (S. M. Derya et al., “Biotechnologically produced fucosylated oligosaccharides inhibit the binding of human noroviruses to their natural receptors,” ''J. Biotechnol.'', vol. 318, no. April, pp. 31–38, 2020, doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.05.001). [[Inhibicija vezave humanega norovirusa na naravni receptor z biotehnološko proizvedenimi fukoziliranimi oligosaharidi]] Anže Karlek (21.4.)
# Complete biosynthesis of a sulfated chondroitin in ''Escherichia coli'' (Badri, A., ''et al''; Nature communications 12 (2021); https://doi.org/10.1038/s41467-021-21692-5). [[Popolna biosinteza hondroitin sulfata v E. coli]] Ana Maklin (22.4.)
# Optimization of cultivation medium and cyclic fed-batch fermentation strategy for enhanced polyhydroxyalkanoate production by Bacillus thuringiensis using a glucose-rich hydrolyzate (Singh et al. Bioresour. Bioprocess. (2021) 8:11, https://doi.org/10.1186/s40643-021-00361-x) [[Optimizacija fermentacijske proizvodnje PHA-bioplastike z b. thuringiensis in z glukozo bogatimi hidrolizati]] Urban Hribar (22.4.)

'''Biotehnološko pridobljeni encimi''' 
# Engineering a carboxypeptidase from ''Aspergillus niger'' M00988 by mutation to increase its ability in high Fischer ratio oligopeptide preparation (Xiong K., Liu J., Wang X., Sun B., Zhang Y., Zhao Z., Pei P., & Li X.; Journal of Biotechnology, 330, 1–8, 2021, https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2021.02.015). [[Priprava karboksipeptidaze iz glive Aspergillus niger M00988 za izboljšanje priprave oligopeptidov z visokim Fischerjevim razmerjem]] Urška Fajdiga (5.5.)
# Cell-Based High-Throughput Screening Protocol for Discovering Antiviral Inhibitors Against SARS-COV-2 Main Protease (3CLpro) (Rothan, H.A., Teoh, T.C; Mol Biotechnol 63, 240–248 (2021); https://doi.org/10.1007/s12033-021-00299-7) [[Visoko zmogljiv presejalni protokol na osnovi celic za raziskovanje antivirusnih inhibitorjev proti Sars-Cov-2 glavni proteazi (3CLpro)]] Mirsad Mešić (6.5.)
# A novel cold-active type I pullulanase from a hot-spring metagenome for effective debranching and production of resistant starch (M. Thakur ''et al''.; Bioresource Technology 320, 2021; https://doi.org/10.1016/j.biortech.2020.124288). [[Pri nizkih temperaturah aktivna pululanaza tipa I iz metagenoma vročih vrelcev omogoča učinkovito klestenje in proizvodnjo odpornega škroba]] Martina Lokar (6.5.)

'''Metabolno inženirstvo v biotehnologiji''' 
# Production of Tyrian purple indigoid dye from tryptophan in ''Escherichia coli'' (J. Lee ''et al.''; Nat. Chem. Biol. 17, 2021; https://doi.org/10.1038/s41589-020-00684-4). [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_%C5%A1krlatnega_indigoidnega_barvila_iz_triptofana_v_bakteriji_Escherichia_coli Proizvodnja škrlatnega indigoidnega barvila iz triptofana v bakteriji ''Escherichia coli''] Jerneja Nimac (12.5.)
# Development of ''Pseudomonas asiatica'' as a host for the production of 3-hydroxypropionic acid from glycerol (T. Thi Nguyen et al., Bioresource Technology, vol. 329, 2021; https://doi.org/10.1016/j.biortech.2021.124867). [[Razvoj gostiteljskega organizma Pseudomonas asiatica za proizvodnjo 3-hidroksipropionske kisline iz glicerola]] Urška Pečarič Strnad (12.5.)
# Generation of an engineered food-grade ''Lactococcus lactis'' strain for production of an antimicrobial peptide: ''in vitro'' and ''in silico'' evaluation (A. Tanhaeian ''et. al''; BMC Biotechnol. 20(1), 2020; https://doi.org/10.1186/s12896-020-00612-3). [[Priprava in ovrednotenje novega seva bakterij Lactococcus lactis za proizvodnjo protimikrobnega peptida]]. Klementina Polanec (13.5.)
# Metabolic engineering of ''E. coli'' for producing phloroglucinol from acetate (S. Yu et. al; Applied Microbiology and Biotechnology. 2020; https://doi.org/10.1007/s00253-020-10591-2). [[Metabolno inženirstvo bakterije Escherichia coli za pridobivanje floroglucinola iz acetata]]. Ernestina Lavrih (13.5.)

'''Biomasa in biogoriva''' 
# Green Deep Eutectic Solvents for ''Microwave-Assisted Biomass'' Delignification and Valorisation (Grillo G. ''et al.''; Molecules 2021; https://www.mdpi.com/1420-3049/26/4/798/htm) [[Zelena globoka evtektična topila za delignifikacijo in valorizacijo biomase s pomočjo mikrovalov]]. Željka Erić (19.5.)
# Incorporating a molecular antenna in diatom microalgae cells enhances photosynthesis (Leone, G., De la Cruz Valbuena, G., Cicco, S.R. ''et al.''; Sci Rep 11, 2021; https://www.nature.com/articles/s41598-021-84690-z#Sec10) [[Vključevanje molekularne antene v celice mikroskopsko majhnih kremenastih alg (diatomej) za izboljšanje fotosintetske učinkovitosti]]. Karin Dobravc Škof (20.5.)
# Integrated cascade biorefinery processes for the production of single cell oil by ''Lipomyces starkeyi'' from ''Arundo donax L.'' hydrolysates (Di Fidio N ''et al.''; ''Bioresour. Tecnhol.'', vol.325, p.124635, Apr. 2021.; https://doi.org/10.1016/j.biortech.2020.124635). [[Integrirana procesa biorafinerijske proizvodnje znotrajceličnih založnih lipidov iz Arundo donax L. v Lipomyces starkeyi]] . Katja Doberšek (20.5.)

'''Okoljski vidiki biotehnologije in bioremediacija''' 
# HriGFP Novel Flourescent Protein: Expression and Applications (Saeed, S. ''et al.''; Molecular Biotechnology. 2020; https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-020-00243-1) [[ HriGFP fluorescentni protein: Izraz in aplikacije]]. Almina Tahirović (26.5.)
# An extracellular lipase from Amycolatopsis mediterannei is a cutinase with plastic degrading activity (T. Yeqi; Computational and Structural Biotechnology Journal 19; 2021, https://doi.org/10.1016/j.csbj.2021.01.019 ) [[ Izvencelična lipaza iz Amycolatopsis Mediterannei je kutinaza z možnostjo razgradnje plastike.]] Eva Keber (27.05.)
# Identifying environmental hotspots and improvement strategies of vanillin production with life cycle assessment (Y. Zhao et. al; Science of the total environment, 769, 2021; https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.144771 ) [[ Opredelitev okoljskih žarišč in strategij za izboljšanje produkcije vanilina z oceno življenjskega cikla. ]] Nina Lukančič (27.5)

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodom v prsti

2021-05-24T22:07:44Z

Ninalukancic: /* OPIS PROJEKTA */

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

== ''' UVOD''' ==

Rastlinsko-parazitske nematode so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodom v kmetijstvu pravimo ogorčice [9]. Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili nov RootPatch za boj proti beli krompirjevi, ''Globodera pallida''. ''Globodera pallida'' izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

== ''' OPIS PROJEKTA''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila ''in silico''.

'''2.1. IZBIRA GOSTITELJSKE BAKTERIJE'''

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodom. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali ''Bacillus mycoides'' M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še ''Bacillus subtilis'' HS3, ''Bacillus megateriu''m DSM319 in ''Bacillus amyloliquefacien''s 205 [4].

'''2.2. IZBIRA NEVROPEPTIDA'''

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

'''2.3. IZBIRA PROMOTORJA'''

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri ''Bacillus mycoides'' za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].

'''2.4. IZBIRA SIGNALENEGA PEPTIDA'''

Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri ''Bacilllus mycoides''. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (''Bacillus subtilis'') , PhoD Tat (''Bacillus subtilis'') , AmyE (''Bacillus megaterium'') in AmyE (''Bacillus mycoides'') sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

'''2.5. METODA INTEGRACIJE'''

V genom gostiteljske bakterije ''Bacillus mycoides'' bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

'''2.6. APLIKACIJA'''

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

'''2.7. VARNOSTNI MEHANIZEM'''

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega ''Bacillus mycoides'' bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YqcG (BBa_K3507002) / YqcF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v ''Bacillus subtilis''. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

== ''' ZAKLJUČEK''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

== ''' VIRI''' ==

[1] Band L., H. Shimotsu, D. J. Henner. 1984. Nucleotide sequence of the Bacillus subtilis trpE and trpD genes. Gene 27:55-65.

[2] Elbaz M., Ben-Yehuda S. (2015). Following the fate of bacterial cells experiencing sudden chromosome loss. MBio, 6(3), 1–11.

[3] Holberger L. E., Garza-Sánchez F., Lamoureux J., Low D. A., Hayes C. S. A novel family of toxin/antitoxin proteins in Bacillus species (2012). FEBS Letters, 586(2), 132–136.

[4] iGEM 2020, Groningen, RootPatch: https://2020.igem.org/Team:Groningen (dostopno 22. 5. 2021).

[5] Lobo C. B., Juárez Tomás M. S., Viruel, E., Ferrero M. A., Lucca, M. E. Development of low-cost formulations of plant growth-promoting bacteria to be used as inoculants in beneficial agricultural technologies. (2019). Microbiological Research, 219, stran: 12–25.

[6] Koo B.J., Adriano D.C., Bolan N.S., Barton C.D. Root exudates and microorganisms. (2005). Encyclopedia of Soils in the Environment, stran: 421-428. 2005

[7] Martínez-Álvarez J.C., Castro-Martínez C., Sánchez-Peña, P., Gutiérrez-Dorado R., Maldonado-Mendoza I.E. Development of a powder formulation based on Bacillus cereus sensu lato strain B25 spores for biological control of Fusarium verticillioides in maize plants. (2016). World Journal Microbiology Biotechnology, 32, stran:75.

[8] Ochola J., Cortada L., Ng’ang’a M., Hassanali A., Coyne, D., Torto B. Mediation of Potato–Potato Cyst Nematode, G. rostochiensis Interaction by Specific Root Exudate Compounds. (2020). Frontiers in Plant Science, 11(June).

[9] Ogoročice oziroma nematode so tudi rastlinski škodljivi organizmi: https://www.gov.si/novice/2020-04-09-ogorocice-oziroma-nematode-so-tudi-rastlinski-skodljivi-organizmi/ (dostopno 22.5.2021)

[10] Yi Y., Li Z., Song C., Kuipers O. P. Exploring plant-microbe interactions of the rhizobacteria Bacillus subtilis and Bacillus mycoides by use of the CRISPR-Cas9 system. (2018). Environmental Microbiology, 20(12), stran: 4245–4260.

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodom v prsti

2021-05-24T21:19:48Z

Ninalukancic: /* OPIS PROJEKTA */

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

== ''' UVOD''' ==

Rastlinsko-parazitske nematode so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodom v kmetijstvu pravimo ogorčice [9]. Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili nov RootPatch za boj proti beli krompirjevi, ''Globodera pallida''. ''Globodera pallida'' izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

== ''' OPIS PROJEKTA''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila ''in silico''.

'''2.1. IZBIRA GOSTITELJSKE BAKTERIJE'''

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodom. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali ''Bacillus mycoides'' M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še ''Bacillus subtilis'' HS3, ''Bacillus megateriu''m DSM319 in ''Bacillus amyloliquefacien''s 205 [4].

'''2.2. IZBIRA NEVROPEPTIDA'''

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

'''2.3. IZBIRA PROMOTORJA'''

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri ''Bacillus mycoides'' za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].

'''2.4. IZBIRA SIGNALENEGA PEPTIDA'''

Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri ''Bacilllus mycoides''. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (''Bacillus subtilis'') , PhoD Tat (''Bacillus subtilis'') , AmyE (''Bacillus megaterium'') in AmyE (''Bacillus mycoides'') sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

'''2.5. METODA INTEGRACIJE'''

V genom gostiteljske bakterije ''Bacillus mycoides'' bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

'''2.6. APLIKACIJA'''

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

'''2.7. VARNOSTNI MEHANIZEM'''

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega ''Bacillus mycoides'' bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v ''Bacillus subtilis''. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

== ''' ZAKLJUČEK''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

== ''' VIRI''' ==

[1] Band L., H. Shimotsu, D. J. Henner. 1984. Nucleotide sequence of the Bacillus subtilis trpE and trpD genes. Gene 27:55-65.

[2] Elbaz M., Ben-Yehuda S. (2015). Following the fate of bacterial cells experiencing sudden chromosome loss. MBio, 6(3), 1–11.

[3] Holberger L. E., Garza-Sánchez F., Lamoureux J., Low D. A., Hayes C. S. A novel family of toxin/antitoxin proteins in Bacillus species (2012). FEBS Letters, 586(2), 132–136.

[4] iGEM 2020, Groningen, RootPatch: https://2020.igem.org/Team:Groningen (dostopno 22. 5. 2021).

[5] Lobo C. B., Juárez Tomás M. S., Viruel, E., Ferrero M. A., Lucca, M. E. Development of low-cost formulations of plant growth-promoting bacteria to be used as inoculants in beneficial agricultural technologies. (2019). Microbiological Research, 219, stran: 12–25.

[6] Koo B.J., Adriano D.C., Bolan N.S., Barton C.D. Root exudates and microorganisms. (2005). Encyclopedia of Soils in the Environment, stran: 421-428. 2005

[7] Martínez-Álvarez J.C., Castro-Martínez C., Sánchez-Peña, P., Gutiérrez-Dorado R., Maldonado-Mendoza I.E. Development of a powder formulation based on Bacillus cereus sensu lato strain B25 spores for biological control of Fusarium verticillioides in maize plants. (2016). World Journal Microbiology Biotechnology, 32, stran:75.

[8] Ochola J., Cortada L., Ng’ang’a M., Hassanali A., Coyne, D., Torto B. Mediation of Potato–Potato Cyst Nematode, G. rostochiensis Interaction by Specific Root Exudate Compounds. (2020). Frontiers in Plant Science, 11(June).

[9] Ogoročice oziroma nematode so tudi rastlinski škodljivi organizmi: https://www.gov.si/novice/2020-04-09-ogorocice-oziroma-nematode-so-tudi-rastlinski-skodljivi-organizmi/ (dostopno 22.5.2021)

[10] Yi Y., Li Z., Song C., Kuipers O. P. Exploring plant-microbe interactions of the rhizobacteria Bacillus subtilis and Bacillus mycoides by use of the CRISPR-Cas9 system. (2018). Environmental Microbiology, 20(12), stran: 4245–4260.

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodom v prsti

2021-05-24T21:12:15Z

Ninalukancic: /* OPIS PROJEKTA */

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

== ''' UVOD''' ==

Rastlinsko-parazitske nematode so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodom v kmetijstvu pravimo ogorčice [9]. Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili nov RootPatch za boj proti beli krompirjevi, ''Globodera pallida''. ''Globodera pallida'' izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

== ''' OPIS PROJEKTA''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila ''in silico''.

'''2.1. IZBIRA GOSTITELJA'''

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodom. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali ''Bacillus mycoides'' M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še ''Bacillus subtilis'' HS3, ''Bacillus megateriu''m DSM319 in ''Bacillus amyloliquefacien''s 205 [4].

'''2.2. IZBIRA NEVROPEPTIDA'''

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

'''2.3. IZBIRA PROMOTORJA'''

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri ''Bacillus mycoides'' za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].

'''2.4. IZBIRA SIGNALENEGA PEPTIDA'''

Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri ''Bacilllus mycoides''. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (''Bacillus subtilis'') , PhoD Tat (''Bacillus subtilis'') , AmyE (''Bacillus megaterium'') in AmyE (''Bacillus mycoides'') sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

'''2.5. METODA INTEGRACIJE'''

V genom gostiteljske bakterije ''Bacillus mycoides'' bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

'''2.6. APLIKACIJA'''

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

'''2.7. VARNOSTNI MEHANIZEM'''

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega ''Bacillus mycoides'' bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v ''Bacillus subtilis''. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

== ''' ZAKLJUČEK''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

== ''' VIRI''' ==

[1] Band L., H. Shimotsu, D. J. Henner. 1984. Nucleotide sequence of the Bacillus subtilis trpE and trpD genes. Gene 27:55-65.

[2] Elbaz M., Ben-Yehuda S. (2015). Following the fate of bacterial cells experiencing sudden chromosome loss. MBio, 6(3), 1–11.

[3] Holberger L. E., Garza-Sánchez F., Lamoureux J., Low D. A., Hayes C. S. A novel family of toxin/antitoxin proteins in Bacillus species (2012). FEBS Letters, 586(2), 132–136.

[4] iGEM 2020, Groningen, RootPatch: https://2020.igem.org/Team:Groningen (dostopno 22. 5. 2021).

[5] Lobo C. B., Juárez Tomás M. S., Viruel, E., Ferrero M. A., Lucca, M. E. Development of low-cost formulations of plant growth-promoting bacteria to be used as inoculants in beneficial agricultural technologies. (2019). Microbiological Research, 219, stran: 12–25.

[6] Koo B.J., Adriano D.C., Bolan N.S., Barton C.D. Root exudates and microorganisms. (2005). Encyclopedia of Soils in the Environment, stran: 421-428. 2005

[7] Martínez-Álvarez J.C., Castro-Martínez C., Sánchez-Peña, P., Gutiérrez-Dorado R., Maldonado-Mendoza I.E. Development of a powder formulation based on Bacillus cereus sensu lato strain B25 spores for biological control of Fusarium verticillioides in maize plants. (2016). World Journal Microbiology Biotechnology, 32, stran:75.

[8] Ochola J., Cortada L., Ng’ang’a M., Hassanali A., Coyne, D., Torto B. Mediation of Potato–Potato Cyst Nematode, G. rostochiensis Interaction by Specific Root Exudate Compounds. (2020). Frontiers in Plant Science, 11(June).

[9] Ogoročice oziroma nematode so tudi rastlinski škodljivi organizmi: https://www.gov.si/novice/2020-04-09-ogorocice-oziroma-nematode-so-tudi-rastlinski-skodljivi-organizmi/ (dostopno 22.5.2021)

[10] Yi Y., Li Z., Song C., Kuipers O. P. Exploring plant-microbe interactions of the rhizobacteria Bacillus subtilis and Bacillus mycoides by use of the CRISPR-Cas9 system. (2018). Environmental Microbiology, 20(12), stran: 4245–4260.

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodom v prsti

2021-05-24T18:14:50Z

Ninalukancic: /* OPIS PROJEKTA */

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

== ''' UVOD''' ==

Rastlinsko-parazitske nematode so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodom v kmetijstvu pravimo ogorčice [9]. Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili nov RootPatch za boj proti beli krompirjevi, ''Globodera pallida''. ''Globodera pallida'' izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

== ''' OPIS PROJEKTA''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila ''in silico''.

'''2.1. IZBIRA GOSTITELJA'''

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodom. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali ''Bacillus mycoides'' M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še ''Bacillus subtilis'' HS3, ''Bacillus megateriu''m DSM319 in ''Bacillus amyloliquefacien''s 205 [4].

'''2.2. IZBIRA NEVROPEPTIDA'''

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

'''2.3. IZBIRA PROMOTORJA'''

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri ''Bacillus mycoides'' za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].

'''2.4. IZBIRA SIGNALENEGA PEPTIDA ZA IZLOČANJE'''

Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri ''Bacilllus mycoides''. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (''Bacillus subtilis'') , PhoD Tat (''Bacillus subtilis'') , AmyE (''Bacillus megaterium'') in AmyE (''Bacillus mycoides'') sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

'''2.5. IZBIRA METODE INTEGRACIJE'''

V genom gostiteljske bakterije ''Bacillus mycoides'' bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

'''2.6. IZBIRA METODE APLIKACIJE'''

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

'''2.7. VARNOSTNI MEHANIZEM'''

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega ''Bacillus mycoides'' bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v ''Bacillus subtilis''. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

== ''' ZAKLJUČEK''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

== ''' VIRI''' ==

[1] Band L., H. Shimotsu, D. J. Henner. 1984. Nucleotide sequence of the Bacillus subtilis trpE and trpD genes. Gene 27:55-65.

[2] Elbaz M., Ben-Yehuda S. (2015). Following the fate of bacterial cells experiencing sudden chromosome loss. MBio, 6(3), 1–11.

[3] Holberger L. E., Garza-Sánchez F., Lamoureux J., Low D. A., Hayes C. S. A novel family of toxin/antitoxin proteins in Bacillus species (2012). FEBS Letters, 586(2), 132–136.

[4] iGEM 2020, Groningen, RootPatch: https://2020.igem.org/Team:Groningen (dostopno 22. 5. 2021).

[5] Lobo C. B., Juárez Tomás M. S., Viruel, E., Ferrero M. A., Lucca, M. E. Development of low-cost formulations of plant growth-promoting bacteria to be used as inoculants in beneficial agricultural technologies. (2019). Microbiological Research, 219, stran: 12–25.

[6] Koo B.J., Adriano D.C., Bolan N.S., Barton C.D. Root exudates and microorganisms. (2005). Encyclopedia of Soils in the Environment, stran: 421-428. 2005

[7] Martínez-Álvarez J.C., Castro-Martínez C., Sánchez-Peña, P., Gutiérrez-Dorado R., Maldonado-Mendoza I.E. Development of a powder formulation based on Bacillus cereus sensu lato strain B25 spores for biological control of Fusarium verticillioides in maize plants. (2016). World Journal Microbiology Biotechnology, 32, stran:75.

[8] Ochola J., Cortada L., Ng’ang’a M., Hassanali A., Coyne, D., Torto B. Mediation of Potato–Potato Cyst Nematode, G. rostochiensis Interaction by Specific Root Exudate Compounds. (2020). Frontiers in Plant Science, 11(June).

[9] Ogoročice oziroma nematode so tudi rastlinski škodljivi organizmi: https://www.gov.si/novice/2020-04-09-ogorocice-oziroma-nematode-so-tudi-rastlinski-skodljivi-organizmi/ (dostopno 22.5.2021)

[10] Yi Y., Li Z., Song C., Kuipers O. P. Exploring plant-microbe interactions of the rhizobacteria Bacillus subtilis and Bacillus mycoides by use of the CRISPR-Cas9 system. (2018). Environmental Microbiology, 20(12), stran: 4245–4260.

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodom v prsti

2021-05-24T18:14:16Z

Ninalukancic: /* OPIS PROJEKTA */

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

== ''' UVOD''' ==

Rastlinsko-parazitske nematode so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodom v kmetijstvu pravimo ogorčice [9]. Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili nov RootPatch za boj proti beli krompirjevi, ''Globodera pallida''. ''Globodera pallida'' izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

== ''' OPIS PROJEKTA''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila ''in silico''.

'''2.1. IZBIRA GOSTITELJA'''

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodom. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali ''Bacillus mycoides'' M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še ''Bacillus subtilis'' HS3, ''Bacillus megateriu''m DSM319 in ''Bacillus amyloliquefacien''s 205 [4].

'''2.2. IZBIRA NEVROPEPTIDA'''

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

'''2.3. IZBIRA PROMOTORJA'''

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri Bacillus mycoides za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].

'''2.4. IZBIRA SIGNALENEGA PEPTIDA ZA IZLOČANJE'''

Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri ''Bacilllus mycoides''. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (''Bacillus subtilis'') , PhoD Tat (''Bacillus subtilis'') , AmyE (''Bacillus megaterium'') in AmyE (''Bacillus mycoides'') sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

'''2.5. IZBIRA METODE INTEGRACIJE'''

V genom gostiteljske bakterije ''Bacillus mycoides'' bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

'''2.6. IZBIRA METODE APLIKACIJE'''

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

'''2.7. VARNOSTNI MEHANIZEM'''

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega ''Bacillus mycoides'' bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v ''Bacillus subtilis''. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

== ''' ZAKLJUČEK''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

== ''' VIRI''' ==

[1] Band L., H. Shimotsu, D. J. Henner. 1984. Nucleotide sequence of the Bacillus subtilis trpE and trpD genes. Gene 27:55-65.

[2] Elbaz M., Ben-Yehuda S. (2015). Following the fate of bacterial cells experiencing sudden chromosome loss. MBio, 6(3), 1–11.

[3] Holberger L. E., Garza-Sánchez F., Lamoureux J., Low D. A., Hayes C. S. A novel family of toxin/antitoxin proteins in Bacillus species (2012). FEBS Letters, 586(2), 132–136.

[4] iGEM 2020, Groningen, RootPatch: https://2020.igem.org/Team:Groningen (dostopno 22. 5. 2021).

[5] Lobo C. B., Juárez Tomás M. S., Viruel, E., Ferrero M. A., Lucca, M. E. Development of low-cost formulations of plant growth-promoting bacteria to be used as inoculants in beneficial agricultural technologies. (2019). Microbiological Research, 219, stran: 12–25.

[6] Koo B.J., Adriano D.C., Bolan N.S., Barton C.D. Root exudates and microorganisms. (2005). Encyclopedia of Soils in the Environment, stran: 421-428. 2005

[7] Martínez-Álvarez J.C., Castro-Martínez C., Sánchez-Peña, P., Gutiérrez-Dorado R., Maldonado-Mendoza I.E. Development of a powder formulation based on Bacillus cereus sensu lato strain B25 spores for biological control of Fusarium verticillioides in maize plants. (2016). World Journal Microbiology Biotechnology, 32, stran:75.

[8] Ochola J., Cortada L., Ng’ang’a M., Hassanali A., Coyne, D., Torto B. Mediation of Potato–Potato Cyst Nematode, G. rostochiensis Interaction by Specific Root Exudate Compounds. (2020). Frontiers in Plant Science, 11(June).

[9] Ogoročice oziroma nematode so tudi rastlinski škodljivi organizmi: https://www.gov.si/novice/2020-04-09-ogorocice-oziroma-nematode-so-tudi-rastlinski-skodljivi-organizmi/ (dostopno 22.5.2021)

[10] Yi Y., Li Z., Song C., Kuipers O. P. Exploring plant-microbe interactions of the rhizobacteria Bacillus subtilis and Bacillus mycoides by use of the CRISPR-Cas9 system. (2018). Environmental Microbiology, 20(12), stran: 4245–4260.

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodom v prsti

2021-05-24T18:06:56Z

Ninalukancic: /* UVOD */

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

== ''' UVOD''' ==

Rastlinsko-parazitske nematode so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodom v kmetijstvu pravimo ogorčice [9]. Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili nov RootPatch za boj proti beli krompirjevi, ''Globodera pallida''. ''Globodera pallida'' izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

== ''' OPIS PROJEKTA''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila ''in silico''.

'''2.1. IZBIRA GOSTITELJA'''

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodam. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali ''Bacillus mycoides'' M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še ''Bacillus subtilis'' HS3, ''Bacillus megateriu''m DSM319 in ''Bacillus amyloliquefacien''s 205 [4].

'''2.2. IZBIRA NEVROPEPTIDA'''

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

'''2.3. IZBIRA PROMOTORJA'''

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri Bacillus mycoides za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].

'''2.4. IZBIRA SIGNALENEGA PEPTIDA ZA IZLOČANJE'''

Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri ''Bacilllus mycoides''. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (''Bacillus subtilis'') , PhoD Tat (''Bacillus subtilis'') , AmyE (''Bacillus megaterium'') in AmyE (''Bacillus mycoides'') sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

'''2.5. IZBIRA METODE INTEGRACIJE'''

V genom gostiteljske bakterije ''Bacillus mycoides'' bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

'''2.6. IZBIRA METODE APLIKACIJE'''

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

'''2.7. VARNOSTNI MEHANIZEM'''

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega ''Bacillus mycoides'' bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v ''Bacillus subtilis''. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

== ''' ZAKLJUČEK''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

== ''' VIRI''' ==

[1] Band L., H. Shimotsu, D. J. Henner. 1984. Nucleotide sequence of the Bacillus subtilis trpE and trpD genes. Gene 27:55-65.

[2] Elbaz M., Ben-Yehuda S. (2015). Following the fate of bacterial cells experiencing sudden chromosome loss. MBio, 6(3), 1–11.

[3] Holberger L. E., Garza-Sánchez F., Lamoureux J., Low D. A., Hayes C. S. A novel family of toxin/antitoxin proteins in Bacillus species (2012). FEBS Letters, 586(2), 132–136.

[4] iGEM 2020, Groningen, RootPatch: https://2020.igem.org/Team:Groningen (dostopno 22. 5. 2021).

[5] Lobo C. B., Juárez Tomás M. S., Viruel, E., Ferrero M. A., Lucca, M. E. Development of low-cost formulations of plant growth-promoting bacteria to be used as inoculants in beneficial agricultural technologies. (2019). Microbiological Research, 219, stran: 12–25.

[6] Koo B.J., Adriano D.C., Bolan N.S., Barton C.D. Root exudates and microorganisms. (2005). Encyclopedia of Soils in the Environment, stran: 421-428. 2005

[7] Martínez-Álvarez J.C., Castro-Martínez C., Sánchez-Peña, P., Gutiérrez-Dorado R., Maldonado-Mendoza I.E. Development of a powder formulation based on Bacillus cereus sensu lato strain B25 spores for biological control of Fusarium verticillioides in maize plants. (2016). World Journal Microbiology Biotechnology, 32, stran:75.

[8] Ochola J., Cortada L., Ng’ang’a M., Hassanali A., Coyne, D., Torto B. Mediation of Potato–Potato Cyst Nematode, G. rostochiensis Interaction by Specific Root Exudate Compounds. (2020). Frontiers in Plant Science, 11(June).

[9] Ogoročice oziroma nematode so tudi rastlinski škodljivi organizmi: https://www.gov.si/novice/2020-04-09-ogorocice-oziroma-nematode-so-tudi-rastlinski-skodljivi-organizmi/ (dostopno 22.5.2021)

[10] Yi Y., Li Z., Song C., Kuipers O. P. Exploring plant-microbe interactions of the rhizobacteria Bacillus subtilis and Bacillus mycoides by use of the CRISPR-Cas9 system. (2018). Environmental Microbiology, 20(12), stran: 4245–4260.

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodom v prsti

2021-05-24T12:08:11Z

Ninalukancic:

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

== ''' UVOD''' ==

Rastlinsko-parazitske nematode so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodam v kmetijstvu pravimo ogorčice [9]. Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili nov RootPatch za boj proti beli krompirjevi, ''Globodera pallida''. ''Globodera pallida'' izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

== ''' OPIS PROJEKTA''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila ''in silico''.

'''2.1. IZBIRA GOSTITELJA'''

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodam. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali ''Bacillus mycoides'' M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še ''Bacillus subtilis'' HS3, ''Bacillus megateriu''m DSM319 in ''Bacillus amyloliquefacien''s 205 [4].

'''2.2. IZBIRA NEVROPEPTIDA'''

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

'''2.3. IZBIRA PROMOTORJA'''

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri Bacillus mycoides za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].

'''2.4. IZBIRA SIGNALENEGA PEPTIDA ZA IZLOČANJE'''

Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri ''Bacilllus mycoides''. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (''Bacillus subtilis'') , PhoD Tat (''Bacillus subtilis'') , AmyE (''Bacillus megaterium'') in AmyE (''Bacillus mycoides'') sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

'''2.5. IZBIRA METODE INTEGRACIJE'''

V genom gostiteljske bakterije ''Bacillus mycoides'' bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

'''2.6. IZBIRA METODE APLIKACIJE'''

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

'''2.7. VARNOSTNI MEHANIZEM'''

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega ''Bacillus mycoides'' bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v ''Bacillus subtilis''. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

== ''' ZAKLJUČEK''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

== ''' VIRI''' ==

[1] Band L., H. Shimotsu, D. J. Henner. 1984. Nucleotide sequence of the Bacillus subtilis trpE and trpD genes. Gene 27:55-65.

[2] Elbaz M., Ben-Yehuda S. (2015). Following the fate of bacterial cells experiencing sudden chromosome loss. MBio, 6(3), 1–11.

[3] Holberger L. E., Garza-Sánchez F., Lamoureux J., Low D. A., Hayes C. S. A novel family of toxin/antitoxin proteins in Bacillus species (2012). FEBS Letters, 586(2), 132–136.

[4] iGEM 2020, Groningen, RootPatch: https://2020.igem.org/Team:Groningen (dostopno 22. 5. 2021).

[5] Lobo C. B., Juárez Tomás M. S., Viruel, E., Ferrero M. A., Lucca, M. E. Development of low-cost formulations of plant growth-promoting bacteria to be used as inoculants in beneficial agricultural technologies. (2019). Microbiological Research, 219, stran: 12–25.

[6] Koo B.J., Adriano D.C., Bolan N.S., Barton C.D. Root exudates and microorganisms. (2005). Encyclopedia of Soils in the Environment, stran: 421-428. 2005

[7] Martínez-Álvarez J.C., Castro-Martínez C., Sánchez-Peña, P., Gutiérrez-Dorado R., Maldonado-Mendoza I.E. Development of a powder formulation based on Bacillus cereus sensu lato strain B25 spores for biological control of Fusarium verticillioides in maize plants. (2016). World Journal Microbiology Biotechnology, 32, stran:75.

[8] Ochola J., Cortada L., Ng’ang’a M., Hassanali A., Coyne, D., Torto B. Mediation of Potato–Potato Cyst Nematode, G. rostochiensis Interaction by Specific Root Exudate Compounds. (2020). Frontiers in Plant Science, 11(June).

[9] Ogoročice oziroma nematode so tudi rastlinski škodljivi organizmi: https://www.gov.si/novice/2020-04-09-ogorocice-oziroma-nematode-so-tudi-rastlinski-skodljivi-organizmi/ (dostopno 22.5.2021)

[10] Yi Y., Li Z., Song C., Kuipers O. P. Exploring plant-microbe interactions of the rhizobacteria Bacillus subtilis and Bacillus mycoides by use of the CRISPR-Cas9 system. (2018). Environmental Microbiology, 20(12), stran: 4245–4260.

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodom v prsti

2021-05-24T12:07:56Z

Ninalukancic:

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

== ''' UVOD''' ==

Rastlinsko-parazitske nematode so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodam v kmetijstvu pravimo ogorčice [9]. Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili nov RootPatch za boj proti beli krompirjevi, ''Globodera pallida''. ''Globodera pallida'' izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

== ''' OPIS PROJEKTA''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila ''in silico''.

'''2.1. IZBIRA GOSTITELJA'''

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodam. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali ''Bacillus mycoides'' M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še ''Bacillus subtilis'' HS3, ''Bacillus megateriu''m DSM319 in ''Bacillus amyloliquefacien''s 205 [4].

'''2.2. IZBIRA NEVROPEPTIDA'''

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

'''2.3. IZBIRA PROMOTORJA'''

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri Bacillus mycoides za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].

'''2.4. IZBIRA SIGNALENEGA PEPTIDA ZA IZLOČANJE'''

Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri ''Bacilllus mycoides''. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (''Bacillus subtilis'') , PhoD Tat (''Bacillus subtilis'') , AmyE (''Bacillus megaterium'') in AmyE (''Bacillus mycoides'') sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

'''2.5. IZBIRA METODE INTEGRACIJE'''

V genom gostiteljske bakterije ''Bacillus mycoides'' bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

'''2.6. IZBIRA METODE APLIKACIJE'''

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

'''2.7. VARNOSTNI MEHANIZEM'''

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega ''Bacillus mycoides'' bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v ''Bacillus subtilis''. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

== ''' ZAKLJUČEK''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

== ''' VIRI''' ==

[1] Band L., H. Shimotsu, D. J. Henner. 1984. Nucleotide sequence of the Bacillus subtilis trpE and trpD genes. Gene 27:55-65.

[2] Elbaz M., Ben-Yehuda S. (2015). Following the fate of bacterial cells experiencing sudden chromosome loss. MBio, 6(3), 1–11.

[3] Holberger L. E., Garza-Sánchez F., Lamoureux J., Low D. A., Hayes C. S. A novel family of toxin/antitoxin proteins in Bacillus species (2012). FEBS Letters, 586(2), 132–136.

[4] iGEM 2020, Groningen, RootPatch: https://2020.igem.org/Team:Groningen (dostopno 22. 5. 2021).

[5] Lobo C. B., Juárez Tomás M. S., Viruel, E., Ferrero M. A., Lucca, M. E. Development of low-cost formulations of plant growth-promoting bacteria to be used as inoculants in beneficial agricultural technologies. (2019). Microbiological Research, 219, stran: 12–25.

[6] Koo B.J., Adriano D.C., Bolan N.S., Barton C.D. Root exudates and microorganisms. (2005). Encyclopedia of Soils in the Environment, stran: 421-428. 2005

[7] Martínez-Álvarez J.C., Castro-Martínez C., Sánchez-Peña, P., Gutiérrez-Dorado R., Maldonado-Mendoza I.E. Development of a powder formulation based on Bacillus cereus sensu lato strain B25 spores for biological control of Fusarium verticillioides in maize plants. (2016). World Journal Microbiology Biotechnology, 32, stran:75.

[8] Ochola J., Cortada L., Ng’ang’a M., Hassanali A., Coyne, D., Torto B. Mediation of Potato–Potato Cyst Nematode, G. rostochiensis Interaction by Specific Root Exudate Compounds. (2020). Frontiers in Plant Science, 11(June).

[9] Ogoročice oziroma nematode so tudi rastlinski škodljivi organizmi: https://www.gov.si/novice/2020-04-09-ogorocice-oziroma-nematode-so-tudi-rastlinski-skodljivi-organizmi/ (dostopno 22.5.2021)

[10] Yi Y., Li Z., Song C., Kuipers O. P. Exploring plant-microbe interactions of the rhizobacteria Bacillus subtilis and Bacillus mycoides by use of the CRISPR-Cas9 system. (2018). Environmental Microbiology, 20(12), stran: 4245–4260.

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodom v prsti

2021-05-24T12:07:04Z

Ninalukancic:

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

== '''1. UVOD''' ==

Rastlinsko-parazitske nematode so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodam v kmetijstvu pravimo ogorčice [9]. Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili nov RootPatch za boj proti beli krompirjevi, ''Globodera pallida''. ''Globodera pallida'' izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

== '''2. OPIS PROJEKTA''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila ''in silico''.

'''2.1. IZBIRA GOSTITELJA'''

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodam. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali ''Bacillus mycoides'' M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še ''Bacillus subtilis'' HS3, ''Bacillus megateriu''m DSM319 in ''Bacillus amyloliquefacien''s 205 [4].

'''2.2. IZBIRA NEVROPEPTIDA'''

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

'''2.3. IZBIRA PROMOTORJA'''

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri Bacillus mycoides za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].

'''2.4. IZBIRA SIGNALENEGA PEPTIDA ZA IZLOČANJE'''

Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri ''Bacilllus mycoides''. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (''Bacillus subtilis'') , PhoD Tat (''Bacillus subtilis'') , AmyE (''Bacillus megaterium'') in AmyE (''Bacillus mycoides'') sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

'''2.5. IZBIRA METODE INTEGRACIJE'''

V genom gostiteljske bakterije ''Bacillus mycoides'' bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

'''2.6. IZBIRA METODE APLIKACIJE'''

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

'''2.7. VARNOSTNI MEHANIZEM'''

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega ''Bacillus mycoides'' bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v ''Bacillus subtilis''. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

== '''3. ZAKLJUČEK''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

== '''4.VIRI''' ==

[1] Band L., H. Shimotsu, D. J. Henner. 1984. Nucleotide sequence of the Bacillus subtilis trpE and trpD genes. Gene 27:55-65.

[2] Elbaz M., Ben-Yehuda S. (2015). Following the fate of bacterial cells experiencing sudden chromosome loss. MBio, 6(3), 1–11.

[3] Holberger L. E., Garza-Sánchez F., Lamoureux J., Low D. A., Hayes C. S. A novel family of toxin/antitoxin proteins in Bacillus species (2012). FEBS Letters, 586(2), 132–136.

[4] iGEM 2020, Groningen, RootPatch: https://2020.igem.org/Team:Groningen (dostopno 22. 5. 2021).

[5] Lobo C. B., Juárez Tomás M. S., Viruel, E., Ferrero M. A., Lucca, M. E. Development of low-cost formulations of plant growth-promoting bacteria to be used as inoculants in beneficial agricultural technologies. (2019). Microbiological Research, 219, stran: 12–25.

[6] Koo B.J., Adriano D.C., Bolan N.S., Barton C.D. Root exudates and microorganisms. (2005). Encyclopedia of Soils in the Environment, stran: 421-428. 2005

[7] Martínez-Álvarez J.C., Castro-Martínez C., Sánchez-Peña, P., Gutiérrez-Dorado R., Maldonado-Mendoza I.E. Development of a powder formulation based on Bacillus cereus sensu lato strain B25 spores for biological control of Fusarium verticillioides in maize plants. (2016). World Journal Microbiology Biotechnology, 32, stran:75.

[8] Ochola J., Cortada L., Ng’ang’a M., Hassanali A., Coyne, D., Torto B. Mediation of Potato–Potato Cyst Nematode, G. rostochiensis Interaction by Specific Root Exudate Compounds. (2020). Frontiers in Plant Science, 11(June).

[9] Ogoročice oziroma nematode so tudi rastlinski škodljivi organizmi: https://www.gov.si/novice/2020-04-09-ogorocice-oziroma-nematode-so-tudi-rastlinski-skodljivi-organizmi/ (dostopno 22.5.2021)

[10] Yi Y., Li Z., Song C., Kuipers O. P. Exploring plant-microbe interactions of the rhizobacteria Bacillus subtilis and Bacillus mycoides by use of the CRISPR-Cas9 system. (2018). Environmental Microbiology, 20(12), stran: 4245–4260.

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodom v prsti

2021-05-24T12:05:55Z

Ninalukancic: /* 4.VIRI */

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

== '''1. UVOD''' ==

Rastlinsko-parazitske nematode so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodam v kmetijstvu pravimo ogorčice [9]. Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili nov RootPatch za boj proti beli krompirjevi, ''Globodera pallida''. ''Globodera pallida'' izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

== '''2. OPIS PROJEKTA''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila ''in silico''.

'''2.1. IZBIRA GOSTITELJA'''

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodam. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali ''Bacillus mycoides'' M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še ''Bacillus subtilis'' HS3, ''Bacillus megateriu''m DSM319 in ''Bacillus amyloliquefacien''s 205 [4].

'''2.2. IZBIRA NEVROPEPTIDA'''

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

'''2.3. IZBIRA PROMOTORJA'''

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri Bacillus mycoides za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].

'''2.4. IZBIRA SIGNALENEGA PEPTIDA ZA IZLOČANJE'''

Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri ''Bacilllus mycoides''. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (''Bacillus subtilis'') , PhoD Tat (''Bacillus subtilis'') , AmyE (''Bacillus megaterium'') in AmyE (''Bacillus mycoides'') sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

'''2.5. IZBIRA METODE INTEGRACIJE'''

V genom gostiteljske bakterije ''Bacillus mycoides'' bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

'''2.6. IZBIRA METODE APLIKACIJE'''

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

'''2.7. VARNOSTNI MEHANIZEM'''

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega ''Bacillus mycoides'' bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v ''Bacillus subtilis''. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

== '''3. ZAKLJUČEK''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

'''== 4.VIRI =='''

[1] Band L., H. Shimotsu, D. J. Henner. 1984. Nucleotide sequence of the Bacillus subtilis trpE and trpD genes. Gene 27:55-65.

[2] Elbaz M., Ben-Yehuda S. (2015). Following the fate of bacterial cells experiencing sudden chromosome loss. MBio, 6(3), 1–11.

[3] Holberger L. E., Garza-Sánchez F., Lamoureux J., Low D. A., Hayes C. S. A novel family of toxin/antitoxin proteins in Bacillus species (2012). FEBS Letters, 586(2), 132–136.

[4] iGEM 2020, Groningen, RootPatch: https://2020.igem.org/Team:Groningen (dostopno 22. 5. 2021).

[5] Lobo C. B., Juárez Tomás M. S., Viruel, E., Ferrero M. A., Lucca, M. E. Development of low-cost formulations of plant growth-promoting bacteria to be used as inoculants in beneficial agricultural technologies. (2019). Microbiological Research, 219, stran: 12–25.

[6] Koo B.J., Adriano D.C., Bolan N.S., Barton C.D. Root exudates and microorganisms. (2005). Encyclopedia of Soils in the Environment, stran: 421-428. 2005

[7] Martínez-Álvarez J.C., Castro-Martínez C., Sánchez-Peña, P., Gutiérrez-Dorado R., Maldonado-Mendoza I.E. Development of a powder formulation based on Bacillus cereus sensu lato strain B25 spores for biological control of Fusarium verticillioides in maize plants. (2016). World Journal Microbiology Biotechnology, 32, stran:75.

[8] Ochola J., Cortada L., Ng’ang’a M., Hassanali A., Coyne, D., Torto B. Mediation of Potato–Potato Cyst Nematode, G. rostochiensis Interaction by Specific Root Exudate Compounds. (2020). Frontiers in Plant Science, 11(June).

[9] Ogoročice oziroma nematode so tudi rastlinski škodljivi organizmi: https://www.gov.si/novice/2020-04-09-ogorocice-oziroma-nematode-so-tudi-rastlinski-skodljivi-organizmi/ (dostopno 22.5.2021)

[10] Yi Y., Li Z., Song C., Kuipers O. P. Exploring plant-microbe interactions of the rhizobacteria Bacillus subtilis and Bacillus mycoides by use of the CRISPR-Cas9 system. (2018). Environmental Microbiology, 20(12), stran: 4245–4260.

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodom v prsti

2021-05-24T12:05:38Z

Ninalukancic:

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

== '''1. UVOD''' ==

Rastlinsko-parazitske nematode so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodam v kmetijstvu pravimo ogorčice [9]. Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili nov RootPatch za boj proti beli krompirjevi, ''Globodera pallida''. ''Globodera pallida'' izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

== '''2. OPIS PROJEKTA''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila ''in silico''.

'''2.1. IZBIRA GOSTITELJA'''

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodam. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali ''Bacillus mycoides'' M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še ''Bacillus subtilis'' HS3, ''Bacillus megateriu''m DSM319 in ''Bacillus amyloliquefacien''s 205 [4].

'''2.2. IZBIRA NEVROPEPTIDA'''

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

'''2.3. IZBIRA PROMOTORJA'''

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri Bacillus mycoides za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].

'''2.4. IZBIRA SIGNALENEGA PEPTIDA ZA IZLOČANJE'''

Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri ''Bacilllus mycoides''. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (''Bacillus subtilis'') , PhoD Tat (''Bacillus subtilis'') , AmyE (''Bacillus megaterium'') in AmyE (''Bacillus mycoides'') sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

'''2.5. IZBIRA METODE INTEGRACIJE'''

V genom gostiteljske bakterije ''Bacillus mycoides'' bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

'''2.6. IZBIRA METODE APLIKACIJE'''

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

'''2.7. VARNOSTNI MEHANIZEM'''

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega ''Bacillus mycoides'' bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v ''Bacillus subtilis''. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

== '''3. ZAKLJUČEK''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

== 4.VIRI ==

[1] Band L., H. Shimotsu, D. J. Henner. 1984. Nucleotide sequence of the Bacillus subtilis trpE and trpD genes. Gene 27:55-65.

[2] Elbaz M., Ben-Yehuda S. (2015). Following the fate of bacterial cells experiencing sudden chromosome loss. MBio, 6(3), 1–11.

[3] Holberger L. E., Garza-Sánchez F., Lamoureux J., Low D. A., Hayes C. S. A novel family of toxin/antitoxin proteins in Bacillus species (2012). FEBS Letters, 586(2), 132–136.

[4] iGEM 2020, Groningen, RootPatch: https://2020.igem.org/Team:Groningen (dostopno 22. 5. 2021).

[5] Lobo C. B., Juárez Tomás M. S., Viruel, E., Ferrero M. A., Lucca, M. E. Development of low-cost formulations of plant growth-promoting bacteria to be used as inoculants in beneficial agricultural technologies. (2019). Microbiological Research, 219, stran: 12–25.

[6] Koo B.J., Adriano D.C., Bolan N.S., Barton C.D. Root exudates and microorganisms. (2005). Encyclopedia of Soils in the Environment, stran: 421-428. 2005

[7] Martínez-Álvarez J.C., Castro-Martínez C., Sánchez-Peña, P., Gutiérrez-Dorado R., Maldonado-Mendoza I.E. Development of a powder formulation based on Bacillus cereus sensu lato strain B25 spores for biological control of Fusarium verticillioides in maize plants. (2016). World Journal Microbiology Biotechnology, 32, stran:75.

[8] Ochola J., Cortada L., Ng’ang’a M., Hassanali A., Coyne, D., Torto B. Mediation of Potato–Potato Cyst Nematode, G. rostochiensis Interaction by Specific Root Exudate Compounds. (2020). Frontiers in Plant Science, 11(June).

[9] Ogoročice oziroma nematode so tudi rastlinski škodljivi organizmi: https://www.gov.si/novice/2020-04-09-ogorocice-oziroma-nematode-so-tudi-rastlinski-skodljivi-organizmi/ (dostopno 22.5.2021)

[10] Yi Y., Li Z., Song C., Kuipers O. P. Exploring plant-microbe interactions of the rhizobacteria Bacillus subtilis and Bacillus mycoides by use of the CRISPR-Cas9 system. (2018). Environmental Microbiology, 20(12), stran: 4245–4260.

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodom v prsti

2021-05-24T12:05:09Z

Ninalukancic: /* 3. ZAKLJUČEK */

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

== '''1. UVOD''' ==

Rastlinsko-parazitske nematode so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodam v kmetijstvu pravimo ogorčice [9]. Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili nov RootPatch za boj proti beli krompirjevi, ''Globodera pallida''. ''Globodera pallida'' izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

== '''2. OPIS PROJEKTA''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila ''in silico''.

'''2.1. IZBIRA GOSTITELJA'''

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodam. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali ''Bacillus mycoides'' M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še ''Bacillus subtilis'' HS3, ''Bacillus megateriu''m DSM319 in ''Bacillus amyloliquefacien''s 205 [4].

'''2.2. IZBIRA NEVROPEPTIDA'''

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

'''2.3. IZBIRA PROMOTORJA'''

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri Bacillus mycoides za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].

'''2.4. IZBIRA SIGNALENEGA PEPTIDA ZA IZLOČANJE'''

Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri ''Bacilllus mycoides''. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (''Bacillus subtilis'') , PhoD Tat (''Bacillus subtilis'') , AmyE (''Bacillus megaterium'') in AmyE (''Bacillus mycoides'') sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

'''2.5. IZBIRA METODE INTEGRACIJE'''

V genom gostiteljske bakterije ''Bacillus mycoides'' bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

'''2.6. IZBIRA METODE APLIKACIJE'''

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

'''2.7. VARNOSTNI MEHANIZEM'''

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega ''Bacillus mycoides'' bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v ''Bacillus subtilis''. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

== '''3. ZAKLJUČEK''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

'''== VIRI =='''

[1] Band L., H. Shimotsu, D. J. Henner. 1984. Nucleotide sequence of the Bacillus subtilis trpE and trpD genes. Gene 27:55-65.

[2] Elbaz M., Ben-Yehuda S. (2015). Following the fate of bacterial cells experiencing sudden chromosome loss. MBio, 6(3), 1–11.

[3] Holberger L. E., Garza-Sánchez F., Lamoureux J., Low D. A., Hayes C. S. A novel family of toxin/antitoxin proteins in Bacillus species (2012). FEBS Letters, 586(2), 132–136.

[4] iGEM 2020, Groningen, RootPatch: https://2020.igem.org/Team:Groningen (dostopno 22. 5. 2021).

[5] Lobo C. B., Juárez Tomás M. S., Viruel, E., Ferrero M. A., Lucca, M. E. Development of low-cost formulations of plant growth-promoting bacteria to be used as inoculants in beneficial agricultural technologies. (2019). Microbiological Research, 219, stran: 12–25.

[6] Koo B.J., Adriano D.C., Bolan N.S., Barton C.D. Root exudates and microorganisms. (2005). Encyclopedia of Soils in the Environment, stran: 421-428. 2005

[7] Martínez-Álvarez J.C., Castro-Martínez C., Sánchez-Peña, P., Gutiérrez-Dorado R., Maldonado-Mendoza I.E. Development of a powder formulation based on Bacillus cereus sensu lato strain B25 spores for biological control of Fusarium verticillioides in maize plants. (2016). World Journal Microbiology Biotechnology, 32, stran:75.

[8] Ochola J., Cortada L., Ng’ang’a M., Hassanali A., Coyne, D., Torto B. Mediation of Potato–Potato Cyst Nematode, G. rostochiensis Interaction by Specific Root Exudate Compounds. (2020). Frontiers in Plant Science, 11(June).

[9] Ogoročice oziroma nematode so tudi rastlinski škodljivi organizmi: https://www.gov.si/novice/2020-04-09-ogorocice-oziroma-nematode-so-tudi-rastlinski-skodljivi-organizmi/ (dostopno 22.5.2021)

[10] Yi Y., Li Z., Song C., Kuipers O. P. Exploring plant-microbe interactions of the rhizobacteria Bacillus subtilis and Bacillus mycoides by use of the CRISPR-Cas9 system. (2018). Environmental Microbiology, 20(12), stran: 4245–4260.

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodom v prsti

2021-05-24T12:04:32Z

Ninalukancic:

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

== '''1. UVOD''' ==

Rastlinsko-parazitske nematode so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodam v kmetijstvu pravimo ogorčice [9]. Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili nov RootPatch za boj proti beli krompirjevi, ''Globodera pallida''. ''Globodera pallida'' izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

== '''2. OPIS PROJEKTA''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila ''in silico''.

'''2.1. IZBIRA GOSTITELJA'''

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodam. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali ''Bacillus mycoides'' M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še ''Bacillus subtilis'' HS3, ''Bacillus megateriu''m DSM319 in ''Bacillus amyloliquefacien''s 205 [4].

'''2.2. IZBIRA NEVROPEPTIDA'''

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

'''2.3. IZBIRA PROMOTORJA'''

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri Bacillus mycoides za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].

'''2.4. IZBIRA SIGNALENEGA PEPTIDA ZA IZLOČANJE'''

Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri ''Bacilllus mycoides''. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (''Bacillus subtilis'') , PhoD Tat (''Bacillus subtilis'') , AmyE (''Bacillus megaterium'') in AmyE (''Bacillus mycoides'') sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

'''2.5. IZBIRA METODE INTEGRACIJE'''

V genom gostiteljske bakterije ''Bacillus mycoides'' bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

'''2.6. IZBIRA METODE APLIKACIJE'''

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

'''2.7. VARNOSTNI MEHANIZEM'''

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega ''Bacillus mycoides'' bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v ''Bacillus subtilis''. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

== '''3. ZAKLJUČEK''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

'''== VIRI =='''

[1] Band L., H. Shimotsu, D. J. Henner. 1984. Nucleotide sequence of the Bacillus subtilis trpE and trpD genes. Gene 27:55-65.

[2] Elbaz M., Ben-Yehuda S. (2015). Following the fate of bacterial cells experiencing sudden chromosome loss. MBio, 6(3), 1–11.

[3] Holberger L. E., Garza-Sánchez F., Lamoureux J., Low D. A., Hayes C. S. A novel family of toxin/antitoxin proteins in Bacillus species (2012). FEBS Letters, 586(2), 132–136.

[4] iGEM 2020, Groningen, RootPatch: https://2020.igem.org/Team:Groningen (dostopno 22. 5. 2021).

[5] Lobo C. B., Juárez Tomás M. S., Viruel, E., Ferrero M. A., Lucca, M. E. Development of low-cost formulations of plant growth-promoting bacteria to be used as inoculants in beneficial agricultural technologies. (2019). Microbiological Research, 219, stran: 12–25.

[6] Koo B.J., Adriano D.C., Bolan N.S., Barton C.D. Root exudates and microorganisms. (2005). Encyclopedia of Soils in the Environment, stran: 421-428. 2005

[7] Martínez-Álvarez J.C., Castro-Martínez C., Sánchez-Peña, P., Gutiérrez-Dorado R., Maldonado-Mendoza I.E. Development of a powder formulation based on Bacillus cereus sensu lato strain B25 spores for biological control of Fusarium verticillioides in maize plants. (2016). World Journal Microbiology Biotechnology, 32, stran:75.

[8] Ochola J., Cortada L., Ng’ang’a M., Hassanali A., Coyne, D., Torto B. Mediation of Potato–Potato Cyst Nematode, G. rostochiensis Interaction by Specific Root Exudate Compounds. (2020). Frontiers in Plant Science, 11(June).

[9] Ogoročice oziroma nematode so tudi rastlinski škodljivi organizmi: https://www.gov.si/novice/2020-04-09-ogorocice-oziroma-nematode-so-tudi-rastlinski-skodljivi-organizmi/ (dostopno 22.5.2021)

[10] Yi Y., Li Z., Song C., Kuipers O. P. Exploring plant-microbe interactions of the rhizobacteria Bacillus subtilis and Bacillus mycoides by use of the CRISPR-Cas9 system. (2018). Environmental Microbiology, 20(12), stran: 4245–4260.

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodom v prsti

2021-05-24T12:02:47Z

Ninalukancic: /* 2. OPIS PROJEKTA */

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

== '''1. UVOD''' ==

Rastlinsko-parazitske nematode so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodam v kmetijstvu pravimo ogorčice [9]. Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili nov RootPatch za boj proti beli krompirjevi, ''Globodera pallida''. ''Globodera pallida'' izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

== '''2. OPIS PROJEKTA''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila ''in silico''.

'''2.1. IZBIRA GOSTITELJA'''

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodam. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali ''Bacillus mycoides'' M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še ''Bacillus subtilis'' HS3, ''Bacillus megateriu''m DSM319 in ''Bacillus amyloliquefacien''s 205 [4].

'''2.2. IZBIRA NEVROPEPTIDA'''

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

'''2.3. IZBIRA PROMOTORJA'''

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri Bacillus mycoides za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].

'''2.4. IZBIRA SIGNALENEGA PEPTIDA ZA IZLOČANJE'''

Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri ''Bacilllus mycoides''. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (''Bacillus subtilis'') , PhoD Tat (''Bacillus subtilis'') , AmyE (''Bacillus megaterium'') in AmyE (''Bacillus mycoides'') sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

'''2.5. IZBIRA METODE INTEGRACIJE'''

V genom gostiteljske bakterije ''Bacillus mycoides'' bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

'''2.6. IZBIRA METODE APLIKACIJE'''

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

'''2.7. VARNOSTNI MEHANIZEM'''

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega ''Bacillus mycoides'' bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v ''Bacillus subtilis''. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

== '''3. ZAKLJUČEK''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodom v prsti

2021-05-24T12:02:07Z

Ninalukancic:

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

== '''1. UVOD''' ==

Rastlinsko-parazitske nematode so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodam v kmetijstvu pravimo ogorčice [9]. Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili nov RootPatch za boj proti beli krompirjevi, ''Globodera pallida''. ''Globodera pallida'' izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

== '''2. OPIS PROJEKTA''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila ''in silico''.

'''1. IZBIRA GOSTITELJA'''

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodam. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali ''Bacillus mycoides'' M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še ''Bacillus subtilis'' HS3, ''Bacillus megateriu''m DSM319 in ''Bacillus amyloliquefacien''s 205 [4].

'''2. IZBIRA NEVROPEPTIDA'''

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

'''3. IZBIRA PROMOTORJA'''

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri Bacillus mycoides za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].

'''4. IZBIRA SIGNALENEGA PEPTIDA ZA IZLOČANJE'''

Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri ''Bacilllus mycoides''. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (''Bacillus subtilis'') , PhoD Tat (''Bacillus subtilis'') , AmyE (''Bacillus megaterium'') in AmyE (''Bacillus mycoides'') sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

'''5. IZBIRA METODE INTEGRACIJE'''

V genom gostiteljske bakterije ''Bacillus mycoides'' bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

'''6. IZBIRA METODE APLIKACIJE'''

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

'''7. VARNOSTNI MEHANIZEM'''

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega ''Bacillus mycoides'' bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v ''Bacillus subtilis''. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

== '''3. ZAKLJUČEK''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodom v prsti

2021-05-24T12:01:29Z

Ninalukancic:

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

== '''UVOD''' ==

Rastlinsko-parazitske nematode so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodam v kmetijstvu pravimo ogorčice [9]. Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili nov RootPatch za boj proti beli krompirjevi, ''Globodera pallida''. ''Globodera pallida'' izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

== '''OPIS PROJEKTA''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila ''in silico''.

'''1. IZBIRA GOSTITELJA'''

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodam. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali ''Bacillus mycoides'' M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še ''Bacillus subtilis'' HS3, ''Bacillus megateriu''m DSM319 in ''Bacillus amyloliquefacien''s 205 [4].

'''2. IZBIRA NEVROPEPTIDA'''

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

'''3. IZBIRA PROMOTORJA'''

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri Bacillus mycoides za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].

'''4. IZBIRA SIGNALENEGA PEPTIDA ZA IZLOČANJE'''

Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri ''Bacilllus mycoides''. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (''Bacillus subtilis'') , PhoD Tat (''Bacillus subtilis'') , AmyE (''Bacillus megaterium'') in AmyE (''Bacillus mycoides'') sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

'''5. IZBIRA METODE INTEGRACIJE'''

V genom gostiteljske bakterije ''Bacillus mycoides'' bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

'''6. IZBIRA METODE APLIKACIJE'''

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

'''7. VARNOSTNI MEHANIZEM'''

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega ''Bacillus mycoides'' bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v ''Bacillus subtilis''. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

== '''ZAKLJUČEK''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodom v prsti

2021-05-24T12:00:17Z

Ninalukancic:

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

== '''UVOD''' ==

Rastlinsko-parazitske nematode so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodam v kmetijstvu pravimo ogorčice [9]. Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili nov RootPatch za boj proti beli krompirjevi, ''Globodera pallida''. ''Globodera pallida'' izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

== '''OPIS PROJEKTA''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila ''in silico''.

1. IZBIRA GOSTITELJA

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodam. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali ''Bacillus mycoides'' M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še ''Bacillus subtilis'' HS3, ''Bacillus megateriu''m DSM319 in ''Bacillus amyloliquefacien''s 205 [4].

2. IZBIRA NEVROPEPTIDA

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

3. IZBIRA PROMOTORJA

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri Bacillus mycoides za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].

4. IZBIRA SIGNALENEGA PEPTIDA ZA IZLOČANJE
Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri ''Bacilllus mycoides''. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (''Bacillus subtilis'') , PhoD Tat (''Bacillus subtilis'') , AmyE (''Bacillus megaterium'') in AmyE (''Bacillus mycoides'') sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

5. IZBIRA METODE INTEGRACIJE

V genom gostiteljske bakterije ''Bacillus mycoides'' bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

6. IZBIRA METODE APLIKACIJE

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

7. VARNOSTNI MEHANIZEM

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega ''Bacillus mycoides'' bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v ''Bacillus subtilis''. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

== '''ZAKLJUČEK''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodom v prsti

2021-05-24T11:56:52Z

Ninalukancic:

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

== '''UVOD''' ==

Rastlinsko-parazitske nematode (ang. PPN) so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodam v kmetijstvu pravimo ogorčice [9]. Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili nov RootPatch za boj proti beli krompirjevi, Globodera pallida. Globodera pallida izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

== '''OPIS PROJEKTA''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila in silico.

1. IZBIRA GOSTITELJA

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodam. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali Bacillus mycoides M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še Bacillus subtilis HS3, Bacillus megaterium DSM319 in Bacillus amyloliquefaciens 205 [4].

2. IZBIRA NEVROPEPTIDA

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

3. IZBIRA PROMOTORJA

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri Bacillus mycoides za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].
4. IZBIRA SIGNALENEGA PEPTIDA ZA IZLOČANJE
Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri Bacilllus mycoides. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (Bacillus subtilis) , PhoD Tat (Bacillus subtilis) , AmyE (Bacillus megaterium) in AmyE (Bacillus mycoides) sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

5. IZBIRA METODE INTEGRACIJE

V genom gostiteljske bakterije Bacillus mycoides bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

6. IZBIRA METODE APLIKACIJE

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

7. VARNOSTNI MEHANIZEM

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega Bacillus mycoides bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v Bacillus subtilis. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

== '''ZAKLJUČEK''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodom v prsti

2021-05-24T11:56:23Z

Ninalukancic:

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

== '''UVOD''' ==

Rastlinsko-parazitske nematode (ang. PPN) so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodam v kmetijstvu pravimo ogorčice [9]. Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili nov RootPatch za boj proti beli krompirjevi, Globodera pallida. Globodera pallida izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

==
'''OPIS PROJEKTA''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila in silico.

1. IZBIRA GOSTITELJA

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodam. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali Bacillus mycoides M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še Bacillus subtilis HS3, Bacillus megaterium DSM319 in Bacillus amyloliquefaciens 205 [4].

2. IZBIRA NEVROPEPTIDA

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

3. IZBIRA PROMOTORJA

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri Bacillus mycoides za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].
4. IZBIRA SIGNALENEGA PEPTIDA ZA IZLOČANJE
Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri Bacilllus mycoides. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (Bacillus subtilis) , PhoD Tat (Bacillus subtilis) , AmyE (Bacillus megaterium) in AmyE (Bacillus mycoides) sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

5. IZBIRA METODE INTEGRACIJE

V genom gostiteljske bakterije Bacillus mycoides bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

6. IZBIRA METODE APLIKACIJE

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

7. VARNOSTNI MEHANIZEM

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega Bacillus mycoides bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v Bacillus subtilis. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

== '''ZAKLJUČEK''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodom v prsti

2021-05-24T11:54:47Z

Ninalukancic:

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

'''UVOD'''

Rastlinsko-parazitske nematode (ang. PPN) so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodam v kmetijstvu pravimo ogorčice [9]. Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili nov RootPatch za boj proti beli krompirjevi, Globodera pallida. Globodera pallida izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

'''OPIS PROJEKTA'''

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila in silico.

1. IZBIRA GOSTITELJA

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodam. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali Bacillus mycoides M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še Bacillus subtilis HS3, Bacillus megaterium DSM319 in Bacillus amyloliquefaciens 205 [4].

2. IZBIRA NEVROPEPTIDA

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

3. IZBIRA PROMOTORJA

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri Bacillus mycoides za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].
4. IZBIRA SIGNALENEGA PEPTIDA ZA IZLOČANJE
Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri Bacilllus mycoides. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (Bacillus subtilis) , PhoD Tat (Bacillus subtilis) , AmyE (Bacillus megaterium) in AmyE (Bacillus mycoides) sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

5. IZBIRA METODE INTEGRACIJE

V genom gostiteljske bakterije Bacillus mycoides bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

6. IZBIRA METODE APLIKACIJE

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

7. VARNOSTNI MEHANIZEM

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega Bacillus mycoides bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v Bacillus subtilis. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

'''ZAKLJUČEK'''

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodom v prsti

2021-05-24T11:54:10Z

Ninalukancic: New page: RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnov...

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

'''UVOD'''

Rastlinsko-parazitske nematode (ang. PPN) so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodam v kmetijstvu pravimo ogorčice [9]. Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili nov RootPatch za boj proti beli krompirjevi, Globodera pallida. Globodera pallida izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

'''OPIS PROJEKTA'''

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila in silico.

1. IZBIRA GOSTITELJA

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodam. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali Bacillus mycoides M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še Bacillus subtilis HS3, Bacillus megaterium DSM319 in Bacillus amyloliquefaciens 205 [4].

2. IZBIRA NEVROPEPTIDA

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

3. IZBIRA PROMOTORJA

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri Bacillus mycoides za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].
4. IZBIRA SIGNALENEGA PEPTIDA ZA IZLOČANJE
Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri Bacilllus mycoides. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (Bacillus subtilis) , PhoD Tat (Bacillus subtilis) , AmyE (Bacillus megaterium) in AmyE (Bacillus mycoides) sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

5. IZBIRA METODE INTEGRACIJE

V genom gostiteljske bakterije Bacillus mycoides bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

6. IZBIRA METODE APLIKACIJE

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

7. VARNOSTNI MEHANIZEM

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega Bacillus mycoides bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v Bacillus subtilis. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

'''ZAKLJUČEK'''
Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

Seminarji SB 2020/21

2021-05-24T11:50:39Z

Ninalukancic:

V študijskem letu 2020/21 študentje 1. letnika predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Proizvodnja_1,3-propandiola_iz_različnih_ogljikovodikov_po_nenaravni_poti_preko_3-hidroksipropanojske_kisline Proizvodnja 1,3-propandiola iz različnih ogljikovodikov po nenaravni poti preko 3-hidroksipropanojske kisline] (Liza Ulčakar) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Doseganje_asimetri%C4%8Dnosti_in_asimetri%C4%8Dne_delitve_pri_E._coli Doseganje asimetričnosti in asimetrične delitve pri E. coli] (Aljaž Bratina) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zmanj%C5%A1ana_procesivnost_ribosomov_v_sistemu_PURE Zmanjšana procesivnost ribosomov v sistemu PURE] (Tina Kolenc Milavec) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Na%C4%8Drtovana_pot_zvijanja_proteinskih_origamijev Načrtovana pot zvijanja proteinskih origamijev] (Anamarija Agnič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/U%C4%8Dinkovita_svetlobno_inducibilna_Dre_rekombinaza_za_%C4%8Dasovno_in_prostorsko_celi%C4%8Dno_specifi%C4%8Dno_urejanje_genoma_v_mi%C5%A1jih_modelih#VIRI Učinkovita svetlobno inducibilna Dre rekombinaza za časovno in prostorsko celično specifično urejanje genoma v mišjih modelih] (Nika Mikulič Vernik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Vzpostavitev_termometra_tRNA_za_dolo%C4%8Danje_temperature_optimalne_rasti_mikroorganizmov Vzpostavitev termometra tRNA za določanje temperature optimalne rasti mikroorganizmov] (Urša Štrancar) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Racionalna_zasnova_minimalnih_sinteti%C4%8Dnih_promotorjev_za_rastline#Construction_of_plasmids Racionalna zasnova minimalnih sintetičnih promotorjev za rastline] (Almina Tahirović) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Reverzibilna_toplotna_regulacija_za_bifunkcionalno_dinamično_uravnavanje_izražanja_genov_v_E._coli Reverzibilna toplotna regulacija za bifunkcionalno dinamično uravnavanje izražanja genov v E. coli] (Urška Fajdiga) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dna_optogenetska_naprava_na_osnovi_BRET_za_pulzirajo%C4%8Do_ekspresijo_transgena%2C_ki_omogo%C4%8Da_glukozno_homeostazo_pri_mi%C5%A1ih Sintetična optogenetska naprava na osnovi BRET za pulzirajočo ekspresijo transgena, ki omogoča glukozno homeostazo pri miših] (Paula Horvat) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hkratna_karakterizacija_več_različnih_racionalno_načrtovanih_promotorskih_arhitektur Vpogled v kombinatorno logiko z IPTG induciranih sistemov] (Urška Zagorc) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Ponovno_določanje_specifičnosti_izven_citoplazme_aktivnih_sigma_faktorjev Ponovno določanje specifičnosti izven citoplazme aktivnih sigma faktorjev] (Eva Keber) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hierarhi%C4%8Dno_sestavljanje_asimetri%C4%8Dnih_ikozaedri%C4%8Dnih_virusnih_kapsid Hierarhično sestavljanje asimetričnih ikozaedričnih virusnih kapsid] (Urška Pečarič Strnad) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Avtomatizirano_oblikovanje_sintezne_mikrobne_zdru%C5%BEbe Avtomatizirano oblikovanje sintezne mikrobne združbe] (Urša Lovše) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Regulacija_stopnje_izra%C5%BEanja_z_L-arabinozo_v_ekspresijskem_sistemu_T7_z_razklopljeno_rastjo Regulacija stopnje izražanja z L-arabinozo v ekspresijskem sistemu T7 z razklopljeno rastjo] (Maruša Mišmaš) 
# [[Oblikovanje sintetičnega faga iz P. aeruginosa z reduciranim genomom|Oblikovanje sintetičnega faga iz ''P. aeruginosa'' z reduciranim genomom]] (Martina Lokar) 
#[[Uravnavanje izražanja genov s pomočjo nanoteles in njihov vpliv na epigenetski spomin]] (Sara Laznik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Priprava_humanih_CAR_imunskih_celic_z_napredno_logiko_in_porazdeljenim_računalništvom Priprava humanih CAR imunskih celic z napredno logiko in porazdeljenim računalništvom] (Tjaša Mlakar) 
# [[Utišanje genov na osnovi majhnih protismernih DNA omogoča manipulacijo in replikacijo genoma bakteriofagov v brezceličnem sistemu]] (Anže Karlek) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Translacijski_nadzor_izražanja_encima_odstranjevalca_preko_s_toksinom_induciranega_miRNA_stikala Translacijski nadzor izražanja encima odstranjevalca preko s toksinom induciranega miRNA stikala] (Ernestina Lavrih) 
# [[Sintetični promotorji za indukcijo imunskih celic v tumorskem mikrookolju]] (Saša Slabe) 

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/RESHAPE_-_spreminjanje_morfologije_nitastih_gliv RESHAPE - spreminjanje morfologije nitastih gliv] (Špela Supej) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/The_Chlamy_Cleaner:_razgradnja_pesticida_z_zeleno_algo The Chlamy Cleaner: razgradnja pesticida z zeleno algo] (Doroteja Armič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/TheraPUFA:_nazalni_probiotik_proti_okužbam_in_vnetjem TheraPUFA- nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem] (Barbara Slapnik) 
# [[S-POP: Modularni biosenzor za zaznavanje obstojnih organskih onesnaževal v okoljskih vodah]] (Tadej Medved) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MARS-magnetni_sistem_za_recikliranje_ATP MARS-magnetni sistem za recikliranje ATP] (David Miškić) 
# [[B.O.T.: Bakterijska oscilacijska terapija za zdravljenje kolorektalnega raka]] (Neža Pavko) 
# [[Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe]] (Mirsad Mešić) 
# [[iGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju]] (Klementina Polanec) 
# [[Antea-Glyphosate: Detekcija in razgradnja glifosata]] (Jernej Imperl) 
# [[NANOFLEX: Standardiziran, prilagodljiv in priročen celični biosenzor]] (Martin Špendl) 
# [[FlavoFlow: ribogojniška zaščita pred okužbami rib]] (Mateja Žvipelj) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/samoreplicirajoč_COVID-19_test Samoreplicirajoč COVID-19-test] (Irma Zeljković) 
# [[Renervate: Polimer za zdravljenje poškodb hrbtenjače]] (Sabina Sladič Oblak) 
# [[PROSTATUS: Diagnostika raka prostate]] (Luka Gnidovec) 
# [[RootPatch: Boj proti škodljivim nematodom v prsti]] (Nina Lukančič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/SINISENS:_kvantifikacija_makrolidnih_antibiotikov_v_okolju SINISENS-kvantifikacija makrolidnih antibiotikov v okolju] (Maja Globočnik) 
# [[PHOCUS: Insekticid proti kobilicam na osnovi bakteriofagov]] (Matija Ruparčič) 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodam v prsti

2021-05-24T11:34:46Z

Ninalukancic:

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

== ''' UVOD''' ==

Rastlinsko-parazitske nematode so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodom v kmetijstvu pravimo ogorčice [9] ). Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili RootPatch za boj proti beli krompirjevi ogorčici, ''Globodera pallida''. ''Globodera pallida'' izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo ''Bacillus mycoides'', katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

== ''' OPIS PROJEKTA''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila ''in silico''.

'''2.1. IZBIRA GOSTITELJSKE BAKTERIJE'''

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodom. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali ''Bacillus mycoides'' M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še ''Bacillus subtilis'' HS3, ''Bacillus megaterium'' DSM319 in ''Bacillus amyloliquefaciens'' 205 [4].

'''2.2. IZBIRA NEVTROPEPTIDA'''

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

'''2.3. IZBIRA PROMOTORJA'''

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz ''Parageobacillus thermoglucosidasius'' [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri ''Bacillus mycoides'' za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].

'''2.4. IZBIRA SIGNALNEGA PEPTIDA'''

Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije ''Lactococcus lacti''s. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri ''Bacilllus mycoides''. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (''Bacillus subtilis'') , PhoD Tat (''Bacillus subtilis'') , AmyE (''Bacillus megaterium'') in AmyE (''Bacillus mycoides'') sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

'''2.5. METODA INTEGRACIJE'''

V genom gostiteljske bakterije ''Bacillus mycoides'' bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

'''2.6. APLIKACIJA RootPatcha'''

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

'''2.7. VARNOSTNI MEHANIZEM'''

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega ''Bacillus mycoides'' bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v ''Bacillus subtilis''. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

== ''' ZAKLJUČEK''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali ''in silico''. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva za boj proti škodljivim nematodam v prsti, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

== ''' VIRI''' ==

[1] Band L., H. Shimotsu, D. J. Henner. 1984. Nucleotide sequence of the Bacillus subtilis trpE and trpD genes. Gene 27, stran: 55-65.

[2] Elbaz M., Ben-Yehuda S. (2015). Following the fate of bacterial cells experiencing sudden chromosome loss. MBio, 6(3), 1–11.

[3] Holberger L. E., Garza-Sánchez F., Lamoureux J., Low D. A., Hayes C. S. A novel family of toxin/antitoxin proteins in Bacillus species (2012). FEBS Letters, 586(2), 132–136.

[4] iGEM 2020, Groningen, RootPatch: https://2020.igem.org/Team:Groningen (dostopno 22. 5. 2021).

[5] Lobo C. B., Juárez Tomás M. S., Viruel, E., Ferrero M. A., Lucca, M. E. Development of low-cost formulations of plant growth-promoting bacteria to be used as inoculants in beneficial agricultural technologies. (2019). Microbiological Research, 219, stran: 12–25.

[6] Koo B.J., Adriano D.C., Bolan N.S., Barton C.D. Root exudates and microorganisms. (2005). Encyclopedia of Soils in the Environment, stran: 421-428.

[7] Martínez-Álvarez J.C., Castro-Martínez C., Sánchez-Peña, P., Gutiérrez-Dorado R., Maldonado-Mendoza I.E. Development of a powder formulation based on Bacillus cereus sensu lato strain B25 spores for biological control of Fusarium verticillioides in maize plants. (2016). World Journal Microbiology Biotechnology, 32, stran:75.

[8] Ochola J., Cortada L., Ng’ang’a M., Hassanali A., Coyne, D., Torto B. Mediation of Potato–Potato Cyst Nematode, G. rostochiensis Interaction by Specific Root Exudate Compounds. (2020). Frontiers in Plant Science.

[9] Ogoročice oziroma nematode so tudi rastlinski škodljivi organizmi: https://www.gov.si/novice/2020-04-09-ogorocice-oziroma-nematode-so-tudi-rastlinski-skodljivi-organizmi/ (dostopno 22.5.2021).

[10] Yi Y., Li Z., Song C., Kuipers O. P. Exploring plant-microbe interactions of the rhizobacteria Bacillus subtilis and Bacillus mycoides by use of the CRISPR-Cas9 system. (2018). Environmental Microbiology, 20(12), stran: 4245–4260.

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodam v prsti

2021-05-24T11:27:54Z

Ninalukancic:

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

== ''' UVOD''' ==

Rastlinsko-parazitske nematode so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodom v kmetijstvu pravimo ogorčice [9] ). Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili RootPatch za boj proti beli krompirjevi ogorčici, Globodera pallida. Globodera pallida izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

== ''' OPIS PROJEKTA''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila in silico.

'''2.1. IZBIRA GOSTITELJSKE BAKTERIJE'''

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodom. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali Bacillus mycoides M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še Bacillus subtilis HS3, Bacillus megaterium DSM319 in Bacillus amyloliquefaciens 205 [4].

'''2.2. IZBIRA NEVTROPEPTIDA'''

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

'''2.3. IZBIRA PROMOTORJA'''

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri Bacillus mycoides za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].

'''2.4. IZBIRA SIGNALNEGA PEPTIDA'''

Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri Bacilllus mycoides. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (Bacillus subtilis) , PhoD Tat (Bacillus subtilis) , AmyE (Bacillus megaterium) in AmyE (Bacillus mycoides) sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

'''2.5. METODA INTEGRACIJE'''

V genom gostiteljske bakterije Bacillus mycoides bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

'''2.6. APLIKACIJA RootPatcha'''

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

'''2.7. VARNOSTNI MEHANIZEM'''

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega Bacillus mycoides bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v Bacillus subtilis. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

== ''' ZAKLJUČEK''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva za boj proti škodljivim nematodam v prsti, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

== ''' VIRI''' ==

[1] Band L., H. Shimotsu, D. J. Henner. 1984. Nucleotide sequence of the Bacillus subtilis trpE and trpD genes. Gene 27, stran: 55-65.

[2] Elbaz M., Ben-Yehuda S. (2015). Following the fate of bacterial cells experiencing sudden chromosome loss. MBio, 6(3), 1–11.

[3] Holberger L. E., Garza-Sánchez F., Lamoureux J., Low D. A., Hayes C. S. A novel family of toxin/antitoxin proteins in Bacillus species (2012). FEBS Letters, 586(2), 132–136.

[4] iGEM 2020, Groningen, RootPatch: https://2020.igem.org/Team:Groningen (dostopno 22. 5. 2021).

[5] Lobo C. B., Juárez Tomás M. S., Viruel, E., Ferrero M. A., Lucca, M. E. Development of low-cost formulations of plant growth-promoting bacteria to be used as inoculants in beneficial agricultural technologies. (2019). Microbiological Research, 219, stran: 12–25.

[6] Koo B.J., Adriano D.C., Bolan N.S., Barton C.D. Root exudates and microorganisms. (2005). Encyclopedia of Soils in the Environment, stran: 421-428.

[7] Martínez-Álvarez J.C., Castro-Martínez C., Sánchez-Peña, P., Gutiérrez-Dorado R., Maldonado-Mendoza I.E. Development of a powder formulation based on Bacillus cereus sensu lato strain B25 spores for biological control of Fusarium verticillioides in maize plants. (2016). World Journal Microbiology Biotechnology, 32, stran:75.

[8] Ochola J., Cortada L., Ng’ang’a M., Hassanali A., Coyne, D., Torto B. Mediation of Potato–Potato Cyst Nematode, G. rostochiensis Interaction by Specific Root Exudate Compounds. (2020). Frontiers in Plant Science.

[9] Ogoročice oziroma nematode so tudi rastlinski škodljivi organizmi: https://www.gov.si/novice/2020-04-09-ogorocice-oziroma-nematode-so-tudi-rastlinski-skodljivi-organizmi/ (dostopno 22.5.2021).

[10] Yi Y., Li Z., Song C., Kuipers O. P. Exploring plant-microbe interactions of the rhizobacteria Bacillus subtilis and Bacillus mycoides by use of the CRISPR-Cas9 system. (2018). Environmental Microbiology, 20(12), stran: 4245–4260.

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodam v prsti

2021-05-24T11:24:49Z

Ninalukancic:

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodom v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

== ''' UVOD''' ==

Rastlinsko-parazitske nematode so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodam v kmetijstvu pravimo ogorčice [9] ). Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili RootPatch za boj proti beli krompirjevi ogorčici, Globodera pallida. Globodera pallida izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

== ''' OPIS PROJEKTA''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila in silico.

'''2.1. IZBIRA GOSTITELJSKE BAKTERIJE'''

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodom. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali Bacillus mycoides M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še Bacillus subtilis HS3, Bacillus megaterium DSM319 in Bacillus amyloliquefaciens 205 [4].

'''2.2. IZBIRA NEVTROPEPTIDA'''

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

'''2.3. IZBIRA PROMOTORJA'''

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri Bacillus mycoides za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].

'''2.4. IZBIRA SIGNALNEGA PEPTIDA'''

Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri Bacilllus mycoides. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (Bacillus subtilis) , PhoD Tat (Bacillus subtilis) , AmyE (Bacillus megaterium) in AmyE (Bacillus mycoides) sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

'''2.5. METODA INTEGRACIJE'''

V genom gostiteljske bakterije Bacillus mycoides bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

'''2.6. APLIKACIJA RootPatcha'''

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

'''2.7. VARNOSTNI MEHANIZEM'''

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega Bacillus mycoides bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v Bacillus subtilis. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

== ''' ZAKLJUČEK''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva za boj proti škodljivim nematodam v prsti, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

== ''' VIRI''' ==

[1] Band L., H. Shimotsu, D. J. Henner. 1984. Nucleotide sequence of the Bacillus subtilis trpE and trpD genes. Gene 27, stran: 55-65.

[2] Elbaz M., Ben-Yehuda S. (2015). Following the fate of bacterial cells experiencing sudden chromosome loss. MBio, 6(3), 1–11.

[3] Holberger L. E., Garza-Sánchez F., Lamoureux J., Low D. A., Hayes C. S. A novel family of toxin/antitoxin proteins in Bacillus species (2012). FEBS Letters, 586(2), 132–136.

[4] iGEM 2020, Groningen, RootPatch: https://2020.igem.org/Team:Groningen (dostopno 22. 5. 2021).

[5] Lobo C. B., Juárez Tomás M. S., Viruel, E., Ferrero M. A., Lucca, M. E. Development of low-cost formulations of plant growth-promoting bacteria to be used as inoculants in beneficial agricultural technologies. (2019). Microbiological Research, 219, stran: 12–25.

[6] Koo B.J., Adriano D.C., Bolan N.S., Barton C.D. Root exudates and microorganisms. (2005). Encyclopedia of Soils in the Environment, stran: 421-428.

[7] Martínez-Álvarez J.C., Castro-Martínez C., Sánchez-Peña, P., Gutiérrez-Dorado R., Maldonado-Mendoza I.E. Development of a powder formulation based on Bacillus cereus sensu lato strain B25 spores for biological control of Fusarium verticillioides in maize plants. (2016). World Journal Microbiology Biotechnology, 32, stran:75.

[8] Ochola J., Cortada L., Ng’ang’a M., Hassanali A., Coyne, D., Torto B. Mediation of Potato–Potato Cyst Nematode, G. rostochiensis Interaction by Specific Root Exudate Compounds. (2020). Frontiers in Plant Science.

[9] Ogoročice oziroma nematode so tudi rastlinski škodljivi organizmi: https://www.gov.si/novice/2020-04-09-ogorocice-oziroma-nematode-so-tudi-rastlinski-skodljivi-organizmi/ (dostopno 22.5.2021).

[10] Yi Y., Li Z., Song C., Kuipers O. P. Exploring plant-microbe interactions of the rhizobacteria Bacillus subtilis and Bacillus mycoides by use of the CRISPR-Cas9 system. (2018). Environmental Microbiology, 20(12), stran: 4245–4260.

RootPatch: Boj proti škodljivim nematodam v prsti

2021-05-24T07:43:53Z

Ninalukancic: /* ZAKLJUČEK */

RootPatch je študentski projekt v okviru tekmovanja iGEM 2020, ki so ga osnovali študentje nevroznanosti in molekularne biologije iz Univerze v Groningenu na Nizozemskem. Ekipa je zasnovala Rootpach za boj proti škodljivim nematodam v prsti.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Groningen

Avtorica povzetka: Nina Lukančič

== ''' UVOD''' ==

Rastlinsko-parazitske nematode so majhni parazitski večcelični organizmi, ki živijo v talnem okolju rastlin. Hranijo se s koreninskim sistemom rastline in ji tako odvzemajo hranila, ki jih le-ta potrebuje za rast in razvoj. Na svetovni ravni je ekonomska škoda, ki jo povzročajo nematode v kmetijstvu ocenjena na 80 do 118 milijard USD letno. Trenutne metode za boj proti njim so bodisi nezadostne bodisi škodljive za biotsko raznovrstnost v tleh. Zato so nujno potrebni novi in trajnostni načini zaščite posevkov krompirja pred krompirjevimi ogorčicam [4] (škodljivim nematodam v kmetijstvu pravimo ogorčice [9] ). Študentje nevroznanosti in molekularne biologije v Groningenu so razvili RootPatch za boj proti beli krompirjevi ogorčici, Globodera pallida. Globodera pallida izvira iz Andov in se je sčasoma razširila v 55 držav po vsem svetu, najverjetneje zaradi distribucije kontaminiranega semenskega krompirja. Uvrščamo jo med cistotvorne ogorčice in je nevarni zajedalec razhudnikov. RootPatch se uporablja v obliki praška in vsebuje gensko spremenjeno bakterijo Bacillus mycoides, katera izločala nevropeptidom podobne proteine (ang.: neuropeptide-like proteins, NLP). Nevropeptidni receptorji so večinoma receptorji, povezani z G-proteini. Dokazano je, da nevropeptidi vplivajo na privlačnost nematod do eksudatov rastlinskih korenin, ter jim tako preprečijo, da bi našle svojega gostitelja. Številni NLP-ji kažejo, da bi lahko bili učinkoviti za določene parazitske nematode, medtem ko na ne-parazitske nematode v tleh ne vplivajo. RootPatch ni namenjen le ustvarjanju rešitve proti rumeni krompirjevi ogorčici, temveč rešitvi, ki bi jo lahko uporabili za različne vrste ogorčic [4].

== ''' OPIS PROJEKTA''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 skupina ni uspela svojega dela opraviti v laboratoriju, ampak je zasnovo projekta Rootpatch naredila in silico.

'''2.1. IZBIRA GOSTITELJSKE BAKTERIJE'''

Glavna ideja projekta RootPatch je izbrati bakterijo v katero bo enostavno vnesti zapis za nevropeptidom podobne proteine, katere bo nato učinkovito izražala in izločala v velikih količinah. Tako bo ustvarila željeno okolje okoli korenin krompirja oziroma katere koli druge rastline ter bo s tem učinkovito odganjala škodljive nematode v prsti. Ključnega pomena je preživetje gostiteljske bakterije, saj če le-ta v težkih razmerah v tleh ne more preživeti, potem tudi visoka proizvodnja NLP-jev ne bo zadostovala v boju proti škodljivim nematodam. Da bi imel RootPatch večje možnosti za uspeh so za gostiteljsko bakterijo izbrali Bacillus mycoides M2E15 z naslednjimi značilnostim: bakterija je naravni izolat iz rizosfere krompirja, sposobna se je razmnoževati tako pri visoki kot tudi nizki vlažnosti, sposobna je sporulacije in tvoriti plast biofilma na koreninah. Ker laboratorijskih in terenskih testov niso izvedli ne morejo trditi, da bo ta bakterija bila res učinkovita. V primeru, da se ne bo izkazala kot primerni gostitelj bodo preizkusili še Bacillus subtilis HS3, Bacillus megaterium DSM319 in Bacillus amyloliquefaciens 205 [4].

'''2.2. IZBIRA NEVTROPEPTIDA'''

NLP-je v RootPatchu bo v tla izločila gostiteljska bakterija, ki sem jo opisala v podpoglavju izbira gostitelja. Z izločanjem NLS v okolje bomo vplivali na obnašanje parazitskih nematod [4]. NLS vplivajo na njihovo kemoatrakcijo do eksudata korenin. Koreninski eksudati so mešanice organskih spojin v rizosferi, ki jih izločajo koreninski sistemi rastlin in imajo sposobnost privabljanja različnih bakterijskih združb. V normalnih razmerah eksudati privlačijo nematode [6]. Kadar koli pa bi bile ogorčice v neposredni bližini korenin krompirja, kateri bo predhodno inokuliran z Roothpatckom, bodo ogorčice sprejele NLP, kar bo spremenilo njihovo notranje nevropeptidno ravnovesje. Posledično se bodo parazitske nematode izogibale koreninskim eksudatom krompirja. Ogorčice so zelo učinkovite pri sprejemanju NLP s svojimi amfidami, senzoričnimi organi. Amfide se nahajajo na glavi nematode in so sestavljene iz pore in kanala, ki vodi do vrečke, v kateri so senzorični nevroni. NLS se bodo vezali na receptorje, povezane z G proteini. Njihov glavni kandidat za NLS je NLP14a ( BBa_K3507001). NLP14a je peptid s 13 aminokislinskimi ostanki in se je v dosedanjih študijah izkazal največje potencialne učinke izogibanja nematod koreninskemu eksudatu. Če ta NLP ne bi povzroči želenega učinka na ogorčicah ali bi vplival na ne-parazitske nematode, bi preverili še ostala dva kandidata: NLP21e in NLP15c [4].

'''2.3. IZBIRA PROMOTORJA'''

Gen za NPL bodo izrazili pod promotorjem Ppta (BBa_K3507004) iz Parageobacillus thermoglucosidasius [4]. Ppta je močan konstitutiven in stabilen promotor, ki je že bil uporabljen pri Bacillus mycoides za proizvodnjo zelenega fluorescentnega proteina [10]. Če se promotor ne bo izkazal za ustreznega bodo preverili promotor P43, Psigx, PgroES ali PdltA [4].

'''2.4. IZBIRA SIGNALNEGA PEPTIDA'''

Po zagotovitvi močne ekspresije NLP je potrebno potrditi, da se bodo izločali v gojišče. Glavna strategija je uporaba oznake za izločanje, za katero je znano, da spodbuja učinkovito izločanje protinov pri različnih gram pozitivnih gostiteljih. Primarno so se odločili za signalni peptid usp45, ki je glavni izločeni peptid mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis. Kljub temu, da je bil opisan kot univerzalni signalni peptid, nimajo eksperimentalnih podatkov o njegovi učinkovitosti pri Bacilllus mycoides. Zato so si za signalne peptide v primeru, da usp45 signalni peptid ne bi bil učinkovit za izločanje NPS, izbrali še PhrH (Bacillus subtilis) , PhoD Tat (Bacillus subtilis) , AmyE (Bacillus megaterium) in AmyE (Bacillus mycoides) sekretorne signale, ki se prav tako zdijo obetavni za izločanje NLP [4].

'''2.5. METODA INTEGRACIJE'''

V genom gostiteljske bakterije Bacillus mycoides bodo s pomočjo tehnologije CRISPR/Cas9 vnesli gen za sintezo NLP, ki so ga Yi in sodelavci opisali leta 2018. Uporabili bodo vektor pYCR, ki omogoča izvedbo enostopenjse integracije, saj vsebuje tako gen Cas9 kot potreben fragment za popravilo DNA. Metoda ima učinkovitost transformacije 77 % [10]. Za mesto integracije so določili gen za α-amilazo. Za detekcijo pa so na C-konec zaporedja NLP dodali heksa histidinsko oznako [4].

'''2.6. APLIKACIJA RootPatcha'''

Prva izbira bi bila ustvariti RootPatch kot inokulat v prahu. Vse predlagane gostiteljske vrste Bacillus lahko tvorijo spore, zato bo rok uporabe več kot 1 leto [7]. Kmetje pogosto uporabljajo granulirana gnojila, tako da dodatne opreme za aplikacijo ne bi potrebovali. Kot alternativo trdni granulirani formulaciji predlagajo uporabo tekoče formulacije. Tekoče inokulacije je lažje izdelati in pogosto z nižjimi stroški kot trdne inokulante [5]. Če bi poskusi pokazali, da je v določenem trenutku sezone potrebna ponovna uporaba RootPatch, bi bila mogoča le tekoča formulacija. RootPatchu bodo dodali smukec, saj omogoča dolgotrajno shranjevanje. Prav tako mu bodo dodali tudi karboksimetil celulozo, kalcijev karbonat in glukozo [4].

'''2.7. VARNOSTNI MEHANIZEM'''

Varnost RootPatcha je vprašljiva, saj vsebuje gensko spremenjene bakterije. Kaj bi se zgodilo, če bi se te bakterije razširile in morda vplivale na druge organizme zunaj polj krompirja? Da bi to preprečili, želijo razviti molekularne mehanizme, zaradi katerih bodo bakterije odvisne od okolja korenin krompirja. Kadarkoli bi bakterija zapusti koreninsko okolje krompirja, ne bi preživela. Za dosego tega cilja razmišljajo o uporabi ene od dveh možnih metod oziroma morda celo kombinacijo obeh pristopov. Prvo je, da gostiteljsko bakterijo naredijo avksotrofno za triptofan [4]. Triptofan je ena od najbolj razširjenih organskih molekul v eksudatu korenin krompirja [8]. Da bi ustvarili avksotrof triptofana, so načrtovali utišanje gena trpE, prvega strukturnega gena trp operona, ki je odgovoren za sintezo triptofana [1]. Z načrtovanjem triptofan avksotrofnega Bacillus mycoides bi mutanta še vedno pritegnili k krompirjevim koreninam, hkrati pa bi znatno omejili njegovo širjenje v okolje, saj bi v okolju, kjer ne bi bilo zadostne količine triptofana umrl. Druga predlagana metoda za preprečevanje širjenja v okolje je, da bi bile bakterije odvisne od solanina, ki se prav tako v velikih količinah nahaja v koreninskem eksudatu krompirja. Zato so oblikovali samomorilsko stikalo. Le-to je osnovano na toksin-antitoksin paru YpcG (BBa_K3507002) / YcpF (BBa_K3507003), ki so ga leta 2012 opisali Holberger in sodelavci v Bacillus subtilis. Toksin, YpcG, kaže aktivnost DNaze in se bo stalno izražal v gostiteljski bakteriji [2]. Antitoksin YpcF inaktivira toksin YpcG. Cilj je postaviti gen za antitoksin pod nadzorovano ekspresijo promotorja, ki se odziva na prisotnost solanina [3]. S to strategijo bo gostiteljska bakterija Bacillus mycoides auksotrofna tako za triptofan kot tudi za solanin. S tem bi zmanjšali možnost nenadzorovanega širjenja v okolje [4].

== ''' ZAKLJUČEK''' ==

Zaradi pandemije COVID-19 študentje niso mogli dostopati do laboratorija, zato so projekt RootPatch preučevali in silico. Čeprav RootPatch deluje prepričljivo in se metoda zdi izvedljiva za boj proti škodljivim nematodam v prsti, pa bo treba v laboratoriju najprej pripraviti konstrukte, nato pa za potrditev učinkovitosti izvesti poskuse v rastlinjaku, kjer bi gojili inokuliran krompir z RootPatchom in preizkušali njegovo učinkovitost proti infiltraciji ogorčic. V primeru, da bo aplikacija učinkovita, pa bodo potrebni nadaljnji postopki odobritve za distribucijo, saj izdelek vsebuje gensko spremenjen bakterije, kjer je regulativa za uporabo v širši populaciji stroga. V primeru, da trg ne bi sprejel gensko spremenjene mikrobiološke rešitve bi morali poiskati neko alternativno rešitev brez uporabe gensko spremenjenih bakterij, kot je proizvodnja NLP in vitro in njihova nadaljnja uporaba s tekočo raztopino na terenu, ali enkapsulacija NLP.

== ''' VIRI''' ==

[1] Band L., H. Shimotsu, D. J. Henner. 1984. Nucleotide sequence of the Bacillus subtilis trpE and trpD genes. Gene 27, stran: 55-65.

[2] Elbaz M., Ben-Yehuda S. (2015). Following the fate of bacterial cells experiencing sudden chromosome loss. MBio, 6(3), 1–11.

[3] Holberger L. E., Garza-Sánchez F., Lamoureux J., Low D. A., Hayes C. S. A novel family of toxin/antitoxin proteins in Bacillus species (2012). FEBS Letters, 586(2), 132–136.

[4] iGEM 2020, Groningen, RootPatch: https://2020.igem.org/Team:Groningen (dostopno 22. 5. 2021).

[5] Lobo C. B., Juárez Tomás M. S., Viruel, E., Ferrero M. A., Lucca, M. E. Development of low-cost formulations of plant growth-promoting bacteria to be used as inoculants in beneficial agricultural technologies. (2019). Microbiological Research, 219, stran: 12–25.

[6] Koo B.J., Adriano D.C., Bolan N.S., Barton C.D. Root exudates and microorganisms. (2005). Encyclopedia of Soils in the Environment, stran: 421-428.

[7] Martínez-Álvarez J.C., Castro-Martínez C., Sánchez-Peña, P., Gutiérrez-Dorado R., Maldonado-Mendoza I.E. Development of a powder formulation based on Bacillus cereus sensu lato strain B25 spores for biological control of Fusarium verticillioides in maize plants. (2016). World Journal Microbiology Biotechnology, 32, stran:75.

[8] Ochola J., Cortada L., Ng’ang’a M., Hassanali A., Coyne, D., Torto B. Mediation of Potato–Potato Cyst Nematode, G. rostochiensis Interaction by Specific Root Exudate Compounds. (2020). Frontiers in Plant Science.

[9] Ogoročice oziroma nematode so tudi rastlinski škodljivi organizmi: https://www.gov.si/novice/2020-04-09-ogorocice-oziroma-nematode-so-tudi-rastlinski-skodljivi-organizmi/ (dostopno 22.5.2021).

[10] Yi Y., Li Z., Song C., Kuipers O. P. Exploring plant-microbe interactions of the rhizobacteria Bacillus subtilis and Bacillus mycoides by use of the CRISPR-Cas9 system. (2018). Environmental Microbiology, 20(12), stran: 4245–4260.