Wiki FKKT - User contributions [en]

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T21:25:13Z

Nograsek147: /* IDEJA */

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3. - 10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji.

Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:NU_Kazakhstan

Avtor povzetka: Jošt Hren

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje [1].

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''P. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE'' [1,2].

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:

1. Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.

2. Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.

3. Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.

4. Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.

5. Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida'' [1]

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:

- ''P. aeruginosa'' divji tip

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''

P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.

Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse [1].

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost ''P. putide''. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej [1].

Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo [1].

Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor [1].

Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide [1].

Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop [1].

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Od NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi [1].

Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur [1,3].

Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s [1].

Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva [1].

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev [1].

Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine [1].

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo [1].

Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja [1].

Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

E24 = (He/Ht) * 100

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %

He je višina emulzije

Ht je celotna višina epruvete [1]

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

== VIRI ==

[1] Team NU_Kazakhstan, iGEM 2021, Remi, du et!; dostopno na: https://2021.igem.org/Team:NU_Kazakhstan (pridobljeno dne 19.05.2022)

[2] Alberts, B. (2015) Molecular Biology of the Cell. 6th Edition, Garland Science, Taylor and Francis Group, New York.

[3] Khani, M.-H., & Bagheri, M. (2020). Skimmed milk as an alternative for IPTG in induction of recombinant protein expression. Protein Expression and Purification, 170, 105593. https://doi.org/10.1016/j.pep.2020.105593

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T21:24:48Z

Nograsek147:

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3. - 10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji.

Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:NU_Kazakhstan

Avtor povzetka: Jošt Hren

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje [1].

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''P. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.
[1,2].
== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:

1. Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.

2. Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.

3. Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.

4. Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.

5. Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida'' [1]

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:

- ''P. aeruginosa'' divji tip

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''

P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.

Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse [1].

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost ''P. putide''. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej [1].

Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo [1].

Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor [1].

Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide [1].

Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop [1].

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Od NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi [1].

Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur [1,3].

Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s [1].

Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva [1].

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev [1].

Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine [1].

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo [1].

Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja [1].

Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

E24 = (He/Ht) * 100

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %

He je višina emulzije

Ht je celotna višina epruvete [1]

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

== VIRI ==

[1] Team NU_Kazakhstan, iGEM 2021, Remi, du et!; dostopno na: https://2021.igem.org/Team:NU_Kazakhstan (pridobljeno dne 19.05.2022)

[2] Alberts, B. (2015) Molecular Biology of the Cell. 6th Edition, Garland Science, Taylor and Francis Group, New York.

[3] Khani, M.-H., & Bagheri, M. (2020). Skimmed milk as an alternative for IPTG in induction of recombinant protein expression. Protein Expression and Purification, 170, 105593. https://doi.org/10.1016/j.pep.2020.105593

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T21:22:52Z

Nograsek147: /* Bioremidacija */

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3. - 10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.

Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:NU_Kazakhstan

Avtor povzetka: Jošt Hren

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje [1].

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ''P. putido'' so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ''P. aeruginosa'', saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov [1,2].

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:

1. Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.

2. Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.

3. Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.

4. Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.

5. Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida'' [1]

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:

- ''P. aeruginosa'' divji tip

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''

P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.

Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse [1].

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost ''P. putide''. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej [1].

Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo [1].

Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor [1].

Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide [1].

Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop [1].

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Od NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi [1].

Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur [1,3].

Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s [1].

Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva [1].

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev [1].

Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine [1].

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo [1].

Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja [1].

Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

E24 = (He/Ht) * 100

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %

He je višina emulzije

Ht je celotna višina epruvete [1]

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

== VIRI ==

[1] Team NU_Kazakhstan, iGEM 2021, Remi, du et!; dostopno na: https://2021.igem.org/Team:NU_Kazakhstan (pridobljeno dne 19.05.2022)

[2] Alberts, B. (2015) Molecular Biology of the Cell. 6th Edition, Garland Science, Taylor and Francis Group, New York.

[3] Khani, M.-H., & Bagheri, M. (2020). Skimmed milk as an alternative for IPTG in induction of recombinant protein expression. Protein Expression and Purification, 170, 105593. https://doi.org/10.1016/j.pep.2020.105593

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T21:21:52Z

Nograsek147: /* VIRI */

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3. - 10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.

Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:NU_Kazakhstan

Avtor povzetka: Jošt Hren

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje [1].

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ''P. putido'' so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ''P. aeruginosa'', saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov [1,2].

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:

1. Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.

2. Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.

3. Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.

4. Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.

5. Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida'' [1]

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:

- ''P. aeruginosa'' divji tip

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''

P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.

Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse [1].

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost ''P. putide''. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej [1].

Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo [1].

Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor [1].

Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide [1].

Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop [1].

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Od NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi [1].

Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur [1,3].

Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s [1].

Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva [1].

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev [1].

Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine [1].

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo [1].

Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja [1].

Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

E24 = (He/Ht) * 100

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %

He je višina emulzije

Ht je celotna višina epruvete [1]

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

== VIRI ==

[1] Team NU_Kazakhstan, iGEM 2021, Remi, du et!; dostopno na: https://2021.igem.org/Team:NU_Kazakhstan (pridobljeno dne 19.05.2022)

[2] Alberts, B. (2015) Molecular Biology of the Cell. 6th Edition, Garland Science, Taylor and Francis Group, New York.

[3] Khani, M.-H., & Bagheri, M. (2020). Skimmed milk as an alternative for IPTG in induction of recombinant protein expression. Protein Expression and Purification, 170, 105593. https://doi.org/10.1016/j.pep.2020.105593

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T21:21:38Z

Nograsek147:

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3. - 10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.

Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:NU_Kazakhstan

Avtor povzetka: Jošt Hren

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje [1].

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ''P. putido'' so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ''P. aeruginosa'', saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov [1,2].

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:

1. Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.

2. Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.

3. Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.

4. Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.

5. Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida'' [1]

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:

- ''P. aeruginosa'' divji tip

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''

P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.

Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse [1].

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost ''P. putide''. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej [1].

Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo [1].

Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor [1].

Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide [1].

Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop [1].

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Od NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi [1].

Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur [1,3].

Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s [1].

Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva [1].

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev [1].

Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine [1].

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo [1].

Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja [1].

Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

E24 = (He/Ht) * 100

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %

He je višina emulzije

Ht je celotna višina epruvete [1]

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

== VIRI ==

[1] Team NU_Kazakhstan, iGEM 2021, Remi, du et!; dostopno na: https://2021.igem.org/Team:NU_Kazakhstan (pridobljeno dne 19.05.2022)
[2] Alberts, B. (2015) Molecular Biology of the Cell. 6th Edition, Garland Science, Taylor and Francis Group, New York.
[3] Khani, M.-H., & Bagheri, M. (2020). Skimmed milk as an alternative for IPTG in induction of recombinant protein expression. Protein Expression and Purification, 170, 105593. https://doi.org/10.1016/j.pep.2020.105593

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T21:13:05Z

Nograsek147:

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3. - 10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.

Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:NU_Kazakhstan

Avtor povzetka: Jošt Hren

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ''P. putido'' so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ''P. aeruginosa'', saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:

1. Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.

2. Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.

3. Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.

4. Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.

5. Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida''.

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:

- ''P. aeruginosa'' divji tip

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''

P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.

Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost ''P. putide''. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.

Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.

Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.

Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.

Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.

Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.

Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.

Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.

Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.

Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.

Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

E24 = (He/Ht) * 100

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %

He je višina emulzije

Ht je celotna višina epruvete

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T21:12:43Z

Nograsek147:

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3. - 10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.

Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:NU_Kazakhstan

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ''P. putido'' so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ''P. aeruginosa'', saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:

1. Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.

2. Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.

3. Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.

4. Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.

5. Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida''.

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:

- ''P. aeruginosa'' divji tip

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''

P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.

Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost ''P. putide''. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.

Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.

Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.

Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.

Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.

Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.

Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.

Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.

Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.

Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.

Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

E24 = (He/Ht) * 100

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %

He je višina emulzije

Ht je celotna višina epruvete

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T21:12:32Z

Nograsek147:

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3. - 10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.

Spletna stran projekta: https://2021.igem.org/Team:NU_Kazakhstan

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ''P. putido'' so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ''P. aeruginosa'', saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:

1. Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.

2. Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.

3. Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.

4. Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.

5. Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida''.

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:

- ''P. aeruginosa'' divji tip

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''

P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.

Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost ''P. putide''. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.

Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.

Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.

Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.

Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.

Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.

Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.

Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.

Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.

Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.

Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

E24 = (He/Ht) * 100

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %

He je višina emulzije

Ht je celotna višina epruvete

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T21:07:11Z

Nograsek147:

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3. - 10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ''P. putido'' so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ''P. aeruginosa'', saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:

1. Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.

2. Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.

3. Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.

4. Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.

5. Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida''.

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:

- ''P. aeruginosa'' divji tip

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''

P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.

Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost ''P. putide''. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.

Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.

Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.

Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.

Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.

Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.

Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.

Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.

Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.

Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.

Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

E24 = (He/Ht) * 100

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %

He je višina emulzije

Ht je celotna višina epruvete

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T21:06:49Z

Nograsek147: /* Bioremidacija */

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3.-10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ''P. putido'' so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ''P. aeruginosa'', saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:

1. Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.

2. Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.

3. Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.

4. Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.

5. Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida''.

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:

- ''P. aeruginosa'' divji tip

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''

P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.

Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost ''P. putide''. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.

Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.

Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.

Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.

Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.

Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.

Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.

Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.

Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.

Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.

Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

E24 = (He/Ht) * 100

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %

He je višina emulzije

Ht je celotna višina epruvete

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T21:06:37Z

Nograsek147: /* Izolacija in analiza biosurfaktantov */

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3.-10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ''P. putido'' so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ''P. aeruginosa'', saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:

1. Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.

2. Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.

3. Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.

4. Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.

5. Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida''.

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:

- ''P. aeruginosa'' divji tip

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''

P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.

Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost ''P. putide''. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.

Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.

Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.

Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.

Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.

Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.

Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.

Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.

Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.
Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.
Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

E24 = (He/Ht) * 100

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %

He je višina emulzije

Ht je celotna višina epruvete

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T21:06:27Z

Nograsek147: /* Elektrofermentacija */

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3.-10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ''P. putido'' so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ''P. aeruginosa'', saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:

1. Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.

2. Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.

3. Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.

4. Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.

5. Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida''.

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:

- ''P. aeruginosa'' divji tip

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''

P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.

Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost ''P. putide''. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.

Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.

Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.

Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.

Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.

Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.

Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.

Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.
Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.
Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.
Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

E24 = (He/Ht) * 100

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %

He je višina emulzije

Ht je celotna višina epruvete

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T21:05:52Z

Nograsek147: /* NAČRT IN EKSPERIMENTI */

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3.-10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ''P. putido'' so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ''P. aeruginosa'', saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:

1. Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.

2. Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.

3. Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.

4. Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.

5. Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida''.

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:

- ''P. aeruginosa'' divji tip

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''

P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.

Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost ''P. putide''. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.

Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.

Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.

Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.

Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.
Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.
Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.
Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.
Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.
Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.
Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

E24 = (He/Ht) * 100

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %

He je višina emulzije

Ht je celotna višina epruvete

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T21:05:32Z

Nograsek147: /* NAČRT IN EKSPERIMENTI */

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3.-10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ''P. putido'' so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ''P. aeruginosa'', saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:
1. Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.
2. Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.
3. Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.
4. Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.
5. Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida''.

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:

- ''P. aeruginosa'' divji tip

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''

P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.

Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost ''P. putide''. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.

Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.

Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.

Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.

Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.
Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.
Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.
Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.
Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.
Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.
Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

E24 = (He/Ht) * 100

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %

He je višina emulzije

Ht je celotna višina epruvete

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T21:04:54Z

Nograsek147: /* Načrtovanje modelov */

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3.-10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ''P. putido'' so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ''P. aeruginosa'', saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:
Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.
Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.
Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.
Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.
Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida''.

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:

- ''P. aeruginosa'' divji tip

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''

P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.

Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost ''P. putide''. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.

Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.

Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.

Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.

Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.
Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.
Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.
Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.
Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.
Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.
Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

E24 = (He/Ht) * 100

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %

He je višina emulzije

Ht je celotna višina epruvete

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T21:04:45Z

Nograsek147: /* Načrtovanje modelov */

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3.-10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ''P. putido'' so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ''P. aeruginosa'', saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:
Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.
Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.
Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.
Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.
Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida''.

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:

- ''P. aeruginosa'' divji tip

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''

- ''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''

P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.

Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost ''P. putide''. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.

Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.

Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.

Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.

Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.
Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.
Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.
Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.
Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.
Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.
Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

E24 = (He/Ht) * 100

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %

He je višina emulzije

Ht je celotna višina epruvete

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T21:04:09Z

Nograsek147: /* Načrtovanje modelov */

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3.-10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ''P. putido'' so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ''P. aeruginosa'', saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:
Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.
Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.
Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.
Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.
Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida''.

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:

''P. aeruginosa'' divji tip

''P. aeruginosa'' pRGPDuo2

''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''

''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''

''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''

P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.

Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost ''P. putide''. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.

Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.

Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.

Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.

Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.
Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.
Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.
Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.
Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.
Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.
Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

E24 = (He/Ht) * 100

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %

He je višina emulzije

Ht je celotna višina epruvete

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T21:03:31Z

Nograsek147: /* Izolacija genov */

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3.-10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ''P. putido'' so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ''P. aeruginosa'', saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:
Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.
Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.
Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.
Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.
Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida''.

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:
''P. aeruginosa'' divji tip
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''
P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.
Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost ''P. putide''. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.

Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.

Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.

Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.

Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.
Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.
Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.
Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.
Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.
Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.
Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

E24 = (He/Ht) * 100

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %

He je višina emulzije

Ht je celotna višina epruvete

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T21:02:19Z

Nograsek147: /* Izolacija genov */

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3.-10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ''P. putido'' so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ''P. aeruginosa'', saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:
Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.
Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.
Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.
Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.
Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida''.

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:
''P. aeruginosa'' divji tip
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''
P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.
Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE, ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost ''P. putide''. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.

Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.

Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.

Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.

Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.
Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.
Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.
Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.
Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.
Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.
Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

E24 = (He/Ht) * 100

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %

He je višina emulzije

Ht je celotna višina epruvete

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T21:00:55Z

Nograsek147:

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3.-10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ''P. putido'' so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ''P. aeruginosa'', saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:
Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.
Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.
Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.
Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.
Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida''.

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:
''P. aeruginosa'' divji tip
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''
P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.
Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE, ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost P. putide. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.
Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.
Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.
Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.
Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.
Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.
Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.
Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.
Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.
Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.
Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

E24 = (He/Ht) * 100

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %

He je višina emulzije

Ht je celotna višina epruvete

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T21:00:14Z

Nograsek147:

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3.-10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ''P. putido'' so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ''P. aeruginosa'', saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:
Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.
Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.
Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.
Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.
Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida''.

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:
''P. aeruginosa'' divji tip
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''
P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.
Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE, ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost P. putide. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.
Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.
Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.
Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.
Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.
Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.
Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.
Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.
Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.
Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.
Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

E24=He/Ht *100

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %

He je višina emulzije

Ht je celotna višina

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T20:59:24Z

Nograsek147:

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3.-10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ''P. putido'' so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ''P. aeruginosa'', saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:
Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.
Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.
Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.
Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.
Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida''.

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:
''P. aeruginosa'' divji tip
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''
P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.
Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE, ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost P. putide. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.
Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.
Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.
Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.
Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.
Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.
Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.
Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.
Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.
Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.
Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

<math>E24=He/Ht *100</math>

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %

He je višina emulzije

Ht je celotna višina

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T20:58:33Z

Nograsek147:

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3.-10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ''P. putido'' so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ''P. aeruginosa'', saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:
Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.
Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.
Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.
Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.
Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida''.

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:
''P. aeruginosa'' divji tip
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''
P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.
Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE, ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost P. putide. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.
Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.
Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.
Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.
Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.
Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.
Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.
Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.
Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.
Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.
Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

<math>E_24=H_e/H_t *100</math>

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %

He je višina emulzije

Ht je celotna višina

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T20:58:05Z

Nograsek147:

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3.-10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ''P. putido'' so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ''P. aeruginosa'', saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:
Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.
Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.
Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.
Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.
Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida''.

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:
''P. aeruginosa'' divji tip
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''
P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.
Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE, ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost P. putide. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.
Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.
Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.
Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.
Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.
Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.
Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.
Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.
Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.
Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.
Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:

E_24=H_e/H_t *100

E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %
He je višina emulzije
Ht je celotna višina

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T20:57:26Z

Nograsek147:

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3.-10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela ''. aeruginosa'', ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ''nadE''.

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ''Pseudomonas putida''. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ''rhlA'' in ''rhlB'', ter genom za NAD sintetazo, ''nadE'', kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ''P. putida''. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ''P. putido'' so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ''P. aeruginosa'', saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:
Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (''nadE'') in ramnolipidna gena (''rhiA'' in ''rhiB'') znotraj elektrogene ''P. aeruginosa''.
Izolacija in čiščenje ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' s PCR in gelsko izolacijo.
Kloniranje in zvišana ekspresija ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' genov v ''P. aeruginosa''.
Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ''P. aeruginosa''.
Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva ''P. aeruginosa'', kot model za ''P. putida''.

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'' v ''P. aeruginosa'' na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:
''P. aeruginosa'' divji tip
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''nadE''
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlA''
''P. aeruginosa'' pRGPDuo2 + ''rhlB''
P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni ''nadE'', ''rhlA'' in ''rhlB'', ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija ''nadE'' povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.
Za pridobitev ''P. aeruginosa'' z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija ''nadE'' in ''rhlA/B'' genov iz ''Pseudomonas aeruginosa'' PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK ''P. aeruginosa'' in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (''nadE, ''rhlA'' in ''rhlB''). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena ''rhlA'' in ''rhlB'' skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli ''nadE'', na MSC2 mestu pa ''rhlA/B'' ter tako povečali produkcijsko sposobnost P. putide. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.
Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.
Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.
Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (''tetR'', ''KanR'') v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.
Potem je sledila še elektroporacija ''Pseudomonas aeruginosa''. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom ''P. aeruginosa''. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.
Divji tip in inženirske seve ''P. aeruginosa'' so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.
Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.
Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.

=== Izolacija in analiza biosurfaktantov ===

Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.
Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.
Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov ''P. aeruginosa'', ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.
Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:
E_24=H_e/H_t *100
E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %
He je višina emulzije
Ht je celotna višina

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T20:50:13Z

Nograsek147:

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3.-10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne ""Pseudomonas putida"" z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela P. aeruginosa, ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo ""nadE"".

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo ""Pseudomonas putida"". To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, ""rhlA"" in ""rhlB"", ter genom za NAD sintetazo, ""nadE"", kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij ""P. putida"". Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z ""P. putido"" so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni ""P. aeruginosa"", saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:
Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (""nadE"") in ramnolipidna gena (""rhiA"" in ""rhiB"") znotraj elektrogene ""P. aeruginosa"".
Izolacija in čiščenje ""nadE"", ""rhlA"" in ""rhlB"" s PCR in gelsko izolacijo.
Kloniranje in zvišana ekspresija ""nadE"", ""rhlA"" in ""rhlB"" genov v ""P. aeruginosa"".
Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu ""P. aeruginosa"".
Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva P. aeruginosa, kot model za P. putida.

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov nadE, rhlA in rhlB v P. aeruginosa na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:
P. aeruginosa divji tip
P. aeruginosa pRGPDuo2
P. aeruginosa pRGPDuo2 + nadE
P. aeruginosa pRGPDuo2 + rhlA
P. aeruginosa pRGPDuo2 + rhlB
P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni nadE, rhlA in rhlB, ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija nadE povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.
Za pridobitev P. aeruginosa z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija nadE in rhlA/B genov iz Pseudomonas aeruginosa PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK P. aeruginosa in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (nadE, rhlA in rhlB). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena rhlA in rhlB skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli nadE, na MSC2 mestu pa rhlA/B ter tako povečali produkcijsko sposobnost P. putide. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.
Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.
Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.
Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (tetR, KanR) v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.
Potem je sledila še elektroporacija Pseudomonas aeruginosa. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom P. aeruginosa. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.
Divji tip in inženirske seve P. aeruginosa so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.
Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.
Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.
Izolacija in analiza biosurfaktantov
Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.
Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.
Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov P. aeruginosa, ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.
Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:
E_24=H_e/H_t *100
E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %
He je višina emulzije
Ht je celotna višina

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T20:45:22Z

Nograsek147:

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3.-10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne Pseudomonas putida z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela P. aeruginosa, ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo nadE.

== PROBLEM ==

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

== IDEJA ==

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo Pseudomonas putida. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, rhlA in rhlB, ter genom za NAD sintetazo, nadE, kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij P. putida. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z P. putido so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni P. aeruginosa, saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

== NAČRT IN EKSPERIMENTI ==

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:
Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (nadE) in ramnolipidna gena (rhiA in rhiB) znotraj elektrogene P. aeruginosa.
Izolacija in čiščenje nadE, rhlA in rhlB s PCR in gelsko izolacijo.
Kloniranje in zvišana ekspresija nadE, rhlA in rhlB genov v P. aeruginosa.
Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu P. aeruginosa.
Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva P. aeruginosa, kot model za P. putida.

=== Načrtovanje modelov ===

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov nadE, rhlA in rhlB v P. aeruginosa na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:
P. aeruginosa divji tip
P. aeruginosa pRGPDuo2
P. aeruginosa pRGPDuo2 + nadE
P. aeruginosa pRGPDuo2 + rhlA
P. aeruginosa pRGPDuo2 + rhlB
P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni nadE, rhlA in rhlB, ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija nadE povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.
Za pridobitev P. aeruginosa z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

=== Izolacija genov ===

Prva naloga je bila izolacija nadE in rhlA/B genov iz Pseudomonas aeruginosa PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK P. aeruginosa in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (nadE, rhlA in rhlB). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena rhlA in rhlB skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli nadE, na MSC2 mestu pa rhlA/B ter tako povečali produkcijsko sposobnost P. putide. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.
Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.
Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.
Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (tetR, KanR) v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.
Potem je sledila še elektroporacija Pseudomonas aeruginosa. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

=== Elektrofermentacija ===

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom P. aeruginosa. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.
Divji tip in inženirske seve P. aeruginosa so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.
Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.
Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.
Izolacija in analiza biosurfaktantov
Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.
Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

=== Bioremidacija ===

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.
Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov P. aeruginosa, ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.
Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:
E_24=H_e/H_t *100
E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %
He je višina emulzije
Ht je celotna višina

== REZULTATI ==

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T20:44:23Z

Nograsek147:

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3.-10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne Pseudomonas putida z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela P. aeruginosa, ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo nadE.

== PROBLEM

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

== IDEJA

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo Pseudomonas putida. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, rhlA in rhlB, ter genom za NAD sintetazo, nadE, kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij P. putida. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z P. putido so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni P. aeruginosa, saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

== NAČRT IN EKSPERIMENTI

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:
Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (nadE) in ramnolipidna gena (rhiA in rhiB) znotraj elektrogene P. aeruginosa.
Izolacija in čiščenje nadE, rhlA in rhlB s PCR in gelsko izolacijo.
Kloniranje in zvišana ekspresija nadE, rhlA in rhlB genov v P. aeruginosa.
Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu P. aeruginosa.
Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva P. aeruginosa, kot model za P. putida.

=== Načrtovanje modelov

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov nadE, rhlA in rhlB v P. aeruginosa na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:
P. aeruginosa divji tip
P. aeruginosa pRGPDuo2
P. aeruginosa pRGPDuo2 + nadE
P. aeruginosa pRGPDuo2 + rhlA
P. aeruginosa pRGPDuo2 + rhlB
P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni nadE, rhlA in rhlB, ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija nadE povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.
Za pridobitev P. aeruginosa z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

=== Izolacija genov

Prva naloga je bila izolacija nadE in rhlA/B genov iz Pseudomonas aeruginosa PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK P. aeruginosa in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (nadE, rhlA in rhlB). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena rhlA in rhlB skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli nadE, na MSC2 mestu pa rhlA/B ter tako povečali produkcijsko sposobnost P. putide. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.
Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.
Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.
Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (tetR, KanR) v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.
Potem je sledila še elektroporacija Pseudomonas aeruginosa. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

=== Elektrofermentacija

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom P. aeruginosa. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.
Divji tip in inženirske seve P. aeruginosa so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.
Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.
Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.
Izolacija in analiza biosurfaktantov
Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.
Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

=== Bioremidacija

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.
Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov P. aeruginosa, ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.
Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:
E_24=H_e/H_t *100
E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %
He je višina emulzije
Ht je celotna višina

== REZULTATI

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte

2022-05-22T20:43:37Z

Nograsek147: New page: Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3.-10. mesto med dodiplomskimi proj...

Remi, du et! je projekt skupine NU_Kazakhstan iz Nazarbayev Univerze, Nur-Sultan, Kazahstan. Ekipa je leta 2021 sodelovala na iGem tekmovanju in zasedla 3.-10. mesto med dodiplomskimi projekti na področju okolja. Ekipa je želela razviti nov postopek za sanacijo surove nafte. Da bi dosegli svoj cilj, so načrtovali modificiranje nevirulentne Pseudomonas putida z uporabo dvojno inducibilnega sistema za prekomerno izražanje genov nadE in rhlA/B, ki kodirajo NAD sintetazo oziroma ramnolipide, pod elektrofermentacijskimi pogoji. Da pa bi preverili hipotezo o povečani produkciji, so se najprej osredotočili na uporabo modela P. aeruginosa, ki omogoča delovanje genov nadE in rhlA/B, s katerimi so želeli doseči povišano izražanje ramolipidov z inducirano prekomerno ekspresijo nadE.

PROBLEM

Vse večje povpraševanje po proizvodnji nafte in plina v sodobnih dneh spodbuja višje stopnje proizvodnje in distribucije. Pojav razlitja nafte v takih procesih ni nenavaden in velika večina ostane za zaprtimi vrati. Obstoječe metode saniranja razlitja so učinkovite le za lokalizirana razlitja kmalu po nesreči, medtem ko so dolgoročno manj stroškovno učinkovite in nevarne za kazahstansko endemično floro in favno. Človeška dejavnost povzroča uhajanje nafte v habitat, kar povzroča okoljske težave. Leta 2020 se je zaradi incidentov s tankerji razlilo približno 1000 ton nafte. In Kazahstan, ki naj bi imel 3 % svetovnih rezerv nafte, z največjimi rezervami nafte pod Kaspijskem morjem, ni imun na takšne težave. Proizvodnja nafte se povečuje tako po svetu, kot tudi v Kazahstanu, z načrtovano proizvodnjo nafte v letu 2021 v višini 85,3 milijona ton. Ugotovljeno je, da so lokalna območja z največ razlitji nafte južni deli Kaspijskega morja. Eno zadnjih večjih razlitij nafte v Kazahstanu je bilo junija 2019 v Mangistauu s površino 40 krat 60 metrov. Ta razlitja pa so posebej nevarna za mangrove in kaspijske tjulnje.

==IDEJA

Skupina je iskala rešitve kako na prijaznejši način saniranja razlitja nafte. Za ta namen so se odločili za produkcijo surfaktantov, natančneje ramnolipidov, z inženirano bakterijo Pseudomonas putida. To bi dosegli z dodanimi geni za ramnolipide, rhlA in rhlB, ter genom za NAD sintetazo, nadE, kateri bi omogočil višji izkoristek proizvodnje ramnolipidov. Prekomerno izražen gen nadE naj bi povzročil povečanje NAD sintetaze, kar bo povečalo NAD/NADH bazen v bakterijah; posledično se bo notranji bazen elektronov razširil. Dani bazen elektronov se lahko uporabi za tvorbo več ATP, razširjeni bazen ATP pa bo povzročil več genske ekspresije in rast bakterij P. putida. Za dodatno povečanje proizvodnje pa bi bakterije gojili v elektrofermentacijskih pogojih. Zaradi težav in težjim delom z P. putido so idejo najprej testirali povečanje sinteze na modelni P. aeruginosa, saj je ta že imela naravno prisotne gene za sintezo ramnolipidov.

==NAČRT IN EKSPERIMENTI

Svojo nalogo so razdelili na 5 korakov:
Molekularna detekcija gena NAD sintetaze (nadE) in ramnolipidna gena (rhiA in rhiB) znotraj elektrogene P. aeruginosa.
Izolacija in čiščenje nadE, rhlA in rhlB s PCR in gelsko izolacijo.
Kloniranje in zvišana ekspresija nadE, rhlA in rhlB genov v P. aeruginosa.
Določitev elektrokemijskega potenciala, NAD/NADH in ramnolipidnega izkoristka v inžinirskem sevu P. aeruginosa.
Remediacija surove nafte z uporabo inžinirskega seva P. aeruginosa, kot model za P. putida.

===Načrtovanje modelov

Da bi preizkusili učinek prekomerne ekspresije genov nadE, rhlA in rhlB v P. aeruginosa na proizvodnjo ramnolipidov, so oblikovali naslednje modele:
P. aeruginosa divji tip
P. aeruginosa pRGPDuo2
P. aeruginosa pRGPDuo2 + nadE
P. aeruginosa pRGPDuo2 + rhlA
P. aeruginosa pRGPDuo2 + rhlB
P. aeruginosa divjega tipa in bakterije z navadnim plazmidom RGPDuo2 so služile kot kontrole. V MCS1 so bili vstavljeni geni nadE, rhlA in rhlB, ki povečajo izražanje vsakega gena v vsakem modelu. Ob načrtovanju je bilo pričakovano, da bo prekomerna ekspresija nadE povzročila povečane ravni ATP in s tem povečano proizvodnjo ramnolipidov.
Za pridobitev P. aeruginosa z geni, ki nas zanimajo, so izvedli naslednje poskuse.

===Izolacija genov

Prva naloga je bila izolacija nadE in rhlA/B genov iz Pseudomonas aeruginosa PAO1. V ta namen so ekstrahirali genomsko DNK P. aeruginosa in oblikovali primerje za amplifikacijo genov, ki so jih zanimali (nadE, rhlA in rhlB). Vsak primer je sestavljen iz nespecifičnega zaporedja 4 baznih parov, ki mu sledita restrikcijsko mesto (SalI ali SacI) in sekvenca, ki je komplementarna genu za vstavljanje. Potem je sledilo pomnoževanje s PCR. Najprej so se odločili izolirati gena rhlA in rhlB skupaj, ter ju tudi skupaj vnesti v vektor. Saj naj bi tako dosegli dvojno inducibilni sistem, kjer bi na MSC1 mestu imeli nadE, na MSC2 mestu pa rhlA/B ter tako povečali produkcijsko sposobnost P. putide. Vendar sta bila združena gena predolga, zato so morali na novo oblikovati primerje in izolirati ter pomnožiti gena vsakega posebej.
Pomnoževanju je sledila izolacija genov, kjer so za barvanje na gelu uporabili GelRed barvilo, saj ta ne vpliva na DNA molekulo. Pred tem so uporabili etidijev bromid, vendar ta poškoduje molekulo DNA za kar pa ta ni več uporabna za nadaljnjo delo.
Potem je sledila restrikcija pomnožkov in pRGPDuo2 vektorja s SalI in SacI restriktazami ter ligacija na MCS1 mesto na vektorju. Ta je lociran pod IPTG inducilnim promotorjem (ptac), kar nam omogoča regulacijo z IPTG. Vsak gen je bil vstavljen v svoj vektor.
Da bi pomnožili količino plazmida in hkrati testirali viabilnost plazmida, so kot vmesno vrsto za prenašanje plazmida uporabili Escherichia coli. Zaporedja odpornosti na antibiotike (tetR, KanR) v plazmidih so služila kot izbirni marker na rastnem mediju, pomešanem z ustreznim antibiotikom. Tako smo lahko pregledali posamezne kolonije, ki so pridobile modificirane plazmide.
Potem je sledila še elektroporacija Pseudomonas aeruginosa. Po vstavitvi genov in gojenju v mediju (LB agar) z antibiotikom (kanamicin) so ekstrahirali DNA za testiranje z nanodrop.

===Elektrofermentacija

Z elektrofermentacijo so primerjali elektrokemično aktivnost in naboj med inženirskim in divjim sevom P. aeruginosa. Encim NH3-odvisna NAD sintetaza je prekomerno izražena z dodatkom gena nadE preko plazmida, zato naj bi bila sinteza kofaktorja NAD povišana. Povečanje NAD je v korelaciji z večjim pretokom elektronov, kar so preučevali v tem delu eksperimenta. Bioelektrokemične celice, uporabljene v tem poskusu, so namenjene induciranju višje stopnje rasti in večjega donosa celičnih produktov, vključno z ramnolipidi.
Divji tip in inženirske seve P. aeruginosa so gojili v bio-elektrokemičnih celicah z vnesenimi grafitnimi elektrodami. Za induciranje izražanja vstavljenih genov je bilo posneto mleko uporabljeno kot nadomestek za IPTG. Vsi vzorci so imeli podobno začetno optično gostoto in so bili inkubirani 24 ur.
Elektrokemijsko aktivnost sevov so analizirali s ciklično voltametrijo (CV) z merjenjem oksidacijskih in redukcijskih potencialov. Elektroaktivnost je bila zabeležena v začetni in v 24-urnem času inkubacije. CV analize so bile izvedene pri hitrostih skeniranja 10 mV/s.
Kronoamperometrična (CA) metoda je bila uporabljena za merjenje toka po času inkubacije. Kronoamperometrične meritve so bile izvedene z delovno elektrodo, ki je bila nastavljena na 400 mV in povprečnim tokom, zabeleženim vsakih 60 s za 24-urni inkubacijski čas. Podatki CA so bili uporabljeni za količinsko opredelitev skupnega naboja po 24 urah za vsako vrsto seva.
Izolacija in analiza biosurfaktantov
Za namene analize bioloških površinsko aktivnih snovi so gojili divje in inženirske seve P. aeruginosa v mediju s surovim oljem v običajnih pogojih 24 ur pri 35 °C. Supernatant brez celic iz proizvodnje ramnolipidov je bil oborjen. Oborino so nato posušili na zraku in zabeležili mase vzorcev.
Produkt, dobljen z obarjanjem supernatanta brez celic, so ponovno raztopili v destilirani vodi. Vzorce so analizirali s FTIR in pridobljene spektre pregledali za vrhove, ki kažejo na vezi, prisotne v ramnolipidnih molekulah. Ti vključujejo značilno raztezanje vezi C-O-C, ki kaže na ramnozni sladkor ter estrske, kisle, alifatske, hidroksilne in karboksilatne skupine.

===Bioremidacija

Vzorci tal, onesnaženi s surovo nafto, so bili uporabljeni za postavitev laboratorijsko nadzorovane bioremediacije. Uporabili smo supernatant brez celic iz vzorcev, vzgojenih v pogojih elektrofermentacije. Načrtovanih je bilo pet nastavitev, od katerih so štiri vsebovale enako količino kontaminirane zemlje in enako količino brozge, ki je vsebovala ramnolipide, ki jih proizvajajo različni sevi. Peta postavitev je bila uporabljena kot negativna kontrola in je vsebovala destilirano vodo z zemljo.
Ta poskus je pokazal sanacijo surove nafte s fermentacijskim produktom inženiranih sevov P. aeruginosa, ki je bil ocenjen tudi z indeksom emulgiranja.
Za iskanje indeksa emulgiranja so bile uporabljene nastavitve iz laboratorijske bioremediacije. Nastavitve so močno pretresli in pustili počivati. Po 24 urah smo epruvete vizualno pregledali in izračunali indeks emulgiranja po naslednji formuli:
E_24=H_e/H_t *100
E24 je indeks emulgiranja po 24 urah v %
He je višina emulzije
Ht je celotna višina

==REZULTATI

Rezultati so pokazali, da na povečanje produkcije ramnolipidov najbolj vpliva dodani nadE, kar je bilo tudi za pričakovati, saj z njim celica pridobi dodatno energijo za ekspresijo genov. Medtem pa pri sevih z dodanim enim od genov za ramnolipide ni prišlo do povečane produkcije, saj celica potrebuje za sintezo ramnolipidov oba gena, kar pomeni da povečana ekspresija enega od encimov v metabolni verigi ne poveča sinteze produkta, saj ni prišlo do povečane ekspresije drugega gena v verigi. Prav tako pa pri teh sevih nismo povečali sinteze NAD sintetaze, kar je pomenilo, da celica ni bila zmožna povečati ekspresije genov.

Seminarji SB 2021/22

2022-05-22T20:41:17Z

Nograsek147:

V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_E._coli Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inžiniring_in_izkoriščanje_sintetične_alosterije_luciferaze_NanoLuc Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc] (Rebeka Dajčman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularen_RNA_interferenčni_sistem_za_regulacijo_multipleksnih_genov Modularen RNA interferenčni sistem za regulacijo multipleksnih genov] (Marko Pavleković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Označevanje_bioloških_celic_za_zanesljivo_celično_inženirstvo Označevanje bioloških celic za zanesljivo celično inženirstvo] (Neža Blaznik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_biosenzorjem_usmerjen_inžiniring_Cupriavidus_necator_H16_za_avtotrofno_proizvodnjo_manitola Z biosenzorjem usmerjen inženiring ''Cupriavidus necator'' H16 za avtotrofno proizvodnjo manitola] (Teo Nograšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/CelloSelect_%E2%80%93_sinteti%C4%8Dna_celobiozna_presnovna_pot_za_izbor_stabilnih_transgenih_celi%C4%8Dnih_linij_CHO CelloSelect – sintetična celobiozna presnovna pot za izbor stabilnih transgenih celičnih linij CHO] (Nika Vegelj)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Hipersensitiven_genetsko_kodiran_fluorescen%C4%8Dni_indikator_%28roGFP2-Prx1%29_za_kontinuirno_merjenje_znotrajceli%C4%8Dnega_H2O2_med_mikro-kultivacijo_celic#Literatura Hipersensitiven genetsko kodiran fluorescenčni indikator (roGFP2-Prx1) za kontinuirno merjenje znotrajceličnega H2O2 med mikro-kultivacijo celic] (Eva Kanalec)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Zasnova_in_karakterizacija_s_salicilno_kislino_induciranega_genskega_ekspresijskega_sistema_za_celice_Jurkat Zasnova in karakterizacija s salicilno kislino induciranega genskega ekspresijskega sistema za celice Jurkat] (Tina Arnšek)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularni_sinteti%C4%8Dni_kromosomi_kot_novo_orodje_za_in%C5%BEenirstvo_metabolizma Modularni sintetični kromosomi kot novo orodje za inženirstvo metabolizma] (Špela Kladnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Sinteti%C4%8Dni_mikrobni_konzorcij_za_biosintezo_2-keto-L-glukonske_kisline_%282-KLG%29 Sintetični mikrobni konzorcij za biosintezo 2-keto-L-glukonske kisline (2-KLG)] (Anastasija Nechevska)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OpenPlast_-_kloroplastni_brezcelični_sistemi_za_hitrejšo_karakterizacijo_genetskih_delov OpenPlast - kloroplastni brezcelični sistemi za hitrejšo karakterizacijo genetskih delov] (Kim Glavič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana PHEAST - ''P. pastoris'' za odstranjevanje metana] (Ana Potočnik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ELIXIO_-Mikrobni_konzorcij_za_vonj_po_vijolicah ELIXIO Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah] (Ajda Godec) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Agrobactory_593_-_Modularna_bakterijska_platforma_za_pripravo_biopesticidov Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidev] (Tim Nograšek) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php?title=CyaSalt_-_metoda_za_razsoljevanje_morskih_voda] (Michelle Oletič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PRYSM_-_s svetlobo regulirane kvasovke PRYSM_-_s svetlobo regulirane kvasovke] (Nika Malečkar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Remi,_du_et!_-_bioremediacija_razlitij_nafte Remi, du et! - bioremediacija razlitij nafte] (Jošt Hren)
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidov

2022-05-10T13:20:48Z

Nograsek147:

Agrobactory 593 je projekt skupine Ecuador, ki je leta 2021 sodelovala na tekmovanju iGEM in zasedla 3-10. mesto v kategoriji Hrana in prehranjevanje. Njihov glavni namen je bil pripraviti bakterijsko platformo za proizvodnjo specifičnih biopesticidev. Samo princip delovanja so prikazali na primeru fungicida na podlagi siRNA za zaščito bananovcev.

Spletna stran projekta Agrobactory 593: https://2021.igem.org/Team:Ecuador

==PROBLEM==
Agrikultura je za državo kot je Ekvador pomemben faktor, ki omogoča samooskrbo, delovna mesta in produkte za izvoz v svet. Predstavlja kar 4% svetovnega in 8 % državnega BDP. Delovna mesta pa daje slabi tretjini prebivalstva.
Velik problem pa pri tem predstavljajo različne rastlinske bolezni, ki lahko privedejo do izredno visokih izgub, kar ne vpliva le na gospodarstvo, ampak tudi na okolje in zdravje ljudi.
Ekvador je glavni izvoznik banan na svetovni trg, kar 22% celotne svetovne trgovine. Obstaja pa kvasovka, ki preprečuje, da bi bil ta promet še večji. Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FocR4T) je škodljivec, ki napade banane iz družine Musaceae in spada med najhujše povzročitelje bolezni v zgodovini agrikulture, ki povzroča milijonske izgube na plantažah banan[1].

==IDEJA==
Skupina Ecuador je iskala nove rešitve, kako pripraviti fungicid proti glivi FocR4T, hkrati pa so projekt zastavili še nekoliko širše in hoteli pripraviti platformo, ki bi omogočila pripravo biopesticidev.Ti bi lahko bili specifični za različne patogene mikroorganizme. Tako je nastala modularna bakterijska platforma Agrobactory 593.
Projekt predstavlja več možnih rešitev v obliki nizkocenovnih biopesticidov na osnovi dvoverižne RNA, ki kasneje s tehnologijo RNAi zavira delovanje fungov. Prvotno so bili poskusi in vitro izvedeni na primeru glive Foc R1 (manj patogena in na voljo), vendar enako deluje tudi pri FocR4T. Osnovni princip pa omogoča preprosto spreminjanje tarčnega patogena, količino biopesticida, uporablja pa se lahko tudi različne bakterijske šasije za dostavo RNAi. Na ta način bi lahko enostavno pripravljali različne biopesticide prilagojene za različne potrebe kmetov[1].

==NAČRT==
Najprej so pripravili celoten model in uporabili ODE (ordinary differential equations) sistem za predvidenje samih rezultatov, kasneje pa so izvedli tudi in vitro eksperimente. Celoten sistem deluje na DBTL princip, kjer si najprej zamislijo model, potem ga pripravijo, nato preizkusijo in na koncu poskušajo optimizirati primarni model za boljše rezultate[1].

===MODEL===
'''Sinteza dsRNA'''

Preden so šli na pripravo fungicida za Foc R4T so pripravili splošen model. Namen je bil pripraviti dsRNA, zato so se odločili pripraviti vektor, ki bo vseboval T7 promotor na obeh straneh tarčnega gena, tako da bi lahko dobili posamične ssRNA, ki bi se nato združile v dsRNA. Zaradi izbranega promotorja so vzeli tudi primerno šasijo in sicer E. coli seva HT115, ki vsebuj zapis za T7 polimerazo. Omenjeni encim je v bakteriji pod nadzorom Lac operona. Ta je represiran s strani LacI, gen za katerega se prav tako nahaja na kromosomu bakterije. LacI v bakteriji dimerizira in se veže na lac operon. Ob dodatku IPTGja v gojišče, se ta veže na LacI in tako prepreči vezavo, hkrati pa omogoči sintezo T7 polimeraze[1].

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

Prva možnost je, da bi dsRNA izolirali iz bakterij in nato injicirali direktno v rastline. Tako bi preprečili rast gliv, hkrati pa ne bi imelo negativnega učinka na rastlino, saj rastline, predvsem bananovci, nimajo nobenega tarčnega zapisa v kromosomih.
Druga možnost, na katero so se bolj osredotočili in se jim je zdela tudi bolj primerna pa je dodatek bakterij h koreninam rastlin in ob lizi bakterij pride do sprostitve dsRNA. Tako so pripravili tudi model za nadzorovano liziranje bakterij, ki je povezano z gostoto celic. Pri sproščanju dsRNA iz celic uporabljajo sistem quorum sensing (QS), kjer posredno izkoriščajo gostoto celic in koncentracijo AHL za transkripcijo gena, ki je odgovoren za lizo celic. Znotraj celic poteka sinteza AHL pod kontrolo LuxI molekul. Ti so pod konstitutivnim promotorjem, ki skrbi za stalno izražanje, LuxI pa vsebuje zapis za AHL sintazo in posledično za proizvodnjo znotrajceličnega AHL. Pri večanju gostote celic, se sprošča tudi več AHL molekul, ki lahko prehajajo membrano. AHL prisoten znotraj celic se veže na LuxR molekule. Te so podobno kot LuxI pod kontrolo konstitutivnega promotorja, deluje pa kot transkripcijski aktivator. Ob vezavi AHL pride do dimerizacije in inhibicije vezave LuxR na lux promotor. S tem omogočimo prepis gena za lux promotorjem, kar so poimenovali ON stanje. V njihovem primeru vsebuje gen zapis za lizne proteine, ki privedejo do lize celice, s tem pa sprostitve dsRNA, ki se vzporedno proizvaja. Ko pride do dovolj visoke koncentracije za lizo celic, te razpadejo. Z razpadom celic se zniža tudi koncentracija AHL v okolici in liznih proteinov, kar omogoči ponovno rast in razmnoževanje preostalih celic. To so poimenovali OFF stanje. Tako dobimo oscilirajoči sistem, ki skrbi da ne pride do prevelikega razmnoževanja bakterij, ko jih uporabimo kot fungicid[1].

'''Sistem utišanja tarčnih genov'''

Izločena dsRNA se izloči v okolico korenin bananovcev, kjer se nahaja zajedavska gliva. Ta preide v celice, kjer se izraža tarčna mRNA. S tem ko imamo dsRNA v celici, ta izkoristi celični sistem DICER za razgradnjo na siRNA velikosti nekje med 20-23 bp, nato pa ob prisotnosti AGO proteinov še tvorbo RISC kompleksa. siRNA znotraj kompleksa prepozna tarčno mRNA in se veže nanjo. Kompleks jo nato razgradi in prepreči njeno izražanje. Do proizvodnje siRNA pride samo v primeru, če je prisotna tarčna mRNA, drugače ostane v dvoverižni obliki. Pri različnih vrstah gliv pa je lahko sama količina siRNA še pomnožena zahvaljujoč sistemu RRP (RNA-odvisna RNA polimeraza), ki tako samo še poveča inhibitorski odgovor. Pri tem lahko nastane problem, ker nam ta sistem lahko pomnoži tudi predele mRNA, na katero je vezana RNAi, s tem pa izgubimo specifičnost in lahko pride do inhibicije drugih zaporedij[1,2].

Vsi ti modeli so bili predstavljeni v obliki matematičnih enačb, ki so jih nato pretvorili v osnovne diferencialne enačbe. Pri tem so upoštevali znane podatke o hitrostih, konstantah in koncentracijah posameznih elementov. Modeli so razdeljeni na zgornje tri nivoje, na koncu pa so dobili predlagan celoten mehanizem od začetka do konca. Posamezne parametre so že sami vmes optimizirali z vmesnimi poskusi. Nato so se lotili še dejanskega eksperimenta za evaluacijo njihovega modela[1].

===EKSPERIMENT===
'''Sinteza dsRNA'''

Pri dejanskem eksperimentu so si pomagali z že znanimi podatki, saj niso imeli na voljo tega agresivnega seva Foc TR4, tako da so delali raziskave na manj agresivnem Foc R1. Najprej so raziskali, kateri geni so sploh povezani s patogenostjo. Ker so še vedno hoteli pripraviti RNAi za agresivnejši sev, so primerjali izbrane gene in iskali tiste z najvišjo homologijo, tako da bi se lahko apliciralo v obeh primerih. Na ta način so prišli do štirih genov (SGE1, ERG11, Velvet in SIX1). Ti so odgovorni za nastanek bolezni pri bananah, kjer pride do sinteze sekundarnih virulenčnih metabolitov (fumonizini in fuzarini) in venenja. Računalniško so nato pripravili zaporedja za vstavitev v vektorje in pripravo dsRNA. Za izgradnjo dsRNA so uporabljali spletni program E-RNAi, ki je primeren za oblikovanje in evaluacijo dsRNA. Izbrali so si 21 nukleotidov dolga zaporedja, ki se nahajajo nekje na sredini samih eksonov.
Za pridobitev samih tarčnih zaporedij je bilo potrebno izolirati mRNA iz gliv in za to so uporabili začetne oligonukleotide s previsnimi konci, ki so vsebovali zaporedja za kasnejše rezanje z restriktazami BgIII in KpnI, za kateri mesta vsebuje tudi izboljšanim vektorjem L4440. Za pomnoževanje vključkov in vektorja so uporabili bakterijski sev DH5α. Z T4 ligazo so oba dela združili, transformirali sev TH115 s toplotnim šokom in inducirali proizvodnjo dsRNA z dodatkom IPTGja[1,3].

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

Dostava in sproščanje dsRNA je precej odvisno od QS, ta pa je precej odvisen od lux promotorja, saj so pod njegovo kontrolo lizni proteini in posledično sproščanje dsRNA. Z uvedbo GFP proteina za lux promotor so hoteli optimizirati delovanje lux promotorja in vpliv QS na izražanje liznega proteina. Pridobljeni podatki so se ujemali s samim predvidenim modelom, iz samih grafičnih rezultatov pa so dobili parametre kot so Kd, Hillov koeficient in bazalno izražanje, kar pa jim je omogočilo optimizacijo modela[1].

Za pripravo vektorja so uporabili metodo golden gate na treh nivojih. Najprej so povezali dva dela, ki sta bila že predhodno pripravljena v registru in sicer transkripcijski model za izražanje GFP pod lux promotorjem in transkripcijski model za konstitutivno izražanje luxR gena. Ločeno so potem pripravili še dve transkripcijski enoti in ju povezali med seboj in sicer transkripcijsko enoto za konstitutivno izražanje luxI gena in transkripcijsko enoto za izražanje liznega proteina phiX174 pod lux promotorjem. Posamezni združeni transkripcijski enoti z dvema deloma so nato združili v končni model, ki vsebuje štiri enote[1].

'''Sistem utišanja tarčnih genov'''

Uspešno pripravljeno dsRNA so na koncu izolirali in izvedli inhibicijski test, kjer so dodajali fungicid različnih koncentracij k sporam gliv in na koncu merili koncentracijo konidij, ki so se razvile v odsotnosti in prisotnosti dsRNA. Na ta način so določili tudi ustrezno koncentracijo dsRNA, ki je potrebno za preprečitev rasti[1].

==UPORABNIKI==

V tem konkretnem primeru bi bil fungicid uporaben za podjetja, ki proizvajajo banane – teh je kar 464 v Ekvadorju, seveda pa bi lahko uporabljali tudi v drugih državah. Pripravili so tudi načrt, kako točno in na katerih predelih polj bi bilo koristno uporabljati fungicid, da ga ne bi preveč.
Bolj splošen cilj pa je priprava platforme, ki bi bila uporabna za različne sintezne biologe, ki bi jim olajšala pripravo različnih fungicidov tako da bi lahko predvideli rezultate in s tem zmanjšali nepotrebne in vivo poskuse[1].

==VIRI==
[1] Team Ecuador, iGEM 2021, Agrobactory593; dostopno na: https://2021.igem.org/Team:Ecuador (pridobljeno dne 09.05.2022)

[2] Richard W Carthew and Erik J Sontheimer. Origins and mechanisms of mirnas and sirnas. Cell, 136(4):642–655, 2009.

[3] V. Gurdaswani, S. B. Ghag, y T. R. Ganapathi, “FocSge1 in Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 1 is essential for full virulence”, BMC Microbiology, vol. 20, núm. 1, p. 255, ago. 2020, doi: 10.1186/s12866-020-01936-y

Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidov

2022-05-10T09:32:02Z

Nograsek147:

Agrobactory 593 je projekt skupine Ecuador, ki je leta 2021 sodelovala na tekmovanju iGEM in zasedla 3-10. mesto v kategoriji Hrana in prehranjevanje. Njihov glavni namen je bil pripraviti bakterijsko platformo za proizvodnjo specifičnih biopesticidev. Samo princip delovanja so prikazali na primeru fungicida na podlagi siRNA za zaščito bananovcev.

Spletna stran projekta Agrobactory 593: https://2021.igem.org/Team:Ecuador

==PROBLEM==
Agrikultura je za državo kot je Ekvador pomemben faktor, ki omogoča samooskrbo, delovna mesta in produkte za izvoz v svet. Predstavlja kar 4% svetovnega in 8 % državnega BDP. Delovna mesta pa daje slabi tretjini prebivalstva.
Velik problem pa pri tem predstavljajo različne rastlinske bolezni, ki lahko privedejo do izredno visokih izgub, kar ne vpliva le na gospodarstvo, ampak tudi na okolje in zdravje ljudi.
Ekvador je glavni izvoznik banan na svetovni trg, kar 22% celotne svetovne trgovine. Obstaja pa kvasovka, ki preprečuje, da bi bil ta promet še večji. Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FocR4T) je škodljivec, ki napade banane iz družine Musaceae in spada med najhujše povzročitelje bolezni v zgodovini agrikulture, ki povzroča milijonske izgube na plantažah banan[1].

==IDEJA==
Skupina Ecuador je iskala nove rešitve, kako pripraviti fungicid proti glivi FocR4T, hkrati pa so projekt zastavili še nekoliko širše in hoteli pripraviti platformo, ki bi omogočila pripravo biopesticidev.Ti bi lahko bili specifični za različne patogene mikroorganizme. Tako je nastala modularna bakterijska platforma Agrobactory 593.
Projekt predstavlja več možnih rešitev v obliki nizkocenovnih biopesticidov na osnovi dvoverižne RNA, ki kasneje s tehnologijo RNAi zavira delovanje fungov. Prvotno so bili poskusi in vitro izvedeni na primeru glive Foc R1 (manj patogena in na voljo), vendar enako deluje tudi pri FocR4T. Osnovni princip pa omogoča preprosto spreminjanje tarčnega patogena, količino biopesticida, uporablja pa se lahko tudi različne bakterijske šasije za dostavo RNAi. Na ta način bi lahko enostavno pripravljali različne biopesticide prilagojene za različne potrebe kmetov[1].

==NAČRT==
Najprej so pripravili celoten model in uporabili ODE (ordinary differential equations) sistem za predvidenje samih rezultatov, kasneje pa so izvedli tudi in vitro eksperimente. Celoten sistem deluje na DBTL princip, kjer si najprej zamislijo model, potem ga pripravijo, nato preizkusijo in na koncu poskušajo optimizirati primarni model za boljše rezultate[1].

===MODEL===
'''Sinteza dsRNA'''

Preden so šli na pripravo fungicida za Foc R4T so pripravili splošen model. Namen je bil pripraviti dsRNA, zato so se odločili pripraviti vektor, ki bo vseboval T7 promotor na obeh straneh tarčnega gena, tako da bi lahko dobili posamične ssRNA, ki bi se nato združile v dsRNA. Zaradi izbranega promotorja so vzeli tudi primerno šasijo in sicer E. coli seva HT115, ki vsebuj zapis za T7 polimerazo. Omenjeni encim je v bakteriji pod nadzorom Lac operona. Ta je represiran s strani LacI, gen za katerega se prav tako nahaja na kromosomu bakterije. LacI v bakteriji dimerizira in se veže na lac operon. Ob dodatku IPTGja v gojišče, se ta veže na LacI in tako prepreči vezavo, hkrati pa omogoči sintezo T7 polimeraze[1].

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

Prva možnost je, da bi dsRNA izolirali iz bakterij in nato injicirali direktno v rastline. Tako bi preprečili rast gliv, hkrati pa ne bi imelo negativnega učinka na rastlino, saj rastline, predvsem bananovci, nimajo nobenega tarčnega zapisa v kromosomih.
Druga možnost, na katero so se bolj osredotočili in se jim je zdela tudi bolj primerna pa je dodatek bakterij h koreninam rastlin in ob lizi bakterij pride do sprostitve dsRNA. Tako so pripravili tudi model za nadzorovano liziranje bakterij, ki je povezano z gostoto celic. Pri sproščanju dsRNA iz celic uporabljajo sistem quorum sensing (QS), kjer posredno izkoriščajo gostoto celic in koncentracijo AHL za transkripcijo gena, ki je odgovoren za lizo celic. Znotraj celic poteka sinteza AHL pod kontrolo LuxI molekul. Ti so pod konstitutivnim promotorjem, ki skrbi za stalno izražanje, LuxI pa vsebuje zapis za AHL sintazo in posledično za proizvodnjo znotrajceličnega AHL. Pri večanju gostote celic, se sprošča tudi več AHL molekul, ki lahko prehajajo membrano. AHL prisoten znotraj celic se veže na LuxR molekule. Te so podobno kot LuxI pod kontrolo konstitutivnega promotorja, deluje pa kot transkripcijski aktivator. Ob vezavi AHL pride do dimerizacije in inhibicije vezave LuxR na lux promotor. S tem omogočimo prepis gena za lux promotorjem, kar so poimenovali ON stanje. V njihovem primeru vsebuje gen zapis za lizne proteine, ki privedejo do lize celice, s tem pa sprostitve dsRNA, ki se vzporedno proizvaja. Ko pride do dovolj visoke koncentracije za lizo celic, te razpadejo. Z razpadom celic se zniža tudi koncentracija AHL v okolici in liznih proteinov, kar omogoči ponovno rast in razmnoževanje preostalih celic. To so poimenovali OFF stanje. Tako dobimo oscilirajoči sistem, ki skrbi da ne pride do prevelikega razmnoževanja bakterij, ko jih uporabimo kot fungicid[1].

'''Sistem utišanja tarčnih genov'''

Izločena dsRNA se izloči v okolico korenin bananovcev, kjer se nahaja zajedavska gliva. Ta preide v celice, kjer se izraža tarčna mRNA. S tem ko imamo dsRNA v celici, ta izkoristi celični sistem DICER za razgradnjo na siRNA velikosti nekje med 20-23 bp, nato pa ob prisotnosti AGO proteinov še tvorbo RISC kompleksa. siRNA znotraj kompleksa prepozna tarčno mRNA in se veže nanjo. Kompleks jo nato razgradi in prepreči njeno izražanje. Do proizvodnje siRNA pride samo v primeru, če je prisotna tarčna mRNA, drugače ostane v dvoverižni obliki. Pri različnih vrstah gliv pa je lahko sama količina siRNA še pomnožena zahvaljujoč sistemu RRP (RNA-odvisna RNA polimeraza), ki tako samo še poveča inhibitorski odgovor. Pri tem lahko nastane problem, ker nam ta sistem lahko pomnoži tudi predele mRNA, na katero je vezana RNAi, s tem pa izgubimo specifičnost in lahko pride do inhibicije drugih zaporedij[1,2].

Vsi ti modeli so bili predstavljeni v obliki matematičnih enačb, ki so jih nato pretvorili v osnovne diferencialne enačbe. Pri tem so upoštevali znane podatke o hitrostih, konstantah in koncentracijah posameznih elementov. Modeli so razdeljeni na zgornje tri nivoje, na koncu pa so dobili predlagan celoten mehanizem od začetka do konca. Posamezne parametre so že sami vmes optimizirali z vmesnimi poskusi. Nato so se lotili še dejanskega eksperimenta za evaluacijo njihovega modela[1].

===EKSPERIMENT===
'''Sinteza dsRNA'''

Pri dejanskem eksperimentu so si pomagali z že znanimi podatki, saj niso imeli na voljo tega agresivnega seva Foc TR4, tako da so delali raziskave na manj agresivnem Foc R1. Najprej so raziskali, kateri geni so sploh povezani s patogenostjo. Ker so še vedno hoteli pripraviti RNAi za agresivnejši sev, so primerjali izbrane gene in iskali tiste z najvišjo homologijo, tako da bi se lahko apliciralo v obeh primerih. Na ta način so prišli do štirih genov (SGE1, ERG11, Velvet in SIX1). Ti so odgovorni za nastanek bolezni pri bananah, kjer pride do sinteze sekundarnih virulenčnih metabolitov (fumonizini in fuzarini) in venenja. Računalniško so nato pripravili zaporedja za vstavitev v vektorje in pripravo dsRNA. Za izgradnjo dsRNA so uporabljali spletni program E-RNAi, ki je primeren za oblikovanje in evaluacijo dsRNA. Izbrali so si 21 nukleotidov dolga zaporedja, ki se nahajajo nekje na sredini samih eksonov.
Za pridobitev samih tarčnih zaporedij je bilo potrebno izolirati mRNA iz gliv in za to so uporabili začetne oligonukleotide s previsnimi konci, ki so vsebovali zaporedja za kasnejše rezanje z restriktazami BgIII in KpnI, za kateri mesta vsebuje tudi izboljšanim vektorjem L4440. Za pomnoževanje vključkov in vektorja so uporabili bakterijski sev DH5α. Z T4 ligazo so oba dela združili, transformirali sev TH115 s toplotnim šokom in inducirali proizvodnjo dsRNA z dodatkom IPTGja[1,3].

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

Dostava in sproščanje dsRNA je precej odvisno od QS, ta pa je precej odvisen od lux promotorja, saj so pod njegovo kontrolo lizni proteini in dsRNA. Tokrat so zamenjali dsRNA z GFP in tako merili fluorescenco. Na ta način so dobili še kvantitativne podatke o delovanju lux promotorja, hkrati pa so z primerjavo z računalniškim modelom dobili precejšno ujemanje. Iz samih grafičnih rezultatov pa so dobili parametre kot so Kd, Hillov koeficient in bazalno izražanje pa so lahko nato optimizirali model[1].

Za pripravo vektorja so uporabili metodo golden gate na treh nivojih. Najprej so povezali dva dela, ki sta bila že predhodno pripravljena v registru in sicer transkripcijski model za izražanje GFP pod lux promotorjem in transkripcijski model za konstitutivno izražanje luxR gena. Ločeno so potem pripravili še dve transkripcijski enoti in ju povezali med seboj in sicer transkripcijsko enoto za konstitutivno izražanje luxI gena in transkripcijsko enoto za izražanje liznega proteina phiX174 pod lux promotorjem. Posamezni združeni transkripcijski enoti z dvema deloma so nato združili v končni model, ki vsebuje štiri enote[1].

'''Sistem utišanja tarčnih genov'''

Uspešno pripravljeno dsRNA so na koncu izolirali in izvedli inhibicijski test, kjer so dodajali fungicid različnih koncentracij k sporam gliv in na koncu merili koncentracijo konidij, ki so se razvile v odsotnosti in prisotnosti dsRNA. Na ta način so določili tudi ustrezno koncentracijo dsRNA, ki je potrebno za preprečitev rasti[1].

==UPORABNIKI==

V tem konkretnem primeru bi bil fungicid uporaben za podjetja, ki proizvajajo banane – teh je kar 464 v Ekvadorju, seveda pa bi lahko uporabljali tudi v drugih državah. Pripravili so tudi načrt, kako točno in na katerih predelih polj bi bilo koristno uporabljati fungicid, da ga ne bi preveč.
Bolj splošen cilj pa je priprava platforme, ki bi bila uporabna za različne sintezne biologe, ki bi jim olajšala pripravo različnih fungicidov tako da bi lahko predvideli rezultate in s tem zmanjšali nepotrebne in vivo poskuse[1].

==VIRI==
[1] Team Ecuador, iGEM 2021, Agrobactory593; dostopno na: https://2021.igem.org/Team:Ecuador (pridobljeno dne 09.05.2022)

[2] Richard W Carthew and Erik J Sontheimer. Origins and mechanisms of mirnas and sirnas. Cell, 136(4):642–655, 2009.

[3] V. Gurdaswani, S. B. Ghag, y T. R. Ganapathi, “FocSge1 in Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 1 is essential for full virulence”, BMC Microbiology, vol. 20, núm. 1, p. 255, ago. 2020, doi: 10.1186/s12866-020-01936-y

Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidov

2022-05-10T09:29:37Z

Nograsek147:

Agrobactory 593 je projekt skupine Ecuador, ki je leta 2021 sodelovala na tekmovanju iGEM in zasedla 3-10. mesto v kategoriji Hrana in prehrana. Njihov glavni namen je bil pripraviti bakterijsko platformo za proizvodnjo specifičnih biopesticidev. Samo princip delovanja so prikazali na primeru fungicida na podlagi siRNA za zaščito bananovcev.

Spletna stran projekta Agrobactory 593: https://2021.igem.org/Team:Ecuador

==PROBLEM==
Agrikultura je za državo kot je Ekvador pomemben faktor, ki omogoča samooskrbo, delovna mesta in produkte za izvoz v svet. Predstavlja kar 4% svetovnega in 8 % državnega BDP. Delovna mesta pa daje slabi tretjini prebivalstva.
Velik problem pa pri tem predstavljajo različne rastlinske bolezni, ki lahko privedejo do izredno visokih izgub, kar ne vpliva le na gospodarstvo, ampak tudi na okolje in zdravje ljudi.
Ekvador je glavni izvoznik banan na svetovni trg, kar 22% celotne svetovne trgovine. Obstaja pa kvasovka, ki preprečuje, da bi bil ta promet še večji. Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FocR4T) je škodljivec, ki napade banane iz družine Musaceae in spada med najhujše povzročitelje bolezni v zgodovini agrikulture, ki povzroča milijonske izgube na plantažah banan[1].

==IDEJA==
Skupina Ecuador je iskala nove rešitve, kako pripraviti fungicid proti glivi FocR4T, hkrati pa so projekt zastavili še nekoliko širše in hoteli pripraviti platformo, ki bi omogočila pripravo biopesticidev.Ti bi lahko bili specifični za različne patogene mikroorganizme. Tako je nastala modularna bakterijska platforma Agrobactory 593.
Projekt predstavlja več možnih rešitev v obliki nizkocenovnih biopesticidov na osnovi dvoverižne RNA, ki kasneje s tehnologijo RNAi zavira delovanje fungov. Prvotno so bili poskusi in vitro izvedeni na primeru glive Foc R1 (manj patogena in na voljo), vendar enako deluje tudi pri FocR4T. Osnovni princip pa omogoča preprosto spreminjanje tarčnega patogena, količino biopesticida, uporablja pa se lahko tudi različne bakterijske šasije za dostavo RNAi. Na ta način bi lahko enostavno pripravljali različne biopesticide prilagojene za različne potrebe kmetov[1].

==NAČRT==
Najprej so pripravili celoten model in uporabili ODE (ordinary differential equations) sistem za predvidenje samih rezultatov, kasneje pa so izvedli tudi in vitro eksperimente. Celoten sistem deluje na DBTL princip, kjer si najprej zamislijo model, potem ga pripravijo, nato preizkusijo in na koncu poskušajo optimizirati primarni model za boljše rezultate[1].

===MODEL===
'''Sinteza dsRNA'''

Preden so šli na pripravo fungicida za Foc R4T so pripravili splošen model. Namen je bil pripraviti dsRNA, zato so se odločili pripraviti vektor, ki bo vseboval T7 promotor na obeh straneh tarčnega gena, tako da bi lahko dobili posamične ssRNA, ki bi se nato združile v dsRNA. Zaradi izbranega promotorja so vzeli tudi primerno šasijo in sicer E. coli seva HT115, ki vsebuj zapis za T7 polimerazo. Omenjeni encim je v bakteriji pod nadzorom Lac operona. Ta je represiran s strani LacI, gen za katerega se prav tako nahaja na kromosomu bakterije. LacI v bakteriji dimerizira in se veže na lac operon. Ob dodatku IPTGja v gojišče, se ta veže na LacI in tako prepreči vezavo, hkrati pa omogoči sintezo T7 polimeraze[1].

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

Prva možnost je, da bi dsRNA izolirali iz bakterij in nato injicirali direktno v rastline. Tako bi preprečili rast gliv, hkrati pa ne bi imelo negativnega učinka na rastlino, saj rastline, predvsem bananovci, nimajo nobenega tarčnega zapisa v kromosomih.
Druga možnost, na katero so se bolj osredotočili in se jim je zdela tudi bolj primerna pa je dodatek bakterij h koreninam rastlin in ob lizi bakterij pride do sprostitve dsRNA. Tako so pripravili tudi model za nadzorovano liziranje bakterij, ki je povezano z gostoto celic. Pri sproščanju dsRNA iz celic uporabljajo sistem quorum sensing (QS), kjer posredno izkoriščajo gostoto celic in koncentracijo AHL za transkripcijo gena, ki je odgovoren za lizo celic. Znotraj celic poteka sinteza AHL pod kontrolo LuxI molekul. Ti so pod konstitutivnim promotorjem, ki skrbi za stalno izražanje, LuxI pa vsebuje zapis za AHL sintazo in posledično za proizvodnjo znotrajceličnega AHL. Pri večanju gostote celic, se sprošča tudi več AHL molekul, ki lahko prehajajo membrano. AHL prisoten znotraj celic se veže na LuxR molekule. Te so podobno kot LuxI pod kontrolo konstitutivnega promotorja, deluje pa kot transkripcijski aktivator. Ob vezavi AHL pride do dimerizacije in inhibicije vezave LuxR na lux promotor. S tem omogočimo prepis gena za lux promotorjem, kar so poimenovali ON stanje. V njihovem primeru vsebuje gen zapis za lizne proteine, ki privedejo do lize celice, s tem pa sprostitve dsRNA, ki se vzporedno proizvaja. Ko pride do dovolj visoke koncentracije za lizo celic, te razpadejo. Z razpadom celic se zniža tudi koncentracija AHL v okolici in liznih proteinov, kar omogoči ponovno rast in razmnoževanje preostalih celic. To so poimenovali OFF stanje. Tako dobimo oscilirajoči sistem, ki skrbi da ne pride do prevelikega razmnoževanja bakterij, ko jih uporabimo kot fungicid[1].

'''Sistem utišanja tarčnih genov'''

Izločena dsRNA se izloči v okolico korenin bananovcev, kjer se nahaja zajedavska gliva. Ta preide v celice, kjer se izraža tarčna mRNA. S tem ko imamo dsRNA v celici, ta izkoristi celični sistem DICER za razgradnjo na siRNA velikosti nekje med 20-23 bp, nato pa ob prisotnosti AGO proteinov še tvorbo RISC kompleksa. siRNA znotraj kompleksa prepozna tarčno mRNA in se veže nanjo. Kompleks jo nato razgradi in prepreči njeno izražanje. Do proizvodnje siRNA pride samo v primeru, če je prisotna tarčna mRNA, drugače ostane v dvoverižni obliki. Pri različnih vrstah gliv pa je lahko sama količina siRNA še pomnožena zahvaljujoč sistemu RRP (RNA-odvisna RNA polimeraza), ki tako samo še poveča inhibitorski odgovor. Pri tem lahko nastane problem, ker nam ta sistem lahko pomnoži tudi predele mRNA, na katero je vezana RNAi, s tem pa izgubimo specifičnost in lahko pride do inhibicije drugih zaporedij[1,2].

Vsi ti modeli so bili predstavljeni v obliki matematičnih enačb, ki so jih nato pretvorili v osnovne diferencialne enačbe. Pri tem so upoštevali znane podatke o hitrostih, konstantah in koncentracijah posameznih elementov. Modeli so razdeljeni na zgornje tri nivoje, na koncu pa so dobili predlagan celoten mehanizem od začetka do konca. Posamezne parametre so že sami vmes optimizirali z vmesnimi poskusi. Nato so se lotili še dejanskega eksperimenta za evaluacijo njihovega modela[1].

===EKSPERIMENT===
'''Sinteza dsRNA'''

Pri dejanskem eksperimentu so si pomagali z že znanimi podatki, saj niso imeli na voljo tega agresivnega seva Foc TR4, tako da so delali raziskave na manj agresivnem Foc R1. Najprej so raziskali, kateri geni so sploh povezani s patogenostjo. Ker so še vedno hoteli pripraviti RNAi za agresivnejši sev, so primerjali izbrane gene in iskali tiste z najvišjo homologijo, tako da bi se lahko apliciralo v obeh primerih. Na ta način so prišli do štirih genov (SGE1, ERG11, Velvet in SIX1). Ti so odgovorni za nastanek bolezni pri bananah, kjer pride do sinteze sekundarnih virulenčnih metabolitov (fumonizini in fuzarini) in venenja. Računalniško so nato pripravili zaporedja za vstavitev v vektorje in pripravo dsRNA. Za izgradnjo dsRNA so uporabljali spletni program E-RNAi, ki je primeren za oblikovanje in evaluacijo dsRNA. Izbrali so si 21 nukleotidov dolga zaporedja, ki se nahajajo nekje na sredini samih eksonov.
Za pridobitev samih tarčnih zaporedij je bilo potrebno izolirati mRNA iz gliv in za to so uporabili začetne oligonukleotide s previsnimi konci, ki so vsebovali zaporedja za kasnejše rezanje z restriktazami BgIII in KpnI, za kateri mesta vsebuje tudi izboljšanim vektorjem L4440. Za pomnoževanje vključkov in vektorja so uporabili bakterijski sev DH5α. Z T4 ligazo so oba dela združili, transformirali sev TH115 s toplotnim šokom in inducirali proizvodnjo dsRNA z dodatkom IPTGja[1,3].

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

Dostava in sproščanje dsRNA je precej odvisno od QS, ta pa je precej odvisen od lux promotorja, saj so pod njegovo kontrolo lizni proteini in dsRNA. Tokrat so zamenjali dsRNA z GFP in tako merili fluorescenco. Na ta način so dobili še kvantitativne podatke o delovanju lux promotorja, hkrati pa so z primerjavo z računalniškim modelom dobili precejšno ujemanje. Iz samih grafičnih rezultatov pa so dobili parametre kot so Kd, Hillov koeficient in bazalno izražanje pa so lahko nato optimizirali model[1].

Za pripravo vektorja so uporabili metodo golden gate na treh nivojih. Najprej so povezali dva dela, ki sta bila že predhodno pripravljena v registru in sicer transkripcijski model za izražanje GFP pod lux promotorjem in transkripcijski model za konstitutivno izražanje luxR gena. Ločeno so potem pripravili še dve transkripcijski enoti in ju povezali med seboj in sicer transkripcijsko enoto za konstitutivno izražanje luxI gena in transkripcijsko enoto za izražanje liznega proteina phiX174 pod lux promotorjem. Posamezni združeni transkripcijski enoti z dvema deloma so nato združili v končni model, ki vsebuje štiri enote[1].

'''Sistem utišanja tarčnih genov'''

Uspešno pripravljeno dsRNA so na koncu izolirali in izvedli inhibicijski test, kjer so dodajali fungicid različnih koncentracij k sporam gliv in na koncu merili koncentracijo konidij, ki so se razvile v odsotnosti in prisotnosti dsRNA. Na ta način so določili tudi ustrezno koncentracijo dsRNA, ki je potrebno za preprečitev rasti[1].

==UPORABNIKI==

V tem konkretnem primeru bi bil fungicid uporaben za podjetja, ki proizvajajo banane – teh je kar 464 v Ekvadorju, seveda pa bi lahko uporabljali tudi v drugih državah. Pripravili so tudi načrt, kako točno in na katerih predelih polj bi bilo koristno uporabljati fungicid, da ga ne bi preveč.
Bolj splošen cilj pa je priprava platforme, ki bi bila uporabna za različne sintezne biologe, ki bi jim olajšala pripravo različnih fungicidov tako da bi lahko predvideli rezultate in s tem zmanjšali nepotrebne in vivo poskuse[1].

==VIRI==
[1] Team Ecuador, iGEM 2021, Agrobactory593; dostopno na: https://2021.igem.org/Team:Ecuador (pridobljeno dne 09.05.2022)

[2] Richard W Carthew and Erik J Sontheimer. Origins and mechanisms of mirnas and sirnas. Cell, 136(4):642–655, 2009.

[3] V. Gurdaswani, S. B. Ghag, y T. R. Ganapathi, “FocSge1 in Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 1 is essential for full virulence”, BMC Microbiology, vol. 20, núm. 1, p. 255, ago. 2020, doi: 10.1186/s12866-020-01936-y

Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidov

2022-05-10T09:26:16Z

Nograsek147:

Agrobactory 593 je projekt skupine Ecuador, ki je leta 2021 sodelovala na tekmovanju iGEM in zasedla 3-10. mesto v kategoriji Hrana in prehrana. Njihov glavni namen je bil pripraviti bakterijsko platformo za proizvodnjo specifičnih biopesticidev. Samo princip delovanja so prikazali na primeru fungicida na podlagi siRNA za zaščito bananovcev.

Spletna stran projekta Agrobactory 593: https://2021.igem.org/Team:Ecuador

==PROBLEM==
Agrikultura je za državo kot je Ekvador pomemben faktor, ki omogoča samooskrbo, delovna mesta in produkte za izvoz v svet. Predstavlja kar 4% svetovnega in 8 % državnega BDP. Delovna mesta pa daje slabi tretjini prebivalstva.
Velik problem pa pri tem predstavljajo različne rastlinske bolezni, ki lahko privedejo do izredno visokih izgub, kar ne vpliva le na gospodarstvo, ampak tudi na okolje in zdravje ljudi.
Ekvador je glavni izvoznik banan na svetovni trg, kar 22% celotne svetovne trgovine. Obstaja pa kvasovka, ki preprečuje, da bi bil ta promet še večji. Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FocR4T) je škodljivec, ki napade banane iz družine Musaceae in spada med najhujše povzročitelje bolezni v zgodovini agrikulture, ki povzroča milijonske izgube na plantažah banan[1].

==IDEJA==
Skupina Ecuador je iskala nove rešitve, kako pripraviti fungicid proti glivi FocR4T, hkrati pa so projekt zastavili še nekoliko širše in hoteli pripraviti platformo, ki bi omogočila pripravo biopesticidev.Ti bi lahko bili specifični za različne patogene mikroorganizme. Tako je nastala modularna bakterijska platforma Agrobactory 593.
Projekt predstavlja več možnih rešitev v obliki nizkocenovnih biopesticidov na osnovi dvoverižne RNA, ki kasneje s tehnologijo RNAi zavira delovanje fungov. Prvotno so bili poskusi in vitro izvedeni na primeru glive Foc R1 (manj patogena in na voljo), vendar enako deluje tudi pri FocR4T. Osnovni princip pa omogoča preprosto spreminjanje tarčnega patogena, količino biopesticida, uporablja pa se lahko tudi različne bakterijske šasije za dostavo RNAi. Na ta način bi lahko enostavno pripravljali različne biopesticide prilagojene za različne potrebe kmetov[1].

==NAČRT==
Najprej so pripravili celoten model in uporabili ODE (ordinary differential equations) sistem za predvidenje samih rezultatov, kasneje pa so izvedli tudi in vitro eksperimente. Celoten sistem deluje na DBTL princip, kjer si najprej zamislijo model, potem ga pripravijo, nato preizkusijo in na koncu poskušajo optimizirati primarni model za boljše rezultate[1].

===MODEL===
'''Sinteza dsRNA'''

Preden so šli na pripravo fungicida za Foc R4T so pripravili splošen model. Namen je bil pripraviti dsRNA, zato so se odločili pripraviti vektor, ki bo vseboval T7 promotor na obeh straneh tarčnega gena, tako da bi lahko dobili posamične ssRNA, ki bi se nato združile v dsRNA. Zaradi izbranega promotorja so vzeli tudi primerno šasijo in sicer E. coli seva HT115, ki vsebuj zapis za T7 polimerazo. Omenjeni encim je v bakteriji pod nadzorom Lac operona. Ta je represiran s strani LacI, gen za katerega se prav tako nahaja na kromosomu bakterije. LacI v bakteriji dimerizira in se veže na lac operon. Ob dodatku IPTGja v gojišče, se ta veže na LacI in tako prepreči vezavo, hkrati pa omogoči sintezo T7 polimeraze[1].

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

Prva možnost je, da bi dsRNA izolirali iz bakterij in nato injicirali direktno v rastline. Tako bi preprečili rast gliv, hkrati pa ne bi imelo negativnega učinka na rastlino, saj rastline, predvsem bananovci, nimajo nobenega tarčnega zapisa v kromosomih.
Druga možnost, na katero so se bolj osredotočili in se jim je zdela tudi bolj primerna pa je dodatek bakterij h koreninam rastlin in ob lizi bakterij pride do sprostitve dsRNA. Tako so pripravili tudi model za nadzorovano liziranje bakterij, ki je povezano z gostoto celic. Pri sproščanju dsRNA iz celic uporabljajo sistem quorum sensing (QS), kjer posredno izkoriščajo gostoto celic in koncentracijo AHL za transkripcijo gena, ki je odgovoren za lizo celic. Znotraj celic poteka sinteza AHL pod kontrolo LuxI molekul. Ti so pod konstitutivnim promotorjem, ki skrbi za stalno izražanje, LuxI pa vsebuje zapis za AHL sintazo in posledično za proizvodnjo znotrajceličnega AHL. Pri večanju gostote celic, se sprošča tudi več AHL molekul, ki lahko prehajajo membrano. AHL prisoten znotraj celic se veže na LuxR molekule. Te so podobno kot LuxI pod kontrolo konstitutivnega promotorja. Ob vezavi AHL pride do dimerizacije in inhibicije vezave LuxR na lux promotor. S tem omogočimo prepis gena za lux promotorjem, kar so poimenovali ON stanje. V njihovem primeru vsebuje gen zapis za lizne proteine, ki privedejo do lize celice, s tem pa sprostitve dsRNA, ki se vzporedno proizvaja. Ko pride do dovolj visoke koncentracije za lizo celic, te razpadejo. Z razpadom celic se zniža tudi koncentracija AHL v okolici in liznih proteinov, kar omogoči ponovno rast in razmnoževanje preostalih celic. To so poimenovali OFF stanje. Tako dobimo oscilirajoči sistem, ki skrbi da ne pride do prevelikega razmnoževanja bakterij, ko jih uporabimo kot fungicid[1].

'''Sistem utišanja tarčnih genov'''

Izločena dsRNA se izloči v okolico korenin bananovcev, kjer se nahaja zajedavska gliva. Ta preide v celice, kjer se izraža tarčna mRNA. S tem ko imamo dsRNA v celici, ta izkoristi celični sistem DICER za razgradnjo na siRNA velikosti nekje med 20-23 bp, nato pa ob prisotnosti AGO proteinov še tvorbo RISC kompleksa. siRNA znotraj kompleksa prepozna tarčno mRNA in se veže nanjo. Kompleks jo nato razgradi in prepreči njeno izražanje. Do proizvodnje siRNA pride samo v primeru, če je prisotna tarčna mRNA, drugače ostane v dvoverižni obliki. Pri različnih vrstah gliv pa je lahko sama količina siRNA še pomnožena zahvaljujoč sistemu RRP (RNA-odvisna RNA polimeraza), ki tako samo še poveča inhibitorski odgovor. Pri tem lahko nastane problem, ker nam ta sistem lahko pomnoži tudi predele mRNA, na katero je vezana RNAi, s tem pa izgubimo specifičnost in lahko pride do inhibicije drugih zaporedij[1,2].

Vsi ti modeli so bili predstavljeni v obliki matematičnih enačb, ki so jih nato pretvorili v osnovne diferencialne enačbe. Pri tem so upoštevali znane podatke o hitrostih, konstantah in koncentracijah posameznih elementov. Modeli so razdeljeni na zgornje tri nivoje, na koncu pa so dobili predlagan celoten mehanizem od začetka do konca. Posamezne parametre so že sami vmes optimizirali z vmesnimi poskusi. Nato so se lotili še dejanskega eksperimenta za evaluacijo njihovega modela[1].

===EKSPERIMENT===
'''Sinteza dsRNA'''

Pri dejanskem eksperimentu so si pomagali z že znanimi podatki, saj niso imeli na voljo tega agresivnega seva Foc TR4, tako da so delali raziskave na manj agresivnem Foc R1. Najprej so raziskali, kateri geni so sploh povezani s patogenostjo. Ker so še vedno hoteli pripraviti RNAi za agresivnejši sev, so primerjali izbrane gene in iskali tiste z najvišjo homologijo, tako da bi se lahko apliciralo v obeh primerih. Na ta način so prišli do štirih genov (SGE1, ERG11, Velvet in SIX1). Ti so odgovorni za nastanek bolezni pri bananah, kjer pride do sinteze sekundarnih virulenčnih metabolitov (fumonizini in fuzarini) in venenja. Računalniško so nato pripravili zaporedja za vstavitev v vektorje in pripravo dsRNA. Za izgradnjo dsRNA so uporabljali spletni program E-RNAi, ki je primeren za oblikovanje in evaluacijo dsRNA. Izbrali so si 21 nukleotidov dolga zaporedja, ki se nahajajo nekje na sredini samih eksonov.
Za pridobitev samih tarčnih zaporedij je bilo potrebno izolirati mRNA iz gliv in za to so uporabili začetne oligonukleotide s previsnimi konci, ki so vsebovali zaporedja za kasnejše rezanje z restriktazami BgIII in KpnI, za kateri mesta vsebuje tudi izboljšanim vektorjem L4440. Za pomnoževanje vključkov in vektorja so uporabili bakterijski sev DH5α. Z T4 ligazo so oba dela združili, transformirali sev TH115 s toplotnim šokom in inducirali proizvodnjo dsRNA z dodatkom IPTGja[1,3].

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

Dostava in sproščanje dsRNA je precej odvisno od QS, ta pa je precej odvisen od lux promotorja, saj so pod njegovo kontrolo lizni proteini in dsRNA. Tokrat so zamenjali dsRNA z GFP in tako merili fluorescenco. Na ta način so dobili še kvantitativne podatke o delovanju lux promotorja, hkrati pa so z primerjavo z računalniškim modelom dobili precejšno ujemanje. Iz samih grafičnih rezultatov pa so dobili parametre kot so Kd, Hillov koeficient in bazalno izražanje pa so lahko nato optimizirali model[1].

Za pripravo vektorja so uporabili metodo golden gate na treh nivojih. Najprej so povezali dva dela, ki sta bila že predhodno pripravljena v registru in sicer transkripcijski model za izražanje GFP pod lux promotorjem in transkripcijski model za konstitutivno izražanje luxR gena. Ločeno so potem pripravili še dve transkripcijski enoti in ju povezali med seboj in sicer transkripcijsko enoto za konstitutivno izražanje luxI gena in transkripcijsko enoto za izražanje liznega proteina phiX174 pod lux promotorjem. Posamezni združeni transkripcijski enoti z dvema deloma so nato združili v končni model, ki vsebuje štiri enote[1].

'''Sistem utišanja tarčnih genov'''

Uspešno pripravljeno dsRNA so na koncu izolirali in izvedli inhibicijski test, kjer so dodajali fungicid različnih koncentracij k sporam gliv in na koncu merili koncentracijo konidij, ki so se razvile v odsotnosti in prisotnosti dsRNA. Na ta način so določili tudi ustrezno koncentracijo dsRNA, ki je potrebno za preprečitev rasti[1].

==UPORABNIKI==

V tem konkretnem primeru bi bil fungicid uporaben za podjetja, ki proizvajajo banane – teh je kar 464 v Ekvadorju, seveda pa bi lahko uporabljali tudi v drugih državah. Pripravili so tudi načrt, kako točno in na katerih predelih polj bi bilo koristno uporabljati fungicid, da ga ne bi preveč.
Bolj splošen cilj pa je priprava platforme, ki bi bila uporabna za različne sintezne biologe, ki bi jim olajšala pripravo različnih fungicidov tako da bi lahko predvideli rezultate in s tem zmanjšali nepotrebne in vivo poskuse[1].

==VIRI==
[1] Team Ecuador, iGEM 2021, Agrobactory593; dostopno na: https://2021.igem.org/Team:Ecuador (pridobljeno dne 09.05.2022)

[2] Richard W Carthew and Erik J Sontheimer. Origins and mechanisms of mirnas and sirnas. Cell, 136(4):642–655, 2009.

[3] V. Gurdaswani, S. B. Ghag, y T. R. Ganapathi, “FocSge1 in Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 1 is essential for full virulence”, BMC Microbiology, vol. 20, núm. 1, p. 255, ago. 2020, doi: 10.1186/s12866-020-01936-y

Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidov

2022-05-09T21:40:06Z

Nograsek147:

Agrobactory 593 je projekt skupine Ecuador, ki je leta 2021 sodelovala na tekmovanju iGEM in zasedla 3-10. mesto v kategoriji Hrana in prehrana. Njihov glavni namen je bil pripraviti bakterijsko platformo za proizvodnjo specifičnih biopesticidev. Samo princip delovanja so prikazali na primeru fungicida na podlagi siRNA za zaščito bananovcev.

Spletna stran projekta Agrobactory 593: https://2021.igem.org/Team:Ecuador

==PROBLEM==
Agrikultura je za državo kot je Ekvador pomemben faktor, ki omogoča samooskrbo, delovna mesta in produkte za izvoz v svet. Predstavlja kar 4% svetovnega in 8 % državnega BDP. Delovna mesta pa daje slabi tretjini prebivalstva.
Velik problem pa pri tem predstavljajo različne rastlinske bolezni, ki lahko privedejo do izredno visokih izgub, kar ne vpliva le na gospodarstvo, ampak tudi na okolje in zdravje ljudi.
Ekvador je glavni izvoznik banan na svetovni trg, kar 22% celotne svetovne trgovine. Obstaja pa kvasovka, ki preprečuje, da bi bil ta promet še večji. Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FocR4T) je škodljivec, ki napade banane iz družine Musaceae in spada med najhujše povzročitelje bolezni v zgodovini agrikulture, ki povzroča milijonske izgube na plantažah banan[1].

==IDEJA==
Skupina Ecuador je iskala nove rešitve, kako pripraviti fungicid proti glivi FocR4T, hkrati pa so projekt zastavili še nekoliko širše in hoteli pripraviti platformo, ki bi omogočila pripravo biopesticidev.Ti bi lahko bili specifični za različne patogene mikroorganizme. Tako je nastala modularna bakterijska platforma Agrobactory 593.
Projekt predstavlja več možnih rešitev v obliki nizkocenovnih biopesticidov na osnovi dvoverižne RNA, ki kasneje s tehnologijo RNAi zavira delovanje fungov. Prvotno so bili poskusi in vitro izvedeni na primeru glive Foc R1 (manj patogena in na voljo), vendar enako deluje tudi pri FocR4T. Osnovni princip pa omogoča preprosto spreminjanje tarčnega patogena, količino biopesticida, uporablja pa se lahko tudi različne bakterijske šasije za dostavo RNAi. Na ta način bi lahko enostavno pripravljali različne biopesticide prilagojene za različne potrebe kmetov[1].

==NAČRT==
Najprej so pripravili celoten model in uporabili ODE (ordinary differential equations) sistem za predvidenje samih rezultatov, kasneje pa so izvedli tudi in vitro eksperimente. Celoten sistem deluje na DBTL princip, kjer si najprej zamislijo model, potem ga pripravijo, nato preizkusijo in na koncu poskušajo optimizirati primarni model za boljše rezultate[1].

===MODEL===
'''Sinteza dsRNA'''

Preden so šli na pripravo fungicida za Foc R4T so pripravili splošen model. Namen je bil pripraviti dsRNA, zato so se odločili pripraviti vektor, ki bo vseboval T7 promotor na obeh straneh tarčnega gena, tako da bi lahko dobili posamične ssRNA, ki bi se nato združile v dsRNA. Zaradi izbranega promotorja so vzeli tudi primerno šasijo in sicer E. coli seva HT115, ki vsebuj zapis za T7 polimerazo. Omenjeni encim je v bakteriji pod nadzorom Lac operona. Ta je represiran s strani LacI, gen za katerega se prav tako nahaja na kromosomu bakterije. LacI v bakteriji dimerizira in se veže na lac operon. Ob dodatku IPTGja v gojišče, se ta veže na LacI in tako prepreči vezavo, hkrati pa omogoči sintezo T7 polimeraze[1].

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

Prva možnost je, da bi dsRNA izolirali iz bakterij in nato injicirali direktno v rastline. Tako bi preprečili rast gliv, hkrati pa ne bi imelo negativnega učinka na rastlino, saj rastline, predvsem bananovci, nimajo nobenega tarčnega zapisa v kromosomih.
Druga možnost, na katero so se bolj osredotočili in se jim je zdela tudi bolj primerna pa je dodatek bakterij h koreninam rastlin in ob lizi bakterij pride do sprostitve dsRNA. Tako so pripravili tudi model za nadzorovano liziranje bakterij, ki je povezano z gostoto celic. Pri sproščanju dsRNA iz celic uporabljajo sistem quorum sensing (QS), kjer posredno izkoriščajo gostoto celic in koncentracijo AHL za transkripcijo gena, ki je odgovoren za lizo celic. Znotraj celic poteka sinteza AHL pod kontrolo LuxI molekul. Ti so pod konstitutivnim promotorjem, ki skrbi za stalno izražanje, LuxI pa vsebuje zapis za AHL sintazo in posledično za proizvodnjo znotrajceličnega AHL. Pri večanju gostote celic, se sprošča tudi več AHL molekul, ki lahko prehajajo membrano. AHL prisoten znotraj celic se veže na LuxR molekule. Te so podobno kot LuxI pod kontrolo konstitutivnega promotorja in delujejo kot represor za lux promotor. Ob vezavi AHL pride do dimerizacije in inhibicije vezave LuxR na lux promotor. S tem omogočimo prepis gena za lux promotorjem, kar so poimenovali ON stanje. V njihovem primeru vsebuje gen zapis za lizne proteine, ki privedejo do lize celice, s tem pa sprostitve dsRNA, ki se vzporedno proizvaja. Ko pride do dovolj visoke koncentracije za lizo celic, te razpadejo. Z razpadom celic se zniža tudi koncentracija AHL v okolici in liznih proteinov, kar omogoči ponovno rast in razmnoževanje preostalih celic. To so poimenovali OFF stanje. Tako dobimo oscilirajoči sistem, ki skrbi da ne pride do prevelikega razmnoževanja bakterij, ko jih uporabimo kot fungicid[1].

'''Sistem utišanja tarčnih genov'''

Izločena dsRNA se izloči v okolico korenin bananovcev, kjer se nahaja zajedavska gliva. Ta preide v celice, kjer se izraža tarčna mRNA. S tem ko imamo dsRNA v celici, ta izkoristi celični sistem DICER za razgradnjo na siRNA velikosti nekje med 20-23 bp, nato pa ob prisotnosti AGO proteinov še tvorbo RISC kompleksa. siRNA znotraj kompleksa prepozna tarčno mRNA in se veže nanjo. Kompleks jo nato razgradi in prepreči njeno izražanje. Do proizvodnje siRNA pride samo v primeru, če je prisotna tarčna mRNA, drugače ostane v dvoverižni obliki. Pri različnih vrstah gliv pa je lahko sama količina siRNA še pomnožena zahvaljujoč sistemu RRP (RNA-odvisna RNA polimeraza), ki tako samo še poveča inhibitorski odgovor. Pri tem lahko nastane problem, ker nam ta sistem lahko pomnoži tudi predele mRNA, na katero je vezana RNAi, s tem pa izgubimo specifičnost in lahko pride do inhibicije drugih zaporedij[1,2].

Vsi ti modeli so bili predstavljeni v obliki matematičnih enačb, ki so jih nato pretvorili v osnovne diferencialne enačbe. Pri tem so upoštevali znane podatke o hitrostih, konstantah in koncentracijah posameznih elementov. Modeli so razdeljeni na zgornje tri nivoje, na koncu pa so dobili predlagan celoten mehanizem od začetka do konca. Posamezne parametre so že sami vmes optimizirali z vmesnimi poskusi. Nato so se lotili še dejanskega eksperimenta za evaluacijo njihovega modela[1].

===EKSPERIMENT===
'''Sinteza dsRNA'''

Pri dejanskem eksperimentu so si pomagali z že znanimi podatki, saj niso imeli na voljo tega agresivnega seva Foc TR4, tako da so delali raziskave na manj agresivnem Foc R1. Najprej so raziskali, kateri geni so sploh povezani s patogenostjo. Ker so še vedno hoteli pripraviti RNAi za agresivnejši sev, so primerjali izbrane gene in iskali tiste z najvišjo homologijo, tako da bi se lahko apliciralo v obeh primerih. Na ta način so prišli do štirih genov (SGE1, ERG11, Velvet in SIX1). Ti so odgovorni za nastanek bolezni pri bananah, kjer pride do sinteze sekundarnih virulenčnih metabolitov (fumonizini in fuzarini) in venenja. Računalniško so nato pripravili zaporedja za vstavitev v vektorje in pripravo dsRNA. Za izgradnjo dsRNA so uporabljali spletni program E-RNAi, ki je primeren za oblikovanje in evaluacijo dsRNA. Izbrali so si 21 nukleotidov dolga zaporedja, ki se nahajajo nekje na sredini samih eksonov.
Za pridobitev samih tarčnih zaporedij je bilo potrebno izolirati mRNA iz gliv in za to so uporabili začetne oligonukleotide s previsnimi konci, ki so vsebovali zaporedja za kasnejše rezanje z restriktazami BgIII in KpnI, za kateri mesta vsebuje tudi izboljšanim vektorjem L4440. Za pomnoževanje vključkov in vektorja so uporabili bakterijski sev DH5α. Z T4 ligazo so oba dela združili, transformirali sev TH115 s toplotnim šokom in inducirali proizvodnjo dsRNA z dodatkom IPTGja[1,3].

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

Dostava in sproščanje dsRNA je precej odvisno od QS, ta pa je precej odvisen od lux promotorja, saj so pod njegovo kontrolo lizni proteini in dsRNA. Tokrat so zamenjali dsRNA z GFP in tako merili fluorescenco. Na ta način so dobili še kvantitativne podatke o delovanju lux promotorja, hkrati pa so z primerjavo z računalniškim modelom dobili precejšno ujemanje. Iz samih grafičnih rezultatov pa so dobili parametre kot so Kd, Hillov koeficient in bazalno izražanje pa so lahko nato optimizirali model[1].

Za pripravo vektorja so uporabili metodo golden gate na treh nivojih. Najprej so povezali dva dela, ki sta bila že predhodno pripravljena v registru in sicer transkripcijski model za izražanje GFP pod lux promotorjem in transkripcijski model za konstitutivno izražanje luxR gena. Ločeno so potem pripravili še dve transkripcijski enoti in ju povezali med seboj in sicer transkripcijsko enoto za konstitutivno izražanje luxI gena in transkripcijsko enoto za izražanje liznega proteina phiX174 pod lux promotorjem. Posamezni združeni transkripcijski enoti z dvema deloma so nato združili v končni model, ki vsebuje štiri enote[1].

'''Sistem utišanja tarčnih genov'''

Uspešno pripravljeno dsRNA so na koncu izolirali in izvedli inhibicijski test, kjer so dodajali fungicid različnih koncentracij k sporam gliv in na koncu merili koncentracijo konidij, ki so se razvile v odsotnosti in prisotnosti dsRNA. Na ta način so določili tudi ustrezno koncentracijo dsRNA, ki je potrebno za preprečitev rasti[1].

==UPORABNIKI==

V tem konkretnem primeru bi bil fungicid uporaben za podjetja, ki proizvajajo banane – teh je kar 464 v Ekvadorju, seveda pa bi lahko uporabljali tudi v drugih državah. Pripravili so tudi načrt, kako točno in na katerih predelih polj bi bilo koristno uporabljati fungicid, da ga ne bi preveč.
Bolj splošen cilj pa je priprava platforme, ki bi bila uporabna za različne sintezne biologe, ki bi jim olajšala pripravo različnih fungicidov tako da bi lahko predvideli rezultate in s tem zmanjšali nepotrebne in vivo poskuse[1].

==VIRI==
[1] Team Ecuador, iGEM 2021, Agrobactory593; dostopno na: https://2021.igem.org/Team:Ecuador (pridobljeno dne 09.05.2022)

[2] Richard W Carthew and Erik J Sontheimer. Origins and mechanisms of mirnas and sirnas. Cell, 136(4):642–655, 2009.

[3] V. Gurdaswani, S. B. Ghag, y T. R. Ganapathi, “FocSge1 in Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 1 is essential for full virulence”, BMC Microbiology, vol. 20, núm. 1, p. 255, ago. 2020, doi: 10.1186/s12866-020-01936-y

Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidov

2022-05-09T21:39:10Z

Nograsek147:

Agrobactory 593 je projekt skupine Ecuador, ki je leta 2021 sodelovala na tekmovanju iGEM in zasedla 3-10. mesto v kategoriji Hrana in prehrana. Njihov glavni namen je bil pripraviti bakterijsko platformo za proizvodnjo specifičnih biopesticidev. Samo princip delovanja so prikazali na primeru fungicida na podlagi siRNA za zaščito bananovcev.

Spletna stran projekta Agrobactory 593: [https://2021.igem.org/Team:Ecuador]

==PROBLEM==
Agrikultura je za državo kot je Ekvador pomemben faktor, ki omogoča samooskrbo, delovna mesta in produkte za izvoz v svet. Predstavlja kar 4% svetovnega in 8 % državnega BDP. Delovna mesta pa daje slabi tretjini prebivalstva.
Velik problem pa pri tem predstavljajo različne rastlinske bolezni, ki lahko privedejo do izredno visokih izgub, kar ne vpliva le na gospodarstvo, ampak tudi na okolje in zdravje ljudi.
Ekvador je glavni izvoznik banan na svetovni trg, kar 22% celotne svetovne trgovine. Obstaja pa kvasovka, ki preprečuje, da bi bil ta promet še večji. Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FocR4T) je škodljivec, ki napade banane iz družine Musaceae in spada med najhujše povzročitelje bolezni v zgodovini agrikulture, ki povzroča milijonske izgube na plantažah banan[1].

==IDEJA==
Skupina Ecuador je iskala nove rešitve, kako pripraviti fungicid proti glivi FocR4T, hkrati pa so projekt zastavili še nekoliko širše in hoteli pripraviti platformo, ki bi omogočila pripravo biopesticidev.Ti bi lahko bili specifični za različne patogene mikroorganizme. Tako je nastala modularna bakterijska platforma Agrobactory 593.
Projekt predstavlja več možnih rešitev v obliki nizkocenovnih biopesticidov na osnovi dvoverižne RNA, ki kasneje s tehnologijo RNAi zavira delovanje fungov. Prvotno so bili poskusi in vitro izvedeni na primeru glive Foc R1 (manj patogena in na voljo), vendar enako deluje tudi pri FocR4T. Osnovni princip pa omogoča preprosto spreminjanje tarčnega patogena, količino biopesticida, uporablja pa se lahko tudi različne bakterijske šasije za dostavo RNAi. Na ta način bi lahko enostavno pripravljali različne biopesticide prilagojene za različne potrebe kmetov[1].

==NAČRT==
Najprej so pripravili celoten model in uporabili ODE (ordinary differential equations) sistem za predvidenje samih rezultatov, kasneje pa so izvedli tudi in vitro eksperimente. Celoten sistem deluje na DBTL princip, kjer si najprej zamislijo model, potem ga pripravijo, nato preizkusijo in na koncu poskušajo optimizirati primarni model za boljše rezultate[1].

===MODEL===
'''Sinteza dsRNA'''

Preden so šli na pripravo fungicida za Foc R4T so pripravili splošen model. Namen je bil pripraviti dsRNA, zato so se odločili pripraviti vektor, ki bo vseboval T7 promotor na obeh straneh tarčnega gena, tako da bi lahko dobili posamične ssRNA, ki bi se nato združile v dsRNA. Zaradi izbranega promotorja so vzeli tudi primerno šasijo in sicer E. coli seva HT115, ki vsebuj zapis za T7 polimerazo. Omenjeni encim je v bakteriji pod nadzorom Lac operona. Ta je represiran s strani LacI, gen za katerega se prav tako nahaja na kromosomu bakterije. LacI v bakteriji dimerizira in se veže na lac operon. Ob dodatku IPTGja v gojišče, se ta veže na LacI in tako prepreči vezavo, hkrati pa omogoči sintezo T7 polimeraze[1].

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

Prva možnost je, da bi dsRNA izolirali iz bakterij in nato injicirali direktno v rastline. Tako bi preprečili rast gliv, hkrati pa ne bi imelo negativnega učinka na rastlino, saj rastline, predvsem bananovci, nimajo nobenega tarčnega zapisa v kromosomih.
Druga možnost, na katero so se bolj osredotočili in se jim je zdela tudi bolj primerna pa je dodatek bakterij h koreninam rastlin in ob lizi bakterij pride do sprostitve dsRNA. Tako so pripravili tudi model za nadzorovano liziranje bakterij, ki je povezano z gostoto celic. Pri sproščanju dsRNA iz celic uporabljajo sistem quorum sensing (QS), kjer posredno izkoriščajo gostoto celic in koncentracijo AHL za transkripcijo gena, ki je odgovoren za lizo celic. Znotraj celic poteka sinteza AHL pod kontrolo LuxI molekul. Ti so pod konstitutivnim promotorjem, ki skrbi za stalno izražanje, LuxI pa vsebuje zapis za AHL sintazo in posledično za proizvodnjo znotrajceličnega AHL. Pri večanju gostote celic, se sprošča tudi več AHL molekul, ki lahko prehajajo membrano. AHL prisoten znotraj celic se veže na LuxR molekule. Te so podobno kot LuxI pod kontrolo konstitutivnega promotorja in delujejo kot represor za lux promotor. Ob vezavi AHL pride do dimerizacije in inhibicije vezave LuxR na lux promotor. S tem omogočimo prepis gena za lux promotorjem, kar so poimenovali ON stanje. V njihovem primeru vsebuje gen zapis za lizne proteine, ki privedejo do lize celice, s tem pa sprostitve dsRNA, ki se vzporedno proizvaja. Ko pride do dovolj visoke koncentracije za lizo celic, te razpadejo. Z razpadom celic se zniža tudi koncentracija AHL v okolici in liznih proteinov, kar omogoči ponovno rast in razmnoževanje preostalih celic. To so poimenovali OFF stanje. Tako dobimo oscilirajoči sistem, ki skrbi da ne pride do prevelikega razmnoževanja bakterij, ko jih uporabimo kot fungicid[1].

'''Sistem utišanja tarčnih genov'''

Izločena dsRNA se izloči v okolico korenin bananovcev, kjer se nahaja zajedavska gliva. Ta preide v celice, kjer se izraža tarčna mRNA. S tem ko imamo dsRNA v celici, ta izkoristi celični sistem DICER za razgradnjo na siRNA velikosti nekje med 20-23 bp, nato pa ob prisotnosti AGO proteinov še tvorbo RISC kompleksa. siRNA znotraj kompleksa prepozna tarčno mRNA in se veže nanjo. Kompleks jo nato razgradi in prepreči njeno izražanje. Do proizvodnje siRNA pride samo v primeru, če je prisotna tarčna mRNA, drugače ostane v dvoverižni obliki. Pri različnih vrstah gliv pa je lahko sama količina siRNA še pomnožena zahvaljujoč sistemu RRP (RNA-odvisna RNA polimeraza), ki tako samo še poveča inhibitorski odgovor. Pri tem lahko nastane problem, ker nam ta sistem lahko pomnoži tudi predele mRNA, na katero je vezana RNAi, s tem pa izgubimo specifičnost in lahko pride do inhibicije drugih zaporedij[1,2].

Vsi ti modeli so bili predstavljeni v obliki matematičnih enačb, ki so jih nato pretvorili v osnovne diferencialne enačbe. Pri tem so upoštevali znane podatke o hitrostih, konstantah in koncentracijah posameznih elementov. Modeli so razdeljeni na zgornje tri nivoje, na koncu pa so dobili predlagan celoten mehanizem od začetka do konca. Posamezne parametre so že sami vmes optimizirali z vmesnimi poskusi. Nato so se lotili še dejanskega eksperimenta za evaluacijo njihovega modela[1].

===EKSPERIMENT===
'''Sinteza dsRNA'''

Pri dejanskem eksperimentu so si pomagali z že znanimi podatki, saj niso imeli na voljo tega agresivnega seva Foc TR4, tako da so delali raziskave na manj agresivnem Foc R1. Najprej so raziskali, kateri geni so sploh povezani s patogenostjo. Ker so še vedno hoteli pripraviti RNAi za agresivnejši sev, so primerjali izbrane gene in iskali tiste z najvišjo homologijo, tako da bi se lahko apliciralo v obeh primerih. Na ta način so prišli do štirih genov (SGE1, ERG11, Velvet in SIX1). Ti so odgovorni za nastanek bolezni pri bananah, kjer pride do sinteze sekundarnih virulenčnih metabolitov (fumonizini in fuzarini) in venenja. Računalniško so nato pripravili zaporedja za vstavitev v vektorje in pripravo dsRNA. Za izgradnjo dsRNA so uporabljali spletni program E-RNAi, ki je primeren za oblikovanje in evaluacijo dsRNA. Izbrali so si 21 nukleotidov dolga zaporedja, ki se nahajajo nekje na sredini samih eksonov.
Za pridobitev samih tarčnih zaporedij je bilo potrebno izolirati mRNA iz gliv in za to so uporabili začetne oligonukleotide s previsnimi konci, ki so vsebovali zaporedja za kasnejše rezanje z restriktazami BgIII in KpnI, za kateri mesta vsebuje tudi izboljšanim vektorjem L4440. Za pomnoževanje vključkov in vektorja so uporabili bakterijski sev DH5α. Z T4 ligazo so oba dela združili, transformirali sev TH115 s toplotnim šokom in inducirali proizvodnjo dsRNA z dodatkom IPTGja[1,3].

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

Dostava in sproščanje dsRNA je precej odvisno od QS, ta pa je precej odvisen od lux promotorja, saj so pod njegovo kontrolo lizni proteini in dsRNA. Tokrat so zamenjali dsRNA z GFP in tako merili fluorescenco. Na ta način so dobili še kvantitativne podatke o delovanju lux promotorja, hkrati pa so z primerjavo z računalniškim modelom dobili precejšno ujemanje. Iz samih grafičnih rezultatov pa so dobili parametre kot so Kd, Hillov koeficient in bazalno izražanje pa so lahko nato optimizirali model[1].

Za pripravo vektorja so uporabili metodo golden gate na treh nivojih. Najprej so povezali dva dela, ki sta bila že predhodno pripravljena v registru in sicer transkripcijski model za izražanje GFP pod lux promotorjem in transkripcijski model za konstitutivno izražanje luxR gena. Ločeno so potem pripravili še dve transkripcijski enoti in ju povezali med seboj in sicer transkripcijsko enoto za konstitutivno izražanje luxI gena in transkripcijsko enoto za izražanje liznega proteina phiX174 pod lux promotorjem. Posamezni združeni transkripcijski enoti z dvema deloma so nato združili v končni model, ki vsebuje štiri enote[1].

'''Sistem utišanja tarčnih genov'''

Uspešno pripravljeno dsRNA so na koncu izolirali in izvedli inhibicijski test, kjer so dodajali fungicid različnih koncentracij k sporam gliv in na koncu merili koncentracijo konidij, ki so se razvile v odsotnosti in prisotnosti dsRNA. Na ta način so določili tudi ustrezno koncentracijo dsRNA, ki je potrebno za preprečitev rasti[1].

==UPORABNIKI==

V tem konkretnem primeru bi bil fungicid uporaben za podjetja, ki proizvajajo banane – teh je kar 464 v Ekvadorju, seveda pa bi lahko uporabljali tudi v drugih državah. Pripravili so tudi načrt, kako točno in na katerih predelih polj bi bilo koristno uporabljati fungicid, da ga ne bi preveč.
Bolj splošen cilj pa je priprava platforme, ki bi bila uporabna za različne sintezne biologe, ki bi jim olajšala pripravo različnih fungicidov tako da bi lahko predvideli rezultate in s tem zmanjšali nepotrebne in vivo poskuse[1].

==VIRI==
[1] Team Ecuador, iGEM 2021, Agrobactory593; dostopno na: https://2021.igem.org/Team:Ecuador (pridobljeno dne 09.05.2022)

[2] Richard W Carthew and Erik J Sontheimer. Origins and mechanisms of mirnas and sirnas. Cell, 136(4):642–655, 2009.

[3] V. Gurdaswani, S. B. Ghag, y T. R. Ganapathi, “FocSge1 in Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 1 is essential for full virulence”, BMC Microbiology, vol. 20, núm. 1, p. 255, ago. 2020, doi: 10.1186/s12866-020-01936-y

Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidov

2022-05-09T21:35:44Z

Nograsek147:

Agrobactory 593 je projekt skupine Ecuador, ki je leta 2021 sodelovala na tekmovanju iGEM in zasedla 3-10. mesto v kategoriji Hrana in prehrana. Njihov glavni namen je bil pripraviti bakterijsko platformo za proizvodnjo specifičnih biopesticidev. Samo princip delovanja so prikazali na primeru fungicida na podlagi siRNA za zaščito bananovcev.

Spletna stran projekta Agrobactory 593: [https://2021.igem.org/Team:Ecuador]

==PROBLEM==
Agrikultura je za državo kot je Ekvador pomemben faktor, ki omogoča samooskrbo, delovna mesta in produkte za izvoz v svet. Predstavlja kar 4% svetovnega in 8 % državnega BDP. Delovna mesta pa daje slabi tretjini prebivalstva.
Velik problem pa pri tem predstavljajo različne rastlinske bolezni, ki lahko privedejo do izredno visokih izgub, kar ne vpliva le na gospodarstvo, ampak tudi na okolje in zdravje ljudi.
Ekvador je glavni izvoznik banan na svetovni trg, kar 22% celotne svetovne trgovine. Obstaja pa kvasovka, ki preprečuje, da bi bil ta promet še večji. Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FocR4T) je škodljivec, ki napade banane iz družine Musaceae in spada med najhujše povzročitelje bolezni v zgodovini agrikulture, ki povzroča milijonske izgube na plantažah banan[1].

==IDEJA==
Skupina Ecuador je iskala nove rešitve, kako pripraviti fungicid proti glivi FocR4T, hkrati pa so projekt zastavili še nekoliko širše in hoteli pripraviti platformo, ki bi omogočila pripravo biopesticidev.Ti bi lahko bili specifični za različne patogene mikroorganizme. Tako je nastala modularna bakterijska platforma Agrobactory 593.
Projekt predstavlja več možnih rešitev v obliki nizkocenovnih biopesticidov na osnovi dvoverižne RNA, ki kasneje s tehnologijo RNAi zavira delovanje fungov. Prvotno so bili poskusi in vitro izvedeni na primeru glive Foc R1 (manj patogena in na voljo), vendar enako deluje tudi pri FocR4T. Osnovni princip pa omogoča preprosto spreminjanje tarčnega patogena, količino biopesticida, uporablja pa se lahko tudi različne bakterijske šasije za dostavo RNAi. Na ta način bi lahko enostavno pripravljali različne biopesticide prilagojene za različne potrebe kmetov[1].

==NAČRT==
Najprej so pripravili celoten model in uporabili ODE (ordinary differential equations) sistem za predvidenje samih rezultatov, kasneje pa so izvedli tudi in vitro eksperimente. Celoten sistem deluje na DBTL princip, kjer si najprej zamislijo model, potem ga pripravijo, nato preizkusijo in na koncu poskušajo optimizirati primarni model za boljše rezultate[1].

===MODEL===
'''Sinteza dsRNA'''

Preden so šli na pripravo fungicida za Foc R4T so pripravili splošen model. Namen je bil pripraviti dsRNA, zato so se odločili pripraviti vektor, ki bo vseboval T7 promotor na obeh straneh tarčnega gena, tako da bi lahko dobili posamične ssRNA, ki bi se nato združile v dsRNA. Zaradi izbranega promotorja so vzeli tudi primerno šasijo in sicer E. coli seva HT115, ki vsebuj zapis za T7 polimerazo. Omenjeni encim je v bakteriji pod nadzorom Lac operona. Ta je represiran s strani LacI, gen za katerega se prav tako nahaja na kromosomu bakterije. LacI v bakteriji dimerizira in se veže na lac operon. Ob dodatku IPTGja v gojišče, se ta veže na LacI in tako prepreči vezavo, hkrati pa omogoči sintezo T7 polimeraze[1].

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

Prva možnost je, da bi dsRNA izolirali iz bakterij in nato injicirali direktno v rastline. Tako bi preprečili rast gliv, hkrati pa ne bi imelo negativnega učinka na rastlino, saj rastline, predvsem bananovci, nimajo nobenega tarčnega zapisa v kromosomih.
Druga možnost, na katero so se bolj osredotočili in se jim je zdela tudi bolj primerna pa je dodatek bakterij h koreninam rastlin in ob lizi bakterij pride do sprostitve dsRNA. Tako so pripravili tudi model za nadzorovano liziranje bakterij, ki je povezano z gostoto celic. Pri sproščanju dsRNA iz celic uporabljajo sistem quorum sensing (QS), kjer posredno izkoriščajo gostoto celic in koncentracijo AHL za transkripcijo gena, ki je odgovoren za lizo celic. Znotraj celic poteka sinteza AHL pod kontrolo LuxI molekul. Ti so pod konstitutivnim promotorjem, ki skrbi za stalno izražanje, LuxI pa vsebuje zapis za AHL sintazo in posledično za proizvodnjo znotrajceličnega AHL. Pri večanju gostote celic, se sprošča tudi več AHL molekul, ki lahko prehajajo membrano. AHL prisoten znotraj celic se veže na LuxR molekule. Te so podobno kot LuxI pod kontrolo konstitutivnega promotorja in delujejo kot represor za lux promotor. Ob vezavi AHL pride do dimerizacije in inhibicije vezave LuxR na lux promotor. S tem omogočimo prepis gena za lux promotorjem, kar so poimenovali ON stanje. V njihovem primeru vsebuje gen zapis za lizne proteine, ki privedejo do lize celice, s tem pa sprostitve dsRNA, ki se vzporedno proizvaja. Ko pride do dovolj visoke koncentracije za lizo celic, te razpadejo. Z razpadom celic se zniža tudi koncentracija AHL v okolici in liznih proteinov, kar omogoči ponovno rast in razmnoževanje preostalih celic. To so poimenovali OFF stanje. Tako dobimo oscilirajoči sistem, ki skrbi da ne pride do prevelikega razmnoževanja bakterij, ko jih uporabimo kot fungicid[1].

'''Sistem utišanja tarčnih genov'''

Izločena dsRNA se izloči v okolico korenin bananovcev, kjer se nahaja zajedavska gliva. Ta preide v celice, kjer se izraža tarčna mRNA. S tem ko imamo dsRNA v celici, ta izkoristi celični sistem DICER za razgradnjo na siRNA velikosti nekje med 20-23 bp, nato pa ob prisotnosti AGO proteinov še tvorbo RISC kompleksa. siRNA znotraj kompleksa prepozna tarčno mRNA in se veže nanjo. Kompleks jo nato razgradi in prepreči njeno izražanje. Do proizvodnje siRNA pride samo v primeru, če je prisotna tarčna mRNA, drugače ostane v dvoverižni obliki. Pri različnih vrstah gliv pa je lahko sama količina siRNA še pomnožena zahvaljujoč sistemu RRP (RNA-odvisna RNA polimeraza), ki tako samo še poveča inhibitorski odgovor. Pri tem lahko nastane problem, ker nam ta sistem lahko pomnoži tudi predele mRNA, na katero je vezana RNAi, s tem pa izgubimo specifičnost in lahko pride do inhibicije drugih zaporedij[1,2].

Vsi ti modeli so bili predstavljeni v obliki matematičnih enačb, ki so jih nato pretvorili v osnovne diferencialne enačbe. Pri tem so upoštevali znane podatke o hitrostih, konstantah in koncentracijah posameznih elementov. Modeli so razdeljeni na zgornje tri nivoje, na koncu pa so dobili predlagan celoten mehanizem od začetka do konca. Posamezne parametre so že sami vmes optimizirali z vmesnimi poskusi. Nato so se lotili še dejanskega eksperimenta za evaluacijo njihovega modela[1].

===EKSPERIMENT===
'''Sinteza dsRNA'''

Pri dejanskem eksperimentu so si pomagali z že znanimi podatki, saj niso imeli na voljo tega agresivnega seva Foc TR4, tako da so delali raziskave na manj agresivnem Foc R1. Najprej so raziskali, kateri geni so sploh povezani s patogenostjo. Ker so še vedno hoteli pripraviti RNAi za agresivnejši sev, so primerjali izbrane gene in iskali tiste z najvišjo homologijo, tako da bi se lahko apliciralo v obeh primerih. Na ta način so prišli do štirih genov (SGE1, ERG11, Velvet in SIX1). Ti so odgovorni za nastanek bolezni pri bananah, kjer pride do sinteze sekundarnih virulenčnih metabolitov (fumonizini in fuzarini) in venenja. Računalniško so nato pripravili zaporedja za vstavitev v vektorje in pripravo dsRNA. Za izgradnjo dsRNA so uporabljali spletni program E-RNAi, ki je primeren za oblikovanje in evaluacijo dsRNA. Izbrali so si 21 nukleotidov dolga zaporedja, ki se nahajajo nekje na sredini samih eksonov.
Za pridobitev samih tarčnih zaporedij je bilo potrebno izolirati mRNA iz gliv in za to so uporabili začetne oligonukleotide s previsnimi konci, ki so vsebovali zaporedja za kasnejše rezanje z restriktazami BgIII in KpnI, za kateri mesta vsebuje tudi izboljšanim vektorjem L4440. Za pomnoževanje vključkov in vektorja so uporabili bakterijski sev DH5α. Z T4 ligazo so oba dela združili, transformirali sev TH115 s toplotnim šokom in inducirali proizvodnjo dsRNA z dodatkom IPTGja[1,3].

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

Dostava in sproščanje dsRNA je precej odvisno od QS, ta pa je precej odvisen od lux promotorja, saj so pod njegovo kontrolo lizni proteini in dsRNA. Tokrat so zamenjali dsRNA z GFP in tako merili fluorescenco. Na ta način so dobili še kvantitativne podatke o delovanju lux promotorja, hkrati pa so z primerjavo z računalniškim modelom dobili precejšno ujemanje. Iz samih grafičnih rezultatov pa so dobili parametre kot so Kd, Hillov koeficient in bazalno izražanje pa so lahko nato optimizirali model[1].

Za pripravo vektorja so uporabili metodo golden gate na treh nivojih. Najprej so povezali dva dela, ki sta bila že predhodno pripravljena v registru in sicer transkripcijski model za izražanje GFP pod lux promotorjem in transkripcijski model za konstitutivno izražanje luxR gena. Ločeno so potem pripravili še dve transkripcijski enoti in ju povezali med seboj in sicer transkripcijsko enoto za konstitutivno izražanje luxI gena in transkripcijsko enoto za izražanje liznega proteina phiX174 pod lux promotorjem. Posamezni združeni transkripcijski enoti z dvema deloma so nato združili v končni model, ki vsebuje štiri enote[1].

'''Sistem utišanja tarčnih genov'''

Uspešno pripravljeno dsRNA so na koncu izolirali in izvedli inhibicijski test, kjer so dodajali fungicid različnih koncentracij k sporam gliv in na koncu merili koncentracijo konidij, ki so se razvile v odsotnosti in prisotnosti dsRNA. Na ta način so določili tudi ustrezno koncentracijo dsRNA, ki je potrebno za preprečitev rasti[1].

==UPORABNIKI==

V tem konkretnem primeru bi bil fungicid uporaben za podjetja, ki proizvajajo banane – teh je kar 464 v Ekvadorju, seveda pa bi lahko uporabljali tudi v drugih državah. Pripravili so tudi načrt, kako točno in na katerih predelih polj bi bilo koristno uporabljati fungicid, da ga ne bi preveč.
Bolj splošen cilj pa je priprava platforme, ki bi bila uporabna za različne sintezne biologe, ki bi jim olajšala pripravo različnih fungicidov tako da bi lahko predvideli rezultate in s tem zmanjšali nepotrebne in vivo poskuse[1].

==VIRI==
[1] Team Ecuador, iGEM 2021, Agrobactory593 [https://2021.igem.org/Team:Ecuador] (pridobljeno dne 09.05.2022)

[2] Richard W Carthew and Erik J Sontheimer. Origins and mechanisms of mirnas and sirnas. Cell, 136(4):642–655, 2009.

[3] V. Gurdaswani, S. B. Ghag, y T. R. Ganapathi, “FocSge1 in Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 1 is essential for full virulence”, BMC Microbiology, vol. 20, núm. 1, p. 255, ago. 2020, doi: 10.1186/s12866-020-01936-y

Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidov

2022-05-09T21:28:22Z

Nograsek147:

Agrobactory 593 je projekt skupine Ecuador, ki je leta 2021 sodelovala na tekmovanju iGEM in zasedla 3-10. mesto v kategoriji Hrana in prehrana. Njihov glavni namen je bil pripraviti bakterijsko platformo za proizvodnjo specifičnih biopesticidev. Samo princip delovanja so prikazali na primeru fungicida na podlagi siRNA za zaščito bananovcev.

Spletna stran projekta Agrobactory 593: [https://2021.igem.org/Team:Ecuador]

==PROBLEM==
Agrikultura je za državo kot je Ekvador pomemben faktor, ki omogoča samooskrbo, delovna mesta in produkte za izvoz v svet. Predstavlja kar 4% svetovnega in 8 % državnega BDP. Delovna mesta pa daje slabi tretjini prebivalstva.
Velik problem pa pri tem predstavljajo različne rastlinske bolezni, ki lahko privedejo do izredno visokih izgub, kar ne vpliva le na gospodarstvo, ampak tudi na okolje in zdravje ljudi.
Ekvador je glavni izvoznik banan na svetovni trg, kar 22% celotne svetovne trgovine. Obstaja pa kvasovka, ki preprečuje, da bi bil ta promet še večji. Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FocR4T) je škodljivec, ki napade banane iz družine Musaceae in spada med najhujše povzročitelje bolezni v zgodovini agrikulture, ki povzroča milijonske izgube na plantažah banan[1].

==IDEJA==
Skupina Ecuador je iskala nove rešitve, kako pripraviti fungicid proti glivi FocR4T, hkrati pa so projekt zastavili še nekoliko širše in hoteli pripraviti platformo, ki bi omogočila pripravo biopesticidev.Ti bi lahko bili specifični za različne patogene mikroorganizme. Tako je nastala modularna bakterijska platforma Agrobactory 593.
Projekt predstavlja več možnih rešitev v obliki nizkocenovnih biopesticidov na osnovi dvoverižne RNA, ki kasneje s tehnologijo RNAi zavira delovanje fungov. Prvotno so bili poskusi in vitro izvedeni na primeru glive Foc R1 (manj patogena in na voljo), vendar enako deluje tudi pri FocR4T. Osnovni princip pa omogoča preprosto spreminjanje tarčnega patogena, količino biopesticida, uporablja pa se lahko tudi različne bakterijske šasije za dostavo RNAi. Na ta način bi lahko enostavno pripravljali različne biopesticide prilagojene za različne potrebe kmetov[1].

==NAČRT==
Najprej so pripravili celoten model in uporabili ODE (ordinary differential equations) sistem za predvidenje samih rezultatov, kasneje pa so izvedli tudi in vitro eksperimente. Celoten sistem deluje na DBTL princip, kjer si najprej zamislijo model, potem ga pripravijo, nato preizkusijo in na koncu poskušajo optimizirati primarni model za boljše rezultate[1].

===MODEL===
'''Sinteza dsRNA'''

Preden so šli na pripravo fungicida za Foc R4T so pripravili splošen model. Namen je bil pripraviti dsRNA, zato so se odločili pripraviti vektor, ki bo vseboval T7 promotor na obeh straneh tarčnega gena, tako da bi lahko dobili posamične ssRNA, ki bi se nato združile v dsRNA. Zaradi izbranega promotorja so vzeli tudi primerno šasijo in sicer E. coli seva HT115, ki vsebuj zapis za T7 polimerazo. Omenjeni encim je v bakteriji pod nadzorom Lac operona. Ta je represiran s strani LacI, gen za katerega se prav tako nahaja na kromosomu bakterije. LacI v bakteriji dimerizira in se veže na lac operon. Ob dodatku IPTGja v gojišče, se ta veže na LacI in tako prepreči vezavo, hkrati pa omogoči sintezo T7 polimeraze[1].

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

Prva možnost je, da bi dsRNA izolirali iz bakterij in nato injicirali direktno v rastline. Tako bi preprečili rast gliv, hkrati pa ne bi imelo negativnega učinka na rastlino, saj rastline, predvsem bananovci, nimajo nobenega tarčnega zapisa v kromosomih.
Druga možnost, na katero so se bolj osredotočili in se jim je zdela tudi bolj primerna pa je dodatek bakterij h koreninam rastlin in ob lizi bakterij pride do sprostitve dsRNA. Tako so pripravili tudi model za nadzorovano liziranje bakterij, ki je povezano z gostoto celic. Pri sproščanju dsRNA iz celic uporabljajo sistem quorum sensing, kjer posredno izkoriščajo gostoto celic in koncentracijo AHL za transkripcijo gena, ki je odgovoren za lizo celic. Znotraj celic poteka sinteza AHL pod kontrolo LuxI molekul. Ti so pod konstitutivnim promotorjem, ki skrbi za stalno izražanje, LuxI pa vsebuje zapis za AHL sintazo in posledično za proizvodnjo znotrajceličnega AHL. Pri večanju gostote celic, se sprošča tudi več AHL molekul, ki lahko prehajajo membrano. AHL prisoten znotraj celic se veže na LuxR molekule. Te so podobno kot LuxI pod kontrolo konstitutivnega promotorja in delujejo kot represor za lux promotor. Ob vezavi AHL pride do dimerizacije in inhibicije vezave LuxR na lux promotor. S tem omogočimo prepis gena za lux promotorjem, kar so poimenovali ON stanje. V njihovem primeru vsebuje gen zapis za lizne proteine, ki privedejo do lize celice, s tem pa sprostitve dsRNA, ki se vzporedno proizvaja. Ko pride do dovolj visoke koncentracije za lizo celic, te razpadejo. Z razpadom celic se zniža tudi koncentracija AHL v okolici in liznih proteinov, kar omogoči ponovno rast in razmnoževanje preostalih celic. To so poimenovali OFF stanje. Tako dobimo oscilirajoči sistem, ki skrbi da ne pride do prevelikega razmnoževanja bakterij, ko jih uporabimo kot fungicid[1].

'''Sistem utišanja tarčnih genov'''

Izločena dsRNA se izloči v okolico korenin bananovcev, kjer se nahaja zajedavska gliva. Ta preide v celice, kjer se izraža tarčna mRNA. S tem ko imamo dsRNA v celici, ta izkoristi celični sistem DICER za razgradnjo na siRNA velikosti nekje med 20-23 bp, nato pa ob prisotnosti AGO proteinov še tvorbo RISC kompleksa. siRNA znotraj kompleksa prepozna tarčno mRNA in se veže nanjo. Kompleks jo nato razgradi in prepreči njeno izražanje. Do proizvodnje siRNA pride samo v primeru, če je prisotna tarčna mRNA, drugače ostane v dvoverižni obliki. Pri različnih vrstah gliv pa je lahko sama količina siRNA še pomnožena zahvaljujoč sistemu RRP (RNA-odvisna RNA polimeraza), ki tako samo še poveča inhibitorski odgovor. Pri tem lahko nastane problem, ker nam ta sistem lahko pomnoži tudi predele mRNA, na katero je vezana RNAi, s tem pa izgubimo specifičnost in lahko pride do inhibicije drugih zaporedij[1,2].

Vsi ti modeli so bili predstavljeni v obliki matematičnih enačb, ki so jih nato pretvorili v osnovne diferencialne enačbe. Pri tem so upoštevali znane podatke o hitrostih, konstantah in koncentracijah posameznih elementov. Modeli so razdeljeni na zgornje tri nivoje, na koncu pa so dobili predlagan celoten mehanizem od začetka do konca. Posamezne parametre so že sami vmes optimizirali z vmesnimi poskusi. Nato so se lotili še dejanskega eksperimenta za evaluacijo njihovega modela[1].

===EKSPERIMENT===
'''Sinteza dsRNA'''

Pri dejanskem eksperimentu so si pomagali z že znanimi podatki, saj niso imeli na voljo tega agresivnega seva Foc TR4, tako da so delali raziskave na manj agresivnem Foc R1. Najprej so raziskali, kateri geni so sploh povezani s patogenostjo. Ker so še vedno hoteli pripraviti RNAi za agresivnejši sev, so primerjali izbrane gene in iskali tiste z najvišjo homologijo, tako da bi se lahko apliciralo v obeh primerih. Na ta način so prišli do štirih genov (SGE1, ERG11, Velvet in SIX1). Ti so odgovorni za nastanek bolezni pri bananah, kjer pride do sinteze sekundarnih virulenčnih metabolitov (fumonizini in fuzarini) in venenja. Računalniško so nato pripravili zaporedja za vstavitev v vektorje in pripravo dsRNA. Za izgradnjo dsRNA so uporabljali spletni program E-RNAi, ki je primeren za oblikovanje in evaluacijo dsRNA. Izbrali so si 21 nukleotidov dolga zaporedja, ki se nahajajo nekje na sredini samih eksonov.
Za pridobitev samih tarčnih zaporedij je bilo potrebno izolirati mRNA iz gliv in za to so uporabili začetne oligonukleotide s previsnimi konci, ki so vsebovali zaporedja za kasnejše rezanje z restriktazami BgIII in KpnI, za kateri mesta vsebuje tudi izboljšanim vektorjem L4440. Za pomnoževanje vključkov in vektorja so uporabili bakterijski sev DH5α. Z T4 ligazo so oba dela združili, transformirali sev TH115 s toplotnim šokom in inducirali proizvodnjo dsRNA z dodatkom IPTGja[1].

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

Dostava in sproščanje dsRNA je precej odvisno od QS, ta pa je precej odvisen od lux promotorja, saj so pod njegovo kontrolo lizni proteini in dsRNA. Tokrat so zamenjali dsRNA z GFP in tako merili fluorescenco. Na ta način so dobili še kvantitativne podatke o delovanju lux promotorja, hkrati pa so z primerjavo z računalniškim modelom dobili precejšno ujemanje. Iz samih grafičnih rezultatov pa so dobili parametre kot so Kd, Hillov koeficient in bazalno izražanje pa so lahko nato optimizirali model[1].

Za pripravo vektorja so uporabili metodo golden gate na treh nivojih. Najprej so povezali dva dela, ki sta bila že predhodno pripravljena v registru in sicer transkripcijski model za izražanje GFP pod lux promotorjem in transkripcijski model za konstitutivno izražanje luxR gena. Ločeno so potem pripravili še dve transkripcijski enoti in ju povezali med seboj in sicer transkripcijsko enoto za konstitutivno izražanje luxI gena in transkripcijsko enoto za izražanje liznega proteina phiX174 pod lux promotorjem. Posamezni združeni transkripcijski enoti z dvema deloma so nato združili v končni model, ki vsebuje štiri enote[1].

'''Sistem utišanja tarčnih genov'''

Uspešno pripravljeno dsRNA so na koncu izolirali in izvedli inhibicijski test, kjer so dodajali fungicid različnih koncentracij k sporam gliv in na koncu merili koncentracijo konidij, ki so se razvile v odsotnosti in prisotnosti dsRNA. Na ta način so določili tudi ustrezno koncentracijo dsRNA, ki je potrebno za preprečitev rasti[1].

==UPORABNIKI==

V tem konkretnem primeru bi bil fungicid uporaben za podjetja, ki proizvajajo banane – teh je kar 464 v Ekvadorju, seveda pa bi lahko uporabljali tudi v drugih državah. Pripravili so tudi načrt, kako točno in na katerih predelih polj bi bilo koristno uporabljati fungicid, da ga ne bi preveč.
Bolj splošen cilj pa je priprava platforme, ki bi bila uporabna za različne sintezne biologe, ki bi jim olajšala pripravo različnih fungicidov tako da bi lahko predvideli rezultate in s tem zmanjšali nepotrebne in vivo poskuse[1].

==VIRI==
[1] Team Ecuador, iGEM 2021, Agrobactory593 [https://2021.igem.org/Team:Ecuador] (pridobljeno dne 09.05.2022)

[2] R. W. Carthew, E. J. Sontheimer: Origins and Mechanisms of MiRNAs and SiRNAs. Cell 2009, 136, 642–655.

Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidov

2022-05-09T21:28:07Z

Nograsek147:

Agrobactory 593 je projekt skupine Ecuador, ki je leta 2021 sodelovala na tekmovanju iGEM in zasedla 3-10. mesto v kategoriji Hrana in prehrana. Njihov glavni namen je bil pripraviti bakterijsko platformo za proizvodnjo specifičnih biopesticidev. Samo princip delovanja so prikazali na primeru fungicida na podlagi siRNA za zaščito bananovcev.

Spletna stran projekta Agrobactory 593: [https://2021.igem.org/Team:Ecuador]

==PROBLEM==
Agrikultura je za državo kot je Ekvador pomemben faktor, ki omogoča samooskrbo, delovna mesta in produkte za izvoz v svet. Predstavlja kar 4% svetovnega in 8 % državnega BDP. Delovna mesta pa daje slabi tretjini prebivalstva.
Velik problem pa pri tem predstavljajo različne rastlinske bolezni, ki lahko privedejo do izredno visokih izgub, kar ne vpliva le na gospodarstvo, ampak tudi na okolje in zdravje ljudi.
Ekvador je glavni izvoznik banan na svetovni trg, kar 22% celotne svetovne trgovine. Obstaja pa kvasovka, ki preprečuje, da bi bil ta promet še večji. Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FocR4T) je škodljivec, ki napade banane iz družine Musaceae in spada med najhujše povzročitelje bolezni v zgodovini agrikulture, ki povzroča milijonske izgube na plantažah banan[1].

==IDEJA==
Skupina Ecuador je iskala nove rešitve, kako pripraviti fungicid proti glivi FocR4T, hkrati pa so projekt zastavili še nekoliko širše in hoteli pripraviti platformo, ki bi omogočila pripravo biopesticidev.Ti bi lahko bili specifični za različne patogene mikroorganizme. Tako je nastala modularna bakterijska platforma Agrobactory 593.
Projekt predstavlja več možnih rešitev v obliki nizkocenovnih biopesticidov na osnovi dvoverižne RNA, ki kasneje s tehnologijo RNAi zavira delovanje fungov. Prvotno so bili poskusi in vitro izvedeni na primeru glive Foc R1 (manj patogena in na voljo), vendar enako deluje tudi pri FocR4T. Osnovni princip pa omogoča preprosto spreminjanje tarčnega patogena, količino biopesticida, uporablja pa se lahko tudi različne bakterijske šasije za dostavo RNAi. Na ta način bi lahko enostavno pripravljali različne biopesticide prilagojene za različne potrebe kmetov[1].

==NAČRT==
Najprej so pripravili celoten model in uporabili ODE (ordinary differential equations) sistem za predvidenje samih rezultatov, kasneje pa so izvedli tudi in vitro eksperimente. Celoten sistem deluje na DBTL princip, kjer si najprej zamislijo model, potem ga pripravijo, nato preizkusijo in na koncu poskušajo optimizirati primarni model za boljše rezultate[1].

===MODEL===
'''Sinteza dsRNA'''

Preden so šli na pripravo fungicida za Foc R4T so pripravili splošen model. Namen je bil pripraviti dsRNA, zato so se odločili pripraviti vektor, ki bo vseboval T7 promotor na obeh straneh tarčnega gena, tako da bi lahko dobili posamične ssRNA, ki bi se nato združile v dsRNA. Zaradi izbranega promotorja so vzeli tudi primerno šasijo in sicer E. coli seva HT115, ki vsebuj zapis za T7 polimerazo. Omenjeni encim je v bakteriji pod nadzorom Lac operona. Ta je represiran s strani LacI, gen za katerega se prav tako nahaja na kromosomu bakterije. LacI v bakteriji dimerizira in se veže na lac operon. Ob dodatku IPTGja v gojišče, se ta veže na LacI in tako prepreči vezavo, hkrati pa omogoči sintezo T7 polimeraze[1].

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

Prva možnost je, da bi dsRNA izolirali iz bakterij in nato injicirali direktno v rastline. Tako bi preprečili rast gliv, hkrati pa ne bi imelo negativnega učinka na rastlino, saj rastline, predvsem bananovci, nimajo nobenega tarčnega zapisa v kromosomih.
Druga možnost, na katero so se bolj osredotočili in se jim je zdela tudi bolj primerna pa je dodatek bakterij h koreninam rastlin in ob lizi bakterij pride do sprostitve dsRNA. Tako so pripravili tudi model za nadzorovano liziranje bakterij, ki je povezano z gostoto celic. Pri sproščanju dsRNA iz celic uporabljajo sistem quorum sensing, kjer posredno izkoriščajo gostoto celic in koncentracijo AHL za transkripcijo gena, ki je odgovoren za lizo celic. Znotraj celic poteka sinteza AHL pod kontrolo LuxI molekul. Ti so pod konstitutivnim promotorjem, ki skrbi za stalno izražanje, LuxI pa vsebuje zapis za AHL sintazo in posledično za proizvodnjo znotrajceličnega AHL. Pri večanju gostote celic, se sprošča tudi več AHL molekul, ki lahko prehajajo membrano. AHL prisoten znotraj celic se veže na LuxR molekule. Te so podobno kot LuxI pod kontrolo konstitutivnega promotorja in delujejo kot represor za lux promotor. Ob vezavi AHL pride do dimerizacije in inhibicije vezave LuxR na lux promotor. S tem omogočimo prepis gena za lux promotorjem, kar so poimenovali ON stanje. V njihovem primeru vsebuje gen zapis za lizne proteine, ki privedejo do lize celice, s tem pa sprostitve dsRNA, ki se vzporedno proizvaja. Ko pride do dovolj visoke koncentracije za lizo celic, te razpadejo. Z razpadom celic se zniža tudi koncentracija AHL v okolici in liznih proteinov, kar omogoči ponovno rast in razmnoževanje preostalih celic. To so poimenovali OFF stanje. Tako dobimo oscilirajoči sistem, ki skrbi da ne pride do prevelikega razmnoževanja bakterij, ko jih uporabimo kot fungicid[1].

'''Sistem utišanja tarčnih genov'''

Izločena dsRNA se izloči v okolico korenin bananovcev, kjer se nahaja zajedavska gliva. Ta preide v celice, kjer se izraža tarčna mRNA. S tem ko imamo dsRNA v celici, ta izkoristi celični sistem DICER za razgradnjo na siRNA velikosti nekje med 20-23 bp, nato pa ob prisotnosti AGO proteinov še tvorbo RISC kompleksa. siRNA znotraj kompleksa prepozna tarčno mRNA in se veže nanjo. Kompleks jo nato razgradi in prepreči njeno izražanje. Do proizvodnje siRNA pride samo v primeru, če je prisotna tarčna mRNA, drugače ostane v dvoverižni obliki. Pri različnih vrstah gliv pa je lahko sama količina siRNA še pomnožena zahvaljujoč sistemu RRP (RNA-odvisna RNA polimeraza), ki tako samo še poveča inhibitorski odgovor. Pri tem lahko nastane problem, ker nam ta sistem lahko pomnoži tudi predele mRNA, na katero je vezana RNAi, s tem pa izgubimo specifičnost in lahko pride do inhibicije drugih zaporedij[1,2].

Vsi ti modeli so bili predstavljeni v obliki matematičnih enačb, ki so jih nato pretvorili v osnovne diferencialne enačbe. Pri tem so upoštevali znane podatke o hitrostih, konstantah in koncentracijah posameznih elementov. Modeli so razdeljeni na zgornje tri nivoje, na koncu pa so dobili predlagan celoten mehanizem od začetka do konca. Posamezne parametre so že sami vmes optimizirali z vmesnimi poskusi. Nato so se lotili še dejanskega eksperimenta za evaluacijo njihovega modela[1].

===EKSPERIMENT===
'''Sinteza dsRNA'''

Pri dejanskem eksperimentu so si pomagali z že znanimi podatki, saj niso imeli na voljo tega agresivnega seva Foc TR4, tako da so delali raziskave na manj agresivnem Foc R1. Najprej so raziskali, kateri geni so sploh povezani s patogenostjo. Ker so še vedno hoteli pripraviti RNAi za agresivnejši sev, so primerjali izbrane gene in iskali tiste z najvišjo homologijo, tako da bi se lahko apliciralo v obeh primerih. Na ta način so prišli do štirih genov (SGE1, ERG11, Velvet in SIX1). Ti so odgovorni za nastanek bolezni pri bananah, kjer pride do sinteze sekundarnih virulenčnih metabolitov (fumonizini in fuzarini) in venenja. Računalniško so nato pripravili zaporedja za vstavitev v vektorje in pripravo dsRNA. Za izgradnjo dsRNA so uporabljali spletni program E-RNAi, ki je primeren za oblikovanje in evaluacijo dsRNA. Izbrali so si 21 nukleotidov dolga zaporedja, ki se nahajajo nekje na sredini samih eksonov.
Za pridobitev samih tarčnih zaporedij je bilo potrebno izolirati mRNA iz gliv in za to so uporabili začetne oligonukleotide s previsnimi konci, ki so vsebovali zaporedja za kasnejše rezanje z restriktazami BgIII in KpnI, za kateri mesta vsebuje tudi izboljšanim vektorjem L4440. Za pomnoževanje vključkov in vektorja so uporabili bakterijski sev DH5α. Z T4 ligazo so oba dela združili, transformirali sev TH115 s toplotnim šokom in inducirali proizvodnjo dsRNA z dodatkom IPTGja[1].

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

Dostava in sproščanje dsRNA je precej odvisno od QS, ta pa je precej odvisen od lux promotorja, saj so pod njegovo kontrolo lizni proteini in dsRNA. Tokrat so zamenjali dsRNA z GFP in tako merili fluorescenco. Na ta način so dobili še kvantitativne podatke o delovanju lux promotorja, hkrati pa so z primerjavo z računalniškim modelom dobili precejšno ujemanje. Iz samih grafičnih rezultatov pa so dobili parametre kot so Kd, Hillov koeficient in bazalno izražanje pa so lahko nato optimizirali model[1].

Za pripravo vektorja so uporabili metodo golden gate na treh nivojih. Najprej so povezali dva dela, ki sta bila že predhodno pripravljena v registru in sicer transkripcijski model za izražanje GFP pod lux promotorjem in transkripcijski model za konstitutivno izražanje luxR gena. Ločeno so potem pripravili še dve transkripcijski enoti in ju povezali med seboj in sicer transkripcijsko enoto za konstitutivno izražanje luxI gena in transkripcijsko enoto za izražanje liznega proteina phiX174 pod lux promotorjem. Posamezni združeni transkripcijski enoti z dvema deloma so nato združili v končni model, ki vsebuje štiri enote[1].

'''Sistem utišanja tarčnih genov'''

Uspešno pripravljeno dsRNA so na koncu izolirali in izvedli inhibicijski test, kjer so dodajali fungicid različnih koncentracij k sporam gliv in na koncu merili koncentracijo konidij, ki so se razvile v odsotnosti in prisotnosti dsRNA. Na ta način so določili tudi ustrezno koncentracijo dsRNA, ki je potrebno za preprečitev rasti[1].

==UPORABNIKI==

V tem konkretnem primeru bi bil fungicid uporaben za podjetja, ki proizvajajo banane – teh je kar 464 v Ekvadorju, seveda pa bi lahko uporabljali tudi v drugih državah. Pripravili so tudi načrt, kako točno in na katerih predelih polj bi bilo koristno uporabljati fungicid, da ga ne bi preveč.
Bolj splošen cilj pa je priprava platforme, ki bi bila uporabna za različne sintezne biologe, ki bi jim olajšala pripravo različnih fungicidov tako da bi lahko predvideli rezultate in s tem zmanjšali nepotrebne in vivo poskuse[1].

==VIRI==
[1] Team Ecuador, iGEM 2021, Agrobactory593 [https://2021.igem.org/Team:Ecuador] (pridobljeno dne 09.05.2022)
[2] R. W. Carthew, E. J. Sontheimer: Origins and Mechanisms of MiRNAs and SiRNAs. Cell 2009, 136, 642–655.

Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidov

2022-05-09T20:35:34Z

Nograsek147:

Agrobactory 593 je projekt skupine Ecuador, ki je leta 2021 sodelovala na tekmovanju iGEM in zasedla 3-10. mesto v kategoriji Hrana in prehrana. Njihov glavni namen je bil pripraviti bakterijsko platformo za proizvodnjo specifičnih biopesticidev. Samo princip delovanja so prikazali na primeru fungicida na podlagi siRNA za zaščito bananovcev.

==PROBLEM==
Agrikultura je za državo kot je Ekvador pomemben faktor, ki omogoča samooskrbo, delovna mesta in produkte za izvoz v svet. Predstavlja kar 4% svetovnega in 8 % državnega BDP. Delovna mesta pa daje slabi tretjini prebivalstva.
Velik problem pa pri tem predstavljajo različne rastlinske bolezni, ki lahko privedejo do izredno visokih izgub, kar ne vpliva le na gospodarstvo, ampak tudi na okolje in zdravje ljudi.
Ekvador je glavni izvoznik banan na svetovni trg, kar 22% celotne svetovne trgovine. Obstaja pa kvasovka, ki preprečuje, da bi bil ta promet še večji. Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FocR4T) je škodljivec, ki napade banane iz družine Musaceae in spada med najhujše povzročitelje bolezni v zgodovini agrikulture, ki povzroča milijonske izgube na plantažah banan.

==IDEJA==
Skupina Ecuador je iskala nove rešitve, kako pripraviti fungicid proti glivi FocR4T, hkrati pa so projekt zastavili še nekoliko širše in hoteli pripraviti platformo, ki bi omogočila pripravo biopesticidev.Ti bi lahko bili specifični za različne patogene mikroorganizme. Tako je nastala modularna bakterijska platforma Agrobactory 593.
Projekt predstavlja več možnih rešitev v obliki nizkocenovnih biopesticidov na osnovi dvoverižne RNA, ki kasneje s tehnologijo RNAi zavira delovanje fungov. Prvotno so bili poskusi in vitro izvedeni na primeru glive Foc R1 (manj patogena in na voljo), vendar enako deluje tudi pri FocR4T. Osnovni princip pa omogoča preprosto spreminjanje tarčnega patogena, količino biopesticida, uporablja pa se lahko tudi različne bakterijske šasije za dostavo RNAi. Na ta način bi lahko enostavno pripravljali različne biopesticide prilagojene za različne potrebe kmetov.

==NAČRT==
Najprej so pripravili celoten model in uporabili ODE (ordinary differential equations) sistem za predvidenje samih rezultatov, kasneje pa so izvedli tudi in vitro eksperimente. Celoten sistem deluje na DBTL princip, kjer si najprej zamislijo model, potem ga pripravijo, nato preizkusijo in na koncu poskušajo optimizirati primarni model za boljše rezultate.

===MODEL===
'''Sinteza dsRNA'''

Preden so šli na pripravo fungicida za Foc R4T so pripravili splošen model. Namen je bil pripraviti dsRNA, zato so se odločili pripraviti vektor, ki bo vseboval T7 promotor na obeh straneh tarčnega gena, tako da bi lahko dobili posamične ssRNA, ki bi se nato združile v dsRNA. Zaradi izbranega promotorja so vzeli tudi primerno šasijo in sicer E. coli seva HT115, ki vsebuj zapis za T7 polimerazo. Omenjeni encim je v bakteriji pod nadzorom Lac operona. Ta je represiran s strani LacI, gen za katerega se prav tako nahaja na kromosomu bakterije. LacI v bakteriji dimerizira in se veže na lac operon. Ob dodatku IPTGja v gojišče, se ta veže na LacI in tako prepreči vezavo, hkrati pa omogoči sintezo T7 polimeraze.

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

Prva možnost je, da bi dsRNA izolirali iz bakterij in nato injicirali direktno v rastline. Tako bi preprečili rast gliv, hkrati pa ne bi imelo negativnega učinka na rastlino, saj rastline, predvsem bananovci, nimajo nobenega tarčnega zapisa v kromosomih.
Druga možnost, na katero so se bolj osredotočili in se jim je zdela tudi bolj primerna pa je dodatek bakterij h koreninam rastlin in ob lizi bakterij pride do sprostitve dsRNA. Tako so pripravili tudi model za nadzorovano liziranje bakterij, ki je povezano z gostoto celic. Pri sproščanju dsRNA iz celic uporabljajo sistem quorum sensing, kjer posredno izkoriščajo gostoto celic in koncentracijo AHL za transkripcijo gena, ki je odgovoren za lizo celic. Znotraj celic poteka sinteza AHL pod kontrolo LuxI molekul. Ti so pod konstitutivnim promotorjem, ki skrbi za stalno izražanje, LuxI pa vsebuje zapis za AHL sintazo in posledično za proizvodnjo znotrajceličnega AHL. Pri večanju gostote celic, se sprošča tudi več AHL molekul, ki lahko prehajajo membrano. AHL prisoten znotraj celic se veže na LuxR molekule. Te so podobno kot LuxI pod kontrolo konstitutivnega promotorja in delujejo kot represor za lux promotor. Ob vezavi AHL pride do dimerizacije in inhibicije vezave LuxR na lux promotor. S tem omogočimo prepis gena za lux promotorjem, kar so poimenovali ON stanje. V njihovem primeru vsebuje gen zapis za lizne proteine, ki privedejo do lize celice, s tem pa sprostitve dsRNA, ki se vzporedno proizvaja. Ko pride do dovolj visoke koncentracije za lizo celic, te razpadejo. Z razpadom celic se zniža tudi koncentracija AHL v okolici in liznih proteinov, kar omogoči ponovno rast in razmnoževanje preostalih celic. To so poimenovali OFF stanje. Tako dobimo oscilirajoči sistem, ki skrbi da ne pride do prevelikega razmnoževanja bakterij, ko jih uporabimo kot fungicid.

'''Sistem utišanja tarčnih genov dsRNA'''

Izločena dsRNA se izloči v okolico korenin bananovcev, kjer se nahaja zajedavska gliva. Ta preide v celice, kjer se izraža tarčna mRNA. S tem ko imamo dsRNA v celici, ta izkoristi celični sistem DICER za razgradnjo na siRNA velikosti nekje med 20-23 bp, nato pa ob prisotnosti AGO proteinov še tvorbo RISC kompleksa. siRNA znotraj kompleksa prepozna tarčno mRNA in se veže nanjo. Kompleks jo nato razgradi in prepreči njeno izražanje. Do proizvodnje siRNA pride samo v primeru, če je prisotna tarčna mRNA, drugače ostane v dvoverižni obliki. Pri različnih vrstah gliv pa je lahko sama količina siRNA še pomnožena zahvaljujoč sistemu RRP (RNA-odvisna RNA polimeraza), ki tako samo še poveča inhibitorski odgovor. Pri tem lahko nastane problem, ker nam ta sistem lahko pomnoži tudi predele mRNA, na katero je vezana RNAi, s tem pa izgubimo specifičnost in lahko pride do inhibicije drugih zaporedij.

Vsi ti modeli so bili predstavljeni v obliki matematičnih enačb, ki so jih nato pretvorili v osnovne diferencialne enačbe. Pri tem so upoštevali znane podatke o hitrostih, konstantah in koncentracijah posameznih elementov. Modeli so razdeljeni na zgornje tri nivoje, na koncu pa so dobili predlagan celoten mehanizem od začetka do konca. Posamezne parametre so že sami vmes optimizirali z vmesnimi poskusi. Nato so se lotili še dejanskega eksperimenta za evaluacijo njihovega modela.

===EKSPERIMENT===
'''Sinteza dsRNA'''

Pri dejanskem eksperimentu so si pomagali z že znanimi podatki, saj niso imeli na voljo tega agresivnega seva Foc TR4, tako da so delali raziskave na manj agresivnem Foc R1. Najprej so raziskali, kateri geni so sploh povezani s patogenostjo. Ker so še vedno hoteli pripraviti RNAi za agresivnejši sev, so primerjali izbrane gene in iskali tiste z najvišjo homologijo, tako da bi se lahko apliciralo v obeh primerih. Na ta način so prišli do štirih genov (SGE1, ERG11, Velvet in SIX1). Ti so odgovorni za nastanek bolezni pri bananah, kjer pride do sinteze sekundarnih virulenčnih metabolitov (fumonizini in fuzarini) in venenja. Računalniško so nato pripravili zaporedja za vstavitev v vektorje in pripravo dsRNA. Za izgradnjo dsRNA so uporabljali spletni program E-RNAi, ki je primeren za oblikovanje in evaluacijo dsRNA. Izbrali so si 21 nukleotidov dolga zaporedja, ki se nahajajo nekje na sredini samih eksonov.
Za pridobitev samih tarčnih zaporedij je bilo potrebno izolirati mRNA iz gliv in za to so uporabili začetne oligonukleotide s previsnimi konci, ki so vsebovali zaporedja za kasnejše rezanje z restriktazami BgIII in KpnI, za kateri mesta vsebuje tudi izboljšanim vektorjem L4440. Za pomnoževanje vključkov in vektorja so uporabili bakterijski sev DH5α. Z T4 ligazo so oba dela združili, transformirali sev TH115 s toplotnim šokom in inducirali proizvodnjo dsRNA z dodatkom IPTGja.

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

Dostava in sproščanje dsRNA je precej odvisno od QS, ta pa je precej odvisen od lux promotorja, saj so pod njegovo kontrolo LuxI, LuxR in lizni proteini. Tokrat so lizne proteine zamenjali z GFP, da bi preverili njegovo izražanje, z merjenjem fluorescence pa lahko določijo učinkovitost in hitrost promotorja.

'''Sistem utišanja tarčnih genov dsRNA'''

Uspešno pripravljeno dsRNA so na koncu izolirali in izvedli inhibicijski test, kjer so dodajali fungicid različnih koncentracij k sporam gliv in na koncu merili koncentracijo konidij, ki so se razvile v odsotnosti in prisotnosti dsRNA. Na ta način so določili tudi ustrezno koncentracijo dsRNA, ki je potrebno za preprečitev rasti.

==UPORABNIKI==

V tem konkretnem primeru bi bil fungicid uporaben za podjetja, ki proizvajajo banane – teh je kar 464 v Ekvadorju, seveda pa bi lahko uporabljali tudi v drugih državah. Pripravili so tudi načrt, kako točno in na katerih predelih polj bi bilo koristno uporabljati fungicid, da ga ne bi preveč.
Bolj splošen cilj pa je priprava platforme, ki bi bila uporabna za različne sintezne biologe, ki bi jim olajšala pripravo različnih fungicidov tako da bi lahko predvideli rezultate in s tem zmanjšali nepotrebne in vivo poskuse.

Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidov

2022-05-09T20:35:09Z

Nograsek147:

Agrobactory 593 je projekt skupine Ecuador, ki je leta 2021 sodelovala na tekmovanju iGEM in zasedla 3-10. mesto v kategoriji Hrana in prehrana. Njihov glavni namen je bil pripraviti bakterijsko platformo za proizvodnjo specifičnih biopesticidev. Samo princip delovanja so prikazali na primeru fungicida na podlagi siRNA za zaščito bananovcev.

==PROBLEM==
Agrikultura je za državo kot je Ekvador pomemben faktor, ki omogoča samooskrbo, delovna mesta in produkte za izvoz v svet. Predstavlja kar 4% svetovnega in 8 % državnega BDP. Delovna mesta pa daje slabi tretjini prebivalstva.
Velik problem pa pri tem predstavljajo različne rastlinske bolezni, ki lahko privedejo do izredno visokih izgub, kar ne vpliva le na gospodarstvo, ampak tudi na okolje in zdravje ljudi.
Ekvador je glavni izvoznik banan na svetovni trg, kar 22% celotne svetovne trgovine. Obstaja pa kvasovka, ki preprečuje, da bi bil ta promet še večji. Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FocR4T) je škodljivec, ki napade banane iz družine Musaceae in spada med najhujše povzročitelje bolezni v zgodovini agrikulture, ki povzroča milijonske izgube na plantažah banan.

==IDEJA==
Skupina Ecuador je iskala nove rešitve, kako pripraviti fungicid proti glivi FocR4T, hkrati pa so projekt zastavili še nekoliko širše in hoteli pripraviti platformo, ki bi omogočila pripravo biopesticidev.Ti bi lahko bili specifični za različne patogene mikroorganizme. Tako je nastala modularna bakterijska platforma Agrobactory 593.
Projekt predstavlja več možnih rešitev v obliki nizkocenovnih biopesticidov na osnovi dvoverižne RNA, ki kasneje s tehnologijo RNAi zavira delovanje fungov. Prvotno so bili poskusi in vitro izvedeni na primeru glive Foc R1 (manj patogena in na voljo), vendar enako deluje tudi pri FocR4T. Osnovni princip pa omogoča preprosto spreminjanje tarčnega patogena, količino biopesticida, uporablja pa se lahko tudi različne bakterijske šasije za dostavo RNAi. Na ta način bi lahko enostavno pripravljali različne biopesticide prilagojene za različne potrebe kmetov.

==NAČRT==
Najprej so pripravili celoten model in uporabili ODE (ordinary differential equations) sistem za predvidenje samih rezultatov, kasneje pa so izvedli tudi in vitro eksperimente. Celoten sistem deluje na DBTL princip, kjer si najprej zamislijo model, potem ga pripravijo, nato preizkusijo in na koncu poskušajo optimizirati primarni model za boljše rezultate.

===MODEL===
'''Sinteza dsRNA'''

Preden so šli na pripravo fungicida za Foc R4T so pripravili splošen model. Namen je bil pripraviti dsRNA, zato so se odločili pripraviti vektor, ki bo vseboval T7 promotor na obeh straneh tarčnega gena, tako da bi lahko dobili posamične ssRNA, ki bi se nato združile v dsRNA. Zaradi izbranega promotorja so vzeli tudi primerno šasijo in sicer E. coli seva HT115, ki vsebuj zapis za T7 polimerazo. Omenjeni encim je v bakteriji pod nadzorom Lac operona. Ta je represiran s strani LacI, gen za katerega se prav tako nahaja na kromosomu bakterije. LacI v bakteriji dimerizira in se veže na lac operon. Ob dodatku IPTGja v gojišče, se ta veže na LacI in tako prepreči vezavo, hkrati pa omogoči sintezo T7 polimeraze.

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

Prva možnost je, da bi dsRNA izolirali iz bakterij in nato injicirali direktno v rastline. Tako bi preprečili rast gliv, hkrati pa ne bi imelo negativnega učinka na rastlino, saj rastline, predvsem bananovci, nimajo nobenega tarčnega zapisa v kromosomih.
Druga možnost, na katero so se bolj osredotočili in se jim je zdela tudi bolj primerna pa je dodatek bakterij h koreninam rastlin in ob lizi bakterij pride do sprostitve dsRNA. Tako so pripravili tudi model za nadzorovano liziranje bakterij, ki je povezano z gostoto celic. Pri sproščanju dsRNA iz celic uporabljajo sistem quorum sensing, kjer posredno izkoriščajo gostoto celic in koncentracijo AHL za transkripcijo gena, ki je odgovoren za lizo celic. Znotraj celic poteka sinteza AHL pod kontrolo LuxI molekul. Ti so pod konstitutivnim promotorjem, ki skrbi za stalno izražanje, LuxI pa vsebuje zapis za AHL sintazo in posledično za proizvodnjo znotrajceličnega AHL. Pri večanju gostote celic, se sprošča tudi več AHL molekul, ki lahko prehajajo membrano. AHL prisoten znotraj celic se veže na LuxR molekule. Te so podobno kot LuxI pod kontrolo konstitutivnega promotorja in delujejo kot represor za lux promotor. Ob vezavi AHL pride do dimerizacije in inhibicije vezave LuxR na lux promotor. S tem omogočimo prepis gena za lux promotorjem, kar so poimenovali ON stanje. V njihovem primeru vsebuje gen zapis za lizne proteine, ki privedejo do lize celice, s tem pa sprostitve dsRNA, ki se vzporedno proizvaja. Ko pride do dovolj visoke koncentracije za lizo celic, te razpadejo. Z razpadom celic se zniža tudi koncentracija AHL v okolici in liznih proteinov, kar omogoči ponovno rast in razmnoževanje preostalih celic. To so poimenovali OFF stanje. Tako dobimo oscilirajoči sistem, ki skrbi da ne pride do prevelikega razmnoževanja bakterij, ko jih uporabimo kot fungicid.

'''Sistem utišanja tarčnih genov dsRNA'''

Izločena dsRNA se izloči v okolico korenin bananovcev, kjer se nahaja zajedavska gliva. Ta preide v celice, kjer se izraža tarčna mRNA. S tem ko imamo dsRNA v celici, ta izkoristi celični sistem DICER za razgradnjo na siRNA velikosti nekje med 20-23 bp, nato pa ob prisotnosti AGO proteinov še tvorbo RISC kompleksa. siRNA znotraj kompleksa prepozna tarčno mRNA in se veže nanjo. Kompleks jo nato razgradi in prepreči njeno izražanje. Do proizvodnje siRNA pride samo v primeru, če je prisotna tarčna mRNA, drugače ostane v dvoverižni obliki. Pri različnih vrstah gliv pa je lahko sama količina siRNA še pomnožena zahvaljujoč sistemu RRP (RNA-odvisna RNA polimeraza), ki tako samo še poveča inhibitorski odgovor. Pri tem lahko nastane problem, ker nam ta sistem lahko pomnoži tudi predele mRNA, na katero je vezana RNAi, s tem pa izgubimo specifičnost in lahko pride do inhibicije drugih zaporedij.

Vsi ti modeli so bili predstavljeni v obliki matematičnih enačb, ki so jih nato pretvorili v osnovne diferencialne enačbe. Pri tem so upoštevali znane podatke o hitrostih, konstantah in koncentracijah posameznih elementov. Modeli so razdeljeni na zgornje tri nivoje, na koncu pa so dobili predlagan celoten mehanizem od začetka do konca. Posamezne parametre so že sami vmes optimizirali z vmesnimi poskusi. Nato so se lotili še dejanskega eksperimenta za evaluacijo njihovega modela.

===EKSPERIMENT===
'''Sinteza dsRNA'''

Pri dejanskem eksperimentu so si pomagali z že znanimi podatki, saj niso imeli na voljo tega agresivnega seva Foc TR4, tako da so delali raziskave na manj agresivnem Foc R1. Najprej so raziskali, kateri geni so sploh povezani s patogenostjo. Ker so še vedno hoteli pripraviti RNAi za agresivnejši sev, so primerjali izbrane gene in iskali tiste z najvišjo homologijo, tako da bi se lahko apliciralo v obeh primerih. Na ta način so prišli do štirih genov (SGE1, ERG11, Velvet in SIX1). Ti so odgovorni za nastanek bolezni pri bananah, kjer pride do sinteze sekundarnih virulenčnih metabolitov (fumonizini in fuzarini) in venenja. Računalniško so nato pripravili zaporedja za vstavitev v vektorje in pripravo dsRNA. Za izgradnjo dsRNA so uporabljali spletni program E-RNAi, ki je primeren za oblikovanje in evaluacijo dsRNA. Izbrali so si 21 nukleotidov dolga zaporedja, ki se nahajajo nekje na sredini samih eksonov.
Za pridobitev samih tarčnih zaporedij je bilo potrebno izolirati mRNA iz gliv in za to so uporabili začetne oligonukleotide s previsnimi konci, ki so vsebovali zaporedja za kasnejše rezanje z restriktazami BgIII in KpnI, za kateri mesta vsebuje tudi izboljšanim vektorjem L4440. Za pomnoževanje vključkov in vektorja so uporabili bakterijski sev DH5α. Z T4 ligazo so oba dela združili, transformirali sev TH115 s toplotnim šokom in inducirali proizvodnjo dsRNA z dodatkom IPTGja.

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

Dostava in sproščanje dsRNA je precej odvisno od QS, ta pa je precej odvisen od lux promotorja, saj so pod njegovo kontrolo LuxI, LuxR in lizni proteini. Tokrat so lizne proteine zamenjali z GFP, da bi preverili njegovo izražanje, z merjenjem fluorescence pa lahko določijo učinkovitost in hitrost promotorja.

'''Sistem utišanja tarčnih genov dsRNA'''

Uspešno pripravljeno dsRNA so na koncu izolirali in izvedli inhibicijski test, kjer so dodajali fungicid različnih koncentracij k sporam gliv in na koncu merili koncentracijo konidij, ki so se razvile v odsotnosti in prisotnosti dsRNA. Na ta način so določili tudi ustrezno koncentracijo dsRNA, ki je potrebno za preprečitev rasti.

==UPORABNIKI==

V tem konkretnem primeru bi bil fungicid uporaben za podjetja, ki proizvajajo banane – teh je kar 464 v Ekvadorju, seveda pa bi lahko uporabljali tudi v drugih državah. Pripravili so tudi načrt, kako točno in na katerih predelih polj bi bilo koristno uporabljati fungicid, da ga ne bi preveč.
Bolj splošen cilj pa je priprava platforme, ki bi bila uporabna za različne sintezne biologe, ki bi jim olajšala pripravo različnih fungicidov tako da bi lahko predvideli rezultate in s tem zmanjšali nepotrebne in vivo poskuse.

Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidov

2022-05-09T20:24:28Z

Nograsek147:

Agrobactory 593 je projekt skupine Ecuador, ki je leta 2021 sodelovala na tekmovanju iGEM in zasedla 3-10. mesto v kategoriji Hrana in prehrana. Njihov glavni namen je bil pripraviti bakterijsko platformo za proizvodnjo specifičnih biopesticidev. Samo princip delovanja so prikazali na primeru fungicida na podlagi siRNA za zaščito bananovcev.

==PROBLEM==
Agrikultura je za državo kot je Ekvador pomemben faktor, ki omogoča samooskrbo, delovna mesta in produkte za izvoz v svet. Predstavlja kar 4% svetovnega in 8 % državnega BDP. Delovna mesta pa daje slabi tretjini prebivalstva.
Velik problem pa pri tem predstavljajo različne rastlinske bolezni, ki lahko privedejo do izredno visokih izgub, kar ne vpliva le na gospodarstvo, ampak tudi na okolje in zdravje ljudi.
Ekvador je glavni izvoznik banan na svetovni trg, kar 22% celotne svetovne trgovine. Obstaja pa kvasovka, ki preprečuje, da bi bil ta promet še večji. Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FocR4T) je škodljivec, ki napade banane iz družine Musaceae in spada med najhujše povzročitelje bolezni v zgodovini agrikulture, ki povzroča milijonske izgube na plantažah banan.

==IDEJA==
Skupina Ecuador je iskala nove rešitve, kako pripraviti fungicid proti glivi FocR4T, hkrati pa so projekt zastavili še nekoliko širše in hoteli pripraviti platformo, ki bi omogočila pripravo biopesticidev.Ti bi lahko bili specifični za različne patogene mikroorganizme. Tako je nastala modularna bakterijska platforma Agrobactory 593.
Projekt predstavlja več možnih rešitev v obliki nizkocenovnih biopesticidov na osnovi dvoverižne RNA, ki kasneje s tehnologijo RNAi zavira delovanje fungov. Prvotno so bili poskusi in vitro izvedeni na primeru glive Foc R1 (manj patogena in na voljo), vendar enako deluje tudi pri FocR4T. Osnovni princip pa omogoča preprosto spreminjanje tarčnega patogena, količino biopesticida, uporablja pa se lahko tudi različne bakterijske šasije za dostavo RNAi. Na ta način bi lahko enostavno pripravljali različne biopesticide prilagojene za različne potrebe kmetov.

==NAČRT==
Najprej so pripravili celoten model in uporabili ODE (ordinary differential equations) sistem za predvidenje samih rezultatov, kasneje pa so izvedli tudi in vitro eksperimente. Celoten sistem deluje na DBTL princip, kjer si najprej zamislijo model, potem ga pripravijo, nato preizkusijo in na koncu poskušajo optimizirati primarni model za boljše rezultate.

===MODEL===
'''Sinteza dsRNA'''

Preden so šli na pripravo fungicida za Foc R4T so pripravili splošen model. Namen je bil pripraviti dsRNA, zato so se odločili pripraviti vektor, ki bo vseboval T7 promotor na obeh straneh tarčnega gena, tako da bi lahko dobili posamične ssRNA, ki bi se nato združile v dsRNA. Zaradi izbranega promotorja so vzeli tudi primerno šasijo in sicer E. coli seva HT115, ki vsebuj zapis za T7 polimerazo. Omenjeni encim je v bakteriji pod nadzorom Lac operona. Ta je represiran s strani LacI, gen za katerega se prav tako nahaja na kromosomu bakterije. LacI v bakteriji dimerizira in se veže na lac operon. Ob dodatku IPTGja v gojišče, se ta veže na LacI in tako prepreči vezavo, hkrati pa omogoči sintezo T7 polimeraze.

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

Prva možnost je, da bi dsRNA izolirali iz bakterij in nato injicirali direktno v rastline. Tako bi preprečili rast gliv, hkrati pa ne bi imelo negativnega učinka na rastlino, saj rastline, predvsem bananovci, nimajo nobenega tarčnega zapisa v kromosomih.
Druga možnost, na katero so se bolj osredotočili in se jim je zdela tudi bolj primerna pa je dodatek bakterij h koreninam rastlin in ob lizi bakterij pride do sprostitve dsRNA. Tako so pripravili tudi model za nadzorovano liziranje bakterij, ki je povezano z gostoto celic. Pri sproščanju dsRNA iz celic uporabljajo sistem quorum sensing, kjer posredno izkoriščajo gostoto celic in koncentracijo AHL za transkripcijo gena, ki je odgovoren za lizo celic. Znotraj celic poteka sinteza AHL pod kontrolo LuxI molekul. Ti so pod konstitutivnim promotorjem, ki skrbi za stalno izražanje, LuxI pa vsebuje zapis za AHL sintazo in posledično za proizvodnjo znotrajceličnega AHL. Pri večanju gostote celic, se sprošča tudi več AHL molekul, ki lahko prehajajo membrano. AHL prisoten znotraj celic se veže na LuxR molekule. Te so podobno kot LuxI pod kontrolo konstitutivnega promotorja in delujejo kot represor za lux promotor. Ob vezavi AHL pride do dimerizacije in inhibicije vezave LuxR na lux promotor. S tem omogočimo prepis gena za lux promotorjem, kar so poimenovali ON stanje. V njihovem primeru vsebuje gen zapis za lizne proteine, ki privedejo do lize celice, s tem pa sprostitve dsRNA, ki se vzporedno proizvaja. Ko pride do dovolj visoke koncentracije za lizo celic, te razpadejo. Z razpadom celic se zniža tudi koncentracija AHL v okolici in liznih proteinov, kar omogoči ponovno rast in razmnoževanje preostalih celic. To so poimenovali OFF stanje. Tako dobimo oscilirajoči sistem, ki skrbi da ne pride do prevelikega razmnoževanja bakterij, ko jih uporabimo kot fungicid.

'''Sistem utišanja tarčnih genov dsRNA'''

Izločena dsRNA se izloči v okolico korenin bananovcev, kjer se nahaja zajedavska gliva. Ta preide v celice, kjer se izraža tarčna mRNA. S tem ko imamo dsRNA v celici, ta izkoristi celični sistem DICER za razgradnjo na siRNA velikosti nekje med 20-23 bp, nato pa ob prisotnosti AGO proteinov še tvorbo RISC kompleksa. siRNA znotraj kompleksa prepozna tarčno mRNA in se veže nanjo. Kompleks jo nato razgradi in prepreči njeno izražanje. Do proizvodnje siRNA pride samo v primeru, če je prisotna tarčna mRNA, drugače ostane v dvoverižni obliki. Pri različnih vrstah gliv pa je lahko sama količina siRNA še pomnožena zahvaljujoč sistemu RRP (RNA-odvisna RNA polimeraza), ki tako samo še poveča inhibitorski odgovor. Pri tem lahko nastane problem, ker nam ta sistem lahko pomnoži tudi predele mRNA, na katero je vezana RNAi, s tem pa izgubimo specifičnost in lahko pride do inhibicije drugih zaporedij.

Vsi ti modeli so bili predstavljeni v obliki matematičnih enačb, ki so jih nato pretvorili v osnovne diferencialne enačbe. Pri tem so upoštevali znane podatke o hitrostih, konstantah in koncentracijah posameznih elementov. Modeli so razdeljeni na zgornje tri nivoje, na koncu pa so dobili predlagan celoten mehanizem od začetka do konca. Posamezne parametre so že sami vmes optimizirali z vmesnimi poskusi. Nato so se lotili še dejanskega eksperimenta za evaluacijo njihovega modela.

===EKSPERIMENT===
'''Sinteza dsRNA'''
Pri dejanskem eksperimentu so si pomagali z že znanimi podatki, saj niso imeli na voljo tega agresivnega seva Foc TR4, tako da so delali raziskave na manj agresivnem Foc R1. Najprej so raziskali, kateri geni so sploh povezani s patogenostjo. Ker so še vedno hoteli pripraviti RNAi za agresivnejši sev, so primerjali izbrane gene in iskali tiste z najvišjo homologijo, tako da bi se lahko apliciralo v obeh primerih. Na ta način so prišli do štirih genov (SGE1, ERG11, Velvet in SIX1). Ti so odgovorni za nastanek bolezni pri bananah, kjer pride do sinteze sekundarnih virulenčnih metabolitov (fumonizini in fuzarini) in venenja. Računalniško so nato pripravili zaporedja za vstavitev v vektorje in pripravo dsRNA. Za izgradnjo dsRNA so uporabljali spletni program E-RNAi, ki je primeren za oblikovanje in evaluacijo dsRNA. Izbrali so si 21 nukleotidov dolga zaporedja, ki se nahajajo nekje na sredini samih eksonov.
Za pridobitev samih tarčnih zaporedij je bilo potrebno izolirati mRNA iz gliv in za to so uporabili začetne oligonukleotide s previsnimi konci, ki so vsebovali zaporedja za kasnejše rezanje z restriktazami BgIII in KpnI, za kateri mesta vsebuje tudi izboljšanim vektorjem L4440. Za pomnoževanje vključkov in vektorja so uporabili bakterijski sev DH5α. Z T4 ligazo so oba dela združili, transformirali sev TH115 s toplotnim šokom in inducirali proizvodnjo dsRNA z dodatkom IPTGja.

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

'''Sistem utišanja tarčnih genov dsRNA'''
==UPORABNIKI==

Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidov

2022-05-09T20:23:45Z

Nograsek147:

Agrobactory 593 je projekt skupine Ecuador, ki je leta 2021 sodelovala na tekmovanju iGEM in zasedla 3-10. mesto v kategoriji Hrana in prehrana. Njihov glavni namen je bil pripraviti bakterijsko platformo za proizvodnjo specifičnih biopesticidev. Samo princip delovanja so prikazali na primeru fungicida na podlagi siRNA za zaščito bananovcev.

==PROBLEM==
Agrikultura je za državo kot je Ekvador pomemben faktor, ki omogoča samooskrbo, delovna mesta in produkte za izvoz v svet. Predstavlja kar 4% svetovnega in 8 % državnega BDP. Delovna mesta pa daje slabi tretjini prebivalstva.
Velik problem pa pri tem predstavljajo različne rastlinske bolezni, ki lahko privedejo do izredno visokih izgub, kar ne vpliva le na gospodarstvo, ampak tudi na okolje in zdravje ljudi.
Ekvador je glavni izvoznik banan na svetovni trg, kar 22% celotne svetovne trgovine. Obstaja pa kvasovka, ki preprečuje, da bi bil ta promet še večji. Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FocR4T) je škodljivec, ki napade banane iz družine Musaceae in spada med najhujše povzročitelje bolezni v zgodovini agrikulture, ki povzroča milijonske izgube na plantažah banan.

==IDEJA==
Skupina Ecuador je iskala nove rešitve, kako pripraviti fungicid proti glivi FocR4T, hkrati pa so projekt zastavili še nekoliko širše in hoteli pripraviti platformo, ki bi omogočila pripravo biopesticidev.Ti bi lahko bili specifični za različne patogene mikroorganizme. Tako je nastala modularna bakterijska platforma Agrobactory 593.
Projekt predstavlja več možnih rešitev v obliki nizkocenovnih biopesticidov na osnovi dvoverižne RNA, ki kasneje s tehnologijo RNAi zavira delovanje fungov. Prvotno so bili poskusi in vitro izvedeni na primeru glive Foc R1 (manj patogena in na voljo), vendar enako deluje tudi pri FocR4T. Osnovni princip pa omogoča preprosto spreminjanje tarčnega patogena, količino biopesticida, uporablja pa se lahko tudi različne bakterijske šasije za dostavo RNAi. Na ta način bi lahko enostavno pripravljali različne biopesticide prilagojene za različne potrebe kmetov.

==NAČRT==
Najprej so pripravili celoten model in uporabili ODE (ordinary differential equations) sistem za predvidenje samih rezultatov, kasneje pa so izvedli tudi in vitro eksperimente. Celoten sistem deluje na DBTL princip, kjer si najprej zamislijo model, potem ga pripravijo, nato preizkusijo in na koncu poskušajo optimizirati primarni model za boljše rezultate.

===MODEL===
'''Sinteza dsRNA'''
Preden so šli na pripravo fungicida za Foc R4T so pripravili splošen model. Namen je bil pripraviti dsRNA, zato so se odločili pripraviti vektor, ki bo vseboval T7 promotor na obeh straneh tarčnega gena, tako da bi lahko dobili posamične ssRNA, ki bi se nato združile v dsRNA. Zaradi izbranega promotorja so vzeli tudi primerno šasijo in sicer E. coli seva HT115, ki vsebuj zapis za T7 polimerazo. Omenjeni encim je v bakteriji pod nadzorom Lac operona. Ta je represiran s strani LacI, gen za katerega se prav tako nahaja na kromosomu bakterije. LacI v bakteriji dimerizira in se veže na lac operon. Ob dodatku IPTGja v gojišče, se ta veže na LacI in tako prepreči vezavo, hkrati pa omogoči sintezo T7 polimeraze.

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''
Prva možnost je, da bi dsRNA izolirali iz bakterij in nato injicirali direktno v rastline. Tako bi preprečili rast gliv, hkrati pa ne bi imelo negativnega učinka na rastlino, saj rastline, predvsem bananovci, nimajo nobenega tarčnega zapisa v kromosomih.
Druga možnost, na katero so se bolj osredotočili in se jim je zdela tudi bolj primerna pa je dodatek bakterij h koreninam rastlin in ob lizi bakterij pride do sprostitve dsRNA. Tako so pripravili tudi model za nadzorovano liziranje bakterij, ki je povezano z gostoto celic. Pri sproščanju dsRNA iz celic uporabljajo sistem quorum sensing, kjer posredno izkoriščajo gostoto celic in koncentracijo AHL za transkripcijo gena, ki je odgovoren za lizo celic. Znotraj celic poteka sinteza AHL pod kontrolo LuxI molekul. Ti so pod konstitutivnim promotorjem, ki skrbi za stalno izražanje, LuxI pa vsebuje zapis za AHL sintazo in posledično za proizvodnjo znotrajceličnega AHL. Pri večanju gostote celic, se sprošča tudi več AHL molekul, ki lahko prehajajo membrano. AHL prisoten znotraj celic se veže na LuxR molekule. Te so podobno kot LuxI pod kontrolo konstitutivnega promotorja in delujejo kot represor za lux promotor. Ob vezavi AHL pride do dimerizacije in inhibicije vezave LuxR na lux promotor. S tem omogočimo prepis gena za lux promotorjem, kar so poimenovali ON stanje. V njihovem primeru vsebuje gen zapis za lizne proteine, ki privedejo do lize celice, s tem pa sprostitve dsRNA, ki se vzporedno proizvaja. Ko pride do dovolj visoke koncentracije za lizo celic, te razpadejo. Z razpadom celic se zniža tudi koncentracija AHL v okolici in liznih proteinov, kar omogoči ponovno rast in razmnoževanje preostalih celic. To so poimenovali OFF stanje. Tako dobimo oscilirajoči sistem, ki skrbi da ne pride do prevelikega razmnoževanja bakterij, ko jih uporabimo kot fungicid.

'''Sistem utišanja tarčnih genov dsRNA'''
Izločena dsRNA se izloči v okolico korenin bananovcev, kjer se nahaja zajedavska gliva. Ta preide v celice, kjer se izraža tarčna mRNA. S tem ko imamo dsRNA v celici, ta izkoristi celični sistem DICER za razgradnjo na siRNA velikosti nekje med 20-23 bp, nato pa ob prisotnosti AGO proteinov še tvorbo RISC kompleksa. siRNA znotraj kompleksa prepozna tarčno mRNA in se veže nanjo. Kompleks jo nato razgradi in prepreči njeno izražanje. Do proizvodnje siRNA pride samo v primeru, če je prisotna tarčna mRNA, drugače ostane v dvoverižni obliki. Pri različnih vrstah gliv pa je lahko sama količina siRNA še pomnožena zahvaljujoč sistemu RRP (RNA-odvisna RNA polimeraza), ki tako samo še poveča inhibitorski odgovor. Pri tem lahko nastane problem, ker nam ta sistem lahko pomnoži tudi predele mRNA, na katero je vezana RNAi, s tem pa izgubimo specifičnost in lahko pride do inhibicije drugih zaporedij.

Vsi ti modeli so bili predstavljeni v obliki matematičnih enačb, ki so jih nato pretvorili v osnovne diferencialne enačbe. Pri tem so upoštevali znane podatke o hitrostih, konstantah in koncentracijah posameznih elementov. Modeli so razdeljeni na zgornje tri nivoje, na koncu pa so dobili predlagan celoten mehanizem od začetka do konca. Posamezne parametre so že sami vmes optimizirali z vmesnimi poskusi. Nato so se lotili še dejanskega eksperimenta za evaluacijo njihovega modela.

===EKSPERIMENT===
'''Sinteza dsRNA'''
Pri dejanskem eksperimentu so si pomagali z že znanimi podatki, saj niso imeli na voljo tega agresivnega seva Foc TR4, tako da so delali raziskave na manj agresivnem Foc R1. Najprej so raziskali, kateri geni so sploh povezani s patogenostjo. Ker so še vedno hoteli pripraviti RNAi za agresivnejši sev, so primerjali izbrane gene in iskali tiste z najvišjo homologijo, tako da bi se lahko apliciralo v obeh primerih. Na ta način so prišli do štirih genov (SGE1, ERG11, Velvet in SIX1). Ti so odgovorni za nastanek bolezni pri bananah, kjer pride do sinteze sekundarnih virulenčnih metabolitov (fumonizini in fuzarini) in venenja. Računalniško so nato pripravili zaporedja za vstavitev v vektorje in pripravo dsRNA. Za izgradnjo dsRNA so uporabljali spletni program E-RNAi, ki je primeren za oblikovanje in evaluacijo dsRNA. Izbrali so si 21 nukleotidov dolga zaporedja, ki se nahajajo nekje na sredini samih eksonov.
Za pridobitev samih tarčnih zaporedij je bilo potrebno izolirati mRNA iz gliv in za to so uporabili začetne oligonukleotide s previsnimi konci, ki so vsebovali zaporedja za kasnejše rezanje z restriktazami BgIII in KpnI, za kateri mesta vsebuje tudi izboljšanim vektorjem L4440. Za pomnoževanje vključkov in vektorja so uporabili bakterijski sev DH5α. Z T4 ligazo so oba dela združili, transformirali sev TH115 s toplotnim šokom in inducirali proizvodnjo dsRNA z dodatkom IPTGja.

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

'''Sistem utišanja tarčnih genov dsRNA'''
==UPORABNIKI==

Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidov

2022-05-09T20:01:42Z

Nograsek147:

==PROBLEM==
==IDEJA==
==NAČRT==
===MODEL===
'''Sinteza dsRNA'''

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

'''Sistem utišanja tarčnih genov dsRNA'''

===EKSPERIMENT===
==UPOARBNIKI==

Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidov

2022-05-09T20:01:23Z

Nograsek147:

==PROBLEM==
==IDEJA==
==NAČRT==
===MODEL===
'''Sinteza dsRNA'''

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

'''Sistem utišanja tarčnih genov dsRNA'''

==EKSPERIMENT==
==UPOARBNIKI==

Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidov

2022-05-09T20:00:31Z

Nograsek147:

==PROBLEM==
==IDEJA==
==NAČRT==
===MODEL===
'''Sinteza dsRNA'''

'''Dostava in sprostitev dsRNA'''

'''Sistem utišanja tarčnih genov dsRNA'''

Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidov

2022-05-09T19:59:02Z

Nograsek147:

==PROBLEM==
==IDEJA==
==NAČRT==
===MODEL===
˝˝˝Sinteza dsRNA˝˝˝
˝˝˝Dostava in sprostitev dsRNA˝˝˝
˝˝˝Sistem utišanja tarčnih genov dsRNA˝˝˝

Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidov

2022-05-09T19:58:07Z

Nograsek147: New page: ==PROBLEM== ==IDEJA== ==NAČRT== ===MODEL=== ´´´Sinteza dsRNA´´´ ´´´Dostava in sprostitev dsRNA´´´ ´´´Sistem utišanja tarčnih genov dsRNA´´´

==PROBLEM==
==IDEJA==
==NAČRT==
===MODEL===
´´´Sinteza dsRNA´´´
´´´Dostava in sprostitev dsRNA´´´
´´´Sistem utišanja tarčnih genov dsRNA´´´

Seminarji SB 2021/22

2022-05-09T19:10:19Z

Nograsek147:

V študijskem letu 2021/22 študentje pri Sintezni biologiji predstavljajo naslednje teme:

RAZISKOVALNI ČLANKI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do izhodiščnega članka na spletu.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kombinatori%C4%8Dni_pristopi_pri_na%C4%8Drtovanju_medproteinskih_interakcij%2C_uravnavanih_s_svetlobnimi_stikali Kombinatorični pristopi pri načrtovanju medproteinskih interakcij, uravnavanih s svetlobnimi stikali] (Neža Žerjav)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/De_novo_na%C4%8Drtovanje_transkripcijskega_faktorja_za_uporabo_v_progesteronskem_biosenzorju ''De novo'' načrtovanje transkripcijskega faktorja za uporabo v progesteronskem biosenzorju] (Polona Skrt)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Prozdravila_na_osnovi_siRNA%2C_ki_aktivirajo_RNA-interferenco_kot_odziv_na_prisotnost_specifi%C4%8Dnega_RNA-biomarkerja Prozdravila na osnovi siRNA, ki aktivirajo RNA-interferenco kot odziv na prisotnost specifičnega RNA-biomarkerja] (Tina Zavodnik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Bifunkcionalno_optogenetsko_stikalo_za_izboljšanje_proizvodnje_šikimske_kisline_v_E._coli Bifunkcionalno optogenetsko stikalo za izboljšanje proizvodnje šikimske kisline v ''E. coli''] (Meta Kodrič)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Inžiniring_in_izkoriščanje_sintetične_alosterije_luciferaze_NanoLuc Inžiniring in izkoriščanje sintetične alosterije luciferaze NanoLuc] (Rebeka Dajčman)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Modularen_RNA_interferenčni_sistem_za_regulacijo_multipleksnih_genov Modularen RNA interferenčni sistem za regulacijo multipleksnih genov] (Marko Pavleković)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Označevanje_bioloških_celic_za_zanesljivo_celično_inženirstvo Označevanje bioloških celic za zanesljivo celično inženirstvo] (Neža Blaznik)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Z_biosenzorjem_usmerjen_inžiniring_Cupriavidus_necator_H16_za_avtotrofno_proizvodnjo_manitola Z biosenzorjem usmerjen inžiniring ''Cupriavidus necator'' H16 za avtotrofno proizvodnjo manitola] (Teo Nograšek)

NAGRAJENI ŠTUDENTSKI PROJEKTI

(Vpišite naslov seminarja v slovenščini in ga povežite z novo stranjo, kjer bo povzetek. Na tej novi strani naj bo pod naslovom povezava do wiki strani študentske ekipe, katere projekt opisujete.) 

# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/MIBOM_-_biokompatibilni_material_iz_školjk MIBOM - biokompatibilni material iz školjk] (Manca Osolin) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/BOOM_V_-_bakterijski_membranski_vezikli_za_zaščito_rastlin_pred_patogeni BOOM V - bakterijski membranski vezikli za zaščito rastlin pred patogeni] (Eva Gartner) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/LET.IT.BEE_-_paradižnik,_katerega_cvetovi_razgradijo_insekticid LET.IT.BEE - paradižnik, katerega cvetovi razgradijo insekticid] (Barbara Jaklič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kissed_by_light_-_sistem_proti_oku%C5%BEbi_opeklin Kissed by light - sistem proti okužbi opeklin] (Nina Varda)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Gutail_Floractory_-_probiotične_bakterije_za_zaščito_črevesja_pred_vnetji Gutail Floractory - probiotične bakterije za zaščito črevesja pred vnetji] (Karmen Mlinar)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/AptaVita_-_diagnostika_pomanjkanja_vitaminov_z_aptacimi AptaVita - diagnostika pomanjkanja vitaminov z aptacimi] (Valeriya Musina)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/P.L.A.N.T._-_rastlinski_detekcijski_sistem_za_bojne_strupe P.L.A.N.T. - rastlinski detekcijski sistem za bojne strupe] (Tina Logonder)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Kolorimetrični_sistem_za_zaznavanje_virusov_na_podlagi_G_-_kvadrupleksov Kolorimetrični sistem za zaznavanje virusov na podlagi G-kvadrupleksov] (Nastja Feguš)
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Aprifreeze Aprifreeze - zaščita marelic pred spomladanskimi pozebami] (Laura Gašperšič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/OpenPlast_-_kloroplastni_brezcelični_sistemi_za_hitrejšo_karakterizacijo_genetskih_delov OpenPlast - kloroplastni brezcelični sistemi za hitrejšo karakterizacijo genetskih delov] (Kim Glavič) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/PHEAST_-_P._pastoris_za_odstranjevanje_metana PHEAST - ''P. pastoris'' za odstranjevanje metana] (Ana Potočnik) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/ELIXIO_-Mikrobni_konzorcij_za_vonj_po_vijolicah ELIXIO Mikrobni konzorcij za vonj po vijolicah] (Ajda Godec) 
# [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Agrobactory_593_-_Modularna_bakterijska_platforma_za_pripravo_biopesticidov Agrobactory 593 - Modularna bakterijska platforma za pripravo biopesticidev] (Tim Nograšek) 
----

Povzetki v slovenščini naj imajo 1200-1500 besed (viri v to vsoto ne štejejo). Povzetek je treba objaviti dva dni pred predstavitvijo do polnoči (za seminarje v sredo torej v ponedeljek). Predstavitev seminarja naj bo dolga 15 minut (13-17). Sledila bo razprava, ki praviloma ne bo daljša od 5 minut.

TBK2019-seminar

2019-04-13T14:15:19Z

Nograsek147: /* Seznam seminarjev */

= Temelji biokemije- seminar =

Seminarje vodi prof. dr. Brigita Lenarčič. Seminarji so obvezni.

Ocena seminarjev (6-10) predstavlja enako število odstotkov, ki se prišteje h končni pisni oceni izpita.
Stran na strežniku s seminarskimi nalogami je zaščitena.
Uporabniško ime je: tbk, password pa: samozame## "##" sta dve številki, ki ju izveste na predavanjih.
Tudi za urejanje Wiki strani potrebujete geslo, ki se od zgornjega razlikuje. Postopek pridobitve Wiki uporabniškega imena in gesla je opisan [http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Main_Page tukaj].

== Seznam seminarjev ==

{| border="1" cellpadding="4" cellspacing="0" style="border:#c9c9c9 1px solid; margin: 1em 1em 1em 0; border-collapse: collapse;"
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Ime in priimek'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Naslov seminarja'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Povezava'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za oddajo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Rok za recenzijo'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Datum predstavitve'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 1'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 2'''
| align="center" style="background:#f0f0f0;"|'''Recenzent 3'''
|-
| Anna Scott||Moj naslov v slovenščini||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||28.10.||05.11.||07.11.||r1||r2||r3
|-
| Maša Andoljšek||Zrele človeške celice lahko spremenijo svojo funkcijo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190213132309.htm||21.02.||22.02.||25.02.|| Isidora Stevanoska|| Tina Arnšek|| Lena Trnovec
|-
| Maja Trifkovič||naslov||povezava do novice||21.02.||22.02.||25.02.|| Manca Osolin|| Tadej Uršič|| Ana Vičič
|-
| Teo Nograšek||Kako se proteini vgradijo v celično membrano||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214100038.htm||21.02.||22.02.||25.02.|| Ajda Košorok|| Ana Potočnik|| Maša Gabrič
|-
| Maja Kolar||Pomen velikosti aksonskih mitohondrijev v možganih||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181127110959.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Hana Zajc|| Mateja Milošević||
Laura Unuk
|-
| Nina Varda||Kompleksne molekule, ki se zvijajo kot proteini, lahko nastanejo spontano||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190117110824.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Katja Benčuk|| Nastja Feguš|| Sašo Jakob
|-
| Anja Konjc||Nanodelci v boju proti raku||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190117092550.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Tina Logonder|| Maja Mahorič|| Alliana Kolar
|-
| Timotej Zgonik||Vijačna struktura v biomolekulah se lahko razvije na dokaj preprost način||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190124095112.htm||28.02.||01.03.||04.03.|| Špela Sotlar|| Nika Banovšek|| Nika Ramšak
|-
| Ela Sabadin||Genska terapija lahko ozdravi prirojeno gluhost pri miši ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190219111643.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Maša Andoljšek|| Greta Junger|| Tim Nograšek
|-
| Kim Glavič||Preveč popravljanja DNA lahko poškoduje tkiva||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190212141409.htm||05.03||08.03.||11.03.|| Maja Trifkovič|| Isidora Stevanoska|| Žan Fortuna
|-
| Oskar Nemec||Shizofrenija je povezana z nenavadnim imunskim odzivom na virus Epstein-Barr||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190109090911.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Teo Nograšek|| Manca Osolin|| Jure Povšin
|-
| Vivian Nemanič||Zmanjšanje stranskih učinkov kemoterapije z absorpcijsko napravo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190109090930.htm||05.03.||08.03.||11.03.|| Maja Kolar|| Ajda Košorok|| Jernej Kastelic
|-
| Srna Anastasovska||Bakterijski genotoksin kolibaktin človeškega črevesa alkilira DNA.||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190214153159.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Nina Varda|| Hana Zajc|| Tina Arnšek
|-
| Karmen Ferjan||Sestavina zelenega čaja, ki pomaga siRNA zdrsniti v celico||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/09/180919083446.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Anja Konjc|| Katja Benčuk|| Tadej Uršič
|-
| Ana Babnik||Kako nas okuži določena vrsta bakterij?||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190225075613.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Timotej Zgonik|| Tina Logonder|| Ana Potočnik
|-
| Aleksandra Rauter||Izolirana bakterija črevesne flore in njena možna povezava z depresijo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190213124350.htm||12.03.||15.03.||18.03.|| Ela Sabadin|| Špela Sotlar|| Mateja Milošević
|-
| Nika Vegelj||Nove poti iskanja funkcionalnega zdravila za virus HIV||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190207173229.htm||19.03.||22.03.||25.03.|| Kim Glavič|| Maša Andoljšek|| Nastja Feguš
|-
| Adela Šajn||||||19.03.||22.03.||25.03.|| Oskar Nemec|| Maja Trifkovič|| Maja Mahorič
|-
| Michelle Oletič||Naivni makrofagi||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181129142441.htm?fbclid=IwAR2x562KFLljGOmHD5T40KXBf6I2L72TpMpvVM0I3lNBckrVxXW3cXQG-vM||19.03.||22.03.||25.03.|| Vivian Nemanič|| Teo Nograšek|| Nika Banovšek
|-
| Tevž Levstek||Odkritje, ki izboljša razumevanje, kako se nekateri virusi množijo ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190312123658.htm||19.03.||22.03.||25.03.|| Srna Anastasovska|| Maja Kolar|| Greta Junger
|-
| Matevž Drnovšek||Koruzni sirup z visoko vsebnostjo fruktoze pospeši proliferacijo raka pri miših||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190321141924.htm||26.03.||29.03.||01.04.|| Karmen Ferjan|| Nina Varda|| Isidora Stevanoska
|-
| Marjeta Milostnik||Ključ do podaljšane življenjske dobe? Rubicon spremeni delovanje avtofagije med staranjem||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190219111744.htm
||26.03.||29.03.||01.04.|| Ana Babnik|| Anja Konjc|| Manca Osolin
|-
| Lena Trnovec||Serotonin lahko regulira izražanje genov v nevronih.|| https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190313143312.htm ||26.03.||29.03.||01.04.|| Aleksandra Rauter|| Timotej Zgonik|| Ajda Košorok
|-
| Ana Vičič||Snov, ki preprečuje malarijo pri komarjih.|| https://www.sciencedaily.com/releases/2018/09/180918082059.htm ||26.03.||29.03.||01.04.|| Nika Vegelj|| Ela Sabadin|| Hana Zajc
|-
| Maša Gabrič||Cepivo, s katerim bi lahko izkoreninili otroško paralizo||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/11/181127092558.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Adela Šajn|| Kim Glavič|| Katja Benčuk
|-
| Laura Unuk||Kako HIV-1 protein zatira odgovore imunskega sistema||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190205102525.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Michelle Oletič|| Oskar Nemec|| Tina Logonder
|-
| Sašo Jakob||Terapija pljučnih bolezni z vdihavanjem mRNA ||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190104104032.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Tevž Levstek|| Vivian Nemanič|| Špela Sotlar
|-
| Alliana Kolar||Hiperaktivnost možganskih celic bi lahko bila razlog za neučinkovitost antidepresivov||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190131162500.htm||02.04.||05.04.||08.04.|| Matevž Drnovšek|| Srna Anastasovska|| Maša Andoljšek
|-
| Nika Ramšak|| ||||09.04.||12.04.||15.04.|| Marjeta Milostnik|| Karmen Ferjan|| Maja Trifkovič
|-
| Tim Nograšek||Molekulska proteza za bolnike s cistično fibrozo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190313143248.htm||09.04.||12.04.||15.04.|| Lena Trnovec|| Ana Babnik|| Teo Nograšek
|-
| Žan Fortuna||Molekula, ki lahko odstrani virus hepatitisa C||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/12/181219142543.htm||09.04.||12.04.||15.04.|| Ana Vičič|| Aleksandra Rauter|| Maja Kolar
|-
| Jure Povšin||Vpliv položaja celice na njeno obnovo||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190327112716.htm||09.04.||12.04.||15.04.|| Maša Gabrič|| Nika Vegelj|| Nina Varda
|-
| Jernej Kastelic||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Laura Unuk|| Adela Šajn|| Anja Konjc
|-
| Tina Arnšek||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Sašo Jakob|| Michelle Oletič|| Timotej Zgonik
|-
| Tadej Uršič||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Alliana Kolar|| Tevž Levstek|| Ela Sabadin
|-
| Ana Potočnik||||||23.04.||26.04.||29.04.|| Nika Ramšak|| Matevž Drnovšek|| Kim Glavič
|-
| Mateja Milošević||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Tim Nograšek|| Marjeta Milostnik|| Oskar Nemec
|-
| Nastja Feguš||||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190227081526.htm||30.04.||03.05.||06.05.|| Žan Fortuna|| Lena Trnovec|| Vivian Nemanič
|-
| Maja Mahorič||Spreminjanje odprtih ran v kožo||https://www.sciencedaily.com/releases/2018/09/180905131831.htm||30.04.||03.05.||06.05.|| Jure Povšin|| Ana Vičič|| Srna Anastasovska
|-
| Nika Banovšek||||||30.04.||03.05.||06.05.|| Jernej Kastelic|| Maša Gabrič|| Karmen Ferjan
|-
| Greta Junger||||||07.05.||10.05.||13.05.|| Tina Arnšek|| Laura Unuk|| Ana Babnik
|-
| Isidora Stevanoska||Črni nanodelci upočasnjujejo rast tumorjev||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/04/190404104404.htm||07.05.||10.05.||13.05.|| Tadej Uršič|| Sašo Jakob|| Aleksandra Rauter
|-
| Manca Osolin||Kako lahko mitohondrijski encim sproži celično smrt||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/03/190314151623.htm||07.05.||10.05.||13.05.|| Ana Potočnik|| Alliana Kolar|| Nika Vegelj
|-
| Ajda Košorok||New pill can deliver insulin through the stomach||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190207142206.htm||07.05.||10.05.||13.05.|| Mateja Milošević|| Nika Ramšak|| Adela Šajn
|-
| Hana Zajc||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Nastja Feguš|| Tim Nograšek|| Michelle Oletič
|-
| Katja Benčuk||||||14.05.||17.05.||20.05.|| Maja Mahorič|| Žan Fortuna|| Tevž Levstek
|-
| Tina Logonder||RNA-vezavni protein Pum2 je tarča v boju proti staranju||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/01/190110141826.htm||14.05.||17.05.||20.05.|| Nika Banovšek|| Jure Povšin|| Matevž Drnovšek
|-
| Špela Sotlar||Vpogled v mehanizem, ki nadzira poškodbe DNA||https://www.sciencedaily.com/releases/2019/02/190226112344.htm||14.05.||17.05.||20.05.|| Greta Junger|| Jernej Kastelic|| Marjeta Milostnik

|}

==Naloga==
* samostojno pripraviti seminar, katerega tema je novica iz področja biokemije na portalu [http://www.sciencedaily.com ScienceDaily], ki je bila objavljena kasneje kot 1. avgusta 2018. Osnova za seminar naj bo znanstveni članek, ki je podlaga za to novico. Poleg tega članka za seminar uporabite še najmanj pet drugih virov, od teh vsaj še dva druga znanstvena članka, ki se navezujeta na to vsebino.
* članke na temo lahko iščete [https://scholar.google.com/ z Google učenjakom].
* naslov izbrane teme in povezavo do novice vpišite v tabelo seminarjev takoj ko ste si izbrali temo, najkasneje pa en teden pred rokom za oddajo
* [[TBK2019 Povzetki seminarjev|Povzetek seminarja]] opišete na wikiju v približno 200 besedah - najkasneje do dne, ko morate oddati seminar recenzentom.
* Povezavo do povzetka vnesete v tabelo seminarjev tekočega letnika.
* Seminar pripravite v obliki seminarske naloge (pisava Cambria, font 11, enojni razmak, 2,5 cm robovi; tekst naj obsega okoli 1000 besed), vsebuje naj 1-2 sliki. Slika mora imeti legendo in v besedilu mora biti na ustreznem mestu sklic na sliko. Vse uporabljene vire citirajte v tekstu, kot npr. (Nobel, 2010), na koncu pa navedite točen seznam literature, kot je opisano spodaj!
*Celotni seminar naj obsega 2 strani A4 formata (po možnosti dvostransko tiskanje).
* Seminar oddajte do datuma oddaje, ki je naveden v tabeli v elektronski obliki z uporabo [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji/ tega obrazca].
* vsi seminarji so v elektronski obliki dostopni [http://bio.ijs.si/~zajec/tbk/poslji//bioseminar/ tukaj].
* Recenzenti do dneva določenega v tabeli določijo popravke in podajo oceno pisnega dela, v predpisanem formatu elektronskega obrazca na internetu.
* Ustna predstavitev sledi na dan, ki je vpisan v tabeli. Za predstavitev je na voljo 12 minut. Recenzenti morajo biti na predstavitvi prisotni. Prvi recenzent vodi predstavitve in razpravo ter skrbi za to, da vse poteka v zastavljenih časovnih okvirih.
* Predstavitvi sledi razprava do 8 minut. Sledijo vprašanja prisotnih, recenzenti postavijo vsak vsaj dve vprašanji in na koncu podajo oceno predstavitve.
* En dan pred predstavitvijo na strežnik oddajte tudi končno verzijo. Na dan predstavitve morate oddati tudi končno (popravljeno) in natisnjeno verzijo seminarja v enem izvodu.
* Seminarska naloga in povzetek na wikiju morajo biti v slovenskem jeziku!

==Imena datotek==
Prosim vas, da vse datoteke, ki jih pošiljate poimenujete po spodnjih pravilih. Ne uporabljajte ČŽŠčžš!
Poslati morate naslednje datoteke:
* TBK_2019_Priimek_Ime.doc(x) za seminar, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor.docx
* TBK_2019_Priimek_ime_final.doc(x) za končno verzijo seminarja
* TBK_2019_Priimek_Ime_rec_Priimek2.doc(x) za recenzijo, kjer je Priimek2 priimek recenzenta, npr. TBK_2019_Guncar_Gregor_rec_Scott.docx (če se pišete Scott in odajate recenzijo za seminar, ki ga je napisal Gunčar)
* TBK_2019_Priimek_Ime.ppt(x) za prezentacijo, npr TBK_2017_Guncar_Gregor.pptx
* TBK_2019_Priimek_Ime_clanek.pdf za datoteko PDF, ki vsebuje izvirni članek, npr. TBK_2017_Guncar_Gregor_clanek.pdf

==Ocenjevanje seminarjev==
Recenzenti ocenijo seminar tako, da izpolnijo [[https://docs.google.com/forms/d/1Hdg2OHCyG24qwLTnFt09yZTng46RIwaIiUqnKOdsJxQ/viewform recenzentsko poročilo]] na spletu.

== Mnenje o predstavitvi ==
Vsak posameznik '''mora''' oceniti seminar tako, da odda svoje [https://docs.google.com/forms/d/1VvE-jaKikfiDO5Gdybqgp9mf_0uJZfBbIK8PLXKDaS0/viewform mnenje] najkasneje v enem tednu po predstavitvi. Kdor na seminarju ni bil prisoten, mnenja '''ne sme''' oddati.

==Urejanje spletnih strani na wikiju==
Wiki so razvili zato, da lahko spletne vsebine ureja vsakdo. Ukazi so preprosti, dokler si ne zamislite česa prav posebnega. Vseeno pa je Word v primerjavi z wikijem pravo čudežno orodje... Če imate težave z oblikovanjem besedila, si preberite poglavje o urejanju wiki-strani na Wikipediji ([http://en.wikipedia.org/wiki/Help:Editing tule] v angleščini in [http://sl.wikipedia.org/wiki/Wikipedija:Urejanje_strani tu] v slovenščini). Pomaga tudi, če pogledate, kako je zapisana kakšna stran, ki se vam zdi v redu: kliknite na zavihek 'Uredite stran' in si poglejte, kako so vpisane povezave, kako nov odstavek in podobno. ''Na koncu seveda pod oknom za urejanje kliknite na 'Prekliči'.''

==Faktor vpliva==
Faktor vpliva (angl. impact factor) neke revije pove, kolikokrat so bili v poprečju citirani članki v tej reviji v dveh letih skupaj pred objavo tega faktorja. Faktorje vpliva za posamezno revijo lahko najdete v [http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?command=CONNECT&base=JCR COBISS-u]. V polje "Naslov revije" vnesite ime revije za katero želite izvedeti faktor vpliva in pritisnite na gumb POIŠČI. V skrajnem desnem stolpcu se bodo izpisali faktorji vpliva za revije, ki ustrezajo vašim iskalnim kriterijem. Zadetkov za posamezno revijo je več zato, ker so navedeni faktorji vpliva za posamezno leto. Za tekoče leto faktorji vpliva še niso objavljeni, zato se orientirajte po faktorjih vpliva zadnjih par let. Če faktorja vpliva za vašo izbrano revijo ne najdete v bazi COBISS, potem izberite članek iz kakšne druge revije.

==Citiranje virov==Citiranje je možno po več shemah, važno je, da se v seminarju držite ene same. Temeljno načelo je, da je treba vir navesti na tak način, da ga je mogoče nedvoumno poiskati. Sicer pa ima vsaka revija lahko svoj način citiranja, ki ga je treba pri pisanju članka upoštevati. '''Citiranje knjig:''' Priimek, I. ''Naslov''. Kraj: Založba, letnica. Priimek, I. ''Naslov: podnaslov''. Izdaja. Kraj: Založba, letnica. Zbirka, številka. ISBN. Boyer, R. ''Temelji biokemije''. Ljubljana: Študentska založba, 2005. Glick BR in Pasternak JJ. ''Molecular biotechnology: principles and applications of recombinant DNA''. 3. izdaja. Washington: ASM Press, 2003. ISBN 1-55581-269-4. Če so avtorji trije, je beseda in med drugim in tretjim avtorjem. Če so avtorji več kot trije, napišemo samo prvega in dopišemo ''et al''. (in drugi, po latinsko). Vse, kar je latinsko, pišemo poševno (npr. tudi imena rastlin in živali, pojme ''in vivo'', ''in vitro'' ipd.). '''Citiranje člankov:''' Priimek, I. Naslov. ''Naslov revije'', letnica, letnik, številka, strani. Lartigue C. ''et al''. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 2007, letn. 317, str. 632-638.Alternativni način citiranja (predvsem v družboslovju) je po pravilih APA, kjer članke citirajo takole: Priimek, I. (letnica, številka). Naslov. Naslov revije, strani. Lartigue C. ''et al.'' (2007, 317) Genome transplantation in bacteria: changing one species to another. ''Science'', 632-638.Revija Science uporablja skrajšani zapis: C. Lartigue ''et al''. Science 317, 632 (2007) V diplomah na FKKT je treba navesti vire tako, da izpišete tudi naslov citiranega dela in strani od-do (ne samo začetne). '''Citiranje spletnih virov:''' Priimek, I. ''Naslov dokumenta''. Izdaja. Kraj: Založnik, letnica. Datum zadnjega popravljanja. [Datum citiranja.] spletni naslov strangeguitars. ''On the brink of artificial life''. 6. 10. 2007. [citirano 13. 11. 2007] http://www.metafilter.com/65331/On-the-brink-of-artificial-life Navedemo čim več podatkov; pogosto vseh iz pravila ne boste našli.